TW202103718A - 腺相關病毒載體調配物及方法 - Google Patents

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Abstract

本文提供一種包含重組AAV粒子之調配物。在一些實施例中，該調配物為冷凍調配物或凍乾調配物。本文亦提供一種降低rAAV粒子釋放rAAV基因組之方法。

Description

腺相關病毒載體調配物及方法
描述用於將治療性產物(諸如治療性蛋白(例如抗體)、治療性RNA (例如shRNA、siRNA及miRNA)及治療性適體)遞送至人類個體之眼睛的視網膜/玻璃體液以治療眼睛病變之組合物及方法，其涉及例如重組病毒載體，諸如重組腺相關病毒(rAAV)載體。
基於重組腺相關病毒(AAV)之載體為目前研究中最廣泛使用的基因療法產物。rAAV載體系統之較佳用途部分係歸因於以下：缺乏與野生型病毒相關之疾病、AAV轉導非分裂細胞以及分裂細胞之能力及在臨床試驗中觀測到之所得長期穩固轉殖基因表現，且指示在基因療法適應症中之巨大的遞送潛能。另外，不同的天然存在及重組rAAV載體血清型特異性靶向不同組織、器官及細胞，且幫助避開對於載體之任何預先存在的免疫性，因此擴大基於AAV之基因療法的治療性應用。
除表明安全性及功效以外，AAV產物在製造、運送、儲存及投與期間必須保持穩定及強效的。對於任何醫藥產品之商業化，鑑別提供穩定性持續延長時間段之調配物應為有利的。鑑別在冷藏條件下或在室溫下為穩定的以避免需要在冷凍條件下運送及儲存之調配物應為進一步有利的。對於必須冷凍之產品，調配物必須能夠抵擋冷凍所引入之脅迫。因此，需要包含重組AAV粒子之經改良之調配物。
本發明提供一種調配物，其包含重組腺相關病毒(rAAV)粒子及緩衝劑、低溫保護及冷凍保護賦形劑、以及非晶形鹽。在一些實施例中，本文提供一種穩定調配物，其包含重組腺相關病毒(rAAV)粒子及緩衝劑、糖及非晶形鹽。在一些實施例中，調配物適合於凍乾。
在一些實施例中，緩衝劑包含Tris、蔗糖及小於約100 mM檸檬酸鈉。在一些實施例中，調配物進一步包含非離子性界面活性劑，例如泊洛沙姆(poloxamer) 188。在一些實施例中，調配物進一步包含塑化劑或穩定劑，例如甘油。在一些實施例中，rAAV包含以下之衣殼蛋白質：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV-11、AAV-12、AAV-13、AAV-14、AAV-15及AAV-16、rAAV.rh8、rAAV.rh10、rAAV.rh20、rAAV.rh39、rAAV.Rh74、rAAV.RHM4-1、AAV.hu37、rAAV.Anc80、rAAV.Anc80L65、rAAV.7m8、rAAV.PHP.B、rAAV2.5、rAAV2tYF、rAAV3B、rAAV.LK03、AAV.HSC1、AAV.HSC2、AAV.HSC3、AAV.HSC4、AAV.HSC5、AAV.HSC6、AAV.HSC7、AAV.HSC8、AAV.HSC9、AAV.HSC10、AAV.HSC11、AAV.HSC12、AAV.HSC13、AAV.HSC14、AAV.HSC15或AAV.HSC16。在一些實施例中，rAAV包含AAV-8或AAV-9血清型之衣殼蛋白質。
本發明提供一種調配物，其包含重組腺相關病毒(rAAV)粒子及緩衝劑、糖及包含檸檬酸鈉之鹽。在一些實施例中，緩衝劑包含Tris、蔗糖及小於約100 mM檸檬酸鈉。在一些實施例中，調配物進一步包含非離子性界面活性劑，例如泊洛沙姆188。在一些實施例中，調配物進一步包含塑化劑或穩定劑，例如甘油。在一些實施例中，rAAV包含以下之衣殼蛋白質：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV-11、AAV-12、AAV-13、AAV-14、AAV-15及AAV-16、rAAV.rh8、rAAV.rh10、rAAV.rh20、rAAV.rh39、rAAV.Rh74、rAAV.RHM4-1、AAV.hu37、rAAV.Anc80、rAAV.Anc80L65、rAAV.7m8、rAAV.PHP.B、rAAV2.5、rAAV2tYF、rAAV3B、rAAV.LK03、AAV.HSC1、AAV.HSC2、AAV.HSC3、AAV.HSC4、AAV.HSC5、AAV.HSC6、AAV.HSC7、AAV.HSC8、AAV.HSC9、AAV.HSC10、AAV.HSC11、AAV.HSC12、AAV.HSC13、AAV.HSC14、AAV.HSC15或AAV.HSC16。在一些實施例中，rAAV包含AAV-8或AAV-9血清型之衣殼蛋白質。
在一些實施例中，調配物適合於凍乾。在一些實施例中，醫藥組合物為來自本文所揭示之液體組合物之凍乾組合物。在一些實施例中，醫藥組合物為經復原之凍乾調配物。
在一些實施例中，調配物為液體調配物。在一些實施例中，調配物為冷凍調配物。在一些實施例中，調配物為自本文所揭示之液體調配物凍乾之調配物。在一些實施例中，調配物為經復原之凍乾調配物。
在一些實施例中，調配物為包含在約1%與約7%之間的殘餘水分含量之凍乾調配物。
本發明亦提供一種製造包含重組腺相關病毒(rAAV)粒子之穩定調配物之方法。
本發明亦提供一種降低rAAV粒子釋放rAAV基因組之方法。
本發明亦提供一種以糖於降低rAAV粒子釋放rAAV基因組上之用途。
本發明亦提供一種以塑化劑於降低rAAV粒子釋放rAAV基因組上之用途。
本發明亦提供一種治療有需要之個體之疾病或病症之方法，其包含投與含本文所揭示之重組AAV粒子之調配物。
在一些實施例中，本發明提供以下： [1.]   一種穩定調配物，其包含重組腺相關病毒(rAAV)粒子，及 a)     緩衝劑， b)     糖，及 c)     包含檸檬酸鈉之鹽； [2.]   如[1]之調配物，其中該緩衝劑包含約1 mM與約50 mM之間的Tris； [3.]   如[2]之調配物，其包含約1 mM與約30 mM之間、約1 mM與約20 mM之間、約5 mM與約30 mM之間、約5 mM與約20 mM之間、約10 mM與約30 mM之間、約10 mM與約20 mM之間或約20 mM與約50 mM之間的Tris； [4.]   如[2]之調配物，其包含約1 mM、約2 mM、約3 mM、約5 mM、約10 mM、約15 mM、約20 mM、約25 mM、約30 mM或約40 mM Tris； [5.]   如[2]之調配物，其包含約5 mM Tris； [6.]   如[1]至[4]中任一項之調配物，其具有約6.5與8.0之間的pH； [7.]   如[6]之調配物，其具有約7.2與7.8之間的pH； [8.]   如[6]之調配物，其具有約7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7或7.8之pH； [9.]   如[6]之調配物，其具有約7.5之pH； [10.] 如[1]至[9]中任一項之調配物，其包含約50 mM與約400 mM之間的糖； [11.] 如[10]之調配物，其包含約50 mM與約350 mM之間、約50 mM與約300 mM之間、約50 mM與約250 mM之間、約50 mM與約200 mM之間或約50 mM與約150 mM的糖； [12.] 如[10]之調配物，其包含約100 mM與約400 mM之間、約150 mM與約400 mM之間、約200 mM與約400 mM之間、約250 mM與約400 mM之間或約300 mM與約400 mM之間的糖； [13.] 如[10]之調配物，其包含約100 mM與約300 mM之間、約150 mM與約250 mM之間、約200 mM與約300 mM之間或約250 mM與約350 mM之間的糖； [14.] 如[10]之調配物，其包含約50 mM、約100 mM、約150 mM、約160 mM、約170 mM、約180 mM、約190 mM、約200 mM、約210 mM、約220 mM、約230 mM、約240 mM、約250 mM、約260 mM、約270 mM、約280 mM、約290 mM、約300 mM或約350 mM糖； [15.] 如[10]之調配物，其包含約190 mM與約230 mM之間、約170 mM與約250 mM之間或約150 mM與約270 mM之間的糖； [16.] 如[10]之調配物，其包含約210 mM糖； [17.] 如[1]至[16]中任一項之調配物，其中該糖為非還原糖； [18.] 如[17]之調配物，其中該非還原糖為蔗糖、海藻糖或棉子糖； [19.] 如[17]之調配物，其中該非還原糖為蔗糖； [20.] 如[1]至[16]中任一項之調配物，其中該糖為還原糖； [21.] 如[20]之調配物，其中該還原糖為葡萄糖、果糖、甘露糖、半乳糖或乳糖； [22.] 如[20]之調配物，其中該還原糖為右旋糖； [23.] 如[1]至[22]中任一項之調配物，其包含小於約100 mM檸檬酸鈉； [24.] 如[23]之調配物，其包含約10 mM與約100 mM之間的檸檬酸鈉； [25.] 如[23]之調配物，其包含約10 mM與約100 mM之間、約20 mM與約100 mM之間、約30 mM與約100 mM之間、約40 mM與約100 mM之間、約50 mM與約100 mM之間、約10 mM與約80 mM之間、約10 mM與約60 mM之間、約10 mM與約50 mM之間、約10 mM與約40 mM之間或約10 mM與約30 mM之間的檸檬酸鈉； [26.] 如[23]之調配物，其包含約10 mM與約50 mM之間、約20 mM與約60 mM之間、約30 mM與約70 mM之間或約10 mM與約30 mM之間的檸檬酸鈉； [27.] 如[23]之調配物，其包含約10 mM、約20 mM、約30 mM、約40 mM、約50 mM或約60 mM檸檬酸鈉； [28.] 如[23]之調配物，其包含約20 mM檸檬酸鈉； [29.] 如[1]至[28]中任一項之調配物，其進一步包含約0.0005%與約0.01%之間的非離子性界面活性劑； [30.] 如[29]之調配物，其包含約0.002%非離子性界面活性劑； [31.] 如[28]或[29]之調配物，其中該非離子性界面活性劑包含泊洛沙姆188、泊洛沙姆407、聚山梨醇酯80、聚山梨醇酯20、普洛尼克(Pluronic) F-68或BRIJ 35； [32.] 如[31]之調配物，其中該非離子性界面活性劑包含泊洛沙姆188； [33.] 一種穩定調配物，其包含重組腺相關病毒(rAAV)粒子，及 a)     約1 mM與約25 mM之間的Tris， b)     約50 mM與約400 mM之間的糖， c)     約10 mM與約100 mM之間的檸檬酸鈉，及 d)     約0.0005%與約0.01%之間的非離子性界面活性劑， 其中該調配物具有約7.2與約7.8之間的pH； [34.] 一種穩定調配物，其包含重組腺相關病毒(rAAV)粒子，及 a)     約2 mM與約10 mM之間的Tris， b)     約150 mM與約250 mM之間的糖， c)     約10 mM與約20 mM之間的檸檬酸鈉，及 d)     約0.001%與約0.005%之間的非離子性界面活性劑， 其中該調配物具有約7.2與約7.8之間的pH； [35.] 一種穩定調配物，其包含重組腺相關病毒(rAAV)粒子，及 a)     約5 mM Tris， b)     約210 mM糖， c)     約20 mM檸檬酸鈉，及 d)     約0.002%非離子性界面活性劑， 其中該調配物具有約7.5之pH； [36.] 如[33]至[35]中任一項之調配物，其中該糖為非還原糖； [37.] 如[36]之調配物，其中該非還原糖為蔗糖、海藻糖或棉子糖； [38.] 如[17]之調配物，其中該非還原糖為蔗糖； [39.] 如 [1]至[38]中任一項之調配物，其包含約1.0E+11個基因組複本/毫升(GC/mL)與約1.0E+15個GC/mL之間的rAAV粒子； [40.] 如[39]之調配物，其包含約1.0E+11個GC/mL、約1.0E+12個GC/mL、約1.0E+13個GC/mL、約1.0E+14個GC/mL或約1.0E+15個GC/ml rAAV粒子； [41.] 如[1]至[40]中任一項之調配物，其中該等rAAV粒子包含以下之衣殼蛋白質：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV-11、AAV-12、AAV-13、AAV-14、AAV-15及AAV-16、rAAV.rh8、rAAV.rh10、rAAV.rh20、rAAV.rh39、rAAV.Rh74、rAAV.RHM4-1、AAV.hu37、rAAV.Anc80、rAAV.Anc80L65、rAAV.7m8、rAAV.PHP.B、rAAV2.5、rAAV2tYF、rAAV3B、rAAV.LK03、AAV.HSC1、AAV.HSC2、AAV.HSC3、AAV.HSC4、AAV.HSC5、AAV.HSC6、AAV.HSC7、AAV.HSC8、AAV.HSC9、AAV.HSC10、AAV.HSC11、AAV.HSC12、AAV.HSC13、AAV.HSC14、AAV.HSC15或AAV.HSC16； [42.] 如[41]之調配物，其中該等rAAV粒子包含AAV-8或AAV-9血清型之衣殼蛋白質； [43.] 如[1]至[42]中任一項之調配物，其進一步包含選自由甘油、木糖醇、山梨糖醇或甘露醇組成之群之塑化劑； [44.] 如[1]至[42]中任一項之調配物，其進一步包含甘油； [45.] 如[44]之調配物，其包含約0.1%與約5%之間的甘油； [46.] 如[44]之調配物，其包含約0.1%與約2%之間的甘油； [47.] 如[44]之調配物，其包含約0.25%與約2%之間的甘油； [48.] 如[1]至[47]中任一項之調配物，其為液體調配物； [49.] 如[1]至[47]中任一項之調配物，其為冷凍調配物； [50.] 如[1]至[47]中任一項之調配物，其為凍乾調配物或經復原之凍乾調配物； [51.] 如[50]之調配物，其具有約1%與約7%之間的殘餘水分含量； [52.] 如[51]之調配物，其中該殘餘水分含量在約1%與約7%之間、約2%與約7%之間、約3%與約7%之間、約4%與約7%之間、約5%與約7%之間、約1%與約6%之間、約1%與約5%之間、約1%與約4%之間或約1%與約3%之間； [53.] 如[51]之調配物，其中該殘餘水分含量在約3%與約7%之間、約3%與約6%之間或約3%與約5%之間； [54.] 如[51]之調配物，其中該殘餘水分含量為約3%、約3.5%、約4%、約4.5%、約5%、約5.5%或約6%； [55.] 如[1]至[54]中任一項之調配物，其中在將該調配物儲存在室溫下3個月之後，該等rAAV粒子之相對效能百分比為至少約60%、至少約70%或至少約80%；其中參考rAAV粒子係儲存在-70℃下具有0.001%泊洛沙姆188之杜爾貝科氏(Dulbecco's)磷酸鹽緩衝鹽水(DPBS)緩衝液中； [56.] 如[1]至[54]中任一項之調配物，其中在將該調配物儲存在室溫下6個月之後，該等rAAV粒子之相對效能百分比為至少約60%、至少約70%或至少約80%，其中參考rAAV粒子係儲存在-70℃下具有0.001%泊洛沙姆188之DPBS緩衝液中； [57.] 如[1]至[54]中任一項之調配物，其中在將該調配物儲存在35℃下1週之後，該等rAAV粒子之相對效能百分比為至少約30%、至少約40%、至少約50%或至少60%，其中參考rAAV粒子係儲存在-70℃下具有0.001%泊洛沙姆188之DPBS緩衝液中； [58.] 如[1]至[54]中任一項之調配物，其中在將該調配物儲存在35℃下2週之後，該等rAAV粒子之相對效能百分比為至少約30%、至少約40%、至少約50%或至少60%，其中參考rAAV粒子係儲存在-70℃下具有0.001%泊洛沙姆188之DPBS緩衝液中； [59.] 如[1]至[54]中任一項之調配物，其中在將該調配物儲存在35℃下4週之後，該等rAAV粒子之相對效能百分比為至少約30%、至少約40%、至少約50%或至少60%，其中參考rAAV粒子係儲存在-70℃下具有0.001%泊洛沙姆188之DPBS緩衝液中； [60.] 一種製造包含重組腺相關病毒(rAAV)粒子之穩定調配物之方法，其包含將rAAV粒子與如[1]至[47]中任一項之調配物之緩衝劑、糖、鹽、視情況選用之塑化劑及視情況選用之非離子性界面活性劑組合，從而製造包含rAAV之調配物； [61.] 一種降低rAAV粒子釋放rAAV基因組之方法，其包含製造含rAAV粒子、緩衝劑、糖、鹽及視情況選用之非離子性界面活性劑之調配物，其中該等rAAV粒子在三個凍融循環之後釋放之rAAV基因組比不包含糖之調配物中釋放之rAAV基因組減少； [62.] 一種降低rAAV粒子釋放rAAV基因組之方法，其包含製造含rAAV粒子、緩衝劑、糖、鹽及視情況選用之非離子性界面活性劑之調配物，其中該等rAAV粒子在凍乾及復原之後釋放之rAAV基因組比不包含糖之調配物中釋放之rAAV基因組減少； [63.] 如[61]或[62]之方法，其進一步包含凍乾該調配物以達成約1%與約5%之間的殘餘水分含量； [64.] 一種降低rAAV粒子釋放rAAV基因組之方法，其包含製造含rAAV粒子、緩衝劑、糖、鹽、塑化劑及視情況選用之非離子性界面活性劑之調配物，其中該等rAAV粒子在三個凍融循環之後釋放之rAAV基因組比不包含糖之調配物中釋放之rAAV基因組減少； [65.] 一種降低rAAV粒子釋放rAAV基因組之方法，其包含製造含rAAV粒子、緩衝劑、糖、鹽、塑化劑及視情況選用之非離子性界面活性劑之調配物，其中該等rAAV粒子在凍乾及復原之後釋放之rAAV基因組比不包含糖之調配物中釋放之rAAV基因組減少； [66.] 一種以糖於降低rAAV粒子釋放rAAV基因組上之用途，其包含製造含rAAV粒子、緩衝劑、糖、鹽及視情況選用之非離子性界面活性劑之調配物，其中該等rAAV粒子在三個凍融循環之後釋放之rAAV基因組比不包含糖之調配物中釋放之rAAV基因組減少； [67.] 一種以糖於降低rAAV粒子釋放rAAV基因組上之用途，其包含製造含rAAV粒子、緩衝劑、糖、鹽及視情況選用之非離子性界面活性劑之調配物，其中該等rAAV粒子在凍乾及復原之後釋放之rAAV基因組比不包含糖之調配物中釋放之rAAV基因組減少； [68.] 如[66]或[67]之用途，其進一步包含凍乾該調配物以達成約1%與約7%之間的殘餘水分含量； [69.] 一種以塑化劑於降低rAAV粒子釋放rAAV基因組上之用途，其包含製造含rAAV粒子、緩衝劑、糖、鹽、塑化劑及視情況選用之非離子性界面活性劑之調配物，其中該等rAAV粒子在三個凍融循環之後釋放之rAAV基因組比不包含糖之調配物中釋放之rAAV基因組減少； [70.] 一種以塑化劑於降低rAAV粒子釋放rAAV基因組上之用途，其包含製造含rAAV粒子、緩衝劑、糖、鹽、塑化劑及視情況選用之非離子性界面活性劑之調配物，其中該等rAAV粒子在凍乾及復原之後釋放之rAAV基因組比不包含糖之調配物中釋放之rAAV基因組減少； [71.] 如[61]至[65]中任一項之方法或如[66]至[70]中任一項之用途，其中藉由量測在存在DNA特異性螢光染色劑下之相對螢光來測定rAAV基因組釋放； [72.] 如[61]至[65]及[71]中任一項之方法或如[66]至[71]中任一項之用途，其中冷凍誘發之rAAV基因組釋放降低了至少約10%、20%、50%、80%或90%； [73.] 如[61]至[65]及[71]中任一項之方法或如[66]至[71]中任一項之用途，其中實質上消除冷凍誘發之rAAV基因組釋放； [74.] 如[61]至[65]及[71]至[73]中任一項之方法或如[66]至[73]中任一項之用途，其中該糖為非還原糖； [75.] 如[74]之方法或如[74]之用途，其中該非還原糖為蔗糖、海藻糖或棉子糖； [76.] 如[74]之方法或如[74]之用途，其中該非還原糖為蔗糖； [77.] 如[61]至[65]及[71]至[73]中任一項之方法或如[66]至[73]中任一項之用途，其中該糖為還原糖； [78.] 如[77]之方法或如[77]之用途，其中該還原糖為葡萄糖、果糖、甘露糖、半乳糖或乳糖； [79.] 如[77]之方法或如[77]之用途，其中該還原糖為右旋糖； [80.] 如[61]至[65]及[71]至[79]中任一項之方法或如[66]至[79]中任一項之用途，其中該塑化劑包含甘油； [81.] 如[61]至[65]及[71]至[80]中任一項之方法或如[66]至[80]中任一項之用途，其中該調配物係根據[1]至[47]中之任一項。
在一些實施例中，本文所揭示之方法包含製造包含重組腺相關病毒(rAAV)粒子之穩定調配物，其中藉由自包含雜質之饋料(例如rAAV生產培養物)分離rAAV粒子來製造該等rAAV粒子，其中用於分離rAAV粒子之方法包含一或多個處理步驟。在一些實施例中，該處理為以下中之至少一者：收穫細胞培養物、淨化所收穫之細胞培養物(例如藉由離心或深度過濾)、切向流過濾、親和層析、陰離子交換層析、陽離子交換層析、尺寸排阻層析、疏水相互作用層析、無菌過濾。在其他實施例中，該處理包括以下中之至少2者、至少3者、至少4者、至少5者或至少6者：收穫細胞培養物、淨化所收穫之細胞培養物(例如藉由離心或深度過濾)、切向流過濾、親和層析、陰離子交換層析、陽離子交換層析、尺寸排阻層析、疏水相互作用層析及無菌過濾。在一些實施例中，該處理不包括離心所收穫之細胞培養物。
本發明提供一種用於製造包含經分離之重組腺相關病毒(rAAV)粒子之穩定調配物之方法，其包含(a)藉由以下中之一或多者自包含雜質之饋料分離粒子：離心、深度過濾、切向流過濾、超過濾、親和層析、尺寸排阻層析、離子交換層析及疏水相互作用層析；及(b)調配該等經分離之rAAV粒子以製造穩定調配物。
本發明提供一種用於製造包含經分離之重組腺相關病毒(rAAV)粒子之穩定調配物之醫藥單位劑量之方法，其包含(a)藉由以下中之一或多者自包含雜質之饋料分離rAAV粒子：離心、深度過濾、切向流過濾、超過濾、親和層析、尺寸排阻層析、離子交換層析及疏水相互作用層析；及(b)調配該等經分離之rAAV粒子。
在某些實施例中，本文提供一種穩定調配物，其包含重組腺相關病毒(rAAV)粒子及 a)     約5 mM Tris， b)     約210 mM蔗糖， c)     約20 mM檸檬酸鈉，及 d)     約0.002% (w/v)泊洛沙姆188。
在某些實施例中，本文提供一種穩定調配物，其包含重組腺相關病毒(rAAV)粒子及 a)     約5 mM Tris， b)     約210 mM蔗糖， c)     約20 mM檸檬酸鈉， d)     約0.002% (w/v)泊洛沙姆188，及 e)     約0.25% (w/v)甘油。
在某些實施例中，本文提供一種穩定調配物，其包含重組腺相關病毒(rAAV)粒子及 a)     約5 mM Tris， b)     約210 mM蔗糖， c)     約20 mM檸檬酸鈉， d)     約0.002% (w/v)泊洛沙姆188，及 e)     約0.5% (w/v)山梨糖醇。
在某些實施例中，本文提供一種穩定調配物，其包含重組腺相關病毒(rAAV)粒子及 a)     約5 mM Tris， a)     約30 mM硫酸鈉， b)     約263 mM蔗糖，及 c)     約0.005% (w/v)泊洛沙姆188。
在某些實施例中，穩定調配物不包含甘露醇。
在某些實施例中，穩定調配物包含小於10 mM、20 mM、30 mM、40 mM、50 mM、60 mM、70 mM、80 mM、90 mM、100 mM、110 mM、120 mM、130 mM、140 mM或150 mM甘露醇。
在某些實施例中，穩定調配物包含在約210 mM之濃度下之蔗糖。在某些實施例中，穩定調配物包含在約263 mM之濃度下之蔗糖。在某些實施例中，穩定調配物包含在約409 mM之濃度下之蔗糖。在某些實施例中，穩定調配物包含在約14.6 mM之濃度下之蔗糖。在某些實施例中，穩定調配物包含在約45 mM之濃度下之蔗糖。在某些實施例中，穩定調配物包含在約0 mM與約20 mM之間的濃度下之蔗糖。在某些實施例中，穩定調配物包含在約20 mM與約50 mM之間的濃度下之蔗糖。在某些實施例中，穩定調配物包含在約50 mM與約100 mM之間的濃度下之蔗糖。在某些實施例中，穩定調配物包含在約100 mM與約200 mM之間的濃度下之蔗糖。在某些實施例中，穩定調配物包含在約200 mM與約300 mM之間的濃度下之蔗糖。在某些實施例中，穩定調配物包含在約300 mM與約400 mM之間的濃度下之蔗糖。在某些實施例中，穩定調配物包含在約400 mM與約500 mM之間的濃度下之蔗糖。在某些實施例中，穩定調配物包含在約500 mM與約600 mM之間的濃度下之蔗糖。在某些實施例中，穩定調配物包含在約600 mM與約700 mM之間的濃度下之蔗糖。
在某些實施例中，穩定調配物包含在約0.5%之濃度下之山梨糖醇。在某些實施例中，穩定調配物包含在約0.25%之濃度下之山梨糖醇。在某些實施例中，穩定調配物包含在約0.10%之濃度下之山梨糖醇。
在某些實施例中，穩定調配物包含在約0%至約0.10%之濃度下之山梨糖醇。在某些實施例中，穩定調配物包含在約0.10%至約0.20%之濃度下之山梨糖醇。在某些實施例中，穩定調配物包含在約0.20%至約0.30%之濃度下之山梨糖醇。在某些實施例中，穩定調配物包含在約0.30%至約0.40%之濃度下之山梨糖醇。在某些實施例中，穩定調配物包含在約0.40%至約0.50%之濃度下之山梨糖醇。在某些實施例中，穩定調配物包含在約0.50%至約0.60%之濃度下之山梨糖醇。在某些實施例中，穩定調配物包含在約0.60%至約0.70%之濃度下之山梨糖醇。在某些實施例中，穩定調配物包含在約0.70%至約0.80%之濃度下之山梨糖醇。在某些實施例中，穩定調配物包含在約0.80%至約0.90%之濃度下之山梨糖醇。在某些實施例中，穩定調配物包含在約0.90%至約1.00%之濃度下之山梨糖醇。
在某些實施例中，穩定調配物包含在約0.5%之濃度下之甘油。在某些實施例中，穩定調配物包含在約0.25%之濃度下之甘油。在某些實施例中，穩定調配物包含在約0.10%之濃度下之甘油。
在某些實施例中，穩定調配物包含在約0%至約0.10%之濃度下之甘油。在某些實施例中，穩定調配物包含在約0.10%至約0.20%之濃度下之甘油。在某些實施例中，穩定調配物包含在約0.20%至約0.30%之濃度下之甘油。在某些實施例中，穩定調配物包含在約0.30%至約0.40%之濃度下之甘油。在某些實施例中，穩定調配物包含在約0.40%至約0.50%之濃度下之甘油。在某些實施例中，穩定調配物包含在約0.50%至約0.60%之濃度下之甘油。在某些實施例中，穩定調配物包含在約0.60%至約0.70%之濃度下之甘油。在某些實施例中，穩定調配物包含在約0.70%至約0.80%之濃度下之甘油。在某些實施例中，穩定調配物包含在約0.80%至約0.90%之濃度下之甘油。在某些實施例中，穩定調配物包含在約0.90%至約1.00%之濃度下之甘油。
在某些實施例中，穩定調配物包含在約0.001% (重量/體積，0.01 g/L)之濃度下之泊洛沙姆188。在某些實施例中，穩定調配物包含在約0.002% (重量/體積，0.02 g/L)之濃度下之泊洛沙姆188。在某些實施例中，穩定調配物包含在約0.005% (重量/體積，0.05 g/L)之濃度下之泊洛沙姆188。
在某些實施例中，穩定調配物包含在約0.0005% (重量/體積，0.005 g/L)至約0.05% (重量/體積，0.5 g/L)之濃度下之泊洛沙姆188。在某些實施例中，穩定調配物包含在約0.0001% (重量/體積，0.001 g/L)至約0.01% (重量/體積，0.1 g/L)之濃度下之泊洛沙姆188。在某些實施例中，穩定調配物包含在約0.0005% (重量/體積，0.005 g/L)至約0.001% (重量/體積，0.01 g/L)之濃度下之泊洛沙姆188。在某些實施例中，穩定調配物包含在約0.001% (重量/體積，0.01 g/L)至約0.05% (重量/體積，0.5 g/L)之濃度下之泊洛沙姆188。在某些實施例中，穩定調配物包含在約0.0005% (重量/體積，0.005 g/L)之濃度下之泊洛沙姆188。在某些實施例中，穩定調配物包含在約0.0006% (重量/體積，0.006 g/L)之濃度下之泊洛沙姆188。在某些實施例中，穩定調配物包含在約0.0007% (重量/體積，0.007 g/L)之濃度下之泊洛沙姆188。在某些實施例中，穩定調配物包含在約0.0008% (重量/體積，0.008 g/L)之濃度下之泊洛沙姆188。在某些實施例中，穩定調配物包含在約0.0009% (重量/體積，0.009 g/L)之濃度下之泊洛沙姆188。在某些實施例中，穩定調配物包含在約0.001% (重量/體積，0.01 g/L)之濃度下之泊洛沙姆188。在某些實施例中，穩定調配物包含在約0.002% (重量/體積，0.02 g/L)之濃度下之泊洛沙姆188。在某些實施例中，穩定調配物包含在約0.003% (重量/體積，0.03 g/L)之濃度下之泊洛沙姆188。在某些實施例中，穩定調配物包含在約0.004% (重量/體積，0.04 g/L)之濃度下之泊洛沙姆188。在某些實施例中，穩定調配物包含在約0.005% (重量/體積，0.05 g/L)之濃度下之泊洛沙姆188。在某些實施例中，穩定調配物包含在約0.01% (重量/體積，0.1 g/L)之濃度下之泊洛沙姆188。在某些實施例中，穩定調配物包含在約0.05% (重量/體積，0.5 g/L)之濃度下之泊洛沙姆188。
在某些實施例中，醫藥組合物之pH值為約7.4。
在某些實施例中，醫藥組合物之pH值為約6.0至8.8。在某些實施例中，醫藥組合物之pH值為約6.0至9.0。在某些實施例中，醫藥組合物之pH值為約6.0。在某些實施例中，醫藥組合物之pH值為約6.1。在某些實施例中，醫藥組合物之pH值為約6.2。在某些實施例中，醫藥組合物之pH值為約6.3。在某些實施例中，醫藥組合物之pH值為約6.4。在某些實施例中，醫藥組合物之pH值為約6.5。在某些實施例中，醫藥組合物之pH值為約6.6。在某些實施例中，醫藥組合物之pH值為約6.7。在某些實施例中，醫藥組合物之pH值為約6.8。在某些實施例中，醫藥組合物之pH值為約6.9。在某些實施例中，醫藥組合物之pH值為約7.0。在某些實施例中，醫藥組合物之pH值為約7.1。在某些實施例中，醫藥組合物之pH值為約7.2。在某些實施例中，醫藥組合物之pH值為約7.3。在某些實施例中，醫藥組合物之pH值為約7.4。在某些實施例中，醫藥組合物之pH值為約7.5。在某些實施例中，醫藥組合物之pH值為約7.6。在某些實施例中，醫藥組合物之pH值為約7.7。在某些實施例中，醫藥組合物之pH值為約7.8。在某些實施例中，醫藥組合物之pH值為約7.9。在某些實施例中，醫藥組合物之pH值為約8.0。在某些實施例中，醫藥組合物之pH值為約8.1。在某些實施例中，醫藥組合物之pH值為約8.2。在某些實施例中，醫藥組合物之pH值為約8.3。在某些實施例中，醫藥組合物之pH值為約8.4。在某些實施例中，醫藥組合物之pH值為約8.5。在某些實施例中，醫藥組合物之pH值為約8.6。在某些實施例中，醫藥組合物之pH值為約8.7。在某些實施例中，醫藥組合物之pH值為約8.8。在某些實施例中，醫藥組合物之pH值為約8.9。在某些實施例中，醫藥組合物之pH值為約9.0。
在某些實施例中，穩定調配物之載體基因組濃度(VGC)為約3 × 109 個GC/mL、4 × 109 個GC/mL、5 × 109 個GC/mL、6 × 109 個GC/mL、7 × 109 個GC/mL、8 × 109 個GC/mL、9 × 109 個GC/mL、約1 × 1010 個GC/mL、約2 × 1010 個GC/mL、約3 × 1010 個GC/mL、約4 × 1010 個GC/mL、約5 × 1010 個GC/mL、約6 × 1010 個GC/mL、約7 × 1010 個GC/mL、約8 × 1010 個GC/mL、約9 × 1010 個GC/mL、約1 × 1011 個GC/mL、約2 × 1011 個GC/mL、約3 × 1011 個GC/mL、約4 × 1011 個GC/mL、約5 × 1011 個GC/mL、約6 × 1011 個GC/mL、約7 × 1011 個GC/mL、約8 × 1011 個GC/mL、約9 × 1011 個GC/mL、約1 × 1012 個GC/mL、約2 × 1012 個GC/mL、約3 × 1012 個GC/mL、約4 × 1012 個GC/mL、約5 × 1012 個GC/mL、約6 × 1012 個GC/mL、約7 × 1012 個GC/mL、約8 × 1012 個GC/mL、約9 × 1012 個GC/mL、約1 × 1013 個GC/mL、約1 × 1013 個GC/mL、約2 × 1013 個GC/mL或約3 × 1013 個GC/mL。
在某些實施例中，對於凍乾或復原處理，穩定調配物中之重組腺相關病毒(rAAV)粒子比參考調配物中之相同rAAV粒子穩定至少約2%、約5%、約7%、約10%、約12%、約15%、約17%、約20%、約25%、約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約100%、約2倍、約3倍、約5倍、約10倍、約100倍或約1000倍。在某些實施例中，藉由章節6.8中所揭示之一或多種分析來測定rAAV粒子之穩定性。
在某些實施例中，穩定調配物中之rAAV粒子之感染力比參考調配物中之相同rAAV粒子之感染力高至少約2%、約5%、約7%、約10%、約12%、約15%、約17%、約20%、約25%、約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約100%、約2倍、約3倍、約5倍、約10倍、約100倍或約1000倍。在某些實施例中，藉由章節6.8中所揭示之一或多種分析來測定rAAV粒子之病毒感染力。在某些實施例中，在凍乾之前或之後，量測感染力。在某些實施例中，在復原凍乾調配物之前或之後，量測感染力。
在某些實施例中，穩定調配物中之rAAV粒子之聚集比參考調配物中之相同rAAV粒子之聚集低至少約2%、約5%、約7%、約10%、約12%、約15%、約17%、約20%、約25%、約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約100%、約2倍、約3倍、約5倍、約10倍、約100倍或約1000倍。在某些實施例中，藉由章節6.8中所揭示之一或多種分析來測定rAAV粒子之聚集。在某些實施例中，在凍乾之前或之後，量測聚集。在某些實施例中，在復原凍乾調配物之前或之後，量測聚集。
在某些實施例中，在儲存之前，凍乾穩定調配物。
在某一實施例中，在儲存之後，復原穩定調配物。
在某些實施例中，將調配物儲存在-80℃、-70℃、-20℃、4℃、20℃、25℃、30℃、35℃、37℃或40℃下。
在某些實施例中，將調配物儲存約1週、約2週、約3週、約4週、約1個月、約2個月、約3個月、約4個月、約5個月、約6個月、約7個月、約8個月、約9個月、約10個月、約11個月、12個月、約15個月、約18個月、約24個月、約2年、約3年或約4年。
在某些實施例中，在將調配物儲存一段時間之後，例如約1週、約2週、約3週、約4週、約1個月、約2個月、約3個月、約4個月、約5個月、約6個月、約7個月、約8個月、約9個月、約10個月、約11個月、12個月、約15個月、約18個月、約24個月、約2年、約3年、約4年，穩定調配物中之rAAV粒子比儲存在相同條件下之參考調配物中之相同rAAV粒子穩定至少約2%、約5%、約7%、約10%、約12%、約15%、約17%、約20%、約25%、約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約100%、約2倍、約3倍、約5倍、約10倍、約100倍或約1000倍。在某些實施例中，藉由章節6.8中所揭示之一或多種分析來測定rAAV粒子之經一段時間之穩定性。
在某些實施例中，在將調配物儲存一段時間之後，例如約1週、約2週、約3週、約4週、約1個月、約2個月、約3個月、約4個月、約5個月、約6個月、約7個月、約8個月、約9個月、約10個月、約11個月、12個月、約15個月、約18個月、約24個月、約2年、約3年、約4年，穩定調配物中之rAAV粒子比參考調配物中之相同rAAV粒子穩定至少約2%、約5%、約7%、約10%、約12%、約15%、約17%、約20%、約25%、約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約100%、約2倍、約3倍、約5倍、約10倍、約100倍或約1000倍。在某些實施例中，藉由章節6.8中所揭示之一或多種分析來測定rAAV粒子之經一段時間之穩定性。
在某些實施例中，穩定調配物中之rAAV粒子之活體外相對效能(IVRP)比參考調配物中之相同rAAV粒子之活體外相對效能高至少約2%、約5%、約7%、約10%、約12%、約15%、約17%、約20%、約25%、約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約100%、約2倍、約3倍、約5倍、約10倍、約100倍或約1000倍。在某些實施例中，藉由章節6.8中所揭示之一或多種分析來測定rAAV粒子之活體外相對效能(IVRP)。在某些實施例中，在凍乾之前或之後，量測IVRP。在某些實施例中，在復原凍乾調配物之前或之後，量測IVRP。
在某些實施例中，穩定調配物中之rAAV粒子之游離DNA比參考調配物中之相同rAAV粒子之游離DNA低至少約2%、約5%、約7%、約10%、約12%、約15%、約17%、約20%、約25%、約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約100%、約2倍、約3倍、約5倍、約10倍、約100倍或約1000倍。在某些實施例中，藉由章節6.8中所揭示之一或多種分析來測定rAAV粒子之游離DNA。在某些實施例中，在凍乾之前或之後，量測游離DNA。在某些實施例中，在復原凍乾調配物之前或之後，量測游離DNA。
在某些實施例中，穩定調配物中之rAAV粒子之rAAV基因組釋放比參考調配物中之相同rAAV粒子之rAAV基因組釋放低至少約2%、約5%、約7%、約10%、約12%、約15%、約17%、約20%、約25%、約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約100%、約2倍、約3倍、約5倍、約10倍、約100倍或約1000倍。在某些實施例中，藉由量測在存在DNA特異性螢光染色劑下之相對螢光，來測定rAAV基因組釋放。在某些實施例中，藉由章節6.8中所揭示之一或多種分析，來測定rAAV基因組釋放。在某些實施例中，在凍乾之前或之後，量測rAAV基因組釋放。在某些實施例中，在復原凍乾調配物之前或之後，量測rAAV基因組釋放。
在某些實施例中，在將調配物儲存一段時間之後，例如約1週、約2週、約3週、約4週、約1個月、約2個月、約3個月、約4個月、約5個月、約6個月、約7個月、約8個月、約9個月、約10個月、約11個月、約12個月、約15個月、約18個月、約24個月、約2年、約3年及約4年，穩定調配物中之rAAV粒子具有至多約20%、約15%、約10%、約8%、約5%、約4%、約3%、約2%或約1%之大小變化。在某些實施例中，藉由章節6.8中所揭示之一或多種分析來測定rAAV粒子之大小。在某些實施例中，在冷凍/解凍循環之前或之後，量測大小。
在某些實施例中，在將調配物儲存一段時間之後，例如至少約1週、約2週、約3週、約4週、約1個月、約2個月、約3個月、約4個月、約5個月、約6個月、約7個月、約8個月、約9個月、約10個月、約11個月、約12個月、約15個月、約18個月、約24個月、約2年、約3年及約4年，穩定調配物中之rAAV粒子具有至多20%、15%、10%、8%、5%、4%、3%、2%或1%之大小變化。在某些實施例中，藉由章節6.8中所揭示之一或多種分析來測定rAAV粒子之大小。在某些實施例中，在凍乾之前或之後，量測大小。在某些實施例中，在復原凍乾調配物之前或之後，量測大小。
在某些實施例中，當儲存在-80℃、-70℃、-20℃、4℃、20℃、25℃、30℃、35℃、37℃或40℃下時，穩定調配物中之rAAV粒子比參考調配物中之相同rAAV粒子穩定至少約2%、約5%、約7%、約10%、約12%、約15%、約17%、約20%、約25%、約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約100%、約2倍、約3倍、約5倍、約10倍、約100倍或約1000倍。在某些實施例中，藉由章節6.8中所揭示之一或多種分析來測定rAAV粒子之穩定性。
在某些實施例中，當儲存在-80℃、-70℃、-20℃、4℃、20℃、25℃、30℃、35℃、37℃或40℃下一段時間，例如約1週、約2週、約3週、約4週、約1個月、約2個月、約3個月、約4個月、約5個月、約6個月、約7個月、約8個月、約9個月、約10個月、約11個月、12個月、約15個月、約18個月、約24個月、約2年、約3年及約4年，穩定調配物中之rAAV粒子之感染力比參考調配物中之相同rAAV粒子之感染力高至少2%、5%、7%、10%、12%、15%、17%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、100%、2倍、3倍、5倍、10倍、100倍或1000倍。在某些實施例中，藉由章節6.8中所揭示之一或多種分析來測定rAAV粒子之病毒感染力。
在某些實施例中，當儲存在-80℃、-70℃、-20℃、4℃、20℃、25℃、30℃、35℃、37℃或40℃下一段時間，例如至少約1週、約2週、約3週、約4週、約1個月、約2個月、約3個月、約4個月、約5個月、約6個月、約7個月、約8個月、約9個月、約10個月、約11個月、12個月、約15個月、約18個月、約24個月、約2年、約3年及約4年，穩定調配物中之rAAV粒子之感染力比參考調配物中之相同rAAV粒子之感染力高至少2%、5%、7%、10%、12%、15%、17%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、100%、2倍、3倍、5倍、10倍、100倍或1000倍。在某些實施例中，藉由章節6.8中所揭示之一或多種分析來測定rAAV粒子之病毒感染力。
在某些實施例中，當儲存在-80℃、-70℃、-20℃、4℃、20℃、25℃、30℃、35℃、37℃或40℃下一段時間，例如約1週、約2週、約3週、約4週、約1個月、約2個月、約3個月、約4個月、約5個月、約6個月、約7個月、約8個月、約9個月、約10個月、約11個月、12個月、約15個月、約18個月、約24個月、約2年、約3年及約4年，穩定調配物中之rAAV粒子之聚集比參考調配物中之相同rAAV粒子之聚集低至少2%、5%、7%、10%、12%、15%、17%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、100%、2倍、3倍、5倍、10倍、100倍或1000倍。在某些實施例中，藉由章節6.8中所揭示之一或多種分析來測定rAAV粒子之聚集。
在某些實施例中，當儲存在-80℃、-70℃、-20℃、4℃、20℃、25℃、30℃、35℃、37℃或40℃下一段時間，例如至少約1週、約2週、約3週、約4週、約1個月、約2個月、約3個月、約4個月、約5個月、約6個月、約7個月、約8個月、約9個月、約10個月、約11個月、12個月、約15個月、約18個月、約24個月、約2年、約3年及約4年，穩定調配物中之rAAV粒子之聚集比參考調配物中之相同rAAV粒子之聚集低至少2%、5%、7%、10%、12%、15%、17%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、100%、2倍、3倍、5倍、10倍、100倍或1000倍。在某些實施例中，藉由章節6.8中所揭示之一或多種分析來測定rAAV粒子之聚集。
在某些實施例中，當儲存在-80℃、-70℃、-20℃、4℃、20℃、25℃、30℃、35℃、37℃或40℃下一段時間，例如約1週、約2週、約3週、約4週、約1個月、約2個月、約3個月、約4個月、約5個月、約6個月、約7個月、約8個月、約9個月、約10個月、約11個月、12個月、約15個月、約18個月、約24個月、約2年、約3年及約4年，穩定調配物中之rAAV粒子比參考調配物中之相同rAAV粒子穩定至少2%、5%、7%、10%、12%、15%、17%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、100%、2倍、3倍、5倍、10倍、100倍或1000倍。在某些實施例中，藉由章節6.8中所揭示之一或多種分析來測定rAAV粒子之經一段時間之穩定性。
在某些實施例中，當儲存在-80℃、-70℃、-20℃、4℃、20℃、25℃、30℃、35℃、37℃或40℃下一段時間，例如至少約1週、約2週、約3週、約4週、約1個月、約2個月、約3個月、約4個月、約5個月、約6個月、約7個月、約8個月、約9個月、約10個月、約11個月、12個月、約15個月、約18個月、約24個月、約2年、約3年及約4年，穩定調配物中之rAAV粒子比參考調配物中之相同rAAV粒子穩定至少2%、5%、7%、10%、12%、15%、17%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、100%、2倍、3倍、5倍、10倍、100倍或1000倍。在某些實施例中，藉由章節6.8中所揭示之一或多種分析來測定rAAV粒子之經一段時間之穩定性。
在某些實施例中，當儲存在-80℃、-70℃、-20℃、4℃、20℃、25℃、30℃、35℃、37℃或40℃下一段時間，例如1週、約2週、約3週、約4週、約1個月、約2個月、約3個月、約4個月、約5個月、約6個月、約7個月、約8個月、約9個月、約10個月、約11個月、12個月、約15個月、約18個月、約24個月、約2年、約3年及約4年，穩定調配物中之rAAV粒子之活體外相對效能(IVRP)比參考調配物中之相同rAAV粒子之活體外相對效能高至少2%、5%、7%、10%、12%、15%、17%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、100%、2倍、3倍、5倍、10倍、100倍或1000倍。在某些實施例中，藉由章節6.8中所揭示之一或多種分析來測定rAAV粒子之活體外相對效能(IVRP)。
在某些實施例中，當儲存在-80℃、-70℃、-20℃、4℃、20℃、25℃、30℃、35℃、37℃或40℃下一段時間，例如至少約1週、約2週、約3週、約4週、約1個月、約2個月、約3個月、約4個月、約5個月、約6個月、約7個月、約8個月、約9個月、約10個月、約11個月、12個月、約15個月、約18個月、約24個月、約2年、約3年及約4年，穩定調配物中之rAAV粒子之活體外相對效能(IVRP)比參考調配物中之相同rAAV粒子之活體外相對效能高至少2%、5%、7%、10%、12%、15%、17%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、100%、2倍、3倍、5倍、10倍、100倍或1000倍。在某些實施例中，藉由章節6.8中所揭示之一或多種分析來測定rAAV粒子之活體外相對效能(IVRP)。
在某些實施例中，當儲存在-80℃、-70℃、-20℃、4℃、20℃、25℃、30℃、35℃、37℃或40℃下一段時間，例如約1週、約2週、約3週、約4週、約1個月、約2個月、約3個月、約4個月、約5個月、約6個月、約7個月、約8個月、約9個月、約10個月、約11個月、12個月、約15個月、約18個月、約24個月、約2年、約3年及約4年，穩定調配物中之rAAV粒子之活體外相對效能(IVRP)比參考調配物中之相同rAAV粒子之活體外相對效能高至少2%、5%、7%、10%、12%、15%、17%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、100%、2倍、3倍、5倍、10倍、100倍或1000倍。在某些實施例中，藉由章節6.8中所揭示之一或多種分析來測定rAAV粒子之活體外相對效能(IVRP)。
在某些實施例中，當儲存在-80℃、-70℃、-20℃、4℃、20℃、25℃、30℃、35℃、37℃或40℃下一段時間，例如至少約1週、約2週、約3週、約4週、約1個月、約2個月、約3個月、約4個月、約5個月、約6個月、約7個月、約8個月、約9個月、約10個月、約11個月、12個月、約15個月、約18個月、約24個月、約2年、約3年及約4年，穩定調配物中之rAAV粒子之活體外相對效能(IVRP)比參考調配物中之相同rAAV粒子之活體外相對效能高至少2%、5%、7%、10%、12%、15%、17%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、100%、2倍、3倍、5倍、10倍、100倍或1000倍。在某些實施例中，藉由章節6.8中所揭示之一或多種分析來測定rAAV粒子之活體外相對效能(IVRP)。
在某些實施例中，當儲存在-80℃、-70℃、-20℃、4℃、20℃、25℃、30℃、35℃、37℃或40℃下一段時間，例如約1週、約2週、約3週、約4週、約1個月、約2個月、約3個月、約4個月、約5個月、約6個月、約7個月、約8個月、約9個月、約10個月、約11個月、12個月、約15個月、約18個月、約24個月、約2年、約3年及約4年，穩定調配物中之rAAV粒子之游離DNA比參考調配物中之相同rAAV粒子之游離DNA低至少2%、5%、7%、10%、12%、15%、17%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、100%、2倍、3倍、5倍、10倍、100倍或1000倍。在某些實施例中，藉由章節6.8中所揭示之一或多種分析來測定rAAV粒子之游離DNA。
在某些實施例中，當儲存在-80℃、-70℃、-20℃、4℃、20℃、25℃、30℃、35℃、37℃或40℃下一段時間，例如至少約1週、約2週、約3週、約4週、約1個月、約2個月、約3個月、約4個月、約5個月、約6個月、約7個月、約8個月、約9個月、約10個月、約11個月、12個月、約15個月、約18個月、約24個月、約2年、約3年及約4年，穩定調配物中之rAAV粒子之游離DNA比參考調配物中之相同rAAV粒子之游離DNA低至少2%、5%、7%、10%、12%、15%、17%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、100%、2倍、3倍、5倍、10倍、100倍或1000倍。在某些實施例中，藉由章節6.8中所揭示之一或多種分析來測定rAAV粒子之游離DNA。
在某些實施例中，當儲存在-80℃、-70℃、-20℃、4℃、20℃、25℃、30℃、35℃、37℃或40℃下一段時間，例如約1週、約2週、約3週、約4週、約1個月、約2個月、約3個月、約4個月、約5個月、約6個月、約7個月、約8個月、約9個月、約10個月、約11個月、約12個月、約15個月、約18個月、約24個月、約2年、約3年及約4年，穩定調配物中之rAAV粒子具有至多20%、15%、10%、8%、5%、4%、3%、2%或1%之大小變化。在某些實施例中，藉由章節6.8中所揭示之一或多種分析來測定rAAV粒子之大小。
在某些實施例中，當儲存在-80℃、-70℃、-20℃、4℃、20℃、25℃、30℃、35℃、37℃或40℃下一段時間，例如至少約1週、約2週、約3週、約4週、約1個月、約2個月、約3個月、約4個月、約5個月、約6個月、約7個月、約8個月、約9個月、約10個月、約11個月、約12個月、約15個月、約18個月、約24個月、約2年、約3年及約4年，穩定調配物中之rAAV粒子具有至多20%、15%、10%、8%、5%、4%、3%、2%或1%之大小變化。在某些實施例中，藉由章節6.8中所揭示之一或多種分析來測定rAAV粒子之大小。
在某些實施例中，參考調配物為具有0.001%泊洛沙姆188之DPBS緩衝液。
在某些實施例中，參考調配物為不包含糖之調配物。在某些實施例中，參考調配物為不包含塑化劑之調配物。
在某些實施例中，在凍乾過程中將調配物冷凍至約-20℃之溫度。在某些實施例中，當冷凍降至-20℃時，冷凍調配物保持約pH 6至約pH 9之間的pH。在某些實施例中，當冷凍降至-20℃時，冷凍調配物保持在冷凍前之pH值±1單位範圍內之pH值。
在某些實施例中，調配物之凍乾餅之玻璃轉化溫度(Tg)高於35℃。
在某些實施例中，調配物之最大冷凍濃縮溶液之玻璃轉化溫度(Tg')高於-40℃。
在某些實施例中，水分含量在約0.5%與約1%之間。在某些實施例中，水分含量在約1%與約2%之間。在某些實施例中，水分含量在約2%與約3%之間。在某些實施例中，水分含量在約3%與約4%之間。在某些實施例中，水分含量在約4%與約5%之間。
在某些實施例中，水分含量為約0.1%、約0.2%、約0.3%、約0.4%、約0.5%、約0.6%、約0.8%、約1.0%、約1.2%、約1.2%、約1.3%、約1.4%、約1.5%、約1.6%、約1.7%、約1.8%、約1.9%、約2.0%、約3.0%、約4.0%或約5.0%。
在一些實施例中，術語「約」意指在既定值或範圍之±10%內。在一些實施例中，術語「約」係指大於或小於所指示數字或範圍之大致10-20%之範圍。在某些實施例中，術語「約」涵蓋所敍述之確切數字。
當結合附圖閱讀時，本文中所描述之組合物及方法之其他特徵及優點將自以下詳細描述變得更顯而易見。 4.1 說明性實施例 4.1.1 集合1 1. 一種穩定調配物，其包含重組腺相關病毒(rAAV)粒子，及 a)     緩衝劑， b)     糖，及 c)     包含檸檬酸鈉之鹽。 2. 如段落1之調配物，其中該緩衝劑包含約1 mM與約50 mM之間的Tris。 3. 如段落2之調配物，其包含約1 mM與約30 mM之間、約1 mM與約20 mM之間、約5 mM與約30 mM之間、約5 mM與約20 mM之間、約10 mM與約30 mM之間、約10 mM與約20 mM之間或約20 mM與約50 mM之間的Tris。 4. 如段落2之調配物，其包含約1 mM、約2 mM、約3 mM、約5 mM、約10 mM、約15 mM、約20 mM、約25 mM、約30 mM或約40 mM Tris。 5. 如段落2之調配物，其包含約5 mM Tris。 6. 如段落1至4中任一項之調配物，其具有約6.5與8.0之間的pH。 7. 如段落6之調配物，其具有約7.2與7.8之間的pH。 8. 如段落6之調配物，其具有約7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7或7.8之pH。 9. 如段落6之調配物，其具有約7.5之pH。 10. 如段落1至9中任一項之調配物，其包含約50 mM與約400 mM之間的糖。 11. 如段落10之調配物，其包含約50 mM與約350 mM之間、約50 mM與約300 mM之間、約50 mM與約250 mM之間、約50 mM與約200 mM之間或約50 mM與約150 mM的糖。 12. 如段落10之調配物，其包含約100 mM與約400 mM之間、約150 mM與約400 mM之間、約200 mM與約400 mM之間、約250 mM與約400 mM之間或約300 mM與約400 mM之間的糖。 13. 如段落10之調配物，其包含約100 mM與約300 mM之間、約150 mM與約250 mM之間、約200 mM與約300 mM之間或約250 mM與約350 mM之間的糖。 14. 如段落10之調配物，其包含約50 mM、約100 mM、約150 mM、約160 mM、約170 mM、約180 mM、約190 mM、約200 mM、約210 mM、約220 mM、約230 mM、約240 mM、約250 mM、約260 mM、約270 mM、約280 mM、約290 mM、約300 mM或約350 mM糖。 15. 如段落10之調配物，其包含約190 mM與約230 mM之間、約170 mM與約250 mM之間或約150 mM與約270 mM之間的糖。 16. 如段落10之調配物，其包含約210 mM糖。 17. 如段落1至16中任一項之調配物，其中該糖為非還原糖。 18. 如段落17之調配物，其中該非還原糖為蔗糖、海藻糖或棉子糖。 19. 如段落17之調配物，其中該非還原糖為蔗糖。 20. 如段落1至16中任一項之調配物，其中該糖為還原糖。 21. 如段落20之調配物，其中該還原糖為葡萄糖、果糖、甘露糖、半乳糖或乳糖。 22. 如段落20之調配物，其中該還原糖為右旋糖。 23. 如段落1至22中任一項之調配物，其包含小於約100 mM檸檬酸鈉。 24. 如段落23之調配物，其包含約10 mM與約100 mM之間的檸檬酸鈉。 25. 如段落23之調配物，其包含約10 mM與約100 mM之間、約20 mM與約100 mM之間、約30 mM與約100 mM之間、約40 mM與約100 mM之間、約50 mM與約100 mM之間、約10 mM與約80 mM之間、約10 mM與約60 mM之間、約10 mM與約50 mM之間、約10 mM與約40 mM之間或約10 mM與約30 mM之間的檸檬酸鈉。 26. 如段落23之調配物，其包含約10 mM與約50 mM之間、約20 mM與約60 mM之間、約30 mM與約70 mM之間或約10 mM與約30 mM之間的檸檬酸鈉。 27. 如段落23之調配物，其包含約10 mM、約20 mM、約30 mM、約40 mM、約50 mM或約60 mM檸檬酸鈉。 28. 如段落23之調配物，其包含約20 mM檸檬酸鈉。 29. 如段落1至28中任一項之調配物，其進一步包含約0.0005%與約0.01%之間的非離子性界面活性劑。 30. 如段落29之調配物，其包含約0.002%非離子性界面活性劑。 31. 如段落28或29之調配物，其中該非離子性界面活性劑包含泊洛沙姆188、泊洛沙姆407、聚山梨醇酯80、聚山梨醇酯20、普洛尼克(Pluronic) F-68或BRIJ 35。 32. 如段落31之調配物，其中該非離子性界面活性劑包含泊洛沙姆188。 33. 一種穩定調配物，其包含重組腺相關病毒(rAAV)粒子，及 a)     約1 mM與約25 mM之間的Tris， b)     約50 mM與約400 mM之間的糖， c)     約10 mM與約100 mM之間的檸檬酸鈉，及 d)     約0.0005%與約0.01%之間的非離子性界面活性劑， 其中該調配物具有約7.2與約7.8之間的pH。 34. 一種穩定調配物，其包含重組腺相關病毒(rAAV)粒子，及 a)     約2 mM與約10 mM之間的Tris， b)     約150 mM與約250 mM之間的糖， c)     約10 mM與約20 mM之間的檸檬酸鈉，及 d)     約0.001%與約0.005%之間的非離子性界面活性劑， 其中該調配物具有約7.2與約7.8之間的pH。 35. 一種穩定調配物，其包含重組腺相關病毒(rAAV)粒子，及 a)     約5 mM Tris， b)     約210 mM糖， c)     約20 mM檸檬酸鈉，及 d)     約0.002%非離子性界面活性劑， 其中該調配物具有約7.5之pH。 36. 如段落33至35中任一項之調配物，其中該糖為非還原糖。 37. 如段落36之調配物，其中該非還原糖為蔗糖、海藻糖或棉子糖。 38. 如段落17之調配物，其中該非還原糖為蔗糖。 39. 如1至38中任一項之調配物，其包含約1.0E+11個基因組複本/毫升(GC/mL)與約1.0E+15個GC/mL之間的rAAV粒子。 40. 如段落39之調配物，其包含約1.0E+11個GC/mL、約1.0E+12個GC/mL、約1.0E+13個GC/mL、約1.0E+14個GC/mL或約1.0E+15個GC/ml rAAV粒子。 41. 如段落1至40中任一項之調配物，其中該等rAAV粒子包含以下之衣殼蛋白質：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV-11、AAV-12、AAV-13、AAV-14、AAV-15及AAV-16、rAAV.rh8、rAAV.rh10、rAAV.rh20、rAAV.rh39、rAAV.Rh74、rAAV.RHM4-1、AAV.hu37、rAAV.Anc80、rAAV.Anc80L65、rAAV.7m8、rAAV.PHP.B、rAAV2.5、rAAV2tYF、rAAV3B、rAAV.LK03、AAV.HSC1、AAV.HSC2、AAV.HSC3、AAV.HSC4、AAV.HSC5、AAV.HSC6、AAV.HSC7、AAV.HSC8、AAV.HSC9、AAV.HSC10、AAV.HSC11、AAV.HSC12、AAV.HSC13、AAV.HSC14、AAV.HSC15或AAV.HSC16。 42. 如段落41之調配物，其中該等rAAV粒子包含AAV-8或AAV-9血清型之衣殼蛋白質。 43. 如段落1至42中任一項之調配物，其進一步包含選自由甘油、木糖醇、山梨糖醇或甘露醇組成之群之塑化劑。 44. 如段落1至42中任一項之調配物，其進一步包含甘油。 45. 如段落44之調配物，其包含約0.1%與約5%之間的甘油。 46. 如段落44之調配物，其包含約0.1%與約2%之間的甘油。 47. 如段落44之調配物，其包含約0.25%與約2%之間的甘油。 48. 如段落1至47中任一項之調配物，其為液體調配物。 49. 如段落1至47中任一項之調配物，其為冷凍調配物。 50. 如段落1至47中任一項之調配物，其為凍乾調配物或經復原之凍乾調配物。 51. 如段落50之調配物，其具有約1%與約7%之間的殘餘水分含量。 52. 如段落51之調配物，其中該殘餘水分含量在約1%與約7%之間、約2%與約7%之間、約3%與約7%之間、約4%與約7%之間、約5%與約7%之間、約1%與約6%之間、約1%與約5%之間、約1%與約4%之間或約1%與約3%之間。 53. 如段落51之調配物，其中該殘餘水分含量在約3%與約7%之間、約3%與約6%之間或約3%與約5%之間。 54. 如段落51之調配物，其中該殘餘水分含量為約3%、約3.5%、約4%、約4.5%、約5%、約5.5%或約6%。 55. 如段落1至54中任一項之調配物，其中在將該調配物儲存在室溫下3個月之後，該等rAAV粒子之相對效能百分比為至少約60%、至少約70%或至少約80%；其中參考rAAV粒子係儲存在-70℃下具有0.001%泊洛沙姆188之DPBS緩衝液中。 56. 如段落1至54中任一項之調配物，其中在將該調配物儲存在室溫下6個月之後，該等rAAV粒子之相對效能百分比為至少約60%、至少約70%或至少約80%，其中參考rAAV粒子係儲存在-70℃下具有0.001%泊洛沙姆188之杜爾貝科氏(Dulbecco's)磷酸鹽緩衝鹽水(DPBS)緩衝液中。 57. 如段落1至54中任一項之調配物，其中在將該調配物儲存在35℃下1週之後，該等rAAV粒子之相對效能百分比為至少約30%、至少約40%、至少約50%或至少60%，其中參考rAAV粒子係儲存在-70℃下具有0.001%泊洛沙姆188之DPBS緩衝液中。 58. 如段落1至54中任一項之調配物，其中在將該調配物儲存在35℃下2週之後，該等rAAV粒子之相對效能百分比為至少約30%、至少約40%、至少約50%或至少60%，其中參考rAAV粒子係儲存在-70℃下具有0.001%泊洛沙姆188之DPBS緩衝液中。 59. 如段落1至54中任一項之調配物，其中在將該調配物儲存在35℃下4週之後，該等rAAV粒子之相對效能百分比為至少約30%、至少約40%、至少約50%或至少60%，其中參考rAAV粒子係儲存在-70℃下具有0.001%泊洛沙姆188之DPBS緩衝液中。 60. 一種製造包含重組腺相關病毒(rAAV)粒子之穩定調配物之方法，其包含將rAAV粒子與如段落1至47中任一項之調配物之緩衝劑、糖、鹽、視情況選用之塑化劑及視情況選用之非離子性界面活性劑組合，從而製造包含rAAV之調配物。 61. 一種降低rAAV粒子釋放rAAV基因組之方法，其包含製造含rAAV粒子、緩衝劑、糖、鹽及視情況選用之非離子性界面活性劑之調配物，其中該等rAAV粒子在三個凍融循環之後釋放之rAAV基因組比不包含糖之調配物中釋放之rAAV基因組減少。 62. 一種降低rAAV粒子釋放rAAV基因組之方法，其包含製造含rAAV粒子、緩衝劑、糖、鹽及視情況選用之非離子性界面活性劑之調配物，其中該等rAAV粒子在凍乾及復原之後釋放之rAAV基因組比不包含糖之調配物中釋放之rAAV基因組減少。 63. 如段落61或62之方法，其進一步包含凍乾該調配物以達成約1%與約5%之間的殘餘水分含量。 64. 一種降低rAAV粒子釋放rAAV基因組之方法，其包含製造含rAAV粒子、緩衝劑、糖、鹽、塑化劑及視情況選用之非離子性界面活性劑之調配物，其中該等rAAV粒子在三個凍融循環之後釋放之rAAV基因組比不包含糖之調配物中釋放之rAAV基因組減少。 65. 一種降低rAAV粒子釋放rAAV基因組之方法，其包含製造含rAAV粒子、緩衝劑、糖、鹽、塑化劑及視情況選用之非離子性界面活性劑之調配物，其中該等rAAV粒子在凍乾及復原之後釋放之rAAV基因組比不包含糖之調配物中釋放之rAAV基因組減少。 66. 一種以糖於降低rAAV粒子釋放rAAV基因組上之用途，其包含製造含rAAV粒子、緩衝劑、糖、鹽及視情況選用之非離子性界面活性劑之調配物，其中該等rAAV粒子在三個凍融循環之後釋放之rAAV基因組比不包含糖之調配物中釋放之rAAV基因組減少。 67. 一種以糖於降低rAAV粒子釋放rAAV基因組上之用途，其包含製造含rAAV粒子、緩衝劑、糖、鹽及視情況選用之非離子性界面活性劑之調配物，其中該等rAAV粒子在凍乾及復原之後釋放之rAAV基因組比不包含糖之調配物中釋放之rAAV基因組減少。 68. 如段落66或67之用途，其進一步包含凍乾該調配物以達成約1%與約7%之間的殘餘水分含量。 69. 一種以塑化劑於降低rAAV粒子釋放rAAV基因組上之用途，其包含製造含rAAV粒子、緩衝劑、糖、鹽、塑化劑及視情況選用之非離子性界面活性劑之調配物，其中該等rAAV粒子在三個凍融循環之後釋放之rAAV基因組比不包含糖之調配物中釋放之rAAV基因組減少。 70. 一種以塑化劑於降低rAAV粒子釋放rAAV基因組上之用途，其包含製造含rAAV粒子、緩衝劑、糖、鹽、塑化劑及視情況選用之非離子性界面活性劑之調配物，其中該等rAAV粒子在凍乾及復原之後釋放之rAAV基因組比不包含糖之調配物中釋放之rAAV基因組減少。 71. 如段落61至65中任一項之方法或如段落66至70中任一項之用途，其中藉由量測在存在DNA特異性螢光染色劑下之相對螢光來測定rAAV基因組釋放。 72. 如段落61至65及71中任一項之方法或如段落66至71中任一項之用途，其中冷凍誘發之rAAV基因組釋放降低了至少約10%、20%、50%、80%或90%。 73. 如段落61至65及71中任一項之方法或如段落66至71中任一項之用途，其中實質上消除冷凍誘發之rAAV基因組釋放。 74. 如段落61至65及71至73中任一項之方法或如段落66至73中任一項之用途，其中該糖為非還原糖。 75. 如段落74之方法或如段落74之用途，其中該非還原糖為蔗糖、海藻糖或棉子糖。 76. 如段落74之方法或如段落74之用途，其中該非還原糖為蔗糖。 77. 如段落61至65及71至73中任一項之方法或如段落66至73中任一項之用途，其中該糖為還原糖。 78. 如段落77之方法或如段落77之用途，其中該還原糖為葡萄糖、果糖、甘露糖、半乳糖或乳糖。 79. 如段落77之方法或如段落77之用途，其中該還原糖為右旋糖。 80. 如段落61至65及71至79中任一項之方法或如段落66至79中任一項之用途，其中該塑化劑包含甘油。 81. 如段落61至65及71至80中任一項之方法或如段落66至80中任一項之用途，其中該調配物係根據1至47中之任一項。 4.1.2 集合2 1. 一種穩定調配物，其包含重組腺相關病毒(rAAV)粒子，及 a)     緩衝劑， b)     糖，及 c)     非晶形鹽， 其中該調配物適合於凍乾。 2. 如段落1之調配物，其中該緩衝劑包含約1 mM與約50 mM之間的Tris。 3. 如段落2之調配物，其包含約1 mM與約30 mM之間、約1 mM與約20 mM之間、約5 mM與約30 mM之間、約5 mM與約20 mM之間、約10 mM與約30 mM之間、約10 mM與約20 mM之間或約20 mM與約50 mM之間的Tris。 4. 如段落2之調配物，其包含約1 mM、約2 mM、約3 mM、約5 mM、約10 mM、約15 mM、約20 mM、約25 mM、約30 mM或約40 mM Tris。 5. 如段落2之調配物，其包含約5 mM Tris。 6. 如段落1至4中任一項之調配物，其中該非晶形鹽為檸檬酸鈉。 7. 如段落1至4中任一項之調配物，其中該非晶形鹽為硫酸鈉。 8. 如段落1至4中任一項之調配物，其中該非晶形鹽為硫酸銨。 9. 如段落1至4中任一項之調配物，其中該非晶形鹽為硫酸鎂。 10. 如段落1至4中任一項之調配物，其中該非晶形鹽為檸檬酸鈉、硫酸鈉、硫酸銨、硫酸鎂或其組合。 11. 如段落1至4中任一項之調配物，其包含檸檬酸鈉。 12. 如段落1至4中任一項之調配物，其包含硫酸鈉。 13. 如段落1至4中任一項之調配物，其包含硫酸銨。 14. 如段落1至4中任一項之調配物，其包含硫酸鎂。 15. 如段落1至4中任一項之調配物，其包含檸檬酸鈉、硫酸鈉、硫酸銨、硫酸鎂或其組合。 16. 如段落1至4中任一項之調配物，其中該調配物包含約10 mM、約20 mM、約30 mM、約40 mM、約50 mM、約60 mM、約70 mM、約80 mM、約90 mM、約100 mM、約120 mM、約140 mM、約150 mM或約200 mM硫酸鈉。 17. 如段落1至16中任一項之調配物，其具有約6.5與8.0之間的pH。 18. 如段落17之調配物，其具有約7.2與7.8之間的pH。 19. 如段落17之調配物，其具有約7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7或7.8之pH。 20. 如段落17之調配物，其具有約7.5之pH。 21. 如段落1至20中任一項之調配物，其包含約50 mM與約400 mM之間的糖。 22. 如段落21之調配物，其包含約50 mM與約350 mM之間、約50 mM與約300 mM之間、約50 mM與約250 mM之間、約50 mM與約200 mM之間或約50 mM與約150 mM之間的糖。 23. 如段落21之調配物，其包含約100 mM與約400 mM之間、約150 mM與約400 mM之間、約200 mM與約400 mM之間、約250 mM與約400 mM之間或約300 mM與約400 mM之間的糖。 24. 如段落21之調配物，其包含約100 mM與約300 mM之間、約150 mM與約250 mM之間、約200 mM與約300 mM之間或約250 mM與約350 mM之間的糖。 25. 如段落21之調配物，其包含約50 mM、約100 mM、約150 mM、約160 mM、約170 mM、約180 mM、約190 mM、約200 mM、約210 mM、約220 mM、約230 mM、約240 mM、約250 mM、約260 mM、約270 mM、約280 mM、約290 mM、約300 mM或約350 mM糖。 26. 如段落21之調配物，其包含約190 mM與約230 mM之間、約170 mM與約250 mM之間或約150 mM與約270 mM之間的糖。 27. 如段落21之調配物，其包含約210 mM糖。 28. 如段落1至27中任一項之調配物，其中該糖為非還原糖。 29. 如段落28之調配物，其中該非還原糖為蔗糖、海藻糖或棉子糖。 30. 如段落28之調配物，其中該非還原糖為蔗糖。 31. 如段落1至27中任一項之調配物，其中該糖為還原糖。 32. 如段落31之調配物，其中該還原糖為葡萄糖、果糖、甘露糖、半乳糖或乳糖。 33. 如段落1至32中任一項之調配物，其包含小於約100 mM檸檬酸鈉。 34. 如段落33之調配物，其包含約10 mM與約100 mM之間的檸檬酸鈉。 35. 如段落33之調配物，其包含約10 mM與約100 mM之間、約20 mM與約100 mM之間、約30 mM與約100 mM之間、約40 mM與約100 mM之間、約50 mM與約100 mM之間、約10 mM與約80 mM之間、約10 mM與約60 mM之間、約10 mM與約50 mM之間、約10 mM與約40 mM之間或約10 mM與約30 mM之間的檸檬酸鈉。 36. 如段落33之調配物，其包含約10 mM與約50 mM之間、約20 mM與約60 mM之間、約30 mM與約70 mM之間或約10 mM與約30 mM之間的檸檬酸鈉。 37. 如段落33之調配物，其包含約10 mM、約20 mM、約30 mM、約40 mM、約50 mM或約60 mM檸檬酸鈉。 38. 如段落33之調配物，其包含約20 mM檸檬酸鈉。 39. 如段落1至38中任一項之調配物，其進一步包含約0.0005%與約0.01%之間的非離子性界面活性劑。 40. 如段落39之調配物，包含約0.002%非離子性界面活性劑。 41. 如段落38或段落39之調配物，其中該非離子性界面活性劑包含泊洛沙姆(poloxamer) 188、泊洛沙姆407、聚山梨醇酯80、聚山梨醇酯20、普洛尼克(Pluronic) F-68或BRIJ 35。 42. 如段落41之調配物，其中該非離子性界面活性劑包含泊洛沙姆188。 43. 一種穩定調配物，其包含重組腺相關病毒(rAAV)粒子，及 a)     約1 mM與約25 mM之間的Tris， b)     約50 mM與約400 mM之間的糖， c)     約10 mM與約100 mM之間的檸檬酸鈉，及 d)     約0.0005%與約0.01%之間的非離子性界面活性劑， 其中該調配物具有約7.2與約7.8之間的pH。 44. 一種穩定調配物，其包含重組腺相關病毒(rAAV)粒子，及 a)     約2 mM與約10 mM之間的Tris， b)     約150 mM與約250 mM之間的糖， c)     約10 mM與約20 mM之間的檸檬酸鈉，及 d)     約0.001%與約0.005%之間的非離子性界面活性劑， 其中該調配物具有約7.2與約7.8之間的pH。 45. 一種穩定調配物，其包含重組腺相關病毒(rAAV)粒子，及 a)     約5 mM Tris， b)     約210 mM糖， c)     約20 mM檸檬酸鈉，及 d)     約0.002%非離子性界面活性劑， 其中該調配物具有約7.5之pH。 46. 如段落43至45中任一項之調配物，其中該糖為非還原糖。 47. 如段落46之調配物，其中該非還原糖為蔗糖、海藻糖或棉子糖。 48. 如段落47之調配物，其中該非還原糖為蔗糖。 49. 一種穩定調配物，其包含重組腺相關病毒(rAAV)粒子，及 a)     約5 mM Tris， b)     約210 mM蔗糖， c) 約20 mM檸檬酸鈉，及 d)     約0.002% (w/v)泊洛沙姆188。 50. 一種穩定調配物，其包含重組腺相關病毒(rAAV)粒子，及 a) 約5 mM Tris， b) 約210 mM蔗糖， c)     約20 mM檸檬酸鈉， d)     約0.002% (w/v)泊洛沙姆188，及 e)     約0.25% (w/v)甘油。 51. 一種穩定調配物，其包含重組腺相關病毒(rAAV)粒子，及 a) 約5 mM Tris， b) 約210 mM蔗糖， c) 約20 mM檸檬酸鈉， d) 約0.002% (w/v)泊洛沙姆188，及 e)     約0.5% (w/v)山梨糖醇。 52. 一種穩定調配物，其包含重組腺相關病毒(rAAV)粒子，及 a) 約5 mM Tris， b)     約30 mM硫酸鈉， c)     約263 mM蔗糖，及 d)     約0.005% (w/v)泊洛沙姆188。 53. 如段落1至52中任一項之調配物，其中該調配物適合於凍乾。 54. 如段落1至53中任一項之調配物，其中該調配物具有約7.5之pH。 55. 如段落1至53中任一項之調配物，其中該調配物具有約7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7或7.8之pH。 56. 如段落1至53中任一項之調配物，其中該調配物具有約7.1之pH。 57. 如段落1至53中任一項之調配物，其中該調配物具有約6.5與約8.0之間的pH。 58. 如段落1至53中任一項之調配物，其中該調配物具有約7.2與約7.8之間的pH。 59. 如段落1至58中任一項之調配物，其中該調配物包含約1.0E+11個基因組複本/毫升(GC/mL)與約1.0E+15個GC/mL之間的rAAV粒子。 60. 如段落59之調配物，其中該調配物包含約1.0E+11個GC/mL、約1.0E+12個GC/mL、約1.0E+13個GC/mL、約1.0E+14個GC/mL或約1.0E+15個GC/mL rAAV粒子。 61. 如段落1至60中任一項之調配物，其中該等rAAV粒子包含以下之衣殼蛋白質：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV-11、AAV-12、AAV-13、AAV-14、AAV-15及AAV-16、rAAV.rh8、rAAV.rh10、rAAV.rh20、rAAV.rh39、rAAV.Rh74、rAAV.RHM4-1、AAV.hu37、rAAV.Anc80、rAAV.Anc80L65、rAAV.7m8、rAAV.PHP.B、rAAV2.5、rAAV2tYF、rAAV3B、rAAV.LK03、AAV.HSC1、AAV.HSC2、AAV.HSC3、AAV.HSC4、AAV.HSC5、AAV.HSC6、AAV.HSC7、AAV.HSC8、AAV.HSC9、AAV.HSC10、AAV.HSC11、AAV.HSC12、AAV.HSC13、AAV.HSC14、AAV.HSC15或AAV.HSC16。 62. 如段落61之調配物，其中該等rAAV粒子包含AAV-8或AAV-9血清型之衣殼蛋白質。 63. 如段落1至62中任一項之調配物，其進一步包含選自由甘油或山梨糖醇組成之群之穩定劑。 64. 如段落1至62中任一項之調配物，其進一步包含甘油。 65. 如段落1至62中任一項之調配物，其包含約0.1%與約5%之間的甘油。 66. 如段落1至62中任一項之調配物，其包含約0.1%與約2%之間的甘油。 67. 如段落1至62中任一項之調配物，其包含約0.25%與約2%之間的甘油。 68. 如段落1至62中任一項之調配物，該調配物不包含甘露醇。 69. 如段落1至62中任一項之調配物，該調配物包含小於10 mM、20 mM、50 mM、100 mM或150 mM甘露醇。 70. 如段落1至69中任一項之調配物，其為凍乾前調配物。 71. 如段落70之調配物，其具有約1%與約7%之間的殘餘水分含量。 72. 如段落71之調配物，其中該殘餘水分含量在約1%與約7%之間、約2%與約7%之間、約3%與約7%之間、約4%與約7%之間、約5%與約7%之間、約1%與約6%之間、約1%與約5%之間、約1%與約4%之間或約1%與約3%之間。 73. 如段落71之調配物，其中該殘餘水分含量在約3%與約7%之間、約3%與約6%之間或約3%與約5%之間。 74. 如段落71之調配物，其中該殘餘水分含量為約3%、約3.5%、約4%、約4.5%、約5%、約5.5%或約6%。 75. 如段落71之調配物，其中該水分含量在約1%至約2%之間。 76. 如段落71之調配物，其中該水分含量為約1.5%、約1.4%、約1.3%、約1.2%或約1.1%。 77. 如段落71之調配物，其中該水分含量為約1%。 78. 如段落1至77中任一項之調配物，其中該調配物之凍乾餅之玻璃轉化溫度(Tg)高於35℃。 79. 如段落1至77中任一項之調配物，其中該調配物之最大冷凍濃縮溶液之玻璃轉化溫度(Tg')高於-40℃。 80. 如段落1至77中任一項之調配物，其中在將該調配物儲存在室溫下3個月之後，該等rAAV粒子之相對效能百分比為至少約60%、至少約70%或至少約80%；其中參考rAAV粒子係儲存在-70℃下具有0.001%泊洛沙姆188之DPBS緩衝液中。 81. 如段落1至77中任一項之調配物，其中在將該調配物儲存在室溫下6個月之後，該等rAAV粒子之相對效能百分比為至少約60%、至少約70%或至少約80%；其中參考rAAV粒子係儲存在-70℃下具有0.001%泊洛沙姆188之杜爾貝科氏(Dulbecco's)磷酸鹽緩衝鹽水(DPBS)緩衝液中。 82. 如段落1至77中任一項之調配物，其中在將該調配物儲存在35℃下1週之後，該等rAAV粒子之相對效能百分比為至少約30%、至少約40%、至少約50%或至少60%，其中參考rAAV粒子係儲存在-70℃下具有0.001%泊洛沙姆188之DPBS緩衝液中。 83. 如段落1至77中任一項之調配物，其中在將該調配物儲存在35℃下2週之後，該等rAAV粒子之相對效能百分比為至少約30%、至少約40%、至少約50%或至少60%，其中參考rAAV粒子係儲存在-70℃下具有0.001%泊洛沙姆188之DPBS緩衝液中。 84. 如段落1至77中任一項之調配物，其中在將該調配物儲存在35℃下4週之後，該等rAAV粒子之相對效能百分比為至少約30%、至少約40%、至少約50%或至少60%，其中參考rAAV粒子係儲存在-70℃下具有0.001%泊洛沙姆188之DPBS緩衝液中。 85. 如段落79至84中任一項之調配物，其中在儲存前將該調配物凍乾。 86. 如段落85之調配物，其中在儲存之後復原該凍乾調配物。 87. 如段落1至77中任一項之調配物，其中該等rAAV粒子在凍乾之後當下之相對效能百分比為至少約25%、至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%或至少約99%。 88. 如段落1至77中任一項之調配物，其中相較於參考調配物中rAAV粒子之聚集程度，該調配物之rAAV粒子之聚集程度降低約10%、約20%、約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、約90%或約100%。 89. 如段落1至77中任一項之調配物，其中藉由載體基因組含量或病毒效價分析來評定該調配物之穩定性，其中相較於儲存在相同條件下之參考調配物之基因組含量，在將該調配物儲存1天、2天、3天、4天、5天、6天、1週、2週、3週、4週、1個月、2個月、3個月、4個月、5個月、6個月、7個月、8個月、9個月、10個月、11個月、1年、2年或3年之後，該調配物具有提高至少約5%、約10%、約20%、約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、約90%、約100%、約200%、約300%或約500%的基因組含量。 90. 如段落1至77中任一項之調配物，其中藉由量測該調配物之相對效能來評定該調配物之穩定性，其中相較於儲存在相同條件下之參考調配物之基因組含量，在將該調配物儲存1天、2天、3天、4天、5天、6天、1週、2週、3週、4週、1個月、2個月、3個月、4個月、5個月、6個月、7個月、8個月、9個月、10個月、11個月、1年、2年或3年之後，該調配物具有提高至少約5%、約10%、約20%、約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、約90%、約100%、約200%、約300%或約500%的相對效能。 91. 如段落1至77中任一項之調配物，其中藉由感染力損失來評定該調配物之穩定性，其中相較於儲存在相同條件下之參考調配物之感染力損失，在將該調配物儲存1天、2天、3天、4天、5天、6天、1週、2週、3週、4週、1個月、2個月、3個月、4個月、5個月、6個月、7個月、8個月、9個月、10個月、11個月、1年、2年或3年之後，該調配物具有減低至少約5%、約10%、約20%、約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、約90%、約100%、約200%、約300%或約500%的感染力損失。 92. 如段落1至77中任一項之調配物，其中藉由rAAV基因組釋放來評定該調配物之穩定性，其中藉由量測DNA特異性螢光染色劑之相對螢光偏好來測定該rAAV基因組釋放，且其中相較於儲存在相同條件下之參考調配物之相對螢光水準，在將該調配物儲存1天、2天、3天、4天、5天、6天、1週、2週、3週、4週、1個月、2個月、3個月、4個月、5個月、6個月、7個月、8個月、9個月、10個月、11個月、1年、2年或3年之後，該調配物具有減低至少約5%、約10%、約20%、約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、約90%、約100%、約200%、約300%或約500%的相對螢光水準。 93. 如段落89至92中任一項之調配物，其中在儲存之前將該調配物凍乾。 94. 如段落93之調配物，其中在儲存之後復原該凍乾調配物。 95. 如段落89至94中任一項之調配物，其中將該調配物儲存在-80℃、-70℃、-20℃、4℃、20℃、25℃、30℃、35℃或40℃下。 96. 如段落88至95中任一項之調配物，其中該參考調配物為具有0.001%泊洛沙姆188之DPBS緩衝液。 97. 如段落88至96中任一項之調配物，其中該參考調配物為不包含糖之調配物。 98. 如段落88至97中任一項之調配物，其中該參考調配物為不包含塑化劑之調配物。 99. 如段落1至98中任一項之調配物，其中在凍乾過程中將該調配物冷凍至約-20℃之溫度。 100. 如段落1至99中任一項之調配物，其中當冷凍降至-20℃時，該冷凍調配物保持約pH 6至約pH 9之間的pH。 101. 如段落1至99中任一項之調配物，其中當冷凍降至-20℃時，該冷凍調配物保持在冷凍前之pH值±1單位範圍內之pH值。 102. 如段落1至101中任一項之調配物，其為凍乾用之rAAV之穩定水性調配物。 103. 一種製造包含重組腺相關病毒(rAAV)粒子之穩定調配物之方法，其包含將rAAV粒子與如段落1至100中任一項之調配物之緩衝劑、糖、鹽、視情況選用之塑化劑及視情況選用之非離子性界面活性劑組合，從而製造包含rAAV之調配物。 104. 一種降低rAAV粒子釋放rAAV基因組之方法，其包含製造含rAAV粒子、緩衝劑、糖、鹽及視情況選用之非離子性界面活性劑之調配物，其中該等rAAV粒子在三個凍融循環之後釋放之rAAV基因組比不包含糖之調配物中釋放之rAAV基因組減少。 105. 一種降低rAAV粒子釋放rAAV基因組之方法，其包含製造含rAAV粒子、緩衝劑、糖、鹽及視情況選用之非離子性界面活性劑之調配物，其中該等rAAV粒子在凍乾及復原之後釋放之rAAV基因組比不包含糖之調配物中釋放之rAAV基因組減少。 106. 如段落104或105之方法，其進一步包含凍乾該調配物以達成約1%與約5%之間的殘餘水分含量。 107. 一種降低rAAV粒子釋放rAAV基因組之方法，其包含製造含rAAV粒子、緩衝劑、糖、鹽、塑化劑及視情況選用之非離子性界面活性劑之調配物，其中該等rAAV粒子在三個凍融循環之後釋放之rAAV基因組比不包含糖之調配物中釋放之rAAV基因組減少。 108. 一種降低rAAV粒子釋放rAAV基因組之方法，其包含製造含rAAV粒子、緩衝劑、糖、鹽、塑化劑及視情況選用之非離子性界面活性劑之調配物，其中該等rAAV粒子在凍乾及復原之後釋放之rAAV基因組比不包含糖之調配物中釋放之rAAV基因組減少。 109. 一種以糖於降低rAAV粒子釋放rAAV基因組上之用途，其包含製造含rAAV粒子、緩衝劑、糖、鹽及視情況選用之非離子性界面活性劑之調配物，其中該等rAAV粒子在三個凍融循環之後釋放之rAAV基因組比不包含糖之調配物中釋放之rAAV基因組減少。 110. 一種以糖於降低rAAV粒子釋放rAAV基因組上之用途，其包含製造含rAAV粒子、緩衝劑、糖、鹽及視情況選用之非離子性界面活性劑之調配物，其中該等rAAV粒子在凍乾及復原之後釋放之rAAV基因組比不包含糖之調配物中釋放之rAAV基因組減少。 111. 如段落109或110之用途，其進一步包含凍乾該調配物以達成約1%與約7%之間的殘餘水分含量。 112. 一種以塑化劑於降低rAAV粒子釋放rAAV基因組上之用途，其包含製造含rAAV粒子、緩衝劑、糖、鹽、塑化劑及視情況選用之非離子性界面活性劑之調配物，其中該等rAAV粒子在三個凍融循環之後釋放之rAAV基因組比不包含糖之調配物中釋放之rAAV基因組減少。 113. 一種以塑化劑於降低rAAV粒子釋放rAAV基因組上之用途，其包含製造含rAAV粒子、緩衝劑、糖、鹽、塑化劑及視情況選用之非離子性界面活性劑之調配物，其中該等rAAV粒子在凍乾及復原之後釋放之rAAV基因組比不包含糖之調配物中釋放之rAAV基因組減少。 114. 如段落104至108中任一項之方法或如段落109至113中任一項之用途，其中藉由量測在存在DNA特異性螢光染色劑下之相對螢光，來測定rAAV基因組釋放。 115. 如段落104至108及114中任一項之方法或如段落109至113中任一項之用途，其中冷凍誘發之rAAV基因組釋放降低了至少約10%、20%、50%、80%或90%。 116. 如段落104至108及114中任一項之方法或如段落109至113中任一項之用途，其中實質上消除冷凍誘發之rAAV基因組釋放。 117. 如段落104至108及114至116中任一項之方法或如段落109至116中任一項之用途，其中該糖為非還原糖。 118. 如段落117之方法或如段落117之用途，其中該非還原糖為蔗糖、海藻糖或棉子糖。 119. 如段落117之方法或如段落117之用途，其中該非還原糖為蔗糖。 120. 如段落104至108及114至116中任一項之方法或如段落109至116中任一項之用途，其中該糖為還原糖。 121. 如段落114之方法或如段落114之用途，其中該還原糖為葡萄糖、果糖、甘露糖、半乳糖或乳糖。 122. 如段落120之方法或如段落120之用途，其中該還原糖為右旋糖。 123. 如段落103至109及114至122中任一項之方法或如段落74至97中任一項之用途，其中該塑化劑包含甘油。 124. 如段落103至109及114至123中任一項之方法或如段落74至98中任一項之用途，其中該調配物係根據段落1至102中任一項。 125. 一種製造rAAV產物之穩定的凍乾調配物之方法，其包含使凍乾前調配物經過凍乾之步驟，其中凍乾前調配物係根據段落1至102中任一項。 126. 一種治療或預防疾病之方法，該方法包含向有需要之個體投與治療有效劑量之rAAV調配物，該rAAV調配物為經復原之穩定的凍乾調配物，其中該穩定的凍乾調配物之該凍乾前調配物係根據段落1至102中任一項。
相關申請案之交叉參考
本申請案主張2019年4月19日申請之美國臨時申請案第62/836,115號之權益，該申請案以全文引用之方式併入本文中。對以電子方式提交之序列表之參考
本申請案以引用之方式併入隨本申請案一起提交之序列表，該序列表呈文字檔案形式，創建於2020年4月16日，標題為「12656-131-228_Sequence_Listing.txt」，且具有70,092位元組之大小。
本文提供調配物，其包含rAAV粒子。在一些實施例中，本文所揭示之調配物包含緩衝劑、一或多種穩定劑(例如糖、多元醇、胺基酸)、鹽及視情況選用之非離子性界面活性劑。在一些實施例中，本文所揭示之調配物為冷凍調配物或凍乾調配物。在一些實施例中，在冷凍期間，本文所揭示之調配物保持非晶形。在一些實施例中，包含本文所揭示之rAAV粒子之調配物在儲存在室溫下持續延長時間段時為穩定的而無顯著的感染力損失。
在一些實施例中，本文提供穩定調配物、與穩定調配物相關之處理方法及與穩定調配物相關之套組。
在一些實施例中，調配章節6.2中所描述之調配物，使得其具有章節6.2中所描述之一或多個功能特性。在一些實施例中，調配章節6.2中所描述之穩定調配物，使得其具有章節6.2中所描述之一或多個特性。在某些實施例中，本文提供之調配物具有各種優點，例如在凍乾後之改良的穩定性及在各種條件下之改良的長期穩定性。本文亦提供可在章節6.8中使用之分析。本發明人出乎意料地發現，防止聚集之最小離子強度要求為AAV血清型依賴性的。可在低於200 mM之離子強度下防止AAV8聚集，且相較於AAV8，AAV9所需之離子強度更小。本發明人已另外出乎意料地發現，在冷凍期間調配物組分之結晶促進自rAAV粒子損失rAAV基因組。據本發明人所知，尚未有對此類型之基因組損失或用於經由調配物研究防止基因組損失之方法的公開報導。本發明人已發現，基因組損失可藉由以下兩種調配方法中之任一者來減輕：(a)用非結晶鹽而非在冷凍期間結晶之鹽來調配；及(b)在調配物中包括抑制結晶之組分(例如糖)。在一些實施例中，本文所揭示之組合物之額外獨特特徵為結合蔗糖使用檸檬酸鈉，其相較於其他鹽為冷凍乾燥處理提供獨特優點。在一些實施例中，本文所揭示之調配物使用阻止在冷凍期間pH位移之緩衝劑。
本發明人已另外出乎意料地發現，在一些實施例中，儘可能地使凍乾rAAV調配物乾燥並不得到乾燥狀態中之最高穩定性。因此，在一些實施例中，本文所揭示之穩定rAAV調配物包含約1%與7%之間的殘餘水分含量。另外，在一些實施例中，不受特定理論束縛，本文所揭示之穩定rAAV調配物包含可充當乾燥狀態中之水取代物之塑化劑(例如甘油)。 6.1 定義
除非另外定義，否則本文所用之所有技術及科學術語均具有與本發明所屬領域之一般技術者通常所理解相同之含義。為了促進對所揭示之方法之理解，在下文中定義多個術語及片語。
修飾例如在本文提供之方法中所採用之組合物中之成分之數量、組合物中之成分之濃度、流速、rAAV粒子產量、饋料體積、鹽濃度及類似值及其範圍之「約」，係指數值數量可例如經由以下而發生之變化：經由用於製備濃縮物或使用溶液所使用之通常量測及處理程序；經由此等程序中之無意誤差；經由用於製備組合物或進行方法之成分之製造、來源或純度之差異；及類似考慮。術語「約」亦涵蓋歸因於組合物之老化而與特定初始濃度或混合物不同之量。術語「約」亦涵蓋歸因於混合或處理組合物而與特定初始濃度或混合物不同之量。無論是否由術語「約」修飾，申請專利範圍包括數量的等效物。在一些實施例中，術語「約」係指大於或小於所指示數字或範圍之大致10-20%之範圍。在其他實施例中，「約」係指所指示數字或範圍之±10%。舉例而言，「約10%」指示9%至11%之範圍。在某些實施例中，術語「約」涵蓋所敍述之確切數字。
「AAV」為腺相關病毒之縮寫，且可用於指病毒本身或其變體、衍生物或假型。除非另有要求，否則該術語覆蓋所有子類型及天然存在及重組形式兩者。縮寫「rAAV」係指重組腺相關病毒。術語「AAV」包括1型AAV (AAV-1)、2型AAV (AAV-2)、3型AAV (AAV-3)、4型AAV (AAV-4)、5型AAV (AAV-5)、6型AAV (AAV-6)、7型AAV (AAV-7)、8型AAV (AAV-8)、9型AAV (AAV-9)禽類AAV、牛AAV、犬AAV、馬AAV、靈長類AAV、非靈長類AAV及綿羊AAV，及其變體、衍生物或假型。「靈長類AAV」係指感染靈長類動物之AAV，「非靈長類AAV」係指感染非靈長類哺乳動物之AAV，「牛AAV」係指感染牛類哺乳動物之AAV等。
「重組」當應用於AAV粒子時意謂，AAV粒子為產生不同於自然界中之AAV粒子之AAV粒子構築體的一或多個程序的產物。
重組腺相關病毒粒子「rAAV粒子」係指包括至少一種AAV衣殼蛋白及所包裹之聚核苷酸rAAV載體之病毒粒子，該聚核苷酸rAAV載體包含異源聚核苷酸(亦即，除野生型AAV基因組以外之聚核苷酸，諸如待遞送至哺乳動物細胞之轉殖基因)。rAAV粒子可具有任何AAV血清型，包括任何變體、衍生物或假型(例如AAV-1、AAV-2、AAV-3、AAV-4、AAV-5、AAV-6、AAV-7、AAV-8、AAV-9或AAV-10，或其衍生物/變體/假型)。此類AAV血清型及衍生物/變體/假型以及製造此類血清型/衍生物/變體/假型之方法為此項技術中已知的(參見例如Asokan等人, Mol. Ther.  20(4):699-708 (2012)。
本發明之rAAV粒子可具有任何血清型或血清型之任何組合(例如包含兩個或更多個血清型，例如包含rAAV2、rAAV8及rAAV9粒子中之兩者或更多者之rAAV粒子群體)。在一些實施例中，rAAV粒子為rAAV1、rAAV2、rAAV3、rAAV4、rAAV5、rAAV6、rAAV7、rAAV8、rAAV9、rAAV10或其他rAAV粒子，或其兩者或更多者之組合。在一些實施例中，rAAV粒子為rAAV8或rAAV9粒子。
在一些實施例中，rAAV粒子具有選自由以下組成之群之血清型之AAV衣殼蛋白：AAV-1、AAV-2、AAV-3、AAV-4、AAV-5、AAV-6、AAV-7、AAV-8、AAV-9、AAV-10、AAV-11、AAV-12、AAV-13、AAV-14、AAV-15及AAV-16，或其衍生物、變體或假型。在一些實施例中，rAAV粒子具有以下之血清型之AAV衣殼蛋白：AAV-8、AAV-9或其衍生物、變體或假型。
如本文所用，術語「純化(purifying/purification)」、「分開(separate/separating/separation)」、「分離(isolate/isolating/isolation)」係指增加來自包含目標產物及一或多種雜質之樣本之rAAV粒子的純度。通常，藉由自樣本移除(完全或部分地)至少一種雜質來增加目標產物之純度。在一些實施例中，藉由使用本文中所描述之方法自樣本移除(完全或部分地)一或多種雜質來增加樣本中之rAAV之純度。
除非上下文另外清楚指出，否則如本發明及申請專利範圍中所用，單數形式「一(a/an)」及「該(the)」包括複數形式。
應理解，當本文中用語言「包含」描述實施例時，亦提供用術語「由……組成」及/或「基本上由……組成」描述之其他類似實施例。亦應理解，當本文中用語言「基本上由……組成」描述實施例時，亦提供用術語「由……組成」描述之其他類似實施例。
如在本文中之諸如「A及/或B」之片語中所使用之術語「及/或」意欲包括A及B兩者；A或B；A (單獨)；及B(單獨)。同樣，如在諸如「A、B及/或C」之片語中使用之術語「及/或」意欲涵蓋以下實施例中之每一者：A、B及C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A及C；A及B；B及C；A (單獨)；B (單獨)；及C (單獨)。
在本發明之實施例根據馬庫西群組(Markush group)或其他替代分組進行描述之情況下，所揭示之方法不僅涵蓋整體列出之整個群組，而且亦單獨地涵蓋群組之各成員及主群組之所有可能子群組，且亦涵蓋缺乏一或多個群組成員之主群組。所揭示之方法亦設想明確排除所揭示之方法中之群組成員中任一者之一或多者。 6.2 包含rAAV粒子之調配物
在一些實施例中，本發明提供調配物，其包含重組腺相關病毒(rAAV)粒子及緩衝劑、糖及鹽。在一些實施例中，鹽為醫藥學上可接受之鹽。在一些實施例中，鹽為非結晶性非晶形鹽。在一些實施例中，鹽為鈉鹽。在一些實施例中，鹽為檸檬酸鈉、乙酸鈉或氯化鈉。在一些實施例中，鹽為檸檬酸鈉、硫酸鈉、硫酸銨或硫酸鎂。多價鹽，其由具有較高離子強度(相較於氯化單鈉所添加之每分子賦形劑)之多電荷離子構成，可抑制AAV聚集同時使結晶降至最低。因此，含有除氯化單鈉以外之維持組合物之非晶形基質之rAAV調配組合物可能適用。
在一些實施例中，本文所揭示之調配物包含小於約100 mM鹽。在一些實施例中，本文所揭示之調配物包含約10 mM與約100 mM之間的鹽。
在一些實施例中，本文所揭示之調配物包含約10 mM與約100 mM之間、約20 mM與約100 mM之間、約30 mM與約100 mM之間、約40 mM與約100 mM之間、約50 mM與約100 mM之間、約10 mM與約80 mM之間、約10 mM與約60 mM之間、約10 mM與約50 mM之間、約10 mM與約40 mM之間或約10 mM與約30 mM之間的鹽。
在一些實施例中，本文所揭示之調配物包含約10 mM與約50 mM之間、約20 mM與約60 mM之間、約30 mM與約70 mM之間或約10 mM與約30 mM之間的鹽。
在一些實施例中，本文所揭示之調配物包含約10 mM、約20 mM、約30 mM、約40 mM、約50 mM或約60 mM鹽。
在一些實施例中，本文所揭示之調配物包含約20 mM鹽。
在一些實施例中，本文所揭示之調配物包含小於約100 mM檸檬酸鈉。在一些實施例中，本文所揭示之調配物包含約10 mM與約100 mM之間的檸檬酸鈉。
在一些實施例中，本文所揭示之調配物包含約10 mM與約100 mM之間的檸檬酸鈉。在一些實施例中，本文所揭示之調配物包含約20 mM與約100 mM之間的檸檬酸鈉。在一些實施例中，本文所揭示之調配物包含約30 mM與約100 mM之間的檸檬酸鈉。在一些實施例中，本文所揭示之調配物包含約40 mM與約100 mM之間的檸檬酸鈉。在一些實施例中，本文所揭示之調配物包含約50 mM與約100 mM之間的檸檬酸鈉。在一些實施例中，本文所揭示之調配物包含約10 mM與約80 mM之間的檸檬酸鈉。在一些實施例中，本文所揭示之調配物包含約10 mM與約60 mM之間的檸檬酸鈉。在一些實施例中，本文所揭示之調配物包含約10 mM與約50 mM之間的檸檬酸鈉。在一些實施例中，本文所揭示之調配物包含約10 mM與約40 mM之間的檸檬酸鈉。在一些實施例中，本文所揭示之調配物包含約10 mM與約30 mM之間的檸檬酸鈉。
在一些實施例中，本文所揭示之調配物包含約10 mM與約50 mM之間的檸檬酸鈉。在一些實施例中，本文所揭示之調配物包含約20 mM與約60 mM之間的檸檬酸鈉。在一些實施例中，本文所揭示之調配物包含約30 mM與約70 mM之間的檸檬酸鈉。在一些實施例中，本文所揭示之調配物包含約10 mM與約30 mM之間的檸檬酸鈉。
在一些實施例中，本文所揭示之調配物包含約10 mM檸檬酸鈉。在一些實施例中，本文所揭示之調配物包含約20 mM檸檬酸鈉。在一些實施例中，本文所揭示之調配物包含約30 mM檸檬酸鈉。在一些實施例中，本文所揭示之調配物包含約40 mM檸檬酸鈉。在一些實施例中，本文所揭示之調配物包含約50 mM檸檬酸鈉。在一些實施例中，本文所揭示之調配物包含約60 mM檸檬酸鈉。
在一些實施例中，本文所揭示之調配物包含約20 mM檸檬酸鈉。
緩衝劑為此項技術中所熟知的且包括(不限於)：磷酸鹽緩衝液、組胺酸、檸檬酸鈉、HEPES、Tris、二甘胺酸、甘胺酸、N-甘胺醯甘胺酸、乙酸鈉、碳酸鈉、甘胺醯基甘胺酸、離胺酸、精胺酸、磷酸鈉及其混合物。在某些實施例中，緩衝液為組胺酸(例如L-組胺酸)。在一些實施例中，緩衝劑為醫藥學上可接受之緩衝劑。在一些實施例中，緩衝劑包含Tris。
在一些實施例中，本文所揭示之調配物包含約1 mM與約50 mM之間的緩衝劑。在一些實施例中，本文所揭示之調配物包含約1 mM與約30 mM之間、約1 mM與約20 mM之間、約5 mM與約30 mM之間、約5 mM與約20 mM之間、約10 mM與約30 mM之間、約10 mM與約20 mM之間或約20 mM與約50 mM之間的緩衝劑。在一些實施例中，本文所揭示之調配物包含約1 mM、約2 mM、約3 mM、約5 mM、約10 mM、約15 mM、約20 mM、約25 mM、約30 mM或約40 mM之緩衝劑。在一些實施例中，本文所揭示之調配物包含約5 mM之緩衝劑。
在一些實施例中，本文所揭示之調配物包含約1 mM與約50 mM之間的Tris。在一些實施例中，本文所揭示之調配物包含約1 mM與約30 mM之間、約1 mM與約20 mM之間、約5 mM與約30 mM之間、約5 mM與約20 mM之間、約10 mM與約30 mM之間、約10 mM與約20 mM之間或約20 mM與約50 mM之間的Tris。在一些實施例中，本文所揭示之調配物包含約1 mM、約2 mM、約3 mM、約5 mM、約10 mM、約15 mM、約20 mM、約25 mM、約30 mM或約40 mM Tris。在一些實施例中，本文所揭示之調配物包含約5 mM Tris。
在一些實施例中，本文所揭示之調配物包含能夠為本文所揭示之調配物提供在液體及冷凍狀態實質上相同之pH的緩衝劑。
在一些實施例中，本文所揭示之調配物具有約6.5與8.0之間的pH。在一些實施例中，本文所揭示之調配物具有約7.0與8.0之間的pH。在一些實施例中，本文所揭示之調配物具有約7.2與7.8之間的pH。
在一些實施例中，本文所揭示之調配物具有約6.6之pH。在一些實施例中，本文所揭示之調配物具有約6.8之pH。在一些實施例中，本文所揭示之調配物具有約7.0之pH。在一些實施例中，本文所揭示之調配物具有約7.2之pH。在一些實施例中，本文所揭示之調配物具有約7.3之pH。在一些實施例中，本文所揭示之調配物具有約7.4之pH。在一些實施例中，本文所揭示之調配物具有約7.5之pH。在一些實施例中，本文所揭示之調配物具有約7.6之pH。在一些實施例中，本文所揭示之調配物具有約7.7之pH。在一些實施例中，本文所揭示之調配物具有約7.8之pH。
在一些實施例中，本文所揭示之調配物具有約7.5之pH。
在一些實施例中，本文所揭示之調配物在液體及冷凍狀態具有實質上相同的pH。
在一些實施例中，本文所揭示之調配物在液體及冷凍狀態具有約6.5與8.0之間的pH。在一些實施例中，本文所揭示之調配物在液體及冷凍狀態具有約7.0與8.0之間的pH。在一些實施例中，本文所揭示之調配物在液體及冷凍狀態具有約7.2與7.8之間的pH。在一些實施例中，本文所揭示之調配物在液體及冷凍狀態具有約6.6、6.8、7.0或7.2之pH。在一些實施例中，本文所揭示之調配物在液體及冷凍狀態具有約7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7或7.8之pH。在一些實施例中，本文所揭示之調配物在液體及冷凍狀態具有約7.5之pH。
在一些實施例中，本文所揭示之調配物包含非還原糖。在一些實施例中，非還原糖為蔗糖、海藻糖、棉子糖或其組合。在一些實施例中，本文所揭示之調配物包含蔗糖。
在一些實施例中，本文所揭示之調配物包含還原糖。在一些實施例中，還原糖為葡萄糖、果糖、甘露糖、半乳糖、乳糖或其組合。在一些實施例中，本文所揭示之調配物包含右旋糖。
在一些實施例中，本文所揭示之調配物包含約50 mM與約400 mM之間的糖。在一些實施例中，本文所揭示之調配物包含約50 mM與約350 mM之間、約50 mM與約300 mM之間、約50 mM與約250 mM之間、約50 mM與約200 mM之間或約50 mM與約150 mM之間的糖。
在一些實施例中，本文所揭示之調配物包含約100 mM與約400 mM之間、約150 mM與約400 mM之間、約200 mM與約400 mM之間、約250 mM與約400 mM之間或約300 mM與約400 mM之間的糖。
在一些實施例中，本文所揭示之調配物包含約100 mM與約300 mM之間、約150 mM與約250 mM之間、約200 mM與約300 mM之間或約250 mM與約350 mM之間的糖。
在一些實施例中，本文所揭示之調配物包含約50 mM、約100 mM、約150 mM、約160 mM、約170 mM、約180 mM、約190 mM、約200 mM、約210 mM、約220 mM、約230 mM、約240 mM、約250 mM、約260 mM、約270 mM、約280 mM、約290 mM、約300 mM或約350 mM糖。
在一些實施例中，本文所揭示之調配物包含約190 mM與約230 mM之間、約170 mM與約250 mM之間或約150 mM與約270 mM之間的糖。
在一些實施例中，本文所揭示之調配物包含約210 mM糖。
在一些實施例中，本文所揭示之調配物包含約50 mM與約400 mM之間的蔗糖。在一些實施例中，本文所揭示之調配物包含約50 mM與約350 mM之間的蔗糖。在一些實施例中，本文所揭示之調配物包含約50 mM與約300 mM之間的蔗糖。在一些實施例中，本文所揭示之調配物包含約50 mM與約250 mM之間的蔗糖。在一些實施例中，本文所揭示之調配物包含約50 mM與約200 mM之間的蔗糖。在一些實施例中，本文所揭示之調配物包含約50 mM與約150 mM之間的蔗糖。
在一些實施例中，本文所揭示之調配物包含約100 mM與約400 mM之間的蔗糖。在一些實施例中，本文所揭示之調配物包含約150 mM與約400 mM之間的蔗糖。在一些實施例中，本文所揭示之調配物包含約200 mM與約400 mM之間的蔗糖。在一些實施例中，本文所揭示之調配物包含約250 mM與約400 mM之間的蔗糖。在一些實施例中，本文所揭示之調配物包含約300 mM與約400 mM之間的蔗糖。
在一些實施例中，本文所揭示之調配物包含約100 mM與約300 mM之間的蔗糖。在一些實施例中，本文所揭示之調配物包含約150 mM與約250 mM之間的蔗糖。在一些實施例中，本文所揭示之調配物包含約200 mM與約300 mM之間的蔗糖。在一些實施例中，本文所揭示之調配物包含約250 mM與約350 mM之間的蔗糖。
在一些實施例中，本文所揭示之調配物包含約50 mM蔗糖。在一些實施例中，本文所揭示之調配物包含約100 mM蔗糖。在一些實施例中，本文所揭示之調配物包含約150 mM蔗糖。在一些實施例中，本文所揭示之調配物包含約160 mM蔗糖。在一些實施例中，本文所揭示之調配物包含約170 mM蔗糖。在一些實施例中，本文所揭示之調配物包含約180 mM蔗糖。在一些實施例中，本文所揭示之調配物包含約190 mM蔗糖。在一些實施例中，本文所揭示之調配物包含約200 mM蔗糖。在一些實施例中，本文所揭示之調配物包含約210 mM蔗糖。在一些實施例中，本文所揭示之調配物包含約220 mM蔗糖。在一些實施例中，本文所揭示之調配物包含約230 mM蔗糖。在一些實施例中，本文所揭示之調配物包含約240 mM蔗糖。在一些實施例中，本文所揭示之調配物包含約250 mM蔗糖。在一些實施例中，本文所揭示之調配物包含約260 mM蔗糖。在一些實施例中，本文所揭示之調配物包含約270 mM蔗糖。在一些實施例中，本文所揭示之調配物包含約280 mM蔗糖。在一些實施例中，本文所揭示之調配物包含約290 mM蔗糖。在一些實施例中，本文所揭示之調配物包含約300 mM蔗糖。在一些實施例中，本文所揭示之調配物包含約350 mM蔗糖。
在一些實施例中，本文所揭示之調配物包含約190 mM與約230 mM之間的蔗糖。在一些實施例中，本文所揭示之調配物包含約170 mM與約250 mM之間的蔗糖。在一些實施例中，本文所揭示之調配物包含約150 mM與約270 mM之間的蔗糖。
在一些實施例中，本文所揭示之調配物包含約210 mM蔗糖。
在一些實施例中，本文所揭示之調配物包含呈特定比率之糖及鹽。在一些實施例中，糖與鹽之比率為莫耳比。在一些實施例中，糖與鹽之莫耳比為約1、約2、約3、約5、約10、約20、約40或約60。在一些實施例中，糖與鹽之莫耳比在約5與約20之間。在一些實施例中，糖與鹽之莫耳比為約10。在一些實施例中，糖包含蔗糖，且鹽包含檸檬酸鈉。
在一些實施例中，本文所揭示之調配物包含呈特定比率之鹽及糖。在一些實施例中，鹽與糖之比率為重量:重量(w:w)比率。在一些實施例中，鹽與糖之w:w比率為約3:1、約1:1或約1:3。在一些實施例中，鹽與糖之w:w比率在約3:1與約1:3之間。在一些實施例中，鹽與糖之w:w比率為約1:1。在一些實施例中，糖包含蔗糖，且鹽包含檸檬酸鈉。
在一些實施例中，本文所揭示之調配物具有高於對應純糖及純鹽溶液之玻璃轉化溫度之玻璃轉化溫度。在一些實施例中，本文所揭示之調配物包含蔗糖及檸檬酸鈉，且具有高於對應純蔗糖及純鹽檸檬酸鈉之玻璃轉化溫度之玻璃轉化溫度。在一些實施例中本文所揭示之調配物包含約50 mM與約400 mM之間的蔗糖及約10 mM與100 mM之間的檸檬酸鈉。
在一些實施例中，本文所揭示之調配物進一步包含非離子性界面活性劑。醫藥學上可接受之非離子性界面活性劑包括(但不限於)泊洛沙姆188、泊洛沙姆407、聚山梨醇酯80、聚山梨醇酯20、普洛尼克F-68或BRIJ 35。在一些實施例中，本文所揭示之調配物包含泊洛沙姆188、泊洛沙姆407、聚山梨醇酯80、聚山梨醇酯20、普洛尼克F-68、BRIJ 35或其組合。在一些實施例中，本文所揭示之調配物包含泊洛沙姆188。
在一些實施例中，本文所揭示之調配物進一步包含約0.0001%與約0.5%之間的非離子性界面活性劑。在一些實施例中，本文所揭示之調配物進一步包含約0.0005%與約0.1%之間的非離子性界面活性劑。在一些實施例中，本文所揭示之調配物進一步包含約0.001%、約0.002%、約0.003%、約0.004%、約0.005%、約0.007%或約0.01%非離子性界面活性劑。
在一些實施例中，本文所揭示之調配物進一步包含約0.0001%與約0.5%之間的泊洛沙姆188。在一些實施例中，本文所揭示之調配物進一步包含約0.0005%與約0.1%之間的泊洛沙姆188。在一些實施例中，本文所揭示之調配物進一步包含約0.001%、約0.002%、約0.003%、約0.004%、約0.005%、約0.007%或約0.01%泊洛沙姆188。
在一些實施例中，本文所揭示之調配物進一步包含約0.0005%泊洛沙姆188。在一些實施例中，本文所揭示之調配物進一步包含約0.001%泊洛沙姆188。在一些實施例中，本文所揭示之調配物進一步包含約0.002%泊洛沙姆188。在一些實施例中，本文所揭示之調配物進一步包含約0.003%泊洛沙姆188。在一些實施例中，本文所揭示之調配物進一步包含約0.004%泊洛沙姆188。在一些實施例中，本文所揭示之調配物進一步包含約0.005%泊洛沙姆188。在一些實施例中，本文所揭示之調配物進一步包含約0.008%泊洛沙姆188。
在一些實施例中，本文所揭示之調配物進一步包含塑化劑。醫藥學上可接受之塑化劑包括(但不限於)甘油、木糖醇、山梨糖醇及甘露醇。在一些實施例中，本文所揭示之調配物進一步包含甘油、木糖醇、山梨糖醇、甘露醇或其組合。在一些實施例中，本文所揭示之調配物進一步包含甘油。
在一些實施例中，本文所揭示之調配物進一步包含約0.1%與約5%之間的塑化劑。在一些實施例中，本文所揭示之調配物進一步包含約0.1%與約2%之間的塑化劑。在一些實施例中，本文所揭示之調配物進一步包含約0.25%與約2%之間的塑化劑。
在一些實施例中，本文所揭示之調配物進一步包含約0.1%與約5%之間的甘油。在一些實施例中，本文所揭示之調配物進一步包含約0.1%與約2%之間的甘油。在一些實施例中，本文所揭示之調配物進一步包含約0.25%與約2%之間的甘油。
在一些實施例中，本文所揭示之調配物包含約1.0E+11個GC/mL與約1.0E+14個GC/mL之間的rAAV粒子。在一些實施例中，本文所揭示之調配物包含約1.0E+11個GC/mL與約1.0E+15個GC/mL之間的rAAV粒子。在一些實施例中，本文所揭示之調配物包含約1.0E+11個GC/mL、約1.0E+12個GC/mL、約1.0E+13個GC/mL、約1.0E+14個GC/mL或約1.0E+15個GC/mL rAAV粒子。在一些實施例中，rAAV粒子包含以下之衣殼蛋白質：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV-11、AAV-12、AAV-13、AAV-14、AAV-15及AAV-16、rAAV.rh8、rAAV.rh10、rAAV.rh20、rAAV.rh39、rAAV.Rh74、rAAV.RHM4-1、AAV.hu37、rAAV.Anc80、rAAV.Anc80L65、rAAV.7m8、rAAV.PHP.B、rAAV2.5、rAAV2tYF、rAAV3B、rAAV.LK03、AAV.HSC1、AAV.HSC2、AAV.HSC3、AAV.HSC4、AAV.HSC5、AAV.HSC6、AAV.HSC7、AAV.HSC8、AAV.HSC9、AAV.HSC10、AAV.HSC11、AAV.HSC12、AAV.HSC13、AAV.HSC14、AAV.HSC15或AAV.HSC16，或其組合。在一些實施例中，rAAV粒子包含以下之衣殼蛋白質：AAV-8血清型、AAV-9血清型或其組合。
在一些實施例中，本文所揭示之調配物為液體調配物。
在一些實施例中，本文所揭示之調配物為冷凍調配物。
在一些實施例中，本文所揭示之調配物為自本文所揭示之液體調配物凍乾之凍乾調配物。
在一些實施例中，本文所揭示之調配物為經復原之凍乾調配物。
在一些實施例中，本文所揭示之調配物為凍乾前調配物。
在一些實施例中，本文所揭示之調配物為具有約1%與約7%之間的殘餘水分含量之凍乾調配物。在一些實施例中，使用Karl Fischer滴定來測定殘餘水分含量。在一些實施例中，殘餘水分含量在約1%與約7%之間。在一些實施例中，殘餘水分含量在約2%與約7%之間。在一些實施例中，殘餘水分含量在約3%與約7%之間。在一些實施例中，殘餘水分含量在約4%與約7%之間。在一些實施例中，殘餘水分含量在約5%與約7%之間。在一些實施例中，殘餘水分含量在約1%與約6%之間。在一些實施例中，殘餘水分含量在約1%與約5%之間。在一些實施例中，殘餘水分含量在約1%與約4%之間。在一些實施例中，殘餘水分含量在約1%與約3%之間。
在一些實施例中，本文所揭示之調配物為具有約1%與約7%之間的殘餘水分含量之凍乾調配物。在一些實施例中，殘餘水分含量在約3%與約7%之間。在一些實施例中，殘餘水分含量在約3%與約6%之間。在一些實施例中，殘餘水分含量在約3%與約5%之間。
在一些實施例中，本文所揭示之調配物為具有約1%與約7%之間的殘餘水分含量之凍乾調配物。在一些實施例中，殘餘水分含量為約3%。在一些實施例中，殘餘水分含量為約3.5%。在一些實施例中，殘餘水分含量為約4%。在一些實施例中，殘餘水分含量為約4.5%。在一些實施例中，殘餘水分含量為約5%。在一些實施例中，殘餘水分含量為約5.5%。在一些實施例中，殘餘水分含量為約6%。
在本文所揭示之調配物之一些實施例中，在將調配物儲存在室溫下3個月之後，rAAV粒子之相對效能百分比為至少約60%、至少約70%或至少約80%。在本文所揭示之調配物之一些實施例中，在將調配物儲存在室溫下3個月之後，rAAV粒子之相對效能百分比為至少約60%。在本文所揭示之調配物之一些實施例中，在將調配物儲存在室溫下3個月之後，rAAV粒子之相對效能百分比為至少約70%。在本文所揭示之調配物之一些實施例中，在將調配物儲存在室溫下6個月之後，rAAV粒子之相對效能百分比為至少約60%、至少約70%或至少約80%。在本文所揭示之調配物之一些實施例中，在將調配物儲存在室溫下6個月之後，rAAV粒子之相對效能百分比為至少約60%。在本文所揭示之調配物之一些實施例中，在將調配物儲存在室溫下6個月之後，rAAV粒子之相對效能百分比為至少約70%。在本文所揭示之調配物之一些實施例中，在將調配物儲存在35℃下1週之後，rAAV粒子之相對效能百分比為至少約30%、至少約40%、至少約50%或至少60%。在本文所揭示之調配物之一些實施例中，在將調配物儲存在35℃下1週之後，rAAV粒子之相對效能百分比為至少約30%。在本文所揭示之調配物之一些實施例中，在將調配物儲存在35℃下1週之後，rAAV粒子之相對效能百分比為至少約50%。在本文所揭示之調配物之一些實施例中，在將調配物儲存在35℃下2週之後，rAAV粒子之相對效能百分比為至少約30%、至少約40%、至少約50%或至少60%。在本文所揭示之調配物之一些實施例中，在將調配物儲存在35℃下2週之後，rAAV粒子之相對效能百分比為至少約30%。在本文所揭示之調配物之一些實施例中，在將調配物儲存在35℃下2週之後，rAAV粒子之相對效能百分比為至少約50%。在本文所揭示之調配物之一些實施例中，在將調配物儲存在35℃下4週之後，rAAV粒子之相對效能百分比為至少約30%、至少約40%、至少約50%或至少60%。在本文所揭示之調配物之一些實施例中，在將調配物儲存在35℃下4週之後，rAAV粒子之相對效能百分比為至少約30%。在本文所揭示之調配物之一些實施例中，在將調配物儲存在35℃下4週之後，rAAV粒子之相對效能百分比為至少約50%。在一些實施例中，參考rAAV粒子係儲存在-70℃下具有0.001%泊洛沙姆188之DPBS緩衝液中。在一些實施例中，如2018年10月15日申請之標題為「METHODS FOR MEASURING THE INFECTIVITY OF REPLICATION DEFECTIVE VIRAL VECTORS AND VIRUSES」之美國臨時申請案第62/745,859號中所揭示，測定相對效能百分比，該臨時申請案以全文引用之方式併入本文中。在一些實施例中，調配物為冷凍調配物。在一些實施例中，調配物為凍乾調配物。在一些實施例中，調配物為凍乾前調配物。在一些實施例中，調配物為液體調配物。在一些實施例中，調配物包含rAAV粒子及約1 mM與約25 mM之間的Tris、約50 mM與約400 mM之間的蔗糖、約10 mM與約100 mM之間的檸檬酸鈉及約0.0005%與約0.01%之間的非離子性界面活性劑，其中調配物具有約7.2與約7.8之間的pH。
在一些實施例中，本文所揭示之調配物包含rAAV粒子及約1 mM與約25 mM之間的緩衝劑、約50 mM與約400 mM之間的糖、約10 mM與約100 mM之間的檸檬酸鈉及約0.0005%與約0.01%之間的非離子性界面活性劑，其中調配物具有約7.2與約7.8之間的pH。在一些實施例中，緩衝劑包含Tris，且糖包含蔗糖。在一些實施例中，緩衝劑包含Tris，糖包含蔗糖，且非離子性界面活性劑包含泊洛沙姆188。在一些實施例中，緩衝劑包含Tris，糖包含蔗糖，非離子性界面活性劑包含泊洛沙姆188，且調配物進一步包含塑化劑(例如約0.1%與約2%之間的甘油)。在一些實施例中，調配物為冷凍調配物。在一些實施例中，調配物為凍乾調配物。在一些實施例中，調配物為液體調配物。在一些實施例中，rAAV粒子包含rAAV-8、rAAV-9或其組合。在一些實施例中，調配物包含約1.0E+11個GC/mL與約1.0E+14個GC/mL之間的rAAV粒子。在一些實施例中，調配物包含約1.0E+11個GC/mL與約1.0E+15個GC/mL之間的rAAV粒子。
在一些實施例中，本文所揭示之調配物包含rAAV粒子及約2 mM與約10 mM之間的緩衝劑、約150 mM與約250 mM之間的糖、約10 mM與約20 mM之間的檸檬酸鈉及約0.001%與約0.005%之間的非離子性界面活性劑，其中調配物具有約7.2與約7.8之間的pH。在一些實施例中，緩衝劑包含Tris，且糖包含蔗糖。在一些實施例中，緩衝劑包含Tris，糖包含蔗糖，且非離子性界面活性劑包含泊洛沙姆188。在一些實施例中，緩衝劑包含Tris，糖包含蔗糖，非離子性界面活性劑包含泊洛沙姆188，且調配物進一步包含塑化劑(例如約0.1%與約2%之間的甘油)。在一些實施例中，調配物為冷凍調配物。在一些實施例中，調配物為凍乾調配物。在一些實施例中，調配物為液體調配物。在一些實施例中，rAAV粒子包含rAAV-8、rAAV-9或其組合。在一些實施例中，調配物包含約1.0E+11個GC/mL與約1.0E+14個GC/mL之間的rAAV粒子。在一些實施例中，調配物包含約1.0E+11個GC/mL與約1.0E+15個GC/mL之間的rAAV粒子。
在一些實施例中，本文所揭示之調配物包含rAAV粒子及約5 mM之緩衝劑、約210 mM糖、約20 mM檸檬酸鈉及約0.002%非離子性界面活性劑，其中調配物具有約7.5之pH。在一些實施例中，緩衝劑包含Tris，且糖包含蔗糖。在一些實施例中，緩衝劑包含Tris，糖包含蔗糖，且非離子性界面活性劑包含泊洛沙姆188。在一些實施例中，緩衝劑包含Tris，糖包含蔗糖，非離子性界面活性劑包含泊洛沙姆188，且調配物進一步包含塑化劑(例如約0.1%與約2%之間的甘油)。在一些實施例中，調配物為冷凍調配物。在一些實施例中，調配物為凍乾調配物。在一些實施例中，調配物為液體調配物。在一些實施例中，rAAV粒子包含rAAV-8、rAAV-9或其組合。在一些實施例中，調配物包含約1.0E+11個GC/mL與約1.0E+14個GC/mL之間的rAAV粒子。在一些實施例中，調配物包含約1.0E+11個GC/mL與約1.0E+15個GC/mL之間的rAAV粒子。
本文所揭示之調配物可包含含來自任何AAV衣殼血清型之衣殼蛋白質之rAAV粒子。在一些實施例中，rAAV粒子包含來自以下之衣殼蛋白質：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV-11、AAV-12、AAV-13、AAV-14、AAV-15及AAV-16、rAAV.rh8、rAAV.rh10、rAAV.rh20、rAAV.rh39、rAAV.Rh74、rAAV.RHM4-1、AAV.hu37、rAAV.Anc80、rAAV.Anc80L65、rAAV.7m8、rAAV.PHP.B、rAAV2.5、rAAV2tYF、rAAV3B、rAAV.LK03、AAV.HSC1、AAV.HSC2、AAV.HSC3、AAV.HSC4、AAV.HSC5、AAV.HSC6、AAV.HSC7、AAV.HSC8、AAV.HSC9、AAV.HSC10、AAV.HSC11、AAV.HSC12、AAV.HSC13、AAV.HSC14、AAV.HSC15或AAV.HSC16。在一些實施例中，rAAV粒子包含呈以下之衍生物、變體或假型之衣殼蛋白質：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV-11、AAV-12、AAV-13、AAV-14、AAV-15及AAV-16、rAAV.rh8、rAAV.rh10、rAAV.rh20、rAAV.rh39、rAAV.Rh74、rAAV.RHM4-1、AAV.hu37、rAAV.Anc80、rAAV.Anc80L65、rAAV.7m8、rAAV.PHP.B、rAAV2.5、rAAV2tYF、rAAV3B、rAAV.LK03、AAV.HSC1、AAV.HSC2、AAV.HSC3、AAV.HSC4、AAV.HSC5、AAV.HSC6、AAV.HSC7、AAV.HSC8、AAV.HSC9、AAV.HSC10、AAV.HSC11、AAV.HSC12、AAV.HSC13、AAV.HSC14、AAV.HSC15或AAV.HSC16衣殼蛋白質。
在一些實施例中，rAAV粒子包含來自選自AAV-8及AAV-9之AAV衣殼血清型之衣殼蛋白質。在一些實施例中，rAAV粒子具有AAV-8之AAV衣殼血清型。在一些實施例中，rAAV粒子具有AAV-9之AAV衣殼血清型。
在一些實施例中，rAAV粒子包含呈AAV-8或AAV-9衣殼蛋白質之衍生物、變體或假型之衣殼蛋白質。在一些實施例中，rAAV粒子包含具有與AAV-8衣殼蛋白質之VP1、VP2及/或VP3序列至少80%或更高一致之AAV-8衣殼蛋白質的衣殼蛋白質，例如85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%等，亦即至多100%一致。
在一些實施例中，rAAV粒子組合物包含呈AAV-9衣殼蛋白質之衍生物、變體或假型之衣殼蛋白質。在一些實施例中，饋料組合物中之rAAV粒子包含具有與AAV-9衣殼蛋白質之VP1、VP2及/或VP3序列至少80%或更高一致之AAV-9衣殼蛋白質的衣殼蛋白質，例如85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%等，亦即至多100%一致。
在額外實施例中，rAAV粒子包含鑲嵌型衣殼。在額外實施例中，rAAV粒子包含假型化rAAV粒子。在額外實施例中，rAAV粒子包含含有兩個或更多個AAV衣殼血清型之衣殼蛋白質嵌合體之衣殼。
在一些實施例中，本文所揭示之調配物為包含醫藥學上可接受之載劑之醫藥組合物。
如本文所用，術語「醫藥學上可接受」意謂生物學上可接受之調配物、氣態、液體或固體或其混合物，其適合於一或多種投與、活體內遞送或接觸途徑。「醫藥學上可接受之」之組合物為生物學上或其他方面無非所需的材料，例如可向個體投與而不引起實質性非所需生物效應的材料。因此，可例如在向個體投與根據所揭示之方法分離之rAAV中使用此種醫藥組合物。補充活性化合物(例如，防腐劑、抗細菌劑、抗病毒劑及抗真菌劑)可併入至組合物中。如本文中所闡述或熟習此項技術者所知，可將醫藥組合物調配成與特定的投與或遞送途徑相容。因此，藥物組合物包括適合於藉由各種途徑投與之載劑、稀釋劑或賦形劑。適合於本發明之rAAV粒子及方法及用途之醫藥組合物及遞送系統為此項技術中已知的(參見例如Remington: The Science and Practice of Pharmacy (2003) 第20版, Mack Publishing Co., Easton, Pa.；Remington's Pharmaceutical Sciences (1990) 第18版, Mack Publishing Co., Easton, Pa.；The Merck Index (1996) 第12版, Merck Publishing Group, Whitehouse, N.J.；Pharmaceutical Principles of Solid Dosage Forms (1993), Technonic Publishing Co., Inc., Lancaster, Pa.；Ansel及Stoklosa, Pharmaceutical Calculations (2001) 第11版, Lippincott Williams & Wilkins, Baltimore, Md.；及Poznansky等人, Drug Delivery Systems (1980), R. L. Juliano編, Oxford, N.Y., 第253-315頁)。
在一些實施例中，本文所揭示之調配物為適合於需要經由已知方法投與之患者投與的醫藥學上可接受之組合物，該等已知方法諸如靜脈內投與(例如如推注或藉由連續輸注一段時間)，或藉由肌肉內、腹膜內、腦脊髓內、皮下、關節內、滑膜內、鞘內、經口、局部或吸入途徑。在一些實施例中，本文所揭示之調配物適合於全身性或局部投與。全身性投與包括(但不限於)：經口、皮下、腹膜內、皮下、經鼻、舌下或經直腸投與途徑。局部投與包括(但不限於)：局部、皮下、肌肉內、視網膜下、鞘內及腹膜內投與途徑。
在一些實施例中，本文所揭示之調配物為醫藥單位劑量。「單位劑量」係指適用作用於待治療之個體之單一劑量的物理離散單位；含有預定量之各單位視情況與在以一或多次劑量投與時經計算以產生所需效果(例如，防治性或治療效果)的醫藥載劑(賦形劑、稀釋劑、媒劑或填充劑)結合。單位劑型可在例如安瓿及小瓶內，其可包括液體組合物或呈冷凍乾燥或凍乾狀態之組合物；無菌液體載劑，例如其可在投與或活體內遞送之前添加。多劑量套組或容器中可包括個別單位劑型。可將重組型載體(例如AAV)序列、質體、載體基因組及重組病毒粒子及其醫藥組合物封裝在單個或多個單位劑型中，以為了易於投與及劑量均一性。在一些實施例中，組合物包含rAAV粒子，該等rAAV粒子包含來自以下之AAV衣殼蛋白質：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV-11、AAV-12、AAV-13、AAV-14、AAV-15及AAV-16、rAAV.rh8、rAAV.rh10、rAAV.rh20、rAAV.rh39、rAAV.Rh74、rAAV.RHM4-1、AAV.hu37、rAAV.Anc80、rAAV.Anc80L65、rAAV.7m8、rAAV.PHP.B、rAAV2.5、rAAV2tYF、rAAV3B、rAAV.LK03、AAV.HSC1、AAV.HSC2、AAV.HSC3、AAV.HSC4、AAV.HSC5、AAV.HSC6、AAV.HSC7、AAV.HSC8、AAV.HSC9、AAV.HSC10、AAV.HSC11、AAV.HSC12、AAV.HSC13、AAV.HSC14、AAV.HSC15或AAV.HSC16。在一些實施例中，AAV衣殼血清型為AAV-8。在一些實施例中，AAV衣殼血清型為AAV-9。
在一些實施例中，本發明提供製造包含本文所揭示之重組腺相關病毒(rAAV)粒子之調配物之方法，其包含將rAAV粒子與本文所揭示之調配物之緩衝劑、糖、鹽、視情況選用之塑化劑及視情況選用之非離子性界面活性劑組合，從而製造包含rAAV之調配物。用於組合調配物之組分以製造調配物之方法為熟習此項技術者已知的。
在某些實施例中，本文提供一種穩定調配物，其包含重組腺相關病毒(rAAV)粒子及 a)     約5 mM Tris， b)     約210 mM蔗糖， c)     約20 mM檸檬酸鈉，及 d)     約0.002% (w/v)泊洛沙姆188。
在某些實施例中，本文提供一種穩定調配物，其包含重組腺相關病毒(rAAV)粒子及 a)     約5 mM Tris， b)     約210 mM蔗糖， c)     約20 mM檸檬酸鈉， d)     約0.002% (w/v)泊洛沙姆188，及 e)     約0.25% (w/v)甘油。
在某些實施例中，本文提供一種穩定調配物，其包含重組腺相關病毒(rAAV)粒子及 a)     約5 mM Tris， b)     約210 mM蔗糖， c)     約20 mM檸檬酸鈉， d)     約0.002% (w/v)泊洛沙姆188，及 e)     約0.5% (w/v)山梨糖醇。
在某些實施例中，本文提供一種穩定調配物，其包含重組腺相關病毒(rAAV)粒子及 a)     約5 mM Tris， b)     約30 mM硫酸鈉， c)     約263 mM蔗糖，及 d)     約0.005% (w/v)泊洛沙姆188。
在某些實施例中，穩定調配物不包含甘露醇。
在某些實施例中，穩定調配物包含小於10 mM、20 mM、30 mM、40 mM、50 mM、60 mM、70 mM、80 mM、90 mM、100 mM、110 mM、120 mM、130 mM、140 mM或150 mM甘露醇。
在某些實施例中，穩定調配物包含在約210 mM之濃度下之蔗糖。在某些實施例中，穩定調配物包含在約263 mM之濃度下之蔗糖。在某些實施例中，穩定調配物包含在約409 mM之濃度下之蔗糖。在某些實施例中，穩定調配物包含在約14.6 mM之濃度下之蔗糖。在某些實施例中，穩定調配物包含在約45 mM之濃度下之蔗糖。在某些實施例中，穩定調配物包含在約0 mM與約20 mM之間的濃度下之蔗糖。在某些實施例中，穩定調配物包含在約20 mM與約50 mM之間的濃度下之蔗糖。在某些實施例中，穩定調配物包含在約50 mM與約100 mM之間的濃度下之蔗糖。在某些實施例中，穩定調配物包含在約100 mM與約200 mM之間的濃度下之蔗糖。在某些實施例中，穩定調配物包含在約200 mM與約300 mM之間的濃度下之蔗糖。在某些實施例中，穩定調配物包含在約300 mM與約400 mM之間的濃度下之蔗糖。在某些實施例中，穩定調配物包含在約400 mM與約500 mM之間的濃度下之蔗糖。在某些實施例中，穩定調配物包含在約500 mM與約600 mM之間的濃度下之蔗糖。在某些實施例中，穩定調配物包含在約600 mM與約700 mM之間的濃度下之蔗糖。
在某些實施例中，穩定調配物包含在約0.5%之濃度下之山梨糖醇。在某些實施例中，穩定調配物包含在約0.25%之濃度下之山梨糖醇。在某些實施例中，穩定調配物包含在約0.10%之濃度下之山梨糖醇。
在某些實施例中，穩定調配物包含在約0%至約0.10%之濃度下之山梨糖醇。在某些實施例中，穩定調配物包含在約0.10%至約0.20%之濃度下之山梨糖醇。在某些實施例中，穩定調配物包含在約0.20%至約0.30%之濃度下之山梨糖醇。在某些實施例中，穩定調配物包含在約0.30%至約0.40%之濃度下之山梨糖醇。在某些實施例中，穩定調配物包含在約0.40%至約0.50%之濃度下之山梨糖醇。在某些實施例中，穩定調配物包含在約0.50%至約0.60%之濃度下之山梨糖醇。在某些實施例中，穩定調配物包含在約0.60%至約0.70%之濃度下之山梨糖醇。在某些實施例中，穩定調配物包含在約0.70%至約0.80%之濃度下之山梨糖醇。在某些實施例中，穩定調配物包含在約0.80%至約0.90%之濃度下之山梨糖醇。在某些實施例中，穩定調配物包含在約0.90%至約1.00%之濃度下之山梨糖醇。
在某些實施例中，穩定調配物包含在約0.5%之濃度下之甘油。在某些實施例中，穩定調配物包含在約0.25%之濃度下之甘油。在某些實施例中，穩定調配物包含在約0.10%之濃度下之甘油。
在某些實施例中，穩定調配物包含在約0%至約0.10%之濃度下之甘油。在某些實施例中，穩定調配物包含在約0.10%至約0.20%之濃度下之甘油。在某些實施例中，穩定調配物包含在約0.20%至約0.30%之濃度下之甘油。在某些實施例中，穩定調配物包含在約0.30%至約0.40%之濃度下之甘油。在某些實施例中，穩定調配物包含在約0.40%至約0.50%之濃度下之甘油。在某些實施例中，穩定調配物包含在約0.50%至約0.60%之濃度下之甘油。在某些實施例中，穩定調配物包含在約0.60%至約0.70%之濃度下之甘油。在某些實施例中，穩定調配物包含在約0.70%至約0.80%之濃度下之甘油。在某些實施例中，穩定調配物包含在約0.80%至約0.90%之濃度下之甘油。在某些實施例中，穩定調配物包含在約0.90%至約1.00%之濃度下之甘油。
在某些實施例中，穩定調配物包含在約0.001% (重量/體積，0.01 g/L)之濃度下之泊洛沙姆188。在某些實施例中，穩定調配物包含在約0.002% (重量/體積，0.02 g/L)之濃度下之泊洛沙姆188。在某些實施例中，穩定調配物包含在約0.005% (重量/體積，0.05 g/L)之濃度下之泊洛沙姆188。
在某些實施例中，穩定調配物包含在約0.0005% (重量/體積，0.005 g/L)至約0.05% (重量/體積，0.5 g/L)之濃度下之泊洛沙姆188。在某些實施例中，穩定調配物包含在約0.0001% (重量/體積，0.001 g/L)至約0.01% (重量/體積，0.1 g/L)之濃度下之泊洛沙姆188。在某些實施例中，穩定調配物包含在約0.0005% (重量/體積，0.005 g/L)至約0.001% (重量/體積，0.01 g/L)之濃度下之泊洛沙姆188。在某些實施例中，穩定調配物包含在約0.001% (重量/體積，0.01 g/L)至約0.05% (重量/體積，0.5 g/L)之濃度下之泊洛沙姆188。在某些實施例中，穩定調配物包含在約0.0005% (重量/體積，0.005 g/L)之濃度下之泊洛沙姆188。在某些實施例中，穩定調配物包含在約0.0006% (重量/體積，0.006 g/L)之濃度下之泊洛沙姆188。在某些實施例中，穩定調配物包含在約0.0007% (重量/體積，0.007 g/L)之濃度下之泊洛沙姆188。在某些實施例中，穩定調配物包含在約0.0008% (重量/體積，0.008 g/L)之濃度下之泊洛沙姆188。在某些實施例中，穩定調配物包含在約0.0009% (重量/體積，0.009 g/L)之濃度下之泊洛沙姆188。在某些實施例中，穩定調配物包含在約0.001% (重量/體積，0.01 g/L)之濃度下之泊洛沙姆188。在某些實施例中，穩定調配物包含在約0.002% (重量/體積，0.02 g/L)之濃度下之泊洛沙姆188。在某些實施例中，穩定調配物包含在約0.003% (重量/體積，0.03 g/L)之濃度下之泊洛沙姆188。在某些實施例中，穩定調配物包含在約0.004% (重量/體積，0.04 g/L)之濃度下之泊洛沙姆188。在某些實施例中，穩定調配物包含在約0.005% (重量/體積，0.05 g/L)之濃度下之泊洛沙姆188。在某些實施例中，穩定調配物包含在約0.01% (重量/體積，0.1 g/L)之濃度下之泊洛沙姆188。在某些實施例中，穩定調配物包含在約0.05% (重量/體積，0.5 g/L)之濃度下之泊洛沙姆188。
在某些實施例中，醫藥組合物之pH值為約7.4。
在某些實施例中，醫藥組合物之pH值為約6.0至8.8。在某些實施例中，醫藥組合物之pH值為約6.0至9.0。在某些實施例中，醫藥組合物之pH值為約6.0。在某些實施例中，醫藥組合物之pH值為約6.1。在某些實施例中，醫藥組合物之pH值為約6.2。在某些實施例中，醫藥組合物之pH值為約6.3。在某些實施例中，醫藥組合物之pH值為約6.4。在某些實施例中，醫藥組合物之pH值為約6.5。在某些實施例中，醫藥組合物之pH值為約6.6。在某些實施例中，醫藥組合物之pH值為約6.7。在某些實施例中，醫藥組合物之pH值為約6.8。在某些實施例中，醫藥組合物之pH值為約6.9。在某些實施例中，醫藥組合物之pH值為約7.0。在某些實施例中，醫藥組合物之pH值為約7.1。在某些實施例中，醫藥組合物之pH值為約7.2。在某些實施例中，醫藥組合物之pH值為約7.3。在某些實施例中，醫藥組合物之pH值為約7.4。在某些實施例中，醫藥組合物之pH值為約7.5。在某些實施例中，醫藥組合物之pH值為約7.6。在某些實施例中，醫藥組合物之pH值為約7.7。在某些實施例中，醫藥組合物之pH值為約7.8。在某些實施例中，醫藥組合物之pH值為約7.9。在某些實施例中，醫藥組合物之pH值為約8.0。在某些實施例中，醫藥組合物之pH值為約8.1。在某些實施例中，醫藥組合物之pH值為約8.2。在某些實施例中，醫藥組合物之pH值為約8.3。在某些實施例中，醫藥組合物之pH值為約8.4。在某些實施例中，醫藥組合物之pH值為約8.5。在某些實施例中，醫藥組合物之pH值為約8.6。在某些實施例中，醫藥組合物之pH值為約8.7。在某些實施例中，醫藥組合物之pH值為約8.8。在某些實施例中，醫藥組合物之pH值為約8.9。在某些實施例中，醫藥組合物之pH值為約9.0。
在某些實施例中，穩定調配物之載體基因組濃度(VGC)為約3 × 109 個GC/mL、4 × 109 個GC/mL、5 × 109 個GC/mL、6 × 109 個GC/mL、7 × 109 個GC/mL、8 × 109 個GC/mL、9 × 109 個GC/mL、約1 × 1010 個GC/mL、約2 × 1010 個GC/mL、約3 × 1010 個GC/mL、約4 × 1010 個GC/mL、約5 × 1010 個GC/mL、約6 × 1010 個GC/mL、約7 × 1010 個GC/mL、約8 × 1010 個GC/mL、約9 × 1010 個GC/mL、約1 × 1011 個GC/mL、約2 × 1011 個GC/mL、約3 × 1011 個GC/mL、約4 × 1011 個GC/mL、約5 × 1011 個GC/mL、約6 × 1011 個GC/mL、約7 × 1011 個GC/mL、約8 × 1011 個GC/mL、約9 × 1011 個GC/mL、約1 × 1012 個GC/mL、約2 × 1012 個GC/mL、約3 × 1012 個GC/mL、約4 × 1012 個GC/mL、約5 × 1012 個GC/mL、約6 × 1012 個GC/mL、約7 × 1012 個GC/mL、約8 × 1012 個GC/mL、約9 × 1012 個GC/mL、約1 × 1013 個GC/mL、約1 × 1013 個GC/mL、約2 × 1013 個GC/mL或約3 × 1013 個GC/mL。 6.3 用於降低rAAV粒子釋放rAAV基因組之方法
在一些實施例中，本發明提供降低rAAV粒子釋放rAAV基因組之方法，其包含製造含rAAV粒子、緩衝劑、糖、鹽及視情況選用之非離子性界面活性劑之本文所揭示之調配物，其中相較於不包含糖之調配物中之rAAV基因組釋放，在三個凍融循環之後，自該等rAAV粒子之rAAV基因組釋放降低。在一些實施例中，調配物為冷凍調配物。在一些實施例中，調配物為凍乾調配物。在一些實施例中，鹽包含檸檬酸鈉。在一些實施例中，鹽包含檸檬酸鈉，且糖包含蔗糖。在一些實施例中，本文所揭示之降低rAAV基因組釋放之方法進一步包含凍乾調配物以達成約1%與約5%之間的殘餘水分含量。
在一些實施例中，本發明提供降低rAAV粒子釋放rAAV基因組之方法，其包含製造含rAAV粒子、緩衝劑、糖、鹽及視情況選用之非離子性界面活性劑之本文所揭示之調配物，其中相較於不包含糖之調配物中之rAAV基因組釋放，在凍乾及復原之後，自該等rAAV粒子之rAAV基因組釋放降低。在一些實施例中，調配物為冷凍調配物。在一些實施例中，調配物為凍乾調配物。在一些實施例中，鹽包含檸檬酸鈉。在一些實施例中，鹽包含檸檬酸鈉，且糖包含蔗糖。在一些實施例中，本文所揭示之降低rAAV基因組釋放之方法進一步包含凍乾調配物以達成約1%與約5%之間的殘餘水分含量。
在一些實施例中，本發明提供降低rAAV粒子釋放rAAV基因組之方法，其包含製造含rAAV粒子、緩衝劑、糖、鹽、塑化劑及視情況選用之非離子性界面活性劑之本文所揭示之調配物，其中相較於不包含糖之調配物中之rAAV基因組釋放，在三個凍融循環之後，自該等rAAV粒子之rAAV基因組釋放降低。在一些實施例中，調配物為冷凍調配物。在一些實施例中，調配物為凍乾調配物。在一些實施例中，鹽包含檸檬酸鈉。在一些實施例中，鹽包含檸檬酸鈉，且糖包含蔗糖。在一些實施例中，鹽包含檸檬酸鈉，糖包含蔗糖，且塑化劑包含甘油。在一些實施例中，本文所揭示之降低rAAV基因組釋放之方法進一步包含將調配物凍乾。
在一些實施例中，本發明提供降低rAAV粒子釋放rAAV基因組之方法，其包含製造含rAAV粒子、緩衝劑、糖、鹽、塑化劑及視情況選用之非離子性界面活性劑之本文所揭示之調配物，其中相較於不包含糖之調配物中之rAAV基因組釋放，在凍乾及復原之後，自該等rAAV粒子之rAAV基因組釋放降低。在一些實施例中，調配物為冷凍調配物。在一些實施例中，調配物為凍乾調配物。在一些實施例中，鹽包含檸檬酸鈉。在一些實施例中，鹽包含檸檬酸鈉，且糖包含蔗糖。在一些實施例中，鹽包含檸檬酸鈉，糖包含蔗糖，且塑化劑包含甘油。在一些實施例中，本文所揭示之降低rAAV基因組釋放之方法進一步包含將調配物凍乾。
在一些實施例中，本發明提供一種以糖於降低rAAV粒子釋放rAAV基因組上之用途，其包含製造含rAAV粒子、緩衝劑、糖、鹽及視情況選用之非離子性界面活性劑之本文所揭示之調配物，其中相較於不包含糖之調配物中之rAAV基因組釋放，在三個凍融循環之後，自該等rAAV粒子之rAAV基因組釋放降低。在一些實施例中，調配物為冷凍調配物。在一些實施例中，調配物為凍乾調配物。在一些實施例中，鹽包含檸檬酸鈉。在一些實施例中，鹽包含檸檬酸鈉，且糖包含蔗糖。在一些實施例中，本文所揭示之用於降低rAAV基因組釋放之糖之用途進一步包含凍乾調配物以達成約1%與約7%之間的殘餘水分含量。
在一些實施例中，本發明提供一種以糖於降低rAAV粒子釋放rAAV基因組上之用途，其包含製造含rAAV粒子、緩衝劑、糖、鹽及視情況選用之非離子性界面活性劑之本文所揭示之調配物，其中相較於不包含糖之調配物中之rAAV基因組釋放，在凍乾及復原之後，自該等rAAV粒子之rAAV基因組釋放降低。在一些實施例中，調配物為冷凍調配物。在一些實施例中，調配物為凍乾調配物。在一些實施例中，鹽包含檸檬酸鈉。在一些實施例中，鹽包含檸檬酸鈉，且糖包含蔗糖。在一些實施例中，本文所揭示之用於降低rAAV基因組釋放之糖之用途進一步包含凍乾調配物以達成約1%與約7%之間的殘餘水分含量。
在一些實施例中，本發明提供一種以塑化劑於降低rAAV粒子釋放rAAV基因組上之用途，其包含製造含rAAV粒子、緩衝劑、糖、鹽、塑化劑及視情況選用之非離子性界面活性劑之本文所揭示之調配物，其中相較於不包含糖之調配物中之rAAV基因組釋放，在三個凍融循環之後，自該等rAAV粒子之rAAV基因組釋放降低。在一些實施例中，調配物為冷凍調配物。在一些實施例中，調配物為凍乾調配物。在一些實施例中，鹽包含檸檬酸鈉。在一些實施例中，鹽包含檸檬酸鈉，且糖包含蔗糖。在一些實施例中，鹽包含檸檬酸鈉，糖包含蔗糖，且塑化劑包含甘油。在一些實施例中，本文所揭示之用於降低rAAV基因組釋放之糖之用途進一步包含將調配物凍乾。
在一些實施例中，本發明提供一種以塑化劑於降低rAAV粒子釋放rAAV基因組上之用途，其包含製造含rAAV粒子、緩衝劑、糖、鹽、塑化劑及視情況選用之非離子性界面活性劑之本文所揭示之調配物，其中相較於不包含糖之調配物中之rAAV基因組釋放，在凍乾及復原之後，自該等rAAV粒子之rAAV基因組釋放降低。在一些實施例中，調配物為冷凍調配物。在一些實施例中，調配物為凍乾調配物。在一些實施例中，鹽包含檸檬酸鈉。在一些實施例中，鹽包含檸檬酸鈉，且糖包含蔗糖。在一些實施例中，鹽包含檸檬酸鈉，糖包含蔗糖，且塑化劑包含甘油。在一些實施例中，本文所揭示之用於降低rAAV基因組釋放之糖之用途進一步包含將調配物凍乾。
在本文所揭示之降低rAAV基因組釋放之方法或用於降低rAAV基因組釋放之化合物之用途之一些實施例中，藉由量測在DNA特異性螢光染色劑存在下的相對螢光，來測定rAAV基因組釋放。在一些實施例中，DNA特異性螢光染色劑為SYBR金。
在本文所揭示之降低rAAV基因組釋放之方法或用於降低rAAV基因組釋放之化合物之用途之一些實施例中，冷凍誘發的rAAV基因組釋放降低了至少約10%、20%、50%、80%或90%。在一些實施例中，冷凍誘發之rAAV基因組釋放降低了至少約20%。在一些實施例中，冷凍誘發之rAAV基因組釋放降低了至少約50%。在一些實施例中，冷凍誘發之rAAV基因組釋放降低了至少約80%。在一些實施例中，實質上消除冷凍誘發之rAAV基因組釋放。
在本文所揭示之降低rAAV基因組釋放之方法或用於降低rAAV基因組釋放之化合物之用途之一些實施例中，糖為非還原糖。在一些實施例中，非還原糖為蔗糖、海藻糖、棉子糖或其組合。在一些實施例中，非還原糖為蔗糖。
在本文所揭示之降低rAAV基因組釋放之方法或用於降低rAAV基因組釋放之化合物之用途之一些實施例中，糖為還原糖。在一些實施例中，還原糖為葡萄糖、果糖、甘露糖、半乳糖、乳糖或其組合。在一些實施例中，還原糖為右旋糖。
在本文所揭示之降低rAAV基因組釋放之方法或用於降低rAAV基因組釋放之化合物之用途之一些實施例中，塑化劑包含甘油、木糖醇、山梨糖醇、甘露醇或其組合。在一些實施例中，塑化劑為甘油。 6.4 rAAV粒子
所提供之調配物適合於包含任何經分離之重組AAV粒子，及用於治療有需要之個體之疾病或病症之方法中，其包含投與任何經分離之重組AAV粒子。另外，所提供之方法適合於調配任何經分離之重組AAV粒子，及降低任何經分離之rAAV粒子釋放rAAV基因組。因此，rAAV可具有任何血清型、此項技術中已知之變體或衍生物或此項技術中已知之其任何組合(例如包含兩個或更多個血清型，例如包含rAAV2、rAAV8及rAAV9粒子中之兩者或更多者之rAAV粒子群體)。在一些實施例中，rAAV粒子為以下各者：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV-11、AAV-12、AAV-13、AAV-14、AAV-15及AAV-16、rAAV.rh8、rAAV.rh10、rAAV.rh20、rAAV.rh39、rAAV.Rh74、rAAV.RHM4-1、AAV.hu37、rAAV.Anc80、rAAV.Anc80L65、rAAV.7m8、rAAV.PHP.B、rAAV2.5、rAAV2tYF、rAAV3B、rAAV.LK03、AAV.HSC1、AAV.HSC2、AAV.HSC3、AAV.HSC4、AAV.HSC5、AAV.HSC6、AAV.HSC7、AAV.HSC8、AAV.HSC9、AAV.HSC10、AAV.HSC11、AAV.HSC12、AAV.HSC13、AAV.HSC14、AAV.HSC15或AAV.HSC16或其他rAAV粒子，或其兩者或更多者之組合。
在一些實施例中，rAAV粒子具有來自選自以下之AAV血清型之衣殼蛋白質：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV-11、AAV-12、AAV-13、AAV-14、AAV-15及AAV-16、rAAV.rh8、rAAV.rh10、rAAV.rh20、rAAV.rh39、rAAV.Rh74、rAAV.RHM4-1、AAV.hu37、rAAV.Anc80、rAAV.Anc80L65、rAAV.7m8、rAAV.PHP.B、rAAV2.5、rAAV2tYF、rAAV3B、rAAV.LK03、AAV.HSC1、AAV.HSC2、AAV.HSC3、AAV.HSC4、AAV.HSC5、AAV.HSC6、AAV.HSC7、AAV.HSC8、AAV.HSC9、AAV.HSC10、AAV.HSC11、AAV.HSC12、AAV.HSC13、AAV.HSC14、AAV.HSC15或AAV.HSC16或其衍生物、變體或假型。在一些實施例中，rAAV粒子包含與例如選自以下之AAV衣殼血清型之VP1、VP2及/或VP3序列至少80%或更高一致(例如85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%等，亦即至多100%一致)之衣殼蛋白質：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV-11、AAV-12、AAV-13、AAV-14、AAV-15及AAV-16、rAAV.rh8、rAAV.rh10、rAAV.rh20、rAAV.rh39、rAAV.Rh74、rAAV.RHM4-1、AAV.hu37、rAAV.Anc80、rAAV.Anc80L65、rAAV.7m8、rAAV.PHP.B、rAAV2.5、rAAV2tYF、rAAV3B、rAAV.LK03、AAV.HSC1、AAV.HSC2、AAV.HSC3、AAV.HSC4、AAV.HSC5、AAV.HSC6、AAV.HSC7、AAV.HSC8、AAV.HSC9、AAV.HSC10、AAV.HSC11、AAV.HSC12、AAV.HSC13、AAV.HSC14、AAV.HSC15或AAV.HSC16。
在一些實施例中，rAAV粒子包含來自選自以下之AAV衣殼血清型之衣殼蛋白質：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV-11、AAV-12、AAV-13、AAV-14、AAV-15及AAV-16、rAAV.rh8、rAAV.rh10、rAAV.rh20、rAAV.rh39、rAAV.Rh74、rAAV.RHM4-1、AAV.hu37、rAAV.Anc80、rAAV.Anc80L65、rAAV.7m8、rAAV.PHP.B、rAAV2.5、rAAV2tYF、rAAV3B、rAAV.LK03、AAV.HSC1、AAV.HSC2、AAV.HSC3、AAV.HSC4、AAV.HSC5、AAV.HSC6、AAV.HSC7、AAV.HSC8、AAV.HSC9、AAV.HSC10、AAV.HSC11、AAV.HSC12、AAV.HSC13、AAV.HSC14、AAV.HSC15或AAV.HSC16或其衍生物、變體或假型。在一些實施例中，rAAV粒子包含與例如選自以下之AAV衣殼血清型之VP1、VP2及/或VP3序列至少80%或更高一致(例如85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%等，亦即至多100%一致)之衣殼蛋白質：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV-11、AAV-12、AAV-13、AAV-14、AAV-15及AAV-16、rAAV.rh8、rAAV.rh10、rAAV.rh20、rAAV.rh39、rAAV.Rh74、rAAV.RHM4-1、AAV.hu37、rAAV.Anc80、rAAV.Anc80L65、rAAV.7m8、rAAV.PHP.B、rAAV2.5、rAAV2tYF、rAAV3B、rAAV.LK03、AAV.HSC1、AAV.HSC2、AAV.HSC3、AAV.HSC4、AAV.HSC5、AAV.HSC6、AAV.HSC7、AAV.HSC8、AAV.HSC9、AAV.HSC10、AAV.HSC11、AAV.HSC12、AAV.HSC13、AAV.HSC14、AAV.HSC15或AAV.HSC16。
在某些實施例中，rAAV粒子包含Anc80或Anc80L65，如Zinn等人, 2015, Cell Rep. 12(6): 1056-1068中所描述，其以全文引用之方式併入。在某些實施例中，rAAV粒子包含以下胺基酸插入中之一者：LGETTRP或LALGETTRP，如美國專利第9,193,956號、第9458517號及第9,587,282號以及美國專利申請公開案第2016/0376323號中所描述，其中之每一者以全文引用之方式併入本文中。在某些實施例中，rAAV粒子包含AAV.7m8，如美國專利第9,193,956號、第9,458,517號及第9,587,282號以及美國專利申請公開案第2016/0376323號中所描述，其中之每一者以全文引用之方式併入本文中。在某些實施例中，rAAV粒子包含美國專利第9,585,971號中所揭示之任何AAV，諸如AAV-PHP.B。在某些實施例中，rAAV粒子包含美國專利第9,840,719號及WO 2015/013313中所揭示之任何AAV，諸如AAV.Rh74及RHM4-1，其中之每一者以全文引用之方式併入本文中。在某些實施例中，rAAV粒子包含WO 2014/172669中所揭示之任何AAV，諸如AAV rh.74，其以全文引用之方式併入本文中。在一些實施例中，rAAV粒子包含如Georgiadis等人, 2016, Gene Therapy 23: 857-862及Georgiadis等人, 2018, Gene Therapy 25: 450中所描述之AAV2/5，其中之每一者以全文引用之方式併入。在某些實施例中，rAAV粒子包含WO 2017/070491中所揭示之任何AAV，諸如AAV2tYF，其以全文引用之方式併入本文中。在某些實施例中，rAAV粒子包含如Puzzo等人, 2017, Sci. Transl. Med. 29(9): 418中所描述之AAVLK03或AAV3B，其以全文引用之方式併入。在某些實施例中，rAAV粒子包含美國專利第8,628,966號、US 8,927,514、US 9,923,120及WO 2016/049230中所揭示之任何AAV，諸如HSC1、HSC2、HSC3、HSC4、HSC5、HSC6、HSC7、HSC8、HSC9、HSC10、HSC11、HSC12、HSC13、HSC14、HSC15或HSC16，其中之每一者以全文引用之方式併入。
在某些實施例中，rAAV粒子包含以下專利及專利申請案(其中之每一者以全文引用之方式併入本文中)中之任一者中所揭示之AAV：美國專利第7,282,199號、第7,906,111號、第8,524,446號、第8,999,678號、第8,628,966號、第8,927,514號、第8,734,809號、第US 9,284,357號、第9,409,953號、第9,169,299號、第9,193,956號、第9458517號及第9,587,282號；美國專利申請公開案第2015/0374803號、第2015/0126588號、第2017/0067908號、第2013/0224836號、第2016/0215024號、第2017/0051257號；及國際專利申請案第PCT/US2015/034799號、第PCT/EP2015/053335號。在一些實施例中，rAAV粒子具有與以下專利及專利申請案(其中之每一者以全文引用之方式併入本文中)中之任一者中所揭示之AAV衣殼之VP1、VP2及/或VP3序列至少80%或更高一致(例如85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%等，亦即至多100%一致)的衣殼蛋白質：美國專利第7,282,199號、第7,906,111號、第8,524,446號、第8,999,678號、第8,628,966號、第8,927,514號、第8,734,809號；第US 9,284,357號、第9,409,953號、第9,169,299號、第9,193,956號、第9458517號及第9,587,282號；美國專利申請公開案第2015/0374803號、第2015/0126588號、第2017/0067908號、第2013/0224836號、第2016/0215024號、第2017/0051257號；及國際專利申請案第PCT/US2015/034799號、第PCT/EP2015/053335號。
在一些實施例中，rAAV粒子具有以下中所揭示之衣殼蛋白質：國際申請公開案第WO 2003/052051號(參見例如SEQ ID NO: 2)、第WO 2005/033321號(參見例如SEQ ID NO: 123及88)、第WO 03/042397號(參見例如SEQ ID NO: 2、81、85及97)、第WO 2006/068888號(參見例如SEQ ID NO: 1及3-6)、第WO 2006/110689號(參見例如SEQ ID NO: 5-38)號、WO2009/104964號(參見例如SEQ ID NO: 1-5、7、9、20、22、24及31)、第WO 2010/127097號(參見例如SEQ ID NO: 5-38)及第WO 2015/191508號(參見例如SEQ ID NO: 80-294)；及美國申請公開案第20150023924號(參見例如SEQ ID NO: 1、5-10)，其中之每一者之內容以全文引用之方式併入本文中。在一些實施例中，rAAV粒子具有與以下中所揭示之AAV衣殼之VP1、VP2及/或VP3序列至少80%或更高一致(例如85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%等，亦即至多100%一致)的衣殼蛋白質：國際申請公開案第WO 2003/052051號(參見例如SEQ ID NO: 2)、第WO 2005/033321號(參見例如SEQ ID NO: 123及88)、第WO 03/042397號(參見例如SEQ ID NO: 2、81、85及97)、第WO 2006/068888號(參見例如SEQ ID NO: 1及3-6)、第WO 2006/110689號(參見例如SEQ ID NO: 5-38) WO2009/104964號(參見例如SEQ ID NO: 1-5、7、9、20、22、24及31)、第WO 2010/127097號(參見例如SEQ ID NO: 5-38)及第WO 2015/191508號(參見例如SEQ ID NO: 80-294)；及美國申請公開案第20150023924號(參見例如SEQ ID NO: 1、5-10)。
例如在以下中教示基於AAV之病毒載體之核酸序列及製備重組AAV與AAV衣殼之方法：美國專利第7,282,199號、第7,906,111號、第8,524,446號、第8,999,678號、第8,628,966號、第8,927,514號、第8,734,809號、第US 9,284,357號、第9,409,953號、第9,169,299號、第9,193,956號、第9458517號及第9,587,282號；美國專利申請公開案第2015/0374803號、第2015/0126588號、第2017/0067908號、第2013/0224836號、第2016/0215024號、第2017/0051257號；國際專利申請案第PCT/US2015/034799號、第PCT/EP2015/053335號、第WO 2003/052051號、第WO 2005/033321號、第WO 03/042397號、第WO 2006/068888號、第WO 2006/110689號、第WO2009/104964號、第WO 2010/127097號及第WO 2015/191508號；及美國申請公開案第20150023924號。
所提供之方法適合於在製造編碼轉殖基因之重組AAV中使用。在一些實施例中，本文提供編碼抗VEGF Fab之AAV病毒載體。在特定實施例中，本文提供編碼抗VEGF Fab之基於AAV8之病毒載體。在更特定實施例中，本文提供編碼蘭比珠單抗(ranibizumab)之基於AAV8之病毒載體。在一些實施例中，本文提供編碼艾杜糖醛酸酶(Iduronidase；IDUA)之AAV病毒載體。在特定實施例中，本文提供編碼IDUA之基於AAV9之病毒載體。在一些實施例中，本文提供編碼艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶(IDS)之AAV病毒載體。在特定實施例中，本文提供編碼IDS之基於AAV9之病毒載體。在一些實施例中，本文提供編碼低密度脂蛋白受體(LDLR)之AAV病毒載體。在特定實施例中，本文提供編碼LDLR之基於AAV8之病毒載體。在一些實施例中，本文提供編碼三肽基肽酶1 (TPP1)蛋白質之AAV病毒載體。在特定實施例中，本文提供編碼TPP之基於AAV9之病毒載體。
在額外實施例中，rAAV粒子包含假型化rAAV粒子。在一些實施例中，假型化AAV為rAAV2/8或rAAV2/9假型化AAV。用於製造及使用假型化rAAV粒子之方法為此項技術中已知的(參見例如Duan等人, J. Virol., 75:7662-7671 (2001)；Halbert等人, J. Virol., 74:1524-1532 (2000)；Zolotukhin等人, Methods 28:158-167 (2002)；及Auricchio等人, Hum. Molec. Genet. 10:3075-3081, (2001))。
在額外實施例中，rAAV粒子包含含有兩個或更多個AAV衣殼血清型之衣殼蛋白質嵌合體之衣殼。在一些實施例中，衣殼蛋白質為來自選自以下之AAV血清型之2種或更多種AAV衣殼蛋白的嵌合體：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV-11、AAV-12、AAV-13、AAV-14、AAV-15及AAV-16、rAAV.rh8、rAAV.rh10、rAAV.rh20、rAAV.rh39、rAAV.Rh74、rAAV.RHM4-1、AAV.hu37、rAAV.Anc80、rAAV.Anc80L65、rAAV.7m8、rAAV.PHP.B、rAAV2.5、rAAV2tYF、rAAV3B、rAAV.LK03、AAV.HSC1、AAV.HSC2、AAV.HSC3、AAV.HSC4、AAV.HSC5、AAV.HSC6、AAV.HSC7、AAV.HSC8、AAV.HSC9、AAV.HSC10、AAV.HSC11、AAV.HSC12、AAV.HSC13、AAV.HSC14、AAV.HSC15或AAV.HSC16。
在某些實施例中，可使用單股AAV (ssAAV)。在某些實施例中，可使用自身互補型載體，例如scAAV (參見例如Wu, 2007, Human Gene Therapy, 18(2):171-82，McCarty等人, 2001, Gene Therapy, 第8卷, 第16期, 第1248-1254頁；及美國專利第6,596,535號；第7,125,717號；及第7,456,683號，其中之每一者以全文引用之方式併入本文中)。
在一些實施例中，rAAV粒子具有來自選自以下之AAV血清型之衣殼蛋白質：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV-11、AAV-12、AAV-13、AAV-14、AAV-15及AAV-16、rAAV.rh8、rAAV.rh10、rAAV.rh20、rAAV.rh39、rAAV.Rh74、rAAV.RHM4-1、AAV.hu37、rAAV.Anc80、rAAV.Anc80L65、rAAV.7m8、rAAV.PHP.B、rAAV2.5、rAAV2tYF、rAAV3B、rAAV.LK03、AAV.HSC1、AAV.HSC2、AAV.HSC3、AAV.HSC4、AAV.HSC5、AAV.HSC6、AAV.HSC7、AAV.HSC8、AAV.HSC9、AAV.HSC10、AAV.HSC11、AAV.HSC12、AAV.HSC13、AAV.HSC14、AAV.HSC15或AAV.HSC16或其衍生物、變體或假型。在一些實施例中，rAAV粒子包含與例如選自以下之AAV衣殼血清型之VP1、VP2及/或VP3序列至少80%或更高一致(例如85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%等，亦即至多100%一致)的衣殼蛋白質：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV-11、AAV-12、AAV-13、AAV-14、AAV-15及AAV-16、rAAV.rh8、rAAV.rh10、rAAV.rh20、rAAV.rh39、rAAV.Rh74、rAAV.RHM4-1、AAV.hu37、rAAV.Anc80、rAAV.Anc80L65、rAAV.7m8、rAAV.PHP.B、rAAV2.5、rAAV2tYF、rAAV3B、rAAV.LK03、AAV.HSC1、AAV.HSC2、AAV.HSC3、AAV.HSC4、AAV.HSC5、AAV.HSC6、AAV.HSC7、AAV.HSC8、AAV.HSC9、AAV.HSC10、AAV.HSC11、AAV.HSC12、AAV.HSC13、AAV.HSC14、AAV.HSC15或AAV.HSC16。
在一些實施例中，rAAV粒子包含來自選自AAV-8或AAV-9之AAV衣殼血清型之衣殼蛋白質。在一些實施例中，rAAV粒子具有AAV-8之AAV衣殼血清型。在一些實施例中，rAAV粒子具有AAV-9之AAV衣殼血清型。
在一些實施例中，rAAV粒子包含呈AAV-8或AAV-9衣殼蛋白質之衍生物、變體或假型之衣殼蛋白質。在一些實施例中，rAAV粒子包含具有與AAV-8衣殼蛋白質之VP1、VP2及/或VP3序列至少80%或更高一致之AAV-8衣殼蛋白質的衣殼蛋白質，例如85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%等，亦即至多100%一致。
在一些實施例中，rAAV粒子包含呈AAV-9衣殼蛋白質之衍生物、變體或假型之衣殼蛋白質。在一些實施例中，rAAV粒子包含具有與AAV-9衣殼蛋白質之VP1、VP2及/或VP3序列至少80%或更高一致之AAV-9衣殼蛋白質的衣殼蛋白質，例如85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%等，亦即至多100%一致。
在額外實施例中，rAAV粒子包含鑲嵌型衣殼。鑲嵌型AAV粒子包括來自不同AAV血清型之病毒衣殼蛋白之混合物。在一些實施例中，rAAV粒子包含含有選自以下之血清型之衣殼蛋白之鑲嵌型衣殼：AAV-1、AAV-2、AAV-3、AAV-4、AAV-5、AAV-6、AAV-7、AAV-8、AAV-9、AAV-10、rAAVrh10、AAV-11、AAV-12、AAV-13、AAV-14、AAV-15及AAV-16。在一些實施例中，rAAV粒子包含含有選自以下之血清型之衣殼蛋白之鑲嵌型衣殼：AAV-1、AAV-2、AAV-5、AAV-6、AAV-7、AAV-8、AAV-9、AAV-10、AAVrh.8及AAVrh.10。
在額外實施例中，rAAV粒子包含假型化rAAV粒子。在一些實施例中，假型化rAAV粒子包含：(a)核酸載體，其包含AAV ITR；及(b)衣殼，其包含來源於AAVx (例如AAV-1、AAV-3、AAV-4、AAV-5、AAV-6、AAV-7、AAV-8、AAV-9、AAV-10、AAV-11、AAV-12、AAV-13、AAV-14、AAV-15及AAV-16)之衣殼蛋白。在額外實施例中，rAAV粒子包含含選自以下之AAV血清型之衣殼蛋白質之假型化rAAV粒子：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV-11、AAV-12、AAV-13、AAV-14、AAV-15及AAV-16、rAAV.rh8、rAAV.rh10、rAAV.rh20、rAAV.rh39、rAAV.Rh74、rAAV.RHM4-1、AAV.hu37、rAAV.Anc80、rAAV.Anc80L65、rAAV.7m8、rAAV.PHP.B、rAAV2.5、rAAV2tYF、rAAV3B、rAAV.LK03、AAV.HSC1、AAV.HSC2、AAV.HSC3、AAV.HSC4、AAV.HSC5、AAV.HSC6、AAV.HSC7、AAV.HSC8、AAV.HSC9、AAV.HSC10、AAV.HSC11、AAV.HSC12、AAV.HSC13、AAV.HSC14、AAV.HSC15及AAV.HSC16。在額外實施例中，rAAV粒子包含含有AAV-8衣殼蛋白質之假型化rAAV粒子。在額外實施例中，rAAV粒子包含含AAV-9衣殼蛋白質之假型化rAAV粒子。在一些實施例中，假型化rAAV8或rAAV9粒子為rAAV2/8或rAAV2/9假型化粒子。用於製造及使用假型化rAAV粒子之方法為此項技術中已知的(參見例如Duan等人, J. Virol., 75:7662-7671 (2001)；Halbert等人, J. Virol., 74:1524-1532 (2000)；Zolotukhin等人, Methods 28:158-167 (2002)；及Auricchio等人, Hum. Molec. Genet. 10:3075-3081, (2001))。
在額外實施例中，rAAV粒子包含含有兩個或更多個AAV衣殼血清型之衣殼蛋白質嵌合體之衣殼。在一些實施例中，rAAV粒子包含AAV-8衣殼蛋白質與來自選自以下之AAV血清型之一或多種AAV衣殼蛋白的AAV衣殼蛋白嵌合體：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV-11、AAV-12、AAV-13、AAV-14、AAV-15及AAV-16、rAAV.rh8、rAAV.rh10、rAAV.rh20、rAAV.rh39、rAAV.Rh74、rAAV.RHM4-1、AAV.hu37、rAAV.Anc80、rAAV.Anc80L65、rAAV.7m8、rAAV.PHP.B、rAAV2.5、rAAV2tYF、rAAV3B、rAAV.LK03、AAV.HSC1、AAV.HSC2、AAV.HSC3、AAV.HSC4、AAV.HSC5、AAV.HSC6、AAV.HSC7、AAV.HSC8、AAV.HSC9、AAV.HSC10、AAV.HSC11、AAV.HSC12、AAV.HSC13、AAV.HSC14、AAV.HSC15及AAV.HSC16。在一些實施例中，rAAV粒子包含AAV-8衣殼蛋白質與來自選自以下之AAV血清型之一或多種AAV衣殼蛋白的AAV衣殼蛋白嵌合體：AAV-1、AAV-2、AAV-5、AAV-6、AAV-7、AAV-9、AAV-10、rAAVrh10、AAVrh.8及AAVrh.10。在一些實施例中，rAAV粒子包含AAV-9衣殼蛋白質選自以下之一或多種AAV衣殼血清型之衣殼蛋白質的AAV衣殼蛋白嵌合體：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV-11、AAV-12、AAV-13、AAV-14、AAV-15及AAV-16、rAAV.rh8、rAAV.rh10、rAAV.rh20、rAAV.rh39、rAAV.Rh74、rAAV.RHM4-1、AAV.hu37、rAAV.Anc80、rAAV.Anc80L65、rAAV.7m8、rAAV.PHP.B、rAAV2.5、rAAV2tYF、rAAV3B、rAAV.LK03、AAV.HSC1、AAV.HSC2、AAV.HSC3、AAV.HSC4、AAV.HSC5、AAV.HSC6、AAV.HSC7、AAV.HSC8、AAV.HSC9、AAV.HSC10、AAV.HSC11、AAV.HSC12、AAV.HSC13、AAV.HSC14、AAV.HSC15及AAV.HSC16。在一些實施例中，rAAV粒子包含AAV-9衣殼蛋白質選自以下之一或多種AAV衣殼血清型之衣殼蛋白質的AAV衣殼蛋白嵌合體：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AA6、AAV7、AAV8、AAV9、AAVrh.8及AAVrh.10。 6.5 用於分離rAAV粒子之方法
在一些實施例中，本發明提供用於製造包含本文所揭示之經分離之重組腺相關病毒(rAAV)粒子之調配物之方法，其包含：(a)自包含雜質之饋料(例如rAAV生產培養物)分離rAAV粒子；及(b)使用本文所揭示之用於製造調配物之方法來調配經分離之rAAV粒子。在一些實施例中，用於製造包含本文所揭示之經分離之重組腺相關病毒(rAAV)粒子之調配物之方法包含：(a)自包含雜質之饋料(例如rAAV生產培養物)分離rAAV粒子；(b)測定經分離之rAAV粒子之基因組效價；及(c)使用本文所揭示之用於製造調配物之方法調配經分離之rAAV粒子。
在一些實施例中，本發明進一步提供用於製造包含本文所揭示之經分離之重組腺相關病毒(rAAV)粒子之調配物之醫藥單位劑量之方法，其包含：自包含雜質的饋料(例如rAAV生產培養物)分離rAAV粒子；測定經分離之rAAV粒子的基因組效價；及使用本文所揭示之方法調配經分離之rAAV粒子。在一些實施例中，用於製造包含本文所揭示之經分離之重組腺相關病毒(rAAV)粒子之調配物之醫藥單位劑量之方法包含：自包含雜質的饋料(例如rAAV生產培養物)分離rAAV粒子；及使用本文所揭示之方法調配經分離之rAAV粒子。
可使用此項技術中已知之方法來分離經分離之rAAV粒子。在一些實施例中，分離rAAV粒子之方法包含下游處理，諸如收穫細胞培養物、淨化所收穫之細胞培養物(例如藉由離心或深度過濾)、切向流過濾、親和層析、陰離子交換層析、陽離子交換層析、尺寸排阻層析、疏水相互作用層析、羥磷灰石層析、無菌過濾或其任何組合。在一些實施例中，下游處理包括以下中之至少2者、至少3者、至少4者、至少5者或至少6者：收穫細胞培養物、淨化所收穫之細胞培養物(例如藉由離心或深度過濾)、切向流過濾、親和層析、陰離子交換層析、陽離子交換層析、尺寸排阻層析、疏水相互作用層析、羥磷灰石層析及無菌過濾。在一些實施例中，下游處理包含：收穫細胞培養物、淨化所收穫之細胞培養物(例如藉由深度過濾)、無菌過濾、切向流過濾、親和層析及陰離子交換層析。在一些實施例中，下游處理包含：淨化所收穫之細胞培養物、無菌過濾、切向流過濾、親和層析及陰離子交換層析。在一些實施例中，下游處理包含：藉由深度過濾來淨化所收穫之細胞培養物、無菌過濾、切向流過濾、親和層析及陰離子交換層析。在一些實施例中，所收穫細胞培養物之淨化包含無菌過濾。在一些實施例中，下游處理不包括離心。在一些實施例中，rAAV粒子包含AAV-8血清型之衣殼蛋白質。在一些實施例中，rAAV粒子包含AAV-9血清型之衣殼蛋白質。
在一些實施例中，分離rAAV粒子之方法包含：收穫細胞培養物、淨化所收穫之細胞培養物(例如藉由深度過濾)、第一無菌過濾、第一切向流過濾、親和層析、整體陰離子交換層析、第二切向流過濾及第二無菌過濾。在一些實施例中，分離rAAV粒子之方法包含：淨化所收穫之細胞培養物、第一無菌過濾、第一切向流過濾、親和層析、整體陰離子交換層析、第二切向流過濾及第二無菌過濾。在一些實施例中，分離rAAV粒子之方法包含：藉由深度過濾來淨化所收穫之細胞培養物、第一無菌過濾、第一切向流過濾、親和層析、整體陰離子交換層析、第二切向流過濾及第二無菌過濾。在一些實施例中，方法不包括離心。在一些實施例中，所收穫細胞培養物之淨化包含無菌過濾。在一些實施例中，rAAV粒子包含AAV-8血清型之衣殼蛋白質。在一些實施例中，rAAV粒子包含AAV-9血清型之衣殼蛋白質。
用於製造rAAV粒子之多種方法為此項技術中已知的，包括轉染、穩定細胞株製造及包括腺病毒-AAV雜合體、疱疹病毒-AAV雜合體及桿狀病毒-AAV雜合體之感染力雜合病毒製造系統。用於製造rAAV病毒粒子之rAAV生產培養物均需要：(1)適合的宿主細胞，包括例如來源於人類之細胞株(諸如HeLa、A549或HEK293細胞及其衍生物(HEK293T細胞、HEK293F細胞))、哺乳動物細胞株(諸如Vero)或來源於昆蟲之細胞株(諸如在桿狀病毒製造系統之情況下，SF-9)；(2)適合的輔助病毒功能，其由野生型或突變型腺病毒(諸如溫度敏感的腺病毒)、疱疹病毒、桿狀病毒或提供輔助功能之質體構築體提供；(3) AAV rep及cap基因及基因產物；(4)側接AAV ITR序列之轉殖基因(諸如治療性轉殖基因)；及(5)支持rAAV製造之適合的培養基及培養基組分。此項技術中已知之適合培養基可用於製造rAAV載體。此等培養基包括(但不限於)：由Hyclone Laboratories及JRH製造之培養基，包括改良伊格爾培養基(Modified Eagle Medium；MEM)；杜爾貝科氏改良的伊格爾培養基(Dulbecco's Modified Eagle Medium；DMEM)；及Sf-900 II SFM培養基，如美國專利第6,723,551號中所描述，其以全文引用之方式併入本文中。
rAAV生產培養物可常規地生長在適合於所使用之特定宿主細胞之各種條件(在寬溫度範圍內、不同時間長度及其類似者)下。如此項技術中已知，rAAV生產培養物包括連接依賴性培養物，其可在適合的連接依賴性容器，諸如滾瓶、中空纖維過濾器、微載體及填充床或流體化床生物反應器中培養。rAAV載體生產培養物亦可包括懸浮適應宿主細胞，諸如HeLa、HEK293、Vero及其衍生物及SF-9細胞，其可以多種方法培養，包括例如旋轉燒瓶、攪拌槽生物反應器及拋棄式系統(諸如Wave袋系統)。用於產生rAAV粒子之多種懸浮培養物為此項技術中已知的，包括例如美國專利第6,995,006號、第9,783,826號中及美國專利申請公開案第20120122155號中所揭示之培養物，其中之每一者以全文引用之方式併入本文中。
在一些實施例中，用於製造rAAV粒子之方法涵蓋：提供包含能夠產生rAAV之細胞的細胞培養物；向細胞培養物中添加組蛋白脫乙醯基酶(HDAC)抑制劑至約0.1 mM與約20 mM之間的最終濃度；及將細胞培養物維持在允許產生rAAV粒子的條件下。在一些實施例中，HDAC抑制劑包含短鏈脂肪酸或其鹽。在一些實施例中，HDAC抑制劑包含丁酸鹽(例如丁酸鈉)、丙戊酸鹽(例如丙戊酸鈉)、丙酸鹽(例如丙酸鈉)或其組合。
在一些實施例中，如2018年8月10日申請之標題為「SCALABLE METHOD FOR RECOMBINANT AAV PRODUCTION」之美國臨時申請案第62/717,212號中所揭示來製造rAAV粒子，其以全文引用之方式併入本文中。
可藉由收穫包含宿主細胞之生產培養物或藉由收穫來自生產培養物之消耗培養基，從rAAV生產培養物中收穫重組AAV粒子，其限制條件為細胞係在此項技術中已知會引起完整宿主細胞釋放rAAV粒子至培養基中之條件下培養。亦可藉由裂解生產培養物之宿主細胞，自rAAV生產培養物收穫重組AAV粒子。裂解細胞之適合方法亦為此項技術中已知且包括例如多個冷凍/解凍循環、音波處理、微流體化、及使用化學物質(諸如清潔劑及/或蛋白酶)處理。
在收穫時，rAAV生產培養物可含有以下一或多者：(1)宿主細胞蛋白質；(2)宿主細胞DNA；(3)質體DNA；(4)輔助病毒；(5)輔助病毒蛋白質；(6)輔助病毒DNA；及(7)培養基組分，包括例如血清蛋白、胺基酸、運鐵蛋白及其他低分子量蛋白質。rAAV生產培養物可進一步含有產物相關雜質，例如無活性載體形式、空病毒衣殼、聚集的病毒粒子或衣殼、摺疊錯誤的病毒衣殼、降解的病毒粒子。
在一些實施例中，淨化rAAV生產培養物收穫物以移除宿主細胞碎片。在一些實施例中，藉由通過一系列深度過濾器之過濾，來淨化生產培養物收穫物。亦可藉由此項技術中已知之多種其他標準技術來達成淨化，諸如離心或通過此項技術中已知之0.2 mm或更大孔徑之任何乙酸纖維素過濾器之過濾。在一些實施例中，所收穫細胞培養物之淨化包含無菌過濾。在一些實施例中，藉由離心來淨化生產培養物收穫物。在一些實施例中，生產培養物收穫物之淨化不包括離心。
在一些實施例中，使用過濾來淨化所收穫之細胞培養物。在一些實施例中，所收穫細胞培養物之淨化包含深度過濾。在一些實施例中，所收穫細胞培養物之淨化進一步包含深度過濾及無菌過濾。在一些實施例中，使用包含一或多種不同過濾介質之過濾器組，來淨化所收穫之細胞培養物。在一些實施例中，過濾器組包含深度過濾介質。在一些實施例中，過濾器組包含一或多種深度過濾介質。在一些實施例中，過濾器組包含兩種深度過濾介質。在一些實施例中，過濾器組包含無菌過濾介質。在一些實施例中，過濾器組包含2種深度過濾介質及無菌過濾介質。在一些實施例中，深度過濾介質為多孔深度過濾器。在一些實施例中，過濾器組包含Clarisolve® 20MS、Millistak+® C0HC及滅菌級過濾介質。在一些實施例中，過濾器組包含Clarisolve® 20MS、Millistak+® C0HC及Sartopore® 2 XLG 0.2 µm。在一些實施例中，在使所收穫之細胞培養物與深度過濾器接觸之前，對其進行預處理。在一些實施例中，預處理包含向所收穫之細胞培養物中添加鹽。在一些實施例中，預處理包含向所收穫之細胞培養物中添加化學凝聚劑。在一些實施例中，在使所收穫之細胞培養物與深度過濾器接觸之前，不對其進行預處理。
在一些實施例中，藉由2018年4月29日申請之標題為「SCALABLE CLARIFICATION PROCESS FOR RECOMBINANT AAV PRODUCTION」之美國臨時申請案第62/664,254號中所揭示之過濾，來淨化生產培養物收穫物，其以全文引用之方式併入本文中。
在一些實施例中，用核酸酶(例如Benzonase®)或核酸內切酶(例如來自黏質沙雷氏菌(Serratia marcescens)之核酸內切酶)處理rAAV生產培養物收穫物，以消化生產培養物中存在之高分子量DNA。核酸酶或核酸內切酶消化可常規地在此項技術中已知之標準條件下進行。舉例而言，在最終濃度為1-2.5單位/毫升之Benzonase®下，在介於環境溫度至37℃之溫度下，持續30分鐘至數小時之時段，來進行核酸酶消化。
無菌過濾涵蓋使用滅菌級過濾介質之過濾。在一些實施例中，滅菌級過濾介質為0.2或0.22 µm孔過濾器。在一些實施例中，滅菌級過濾介質包含聚醚碸(PES)。在一些實施例中，滅菌級過濾介質包含聚偏二氟乙烯(PVDF)。在一些實施例中，滅菌級過濾介質具有親水性非均勻雙層設計。在一些實施例中，滅菌級過濾介質具有0.8 µm前篩選器及0.2 µm最終過濾薄膜之親水性非均勻雙層設計。在一些實施例中，滅菌級過濾介質具有1.2 µm前篩選器及0.2 µm最終過濾薄膜之親水性非均勻雙層設計。在一些實施例中，滅菌級過濾介質為0.2或0.22 µm孔過濾器。在其他實施例中，滅菌級過濾介質為0.2 µm孔過濾器。在一些實施例中，滅菌級過濾介質為Sartopore® 2 XLG 0.2 µm、Durapore™ PVDF膜0.45µm或Sartoguard® PES 1.2 μm + 0.2 μm平均孔徑組合。在一些實施例中，滅菌級過濾介質為Sartopore® 2 XLG 0.2 µm。
在一些實施例中，在施加至層析介質(例如親和層析介質)之前，經由切向流過濾(「TFF」)濃縮所淨化之饋料。使用TFF超過濾大規模濃縮病毒已由Paul等人, Human Gene Therapy 4:609-615 (1993)所描述。TFF濃縮所淨化之饋料使得能夠使可技術上控制體積之所淨化之饋料經受層析，且允許更合理的對管柱進行大小測定而無需冗長的再循環時間。在一些實施例中，將所淨化之饋料濃縮至少兩倍至至少十倍。在一些實施例中，將所淨化之饋料濃縮至少十倍至至少二十倍。在一些實施例中，將所淨化之饋料濃縮至少二十倍至至少五十倍。在一些實施例中，將所淨化之饋料濃縮約二十倍。一般熟習此項技術者亦將認識到，TFF亦可用於經由透濾自所淨化之饋料移除小分子雜質(例如細胞培養物雜質，包含介質組分、血清白蛋白或其他血清蛋白)。在一些實施例中，使所淨化之饋料經受透濾以移除小分子雜質。在一些實施例中，透濾包含使用約3與約10個透濾體積之間的緩衝液。在一些實施例中，透濾包含使用約5個透濾體積之緩衝液。一般熟習此項技術者亦將認識到，在進行純化過程中之下一步驟之前在純化過程中之需要交換緩衝液之任何步驟，亦可使用TFF。在一些實施例中，用於自本文所揭示之所淨化之饋料分離rAAV之方法包含使用TFF來交換緩衝液。
親和層析可用於自組合物分離rAAV粒子。在一些實施例中，親和層析用於自所淨化之饋料分離rAAV粒子。在一些實施例中，親和層析用於自已經受切向流過濾之所淨化之饋料分離rAAV粒子。適合的親和層析介質為此項技術中已知的，且包括(不限於) AVB Sepharose™、POROS™ CaptureSelect™ AAVX親和樹脂、POROS™ CaptureSelect™ AAV9親和樹脂及POROS™ CaptureSelect™ AAV8親和樹脂。在一些實施例中，親和層析介質為POROS™ CaptureSelect™ AAV9親和樹脂。在一些實施例中，親和層析介質為POROS™ CaptureSelect™ AAV8親和樹脂。在一些實施例中，親和層析介質為POROS™ CaptureSelect™ AAVX親和樹脂。
陰離子交換層析可用於自組合物分離rAAV粒子。在一些實施例中，在親和層析之後，使用陰離子交換層析作為最終濃縮及高純化(polish)步驟。適合的陰離子交換層析介質為此項技術中已知的，且包括(不限於)：Unosphere Q (Biorad, Hercules, Calif.)及N-帶電胺基或亞胺基樹脂，諸如POROS 50 PI，或任何DEAE、TMAE、三級或四級胺，或此項技術中已知之基於PEI之樹脂(美國專利第6,989,264號；Brument等人, Mol. Therapy 6(5):678-686 (2002)；Gao等人, Hum. Gene Therapy 11:2079-2091 (2000))。在一些實施例中，陰離子交換層析介質包含四級胺。在一些實施例中，陰離子交換介質為整體陰離子交換層析樹脂。在一些實施例中，整體陰離子交換層析介質包含甲基丙烯酸縮水甘油酯-二甲基丙烯酸二乙醇酯或苯乙烯-二乙烯苯聚合物。在一些實施例中，整體陰離子交換層析介質係選自由以下組成之群：CIMmultus™ QA-1高級複合管柱(四級胺)、CIMmultus™ DEAE-1高級複合管柱(二乙胺基)、CIM® QA Disk(四級胺)、CIM® DEAE及CIM® EDA Disk (乙二胺)。在一些實施例中，整體陰離子交換層析介質為CIMmultus™ QA-1高級複合管柱(四級胺)。在一些實施例中，整體陰離子交換層析介質為CIM® QA Disk (四級胺)。在一些實施例中，陰離子交換層析介質為CIM QA (BIA Separations, Slovenia)。在一些實施例中，陰離子交換層析介質為BIA CIM® QA-80 (管柱體積為80 mL)。一般熟習此項技術者可瞭解，可鑑別適合離子強度之洗滌緩衝液，使得rAAV保持與樹脂結合同時去除掉雜質，包括(但不限於)可由上游純化所引入之雜質。
在一些實施例中，根據2018年6月14日申請之標題為「Anion Exchange Chromatography for Recombinant AAV production」之美國臨時申請案第62/684,835號中所揭示之方法進行陰離子交換層析，其以全文引用之方式併入本文中。
在一些實施例中，分離rAAV粒子之方法包含測定載體基因組效價、衣殼效價及/或包含經分離之rAAV粒子之組合物中之滿衣殼與空衣殼的比率。在一些實施例中，藉由定量PCR (qPCR)或數位PCR (dPCR)或液滴式數位PCR (ddPCR)來測定載體基因組效價。在一些實施例中，藉由血清型特異性ELISA來測定衣殼效價。在一些實施例中，藉由分析性超速離心(AUC)或穿透式電子顯微鏡(TEM)來測定滿衣殼與空衣殼之比率。
在一些實施例中，藉由分光光度法，例如藉由量測在260 nm下組合物之吸光度；及量測在280 nm下組合物之吸光度，來測定載體基因組效價、衣殼效價及/或滿衣殼與空衣殼之比率。在一些實施例中，在量測組合物之吸光度之前，不使rAAV粒子變性。在一些實施例中，在量測組合物之吸光度之前，使rAAV粒子變性。在一些實施例中，使用分光光度計測定在260 nm及280 nm下組合物之吸光度。在一些實施例中，使用HPLC測定在260 nm及280 nm下組合物之吸光度。在一些實施例中，吸光度為峰值吸光度。用於量測在260 nm及280 nm下組合物之吸光度之若干方法為此項技術中已知的。測定包含經分離之重組rAAV粒子之組合物之載體基因組效價及衣殼效價之方法揭示於以下中：2018年5月15日申請之標題為「Systems and methods of spectrophotometry for the determination of genome copies and full/empty ratios of adeno-associated virus particles」的美國臨時申請案第62/671,965號；及2018年4月29日申請之美國臨時申請案第62/664,251號；及2018年4月29日申請之標題為「Systems and methods of spectrophotometry for the determination of genome copies and full/empty ratios of adeno-associated virus particles」的美國臨時申請案第62/663,979號，其中之每一者以全文引用之方式併入本文中。 6.6 套組
在一些實施例中，本發明提供套組，其包含本文所揭示之調配物，該調配物可用於進行治療有需要之個體之疾病或病症之方法，包含投與經分離之重組AAV粒子。在一些實施例中，套組包含至少一種調配物，其包含於一或多個容器中之包含本文所揭示之rAAV粒子的調配物。在一些實施例中，套組含有進行治療有需要之個體之疾病或病症之方法所必需及/或足夠的所有組分，該治療方法包含投與經分離之重組AAV粒子。熟習此項技術者將容易地認識到，可容易地將包含含本文所揭示之rAAV粒子之調配物的調配物併入至為此項技術中所熟知之任一種確立套組型式中。
為了本文提供之本發明可容易理解且付諸實踐，現將藉助於以下非限制性實例來描述一些實施例。 6.7 功能特性
在某些實施例中，本文中所描述之調配物或穩定調配物適合於靜脈內投與、皮下投與、肌肉內注射、脈絡膜上腔注射(例如經由脈絡膜上腔藥物遞送裝置，諸如具有微針之微小注射器)、經由經玻璃體途徑之視網膜下注射(手術程序)、近鞏膜投與、玻璃體內投與、結膜下投與、視網膜內投與、經由脈絡膜上腔空間之視網膜下投與(例如經由視網膜下藥物遞送裝置之手術程序，該視網膜下藥物遞送裝置包含可插入且遂穿脈絡膜上腔空間接近後極的導管，在該後極處小針注入至視網膜下腔中)及/或後近鞏膜儲槽程序(例如經由近鞏膜藥物遞送裝置，其包含尖端可插入且保持直接並置於鞏膜表面的插管))。
在某些實施例中，醫藥組合物具有適合於以下之所需密度：靜脈內投與、皮下投與、肌肉內注射、脈絡膜上腔注射(例如經由脈絡膜上腔藥物遞送裝置，諸如具有微針之微小注射器)、經由經玻璃體途徑之視網膜下注射(手術程序)、近鞏膜投與、玻璃體內投與、結膜下投與、視網膜內投與、經由脈絡膜上腔空間之視網膜下投與(例如經由視網膜下藥物遞送裝置之手術程序，該視網膜下藥物遞送裝置包含可插入且遂穿脈絡膜上腔空間接近後極的導管，在該後極處小針注入至視網膜下腔中)及/或後近鞏膜儲槽程序(例如經由近鞏膜藥物遞送裝置，其包含尖端可插入且保持直接並置於鞏膜表面的插管))。
在某些實施例中，醫藥組合物具有適合於以下之所需黏度：靜脈內投與、皮下投與、肌肉內注射、脈絡膜上腔注射(例如經由脈絡膜上腔藥物遞送裝置，諸如具有微針之微小注射器)、近鞏膜投與、玻璃體內投與、結膜下投與、視網膜內投與、經由經玻璃體途徑之視網膜下注射(手術程序)、經由脈絡膜上腔空間之視網膜下投與(例如經由視網膜下藥物遞送裝置之手術程序，該視網膜下藥物遞送裝置包含可插入且遂穿脈絡膜上腔空間接近後極的導管，在該後極處小針注入至視網膜下腔中)及/或後近鞏膜儲槽程序(例如經由近鞏膜藥物遞送裝置，其包含尖端可插入且保持直接並置於鞏膜表面的插管))。
在某些實施例中，對於凍乾或復原處理，穩定調配物中之重組腺相關病毒(rAAV)粒子比參考調配物中之相同rAAV粒子穩定至少約2%、約5%、約7%、約10%、約12%、約15%、約17%、約20%、約25%、約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約100%、約2倍、約3倍、約5倍、約10倍、約100倍或約1000倍。在某些實施例中，藉由章節6.8中所揭示之一或多種分析來測定rAAV粒子之穩定性。
在某些實施例中，穩定調配物中之rAAV粒子之感染力比參考調配物中之相同rAAV粒子之感染力高至少約2%、約5%、約7%、約10%、約12%、約15%、約17%、約20%、約25%、約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約100%、約2倍、約3倍、約5倍、約10倍、約100倍或約1000倍。在某些實施例中，藉由章節6.8中所揭示之一或多種分析來測定rAAV粒子之病毒感染力。在某些實施例中，在凍乾之前或之後，量測感染力。在某些實施例中，在復原凍乾調配物之前或之後，量測感染力。
在某些實施例中，穩定調配物中之rAAV粒子之聚集比參考調配物中之相同rAAV粒子之聚集低至少約2%、約5%、約7%、約10%、約12%、約15%、約17%、約20%、約25%、約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約100%、約2倍、約3倍、約5倍、約10倍、約100倍或約1000倍。在某些實施例中，藉由章節6.8中所揭示之一或多種分析來測定rAAV粒子之聚集。在某些實施例中，在凍乾之前或之後，量測聚集。在某些實施例中，在復原凍乾調配物之前或之後，量測聚集。
在某些實施例中，在儲存之前，凍乾穩定調配物。
在某一實施例中，在儲存之後，復原穩定調配物。
在某些實施例中，將調配物儲存在-80℃、-70℃、-20℃、4℃、20℃、25℃、30℃、35℃、37℃或40℃下。
在某些實施例中，將調配物儲存約1週、約2週、約3週、約4週、約1個月、約2個月、約3個月、約4個月、約5個月、約6個月、約7個月、約8個月、約9個月、約10個月、約11個月、12個月、約15個月、約18個月、約24個月、約2年、約3年或約4年。
在某些實施例中，在將調配物儲存一段時間之後，例如約1週、約2週、約3週、約4週、約1個月、約2個月、約3個月、約4個月、約5個月、約6個月、約7個月、約8個月、約9個月、約10個月、約11個月、12個月、約15個月、約18個月、約24個月、約2年、約3年、約4年，穩定調配物中之rAAV粒子比儲存在相同條件下之參考調配物中之相同rAAV粒子穩定至少約2%、約5%、約7%、約10%、約12%、約15%、約17%、約20%、約25%、約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約100%、約2倍、約3倍、約5倍、約10倍、約100倍或約1000倍。在某些實施例中，藉由章節6.8中所揭示之一或多種分析來測定rAAV粒子之經一段時間之穩定性。
在某些實施例中，在將調配物儲存一段時間之後，例如約1週、約2週、約3週、約4週、約1個月、約2個月、約3個月、約4個月、約5個月、約6個月、約7個月、約8個月、約9個月、約10個月、約11個月、12個月、約15個月、約18個月、約24個月、約2年、約3年、約4年，穩定調配物中之rAAV粒子比參考調配物中之相同rAAV粒子穩定至少約2%、約5%、約7%、約10%、約12%、約15%、約17%、約20%、約25%、約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約100%、約2倍、約3倍、約5倍、約10倍、約100倍或約1000倍。在某些實施例中，藉由章節6.8中所揭示之一或多種分析來測定rAAV粒子之經一段時間之穩定性。
在某些實施例中，穩定調配物中之rAAV粒子之活體外相對效能(IVRP)比參考調配物中之相同rAAV粒子之活體外相對效能高至少約2%、約5%、約7%、約10%、約12%、約15%、約17%、約20%、約25%、約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約100%、約2倍、約3倍、約5倍、約10倍、約100倍或約1000倍。在某些實施例中，藉由章節6.8中所揭示之一或多種分析來測定rAAV粒子之活體外相對效能(IVRP)。在某些實施例中，在凍乾之前或之後，量測IVRP。在某些實施例中，在復原凍乾調配物之前或之後，量測IVRP。
在某些實施例中，穩定調配物中之rAAV粒子之游離DNA比參考調配物中之相同rAAV粒子之游離DNA低至少約2%、約5%、約7%、約10%、約12%、約15%、約17%、約20%、約25%、約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約100%、約2倍、約3倍、約5倍、約10倍、約100倍或約1000倍。在某些實施例中，藉由章節6.8中所揭示之一或多種分析來測定rAAV粒子之游離DNA。在某些實施例中，在凍乾之前或之後，量測游離DNA。在某些實施例中，在復原凍乾調配物之前或之後，量測游離DNA。
在某些實施例中，穩定調配物中之rAAV粒子之rAAV基因組釋放比參考調配物中之相同rAAV粒子之rAAV基因組釋放降低至少約2%、約5%、約7%、約10%、約12%、約15%、約17%、約20%、約25%、約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約100%、約2倍、約3倍、約5倍、約10倍、約100倍或約1000倍。在某些實施例中，藉由量測在存在DNA特異性螢光染色劑下之相對螢光，來測定rAAV基因組釋放。在某些實施例中，藉由章節6.8中所揭示之一或多種分析，來測定rAAV基因組釋放。在某些實施例中，在凍乾之前或之後，量測rAAV基因組釋放。在某些實施例中，在復原凍乾調配物之前或之後，量測rAAV基因組釋放。
在某些實施例中，在將調配物儲存一段時間之後，例如約1週、約2週、約3週、約4週、約1個月、約2個月、約3個月、約4個月、約5個月、約6個月、約7個月、約8個月、約9個月、約10個月、約11個月、約12個月、約15個月、約18個月、約24個月、約2年、約3年及約4年，穩定調配物中之rAAV粒子具有至多約20%、約15%、約10%、約8%、約5%、約4%、約3%、約2%或約1%之大小變化。在某些實施例中，藉由章節6.8中所揭示之一或多種分析來測定rAAV粒子之大小。在某些實施例中，在冷凍/解凍循環之前或之後，量測大小。
在某些實施例中，在將調配物儲存一段時間之後，例如至少約1週、約2週、約3週、約4週、約1個月、約2個月、約3個月、約4個月、約5個月、約6個月、約7個月、約8個月、約9個月、約10個月、約11個月、約12個月、約15個月、約18個月、約24個月、約2年、約3年及約4年，穩定調配物中之rAAV粒子具有至多20%、15%、10%、8%、5%、4%、3%、2%或1%之大小變化。在某些實施例中，藉由章節6.8中所揭示之一或多種分析來測定rAAV粒子之大小。在某些實施例中，在凍乾之前或之後，量測大小。在某些實施例中，在復原凍乾調配物之前或之後，量測大小。
在某些實施例中，當儲存在-80℃、-70℃、-20℃、4℃、20℃、25℃、30℃、35℃、37℃或40℃下時，穩定調配物中之rAAV粒子比參考調配物中之相同rAAV粒子穩定至少約2%、約5%、約7%、約10%、約12%、約15%、約17%、約20%、約25%、約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約100%、約2倍、約3倍、約5倍、約10倍、約100倍或約1000倍。在某些實施例中，藉由章節6.8中所揭示之一或多種分析來測定rAAV粒子之穩定性。
在某些實施例中，當儲存在-80℃、-70℃、-20℃、4℃、20℃、25℃、30℃、35℃、37℃或40℃下一段時間，例如約1週、約2週、約3週、約4週、約1個月、約2個月、約3個月、約4個月、約5個月、約6個月、約7個月、約8個月、約9個月、約10個月、約11個月、12個月、約15個月、約18個月、約24個月、約2年、約3年及約4年，穩定調配物中之rAAV粒子之感染力比參考調配物中之相同rAAV粒子之感染力高至少2%、5%、7%、10%、12%、15%、17%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、100%、2倍、3倍、5倍、10倍、100倍或1000倍。在某些實施例中，藉由章節6.8中所揭示之一或多種分析來測定rAAV粒子之病毒感染力。
在某些實施例中，當儲存在-80℃、-70℃、-20℃、4℃、20℃、25℃、30℃、35℃、37℃或40℃下一段時間，例如至少約1週、約2週、約3週、約4週、約1個月、約2個月、約3個月、約4個月、約5個月、約6個月、約7個月、約8個月、約9個月、約10個月、約11個月、12個月、約15個月、約18個月、約24個月、約2年、約3年及約4年，穩定調配物中之rAAV粒子之感染力比參考調配物中之相同rAAV粒子之感染力高至少2%、5%、7%、10%、12%、15%、17%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、100%、2倍、3倍、5倍、10倍、100倍或1000倍。在某些實施例中，藉由章節6.8中所揭示之一或多種分析來測定rAAV粒子之病毒感染力。
在某些實施例中，當儲存在-80℃、-70℃、-20℃、4℃、20℃、25℃、30℃、35℃、37℃或40℃下一段時間，例如約1週、約2週、約3週、約4週、約1個月、約2個月、約3個月、約4個月、約5個月、約6個月、約7個月、約8個月、約9個月、約10個月、約11個月、12個月、約15個月、約18個月、約24個月、約2年、約3年及約4年，穩定調配物中之rAAV粒子之聚集比參考調配物中之相同rAAV粒子之聚集低至少2%、5%、7%、10%、12%、15%、17%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、100%、2倍、3倍、5倍、10倍、100倍或1000倍。在某些實施例中，藉由章節6.8中所揭示之一或多種分析來測定rAAV粒子之聚集。
在某些實施例中，當儲存在-80℃、-70℃、-20℃、4℃、20℃、25℃、30℃、35℃、37℃或40℃下一段時間，例如至少約1週、約2週、約3週、約4週、約1個月、約2個月、約3個月、約4個月、約5個月、約6個月、約7個月、約8個月、約9個月、約10個月、約11個月、12個月、約15個月、約18個月、約24個月、約2年、約3年及約4年，穩定調配物中之rAAV粒子之聚集比參考調配物中之相同rAAV粒子之聚集低至少2%、5%、7%、10%、12%、15%、17%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、100%、2倍、3倍、5倍、10倍、100倍或1000倍。在某些實施例中，藉由章節6.8中所揭示之一或多種分析來測定rAAV粒子之聚集。
在某些實施例中，當儲存在-80℃、-70℃、-20℃、4℃、20℃、25℃、30℃、35℃、37℃或40℃下一段時間，例如約1週、約2週、約3週、約4週、約1個月、約2個月、約3個月、約4個月、約5個月、約6個月、約7個月、約8個月、約9個月、約10個月、約11個月、12個月、約15個月、約18個月、約24個月、約2年、約3年及約4年，穩定調配物中之rAAV粒子比參考調配物中之相同rAAV粒子穩定至少2%、5%、7%、10%、12%、15%、17%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、100%、2倍、3倍、5倍、10倍、100倍或1000倍。在某些實施例中，藉由章節6.8中所揭示之一或多種分析來測定rAAV粒子之經一段時間之穩定性。
在某些實施例中，當儲存在-80℃、-70℃、-20℃、4℃、20℃、25℃、30℃、35℃、37℃或40℃下一段時間，例如至少約1週、約2週、約3週、約4週、約1個月、約2個月、約3個月、約4個月、約5個月、約6個月、約7個月、約8個月、約9個月、約10個月、約11個月、12個月、約15個月、約18個月、約24個月、約2年、約3年及約4年，穩定調配物中之rAAV粒子比參考調配物中之相同rAAV粒子穩定至少2%、5%、7%、10%、12%、15%、17%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、100%、2倍、3倍、5倍、10倍、100倍或1000倍。在某些實施例中，藉由章節6.8中所揭示之一或多種分析來測定rAAV粒子之經一段時間之穩定性。
在某些實施例中，當儲存在-80℃、-70℃、-20℃、4℃、20℃、25℃、30℃、35℃、37℃或40℃下一段時間，例如1週、約2週、約3週、約4週、約1個月、約2個月、約3個月、約4個月、約5個月、約6個月、約7個月、約8個月、約9個月、約10個月、約11個月、12個月、約15個月、約18個月、約24個月、約2年、約3年及約4年，穩定調配物中之rAAV粒子之活體外相對效能(IVRP)比參考調配物中之相同rAAV粒子之活體外相對效能高至少2%、5%、7%、10%、12%、15%、17%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、100%、2倍、3倍、5倍、10倍、100倍或1000倍。在某些實施例中，藉由章節6.8中所揭示之一或多種分析來測定rAAV粒子之活體外相對效能(IVRP)。
在某些實施例中，當儲存在-80℃、-70℃、-20℃、4℃、20℃、25℃、30℃、35℃、37℃或40℃下一段時間，例如至少約1週、約2週、約3週、約4週、約1個月、約2個月、約3個月、約4個月、約5個月、約6個月、約7個月、約8個月、約9個月、約10個月、約11個月、12個月、約15個月、約18個月、約24個月、約2年、約3年及約4年，穩定調配物中之rAAV粒子之活體外相對效能(IVRP)比參考調配物中之相同rAAV粒子之活體外相對效能高至少2%、5%、7%、10%、12%、15%、17%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、100%、2倍、3倍、5倍、10倍、100倍或1000倍。在某些實施例中，藉由章節6.8中所揭示之一或多種分析來測定rAAV粒子之活體外相對效能(IVRP)。
在某些實施例中，當儲存在-80℃、-70℃、-20℃、4℃、20℃、25℃、30℃、35℃、37℃或40℃下一段時間，例如約1週、約2週、約3週、約4週、約1個月、約2個月、約3個月、約4個月、約5個月、約6個月、約7個月、約8個月、約9個月、約10個月、約11個月、12個月、約15個月、約18個月、約24個月、約2年、約3年及約4年，穩定調配物中之rAAV粒子之活體外相對效能(IVRP)比參考調配物中之相同rAAV粒子之活體外相對效能高至少2%、5%、7%、10%、12%、15%、17%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、100%、2倍、3倍、5倍、10倍、100倍或1000倍。在某些實施例中，藉由章節6.8中所揭示之一或多種分析來測定rAAV粒子之活體外相對效能(IVRP)。
在某些實施例中，當儲存在-80℃、-70℃、-20℃、4℃、20℃、25℃、30℃、35℃、37℃或40℃下一段時間，例如至少約1週、約2週、約3週、約4週、約1個月、約2個月、約3個月、約4個月、約5個月、約6個月、約7個月、約8個月、約9個月、約10個月、約11個月、12個月、約15個月、約18個月、約24個月、約2年、約3年及約4年，穩定調配物中之rAAV粒子之活體外相對效能(IVRP)比參考調配物中之相同rAAV粒子之活體外相對效能高至少2%、5%、7%、10%、12%、15%、17%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、100%、2倍、3倍、5倍、10倍、100倍或1000倍。在某些實施例中，藉由章節6.8中所揭示之一或多種分析來測定rAAV粒子之活體外相對效能(IVRP)。
在某些實施例中，當儲存在-80℃、-70℃、-20℃、4℃、20℃、25℃、30℃、35℃、37℃或40℃下一段時間，例如約1週、約2週、約3週、約4週、約1個月、約2個月、約3個月、約4個月、約5個月、約6個月、約7個月、約8個月、約9個月、約10個月、約11個月、12個月、約15個月、約18個月、約24個月、約2年、約3年及約4年，穩定調配物中之rAAV粒子之游離DNA比參考調配物中之相同rAAV粒子之游離DNA低至少2%、5%、7%、10%、12%、15%、17%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、100%、2倍、3倍、5倍、10倍、100倍或1000倍。在某些實施例中，藉由章節6.8中所揭示之一或多種分析來測定rAAV粒子之游離DNA。
在某些實施例中，當儲存在-80℃、-70℃、-20℃、4℃、20℃、25℃、30℃、35℃、37℃或40℃下一段時間，例如至少約1週、約2週、約3週、約4週、約1個月、約2個月、約3個月、約4個月、約5個月、約6個月、約7個月、約8個月、約9個月、約10個月、約11個月、12個月、約15個月、約18個月、約24個月、約2年、約3年及約4年，穩定調配物中之rAAV粒子之游離DNA比參考調配物中之相同rAAV粒子之游離DNA低至少2%、5%、7%、10%、12%、15%、17%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、100%、2倍、3倍、5倍、10倍、100倍或1000倍。在某些實施例中，藉由章節6.8中所揭示之一或多種分析來測定rAAV粒子之游離DNA。
在某些實施例中，當儲存在-80℃、-70℃、-20℃、4℃、20℃、25℃、30℃、35℃、37℃或40℃下一段時間，例如約1週、約2週、約3週、約4週、約1個月、約2個月、約3個月、約4個月、約5個月、約6個月、約7個月、約8個月、約9個月、約10個月、約11個月、約12個月、約15個月、約18個月、約24個月、約2年、約3年及約4年，穩定調配物中之rAAV粒子具有至多20%、15%、10%、8%、5%、4%、3%、2%或1%之大小變化。在某些實施例中，藉由章節6.8中所揭示之一或多種分析來測定rAAV粒子之大小。
在某些實施例中，當儲存在-80℃、-70℃、-20℃、4℃、20℃、25℃、30℃、35℃、37℃或40℃下一段時間，例如至少約1週、約2週、約3週、約4週、約1個月、約2個月、約3個月、約4個月、約5個月、約6個月、約7個月、約8個月、約9個月、約10個月、約11個月、約12個月、約15個月、約18個月、約24個月、約2年、約3年及約4年，穩定調配物中之rAAV粒子具有至多20%、15%、10%、8%、5%、4%、3%、2%或1%之大小變化。在某些實施例中，藉由章節6.8中所揭示之一或多種分析來測定rAAV粒子之大小。在某些實施例中，參考調配物為具有0.001%泊洛沙姆188之DPBS緩衝液。
在某些實施例中，參考調配物為不包含糖之調配物。在某些實施例中，參考調配物為不包含塑化劑之調配物。
在某些實施例中，在凍乾過程中將調配物冷凍至約-20℃之溫度。在某些實施例中，當冷凍降至-20℃時，冷凍調配物保持約pH 6至約pH 9之間的pH。在某些實施例中，當冷凍降至-20℃時，冷凍調配物保持在冷凍前之pH值±1單位範圍內之pH值。
在某些實施例中，調配物之凍乾餅之玻璃轉化溫度(Tg)高於35℃。
在某些實施例中，調配物之最大冷凍濃縮溶液之玻璃轉化溫度(Tg')高於-40℃。
在某些實施例中，水分含量在約0.5%與約1%之間。在某些實施例中，水分含量在約1%與約2%之間。在某些實施例中，水分含量在約2%與約3%之間。在某些實施例中，水分含量在約3%與約4%之間。在某些實施例中，水分含量在約4%與約5%之間。
在某些實施例中，水分含量為約0.1%、約0.2%、約0.3%、約0.4%、約0.5%、約0.6%、約0.8%、約1.0%、約1.2%、約1.2%、約1.3%、約1.4%、約1.5%、約1.6%、約1.7%、約1.8%、約1.9%、約2.0%、約3.0%、約4.0%或約5.0%。
如本文所用且除非另外規定，否則術語「約」意謂在既定值或範圍之±10%內。在某些實施例中，術語「約」涵蓋所敍述之確切數字。 6.8 分析
熟練人員可使用如本文所描述之分析及/或此項技術中已知之技術來研究本文所描述之組合物及方法，例如用於測試本文提供之調配物。章節8中提供之實例亦更詳細地說明此類分析可如何用於測試本文提供之調配物。
如Li等人, 2019 Cell & Gene Therapy Insights, 5(4):537-547 (其以全文引用之方式併入本文中)所描述，例示性分析包括但(不限於)以下：(1)數位液滴PCR (ddPCR)，其用於基因組複本測定；(2)藉由分光光度法進行對AAV之基因組含量及滿衣殼%分析；(3)尺寸排阻層析，用以測定DNA分佈及衣殼純度；(4)使用毛細電泳法評定衣殼病毒蛋白質純度；(5)活體外效能方法--相對感染力，作為用於量化活體外AAV載體之感染力之差異的可靠方法；及(6)分析性超速離心(AUC)，用以測定衣殼空/滿比率及大小分佈。 6.8.1 溫度脅迫分析
溫度脅迫發展穩定性研究可在選擇濃度下在一段時間內進行，例如在-80℃、-70℃、-20℃、4℃、20℃、25℃、30℃、35℃、37℃或40℃下約1週、約2週、約3週、約4週、約1個月、約2個月、約3個月、約4個月、約5個月、約6個月、約7個月、約8個月、約9個月、約10個月、約11個月、約12個月、約15個月、約18個月、約24個月、約2年、約3年或約4年，以評價本文提供之調配物的相對穩定性。
分析可用於評定穩定性，包括(但不限於)活體外相對效能(IVRP)、載體基因組濃度(VGC，藉由ddPCR)、游離DNA(藉由染料螢光)、動態光散射、外觀、感染力、效能及pH。 6.8.2 長期穩定性分析
可進行長期發展穩定性研究12個月，以證明本文提供之調配物之活體外相對效能之維持及在-80℃ (≤-60℃)及-20℃ (-25℃至-15℃)下之其他性質。 6.8.3 活體外相對效能(IVRP)分析
為了使ddPCR GC效價與基因表現相關，可藉由轉導HEK293細胞及分析細胞培養物上清液之抗VEGF Fab蛋白質水準，來進行活體外生物分析。將HEK293細胞塗鋪至三個聚D-離胺酸塗覆之96孔組織培養盤上隔夜。隨後，細胞用野生型人類Ad5病毒預感染，隨後用三個獨立製備的rAAV參考標準物及測試物品之連續稀釋液轉導，其中各製劑塗鋪至單獨培養盤上之不同位置。在轉導後第三天，自培養盤收集細胞培養基，且經由ELISA量測其VEGF結合Fab蛋白質水準。對於ELISA而言，塗覆有VEGF之96孔ELISA盤經阻斷，且隨後與所收集之細胞培養基一起培育，以捕獲HEK293細胞產生之抗VEGF Fab。使用Fab特異性抗人類IgG抗體來偵測捕獲VEGF之Fab蛋白質。在洗滌之後，添加辣根過氧化酶(HRP)受質溶液，允許發展，用終止緩衝液終止，且在讀盤器中閱讀培養盤。繪製相對於對數稀釋之HRP產物之吸光度或OD，且計算各測試物品相對於同一培養盤上之參考標準物之相對效能，其用在經過平行度相似性測試後之四參數邏輯回歸模型擬合，使用式：EC50參考物÷EC50測試物品。測試物品之效能報導為根據三個培養盤之加權平均計算之參考標準物效能之百分比。
為了使ddPCR GC效價與功能性基因表現相關，可藉由轉導HEK293細胞及分析其轉殖基因(例如酶)活性，來進行活體外生物分析。將HEK293細胞塗鋪至三個96孔組織培養盤上隔夜。隨後，細胞用野生型人類腺病毒血清型5病毒預感染，隨後用三個獨立製備之酶參考標準物及測試物品之連續稀釋液轉導，其中各製劑塗鋪至單獨培養盤上之不同位置。在轉導後第二天，將細胞裂解，用低pH處理以使酶活化，且使用在藉由轉殖基因(酶)裂解後產生增加之螢光信號的肽受質來分析其酶活性。繪製相對於對數稀釋之螢光或RFU，且計算各測試物品相對於同一培養盤上之參考標準物之相對效能，其用經過平行度相似性測試後之四參數邏輯回歸模型擬合，使用式：EC50參考物÷EC50測試物品。測試物品之效能報導為根據三個培養盤之加權平均計算之參考標準物效能之百分比。 6.8.4 載體基因組濃度分析
亦可使用ddPCR來評價載體基因組濃度GC。 6.8.5 使用染料螢光分析之游離DNA分析
可藉由與DNA結合之SYBR® Gold核酸凝膠染色劑(「SYBR金染料」)之螢光來測定游離DNA。螢光可使用微量盤讀取器來量測且用DNA標準物進行定量。結果可以ng/µL為單位報導。
可使用兩種來估計總DNA，以便將以ng/µL為單位之所量測之游離DNA轉化為游離DNA之百分比。在第一種方法中，藉由UV可見光光譜分析測定之GC/mL (OD)用於估計樣本中之總DNA，其中M為DNA之分子量且1E6為單位轉化因子：
所估計之總DNA (ng/µL) = 1E6 × GC/mL (OD)×M (g/mol)/6.02E23
在第二種方法中，可將樣本與例如0.05%泊洛沙姆188一起加熱至85℃持續20 min，且藉由SYBR金染料分析量測之加熱樣本中之所量測實際DNA可用作總DNA。因此，此具有假設，回收所有DNA且進行定量。將游離DNA之ng/µL轉化為游離DNA之百分比之任何變化可捕獲為報導結果中之範圍)。對於趨勢而言，可使用原始ng/µL或可使用藉由一貫方法所測定之百分比。 6.8.6 尺寸排阻層析(SEC)
SEC可使用具有25 mm路徑長度流槽之Waters Acquity Arc Equipment ID 0447 (C3PO)上之Sepax SRT SEC-1000 Peek管柱(PN 215950P-4630，SN：8A11982，LN：BT090，5 µm 1000A，4.6×300mm)來進行。移動相可例如為20 mM磷酸鈉、300 mM NaCl、0.005%泊洛沙姆188，pH 6.5，其中0.35毫升/分鐘之流速持續20分鐘，其中管柱在環境溫度下。可用2點/秒取樣速率進行資料收集，且25點之1.2 nm解析度意謂在214、260及280 nm下平滑。理想目標負載可為1.5E11 GC。可對樣本注射50 µL，約1/3之理想目標或注射5 µL。 6.8.7 動態光散射(DLS)分析
可在Wyatt DynaProIII上，使用Corning 3540 384孔盤來進行動態光散射(DLS)，其中樣本體積為30 µL。可每重複各自收集十個採集持續10 s，且對每樣本進行三個重複量測。可根據樣本中使用之溶劑設定溶劑，例如對於含rAAV之dPBS為「PBS」，及對於含rAAV之具有蔗糖樣本之改良dPBS為「4%蔗糖」。可「標記」不滿足資料質量標準(基線、SOS、雜訊、擬合)之結果且排除在分析外。對於具有蔗糖樣本之改良dPBS，低延遲時間截止值可自1.4 µs改變為10 µs，以消除在約1 nm處之蔗糖賦形劑峰對於引起人工低高階累積分析直徑結果之影響。 6.8.8 差示掃描熱量法
可使用TA Instruments DSC250運行低溫差示掃描熱量法(低溫DSC)。可將約20 µL樣本負載至Tzero盤中且用Tzero密封蓋旋緊。可將樣本在25℃下平衡2 min，隨後以5℃/min冷卻至-60℃，平衡2 min，隨後以5℃/min加熱至25℃。可以習知模式收集熱流資料。 6.8.9 即時緩衝液pH追蹤
用可偵測低至-30℃之pH之INLAB COOL PRO-ISM低溫pH探針，監測不同調配物緩衝液之pH。將一毫升緩衝液置於15 mL Falcon管中，且隨後將pH探針浸沒於緩衝液中。使用一片封口膜來密封Falcon管與pH探針之間的間隙以避免污染及蒸發。將探針以及Falcon管置於-20 AD冰箱中。每2.5 min記錄緩衝液之pH及溫度，持續約20小時或直至pH與溫度行為達成重複模式為止。由自動除霜過程引起之溫度變化為緩衝液pH穩定性創造脅迫條件。 6.8.10 密度量測
可用Anton Paar DMA500密度計，使用水作為參考物來量測密度。密度計可用水洗滌且隨後用甲醇洗滌，隨後在樣本間風乾。 6.8.11 黏度量測
可使用此項技術中已知之方法，例如2019年公開之《美國藥典》(the United States Pharmacopeia；USP)及其先前版本(以全文引用之方式併入本文中)中提供之方法，來量測黏度。 6.8.12 病毒感染力分析
可使用如François等人 Molecular Therapy Methods & Clinical Development (2018) 第10卷, 第223-236頁(以全文引用之方式併入本文中)中所描述之TCID50 感染力效價分析。可使用如2018年10月15日申請之臨時申請案62/745859中所描述之相對感染力分析。 6.8.13 結晶及玻璃化轉變溫度
例示性方法描述於Croyle等人, 2001, Gene Ther. 8(17):1281-90 (以全文引用之方式併入本文中)中。 7. 序列表
SEQ ID NO: 描述 序列
1 AAV1 MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWDLKPGAPKPKANQQKQDDGRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLKAGDNPYLRYNHADAEFQERLQEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEGAKTAPGKKRPVEQSPQEPDSSSGIGKTGQQPAKKRLNFGQTGDSESVPDPQPLGEPPATPAAVGPTTMASGGGAPMADNNEGADGVGNASGNWHCDSTWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSASTGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTTNDGVTTIANNLTSTVQVFSDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFTFSYTFEEVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLNRTQNQSGSAQNKDLLFSRGSPAGMSVQPKNWLPGPCYRQQRVSKTKTDNNNSNFTWTGASKYNLNGRESIINPGTAMASHKDDEDKFFPMSGVMIFGKESAGASNTALDNVMITDEEEIKATNPVATERFGTVAVNFQSSSTDPATGDVHAMGALPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKNPPPQILIKNTPVPANPPAEFSATKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEVQYTSNYAKSANVDFTVDNNGLYTEPRPIGTRYLTRPL
2 AAV2 MAADGYLPDWLEDTLSEGIRQWWKLKPGPPPPKPAERHKDDSRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNEADAAALEHDKAYDRQLDSGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEPVKTAPGKKRPVEHSPVEPDSSSGTGKAGQQPARKRLNFGQTGDADSVPDPQPLGQPPAAPSGLGTNTMATGSGAPMADNNEGADGVGNSSGNWHCDSTWMGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSQSGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTQNDGTTTIANNLTSTVQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMVPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFTFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTNTPSGTTTQSRLQFSQAGASDIRDQSRNWLPGPCYRQQRVSKTSADNNNSEYSWTGATKYHLNGRDSLVNPGPAMASHKDDEEKFFPQSGVLIFGKQGSEKTNVDIEKVMITDEEEIRTTNPVATEQYGSVSTNLQRGNRQAATADVNTQGVLPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPANPSTTFSAAKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYNKSVNVDFTVDTNGVYSEPRPIGTRYLTRNL
3 AAV3-3 MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWALKPGVPQPKANQQHQDNRRGLVLPGYKYLGPGNGLDKGEPVNEADAAALEHDKAYDQQLKAGDNPYLKYNHADAEFQERLQEDTSFGGNLGRAVFQAKKRILEPLGLVEEAAKTAPGKKGAVDQSPQEPDSSSGVGKSGKQPARKRLNFGQTGDSESVPDPQPLGEPPAAPTSLGSNTMASGGGAPMADNNEGADGVGNSSGNWHCDSQWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSQSGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKKLSFKLFNIQVRGVTQNDGTTTIANNLTSTVQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMVPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFQFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLNRTQGTTSGTTNQSRLLFSQAGPQSMSLQARNWLPGPCYRQQRLSKTANDNNNSNFPWTAASKYHLNGRDSLVNPGPAMASHKDDEEKFFPMHGNLIFGKEGTTASNAELDNVMITDEEEIRTTNPVATEQYGTVANNLQSSNTAPTTGTVNHQGALPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKHPPPQIMIKNTPVPANPPTTFSPAKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYNKSVNVDFTVDTNGVYSEPRPIGTRYLTRNL
4 AAV4-4 MTDGYLPDWLEDNLSEGVREWWALQPGAPKPKANQQHQDNARGLVLPGYKYLGPGNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLKAGDNPYLKYNHADAEFQQRLQGDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEQAGETAPGKKRPLIESPQQPDSSTGIGKKGKQPAKKKLVFEDETGAGDGPPEGSTSGAMSDDSEMRAAAGGAAVEGGQGADGVGNASGDWHCDSTWSEGHVTTTSTRTWVLPTYNNHLYKRLGESLQSNTYNGFSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGMRPKAMRVKIFNIQVKEVTTSNGETTVANNLTSTVQIFADSSYELPYVMDAGQEGSLPPFPNDVFMVPQYGYCGLVTGNTSQQQTDRNAFYCLEYFPSQMLRTGNNFEITYSFEKVPFHSMYAHSQSLDRLMNPLIDQYLWGLQSTTTGTTLNAGTATTNFTKLRPTNFSNFKKNWLPGPSIKQQGFSKTANQNYKIPATGSDSLIKYETHSTLDGRWSALTPGPPMATAGPADSKFSNSQLIFAGPKQNGNTATVPGTLIFTSEEELAATNATDTDMWGNLPGGDQSNSNLPTVDRLTALGAVPGMVWQNRDIYYQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLIGGFGLKHPPPQIFIKNTPVPANPATTFSSTPVNSFITQYSTGQVSVQIDWEIQKERSKRWNPEVQFTSNYGQQNSLLWAPDAAGKYTEPRAIGTRYLTHHL
5 AAV5 MSFVDHPPDWLEEVGEGLREFLGLEAGPPKPKPNQQHQDQARGLVLPGYNYLGPGNGLDRGEPVNRADEVAREHDISYNEQLEAGDNPYLKYNHADAEFQEKLADDTSFGGNLGKAVFQAKKRVLEPFGLVEEGAKTAPTGKRIDDHFPKRKKARTEEDSKPSTSSDAEAGPSGSQQLQIPAQPASSLGADTMSAGGGGPLGDNNQGADGVGNASGDWHCDSTWMGDRVVTKSTRTWVLPSYNNHQYREIKSGSVDGSNANAYFGYSTPWGYFDFNRFHSHWSPRDWQRLINNYWGFRPRSLRVKIFNIQVKEVTVQDSTTTIANNLTSTVQVFTDDDYQLPYVVGNGTEGCLPAFPPQVFTLPQYGYATLNRDNTENPTERSSFFCLEYFPSKMLRTGNNFEFTYNFEEVPFHSSFAPSQNLFKLANPLVDQYLYRFVSTNNTGGVQFNKNLAGRYANTYKNWFPGPMGRTQGWNLGSGVNRASVSAFATTNRMELEGASYQVPPQPNGMTNNLQGSNTYALENTMIFNSQPANPGTTATYLEGNMLITSESETQPVNRVAYNVGGQMATNNQSSTTAPATGTYNLQEIVPGSVWMERDVYLQGPIWAKIPETGAHFHPSPAMGGFGLKHPPPMMLIKNTPVPGNITSFSDVPVSSFITQYSTGQVTVEMEWELKKENSKRWNPEIQYTNNYNDPQFVDFAPDSTGEYRTTRPIGTRYLTRPL
6 AAV6 MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWDLKPGAPKPKANQQKQDDGRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLKAGDNPYLRYNHADAEFQERLQEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPFGLVEEGAKTAPGKKRPVEQSPQEPDSSSGIGKTGQQPAKKRLNFGQTGDSESVPDPQPLGEPPATPAAVGPTTMASGGGAPMADNNEGADGVGNASGNWHCDSTWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSASTGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTTNDGVTTIANNLTSTVQVFSDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFTFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLNRTQNQSGSAQNKDLLFSRGSPAGMSVQPKNWLPGPCYRQQRVSKTKTDNNNSNFTWTGASKYNLNGRESIINPGTAMASHKDDKDKFFPMSGVMIFGKESAGASNTALDNVMITDEEEIKATNPVATERFGTVAVNLQSSSTDPATGDVHVMGALPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPANPPAEFSATKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEVQYTSNYAKSANVDFTVDNNGLYTEPRPIGTRYLTRPL
7 AAV7 MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWDLKPGAPKPKANQQKQDNGRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLKAGDNPYLRYNHADAEFQERLQEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEGAKTAPAKKRPVEPSPQRSPDSSTGIGKKGQQPARKRLNFGQTGDSESVPDPQPLGEPPAAPSSVGSGTVAAGGGAPMADNNEGADGVGNASGNWHCDSTWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSETAGSTNDNTYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKKLRFKLFNIQVKEVTTNDGVTTIANNLTSTIQVFSDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNNGSQSVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFEFSYSFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLARTQSNPGGTAGNRELQFYQGGPSTMAEQAKNWLPGPCFRQQRVSKTLDQNNNSNFAWTGATKYHLNGRNSLVNPGVAMATHKDDEDRFFPSSGVLIFGKTGATNKTTLENVLMTNEEEIRPTNPVATEEYGIVSSNLQAANTAAQTQVVNNQGALPGMVWQNRDVYLQGPIWAKIPHTDGNFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPANPPEVFTPAKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNFEKQTGVDFAVDSQGVYSEPRPIGTRYLTRNL
8 AAV8 MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWALKPGAPKPKANQQKQDDGRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLQAGDNPYLRYNHADAEFQERLQEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEGAKTAPGKKRPVEPSPQRSPDSSTGIGKKGQQPARKRLNFGQTGDSESVPDPQPLGEPPAAPSGVGPNTMAAGGGAPMADNNEGADGVGSSSGNWHCDSTWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISNGTSGGATNDNTYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLSFKLFNIQVKEVTQNEGTKTIANNLTSTIQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFQFTYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTQTTGGTANTQTLGFSQGGPNTMANQAKNWLPGPCYRQQRVSTTTGQNNNSNFAWTAGTKYHLNGRNSLANPGIAMATHKDDEERFFPSNGILIFGKQNAARDNADYSDVMLTSEEEIKTTNPVATEEYGIVADNLQQQNTAPQIGTVNSQGALPGMVWQNRDVYLQGPIWAKIPHTDGNFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPADPPTTFNQSKLNSFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYYKSTSVDFAVNTEGVYSEPRPIGTRYLTRNL
9 hu31 MAADGYLPDWLEDTLSEGIRQWWKLKPGPPPPKPAERHKDDSRGLVLPGYKYLGPGNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLKAGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRLLEPLGLVEEAAKTAPGKKRPVEQSPQEPDSSAGIGKSGSQPAKKKLNFGQTGDTESVPDPQPIGEPPAAPSGVGSLTMASGGGAPVADNNEGADGVGSSSGNWHCDSQWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISNSTSGGSSNDNAYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTDNNGVKTIANNLTSTVQVFTDSDYQLPYVLGSAHEGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNDGGQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFQFSYEFENVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSKTINGSGQNQQTLKFSVAGPSNMAVQGRNYIPGPSYRQQRVSTTVTQNNNSEFAWPGASSWALNGRNSLMNPGPAMASHKEGEDRFFPLSGSLIFGKQGTGRDNVDADKVMITNEEEIKTTNPVATESYGQVATNHQSAQAQAQTGWVQNQGILPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGNFHPSPLMGGFGMKHPPPQILIKNTPVPADPPTAFNKDKLNSFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYYKSNNVEFAVSTEGVYSEPRPIGTRYLTRNL
10 hu32 MAADGYLPDWLEDTLSEGIRQWWKLKPGPPPPKPAERHKDDSRGLVLPGYKYLGPGNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLKAGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRLLEPLGLVEEAAKTAPGKKRPVEQSPQEPDSSAGIGKSGSQPAKKKLNFGQTGDTESVPDPQPIGEPPAAPSGVGSLTMASGGGAPVADNNEGADGVGSSSGNWHCDSQWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISNSTSGGSSNDNAYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTDNNGVKTIANNLTSTVQVFTDSDYQLPYVLGSAHEGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNDGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFQFSYEFENVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSKTINGSGQNQQTLKFSVAGPSNMAVQGRNYIPGPSYRQQRVSTTVTQNNNSEFAWPGASSWALNGRNSLMNPGPAMASHKEGEDRFFPLSGSLIFGKQGTGRDNVDADKVMITNEEEIKTTNPVATESYGQVATNHQSAQAQAQTGWVQNQGILPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGNFHPSPLMGGFGMKHPPPQILIKNTPVPADPPTAFNKDKLNSFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYYKSNNVEFAVNTEGVYSEPRPIGTRYLTRNL
11 AAV9 MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWALKPGAPQPKANQQHQDNARGLVLPGYKYLGPGNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLKAGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRLLEPLGLVEEAAKTAPGKKRPVEQSPQEPDSSAGIGKSGAQPAKKRLNFGQTGDTESVPDPQPIGEPPAAPSGVGSLTMASGGGAPVADNNEGADGVGSSSGNWHCDSQWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISNSTSGGSSNDNAYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTDNNGVKTIANNLTSTVQVFTDSDYQLPYVLGSAHEGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNDGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFQFSYEFENVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSKTINGSGQNQQTLKFSVAGPSNMAVQGRNYIPGPSYRQQRVSTTVTQNNNSEFAWPGASSWALNGRNSLMNPGPAMASHKEGEDRFFPLSGSLIFGKQGTGRDNVDADKVMITNEEEIKTTNPVATESYGQVATNHQSAQAQAQTGWVQNQGILPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGNFHPSPLMGGFGMKHPPPQILIKNTPVPADPPTAFNKDKLNSFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYYKSNNVEFAVNTEGVYSEPRPIGTRYLTRNL
8. 實例 8.1 實例1：AAV基因療法產物之調配物及遞送挑戰.
腺相關病毒(AAV)為研究最旺盛的基因療法載體之一，受到令人鼓舞的臨床結果及商業認可增加之前景增強。除表明安全性及功效以外，AAV產物在製造、運送、儲存及投與期間必須保持穩定及強效的。對於AAV之商業化，鑑別提供穩定性延長時間段之調配物為有必要的。鑑別在冷藏條件下或在室溫下為穩定的以避免需要在冷凍條件下運送及儲存之調配物應為有利的。對於必須冷凍之產品，調配物必須能夠抵擋冷凍所引入之脅迫。
藉由顯著地降低溶液中發生之降解路徑之速率，乾燥調配物提供改良穩定性之潛能。凍乾或冷凍乾燥的調配物在冷凍及乾燥步驟期間必須為穩定的。此外，進行凍乾之調配物應始終產生精緻的餅；必須謹慎地選擇調配物組分以減輕自凍乾過程產品塌陷之風險。
相較於傳統蛋白質治療劑，AAV存在獨特的調配物挑戰。此等挑戰包括AAV粒子之複雜性質、分析學、大分子之填充/修整挑戰、缺乏公開穩定性/調配物資訊及由投與途徑造成之限制。
AAV粒子為易受不同化學及物理降解路徑影響之不同蛋白質與核酸之複雜大分子組裝件。關於針對單一大分子實體(例如多肽，諸如抗體，或核酸)開發之調配物之資訊並不提供以下合理的期望：包含多肽及核酸組分之AAV粒子亦將在相同調配物中穩定。缺乏適合於工業用途之GMP順應性分析亦妨礙AAV調配物開發。在該領域中存在對於不精確生物分析之重度依賴。AAV特異性降解路徑需要進行鑑別。病毒粒子聚集造成對於填充/修整方法之挑戰，此係因為其可引起在0.2 μm過濾後之損失。缺少關於AAV粒子之公開穩定性/調配物資訊。此部分地係歸因於對於冷凍儲存(≤ -60℃)於基於PBS之緩衝液中之常見預設的重度依賴。關於針對計劃用於一些rAAV產品之某些投與途徑(諸如視網膜下及鞘內)之調配物之資訊亦極其有限。總之，此等及其他挑戰使得新穎穩定AAV調配物之開發為極其不可預測的冒險。 8.2 實例2.聚集為一種AAV調配物挑戰.
已描述AAV粒子聚集，其中據報導需要至少200 mM之溶液離子強度來防止此聚集。美國專利9,051,542。
需要最小離子強度來防止聚集或AAV粒子之自結合。(圖1A及圖1B)。發現，防止粒子聚集或自結合所需之最小離子強度為AAV血清型依賴性的。可在低於200 mM之離子強度下防止AAV8聚集(圖2)，且相較於AAV8，AAV9所需之離子強度更小(圖3)。用較少鹽調配之能力對於冷凍及乾燥調配物而言為有利的。然而，粒子聚集之血清型特異性差異指示，不同血清型可能需要不同調配物。 8.3 實例3.冷凍調配物中之rAAV基因組釋放為一種調配物挑戰.
防止聚集為必需的但並不足以確保穩定的藥物產品。能夠防止粒子聚集之儲存在25℃下於調配物中之病毒粒子之相對效能顯著地低於儲存在-80℃下於相同調配物中之病毒粒子之相對效能。此指示在溶液中病毒粒子存在額外降解路徑。
發現，在冷凍期間之調配物組分之結晶促進自AAV載體粒子損失載體DNA。先前尚未報導此類型之載體DNA損失及其對於調配物開發之應用。此DNA損失可藉由以下兩種調配方法中之任一者來減輕：(1)用非結晶鹽而非在冷凍期間結晶之鹽來調配；及(2)在調配物中包括抑制結晶之組分(例如糖)。
相較於對照，在3個凍融循環之後，偵測到病毒基因組釋放增加。圖5。基因組釋放之程度受到調配物中之鹽類型的影響。在NaCl存在下之凍融循環比在檸檬酸鈉存在下之凍融循環引起更多的基因組釋放。圖5顯示SYBR金與在NaCl (A) (其在冷凍期間結晶)存在下釋放之DNA的結合，但在檸檬酸鈉(B) (其保持非晶形)中的結合為極少的。
檢查在Tris、磷酸鈉及組胺酸緩衝液中之在冷凍後之結晶鹽誘發之病毒基因組釋放。圖6。在此等緩衝液中之每一者中，NaCl之存在引起在NaCl存在下偵測到之病毒基因組釋放比在非晶形檸檬酸鈉存在下的更多。
在調配物中包括抑制結晶之組分(例如糖)降低在冷凍後的病毒基因組釋放。亦偵測在10個凍融循環之後PBS中之病毒基因組釋放。圖7A。調配物中包括4%蔗糖防止在冷凍後病毒基因組釋放。圖7B。
非晶形糖之添加抑制共溶質結晶，導致較少DNA釋放。圖8。使用不同質量比率之甘露醇與蔗糖來調配AAV，包括3份甘露醇與1份蔗糖、2份甘露醇與2份蔗糖、1份蔗糖與3份甘露醇、及4份蔗糖無甘露醇及4份甘露醇無蔗糖。在三個冷凍/解凍之後，隨著蔗糖(其為非晶形)與甘露醇(其結晶)之比率增加，DNA釋放降低。在較高比率之蔗糖與甘露醇下，游離DNA釋放完全抑制，如藉由等效於未冷凍對照所證明。 8.4 實例4. AAV之凍乾呈現獨特挑戰.
如上文所論述，需要最小溶液離子強度來防止粒子聚集。在凍乾期間，鹽一般降低塌陷溫度，除非其完全結晶。然而，結晶促進在冷凍後之DNA釋放。且基因組複本(GC)損失引起凍乾後相對效能之並行損失。圖9。AAV粒子之凍乾過程必須找到一種方法來防止調配物組分結晶而不降低塌陷溫度至不可接受的水準。測試包含緩衝液(Tris、磷酸鹽及組胺酸)、鹽(NaCl及檸檬酸鈉)及賦形劑(甘露醇、蔗糖及甘油)之多種不同調配物。所測試之所有調配物均包含普洛尼克F-68。
最大限度冷凍濃縮的溶液之玻璃轉化溫度(Tg ' )為與塌陷溫度緊密相關之參數。發現蔗糖/檸檬酸鹽調配物中之Tg ' 高於純蔗糖(-32℃) (Chang及Randall,Cryobiology , 29: 632-656 (1992))及檸檬酸鈉(-43℃) (Izutsu等人,Chem Pharm Bull , 57: 1231-1236 (2009))之個別Tg ' 值。此結果可能歸因於兩種分子之間的相互作用。Kets等人,Cryobiology , 48: 46-54 (2004)。蔗糖/檸檬酸鹽調配物之此特性使得其對於凍乾過程開發更有利同時亦提供所需離子強度以防止AAV聚集。 8.5 實例5. AAV之凍乾呈現獨特挑戰.
冷凍溶液之pH影響凍乾調配物之穩定性。藉由量測在25℃下儲存6個月後之相對效能，來評定3個凍乾rAAV調配物之穩定性。圖10。調配物1、2及3分別包含磷酸鹽緩衝液、Tris緩衝液及組胺酸緩衝液。在冷凍後，調配物1經受自pH 7.5至更酸性pH之pH位移，如由液體與冷凍調配物之間的色差指示。調配物2 (pH 7.5)及3 (pH 6.5)之pH仍穩定。在25℃下儲存6個月之後，調配物1及3之相對效能比調配物2之相對效能更顯著地降低。
比較包含Tris或磷酸鹽緩衝液之凍乾AAV8調配物之穩定性。非凍乾對照(「液體」)、凍乾後(after lyophilization) (「凍乾後(Post Lyo)」)及3個月與6個月室溫儲存後之調配物之相對效能百分比顯示於圖11中。磷酸鹽緩衝液調配物之相對效能比Tris調配物之相對效能更顯著地下降。在冷凍期間，磷酸鹽緩衝液進行酸性pH位移。 8.6 實例6.殘餘水分含量影響rAAV穩定性.
生成包含不同殘餘水分水準之凍乾調配物之穩定性資料。圖13及圖14。發現在中等水分水準下具有最高穩定性。儘可能地乾燥未必得到最佳穩定性。過度乾燥引起rAAV粒子增加釋放rAAV基因組。圖15。
過量殘餘水分可經由凍乾餅之塑化機制而使rAAV粒子穩定。因此，塑化劑或穩定劑(諸如甘油)可在調配物中用作較高殘餘水分之取代物。塑化劑或穩定劑(例如甘油)之使用提供穩定性改良之益處同時亦允許簡單靶向大量水之移除的乾燥過程。
雖然已結合目前被視為最實用且較佳實施例之內容來描述所揭示之方法，但應理解，本發明所涵蓋之方法不應限於所揭示之實施例，而相反，其意欲涵蓋包括在隨附申請專利範圍之精神及範疇內的各種修改及等效配置。
出於所有目的，在本文中所引用之全部公開案、專利、專利申請案、網際網路站點及寄存編號/資料庫序列(包括聚核苷酸及多肽序列兩者)以全文引用之方式併入本文中，其程度如同專門及單獨指示各個別公開案、專利、專利申請案、網際網路站點或寄存編號/資料庫序列因此以引用之方式併入一般。 8.7 實例7.需要獨特賦形劑組成來使凍乾調配物中之AAV穩定.
為了評價緩衝液系統、塑化劑及鹽/增積劑之影響，比較凍乾研究1之五種不同調配物(表1)。在表2中比較在40℃脅迫研究下一個月後、及在25℃與5℃下12個月後之載體基因組含量(VGC)/病毒效價及效能資料。表2中所列舉之調配物及其濃度為凍乾前 賦形劑濃度。用磷酸鈉緩衝之所有調配物(調配物1、2、3及4)顯示在40℃下1個月後(＜5%殘留)及在25℃下12個月後(＜80%殘留)之效能降低。當相較於調配物1時，調配物5 (用TRIS緩衝)顯示在40℃下1個月後(35%)及在5℃下12個月後(90%)之效能高許多，且兩種調配物之間的唯一差異為緩衝液系統，表明對於AAV之凍乾，tris緩衝液優於磷酸鹽緩衝液。基於此研究，選擇Tris作為基礎緩衝液系統。
另外，含有甘露醇之調配物(調配物3及4)顯示低許多之VGC，儘管水分含量更低。在此研究中，結晶增積劑、甘露醇、一般用於改良餅穩定性及結構之賦形劑及凍乾過程設計(亦即，能夠在較高溫度下進行初次乾燥而不塌陷)之使用，使AAV去穩定化。考慮到調配物1之水分含量(2.9%)高於調配物3及4 (1.2%及1.4%)，在凍乾研究2中生成具有類似水分含量之不同調配物之凍乾餅，以進一步研究甘露醇對於AAV之去穩定化作用之機制。 表1.凍乾研究1中檢查之調配物組成
調配物編號
組分 1 2 3 4 5
緩衝液 5 mM NaPi pH 7.1 10 mM NaPi pH 7.1 5 mM tris pH 7.5
鹽 20 mM檸檬酸鈉 50 mM NaCl 20 mM檸檬酸鈉
低溫/ 凍乾保護劑 210 mM蔗糖 14.6 mM蔗糖 210 mM蔗糖
界面活性劑 0.002% (w/v) P188
增積劑 NA NA 210 mM甘露醇 NA
塑化劑 NA 0.25% (w/v)甘油 NA NA NA
表2.凍乾研究1穩定性資料概述
調配物編號 水分(%) VGC (GC/mL) 效能
T0 在40 ℃ 下 1 個月 在 25 ℃ 下6 個月 在 25 ℃ 下12 個月 在 5 ℃ 下9 個月 在 5 ℃ 下12 個月
1 2.9% 1.5e11 80% 3% 18% 5% 72% 78%
2 2.5% 1.5e11 98% 2% 34% 10% NT 72%
3 1.2% 4.6e10 25% 0% NT NT NT NT
4 1.4% 7.7e10 50% 0% NT NT NT NT
5 2.7% 1.4e11 87% 35% 74% 38% 75% 90%
凍乾研究2之調配物組成列舉於表3中。表3中列舉之調配物及其濃度為凍乾前賦形劑濃度。除甘露醇影響以外，檢查凍乾研究2中之蔗糖濃度、塑化劑及替代多價鹽之效果。在生物製劑調配物中，蔗糖可用作凍乾保護劑/低溫保護劑及穩定劑兩者，而甘露醇提供用作更易於復原、精緻餅外觀及潛在有效及穩固凍乾循環之增積劑的額外功能。(Shreya, 2018) 不同於傳統大分子療法(諸如抗體及酶)，AAV為需要衣殼完整性來保護病毒基因組以及介導細胞吸收及胞內遷移之複合實體。(Giles, 2018) SYBR金螢光分析用於評定AAV衣殼完整性，其中SYBR金染料與痕量之游離DNA分子結合且間接偵測衣殼損傷(亦即，其偵測自受損衣殼釋放之DNA)。如表4中所示，在凍乾研究2中達成含純蔗糖之調配物(1A)及含甘露醇之調配物(6A及7A)之類似水分含量(~ 1%)，低於凍乾研究1中之水分含量。當以1:14及1:4之蔗糖與甘露醇莫耳比向AAV調配物中添加甘露醇(調配物6A及7A)時，在含甘露醇之調配物中偵測到高得多的螢光強度，表明藉由甘露醇形成之結晶基質引起藉由損傷AAV衣殼之更多病毒基因組釋放(圖15A)。與衣殼損傷一致，調配物6A及7A顯示約0.4對數效價損失，其中1A僅具有0.16對數效價損失(圖15B)。此外，緊接在凍乾之後，6A及7A之效能分別降低至25%及57%，而1A維持108%效能(表4)。此等資料一起顯示，含甘露醇之調配物中之效價及效能之損失係歸因於結晶基質而並非更低水分含量。隨著水分含量自0.6%增加至1.4%以及甘露醇與蔗糖莫耳比自8:1至降低2:1，腺病毒之前述調配物研究顯示在凍乾後之更好的效價恢復。其推斷，在低水分含量下之較差效價係歸因於低水分含量或「過度乾燥」。(Croyle, 2001) 然而，其不係一種合理結論，此係由於其研究中之水分含量改變以及調配物組成。藉由在含甘露醇之調配物及含蔗糖之調配物中達成類似水分含量，吾人證實，非晶形基質比結晶基質在使凍乾調配物中之AAV穩定化方面更好。 表3.凍乾研究2中檢查之調配物組成
調配物編號
組分 1A* 2A 3A 4A 5A 6A 7A
緩衝液 5 mM Tris 5 mM Tris 5 mM Tris 1.5 mM磷酸二氫鉀晶體，8.1 mM無水磷酸氫二鈉 5 mM Tris 5 mM NaPi 5 mM Tris
鹽 20 mM檸檬酸鈉 20 mM檸檬酸鈉 20 mM檸檬酸鈉 2.7 mM氯化鉀，60 mM NaCl 30 mM Na2 SO4 20 mM檸檬酸鈉 20 mM檸檬酸鈉
低溫/ 凍乾保護劑 210 mM蔗糖 210 mM蔗糖 210 mM蔗糖 409 mM蔗糖 263 mM蔗糖 14.6 mM蔗糖 45 mM蔗糖
增積劑                210 mM甘露醇 180 mM甘露醇
界面活性劑 0.002% (w/v) P188 0.002% (w/v) P188 0.002% (w/v) P188 0.001% (w/v) P188 0.005% (w/v) P188 0.002% (w/v) P188 0.002% (w/v) P188
塑化劑    0.25% (w/v)甘油 0.5% (w/v)山梨糖醇            
* 凍乾研究2中之調配物1A與凍乾研究1中之調配物5具有相同組成，使用新編號係為了容易論述。
進一步測試在不同濃度下之蔗糖的影響，分別於調配物1A、5A及4A中之210、263及409 mM。若一部分鹽不結晶，則氯化鈉可極大地降低調配物之塌陷溫度。在冷凍及退火期間NaCl之結晶可受到其他賦形劑抑制。(Carpenter, 2002) 調配物4A之熱分析之特徵在於圖16中之低溫DSC。低於-37℃未偵測到結晶事件。在-36.1℃下之Tg'係歸因於蔗糖之玻璃轉化。當在調配物4A中使用極高蔗糖濃度時，抑制NaCl之結晶。調配物4A及5A (409 mM及263 mM蔗糖)顯示比調配物1A (210 mM蔗糖)更少的由衣殼損傷引起的游離DNA釋放，表明蔗糖抑制NaCl結晶之關鍵性及蔗糖在AAV調配物中之濃度依賴性保護作用。圖17。 表4.緊接在凍乾後之結晶及非晶形調配物中之AAV穩定性之比較
調配物 水分(%) 螢光強度之增加 對數效價損失 效能(%)
1A 1.1% 7348 0.163 108
6A 1.2% 39944 0.416 25
7A 0.9% 21455 0.441 57
除檸檬酸鈉以外，尋求用於抑制AAV聚集同時確保溶液Tg'仍適合於凍乾循環發展之替代多價離子。檸檬酸鹽與蔗糖組合之益處在於，乾燥餅玻璃轉化溫度(Tg)較高，其預期得到較高的凍乾AAV穩定性(Kets, 2003)。然而，亦已知檸檬酸鹽會引起注射位點疼痛，尤其對於肌肉內或皮下注射而言(Brazeau, 1998)。對於紅血球生成素之皮下調配物，建議移除檸檬酸鹽(Brazeau, 1998)。另一實例為「無檸檬酸修美樂(Humira citrate-free)」，其作為提供「緊接在注射後較少疼痛」之改良調配物出售。(無檸檬酸修美樂網站，19Mar20訪問)。對於一些投與途徑而言，預期檸檬酸鹽之存在不影響疼痛感覺，此係因為疼痛之途徑及受體是否存在，或係因為可進行掩蔽檸檬酸鹽之相對疼痛感知之手術。舉例而言，緩慢靜脈內輸注可稀釋且使疼痛感覺降至最低，或視網膜下注射手術可能並不具有伴隨檸檬酸鹽調配物之相對較高的疼痛感知。在此等情況下，檸檬酸鹽之存在可能並不係注射處之疼痛的問題。對於諸如肌肉內、脈絡膜上腔及皮下注射之情況，檸檬酸鹽之存在可能導致更高的疼痛感知。為了解決一些投與途徑之此問題，吾人評價針對凍乾調配物之檸檬酸鹽的替代物。如圖18A中所示，需要比氯化鈉低許多的硫酸鈉濃度來達成類似AAV聚集抑制作用。此為關於蔗糖之益處，能夠更充分抑制更低濃度之硫酸鈉之結晶。結晶似乎不利地影響AAV之穩定性，如藉由含甘露醇之調配物之穩定性缺乏所示。在Na2 SO4 存在下於RT下脅迫24小時之後，AAV之粒度仍恆定。圖18B及圖18C。重要的是，在至多14%蔗糖(409 mM)存在下，30 mM Na2 SO4 可有效地抑制AAV聚集。圖18C。其他類似多價鹽，MgSO4 及(NH4 )2 SO4 ，可用作用於抑制凍乾調配物中之AAV聚集之替代鹽。
為了評價在凍乾調配物中使用硫酸鈉之可行性，不同調配物緩衝液之Tg'顯示於表5中。對於穩固凍乾過程，需要較高(較不負的負值，較不冷的) Tg'，理想地高於-40℃。調配物1A、2A、3A、4A及5A均顯示所需Tg'溫度，而含有PBS及NaCl之調配物(緩衝液1及2)應導致較長的凍乾循環，此更傾向於歸因於鹽結晶之塌陷。
另外，在冷凍期間之pH穩定性在維持AAV效能中為關鍵的。在冷凍後，在基於dPBS之調配物緩衝液中觀測到3個pH單位位移。然而，在調配物4A及5A中僅見到1個pH單位位移。圖19。此可部分地解釋為何tris緩衝系統比磷酸鹽緩衝系統更適合於凍乾。在磷酸鹽緩衝液之冷凍期間將AAV暴露於低pH為去穩定化。 表5.包括不同賦形劑之凍乾調配物之Tg'
調配物描述 Tg' ( ℃)
緩衝液1 ： 2.70 mM氯化鉀，1.47 mM磷酸二氫鉀，100 mM氯化鈉，8.10 mM無水磷酸氫二鈉，4%蔗糖，pH 7.4，0.001%泊洛沙姆188 -44.8
緩衝液2 ： 5 mM Tris，6%蔗糖，80 mM NaCl，pH 7.4，0.001%泊洛沙姆188 -41.2
1A -35
2A -37.2
3A -35.6
4A -36.1
5A -35.6
存在以下實例及理論，添加少量賦形劑添加劑，諸如甘油或山梨糖醇，可使一些凍乾生物製劑穩定，但尚未知曉此種方法是否可對AAV起作用(Cicerone, 2003)。理論，諸如藉由用更強的甘油-糖H鍵置換水-雙醣糖H鍵之「水置換」或「塑化劑」行為，用於解釋此等添加劑如何改良生物製劑之穩定性，但此等類型之賦形劑對於凍乾AAV之穩定性的影響並不清楚。(Starciuc, 2017; Cicerone, 2003) 為了評價「水置換」或「塑化劑」可幫助穩定性之可能性，向調配物1A中添加甘油及山梨糖醇(調配物2A及3A)以評價是否可達成更好的凍乾AAV穩定性。藉由所有成分之Tg、其重量百分比及水分含量來判定凍乾餅之Tg。如前述章節中所論述，檸檬酸鹽與蔗糖之間的分子間相互作用使1A之Tg提昇至58.7℃，而2A及3A分別具有在42.0℃及37.8℃下之Tg (表6)。已報導，儘管塑化劑，諸如甘油及山梨糖醇，降低非晶形凍乾餅Tg，但當儲存在低於凍乾餅之玻璃轉化溫度之溫度下時，其可藉由經由抗塑化作用減緩玻璃基質之β弛豫而使蛋白質治療劑穩定。(Cicerone, 2003)。在35℃ (其低於調配物1A、2A及3A之Tg)下，在添加甘油之調配物2A中而並非在添加山梨糖醇之調配物3A中達成引起釋放游離DNA之較少AAV衣殼破壞及較高效能，表明甘油在使凍乾調配物中之AAV穩定化方面的獨特能力，此先前尚未有報導。圖17。出乎意料地，含山梨糖醇之調配物(調配物3A)並不提供與甘油相同的益處，且與無山梨糖醇之匹配調配物組成具有幾乎一致的游離DNA釋放。此表明，甘油使凍乾AAV穩定之能力為特殊且獨特的，且使用「水置換」或「塑化劑」賦形劑之通用概念並不充分解釋甘油對於凍乾AAV之穩定化益處。 表6.調配物1A-5A之凍乾餅之水分含量及Tg
調配物描述 水分(%) 固體餅Tg ( ℃)
1A 1.5 58.7
2A 1.1 42.0
3A 1.5 37.8
4A 1.8 37.5
5A 1.4 39.3
在35℃下2週之短期脅迫研究之後，檢查1A、2A、3A、4A及5A之病毒效價及活體外相對效能。在35℃ 2週之後，五種調配物能夠保留47%至75%效能(圖17C)。在40℃ 4週之後具有35%效能之調配物1A顯示在5℃下12個月後具有90%效能(表1中之調配物5為表3中之調配物1A)。如圖12中所示，歸因於35℃溫度脅迫之效能降低在2週至4週達到平穩。儘管吾人不具有在1%水分含量範圍下之調配物1A-5A之長期穩定性，但35℃脅迫研究結果表明更好的長期穩定性。
此處吾人呈現用tris緩衝的調配物，其含有在20或30 mM下之最少量檸檬酸鹽或硫酸鹽作為防止AAV自結合的鹽、抑制鹽結晶且提供低溫保護及冷凍保護玻璃樣狀態的蔗糖、防止AAV吸附至表面的泊洛沙姆188及為AAV提供適合的凍乾穩定性的「塑化劑」甘油。調配物1A、2A、4A及5A均為AAV凍乾之候選調配物，此係歸因於不同賦形劑用於抑制AAV聚集同時藉由保護針對冷凍及乾燥脅迫之AAV衣殼而保留有利Tg'溫度及高效能的獨特選擇。 等效物
儘管本發明參考其特定實施例詳細描述，但應理解功能上等效之變化在本發明之範疇內。實際上，根據前文描述及附圖，除本文所顯示及描述之彼等修改之外，本發明之各種修改對熟習此項技術者而言將變得顯而易見。此類修改意欲屬於隨附申請專利範圍之範疇內。熟習此項技術者將認識到或能夠僅使用常規實驗即可確定本文所描述之本發明特定實施例的許多等效物。此類等效物意欲由隨附申請專利範圍涵蓋。
本說明書中所提及之所有公開案、專利及專利申請案在本文中均以引用之方式併入本說明書中，程度如同各個別公開案、專利或專利申請案專門且單獨地指示為以全文引用之方式併入本文中一般。
圖1A及圖1B. 病毒粒子聚集受離子強度影響。(圖1A)在稀釋至緩衝液中後，在不同離子強度下觀測到之病毒粒子聚集。鹽1為氯化鈉，且鹽2為檸檬酸鈉。(圖1B)病毒粒子聚集隨著時間推移而增加。
圖2. 用於防止聚集之最小離子強度。在不同NaCl濃度下製備之在1.8E+13個GC/mL下之AAV8粒子的有效直徑。呈現需要離子強度≥ 90 mM來防止粒子聚集，如由粒子之直徑指示。
圖3. 最小離子強度為血清型依賴性的。在不同NaCl濃度下製備之AAV8 (空心方形)及AAV9 (空心三角形)之有效直徑。載體之濃度為6.0E+11個GC/mL。
圖4. 防止聚集為必需的但並不足以確保穩定的藥物產品。所顯示之在儲存在-80℃ (在-80℃下6個月)下或在25℃(在25℃下6個月)下6個月之後之病毒顆粒的粒度分佈。
圖5A及圖5B. 在SYBR金(SYBR gold) (一種在與DNA結合後螢光強度呈現顯著增加之染料)存在下，AAV基因組釋放之偵測。溶液於Tris緩衝液中含有9.7E+11個GC/mL之AAV8粒子，該Tris緩衝液含有含泊洛沙姆188之(A) NaCl或(B)檸檬酸鈉。實線為非冷凍對照，且虛線為在3個凍融循環之後。
圖6. 在冷凍期間結晶之鹽存在下之增加的DNA釋放。鹽1為檸檬酸鈉，且鹽2為氯化鈉。顯示對照樣本中及3個凍融循環(3× F/T)後之DNA釋放。緩衝液1為Tris，緩衝液2為磷酸鈉，且緩衝液3為組胺酸。
圖7A及圖7B. 在SYBR金存在下之AAV基因組釋放之偵測。溶液於磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)(圖7A)或含有4%蔗糖之PBS (圖7B)中含有1E+12個GC/mL之AAV8。實線為非冷凍對照，且虛線為在10個凍融循環之後。
圖8. 添加非晶形糖抑制共溶質結晶，呈現較少DNA釋放。顯示對照樣本中及3個凍融循環(3× F/T)後包含不同比率之結晶甘露醇與非晶形蔗糖組分之緩衝液中之DNA釋放。
圖9. 凍乾後，GC損失引起相對效能之並行損失。顯示凍乾後調配物之相對效能及病毒DNA效價。用「C」標記之樣本包括結晶增積劑。
圖10. 冷凍溶液之pH影響凍乾固體之穩定性。液體及冷凍溶液之pH由顏色指示。顯示在25℃下儲存6個月後之凍乾調配物之相對效能。
圖11. 非凍乾對照(「液體」)中、凍乾後(after lyophilization) (「凍乾後(Post Lyo)」)及3個月與6個月室溫儲存後之AAV8調配物之相對效能百分比。調配物係於Tris緩衝液(實心填充)或磷酸鹽緩衝液(灰色填充)中。
圖12. 儲存在35℃下期間之凍乾AAV8調配物之相對效能百分比。殘餘水分含量為5.8% (圓圈)、4.7% (三角形)、3.6% (菱形)及2.1% (方形)。
圖13. 儲存在5℃(三角形)或室溫(方形)下期間凍乾AAV8調配物之相對效能百分比。
圖14.在SYBR金(SYBR gold)之存在下偵測AAV基因組之釋放。在凍乾(實線)之前或在凍乾至不同殘餘水分水準(4.7% (虛線)、3.6% (虛線)及2.1% (點劃線))隨後用水復原至初始體積之後，溶液含有單獨調配物緩衝液(粗實線)或2.4E+11個GC/mL之AAV8。隨著殘餘水分降低釋放更多AAV基因組。
圖15A至圖15C. 在凍乾之後，調配物1A、6A及7A中之AAV穩定性之比較。圖15A顯示歸因於AAV衣殼損傷之游離DNA釋放。較高螢光強度指示較多游離DNA。圖15B顯示病毒效價損失之對數值。圖15C顯示活體外相對效能。
圖16. 特徵在於低溫DSC之調配物4A之熱轉移。
圖17A至圖17C. 在35℃ 2週之後，調配物1A、2A、3A、4A及5A之比較。圖17A顯示歸因於AAV衣殼損傷之游離DNA釋放。圖17B顯示病毒效價。圖17C顯示活體外相對效能。
圖18A至圖18C.於NaCl或Na2 SO4 溶液中稀釋成不同離子強度後之AAV之粒度，圖18A顯示在T0 時之直徑。圖18B顯示在8小時後之直徑。圖18C顯示在30 mM Na2 SO4 存在下，在提高蔗糖濃度下，於室溫下24小時之後的直徑。
圖19顯示當冷凍降至-20℃時之dPBS、調配物4A及5A之pH位移。
圖19A及圖19B顯示當冷凍降至-20℃時之dPBS、調配物4A及5A之pH位移。
圖20. AAV衣殼1-9 (SEQ ID NO: 41-51)之Clustal多序列比對。可藉由自其他比對AAV衣殼之對應位置「募集」胺基酸殘基來對AAV9及AAV8衣殼進行胺基酸取代(在底部列中以粗體顯示)。由「HVR」標示之序列區=高變區。
Figure 12_A0101_SEQ_0001
Figure 12_A0101_SEQ_0002
Figure 12_A0101_SEQ_0003
Figure 12_A0101_SEQ_0004
Figure 12_A0101_SEQ_0005
Figure 12_A0101_SEQ_0006
Figure 12_A0101_SEQ_0007
Figure 12_A0101_SEQ_0008
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Claims (126)

  1. 一種穩定調配物，其包含重組腺相關病毒(rAAV)粒子，及 a)     緩衝劑， b)     糖，及 c)     非晶形鹽， 其中該調配物適合於凍乾。
  2. 如請求項1之調配物，其中該緩衝劑包含約1 mM與約50 mM之間的Tris。
  3. 如請求項2之調配物，其包含約1 mM與約30 mM之間、約1 mM與約20 mM之間、約5 mM與約30 mM之間、約5 mM與約20 mM之間、約10 mM與約30 mM之間、約10 mM與約20 mM之間或約20 mM與約50 mM之間的Tris。
  4. 如請求項2之調配物，其包含約1 mM、約2 mM、約3 mM、約5 mM、約10 mM、約15 mM、約20 mM、約25 mM、約30 mM或約40 mM Tris。
  5. 如請求項2之調配物，其包含約5 mM Tris。
  6. 如請求項1至4中任一項之調配物，其中該非晶形鹽為檸檬酸鈉。
  7. 如請求項1至4中任一項之調配物，其中該非晶形鹽為硫酸鈉。
  8. 如請求項1至4中任一項之調配物，其中該非晶形鹽為硫酸銨。
  9. 如請求項1至4中任一項之調配物，其中該非晶形鹽為硫酸鎂。
  10. 如請求項1至4中任一項之調配物，其中該非晶形鹽為檸檬酸鈉、硫酸鈉、硫酸銨、硫酸鎂或其組合。
  11. 如請求項1至4中任一項之調配物，其包含檸檬酸鈉。
  12. 如請求項1至4中任一項之調配物，其包含硫酸鈉。
  13. 如請求項1至4中任一項之調配物，其包含硫酸銨。
  14. 如請求項1至4中任一項之調配物，其包含硫酸鎂。
  15. 如請求項1至4中任一項之調配物，其包含檸檬酸鈉、硫酸鈉、硫酸銨、硫酸鎂或其組合。
  16. 如請求項1至4中任一項之調配物，其中該調配物包含約10 mM、約20 mM、約30 mM、約40 mM、約50 mM、約60 mM、約70 mM、約80 mM、約90 mM、約100 mM、約120 mM、約140 mM、約150 mM或約200 mM硫酸鈉。
  17. 如請求項1至16中任一項之調配物，其具有約6.5與8.0之間的pH。
  18. 如請求項17之調配物，其具有約7.2與7.8之間的pH。
  19. 如請求項17之調配物，其具有約7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7或7.8之pH。
  20. 如請求項17之調配物，其具有約7.5之pH。
  21. 如請求項1至20中任一項之調配物，其包含約50 mM與約400 mM之間的糖。
  22. 如請求項21之調配物，其包含約50 mM與約350 mM之間、約50 mM與約300 mM之間、約50 mM與約250 mM之間、約50 mM與約200 mM之間或約50 mM與約150 mM之間的糖。
  23. 如請求項21之調配物，其包含約100 mM與約400 mM之間、約150 mM與約400 mM之間、約200 mM與約400 mM之間、約250 mM與約400 mM之間或約300 mM與約400 mM之間的糖。
  24. 如請求項21之調配物，其包含約100 mM與約300 mM之間、約150 mM與約250 mM之間、約200 mM與約300 mM之間或約250 mM與約350 mM之間的糖。
  25. 如請求項21之調配物，其包含約50 mM、約100 mM、約150 mM、約160 mM、約170 mM、約180 mM、約190 mM、約200 mM、約210 mM、約220 mM、約230 mM、約240 mM、約250 mM、約260 mM、約270 mM、約280 mM、約290 mM、約300 mM或約350 mM糖。
  26. 如請求項21之調配物，其包含約190 mM與約230 mM之間、約170 mM與約250 mM之間或約150 mM與約270 mM之間的糖。
  27. 如請求項21之調配物，其包含約210 mM糖。
  28. 如請求項1至27中任一項之調配物，其中該糖為非還原糖。
  29. 如請求項28之調配物，其中該非還原糖為蔗糖、海藻糖或棉子糖。
  30. 如請求項28之調配物，其中該非還原糖為蔗糖。
  31. 如請求項1至27中任一項之調配物，其中該糖為還原糖。
  32. 如請求項31之調配物，其中該還原糖為葡萄糖、果糖、甘露糖、半乳糖或乳糖。
  33. 如請求項1至32中任一項之調配物，其包含小於約100 mM檸檬酸鈉。
  34. 如請求項33之調配物，其包含約10 mM與約100 mM之間的檸檬酸鈉。
  35. 如請求項33之調配物，其包含約10 mM與約100 mM之間、約20 mM與約100 mM之間、約30 mM與約100 mM之間、約40 mM與約100 mM之間、約50 mM與約100 mM之間、約10 mM與約80 mM之間、約10 mM與約60 mM之間、約10 mM與約50 mM之間、約10 mM與約40 mM之間或約10 mM與約30 mM之間的檸檬酸鈉。
  36. 如請求項33之調配物，其包含約10 mM與約50 mM之間、約20 mM與約60 mM之間、約30 mM與約70 mM之間或約10 mM與約30 mM之間的檸檬酸鈉。
  37. 如請求項33之調配物，其包含約10 mM、約20 mM、約30 mM、約40 mM、約50 mM或約60 mM檸檬酸鈉。
  38. 如請求項33之調配物，其包含約20 mM檸檬酸鈉。
  39. 如請求項1至38中任一項之調配物，其進一步包含約0.0005%與約0.01%之間的非離子性界面活性劑。
  40. 如請求項39之調配物，包含約0.002%非離子性界面活性劑。
  41. 如請求項38或請求項39之調配物，其中該非離子性界面活性劑包含泊洛沙姆(poloxamer) 188、泊洛沙姆407、聚山梨醇酯80、聚山梨醇酯20、普洛尼克(Pluronic) F-68或BRIJ 35。
  42. 如請求項41之調配物，其中該非離子性界面活性劑包含泊洛沙姆188。
  43. 一種穩定調配物，其包含重組腺相關病毒(rAAV)粒子，及 a)     約1 mM與約25 mM之間的Tris， b)     約50 mM與約400 mM之間的糖， c)     約10 mM與約100 mM之間的檸檬酸鈉，及 d)     約0.0005%與約0.01%之間的非離子性界面活性劑， 其中該調配物具有約7.2與約7.8之間的pH。
  44. 一種穩定調配物，其包含重組腺相關病毒(rAAV)粒子，及 a)     約2 mM與約10 mM之間的Tris， b)     約150 mM與約250 mM之間的糖， c)     約10 mM與約20 mM之間的檸檬酸鈉，及 d)     約0.001%與約0.005%之間的非離子性界面活性劑， 其中該調配物具有約7.2與約7.8之間的pH。
  45. 一種穩定調配物，其包含重組腺相關病毒(rAAV)粒子，及 a)     約5 mM Tris， b)     約210 mM糖， c)     約20 mM檸檬酸鈉，及 d)     約0.002%非離子性界面活性劑， 其中該調配物具有約7.5之pH。
  46. 如請求項43至45中任一項之調配物，其中該糖為非還原糖。
  47. 如請求項46之調配物，其中該非還原糖為蔗糖、海藻糖或棉子糖。
  48. 如請求項47之調配物，其中該非還原糖為蔗糖。
  49. 一種穩定調配物，其包含重組腺相關病毒(rAAV)粒子，及 a)     約5 mM Tris， b)     約210 mM蔗糖， c)     約20 mM檸檬酸鈉，及 d)     約0.002% (w/v)泊洛沙姆188。
  50. 一種穩定調配物，其包含重組腺相關病毒(rAAV)粒子，及 a)     約5 mM Tris， b)     約210 mM蔗糖， c)     約20 mM檸檬酸鈉， d)     約0.002% (w/v)泊洛沙姆188，及 e)     約0.25% (w/v)甘油。
  51. 一種穩定調配物，其包含重組腺相關病毒(rAAV)粒子，及 a)     約5 mM Tris， b)     約210 mM蔗糖， c)     約20 mM檸檬酸鈉， d)     約0.002% (w/v)泊洛沙姆188，及 e)     約0.5% (w/v)山梨糖醇。
  52. 一種穩定調配物，其包含重組腺相關病毒(rAAV)粒子，及 a)     約5 mM Tris， b)     約30 mM硫酸鈉， c)     約263 mM蔗糖，及 d)     約0.005% (w/v)泊洛沙姆188。
  53. 如請求項1至52中任一項之調配物，其中該調配物適合於凍乾。
  54. 如請求項1至53中任一項之調配物，其中該調配物具有約7.5之pH。
  55. 如請求項1至53中任一項之調配物，其中該調配物具有約7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7或7.8之pH。
  56. 如請求項1至53中任一項之調配物，其中該調配物具有約7.1之pH。
  57. 如請求項1至53中任一項之調配物，其中該調配物具有約6.5與約8.0之間的pH。
  58. 如請求項1至53中任一項之調配物，其中該調配物具有約7.2與約7.8之間的pH。
  59. 如請求項1至58中任一項之調配物，其中該調配物包含約1.0E+11個基因組複本/毫升(GC/mL)與約1.0E+15個GC/mL之間的rAAV粒子。
  60. 如請求項59之調配物，其中該調配物包含約1.0E+11個GC/mL、約1.0E+12個GC/mL、約1.0E+13個GC/mL、約1.0E+14個GC/mL或約1.0E+15個GC/mL rAAV粒子。
  61. 如請求項1至60中任一項之調配物，其中該等rAAV粒子包含以下之衣殼蛋白質：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV-11、AAV-12、AAV-13、AAV-14、AAV-15及AAV-16、rAAV.rh8、rAAV.rh10、rAAV.rh20、rAAV.rh39、rAAV.Rh74、rAAV.RHM4-1、AAV.hu37、rAAV.Anc80、rAAV.Anc80L65、rAAV.7m8、rAAV.PHP.B、rAAV2.5、rAAV2tYF、rAAV3B、rAAV.LK03、AAV.HSC1、AAV.HSC2、AAV.HSC3、AAV.HSC4、AAV.HSC5、AAV.HSC6、AAV.HSC7、AAV.HSC8、AAV.HSC9、AAV.HSC10、AAV.HSC11、AAV.HSC12、AAV.HSC13、AAV.HSC14、AAV.HSC15或AAV.HSC16。
  62. 如請求項61之調配物，其中該等rAAV粒子包含AAV-8或AAV-9血清型之衣殼蛋白質。
  63. 如請求項1至62中任一項之調配物，其進一步包含選自由甘油或山梨糖醇組成之群之穩定劑。
  64. 如請求項1至62中任一項之調配物，其進一步包含甘油。
  65. 如請求項1至62中任一項之調配物，其包含約0.1%與約5%之間的甘油。
  66. 如請求項1至62中任一項之調配物，其包含約0.1%與約2%之間的甘油。
  67. 如請求項1至62中任一項之調配物，其包含約0.25%與約2%之間的甘油。
  68. 如請求項1至62中任一項之調配物，該調配物不包含甘露醇。
  69. 如請求項1至62中任一項之調配物，該調配物包含小於10 mM、20 mM、50 mM、100 mM或150 mM甘露醇。
  70. 如請求項1至69中任一項之調配物，其為凍乾前調配物。
  71. 如請求項70之調配物，其具有約1%與約7%之間的殘餘水分含量。
  72. 如請求項71之調配物，其中該殘餘水分含量在約1%與約7%之間、約2%與約7%之間、約3%與約7%之間、約4%與約7%之間、約5%與約7%之間、約1%與約6%之間、約1%與約5%之間、約1%與約4%之間或約1%與約3%之間。
  73. 如請求項71之調配物，其中該殘餘水分含量在約3%與約7%之間、約3%與約6%之間或約3%與約5%之間。
  74. 如請求項71之調配物，其中該殘餘水分含量為約3%、約3.5%、約4%、約4.5%、約5%、約5.5%或約6%。
  75. 如請求項71之調配物，其中該水分含量在約1%至約2%之間。
  76. 如請求項71之調配物，其中該水分含量為約1.5%、約1.4%、約1.3%、約1.2%或約1.1%。
  77. 如請求項71之調配物，其中該水分含量為約1%。
  78. 如請求項1至77中任一項之調配物，其中該調配物之凍乾餅之玻璃轉化溫度(Tg)高於35℃。
  79. 如請求項1至77中任一項之調配物，其中該調配物之最大冷凍濃縮溶液之玻璃轉化溫度(Tg')高於-40℃。
  80. 如請求項1至77中任一項之調配物，其中該調配物儲存在室溫下3個月之後，該等rAAV粒子之相對效能百分比為至少約60%、至少約70%或至少約80%；其中參考rAAV粒子係儲存在-70℃下含有0.001%泊洛沙姆188之DPBS緩衝液中。
  81. 如請求項1至77中任一項之調配物，其中該調配物儲存在室溫下6個月之後，該等rAAV粒子之相對效能百分比為至少約60%、至少約70%或至少約80%；其中參考rAAV粒子係儲存在-70℃下含有0.001%泊洛沙姆188之杜爾貝科氏(Dulbecco's)磷酸鹽緩衝鹽水(DPBS)緩衝液中。
  82. 如請求項1至77中任一項之調配物，其中該調配物儲存在35℃下1週之後，該等rAAV粒子之相對效能百分比為至少約30%、至少約40%、至少約50%或至少60%，其中參考rAAV粒子係儲存在-70℃下含有0.001%泊洛沙姆188之DPBS緩衝液中。
  83. 如請求項1至77中任一項之調配物，其中該調配物儲存在35℃下2週之後，該等rAAV粒子之相對效能百分比為至少約30%、至少約40%、至少約50%或至少60%，其中參考rAAV粒子係儲存在-70℃下含有0.001%泊洛沙姆188之DPBS緩衝液中。
  84. 如請求項1至77中任一項之調配物，其中該調配物儲存在35℃下4週之後，該等rAAV粒子之相對效能百分比為至少約30%、至少約40%、至少約50%或至少60%，其中參考rAAV粒子係儲存在-70℃下含有0.001%泊洛沙姆188之DPBS緩衝液中。
  85. 如請求項79至84中任一項之調配物，其中該調配物在儲存前先凍乾。
  86. 如請求項85之調配物，其中該凍乾調配物在儲存之後復原。
  87. 如請求項1至77中任一項之調配物，其中該等rAAV粒子在凍乾之後當下之相對效能百分比為至少約25%、至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%或至少約99%。
  88. 如請求項1至77中任一項之調配物，其中相較於參考調配物中rAAV粒子之聚集程度，該調配物之rAAV粒子之聚集程度降低約10%、約20%、約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、約90%或約100%。
  89. 如請求項1至77中任一項之調配物，其中藉由載體基因組含量或病毒效價分析來評定該調配物之穩定性，其中相較於儲存在相同條件下之參考調配物之基因組含量，該調配物儲存1天、2天、3天、4天、5天、6天、1週、2週、3週、4週、1個月、2個月、3個月、4個月、5個月、6個月、7個月、8個月、9個月、10個月、11個月、1年、2年或3年之後，該調配物具有提高至少約5%、約10%、約20%、約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、約90%、約100%、約200%、約300%或約500%的基因組含量。
  90. 如請求項1至77中任一項之調配物，其中藉由量測該調配物之相對效能來評定該調配物之穩定性，其中相較於儲存在相同條件下之參考調配物之基因組含量，該調配物儲存1天、2天、3天、4天、5天、6天、1週、2週、3週、4週、1個月、2個月、3個月、4個月、5個月、6個月、7個月、8個月、9個月、10個月、11個月、1年、2年或3年之後，該調配物具有提高至少約5%、約10%、約20%、約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、約90%、約100%、約200%、約300%或約500%的相對效能。
  91. 如請求項1至77中任一項之調配物，其中藉由感染力損失來評定該調配物之穩定性，其中相較於儲存在相同條件下之參考調配物之感染力損失，該調配物儲存1天、2天、3天、4天、5天、6天、1週、2週、3週、4週、1個月、2個月、3個月、4個月、5個月、6個月、7個月、8個月、9個月、10個月、11個月、1年、2年或3年之後，該調配物具有減低至少約5%、約10%、約20%、約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、約90%、約100%、約200%、約300%或約500%的感染力損失。
  92. 如請求項1至77中任一項之調配物，其中藉由rAAV基因組釋放來評定該調配物之穩定性，其中藉由量測DNA特異性螢光染色劑之相對螢光偏好來測定該rAAV基因組釋放，且其中相較於儲存在相同條件下之參考調配物之相對螢光水準，該調配物儲存1天、2天、3天、4天、5天、6天、1週、2週、3週、4週、1個月、2個月、3個月、4個月、5個月、6個月、7個月、8個月、9個月、10個月、11個月、1年、2年或3年之後，該調配物具有減低至少約5%、約10%、約20%、約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、約90%、約100%、約200%、約300%或約500%的相對螢光水準。
  93. 如請求項89至92中任一項之調配物，其中該調配物在儲存之前先凍乾。
  94. 如請求項93之調配物，其中該凍乾調配物在儲存之後復原。
  95. 如請求項89至94中任一項之調配物，其中該調配物儲存在-80℃、-70℃、-20℃、4℃、20℃、25℃、30℃、35℃或40℃下。
  96. 如請求項88至95中任一項之調配物，其中該參考調配物為含有0.001%泊洛沙姆188之DPBS緩衝液。
  97. 如請求項88至96中任一項之調配物，其中該參考調配物為不包含糖之調配物。
  98. 如請求項88至97中任一項之調配物，其中該參考調配物為不包含塑化劑之調配物。
  99. 如請求項1至98中任一項之調配物，其中該調配物在凍乾過程中冷凍至約-20℃之溫度。
  100. 如請求項1至99中任一項之調配物，其中當冷凍降至-20℃時，該冷凍調配物保持約pH 6至約pH 9之間的pH。
  101. 如請求項1至99中任一項之調配物，其中當冷凍降至-20℃時，該冷凍調配物保持在冷凍前之pH值±1單位範圍內之pH值。
  102. 如請求項1至101中任一項之調配物，其為凍乾用之rAAV之穩定水性調配物。
  103. 一種製造包含重組腺相關病毒(rAAV)粒子之穩定調配物之方法，其包含將rAAV粒子與如請求項1至100中任一項之調配物之緩衝劑、糖、鹽、視情況選用之塑化劑及視情況選用之非離子性界面活性劑組合，從而製造包含rAAV之調配物。
  104. 一種降低rAAV粒子釋放rAAV基因組之方法，其包含製造含rAAV粒子、緩衝劑、糖、鹽及視情況選用之非離子性界面活性劑之調配物，其中該等rAAV粒子在三個凍融循環之後釋放之rAAV基因組比不包含糖之調配物中釋放之rAAV基因組減少。
  105. 一種降低rAAV粒子釋放rAAV基因組之方法，其包含製造含rAAV粒子、緩衝劑、糖、鹽及視情況選用之非離子性界面活性劑之調配物，其中該等rAAV粒子在凍乾及復原之後釋放之rAAV基因組比不包含糖之調配物中釋放之rAAV基因組減少。
  106. 如請求項104或105之方法，其進一步包含凍乾該調配物以達成約1%與約5%之間的殘餘水分含量。
  107. 一種降低rAAV粒子釋放rAAV基因組之方法，其包含製造含rAAV粒子、緩衝劑、糖、鹽、塑化劑及視情況選用之非離子性界面活性劑之調配物，其中該等rAAV粒子在三個凍融循環之後釋放之rAAV基因組比不包含糖之調配物中釋放之rAAV基因組減少。
  108. 一種降低rAAV粒子釋放rAAV基因組之方法，其包含製造含rAAV粒子、緩衝劑、糖、鹽、塑化劑及視情況選用之非離子性界面活性劑之調配物，其中該等rAAV粒子在凍乾及復原之後釋放之rAAV基因組比不包含糖之調配物中釋放之rAAV基因組減少。
  109. 一種以糖於降低rAAV粒子釋放rAAV基因組上之用途，其包含製造含rAAV粒子、緩衝劑、糖、鹽及視情況選用之非離子性界面活性劑之調配物，其中該等rAAV粒子在三個凍融循環之後釋放之rAAV基因組比不包含糖之調配物中釋放之rAAV基因組減少。
  110. 一種以糖於降低rAAV粒子釋放rAAV基因組上之用途，其包含製造含rAAV粒子、緩衝劑、糖、鹽及視情況選用之非離子性界面活性劑之調配物，其中該等rAAV粒子在凍乾及復原之後釋放之rAAV基因組比不包含糖之調配物中釋放之rAAV基因組減少。
  111. 如請求項109或110之用途，其進一步包含凍乾該調配物，以達成約1%與約7%之間的殘餘水分含量。
  112. 一種以塑化劑於降低rAAV粒子釋放rAAV基因組上之用途，其包含製造含rAAV粒子、緩衝劑、糖、鹽、塑化劑及視情況選用之非離子性界面活性劑之調配物，其中該等rAAV粒子在三個凍融循環之後釋放之rAAV基因組比不包含糖之調配物中釋放之rAAV基因組減少。
  113. 一種以塑化劑於降低rAAV粒子釋放rAAV基因組上之用途，其包含製造含rAAV粒子、緩衝劑、糖、鹽、塑化劑及視情況選用之非離子性界面活性劑之調配物，其中該等rAAV粒子在凍乾及復原之後釋放之rAAV基因組比不包含糖之調配物中釋放之rAAV基因組減少。
  114. 如請求項104至108中任一項之方法或如請求項109至113中任一項之用途，其中藉由量測在存在DNA特異性螢光染色劑下之相對螢光，來測定rAAV基因組釋放。
  115. 如請求項104至108及114中任一項之方法或如請求項109至113中任一項之用途，其中冷凍誘發之rAAV基因組釋放係降低至少約10%、20%、50%、80%或90%。
  116. 如請求項104至108及114中任一項之方法或如請求項109至113中任一項之用途，其中實質上消除由冷凍誘發之rAAV基因組釋放。
  117. 如請求項104至108及114至116中任一項之方法或如請求項109至116中任一項之用途，其中該糖為非還原糖。
  118. 如請求項117之方法或如請求項117之用途，其中該非還原糖為蔗糖、海藻糖或棉子糖。
  119. 如請求項117之方法或如請求項117之用途，其中該非還原糖為蔗糖。
  120. 如請求項104至108及114至116中任一項之方法或如請求項109至116中任一項之用途，其中該糖為還原糖。
  121. 如請求項114之方法或如請求項114之用途，其中該還原糖為葡萄糖、果糖、甘露糖、半乳糖或乳糖。
  122. 如請求項120之方法或如請求項120之用途，其中該還原糖為右旋糖。
  123. 如請求項103至108及114至122中任一項之方法或如請求項109至113中任一項之用途，其中該塑化劑包含甘油。
  124. 如請求項103至108及114至123中任一項之方法或如請求項109至113中任一項之用途，其中該調配物係根據請求項1至102中任一項。
  125. 一種製造rAAV產物之穩定的凍乾調配物之方法，其包含使凍乾前調配物經過凍乾之步驟，其中凍乾前調配物係根據請求項1至102中任一項。
  126. 一種治療或預防疾病之方法，該方法包含向有需要之個體投與治療有效劑量之rAAV調配物，該rAAV調配物為經復原之穩定的凍乾調配物，其中該穩定的凍乾調配物之該凍乾前調配物係根據請求項1至102中任一項。
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