KR20230121863A - 로키산 홍반열 검출 및 치료 - Google Patents

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Abstract

로키산 홍반열("RMSF")의 검출 및 치료를 위한 조성물 및 방법이 본원에 제공된다. 조성물은 리케차 리케치(Rickettsia rickettsii)를 특이적으로 검출하고, RMSF의 신속하고 정확한 검출 및 진단을 제공하는 다른 리케차(Rickettsia) 종과 교차 반응하지 않는다.

Description

로키산 홍반열 검출 및 치료
우선권
본 출원은 2020년 12월 17일에 출원된, 미국 출원 제63/126,756호의 이익을 주장하며, 이는 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다.
서열 목록
본 출원은 EFS-Web을 통해 ASCII 포맷으로 제출된 서열 목록을 포함하며, 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다. 2021년 12월 16일에 생성된, 상기 ASCII 사본의 명칭은 "331721-000066 sequence listing_ST25.txt"이며, 크기는 약 29 바이트이다.
로키산 홍반열(Rocky Mountain Spoted Fever, RMSF)은 리케차 리케치(Rickettsia rickettsii) 감염에 의해 유발되는 벡터 매개 질환이다. 비병원성 리케차 속(Rickettsia spp) 유래의 교차 반응 항체로 인해 개에서 질환을 식별하는 것은 어렵다. 따라서, R. 리케치(R. rickettsii) 특이적 유전자/단백질의 식별이 효과적인 진단 테스트 개발에 중요하다. RMSF는 주로 미국 개 진드기(Dermacentor variabilis), 로키산 우드 진드기(Dermacentor andersonii) 및 기타 진드기, 예컨대 Ambylomma 및 Rhipicephalus에 의해 개에 전달되는 인수공통 질환(zoonotic disease)이다. R. 리케치(R. rickettsii)에 감염된 진드기가 인간, 개, 사슴 및 기타 동물을 물고 이에 의해 감염성 박테리아를 확산시킨다. R. 리케치(R. rickettsii)는 진드기가 무는 동안 혈류로 들어가서 미세순환계의 혈관 세포를 침입하여, 종종 광범위한 혈관 손상을 초래한다.
R. 리케치(R. rickettsii)는 다른 리케차 속(Rickettsia spp) 및 내공생체(endosymbionts)와 물리적으로 밀접한 관련이 있다. 리케차(Rickettsia)의 여러 상이한 종의 게놈이 시퀀싱되었지만, 진단 항원의 식별을 위한 어려움은 비병원성 또는 내공생체 및 다른 리케차(Rickettsia) 종 유래의 교차 반응 항체이다. 현재의 RMSF 진단은 PCR, IFA 및 배양에 의해 수행된다. 그러나, 이들 진단 방법은 감염 검출에 있어서 특정 한계를 갖는다(Parola 등, (2005) Veterinary research,　36(3), 469-492; Breitschwerdt 등., (1999)　Antimicrobial agents and chemotherapy,　43(4), 813-821; Levin 등 (2014) PloS one,　9(12).
RMSF는 가장 치명적인 진드기 매개 질환 중 하나이다. R. 리케치(R. rickettsii)에 의한 인간 감염은 미치료시 사망률이 ~15%가 될 수 있다. 지난 10년 동안 인간 사례가 꾸준히 증가하고 있다. 개과에서의 유병률은 비 풍토병 지역에서 0.1%만큼 낮은 것부터 풍토병 지역에서 또는 국소 발병 동안 14% 이상 만큼 높은 것까지 다양할 수 있다. 항-리케차 리케치(Rickettsia rickettsii) 항체의 조기(4-14일 DPI 감염 또는 그 이전) 및 매우 특이적인 검출로 이어지게 될 R. 리케치(R. rickettsii) 감염에 대해 신규한 마커가 필요하다. 또한, R. 리케치(R. rickettsii)에 대한 종-특이적 진단 테스트가 필요하다.
일 실시예는 (i) 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7에 제시된 폴리펩티드에 대한 90% 이상의 서열 동일성; (ii) 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7과 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 2, 3, 4, 5, 6, 7개 또는 그 이상의 폴리펩티드로 이루어진 융합 단백질; 또는 (iii) 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7과 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 적어도 2개의 폴리펩티드로 이루어진 융합 단백질을 포함하는 폴리펩티드를 제공한다.
또 다른 실시예는 75개 미만의 총 아미노산을 가지며, 서열번호 1, 2, 5, 6 또는 7에 제시된 폴리펩티드와 90% 이상의 서열 동일성을 포함하는 폴리펩티드를 제공한다.
또 다른 실시예는 350개 미만의 총 아미노산을 가지며, 서열번호 3 또는 4에 제시된 폴리펩티드와 90% 이상의 서열 동일성을 포함하는 폴리펩티드를 제공한다.
일 실시예에서, 폴리펩티드는 자연적으로 발생하는 것이 아니다. 폴리펩티드는 동결 건조되거나, 탈수되거나, 건조될 수 있다. 폴리펩티드는 하나 이상의 표지 또는 태그를 더 포함할 수 있다. 폴리펩티드는 지지체에 고정될 수 있다. 폴리펩티드는 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7에 제시된 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 항체와 면역복합체로 존재할 수 있다.
또 다른 실시예는 항-리케차 리케치(Rickettsia rickettsii) 항체 또는 이의 특이적 결합 단편을 검출하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7에 제시된 폴리펩티드에 대한 90% 이상의 서열 동일성을 포함하는 하나 이상의 폴리펩티드와 시험 시료를 접촉시키는 단계; 및 항-리케차 리케치(Rickettsia rickettsii) 항체 또는 이의 특이적 결합 단편 및 하나 이상의 폴리펩티드의 복합체를 검출하는 단계를 포함할 수 있다. 하나 이상의 폴리펩티드는 지지체에 고정될 수 있다. 복합체는 항-리케차 리케치(Rickettsia rickettsii) 항체 또는 이의 특이적 결합 단편에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 이차 항체 또는 이의 특이적 결합 단편을 사용하여 검출될 수 있다. 이차 항체 또는 이의 특이적 결합 단편은 하나 이상의 태그 또는 표지를 포함할 수 있다. 복합체는 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7에 제시된 폴리펩티드에 대한 90% 이상의 서열 동일성을 포함하는 하나 이상의 검출기 폴리펩티드를 사용하여 검출될 수 있다. 하나 이상의 검출기 폴리펩티드는 표지 또는 태그를 포함할 수 있다. 폴리펩티드는 서열번호 1, 2, 5, 6 또는 7에 제시된 폴리펩티드에 대한 90% 이상의 서열 동일성을 포함할 수 있고, 하나 이상의 분비성 신호 서열, 하나 이상의 에피토프 태그, 또는 하나 이상의 분비성 신호 서열 및 하나 이상의 에피토프 태그를 추가로 포함할 수 있다.
또 다른 실시예는 대상체에서 리케차 리케치(Rickettsia rickettsii)에 의해 야기된 질환을 진단하기 위한 방법을 제공한다. 상기 방법은 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7에 제시된 폴리펩티드에 대한 90% 이상의 서열 동일성을 포함하는 하나 이상의 폴리펩티드와 시험 시료를 접촉시키는 단계; 및 항-리케차 리케치(Rickettsia rickettsii) 항체 또는 이의 특이적 결합 단편 및 하나 이상의 폴리펩티드의 복합체를 검출하는 단계를 포함할 수 있다. 대상체는 약 4, 5, 6, 7, 8 또는 9일 미만 동안 리케차 리케치(Rickettsia rickettsii)에 감염될 수 있다. 상기 방법은 시료 내의 복합체의 양을 대조군 시료 또는 대조군 표준과 비교하는 단계를 추가로 포함할 수 있으며, 여기서 상기 대조군 시료 또는 대조군 표준과 비교하여 상기 복합체의 수준이 상승된 것은 리케차 리케치(Rickettsia rickettsii)에 의해 야기된 질환의 표시이다.　상기 방법은복합체가 검출되는 리케차 리케치(Rickettsia rickettsii)에 의해 야기된 질환에 대한 치료제를 투여하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 방법은 시료에서 항-리케차 리케치(Rickettsia rickettsii) 항체 또는 이의 특이적 결합 단편의 양을 결정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 대상체는 인간 또는 비인간 동물일 수 있다. 시험 시료는 전혈, 혈장, 혈청, 림프액, 소변, 대변, 비강 면봉, 인후 면봉, 타액, 환경 시료, 또는 임의의 다른 적절한 시료일 수 있다.
일 실시예에서, 항-리케차 리케치(Rickettsia rickettsii) 항체 또는 이의 특이적 결합 단편은 경쟁 면역검정, 샌드위치 면역검정, 효소-결합 면역흡착 검정(ELISA), 면역조직화학 검정, 혼탁도 면역검정, 입자 강화 혼탁도 면역검정, 방사성 면역검정(RIA), 형광 면역흡착 검정(FIA), 멀티플렉스 면역검정, 단백질/펩티드 어레이 면역검정, 고상 방사성 면역검정(SPRIA), 간접 면역형광 검정(IIF), 화학발광 면역검정(CIA), 입자 기반 다중분석물 시험(PMAT), 도트 블롯 검정, 웨스턴 블롯 검정, 표면 플라스몬 공명(SPR), 등온 적정 열량측정(ITC), 마이크로스케일 전기영동(MST), 생물층 간섭계, 또는 격자 결합 간섭계에 의해 검출될 수 있다.
또 다른 실시예는리케차 리케치(Rickettsia rickettsii)에 의해 야기된 질환을 진단하기 위한 키트를 제공한다. 키트는 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7에 제시된 폴리펩티드에 대한 90% 이상의 서열 동일성을 포함하는 하나 이상의 폴리펩티드 -여기서 폴리펩티드는 자연적으로 발생한 것이 아님-; 및 하나 이상의 폴리펩티드가 시험 시료에 존재하는 항-리케차 리케치(Rickettsia rickettsii) 항체 또는 이의 특이적 결합 단편에 결합하는 것을 용이하게 하는 하나 이상의 시약을 포함할 수 있다.
도 1은 감염 후 선택된 시간에 RMSF 감염 및 이용 가능한 진단에 대한 가설적인 시간 경과를 보여준다. 중증도, 사망률 위험, 및 혈청전환은 병원균의 투여량, 감염된 면역 반응 및 리케차 균주에 따라 달라진다. x-축은 감염 후 일(DPI)을 나타내고, y-축은 감염 중증도를 나타낸다. 곡선은 RMSF 감염의 대표적인 시간 경과이다. 시간이 지남에 따라 감염이 진행됨에 따라, 감염된 사람은 혈청변환하여 감염을 제거하거나, 다기관 부전 및 잠재적 사망에 이르게 된다. 삽입물은 R. 리케치(R. rickettsii) 감염된 혈관구조의 길이방향 섹션을 보여준다. 독시사이클린에 의한 화살표는 효과적인 치료를 위한 시간 허용범위를 나타낸다. R. 리케치(R. rickettsii)를 진화적으로 프라이밍하여 혈류를 신속하게 빠져나와 혈관 내피 세포(삽입물 참조)에서 복제시키고, 이에 따라 감염 후 처음 며칠이 지나서 채혈의 PCR을 비효과적으로 만든다. 혈청변환을 검출하는 IFA는 특이성이 부족하고 일반적으로 매우 힘들기 때문에, 치료에 대한 신속한 또는 병원 내 지침에는 효과가 없다.
도 2는 상단 창에서 세포외 단백질 SCA2의 개략도를 보여준다. 박스 처리된 세포외 단백질 SCA2의 오토차페론 도메인(AC)에는 R. 리케치(R. rickettsii) 균주에만 존재하는 아미노산 스트레치가 존재한다. 하단 창은 리케차(Rickettsia) 종 유래의 SCA2 오토 샤페론 영역에 대한 서열을 보여준다. 전체 고유 영역(더 큰 수평 박스)은 PDX6인 반면, 약간 절단된 영역(더 작은 수평 박스)은 PDX7이다.
도 3은 Sca2 단백질의 R. 리케치(R. rickettsii) 특이적 영역 주위에서 생성된 특이적 시약을 보여준다. PDX6은 관심있는 전체 고유 영역을 나타내는 반면, PDX7은 약간 절단된 서열이다. PDX6 영역의 3 반복체(TDX1779) 또는 PDX6 영역의 5 반복체(TDX1780)로 이루어진 2개의 재조합 융합 단백질을 만들었다. 재조합 단백질도 8x His 태그 및 에피토프 태그로 합성하였다.
도 4는 일차 및 이차 항체와 아미노 비드에 접합된 PDX7 폴리펩티드의 개략도를 도시한다. 항체 결합 검출은 비오티닐화된 토끼 항 개과 IgG를 사용하여 보고되었다.
도 5는 멀티플렉스 상에서 실험적(풀링된) 혈청에 대한 PDX7 반응성을 보여준다. 감염 전 및 감염 후 4, 7, 11, 14, 21, 25, 32, 및 39일 (PDI)의 PDX7의 PDX7 형광 강도(MFI). PDX7을 아미노 비드에 접합시키고, R. 리케치(R. rickettsii)로 실험적으로 감염된 개과 유래의 풀링된 혈청에 대해 인큐베이션하였다. 항체 결합 검출은 비오티닐화된 토끼 항-개과 IgG를 사용하여 보고되었다. 이상적인 치료 허용범위는 PID4와 PID21 사이의 범위에 있다.
도 6은 멀티플렉스 상에서 실험 혈청에 대한 TDX1779 및 1780 반응성을 보여준다 (간접 항-종 포맷). TDX1779 및 TDX1780을 카르복시 비드에 결합시키고 R. 리케치(R. rickettsii)로 실험적으로 감염된 개과(Dog 1 또는 Dog 6)의 혈청에 대해 인큐베이션하였다 (감염 후 일 = PID). 항체 결합의 검출은 비오티닐화된 토끼 항 개과 IgG를 사용하여 보고되었다.
도 7은 항-리케차 리케치(Rickettsia rickettsii) 항체가 아미노 비드에 접합된 PDX7에 의해 포획되고 비오티닐화된 항-종 항체 대신에 비오티닐화된 PDX7 펩티드에 의해 검출되는 직접 검정 포맷의 개략도를 도시한다.
도 8은, 비오티닐화된 펩티드가 항-종 IgG 대신에 검출기로서 사용되는 직접 검정 포맷을 사용하여, 아미노 비드에 접합되고 미국으로부터의 574개의 시료에 대해 스크리닝된PDX7 펩티드를 도시한다 (직접 포맷, 도 7 참조). 이 접근법을 사용하여, 시험된 574개 중 8개의 양성 시료를 식별하였다. 양성을 확인하기 위해 RMSF 면역형광 검정(IFA)을 사용하여 8개의 양성을 추가로 평가하였다. 멀티플렉스에 의해 식별된 8개의 PDX7 양성 시료 중, 6개는 IFA에 의해 양성으로 확인되었으며, 이는 항-리케차(Rickettsia) 항체를 포획하기 위한 PDX7 펩티드의 강한 민감도 및 예측 값을 시사한다.
도 9는 R. 리케치(R. rickettsii)로 실험적으로 감염된 개과 유래된 혈청의 PDX21 폴리펩티드에 대한 반응성을 보여준다.
쉘 바이알(shell vial) 기술은 현재 RMSF에 대한 가장 확실한 진단 방법이다. 이 기술은, 임상 시편을 쉘 바이알 배양 튜브의 커버 슬립 상에서 성장시킨 세포 단층에 접종하고, 바이러스 감염성을 향상시키기 위한 저속 원심분리한 다음, 인큐베이션하는 것을 포함한다. 그러나, 이 기술에는 심각한 단점이 있다. 새로운 세포로 계대배양될 때, 약 1/3의 단리물이 손실될 수 있다. 또한, 배양 기술은 생물 안전성 수준 3 시설 및 살아있는 숙주 세포(동물 마우스 모델 또는 발육란) 또는 세포 배양(Vero, L929, HEL, XTC-2, 또는 MRC5 세포)을 유지할 수 있는 직원을 갖춘 실험실로 제한된다.
RMSF 진단을 위한 표준 혈청학적 검사는 R. 리케치(R. rickettsii) 병원균을 사용해 슬라이드에 고정시킨 면역글로불린 G(IgG)에 대한 간접 면역형광 검정(IFA)이다. 　 그러나, 이 검정은 R. 리케치(R. rickettsii)에 특이적이지 않다. 이는 또한, 예를 들어, R. akari, R. parkeri, 및 Rickettsia 364D도 검출한다. 동일 속 내 및 때때로 상이한 속 내 병원균 항원 간의 교차 반응성은 혈청학의 알려진 주요 한계이다. IFA는 또한 슬라이드에 비특이적으로 결합하는 항체 교차 반응성 및/또는 항-종 항체의 결과로서 비특이적 신호를 겪는다. 추가적인 제한 사항으로서, 리케차(Rickettsia) 병원균이 이전에 단리되거나 검출되지 않은 영역에서는, IFA 검정은 유일한 진단 방법으로서 신뢰할 수 없고, 교차 참조 기술로서만 신뢰할 수 있다.
중합효소 연쇄 반응(PCR) 검정 및 시퀀싱 방법 또한 혈액 및 피부 생검에서 RMSF를 검출하고 식별하는 데 사용될 수 있다. PCR 및 시퀀싱 방법은 빠르지만, 전통적인 PCR은 혈액 시료에서 R. 리케치(R. rickettsii) 검출에 대한 민감도가 낮으며, 시료가 오염될 수 있다. 제안된 "자살 PCR" 검정과 같은 중첩(nested) PCR 검정은 이전 검정으로부터의 앰플리콘에 의한 수직 오염을 완화시키려고 시도한다. 자살 PCR 검정은 실험실에서 이전에 증폭되지 않은 유전자를 표적화하는 일회용 프라이머를 사용한다. 그럼에도 불구하고, 표준 중첩 PCR 검정은 오염 및 위양성 결과에 매우 취약하다.
리케차 리케치(Rickettsia rickettsii)를 특이적으로 검출할 수 있고 다른 리케차(Rickettsia) 종과 교차 반응하지 않는 RMSF에 대한 진단 방법이 신속하고 정확한 RMSF 진단에 기여할 것이다. 배양, IFA 및 PCR 방법의 단점을 완화하면서 이러한 이점을 제공하는 진단 테스트는 더 큰 전세계 모집단에서 RMSF의 더 정확하고 시기적절한 진단을 보장할 것이다. RMSF에 대한 더 빠르고 정확한 진단 테스트는 더 이른 치료로 이어지고, 이는 치료가 지연될 때 RMSF에 대한 사망률이 증가함에 따라 중요하다.
RMSF의 검출 및 치료를 위한 조성물 및 방법이 본원에 제공된다. 조성물은 리케차 리케치(Rickettsia rickettsii)를 특이적으로 검출할 수 있고 다른 리케차(Rickettsia) 종과 교차 반응할 가능성이 없어서 신속하고 정확한 RMSF 진단을 제공할 수 있다.
폴리펩티드
폴리펩티드는 아미드 결합이 3개 이상의 아미노산을 공유 결합하는 중합체이다. 폴리펩티드는 번역 후 변형될 수 있다. 정제된 폴리펩티드는 세포 물질, 다른 유형의 폴리 펩티드, 화학 전구체, 폴리펩티드의 합성에 사용되는 화학물질, 또는 이들의 조합이 실질적으로 없는 폴리펩티드 제조물이다. 세포 물질, 배양 배지, 화학 전구체, 폴리펩티드의 합성에 사용되는 화학물질이 실질적으로 없는 폴리펩티드 제조물은 약 30%, 20%, 10%, 5%, 1% 또는 그 미만의 다른 폴리펩티드, 배양 배지, 화학 전구체, 및/또는 합성에 사용되는 다른 화학물질을 갖는다. 따라서, 정제된 폴리펩티드는 약 70%, 80%, 90%, 95%, 99% 또는 그 이상 순수하다.
용어 "폴리펩티드"는 하나 이상의 유형의 폴리펩티드 또는 일련의 폴리펩티드를 지칭할 수 있다. "폴리펩티드"는 또한 전장 단백질, 절단된 폴리펩티드, 또는 폴리펩티드 단편을 포함하지만 이에 한정되지 않는 둘 이상의 상이한 유형의 폴리펩티드의 혼합물을 지칭할 수 있다. 용어 "폴리펩티드들" 또는 "폴리펩티드"는 각각 "하나 이상의 폴리펩티드"를 의미할 수 있다.
SCA2 폴리펩티드
리케차(Rickettsia) SCA2 단백질은 17가지 표면 세포 항원(SCA, surface cell antigen) 단백질 중 하나이다. 표면 세포 항원(SCA) 단백질은 리케차(Rickettsia) 자가수송체(AT) 계열을 지칭한다. 이들 SCA 단백질은 숙주 세포의 박테리아 감염에 관여한다. SCA2 단백질은 리케차(Rickettsia) 종 전체에 걸쳐 고도로 보존되며, 표적 세포에 대한 리케차(Rickettsia)의 접착 침입 및 운동성을 용이하게 할 수 있는 외막 단백질이다. SCA2의 폴리펩티드 서열의 예는 GenBank 수탁번호 AJG33947.1 및 AJG32613.1에 제시되어 있다. SCA2는, 예를 들어, 숙주 세포 세포질에서 리케차(Rickettsia)의 액틴 기반 운동성을 담당하는 포르민(formin) 모방체로서 기능한다.
R. 리케치(R. rickettsii) 균주에만 존재하는 아미노산의 스트레치가 세포외 단백질 SCA2의 오토샤페론 도메인(AC)에 존재한다. 본원에서 PDX6으로 불리는 전체 고유 영역인 반면, 약간 절단된 영역은 본원에서 PDX7로 명명된다. 도 3 참조. 또한, 각각 3개의 PDX6 반복 또는 5개의 PDX6 반복의 융합에 의해 2개의 재조합 융합 단백질인 TDX1779 및 TDX1780이 작제되었다. 이들 폴리펩티드 중 임의의 것은, 예를 들어, 바코드 자기 비드(BMB)와 같은 지지체에 고정될 수 있고 검출 분석에 사용될 수 있다.
(PDX6) 서열번호 1
C DYKKSLLXLRSSDEDDQGYATGYTTDEEELEEXNSTTGEELKKDISD
위치 9에서의 X는 E 또는 A일 수 있다. 위치 34에서의 X는 G 또는 S일 수 있다.
(PDX7) 서열번호 2
C SSDEDDQGYATGYTTDEEELEEXNSTTGEELKKDISD
위치 24에서의 X는 G 또는 S일 수 있다.
(TDX1779) 서열번호 3
MDWTWRVFFLLALATGVHS C DYKKSLLELRSSDEDDQGYATGYTTDEEELEESNSTTGEELKKDISDDYKKSLLELRSSDEDDQGYATGYTTDEEELEESNSTTGEELKKDISDDYKKSLLELRSSDEDDQGYATGYTTDEEELEESNSTTGEELKKDISDAAAHHHHHHHH
TDX1779의 구조는 (MDWTWRVFFLLALATGVHS-PDX6-PDX6-PDX6-8XHIS)이다) (도 3 참조). N 말단에서 서열의 밑줄 친 부분(예: MDWTWRVFFLLALATGVHS 서열번호 24)은 분비 (신호) 서열이다. "8XHIS"는 8개의 His 잔기를 포함하는 His 태그를 의미한다.
(TDX1780) 서열번호 4
MDWTWRVFFLLALATGVHS C DYKKSLLELRSSDEDDQGYATGYTTDEEELEESNSTTGEELKKDISDDYKKSLLELRSSDEDDQGYATGYTTDEEELEESNSTTGEELKKDISDDYKKSLLELRSSDEDDQGYATGYTTDEEELEESNSTTGEELKKDISDDYKKSLLELRSSDEDDQGYATGYTTDEEELEESNSTTGEELKKDISDDYKKSLLELRSSDEDDQGYATGYTTDEEELEESNSTTGEELKKDISDAAAHHHHHHHH
TDX1780의 구조는 (MDWTWRVFFLLALATGVHS-PDX6-PDX6-PDX6-PDX6-PDX6-PDX6-8XHIS)이다. 도 3 참조.
밑줄 친 아미노산은 생화학적/면역학적 목적으로 조작된 폴리펩티드 서열에 대한 비-자연적 변이 및/또는 첨가를 나타낸다. 따라서, 이들 폴리펩티드는 비-자연 발생적이며, 예를 들어, 분석에서 더 양호한 정제 특성 및 더 양호한 특이성 및 민감도를 포함하여 자연 발생 폴리펩티드와 상이한 특성을 갖는다.
분비 신호 서열은 펩티드 서열의 N-말단(또는 일부 경우에, C-말단)에 존재하는 펩티드 서열(또는 펩티드 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드)이다. 분비 신호 서열은 신호 서열, 표적화 신호, 국소화 신호, 국소화 서열, 전이 펩티드, 리더 서열, 리더 펩티드, 프리프로 서열, 프리 서열, 또는 분비 신호 펩티드와 같은 다양한 명칭으로 지칭될 수 있지만, 이들로 한정되지는 않는다). 분비 신호 서열은 약 10 내지 110개 아미노산 길이(예를 들어, 약 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45,50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105 또는 110개 아미노산 길이)일 수 있다. 보다 큰 폴리펩티드의 성분으로서, 분비 신호 서열은 표적화에 유용할 수 있고, 그것이 합성되는 세포의 분비 경로를 통해 보다 큰 폴리펩티드를 지시할 수 있다. 일부 실시예에서, 더 큰 폴리펩티드는 분비 경로를 통과하는 동안 분비 신호 서열을 제거하기 위해 절단된다. 분비 신호 서열은 내인성이거나 조작될 수 있다.
분비 신호 서열은, 예를 들어, von Heinje(Eur. J. Biochem. 133: 17-21, 1983; J. Mol. Biol. 184: 99-105, 1985; Nuc. Acids. Res. 14: 4683-3690, 1986)에 의해 확립된 규칙에 따라 합성될 수 있다. 분비 신호 서열의 예가 표 2에 나타나 있다. 당 기술분야에 또는 당 기술분야의 숙련자에게 공지된 임의의 분비 신호 서열이 본원에 설명된 폴리펩티드 및 방법에 사용될 수 있다.
설명
(해당되는 경우) 		분비 신호 서열 서열번호
TDX1779 및 TDX1780 분비 신호 서열 MDWTWRVFFLLALATGVHS 서열번호 24
SignalP 3.0 MDWTWRILFLVAAATGTHA 서열번호 25
Erwinia carotovora 펙테이트 라이아제 2 (pelB) 리더 펩티드 MKYLLPTAAAGLLLLAAQPAMA 서열번호 26
인간 성장 호르몬 신호 서열 MATGSRTSLLLAFGLLCLWLQEGSA 서열번호 27
otPA 프리-프로 신호 서열 MPLLLLLPLLWAGALA 서열번호 28
인간 CD33 신호 서열 MDAMKRGLCCVLLLCGAVFVSLSQEIHAELRRFRR 서열번호 29
PhoA MKQSTIALALLPLLFTPVKTA 서열번호 30
OmpA MKKTAIAIAVALAGFATVAQA 서열번호 31
DsbA MKKIWLALAGLVLAFSASA 서열번호 32
TorT MRVLLFLLSLFMLPAFS 서열번호 33
SufI MSLSRRQFIQASGIALCAGAVPLKASA 서열번호 34
TorA MNNNDLFQASRRRFLAQLGGLTVAGMLGPSLLTPRRATA 서열번호 35
N 말단 분비 신호 펩티드 서열 MAGPATQSPMKLMALQLLLWHSALWTVQEA 서열번호 36
인간 α-1-항 트립신 (AAT) MMPSSVSWGILLLAGLCCLVPVSLA 서열번호 37
인간 인자 IX (FIX) MQRVNMIMAESPSLITICLLGYLLSAECTVFLDHENANKILNRPKR 서열번호 38
인간 프로락틴 (Prolac) MKGSLLLLLVSNLLLCQSVAP 서열번호 39
인간 알부민 (Alb) MKWVTFISLLFLFSSAYSRGVFRR 서열번호 40
YDR420w 분비 신호 펩티드 MVSLKIKKLLLVSLLNAIEAYSNDTI YSTSYNNGIESTPSYSTSAISSTGSSNKENAITSSSETTTMAGDYGESGSTTIMDEQETGTSSQYISVTTTTQ 서열번호 41
YBR187w 분비 신호 펩티드 NGGNMAIKKASLIALLPLFTAAAAAATDAETSNESGSSSHLKS 서열번호 42
YHR139c 분비 신호 펩티드 MKFTSVLAFFLATLTASATFLYKRQNVTSGGGTVPIITGGPAVSGSQSNVTTTTLFNSTSTLNITQLYQIATDVNDTLQSESSS 서열번호 43
YGR014w 분비 신호 펩티드 MQFPFACLLSTLVISGSLARASPFDFIFGNGTQQAQSQSESQGQVSFTNEASQDSSTTSLVTAYSQGVHSHQSATIVSATISSLPSTWYDASSTSQTSVS 서열번호 44
YBR078w 분비 신호 펩티드 MQFKNALTATAILSASALAANSTTSIPSSCSIGTSATATAQADLDKISQCSTIVGNLTITGDLGSAALASIQEIDGSLTIFNSSSLSSFSADIKKI 서열번호 45
YNL300w 분비 신호 펩티드 MKFSTLSTVAAIAAFASADSTSDGVTYVDVTTTPQSTTSMVSTVKTTSTPYTTSTIATLSTKSISSQANTTTHEIST 서열번호 46
YLR084c 분비 신호 펩티드 MFVHRLWTLAFPFLVEISKASQLENIKSLLDIEDNVLPNLNISQNNSNAVQILGGVDALSFYEYTGQQNFTKEIGPETSSHGLVYYSNNTYIQLEDASDD 서열번호 47
YMR008c 분비 신호 펩티드 MKLQSLLVSAAVLTSLTENVNAMSPNNSYVPANVTCDDDINLVREASGLSDNEYEMLKKRDAYTKE 서열번호 48
폴리펩티드는 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7에 제시된 (하기 서열번호 5, 6 및 7의 설명 참조) 하나 이상의 폴리펩티드(예: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 그 이상)에 대한 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 및 그 이상의 서열 동일성을 포함할 수 있고, 하나 이상(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5 또는 그 이상)의 분비 신호 서열, 하나 이상(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5 또는 그 이상)의 에피토프 태그, 또는 하나 이상의 분비 신호 서열 및 하나 이상의 에피토프 태그를 추가로 포함할 수 있다. 이들 요소는 융합 단백질을 구성하는 개별 단백질 또는 서열 사이에 하나 이상의 링커를 갖는 융합 단백질로서 존재할 수 있다. 대안적으로, 융합 단백질을 구성하는 개별 단백질 또는 서열 사이에는 링커가 존재할 수 없다. 융합 단백질의 요소(즉, 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7에 제시된 폴리펩티드, 분비 신호 서열, 및 에피토프 태그)는 융합 단백질에서 임의의 순서로 발생할 수 있다.
VUT 폴리펩티드
리케차(Rickettsia) 비타민 흡수 수송체 VUT 계열 단백질은 박테리아 세포 표면에 상주하는 것으로 예측되는 200개의 아미노산, 가상 단백질이다. 도메인 상동성에 기초하여 제안된 VUT의 기능은 박테리아 생장에 대한 중요한 요건인 퀴오신 구제와 일치한다. 이 단백질의 예는 GenBank 수탁번호 WP_012150928.1이며, 서열번호 8에 제시되어 있다:
MLFDKIKSKRKGKCMSNINAKFYIPLVSLLGVFIYLLNCFNKISQCSLVFVFLAITTNIISELYGRKRALIAVALCIIVSFGLLWNFNYYIHGRVIKGVVFASFVSVLLSTYCSTSIFSQLKPRCSLNTRNFASLIMCAVVDGIVMSGFFVNVFSTSKVLSIFYKEVLYKCAYSLTVYICIFLVQKVYGNNGSVRALKNF
일 실시예에서, VUT 단백질은 단백질의 양 말단 측부에 위치하는 2개의 관심 영역을 갖는다. PDX21 및 PDX39 펩티드는 VUT 단백질의 처음 38개 잔기 및 마지막 38개 잔기로부터 각각 유래하였다. 일 실시예에서, PDX21 및 PDX39 펩티드는 시스테인 잔기에 점 돌연변이를 갖는다. 즉, 자연적으로 발생하는 시스테인 아미노산은, 예를 들어, 세린으로 변경된다. 또한, 자연적으로 발생하는 메티오닌은 시스테인으로 변경될 수 있다. 이러한 변경사항이 아래에 밑줄이 그어져 있다.
(PDX21) 서열번호 5
MLFDKIKSKRKGK S MSNINAKFYIPLVSLLGVFIYLLN
(PDX39) 서열번호 6
C KEVLYK S AYSLTVYI S IFLVQKVYGNNGSVRALKNF
(PDX40) 서열번호 7
C LFDKIKSKRKGK S MSNINAKFYIPLVSLLGVFIYLLN
PDX40은 PDX21이고, 생화학적 목적으로 첫 번째 메티오닌(M)이 시스테인(C)으로 대체된 것이다.
따라서, 이들 폴리펩티드는 비-자연 발생적이며, 예를 들어, 이차 구조를 형성하는 경향이 감소되어 있고 시험을 위해 고상에 접합하는 능력을 포함하는 자연 발생 폴리펩티드와 상이한 특성을 갖는다.
일 실시예는 완전한 SCA2 단백질, 완전한 VUT 단백질, PDX6, PDX7, TDX1779, TDX1780, PDX21, PDX39, PDX40 또는 이의 단편을 포함하는 정제된 폴리펩티드를 제공한다. 완전한 SCA2 단백질, 완전한 VUT 단백질, PDX6, PDX7, TDX1779, TDX1780, PDX21, PDX39, PDX40의 폴리펩티드 단편은 약 350, 300, 250, 200, 150, 100, 95, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10 미만 (또는 약 10 내지 약 350의 임의의 범위)인 총 연속 아미노산일 수 있다. 일 실시예에서, 폴리펩티드 단편은 완전한 SCA2 단백질, 완전한 VUT 단백질, PDX6, PDX7, TDX1779, TDX1780, PDX21, PDX39, PDX40의 약 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 100, 150, 200, 250, 300 또는 350 초과의 총 연속 아미노산이다. 일 실시예에서, 폴리펩티드는 약 95, 75, 50, 또는 25 미만의 총 아미노산을 가지고 서열번호 1, 2, 5, 6 또는 7에 제시된 폴리펩티드와 70%, 80%, 90%, 95% 또는 그 이상의 서열 동일성을 포함한다. 일 실시예에서, 폴리펩티드는 약 400, 350, 300, 200, 또는 150 미만의 총 아미노산을 가지며, 서열번호 3 또는 4에 제시된 폴리펩티드와 약 70%, 80%, 90%, 95% 또는 그 이상의 서열 동일성을 포함한다.
예를 들어, 서열번호 1은 적어도 48개 아미노산의 길이이다. 일 실시예에서, 폴리펩티드는 폴리펩티드를 예를 들어 95개 아미노산의 길이까지 연장시키기 위해 추가의 아미노산을 포함할 수 있다. 여분 또는 추가 아미노산은, 예를 들어, 표지, 태그, 추가 R. 리케치(R. rickettsii) 아미노산, R. 리케치(R. rickettsii)와 무관한 아미노산, 정제에 사용될 수 있는 아미노산, 폴리펩티드의 용해도를 증가시키는 데 사용될 수 있는 아미노산, 폴리펩티드의 다른 특성을 개선하는 아미노산, 또는 다른 아미노산일 수 있다. 일 실시예에서, 추가 아미노산은 R. 리케치(R. rickettsii) 아미노산이 아니다. 본 실시예에서, 95개 아미노산 길이의 폴리펩티드는 서열번호 1의 48개의 연속 아미노산에 걸쳐 서열번호 1에 제시된 폴리펩티드와 약 70%, 80%, 90%, 95% 또는 그 이상의 서열 동일성을 갖는 반면, 95개 아미노산 폴리펩티드의 나머지 47개 아미노산은, 예를 들어, 서열번호 1과 서열 동일성이 없을 수 있다.
또 다른 비제한적인 예에서, 총 아미노산이 75개 미만이고 서열번호 2에 제시된 폴리펩티드와 90% 또는 그 이상의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드는 70개 아미노산을 갖는 폴리펩티드일 수 있다. 70개 아미노산 길이의 폴리펩티드는 서열번호 2의 38개의 연속 아미노산에 걸쳐 서열번호 2에 제시된 폴리펩티드와 90% 또는 그 이상의 서열 동일성을 가질 수 있는 반면, 70개 아미노산 폴리펩티드의 나머지 32개 아미노산은, 예를 들어, 서열번호 2와 서열 동일성이 없을 수 있다.
또 다른 비제한적인 예에서, 총 아미노산이 350개 미만이고 서열번호 3에 제시된 폴리펩티드와 90% 또는 그 이상의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드는 300개 아미노산 길이일 수 있다. 300개 아미노산 길이의 폴리펩티드는 서열번호 3의 172개의 연속 아미노산에 걸쳐 서열번호 3에 제시된 폴리펩티드에 대한 90% 또는 그 이상의 서열 동일성을 가질 수 있는 반면, 300개 아미노산 폴리펩티드의 나머지 128개 아미노산은, 예를 들어, 서열번호 3에 대한 서열 동일성이 없을 수 있다.
폴리펩티드(예를 들어, 서열번호 1-7)가 전장 R. 리케치(R. rickettsii) 폴리펩티드보다 더 작다는 사실은 중요한데, 더 작은 폴리펩티드가 검출 또는 진단 검정에서 전장 폴리펩티드보다 더 큰 특이성 및/또는 민감도를 가질 수 있기 때문이다. 또한, 이들 더 작은 폴리펩티드는 제조하는 데 덜 비싸고 전장 폴리펩티드보다 더 높은 순도로 수득될 수 있다.
일 실시예에서, 폴리펩티드 또는 이의 단편은 자연 발생된 것이 아니다. 즉, 폴리펩티드 또는 단편은 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 75개 이상의 비-자연 발생 아미노산을 포함한다. 일 실시예에서, 비-자연 발생 아미노산은 분석에서 폴리펩티드의 증가된 용해도 또는 폴리펩티드의 증가된 민감도 또는 증가된 특이성과 같은 유익한 특성을 제공할 수 있다.
용어 "서열 동일성" 또는 "동일성 백분율"은 본원에서 상호 교환적으로 사용된다. 2개의 폴리펩티드 분자 또는 2개의 폴리뉴클레오티드 서열의 동일성 백분율을 결정하기 위해, 서열들은 최적의 비교 목적을 위해 정렬된다 (예를 들어, 제2 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열과의 최적 정렬을 위해 제1 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드의 서열에 갭이 도입될 수 있음). 그런 다음, 대응하는 아미노산 또는 뉴클레오티드 위치에서의 아미노산 또는 뉴클레오티드를 비교한다. 제1 서열에서의 위치가 제2 서열에서의 대응하는 위치와 동일한 아미노산 또는 뉴클레오티드에 의해 점유되는 경우, 분자는 그 위치에서 동일하다. 2개의 서열 간의 동일성 백분율은 서열에 의해 공유된 동일한 위치의 수의 함수이다 (즉, 동일성 %=동일한 위치의 수/위치의 총 수 (즉, 중첩 위치) x 100). 일부 실시예에서, 비교 목적으로 정렬된 기준 서열(예: 서열번호 1-7)의 길이는 비교 서열의 길이의 적어도 50, 60, 70 또는 80%이고, 일부 실시예에서는 적어도 90% 또는 100%이다. 일 실시예에서, 2개의 서열은 동일한 길이이다.
원하는 서열 동일성 정도의 범위는 대략 80% 내지 100%이고, 그 사이의 정수 값이다. 개시된 서열과 청구된 서열 사이의 동일성 백분율은 적어도 80%, 적어도 83%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 적어도 99.9%일 수 있다. 일반적으로, 정확한 일치는 기준 서열(예: 서열번호 1-7)의 길이에 걸쳐 100% 동일성을 나타낸다.
본원에 설명된 폴리펩티드(예: SCA2 또는 VUT 폴리펩티드)와 충분히 유사한 폴리펩티드가 본원에서 사용될 수 있다. 본원에 설명된 폴리펩티드와 약 90, 91, 92, 93, 94 95, 96, 97, 98, 99, 99.5% 또는 그 이상 동일한 폴리펩티드도 본원에서 사용될 수 있다.
폴리펩티드 변이체는 예를 들어, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 또는 그 이상의 아미노산 잔기에 의해 (예를 들어, 아미노산 첨가, 치환 또는 결실) 서열번호 1-7 또는 이의 단편으로 나타낸 펩티드와 상이하다. 이러한 비교가 정렬을 필요로 하는 경우, 서열들은 최대 상동성을 위해 정렬된다. 변이 부위는 폴리펩티드의 어느 곳에서나 발생할 수 있다. 일 실시예에서, 변이체는 원래 폴리펩티드와 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%의 서열 동일성을 갖는다.
변이체 폴리펩티드는 일반적으로 본원에 설명된 폴리펩티드 서열 중 하나를 변형시키고 변형된 폴리펩티드의 특성을 평가하여 생물학적 등가물인지 여부를 결정함으로써 식별될 수 있다. 변이체는 면역조직화학 검정, 효소-결합 면역흡착 검정(ELISA), 혼탁도 면역검정, 입자-강화 혼탁도 면역검정, 입자-강화 혼탁도 면역분석, 방사성면역 검정(RIA), 면역효소 검정, 웨스턴 블롯 검정, 또는 다른 적절한 검정과 같은 검정에서 본원에 설명된 폴리펩티드와 실질적으로 동일한 생물학적 등가물이다. 즉, 변이체가 원래 폴리펩티드의 활성의 90-110%를 갖는 경우, 변이체는 생물학적 등가물이다. 일 실시예에서, 검정은 경쟁 검정이며, 여기서 생물학적으로 동등한 폴리펩티드는 대응하는 반응성 항원 또는 항체에 대한 본원에 설명된 폴리펩티드의 결합을 약 80%, 95%, 99%, 또는 100%만큼 감소시킬 수 있다. 대응하는 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체는 또한 변이체 폴리펩티드에 특이적으로 결합한다.
변이체 폴리펩티드는 하나 이상의 보존적 아미노산 변이 또는 다른 경미한 변형을 가질 수 있고, 생물학적 활성을 보유할 수 있으며, 즉 PDX6, PDX7, TDX1779, TDX1780, PDX21, PDX39, PDX40 또는 이의 단편과 생물학적으로 기능적으로 동등하다. 변이체 폴리펩티드는 표지, 태그, 추가 R. 리케치(R. rickettsii) 아미노산, R. 리케치(R. rickettsii)와 무관한 아미노산, 정제에 사용될 수 있는 아미노산, 폴리펩티드의 용해도를 증가시키는 데 사용될 수 있는 아미노산, 폴리펩티드의 다른 특성을 개선하는 아미노산, 또는 다른 아미노산을 가질 수 있다. 일 실시예에서, 추가 아미노산은 R. 리케치(R. rickettsii) 아미노산이 아니다.
아미노산서열에 돌연변이를 도입하는 방법은 당 분야의 숙련자에게 잘 알려져 있다. 예를 들어, Ausubel (ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc. (1994); Maniatis 등의 Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989) 참조. 돌연변이는 또한 "QuikChangeTM 부위 지정 돌연변이 유발 키트"(Stratagene)와 같은 상업적으로 이용 가능한 키트를 사용하여 도입될 수 있다. 폴리펩티드의 기능에 영향을 미치지 않는 아미노산을 대체함으로써 기능적으로 활성인 변이체 폴리펩티드를 생성하는 것은 당 분야의 숙련자에 의해 달성될 수 있다. 변이체 폴리펩티드는 화학적으로 합성될 수도 있다.
변이체 폴리펩티드는 하나 이상의 예측된 비필수 아미노산 잔기에서 보존적 아미노산 치환을 가질 수 있다. 보존적 치환은 한 아미노산이 유사한 특성을 갖는 또 다른 아미노산에 대해 치환되는 것으로서, 펩티드 화학 분야의 숙련자라면 폴리펩티드의 이차 구조 및 습윤성 성질이 실질적으로 변하지 않을 것으로 예상한다. 일반적으로, 아미노산의 다음 군은 보존적 변화를 나타낸다: (1) ala, pro, gly, glu, asp, gln, asn, ser, thr; (2) cys, ser, tyr, thr; (3) val, ile, leu, met, ala, phe; (4) lys, arg, his; 및 (5) phe, tyr, trp, his. 일 실시예에서, 폴리펩티드는 약 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20개 또는 그 이하의 보존적 아미노산 치환을 갖는다.
폴리펩티드는, 아미노산 링커, 아미노산 스페이서, 신호 서열, TMR 정지 전달 서열, 막관통 도메인과 같은 다른 아미노산 서열 뿐만 아니라, 글루타티온-S-트랜스퍼라아제, 히스티딘 태그(예를 들어, 약 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 이상의 His 잔기) 및 포도상구균 단백질 같은 단백질 정제에 유용한 리간드, 또는 이들의 조합을 함유할 수 있는, 융합 단백질일 수 있다. 일 실시예에서, 폴리펩티드는 하나 이상의 에피토프 태그, 예컨대 FLAG(예를 들어, DYKDDDDK; 서열번호 16), HA (YPYDVPDYAC; 서열번호 9), myc (EQKLISEEDLC; 서열번호 10), V5 (GKPIPNPLLGLDST; 서열번호 11), E-tag (GAPVPYPDPLEPR; 서열번호 12), VSV-g (YTDIEMNRLGK; 서열번호 13), 6xHis (HHHHHHH; 서열번호 14), and HSV (QPELAPEDPEDC; 서열번호 15)를 포함한다. 단클론 항체와 같은 항체는 에피토프 태그에 특이적으로 결합할 수 있고, 에피토프 태그를 포함하는 폴리펩티드를 정제하는 데 사용될 수 있다.
융합 단백질은 서로 작동 가능하게 연결된 둘 이상의 상이한 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 융합 단백질 작제물은 개별 폴리펩티드 단편들을 고정된 서열로 함께 결합시킴으로써 유기 화합물 합성 기술을 사용하여 화학적으로 합성될 수 있다. 융합 단백질은 화학적으로 합성될 수도 있다. 융합 단백질 작제물은 또한 시험관 내에서 배양된 유전적으로 변형된 숙주 세포(예컨대, 대장균)에 의해 발현될 수 있으며, 이는 적절한 서열로 아미노산 잔기를 암호화하는 특정된 재조합 DNA 서열을 보유하는 도입된 발현 벡터를 운반한다. 이종 폴리펩티드는, 예를 들어, 폴리펩티드의 N-말단 또는 C-말단에 융합될 수 있다. 하나 초과의 폴리펩티드가 융합 단백질에 존재할 수 있다. 폴리펩티드의 단편들이 융합 단백질에 존재할 수 있다. 융합 단백질은, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7개 또는 그 이상의 PDX6, PDX7, TDX1779, TDX1780, PDX21, PDX39, PDX40, 이들의 단편, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 폴리펩티드는 다량체 형태일 수 있다. 즉, 폴리펩티드는 PDX6, PDX7, TDX1779, TDX1780, PDX21, PDX39, PDX40, 이의 단편, 또는 이들의 조합의 2개 이상의 사본(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7개 또는 그 이상)을 포함할 수 있다. 폴리펩티드는, 예를 들어, 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7과 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 동일성을 갖는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7개 또는 그 이상의 폴리펩티드의 융합 단백질; 또는 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7과 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 서열 동일성을 갖는 적어도 2개의 폴리펩티드의 융합 단백질을 포함할 수 있다. 폴리펩티드는 융합 단백질을 구성하는 개별 단백질(즉, 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7) 사이에 하나 이상의 링커를 포함할 수 있는 융합 단백질일 수 있다. 대안적으로, 융합 단백질을 구성하는 개별 단백질 사이에는 링커가 존재할 수 없다. 융합 폴리펩티드는 다른 아미노산 서열, 예컨대 아미노산 링커, 아미노산 스페이서, 신호 서열, TMR 정지 전달 서열, 막관통 도메인 뿐만 아니라 글루타티온-S-트랜스퍼라아제, 히스티딘 태그, 에피토프 태그, 및 포도상구균 단백질 A 같은 단백질 정제에 유용한 리간드, 또는 이들의 조합을 함유할 수 있다.
융합 단백질의 또 다른 성분은 분비 (신호) 서열일 수 있다. 이들 서열은 발현 중에 숙주 세포로부터 융합 단백질의 분비를 허용할 수 있다. 분비 (신호) 서열은, 이러한 서열을 갖는 경우, 생산되는 이종 단백질의 서열일 수 있거나, 다른 분비된 단백질(예: t-PA)로부터 유래될 수 있거나, 새롭게 합성된 서열일 수 있다. 분비 (신호) 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열은 융합 단백질 DNA 서열에 작동 가능하게 연결될 수 있는데, 즉, 2개의 서열은 정확한 판독 프레임에서 연결되고 새롭게 합성된 폴리펩티드를 숙주 세포의 분비 경로로 유도하도록 위치된다. 분비 (신호) 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열은, 소정의 신호 서열이 관심 DNA 서열의 다른 곳에 위치할 수 있지만, 관심 폴리펩티드를 암호화하는 DNA 서열에 대해 일반적으로 5'에 위치한다 (예를 들어, Welch 등의 미국 특허 제5,037,743호; Holland 등의 미국 특허 제5,143,830호 참조).
일 실시예에서, 본원에 설명된 폴리펩티드는 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7에 제시된 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 항체 또는 이의 특이적 결합 단편과 면역복합체로 존재한다. 하나 이상의 항체 또는 이의 특이적 결합 단편은 항-리케차 리케치(Rickettsia rickettsii) 또는 이의 특이적 결합 단편일 수 있다.
폴리펩티드는 동결 건조되거나, 탈수되거나, 예를 들어 냉동 건조될 수 있다. 동결 건조된 폴리펩티드는 폴리펩티드의 제제를 저온으로 수행하여 시료로부터 물을 제거함으로써 수득될 수 있다. 탈수된 폴리펩티드 조성물은 물의 제거에 의해 폴리펩티드의 제제를 건조시킴으로써 수득될 수 있다. 건조된 폴리펩티드 제제는 공기 건조된(예를 들어, 냉동 건조된) 폴리펩티드 제제를 지칭할 수 있다.
표지
본원에 설명된 하나 이상의 폴리펩티드(검출기 폴리펩티드 포함)는 하나 이상의 표지 또는 태그에 접합될 수 있다. 표지 또는 태그는 원하는 분석 성분(예: 항체, 폴리펩티드 또는 지지체)에 직접 또는 간접적으로 커플링될 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드는 형광단, 효소, 화학발광 모이어티, 방사성 모이어티, 유기 염료, 소분자, 폴리펩티드 또는 이의 기능적 단편에 접합될 수 있다. 형광단의 예는 피코에리테린(PE), 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC), 테트라메틸로다민(TRITC), BODIPY, 텍사스 레드, 로다민 및 AlexaFluor® 염료와 같은 형광 염료를 포함한다. 형광 염료는 또한 형광 공명 에너지 전달(FRET)-염료 또는 시간-분해(TR)-FRET 염료를 포함할 수 있다. 형광단 표지는 녹색 형광 단백질(GFP), 증강된 녹색 형광 단백질, 및 시안 형광 단백질(CFP)과 같은 형광 단백질을 포함할수 있다. 효소 표지의 예는 가수분해 효소, 예컨대 알칼리 인산분해효소를 포함하는 인산분해효소, 에스테라아제 및 글리코시다아제, 또는 옥시도리덕타아제, 퍼옥시다아제, 예컨대 서양고추냉이 퍼옥시다아제, 및 효소-결합 면역흡착 분석, ELISA에 흔히 사용되는 다른 것을 포함한다. 3,3'5,5'-테트라메틸벤지딘(TMB), 3,3'-디아미노벤지덴(DAB), 또는 2,2'-아지노-비스(3-에틸벤조티아졸린-6-설폰산)(ABTS)와 같은 기질이 HRP에 인가될 때, 착색된(발색성) 또는 광(화학발광) 신호가 생성된다. 방사성 모이어티 표지는, 예를 들어,　3H,　125I,　35S,　14C, 또는　32P일 수 있다. 소분자 표지는, 예를 들어, 아가로스 비드와 같은 수지, 및 자성 비드, 예컨대 형광 표지된 자성 비드 또는 바코드화된 자성 비드(예를 들어, 캘리포니아주 산타페 스프링스의 Applied BioCode로부터 입수 가능한 바코드화된 자성 비드), DynabeadsTM, 착색된 유리 또는 플라스틱(예를 들어, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 라텍스 등) 비드, 및 콜로이드 금과 같은 나노입자를 포함한다. 폴리펩티드 또는 기능성 단편 표지는, 예를 들어, 비오틴, 헤마글루티닌(HA), 글루타티온-S-트랜스퍼라아제(GST), 또는 c-myc에 대한 친화도를 갖는 아비딘, 스트렙타비딘 또는 뉴트라비딘을 포함한다.
표지 또는 태그의 검출은 많은 상이한 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 예를 들어, 방사성 표지는 섬광 계수기, 자가 방사선 촬영에서와 같은 사진 필름, 또는 저장 인광 이미징을 사용하여 검출될 수 있다. 표지가 형광 표지인 경우, 적정 광 파장으로 형광크롬을 여기시키고 생성된 형광을 검출함으로써 검출할 수 있다. 형광은, 전하 결합 장치(CCD) 또는 광전자증폭기 등과 같은 전자 검출기의 사용에 의해, 사진 필름에 의해 시각적으로 검출될 수 있다. 유사하게, 효소 표지는 효소에 대한 적정 기질을 제공하고 생성된 반응 생성물을 검출함으로써 검출될 수 있다. 간단한 비색 표지는 표지와 연관된 색상을 관찰함으로써 검출될 수 있다. 한 쌍의 형광단이 검정에 사용될 때, 이들은 쉽게 구별될 수 있도록 구별되는 방출 패턴(파장)을 가질 수 있다.
본원에 설명된 성분(예를 들어, 폴리펩티드, 항체 및 이의 특이적 결합 단편)은 표지를 포함할 수 있지만, 예를 들어 표면 플라스몬 공명, 생물-층 간섭계, 및 격자-결합 간섭계 검출 검정을 포함하는 표지-무 검출을 위한 많은 옵션이 존재하기 때문에 표지는 폴리펩티드/항체 복합체의 검출에 필요하지 않다.
지지체
일 실시예에서, 검정의 성분(예: 폴리펩티드 또는 항체 또는 이의 특이적 결합 단편)은 지지체에 고정될 수 있다. 지지체는 본원에 설명된 바와 같은 하나 이상의 폴리펩티드, 항체, 또는 특이적 결합 단편의 부착에 적합하거나 이에 대해 적합하도록 변형될 수 있는 임의의 물질이다. 지지체의 예에는 유리 및 변형되거나 기능화된 유리, 플라스틱(아크릴, 폴리스티렌, 메틸스티렌, 폴리우레탄, Teflon®, 등 포함), 상자성 물질, 토리아 졸, 탄소 흑연, 산화티탄, 라텍스 또는 가교 덱스트란, 예컨대 Sepharose, 셀룰로오스 다당류, 나일론 또는 니트로셀룰로오스, 세라믹, 수지, 규소 및 변성 규소를 포함하는 실리카 또는 실리카계 물질, 탄소 금속, 무기 유리, 광섬유 다발, 및 다양한 다른 중합체를 포함한다. 일 실시예에서, 지지체는 마이크로역가 웰 플레이트(예: 96-웰, 384-웰 또는 1536-웰 플레이트)에 위치할 수 있다. 일 실시예에서, 지지체는 유동 세포 또는 유동 세포 장치(예: 단백질 칩 상 유동 세포) 내에 위치할 수 있다. 지지체는 견고한 지지체일 수 있다.
일 실시예에서, 지지체는 비드, 예컨대 자기 바코드 비드, 미소구체, 입자, 막, 칩, 슬라이드, 웰 또는 시험관일 수 있다. 비드는 미소구체 또는 입자를 포함하며, 이는 마이크로미터 또는 나노미터 치수의 작고, 이산적이고, 평면이 아닌 입자일 수 있다. 비드는 구형이거나 불규칙할 수 있다. 비드는 다공성일 수 있다. 일 실시예에서, 지지체는 질서정연한 패턴으로 폴리펩티드(예: 단백질 칩)를 고정시키기에 적합한 패터닝된 표면을 포함할 수 있다.
일 실시예에서, 본원에 설명된 바와 같은 하나 이상의 폴리펩티드는 링커 분자를 통해 지지체에 고정될 수 있다. 하나 이상의 폴리펩티드는 임의의 적절한 방법론을 사용하여 지지체에 접합될 수 있다. 일 실시예에서, 하나 이상의 폴리펩티드는 공유 및 비공유 접합 시약을 포함하는 접합 시약을 사용하여 지지체에 접합된다. 공유 접합 시약은 표면에 폴리펩티드를 공유 고정시키는 데 사용될 수 있는 임의의 화학적 또는 생물학적 시약을 포함할 수 있다. 공유 접합 시약은, 예를 들어, 카르복실-대-아민 반응성 기, 예컨대 카르보디이미드, 예컨대 EDC 또는 DCC, 아민 반응성 기, 예컨대 N-하이드록시숙신이미드(NHS) 에스테르 또는 이미도에스테르, 설프히드릴-반응성 가교제, 예컨대 말레이미드, 할로아세틸, 또는 피리딜 디설파이드, 카르보닐-반응성 가교제 기, 예컨대, 하이드라지드 또는 알콕시아민, 광반응성 가교제, 예컨대 아릴 아지드화물 또는 디지린, 또는 화학선택적 연결기, 예컨대 슈타우딩거 반응 쌍을 포함한다. 비공유 고정 시약은 표면 상에 폴리펩티드를 비공유적으로 고정시키는 데 사용될 수 있는 임의의 화학적 또는 생물학적 시약, 예컨대 비오틴과 같은 친화성 태그 또는 스트렙타비딘 같은 포획 시약 또는 항-His6 또는 항-Myc 항체 같은 항-태그 항체를 포함할 수 있다.
검출 및 진단 방법
일 실시예에서, 검정 방법은 폴리펩티드와 항체 또는 이의 특이적 결합 단편 사이의 복합체 형성에 적합한 조건 하에서 하나 이상의 폴리펩티드와 시험 시료를 접촉시키는 단계를 포함할 수 있다. 하나 이상의 폴리펩티드는, 예를 들어, 본원에 설명된 바와 같은 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7, 이들 폴리펩티드의 단편 또는 변이체와 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%의 서열 동일성을 포함할 수 있다. 폴리펩티드 및 항체 또는 이의 특이적 결합 단편의 복합체가 검출될 수 있다. 일 실시예에서, 폴리펩티드 및 항체 또는 특이적 결합 단편의 복합체는 하나 이상의 표지 또는 태그를 포함할 수도 있다. 복합체가 검출되면, 시료는 항-리케차 리케치(Rickettsia rickettsii) 항체를 함유한다.
일 실시예에서, 방법은 대상체에서 리케차 리케치(Rickettsia rickettsii)에 의해 유발된 질환을 진단하는 단계를 포함한다. 시험 시료는 본원에 설명된 바와 같은 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7, 단편 또는 변이체와 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%의 서열 동일성을 포함하는 하나 이상의 폴리펩티드와 접촉할 수 있다. 그런 다음, 항-리케차 리케치(Rickettsia rickettsii) 항체 또는 이의 특이적 결합 단편과 하나 이상의 폴리펩티드의 복합체가 검출된다. 대상체는 약 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 또는 2일 미만 동안 리케차(Rickettsia)에 감염되었을 수 있다. 시료에서 항-리케차 리케치(Rickettsia rickettsii) 항체 또는 이의 특이적 결합 단편의 양을 결정할 수 있다. 시료 내의 복합체의 양은 대조군 시료 또는 대조군 표준과 비교될 수 있으며, 여기서 대조군 시료 또는 대조군 표준과 비교하여 복합체의 수준이 상승된 것은 R. 리케치(R. rickettsii)에 의해 유발된 질환의 지표이다. 복합체가 검출되는 경우, 치료제가 대상체에게 투여될 수 있다. 대상체는 인간 또는 비-인간 포유동물, 예컨대 개, 말, 젖소, 또는 고양이일 수 있다. 시험 시료는, 예를 들어, 혈액, 혈장, 혈청, 림프액, 또는 임의의 다른 체액 시료일 수 있다.
일 실시예에서, 본원에 설명된 하나 이상의 폴리펩티드와 하나 이상의 항-리케차 리케치(Rickettsia rickettsii) 항체 또는 이의 특이적 결합 단편 간의 특이적 결합은 이차 항체 또는 이의 특이적 결합 단편을 사용하여 검출된다. 일 실시예에서, 이차 항체는 특이적 결합을 검출하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 이차 항체 또는 이의 특이적 결합 단편은 항-리케차 리케치(Rickettsia rickettsii) 항체 또는 이의 특이적 결합 단편에 결합할 수 있다. 일 실시예에서, 이차 항체는 토끼 항-개 또는 토끼 항-인간 항체와 같은 항-종 항체이다. 일 실시예에서, 이차 항체는 폴리펩티드/항-리케차 리케치(Rickettsia rickettsii) 항체/이차 항체 복합체의 검출에 사용될 수 있는 표지 또는 태그에 공유 결합 또는 비공유 결합된다. 일 실시예에서, 이차 항체는 비오틴 또는 다른 표지 또는 태그에 접합될 수 있다. 스트렙타비딘 형광색소 접합체와 같은 (비오틴 표지의 경우) 스트렙타비딘 접합체를 사용하여 폴리펩티드/항-리케차 리케치(Rickettsia rickettsii) 항체/이차 항체 복합체를 검출할 수 있다.
일 실시예에서, 본원에 설명된 하나 이상의 폴리펩티드와 하나 이상의 항-리케차 리케치(Rickettsia rickettsii) 항체 또는 이의 특이적 결합 단편 간의 특이적 결합은 항-리케차 리케치(Rickettsia rickettsii) 항체 또는 이의 특이적 결합 단편에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 검출기 폴리펩티드를 사용하여 검출된다. 일 예에서, 하나 이상의 검출기 폴리펩티드는 본원에 설명된 바와 같은 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7에 제시된 바와 같은 폴리펩티드, 이의 단편 또는 변이체에 대한 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 서열 동일성을 포함한다. 일 실시예에서, 하나 이상의 검출기 폴리펩티드는 폴리펩티드/항-리케차 리케치(Rickettsia rickettsii) 항체/검출기 폴리펩티드 복합체의 검출에 사용될 수 있는 표지 또는 태그에 공유 결합 또는 비공유 결합된다. 일 실시예에서, 검출기 폴리펩티드는 비오틴과 같은 표지 또는 태그에 접합될 수 있다. 스트렙트아비딘 형광색소 접합체와 같은 스트렙타비딘 접합체(비오틴 표지의 경우)를 사용하여 폴리펩티드/항-리케차 리케치(Rickettsia rickettsii) 항체/검출기 폴리펩티드 복합체를 검출할 수 있다.
본원에 설명된 하나 이상의 폴리펩티드와 하나 이상의 항체 또는 이의 특이적 결합 단편 간의 특이적 결합의 검출은 임의의 적절한 방법, 예를 들어,　경쟁 면역검정, 샌드위치 면역검정, 효소-결합 면역흡착 검정(ELISA), 면역조직화학 검정,　혼탁도 면역검정, 입자 강화 혼탁도 면역검정, 방사성 면역검정(RIA),　형광 면역흡착 검정(FIA), 멀티플렉스　면역검정,　단백질/펩티드 어레이　면역검정,　고상 방사성 면역검정(SPRIA), 간접 면역형광 검정(IIF), 화학발광　면역검정(CIA), 입자 기반 다중분석물 시험(PMAT), 도트 블롯 검정,　또는 웨스턴 블롯 검정을 사용하여 완료될 수 있다. 항체 및/또는 항체/폴리펩티드 복합체를 검출하는 데 사용될 수 있는 다른 검정 방법은, 예를 들어, 표면 플라스몬 공명(SPR), 등온 적정 열량측정(ITC), 마이크로스케일 열 영동(MST), 생물층 간섭계, 또는 격자 결합 간섭계를 포함한다.
본원에 설명된 항체는 다클론 항체, 단클론 항체, 단쇄 항체(scFv), 또는 항체의 특이적 결합 단편일 수 있다. 항체 특이적 결합 단편은 온전한 항체의 항원 결합 부위 또는 가변 영역을 포함하는 온전한 항체의 하나 이상의 부분이며, 여기서 상기 부분은 항체의 Fc 영역의 불변 중쇄 도메인이 없다. 항원에 결합하는 항체 단편의 예는 Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2 및 Fv 단편을 포함한다. 본원에 설명된 항체는, 예를 들어, IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE를 포함하는 임의의 종류의 항체일 수 있다.
"특이적으로 결합한다" 또는 "~에 특이적인"은 제1 항원, 예를 들어 본원에 설명된 바와 같은 서열번호 1-7에 제시된 폴리펩티드, 이의 단편, 또는 변이체가 항-R. 리케차(R. rickettsia) 항체 또는 이의 특이적 결합 단편을 다른 비특이적 분자보다 더 큰 친화도로 인식하고 이에 결합한다는 것을 의미한다. 비특이적 분자는 제1 항원과 공통 에피토프를 공유하지 않는 항원이다. 일 실시예에서, 비특이적 분자는 R. 리케차(R. rickettsia) 폴리펩티드가 아니며 R. 리케차(R. rickettsia)와 관련이 없다. 일 실시예에서, 비특이적 분자는 리케차(Rickettsia) 유기체로부터 유래되지 않는다. 예를 들어, 비특이적 항원에 대해서 보다 효율적으로 결합하는 제1 항원(예: R. 리케차(R. rickettsia))에 대해 생성된 항체는 제1 항원에 특이적으로 결합하는 것으로 설명될 수 있다. 폴리펩티드는 10-6 M 이하의 결합 친화도(KD)로 결합할 때 항-R. 리케차(R. rickettsia) 항체 또는 특이적 결합 단편에 특이적으로 결합한다. 일 실시예에서, 폴리펩티드는 2 x 10-6 M 이하의 친화도(KD)로 결합할 때 항-R. 리케차(R. rickettsia) 항체 또는 특이적 결합 단편에 특이적으로 결합한다. 일 실시예에서, 폴리펩티드는 적어도 10-6 M, 10-7 M, 10-8 M, 10-9 M 이하의 친화도(KD)로 결합할 때 항-R. 리케차(R. rickettsia) 항체 또는 특이적 결합 단편에 특이적으로 결합한다. 특정 실시예에서, 친화도는 표면 플라스몬 공명 또는 KinExA 검정에 의해 측정된다. 일 실시예에서, 상기 방법은 리케차 리케치(Rickettsia rickettsii)를 특이적으로 검출하고 R. conorii, R. africae, R. japonica, R. phillipii, R. parkeri, R. massiliae, R. felis, R. typhi, R. prowazekii, R. bellii, 또는 이들의 조합과 같은 다른 리케차(Rickettsia) 종을 검출하지 않는다.
키트
키트는 본원에 설명된 폴리펩티드 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 키트는 또한 검출을 위한 태그, 표지, 또는 접합체를 포함할 수 있다. 하나 이상의 폴리펩티드는 지지체 상에 공유적으로 또는 비공유적으로 고정될 수 있다.
예를 들어, 키트의 표지는 형광단, 효소, 화학발광 모이어티, 방사성 모이어티, 유기 염료, 소분자, 폴리펩티드 또는 이의 기능적 단편을 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 키트의 표지는 피코에리테린을 포함한다. 일부 실시예에서, 키트의 표지는 플루오레세인 이소티오시아네이트를 포함한다. 일부 실시예에서, 표지는 이차 항체 또는 검출기 폴리펩티드에 접합된다.
키트는 양성 대조군을 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 양성 대조군은 검출 가능한 양의 항-R. 리케차(R. rickettsia) 항체를 함유하는 시료일 수 있다. 일 실시예에서, 양성 대조군은 항-R. 리케차(R. rickettsia) 항체를 갖는 질환 대상체로부터 수득될 수 있다. 일 실시예에서, 양성 대조군은 시험관 내에서 합성되거나 달리 수득된 항-R. 리케차(R. rickettsia) 항체를 포함할 수 있다. 일 실시예에서, 키트는 음성 대조군을 포함할 수 있다. 음성 대조군은 검출 가능한 양의 항-R. 리케차(R. rickettsia) 항체를 함유하지 않는 시료일 수 있다. 일부 실시예에서, 음성 대조군은 건강한 대조군 개체로부터 수득될 수 있거나 시험관 내에서 합성될 수 있다. 예를 들어, 음성 대조군은 물 또는 완충액을 포함할 수 있다.
일부 실시예에서, 키트는 시료에서 항-R. 리케차(R. rickettsia) 항체의 양을 결정하기 위한 표준 곡선을 포함할 수 있다. 항-리케차 리케치(Rickettsia rickettsii) 항체는 검정을 위한 표준 곡선을 생성하는 데 사용될 수 있다. 표준 곡선을 사용하여 시료에서 항-리케차 리케치(Rickettsia rickettsii) 항체의 농도를 결정할 수 있다. 표준 곡선은 측정된 양을 "알려진" 시료, 즉 알려진 농도의 표준에서 항-리케차 리케치(Rickettsia rickettsii) 항체의 농도와 관련시킴으로써 얻는다. 이들 표준은 시료에서 항-R. 리케차(R. rickettsia) 항체의 알려지지 않은 농도를 결정하기 위한 참조를 제공한다. 표준의 양은 "알려지지 않은" 또는 "시험" 시료 농도에서 발견될 것으로 예상되는 전체 농도 범위에 걸쳐 있을 수 있다.
키트는 항-리케차 리케치(Rickettsia rickettsii) 항체 또는 이의 특이적 결합 단편에 대한 하나 이상의 폴리펩티드의 결합을 용이하게 하는 하나 이상의 분석 시약을 추가로 포함할 수 있다. 분석 시약은 키트의 의도된 목적을 수행하는 데 유용한 물질, 혼합물, 재료 또는 성분이다. 시약은, 예를 들어, 접합 시약, 완충액, 표준, 양성 대조군, 표지, 시료 수집 장치, 지침 등을 포함할 수 있다.
키트는 세척 완충액과 같은, 하나 이상의 완충액을 포함할 수 있다. 세척 완충액은, 예를 들어 트리스(히드록시메틸)아미노메탄 (Tris)-기반 완충액, 예컨대 Tris-완충 식염수(TBS) 또는 인산염-완충 식염수(PBS) 같은 인산염 완충액을 포함할 수 있다. 세척 완충액은, 예를 들어, 이온성 또는 비-이온성 세제와 같은 세제로 구성될 수 있다. 일부 실시예에서, 세척 완충액은 약 0.001, 0.01, 0.02, 0.03, 0.04, 0.05, 0.06, 0.07, 0.08% 또는 그 이상의 Tween™20 (폴리소르베이트)을 포함하여 약 pH 7.0, 7.2, 7.4, 7.6, 7.8의 PBS 완충액일 수 있다.
키트는 희석 완충액을 포함할 수 있다. 희석 완충액은, 예를 들어, 소 혈청 알부민(BSA)과 같은 담체 단백질 및 Tween®20(폴리소르베이트)과 같은 세제를 포함한다.
키트는 검출 또는 검정 완충액을 포함할 수 있다. 검출 또는 검정 완충액은, 예를 들어, 비색 검출 또는 검정 완충액, 형광 검출 또는 검정 완충액, 또는 화학발광 검출 또는 검정 완충액일 수 있다. 비색 검출 또는 검정 완충액은, 예를 들어, PNPP (p-니트로페닐 포스페이트), ABTS (2,2'-아지노-비스(3-에틸벤조티아졸린-6-설폰산)) 또는 OPD (o-페닐렌디아민)를 포함한다. 형광 검출 또는 검정 완충액은 QuantaBlu® 또는 QuantaRed®(Thermo Scientific, 매사추세츠주 월섬)를 포함한다. 화학발광 검출 또는 검정 완충액은 루미놀 또는 루시페린을 포함할 수 있다. 검출 또는 검정 완충액은 또한 H2O2와 같은 트리거 및 이소루미놀-접합체와 같은 트레이서를 포함할 수 있다.
키트는 정지 용액을 포함할 수 있다. 의 정지 용액은 검출 시약 및 대응하는 분석 신호의 추가 개발을 종료시키거나 지연시킬 수 있다. 정지 용액은, 예를 들어, 저-pH 완충액(예를 들어, 글리신-완충액, pH 2.0), 카오트로픽제(예를 들어, 구아니디늄 클로라이드, 나트륨-도데실설페이트(SDS)), 환원제(예를 들어, 디티오트레이톨, β-메르캅토에탄올) 등을 포함할 수 있다.
제공된 키트는 채취 튜브, 컬럼, 면봉, 주사기 및 바늘과 같은 생물학적 시료를 채취하기 위한 장치를 포함할 수 있다. 키트는 키트의 구성 요소를 사용하기 위한 지침을 포함할 수 있다. 상기 지침은 프로토콜 및 분석 기술에 관한 세부사항을 제공할 수 있다.
키트의 구성 요소는 임의의 물리적 상태에 있을 수 있다. 예를 들어, 성분 중 하나 이상은 수용액에서 동결 건조되거나, 냉동될 수 있다.
키트는 특정 분석 기술에 맞게 설계될 수 있다. 예를 들어, 키트는 면역검정 키트, 경쟁 면역검정 키트, 샌드위치 면역검정 키트, 효소-결합 면역흡착 검정(ELISA) 키트, 면역조직화학 검정 키트, 혼탁도 면역검정 키트, 입자 강화 혼탁도 면역검정 키트, 방사성 면역검정(RIA) 키트, 형광 면역흡착 검정(FIA) 키트, 다중 면역검정 키트, 단백질/펩티드 어레이 면역검정 키트, 고형상 방사성 면역검정(SPRIA) 키트, 간접 면역형광 검정(IIF) 키트, 화학발광 면역검정(CIA) 키트, 입자 기반 다중분석물 시험(PMAT) 키트, 도트 블롯 검정 키트, 또는 웨스턴 블롯 검정 키트, 표면 플라스몬 공명(SPR) 키트, 등온 적정 열량측정(ITC) 키트, 마이크로스케일 전기영동(MST) 키트, 생물층 간섭계 키트, 또는 격자 결합 간섭계 키트일 수 있다. 일 실시예에서, ELISA 키트는, 예를 들어, 세척 완충액, 시료 희석제, 이차 항체, 이차 항체-효소 접합체, 검출기 폴리펩티드, 표지된 검출기 폴리펩티드, 검출 시약, 및 정지 용액을 포함할 수 있다. 일 실시예에서, 도트 블롯 키트는, 예를 들어, 세척 완충액, 시료 희석제, 이차 항체-효소 접합체, 검출 시약, 및 정지 용액을 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 화학발광 면역검정 키트는 세척 완충액, 시료 희석제, 트레이서(예: 이소루미놀-접합체) 및 트리거(예: H2O2)를 포함할 수 있다. 일 실시예에서, 다중 키트는, 예를 들어, 세척 완충액, 시료 희석제, 및 이차 항체-효소 접합체를 포함할 수 있다.
치료 방법
일단 검출되거나 진단되면, RMSF는, 예를 들어, 항생제 약물, 단백질 또는 펩티드 약물, 핵산-기반 약물, 항-염증 약물, 기타 약물, 면역조절 치료, 대체 요법, 또는 이들의 조합으로 치료될 수 있다.
예를 들어, RMSF는 다수의 항생제, 예를 들어 독시사이클린(Monodox, Vibramycin), 테트라사이클린(옥시테트라사이클린), 아지스로마이신, 클로람페니콜(Chloromycetin), 트로바플록사신(Trovan), 미노사이클린 유도체(예를 들어, US20160030452 참조), 및 베타-락타마제 억제제(예를 들어, US20130023512 참조)로 치료될 수 있다. 독시사이클린은 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14일 또는 그 이상 동안 6시간마다, 12시간마다, 1일 1회, 또는 2일 1회 약 50, 100, 150, 200 mg으로 성인에게 투여될 수 있다. 45 kg 미만의 소아에게는 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14일 또는 그 이상 동안 6시간마다, 12시간마다, 1일 1회, 또는 2일에 1회 약 1.0, 2.0, 2.2, 3.0, 4.0 mg/kg 체중 또는 그 이상을 투여할 수 있다.
RMSF 치료에 적합한 단백질 또는 펩티드 약물은, 예를 들어, 단리된 키메라 외표면 단백질 A(OspA)(예: US20180296656, US20160333056 참조), γ-AA펩티드(예: US20150274782 참조), 플라젤린에 특이적인 단클론 항체(예: US20100239583 참조), 비-염증성 근골격계 통증 또는 골관절염 통증을 치료하기 위한 펩티드 화합물(예를 들어, US 20080280835 참조), 및 이종 재조합 Sca5/OmpB 단백질 기반 백신을 포함한다.
RMSF는 핵산 기반 약물, 이의 유도체(예를 들어, US2012002104, US20090324584), 및 지질-변형 핵산(예를 들어, US20070280929 참조)으로 치료될 수 있다.
RMSF는 항염증제, 예를 들어, 황산 셀룰로오스 중합체 또는 키토산(음으로 하전된) 중합체(예를 들어, US20090298792 참조), 아라키돈산 캐스케이드를 방해하는 혈소판 활성화 인자(PAF) 억제제 및 항산화제(예를 들어, US 20040022879 참조), 및 항염증제 또는 면역억제제 용량의 프레드니솔론 또는 기타 스테로이드로 치료될 수 있다.
RMSF는, 예를 들어, 면역조절 화합물(예를 들어, US20110184025 참조), 예컨대, 거울상 이성질체적으로 순수한 4-(아미노)-2-(2,6-디옥소(3-피페리딜))-이소인돌린-1,3-디온 또는 3-(4-아미노-1-옥소-1,3-디하이드로-이소인돌-2-일)-피페리딘-2,6-디온)을 단독으로 투여하거나, 항생제, 기능성 면역자극 단백질 CD40L, 구성적 활성 TLR4(caTLR4), 기능성 면역자극 단백질 CD70(예를 들어, US20170000881 참조), 및/또는 정맥내 면역글로불린 요법과 함께 투여하여 치료될 수 있다.
RMSF는 또한 글리신, 피루브산염, 및/또는 숙신산과의 구리(I) 복합체의 약학적 및/또는 식이 보충제(예를 들어, US20180071336 참조), 이소티오시아네이트 기능성 계면활성제(예를 들어, 2018/0311202 참조), 항기생충제로서 사용되는 이소옥사졸린 조성물, 예컨대 4-(이속사졸리닐)-벤즈아미드(예를 들어, 치환된 4-(5-(할로메틸)-5-페닐-이속사졸린-3-일)-벤즈아미드) 및 4-(이속사졸리닐)-벤조티오아미드 (예를 들어, 치환된 4-(5-(할로메틸)-5-페닐-이속사졸린-3-일)-벤조티오아미드) (예를 들어, US20180155301 참조), 피라졸로[1,5-a][1,3,5]트리아진 유도체 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염(예를 들어, US20150111873 참조), 유리 염소를 포함하는 전해산 물을 국소 투여하는 것(예를 들어, US20130259955 참조), 프로테아좀 억제제(예를 들어, US20110172285 참조), 염산염 다형체 (S)-3-아미노메틸-7-(3-히드록시-프로폭시)-3H-벤조[c][1,2]옥사보롤-1-올(예를 들어, US20110152217 참조), 피리디닐아민(예를 들어, US20090196912 참조), 헤테로바이시클릭 화합물(예컨대 4,5,6,7-테트라하이드로벤조[b]티오펜-3-카르복시산 아미드, 4,7-디하이드로-5H-티에노[2,3-c]티오피란 3-카르복시산 아미드, 4,7-디하이드로-5H-티에노[2,3-c]피란-3-카르복시산 아미드, 또는 벤조[b]티오펜-3-카르복시산 아미드) 및 약학적으로 허용 가능한 염(예를 들어, US20070275962 참조), 피라진 유도체(예를 들어, US20080194574 참조), 트립신-유사 프로테아제의 방향족 아미딘 억제제(예컨대, 비스(5-아미디노-2-벤즈이미다졸릴)-메탄), 1,2-비스(5-아미디노2-벤즈이미다졸릴)에탄, 1,5-비스(5-아미디노-2-벤즈이미다졸릴)펜탄, 및 5-아미디노인돌), 및/또는 미토콘드리아 기능과 관련된 질환 및 병태를 치료하기 위한 ATP 합성효소 억제제(예를 들어, US20090275099 참조)를 포함하는 다수의 추가 약물로 치료될 수 있다.
또한, RMSF는 US20140256826에 기술된 바와 같은 항균 화합물 또는 항균제 및 항균 관련 화합물의 고 침투 조성물(HPC) 또는 고 침투 전구약물(HPP)의 조성물(예를 들어, US20130018029 참조)로 치료될 수 있다.
RMSF는 또한, 예를 들어, 재조합 대장균, 항-TNF-알파 억제제, 및/또는 핵 인자 카파 B의 음파 용해물로 치료될 수 있다.
RMSF의 치료를 위한 대체 요법에는 증가된 수분 섭취, 포도당 및 당 섭취 감소, 소화를 늦추는 고지방 식품 감소, 소량의 식사, 순하거나 저자극 음식 식단, 콤부차 또는 미소 수프와 같은 프로바이오틱 제품, 마그네슘, 칼륨, 칼슘, 클로렐라, 스피룰리나, 에센셜 오일 혼합물(페퍼민트 오일, 사이프러스 오일, 코코넛 오일, 예를 들어), 생강, 카모마일 차, 비타민 B6, 레몬, 적어도 하나의 항생제와 함께 투여되는 페놀이 풍부한 메이플 시럽 추출물(예를 들어, US 20160339071 참조), 이마 또는 목 뒤 냉찜질, 침술, 및/또는 식사 후 똑바로 앉기가 있다.
조성물 및 방법은 이하에서 더욱 구체적으로 설명되며, 본원에 기재된 실시예는 단지 예시적인 것으로 의도되는데, 그 내의 수많은 변형 및 변형이 당 분야의 숙련자에게 명백해질 것이기 때문이다. 본 명세서에 사용된 용어는 일반적으로, 본원에 설명된 조성물 및 방법의 문맥 내에서, 및 각각의 용어가 사용되는 특정 문맥 내에서 당업계에서 이들의 통상적인 의미를 갖는다. 일부 용어는 조성물 및 방법의 설명에 관한 추가 지침을 실시자에게 제공하기 위해 본원에서 보다 구체적으로 정의되었다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "및/또는"은 연관된 열거된 항목들 중 하나 이상의 임의의 그리고 모든 조합을 포함한다. 본원의 설명에서 및 이어지는 청구범위 전체에 걸쳐 사용되는 바와 같이, "a", "an", 및 "the"의 의미는 문맥이 달리 명확하게 언급하지 않는 한 단수 참조뿐만 아니라 복수 참조도 포함한다. 숫자 값과 관련하여 용어 "약"은 값이 5%만큼 위 또는 아래로 변한다는 것을 의미한다. 예를 들어, 약 100의 값에 대해, 95 내지 105(또는 95 내지 105의 임의의 값)를 의미한다.
본원의 어느 곳에서나 언급된 모든 특허, 특허 출원, 및 기타 과학적 또는 기술적 저작물은 그 전체가 본원에 참조로서 통합된다. 본원에 예시적으로 설명된 실시예는 임의의 요소 또는 요소들, 구체적으로 또는 구체적으로 개시되지 않은 제한 또는 제한들의 부재 하에 실시될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 본원에서의 각각의 경우에, 임의의 용어 "포함하는", "필수적으로 구성되는", 및 "구성되는"은 이들의 통상적인 의미를 유지하면서 다른 두 용어 중 어느 하나로 대체될 수 있다. 사용된 용어 및 표현은 한정적이지 않고 설명의 용어로서 사용되고, 이러한 용어 및 표현에서, 도시되고 기술된 특징 또는 그의 부분의 임의의 등가물을 배제하려는 의도는 없지만, 청구범위의 범위 내에서 다양한 변형이 가능하다는 것은 인정된다. 따라서, 본 방법 및 조성물이 실시예 및 선택적인 특징부에 의해 구체적으로 개시되었지만, 본원에 개시된 개념의 수정 및 변형은 당 분야의 숙련자에 의해 의지될 수 있고, 이러한 수정 및 변형은 설명 및 첨부된 청구범위에 의해 정의된 바와 같은 조성물 및 방법의 범위 내에 있는 것으로 간주된다는 것을 이해해야 한다.
본원에 설명된 임의의 단일 용어, 단일 요소, 단일 문구, 용어 그룹, 문구 그룹, 또는 요소 그룹은 각각 청구범위로부터 구체적으로 배제될 수 있다.
범위가 본 명세서에 주어질 때마다, 예를 들어, 온도 범위, 시간 범위, 조성, 또는 농도 범위, 모든 중간 범위 및 하위 범위뿐만 아니라 주어진 범위에 포함된 모든 개별 값은 본 개시에 포함되도록 의도된다. 본원의 설명에 포함되는 범위 또는 하위 범위의 임의의 하위 범위 또는 개별 값은 본원의 측면에서부터 배제될 수 있음을 이해할 것이다. 본원의 설명에 포함되는 임의의 요소 또는 단계가 청구된 조성물 또는 방법으로부터 배제될 수 있음을 이해할 것이다.
또한, 조성물 및 방법의 특징부 또는 측면이 마쿠쉬 그룹 또는 다른 대안 그룹의 관점에서 기술되는 경우, 당 분야의 숙련자라면 조성물 및 방법이 또한 이에 따라 마쿠쉬 그룹 또는 다른 그룹의 구성원의 임의의 개별 구성원 또는 하위 그룹의 관점에서 기술된다는 것을 인식할 것이다.
하기는 예시 목적으로만 제공되며, 상기에서 광의의 용어로 기술된 실시예의 범위를 제한하도록 의도되지 않는다.
예
예 1: SCA2 폴리펩티드
R. 리케치(R. rickettsii) 균주에만 존재하는 아미노산의 스트레치를 포함하는 세포외 단백질 SCA2의 오토샤페론 도메인(AC)이 발견되었다. 전체 고유 영역(도 3에 박스로 표시됨)을 PDX6으로 명명하였다. 약간 절단된 박스형 영역(도 3)을 PDX7이라고 명명하였다.
3개의 PDX6 반복("TDX1779") 또는 5개의 PDX6 반복("TDX1780")의 융합에 의해 2개의 재조합 융합 단백질을 만들었다. 도 3 참조. 본 예에서, TDX1779 및 TDX1780은 폴리펩티드의 카르복시 말단에 에피토프 태그를 추가로 포함하고 폴리펩티드의 n 말단에 분비 (신호) 서열을 추가로 포함한다. PDX7, TDX1779 및 TDX1780을 바코드 자성 비드(BMB)에 코팅하였다. PDX7을 SM(PEG)12 링커(ThermoFisher)로 아미노 활성화 비드 상에 연결하였다. TDX1779 및 TDX1780을 EDAC 링커로 카르복시 활성화 비드 상에 연결하였다. PDX, TDX1779, 및 TDX1780 연결된 비드를 간접 및 직접 포맷 모두에서 반응성에 대해 시험하였다.
PDX7, TDX1779 및 TDX1780을 간접(항-종 항체) 포맷을 사용하여 멀티플렉스에서 반응성에 대해 시험하였다. 간접 방법론의 다이어그램이 도 4에 도시되어 있다. 간략하게, (예를 들어, 감염된 개로부터 유래된) PDX7, TDX1779 또는 TDX1780에 존재하는 하나 이상의 에피토프에 특이적으로 결합하는 일차 항체는 PDX7, TDX1779 및 TDX1780 펩티드 코팅된 비드에 특이적으로 결합할 수 있다. 표지된(예를 들어, 비오티닐화된) 이차 항체(예를 들어, 항-종 항체, 이 경우에는, 토끼 항-개 항체)는 일차 항체에 특이적으로 결합한다. 스트렙타비딘-피코에리트린은 비드-펩티드-일차 항체-표지된 이차 항체 복합체를 검출하는데 사용될 수 있다.
PDX7을 아미노 활성화 비드에 접합하고, R. 리케차(R. rickettsia)가 실험적으로 감염된 개 유래의 풀링된 혈청과 함께 인큐베이션하였다. 항체 결합 검출은 비오티닐화된 토끼 항-개과 IgG를 사용하여 보고되었다. 결과를 도 5에 도시하였다(PID는 감염 후 일을 의미함). PDX7은 감염 후 7일차까지 감염을 검출할 수 있었다.
TDX1779 및 TDX1780을 카르복시 비드에 결합시키고 R. 리케치(R. rickettsii)의 실험적으로 감염된 개 유래의 혈청에 대해 배양하였다. 항체 결합 검출은 비오티닐화된 토끼 항 개과 IgG를 사용하여 보고되었다. 도 6은 실험 혈청에 대한 TDX1779 및 1780 반응성을 간접 항-종 포맷으로 도시한다. TDX1779 및 TDX1780은 시험된 개에 따라 다양한 정도로 감염 후 약 7일 내에 항체를 검출할 수 있었다.
PDX7, TDX1779 및 TDX1780도 직접(예를 들어, 비오티닐화된 분석물) 포맷으로 반응성에 대해 시험하였다. 직접 방법론의 다이어그램이 도 7에 도시되어 있다. 간략하게, (예를 들어, 감염된 개로부터 유래된) PDX7, TDX1779 또는 TDX1780에 존재하는 하나 이상의 에피토프에 특이적으로 결합하는 일차 항체는 PDX7, TDX1779 및 TDX1780 펩티드 코팅된 비드에 특이적으로 결합할 수 있다. 검출기 폴리펩티드(예를 들어, PDX7, TDX1779 및 TDX1780 폴리펩티드)는 또한 일차 항체에 특이적으로 결합할 수 있다. 검출기 폴리펩티드는, 예를 들어 비오틴으로 표지될 수 있다. 스트렙타비딘-피코에리트린은 비드-펩티드-일차 항체-검출 복합체를 검출하는 데 사용될 수 있다.
PDX7 펩티드를 아미노 비드에 접합시키고, 비오티닐화된 펩티드가 검출기 폴리펩티드로서 사용되는 직접 분석 포맷을 사용하여 미국으로부터의 574개의 시료에 대해 스크리닝하였다. 이 접근법을 사용하여, 시험된 574개 중 8개의 양성 시료를 식별하였다 (1.4% 양성; 98.6% 음성). 8개의 양성은 양성을 확인하기 위해 IDEXX RMSF IFA에서 추가로 평가하였다. 다중화에 의한 8개의 PDX7 양성 시료 중 6개는 IFA에 의해 양성으로 확인되었으며, 이는 항-리케차 리케치(Rickettsiarickettsii) 항체를 포획하기 위한 PDX7 펩티드의 강한 민감도를 시사한다. 양성 시료(6/8 양성)에 대한 IFA와의 75% 일치 및 음성 시료(8/10 양성)과의 80% 일치를 보여주는 도 8을 참조한다.
PDX7, TDX1779 및 TDX1780 코팅된 비드를 Sacramento의 IDEXX 기준 실험실의 RMSF 음성(neg) 또는 양성(pos) 혈청에 대해 인큐베이션하고, 비오티닐화된 TDX1779를 접합체로서 사용하여 검출하였다. 이 데이터는 추정된 음성 혈청이 이러한 마커에 대해 음성이고 추정된 양성 혈청이 반응함을 시사한다. 마커가 R. 리케치(R. rickettsii) 감염에 대해 훨씬 더 높은 특이성을 가질 것으로 예측되는 반면, IFA는 리케차(Rickettsia) 종을 구별할 수 없기 때문에, 모든 추정 양성이 반응할 것으로 예상되지 않는다는 것을 주목할 가치가 있다. 표 1 참조.
분석물 RMSF IFA
Neg.
반응성		 RMSF IFA
Pos.
반응성		 RMSF IFA
음성
합의		 RMSF IFA
양성
합의
PDX7 0/59 2/36 100% 5.6%
TDX1779 2/59 6/36 96.6% 16.7%
TDX1780 2/59 4/36 96/6% 11.1%
PDX6, PDX7, TDX1779 및 TDX1780(각각 서열번호 1-4)을 R. 리케치(R. rickettsii)에 대한 항체에 특이적으로 결합하는 이들의 능력에 대해 시험하였다. PDX6, PDX7, TDX1779 또는 TDX1780(각각 서열번호 1-4)으로 코팅된 비드를 275개의 개 혈청 각각과 함께 인큐베이션하고, 스트렙타비딘-피코에리트린을 표지로 사용하여 직접 포맷의 접합체로서 비오티닐화된 TDX1779(서열번호 3)를 사용해 검출하였다. 275개 혈청은 다른 진드기 매개 병원균에 대한 이들의 시험 결과에 기초하여 선택하였다(43개 혈청은 각각 다음과 같은 여러 진드기 매개 병원균 중 하나에 대한 항체에 대해 양성으로 시험되었다: 18개 혈청은 Anaplasma ssp.에 대한 항체에 대해 양성으로 시험되었다; 11개 혈청은 Ehrlichia canis 또는 Ehrlichia ewingii에 대한 항체에 대해 양성으로 시험되었다; 14개 혈청은 미국 전역에 걸쳐 이들의 지리적 분포뿐만 아니라 Borrelia burgdorferi)에 대한 항체에 대해 양성으로 시험되었다. 43개의 양성 혈청 중 어느 것도 TDX1779 및 TDX1780(100% 특이성)으로 양성 결과를 나타내지 않았다(서열번호 3-4, 각각 참조). 43개의 양성 혈청 중 하나(즉, Anaplasma ssp.에 대한 항체에 대해 양성인 혈청 중 하나)는 PDX6 및 PDX7(적어도 97.7% 특이성)로 양성 결과를 수득하였다(서열번호 1-2, 각각). 이 데이터는 PDX6, PDX7, TDX1779 및 TDX1780(각각 서열번호 1-4)이 R. 리케치(R. rickettsii)에 대한 환자 항체에 각각 높은 특이성으로 결합한다는 것을 입증한다. 이 데이터는 또한 R. 리케치(R. rickettsii)에 대한 항체에 대한 고도로 특이적인 검정이 PDX6, PDX7, TDX1779 및 TDX1780(각각 서열번호 1-4)로 구축될 수 있음을 입증한다.
예 2
R. 리케치(R. rickettsii) 실험적으로 감염된 개과 유래 혈청을, 검출기로서 비오티닐화된 토끼 항-개과를 사용하여 ABC 다중 플랫폼에서 PDX21 폴리펩티드(서열번호 5)에 대한 반응성에 대해 평가하였다. 도 9에서, 개별 개 1-6(좌측에서 우측)은 수직 흑색 선으로 분리된다. 각각의 실험적으로 감염된 개과에 대해, 개 뒤의 숫자로 표시된 바와 같이, 면역 전 혈청 "Pre"를 감염 후 4, 7,18, 28, 32 및 39일차의 혈청과 비교하였다. 각각의 개는 다양한 베이스라인 반응성을 나타낸 반면, 6마리의 개 모두는 각각의 면역-전 혈청과 비교하여 감염 후 7-18일 사이에 PDX21에 대한 반응성 증가를 나타냈다. PDX21에 대한 반응성은 감염 후 28-32일차에 최고치에 달했고, 그 후 정체되거나 감소하기 시작했다. 도 9의 최우측에 음성 대조군 및 양성 대조군이 도시되어 있다. NC= 시료로서 BSA/PBS, FBS= 시료로서 소 태아 혈청, 양성 대조군(PC)은 NAR0085, 1088 및 1349인 것으로 확인된 RMSF 양성 시료이며, PDX21에 대한 강한 반응성을 나타내어, R. 리케치(R. rickettsii)로부터 자연적으로 및 실험적으로 감염된 개 혈청으로부터의 혈청에 대한 VUT 단백질 유래 PDX21 펩티드의 반응성을 부각시켰다
SEQUENCE LISTING <110> IDEXX LABORATORIES, INC. BOUCHER, Joshua Madrid, Clever Buch, Jesse Mestek, Anton <120> Rocky Mountain Spotted Fever Detection and Treatment <130> 331721-000066 <150> 63/126,756 <151> 2020-12-17 <160> 48 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 48 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PDX6 <220> <221> X <222> (9)..(9) <223> The X at position 9 can be E or A <220> <221> X <222> (34)..(34) <223> The X at position 34 can be G or S <400> 1 Cys Asp Tyr Lys Lys Ser Leu Leu Xaa Leu Arg Ser Ser Asp Glu Asp 1 5 10 15 Asp Gln Gly Tyr Ala Thr Gly Tyr Thr Thr Asp Glu Glu Glu Leu Glu 20 25 30 Glu Xaa Asn Ser Thr Thr Gly Glu Glu Leu Lys Lys Asp Ile Ser Asp 35 40 45 <210> 2 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PDX7 <220> <221> X <222> (24)..(24) <223> The X at position 24 can be G or S <400> 2 Cys Ser Ser Asp Glu Asp Asp Gln Gly Tyr Ala Thr Gly Tyr Thr Thr 1 5 10 15 Asp Glu Glu Glu Leu Glu Glu Xaa Asn Ser Thr Thr Gly Glu Glu Leu 20 25 30 Lys Lys Asp Ile Ser Asp 35 <210> 3 <211> 172 <212> PRT 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Sequence <220> <223> SCA2 auto chaperone region from Rickettsia bellii species <400> 23 Ile Arg Ala His Pro Asp Leu Phe Pro Thr Val Phe Asn Asp Pro Asp 1 5 10 15 Thr Leu Ala <210> 24 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> secretory signal sequence <400> 24 Met Asp Trp Thr Trp Arg Val Phe Phe Leu Leu Ala Leu Ala Thr Gly 1 5 10 15 Val His Ser <210> 25 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> secretory signal sequence <400> 25 Met Asp Trp Thr Trp Arg Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Gly 1 5 10 15 Thr His Ala <210> 26 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> secretory signal sequence <400> 26 Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala 1 5 10 15 Ala Gln Pro Ala Met Ala 20 <210> 27 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> secretory signal sequence <400> 27 Met Ala Thr Gly Ser Arg Thr Ser Leu Leu Leu Ala Phe Gly Leu Leu 1 5 10 15 Cys Leu Trp Leu Gln Glu Gly Ser Ala 20 25 <210> 28 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> secretory signal sequence <400> 28 Met Pro Leu Leu Leu Leu Leu Pro Leu Leu Trp Ala Gly Ala Leu Ala 1 5 10 15 <210> 29 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> secretory signal sequence <400> 29 Met Asp Ala Met Lys Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly 1 5 10 15 Ala Val Phe Val Ser Leu Ser Gln Glu Ile His Ala Glu Leu Arg Arg 20 25 30 Phe Arg Arg 35 <210> 30 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> secretory signal sequence <400> 30 Met Lys Gln Ser Thr Ile Ala Leu Ala Leu Leu Pro Leu Leu Phe Thr 1 5 10 15 Pro Val Lys Thr Ala 20 <210> 31 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> secretory signal sequence <400> 31 Met Lys Lys Thr Ala Ile Ala Ile Ala Val Ala Leu Ala Gly Phe Ala 1 5 10 15 Thr Val Ala Gln Ala 20 <210> 32 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> secretory signal sequence <400> 32 Met Lys Lys Ile Trp Leu Ala Leu Ala Gly Leu Val Leu Ala Phe Ser 1 5 10 15 Ala Ser Ala <210> 33 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sequence <400> 37 Met Met Pro Ser Ser Val Ser Trp Gly Ile Leu Leu Leu Ala Gly Leu 1 5 10 15 Cys Cys Leu Val Pro Val Ser Leu Ala 20 25 <210> 38 <211> 46 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> secretory signal sequence <400> 38 Met Gln Arg Val Asn Met Ile Met Ala Glu Ser Pro Ser Leu Ile Thr 1 5 10 15 Ile Cys Leu Leu Gly Tyr Leu Leu Ser Ala Glu Cys Thr Val Phe Leu 20 25 30 Asp His Glu Asn Ala Asn Lys Ile Leu Asn Arg Pro Lys Arg 35 40 45 <210> 39 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> secretory signal sequence <400> 39 Met Lys Gly Ser Leu Leu Leu Leu Leu Val Ser Asn Leu Leu Leu Cys 1 5 10 15 Gln Ser Val Ala Pro 20 <210> 40 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> secretory signal sequence <400> 40 Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala 1 5 10 15 Tyr Ser Arg Gly Val Phe Arg Arg 20 <210> 41 <211> 99 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> secretory signal sequence <400> 41 Met Val Ser Leu Lys Ile Lys Lys Leu Leu Leu 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Claims (24)

  1. 폴리펩티드로서,
    (i) 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7에 제시된 폴리펩티드에 대한 90% 이상의 서열 동일성;
    (ii) 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7과 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 2, 3, 4, 5, 6, 7개 또는 그 이상의 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질; 또는
    (iii) 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7과 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 적어도 2개의 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질을 포함하는, 폴리펩티드.
  2. 총 아미노산이 75개 미만이고 서열번호 1, 2, 5, 6 또는 7에 제시된 폴리펩티드와 90% 이상의 서열 동일성을 포함하는 폴리펩티드.
  3. 총 아미노산이 350개 미만이고 서열번호 3 또는 4에 제시된 폴리펩티드와 90% 이상의 서열 동일성을 포함하는 폴리펩티드.
  4. 제1항, 제2항 또는 제3항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 자연적으로 발생하는 것이 아닌, 폴리펩티드.
  5. 제1항, 제2항 또는 제3항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 동결 건조되거나, 탈수되거나, 건조되는, 폴리펩티드.
  6. 제1항, 제2항 또는 제3항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 하나 이상의 표지 또는 태그를 더 포함하는, 폴리펩티드.
  7. 제1항, 제2항 또는 제3항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 지지체에 고정되는, 폴리펩티드.
  8. 제1항, 제2항 또는 제3항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7에 제시된 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 항체와 면역 복합체 내에 존재하는, 폴리펩티드.
  9. 제1항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 서열번호 1, 2, 5, 6 또는 7에 제시된 폴리펩티드와 90% 이상의 서열 동일성 및 하나 이상의 분비 신호 서열, 하나 이상의 에피토프 태그, 또는 하나 이상의 분비 신호 서열 및 하나 이상의 에피토프 태그를 포함하는, 폴리펩티드.
  10. 항-리케차 리케차(Rickettsia rickettsia) 항체 또는 이의 특이적 결합 단편을 검출하는 방법으로서, (a) 시험 시료를 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7에 제시된 폴리펩티드에 90% 이상의 서열 동일성을 포함하는 하나 이상의 폴리펩티드와 접촉시키는 단계; 및 (b) 항-리케차 리케치(Rickettsia rickettsii) 항체 또는 이의 특이적 결합 단편 및 하나 이상의 폴리펩티드의 복합체를 검출하는 단계를 포함하는, 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 하나 이상의 폴리펩티드는 지지체에 고정되는, 방법.
  12. 제10항에 있어서, 상기 복합체는 항-리케차 리케치(Rickettsia rickettsii) 항체 또는 이의 특이적 결합 단편에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 이차 항체 또는 이의 특이적 결합 단편을 사용하여 검출되는, 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 이차 항체 또는 이의 특이적 결합 단편은 하나 이상의 태그 또는 표지를 포함하는, 방법.
  14. 제10항에 있어서, 상기 복합체는 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7에 제시된 폴리펩티드와 90% 이상의 서열 동일성을 포함하는 하나 이상의 검출기 폴리펩티드를 사용하여 검출되는, 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 하나 이상의 검출기 폴리펩티드는 표지 또는 태그를 포함하는, 방법.
  16. (a) 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7에 제시된 폴리펩티드에 대한 90% 이상의 서열 동일성을 포함하는 하나 이상의 폴리펩티드와 시험 시료를 접촉시키는 단계; 및 (b) 항-리케차 리케치(Rickettsia rickettsii) 항체 또는 이의 특이적 결합 단편 및 하나 이상의 폴리펩티드의 복합체를 검출하는 단계에 의해 대상체에서 리케차 리케치(Rickettsia rickettsii)에 의해 유발된 질환을 진단하기 위한 방법.
  17. 제16항에 있어서, 대상체는 7일 미만 동안 리케차(Rickettsia)에 감염된, 방법.
  18. 제16항에 있어서, 상기 시료 내 복합체의 양을 대조군 시료 또는 대조군 표준과 비교하는 단계를 추가로 포함하고, 상기 대조군 시료 또는 대조군 표준과 비교하여 상기 복합체의 수준이 상승된 것은 리케차 리케치(Rickettsia rickettsii)에 의해 유발된 질환의 표시인, 방법.
  19. 제16항에 있어서, 복합체가 검출되는 리케차 리케치(Rickettsia rickettsii)에 의해 유발된 질환에 대한 치료제를 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  20. 제16항에 있어서, 상기 시료에서 항-리케차 리케치(Rickettsia rickettsii) 항체 또는 이의 특이적 결합 단편의 양을 결정하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  21. 제16항에 있어서, 대상체는 비인간 동물인, 방법.
  22. 제16항에 있어서, 상기 시험 시료는 혈액, 혈장, 혈청, 또는 림프액인, 방법.
  23. 제10항 또는 제16항에 있어서, 상기 항-리케차 리케치(Rickettsia rickettsii) 항체 또는 이의 특이적 결합 단편은 경쟁 면역검정, 샌드위치 면역검정, 효소-결합 면역흡착 검정(ELISA), 면역조직화학 검정, 혼탁도 면역검정, 입자 강화 혼탁도 면역검정, 방사성 면역검정(RIA), 형광 면역흡착 검정(FIA), 멀티플렉스 면역검정, 단백질/펩티드 어레이 면역검정, 고상 방사성 면역검정(SPRIA), 간접 면역형광 검정(IIF), 화학발광 면역검정(CIA), 입자 기반 다중분석물 시험(PMAT), 도트 블롯 검정, 웨스턴 블롯 검정, 표면 플라스몬 공명(SPR), 등온 적정 열량측정(ITC), 마이크로스케일 전기영동(MST), 생물층 간섭계, 또는 격자 결합 간섭계에 의해 검출되는, 방법.
  24. 리케차 리케치(Rickettsia rickettsii)에 의해 유발된 질환을 진단하기 위한 키트로서, 상기 키트는:
    (a) 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7에 제시된 폴리펩티드에 대한 90% 이상의 서열 동일성을 포함하고, 자연적으로 발생하는 것이 아닌, 하나 이상의 폴리펩티드; 및
    (b) 시험 시료에 존재하는 항-리케차 리케치(Rickettsia rickettsii) 항체 또는 이의 특이적 결합 단편에 대한 상기 하나 이상의 폴리펩티드의 결합을 용이하게 하는 하나 이상의 시약을 포함하는, 키트.
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