KR20230121791A - 섬유아세포-유사 활막세포 매개된 류마티스 관절염의효과적인 관리를 위한 조성물 - Google Patents

섬유아세포-유사 활막세포 매개된 류마티스 관절염의효과적인 관리를 위한 조성물 Download PDF

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Abstract

개시된 본 발명은 대상체에서 섬유아세포-유사 활막세포(FLS)의 증식, 이동을 억제하는데 사용하기 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 T-헬퍼(helper) 17(Th17), T-세포에서 불균형을 조절하기 위한 조성물 및 방법을 개시한다. 개시된 조성물은 20 내지 50% BDMC, 10 내지 25% w/w DMC 및 30 내지 50% w/w 커큐민을 포함하며, 35 내지 50% w/w 및 35 내지 45% w/w 범위의 보스웰산 및 다당류를 추가로 포함한다.

Description

섬유아세포-유사 활막세포 매개된 류마티스 관절염의 효과적인 관리를 위한 조성물
관련 출원에 대한 교차 참조
이는 2020년 12월 17일에 출원된 미국 가특허출원 제63126920호의 우선권을 주장하는 PCT 출원이고, 이의 내용은 본원에 참조로 포함된다.
본 발명의 분야
본 발명은 일반적으로 대상체에서 섬유아세포-유사 활막세포(Fibroblast-like Synoviocytes: FLS)의 증식, 이동을 억제하는데 사용하기 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 T-헬퍼(helper) 17(Th17), T-세포에서 불균형을 조절하기 위한 조성물 및 방법을 개시한다. 보다 더 구체적으로, 본 발명은 보스웰리아 세라타(Boswellia serrata)로부터의 보스웰산(boswellic acid) 및 다당류(polysaccharide)를 추가로 포함하는, 20 내지 50% BDMC, 10 내지 25% w/w DMC 및 30 내지 50% w/w 커큐민을 포함하는 조성물을 개시한다.
유전적 요인과 환경적 요인의 복합적인 상호작용에 의해 발생하는 자가면역성 활막 질병인 류마티스 관절염(Rheumatoid arthritis, RA)의 임상 양상은 활막의 염증과 관절 손상에 의해 발생한다. 섬유아세포-유사 활막 세포(FLS)는 활막, 가동 관절의 공간을 감싸는 연조직, 힘줄집과 점액낭의 관절 내부에 위치한 중간엽 세포(mesenchymal cell)이다(Nygaard, G., Firestein, G.S. Restoring synovial homeostasis in rheumatoid arthritis by targeting fibroblast-like synoviocytes. Nat Rev Rheumatol 16, 316-333 (2020)). 활막 내막의 FLS는 염증을 지속시키는 사이토카인과 연골 파괴에 기여하는 프로테아제를 생산하는 데 중요한 역할을 한다. 내막층은 A형 또는 대식세포 유사 활막 세포와 B형 또는 FLS의 두 가지 세포 유형으로 구성된다. 활막의 내막층에 존재하는 FLS의 역할은 연골 표면을 윤활하고 영양을 공급하기 위한 세포외 기질(ECM)과 활액의 조성물을 조절하는 것이다. 다양한 연구에 따르면 RA에서 A형 세포는 전 염증성 사이토카인, 케모카인 및 성장 인자를 생산하는데 우세하며, 이는 다시 국소 FLS를 활성화하고 IL-6, 프로스타노이드 및 매트릭스 메탈로프로테이나제(MMP)의 생산을 유도한다. 이 과정은 자가분비/주변분비 네트워크에 의해 작동되는 세포외 기질의 파괴를 일으켜 활액막염을 지속시킨다. 또한 RA가 세포자연사(apoptosis)를 통한 결실을 방지하는 FLS의 생존을 촉진한다는 것이 문서화되어 있다(Bartok B, Firestein GS: Fibroblast-like synoviocytes: key effector cells in rheumatoid arthritis. Immunol Rev. 2010; 233:233-255). 조절 T-세포(Treg)/T-헬퍼 17(Th17) 세포 간의 균형은 RA의 진행과 관련이 있다. Th17 세포는 조직 파괴 및 관절 연골 손상에 중요한 역할을 하는 IL-17A 및 TNF-α를 분비하여 전염증 반응을 매개하는 반면 Treg는 항염증 반응을 매개하고 자가면역 내성 상태를 유지한다. 이러한 불균형은 다발성 경화증, 죽상동맥경화증, SLE 등을 포함하는 여러 자가면역 질병의 근본적인 원인인 것으로 보인다(Li, C. 외. Arsenic trioxide improves Treg and Th17 balance by modulating STAT3 in treatment-naive rheumatoid arthritis patients. Int. Immunopharmacol. 73, 539-551, 2019). 추가로, 합성 질병-변형 항류마티스 약물(DMARD) 및 생물학적 DMARD를 개별적으로 또는 조합하여 사용하는 RA의 현재 치료는 치료 전략을 제공하지만 특히 면역과 관련된 과민증을 포함하는 상당한 부작용을 나타낸다. 이 분야에서 효과적이고 면역 조절이 없는 치료 표적을 찾기 위한 상당한 연구 노력이 있다(Kohler 외. Current Therapeutic Options in the Treatment of Rheumatoid Arthritis, J. Clin. Med. 8, 1-15 (2019). 　 　
Rizaldy 등은 강황 뿌리(Curcuma longa)와 보스웰리아 서레이트(Boswellia serrate) 추출물이 골관절염에 치료 효과가 있음을 보여주었는데(Rizaldy 외. A randomized Controlled Trial of Curcuma Longa and Boswellia Serrata Extract in Osteoarthritis. Global Journal of Medical Research: H Orthopedic and Musculoskeletal System 19(3)), 그러나 이 논문은 이 활동을 담당하는 경로와 에이전트에 대해 조명하지 않는다. 또한, 골관절염의 고립된 관절과 RA의 여러 관절들을 표적으로 삼는 것은 완전히 상이하다.
Svensson 등은 TNF 억제제와 Fc-Ig1 및 Ig2를 포함하는 비 면역 조절 항 FLS 접근법을 통해 더 나은 효능과 더 적은 부작용으로 관절염에 효과적으로 작용하는 병용 요법을 재확인했다(Svensson 외. Synoviocyte-targeted therapy synergizes with TNF inhibition in arthritis reversal. Sci. Adv. 6, eaba4353, Pgs. 1-17 (2020)).
Shaikh 등은 류마티스 관절염 치료에서 다른 커큐미노이드(curcuminoid)에 비해 커큐민이 더 큰 항염증 작용을 하는 것으로 나타났다. 또한 그들은 DMC와 BDMC가 터메릭(turmeric)에서 커큐민의 효과를 방해한다는 것을 보여주었다(Shaikh 외. Does Curcumin Analogues, Demethoxycurcumin and Bisdemethoxycurcumin (BDMC), Enhance the Therapeutic efficacy of Curcumin in the Treatment of Rheumatoid Arthritis (RA), Nat. Prod. Chem. 8(6), Pgs. 1-9, 2020).
Makuch 등은 RA에 대한 커큐민의 포괄적인 검토를 제공했지만 작용 메커니즘과 세포 집단에 미치는 영향에 대해서는 추가 연구가 필요함을 밝혔다(The Immunomodulatory and Anti-Inflammatory Effect of Curcumin on Immune Cell Populations, Cytokines, and In Vivo Models of Rheumatoid Arthritis, Pharmaceuticals, 14, Pgs. 1-18, 2021). Kloesch 등은 고농도의 커큐민으로 FLS를 치료하면 세포 생존력이 급격히 감소하고 세포자연사가 유도되는 것으로 나타났다. 그러나 커큐민의 분자 메커니즘은 불분명했다 (kloesch 외. Anti-Inflammatory and Apoptotic Effects of the Polyphenol Curcumin on Human Fibroblast-like Synoviocytes, 15, Pgs. 400-405 (2013)).
WO 2021/090154 A1은 아놀리드 강화 아슈와간다(anolide enriched ashwagandha), BDMC 강화 커큐민 및 AKBA 강화 보스웰리아를 포함하는 골관절염에 대한 병용 치료를 포함한다. 그러나 비 면역 조절 효과에 대한 FLS 경로는 다루지 않는다.
유사하게, AU 2010/345338 B2는 관절염을 포함하는 염증 상태에서 사용하기 위한 보스웰리아 추출물 및 강황 종을 포함하는 상승적 조성물을 다루지만, 임의의 특정 경로를 다루지 못한다.
본질적으로, RA에 대해 안전하고 덜 독성이며 효과적인 치료에 대한 미충족 요구가 있으며, 이는 현재의 접근 방식과 함께 작용하고 면역 체계를 억제하지 않고 질병 제어를 개선할 수 있다. 더욱이 치료가 천연 허브를 기반으로 하는 경우 RA 치료의 면역 조절 효과와 관련된 많은 부작용을 극복할 수 있다.
본 발명의 주요 목적은 개별 농도의 BDMC, DMC, 커큐민, 커큐미노이드, 보스웰산(B) 또는 다당류(PS)를 포함하는, 대상체에서 섬유아세포 유사 활막세포(FLS)의 증식 및 이동을 억제하는 데 사용하기 위한 방법 및 조성물을 개시하는 것이다. 다른 목적은 강화된(enriched) BDMC 커큐미노이드 및 BPS의 조성물을 포함하는 대상체에서 섬유아세포-유사 활막 세포의 증식 및 이동을 억제하는데 사용하기 위한 방법 및 조성물을 개시하는 것이다.
본 발명의 또 다른 주요 목적은 개별 농도의 BDMC, DMC, 커큐민, 커큐미노이드, 보스웰산 또는 다당류를 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함하는 포유동물의 비장에 있는 T-헬퍼 17(Th17) 및 T-세포(Treg)에서의 불균형 조절에 사용하기 위한 방법 및 조성물을 개시하는 것이다. 또 다른 목적은 강화된 BDMC 커큐미노이드 및 BPS의 조합을 포함하는 조성물을 사용하여 포유동물에서 T-헬퍼 17(Th17), T-세포(Treg)의 불균형을 조절하는데 사용하기 위한 방법 및 조성물을 개시하는 것이다.
포유동물에서 류마티스성 관절염의 치료적 관리에 사용하기 위한 방법 및 조성물을 개시하는 본 발명의 또 다른 주요 목적에서, 상기 방법은 개별 농도의 BDMC, DMC, 커큐민, 커큐미노이드, 보스웰산 또는 다당류를 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 다른 목적은 포유동물에서 류마티스 관절염의 치료적 관리에 사용하기 위한 방법 및 조성물을 개시하는 것이며, 상기 방법은 강화된 BDMC 커큐미노이드 및 BPS 조합을 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함한다.
본 발명은 대상체에서 FLS의 증식, 이동을 억제하고 BDMC, DMC, 커큐민, 커큐미노이드, 보스웰산 또는 다당류 또는 강화된 BDMC 커큐미노이드 조성물과 보스웰산 다당류의 조합 중 개별적으로 포유동물의 비장에 있는 T-헬퍼 17(Th17), T-세포(Treg)의 불균형을 조절하는데 사용하기 위한 방법 및 조성물을 포괄함으로써 배경기술에서 언급된 전술한 문제를 광범위하게 해결한다.
본 발명의 제1 측면은 대상체에서 섬유아세포 유사 활막세포(FLS)의 증식 및 이동을 억제하는 데 사용하기 위한 조성물에 관한 것으로, 상기 조성물은 개별 농도의 BDMC, DMC, 커큐민, 커큐미노이드, 보스웰산, 또는 다당류를 포함한다. 또한 강화된 BDMC 커큐미노이드와 BPS의 조합을 포함하는 조성물을 포함한다.
본 발명의 또 다른 측면에서 포유동물의 비장에 있는 T-헬퍼 17(Th17) 및 T-세포(Treg)에서 불균형 조절에 사용하기 위한 조성물을 포함하고, 상기 조성물은 개별 농도의 BDMC, DMC, 커큐민, 커큐미노이드, 보스웰산 또는 다당류를 포함한다. 또한 강화된 BDMC 커큐미노이드와 BPS의 병용 투여를 포함한다.
본 발명의 또 다른 측면에서, 포유동물에서 류마티스 관절염의 치료적 관리에 사용하기 위한 조성물을 포함하며, 상기 조성물은 개별 농도의 BDMC, DMC, 커큐민, 커큐미노이드, 보스웰산 또는 다당류를 포함한다. 또한 강화된 BDMC 커큐미노이드와 BPS의 병용 투여를 포함한다.
본 발명의 또 다른 측면은 포유동물에서 섬유아세포 유사 활막세포(FLS)의 증식 및 이동을 억제하는 데 사용하기 위한 방법을 포함하고, 상기 방법은 개별 농도의 BDMC, DMC, 커큐민, 커큐미노이드, 보스웰산 또는 다당류를 포함하는 조성물과 포유동물 FLS를 접촉시키는 단계를 포함한다. 또한 강화된 BDMC 커큐미노이드와 BPS의 조합을 포함하는 조성물을 포함한다.
본 발명의 또 다른 측면에서 포유동물의 비장에 있는 T-헬퍼 17(Th17) 및 T-세포(Treg)에서의 불균형 조절에 사용하기 위한 방법을 포함하고, 상기 방법은 a) T-헬퍼 17(Th17), Treg 불균형을 갖는 포유동물을 식별하는 단계 및 b) 개별 농도의 BDMC, DMC, 커큐민, 커큐미노이드, 보스웰산, 다당류를 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함한다. 또한 강화된 BDMC 커큐미노이드와 BPS의 조합을 포함하는 조성물을 포함한다.
본 발명의 또 다른 측면에서 대상체에서 류마티스 관절염의 치료적 관리 방법을 다루고, 상기 방법은 a) 류마티스 관절염이 있는 대상체를 식별하는 단계 및 b) 개별 농도의 BDMC, DMC, 커큐민, 커큐미노이드, 보스웰산 또는 다당류를 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함한다. 또한 강화된 BDMC 커큐미노이드와 BPS의 조합을 포함하는 조성물을 포함한다.
본 발명의 적용 가능성의 더 넓은 범위는 아래의 상세한 설명으로부터 명백해질 것이다. 그러나, 이하의 상세한 설명 및 구체적인 실시예는 본 발명의 바람직한 구현예를 나타내지만, 본 발명을 제한하는 것으로 해석되어서는 안 되며, 다양한 변형 및 수정을 가하는 것은 당업자의 범위 내에 있고, 예를 들어 사용된 샘플의 농도 범위, 커큐미노이드의 유도체/유사체, BPS, 실험 조건, 포유동물의 선택을 변경하는 것은 이 상세한 설명으로부터 본 발명의 사상 및 범위 내에 충분히 포함됨을 이해해야 한다.
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도 1 및 도 2는 FLS에서 비멘틴(Vimentin)의 면역염색을 나타낸다.
도 3은 10, 20 및 40 ㎍/mL에서 AC3를 사용한 FLS 증식의 농도 의존적 억제를 나타낸다. 20 및 40 ㎍/ml에서 FLS 대조군과 비교하여 P＜0.01.
도 4는 10, 20 및 40 ㎍/mL에서 용량 의존적 방식으로 AC3의 억제율을 나타낸다. 20 및 40 ㎍/ml에서 FLS 대조군과 비교하여 P＜0.01.
도 5는 임의의 커큐미노이드, AC3, C3 및 BPS에 의한 FLS 증식 억제의 비교 효과를 나타낸다. BPS를 제외한 FLS 대조군과 비교하여 P＜0.01.
도 6은 FLS 증식의 억제에서 AC3 및 BPS의 효과를 나타낸다. AC3 및 조합에 대한 조합에 대한 FLS 대조군과 비교하여 P＜0.01.
도 7은 커큐미노이드, AC3, C3 및 BPS의 세포 주기 억제를 나타낸다.
도 8은 임의의 커큐미노이드, AC3, C3 및 BPS로 처리될 때 S 단계에 있는 세포의 비율을 나타낸다.
도 9는 AC3, BPS로 개별적으로 및 또한 조합으로 처리될 때 세포의 비율을 나타낸다.
도 10 내지 18은 미처리(도 10), 커큐민(도 11), BDMC(도 12), DMC(도 13), AC3(도 14), C3(도 15), 각각 40 ㎍/mL에서의 BPS(도 16), 80 ㎍/mL에서의 BPS(도 17), 각각 10 및 40 ㎍/mL에서의 AC3 및 BPS의 조합(도 18)에 대한 FACS를 사용한 세포 주기 억제를 나타낸다.
도 19는 쿠르쿠미노이드, AC3, C3, BPS 및 AC3+BPS의 조합 중 임의의 것을 사용하여 세포자연사 촉진(pro-apoptosis)을 제안하는 Bax/Bcl2의 비율을 나타낸다. AC3, Cur 및 BDMC에 대한 FLS 대조군과 비교하여 P＜0.01. DMC 및 AC3+BPS의 경우 P＜0.05.
도 20 내지 31은 대조군(도 20), 각각의 BDMC(도 21), 커큐민(도 22), DMC(도 23), AC3(도 24), 15 ㎍/mL의 C3(도 25), BPS(도 26), AC3(10 ㎍/mL, 도 27), BPS(40 ㎍/mL, 도 28) 및 AC3+BPS의 조합(10+40 ㎍/mL, 도 29)으로 처리된 경우, 이동 검정에서 FLS의 이동 및 침범을 나타내고, 도 30 및 31은 이동 억제율을 나타낸다.
도 32는 대조군, RA 대조군, 셀레콕시브 대조군, 커큐미노이드, AC3, C3, BPS, 및 AC3+BPS의 조합으로 치료했을 때의 관절염 점수를 나타내고, p＜0.05 및 ** P＜0.01.
도 33 내지 35는 대조군, RA, 셀레콕시브, AC3, BPS, 및 AC3+BPS의 조합으로 처리될 때 Th17(도 33), Treg(도 34) 및 Th17/Treg의 비율(도 35)에 대한 조절 효과를 보여준다. 정상(도 36), AC3(50 mg/kg, 도 37), AC3(100 mg/kg, 도 38), BPS(40 mg/kg, 도 39), AC3+BPS(50+40 mg/kg, 도 40), AC3+BPS (100+40 mg/kg, 도 41), 셀레콕시브(도 42)의 FACS 연구.
선택된 정의
본 출원에서 사용된 모든 용어는 달리 명시되지 않는 한 선행 기술에서 알려진 일반적인 의미를 지닌다. 본 명세서 전체에 적용되는 본 발명에 사용된 몇몇 다른 특정 정의가 아래에 설명되어 있다. 청구항은 달리 명시되지 않는 한 더 넓은 정의를 제공한다.
본 출원에서, 샘플에 대한 모든 언급은 치료 효과를 가져오는 다음 제제 중 하나 또는 조합을 의미한다. 제제에는 일반적으로 커큐민, 비스데메톡시커큐민(bisdemethoxycurcumin) 및 데메톡시커큐민(demethoxycurcumin) 또는 적절하게 언급되는 경우 이들의 조합 중 하나를 지칭하는 커큐미노이드가 포함된다. 강화된 BDMC 조성물은 적어도 20% w/w의 BDMC를 포함하는 커큐미노이드 조성물을 지칭한다. 보다 구체적으로, AC3는 20 내지 50% w/w 비스데메톡시커큐민, 10 내지 25% w/w 데메톡시커큐민 및 30 내지 50% w/w 커큐민인 조성물을 지칭한다. C3 복합체는 75 내지 81% 커큐민, 15 내지 19% 데메톡시커큐민 및 2.2 내지 6.5% 비스데메톡시커큐민인 커큐민이 풍부하다. US60/268,713에 개시된 바와 같이 보스웰리아 세라타로부터 분리된 천연 추출물인 보스웰산, 및 PS는 보스웰리아 세라타의 검 수지로부터의 다당류이다. 구체적으로, 보스웰산(B)이 언급될 때마다 β-보스웰산 20 내지 30% w/w, 3-아세틸-11-케토-β-보스웰산, 12% w/w(AKBA)를 함유하도록 표준화된 35 내지 50% w/w의 총 보스웰산 함량을 포함한다. 다당류(PS)가 언급될 때마다 갈락토스, 아라비노스 및 D-글루쿠론산으로 이루어진 중성 당을 함유하는 35 내지 45% w/w 다당류(PS)를 포함한다. (보스웰리아 세라타 조성물은 인도 방갈로르 소재의 사미-사빈사 그룹 리미티드(Sami-Sabinsa Group Limited)로부터 보스웰린(Boswellin®) PS로서 시판된다.
치료적 관리 또는 관리는 본 발명에 개시된 상태를 효과적으로 개선하는 상태를 지칭한다. 본 명세서에서 대조군에 대한 모든 언급은 실험에 따라 미처리, RA 대조군 또는 셀레콕시브 대조군 중 하나를 지칭하며, 적용되는 실시예 및 대조군 세부사항은 적절한 경우 언급된다.
본 발명은 일반적으로 개별 농도의 BDMC, DMC, 커큐민, 커큐미노이드, 보스웰산(B) 또는 다당류(PS)를 포함하는, 섬유아세포 유사 활막세포의 증식, 이동을 억제하고, T-헬퍼 17(Th17) 및 T-세포(Treg)의 불균형 조절에 사용하기 위한 방법 및 조성물을 포함한다. 또한 강화된 BDMC 커큐미노이드와 BPS의 조합을 포함하는 조성물을 포함한다. 본 발명은 또한 전술한 조성물을 사용하여 대상체에서 류마티스 관절염의 치료적 관리 방법을 포함한다.
가장 바람직한 구현예에서, 본 발명은 대상체에서 섬유아세포-유사 활막 세포(FLS)의 증식 및 이동을 억제하는데 사용하기 위한 조성물을 개시하며, 상기 조성물은 20% w/w 이상으로 존재하는 강화된 비스데메톡시커큐민(BDMC)을 포함한다.
본 발명의 다른 바람직한 구현예에서, 본 발명은 포유동물의 비장에서 T-헬퍼 17(Th17), T-세포(Treg)의 불균형을 조절하는데 사용하기 위한 조성물을 개시하며, 여기서 조성물은 20% w/w 이상의 비스데메톡시커큐민(BDMC)을 포함한다. 이 구현예의 관련 측면에서, 불균형은 3.5에서의 RA 대조군과 비교된(도 35) 및 0.5에서의 셀레콕시브 대조군만큼 우수한(도 35) 바람직하게는 1 이상, 더 바람직하게는 0 내지 1인 Th17/Treg 비율로 Th17 세포를 감소시키고 T-세포(Treg)를 증가시킴으로써 조절된다(도 33 내지 35, 실시예 9).
본 발명의 또 다른 바람직한 구현예에서, 본 발명은 포유동물에서 류마티스 관절염의 치료적 관리에 사용하기 위한 조성물을 개시하고, 여기서 조성물은 20% w/w 이상으로 존재하는 강화된 비스데메톡시커큐민(BDMC)을 포함한다. 이 구현예의 관련 측면에서, 포유동물에서 류마티스 관절염의 관리는 염증 마커(inflammatory marker)의 수준을 낮추고 세포자연사를 촉진하는, 섬유아세포 유사 활막세포의 증식 및 이동을 억제하고, 포유류의 비장에서 T-헬퍼 17(Th17) 및 T-세포(Treg)의 불균형을 조절함으로써 이루어진다. 이 구현예의 관련 측면에서, 개선된 관절염 점수(arthritis score)를 초래한다. 섬유아세포 유사 활막 세포의 억제 및 이동, T-헬퍼 17(Th17), T-세포(Treg)의 불균형 조절, 염증 마커 수준 감소, 세포자연사 촉진 및 관절염 점수 개선의 범위와 세부 사항은 관련 구현예에서 설명된다.
본 발명의 또 다른 가장 바람직한 구현예에서, 본 발명은 포유동물에서 섬유아세포-유사 활막세포(FLS)의 증식 및 이동을 억제하는 방법을 개시하고, 상기 방법은 포유동물 FLS를 20% w/w 이상 존재하는 강화된 비스데메톡시커큐민(BDMC)을 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계를 포함한다.
본 발명의 또 다른 가장 바람직한 측면에서, 본 발명은 포유동물의 비장에 있는 T-헬퍼 17(Th17), T-세포(Treg)에서의 불균형을 조절하는 방법을 개시하고, 상기 방법은 a) T-헬퍼 17(Th17), Treg 불균형을 갖는 포유동물을 식별하는 단계 및 b) 20% w/w 이상으로 존재하는 강화된 비스데메톡시커큐민(BDMC)을 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함한다. 이 구현예의 관련 측면에서, 불균형은 3.5에서의 RA 대조군과 비교하여(도 35) 바람직하게는 1 이상, 더 바람직하게는 0 내지 1인 Th17/Treg 비율로 Th17 세포를 감소시키고 T-세포(Treg)를 증가시킴으로써 조절된다(도 33 내지 35, 실시예 9).
본 발명의 또 다른 가장 바람직한 구현예에서, 대상체에서 류마티스 관절염의 치료적 관리에 대한 방법을 개시하며, 상기 방법은 a) 류마티스 관절염이 있는 대상체를 식별하는 단계 및 b) 20% w/w 이상으로 존재하는 강화된 비스데메톡시커큐민(BDMC)을 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함한다. 이 구현예의 관련 측면에서, 포유동물에서 류마티스 관절염의 관리는 염증 마커의 수준을 낮추고 세포자연사를 촉진하는, 섬유아세포 유사 활막세포의 증식 및 이동을 억제하고, 포유류의 비장에서 T-헬퍼 17(Th17) 및 T-세포(Treg)의 불균형을 조절함으로써 이루어진다. 이 구현예의 관련 측면에서, 개선된 관절염 점수를 초래한다. 섬유아세포 유사 활막 세포의 억제 및 이동, T-헬퍼 17(Th17), T-세포(Treg)의 불균형 조절, 염증 마커 수준 감소, 세포자연사 촉진 및 관절염 점수 개선의 범위와 세부 사항은 관련 구현예에서 설명된다.
FLS의 증식 및 억제와 관련된 구현예에서, 조성물은 20 내지 50% w/w BDMC, 10 내지 25% w/w 데메톡시커큐민(DMC) 및 30 내지 50% w/w 커큐민을 포함하고, 조성물의 총 커큐미노이드는 20 내지 95% w/w 범위이다. 본 발명의 이러한 구현예의 관련 측면에서, 조성물은 추가로 보스웰리아 세라타(Boswellia serrata)로부터의 보스웰산(B) 및 다당류(PS)를 포함하고, 여기서 보스웰산 및 다당류(BPS)는 각각 35 내지 50% w/w 및 35 내지 45% w/w 범위로 존재한다. 이것의 또 다른 관련 측면 및 본 발명의 다른 구현예에서, 조성물 내의 BDMC, DMC, 커큐민, 커큐미노이드, 보스웰산, 다당류의 농도를 개별적으로 사용하는 경우 10 내지 100 ㎍/mL로 구성된 범위에서 선택된다. 본 발명의 이러한 측면 및 다른 관련 구현예에서, 조성물은 강화된 BDMC 커큐미노이드 및 BPS가 각각 1:1, 또는 바람직하게는 1:2, 또는 바람직하게는 1:3, 또는 바람직하게는 1:4 또는 바람직하게는 4:1, 또는 바람직하게는 3:1, 또는 바람직하게는 2:1의 비율의 조합으로 존재하는 조성물을 포함한다. 본 발명의 이 구현예의 관련 측면에서, C3 및 BPS는 상기 특정 범위로서 조합으로서 사용된다. 특정 범위 내에서 조합을 찾거나 적합한 범위를 찾는 것은 통상의 지식 및 당업자에게 있다. 또한, 본 발명의 이러한 측면 및 다른 구현예에서, 더욱 바람직하게는 AC3는 단독으로 또는 BPS와 함께 사용된다. 본 발명의 추가 측면 및 다른 구현예에서 BDMC, 커큐민, DMC, BPS, AC3, C3의 농도를 개별적으로 사용하는 경우 10 내지 100 ㎍/mL 범위, 또는 바람직하게는 20 내지 80 ㎍/mL 범위, 또는 바람직하게는 40 내지 60 ㎍/mL 범위에서 사용된다.
본 발명의 이와 관련된 측면 및 앞서 언급한 다른 구현예에서, 섬유아세포-유사 활막세포(FLS) 억제는 세포 주기 억제, 염증 마커 수준 감소, 세포자연사 촉진 및 관절염 점수 개선에 의해 야기된다. 이 구현예의 관련 측면에서, 샘플로 치료한 후 FLS 증식의 억제는 미처리 대조군과 비교하여 10 내지 90% 범위, 또는 더 바람직하게는 50 내지 90% 범위, 또는 가장 바람직하게는 60 내지 90% 범위이다(도 3 내지 6, 실시예 2). 본 발명의 이러한 구현예의 관련 측면에서, 샘플로 치료한 후 세포 주기 억제는 G0/G1 단계에 있고, S 단계에 있는 세포의 백분율은 1 내지 20% 범위, 또는 더 바람직하게는 1 내지 10% 범위, 또는 가장 바람직하게는 1 내지 5% 범위(도 7 내지 9, 실시예 3)이다. 본 발명의 이 구현예의 관련 측면에서, 염증 마커는 TNF-α, IFN-γ, CCL-5, MMP-3 및 카텝신으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 이 구현예의 추가 측면에서, 각각의 샘플(들)로 치료 후 염증 마커의 발현 수준은 미처리 대조군과 비교하여 적어도 10%, 또는 적어도 20%, 또는 적어도 30%, 또는 적어도 40% 또는 적어도 50% 또는 적어도 60% 감소한다(표 3, 실시예 4). 본 구현예의 추가 측면에서, 염증 마커 IL6에 대한 ELISA 연구는 AC3 및 BPS의 조합이 개별적으로 사용된 AC3 또는 BPS와 비교하여 더 나은 억제를 나타냄을 보여주었다(실시예 4). 이 구현예의 추가 측면에서, 샘플로 치료 후 세포자연사는 Bax/Bcl2 비율이 미처리 대조군 1과 비교하여 1 내지 1.5 범위, 또는 바람직하게는 1.25 내지 1.5 비율로 증가함에 따라 촉진된다(도 19, 실시예 5). 이 구현예의 추가 측면에서, FLS의 이동은 샘플로 치료 후 억제되었고(도 20 내지 31, 실시예 6), 여기서 이동 억제는 미처리 대조군에 비교하여 40 내지 80%, 또는 바람직하게는 50 내지 80%, 또는 더 바람직하게는 50 내지 70%이고(도 30), AC3+BPS의 조합은 개별 처리에 비해 효과적이었다(도 31). 이 구현예의 또 다른 측면에서, 샘플로 치료한 후 관절염 점수는 미처리 대조군과 비교하여 1-3 범위, 보다 바람직하게는 1-2 범위이다(도 32, 실시예 8, RA 대조군은 3.5, 양성 대조군 셀레콕시브는 1)이다.
포유동물의 비장에서 T-헬퍼 17(Th17), T-세포(Treg)의 불균형 조절 및 포유동물에서 RA의 치료적 관리와 관련된 구현예에서, 조성물은 조성물 내의 BDMC, DMC, 커큐민, 커큐미노이드, 보스웰산 또는 다당류의 농도를 개별적으로 사용하는 경우 바람직하게는 포유동물 체중의 40 mg/kg 내지 100 mg/kg, 또는 바람직하게는 50 내지 100 mg/kg으로 이루어진 범위로부터 선택된다. 관련 구현예에서, 강화된 BDMC 커큐미노이드 조성물 및 BPS가 각각 1:1, 또는 바람직하게는 1:2, 또는 바람직하게는 1:3, 또는 바람직하게는 1:4 또는 바람직하게는 4:1, 또는 바람직하게는 3:1, 또는 바람직하게는 2:1의 비율의 조합으로 존재한다.
본 발명의 또 다른 관련 구현예에서, 조성물은 안정화제, 생체이용률 향상제 및 항산화제, 약제학적으로 또는 기능식품적으로(nutraceutically) 또는 약용화장품으로(cosmeceutically) 허용되는 부형제 및 향상제를 추가로 포함하고, 정제, 캡슐, 시럽, 구미, 산제, 현탁액, 에멀젼, 츄어블(chewable), 캔디 또는 식용품(eatables)의 형태로 경구 투여되도록 적절하게 제형화된다(실시예 10). 투여에 적합한 제형을 고안하는 것은 당업자의 범위 내에 있다.
실시예
실시예 1: 섬유아세포 유사 활막세포(FLS)의 분리 및 배양: 활막 조직은 무균 상태에서 콜라겐 유도된 관절염 래트로부터 (Jinjun Zhao, Qingqing Ouyang, Ziyou Hu, Qin Huang, Jing Wu, Ran Wang 및 Min Yang. A protocol for the culture and isolation of murine synovial fibroblasts. Biomedical Reports 5: 171-175, 2016)의 방법에 따라 얻었다.
FLS는 효소 분해에 의해 활막 조직으로부터 분리되었다. 요컨대, 미세 수술용 가위로 조직을 1-mm 3블록으로 분리했다. 그런 다음 조직을 효소 분해를 위해 10% FBS가 보충된 DMEM에서 0.1% 콜라게나제 II형 효소와 함께 오비탈(orbital) 진탕 인큐베이터(200 rpm)에서 37℃에서 45분 동안 배양했다.
배양 시간 후, 튜브를 1 내지 2분 동안 격렬하게 와동(vortex)시켜 세포를 방출하고 100 ㎛ 메쉬 스트레이너(strainer)를 사용하여 여과하였다. 여액을 1200 rpm에서 5분 동안 원심분리하고, 세포를 10% FBS 및 100 ㎍/ml 스트렙토마이신 및 100 U/ml 페니실린이 보충된 DMEM에 재현탁하고, 가습 인큐베이터에서 37℃, 5% CO2 하에서 배양하였다. 항비멘틴 항체(PA5-27231, Thermo Fisher Scientific)를 사용한 세포 형태 및 면역세포화학적 염색을 기반으로 한 FLS 식별 후(도 1 및 2), 4 내지 7계대(passage)의 세포를 추가 연구에 사용했다.
실시예 2: WST-1 증식 검정: FLS 증식에 대한 상이한 샘플의 효과를 측정하기 위해 WST-1 검정을 사용하였다. FLS를 96-웰 플레이트에 5 × 103 세포/웰의 밀도로 씨딩하고 5% CO2하에 37℃에서 밤새 배양했다. 그 다음, 세포를 도 3 내지 6에 나타낸 바와 같이 상이한 농도의 샘플(AC3, C3, Cur, BDMC, DMC, BPS)로 72시간 동안 처리하였다. 처리 기간 후, 무혈청 DMEM 배양 배지에 1:10으로 희석된 100 μl WST-1 시약(5015944001, Sigma, USA)을 각 웰에 첨가하고, 37℃, 5% CO2 하에서 2시간 동안 배양하였다. 흡광도는 610 nm의 기준 파장으로 450 nm에서 측정되었다. AC3는 용량 의존적 방식으로 20 ㎍/mL 및 40 ㎍/mL(도 3 및 4)에서 FLS 증식을 더 잘 억제하는 것으로 나타났다. FLS 증식 억제에서 커큐미노이드 유사체에 대한 비교 연구는 20 ㎍/mL에서 BDMC ＞ 커큐민 ＞ DMC(도 5)의 경향을 보인 반면 BPS는 10%만 억제했으며 조합은 보스웰린(Boswellin) PS(BPS) 또는 개별적으로 사용되는 AC3보다 훨씬 효과적이었다(도 6).
실시예 3: 세포 주기 분석: FLS 세포(8 x 104 세포/웰)를 24-웰 플레이트에 씨딩하고 37℃, 5% CO2에서 밤새 배양했다. 24시간 동안 무혈청 배지에서 동기화(synchronization)한 후, 세포를 DMEM 10% FBS에서 24시간 동안 샘플의 존재 유무에 관계없이 처리했다. 처리 기간 후, 세포를 수집하고, 빙냉 PBS에 현탁시켰다. 원심분리 후 펠릿에 70% 빙냉 에탄올을 한 방울씩 적가하여 와동하면서 세포를 고정하고 4℃에서 30분 동안 보관했다. 세포를 어두운 곳에서 37℃에서 30분 동안 프로피듐 요오드(propidium iodide:PI) 용액(50 ㎍/ml)으로 염색했다. DNA 함량은 유세포 분석기(BD FACS Celesta 유세포 분석기)로 분석했다. 커큐미노이드 중 AC3, BDMC는 FLS 복제의 최대 억제를 보였고(도 7, 8, 12 및 14), FLS는 G0/G1 단계에서 정지되었다. 보스웰린 PS(BPS)는 80 ㎍/mL에서만 억제를 나타냈다(도 8, 도 16). 세포 주기 억제에 대한 조합(AC3 + BPS)의 효과는 도 9에 예시된 바와 같이 사용된 개별 샘플(AC3 및 BPS)보다 우수했다.
실시예 4: 염증 마커 측정: FLS 세포(8 x 104 세포/웰)를 24-웰 플레이트에 씨딩하고 37℃, 5% CO2에서 밤새 배양했다. 6시간 및 24시간 동안 DMEM 10% FBS에서 다양한 농도의 샘플 존재 여부에 관계없이 10 ng/ml 재조합 래트 TNF-α(Cat No.400-14, Peprotech, NJ, USA)로 세포를 유도하여 샘플의 항 염증 효과를 평가하였다. 커큐민은 염증 마커(IFN γ, CCL-5, MMP-3 및 카텝신, 표 2)를 억제하여 더 나은 항염증 활성을 보인 반면, BDMC는 TNF-α에서 가장 효과적이었고 가장 중요한 것은 AC3과 BPS의 조합이 가장 효과적이라는 것이다(표 2).
ELISA: 24시간의 배양 기간 후, 배양 상청액을 수집하고 ELISA 방법에 의해 염증 마커 IL6에 대해 평가하였다. 10 ㎍/mL(AC3) 및 40 ㎍/mL(BPS) 농도의 경우, 조합으로 사용했을 때 억제율은 AC3 및 BPS를 개별적으로 사용할 때 3% 및 1%에 비해 20%였다.
사용된 키트- 래트 IL-6 DuoSet ELISA R&D Systems, DY506-05.
RT-PCR 발현 연구: 6시간 배양 후, Trizol 시약®(Ambion, Life Technologies)을 사용하여 제조업체의 지침에 따라 미처리된 세포와 처리된 세포의 총 세포 RNA를 분리한 후 리보뉴클레아제 없는 DNA 분해효소(RNase-free DNase) I 처리(ThermoFisher Scientific)를 수행하여 게놈 DNA를 제거했다. 메신저 RNA 품질 및 농도를 분광광도계(NanoDrop Lite, ThermoFisher Scientific)로 분석했다. 제조업체의 지침에 따라 Revert-aid First Strand cDNA 합성 키트(ThermoFisher Scientific)를 사용하여 총 RNA 1마이크로그램을 cDNA로 역전사하고 사용할 때까지 -80℃에서 보관했다.
이어서 반응 혼합물 20 μl를 내부 대조군으로서 유로핀 인디아(Eurofins India)에서 조달한 특별히 설계된 프라이머를 사용하여 cDNA 증폭을 위한 SYBR 그린 qPCR 마스터 믹스를 사용하여 PCR에 적용하고, 하우스 키핑 유전자 β 액틴(actin)을 각각의 반응과 함께 공동 증폭시켰다(표 2). PCR은 Light cycler 96(Roche Life Science)에서 수행하였으며, 유전자에 대한 PCR 조건은 95℃에서 10분 동안의 초기 변성 후 95℃에서 30초 동안 변성, 60℃에서 30초 동안 프라이머의 어닐링, 72℃에서 30초 동안 연장 및 최종으로 72℃에서 30초 동안 냉각으로 이루어진 35 주기였다(표 1).
[표 1] RT-PCR용 서열
[표 2] 염증 마커
실시예 5: 세포자연사 분석 - FLS 세포자연사를 RT-PCR 발현 연구로 평가하였다. 요컨대, FLS 세포(8 x 104 세포/웰)를 24-웰 플레이트에 씨딩하고 37℃, 5% CO2에서 밤새 배양했다. 24시간 동안 무혈청 배지에서 동기화(synchronization)한 후, 세포를 DMEM 10% FBS에서 24시간 동안 샘플의 존재 유무에 관계없이 처리했다. 처리 기간 후, 세포를 수집하고, 총 세포 RNA를 분리하고 앞서 언급한 바와 같이 RT-PCR 분석을 위해 처리하였다(표 3). BCl-2 및 Bax 단백질 계열은 세포자연사의 조절에 중심적인 역할을 한다. Bax/Bcl-2 비율은 세포자연사에 대한 세포 감수성을 결정하는 가변 저항으로 작용할 수 있으며, 세포자연사를 겪고 있는 세포는 Bax/Bcl-2 비율이 더 높다(도 19). 커큐미노이드 중에서 BDMC＞DMC＞커큐민, AC3 복합체는 대조군과 비교할 때 C3 복합체보다 더 우수하였다(도 19).
[표 3] RT-PCR 분석용 서열
실시예 6: 이동-검정- FLS의 이동과 침범은 활막염과 뼈 파괴에 중요한 역할을 한다. FLS는 국소적으로 이동하며 혈류를 통해 먼 부위와 관절을 침범할 수도 있다. RA-FLS는 연골의 매트릭스 분해를 더욱 악화시키는 MMP를 분비하여 궁극적으로 뼈 침식을 초래한다.
FLS의 이동 가능성은 간단한 스크래치 분석 및 FLS 이동에 의한 상처 봉합을 평가하여 연구할 수 있다. 처리되지 않은 FLS는 이동하여 상처를 닫는 반면 처리된 FLS는 봉합이 지연된다(J Immunol　March 1, 2014,　192　(5)　2063-2070). FLS 세포(5 × 104세포/웰)를 24-웰 플레이트에 씨딩하고, 37℃, 5% CO2에서 배양하여 약 80 내지 90%의 전면생장(confluence)에 도달한 다음, 200 μl 피펫 팁으로 긁어서 상처를 입혔다. 세포를 PBS로 세척하여 파편 및 부유 세포를 완전히 제거했다. 이어서 세포를 2% FBS를 함유하는 DMEM 배지에서 상이한 농도의 샘플과 함께 배양하였다. 대조군 샘플은 임의의 샘플 없이 세포 및 배양 배지를 함유하였다. Magvision 소프트웨어를 사용하여 단층 간극 폐쇄를 평가하여 세포 이동을 평가했다. 대조군 웰과 비교하여 상처 봉합 억제 백분율을 계산하였다. 각각 15 ㎍/mL의 커큐미노이드 중에서 BDMC(도 21)는 DMC(도 23), 커큐민(도 22)보다 나은 반면 AC3 복합체(도 24)는 C3 복합체(도 25)보다 우수했으며 AC3 + 보스웰린 PS(BPS)(도 29)는 대조군(도 20)에 비해 AC3(도 27) 및 BPS(도 28)보다 우수하였다.
실시예 7: 래트의 관절염 연구
마우스 모델(표 4) 콜라겐-유도된 관절염(CIA)은 널리 연구된 류마티스 관절염의 자가면역 모델이다. 이 모델에서 자가면역 관절염은 완전 프로인트 보조제(Freund's adjuvant)에 유화된 II형 콜라겐(CII)으로 면역화하여 유도된다. 이 동물들은 인간의 자가면역 질병인 류마티스 관절염과 몇 가지 임상적, 조직학적 및 면역학적 특징을 공유하는 자가면역 매개성 다발성 관절염이 발생한다. CII에 대한 면역 반응은 콜라겐 특이적 T 세포의 자극과 면역원(이종 CII) 및 자가항원(마우스 또는 래트 CII) 모두에 특이적인 높은 역가의 항체 생산을 특징으로 한다.
[표 4] 연구 그룹
1:1 비율로 불완전 프로인트 보조제(FIA)로 유화될 2형 콜라겐(닭 흉골 연골, Sigma 카탈로그 번호: C9301)을 투여하여 관절염을 유발했다. 0 일째에, 200 μL(200 ㎍/동물)의 콜라겐-FIA 에멀젼을 래트의 꼬리 기저부에 피내 주사하였다(첫 번째 면역화). 부스터 주입을 위해 에멀젼은 위와 동일하게 준비되었고 7일째 콜라겐-FIA 에멀젼 100 μL(100 ㎍/동물)가 주입되었다. 0일부터 20일까지 테스트 샘플을 투여한다.
실시예 8: 관절염 점수: 관절염 점수의 표준화된 방법을 사용하여 네 발 모두의 종창 및 홍반의 정도를 평가했다. 0 - 징후 없음; 1 - 부종이 없는 발적; 2 - 가벼운 부종을 동반한 발적; 3 - 심한 부종을 동반한 발적; 4 - 발적, 심한 부종 및 움직임의 경직. AC3 및 BPS의 조합(도 32)은 각각 100 및 40 mg/kg의 농도에서 효과적이었다. 세레콕시브는 류마티스 관절염 대조군과 함께 양성 대조군으로 사용되었다.
실시예 9: 비장에서 Treg 및 Th17 분석, 비장 세포의 분리: 비장은 림프구 분리를 위해 무균 상태에서 콜라겐 유도 관절염 래트에서 얻었다. 비장은 100 ㎍/ml 스트렙토마이신 및 100 U/ml 페니실린을 함유하는 PBS로 2회 세척하고 미세 수술용 가위로 작은 조각으로 자르고, 주사기의 플런저 말단으로 균질화하고 100 μm 메쉬 스트레이너를 사용하여 여과하였다. 여액을 1200 rpm에서 5분 동안 원심분리하고, PBS로 1 내지 2회 세척한 후, 1x106 세포/ml를 10% FBS가 보충된 RPMI 배지에 현탁시켰다. 불균형은 Th17 세포를 감소시키고 T-세포(Treg)를 증가시킴으로써 발생되며(도 33 내지 35) Th17/Treg의 비율은 3.5에서 RA 대조군과 비교하여 바람직하게는 1, 또는 더 바람직하게는 0 내지 1이다(도 35).
유세포 분석기(FCM) 분석: Th17 및 Treg 세포를 평가하기 위해 분리된 림프구를 20 ng/mL 포르볼 미리스테이트 아세테이트(P8139, Sigma) 및 500 ng/mL 이오노마이신과 함께 제조업체가 제안한 농도로 모넨신(554724, BD)을 함유하는 단백질 수송 억제제인 BD GolgiStop으로 4시간 동안 자극했다.
자극 후, 세포를 수집하고 Th17 및 Treg 개체군을 평가하기 위해 2x105 세포를 다른 튜브에 분취하였다. 분석에 사용된 항체 희석액은 각 제조업체에서 권장한 대로 사용되었다. Th17 개체군을 평가하기 위해 세포를 처음에 FITC 마우스 항-래트 CD3(559975, BD pharmingen) 및 APC 마우스 항-래트 CD4(550057, BD pharmingen) 항체로 염색했다. Treg 개체군을 평가하기 위해 세포를 처음에 APC 마우스 항-래트 CD4(550057, BD pharmingen) 및 BV421 마우스 항-래트 CD25(565608, BD pharmingen) 항체로 염색했다. 각각의 표면 염색 항체를 첨가한 후, 튜브를 어두운 곳에서 4℃에서 30분 동안 배양했다. 표면 염색 후, 제조사의 지시에 따라 고정 및 투과화 용액(BD Cytofix/Cytoperm, 554722)을 사용하여 세포를 고정 및 가동화하고 사포닌 함유 완충액(BD Perm/Wash, 554723)에 재현탁시켰다. 고정 및 투과화 후, Th17 및 Treg 세포를 어두운 곳에서 4℃에서 30분 동안 각각 PE 접합된 항-마우스/래트 IL-17A(12-7177-81, eBioscience) 및 PE-접합된 항-FOXP3(12-5773-80, eBioscience) 항체와 함께 배양하였다. 이어서 세포를 사포닌 함유 완충액으로 2회 세척하고 유세포 분석 전에 염색 완충액에 재현탁시켰다. FCM은 BD FACSCelesta 시스템(BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA)에서 수행되었으며 FlowJo 소프트웨어를 사용하여 분석되었다.
실시예 10: 제형: 상기 조성물은 약제학적으로/영양보조적으로(nutraceutically) 허용되는 부형제, 보조제(adjuvants), 희석제, 안정제, 분산성 검, 생체이용률 향상제 또는 담체와 함께 제형화되어 정제, 캡슐, 시럽, 구미(gummies), 산제, 현탁액, 에멀젼(emulsions), 츄어블제(chewables), 캔디(candies) 또는 식용품(eatables)의 형태로 경구 투여된다.
관련 측면에서, 상기 생체이용률 향상제는 피페린(BioPerine®), 퀘르세틴, 마늘 추출물, 생강 추출물 및 나린진을 포함하는 그룹으로부터 선택된다. 또 다른 관련된 측면에서, 상기 안정화제는 로스마린산, 부틸화된 하이드록시아니솔, 부틸화된 하이드록시톨루엔, 메타중아황산 나트륨, 프로필 갈레이트, 시스테인, 아스코르브산 및 토코페롤로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 또 다른 관련 측면에서, 분산성 검은 한천, 알기네이트, 카라기난, 아라비아 검, 구아 검, 로커스트 콩 검, 곤약 검, 잔탄 검 및 펙틴으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
표 5 내지 9는 비스데메톡시커큐민을 함유하는 기능성 식품 제형의 예시적인 실시예를 제공한다.
[표 5] 정제
[표 6] 캡슐
[표 7] 산제
[표 8] 구미 제형
[표 9] 캔디 제형
상기 제형은 단지 예시적인 예일뿐이고, 상기 목적을 위한 상기 활성 성분을 함유하는 임의의 제형은 동등한 것으로 간주된다.
본 발명의 다른 수정 및 변형은 전술한 개시 및 교시로부터 당업자에게 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 소정 구현예들만이 본원에 구체적으로 기술되었지만, 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않으면서 본 발명에 많은 수정이 이루어질 수 있으며 첨부된 청구범위와 함께 해석되어야 한다는 것이 명백할 것이다.
SEQUENCE LISTING <110> MAJEED, MUHAMMED NAGABHUSHANAM, KALYANAM MUNDKUR, LAKSHMI <120> COMPOSITIONS FOR EFFECTIVE MANAGEMENT OF FIBROBLAST-LIKE SYNOVIOCYTES MEDIATED RHEUMATOID ARTHRITIS <130> BDMC-FLS <160> 18 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> ARTIFICIAL SEQUENCE <220> <223> FORWARD PRIMER FOR BETA ACTIN <400> 1 cccgcgagta caaccttct 19 <210> 2 <211> 18 <212> DNA <213> ARTIFICIAL SEQUENCE <220> <223> REVERSE PRIMER FOR BETA ACTIN <400> 2 cgtcatccat ggcgaact 18 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> ARTIFICIAL SEQUENCE <220> <223> FORWARD PRIMER FOR CCL5 <400> 3 cctgctgctt tgcctacctc tc 22 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> ARTIFICIAL SEQUENCE <220> <223> REVERSE PRIMER FOR CCL5 <400> 4 acacacttgg cggttccttc ga 22 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> ARTIFICIAL SEQUENCE <220> <223> FORWARD PRIMER FOR TNF ALPHA <400> 5 actgaacttc ggggtgattg 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> ARTIFICIAL SEQUENCE <220> <223> REVERSE PRIMER FOR TNF ALPHA <400> 6 gcttggtggt ttgctacgac 20 <210> 7 <211> 32 <212> DNA <213> ARTIFICIAL SEQUENCE <220> <223> FORWARD PRIMER FOR INTERFERON GAMMA <400> 7 agtctgaaga actattttaa ctcaagtagc at 32 <210> 8 <211> 26 <212> DNA <213> ARTIFICIAL SEQUENCE <220> <223> REVERSE PRIMER FOR INTERFERON GAMMA <400> 8 ctggctctca agtattttcg tgttac 26 <210> 9 <211> 22 <212> DNA <213> ARTIFICIAL SEQUENCE <220> <223> FORWARD PRIMER FOR MMP3 <400> 9 atgatgaacg atggacagat ga 22 <210> 10 <211> 22 <212> DNA <213> ARTIFICIAL SEQUENCE <220> <223> REVERSE PRIMER FOR MMP3 <400> 10 cattggctga gtgaaagaga cc 22 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> ARTIFICIAL SEQUENCE <220> <223> FORWARD PRIMER FOR MMP13 <400> 11 acccagccct atcccttgat 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> ARTIFICIAL SEQUENCE <220> <223> REVERSE PRIMER FOR MMP13 <400> 12 tctcgggatg gatgctcgta 20 <210> 13 <211> 21 <212> DNA <213> ARTIFICIAL SEQUENCE <220> <223> FORWARD PRIMER FOR CATH <400> 13 aattgtgacc gtgataatgt g 21 <210> 14 <211> 19 <212> DNA <213> ARTIFICIAL SEQUENCE <220> <223> REVERSE PRIMER FOR CATH <400> 14 gcaggcgttg ttcttattc 19 <210> 15 <211> 18 <212> DNA <213> ARTIFICIAL SEQUENCE <220> <223> FORWARD PRIMER FOR BAX <400> 15 atggacgggt ccggggag 18 <210> 16 <211> 18 <212> DNA <213> ARTIFICIAL SEQUENCE <220> <223> REVERSE PRIMER FOR BAX <400> 16 atccagccca acagccgc 18 <210> 17 <211> 18 <212> DNA <213> ARTIFICIAL SEQUENCE <220> <223> FORWARD PRIMER FOR BCL2 <400> 17 aagccggcga cgacttct 18 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> ARTIFICIAL SEQUENCE <220> <223> REVERSE PRIMER FOR BCL2 <400> 18 ggtgccggtt caggtactca 20

Claims (28)

  1. 대상체에서 섬유아세포-유사 활막세포(Fibroblast-like synoviocytes; FLS)의 증식 및 이동을 억제하는데 사용하기 위한 조성물로서, 상기 조성물은 20% w/w 이상으로 존재하는 강화된(enriched) 비스데메톡시커큐민(Bisdemethoxycurcumin; BDMC)을 포함하는, 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 20 내지 50% w/w BDMC, 10 내지 25% w/w 데메톡시커큐민(DMC), 및 30 내지 50% w/w 커큐민을 포함하며, 상기 조성물 중 총 커큐미노이드(curcuminoid)는 20 내지 95% w/w의 범위 내에 있는 것인, 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 조성물 내의 BDMC, DMC, 커큐민 또는 커큐미노이드의 농도를 개별적으로 사용하는 경우 10 내지 100㎍/mL로 이루어진 범위로부터 선택되는 것인, 조성물.
  4. 제3항에 있어서, 상기 조성물은 보스웰리아 세라타(Boswellia serrata)로부터의 보스웰산(Boswellic acid)(B) 및 다당류(polysaccharide; PS)를 추가로 포함하고, 상기 보스웰산은 보스웰산 35 내지 50% w/w, β-보스웰산 20 내지 30% w/w, 3-아세틸-11-케토-β-보스웰산(AKBA) 12% w/w, 및 다당류 35 내지 45% w/w를 포함하는 것인, 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 상기 보스웰산, 다당류의 농도를 개별적으로 사용하는 경우 10 내지 100㎍/mL로 이루어진 범위로부터 선택되는 것인, 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 강화된 BDMC 커큐미노이드 조성물 및 BPS가 1-4:4-1의 비율로 조합되어 존재하는 것인, 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 상기 섬유아세포-유사 활막세포(FLS) 억제는 세포 주기 억제, 염증 마커의 수준 감소 및 세포자연사(apoptosis) 촉진에 의해 초래되는 것인, 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 상기 세포 주기 억제가 G0/G1 단계에 있는 것인, 조성물.
  9. 제7항에 있어서, 상기 세포자연사는 Bcl-2에 대한 Bax의 비율로 측정되는 것인, 조성물.
  10. 제7항에 있어서, 상기 염증 마커는 TNF-α, IFN-γ, CCL-5, MMP-3 및 카텝신으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것인, 조성물.
  11. 제1항에 있어서, 상기 섬유아세포-유사 활막세포의 억제는 개선된 관절염 점수(arthritis score)를 초래하는 것인, 조성물.
  12. 제1항에 있어서, 상기 대상체가 포유동물인 것인, 조성물.
  13. 포유동물의 비장에서 T-헬퍼 17(Th17) 및, T-세포(Treg)의 불균형 조절에 사용하기 위한 조성물로서, 상기 조성물은 20% w/w 이상으로 존재하는 강화된 비스데메톡시커큐민(BDMC)을 포함하는, 조성물.
  14. 제13항에 있어서, 상기 조성물은 20 내지 50% w/w BDMC, 10 내지 25% w/w DMC, 및 30 내지 50% w/w 커큐민을 포함하며, 상기 조성물 중 총 커큐미노이드(curcuminoid)는 20 내지 95% w/w의 범위 내에 있는 것인, 조성물.
  15. 제13항에 있어서, 상기 조성물 내의 BDMC, DMC, 커큐민 또는 커큐미노이드의 농도를 개별적으로 사용하는 경우 포유동물 체중의 40 mg/kg 내지 100 mg/kg으로 이루어진 범위로부터 선택되는 것인, 조성물.
  16. 제13항에 있어서, 상기 조성물은 보스웰리아 세라타(Boswellia serrata)로부터의 보스웰산(B) 및 다당류(PS)를 추가로 포함하고, 상기 보스웰산은 보스웰산 35 내지 50% w/w, β-보스웰산 20 내지 30% w/w, 3-아세틸-11-케토-β-보스웰산(AKBA) 12% w/w, 및 다당류 35 내지 45% w/w를 포함하는 것인, 조성물.
  17. 제16항에 있어서, 상기 보스웰산, 다당류의 농도를 개별적으로 사용하는 경우 포유동물 체중의 40 mg/kg 내지 100 mg/kg으로 이루어진 범위로부터 선택되는 것인, 조성물.
  18. 제13항에 있어서, 상기 강화된 BDMC 커큐미노이드 조성물 및 BPS가 1-4:4-1의 비율로 조합되어 존재하는 것인, 조성물.
  19. 제13항에 있어서, 상기 불균형은 Th17 세포를 감소시키고 T-세포(Treg)를 증가시켜 Th17/Treg 비율을 감소시킴으로써 조절되는 것인, 조성물.
  20. 제13항에 있어서, 상기 조성물은 안정화제, 생체이용률 향상제 및 항산화제, 약제학적으로 또는 기능식품적으로(nutraceutically) 또는 약용화장품으로(cosmeceutically) 허용되는 부형제 및 향상제를 추가로 포함하고, 정제, 캡슐, 시럽, 구미, 산제, 현탁액, 에멀젼, 츄어블(chewable), 캔디 또는 식용품(eatables)의 형태로 경구 투여되는, 조성물.
  21. 포유동물에서 류마티스 관절염의 치료적 관리에 사용하기 위한 조성물로서, 상기 조성물은 20% w/w 이상으로 존재하는 강화된 비스데메톡시커큐민(BDMC)을 포함하는, 조성물.
  22. 제21항에 있어서, 상기 조성물은 20 내지 50% w/w 비스데메톡시커큐민, 10 내지 25% w/w 데메톡시커큐민, 및 30 내지 50% w/w 커큐민을 포함하며, 상기 조성물 중 총 커큐미노이드(curcuminoid)는 20 내지 95% w/w의 범위 내에 있는 것인, 조성물.
  23. 제21항에 있어서, 상기 조성물 내의 BDMC, DMC, 커큐민 또는 커큐미노이드의 농도를 개별적으로 사용하는 경우 포유동물 체중의 40 mg/kg 내지 100 mg/kg에서 선택되는 것인, 조성물.
  24. 제21항에 있어서, 상기 조성물은 보스웰리아 세라타(Boswellia serrata)로부터의 보스웰산(B) 및 다당류(PS)를 추가로 포함하고, 상기 보스웰산 및 다당류(BPS)는 각각 35 내지 50% w/w 및 35 내지 45% w/w 범위로 존재하는 것인, 조성물.
  25. 제24항에 있어서, 상기 보스웰산, 다당류의 농도를 개별적으로 사용하는 경우 포유동물 체중의 40 mg/kg 내지 100 mg/kg의 범위로부터 선택되는 것인, 조성물.
  26. 제21항에 있어서, 상기 강화된 BDMC 커큐미노이드 조성물 및 BPS가 1-4:4-1의 비율로 조합되어 존재하는 것인, 조성물.
  27. 제21항에 있어서, 상기 포유동물의 류마티스 관절염의 관리는 섬유아세포 유사 활막세포의 증식 및 이동을 억제하고, T-헬퍼 17(Th17), T-세포(Treg)의 불균형을 조절하고, 염증 마커의 수준을 감소시키고, 세포자연사를 촉진하고, 관절염 점수를 개선함으로써 초래되는 것인, 조성물.
  28. 제21항에 있어서, 상기 조성물은 안정화제, 생체이용률 향상제 및 항산화제, 약제학적으로 또는 기능식품적으로 또는 약용화장품으로 허용되는 부형제 및 향상제를 추가로 포함하고, 정제, 캡슐, 시럽, 구미, 산제, 현탁액, 에멀젼, 츄어블(chewable), 캔디 또는 식용품(eatables)의 형태로 경구 투여되는, 조성물.
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