KR20230121579A - 만성 림프구성 백혈병의 b 세포 수용체를 표적으로 하는 항체 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 만성 림프구성 백혈병(CLL) 치료용 항체를 제공한다. 이들 항체는 R110-돌연변이된 면역글로불린 람다 가변 3-21(IGLV3-21^R110)을 특징으로 하는 CLL 세포의 B-세포 수용체(BCR)를 표적으로 한다. 본 발명은 또한 상기 항체를 암호화하는 핵산 서열, 이를 포함하는 벡터, 약학적 조성물 및 사용 설명서를 포함하는 키트를 제공한다.

Description

만성 림프구성 백혈병의 B 세포 수용체를 표적으로 하는 항체 및 이의 용도 {Antibodies targeting the B-cell receptor of Chronic lymphocytic leukemia and Uses Thereof}

본 발명은 만성 림프구성 백혈병(CLL) 치료용 항체를 제공한다. 이들 항체는 R110-돌연변이된 면역글로불린 람다 가변 3-21(IGLV3-21^R110)을 특징으로 하는 CLL 세포의 B-세포 수용체(BCR)를 표적으로 한다.

본 발명은 또한 상기 항체를 암호화하는 핵산 서열, 이를 포함하는 벡터, 약학적 조성물 및 사용 설명서를 포함하는 키트를 제공한다.

항체 치료제는 B-계통 세포의 악성 형질전환에서 유래하는 백혈병 및 림프종 치료에 매우 효과적인 시약임이 입증되었다. 리툭시맙과 같은 모노클로날 항체의 승인 이후, CLL 환자의 반응률, 장기 예후 및 삶의 질이 현저하게 향상되었다.

CLL은 골수, 림프절, 말초 혈액 및 비장에 점진적으로 축적되는 B 림프구의 CD5-양성 하위모집단의 클론 증식으로 인한 이질적인 B-림프구-유래된 악성종양이다(Rozman C, Montserrat E. Chronic lymphocytic leukemia. N Engl J Med. 1995; 333: 1052-1057). 이 질환은 서방 국가에서 가장 흔한 유형의 백혈병이고 여성에 비하여 남성의 경우 CLL을 발병할 위험이 2배 증가하며, 전형적으로 노인 환자에서 발생한다(Kipps TJ, Steven-son FK, Wu CJ, Croce CM , Packham G, Wierda WG, et al. Chronic lymphocytic leukemia. Nat Rev Dis Primers (2017) 3:1-12).

임상 및 생물학적 증거는 Burger와 Chiorazzi에 의해 검토된 바와 같이 BCR이 CLL 세포의 클론 선택 및 생존에 있어 주요 인자 중 하나임을 보여주었다(Burger JA, Chiorazzi N. B cell receptor signaling in chronic lymphocytic leukemia. Trends Immunol 2013; 34: 592-601).

BCR은 비-공유적으로 연계된 항원 결합 서브유닛과 시그널링 서브유닛으로 구성된 다중단백질 구조이다. 항원-결합 서브유닛은 2개의 동일한 중쇄 및 2개의 동일한 경쇄를 함유하는 막 면역글로불린으로 구성되며 각 경쇄에는 하나의 불변 도메인이 있고 각 중쇄에는 3개의 불변 도메인이 있다. 각 중쇄는 경쇄와 연계하여 항원-결합 부위를 형성한다. 각각의 경쇄 및 중쇄는 항원-결합 부위를 형성하는 가변 도메인을 함유한다. Igh, Igl 및 Igk 유전자좌에 암호화된 면역글로불린 유전자는 하나 이상의 불변 엑손 상류에 다수의 V(가변), D(상이) 및 J(결합) 유전자 세그먼트를 함유한다. B 세포이 발생할 때, 면역글로불린 유전자 재배열은 V, D 및 J 유전자 세그먼트를 무작위로 조립하여 Igh 유전자좌에 완전한 V 엑손 및 Igk 또는 Igl 유전자좌에 V 및 J 유전자 세그먼트를 생성한다. 유전자 세그먼트의 조합적 결합, 연접의 상이 및 무작위 중쇄 및 경쇄 페어링을 통해, 각각의 개별 B 세포 전구체는 그 자체의 거의 고유한 항원 결합 서브유닛을 생성하며, 그 항원-결합 친화성은 체세포 과돌연변이(SHM)에 의해 추가로 개량될 수 있다.

BCR의 신호 전달 모이어티는 Igα 및 Igβ(CD79a/CD79b) 단백질의 이황화-연결된 헤테로다이머로 구성된다. Igα 및 Igβ 각각은 항원-결합 시 BCR 응집에 이어서 신호 전달을 개시하는 이들의 세포질 꼬리 내에 단일 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프(ITAM)를 함유한다(Flaswinkel, H., Reth, M., 1994. Dual role of the tyrosine activation motif of the Ig-alpha protein during signal transduction via the B cell antigen receptor. EMBO J. 13, 83-89).

항원-결합은 Src 계열 키나아제 Lyn을 빠르게 활성화하여 Igα/Igβ의 인산화를 유도한다. 이것은 BCR, 다양한 티로신 키나아제, 어댑터 단백질 및 시그널링 효소로 구성된 막의 세포질 측면에서 큰 시그널링 복합체의 형성을 개시한다. 근위 BCR 시그널링은 Igα 및 Igβ의 인산화된 ITAM에 동원되는 단백질 티로신 키나아제 Syk(비장 티로신 키나아제)에 의해 매개되어, Syk와 어댑터 단백질 SLP65 및 그의 다운스트림 시그널링 효소 브루톤의 티로신 키나아제(BTK) 및 포스포리파아제 Cγ2(PLCγ2)의 연계를 통해 신호의 전파를 유도한다. 시그널링 복합체를 발산하는 신호는 칼슘 동원, 포스포이노시티드 3-키나아제(PI3K), 핵 인자-κB(NF-κB), 활성화된 T-세포의 핵 인자(NF-AT), 미토겐-활성화된 단백질 키나아제(MAPK) 및 랫트 육종(RAS) 시그널링 경로를 포함한 다운스트림 경로를 활성화한다(Burger JA 및 Chiorazzi N, 2013, s.a).

B-세포 수용체를 통한 성숙한 B 세포의 만성적 활성화는 CLL의 형성 및 발달에 핵심적인 과정인 것으로 나타났다(Stevenson FK, Krysov S, Davies AJ, Steele AJ, Packham G. B-cell receptor signaling in chronic lymphocytic leukemia Blood. 2011; 118: 4313-4320). 이것은 또한 EBV 단백질 LMP2A를 구성적으로 활성인 BCR 대용물로 사용한 연구와도 일치하며, 이는 마우스 B1 하위집합의 발달이 강력하고 지속적인 BCR 자극에 의존하였다는 것을 보여주었다(Casola S, Otipoby KI, Alimzhanov M, et al. B cell receptor signal strength determines B cell fate. Nat Immunol 2004; 5: 317-27). 더욱이, 세포 상의 2개의 인접한 BCR의 상호작용으로 인한 일차 CLL B 세포의 항원-독립적 자율 시그널링은 CLL 발달의 중요한 동인으로 식별되어, BCR 근위 시그널링 분자의 상승된 티로신 인산화를 초래하여 주기적인 시그널링 및 상승된 Ca²⁺ 동원을 유도한다(D

hren-von Minden M et al. Chronic lymphocytic leukemia is driving by antigen-independent cell-autonomous signalling. Nature. 2012; 489: 309-313).

단백질 키나아제 Syk가 지속적인 BCR 시그널링을 통해 구조적으로 인산화된다는 것은 잘 문헌화되어 있고, 여러 연구에서는 또한 PKC, 포스포이노시티드 3-키나아제 및 미토겐-활성화된 단백질 키나아제 p38과 같은 정상 B 세포에서 BCR 계합의 시그널링 경로 다운스트림의 다른 주요 분자가 B-CLL 세포에서 구성적으로 활성화되어, 여러 향생존 분자 및 다운스트림 경로의 활성 및 발현의 해제를 초래한다는 것을 밝혔다(Gobessi S, Laurenti L, Longo PG, Carsetti L, Berno V, Sica S et al. Inhibition of constitutive and BCR-induced Syk activation downregulates Mcl-1 and induces apoptosis in chronic lymphocytic leukemia B cells. Leukemia 2009; 23: 686-697. Ringshausen I, Schneller F, Bogner C, Hipp S, Duyster J, Peschel C et al. Constitutively activated phosphatidylinositol-3 kinase (PI-3K) is involved in the defect of apoptosis in B-CLL: association with protein kinase C delta. Blood 2002; 100: 3741-3748. Plate JM . PI3-kinase regulates survival of chronic lymphocytic leukemia B-cells by preventing caspase 8 activation. Leuk Lymphoma 2004; 45: 1519-1529. Sainz-Perez A, Gary-Gouy H, Portier A, Davi F, Merle-Beral H, Galanaud P et al. High Mda-7 expression promotes malignant cell survival and p38 MAP kinase activation in chronic lymphocytic leukemia. Leukemia 2006; 20: 498-504.).

NF-kB 또는 PI3K/AKT와 같은 구성적으로 활성화된 시그널링 경로는 주요 항세포자멸사 단백질, 특히 B-세포 림프종 2(Bcl-2)의 여러 구성원 및 세포자멸사 단백질의 억제제(IAP) 계열의 전사 및 과발현을 유도하는 것으로 나타났다(Loeder S et al. A novel paradigm to trigger apoptosis in chronic lymphocytic leukemia. Cancer Res. 2009; 69: 8977-8986). Bcl-2 자체 외에도 Mcl-1이 CLL 세포의 손상된 세포자멸사에 중요한 역할을 하는 것이 잘 확립되어 있고, 보고에 따르면 BCR 신호는 PI3K/AKT 경로를 통해 Mcl-1 발현을 상향조절한다(Petlickovski A, Laurenti L, Li X, Marietti S, Chiusolo P, Sica S, Leone G, Efremov DG. Sustained signaling through the B-cell receptor induces Mcl-1 and promotes survival of chronic lymphocytic leukemia B cells. Blood. 2005; 105: 4820-4827).

BCR의 다양한 양태가 주요 CLL 질환 아형을 식별하기 위해 인식되었다. 예를 들어, BCR 면역글로불린 중쇄(IGHV)의 가변 영역 내의 체세포 과돌연변이의 수준은 수십년 동안 예후 마커로 사용되었다. 돌연변이된 IGHV-유전자(M-CLL)를 가진 CLL 환자, 즉 가장 가까운 생식계열과 98% 미만의 IGHV 유전자 동일성을 나타내는 CLL 환자는 일반적으로 98% 이상의 생식계열 동일성을 갖는 돌연변이되지 않은 IGHV 유전자를 가진 CLL 환자(U-CLL)보다 훨씬 더 서서히 진행하는 질환 경과를 갖는다. 그러나, 이 규칙에 대한 예외가 돌연변이 IGHV-유전자 상태가 특정 질환 과정과 상관관계가 없을 수 있는 경우에서 관찰되었다. 예를 들어, IGHV3-21-유전자를 사용하는 사례는 대부분 돌연변이된 BCR을 나타내지만 최악의 임상 결과 중 하나였다. 또한 IGHV-결정되었지만, 다른 접근방식은 CLL 사례의 대략 30%의 다른 예후적으로 중요한 하위집합으로의 분류를 초래했으며, 각 하위집합은 고도로 동질적인 생물학적 특징, 임상 양상 및 결과를 가졌다. 이 분류는 돌연변이 및 비돌연변이된 사례 중에서 밀접하게 상동성인 중쇄 상보성 결정 영역 3(H-CDR3) 서열을 담지하는 고정형 BCR이 존재한다는 관찰을 기반으로 한다. 이 접근방식에 따라 돌연변이된 IGHV3-21을 특징으로 하는 CLL 사례는 소위 하위집합 #2에 할당될 수 있다(Stamatopoulos K, Belessi C, Moreno C, et al. Over 20% of patients with chronic lymphocytic leukemia carry stereotyped receptors: pathogenic implications and clinical correlations. Blood. 2007; 109(1): 259-270; Agathangelidis A., et al. Stereotyped B-cell receptors in one-third of chronic lymphocytic leukemia: A molecular classification with implications for targeted therapies. Blood. 2012; 119: 4467-4475).

특히, 하위집합 #2에 따른 IGHV3-21 사용은 경쇄에서 아미노산 위치 110(IGLV3-21^R110)에서 아르기닌으로 글리신의 후천적 치환과 함께 면역글로불린 람다 가변 3-21 사슬의 발현과 관련하여 항상 관찰되었다. IGLV3-21^R110의 아르기닌 110(R110)에 대한 원인은 면역글로불린 람다 J와 불변 유전자 사이의 스플라이스 부위 상의 단일 G>C 치환이다. 하나의 BCR에서 생식계열 암호화된 라이신 16(K16)과 함께 R110, 및 이웃 BCR의 티로신-아스파르테이트-세린-아스파르테이트(YDSD) 모티프에서 아스파르테이트(D) 50 및 52의 존재는 BCR-BCR 상호작용을 가능하게 하고, 따라서 세포-자율 시그널링을 촉발하는 것으로 식별되었다(도 6 및 7; Minici, C. et al., Distinct homotypic B-cell receptor interactions shape the result of chronic lymphocytic leukemia, Nature Comm. 2017; 8:15746).

BCR 경쇄에 초점을 맞춘 대규모 CLL 환자 코호트의 후생유전학적, 게놈 및 전사체 특성화의 과정에서, 대략 60%의 IGLV3-21^R110 사례가 비-고정형 BCR을 보유하고 있다는 것이 분명해졌으며, 이는 하위집합 #2가 IGLV3-21^R110을 특징으로 하는 CLL의 단지 사소한 하위군이라는 점을 강조한다(Stamatopoulos B, Smith T, Crompot E, et al. The Light Chain IgLV3-21 Denes a New Poor Prognostic Subgroup in Chronic Lymphocytic Leukemia: Results of a Multicenter Study. Clin Cancer Res. 2018; 24(20): 5048-5057. Nadeu F, Royo R, Clot G, et al. IGLV3-21^R110 identifies an aggressive biological subtype of chronic lymphocytic leukemia with intermediate epigenetics. Blood. 2021; 137(21): 2935-2946).

인간에서 식별된 IGLV3-21 유전자의 4개 대립유전자 중 대립유전자 IGLV3-21*01(IMGT/LIGM-DB 수탁번호 X71966) 및 IGLV3-21*04(IMGT/LIGM-DB 수탁번호 AC279208)는 전제조건 K16 및 D50과 D52를 암호화하며, 마지막 2개는 대부분의 경우에 연구된 모티프에 통합되어 IGLV3-21^R110의 위치 49에 티로신 및 위치 51에 세린을 포함한다(예시적으로 IGLV3-21^R110의 경우 도 7 참조). 그러나, 티로신의 페닐알라닌으로의 대체 또는 세린의 트레오닌으로의 대체와 같은 IGLV3-21^R110 CLL 환자에서도 이 모티프에서 기능적으로 동등한 변이가 관찰되었다(Nadeu et al. 2021, s.a.; 변이체에 대해서는 도 7 참조). 흥미롭게도, 대립유전자 IGLV3-21 ^* 01 및 IGLV3-21 ^* 04는 건강한 공여자의 B-세포에서 현저하게 과소표현되는 반면, 다른 그룹에 의해 연구된 환자에서 모든 IGLV3-21 유전자는 대립유전자 IGLV3-21 ^* 01 또는 대립유전자 IGLV3-21 ^* 04에 할당될 수 있어 이들 대립유전자가 IGLV3-21^R110 연관된 CLL의 전개에 기계적으로 필요할 수 있음을 시사한다.

명칭 하위집합 #2L이 또한 제안된 IGLV3-21^R110 CLL 하위그룹은 매우 공격적인 질환 경로와 연관되어 있다. 실제로, IGLV3-21^R110 CLL 사례의 불량한 결과는 IGHV 돌연변이의 상태 또는 중쇄의 특성과 무관하다. IGHV3-21^R110은 IGHV1-18, IGHV3-53 또는 IGHV3-64와 같은 상이한 중쇄와 연관되어 있을 뿐만 아니라 하위집합 #2(상기 참조)와 같은 돌연변이된 CLL에서 발견되기 때문에(Nadeu et al. 2021, supra), IGLV3-21^R110은 경험적으로 정의된 후생유전학적 고정형에 기반한 통상적인 하위집합 분류나 IGHV-돌연변이된 상태에 제한되지 않는 CLL의 그룹을 정의한다. 더욱이, CLL 구동자 돌연변이로서 R110의 필수적인 역할은 부위-특이적 돌연변이유발 실험에 의해 확인되었으며, 이는 IGLV3-21^G110으로 IGLV3-21^R110의 전환이 BCR의 자율 시그널링 기능의 폐기를 초래했다는 것을 밝혔다(Stamatopoulos B, Smith T, Crompot E, et al. 2018, s.a.).

IGLV3-21^R110-담지 BCR의 존재와 시간-대-일차 치료(TTFT) 및 전체 생존율(OS)을 연관시킨 연구는 비-IGLV3-21^R110 CLL을 가진 환자에 비해 IGLV3-21^R110을 발현하는 환자에 대해 유의하게 더 짧은 값을 나타내어 IGLV3-21^R110-양성 환자에 대한 치료의 신속한 필요성을 강조했다(Nadeu F et al. 2021; s.a.).

이들 환자에서 CLL은 일반적으로 이델라리십 및 이브루티닙과 같은 화학요법으로, 둘 모두 단일 제제로 및 다른 약물과의 조합으로 치료된다. 이델라리십은 일차 CLL 세포에서 세포자멸사를 촉진하는 PI3K의 조혈 세포 제한된 δ 이소-폼의 억제제이다(Hoellenriegel J, Meadows SA, Sivina M, et al. The phosphoinositide 3'-kinase delta inhibitor, CAL-101, inhibits B-cell receptor signaling and chemokine networks in chronic lymphocytic leukemia. Blood. 2011; 118: 3603-3612). 이브루티닙은 B-세포 림프종 및 CLL-세포에서 세포자멸사를 유도하는 BTK의 억제제이다(Hermann SE, Gordon AL, Hertlein E, et al. Bruton tyrosine kinase represents a promising therapeutic target for treatment of chronic lymphocytic leukemia and is effectively targeted by PCI-32765. Blood. 2011; 117: 6287-6296). 보다 최근의 치료법은 예를 들어, CD52 항체로 작용하는 알렘투주맙, 또는 세포 표면 B-계통-제한된 항원 CD-20을 표적으로 하는 오비누투주맙, 리툭시맙 및 오파투무맙과 같은 모노클로날 항체를 점점 더 많이 사용하고 있다. 이들 항체를 사용함에 의해 관해 시간을 대략적으로 10개월 연장할 수 있다. 그러나, 약물 표적이 정상 및 악성 B 세포 둘 모두의 생존에 중요하고, 특정 백혈구의 낮은 수준을 포함하여 낮은 혈구 수(호중구감소증)는 일반적인 부작용이기 때문에 치료를 위한 최신 치료법은 일반적으로 환자에게 매우 스트레스가 많다. 더욱이, 화학요법제와 관련하여, 높은 감염 위험, 잠복 감염 및 면역계에 대한 표적-외 효과가 추가 부작용으로 보고되었다. 일반적으로 치료의 바람직하지 않은 부작용과 종종 약물의 불충분한 효과는 종양 세포뿐만 아니라 면역계의 건강한 세포도 손상되기 때문에 높은 사망률로 이어진다고 요약할 수 있다.

그로부터 앞서 언급한 부작용을 동반하지 않는 IGLV3-21^R110-양성 CLL 환자에 대한 구체적인 치료 옵션이 여전히 발견되어야 한다.

IGLV3-21^R110 담지 BCR을 표적으로 하는 잠재적 항체에 관한 현재 조사는 주로 이 특정 하위유형의 CLL의 진단에 중점을 둔다. 예를 들어, Maity 등은 CLL에 대한 예후 마커로 사용되는 항 IGLV3-21^R110 항체를 사용한 면역표현형 연구를 기술한다. 상기 진단용 항-IGLV3-21^R110 항체는 IgG2a 및 Igκ 항체인 것으로 개시되어 있다(Maity PC, Bilal M, Koning MT, et al. IGLV3-21^*01 is an inherited risk factor for CLL through the acquisition of a single-point mutation enabling autonomous BCR signalling. PNAS. 2020; 117(8): 4320-4327).

치료 옵션을 여는 것에 대한 제1 단계는 혈액 샘플로부터 CLL 세포를 제거하는데 사용될 수 있는 항체를 개시하는 WO 2019/008129에 개시되어 있다. WO 2019/008129의 항체는 뮤린 숙주에서 유래한 하이브리도마 세포주에서 IgG 항체로 발현되었다. WO 2019/008129는 그러한 항체의 각각의 가변 중쇄 및 경쇄 도메인만을 개시한다.

WO 2019/008129는 거기에 개시된 항체가 건강한 조직과 질환에 걸린 조직 사이에 선택적이라는 것을 나타내지 않을뿐 아니라 그것이 생체내에 적용되었다는 것도 나타내지 않는다. 따라서 이의 어떠한 치료 효과도 나타내지 않는다.

전술한 것으로부터, IGLV3-21^R110 양성 환자에서 CLL의 개선된 치료를 가능하게 하는 치료 옵션, 특히 다른 조직에 특이적이고 선택적이고, 비-교차-반응성인 항체는 아직 알려지지 않았지만 필요하다.

본 발명은 제1 양태에서 서열번호: 1의 중쇄 아미노산 서열 및 서열번호: 2의 경쇄 아미노산 서열, 또는 서열번호: 11의 중쇄 아미노산 서열 및 서열번호: 12의 경쇄 아미노산 서열을 갖는 항체; 또는 서열번호: 16, 서열번호: 17, 서열번호: 18, 및 서열번호: 19으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 갖는 가변 경쇄와 조합된, 서열번호: 15 및 서열번호: 20으로 구성된 군으로부터 선택된 서열을 갖는 가변 중쇄를 포함하는 항체를 제공함으로써 상기 문제를 해결한다.

CLL 환자의 다른 조직과 특이적으로 선택적으로 비-교차-반응성인 이러한 항체는 IGLV3-21^R110-담지 BCR에 결합하고 이에 의해 악성 B-세포를 사멸시킨다. BCR의 IGLV3-21^R110-부분의 존재를 인식하면서, 이 새로운 항체는 또한 IGHV3-21/IGLV3-21^R110-조합 또는 IGLV3-21^R110을 포함한 임의의 다른 CLL을 포함하는 BCR을 특징으로 하는 "하위집합 #2 CLL"을 치료할 수 있다.

이들 항체의 제공은 IGLV3-21^R110 양성 환자에서 CLL의 치료에 사용하기 위한 상기 항체의 제공인 본 발명의 제2 양태를 초래한다. 마찬가지로, 본 발명의 이 제2 양태는 치료적으로 활성인 양의 상기 항체를 투여함에 의해 IGLV3-21^R110 양성 환자에서 CLL의 치료의 방법에 속한다.

이것은 IGLV3-21^R110 양성 환자에서 CLL에 대한 제1 치료 옵션으로, 최신 기술이 제공하는 치료와 연관된 부작용 없이 악성 B-세포의 선택적 사멸을 가능하게 한다. 더욱이, CLL에 대한 마커로 식별된 IGLV3-21^R110-담지 BCR의 존재에 의해서만 특징되어 지는 B-세포의 결합 및 사멸은 그러한 치료를 특정 IGHV에 의해 정의된 임의의 이전에 식별된 CLL의 하위집합에 속하게 하는 그러한 CLL의 요건과 무관하게 만든다.

이론에 구속됨이 없이, 본 발명의 항체를 사용한 치료는 공동-자극 신호의 부재에서 BCR의 IGLV3-21^R110을 통해 B-세포의 과-활성화를 유도하는 것으로 간주된다. 이것은 최종적으로 항체에 의해 결합된 CLL 세포에서 세포자멸사의 유도를 초래한다. 따라서 본 발명의 항체를 사용한 치료는 악성 B-세포에 대해 매우 선택적이고, 그 중에서 IGLV3-21^R110 양성 B-세포에 대해 훨씬 더 선택적이다.

제3 양태에서 발명은 또한 발명의 항체를 암호화하는 DNA 분자(핵산)에 관한 것이다. 따라서, 발명은 또한 발명의 핵산 서열을 함유하는 벡터 및 숙주 세포에 관한 것이다.

정의

달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술분야의 통상인에 의해 일반적으로 이해되는 의미를 갖는다. 그러나 다음 참고문헌은 본 발명이 속하는 기술분야의 숙련자에게 본 발명에 사용된 많은 용어의 일반적인 정의를 제공할 수 있고, 이러한 정의가 당업계에서 일반적으로 이해되는 의미와 일치하는 한 참조되고 사용될 수 있다. 이러한 참고문헌은 Singleton et ah, Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (2d ed. 1994); The Cambridge Dictionary of Science and Technology (Walker ed., 1988); Hale & Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology (1991 ); 및 Lackie et al., The Dictionary of Cell & Molecular Biology (3d ed. 1999); 및 Cellular and Molecular Immunology, Eds. Abbas, Lichtman and Pober, 2nd Edition, W.B. Saunders Company를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 당업계에서 일반적으로 이해되는 의미를 갖는 본 명세서에 사용된 용어의 정의를 제공하는 당업계의 통상인에게 이용가능한 임의의 추가 기술 자료를 참조할 수 있다. 본 발명의 목적을 위해, 다음 용어가 추가로 정의된다.

본 명세서 및 첨부된 청구범위에서 사용된 단수형 "a", "and" 및 "the"는 문맥상 명백하게 달리 지시하지 않는 한 복수 언급을 포함한다. 따라서, 예를 들어 "유전자"에 대한 언급은 하나 이상의 유전자에 대한 언급이고 당업자에게 공지된 이의 등가물 등을 포함한다.

"자율적으로 활성인" BCR은 영구적으로 활성인 BCR의 특수한 유형이다. 통상의 활성화가 외부 항원을 기반으로 하는 반면, 자율적으로 활성인 BCR은 동일한 세포의 표면 상의 막 구조와의 그 상호작용으로 인해 발생한다. CLL의 임상적 영상에 대해, 동일한 세포의 표면 상에 서로 인접한 BCR 사이의 자율적 활성화-촉발 상호작용이 나타날 수 있다(예를 들어 M. D

hren-von Minden et. al; Nature 2012).

IGLV3-21^R110은 BCR의 경쇄 가변 영역으로, 이는 BCR-BCR 상호작용을 가능하게 하여 자율적으로 활성인 BCR을 유도한다. 구조적으로 이러한 IGLV3-21^R110은 서열번호 53으로 표시되는 서열에 대해 80% 초과의 서열 동일성을 특징으로 하며, 여기서 어느 경우든 상기 서열의 위치 110에는 글리신이 아니라 아르기닌이 있다.

본 명세서에 사용된 용어 "항체"는 바람직하게는 4개의 폴리펩티드 사슬, 전형적으로 이황화 결합에 의해 상호-연결된 2개의 중쇄(H) 및 2개의 경쇄(L)로 구성된 면역글로불린 분자를 지칭하는 것으로 의도된다. 각 중쇄는 중쇄 가변 영역(본 명세서에서는 VH로 약칭함)과 중쇄 불변 영역으로 구성된다. 중쇄 불변 영역은 예를 들어, 3개의 도메인 CH1, CH2 및 CH3을 포함할 수 있다. 각 경쇄는 경쇄 가변 영역(본 명세서에서는 VL로 약칭함)과 경쇄 불변 영역으로 구성된다. 경쇄 불변 영역은 하나의 도메인(CL)으로 구성된다. VH 및 VL 영역은 상보성 결정 영역(CDR)이라고 하는 초가변성의 영역으로 더 세분될 수 있으며, 프레임워크 영역(FR)이라고 하는 보다 보존된 영역이 산재되어 있다. 각 VH 및 VL은 전형적으로 아미노 말단에서 카르복시 말단으로, 예를 들어 다음의 순서: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4로 배열된, 3개의 CDR과 최대 4개의 FR로 구성된다.

본 명세서에서 사용된 용어 "상보성 결정 영역(CDR; 예를 들어, CDR1, CDR2 및 CDR3)"은 그 존재가 항원 결합에 필요한 항체 가변 도메인의 아미노산 잔기를 지칭한다. 각각의 가변 도메인은 전형적으로 CDR1, CDR2 및 CDR3으로 식별되는 3개의 CDR 영역을 가지고 있다. 주어진 CDR의 아미노산 서열 경계는 Kabat 등("Sequences of Proteins of Immunological Interest," 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991; "Kabat" numbering scheme), Chothia와 Lesk(J Mol Biol 196: 901-917 (1987)), 및 Lefranc 등("IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Ig superfamily V-like domains," Dev. Comp. Immunol., 27:55-77, 2003; "IMGT" numbering scheme)에 의해 기술된 것을 포함하여 다수의 잘 알려진 계획 중 임의의 것을 사용하여 쉽게 결정될 수 있다. 각각의 상보성 결정 영역은 IMGT에 의해 정의된 아미노산 잔기를 포함한다. 일부 경우에, 상보성 결정 영역은 또한 Kabat에 따라 정의된 CDR 영역 및/또는 Chothia 넘버링 시스템에 따른 초가변 루프로부터의 아미노산을 포함할 수 있다.

중쇄의 불변 도메인의 아미노산 서열에 의존하여, 온전한 항체는 다른 "클래스"로 할당될 수 있다. 온전한 항체의 5가지 주요 클래스: IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM이 있으며 이들 중 일부는 "서브클래스"(이소타입), 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA 및 IgA2로 추가로 세분화될 수 있다. 상이한 클래스의 항체에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 각각 [알파], [델타], [엡실론], [감마], 및 [뮤]로 불린다. 상이한 클래스의 면역글로불린의 서브유닛 구조 및 3-차원 형상은 잘 알려져 있다.

본 명세서에서 사용된 용어 "항체"는 또한 항원-결합 단편 및 그의 변이체를 포함하는 것으로 이해된다. 따라서, 본 발명의 맥락에서 "항체"에 대한 임의의 언급은 또한, 달리 명시적으로 언급되지 않는다면, 상기 항체를 형성하기 위해 조합된 항체의 전체 중쇄 또는 전체 경쇄를 특정함에 의한 것과 같이, 항원-결합 단편 및/또는 이의 변이체에 대한 언급이다.

본 명세서에서 "항원-결합 단편"은 항원-결합 영역을 보유하는 항체/면역글로불린(예를 들어, IgG의 가변 영역)의 단편으로 정의된다. 발명의 항원-결합 단편은 Fab, Fab', F(ab')₂ 및 Fv 단편; 디아바디; 단일 도메인 항체(DAbs), 선형 항체; 단일-사슬 항체 분자(scFv); 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적, 예컨대 이중-특이적 및 삼중-특이적 항체를 포함한다(C. A. K Borrebaeck, editor (1995) Antibody Engineering (Breakthroughs in Molecular Biology), Oxford University Press; R. Kontermann & S. Duebel, editors (2001) Antibody Engineering (Springer Laboratory Manual), Springer Verlag). "다중-특이적" 또는 "다중-기능성" 항체 이외의 항체는 각각의 동일한 그 결합 부위를 갖는 것으로 이해된다. F(ab')₂ 또는 Fab는 C_H1과 C_L 도메인 사이에서 발생하는 분자간 이황화 상호작용을 최소화하거나 완전히 제거하도록 조작될 수 있다.

항체의 "항원-결합 영역"은 전형적으로 항체의 하나 이상의 초가변 영역(들), 예를 들어, CDR1, -2 및/또는 -3 영역에서 발견되지만; 가변 "프레임워크" 영역은 항원 결합에서 CDR에 대해 스캐폴드를 제공하는 것과 같이 중요한 역할을 수행할 수도 있다.

발명에서 고려되는 항체 또는 항원-결합 단편의 "변이체"는 IGLV3-21^R110에 대한 항체 또는 항원-결합 단편의 결합 활성이 유지되는 분자이다.

"인간화된" 항체는 본 명세서에서 (i) 항체가 인간 생식계열 서열에 기초하는, 비-인간 공급원(예를 들어, 이종 면역계를 담지하는 이식유전자 마우스)으로부터 유래되고; (ii) 여기서 비-인간 항체의 프레임워크 영역의 아미노산이 유전적 조작에 의해 인간 아미노산 서열로 부분적으로 교환되거나 또는 (iii) 가변 도메인의 CDR이 비-인간 기원으로부터 온 반면, 가변 도메인의 하나 이상의 프레임워크는 인간 기원의 것이고 불변 도메인(있는 경우)은 인간 기원의 것인 CDR-그래프트된 것으로 정의된다.

"키메라" 항체는 본 명세서에서 가변 도메인이 비-인간 기원으로부터 유래되고 일부 또는 모든 불변 도메인이 인간 기원으로부터 유래된 것으로 정의된다.

본 명세서에 사용된 용어 "모노클로날" 항체는 실질적으로 동종인 항체의 모집단으로부터 수득된 항체를 지칭하며, 즉 모집단을 포함하는 개별 항체는 소량으로 존재할 수 있는 가능한 돌연변이, 예를 들어 자연적으로 발생하는 돌연변이를 제외하고는 동일하다. 따라서 용어 "모노클로날"은 별도 항체의 혼합물이 아닌 것으로 항체의 특성을 나타낸다. 전형적으로 다른 결정인자(에피토프)에 대해 지시된 다른 항체를 포함하는 폴리클로날 항체 제제와 대비하여, 모노클로날 항체 제제의 각 모노클로날 항체는 항원 상의 단일 결정인자에 대해 지시된다. 그의 특이성에 부가하여, 모노클로날 항체 제제는 전형적으로 다른 면역글로불린에 의해 오염되지 않는다는 점에서 유리하다. 용어 "모노클로날"은 임의의 특정 방법에 의해 항체의 생산을 요하는 것으로 해석되지 않는다. 용어 모노클로날 항체는 구체적으로 뮤린, 키메라 및 인간화된 항체를 포함한다.

본 명세서에 사용된 바와 같이, "특이적으로 결합하는" 항체는 관심있는 항원에 "특이적"이거나 또는 관심있는 항원을 "특이적으로 인식"하며, 예를 들어 종양-연관된 폴리펩티드 항원 표적(여기서는 IGLV3-21^R110)은 이러한 항원과 하나 이상의 참조 항원(들)을 구별할 수 있다. 가장 일반적인 형태에서 "특이적 결합". "에 특이적으로 결합한다"는 "에 대해 특이적이다"이거나 또는 "특이적으로 인식한다"는 예를 들어, 다음 방법 중 하나에 따라 결정된 바와 같이, 관심있는 항원과 비관련된 항원 간을 구별하는 항체의 능력에 대해 지칭하는 것이다. 이러한 방법은 유세포분석, 웨스턴 블롯, ELISA-, RIA-, ECL-, IRMA-, 면역조직학적-검사 및 펩티드 스캔을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.

"결합 친화성" 또는 "친화성"은 분자의 단일 결합 부위와 그의 결합 파트너 사이의 비공유 상호작용의 총합의 강도를 지칭한다. 달리 나타내지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 "결합 친화성" 또는 "친화성"은 결합 쌍의 구성원(예를 들어, 항체와 항원) 사이의 1:1 상호작용을 반영하는 고유 결합 친화성을 지칭한다. 해리 속도 상수 K_D는 일반적으로 평형 결합(k_a)과 해리 속도(k_d) 상수의 비율을 기반으로 계산된다. 해리 상수 "K_D"는 일반적으로 분자(예컨대 항체)와 결합 파트너(예컨대 항원) 사이의 친화성, 즉 리간드가 특정 단백질에 얼마나 단단히 결합하는지를 기술하는데 사용된다. 리간드-단백질 친화성은 두 분자 사이의 비-공유 분자간 상호작용에 의해 영향을 받는다. 용어 "높은 친화성"은 항체가 10^-9M 이하의 친화성(KD)(1가 친화성)으로 IGLV3-21^R110-양성 CLL BCR에 결합한다는 것을 의미한다. 항체는 다른 비관련된 분자에 비해 표적 항원에 대해 실질적으로 더 큰 친화성을 가질 수 있다. 친화성은 당업계에 공지된 일반적인 방법에 의해, 예를 들어 실시예 5에 따라 측정될 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어 '에피토프'는 면역글로불린 또는 T-세포 수용체에 특이적으로 결합할 수 있는 임의의 단백질 결정인자를 포함한다. 에피토프 결정인자는 일반적으로 아미노산 또는 당 측쇄 또는 이들의 조합과 같은 분자의 화학적으로 활성인 표면 그룹화로 구성되고 일반적으로 특정 전하 특성뿐만 아니라 특정 3차원 구조적 특성을 갖는다.

"단리된" 항체는 그것을 발현한 세포의 성분으로부터 식별되고 분리된 것이다. 세포의 오염 성분은 항체의 진단적 또는 치료적 용도를 방해하는 물질이고 효소, 호르몬 및 기타 단백질성 또는 비단백질성 용질을 포함할 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 항체는 (1) 예를 들어, Lowry 방법, 1N-Vis 분광학에 의해 또는 SDS-모세관 겔 전기영동(예를 들어 Caliper LabChip GXII, GX 90 또는 Biorad Bioanalyzer 장치 상)에 의해 결정된 항체의 95 중량% 초과, 그리고 추가의 바람직한 실시형태에서 99 중량% 초과로, (2) N-말단 또는 내부 아미노산 서열의 적어도 15개 잔기를 얻기에 충분한 정도로, 또는 (3) 쿠마시 블루 또는 바람직하게는 은 염색을 사용하여 환원 또는 비환원 조건 하에서 SDS-PAGE에 의한 동종으로 정제된다. 단리된 자연적으로 발생하는 항체는 항체의 천연 환경의 적어도 하나의 성분이 존재하지 않을 것이기 때문에 재조합 세포 내의 제자리 항체를 포함한다. 그러나, 통상적으로 단리된 항체는 적어도 하나의 정제 단계에 의해 준비될 것이다.

용어 "암"은 세포가 제어 없이 분열하여 통제되지 않은 세포 성장을 초래하는 생리학적 병태 또는 질환을 지칭한다. "종양"은 하나 이상의 암 세포를 포함한다.

"항체-의존성 세포-매개된 세포독성" 또는 "ADCC"는 특정 세포독성 세포(예를 들어 NK 세포, 호중구 및 대식세포) 상에 존재하는 Fc 감마 수용체(FcγR) 상에 결합된 분비된 Ig가 이들 세포독성 이펙터 세포가 항원-보유 표적 세포에 특이적으로 결합하고 이어서 예를 들어 세포독소로 표적 세포를 사멸시킬 수 있게 하는 세포독성의 형태를 지칭한다.

"보체 의존성 세포독성" 또는 "CDC"는 보체의 존재에서 표적 세포의 용리를 지칭한다. 고전적인 보체 경로의 활성화는 보체 시스템의 제1 성분(C1q)이 동족 항원에 결합된 (적절한 서브클래스의) 항체에 결합함에 의해 개시된다. 보체 활성화를 평가하기 위해, 예를 들어 Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202: 163(1996)에 기술된 바와 같은 CDC 검정이 수행될 수 있다. 변경된 Fc 영역 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 변이체(변이체 Fc 영역을 갖는 폴리펩티드) 및 증가 또는 감소된 C1q 결합이, 예를 들어, 미국 특허 번호 6,194,551 B1 및 WO 1999/51642에 기재되어 있다.

참조 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열 각각에 대한 "퍼센트(%) 서열 동일성"은 최대 퍼센트 서열 동일성을 달성하기 위해 필요하다면 서열을 정렬하고 갭을 도입한 후, 각각 참조 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열에서 각각 핵산 또는 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열에서, 각각 핵산 또는 아미노산 잔기의 백분율로 정의된다. 보존적 치환은 서열 동일성의 일부로 간주되지 않는다. 간격이 없는 정렬이 선호된다. 퍼센트 아미노산 서열 동일성을 결정하기 위한 목적을 위한 정렬은, 예를 들어, BLAST, BLAST-2, ALIGN, LALIGN 또는 Megalign(DNASTAR) 소프트웨어와 같은 공개적으로 이용가능한 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 당업계의 기술 내에서 다양한 방식으로 달성될 수 있다. 당업계의 통상인은 비교되는 서열의 전체 길이에 걸쳐 최대 정렬을 달성하는데 필요한 임의의 알고리즘을 포함하여 서열을 정렬하기 위한 적절한 매개변수를 결정할 수 있다.

도 1A 내지 1D는 FACS FSC-SSC 플롯(도 1A, 1C)뿐만 아니라 항-IgM-PE(도 1B, 1D, y-축)에 대한 mAb01-01-APC(도 1B, 1D, x-축)의 게이팅된 플롯을 도시한다.
실시예 4에 따라, 도 1A 및 1B의 플롯은 상기 형광 표지된 항체로 염색된 IGHV3-21/IGLV3-21^R110 BCR 양성 TKO 마우스 세포 및 BCR을 결하는 TKO 세포(세포 혼합 A)를 포함하는 1:1 세포 혼합으로부터 만들어진 반면, 도 1C 및 1D의 플롯은 IGHV3-21/IGLV3-21^G110 BCR 양성 TKO 마우스 세포 및 BCR을 결하는 TKO 세포(세포 혼합 B)를 포함하는 1:1 세포 혼합으로 만들어졌다.
도 1B 및 1D에서 쉽게 인지할 수 있는 바와 같이, 분석된 TKO 세포의 거의 절반이 각각의 항-IgM 항체로 양성으로 염색되어, 각 세포 혼합의 TKO 세포 중 대략적으로 50%의 표면 상에 BCR의 발현과 일치하는 BCR을 그것이 보유하고 있음을 나타낸다. 도 1B 및 1D의 비교에 의해, 본 발명의 항체 "mAb01-01" 만이 R110 돌연변이를 보유는 IGLV3-21의 악성 변이체를 인식한다는 것이 명백해진다.
도 2A 내지 2F는 실시예 6에 따라 처리된 인간 PBMC의 FACS 플롯을 도시한다. 도 2A 및 2D는 게이트가 도 1A 및 1C와 마찬가지로 외관상 살아있는 세포로 설정된 상기 PBMC의 FSC-SSC 표현을 도시한다. 게이팅된 세포는 항-CD5-PE-Cy5에 대한 항-CD19-VioBright515(도 2B 및 2E) 뿐만 아니라 mAb01-01-APC에 대한 항-CD19-VioBright515(도 2C 및 2F)를 갖도록 플롯팅된다. 도 2A 내지 2C는 IGHV4-39/IGLV3-21^R110-BCR을 발현하는 B-세포를 갖는 것으로 양성적으로 진단된 환자의 인간 PBMC의 분석을 도시하고, 도 2A 내지 2F는 CLL이 IGHV3-21^R110-BCR에 의해 특징화되지 않는(즉, 비-IGLV3-21^R110 CLL) 환자의 인간 PBMC의 동일한 분석을 도시한다. 도 2B와 2C의 비교에서 볼 수 있듯이, CD5/CD19⁺⁺ B-세포는 분해될 수 있었고 두 환자 샘플 간의 추가 비교(도 2C와 2F)는 mAb01-01이 IGLV3-21^R110-양성 CLL B-세포만을 선택적으로 식별하여, CLL 유형 간의 구별을 허용한다는 것을 보여준다.
도 3은 본 발명 및 실시예 7에 따른 항체 HC0-LC0, HC6-LC6 및 HC7-LC6의 비교 결합 동역학을 도시한다. 알 수 있는 바와 같이, 이들 3개의 항체는 본질적으로 동일한 결합 동역학을 나타내고 늦어도 10μg/ml 농도에서 거의 동등한 결합 특이성을 갖는다.
도 4는 실시예 8에 따라 항-IgG(오른쪽 열)로 단독으로 동일한 조직 샘플의 단독 처리에 대한 그러한 mAb01-01(샌드위치-검정)에 대한 항-IgG 및 mAb01-01로 염색된(왼쪽 열) 조직의 비교를 도시한다. 상단 행은 IGLV3-21^R110-양성인 CLL 환자의 조직 샘플에서의 각각의 결과를 나타내는 반면, 하단 행은 건강한 공여자 샘플에서의 결과를 나타낸다.
왼쪽 상단 사진과 왼쪽 열의 나머지 사진 모두의 비교로부터 mAb01-01이 질환이 있는 환자의 비장에서 질환이 있는 B-세포를 양성적으로 및 선택적으로 식별하고 동일한 조직(비장)이나 임의의 다른 조직 유형(피부, 신장, 심장 및 뇌)에 있지 않은 임의의 건강한 공여자의 샘플에 교차-반응성이 없다는 것을 알 수 있다. 이는 본 발명의 항체가 선택적이고 안전하고 비-교차-반응성임을 보여준다. 오른쪽 열의 추가 사진은 왼쪽 상단 사진에서 얻은 염색과 또한 왼쪽 열의 하단 사진에서 염색의 부족이 임의의 배경 또는 기타 인위적인 효과와 관련이 없음을 보여준다.
도 5는 실시예 9에 따른 실험의 종료 시 비장 내 CLL 세포의 절대수를 도시한다. 상기 실험에서 인공적으로 IGLV3-21^R110-양성 CLL을 앓고 있는 이종이식 마우스 모델을 (약학적 불활성) 대조군(그룹 A), mAb01-01의 양 0.3mg/kg(그룹 B), 양 5mg/kg(그룹 C) 및 10mg/kg(그룹 D) 체중으로 처리하였다. 이 도면에서 알 수 있듯이 모든 처리는 비장에서 CLL-세포의 고갈을 초래하는 반면, 10mg/kg에서 고갈은 매우 유의하다. 이것은 본 발명의 항체가 실제로 IGLV3-21^R110-양성 BCR을 특징으로 하는 CLL의 효과적인 치료를 촉진한다는 것을 보여준다.
도 6은 IGLV3-21^R110 경쇄의 BCR-BCR 동형 상호작용의 개략도를 도시한다(Minici et al.에 의해 기술됨). 2개의 인접하는 BCR은 중쇄(HC) 및 경쇄(LC), 막관통 도메인(TM)뿐만 아니라 Igα 및 Igβ 단백질의 이황화-연결된 헤테로이량체(CD79a/CD79b)로 구성된 시그널링 서브유닛(SU)을 포함하는 항원-결합 서브유닛으로 묘사된다. 하나의 BCR의 위치 110(R)에서 돌연변이된 아르기닌은 인접한 BCR의 위치 50에서 생식계열-암호화된 아스파르테이트(D)와 상호작용한다. 두 BCR 사이의 추가적인 상호작용은 위치 16에서 라이신(K)과 위치 52에서 아스파르테이트(D)인 생식계열-암호화된 아미노산 잔기에 의해 매개된다.
도 7은 IGLV3-21R¹¹⁰의 개략도를 도시한다. 도 7A: 예시적으로 일-문자 코드에서의 IGLV3-21^R110(서열번호: 53). Minici et al.에 따른 BCR-BCR 동형 상호작용에 관여하는 아미노산 잔기는 굵게 표시된다. 도 7B: 라인 1: IGLV3-21^R110의 아미노산 위치. 라인 2: Minici et al.에 따른 BCR-BCR 동형 상호작용에 관여하는 아미노산 잔기. 라인 3 내지 5: 비교에서 YDSD-모티프의 다양한 변형체. 아미노산은 3-문자 코드로 묘사된다.
본 발명은 하기 실시예에 의해 추가로 기술된다. 실시예는 특정 실시형태를 참조하여 발명을 예시하기 위해서만 제공된다. 이들 예시는 발명의 특정 양태를 예시하지만 개시된 발명의 한계를 표시하지 않고 그 범주를 제한하지 않는다.
달리 상세하게 기술된 경우를 제외하고, 모든 실시예는 당업계의 통상인에게 잘 알려져 있고 통상적인 표준 기술을 사용하여 수행되었다. 다음 실시예의 통상적인 분자 생물학 기술은 Sambrook et al., 1989 supra와 같은 표준 실험실 매뉴얼에 기술된 바와 같이 수행될 수 있다.
도 6은 IGLV3-21^R110 경쇄의 BCR-BCR 동형 상호작용의 개략도를 도시한다(Minici et al.에 의해 기술됨). 2개의 인접하는 BCR은 중쇄(HC) 및 경쇄(LC), 막관통 도메인(TM)뿐만 아니라 Igα 및 Igβ 단백질의 이황화-연결된 헤테로이량체(CD79a/CD79b)로 구성된 시그널링 서브유닛(SU)을 포함하는 항원-결합 서브유닛으로 묘사된다. 하나의 BCR의 위치 110(R)에서 돌연변이된 아르기닌은 인접한 BCR의 위치 50에서 생식계열-암호화된 아스파르테이트(D)와 상호작용한다. 두 BCR 사이의 추가적인 상호작용은 위치 16에서 라이신(K)과 위치 52에서 아스파르테이트(D)인 생식계열-암호화된 아미노산 잔기에 의해 매개된다.
도 7은 IGLV3-21R¹¹⁰의 개략도를 도시한다. 도 7A: 예시적으로 일-문자 코드에서의 IGLV3-21^R110(서열번호: 53). Minici et al.에 따른 BCR-BCR 동형 상호작용에 관여하는 아미노산 잔기는 굵게 표시된다. 도 7B: 라인 1: IGLV3-21^R110의 아미노산 위치. 라인 2: Minici et al.에 따른 BCR-BCR 동형 상호작용에 관여하는 아미노산 잔기. 라인 3 내지 5: 비교에서 YDSD-모티프의 다양한 변형체. 아미노산은 3-문자 코드로 묘사된다.

발명의 제1 양태 - 항체

본 발명의 항체는 IGLV3-21^R110을 수반하는 BCR에 대한 특이적 친화성을 갖고 대상체에게 치료적 이점을 전달할 수 있는 신규 뮤린 항체의 발견을 기반으로 한다. 치료적 활성을 가능하게 하는 항체 및 이의 유익한 특성은 이후에서 보다 상세히 기술된다.

뮤린, 인간화된 또는 키메라일 수 있는 발명의 항체는 본 명세서에서 더 충분하게 기술되는 많은 맥락에서 사용될 수 있다.

본 발명의 제1 양태에 따르면, 서열번호: 1의 중쇄 아미노산 서열과 서열번호: 2의 경쇄 아미노산 서열 또는 서열번호: 11의 중쇄 아미노산 서열과 서열번호: 12의 경쇄 아미노산 서열을 갖는 항체; 또는 서열번호: 16, 서열번호: 17, 서열번호: 18 및 서열번호: 19로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 갖는 가변 경쇄와 조합된 서열번호: 15 및 서열번호: 20으로 구성된 군으로부터 선택된 서열을 갖는 가변 중쇄를 포함하는 항체가 제공된다.

이들 항체는 뮤린, 인간화된 또는 키메라 항체일 수 있고 높은 친화성으로 IGLV3-21^R110-BCR에 특이적으로 결합한다.

상기에 요약된 바와 같이, 이들 항체는 IGLV3-21^R110-BCR을 강력하게 활성화시키는 것으로 여겨진다. 보다 구체적으로 이들 항체는 단기적으로 Syk, BTK 및 PI3K의 강력한 인산화를 야기하여, 세포자멸사를 유도하고 따라서 최종적으로 생체내에서 종양 성장을 억제한다.

본 발명의 제1 양태의 바람직한 실시형태는 실시예의 표 1 및 표 2에서 보다 상세히 추가로 특징되어 진다.

따라서 항체 "mAb01-01"은 본 발명의 제1 양태의 제1 바람직한 실시형태이며, 이는 서열번호: 1에 상응하는 중쇄 및 서열번호: 2에 상응하는 경쇄를 특징으로 한다.

따라서 항체 "HC0-LC0"은 본 발명의 제1 양태의 제2 바람직한 실시형태이며, 이는 서열번호: 11에 상응하는 중쇄 및 서열번호: 12에 상응하는 경쇄를 특징으로 한다.

따라서 항체 "HC6-LC6"은 본 발명의 제1 양태의 제3 바람직한 실시형태이며, 이는 서열번호: 15에 상응하는 가변 중쇄 영역 및 서열번호: 16에 상응하는 가변 경쇄 영역을 특징으로 한다.

본 발명의 제1 양태의 상기 제3 바람직한 실시형태 내에서, 서열번호: 13에 상응하는 중쇄 및 서열번호: 14에 상응하는 경쇄를 특징으로 하는 항체가 더욱 바람직하다.

따라서 항체 "HC6-LC7"은 본 발명의 제1 양태의 제4 바람직한 실시형태이며, 이는 서열번호: 15에 상응하는 가변 중쇄 영역 및 서열번호: 17에 상응하는 가변 경쇄 영역을 특징으로 한다.

발명의 제1 양태의 상기 제4 바람직한 실시형태 내에서, 서열번호: 13에 상응하는 중쇄 및 서열번호: 22에 상응하는 경쇄를 특징으로 하는 항체가 더욱 바람직하다.

따라서 항체 "HC6-LC8"은 본 발명의 제1 양태의 제5 바람직한 실시형태이며, 이는 서열번호: 15에 상응하는 가변 중쇄 영역 및 서열번호: 18에 상응하는 가변 경쇄 영역을 특징으로 한다.

발명의 제1 양태의 상기 제5 바람직한 실시형태 내에서, 서열번호: 13에 상응하는 중쇄 및 서열번호: 23에 상응하는 경쇄를 특징으로 하는 항체가 더욱 바람직하다.

따라서 항체 "HC6-LC9"는 본 발명의 제1 양태의 제6 바람직한 실시형태이며, 이는 서열번호: 15에 상응하는 가변 중쇄 영역 및 서열번호: 19에 상응하는 가변 경쇄 영역을 특징으로 한다.

본 발명의 제1 양태의 상기 제6 바람직한 실시형태 내에서, 서열번호: 13에 상응하는 중쇄 및 서열번호: 24에 상응하는 경쇄를 특징으로 하는 항체가 더욱 바람직한다.

따라서 항체 "HC7-LC6"은 본 발명의 제1 양태의 제7 바람직한 실시형태이며, 이는 서열번호: 20에 상응하는 가변 중쇄 영역 및 서열번호: 16에 상응하는 가변 경쇄 영역을 특징으로 한다.

발명의 제1 양태의 상기 제7 바람직한 실시형태 내에서, 서열번호: 21에 상응하는 중쇄 및 서열번호: 14에 상응하는 경쇄를 특징으로 하는 항체가 더욱 바람직하다.

따라서 항체 "HC7-LC7"은 본 발명의 제1 양태의 제8 바람직한 실시형태이며, 이는 서열번호: 20에 상응하는 가변 중쇄 영역 및 서열번호: 17에 상응하는 가변 경쇄 영역을 특징으로 한다.

발명의 제1 양태의 상기 제8 바람직한 실시형태 내에서, 서열번호: 21에 상응하는 중쇄 및 서열번호: 22에 상응하는 경쇄를 특징으로 하는 항체가 더욱 바람직하다.

따라서 항체 "HC7-LC8"은 본 발명의 제1 양태의 제9 바람직한 실시형태이며, 이는 서열번호: 20에 상응하는 가변 중쇄 영역 및 서열번호: 18에 상응하는 가변 경쇄 영역을 특징으로 한다.

발명의 제1 양태의 상기 제9 바람직한 실시형태 내에서, 서열번호: 21에 상응하는 중쇄 및 서열번호: 23에 상응하는 경쇄를 특징으로 하는 항체가 더욱 바람직하다.

따라서 항체 "HC7-LC9"는 본 발명의 제1 양태의 제10 바람직한 실시형태이며, 이는 서열번호: 20에 상응하는 가변 중쇄 영역 및 서열번호: 19에 상응하는 가변 경쇄 영역을 특징으로 한다.

발명의 제1 양태의 상기 제10 바람직한 실시형태 내에서, 서열번호: 21에 상응하는 중쇄 및 서열번호: 24에 상응하는 경쇄를 특징으로 하는 항체가 더욱 바람직하다.

발명의 제1 양태의 항체는 제공된 특정 펩티드 서열에 제한되지 않는다. 오히려, 발명은 또한 변형을 구현한다. 본 개시내용 및 통상적으로 이용가능한 기술 및 참고문헌을 참조하여, 숙련된 작업자는 IGLV3-21^R110-BCR에 결합하는 능력을 가지고 이에 의해 본 발명의 범주 내에 속하는 B-세포를 사멸시키는 이들 변이체를 인식하면서 본 명세서에 개시된 항체의 기능적 변이체를 제조, 시험 및 이용할 수 있을 것이다.

변이체는 예를 들어 본 명세서에 개시된 펩티드 서열에 관하여 적어도 하나의 변경된 상보적 결정 영역(CDR)(초가변성) 및/또는 프레임워크(FR)(가변성) 도메인/위치를 갖는 항체를 포함할 수 있다. 이 개념을 더 잘 예시하기 위해 항체 구조의 간략한 설명이 이어진다.

항체는 각각 1개(경쇄) 또는 3개(중쇄) 불변 도메인과 가변 영역(VL, VH)을 함유하는 2개의 펩티드 사슬로 구성되며, 후자는 각 경우에서 4개의 FR 영역과 3개의 간격을 둔 CDR(상보성 결정 영역)로 구성된다. 항원-결합 부위는 하나 이상의 CDR에 의해 형성되지만 FR 영역은 CDR에 대한 구조적 프레임워크를 제공하므로 항원 결합에서 중요한 역할을 수행한다. CDR 또는 FR 영역에서 하나 이상의 아미노산 잔기를 변경함에 의해, 숙련된 작업자는 일상적으로 돌연변이되거나 다양화된 항체 서열을 생성할 수 있다.

예로서, 숙련된 작업자는 본 발명의 범주 내에 있는 펩티드 변이체를 설계하기 위해 본 명세서에 제공된 항체의 서열(예를 들어, 표 1 및/또는 표 2의 것)을 사용할 수 있다.

더욱이, 변이체는 항체에서 하나 이상의 아미노산 잔기, 바람직하게는 하나 이상의 CDR에서 아미노산 잔기를 분기하고, 항체 변이체의 결과적인 집합체를 스크리닝함으로써 최적화를 위한 출발점으로서 발명의 제1 양태의 하나의 항체를 사용함으로써 얻어질 수 있다. 분기는 트리뉴클레오티드 돌연변이유발(TRIM) 기술(Virnekiis B. et al., Nucl. Acids Res. 1994, 22: 5600.)을 사용하여 DNA 분자의 집합체를 합성함으로써 수행될 수 있다. 항체는 예를 들어 변경된 반감기(예를 들어 Fe 부분의 변형 또는 PEG와 같은 추가 분자의 부착), 변경된 결합 친화성 또는 변경된 ADCC 또는 CDC 활성으로 이어지는 변형을 포함하지만 이에 제한되지 않는 변형/변이를 갖는 분자를 포함한다.

본 명세서에 기술된 항체 펩티드 서열의 전반적인 분자 구조를 보존하는 폴리펩티드 변이체가 만들어질 수 있다. 개별 아미노산의 특성이 주어지면 일부 합리적인 치환은 숙련된 작업자에 의해 인식될 것이다. 예를 들어, 아미노산 치환, "보존적 치환"은 관련된 잔기의 극성, 전하, 용해도, 소수성, 친수성 및/또는 양친매성 성질에서의 유사성에 기반하여 이루어질 수 있다.

예를 들어, (a) 비극성(소수성) 아미노산은 알라닌, 류신, 이소류신, 발린, 프롤린, 페닐알라닌, 트립토판 및 메티오닌을 포함하고; (b) 극성 중성 아미노산은 글리신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라긴 및 글루타민을 포함하고; (c) 양으로 하전된(염기성) 아미노산은 아르기닌, 라이신 및 히스티딘을 포함하고; (d) 음으로 하전된(산성) 아미노산은 아스파르트산 및 글루탐산을 포함한다. 치환은 전형적으로 그룹 (a)-(d) 내에서 이루어질 수 있다. 부가하여, 글리신과 프롤린은 α-나선을 파괴하는 그 능력에 기반하여 서로에 대해 치환될 수 있다. 유사하게, 알라닌, 시스테인, 류신, 메티오닌, 글루탐산, 글루타민, 히스티딘 및 라이신과 같은 특정 아미노산은 α-나선에서 더 공통적으로 발견되는 반면, 발린, 이소류신, 페닐알라닌, 티로신, 트립토판 및 트레오닌은 β-주름 시트에서 더 공통적으로 발견된다. 글리신, 세린, 아스파르트산, 아스파라긴 및 프롤린은 공통적으로 차례로 발견된다. 일부 바람직한 치환은 다음 그룹 중에서 이루어질 수 있다: (i) S 및 T; (ii) P 및 G; 및 (iii) A, V, L 및 I. 알려진 유전자 코드, 재조합 및 합성 DNA 기술이 주어지면 숙련된 과학자는 보존적 아미노산 변이체를 암호화하는 DNA를 쉽게 구축할 수 있다.

본 발명의 제1 양태에 따른 항체의 제3 내지 제10 바람직한 실시형태는 또한 서열번호: 15에 의해 제시된 바와 같은 가변 중쇄에 적어도 83.3%, 85%, 90%, 92%, 95% 서열이 동일하거나, 또는 서열번호: 20에 의해 제시된 바와 같은 가변 중쇄에 적어도 82.5%, 85%, 90%, 92%, 95% 서열이 동일한 가변 중쇄를 포함할 수 있다.

본 발명의 제1 양태에 따른 항체의 제3 내지 제10 바람직한 실시형태는 또한 서열번호: 16에 의해 제시된 바와 같은 가변 경쇄에 적어도 90%, 92%, 95% 서열이 동일하거나, 또는 서열번호: 17에 의해 제시된 바와 같은 가변 경쇄에 적어도 87%, 90%, 92%, 95% 동일하거나, 또는 서열번호: 18에 의해 제시된 바와 같은 가변 경쇄에 적어도 80.5%, 85%, 90%, 92%, 95% 서열이 동일하거나, 또는 서열번호: 19에 의해 제시된 바와 같은 가변 경쇄에 적어도 77.7%, 80%, 85%, 90%, 92%, 95% 서열이 동일한 가변 경쇄를 포함할 수 있다.

본 발명의 제1 양태에 따른 항체의 모든 바람직한 실시형태는 서열번호: 5(H-CDR 1), 서열번호: 6(H-CDR 2) 및 서열번호: 7(H-CDR 3)에 의해 표시되는 서열을 포함하는 가변 중쇄 서열을 서열번호: 8(L-CDR 1), 서열번호: 9(L-CDR 2), 서열 번호: 10(L-CDR 3)에 의해 표시되는 서열을 포함하는 가변 경쇄 서열과 조합한다.

발명의 제1 양태에 따른 항체는 바람직하게는 임의의 이소타입(예를 들어, IgG₁, IgG₂, IgG₃, IgG₄)의 IgG이다. 이들 각각의 항원-결합 단편은 예를 들어 Fab, Fab', F(ab')2 또는 scFv일 수 있다.

보다 바람직하게는, 본 발명의 제1 양태에 따른 항체는 IgG₁ 이소타입 항체로 발현되고, 더욱 더 바람직하게는 인간화된다.

본 발명의 제1 양태의 가장 바람직한 항체는 제2, 제3 및 제7 실시형태의 항체("HC0-LC0", "HC6-LC6" 및 "HC7-LC6")이며, 여기서 이들 중 가장 바람직한 항체는 제3 및 제7 실시형태의 항체("HC6-LC6" 및 "HC7-LC6")이다.

본 발명의 제1 양태의 전술한 바람직한 실시형태 모두는 K_D ~10^-10M의 범위에서 매우 높은 친화성을 표시하는 것으로 나타났기 때문에 특히 유리하며, 이는 CLL 환자의 다른 조직과 특이적으로, 선택적으로, 그리고 비-교차-반응성으로 IGLV3-21^R110-보유 BCR에 결합하여 악성 B-세포의 선택적 사멸을 가능하게 하는 본 발명의 유익한 양태를 초래한다.

가장 바람직한 항체("HC0-LC0", "HC6-LC6" 및 "HC7-LC6")와 관련하여, 이들은 단지 약 1.2 내지 2.1 10^-10M의 가장 높은 친화성을 나타낸다. 제3 및 제7 바람직한 실시형태에 따른 항체 "HC6-LC6" 및 "HC7-LC6"은 추가로 인간화되어, 이들을 그 감소된 면역원성으로 인해 치료적 사용에 대해 특히 적합하게 만든다.

발명의 제1 양태의 전술한 실시형태 모두는 IGLV3-21^R110에 선택적으로 결합한다. 상기 IGLV3-21^R110에 대해 제공된 정의를 넘어, 상기한 IGLV3-21^R110은 서열번호 53에 의해 표시되는 서열에 80% 초과의 서열 동일성을 추가로 특징으로 하는 발명의 제1 양태의 일반적으로 바람직한 실시형태이며, 여기서 상기 서열의 위치 16에는 라이신이 있고 위치 50 및 52에는 아스파르테이트가 있다. 발명의 제1 양태의 일반적으로 보다 바람직한 실시형태에서, 위치 49에는 티로신 또는 페닐알라닌이 있고 위치 51에는 세린 또는 트레오닌이 있다. 발명의 제1 양태의 일반적으로 더 바람직한 실시형태에서 위치 49에는 티로신이 있고 위치 51에는 세린이 있다.

발명의 제2 양태 - 치료 용도

본 발명의 제2 양태는 IGLV3-21^R110 양성 환자에서 CLL의 치료에 사용하기 위한 본 발명의 제1 양태의 항체의 제공에 관한 것이다. 마찬가지로, 본 발명의 이 제2 양태는 본 발명의 제1 양태의 항체의 치료적으로 활성인 양을 투여함으로써 IGLV3-21^R110 양성 환자에서 CLL를 치료하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 제2 양태의 제1 바람직한 실시형태에서, 따라서 항체는 서열번호: 1에 상응하는 중쇄 및 서열번호: 2에 상응하는 경쇄를 특징으로 한다.

본 발명의 제2 양태의 제2 바람직한 실시형태에서, 항체는 서열번호: 11에 상응하는 중쇄 및 서열번호: 12에 상응하는 경쇄를 특징으로 한다.

본 발명의 제2 양태의 제3 바람직한 실시형태에서, 항체는 서열번호: 15에 상응하는 가변 중쇄 영역 및 서열번호: 16에 상응하는 가변 경쇄 영역을 특징으로 한다.

상기 제3 바람직한 실시형태 내에서, 서열번호: 13에 상응하는 중쇄 및 서열번호: 14에 상응하는 경쇄를 특징으로 하는 항체가 더욱 바람직하다.

본 발명의 제2 양태의 제4 바람직한 실시형태에서, 항체는 서열번호: 15에 상응하는 가변 중쇄 영역 및 서열번호: 17에 상응하는 가변 경쇄 영역을 특징으로 한다.

상기 제4 바람직한 실시형태 내에서, 서열번호: 13에 상응하는 중쇄 및 서열번호: 22에 상응하는 경쇄를 특징으로 하는 항체가 더욱 바람직하다.

본 발명의 제2 양태의 제5 바람직한 실시형태에서, 항체는 서열번호: 15에 상응하는 가변 중쇄 영역 및 서열번호: 18에 상응하는 가변 경쇄 영역을 특징으로 한다.

상기 제5 바람직한 실시형태 내에서, 서열번호: 13에 상응하는 중쇄 및 서열번호: 23에 상응하는 경쇄를 특징으로 하는 항체가 더욱 바람직하다.

본 발명의 제2 양태의 제6 바람직한 실시형태에서, 항체는 서열번호: 15에 상응하는 가변 중쇄 영역 및 서열번호: 19에 상응하는 가변 경쇄 영역을 특징으로 한다.

상기 제6 바람직한 실시형태 내에서, 서열번호: 13에 상응하는 중쇄 및 서열번호: 24에 상응하는 경쇄를 특징으로 하는 항체가 더욱 바람직하다.

본 발명의 제2 양태의 제7 바람직한 실시형태에서, 항체는 서열번호: 20에 상응하는 가변 중쇄 영역 및 서열번호: 16에 상응하는 가변 경쇄 영역을 특징으로 한다.

상기 제7 바람직한 실시형태 내에서, 서열번호: 21에 상응하는 중쇄 및 서열번호: 14에 상응하는 경쇄를 특징으로 하는 항체가 더욱 바람직하다.

본 발명의 제2 양태의 제8 바람직한 실시형태에서, 항체는 서열번호: 20에 상응하는 가변 중쇄 영역 및 서열번호: 17에 상응하는 가변 경쇄 영역을 특징으로 한다.

상기 제8 바람직한 실시형태 내에서, 서열번호: 21에 상응하는 중쇄 및 서열번호: 22에 상응하는 경쇄를 특징으로 하는 항체가 더욱 바람직하다.

본 발명의 제2 양태의 제9 바람직한 실시형태에서, 항체는 서열번호: 20에 상응하는 가변 중쇄 영역 및 서열번호: 18에 상응하는 가변 경쇄 영역을 특징으로 한다.

상기 제9 바람직한 실시형태 내에서, 서열번호: 21에 상응하는 중쇄 및 서열번호: 23에 상응하는 경쇄를 특징으로 하는 항체가 더욱 바람직하다.

본 발명의 제2 양태의 제10 바람직한 실시형태에서, 항체는 서열번호: 20에 상응하는 가변 중쇄 영역 및 서열번호: 19에 상응하는 가변 경쇄 영역을 특징으로 한다.

상기 제10 바람직한 실시형태 내에서, 서열번호: 21에 상응하는 중쇄 및 서열번호: 24에 상응하는 경쇄를 특징으로 하는 항체가 더욱 바람직하다.

본 발명의 제1 양태의 맥락에서 언급된 바와 같이, 발명의 제2 양태의 상기 언급된 모든 실시형태는 매우 높은 친화성을 갖는 항체에 의존한다. 이들 중 어느 것도 약 0.3nm의 포획 속도에서 약 3ㆍ10^-10M 초과의 친화성을 갖지 않는다. 그것만으로도 본 발명의 제2 양태는 IGLV3-21^R110 양성인 환자에서 CLL의 매우 선택적인 치료를 가능하게 한다.

이제 이들 항체(도 1 참조)가 야생형 IGLV3-21^G110 변이체와 악성 IGLV3-21^R110 변이체를 선택적으로 구별할 수 있고 이종이식 마우스 모델에서 이들 항체로의 치료(도 5 및 실시예 9 참조)는 인간 IGLV3-21^R110-양성 B-세포의 현저한 고갈을 초래하여 CLL의 개선을 초래한다는 것이 추가로 입증되었다.

따라서 놀랍게도 IGLV3-21^R110-양성 환자에서 CLL의 치료에 사용하기 위한 항체가 효과적이라는 것이 밝혀졌다.

더욱이 이러한 치료에 사용된 항체는 다른 조직에 대한 교차-반응성을 나타내지 않는다는 것을 보여줄 수 있다(도 4, 실시예 8 참조).

그러한 항체의 유효 용량의 결정은 당업계의 통상인의 능력 내에 있다. 임의의 화합물에 대해, 치료적으로 유효한 용량은 세포 배양 검정, 예를 들어 신생물 세포 또는 동물 모델, 일반적으로 마우스, 토끼, 개, 돼지 또는 원숭이에서 초기에 추정될 수 있다. 동물 모델은 또한 바람직한 농도 범위 및 투여 경로를 달성하기 위해 사용된다. 그런 다음 이러한 정보를 사용하여 인간에게 유용한 용량과 투여에 대한 경로를 결정할 수 있다.

치료적으로 유효한 용량은 치료되는 증상 또는 병태를 개선하는 항체의 양을 지칭한다. 본 발명의 맥락에서, 치료되는 이러한 병태는 자율적으로 활성인 BCR을 갖는 B-세포의 비정상적인 증식에 의해 야기되는 임상적으로 명백한 CLL이다. 보다 구체적으로 본 발명의 제2 양태는 IGLV3-21^R110을 보유하는 자율적으로 활성인 BCR을 갖는 B-세포의 비정상적인 증식을 특징으로 하는 임상적으로 명백한 CLL을 다룬다.

발명의 제2 양태의 전술한 모든 실시형태는 IGLV3-21^R110 양성인 환자에서 CLL의 치료에 관한 것이다. 상기 IGLV3-21^R110에 대해 제공된 정의를 넘어, 상기한 IGLV3-21^R110은 서열번호 53에 의해 표시되는 서열에 80% 초과의 서열 동일성을 추가로 특징으로 하는 발명의 제2 양태의 일반적으로 바람직한 실시형태이며, 여기서 상기 서열의 위치 16에는 라이신이 있고 위치 50 및 52에는 아스파르테이트가 있다. 발명의 이 제1 양태의 일반적으로 보다 바람직한 실시형태에서, 위치 49에는 티로신 또는 페닐알라닌이 있고 위치 51에는 세린 또는 트레오닌이 있다. 발명의 이 제1 양태의 일반적으로 더 바람직한 실시형태에서 위치 49에는 티로신이 있고 위치 51에는 세린이 있다.

치료적으로 유효한 양은 따라서 - 단일 용량으로 또는 다중 용량 요법에 따라 환자의 치료된 부위에서 IGLV3-21^R110-양성 CLL 세포를 고갈시키기에 충분한 양인 항체의 양이지만, 그 양은 독성학적으로 견딜 수 있는 양이다.

발명의 제2 양태에서 IGLV3-21^R110 양성 환자에서 CLL의 치료에 사용하기 위한 항체는 바람직하게는 0.25 내지 25mg/_체중kg, 보다 바람직하게는 1 내지 20mg/_체중kg, 가장 바람직하게는 7 초과 내지 15mg/_체중kg, 특히 바람직하게는 8 내지 12mg/_체중kg의 용량으로 이용되는 것이다.

이들 복용량은 매우 적어서, 악성 B-세포의 강력한 고갈을 달성하기 위해 특히 바람직하게는 640 내지 960mg 미만의 약 80kg의 평균 인간 환자에게 가정적으로 투여되는 전반적인 약물 양을 초래한다.

정확한 복용량은 치료되는 환자의 관점에서 개별 의사에 의해 선택된다. 복용량 및 투여는 충분한 수준의 활성인 모이어티를 제공하거나 원하는 효과를 달성하도록 조정된다. 그러나 본 발명에 의해 0.3mg/kg 이하의 주 2회 복용량이 이종이식 마우스 모델에서 이미 효과적인 반면, 악성 세포의 강력한 고갈은 10mg/kg의 복용량(주 2회)에서 달성될 수 있음이 밝혀졌다.

본 발명의 제2 양태에 따라 항체를 투여할 때, 질환 상태의 중증도, 예를 들어 종양 크기 및 위치; 환자의 나이, 체중, 성별 및 식이요법을 포함할 수 있는 부가 요인이 또한 고려될 수 있다. 적절한 용량을 결정하는 추가 영향 요인은 약물 조합(들), 반응 민감성 및 치료에 대한 내성/반응일 수 있다.

더욱이, 투약은 1회 초과로 수행될 수 있고 투여의 시간 및 빈도는 투여되는 개별 복용량에 추가로 영향을 미칠 수 있다.

본 발명의 제2 양태에 따르면, 항체는 또한 공지된 약제와 공동-투여될 수 있다. 따라서 이들은 단독 약학적 제제로서 또는 조합이 허용할 수 없는 역효과를 야기하지 않는 경우 하나 이상의 추가 치료제와 조합하여 투여될 수 있다. 이 병용 요법은 발명의 제1 양태에 따른 항체 및 하나 이상의 추가 치료제를 함유하는 단일 약학적 복용량 제형의 투여뿐만 아니라 발명의 제1 양태의 항체 및 각각의 추가 치료제를 그 자체 별도의 약학적 복용량 제형으로의 투여를 포함한다.

별도의 복용량 제형이 사용되는 경우, 하나 이상의 추가 치료제와 함께 본 발명의 제2 양태에 따른 치료는 본질적으로 동일한 시간에(예를 들어, 동시에) 또는 개별적으로 엇갈린 시간에(예를 들어, 순차적으로) 수행될 수 있다. 특히, 본 발명에 따른 치료는 알킬화제, 항-대사제, 식물-유래된 항-종양제, 호르몬 요법제, 토포이소머라제 억제제, 캄프토테신 유도체, 키나아제 억제제, 표적화된 약물, 항체, 인터페론 및/또는 생물학적 반응 조절제, 항-혈관신생 화합물 및 기타 항-종양 약물과 같은 다른 항-종양제와 고정 또는 별도의 조합으로 수행될 수 있다.

본 발명의 항체는 또한 방사선 요법 및/또는 외과적 개입과 병용하여 암 치료에 이용될 수 있다.

제3 양태 - 폴리뉴클레오티드

본 발명은 또한 발명의 제1 양태의 항체를 암호화하는 DNA 분자에 관한 것이다.

발명의 DNA 분자는 본 명세서에 개시된 서열에 제한되지 않지만, 또한 그의 변이체를 포함한다. 발명 내의 DNA 변이체는 혼성화에서 그의 물리적 특성을 참조하여 기술될 수 있다. 숙련된 작업자는 DNA가 그 상보체 및, DNA가 이중 가닥이기 때문에, 핵산 혼성화 기술을 사용하여 그의 등가물 또는 상동체를 식별하는데 사용될 수 있음을 인식할 것이다. 또한 혼성화는 100% 미만의 상보성으로 발생할 수 있음을 인식할 것이다. 그러나, 조건의 적절한 선택이 주어지면 혼성화 기술을 사용하여 특정 프로브에 대한 그 구조적 관련성에 기반하여 DNA 서열 중에서 차별화할 수 있다. 이러한 조건에 관한 지침은 Sambrook, J., Fritsch, E. F. 및 Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, USA 및 Ausubel et al., 1995 (Ausubel, F. M., Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D. D., Sedman, J. G., Smith, J. A., & S1ruhl, K. eds. (1995). Current Protocols in Molecular Biology. New York: John Wiley and Sons)를 참조한다.

2개의 폴리뉴클레오티드 서열 사이의 구조적 유사성은 2개의 서열이 서로 혼성화하는 조건의 "엄격성"의 함수로 표현될 수 있다. 본 명세서에서 사용된 용어 "엄격성"은 조건이 혼성화를 선호하지 않는 정도를 지칭한다. 엄격한 조건은 혼성화를 매우 선호하지 않고 가장 구조적으로 관련된 분자만이 이러한 조건 하에서 서로 혼성화할 것이다. 반대로, 비-엄격한 조건은 보다 낮은 정도의 구조적 관련성을 나타내는 분자의 혼성화를 선호한다. 따라서, 혼성화 엄격성은 두 핵산 서열의 구조적 관계와 직접적으로 상호관련된다. 다음 관계는 혼성화와 관련성을 상호연관시키는데 유용하다(여기서 Tm은 핵산 듀플렉스의 녹는 온도임):

a. T_m= 69.3 + 0.41(G+C)%

b. 듀플렉스 DNA의 T_m은 불일치된 염기쌍의 수에서 1% 증가할 때마다 1℃씩 감소한다.

c. (T_m)μ2- (T_m)μ1 = 18.5 log₁₀μ2/μ1

여기서 μ1과 μ2는 두 용액의 이온 강도임.

혼성화 엄격성은 전반적인 DNA 농도, 이온 강도, 온도, 프로브 크기 및 수소 결합을 방해하는 작용제의 존재를 포함하는 많은 요인의 함수이다. 혼성화를 촉진하는 요인은 높은 DNA 농도, 높은 이온 강도, 낮은 온도, 더 긴 프로브 크기 및 수소 결합을 방해하는 작용제의 부재를 포함한다. 혼성화는 전형적으로 "결합" 단계와 "세척" 단계인 두 단계에서 수행된다.

발명의 범주 내의 DNA 변이체의 또 다른 클래스는 그들이 암호화하는 생성물과 관련하여 기술될 수 있다. 이들 기능적으로 동등한 폴리뉴클레오티드는 유전자 코드의 축퇴에 기인하여 서열번호: 1 내지 24에서 발견되는 동일한 펩티드 서열을 암호화한다는 사실을 특징으로 한다.

본 명세서에 제공된 DNA 분자의 변이체는 여러 가지 다른 방식으로 구축될 수 있음이 인식된다. 예를 들어, 그것은 완전하게 합성된 DNA로 구축될 수 있다. 20 내지 약 150개 뉴클레오티드의 범위에서 올리고뉴클레오티드를 효율적으로 합성하는 방법이 널리 이용가능하다. Ausubel et al., section 2.11, Supplement 21(1993)을 참조한다. 중첩하는 올리고뉴클레오티드는 Khorana et al., J. Mol. Biol. 72:209-217 (1971)에 의해 처음 보고된 양식으로 합성되고 조립될 수 있으며; 또한 Ausubel et al., supra, Section 8.2를 참조한다. 합성 DNA는 바람직하게는 적절한 벡터로의 클로닝을 용이하게 하기 위해 유전자의 5' 및 3' 말단에서 조작된 편리한 제한 부위로 디자인된다.

나타낸 바와 같이, 변이체를 생성하는 방법은 본 명세서에 개시된 DNA 중 하나로 시작한 다음 부위-지정된 돌연변이유발을 수행하는 것이다. Ausubel et al., supra, Chapter 8, Supplement 37(1997)을 참조한다. 전형적인 방법에서, 표적 DNA는 단일-가닥의 DNA 박테리오파지 비히클 안으로 클로닝된다. 단일-가닥의 DNA를 단리하고 원하는 뉴클레오티드 변경(들)을 함유하는 올리고뉴클레오티드와 혼성화한다. 상보적인 가닥이 합성되고 이중 가닥의 파지가 숙주 안으로 도입된다. 생성된 자손 중 일부는 DNA 시퀀싱을 사용하여 확인될 수 있는 원하는 돌연변이체를 함유할 것이다. 부가하여, 자손 파지가 원하는 돌연변이체가 될 확률을 높이는 다양한 방법이 이용가능하다. 이들 방법은 당업자에게 잘 알려져 있으며 키트는 이러한 돌연변이체를 생성하기 위해 상업적으로 이용가능하다.

본 발명의 제1 양태와 마찬가지로, 발명의 제3 양태의 상응하는 바람직한 실시형태가 또한 있다.

본 발명의 제3 양태의 제1 바람직한 실시형태에서, 본 발명은 서열번호: 25, 서열번호: 29, 서열번호: 33 및 서열번호: 38로 구성된 군으로부터 선택된 임의의 서열에 의해 표시되는 본 발명의 제1 양태의 바람직한 항체 중 하나의 중쇄를 암호화하는 DNA 분자에 관한 것이다.

본 발명의 제3 양태의 제2 바람직한 실시형태에서, 본 발명은 서열번호: 26, 서열번호: 30, 서열번호: 34, 서열번호: 35, 서열번호: 36 및 서열번호: 37로 구성된 군으로부터 선택된 임의의 서열에 의해 표시되는 본 발명의 제1 양태의 바람직한 항체 중 하나의 경쇄를 암호화하는 DNA 분자에 관한 것이다.

발명의 핵산은 발명의 핵산 서열을 함유하는 표준 벡터 및 숙주 세포를 사용하여 항체의 재조합 생산에 적합하다.

발명의 추가 양태

본 발명의 제2 양태에서 사용되는 본 발명의 제1 양태의 항체는 공지된 약제와 공동-투여될 수 있다. 예를 들어, 항체는 임의의 일반 항-B 세포 항체와 공동-투여될 수 있다.

본 발명은 또한 발명의 제2 양태과 유사하게 사용될 수 있는 발명의 제1 양태의 임의의 실시형태에 따른 항체를 포함하는 조성물에 관한 것이다.

따라서, 발명은 발명의 제1 양태에 따른 항체를 단독으로 또는 적어도 하나의 다른 작용제 및 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제와 조합하여 포함하는 약학적 조성물을 포함한다.

다른 작용제는 예를 들어 안정화 화합물일 수 있고 그러한 적어도 하나의 다른 작용제 및 발명의 제1 양태에 따른 항체는 식염수, 완충 식염수, 덱스트로스 및 물을 포함하지만 이에 제한되지 않는 임의의 멸균, 생체적합성 약학적 담체로 투여될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 당업계에 공지된 방식, 예를 들어 통상적인 혼합, 용해, 유화, 캡슐화, 포획 또는 동결건조 공정에 의해 제조될 수 있다.

바람직한 약학적 조성물은 사용 이전에 완충액과 조합된 4.5 내지 5.5의 pH 범위에서 1mM-50mM 히스티딘, 0.1%-2% 수크로스, 2%-7% 만니톨 내 발명의 제1 양태에 따른 항체의 동결건조된 분말로부터 구성된다.

허용가능한 담체에 제형화된 발명의 항체를 포함하는 약학적 조성물이 제조된 후, 그것은 적절한 용기에 위치되고 지시된 병태의 치료에 대해 표지될 수 있다.

결과적으로, 관련된 양태에서, 본 발명은 또한 IGLV3-21^R110 양성 환자에서 CLL의 사용을 위한 이러한 약학적 조성물에 관한 것이다. 마찬가지로, 본 발명의 이 관련된 양태는 치료적으로 활성인 양의 상기 그러한 약학적 조성물을 투여함에 의해 IGLV3-21^R110 양성 환자에서 CLL의 치료의 방법에 관한 것이다.

이러한 투여는 일반적으로 비경구적으로 성취된다. 비경구 전달의 방법은 국소, 동맥-내(종양에 직접적으로), 근육내, 피하, 골수내, 척수강내, 심실내, 정맥내, 복강내 또는 비강내 투여를 포함한다.

바람직한 투여의 경로는 정맥내 및 동맥내 투여(종양에 직접으로)이다.

비경구 투여용 약학적 조성물은 활성 화합물의 수성 용액을 포함한다. 주사용으로, 발명의 약학적 조성물은 수성 용액, 바람직하게는 행크 용액, 링거 용액 또는 생리학적으로 완충된 식염수와 같은 생리학적으로 적합한 완충액에 제형화될 수 있다. 수성 주사 현탁액은 나트륨 카르복시메틸 셀룰로오스, 소르비톨 또는 덱스트란과 같은 현탁액의 점도를 증가시키는 물질을 함유할 수 있다. 추가로, 활성 화합물의 현탁액은 적절한 유성 주사 현탁액으로 제조될 수 있다. 적합한 친유성 용매 또는 비히클은 참기름과 같은 지방 오일, 또는 에틸 올레이트 또는 트리글리세리드와 같은 합성 지방산 에스테르, 또는 리포좀을 포함한다. 선택적으로, 현탁액은 고도로 농축된 용액의 제조를 가능하게 하기 위해 화합물의 용해도를 증가시키는 적절한 안정제 또는 작용제를 함유할 수도 있다.

국소 투여 또는 비강 투여를 위해, 투과되는 특정 장벽에 적합한 침투제가 제형에 사용된다. 이러한 침투제는 일반적으로 당업계에 공지되어 있다.

발명은 또한 전술한 발명의 조성물의 하나 이상의 성분으로 충진된 하나 이상의 용기를 포함하는 약학적 팩 및 키트에 관한 것이다. 이러한 용기(들)에는 약학적 또는 생물학적 생성물의 제조, 사용 또는 판매를 규제하고, 인간 투여를 위한 생성물의 제조, 사용 또는 판매의 기관에 의한 승인을 반영하는 정부 기관에서 규정한 형식의 통지가 연관될 수 있다.

다른 실시형태에서, 키트는 발명의 제3 양태에 따른 항체를 암호화하는 DNA 서열을 함유할 수 있다. 바람직하게는 이들 항체를 암호화하는 DNA 서열은 숙주 세포로의 형질전환 및 이에 의한 발현에 적합한 플라스미드에 제공된다. 플라스미드는 숙주 세포에서 DNA의 발현을 조절하기 위한 프로모터(종종 유도성 프로모터)를 함유할 수 있다. 플라스미드는 또한 다양한 항체를 생산하기 위해 플라스미드 안으로 다른 DNA 서열의 삽입을 용이하게 하는 적절한 제한 부위를 함유할 수 있다. 플라스미드는 또한 암호화된 단백질의 클로닝 및 발현을 용이하게 하는 다수의 다른 요소를 함유할 수 있다. 이러한 요소는 당업계의 통상인에게 잘 알려져 있고, 예를 들어 선별 마커, 개시 코돈, 종결 코돈 등을 포함한다.

따라서 발명은 더욱이 IGLV3-21^R110 양성 환자에서 CLL의 치료에 사용하기 위한 발명의 전술한 조성물의 성분 중 하나 이상으로 충진된 하나 이상의 용기를 포함하는 전술한 팩 및 키트에 관한 것이다.

발명의 바람직한 실시형태는 다음과 같다:

A. IGLV3-21^R110 양성 환자에서 CLL의 치료에 사용하기 위한 항체로서, 여기서 상기 항체는

서열번호: 1의 중쇄 아미노산 서열 및 서열번호: 2의 경쇄 아미노산 서열; 또는

서열번호: 11의 중쇄 아미노산 서열 및 서열번호: 12의 경쇄 아미노산 서열을 갖거나; 또는

서열번호: 16, 서열번호: 17, 서열번호: 18 및 서열번호: 19으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 갖는 가변 경쇄와 조합된 서열번호: 15 및 서열번호: 20으로 구성된 군으로부터 선택된 서열을 갖는 가변 중쇄를 포함함.

B. 실시형태 A에 따른, 서열번호: 1에 상응하는 중쇄 및 서열번호: 2에 상응하는 경쇄를 특징으로 하는, 항체.

C. 실시형태 A에 따른, 서열번호: 11의 중쇄 아미노산 서열 및 서열번호: 12의 경쇄 아미노산 서열을 특징으로 하는, 항체.

D. 실시형태 A에 따른, 서열번호: 13에 상응하는 중쇄 및 서열번호: 14에 상응하는 경쇄를 특징으로 하는, 항체.

E. 실시형태 A에 따른, 서열번호: 21에 상응하는 중쇄 및 서열번호: 14에 상응하는 경쇄를 특징으로 하는, 항체.

F. 실시형태 A 또는 C에 따른, 키메라인, 항체.

G. 실시형태 D 및 E에 따른, 인간화된, 항체.

H. 전술한 실시형태 중 어느 하나에 따른, 항체가 0.25 내지 25mg/_체중kg의 용량으로 적용되는, 항체.

I. 실시형태 H에 따른, 항체가 1 내지 20mg/_체중kg의 용량으로 적용되는, 항체.

J. 실시형태 H에 따른, 항체가 7 내지 15mg/_체중kg의 용량으로 적용되는, 항체.

K. 실시형태 H에 따른, 항체가 8 내지 12mg/_체중kg의 용량으로 적용되는, 항체.

L. IGLV3-21^R110 양성 환자에서 CLL의 치료에 사용하기 위한, 전술한 실시형태 A 내지 G 중 어느 하나에 따른 항체를 단독으로 또는 적어도 하나의 다른 작용제 및 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제와 조합하여 포함하는 약학적 조성물.

M. IGLV3-21^R110 양성 환자에서 CLL의 치료에 사용하기 위한, 실시형태 L에 따른 약학적 조성물을 포함하는 키트.

발명의 바람직한 실시형태는 다음과 같다:

실시예

실시예 1

뮤린 항체의 생성

하이브리도마 세포주의 면역화 및 생성

IGLV3-21^R110-보유 BCR에 대한 뮤린 항체는 수용성 형태의 BCR로 마우스의 면역화와 완전하고 기능적인 BCR이 막 결합되어 제시된 세포 시스템을 사용한 적합한 항체의 선별의 조합에 의해 개발되었다.

처음에는 마우스의 면역화를 위해 IgG₁의 형태에서 가용성 형태의 BCR을 획득해야 했다. 따라서, 예시적인 가변 중쇄(VH)로서 IGHV3-21을 암호화하는 DNA 세그먼트 및 IGLV3-21^R110을 포괄하는 완전한 경쇄(LC) DNA는 표준 절차를 사용하여 계약 제조자에 의해 합성되었다. 그런 다음 이들은 중합효소 연쇄 반응(PCR)에 의해 뮤린 IgG₁ 불변 세그먼트와 융합되고 사이토메갈로바이러스(CMV) 벡터 안으로 클로닝되었다. HEK293T 세포에 기반한 인간 세포 발현 시스템은, 예를 들어, Rekombinante Antikrper, Lehrbuch und Kompendium f

r Studium und Praxis, 2. Auflage, Springer Verlag 2019에서 이전에 기술된 바와 같이 이러한 IgG₁(VH의 경우 서열번호: 49, 및 LC의 경우 서열번호: 50)의 발현을 위해 사용되었다. 폴리에틸렌이민(PEI) 기반 프로토콜이 형질감염에 사용되었다. 여러번 계대 후, 상등액을 모으고 조합된 세포 상등액에 함유된 배지를 단백질 G 컬럼을 사용하여 정제하였다. 가용성 IgG₁의 순도 및 품질은 웨스턴 블로팅으로 결정되었다.

그 후, BCR의 재조합적으로 생성된 가용성 형태(참조: 서열번호: 49 및 50)로 마우스를 면역화하였다.

그런 다음 원하는 특이성을 가진 면역 세포가 이들 마우스로부터 획득될 수 있고 세포 융합에 의해 하이브리도마 세포로 형질전환될 수 있다. 둘째, FACS 스크리닝 방법이 IGLV3-21^R110을 보유하는 BCR을 특이적으로 표적으로 하는 항체를 선택하기 위해 BCR에 대한 다양한 변이체를 발현하는 삼중 녹아웃 세포(TKO; 유전자 Lambda5, RAG2 및 SLP65에 대한 녹아웃)로 수행되었다.

모노클로날 항체는 마우스와 하이브리도마 세포의 후속 세대에서 표준 절차를 사용하여 생산되었다.

이 접근방식은 독특한 모노클로날 항체 "mAb01-01"(중쇄의 경우 서열번호: 1, 경쇄의 경우 서열번호: 2)의 단리를 가능하게 했다.

모노클로날 항체의 선택

양성 클론에 대한 스크리닝은 평소와 같은 효소 연결된 면역흡착 검정(ELISA)에 의해 수행되지 않았다. 표적 구조는 막-결합된 수용체이기 때문에, 즉 이 세포 유형에 고유한 세포 생리학적 상태를 크게 보존하면서, 세포 시스템에서 잠재적인 항체의 결합을 검증하는 것이 가장 중요한 것이다. 먼저, 모아진 상등액의 그룹을 형광 활성화된 세포 분류(FACS) 분석을 사용하여 결합 이벤트에 대해 검사했다. 이 목적을 위해 BCR 자체를 발현할 수 없는 삼중 녹아웃(TKO) 세포주의 표면에 상이한 BCR 변이체가 발현되었다.

TKO 세포의 생산을 위한 출발점은 Lambda5, RAG1 또는 RAG2 및 SLP65 유전자에 대한 각각의 녹아웃을 갖는 이식유전자 마우스에 의해 형성된다(D

hren von Minden et al., 2012, Nature 489, p. 309-313). RAG2 또는 RAG1과 Lambda5의 녹아웃 조합은 pro-B 세포 단계에서 pre-B 세포 단계로의 전이에서의 차단을 야기하며, 이는 고전적으로 중쇄(HC)의 VDJ 세그먼트의 초기 재배열을 특징으로 한다. 따라서 이들은 pro-/pre-B 세포이다. BCR의 활성은 유도성 SLP65로 재구성에 의해 측정될 수 있다. 이러한 마우스의 생산은 전문가에게 알려져 있고 최신 기술에 속한다. 세포를 획득하기 위해 마우스를 희생시킨 후 대퇴골의 골수를 적출하였다. 이 방식으로 획득된 세포는 그 다음 pro-/pre-B 세포의 생존을 촉진하는 조건(37℃, 7.5% CO2, Iscoves 배지, 10% FCS, P/S, 뮤린 IL7) 하에서 배양되었다. 여러번 계대 후, 대조 목적을 위해 FACS 분류를 수행하고, pro-/pre-B 세포를 분류한 다음 배양물로 복귀시켰다. 이 목적을 위해 사용된 마커는 전문가에게 알려져 있다.

'관심있는 BCR'로 재구성을 위해, VH에 대해 서열 코딩에 상응하는 서열을 중합효소 연쇄 반응(PCR)에 의해 인간 IgM 불변 세그먼트와 융합시키고, 중쇄(HC) 및 경쇄(LC)를 각각 CMV 프로모터를 갖는 각각의 발현 벡터 안으로 클로닝하였다. 이들은 리포펙션에 의해 패키징 세포주(Phoenix cell line) 안으로 도입되었다. 36시간의 인큐베이션 후, 바이러스 상등액을 제거하고 TKO 세포의 스핀펙션에 사용하였다. BCR 발현은 FACS에서 항-IgM 및 항-LC 항체를 사용하여 결정되었다. 이 목적을 위해, 일부 세포를 취하여 PBS에서 총 부피 100μl 중 항체 5μl로 각각 염색했다. 상등액을 추출하는 작업과 TKO의 스핀펙션 둘 모두는 널리 알려진 절차이고 전문가에게 알려져 있다. RAG2 또는 RAG1 및 Lambda5의 녹아웃은 "관심있는 BCR"만이 표면 상에 발현되도록 보장했다.

이 방식에서, 2개의 다른 BCR-발현 TKO 세포주가 생성되었으며, 그 중 하나는 막-결합 IGHV3-21/IGLV3-21^R110 BCR을 발현했다. 제2 BCR-발현 TKO 세포주의 생성을 위해, IGLV3-21^R110을 암호화하는 DNA의 위치 110에서의 아르기닌에 대한 코돈은 잘 알려진 부위-지정된 돌연변이유발 기술(예를 들어 Sambrook et al., 1989 supra 참조)에 의해 생식계열 서열로 복귀되었다. 결과적인 TKO 세포는 아미노산 위치 110에 글리신을 갖는 IGLV3-21(IGLV3-21^G110)을 함유하는 BCR을 발현했다. 그 표면 상에 BCR 발현이 없는 세 번째 대조군 TKO 세포주를 생성하기 위해, 빈 발현 벡터로 스핀펙션을 수행했다. 유도성 SLP65를 사용하여 세포를 재구성함으로써 발현된 BCR의 기능을 특성화할 수 있고 표면 상의 IGHV3-21/IGLV3-21^R110 BCR의 자율적으로 활성인 상태를 따라서 선택 전에 확인할 수 있었다. 여기에 선택의 방법은 FACS 분석을 사용한 SLP65를 유도 및 Indo-1과 같은 Ca²⁺ 의존 염료의 사용 후 Ca-플럭스의 측정이다. 이들 방법은 전문가에게 알려져 있다(M. D

hren-von Minden et. al; Nature 2012 참조). 이들 세포를 "표적"으로 하여 FACS는 이제 IGLV3-21^R110-보유 BCR에 특이적으로 결합하는 항체를 식별하는데 사용되었다. 제1 단계는 그 항체가 결합을 나타내는 상등액을 식별하는 것이었다. 이 1차 선별 라운드에서, 여러 클론의 상등액을 조합하고 그 결합 프로필에 관하여 검사했다. IGHV3-21/IGLV3-21^R110-BCR에 대한 특이적 결합이 나타나면 양성 결합 프로필이 제공된다. 이러한 프로필을 나타내는 그룹을 단리하고 개별 클론의 결합 프로필을 제2 선별 라운드 동안 다시 특성화했다. 모노클로날 항체의 결합은 형광으로 표지된 항-마우스 IgG 항체를 사용하는 FACS 결합 검정을 사용하여 검증하였다.

이 선별 접근방식은 IGHV3-21/IGLV3-21^R110 BCR 양성 TKO 마우스 세포에 결합하지만 IGHV3-21/IGLV3-21^G110 BCR 양성 TKO 마우스 세포에는 결합하지 않는 항체 mAb01-01의 식별을 유도했다.

뮤린 항체의 생산

선별에 의해 바람직한 항체의 식별 후, mRNA를 개별 하이브리도마 클론으로부터 단리하고, cDNA를 생성하고 앵커 PCR에 의해 증폭하였다(Rapid expression cloning of human immunoglobulin Fab fragments for the analysis of antigen specificity of B cell lymphomas and anti-idiotype lymphoma vaccination; Osterroth F, Alkan O, Mackensen A, Lindemann A, Fisch P, Skerra A, Veelken H. J Immunol Methods 1999 Oct 29; 229(1-2):141-53). 모노클로날 항체 mAb01-01을 암호화하는 cDNA의 서열을 생어 시퀀싱에 의해 확인하고(HC 뉴클레오티드의 경우 서열번호: 25, LC 뉴클레오티드의 경우 서열번호: 26) CHO 세포에서 발현에 적합한 벡터 안으로 배치했다.

IgG1 서브타입으로서 mAb01-01의 발현은 2차 항-뮤린 IgG1-APC 및 IgG2-APC 항체를 사용하여 검증되었다. 이 목적을 위해, IGHV3-21/IGLV3-21^R110-발현 TKO 세포를 2차 항체 단독으로 한 배치에서 염색하고 mAb01-01 및 2차 항체로 다른 배치에서 염색했다. 후속 FACS 분석은 항체가 IgG1로 발현되었음을 확인했다.

특정 모노클로날 항체 mAb01-01을 시퀀싱했다. 다음 아미노산 서열을 표 1에 묘사된 바와 같이 결정하였다: HC에 대한 서열번호: 1, LC에 대한 서열번호: 2, VH에 대한 서열번호: 3, VL에 대한 서열번호: 4. 중쇄의 상보성 결정 영역(CDR)에 상응하는 서열인 H-CDR1, H-CDR2 및 H-CDR3은 서열번호: 5, 6 및 7에 포함되는 반면, 경쇄 CDR에 상응하는 서열인 L-CDR1, L-CDR2 및 L-CDR3은 서열번호: 8, 9 및 10에 포함된다.

실시예 2

키메라 항체의 생성

뮤린 모노클로날 항체 mAb01-01 VH 및 VL 뉴클레오티드 서열(VH 뉴클레오티드에 대한 서열번호: 27, VL 뉴클레오티드에 대한 서열번호: 28)을 사용하여 키메라 항체를 합성하였다. 이 목적을 위해, VH 서열은 인간 IgG1 이소타입 불변 도메인 서열(IgG1 불변 뉴클레오티드에 대한 서열번호: 31)과 융합되었고 VL 서열은 PCR에 의해 인간 IgK 이소타입 불변 도메인(IgK 불변 뉴클레오티드에 대한 서열번호: 32)과 융합되었고 CHO 기반 일시적 발현 시스템을 사용하여 발현되었다. 결과적인 항체 함유 세포 배양 상등액은 원심분리 및 여과에 의해 정화되었다. 키메라 항체는 친화성 크로마토그래피를 통해 세포 배양 상등액으로부터 정제되었다. 항체의 순도는 소듐 도데실 설페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)을 환원하고 변성함으로써 판단된 바와 같이 >95%인 것으로 결정되었다. 항체는 PBS-완충액에서 사이즈 배제 크로마토그래피(SEC)를 통해 단백질 함량 및 농도에 대해 분석되었다. 모든 단계는 최첨단 장비와 기술로 수행되었다.

이 접근방식은 키메라 항체 "HC0-LC0"을 초래하였고, 그의 서열은 표 1에 요약되어 있다.

표 1: 뮤린 및 키메라 항체의 서열

실시예 3

인간화된 항체의 생성

mAb01-01의 인간화는 북아일랜드 밸파스트 소재의 Fusion Antibodies Plc에 의한 표준 CDR-이식 기술을 사용하여 뮤린 CDR을 성숙한 인간 항체 프레임워크 안으로 인실리코 그래프팅함에 의해 수행했다. VH/VL 인터페이스 및 규범적인 루프 구조에 중요한 주요 잔기는 CDRx 플랫폼(Fusion Antibodies Plc, 북아일랜드 밸파스트 소재)을 사용하는 인간화된 변이체에서 가능한 한 많이 유지되었다. 이어서, 융합 항체에 의해 생성된 인간화된 변이체의 아미노산 서열을 Geneiouse 소프트웨어(Geneious Prime 2, 뉴질랜드 오클랜드 소재)를 사용하여 뉴클레오티드 서열로 전환시켰다. PCR로 VH 서열을 인간 IgG1 이소타입 불변 도메인 서열(IgG1 불변 뉴클레오티드에 대한 서열번호: 31)과, 그리고 VL 서열을 인간 IgK 이소타입 불변 도메인(IgK 불변 뉴클레오티드에 대한 서열번호: 32)과 융합함으로써, 16쌍의 인간화된 중쇄 및 경쇄가 생성되었고, 항체 유전자 서열이 중국 햄스터 난소 세포(CHO)에서 일시적으로 발현되었다. 배치 배양 후, 발현된 인간화된 항체는 세포 배양 상등액으로부터 정제되었고 HCO-LC0에 대해 실시예 2에 기재된 바와 같이 분석되었다. 표 2에 묘사된 8개의 인간화된 항체가 성공적으로 산출되었다.

표 2: 인간화된 항체의 서열

실시예 4

TKO 세포를 발현하는 IGLV3-21 ^R110 -BCR 및 IGLV3-21 ^G110 -BCR에 대한 mAb01-01의 결합

선별에서 관찰된 항체 mAb01-01의 특이성(실시예 1)은 형광 마커에 커플링된 항체를 사용하여 FACS 검정에서 검증되었다.

이 목적을 위해, 실시예 1에 따른 3개의 상이한 TKO 세포주로부터 2개의 세포 혼합물인, 세포 혼합 A 및 세포 혼합 B를 제조하고 이어서 mAb01-01-APC로 염색하였다(mAb01-01은 Immunotools GmbH에 의한 형광 마커 APC와 커플링됨). 대조를 위해, 각 배치를 항-IgM 항체(항-인간 IgM-PE, 클론: MHM-88, BioLegend Cat-No.: 314508)로 추가로 염색했다.

세포 혼합물 A는 PBS 완충액(Gibco, pH 7.2, Cat.no. 20012-019)에서 TKO 세포를 발현하는 IGHV3-21/IGLV3-21^R110 B-세포 수용체 및 B-세포 수용체 음성(빈 벡터; 대조군) TKO 세포의 1:1 비율로 제조되었다.

세포 혼합물 B는 PBS 완충액에서 TKO 세포를 발현하는 IGHV3-21/IGLV3-21^G110 B-세포 수용체 및 B-세포 수용체 음성(빈 벡터; 대조군) TKO 세포의 1:1 비율로 제조되었다.

세포 혼합물 A 또는 B의 세포를 PBS 완충액에 항체의 희석액(5μg/ml mAb01-01-APC, 2μg/ml 항-인간 IgM-PE, 총 부피 100μl 내)에서 FACS 튜브당 대략적으로 106개 세포로 현탁하고 암실에서 4℃에서 15분 동안 인큐베이션했다. 그 후, 세포를 1ml 차가운 PBS 완충액으로 1회 세척하고, 200μL 차가운 PBS 완충액에 재현탁시켰다.

FACS 분석은 MACSQuant Analyzer 10(Miltenyi Biotec B.V. & Co. KG; 기기는 제조업체에서 권장하는 대로 보정됨, 유속: 낮음, 샘플 혼합: 온화한 혼합, 모드, 표준, 흡수 부피: 50μL, 샘플 부피: 200μL)을 사용하여 수행하였다. 세포 혼합물 A 또는 세포 혼합물 B의 TKO-세포는 측면 산란(SSC) 대 전방 산란(FSC)에서 게이팅되었고 게이팅된 TKO-세포는 항-IgM-PE 대 mAb01-01-APC 도트-플롯에서 분석되어 사분면 통계를 사용하여 다른 TKO-세포 모집단을 열거하였다.

도 1A 내지 1D에 도시된 바와 같이, mAb01-01은 인간 IGLV3-21^R110-BCR을 발현하는 뮤린 TKO 세포에 결합하는 반면, 인간 IGLV3-21^G110-BCR 발현 TKO 마우스 세포에 대한 결합은 발생하지 않는다.

실시예 5

IGLV3-21 ^R110 B-세포 수용체에 대한 항체의 친화도

IGLV3-21^R110-보유 B-세포 수용체에 대한 항체의 결합 친화성을 정의하기 위해, BCR의 가용성 재조합 버전(170.5kDa; HC에 대한 서열번호: 51 및 LC에 대한 52에 따른 서열)이 실시예 1에 기술된 프로토콜을 사용한 일시적인 발현에 의한 단량체 인간 IgM으로 293-HEK 세포주에서 생산되었고, 고정된 항-IGLV3-21^R110 항체에 대한 결합은 Fortebio Octet 기기(Satorius) 상에서 바이오-레이어 간섭계(BLI)에 의해 모니터링되었다.

역학적 검정은 항 IGLV3-21^R110 항체를 간접 포획 시약인 항-인간 IgG Fc 항체를 통해 바이오센서 상에 먼저 고정화함으로써 수행하였다. 항 IGLV3-21^R110 항체를 0.01875μg/ml의 농도로 로딩하여 0.30 내지 0.34nm의 항 IGLV3-21^R110 항체 포획 수준을 생성하였다. 러닝 완충액(PBS, 0.02% Tween20, 0,1%BSA, 0.05% 산나트륨)에 9nM BCR-단편 용액을 준비하고 1:3으로 연속 희석하여 9 내지 0.012nM의 7개 농도(9nM, 3nM, 1nM, 0.333nM, 0.111nM, 0.037nM 및 0.012nM)를 얻었다. 항 IGLV3-21^R110 항체 포획 바이오센서를 그 다음 900초(연합 단계) 동안 상이한 농도의 가용성 BCR-단편을 함유하는 웰에 침지시킨 후 러닝 완충액에서 1200초의 해리 단계가 이어졌다. 단계는 1000rpm의 일정한 진탕 속도에서 수행되었다. 모든 시약은 제조업체에서 설명한 대로 사용되었다. 포획 항 IGLV3-21^R110 항체의 자연 해리 및 또한 센서 표면에 대한 가용성 BCR-단편의 비-특이적 결합 둘 모두를 보상하기 위해 이중 참조 보정(완충액 및 블랭크 센서) 후에 센서그램이 생성되었다. 해리 속도 상수(K_D)는 Fortebio 데이터 분석 소프트웨어(Satorius)를 사용하여 1차 1:1 결합 모델로 센서그램을 피팅함에 의해 얻어진 연합(k_a) 및 해리 속도(k_d) 상수의 비율을 기반으로 계산되었다.

표 3에 나타낸 바와 같이, 키메라 항체 HCO-LC0는 가용성 IGLV3-21^R110 B-세포 수용체에 대략 120nM의 K_D 값으로 결합한다. 인간화된 항체 HC6-LC6 및 HC7-LC6은 키메라 항체 HC01 LC01의 2-배수 이내의 해리 상수를 나타내는 키메라 항체 HC0-LC0의 것에 유사한 결합 특성을 나타낸다. 모든 인간화된 항체의 K_D 값에 대해 표 3을 참조한다.

표 3: 가용성 IGLV3-21^R110 B-세포 수용체 및 항 IGLV3-21^R110 항체 포획 수준으로 Fortebio에 의해 측정된 키메라 항체 HC0-LC0 및 인간화된 변이체의 1가 K_D 값

실시예 6

IGLV3-21 ^R110 -BCR 양성 인간 B-CLL 세포의 세포 표면에 대한 뮤린 항체 mAb01-01의 결합

IGLV3-21^R110-B-세포 수용체 양성 인간 CLL 세포 대 비-IGLV3-21^R110 인간 B-세포에 대한 mAb01-01의 결합 특성을 결정하기 위해, 결합은 유세포분석에 의해 시험되었다.

이 목적을 위해, 2명의 CLL 환자의 동결보존된 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 사용하였다. 이들 환자 중 한 명의 CLL은 IGLV3-21^R110의 존재를 특징으로 한다. 보다 구체적으로, CLL 세포는 IGLV3-21^R110과 IGHV4-39 중쇄의 조합(IGHV4-39/IGLV3-21^R110-BCR)으로 BCR을 발현하였다. 다른 환자는 비-IGLV3-21^R110 CLL로 고통받는 것으로 진단되었다. PBMC는 당해 분야에 공지된 기술을 사용하여, 예를 들어 Bøyum A. Isolation of mononuclear cells and granulocytes from human blood. Scan. J. Clin. Lab. Invest. 1968, 21 (Suppl. 97): 77-89에 따라 Ficoll-Paque PLUS(GE Healthcare Bio-Sciences AB) 밀도 구배 원심분리에 의해 헤파린처리된 정맥혈로부터 분리될 수 있다.

해동되고 5ml 세포 배양 배지(RPMI, Gibco; 10% FCS, PAN-Biotec)에 재현탁된 샘플. 세포를 300g에 의해 원심분리한 후(Eppendorf centrifuge 5425R), 1ml RPMI에 추가로 재현탁했다. 세포 계수는 Neubauer Chamber를 사용하여 획득했다. 염색을 위해 1×10E6 세포를 사용하고 FACS-튜브로 옮겼다. 세포는 총 부피 100μl PBS 완충액에서 2μl 항-CD19 VioBright515(Miltiny Biotech, Klon:REA675), 2μl 항-CD5-PE-Vio770(Miltenyi Biotec, Klon:REA782) 및 5μl mAb01-01-APC(mAb01-01은 Immunotools GmbH에 의한 형광 마커 APC로 커플링됨)를 사용하여 염색하고 암실에서 4℃에서 15분 동안 인큐베이션했다. 다음에서, 세포를 1ml 차가운 PBS 완충액으로 1회 세척하고, 200μL 차가운 PBS 완충액에 재현탁하고, BD LSRFortessa™ 세포 분석기(BDbioscience)를 사용한 유세포분석에 의해 분석했다. 기기는 제조업체에서 권장하는 대로 보정되었다. FlowJo-Software X(BDbioscience)를 사용하여 수행된 원시 데이터의 분석. 도 2에 입증된 바와 같이 설정된 분석 게이트.

도 2에 도시된 바와 같이, mAb01-01은 IGLV3-21^R110 양성 CLL B 세포에 전적으로 결합하지만, IGLV3-21^R110을 보유하지 않는 CLL 환자의 BCR에는 결합하지 않는다. 보다 구체적으로, mAb01-01은 중쇄의 특성에 무관하게 IGLV3-21^R110-BCR을 인식한다.

실시예 7

IGLV3-21 ^R110 -BCR 양성 뮤린 TKO 세포의 세포 표면에 대한 키메라 및 인간화된 항체의 결합 특성

키메라 항체와 2개의 인간화된 버전의 특이적 IGLV3-21^R110-BCR 결합을 비교하기 위해, IGLV3-21^R110-BCR 뮤린 TKO 세포(실시예 1 참조)를 상이한 농도의 항체 HC0-LC0, HC6-LC6 및 HC7-LC6과 함께 인큐베이션하고 유세포분석 및 샌드위치 검정 설정에 의해 분석했다. 대조군은 TKO - 빈 벡터 세포주(표면 BCR 없음)로 수행되었다.

각 세포주로부터, 7.5×10E6 세포를 별도의 15ml 블루캡 안으로 옮기고 10분 동안 원심분리(300g, 4℃)하고 1,5ml PBS(Gibco)에 재현탁한다.

96-웰 플레이트에서 수행된 염색(VWR, U-바닥, 비-처리됨). 각 반응에 대해 2×10E5 세포를 사용했다. 실험 설정은 표 4에 나타나 있다.

표 4: 96-웰 플레이트의 실험 설정

상이한 인간화된 변이체의 결합 특성을 특성화하기 위해 PBS 내 각 항체의 10가지 상이한 농도가 웰당 총 부피 200μl에서 염색(10, 5, 2.5, 0.625, 0.31, 0.16, 0.08, 0.04, 0μg/ml)에 사용되었다. 인큐베이션은 4℃, 어두운 곳에서 30분 동안 수행되었다. 그런 다음 96-웰은 300g, 4℃에서 10분 동안 원심분리되었다(VWR, MEGA STAR 1.6R). 상등액은 폐기되고 세포는 100μl 얼음처럼 차가운 PBS에 재현탁되었다. 검출을 위해 APC로 표지된 인간 IgG1에 대한 2차 항체가 10μg/ml의 최종 농도로 사용되었다.

인큐베이션은 어두운 곳에서 4℃에서 15분 동안 200μl/웰 총 부피에서 수행된 후 얼음처럼 차가운 PBS로 추가 세척 단계가 이어졌다. 세포는 획득을 위해 150μl 얼음처럼 차가운 PBS에 재현탁되었다. 세포는 MACS-Quant10(Miltenyi Biotec)에서 분석되고, 제조업체의 지시에 따라 보정되었다.

모든 IGLV3-21^R110-BCR TKO 측정의 MFI(중앙 형광 강도)는 대조군 세포 값을 차감함에 의해 중성화되고 항체의 농도에 대해 플롯팅되었다. 3가지 항체 모두에 대한 IGLV3-21^R110-BCR의 결합에서 농도-의존적 증가를 입증하는 함수가 생성되었다. 도 3에 도시된 바와 같이, 2개 인간화된 변이체는 항체 농도가 증가함에 따라 키메라 항체에 점진적으로 동일한 결합 특성을 나타내고 늦어도 10μg/ml에서는 거의 동일한 결합 특이성을 갖는다.

실시예 8

mAb01-01의 조직 교차-반응성 프로필

면역조직화학(IHC) 실험에서 인간 CLL 및 건강한 조직에 대한 mAB01-01의 결합 특성을 결정하기 위해, 면역염색이 IGLV3-21^R110-BCR을 발현하는 비장 조직 및 건강한 비장, 피부, 신장, 심장, 및 뇌 조직의 절편 상에 수행되었다.

IHC 이전에 조직 절편은 탈파라핀화되고 수화되었다. 항원이 가려지지 않도록 하기 위해, pH 6.0의 시트레이트 완충액(9ml 시트르산(0.1M) 및 41ml 나트륨 시트레이트(0.1M))으로 마이크로웨이브 처리가 수행되었다. 이를 위해, 절편을 버블링 시트레이트 완충액에서 15분 동안 끓인 후 실온에서 30분 동안 식힌 다음 이를 PBS에서 3×5분 헹구었다. IHC 경우, 슬라이드를 습도 챔버에서 RT에서 1:200의 희석으로 제1 항체와 함께 2시간 동안 인큐베이션하였다. 대조군으로 모든 조직의 절편을 제1 항체 없이 동일한 조건 하에서 인큐베이션하였다. 그 후, 슬라이드를 PBS에서 3×5분 세척하였다. 2차 항체로 고추냉이 과산화효소(HRP)가 접합된 항-IgG 항체(염소 항-마우스 IgG(H+L)-HRP, Southern Biotech, Cat. No. 1036-05)를 가습된 챔버에서 RT에서 1:10000의 희석에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서, PBS로 10분 동안 세척하고 DAB 기질 키트(#34065, Thermo Fisher)를 사용하여 HRP의 활성을 검출하였다. DAB(3,3'-디아미노벤지딘 테트라하이드로클로라이드) 기질을 15분 동안 인큐베이션하였다. Fluoromount-1을 캡핑제로 사용하였다. 평가는 30분 후에 수행되었고 HRP 접합된 항-IgG 항체가 조직에 결합된 부위에서 불용성 갈색 색상의 반응 생성물을 나타내었다.

도 4에 도시된 바와 같이, IGLV3-21^R110-BCR 양성 비장 절편에 대해 양성 염색이 관찰될 수 있었고, 따라서 mAb01-01은 인간 CLL-조직에 대한 결합에서 교차-반응성이다. 대조적으로, 비장, 피부, 신장, 심장 및 뇌의 건강한 인간 조직 절편에서는 염색이 검출되지 않았다. 따라서 mAB01-01은 건강한 인간 조직과 교차-반응성을 나타내지 않는다.

실시예 9

환자 유래된 이종이식 모델에서 항-IGLV3-21 ^R110 -BCR 항체의 테스트

항-IGLV3-21^R110 항체의 효능을 결정하기 위해 환자 유래된 이종이식 모델을 선택했다. 용량 찾기 실험을 위해 4마리 NOD-scid IL2rg null(NSG)-마우스(Jackson ImmunoResearch, Qi J et al.: An IgG1-like bispecific antibody targeting CD52 and CD20 for the treatment of B-cell malignancies, Methods 2019, 154:70-76에 기술된 바와 같이 준비됨)로 4개 그룹이 사용되었다:

그룹 A: 항체 처리가 없는 대조군

그룹 B: 용량 0.3mg/kg 체중

그룹 C: 용량 5mg/kg 체중

그룹 D: 용량 10mg/kg 체중

IGLV3-21^R110-BCR 환자로부터의 PMBS를 해동하고 PBS에 재현탁했다. 제조업체에 의해 제공된 사용 지침에 따라 Miltenyi CD3 Beads(Miltenyi Biotec)를 사용함에 의해 T 세포를 분리한다. T 세포는 이전에 기술된 바와 같이(Qi J et al. Methods, 2019 s.a.) CD3/CD28 dynabeads(T 세포 팽창 및 활성화를 위한 Dynabeads™ 인간 T-활성제 CD3/CD28, Cat. No. 11161D, GIBCO)를 사용하여 7일 동안 배양되고 팽창되었다.

7일 후, 활성화된 T 세포 및 PBMC(마우스당 20×10⁶ CLL PBMC 및 5×10⁵ T 세포)를 NSG 마우스 안으로 i.v. 주사하였다. 치료를 위해 mAb01-01을 생착 후 2주차에 시작하여 총 3주 동안 주당 2회 상이한 복용량으로 i.p.로 제공했다. 마우스는 매주 초에 250μl 인간 혈청으로 사전-컨디셔닝되었다. 마우스는 치료의 3주 후에 희생되었다. 분석을 위해 비장을 단리하고 mAb01-01 및 인간 CD45, CD5 및 CD19에 대한 항체(CD5 IgG1 UCHT2, BioLegend; CD19 IgG1 HIB19, BD Biosciences; CD45(인간) IgG1 H130 Invitrogen)를 사용한 유세포분석에 의해 인간 IGLV3-21^R110 양성 CLL B 세포의 존재에 대해 분석하였다. 유세포분석을 위해, 세포를 원심분리에 의해 수집하고 PBS(유세포분석완충액) 내 얼음처럼-차가운 0.1%(w/v) BSA에 재현탁했다. 5×10⁵개 세포를 함유하는 100μL를 V-바닥 96-웰 플레이트(Corning) 안에 분배하였다. 세포를 먼저 얼음 상에 30분 동안 5%(v/v) 염소 혈청(Jackson ImmunoResearch)으로 차단한 다음 제조업체에서 권장하는 대로 표시된 항체와 인큐베이션했다. 세포를 어두운 곳에서 얼음 상에서 30분 동안 인큐베이션했다. 그런 다음 세포를 얼음처럼-차가운 유세포분석 완충액으로 두 번 세척하고 200μL 유세포분석 완충액에 재현탁하고 FACSCanto(BD Biosciences)를 사용하여 분석했다.

도 5에 도시된 바와 같이, mAb01-01로 처리는 모든 처리된 마우스에서 종양 세포 계수에서 감소를 초래했고, 10mg/kg mAb01-01로 처리는 종양 성장을 극도로 감소시켰다.

Claims (13)

1. IGLV3-21^R110 양성 환자에서 CLL의 치료에 사용하기 위한 항체로서,
   상기 항체는
   서열번호: 1의 중쇄 아미노산 서열 및 서열번호: 2의 경쇄 아미노산 서열; 또는
   서열번호: 11의 중쇄 아미노산 서열 및 서열번호: 12의 경쇄 아미노산 서열
   을 가지거나; 또는
   서열번호: 16, 서열번호: 17, 서열번호: 18 및 서열번호: 19로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 갖는 가변 경쇄와 조합된, 서열번호: 15 및 서열번호: 20으로 구성된 군으로부터 선택된 서열을 갖는 가변 중쇄
   를 포함하는, 항체.
2. 제1항에 있어서, 서열번호: 1에 상응하는 중쇄 및 서열번호: 2에 상응하는 경쇄를 특징으로 하는, 항체.
3. 제1항에 있어서, 서열번호: 11의 중쇄 아미노산 서열 및 서열번호: 12의 경쇄 아미노산 서열을 특징으로 하는, 항체.
4. 제1항에 있어서, 서열번호: 13에 상응하는 중쇄 및 서열번호: 14에 상응하는 경쇄를 특징으로 하는, 항체.
5. 제1항에 있어서, 서열번호: 21에 상응하는 중쇄 및 서열번호: 14에 상응하는 경쇄를 특징으로 하는, 항체.
6. 제1항 또는 제3항에 있어서, 키메라인, 항체.
7. 제4항 또는 제5항에 있어서, 인간화된 것인, 항체.
8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 0.25 내지 25mg/_체중kg의 용량으로 적용되는, 항체.
9. 제8항에 있어서, 항체는 1 내지 20mg/_체중kg의 용량으로 적용되는, 항체.
10. 제8항에 있어서, 항체는 7 내지 15mg/_체중kg의 용량으로 적용되는, 항체.
11. 제8항에 있어서, 항체는 8 내지 12mg/_체중kg의 용량으로 적용되는, 항체.
12. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 항체 및 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함하는, IGLV3-21^R110 양성 환자에서 CLL의 치료에 사용하기 위한 약학적 조성물.
13. 제12항에 따른 약학적 조성물을 포함하는, IGLV3-21^R110 양성 환자에서 CLL의 치료에 사용하기 위한 키트.