CN115521379A - Pd-1抗体及其用途 - Google Patents

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Abstract

本申请涉及一种PD‑1抗体及其用途，所述PD‑1抗体以约5E‑07M或以下的KD值与人PD‑1蛋白特异性结合，并能够阻断PD‑1与PD‑L1的结合；本申请还涉及所述抗体中Fc区的改造；本申请还提供了包含所述PD‑1抗体的免疫缀合物、制备所述PD‑1抗体的方法以及PD‑1抗体的用途。

Description

PD-1抗体及其用途
技术领域
本申请涉及生物医药领域，具体的涉及一种PD-1抗体及其用途。
背景技术
人程序性细胞死亡受体-1(PD-1)是已知的主要免疫检查点之一，其表达在已经激活的T淋巴细胞表面，它与配体PD-L1(程序性死亡受体-配体1，programmed cell death-Ligand 1)和PD-L2(程序性死亡受体-配体2，programmed cell death-Ligand 2)结合可以抑制T淋巴细胞的活性及相关的体内细胞免疫反应。PD-L1/PD-1信号通路是免疫反应中非常重要的共抑制信号途径，负调节T细胞免疫应答，抑制T细胞活性，减弱细胞因子的分泌。研究发现PD-L1能在许多肿瘤组织中表达，包括胃癌、肺癌、乳腺癌、胰腺癌、卵巢癌、结肠癌、肥大细胞性肿瘤以及恶性黑色素瘤等，以及在浸润肿瘤微环境的骨髓细胞中表达，大量研究表明，PD-1和PD-L1的相互作用是导致PD-L1表达阳性肿瘤细胞规避免疫监视的主要原因。通过阻断肿瘤细胞对PD-1/PD-L1信号通路的负调控，激活免疫系统，能够促进T细胞相关的肿瘤特异性细胞免疫反应，治疗肿瘤。
目前，抗PD-1抗体还存在选择性不强、亲和力较低的缺陷。因此，有必要开发对PD-1亲和力高、特异性强的新型抗PD-1抗体。
发明内容
本申请提供了一种分离的抗原结合蛋白，其具有下述性质中的一种或多种：a)在Biacore检测中，以约5E-07M或以下的KD值与人PD-1蛋白特异性结合；以及b)能够阻断PD-1与PD-L1的结合。
在某些实施方式中，所述分离的抗原结合蛋白包含HCDR3，所述HCDR3包含SEQ IDNO:53所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述HCDR3包含SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述分离的抗原结合蛋白包含HCDR2，所述HCDR2包含SEQ IDNO:6所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述分离的抗原结合蛋白包含HCDR1，所述HCDR1包含SEQ IDNO:3所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述分离的抗原结合蛋白包含SEQ ID NO:54所示的重链可变区VH的HCDR1、HCDR2和HCDR3。
在某些实施方式中，所述分离的抗原结合蛋白包含SEQ ID NO:29至SEQ ID NO:31中任一项所示的重链可变区VH的HCDR1、HCDR2和HCDR3。
在某些实施方式中，所述分离的抗原结合蛋白包括重链可变区VH，所述VH包含所述HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述HCDR3包含SEQ ID NO:53所示的氨基酸序列；所述HCDR2包含SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列；以及所述HCDR1包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述分离的抗原结合蛋白中所述HCDR1、HCDR2和HCDR3包含选自下述任意一组的氨基酸序列：
a)HCDR1：SEQ ID NO:3，HCDR2：SEQ ID NO:6和HCDR3：SEQ ID NO:9；和
b)HCDR1：SEQ ID NO:3，HCDR2：SEQ ID NO:6和HCDR3：SEQ ID NO:10。
在某些实施方式中，所述分离的抗原结合蛋白包含H-FR1，所述H-FR1的C末端与所述HCDR1的N末端直接或间接地相连，且所述H-FR1包含SEQ ID NO:49所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述H-FR1包含SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述分离的抗原结合蛋白包含H-FR2，所述H-FR2位于所述HCDR1与所述HCDR2之间，且所述H-FR2包含SEQ ID NO:50所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述分离的抗原结合蛋白中所述H-FR2包含SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述分离的抗原结合蛋白包含H-FR3，所述H-FR3位于所述HCDR2与所述HCDR3之间，且所述H-FR3包含SEQ ID NO:51所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述分离的抗原结合蛋白中所述H-FR3包含SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述分离的抗原结合蛋白包含H-FR4，所述H-FR4的N末端与所述HCDR3的C末端直接或间接地相连，且所述H-FR4包含SEQ ID NO:52所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述分离的抗原结合蛋白中所述H-FR4包含SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述分离的抗原结合蛋白包含H-FR1，H-FR2，H-FR3和H-FR4，所述H-FR1包含SEQ ID NO:49所示的氨基酸序列；所述H-FR2包含SEQ ID NO:50所示的氨基酸序列；所述H-FR3包含SEQ ID NO:51所示的氨基酸序列；以及所述H-FR4包含SEQ ID NO:52所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述分离的抗原结合蛋白包含H-FR1，H-FR2，H-FR3和H-FR4，所述H-FR1包含SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2中任一项所示的氨基酸序列；所述H-FR2包含SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5中任一项所示的氨基酸序列；所述H-FR3包含SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8中任一项所示的氨基酸序列；以及所述H-FR4包含SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述分离的抗原结合蛋白中所述H-FR1、H-FR2、H-FR3和H-FR4包含选自下述任意一组的氨基酸序列：
a)H-FR1：SEQ ID NO:1，H-FR2：SEQ ID NO:4，H-FR3：SEQ ID NO:7和H-FR4：SEQ IDNO:11；和
b)H-FR1：SEQ ID NO:2，H-FR2：SEQ ID NO:5，H-FR3：SEQ ID NO:8和H-FR4：SEQ IDNO:12。
在某些实施方式中，所述分离的抗原结合蛋白包含重链可变区VH，所述VH包含SEQID NO:54所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述分离的抗原结合蛋白包含重链可变区VH，所述VH包含SEQID NO:29至SEQ ID NO:31中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述分离的抗原结合蛋白包含LCDR3，所述LCDR3包含SEQ IDNO:59所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述分离的抗原结合蛋白中所述LCDR3包含SEQ ID NO:21至SEQ ID NO:26中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述分离的抗原结合蛋白包含LCDR2，所述LCDR2包含SEQ IDNO:18所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述分离的抗原结合蛋白包含LCDR1，所述LCDR1包含SEQ IDNO:15所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述分离的抗原结合蛋白包含SEQ ID NO:60所示的轻链可变区VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在某些实施方式中，所述分离的抗原结合蛋白包含SEQ ID NO:32至SEQ ID NO:38中任一项所示的轻链可变区VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在某些实施方式中，所述分离的抗原结合蛋白包含轻链可变区VL，所述VL包含所述LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述LCDR3包含SEQ ID NO:59所示的氨基酸序列；所述LCDR2包含SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列；以及所述LCDR1包含SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述分离的抗原结合蛋白中所述LCDR1、LCDR2和LCDR3包含选自下述任意一组的氨基酸序列：
a)LCDR1：SEQ ID NO:15，LCDR2：SEQ ID NO:18和LCDR3：SEQ ID NO:21；
b)LCDR1：SEQ ID NO:15，LCDR2：SEQ ID NO:18和LCDR3：SEQ ID NO:22；
c)LCDR1：SEQ ID NO:15，LCDR2：SEQ ID NO:18和LCDR3：SEQ ID NO:23；
d)LCDR1：SEQ ID NO:15，LCDR2：SEQ ID NO:18和LCDR3：SEQ ID NO:24；
e)LCDR1：SEQ ID NO:15，LCDR2：SEQ ID NO:18和LCDR3：SEQ ID NO:25；和
f)LCDR1：SEQ ID NO:15，LCDR2：SEQ ID NO:18和LCDR3：SEQ ID NO:26。
在某些实施方式中，所述分离的抗原结合蛋白包含L-FR1，所述L-FR1的C末端与所述LCDR1的N末端直接或间接地相连，且所述L-FR1包含SEQ ID NO:55所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述分离的抗原结合蛋白中所述L-FR1包含SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述分离的抗原结合蛋白包含L-FR2，所述L-FR2位于所述LCDR1与所述LCDR2之间，且所述L-FR2包含SEQ ID NO:56所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述分离的抗原结合蛋白中所述L-FR2包含SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:17中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述分离的抗原结合蛋白包含L-FR3，所述L-FR3位于所述LCDR2与所述LCDR3之间，且所述L-FR3包含SEQ ID NO:57所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述分离的抗原结合蛋白中所述L-FR3包含SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述分离的抗原结合蛋白包含L-FR4，所述L-FR4的N末端与所述LCDR3的C末端直接或间接地相连，且所述L-FR4包含SEQ ID NO:58所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述分离的抗原结合蛋白中所述L-FR4包含SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述分离的抗原结合蛋白包含L-FR1，L-FR2，L-FR3和L-FR4，所述L-FR1包SEQ ID NO:55所示的氨基酸序列；所述L-FR2包含SEQ ID NO:56所示的氨基酸序列；所述L-FR3包含SEQ ID NO:57所示的氨基酸序列；以及所述L-FR4包含SEQ ID NO:58所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述分离的抗原结合蛋白包含L-FR1，L-FR2，L-FR3和L-FR4，所述L-FR1包含SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列；所述L-FR2包含SEQ IDNO:16和SEQ ID NO:17中任一项所示的氨基酸序列；所述L-FR3包含SEQ ID NO:19和SEQ IDNO:20中任一项所示的氨基酸序列；以及所述L-FR4包含SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述分离的抗原结合蛋白中所述L-FR1、L-FR2、L-FR3和L-FR4包含选自下述任意一组的氨基酸序列：
a)L-FR1：SEQ ID NO:13，L-FR2：SEQ ID NO:16，L-FR3：SEQ ID NO:19和L-FR4：SEQID NO:27；和
b)L-FR1：SEQ ID NO:14，L-FR2：SEQ ID NO:17，L-FR3：SEQ ID NO:20和L-FR4：SEQID NO:28。
在某些实施方式中，所述分离的抗原结合蛋白中所述VL包含SEQ ID NO:60所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述分离的抗原结合蛋白中所述VL包含SEQ ID NO:32至SEQID NO:38中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述分离的抗原结合蛋白中所述VH和VL包含选自下述任意一组的氨基酸序列：
a)VH：SEQ ID NO:29和VL：SEQ ID NO:32；
b)VH：SEQ ID NO:30和VL：SEQ ID NO:33；
c)VH：SEQ ID NO:30和VL：SEQ ID NO:34；
d)VH：SEQ ID NO:30和VL：SEQ ID NO:35；
e)VH：SEQ ID NO:30和VL：SEQ ID NO:36；
f)VH：SEQ ID NO:30和VL：SEQ ID NO:37；
g)VH：SEQ ID NO:30和VL：SEQ ID NO:38；
h)VH：SEQ ID NO:31和VL：SEQ ID NO:33；和
i)VH：SEQ ID NO:31和VL：SEQ ID NO:36。
在某些实施方式中，所述分离的抗原结合蛋白与野生型抗体相比，具有延长的半衰期。
在某些实施方式中，所述分离的抗原结合蛋白与野生型抗体相比，能够降低抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。
在某些实施方式中，所述分离的抗原结合蛋白包含重链恒定区，且所述重链恒定区包括源自IgG的恒定区或源自IgY的恒定区。
在某些实施方式中，所述的分离的抗体结合蛋白中所述重链恒定区包括源自IgG的恒定区。
在某些实施方式中，所述重链恒定区包括源自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的恒定区。
在某些实施方式中，所述重链恒定区包括源自IgG1的Fc区。
在某些实施方式中，所述重链恒定区的N297位发生突变，残基根据Kabat系统进行编号。
在某些实施方式中，所述重链恒定区的M252位发生突变，残基根据Kabat系统进行编号。
在某些实施方式中，所述重链恒定区的S254位发生突变，残基根据Kabat系统进行编号。
在某些实施方式中，所述重链恒定区的T256位发生突变，残基根据Kabat系统进行编号。
在某些实施方式中，所述重链恒定区中的Fc区包含N297A突变。
在某些实施方式中，所述重链恒定区中的Fc区包含M252Y突变。
在某些实施方式中，所述重链恒定区中的Fc区包含S254T突变。
在某些实施方式中，所述重链恒定区中的Fc区包含T256E突变。
在某些实施方式中，所述重链恒定区包含SEQ ID NO:48所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述分离的抗原结合蛋白包含轻链恒定区，且所述轻链恒定区包括源自Igκ的恒定区或源自Igλ的恒定区。
在某些实施方式中，所述轻链恒定区包括源自人Igκ的恒定区。
在某些实施方式中，所述轻链恒定区包含SEQ ID NO:47所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述分离的抗原结合蛋白包含重链HC，所述HC包含SEQ IDNO:39和SEQ ID NO:40中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述分离的抗原结合蛋白包含轻链LC，所述LC包含SEQ IDNO:41至SEQ ID NO:46中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述分离的抗原结合蛋白包括抗体或其抗原结合片段。
在某些实施方式中，所述抗原结合片段选自下组：Fab，Fab’，F(ab)2，Fv片段，F(ab’)2，scFv，di-scFv，VHH和/或dAb。
在某些实施方式中，所述抗体选自下组：单克隆抗体、单链抗体、嵌合抗体、人源化抗体、双特异性抗体、多特异性抗体和全人源抗体。
另一方面，本申请提供了一种或多种多肽，其包含所述的分离的抗原结合蛋白。
另一方面，本申请提供了一种或多种免疫缀合物，其包含所述的分离的抗原结合蛋白或所述的多肽。
另一方面，本申请提供了一种或多种分离的核酸分子，其编码所述分离的抗原结合蛋白，或者所述的多肽。
另一方面，本申请提供了一种或多种载体，其包含所述分离的核酸分子。
另一方面，本申请提供了一种或多种细胞，其包含所述分离的抗原结合蛋白，所述的多肽，所述的免疫缀合物，所述分离的核酸分子和/或所述的载体。
另一方面，本申请提供了一种制备所述分离的抗原结合蛋白或所述的多肽的方法，所述方法包括再使得所述分离的抗原结合蛋白或所述的多肽表达的条件下，培养所述的细胞。
另一方面，本申请提供了一种或多种药物组合物，其包含所述分离的抗原结合蛋白，所述的多肽，所述的免疫缀合物，所述分离的核酸分子，所述的载体，所述的细胞，和/或药学上可接受的佐剂和/或赋形剂。
另一方面，本申请提供了一种用于检测或测定PD-1的方法，所述方法包括使用所述分离的抗原结合蛋白或所述的多肽。
另一方面，本申请提供了一种PD-1的检测试剂盒，其包含所述分离的抗原结合蛋白或所述的多肽。
另一方面，本申请提供了所述分离的抗原结合蛋白或所述的多肽在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于检测PD-1的存在和/或含量。
另一方面，本申请提供了一种抑制PD-1与PD-L1相互作用的方法，其包括向有需要的受试者施用有效量的所述分离的抗原结合蛋白，所述的多肽，所述的免疫缀合物，所述的分离的核酸分子，所述的载体，和/或所述的细胞。
另一方面，本申请提供了一种所述分离的抗原结合蛋白，所述的多肽，所述的免疫缀合物，所述分离的核酸分子，所述的载体，所述的细胞和/或所述的药物组合物在制备预防和/或治疗疾病或病症的药物中的用途。
在某些实施方式中，所述疾病或病症包括肿瘤。
在某些实施方式中，所述肿瘤包括实体瘤。
在某些实施方式中，所述肿瘤包括非实体瘤。
在某些实施方式中，所述肿瘤包括黑色素瘤，肺癌，头颈鳞状细胞癌，淋巴瘤，肝细胞癌，肾细胞癌，尿路上皮癌，结直肠癌和/或乳腺癌。
另一方面，本申请提供了所述分离的抗原结合蛋白，所述的多肽，所述的免疫缀合物，所述分离的核酸分子，所述的载体，所述的细胞和/或所述的药物组合物，其用于预防、缓解和/或治疗疾病或病症。
在某些实施方式中，所述疾病或病症包括肿瘤。
在某些实施方式中，所述肿瘤包括实体瘤。
在某些实施方式中，所述肿瘤包括非实体瘤。
所述肿瘤包括黑色素瘤，肺癌，头颈鳞状细胞癌，淋巴瘤，肝细胞癌，肾细胞癌，尿路上皮癌，结直肠癌和/或乳腺癌。
另一方面，本申请提供了一种预防和/或治疗疾病或病症的方法，其包括向有需要的受试者施用有效量的所述分离的抗原结合蛋白，所述的多肽，所述的免疫缀合物，所述的分离的核酸分子，所述的载体，和/或所述的细胞。
在某些实施方式中，所述疾病或病症包括肿瘤。
在某些实施方式中，所述肿瘤包括实体瘤。
在某些实施方式中，所述肿瘤包括实体瘤。
在某些实施方式中，所述肿瘤包括黑色素瘤，肺癌，头颈鳞状细胞癌，淋巴瘤，肝细胞癌，肾细胞癌，尿路上皮癌，结直肠癌和/或乳腺癌。
本领域技术人员能够从下文的详细描述中容易地洞察到本申请的其它方面和优势。下文的详细描述中仅显示和描述了本申请的示例性实施方式。如本领域技术人员将认识到的，本申请的内容使得本领域技术人员能够对所公开的具体实施方式进行改动而不脱离本申请所涉及发明的精神和范围。相应地，本申请的附图和说明书中的描述仅仅是示例性的，而非为限制性的。
附图说明
本申请所涉及的发明的具体特征如所附权利要求书所显示。通过参考下文中详细描述的示例性实施方式和附图能够更好地理解本申请所涉及发明的特点和优势。对附图简要说明如下：
图1显示的是本申请所述抗原结合蛋白抑制PD-L1与PD-1的结合的ELISA检测结果；
图2a-2b显示的是本申请所述抗原结合蛋白的MLR检测结果；
图3显示的是本申请所述Fc改造的抗原结合蛋白抑制PD-L1与PD-1的结合的ELISA检测结果；
图4a-4b显示的是本申请所述Fc改造的抗原结合蛋白的功能性细胞实验结果。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本申请发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所公开的内容容易地了解本申请发明的其他优点及效果。
术语定义
在本申请中，术语“分离的”通常指从天然状态下经人工手段获得的。如果自然界中出现某一种“分离”的物质或成分，那么可能是其所处的天然环境发生了改变，或从天然环境下分离出该物质，或二者情况均有发生。例如，某一活体动物体内天然存在某种未被分离的多聚核苷酸或多肽，而从这种天然状态下分离出来的高纯度的相同的多聚核苷酸或多肽即称之为分离的。术语“分离的”不排除混有人工或合成的物质，也不排除存在不影响物质活性的其它不纯物质。
在本申请中，术语“抗原结合蛋白”通常是指一种能够特异性识别和/或中和特定抗原的多肽分子。例如，在本申请中，术语“抗原结合蛋白”可包括“抗体”或“抗原结合片段”。例如，所述抗体可包含通过二硫键相互连接的至少两条重(H)链和两条轻(L)链组成的免疫球蛋白，并且可包括任何包含其抗原结合部分的分子。术语“抗体”可包括单克隆抗体、抗体片段或抗体衍生物，包括但不限于鼠源抗体、人抗体(全人源抗体)、人源化抗体、嵌合抗体、单链抗体(例如，scFv)，以及与抗原结合的抗体片段(例如，Fab、Fab’，VHH和(Fab)2片段)。术语“抗体”还可包括抗体的所有重组体形式，例如在原核细胞中表达的抗体、未糖基化的抗体以及本文所述的任何与抗原结合的抗体片段及其衍生物。每条重链可由重链可变区(VH)和重链恒定区构成。每条轻链可由轻链可变区(VL)和轻链恒定区构成。VH和VL区可进一步被区分为称为互补决定区(CDR)的高变区，它们散布在称为构架区(FR)的更保守的区域中。每个VH和VL可由三个CDR和四个FR区构成，它们从氨基端至羧基端可按以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原(例如，人PD-1)相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可介导该免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，所述宿主组织或因子包括免疫系统的多种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一成分(Clq)。所述CDRs的确切边界已根据不同系统不同地限定。由Kabat(Kabat等人，Sequencesof Proteins of Immunological Interest(National Institutes of Health，Bethesda，Md.(1987)和(1991))描述的系统，不仅提供了可应用于抗原结合片段的任何可变区的明确残基编号系统，还提供了限定CDRs的精确残基边界。这些CDRs可以被称为Kabat CDRs。Chothia和同事(Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.196：901-917(1987)以及Chothia等人，Nature 342：877-883(1989))发现尽管在氨基酸序列水平上具有大的多样性，但是KabatCDRs内的某些亚部分采取几乎相同的肽主链构象。这些亚部分命名为L1、L2和L3或H1、H2和H3，其中“L”和“H”分别指轻链和重链区域。这些区域可以被称为Chothia CDRs，所述Chothia CDRs具有与Kabat CDRs重叠的边界。与Kabat CDRs重叠的限定CDRs的其他边界已由Padlan(FASEB J.9：133-139(1995))和MacCallum(J Mol Biol 262(5)：732-45(1996))描述。另外，其他的CDR边界定义可能不严格地遵循上述系统之一，但仍将与Kabat CDRs重叠，尽管按照特定残基或残基组或甚至整个CDRs并不显著影响抗原结合的预测或实验发现，它们可以缩短或加长。在本申请中，所述CDR可通过使用的是Kabat编号系统定义。
在本申请中，术语“抗原结合片段”通常是指抗体中发挥特异性结合抗原功能的一个或多个片段。抗体的抗原结合功能可通过抗体的全长片段来实现。抗体的抗原结合功能也可通过以下来实现：包括Fv、ScFv、dsFv、Fab、Fab’或F(ab’)2的片段的重链，或者，包括Fv、scFv、dsFv、Fab、Fab’或F(ab’)2的片段的轻链。(1)Fab片段，通常为由VL、VH、CL和CH结构域组成的一价片段；(2)F(ab’)2片段，包含通过铰链区处的二硫键连接的两个Fab片段的二价片段；(3)由VH和CH结构域组成的Fd片段；(4)由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；(5)由VH结构域组成的dAb片段(Ward等，(1989)Nature 341：544-546)；(6)分离的互补决定区(CDR)和(7)可任选地通过接头连接的两个或以上分离的CDR的组合。例如，还可包括由VL和VH配对形成的一价单链分子Fv(scFv)(参见Bird等(1988)Science 242：423-426；以及Huston等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.85：5879-5883)。例如，还可包括缺失抗体轻链而只有重链可变区的一类抗体VHH(例如，可参见康晓圳等，生物工程学报,2018,34(12):1974-1984)。所述“抗原结合部分”还可包括免疫球蛋白融合蛋白，所述融合蛋白包含选自以下的结合结构域：(1)与免疫球蛋白铰链区多肽融合的结合结构域多肽；(2)与铰链区融合的免疫球蛋白重链CH2恒定区；和(3)与CH2恒定区融合的免疫球蛋白重链CH3恒定区。
在本申请中，术语“单克隆抗体”通常是指一群基本同源的抗体，即包含该群的各个抗体除了可能的以微量存在的天然发生的突变之外是相同的。单克隆抗体是高度特异性的，直接针对单个抗原性位点。例如，所述单克隆抗体可以通过杂交瘤技术制备或者通过使用重组DNA方法在细菌、真核动物或植物细胞中产生。单克隆抗体也可以得自噬菌体抗体文库，使用例如Clackson etal.,Nature,352:624-628(1991)和Marks et al.,Mol.Biol.，222:581-597(1991)所述的技术进行。
在本申请中，术语“嵌合抗体”通常是指这样的抗体，其中每个重链或轻链氨基酸序列的一部分与来自特定物种的抗体中相应氨基酸序列同源，或者属于特定的类别，而该链的其余区段则与另一物种中的相应序列同源。例如，轻链和重链的可变区均来自一个动物物种(如小鼠、大鼠等)的抗体的可变区，而恒定部分则与来自另一物种(如人)的抗体序列同源。例如，为获得嵌合抗体，可利用非人源的B细胞或杂交瘤细胞产生可变区，而与其组合的恒定区则来自人。所述可变区具有易于制备的优点，并且其特异性不受与其组合的恒定区的来源的影响。同时，由于嵌合抗体的恒定区可来源于人类，因此嵌合在注射时抗体引发免疫应答的可能性会低于使用恒定区为非人来源的抗体。
在本申请中，术语“人源化抗体”通常是指一种嵌合抗体，其含有较少的来自非人免疫球蛋白的序列，从而降低异种抗体引入到人类中时的免疫原性，同时保持抗体的完全抗原结合亲和力和特异性。例如，可以使用CDR移植(Jones et al.,Nature 321:522(1986))及其变体；包括“重塑”(reshaping)，(Verhoeyen,et al.,1988Science 239:1534-1536；Riechmann,et al.,1988Nature 332:323-337；Tempest,et al.,Bio/Technol 19919:266-271)，“高度加成”(hyperchimerization)，(Queen,et al.,1989Proc Natl AcadSci USA 86:10029-10033；Co,et al.,1991Proc Natl Acad Sci USA88:2869-2873；Co,etal.,1992J Immunol 148:1149-1154)和“贴面”(veneering)，(Mark,et al.,“Derivationof therapeutically active humanized and veneered anti-CD18 antibodies.”In:Metcalf B W,Dalton B J,eds.Cellular adhesion:molecular definition totherapeutic potential.New York:Plenum Press,1994:291-312)、表面重建(美国专利US5639641)等技术手段，对非人源的结合域进行人源化。如果其他区域，例如铰链区和恒定区结构域也源自非人来源，则这些区域也可以被人源化。
在本申请中，术语“鼠源抗体”通常是指可变区框架和CDR区得自小鼠种系免疫球蛋白序列的抗体。此外，如果抗体包含恒定区，其也得自小鼠种系免疫球蛋白序列。本申请的鼠源抗体可以包含不由小鼠种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基，例如可以包括通过体外随机突变或点突变或通过体内体细胞突变而导入的突变。
在本申请中，术语“PD-1蛋白”，“PD-1”或“PD-1抗原”可以互换使用，并且包括PD-1的任何功能活性片段、变体和同源物，其由细胞天然表达或在用PD-1基因转染的细胞上表达。在本申请中，PD-1可以为人PD-1，其在UniProt/Swiss-Prot中的登录号为Q15116。例如，PD-1可以为人PD-1的功能活性片段。例如，所述“功能活性片段”可以包括保留至少一种天然存在的蛋白质的内源功能(例如，与本申请所述的抗原结合蛋白结合)的片段。例如，所述“功能活性片段”可以包括与本申请的抗原结合蛋白结合的结构域。
除了本文提到的特定蛋白质和核苷酸之外，本申请还可包括其功能活性片段、衍生物、类似物、同源物及其片段。
术语“功能活性片段”指与天然存在序列具有基本上同一的氨基酸序列或由基本上同一的核苷酸序列编码并能够具有天然存在序列的一种或多种活性的多肽。在本申请的上下文中，任何给定序列的功能活性片段是指其中残基的特定序列(无论是氨基酸或核苷酸残基)已经经过修饰而使得所述多肽或多核苷酸基本上保留至少一种内源功能的序列。可以通过天然存在的蛋白质和/或多核苷酸中存在的至少一个氨基酸残基和/或核苷酸残基的添加、缺失、取代、修饰、替换和/或变异来获得编码功能活性片段的序列，只要保持原来的功能活性即可。
在本申请中，术语“衍生物”通常是指本申请的多肽或多核苷酸而言包括自/对序列的一个(或多个)氨基酸残基的任何取代、变异、修饰、替换、缺失和/或添加，只要所得的多肽或多核苷酸基本上保留其至少一种内源功能。
在本申请中，术语“类似物”通常对多肽或多核苷酸而言，包括多肽或多核苷酸的任何模拟物，即拥有该模拟物模拟的多肽或多核苷酸的至少一种内源功能的化学化合物。
通常，可以进行氨基酸取代，例如至少1个(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或20个以上)氨基酸取代，只要经修饰的序列基本上保持需要的活性或能力。氨基酸取代可包括使用非天然存在的类似物。
在本申请中，术语“同源物”通常是指与天然存在序列具有一定同源性的氨基酸序列或核苷酸序列。术语“同源性”可以等同于序列“同一性”。同源序列可以包括可以与主题序列是至少80％、85％、90％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％相同的氨基酸序列。通常，同源物将包含与主题氨基酸序列相同的活性位点等。同源性可以根据相似性(即具有相似化学性质/功能的氨基酸残基)来考虑，也可以在序列同一性方面表达同源性。在本申请中，提及的氨基酸序列或核苷酸序列的SEQ ID NO中的任一项具有百分比同一性的序列是指在所提及的SEQ ID NO的整个长度上具有所述百分比同一性的序列。为了确定序列同一性，可进行序列比对，其可通过本领域技术人员了解的各种方式进行，例如，使用BLAST、BLAST-2、ALIGN、NEEDLE或Megalign(DNASTAR)软件等。本领域技术人员能够确定用于比对的适当参数，包括在所比较的全长序列中实现最优比对所需要的任何算法。
用于本申请的蛋白质或多肽也可以具有氨基酸残基的缺失、插入或取代，所述氨基酸残基产生沉默的变化并导致功能上等同的蛋白质。可以根据残基的极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性和/或两性性质的相似性进行有意的氨基酸取代，只要保留内源性功能即可。例如，带负电荷的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；带正电荷的氨基酸包括赖氨酸和精氨酸；并且含具有相似亲水性值的不带电极性头基的氨基酸包括天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸。
在本申请中，术语“肿瘤”通常是指在各种致瘤因子作用下，局部组织细胞增生所形成的赘生物。例如，所述肿瘤可包括实体瘤。例如，所述肿瘤可包括非实体瘤。例如，所述肿瘤可包括与PD-L1的表达相关的肿瘤。术语“与PD-L1的表达相关的肿瘤”通常是指PD-L1表达改变导致疾病进展或逃避免疫监视而形成的肿瘤。例如，所述“与PD-L1的表达相关的肿瘤”可以是PD-L1表达量上调导致疾病进展或逃避免疫监视而形成的肿瘤。所述与PD-L1的蛋白表达相关的肿瘤可以是PD-L1阳性的肿瘤。在PD-L1阳性的肿瘤中，与正常细胞相比，肿瘤细胞表面或肿瘤微环境中的PD-L1的蛋白表达量高约1％，5％，10％，15％，20％，25％，30％，35％，40％，50％，60％，70％，80％或更高。
在本申请中，术语“实体瘤”通常是指可通过临床检测(例如，X线射片，CT扫描，B超或触诊)到的有形肿块。例如，所述实体瘤可选自下组：黑色素瘤，肺癌，头颈鳞状细胞癌，肝细胞癌，肾细胞癌，尿路上皮癌，结直肠癌和乳腺癌。
在本申请中，术语“非实体瘤”通常是指X线射片、CT扫描、B超以及触诊无法看到或扪及到的肿瘤。例如，所述非实体瘤可以包括白血病。例如，所述非实体瘤可以包括淋巴瘤。例如，所述非实体瘤可包括多发性骨髓瘤。
在本申请中，术语“免疫缀合物”通常是指所述其他治疗剂与所述分离的抗原结合蛋白缀合(例如，通过连接分子共价相连)而形成的缀合物，该缀合物可以通过所述分离的抗原结合蛋白与靶细胞上的抗原的特异性结合，将所述其他治疗剂递送至靶细胞(例如，肿瘤细胞)。此外，所述抗原也可以由所述靶细胞分泌，并位于所述靶细胞外的间隙。
在本申请中，术语“受试者”通常指人类或非人类动物，包括但不限于猫、狗、马、猪、奶牛、羊、兔、小鼠、大鼠或猴。
在本申请中，术语“核酸分子”通常是指从其天然环境中分离的或人工合成的任何长度的分离形式的核苷酸、脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其类似物。
在本申请中，术语“载体”通常是指一种核酸分子，该种核酸分子能够转运与其连接的另一核酸。所述载体可将插入的核酸分子转移到细胞中和/或细胞之间。所述载体可包括主要用于将DNA或RNA插入细胞中的载体、主要用于复制DNA或RNA的载体，以及主要用于DNA或RNA的转录和/或翻译的表达的载体。所述载体可以是当引入合适的细胞时能够转录并翻译成多肽的多核苷酸。通常，通过培养包含所述载体的合适的细胞，所述载体可以产生期望的表达产物。在本申请中，所述载体可包含慢病毒载体。
在本申请中，术语“细胞”通常是指可以或已经含有包括本申请所述的核酸分子的质粒或载体，或者能够表达本申请所述的多肽或本申请所述的抗原结合蛋白的个体细胞，细胞系或细胞培养物。所述细胞可以包括单个细胞的子代。由于天然的，意外的或故意的突变，子代细胞与原始亲本细胞在形态上或在基因组上可能不一定完全相同，但能够表达本申请所述的多肽或抗原结合蛋白即可。所述细胞可以通过使用本申请所述的载体体外转染细胞而得到。所述细胞可以是原核细胞(例如大肠杆菌)，也可以是真核细胞(例如酵母细胞，例如COS细胞，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，HeLa细胞，HEK293细胞，COS-1细胞，NS0细胞或骨髓瘤细胞)。在一些实施方式中，所述细胞可以是免疫细胞。例如，所述免疫细胞可以选自下组：T细胞、B细胞、天然杀伤细胞(NK细胞)、巨噬细胞、NKT细胞、单核细胞、树突状细胞、粒细胞、淋巴细胞、白细胞和/或外周血单个核细胞。
在本申请中，术语“治疗”通常是指：(i)预防可能易患疾病、病症和/或病状、但尚未诊断出患病的患者出现该疾病、病症或病状；(ii)抑制该疾病、病症或病状，亦即遏制其发展；以及(iii)缓解该疾病、病症或病状，亦即使得该疾病、病症和/或病状和/或与该疾病、病症和/或病状相关联的症状消退。
在本申请中，术语“多肽”、“肽”、“蛋白”和“蛋白质”可互换地使用，通常是指具有任何长度的氨基酸的聚合物。该聚合物可以是直链或支链的，它可以包含修饰的氨基酸，并且可以被非氨基酸中断。这些术语还涵盖已经被修饰的氨基酸聚合物。这些修饰可以包含：二硫键形成、糖基化、脂化(lipidation)、乙酰化、磷酸化、或任何其他操纵(如与标记组分结合)。术语“氨基酸”包括天然的和/或非天然的或者合成的氨基酸，包括甘氨酸以及D和L旋光异构体、以及氨基酸类似物和肽模拟物。
在本申请中，术语“多核苷酸”、“核苷酸”、“核苷酸序列”、“核酸”和“寡核苷酸”可互换地使用，通常是指具有任何长度的核苷酸的聚合形式，如脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸、或其类似物。多核苷酸可具有任何三维结构，并且可以执行已知或未知的任何功能。以下是多核苷酸的非限制性实例：基因或基因片段的编码区或非编码区、根据连接分析定义的多个座位(一个座位)、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转运RNA、核糖体RNA、短干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)、micro-RNA(miRNA)、核酶、cDNA、重组多核苷酸、分支多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离的DNA、任何序列的分离的RNA、核酸探针、和引物。多核苷酸可以包含一个或多个经修饰的核苷酸，如甲基化的核苷酸和核苷酸类似物。如果存在，可以在聚合物组装之前或之后进行核苷酸结构的修饰。核苷酸的序列可以被非核苷酸组分中断。多核苷酸可以在聚合后，如通过与标记的组分缀合来进一步修饰。
在本申请中，术语“KD”(同样地，“KD”或“KD”)通常指“亲和常数”或“平衡解离常数”，并指在滴定测量中在平衡时、或者通过将解离速率常数(kd)除以结合速率常数(ka)所获得的值。使用结合速率常数(ka)、解离速率常数(kd)和平衡解离常数(KD)表示结合蛋白(例如本申请所述的分离的抗原结合蛋白)对抗原(例如，PD-1蛋白)的结合亲和力。确定结合和解离速率常数的方法为本领域熟知。使用基于荧光的技术提供了高灵敏度以及在生理缓冲液中在平衡时检查样品的能力。例如，可以通过Biacore(生物分子相互作用分析)测定(例如，可以从BIAcoreInternationalAB，aGEHealthcarecompany，Uppsala，瑞典获得的仪器)所述KD值，也可以使用其他实验途径和仪器例如Octet检测。另外，也可以使用可以从SapidyneInstruments(Boise，Idaho)获得的KinExA(动态排阻测定(KineticExclusionAssay))测定所述KD值，或者使用表面等离子共振仪(SPR)测定所述KD值。例如，也可以通过胺偶联试剂盒测定所述KD值。
在本申请中，术语“和/或”应理解为意指可选项中的任一项或可选项的两项。
在本申请中，术语“包含”通常是指包括明确指定的特征，但不排除其他要素。在某些情形中，“包含”也涵盖仅包括指定的组分的情况。例如，包含也表示为也表示“由……组成”的含义。
在本申请中，术语“约”通常是指在指定数值以上或以下0.5％-10％的范围内变动，例如在指定数值以上或以下0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％、5％、5.5％、6％、6.5％、7％、7.5％、8％、8.5％、9％、9.5％、或10％的范围内变动。
在本申请中，术语“包括”通常是指包含、总括、含有或包涵的含义。在某些情况下，也表示“为”、“由……组成”的含义。
发明详述
本申请所述分离的抗原结合蛋白
一方面，本申请提供一种分离的抗原结合蛋白，其在Biacore测定中，可以以约5E-07M或以下的KD值(例如，所述KD不高于约5E-07M、不高于约4.9E-07M、不高于约4.8E-07M、不高于约4.7E-07M、不高于约4.6E-07M、不高于约4.5E-07M、不高于约4.4E-07M、不高于约4.3E-07M、不高于约4.0E-07M、不高于约3.5E-07M、不高于约3.0E-07M、不高于约2.5E-07M、不高于约2.0E-07M、不高于约1.5E-07M、不高于约1.0E-07M、不高于约9E-08M或不高于约8.5E-08M或以下)与人PD-1蛋白特异性结合。
一方面，本申请提供一种分离的抗原结合蛋白，其可以包含抗体重链可变区VH中的至少一个CDR，所述VH可以包含SEQ ID NO:54所示的氨基酸序列。
例如，所述VH可以包含SEQ ID NO:29至SEQ ID NO:31中任一项所示的氨基酸序列。在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白的HCDR可以通过任何形式划分，只要VH与SEQ IDNO:29至SEQ ID NO:31中任一项所示的氨基酸序列相同，以任何形式划分得到的HCDR都可落入本申请的保护范围内。
抗体的CDR又称互补决定区，是可变区的一部分。该区域的氨基酸残基可以与抗原或抗原表位接触。抗体CDR可以通过多种编码系统来确定，如CCG、Kabat、Chothia、IMGT、AbM、综合考虑Kabat/Chothia等。这些编码系统为本领域内已知，具体可参见，例如，http://www.bioinf.org.uk/abs/index.html#kabatnum。本领域技术人员可以根据抗体的序列和结构，用不同的编码系统确定出CDR区。使用不同的编码系统，CDR区可能存在差别。在本申请中，所述CDR涵盖根据任何CDR划分方式划分得到的CDR序列；也涵盖其变体，所述变体包括所述CDR的氨基酸序列经过取代、缺失和/或添加一个或多个氨基酸。例如1-30个、1-20个或1-10个，又例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个或9个氨基酸取代、缺失和/或插入；也涵盖其同源物，所述同源物可以为与所述CDR的氨基酸序列具有至少约85％(例如，具有至少约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或更高的)序列同源性的氨基酸序列。在某些实施方式中，本申请所述分离的抗原结合蛋白通过Kabat编码系统定义。
在本申请中，所述抗原结合蛋白可包含重链可变区VH，所述VH可包含HCDR1、HCDR2和HCDR3中的至少一个、两个或三个。
在本申请中，所述抗原结合蛋白的HCDR3可包含SEQ ID NO:53所示的氨基酸序列。例如，所述抗原结合蛋白的HCDR3序列可根据Kabat编码系统定义。
例如，所述抗原结合蛋白的HCDR3与SEQ ID NO：53所示的序列相比，在选自下组的一个或多个氨基酸处存在氨基酸取代(例如，保守氨基酸取代等)：X1。
X1HYGTSPFVY(SEQ ID NO：53)，其中，X1可以是D或E。
在本申请中，所述抗原结合蛋白的HCDR3可包含SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10中任一项所示的氨基酸序列。例如，所述抗原结合蛋白的HCDR3序列可根据Kabat编码系统定义。
在本申请中，所述抗原结合蛋白的HCDR2可包含SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列。例如，所述抗原结合蛋白的HCDR2序列可根据Kabat编码系统定义。
在本申请中，所述抗原结合蛋白的HCDR1可包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。例如，所述抗原结合蛋白的HCDR1序列可根据Kabat编码系统定义。
例如，所述抗原结合蛋白的HCDR1可包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；所述HCDR2可包含SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列；且所述HCDR3可包含SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列。例如，所述抗原结合蛋白可包括抗体19D4F1、hu19D4-25、19D4-25-1A3、19D4-25-1B3、19D4-25-1C2、19D4-25-1E4、19D4-25-2E10或与其具有相同HCDR3(例如，与其具有相同的HCDR1-3)的抗原结合片段。
例如，所述抗原结合蛋白的HCDR1可包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；所述HCDR2可包含SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列；且所述HCDR3可包含SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列。例如，所述抗原结合蛋白可包括抗体19D4-25-3C11、19D4-25-1C2-3C11或与其具有相同HCDR3(例如，与其具有相同的HCDR1-3)的抗原结合片段。
例如，所述抗原结合蛋白的VH可包含框架区H-FR1，H-FR2，H-FR3和H-FR4。
在本申请中，所述抗原结合蛋白的H-FR1可包含SEQ ID NO:49所示的氨基酸序列。例如，所述抗原结合蛋白的H-FR1与SEQ ID NO:49所示的序列相比，在选自下组的一个或多个氨基酸处存在氨基酸取代(例如，保守氨基酸取代等)：X1，X5，X13，X16，X17和X20。
X1VQLX5ESGPGLVX13PSX16X17LSX20TCTVSGFSLT(SEQ ID NO：49)，其中，X1可以是E或Q，X5可以是K或Q，X13可以是A或K，X16可以是E或Q，X17可以是S或T和X20可以是I或L。
在本申请中，所述抗原结合蛋白的H-FR1可包含SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2中任一项所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述抗原结合蛋白的H-FR2可包含SEQ ID NO:50所示的氨基酸序列。例如，所述抗原结合蛋白的H-FR2与SEQ ID NO:50所示的序列相比，在选自下组的一个或多个氨基酸处存在氨基酸取代(例如，保守氨基酸取代等)：X2和X13。
WX2RQPPGKGLEWX13G(SEQ ID NO：50)，其中，X2可以是I或V，X13可以是I或L。
在本申请中，所述抗原结合蛋白的H-FR2可包含SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5中任一项所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述抗原结合蛋白的H-FR3可包含SEQ ID NO:51所示的氨基酸序列。例如，所述抗原结合蛋白的H-FR3与SEQ ID NO:51所示的序列相比，在选自下组的一个或多个氨基酸处存在氨基酸取代(例如，保守氨基酸取代等)：X2，X3，X8，X11，X14，X17，X18，X20，X21，X22，X23和X27。
RX2X3ISKDX8SKX11QVX14LKX17X18SX20X21X22X23DTAX27YYCAR(SEQ ID NO：51)，其中，X2可以是L或V，X3可以是S或T，X8可以是N或T，X11可以是N或S，X14可以是F或S，X17可以是L或M，X18可以是N或S，X20可以是L或V，X21可以是Q或T，X22可以是A或T，X23可以是A或E，X27可以是S或V。
在本申请中，所述抗原结合蛋白的H-FR3可包含SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8中任一项所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述抗原结合蛋白的H-FR4可包含SEQ ID NO:52所示的氨基酸序列。例如，所述抗原结合蛋白的H-FR4与SEQ ID NO:52所示的序列相比，在选自下组的一个或多个氨基酸处存在氨基酸取代(例如，保守氨基酸取代等)：X11。
WGQGTLVTVSX11(SEQ ID NO：52)，其中，X11可以是A或S。
在本申请中，所述抗原结合蛋白的H-FR4可包含SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12中任一项所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述抗原结合蛋白的H-FR1可包含SEQ ID NO:49所示的氨基酸序列；所述H-FR2可包含SEQ ID NO:50所示的氨基酸序列；所述H-FR3可包含SEQ ID NO:51所示的氨基酸序列；且所述H-FR4可包含SEQ ID NO:52所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述抗原结合蛋白的H-FR1可包含SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2中任一项所示的氨基酸序列；所述H-FR2可包含SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5中任一项所示的氨基酸序列；所述H-FR3可包含SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8中任一项所示的氨基酸序列；且所述H-FR4可包含SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12中任一项所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述抗原结合蛋白的H-FR1可包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；所述H-FR2可包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列；所述H-FR3可包含SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列；且所述H-FR4可包含SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列。例如，所述抗原结合蛋白可包括抗体19D4F1或与其具有相同H-FR1-4的抗原结合片段。
在本申请中，所述抗原结合蛋白的H-FR1可包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；所述H-FR2可包含SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列；所述H-FR3可包含SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列；且所述H-FR4可包含SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列。例如，所述抗原结合蛋白可包括抗体hu19D4-25、19D4-25-1A3、19D4-25-1B3、19D4-25-1C2、19D4-25-1E4、19D4-25-2E10、19D4-25-3C11、19D4-25-1C2-3C11或与其具有相同H-FR1-4的抗原结合片段。
在本申请中，所述抗原结合蛋白可包含重链可变区，所述重链可变区可包SEQ IDNO:54所示的氨基酸序列。例如，所述抗原结合蛋白包含VH，所述VH与SEQ ID NO:54所示的序列相比，在选自下组的一个或多个氨基酸处存在氨基酸取代(例如，保守氨基酸取代等)：X1，X5，X13，X16，X17，X20，X37，X48，X67，X68，X73，X76，X79，X82，X83，X85，X86，X87，X88，X92，X98和X118。
X1VQLX5ESGPGLVX13PSX16X17LSX20TCTVSGFSLTSYAISWX37RQPPGKGLEWX48GVIWTGGGTNYNSALKSRX67X68ISKDX73SKX76QVX79LKX82X83SX85X86X87X88DTAX92YYCARX98HYGTSPFVYWGQGTLVTVSX118(SEQ ID NO：54)，其中，X1可以是E或Q，X5可以是K或Q，X13可以是A或K，X16可以是E或Q，X17可以是S或T，X20可以是I或L，X37可以是I或V，X48可以是I或L，X67可以是L或V，X68可以是S或T，X73可以是N或T，X76可以是N或S，X79可以是F或S，X82可以是L或M，X83可以是N或S，X85可以是L或V，X86可以是Q或T，X87可以是A或T，X88可以是A或E，X92可以是S或V，X98可以是D或E，X118可以是A或S。
在本申请中，所述抗原结合蛋白的重链可变区可包含SEQ ID NO:29至SEQ ID NO:31中任一项所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述抗原结合蛋白可包含重链恒定区，所述重链恒定区可包括源自IgG的恒定区或源自IgY的恒定区。
例如，所述抗原结合蛋白的重链恒定区可包含SEQ ID NO:48所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述抗原结合蛋白可以包含抗体轻链可变区VL中的至少一个CDR，所述VL可以包含SEQ ID NO:60所示的氨基酸序列。
例如，所述VL可以包含SEQ ID NO:32至SEQ ID NO:38中任一项所示的氨基酸序列。在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白的LCDR可以通过任何形式划分，只要VL与SEQ IDNO:32至SEQ ID NO:38中任一项所示的氨基酸序列相同，以任何形式划分得到的LCDR都可落入本申请的保护范围内。
在本申请中，所述抗原结合蛋白可包括轻链可变区VL，所述VL可包含LCDR1、LCDR2和LCDR3中的至少一个，至少两个或至少三个。
在本申请中，所述抗原结合蛋白的LCDR3可包含SEQ ID NO:59所示的氨基酸序列。例如，所述抗原结合蛋白的LCDR3可根据Kabat编号系统定义。
例如，所述抗原结合蛋白的LCDR3与SEQ ID NO:59所示的序列相比，在选自下组的一个或多个氨基酸处存在氨基酸取代(例如，保守氨基酸取代等)：X1，X4，X5，X7和X9。
X1QSX4X5VX7WX9(SEQ ID NO：59)，其中，X1可以是Q或S，X4可以是K，L或S，X5可以是E，H，K或R，X7可以是N或P，X9可以是S或T。
在本申请中，所述抗原结合蛋白的LCDR3可包含SEQ ID NO:21至SEQ ID NO:26中任一项所示的氨基酸序列。例如，所述抗原结合蛋白的LCDR3可根据Kabat编号系统定义。
在本申请中，所述抗原结合蛋白的LCDR2可包含SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列。例如，所述抗原结合蛋白的LCDR2可根据Kabat编号系统定义。
在本申请中，所述抗原结合蛋白的LCDR1可包含SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列。例如，所述抗原结合蛋白的LCDR1可根据Kabat编号系统定义。
例如，本申请所述抗原结合蛋白的LCDR1可包含SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列；所述LCDR2可包含SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列；且所述LCDR3可包含SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列。例如，所述抗原结合蛋白可包括抗体19D4F1、hu19D4-25、19D4-25-3C11或与其具有相同LCDR3(例如，与其具有相同LCDR1-3)的抗原结合片段。
例如，本申请所述抗原结合蛋白的LCDR1可包含SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列；所述LCDR2可包含SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列；且所述LCDR3可包含SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列。例如，所述抗原结合蛋白可包括抗体19D4-25-1A3或与其具有相同LCDR3(例如，与其具有相同LCDR1-3)的抗原结合片段。
例如，本申请所述抗原结合蛋白的LCDR1可包含SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列；所述LCDR2可包含SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列；且所述LCDR3可包含SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列。例如，所述抗原结合蛋白可包括抗体19D4-25-1B3或与其具有相同LCDR3(例如，与其具有相同LCDR1-3)的抗原结合片段。
例如，本申请所述抗原结合蛋白的LCDR1可包含SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列；所述LCDR2可包含SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列；且所述LCDR3可包含SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列。例如，所述抗原结合蛋白可包括抗体19D4-25-1C2、19D4-25-1C2-3C11或与其具有相同LCDR3(例如，与其具有相同LCDR1-3)的抗原结合片段。
例如，本申请所述抗原结合蛋白的LCDR1可包含SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列；所述LCDR2可包含SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列；且所述LCDR3可包含SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列。例如，所述抗原结合蛋白可包括抗体19D4-25-1E4或与其具有相同LCDR3(例如，与其具有相同LCDR1-3)的抗原结合片段。
例如，本申请所述抗原结合蛋白的LCDR1可包含SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列；所述LCDR2可包含SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列；且所述LCDR3可包含SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列。例如，所述抗原结合蛋白可包括抗体19D4-25-2E10或与其具有相同LCDR3(例如，与其具有相同LCDR1-3)的抗原结合片段。
例如，所述抗原结合蛋白的VL可包含框架区L-FR1，L-FR2，L-FR3和L-FR4。
在本申请中，所述抗原结合蛋白的L-FR1可包含SEQ ID NO:55所示的氨基酸序列。例如，所述抗原结合蛋白的L-FR1与SEQ ID NO:55所示的序列相比，在选自下组的一个或多个氨基酸处存在氨基酸取代(例如，保守氨基酸取代等)：X7，X9，X12，X14，X15，X18和X20。
DIVLTQX7PX9SLX12VX14X15GQX18AX20ISC(SEQ ID NO：55)，其中，X7可以是S或T，X9可以是A或L，X12可以是A或S，X14可以是S或T，X15可以是L或P，X18可以是P或R，X20可以是S或T。
在本申请中，所述抗原结合蛋白的L-FR1可包含SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14中任一项所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述抗原结合蛋白的L-FR2可包含SEQ ID NO:56所示的氨基酸序列。例如，所述抗原结合蛋白的L-FR2与SEQ ID NO:56所示的序列相比，在选自下组的一个或多个氨基酸处存在氨基酸取代(例如，保守氨基酸取代等)：X3和X11。
WFX3QKPGQPPX11LLIY(SEQ ID NO：56)，其中，X3可以是L或Q，X11可以是K或Q。
在本申请中，所述抗原结合蛋白的L-FR2可包含SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:17中任一项所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述抗原结合蛋白的L-FR3可包含SEQ ID NO:57所示的氨基酸序列。例如，所述抗原结合蛋白的L-FR3与SEQ ID NO:57所示的序列相比，在选自下组的一个或多个氨基酸处存在氨基酸取代(例如，保守氨基酸取代等)：X4，X16，X18，X20，X21，X22，X24，X25，X27，X28和X29。
GVPX4RFSGSGSGTDFX16LX18IX20X21X22EX24X25DX27X28X29YFC(SEQ ID NO：57)，其中，X4可以是A或D，X16可以是S或T，X18可以是K或N，X20可以是H或S，X21可以是P或R，X22可以是M或V，X24可以是A或E，X25可以是D或E，X27可以是T或V，X28可以是A或G，X29可以是M或V。
在本申请中，所述抗原结合蛋白的L-FR3可包含SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20中任一项所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述抗原结合蛋白的L-FR4可包含SEQ ID NO:58所示的氨基酸序列。例如，所述抗原结合蛋白的L-FR4与SEQ ID NO:58所示的序列相比，在选自下组的一个或多个氨基酸处存在氨基酸取代(例如，保守氨基酸取代等)：X7。
FGGGTKX7EIK(SEQ ID NO：58)，其中，X7可以是L或V。
在本申请中，所述抗原结合蛋白的L-FR4可包含SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28中任一项所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述抗原结合蛋白的L-FR1可包含SEQ ID NO:55所示的氨基酸序列；所述L-FR2可包含SEQ ID NO:56所示的氨基酸序列；所述L-FR3可包含SEQ ID NO:57所示的氨基酸序列；且所述L-FR4可包含SEQ ID NO:58所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述抗原结合蛋白的L-FR1可包含SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14中任一项所示的氨基酸序列；所述L-FR2可包含SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:17中任一项所示的氨基酸序列；所述L-FR3可包含SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20中任一项所示的氨基酸序列；且所述L-FR4可包含SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28中任一项所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述抗原结合蛋白的L-FR1可包含SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列；所述L-FR2可包含SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列；所述L-FR3可包含SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列；且所述L-FR4可包含SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列。例如，所述抗原结合蛋白可包括抗体19D4F1或与其具有相同L-FR1-4的抗体。
在本申请中，所述抗原结合蛋白的L-FR1可包含SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列；所述L-FR2可包含SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列；所述L-FR3可包含SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列；且所述L-FR4可包含SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列。例如，所述抗原结合蛋白可包括抗体hu19D4-25、19D4-25-1A3、19D4-25-1B3、19D4-25-1C2、19D4-25-1E4、19D4-25-2E10、19D4-25-3C11、19D4-25-1C2-3C11或与其具有相同H-FR1-4的抗体。
在本申请中，所述抗原结合蛋白可包含轻链可变区VL，所述VL可包含SEQ ID NO:60所示的氨基酸序列。例如，所述抗原结合蛋白的VL与SEQ ID NO:60所示的序列相比，在选自下组的一个或多个氨基酸处存在氨基酸取代(例如，保守氨基酸取代等)：X7，X9，X12，X14，X15，X18，X20，X41，X49，X64，X76，X78，X80，X81，X82，X84，X85，X87，X88，X89，X93，X96，X97，X99，X101和X108。
DIVLTQX7PX9SLX12VX14X15GQX18AX20ISCRASESVDNYGISFMNWFX41QKPGQPPX49LLIYAASNQGSGVPX64RFSGSGSGTDFX76LX78IX80X81X82EX84X85DX87X88X89YFCX93QSX96X97VX99WX101FGGGTKX108EIK(SEQ ID NO：60)，其中，X7可以是S或T，X9可以是A或L，X12可以是A或S，X14可以是S或T，X15可以是L或P，X18可以是P或R，X20可以是S或T，X41可以是L或Q，X49可以是K或Q，X64可以是A或D，X76可以是S或T，X78可以是K或N，X80可以是H或S，X81可以是P或R，X82可以是M或V，X84可以是A或E，X85可以是D或E，X87可以是T或V，X88可以是A或G，X89可以是M或V，X93可以是Q或S，X96可以是K，L或S，X97可以是E，H，K或R，X99可以是N或P，X101可以是S或T，X108可以是L或V。
在本申请中，所述抗原结合蛋白的轻链可变区可包含SEQ ID NO:32至SEQ ID NO:38中任一项所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述抗原结合蛋白可包含轻链恒定区，所述轻链恒定区可包括源自Igκ的恒定区或源自Igλ的恒定区。
例如，所述轻链恒定区可包括源自Igκ的恒定区。
例如，所述抗原结合蛋白的轻链恒定区包含SEQ ID NO:47所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述抗原结合蛋白可包含HCDR1-3和LCDR1-3。例如，所述抗原结合蛋白的HCDR1可包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；所述抗原结合蛋白的HCDR2可包含SEQID NO:6所示的氨基酸序列；所述抗原结合蛋白的HCDR3可包含SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列；所述抗原结合蛋白的LCDR1可包括SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列；所述抗原结合蛋白的LCDR2可包含SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列；所述抗原结合蛋白的LCDR3可包含SEQID NO:21所示的氨基酸序列。例如，所述抗原结合蛋白可包括抗体19D4F1、hu19D4-25或与其具有相同HCDR3(例如，与其具有相同HCDR1-3)和LCDR3(例如，与其具有相同LCDR1-3)的抗原结合片段。
在本申请中，所述抗原结合蛋白可包含HCDR1-3和LCDR1-3。例如，所述抗原结合蛋白的HCDR1可包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；所述抗原结合蛋白的HCDR2可包含SEQID NO:6所示的氨基酸序列；所述抗原结合蛋白的HCDR3可包含SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列；所述抗原结合蛋白的LCDR1可包括SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列；所述抗原结合蛋白的LCDR2可包含SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列；所述抗原结合蛋白的LCDR3可包含SEQID NO:22所示的氨基酸序列。例如，所述抗原结合蛋白可包括抗体19D4-25-1A3或与其具有相同HCDR3(例如，与其具有相同HCDR1-3)和LCDR3(例如，与其具有相同LCDR1-3)的抗原结合片段。
在本申请中，所述抗原结合蛋白可包含HCDR1-3和LCDR1-3。例如，所述抗原结合蛋白的HCDR1可包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；所述抗原结合蛋白的HCDR2可包含SEQID NO:6所示的氨基酸序列；所述抗原结合蛋白的HCDR3可包含SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列；所述抗原结合蛋白的LCDR1可包括SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列；所述抗原结合蛋白的LCDR2可包含SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列；所述抗原结合蛋白的LCDR3可包含SEQID NO:23所示的氨基酸序列。例如，所述抗原结合蛋白可包括抗体19D4-25-1B3或与其具有相同HCDR3(例如，与其具有相同HCDR1-3)和LCDR3(例如，与其具有相同LCDR1-3)的抗原结合片段。
在本申请中，所述抗原结合蛋白可包含HCDR1-3和LCDR1-3。例如，所述抗原结合蛋白的HCDR1可包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；所述抗原结合蛋白的HCDR2可包含SEQID NO:6所示的氨基酸序列；所述抗原结合蛋白的HCDR3可包含SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列；所述抗原结合蛋白的LCDR1可包括SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列；所述抗原结合蛋白的LCDR2可包含SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列；所述抗原结合蛋白的LCDR3可包含SEQID NO:24所示的氨基酸序列。例如，所述抗原结合蛋白可包括抗体19D4-25-1C2或与其具有相同HCDR3(例如，与其具有相同HCDR1-3)和LCDR3(例如，与其具有相同LCDR1-3)的抗原结合片段。
在本申请中，所述抗原结合蛋白可包含HCDR1-3和LCDR1-3。例如，所述抗原结合蛋白的HCDR1可包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；所述抗原结合蛋白的HCDR2可包含SEQID NO:6所示的氨基酸序列；所述抗原结合蛋白的HCDR3可包含SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列；所述抗原结合蛋白的LCDR1可包括SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列；所述抗原结合蛋白的LCDR2可包含SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列；所述抗原结合蛋白的LCDR3可包含SEQID NO:25所示的氨基酸序列。例如，所述抗原结合蛋白可包括抗体19D4-25-1E4或与其具有相同HCDR3(例如，与其具有相同HCDR1-3)和LCDR3(例如，与其具有相同LCDR1-3)的抗原结合片段。
在本申请中，所述抗原结合蛋白可包含HCDR1-3和LCDR1-3。例如，所述抗原结合蛋白的HCDR1可包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；所述抗原结合蛋白的HCDR2可包含SEQID NO:6所示的氨基酸序列；所述抗原结合蛋白的HCDR3可包含SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列；所述抗原结合蛋白的LCDR1可包括SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列；所述抗原结合蛋白的LCDR2可包含SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列；所述抗原结合蛋白的LCDR3可包含SEQID NO:26所示的氨基酸序列。例如，所述抗原结合蛋白可包括抗体19D4-25-2E10或与其具有相同HCDR3(例如，与其具有相同HCDR1-3)和LCDR3(例如，与其具有相同LCDR1-3)的抗原结合片段。
在本申请中，所述抗原结合蛋白可包含HCDR1-3和LCDR1-3。例如，所述抗原结合蛋白的HCDR1可包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；所述抗原结合蛋白的HCDR2可包含SEQID NO:6所示的氨基酸序列；所述抗原结合蛋白的HCDR3可包含SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列；所述抗原结合蛋白的LCDR1可包括SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列；所述抗原结合蛋白的LCDR2可包含SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列；所述抗原结合蛋白的LCDR3可包含SEQID NO:21所示的氨基酸序列。例如，所述抗原结合蛋白可包括抗体19D4-25-3C11或与其具有相同HCDR3(例如，与其具有相同HCDR1-3)和LCDR3(例如，与其具有相同LCDR1-3)的抗原结合片段。
在本申请中，所述抗原结合蛋白可包含HCDR1-3和LCDR1-3。例如，所述抗原结合蛋白的HCDR1可包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；所述抗原结合蛋白的HCDR2可包含SEQID NO:6所示的氨基酸序列；所述抗原结合蛋白的HCDR3可包含SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列；所述抗原结合蛋白的LCDR1可包括SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列；所述抗原结合蛋白的LCDR2可包含SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列；所述抗原结合蛋白的LCDR3可包含SEQID NO:24所示的氨基酸序列。例如，所述抗原结合蛋白可包括抗体19D4-25-1C2-3C11或与其具有相同HCDR3(例如，与其具有相同HCDR1-3)和LCDR3(例如，与其具有相同LCDR1-3)的抗原结合片段。
在本申请中，所述抗原结合蛋白可包含重链可变区和轻链可变区。所述抗原结合蛋白的重链可变区可包含HCDR1-3以及H-FR1-4。所述抗原结合蛋白的轻链可变区可包含LCDR1-3以及L-FR1-4。例如，所述HCDR1可包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；所述HCDR2可包含SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列；所述HCDR3可包含SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列；所述LCDR1可包括SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列；所述LCDR2可包含SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列；所述LCDR3可包含SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列。例如，所述H-FR1可包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；所述H-FR2可包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列；所述H-FR3可包含SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列；所述H-FR4可包含SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列；所述L-FR1可包括SEQ ID NO:13的氨基酸序列；所述L-FR2可包含SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列；所述L-FR3可包含SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列；所述L-FR4可包含SEQID NO:27所示的氨基酸序列。例如，所述抗原结合蛋白的重链可变区可包含SEQ ID NO:29所示的氨基酸序列。例如，所述抗原结合蛋白可包括抗体19D4F1或与其具有相同重链可变区的抗原结合蛋白。例如，所述抗原结合蛋白的轻链可变区可包含SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列。例如，所述抗原结合蛋白可包括抗体19D4F1或与其具有相同轻链可变区的抗原结合蛋白。
在本申请中，所述抗原结合蛋白可包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区可包含HCDR1-3以及H-FR1-4。所述轻链可变区可包含LCDR1-3以及L-FR1-4。例如，所述HCDR1可包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；所述HCDR2可包含SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列；所述HCDR3可包含SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列；所述LCDR1可包括SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列；所述LCDR2可包含SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列；所述LCDR3可包含SEQID NO:21所示的氨基酸序列。例如，所述H-FR1可包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；所述H-FR2可包含SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列；所述H-FR3可包含SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列；所述H-FR4可包含SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列；所述L-FR1可包括SEQ ID NO:14的氨基酸序列；所述L-FR2可包含SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列；所述L-FR3可包含SEQID NO:20所示的氨基酸序列；所述L-FR4可包含SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列。例如，所述抗原结合蛋白的重链可变区可包含SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列。例如，所述抗原结合蛋白可包括抗体hu19D4-25或与其具有相同重链可变区的抗原结合蛋白。例如，所述抗原结合蛋白的轻链可变区可包含SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列。例如，所述抗原结合蛋白可包括抗体hu19D4-25或与其具有相同轻链可变区的抗原结合蛋白。
在本申请中，所述抗原结合蛋白可包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区可包含HCDR1-3以及H-FR1-4。所述轻链可变区可包含LCDR1-3以及L-FR1-4。例如，所述HCDR1可包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；所述HCDR2可包含SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列；所述HCDR3可包含SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列；所述LCDR1可包括SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列；所述LCDR2可包含SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列；所述LCDR3可包含SEQID NO:22所示的氨基酸序列。例如，所述H-FR1可包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；所述H-FR2可包含SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列；所述H-FR3可包含SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列；所述H-FR4可包含SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列；所述L-FR1可包括SEQ ID NO:14的氨基酸序列；所述L-FR2可包含SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列；所述L-FR3可包含SEQID NO:20所示的氨基酸序列；所述L-FR4可包含SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列。例如，所述抗原结合蛋白的重链可变区可包含SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列。例如，所述抗原结合蛋白可包括抗体19D4-25-1A3或与其具有相同重链可变区的抗原结合蛋白。例如，所述抗原结合蛋白的轻链可变区可包含SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列。例如，所述抗原结合蛋白可包括抗体19D4-25-1A3或与其具有相同轻链可变区的抗原结合蛋白。
在本申请中，所述抗原结合蛋白可包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区可包含HCDR1-3以及H-FR1-4。所述轻链可变区可包含LCDR1-3以及L-FR1-4。例如，所述HCDR1可包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；所述HCDR2可包含SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列；所述HCDR3可包含SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列；所述LCDR1可包括SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列；所述LCDR2可包含SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列；所述LCDR3可包含SEQID NO:23所示的氨基酸序列。例如，所述H-FR1可包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；所述H-FR2可包含SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列；所述H-FR3可包含SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列；所述H-FR4可包含SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列；所述L-FR1可包括SEQ ID NO:14的氨基酸序列；所述L-FR2可包含SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列；所述L-FR3可包含SEQID NO:20所示的氨基酸序列；所述L-FR4可包含SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列。例如，所述抗原结合蛋白的重链可变区可包含SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列。例如，所述抗原结合蛋白可包括抗原结合片段19D4-25-1B3或与其具有相同重链可变区的抗原结合蛋白。例如，所述抗原结合蛋白的轻链可变区可包含SEQ ID NO:35所示的氨基酸序列。例如，所述抗原结合蛋白可包括抗体19D4-25-1B3或与其具有相同轻链可变区的抗原结合蛋白。
在本申请中，所述抗原结合蛋白可包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区可包含HCDR1-3以及H-FR1-4。所述轻链可变区可包含LCDR1-3以及L-FR1-4。例如，所述HCDR1可包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；所述HCDR2可包含SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列；所述HCDR3可包含SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列；所述LCDR1可包括SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列；所述LCDR2可包含SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列；所述LCDR3可包含SEQID NO:24所示的氨基酸序列。例如，所述H-FR1可包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；所述H-FR2可包含SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列；所述H-FR3可包含SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列；所述H-FR4可包含SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列；所述L-FR1可包括SEQ ID NO:14的氨基酸序列；所述L-FR2可包含SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列；所述L-FR3可包含SEQID NO:20所示的氨基酸序列；所述L-FR4可包含SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列。例如，所述抗原结合蛋白的重链可变区可包含SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列。例如，所述抗原结合蛋白可包括抗体19D4-25-1C2或与其具有相同重链可变区的抗原结合蛋白。例如，所述抗原结合蛋白的轻链可变区可包含SEQ ID NO:36所示的氨基酸序列。例如，所述抗原结合蛋白可包括抗体19D4-25-1C2或与其具有相同轻链可变区的抗原结合蛋白。
在本申请中，所述抗原结合蛋白可包含重链可变区和轻链可变区。所述抗原结合蛋白的重链可变区可包含HCDR1-3以及H-FR1-4。所述抗原结合蛋白的轻链可变区可包含LCDR1-3以及L-FR1-4。例如，所述HCDR1可包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；所述HCDR2可包含SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列；所述HCDR3可包含SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列；所述LCDR1可包括SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列；所述LCDR2可包含SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列；所述LCDR3可包含SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列。例如，所述H-FR1可包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；所述H-FR2可包含SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列；所述H-FR3可包含SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列；所述H-FR4可包含SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列；所述L-FR1可包括SEQ ID NO:14的氨基酸序列；所述L-FR2可包含SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列；所述L-FR3可包含SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列；所述L-FR4可包含SEQID NO:28所示的氨基酸序列。例如，所述抗原结合蛋白的重链可变区可包含SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列。例如，所述抗原结合蛋白可包括抗体19D4-25-1E4或与其具有相同重链可变区的抗原结合蛋白。例如，所述抗原结合蛋白的轻链可变区可包含SEQ ID NO:37所示的氨基酸序列。例如，所述抗原结合蛋白可包括抗体19D4-25-1E4或与其具有相同轻链可变区的抗原结合蛋白。
在本申请中，所述抗原结合蛋白可包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区可包含HCDR1-3以及H-FR1-4。所述轻链可变区可包含LCDR1-3以及L-FR1-4。例如，所述HCDR1可包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；所述HCDR2可包含SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列；所述HCDR3可包含SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列；所述LCDR1可包括SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列；所述LCDR2可包含SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列；所述LCDR3可包含SEQID NO:26所示的氨基酸序列。例如，所述H-FR1可包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；所述H-FR2可包含SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列；所述H-FR3可包含SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列；所述H-FR4可包含SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列；所述L-FR1可包括SEQ ID NO:14的氨基酸序列；所述L-FR2可包含SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列；所述L-FR3可包含SEQID NO:20所示的氨基酸序列；所述L-FR4可包含SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列。例如，所述抗原结合蛋白的重链可变区可包含SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列。例如，所述抗原结合蛋白可包括抗体19D4-25-2E10或与其具有相同重链可变区的抗原结合蛋白。例如，所述抗原结合蛋白的轻链可变区可包含SEQ ID NO:38所示的氨基酸序列。例如，所述抗原结合蛋白可包括抗体19D4-25-2E10或与其具有相同轻链可变区的抗原结合蛋白。
在本申请中，所述抗原结合蛋白可包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区可包含HCDR1-3以及H-FR1-4。所述轻链可变区可包含LCDR1-3以及L-FR1-4。例如，所述HCDR1可包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；所述HCDR2可包含SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列；所述HCDR3可包含SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列；所述LCDR1可包括SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列；所述LCDR2可包含SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列；所述LCDR3可包含SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列。例如，所述H-FR1可包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；所述H-FR2可包含SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列；所述H-FR3可包含SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列；所述H-FR4可包含SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列；所述L-FR1可包括SEQ IDNO:14的氨基酸序列；所述L-FR2可包含SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列；所述L-FR3可包含SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列；所述L-FR4可包含SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列。例如，所述抗原结合蛋白的重链可变区可包含SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列。例如，所述抗原结合蛋白可包括抗体19D4-25-3C11或与其具有相同重链可变区的抗原结合蛋白。例如，所述抗原结合蛋白的轻链可变区可包含SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列。例如，所述抗原结合蛋白可包括抗体19D4-25-3C11或与其具有相同轻链可变区的抗原结合蛋白。
在本申请中，所述抗原结合蛋白可包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区可包含HCDR1-3以及H-FR1-4。所述轻链可变区可包含LCDR1-3以及L-FR1-4。例如，所述HCDR1可包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；所述HCDR2可包含SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列；所述HCDR3可包含SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列；所述LCDR1可包括SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列；所述LCDR2可包含SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列；所述LCDR3可包含SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列。例如，所述H-FR1可包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；所述H-FR2可包含SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列；所述H-FR3可包含SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列；所述H-FR4可包含SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列；所述L-FR1可包括SEQ IDNO:14的氨基酸序列；所述L-FR2可包含SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列；所述L-FR3可包含SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列；所述L-FR4可包含SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列。例如，所述抗原结合蛋白的重链可变区可包含SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列。例如，所述抗原结合蛋白可包括抗体19D4-25-1C2-3C11或与其具有相同重链可变区的抗原结合蛋白。例如，所述抗原结合蛋白的轻链可变区可包含SEQ ID NO:36所示的氨基酸序列。例如，所述抗原结合蛋白可包括抗体19D4-25-1C2-3C11或与其具有相同轻链可变区的抗原结合蛋白。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白还可与参比抗体竞争结合所述人PD-1蛋白，所述参比抗体可包含重链可变区VH，所述参比抗体的VH可包含HCDR1、HCDR2和HCDR3中的至少一个、两个或三个。
在本申请中，所述参比抗体的HCDR3可包含SEQ ID NO:53所示的氨基酸序列。例如，所述参比抗体的HCDR3序列可根据Kabat编码系统定义。
例如，所述参比抗体的HCDR3与SEQ ID NO：53所示的序列相比，在选自下组的一个或多个氨基酸处存在氨基酸取代(例如，保守氨基酸取代等)：X1。
X1HYGTSPFVY(SEQ ID NO：53)，其中，X1可以是D或E。
在本申请中，所述参比抗体的HCDR3可包含SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10中任一项所示的氨基酸序列。例如，所述参比抗体的HCDR3序列可根据Kabat编码系统定义。
在本申请中，所述参比抗体的HCDR2可包含SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列。例如，所述参比抗体的HCDR2序列可根据Kabat编码系统定义。
在本申请中，所述参比抗体的HCDR1可包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。例如，所述参比抗体的HCDR1序列可根据Kabat编码系统定义。
例如，所述参比抗体的HCDR1可包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；所述HCDR2可包含SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列；且所述HCDR3可包含SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列。例如，所述参比抗体可包括抗体19D4F1、hu19D4-25、19D4-25-1A3、19D4-25-1B3、19D4-25-1C2、19D4-25-1E4、19D4-25-2E10或与其具有相同HCDR3(例如，与其具有相同的HCDR1-3)的抗原结合片段。
例如，所述参比抗体的HCDR1可包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；所述HCDR2可包含SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列；且所述HCDR3可包含SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列。例如，所述参比抗体可包括抗体19D4-25-3C11、19D4-25-1C2-3C11或与其具有相同HCDR3(例如，与其具有相同的HCDR1-3)的抗原结合片段。
在本申请中，所述参比抗体可包含重链可变区，所述重链可变区可包SEQ ID NO:54所示的氨基酸序列。例如，所述参比抗体包含VH，所述VH与SEQ ID NO:54所示的序列相比，在选自下组的一个或多个氨基酸处存在氨基酸取代(例如，保守氨基酸取代等)：X1，X5，X13，X16，X17，X20，X37，X48，X67，X68，X73，X76，X79，X82，X83，X85，X86，X87，X88，X92，X98和X118。
X1VQLX5ESGPGLVX13PSX16X17LSX20TCTVSGFSLTSYAISWX37RQPPGKGLEWX48GVIWTGGGTNYNSALKSRX67X68ISKDX73SKX76QVX79LKX82X83SX85X86X87X88DTAX92YYCARX98HYGTSPFVYWGQGTLVTVSX118(SEQ ID NO：54)，其中，X1可以是E或Q，X5可以是K或Q，X13可以是A或K，X16可以是E或Q，X17可以是S或T，X20可以是I或L，X37可以是I或V，X48可以是I或L，X67可以是L或V，X68可以是S或T，X73可以是N或T，X76可以是N或S，X79可以是F或S，X82可以是L或M，X83可以是N或S，X85可以是L或V，X86可以是Q或T，X87可以是A或T，X88可以是A或E，X92可以是S或V，X98可以是D或E，X118可以是A或S。
在本申请中，所述参比抗体的重链可变区可包含SEQ ID NO:29至SEQ ID NO:31中任一项所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述参比抗体可包含重链恒定区，所述重链恒定区可包括源自IgG的恒定区或源自IgY的恒定区。
例如，所述参比抗体的重链恒定区可包含SEQ ID NO:48所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述参比抗体可以包含抗体轻链可变区VL中的至少一个CDR，所述VL可以包含SEQ ID NO:60所示的氨基酸序列。
例如，所述参比抗体的VL可以包含SEQ ID NO:32至SEQ ID NO:38中任一项所示的氨基酸序列。在本申请中，所述分离的参比抗体的LCDR可以通过任何形式划分，只要VL与SEQ ID NO:32至SEQ ID NO:38中任一项所示的氨基酸序列相同，以任何形式划分得到的LCDR都可落入本申请的保护范围内。
在本申请中，所述参比抗体可包括轻链可变区VL，所述VL可包含LCDR1、LCDR2和LCDR3中的至少一个，至少两个或至少三个。
在本申请中，所述参比抗体的LCDR3可包含SEQ ID NO:59所示的氨基酸序列。例如，所述参比抗体的LCDR3可根据Kabat编号系统定义。
例如，所述参比抗体的LCDR3与SEQ ID NO:59所示的序列相比，在选自下组的一个或多个氨基酸处存在氨基酸取代(例如，保守氨基酸取代等)：X1，X4，X5，X7和X9。
X1QSX4X5VX7WX9(SEQ ID NO：59)，其中，X1可以是Q或S，X4可以是K，L或S，X5可以是E，H，K或R，X7可以是N或P，X9可以是S或T。
在本申请中，所述参比抗体的LCDR3可包含SEQ ID NO:21至SEQ ID NO:26中任一项所示的氨基酸序列。例如，所述参比抗体的LCDR3可根据Kabat编号系统定义。
在本申请中，所述参比抗体的LCDR2可包含SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列。例如，所述参比抗体的LCDR2可根据Kabat编号系统定义。
在本申请中，所述参比抗体的LCDR1可包含SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列。例如，所述参比抗体的LCDR1可根据Kabat编号系统定义。
例如，本申请所述参比抗体的LCDR1可包含SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列；所述LCDR2可包含SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列；且所述LCDR3可包含SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列。例如，所述参比抗体可包括抗体19D4F1、hu19D4-25、19D4-25-3C11或与其具有相同LCDR3(例如，与其具有相同LCDR1-3)的抗原结合片段。
例如，本申请所述参比抗体的LCDR1可包含SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列；所述LCDR2可包含SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列；且所述LCDR3可包含SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列。例如，所述参比抗体可包括抗体19D4-25-1A3或与其具有相同LCDR3(例如，与其具有相同LCDR1-3)的抗原结合片段。
例如，本申请所述参比抗体的LCDR1可包含SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列；所述LCDR2可包含SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列；且所述LCDR3可包含SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列。例如，所述参比抗体可包括抗体19D4-25-1B3或与其具有相同LCDR3(例如，与其具有相同LCDR1-3)的抗原结合片段。
例如，本申请所述参比抗体的LCDR1可包含SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列；所述LCDR2可包含SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列；且所述LCDR3可包含SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列。例如，所述参比抗体可包括抗体19D4-25-1C2、19D4-25-1C2-3C11或与其具有相同LCDR3(例如，与其具有相同LCDR1-3)的抗原结合片段。
例如，本申请所述参比抗体的LCDR1可包含SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列；所述LCDR2可包含SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列；且所述LCDR3可包含SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列。例如，所述参比抗体可包括抗体19D4-25-1E4或与其具有相同LCDR3(例如，与其具有相同LCDR1-3)的抗原结合片段。
例如，本申请所述参比抗体的LCDR1可包含SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列；所述LCDR2可包含SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列；且所述LCDR3可包含SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列。例如，所述参比抗体可包括抗体19D4-25-2E10或与其具有相同LCDR3(例如，与其具有相同LCDR1-3)的抗原结合片段。
在本申请中，所述参比抗体可包含轻链可变区VL，所述VL可包含SEQ ID NO:60所示的氨基酸序列。例如，所述参比抗体的VL与SEQ ID NO:60所示的序列相比，在选自下组的一个或多个氨基酸处存在氨基酸取代(例如，保守氨基酸取代等)：X7，X9，X12，X14，X15，X18，X20，X41，X49，X64，X76，X78，X80，X81，X82，X84，X85，X87，X88，X89，X93，X96，X97，X99，X101和X108。
DIVLTQX7PX9SLX12VX14X15GQX18AX20ISCRASESVDNYGISFMNWFX41QKPGQPPX49LLIYAASNQGSGVPX64RFSGSGSGTDFX76LX78IX80X81X82EX84X85DX87X88X89YFCX93QSX96X97VX99WX101FGGGTKX108EIK(SEQ ID NO：60)，其中，X7可以是S或T，X9可以是A或L，X12可以是A或S，X14可以是S或T，X15可以是L或P，X18可以是P或R，X20可以是S或T，X41可以是L或Q，X49可以是K或Q，X64可以是A或D，X76可以是S或T，X78可以是K或N，X80可以是H或S，X81可以是P或R，X82可以是M或V，X84可以是A或E，X85可以是D或E，X87可以是T或V，X88可以是A或G，X89可以是M或V，X93可以是Q或S，X96可以是K，L或S，X97可以是E，H，K或R，X99可以是N或P，X101可以是S或T，X108可以是L或V。
在本申请中，所述参比抗体的轻链可变区可包含SEQ ID NO:32至SEQ ID NO:38中任一项所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述参比抗体可包含轻链恒定区，所述轻链恒定区可包括源自Igκ的恒定区或源自Igλ的恒定区。
例如，所述轻链恒定区可包括源自Igκ的恒定区。
例如，所述参比抗体的轻链恒定区包含SEQ ID NO:47所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述参比抗体可包含HCDR1-3和LCDR1-3。例如，所述参比抗体的HCDR1可包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；所述参比抗体的HCDR2可包含SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列；所述参比抗体的HCDR3可包含SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列；所述参比抗体的LCDR1可包括SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列；所述参比抗体的LCDR2可包含SEQ IDNO:18所示的氨基酸序列；所述参比抗体的LCDR3可包含SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列。例如，所述参比抗体可包括抗体19D4F1、hu19D4-25或与其具有相同HCDR3(例如，与其具有相同HCDR1-3)和LCDR3(例如，与其具有相同LCDR1-3)的抗原结合片段。
在本申请中，所述参比抗体可包含HCDR1-3和LCDR1-3。例如，所述参比抗体的HCDR1可包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；所述参比抗体的HCDR2可包含SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列；所述参比抗体的HCDR3可包含SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列；所述参比抗体的LCDR1可包括SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列；所述参比抗体的LCDR2可包含SEQ IDNO:18所示的氨基酸序列；所述参比抗体的LCDR3可包含SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列。例如，所述参比抗体可包括抗体19D4-25-1A3或与其具有相同HCDR3(例如，与其具有相同HCDR1-3)和LCDR3(例如，与其具有相同LCDR1-3)的抗原结合片段。
在本申请中，所述参比抗体可包含HCDR1-3和LCDR1-3。例如，所述参比抗体的HCDR1可包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；所述参比抗体的HCDR2可包含SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列；所述参比抗体的HCDR3可包含SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列；所述参比抗体的LCDR1可包括SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列；所述参比抗体的LCDR2可包含SEQ IDNO:18所示的氨基酸序列；所述参比抗体的LCDR3可包含SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列。例如，所述参比抗体可包括抗体19D4-25-1B3或与其具有相同HCDR3(例如，与其具有相同HCDR1-3)和LCDR3(例如，与其具有相同LCDR1-3)的抗原结合片段。
在本申请中，所述参比抗体可包含HCDR1-3和LCDR1-3。例如，所述参比抗体的HCDR1可包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；所述参比抗体的HCDR2可包含SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列；所述参比抗体的HCDR3可包含SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列；所述参比抗体的LCDR1可包括SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列；所述参比抗体的LCDR2可包含SEQ IDNO:18所示的氨基酸序列；所述参比抗体的LCDR3可包含SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列。例如，所述参比抗体可包括抗体19D4-25-1C2或与其具有相同HCDR3(例如，与其具有相同HCDR1-3)和LCDR3(例如，与其具有相同LCDR1-3)的抗原结合片段。
在本申请中，所述参比抗体可包含HCDR1-3和LCDR1-3。例如，所述参比抗体的HCDR1可包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；所述参比抗体的HCDR2可包含SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列；所述参比抗体的HCDR3可包含SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列；所述参比抗体的LCDR1可包括SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列；所述参比抗体的LCDR2可包含SEQ IDNO:18所示的氨基酸序列；所述参比抗体的LCDR3可包含SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列。例如，所述参比抗体可包括抗体19D4-25-1E4或与其具有相同HCDR3(例如，与其具有相同HCDR1-3)和LCDR3(例如，与其具有相同LCDR1-3)的抗原结合片段。
在本申请中，所述参比抗体可包含HCDR1-3和LCDR1-3。例如，所述参比抗体的HCDR1可包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；所述参比抗体的HCDR2可包含SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列；所述参比抗体的HCDR3可包含SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列；所述参比抗体的LCDR1可包括SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列；所述参比抗体的LCDR2可包含SEQ IDNO:18所示的氨基酸序列；所述参比抗体的LCDR3可包含SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列。例如，所述参比抗体可包括抗体19D4-25-2E10或与其具有相同HCDR3(例如，与其具有相同HCDR1-3)和LCDR3(例如，与其具有相同LCDR1-3)的抗原结合片段。
在本申请中，所述参比抗体可包含HCDR1-3和LCDR1-3。例如，所述参比抗体的HCDR1可包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；所述参比抗体的HCDR2可包含SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列；所述参比抗体的HCDR3可包含SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列；所述参比抗体的LCDR1可包括SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列；所述参比抗体的LCDR2可包含SEQ IDNO:18所示的氨基酸序列；所述参比抗体的LCDR3可包含SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列。例如，所述参比抗体可包括抗体19D4-25-3C11或与其具有相同HCDR3(例如，与其具有相同HCDR1-3)和LCDR3(例如，与其具有相同LCDR1-3)的抗原结合片段。
在本申请中，所述参比抗体可包含HCDR1-3和LCDR1-3。例如，所述参比抗体的HCDR1可包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；所述参比抗体的HCDR2可包含SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列；所述参比抗体的HCDR3可包含SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列；所述参比抗体的LCDR1可包括SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列；所述参比抗体的LCDR2可包含SEQ IDNO:18所示的氨基酸序列；所述参比抗体的LCDR3可包含SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列。例如，所述参比抗体可包括抗体19D4-25-1C2-3C11或与其具有相同HCDR3(例如，与其具有相同HCDR1-3)和LCDR3(例如，与其具有相同LCDR1-3)的抗原结合片段。
多肽和免疫缀合物
另一方面，本申请提供了一种或多种多肽，其可包含本申请的分离的抗原结合蛋白。例如，所述多肽可包括融合蛋白。例如，所述多肽可包括多特异性抗体(例如，双特异性抗体)。
另一方面，本申请提供了一种或多种免疫缀合物，所述免疫缀合物可包含本申请的分离的抗原结合蛋白。在某些实施方式中，所述免疫缀合物还可包含药学上可接受的治疗剂、标记物和/或检测剂。
核酸、载体、细胞和药物组合物
另一方面，本申请还提供了分离的一种或多种核酸分子，所述一种或多种核酸分子可编码本申请所述分离的抗原结合蛋白。例如，所述一种或多种核酸分子中的每一个核酸分子可以编码完整的所述抗原结合蛋白，也可以编码其中的一部分(例如，HCDR1-3、重链可变区中的一种或多种)。
例如，当核酸分子分别编码所述抗原结合蛋白的一部分时，核酸分子编码的产物合在一起可以形成有功能的(例如，可结合PD-1)的本申请的分离的抗原结合蛋白。
本申请所述的核酸分子可以为分离的。例如，其可以是通过以下方法产生或合成的：(i)在体外扩增的，例如通过聚合酶链式反应(PCR)扩增产生的，(ii)通过克隆重组产生的，(iii)纯化的，例如通过酶切和凝胶电泳分级分离，或者(iv)合成的，例如通过化学合成。例如，所述分离的核酸可以是通过重组DNA技术制备的核酸分子。
在本申请中，可以通过本领域已知的多种方法来制备编码所述分离的抗原结合蛋白的核酸，这些方法包括但不限于，采用逆转录PCR和PCR获得本申请所述分离的抗原结合蛋白的核酸分子。
另一方面，本申请提供了一种或多种载体，其包含本申请所述的一种或多种核酸分子。每种载体中可包含一种或多种所述核酸分子。此外，所述载体中还可包含其他基因，例如允许在适当的宿主细胞中和在适当的条件下选择该载体的标记基因。此外，所述载体还可包含允许编码区在适当宿主中正确表达的表达控制元件。这样的控制元件为本领域技术人员所熟知的，例如，可包括启动子、核糖体结合位点、增强子和调节基因转录或mRNA翻译的其他控制元件等。在某些实施方式中，所述表达控制序列为可调的元件。所述表达控制序列的具体结构可根据物种或细胞类型的功能而变化，但通常包含分别参与转录和翻译起始的5’非转录序列和5’及3’非翻译序列，例如TATA盒、加帽序列、CAAT序列等。例如，5’非转录表达控制序列可包含启动子区，启动子区可包含用于转录控制功能性连接核酸的启动子序列。所述表达控制序列还可包括增强子序列或上游活化子序列。在本申请中，适当的启动子可包括，例如用于SP6、T3和T7聚合酶的启动子、人U6RNA启动子、CMV启动子及其人工杂合启动子(如CMV)，其中启动子的某部分可与其他细胞蛋白(如人GAPDH，甘油醛-3-磷酸脱氢酶)基因启动子的某部分融合，其可包含或不包含另外的内含子。本申请所述的一种或多种核酸分子可以与所述表达控制元件可操作地连接。
所述载体可以包括，例如质粒、粘粒、病毒、噬菌体或者在例如遗传工程中通常使用的其他载体。例如，所述载体可为表达载体。例如，所述载体可为病毒载体。可以将病毒载体直接给予至患者(体内)或可以通过间接的形式，例如，在体外使用病毒处理细胞，然后将处理过的细胞给予至患者(离体)。病毒载体技术在本领域中是公知的，并在例如Sambrook等(2001,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,New York)和其他病毒学和分子生物学手册中进行了描述。常规的基于病毒的系统可以包括用于基因转移的逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体以及单纯疱疹病毒载体。在某些情形中，可以用逆转录病毒、慢病毒和腺相关病毒的方法将基因转移整合进宿主基因组中，使插入的基因长期表达。慢病毒载体是能够转导或感染非分裂细胞并典型地产生较高病毒效价的逆转录病毒载体。慢病毒载体可包含长末端重复序列5’LTR和截短的3’LTR、RRE、rev应答元件(cPPT)、中央终止序列(CTS)和/或翻译后调控元件(WPRE)。本申请所述的载体可以被引入细胞。
另一方面，本申请提供了一种细胞。所述细胞可包含本申请所述的分离的抗原结合蛋白、所述的多肽、所述的免疫缀合物、一种或多种核酸分子和/或本申请所述的一种或多种载体。例如，每种或每个细胞可包含一个或一种本申请所述的核酸分子或载体。例如，每种或每个细胞可包含多个(例如，2个或以上)或多种(例如，2种或以上)本申请所述的核酸分子或载体。例如，可将本申请所述的载体引入所述宿主细胞中，例如原核细胞(例如，细菌细胞)、CHO细胞、NS/0细胞、HEK293T细胞、293F细胞或HEK293A细胞，或者其他真核细胞，如来自植物的细胞、真菌或酵母细胞等。可通过本领域已知的方法将本申请所述的载体引入所述宿主细胞中，例如电穿孔、lipofectine转染、lipofectamin转染等。例如，所述细胞可以包括酵母细胞。例如，所述细胞可以包括大肠杆菌细胞。例如，所述细胞可以包括哺乳动物细胞。例如，所述细胞可以包括免疫细胞。
所述细胞可以包括免疫细胞。在某些情形中，所述细胞可以包括免疫细胞。例如，所述细胞可包括T细胞、B细胞、天然杀伤(NK)细胞、巨噬细胞、NKT细胞、单核细胞、树突状细胞、粒细胞、淋巴细胞、白细胞和/或外周血单个核细胞。
另一方面，本申请提供了一种药物组合物。所述药物组合物可包含本申请所述的分离的抗原结合蛋白、所述的多肽、所述的免疫缀合物、所述分离的核酸分子、所述的载体、所述的细胞，和/或药学上可接受的佐剂和/或赋形剂。在本申请中，所述药学上可接受的佐剂可以包括缓冲剂、抗氧化剂、防腐剂、低分子量多肽、蛋白质、亲水聚合物、氨基酸、糖、螯合剂、反离子、金属复合物和/或非离子表面活性剂。除非与本申请所述的细胞不相容，否则任何常规介质或试剂均可以考虑用于本申请的药物组合物中。在本申请中，所述药学上可接受的赋形剂可以包括在药物制剂中除主药以外的附加物，也可称为辅料。例如，所述赋形剂可以包括片剂中的粘合剂、填充剂、崩解剂、润滑剂。例如，所述赋形剂可以包括中药丸剂中的酒、醋、药汁等。例如，所述赋形剂可以包括半固体制剂软膏剂、霜剂中的基质部分。例如，所述赋形剂可以包括液体制剂中的防腐剂、抗氧剂、矫味剂、芳香剂、助溶剂、乳化剂、增溶剂、渗透压调节剂、着色剂。
试剂盒、用途和方法
另一方面，本申请提供了一种用于检测或测定PD-1的方法，所述方法可包括使用所述分离的抗原结合蛋白或所述的多肽。
在本申请中，所述方法可包括体外方法，离体方法，非诊断或非治疗目的的方法。
例如，所述方法可包括用于非诊断目的的检测PD-1的存在和/或含量的方法，其可包括下述步骤：
1)使样品与本申请的抗原结合蛋白接触；以及
2)检测样品结合的所述抗原结合蛋白的存在和/或含量来确定获自受试者的样品中PD-1的存在和/或表达水平。
另一方面，本申请提供了一种PD-1的试剂盒，其可包括使用所述分离的抗原结合蛋白或所述的多肽。
在本申请中，所述试剂盒还可包含使用说明，所述使用说明记载用于检测PD-1的存在和/或含量的方法。例如，所述方法可包括体外方法，离体方法，非诊断或非治疗目的的方法。
另一方面，本申请提供了一种所述的分离的抗原结合蛋白或所述的多肽在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒可用于检测PD-1的存在和/或含量的方法。例如，所述方法可包括体外方法，离体方法，非诊断或非治疗目的的方法。
另一方面，本申请提供了一种调节免疫应答的方法，其包括向有需要的受试者施用有效量的所述分离的抗原结合蛋白，所述的多肽，所述的免疫缀合物，所述分离的核酸分子，所述的载体，所述的细胞和/或所述的药物组合物，和/或药学上可接受的治疗剂。
在本申请中，所述调节免疫应答的方法可包括体外方法，离体方法，非诊断或非治疗目的的方法。
另一方面，本申请提供了一种调节免疫应答的方法，其包括向有需要的受试者施用有效量的所述的药物组合，和/或药学上可接受的治疗剂。
在本申请中，所述调节免疫应答的方法可包括体外方法，离体方法，非诊断或非治疗目的的方法。
另一方面，本申请提供了分离的抗原结合蛋白、所述的多肽、所述的免疫缀合物、所述分离的核酸分子、所述的载体、所述的药物组合物用于预防、缓解和/或治疗疾病或病症。
在本申请中，所述疾病或病症可包括肿瘤。例如，所述肿瘤可包括非实体瘤。例如，所述肿瘤可包括与PD-L1的表达相关的肿瘤。术语“与PD-L1的表达相关的肿瘤”通常是指PD-L1表达改变导致疾病进展或逃避免疫监视而形成的肿瘤。例如，所述“与PD-L1的表达相关的肿瘤”可以是PD-L1表达量上调导致疾病进展或逃避免疫监视而形成的肿瘤。所述与PD-L1的蛋白表达相关的肿瘤可以是PD-L1阳性的肿瘤。在PD-L1阳性的肿瘤中，与正常细胞相比，肿瘤细胞表面或肿瘤微环境中的PD-L1的蛋白表达量高约1％，5％，10％，15％，20％，25％，30％，35％，40％，50％，60％，70％，80％或更高。
另一方面，本申请提供了一种所述的分离的抗原结合蛋白、所述的多肽、所述的免疫缀合物、所述的分离的核酸分子、所述的载体，所述的细胞和/或所述的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于预防、缓解和/或治疗疾病或病症。
在本申请中，所述疾病或病症可包括肿瘤。例如，所述肿瘤可包括实体瘤。例如，所述肿瘤可包括非实体瘤。例如，所述肿瘤可包括与PD-L1的表达相关的肿瘤。术语“与PD-L1的表达相关的肿瘤”通常是指PD-L1表达改变导致疾病进展或逃避免疫监视而形成的肿瘤。例如，所述“与PD-L1的表达相关的肿瘤”可以是PD-L1表达量上调导致疾病进展或逃避免疫监视而形成的肿瘤。所述与PD-L1的蛋白表达相关的肿瘤可以是PD-L1阳性的肿瘤。在PD-L1阳性的肿瘤中，与正常细胞相比，肿瘤细胞表面或肿瘤微环境中的PD-L1的蛋白表达量高约1％，5％，10％，15％，20％，25％，30％，35％，40％，50％，60％，70％，80％或更高。另一方面，本申请提供了一种预防和/或治疗疾病或病症的方法，其包括向有需要的受试者施用所述的分离的抗原结合蛋白、所述的分离的核酸分子、所述的载体，所述的细胞、所述的药物组合物。
在本申请中，所述疾病或病症可包括肿瘤。例如，所述肿瘤可包括非实体瘤。例如，所述肿瘤可包括与PD-L1的表达相关的肿瘤。术语“与PD-L1的表达相关的肿瘤”通常是指PD-L1表达改变导致疾病进展或逃避免疫监视而形成的肿瘤。例如，所述“与PD-L1的表达相关的肿瘤”可以是PD-L1表达量上调导致疾病进展或逃避免疫监视而形成的肿瘤。所述与PD-L1的蛋白表达相关的肿瘤可以是PD-L1阳性的肿瘤。在PD-L1阳性的肿瘤中，与正常细胞相比，肿瘤细胞表面或肿瘤微环境中的PD-L1的蛋白表达量高约1％，5％，10％，15％，20％，25％，30％，35％，40％，50％，60％，70％，80％或更高。本申请所述药物组合物及方法可与其他类型的癌症疗法结合使用，诸如化学疗法、手术、放射、基因疗法等。本申请中所描述的药物组合物及方法可用于其他依赖于免疫反应的疾病病状，诸如炎症、免疫疾病及感染性疾病。
在本申请中，所述受试者可以包括人或非人动物。例如，所述非人动物可以选自下组：猴、鸡、鹅、猫、狗、小鼠和大鼠。此外，非人动物也可以包括任何除人以外的动物物种，例如家畜动物，或啮齿类动物，或灵长类动物，或家养动物，或家禽动物。所述人可以是高加索人、非洲人、亚洲人、闪族人，或其他种族，或各种种族的杂合体。又例如，所述人可以是老年、成年、青少年、儿童或者婴儿。
可以根据在实验动物中的有效量推测在人类中的有效量。例如，Freireich等人描述了动物和人的剂量的相互关系(基于每平方米身体表面的毫克数)(Freireich et al.，Cancer Chemother.Rep.50，219(1966))。身体表面积可以从患者的身高和体重近似确定。参见例如Scientific Tables，Geigy Pharmaceuticals，Ardsley，N.Y.，537(1970)。
不欲被任何理论所限，下文中的实施例仅仅是为了阐释本申请的抗原结合蛋白、免疫缀合物、制备方法和用途等，而不用于限制本申请发明的范围。
实施例
实施例1抗原结合蛋白的制备和筛选
1.1动物免疫
抗PD-1抗体通过编码人PD1质粒用基因枪(gene gun)通过肌肉注射免疫小鼠产生，饲养环境:SPF级。小鼠购进后在实验室环境饲养l周，将编码人PD1质粒用基因枪(genegun)通过肌肉注射与心脏毒素(Cardiotoxin)佐剂免疫已适应环境的小鼠。进行多次免疫，期间监测血清抗体水平，选择血清中抗体滴度高的小鼠进行加强免疫，之后处死小鼠，取脾细胞，与骨髓瘤细胞融合。将脾淋巴细胞与骨髓瘤细胞Sp2/0细胞进行融合得到杂交瘤细胞。杂交瘤的制备方法可根据本领域许多文献公示的方法进行。
1.2抗原结合蛋白的筛选
抗原结合蛋白抑制PD-L1与PD-1的结合的ELISA实验
用生物素标记PD1蛋白(Sulfo-NHS-Biotin，Pierce)，用PBS缓冲液稀释；在96孔板中包被PD-L1蛋白(1ug/mL,100uL/孔，4℃过夜)；加入200uL/孔封闭液封闭，用PBST洗板3次；向96孔板中加入抗PD-1抗体(从5ug/mL起，2倍稀释至0.078ug/mL，7个稀释点)和PD-1[B](0.5ug/mL，在PD1-PDL1结合的线性范围内)，孵育60分钟，用PBST洗板3次；加入HRP*-链霉亲和素，ELISA检测OD值。
结果如图1所示，本申请的抗原结合蛋白能够有效抑制PD-L1与PD-1的结合，且抑制效果与阳性对照抗体(Pembrolizumab)相当，IC50值如表1所示。
表1抗原结合蛋白抑制PD-L1与PD-1的结合的ELISA实验结果
克隆 IC50(nM)
19D4F1 3.72
实施例2抗原结合蛋白的表位检测
用生物素标记抗原结合蛋白19D4F1(0.5mg)。用PBS缓冲液稀释；在96孔板中包被PD-1蛋白(0.1ug/mL，100uL/孔，4℃过夜)；加入封闭液封闭，200uL/孔，用PBST洗板3次；每孔加入未标记的抗原结合蛋白19D4F1(2ug/mL，40x检测抗体)，孵育30分钟；在相应的孔中加入检测抗体(生物素标记的抗原结合蛋白19D4F1，50ng/mL)，孵育60分钟，用PBST洗板3次；加入HRP*-链霉亲和素，ELISA检测OD值。结果如表2-表3所示，19D4F1可以与Pembrolizumab(商品名：Keytruda)竞争结合PD-1。
表2ELISA结果
Figure BDA0003679288950000401
表3表位竞争结果
Figure BDA0003679288950000411
备注：信号减弱>50％。当两种抗体竞争结合的信号减弱大于50％时，视为两种抗体识别相同的表位。
实施例3抗原结合蛋白的人源化设计
3.1选择人类生殖系接受者家族亚群
确定VH/VL CDR残基，并以Kabat编号系统进行注释。根据已发表的文献确定VH/VLCDR的典型结构。根据VH/VL CDR的典型结构，选择具有相同典型结构的人类生殖系框架接受体。
3.2设计人源化的VH
(1)首先确定支持环路结构和VH界面的残基
对同一典型子集内的单个人类种系框架序列进行分析，确定与小鼠VH序列具有最佳整体同源性的种系序列。它被选为移植鼠源VH CDR的人类种系框架区。
(2)设计反向突变
Q1E突变是为了消除N端焦谷氨酸的形成。突变也可包括根据三维结构同源建模从CDR结合区中确定的突变。
(3)J-区域设计
人源化抗体的JH区域是根据最佳序列同源性选择的。
3.3人源化VL的设计遵循与VH设计相同的程序。
3.4人源化抗体的产生
合成设计的VH/VLs，重组DNA构建体用于在人IgG4/k野生型骨架上表达人源化抗体。各种人源化的LC/HC构建体将被平行地共同表达，这将产生一个由293细胞表达的抗体小组。这些抗体将由pH7.4(默认)的PBS配制。滴度和产量将被记录下来。
3.5人源化抗体的特征
每个纯化的人源性抗体将做理化性质分析。
实施例4人源化抗体与PD-1的结合ELISA实验
在96孔板中加入PD-1蛋白(1ug/mL,100uL/孔，4℃过夜)，4℃包被过夜。用封闭液封闭，用PBST洗板3次。向96孔板中加入抗PD-1抗体(从5ug/mL起，2倍稀释至0.078ug/mL，7个稀释点)，孵育60分钟，用PBST洗板3次；加入HRP*-链霉亲和素，ELISA检测OD值。实验结果如表4所示，本申请的抗原结合蛋白能有效地与PD-1蛋白结合。
表4人源化抗体与PD-1的结合ELISA实验结果
抗体 EC50(nM)
hu19D4-25 0.1915
Pembrolizumab 0.2340
实施例5人源化抗体对PD-1的亲和力检测实验
(1)将抗人Fc固定在CMS传感器芯片上
固定抗人Fc。以HBS-EP+(10mM HEPES，150mM NaCl，3mM EDTA和0.05％P20，pH7.4)作为流动缓冲液，目标蛋白固定化水平被设定为8000RU。准备足够的50mM NaOH、50mMN-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、200mM 1-乙基-3-(3-二甲胺基丙基)碳二亚胺氢氯化物(EDC)、20μg/mL抗人Fc(稀释于10mmol/L NaAc pH 4.5)和1M乙醇胺，并采用向导方法固定抗人Fc到流动单元1和2。在固定后为了保持平衡，缓冲液流速保持在10μL/分钟。
(2)抗原结合蛋白和PD-1之间的SPR结合
以HBS-EP+作为流动缓冲液，在每个动力学周期中都包括捕获被测抗体、注射连续稀释的PD-1和表面再生。被测抗体被捕获到流动单元2上，流动单元1被用作参考。然后将稀释后的PD-1部分注入流动单元1和2(30μL/min)，关联时间为180s。缓冲液流保持900秒进行解离。为了去除测试的样品和分析物，使用30s注射10mM甘氨酸-盐酸(pH1.5)进行再生。
(3)数据分析
使用Biacore T200评估软件1.0评估每个样品的KD值。结果如表5所示。
表5人源化抗体对PD-1的亲和力检测结果
抗体 抗原 ka(1/Ms) kd(1/s) KD(M)
hu19D4-25 PD1 1.18E+05 0.01053 8.95E-08
实施例6人源化抗体的MLR检测
6.1PBMC分离
(1)将单个献血者的血样用PBS稀释；(2)将Ficoll-Pague培养基转移到一个新的50ml离心管中，然后加入稀释的血液与Ficoll，体积比应为4：3；(3)以400xg离心，30分钟，20℃；(4)小心地吸收并将这层单核细胞层转移到另一个新的无菌离心管中；(5)用PBS清洗细胞三次；(6)用RCLB重悬细胞5-10分钟，4℃；(7)用培养基终止反应；(8)弃去上清液，然后重新悬浮细胞。
6.2培养DC细胞
(1)用RPMI-1640培养基稀释分离的人PBMC，并将其分配到细胞培养皿中。在37℃下孵育3小时；(2)吸收并抛弃上清液。加入含有IL-4和GM-CSF的新鲜培养基。在37℃下孵育1天；(3)吸收并抛弃上清液。加入含有IL-4和GM-CSF的新鲜培养基。在37℃下孵育1天。在孵化器中，37℃下孵育；(4)在第3天和第5天用新鲜的IL-4和GM-CSF替换三分之一的细胞培养基；(5)用LPS使DC细胞成熟，用PBS洗两次。
6.3抑制过程
(1)用丝裂霉素C抑制DC细胞的增殖，然后用PBS洗三次。
6.4CD4+T细胞的分离
根据制造商的指南(EasySepTM人类CD4+T细胞分离试剂盒)的程序，从另一个捐赠者的PBMC中纯化CD4+T细胞。
6.5抗体溶液制备
用培养基制备抗体稀释液。
6.6混合淋巴细胞反应(MLR)
(1)调整CD4+T细胞(反应细胞)和DC细胞(刺激细胞)的密度；(2)将刺激细胞和反应细胞按1:1的体积比混合；(3)在96孔板的每个孔中加入50uL稀释后的抗体溶液；(4)然后加入200uL的混合细胞悬液；分别将混合物在37℃下孵育72小时，用于IL-2试验，孵育120小时用于IFN-γ试验；(5)及时收集上清液，并在-20℃以下冷冻，用于ELISA试验。
6.7定量ELISA
按照人IL-2DuoSet ELISA试剂盒(R&D，DY202)的检测程序进行操作。
或人IFN-γDuoSet ELISA试剂盒(R&D，DY285B)的检测程序。
实验结果如图2a-2b所示。本申请的抗原结合蛋白能够促进淋巴细胞释放IL-2和IFN-γ。
实施例7亲和力成熟
7.1噬菌体库的构建
(1)单CDR密码子诱变库的构建
基于密码子的诱变所使用的寡核苷酸是由上海百胜生物科技有限公司合成的。CDRH3和CDRL3被选择为突变对象。VH和VL链的这两个CDR是诱变的目标，因为它们发生在抗体结合界面的中心，因此是亲和力成熟的目标。使用基于密码子的寡核苷酸扩增hu19D4-25的VH和VL片段。通过重叠PCR将VH和VL片段组合成scFv。用Sfi I消化scFv片段并克隆到用相同限制性酶消化的pCANTab5E载体上。使用Qiagen公司的QIAquick纯化试剂盒对连接产物进行纯化，并在2.5KV的电压下通过电穿孔电转TG1细胞。将转化的细胞用2YT培养基重新悬浮，在37℃和250rpm下培养1小时。在2YT-GA琼脂平板上，每个稀释度都有10微升的细胞悬液，以确定转化效率。将悬浮液中的其余细胞铺在25×25厘米的平板上，在37℃下孵育过夜。从平板上收集菌落，并在-80℃下加入甘油储存。通过对用于确定转化效率的平板上的克隆进行测序来验证该文库。
7.2噬菌体展示
(1)库拯救
将100mL 2YT-GA培养基与来自文库甘油储备的细胞悬液接种到初始OD600约0.1，并在37℃下摇动细胞生长至OD600 0.5-0.6(约1.5小时)。我们加入5x 10^12cfu的辅助细胞M13KO7(NEB，美国)进行感染，在37℃下不摇动孵化30分钟，再摇动孵化30分钟。将悬浮液在3200g下离心10分钟，使细胞颗粒化，弃去上清液，将细胞重新悬浮在100ml 2YT-AK培养基中，在30℃和250rpm下孵育过夜。悬浮液在3200g下离心10分钟，收集上清液。加入五分之一体积的PEG溶液(20％PEG6000，2.5M NaCl)并在冰上孵育1小时。噬菌体在3200xg下离心30分钟，弃去上清液，用1ml PBS重新悬浮噬菌体。在16000g下再次离心，去除碎片和残余细胞，并将上清液转移到一个新的管中。对噬菌体制剂进行滴定，并将其用于平移。
(2)溶液选择
为了减少背景结合，100μl磁性链霉菌素珠(Invitrogen，美国)用1ml MPBS在室温下阻断1小时。在另一个试管中，库中的噬菌体与100微升磁性链霉蛋白珠在1毫升MPBS中进行预孵化(每轮5×10^11～12)，以去除不需要的结合物。使用磁粉浓缩器分离噬菌体和珠子。将生物素化的PD-1蛋白(ACROBiosystems，美国)加入到噬菌体中，在室温下孵育2小时，并使用上方的摇床轻轻混合。加入阻断的珠子(100μl)，并在室温下继续孵育15分钟，用摇床轻轻搅拌。将溶液中携带噬菌体的珠子在磁粉浓缩器中分离，弃去上清液。用新鲜的清洗缓冲液清洗珠子，用PBST清洗10次，用PBS(pH7.4)清洗10次。加入1毫升10μg/ml的PBS稀释的胰蛋白酶(美国Sigma公司)，并在37℃下孵育30分钟以洗脱噬菌体。滴定得到的噬菌体，并为下一轮平移做准备，逐轮降低抗原浓度。
7.3酶联免疫吸附法筛选和脱率排序
(1)ELISA筛选
挑选克隆，接种到含有2YT-AG培养基的96孔U型底板的每个孔中，在37℃和1000rpm的微孔板摇床中培养过夜。为了准备储备板，将50μl细胞培养物分配到新鲜板中，与50μl50％的甘油混合并储存在-80℃。将另一个含有2YT-A培养基(0.05％葡萄糖)的96孔U型底板接种过夜培养物，并在37℃和1000rpm的微孔板摇床上培养2小时。在培养基中加入1M的IPTG，最终浓度为1mM，以诱导scFv的表达。在30℃和250rpm下培养过夜，在3200g下离心15分钟，将上清液转移到一个新的平板上。在微孔板中，每孔包被200ng的PBS稀释的Neutravidin(Pierce,USA)，4℃过夜。用PBST洗板三次，用封闭缓冲液(PBST+1％BSA)在室温下封闭1小时。用PBST洗板三次，并在室温下加入100ng生物素化的抗原1小时。用PBST洗3次后，加入上清液并在室温下孵育1小时。用PBST洗3次后，在封闭缓冲液中加入1:10000稀释的抗myc-tag HRP偶联抗体(Abcam，美国)，并在室温下孵育1小时。用PBST洗板三次，然后加入100μl新鲜制备的TMB溶液，孵育15分钟。加入100μl2M H2SO4停止显色，并用ELISA测量OD450。鉴定ELISA阳性克隆并送去测序。
(2)PPE样品的制备
用4毫升2YT-GA培养基接种克隆，在37℃和250rpm下培养过夜。另取4ml 2YT-A培养基(0.05％葡萄糖)接种40μl过夜培养物，在37℃和250rpm下培养至OD600～0.5。在培养基中加入IPTG(1M)，最终浓度为1mM，以诱导scFv表达。在30℃和250rpm下培养过夜，在3200g下离心15分钟，弃去上清液。将细胞颗粒重新悬浮在200μl冰冷的1XTES缓冲液(0.2MTris-HCl，0.5mM EDTA，0.5M蔗糖，pH8.0)中。然后加入300μl 1/5XTES缓冲液，涡旋重悬。细胞颗粒在冰上孵化30分钟，在12000g下离心10分钟。将含有可溶性抗体片段的上清液转移到一个干净的管子里，进行离率排查。
(3)亲和力提高的变体
使用Fortebio公司的传感器头(AR2G)将PD1蛋白捕获到传感器的表面：首先将传感器放入EDC(20mM)/Sulfo NHS(10mM)缓冲液中进行激活，然后放入含有PD1蛋白的孔中(30μg/ml的PD1蛋白在NaAc 5.0中)。然后将传感器移到1M乙醇胺中淬灭，动力学缓冲液中平衡。关联过程在30℃下进行了5分钟。将传感器放入7个孔中：5个孔中有4个不同的scFvsPPE(未知浓度)，一个孔中有阳性对照蛋白，一个孔中有阴性对照作为参考。将传感器放入动力学缓冲液中，在30℃下进行5分钟的解离过程。从所有曲线中除去阴性对照。在每个周期结束时，用10mM甘氨酸pH1.5洗涤5s，然后用PBS洗涤5s，重复5次，使传感器尖端再生。变体19D4-25-1A3/19D4-25-1B3/19D4-25-1C2/19D4-25-1E4/19D4-25-2E10/19D4-25-3C11的KD值如表6所示。
表6亲和力成熟的抗原结合蛋白与PD1蛋白的亲和力
抗原结合蛋白 KD(nM) Kon(10<sup>5</sup>s<sup>-1</sup>M<sup>-1</sup>) Koff(10<sup>-2</sup>s<sup>-1</sup>)
WT(hu19D4-25) 3.31 3.21 1.06
19D4-25-1A3 9.90 3.62 3.58
19D4-25-1B3 1.90 2.22 0.42
19D4-25-1C2 0.34 5.34 0.18
19D4-25-1E4 2.27 2.41 0.54
19D4-25-2E10 6.01 2.83 1.70
19D4-25-3C11 0.37 3.61 0.13
实施例8Fc工程化改造提高半衰期和移除糖基化位点
8.1Fc工程化改造
Fc中三个氨基酸被替换为YTE以延长IgG的半衰期，具体的突变为M252Y，S254T，T256E。N297被突变为Alanin以去除糖基化部位。W52F指的是第52位氨基酸由W变为F。
8.2Fc改造的抗原结合蛋白对FcRn的亲和力检测
(1)将抗his抗体固定在CMS传感器上
用HBS-EP+(pH6.0)作为运行缓冲液，制备了足够的50mM NaOH，50mmol/L N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，200mmol/L 1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)，15μg/mL抗his抗体(在10mmol/L NaAc pH 4.5中稀释)和1M乙醇胺，并设置适当的参数值(洗涤30秒，激活420秒，注入配体600秒，锁定420秒)，固定化方法通过Biacore 8K将抗-his抗体固定在一个CM5芯片的16个流动单元上。固定化后保持10μL/min的缓冲液流量进行平衡。
(2)测试样品(抗原结合蛋白)与FcRn的SPR结合
以HBS-EP+(pH6.0)为运行缓冲液，在每个动力学循环中包括捕获FcRn、注入系列稀释的被测抗体和表面再生。0.4μg/mL的FcRn被捕获到每个通道的流动单元2，同一通道的流动单元1被用作参考。然后在每个通道的两个流动单元中注射连续稀释的样品(30微升/分钟)，解离。为了去除测试的样品和受体，使用30s注射10mM甘氨酸-盐酸(pH1.5)进行界面再生。
(3)数据分析
使用Biacore8K评估软件评估每个样品的KD值。结果如表7所示，Fc改造的抗原结合蛋白对FcRn的亲和力改善。1C2-A指代的是19D4-25-1C2与YTE突变的Fc融合后得到的抗原结合蛋白，1C2-B指代的是19D4-25-1C2与未经改造的Fc融合得到的抗原结合蛋白，1C2-3C11-A指代的是19D4-25-1C2-3C11与YTE突变的Fc融合后得到的抗原结合蛋白，3C11-A指代的是19D4-25-3C11与YTE突变的Fc融合后得到的抗原结合蛋白。
8.3Fc改造的抗原结合蛋白对PD-1的亲和力检测
实验步骤同实施例5。结果如表8所示，Fc改造的抗原结合蛋白对PD-1的亲和力改善。其中，1C2-A指代的是19D4-25-1C2与YTE突变的Fc融合后得到的抗原结合蛋白，1C2-B指代的是19D4-25-1C2与未经改造的Fc融合得到的抗原结合蛋白，1C2-3C11-A指代的是19D4-25-1C2-3C11与YTE突变的Fc融合后得到的抗原结合蛋白，3C11-A指代的是19D4-25-3C11与YTE突变的Fc融合后得到的抗原结合蛋白，WT-A指代的是hu19D4-25与YTE突变的Fc融合后得到的抗原结合蛋白。
亲和力提高倍数的结果如表9所示，Fc改造后，抗原结合蛋白对FcRn的亲和力改善，半衰期延长。其中，1C2-Agly-YTE代表的是19D4-25-1C2与YTE突变、N297突变的Fc融合后得到的抗原结合蛋白，1C2-Agly代表的是19D4-25-1C2与N297突变的Fc融合后得到的抗原结合蛋白，1C2-3C11-Agly-YTE指代的是19D4-25-1C2-3C11与YTE突变、N297突变的Fc融合后得到的抗原结合蛋白，3C11-Agly-YTE指代的是19D4-25-3C11与YTE突变、N297突变的Fc融合后得到的抗原结合蛋白，WT-Agly-YTE指代的是hu19D4-25与YTE突变、N297突变的Fc融合后得到的抗原结合蛋白。
亲和力提高倍数的计算方式：亲和力提高倍数＝抗体的KD值/WT-AGY-YTE的KD值。
如表10所示，1C2-3C11-A对FcRn的亲和力是Pembrolizumab的10倍。
表7 Fc改造的抗原结合蛋白对FcRn的亲和力
Figure BDA0003679288950000471
表8 Fc改造的抗原结合蛋白对PD-1的亲和力
Figure BDA0003679288950000481
表9 Fc改造的抗原结合蛋白与野生型相比对FcRn的亲和力提高倍数统计
Figure BDA0003679288950000482
表10 Fc改造的抗原结合蛋白与Pembrolizumab相比对FcRn的亲和力提高倍数统计
抗原 抗体 比较 亲和力提高倍数
FcRn 1C2-3C11-A Pembrolizumab 10
8.4Fc改造的抗原结合蛋白抑制PD-L1与PD-1的结合的ELISA实验
用生物素标记PD1蛋白(Sulfo-NHS-Biotin，Pierce)，用PBS缓冲液稀释；在96孔板中包被PD-L1蛋白(1ug/mL,100uL/孔，4℃过夜)；加入200uL/孔封闭液封闭，用PBST洗板3次；向96孔板中加入抗PD-1抗体(从5ug/mL起，2倍稀释至0.078ug/mL，7个稀释点)和PD-1[B](0.5ug/mL，在PD1-PDL1结合的线性范围内)，孵育60分钟，用PBST洗板3次；加入HRP*-链霉亲和素，ELISA检测OD值。
结果如图3所示，Fc改造的抗原结合蛋白能够有效抑制PD-L1与PD-1的结合。IC50值如表11所示。
表11 ELISA实验结果
抗体 IC50(ug/ml)
Pembrolizumab 0.2445
1C2-3C11-W52F-Agly-YTE 0.4953
1C2-Agly-YTE 0.4916
1C2-Agly 0.3754
1C2-3C11-Agly-YTE 0.3695
3C11-Agly-YTE 0.5429
WT-Agly-YTE 0.4109
8.5Fc改造的抗原结合蛋白的功能性细胞实验
表达CD3抗体片段/IL-2基因/PDL1的HEK293细胞和表达HPD1的HUTT细胞混合培养后，PD1和PDL1的结合会抑制IL-2的产生。PD1抗体可阻断结合，使IL-2分泌增加。如图4a-4b所示，可以看到WT-Ag-YTE(没有亲和力成熟的hu19D4-25与YTE突变、N297突变的Fc融合后得到的抗原结合蛋白)有刺激IL-2分泌的能力，所有亲和力成熟的抗体都显著刺激IL-2的分泌。
需要说明的是，以上内容仅仅说明了本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰均落入本发明权利要求书的保护范围之内。
序列表
<110> 南京吉盛澳玛生物医药有限公司
<120> PD-1抗体及其用途
<150> 2021108074376
<151> 2021-07-16
<160> 48
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr
20 25 30
<210> 2
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr
20 25 30
<210> 3
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Ser Tyr Ala Ile Ser
1 5
<210> 4
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly
1 5 10
<210> 5
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly
1 5 10
<210> 6
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Val Ile Trp Thr Gly Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser
1 5 10 15
<210> 7
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys
1 5 10 15
Met Asn Ser Leu Gln Thr Glu Asp Thr Ala Ser Tyr Tyr Cys Ala Arg
20 25 30
<210> 8
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Arg Val Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu Lys
1 5 10 15
Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
20 25 30
<210> 9
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Asp His Tyr Gly Thr Ser Pro Phe Val Tyr
1 5 10
<210> 10
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
Glu His Tyr Gly Thr Ser Pro Phe Val Tyr
1 5 10
<210> 11
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
1 5 10
<210> 12
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 13
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys
20
<210> 14
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
Asp Ile Val Leu Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys
20
<210> 15
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Tyr Gly Ile Ser Phe Met Asn
1 5 10 15
<210> 16
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
1 5 10 15
<210> 17
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
Trp Phe Leu Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Gln Leu Leu Ile Tyr
1 5 10 15
<210> 18
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
Ala Ala Ser Asn Gln Gly Ser
1 5
<210> 19
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser
1 5 10 15
Leu Asn Ile His Pro Met Glu Glu Asp Asp Thr Ala Met Tyr Phe Cys
20 25 30
<210> 20
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
1 5 10 15
Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Phe Cys
20 25 30
<210> 21
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
Gln Gln Ser Lys Glu Val Pro Trp Thr
1 5
<210> 22
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
Gln Gln Ser Lys Glu Val Asn Trp Thr
1 5
<210> 23
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
Gln Gln Ser Leu Arg Val Pro Trp Thr
1 5
<210> 24
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
Gln Gln Ser Leu Glu Val Pro Trp Thr
1 5
<210> 25
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
Gln Gln Ser Leu Lys Val Pro Trp Ser
1 5
<210> 26
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
Ser Gln Ser Ser His Val Pro Trp Thr
1 5
<210> 27
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
1 5 10
<210> 28
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
1 5 10
<210> 29
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Val Ile Trp Thr Gly Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu
65 70 75 80
Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Glu Asp Thr Ala Ser Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Asp His Tyr Gly Thr Ser Pro Phe Val Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ala
115
<210> 30
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Val Ile Trp Thr Gly Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Asp His Tyr Gly Thr Ser Pro Phe Val Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 31
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Val Ile Trp Thr Gly Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Glu His Tyr Gly Thr Ser Pro Phe Val Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 32
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Tyr
20 25 30
Gly Ile Ser Phe Met Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Gln Gly Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Asn Ile His
65 70 75 80
Pro Met Glu Glu Asp Asp Thr Ala Met Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Lys
85 90 95
Glu Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 33
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
Asp Ile Val Leu Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Tyr
20 25 30
Gly Ile Ser Phe Met Asn Trp Phe Leu Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Gln Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Gln Gly Ser Gly Val Pro Asp
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser
65 70 75 80
Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Lys
85 90 95
Glu Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 34
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
Asp Ile Val Leu Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Tyr
20 25 30
Gly Ile Ser Phe Met Asn Trp Phe Leu Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Gln Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Gln Gly Ser Gly Val Pro Asp
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser
65 70 75 80
Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Lys
85 90 95
Glu Val Asn Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 35
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
Asp Ile Val Leu Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Tyr
20 25 30
Gly Ile Ser Phe Met Asn Trp Phe Leu Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Gln Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Gln Gly Ser Gly Val Pro Asp
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser
65 70 75 80
Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Leu
85 90 95
Arg Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 36
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
Asp Ile Val Leu Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Tyr
20 25 30
Gly Ile Ser Phe Met Asn Trp Phe Leu Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Gln Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Gln Gly Ser Gly Val Pro Asp
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser
65 70 75 80
Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Leu
85 90 95
Glu Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 37
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
Asp Ile Val Leu Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Tyr
20 25 30
Gly Ile Ser Phe Met Asn Trp Phe Leu Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Gln Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Gln Gly Ser Gly Val Pro Asp
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser
65 70 75 80
Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Leu
85 90 95
Lys Val Pro Trp Ser Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 38
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
Asp Ile Val Leu Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Tyr
20 25 30
Gly Ile Ser Phe Met Asn Trp Phe Leu Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
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Gln Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Gln Gly Ser Gly Val Pro Asp
50 55 60
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65 70 75 80
Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser Ser
85 90 95
His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 39
<211> 445
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Val Ile Trp Thr Gly Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Asp His Tyr Gly Thr Ser Pro Phe Val Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys
210 215 220
Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
225 230 235 240
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
245 250 255
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln
260 265 270
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
275 280 285
Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
290 295 300
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
305 310 315 320
Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
325 330 335
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
340 345 350
Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
355 360 365
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
370 375 380
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
385 390 395 400
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
405 410 415
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420 425 430
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
435 440 445
<210> 40
<211> 445
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Val Ile Trp Thr Gly Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Glu His Tyr Gly Thr Ser Pro Phe Val Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys
210 215 220
Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
225 230 235 240
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
245 250 255
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln
260 265 270
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
275 280 285
Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
290 295 300
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
305 310 315 320
Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
325 330 335
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
340 345 350
Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
355 360 365
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
370 375 380
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
385 390 395 400
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
405 410 415
Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
420 425 430
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
435 440 445
<210> 41
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
Asp Ile Val Leu Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Tyr
20 25 30
Gly Ile Ser Phe Met Asn Trp Phe Leu Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Gln Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Gln Gly Ser Gly Val Pro Asp
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser
65 70 75 80
Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Lys
85 90 95
Glu Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105 110
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
115 120 125
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
130 135 140
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
145 150 155 160
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
165 170 175
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
180 185 190
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
195 200 205
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 42
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
Asp Ile Val Leu Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Tyr
20 25 30
Gly Ile Ser Phe Met Asn Trp Phe Leu Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Gln Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Gln Gly Ser Gly Val Pro Asp
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser
65 70 75 80
Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Lys
85 90 95
Glu Val Asn Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105 110
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
115 120 125
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
130 135 140
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
145 150 155 160
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
165 170 175
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
180 185 190
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
195 200 205
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 43
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 43
Asp Ile Val Leu Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Tyr
20 25 30
Gly Ile Ser Phe Met Asn Trp Phe Leu Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Gln Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Gln Gly Ser Gly Val Pro Asp
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser
65 70 75 80
Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Leu
85 90 95
Arg Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105 110
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
115 120 125
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
130 135 140
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
145 150 155 160
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
165 170 175
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
180 185 190
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
195 200 205
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 44
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 44
Asp Ile Val Leu Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Tyr
20 25 30
Gly Ile Ser Phe Met Asn Trp Phe Leu Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Gln Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Gln Gly Ser Gly Val Pro Asp
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser
65 70 75 80
Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Leu
85 90 95
Glu Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105 110
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
115 120 125
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
130 135 140
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
145 150 155 160
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
165 170 175
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
180 185 190
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
195 200 205
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 45
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 45
Asp Ile Val Leu Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Tyr
20 25 30
Gly Ile Ser Phe Met Asn Trp Phe Leu Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Gln Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Gln Gly Ser Gly Val Pro Asp
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser
65 70 75 80
Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Leu
85 90 95
Lys Val Pro Trp Ser Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105 110
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
115 120 125
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
130 135 140
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
145 150 155 160
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
165 170 175
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
180 185 190
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
195 200 205
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 46
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 46
Asp Ile Val Leu Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Tyr
20 25 30
Gly Ile Ser Phe Met Asn Trp Phe Leu Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Gln Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Gln Gly Ser Gly Val Pro Asp
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser
65 70 75 80
Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser Ser
85 90 95
His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105 110
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
115 120 125
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
130 135 140
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
145 150 155 160
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
165 170 175
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
180 185 190
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
195 200 205
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 47
<211> 198
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 47
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
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65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Arg Thr Val Ala Ala
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Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
100 105 110
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115 120 125
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
130 135 140
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
145 150 155 160
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
165 170 175
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180 185 190
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
195
<210> 48
<211> 629
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 48
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
100 105 110
Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
115 120 125
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
130 135 140
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
145 150 155 160
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
165 170 175
Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr
180 185 190
Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr
195 200 205
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
210 215 220
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Tyr Ile Thr Arg Glu Pro
225 230 235 240
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
245 250 255
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
260 265 270
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
275 280 285
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Lys Ser Cys Asp Lys Thr
290 295 300
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
305 310 315 320
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Tyr Ile Thr Arg
325 330 335
Glu Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
340 345 350
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
355 360 365
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg Val Val
370 375 380
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
385 390 395 400
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
405 410 415
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
420 425 430
Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
435 440 445
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
450 455 460
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
465 470 475 480
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
485 490 495
Arg Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala
500 505 510
Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
515 520 525
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln
530 535 540
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
545 550 555 560
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
565 570 575
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
580 585 590
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
595 600 605
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
610 615 620
Leu Ser Pro Gly Lys
625

Claims (93)

1.分离的抗原结合蛋白，其具有下述性质中的一种或多种：
a)在Biacore检测中，以约5E-07M或以下的KD值与人PD-1蛋白特异性结合；
b)能够阻断PD-1与PD-L1的结合。
2.根据权利要求1所述的分离的抗原结合蛋白，其包含HCDR3，所述HCDR3包含SEQ IDNO:53所示的氨基酸序列。
3.根据权利要求2所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述HCDR3包含SEQ ID NO:9和SEQID NO:10中任一项所示的氨基酸序列。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其包含HCDR2，所述HCDR2包含SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其包含HCDR1，所述HCDR1包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其包含SEQ ID NO:54所示的重链可变区VH的HCDR1、HCDR2和HCDR3。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其包含SEQ ID NO:29至SEQID NO:31中任一项所示的重链可变区VH的HCDR1、HCDR2和HCDR3。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其包括重链可变区VH，所述VH包含所述HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述HCDR3包含SEQ ID NO:53所示的氨基酸序列；所述HCDR2包含SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列；以及所述HCDR1包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。
9.根据权利要求8所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述HCDR1、HCDR2和HCDR3包含选自下述任意一组的氨基酸序列：
a)HCDR1：SEQ ID NO:3，HCDR2：SEQ ID NO:6和HCDR3：SEQ ID NO:9；和
b)HCDR1：SEQ ID NO:3，HCDR2：SEQ ID NO:6和HCDR3：SEQ ID NO:10。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其包含H-FR1，所述H-FR1的C末端与所述HCDR1的N末端直接或间接地相连，且所述H-FR1包含SEQ ID NO:49所示的氨基酸序列。
11.根据权利要求10所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述H-FR1包含SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2中任一项所示的氨基酸序列。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其包含H-FR2，所述H-FR2位于所述HCDR1与所述HCDR2之间，且所述H-FR2包含SEQ ID NO:50所示的氨基酸序列。
13.根据权利要求12所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述H-FR2包含SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5中任一项所示的氨基酸序列。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其包含H-FR3，所述H-FR3位于所述HCDR2与所述HCDR3之间，且所述H-FR3包含SEQ ID NO:51所示的氨基酸序列。
15.根据权利要求14所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述H-FR3包含SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8中任一项所示的氨基酸序列。
16.根据权利要求1-15中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其包含H-FR4，所述H-FR4的N末端与所述HCDR3的C末端直接或间接地相连，且所述H-FR4包含SEQ ID NO:52所示的氨基酸序列。
17.根据权利要求16所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述H-FR4包含SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12中任一项所示的氨基酸序列。
18.根据权利要求1-17中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其包含H-FR1，H-FR2，H-FR3和H-FR4，所述H-FR1包含SEQ ID NO:49所示的氨基酸序列；所述H-FR2包含SEQ ID NO:50所示的氨基酸序列；所述H-FR3包含SEQ ID NO:51所示的氨基酸序列；以及所述H-FR4包含SEQ ID NO:52所示的氨基酸序列。
19.根据权利要求18所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述H-FR1包含SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2中任一项所示的氨基酸序列；所述H-FR2包含SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5中任一项所示的氨基酸序列；所述H-FR3包含SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8中任一项所示的氨基酸序列；以及所述H-FR4包含SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12中任一项所示的氨基酸序列。
20.根据权利要求18-19中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述H-FR1、H-FR2、H-FR3和H-FR4包含选自下述任意一组的氨基酸序列：
a)H-FR1：SEQ ID NO:1，H-FR2：SEQ ID NO:4，H-FR3：SEQ ID NO:7和H-FR4：SEQ ID NO:11；和
b)H-FR1：SEQ ID NO:2，H-FR2：SEQ ID NO:5，H-FR3：SEQ ID NO:8和H-FR4：SEQ ID NO:12。
21.根据权利要求1-20中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其包含重链可变区VH，所述VH包含SEQ ID NO:54所示的氨基酸序列。
22.根据权利要求21所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述VH包含SEQ ID NO:29至SEQID NO:31中任一项所示的氨基酸序列。
23.根据权利要求1-22中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其包含LCDR3，所述LCDR3包含SEQ ID NO:59所示的氨基酸序列。
24.根据权利要求23所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述LCDR3包含SEQ ID NO:21至SEQ ID NO:26中任一项所示的氨基酸序列。
25.根据权利要求1-24中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其包含LCDR2，所述LCDR2包含SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列。
26.根据权利要求1-25中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其包含LCDR1，所述LCDR1包含SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列。
27.根据权利要求1-26中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其包含SEQ ID NO:60所示的轻链可变区VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
28.根据权利要求1-27中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其包含SEQ ID NO:32至SEQ ID NO:38中任一项所示的轻链可变区VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
29.根据权利要求1-28中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其包含轻链可变区VL，所述VL包含所述LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述LCDR3包含SEQ ID NO:59所示的氨基酸序列；所述LCDR2包含SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列；以及所述LCDR1包含SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列。
30.根据权利要求28-29中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述LCDR1、LCDR2和LCDR3包含选自下述任意一组的氨基酸序列：
a)LCDR1：SEQ ID NO:15，LCDR2：SEQ ID NO:18和LCDR3：SEQ ID NO:21；
b)LCDR1：SEQ ID NO:15，LCDR2：SEQ ID NO:18和LCDR3：SEQ ID NO:22；
c)LCDR1：SEQ ID NO:15，LCDR2：SEQ ID NO:18和LCDR3：SEQ ID NO:23；
d)LCDR1：SEQ ID NO:15，LCDR2：SEQ ID NO:18和LCDR3：SEQ ID NO:24；
e)LCDR1：SEQ ID NO:15，LCDR2：SEQ ID NO:18和LCDR3：SEQ ID NO:25；和
f)LCDR1：SEQ ID NO:15，LCDR2：SEQ ID NO:18和LCDR3：SEQ ID NO:26。
31.根据权利要求1-30中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其包含L-FR1，所述L-FR1的C末端与所述LCDR1的N末端直接或间接地相连，且所述L-FR1包含SEQ ID NO:55所示的氨基酸序列。
32.根据权利要求31所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述L-FR1包含SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14中任一项所示的氨基酸序列。
33.根据权利要求1-32中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其包含L-FR2，所述L-FR2位于所述LCDR1与所述LCDR2之间，且所述L-FR2包含SEQ ID NO:56所示的氨基酸序列。
34.根据权利要求33所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述L-FR2包含SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:17中任一项所示的氨基酸序列。
35.根据权利要求1-34中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其包含L-FR3，所述L-FR3位于所述LCDR2与所述LCDR3之间，且所述L-FR3包含SEQ ID NO:57所示的氨基酸序列。
36.根据权利要求35所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述L-FR3包含SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20中任一项所示的氨基酸序列。
37.根据权利要求1-36中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其包含L-FR4，所述L-FR4的N末端与所述LCDR3的C末端直接或间接地相连，且所述L-FR4包含SEQ ID NO:58所示的氨基酸序列。
38.根据权利要求37所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述L-FR4包含SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28中任一项所示的氨基酸序列。
39.根据权利要求1-38中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其包含L-FR1，L-FR2，L-FR3和L-FR4，所述L-FR1包含SEQ ID NO:55所示的氨基酸序列；所述L-FR2包含SEQ ID NO:56所示的氨基酸序列；所述L-FR3包含SEQ ID NO:57所示的氨基酸序列；以及所述L-FR4包含SEQ ID NO:58所示的氨基酸序列。
40.根据权利要求39所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述L-FR1包含SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14中任一项所示的氨基酸序列；所述L-FR2包含SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:17中任一项所示的氨基酸序列；所述L-FR3包含SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20中任一项所示的氨基酸序列；以及所述L-FR4包含SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28中任一项所示的氨基酸序列。
41.根据权利要求39-40中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述L-FR1、L-FR2、L-FR3和L-FR4包含选自下述任意一组的氨基酸序列：
a)L-FR1：SEQ ID NO:13，L-FR2：SEQ ID NO:16，L-FR3：SEQ ID NO:19和L-FR4：SEQ IDNO:27；和
b)L-FR1：SEQ ID NO:14，L-FR2：SEQ ID NO:17，L-FR3：SEQ ID NO:20和L-FR4：SEQ IDNO:28。
42.根据权利要求1-41中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述VL包含SEQ IDNO:60中任一项所示的氨基酸序列。
43.根据权利要求42所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述VL包含SEQ ID NO:32至SEQID NO:38中任一项所示的氨基酸序列。
44.根据权利要求1-43中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其包括VH和VL，所述VH和VL包含选自下述任意一组的氨基酸序列：
a)VH：SEQ ID NO:29和VL：SEQ ID NO:32；
b)VH：SEQ ID NO:30和VL：SEQ ID NO:33；
c)VH：SEQ ID NO:30和VL：SEQ ID NO:34；
d)VH：SEQ ID NO:30和VL：SEQ ID NO:35；
e)VH：SEQ ID NO:30和VL：SEQ ID NO:36；
f)VH：SEQ ID NO:30和VL：SEQ ID NO:37；
g)VH：SEQ ID NO:30和VL：SEQ ID NO:38；
h)VH：SEQ ID NO:31和VL：SEQ ID NO:33；和
i)VH：SEQ ID NO:31和VL：SEQ ID NO:36。
45.根据权利要求1-44中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其与野生型抗体相比，所述抗原结合蛋白具有延长的半衰期。
46.根据权利要求1-45中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其与野生型抗体相比，所述抗原结合蛋白能够降低抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。
47.根据权利要求1-46中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其包含重链恒定区，且所述重链恒定区包括源自IgG的恒定区或源自IgY的恒定区。
48.根据权利要求47所述的分离的抗体结合蛋白，其中所述重链恒定区包括源自IgG的恒定区。
49.根据权利要求47-48中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述重链恒定区包括源自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的恒定区。
50.根据权利要求47-49任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述重链恒定区包括源自IgG1的Fc区。
51.根据权利要求47-50中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述重链恒定区的N297位发生突变，残基根据Kabat系统进行编号。
52.根据权利要求47-51中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述重链恒定区的M252位发生突变，残基根据Kabat系统进行编号。
53.根据权利要求47-52中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述重链恒定区的S254位发生突变，残基根据Kabat系统进行编号。
54.根据权利要求47-53中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述重链恒定区的T256位发生突变，残基根据Kabat系统进行编号。
55.根据权利要求47-54中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述重链恒定区中的Fc区包含N297A突变。
56.根据权利要求47-55中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述重链恒定区中的Fc区包含M252Y突变。
57.根据权利要求47-56中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述重链恒定区中的Fc区包含S254T突变。
58.根据权利要求47-57中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述重链恒定区中的Fc区包含T256E突变。
59.根据权利要求47-58中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述重链恒定区包含SEQ ID NO:48所示的氨基酸序列。
60.根据权利要求1-59中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其包含轻链恒定区，且所述轻链恒定区包括源自Igκ的恒定区或源自Igλ的恒定区。
61.根据权利要求60所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述轻链恒定区包括源自人Igκ的恒定区。
62.根据权利要求60-61中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述轻链恒定区包含SEQ ID NO:47所示的氨基酸序列。
63.根据权利要求1-62中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其包含重链HC，所述HC包含SEQ ID NO:39和SEQ ID NO:40中任一项所示的氨基酸序列。
64.根据权利要求1-63中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其包含轻链LC，所述LC包含SEQ ID NO:41至SEQ ID NO:46中任一项所示的氨基酸序列。
65.根据权利要求1-64中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其包括抗体或其抗原结合片段。
66.根据权利要求65所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合片段选自下组：Fab，Fab’，F(ab)2，Fv片段，F(ab’)2，scFv，di-scFv，VHH和/或dAb。
67.根据权利要求65-66中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述抗体选自下组：单克隆抗体、单链抗体、嵌合抗体、人源化抗体、双特异性抗体、多特异性抗体和全人源抗体。
68.多肽，其包含权利要求1-67中任一项所述的分离的抗原结合蛋白。
69.免疫缀合物，其包含权利要求1-67中任一项所述的分离的抗原结合蛋白或权利要求68所述的多肽。
70.分离的核酸分子，其编码权利要求1-67中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，或者权利要求68所述的多肽。
71.载体，其包含权利要求70所述的分离的核酸分子。
72.细胞，其包含权利要求1-67中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，权利要求68所述的多肽，权利要求69所述的免疫缀合物，权利要求70所述的分离的核酸分子和/或权利要求71所述的载体。
73.制备权利要求1-67中任一项所述的分离的抗原结合蛋白或权利要求68所述的多肽的方法，所述方法包括再使得权利要求1-67中任一项所述的分离的抗原结合蛋白或权利要求68所述的多肽表达的条件下，培养权利要求72所述的细胞。
74.药物组合物，其包含权利要求1-67中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，权利要求68所述的多肽，权利要求69所述的免疫缀合物，权利要求70所述的分离的核酸分子，权利要求71所述的载体，权利要求72所述的细胞，和/或药学上可接受的佐剂和/或赋形剂。
75.一种用于检测或测定PD-1的方法，所述方法包括使用权利要求1-67中任一项所述的分离的抗原结合蛋白或权利要求68所述的多肽。
76.一种PD-1的检测试剂盒，其包含权利要求1-67中任一项所述的分离的抗原结合蛋白或权利要求68所述的多肽。
77.权利要求1-67中任一项所述的分离的抗原结合蛋白或权利要求68所述的多肽在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于检测PD-1的存在和/或含量。
78.抑制PD-1与PD-L1相互作用的方法，其包括向有需要的受试者施用有效量的权利要求1-67中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，权利要求68所述的多肽，权利要求69所述的免疫缀合物，权利要求70所述的分离的核酸分子，权利要求71所述的载体，和/或权利要求72所述的细胞。
79.权利要求1-67中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，权利要求68所述的多肽，权利要求69所述的免疫缀合物，权利要求70所述的分离的核酸分子，权利要求71所述的载体，权利要求72所述的细胞和/或权利要求74所述的药物组合物在制备预防和/或治疗疾病或病症的药物中的用途。
80.根据权利要求79所述的用途，其中所述疾病或病症包括肿瘤。
81.根据权利要求80所述的用途，其中所述肿瘤包括实体瘤。
82.根据权利要求80-81中任一项所述的用途，其中所述肿瘤包括非实体瘤。
83.根据权利要求80-82中任一项所述的用途，其中所述肿瘤包括黑色素瘤，肺癌，头颈鳞状细胞癌，淋巴瘤，肝细胞癌，肾细胞癌，尿路上皮癌，结直肠癌和/或乳腺癌。
84.权利要求1-67中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，权利要求68所述的多肽，权利要求69所述的免疫缀合物，权利要求70所述的分离的核酸分子，权利要求71所述的载体，权利要求72所述的细胞和/或权利要求74所述的药物组合物，其用于预防、缓解和/或治疗疾病或病症。
85.根据权利要求84所述的用途，其中所述疾病或病症包括肿瘤。
86.根据权利要求85所述的用途，其中所述肿瘤包括实体瘤。
87.根据权利要求85-86中任一项所述的用途，其中所述肿瘤包括非实体瘤。
88.根据权利要求85-87中任一项所述的用途，其中所述肿瘤包括黑色素瘤，肺癌，头颈鳞状细胞癌，淋巴瘤，肝细胞癌，肾细胞癌，尿路上皮癌，结直肠癌和/或乳腺癌。
89.一种预防和/或治疗疾病或病症的方法，其包括向有需要的受试者施用有效量的权利要求1-67中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，权利要求68所述的多肽，权利要求69所述的免疫缀合物，权利要求70所述的分离的核酸分子，权利要求71所述的载体，权利要求72所述的细胞和/或权利要求74所述的药物组合物。
90.根据权利要求89所述的方法，其中所述疾病或病症包括肿瘤。
91.根据权利要求90所述的方法，其中所述肿瘤包括实体瘤。
92.根据权利要求90-91中任一项所述的方法，其中所述肿瘤包括非实体瘤。
93.根据权利要求90-92中任一项所述的方法，其中所述肿瘤包括黑色素瘤，肺癌，头颈鳞状细胞癌，淋巴瘤，肝细胞癌，肾细胞癌，尿路上皮癌，结直肠癌和/或乳腺癌。
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