KR20230118874A

KR20230118874A - Prame 결합성 분자

Info

Publication number: KR20230118874A
Application number: KR1020237021432A
Authority: KR
Inventors: 히로시 시쿠; 야스시 아카호리; 히로유키 히라츠카
Original assignee: 고쿠리츠다이가쿠호진 미에다이가쿠
Priority date: 2020-12-10
Filing date: 2021-12-07
Publication date: 2023-08-14
Also published as: WO2022124282A1; US20240024480A1; JPWO2022124282A1; EP4260870A1; CN116710136A

Abstract

PRAME 결합성 분자를 제공하는 것을 과제로 하고, 당해 과제를, 서열 번호 1 로 나타내는 아미노산 서열을 포함하는 중사슬 CDR1, 서열 번호 2 로 나타내는 아미노산 서열을 포함하는 중사슬 CDR2, 및 서열 번호 3 으로 나타내는 아미노산 서열을 포함하는 중사슬 CDR3 을 포함하는 중사슬 가변 영역, 그리고/혹은 서열 번호 9 로 나타내는 아미노산 서열을 포함하는 경사슬 CDR1, 서열 번호 10 으로 나타내는 아미노산 서열을 포함하는 경사슬 CDR2, 및 서열 번호 11 로 나타내는 아미노산 서열을 포함하는 경사슬 CDR3 을 포함하는 경사슬 가변 영역을 포함하는, PRAME 결합성 분자에 의해 해결한다.

Description

PRAME 결합성 분자

본 발명은 PRAME 결합성 분자 등에 관한 것이다.

PRAME (Preferentially Expressed Antigen in Melanoma) 는, 암 정소 항원인 것이 알려져 있고, 성인의 정상 조직에서는 정소 외에는 자궁 내막, 난소, 부신에서 약간의 발현이 있을 뿐이다. PRAME 를 고발현하는 암으로는, 멜라노머 (환자의 95 ％) 나 폐암 (50 ％), 유방암 (27 ％), 급성 백혈병 (30 ％), 다발성 골수종 (52 ％) 등이 알려져 있고 (비특허문헌 1, 2, 3), 암치료의 타깃으로서 주목받고 있다. 그 타깃이 되는 펩티드로는, HLA-A2 에서는 p100-108, p142-151, p300-309, p425-433, p435-443 등이 알려져 있고, 한편 HLA-A24 에서는 p301-309 가 알려져 있다. 각각 pMHC 를 인식하는 T cell 이 클로닝되고, T cell receptor (TCR) 가 단리되어 그 기능이 해석되고 있지만 (비특허문헌 4, 5, 6), 지금까지 암치료에 사용할 수 있는 TCR 은 단리되어 있지 않다.

N. van Baren, H. Chambost, A. Ferrant, L. Michaux, H. Ikeda, I. Millard, D. Olive, T. Boon, P. G. Coulie (1998), PRAME, a gene encoding an antigen recognized on a human melanoma by cytolytic T cells, is expressed inacute leukaemia cells. Br. J. Haematol. 102 : 1376 - 1379. E. Neumann, A. Engelsberg, J. Decker, S. Storkel, E. Jaeger, C. Huber, B. Seliger (1998) Heterogeneous expression of the tumor-associated antigens RAGE-1, PRAME, and glycoprotein 75 in human renal cell carcinomacandidates for T-cell-based immunotherapies? Cancer Res. 58 : 4090 - 4095. C. Pellat-Deceunynck, M. P. Mellerin, N. Labarriere, G. Jego, A. Moreau-Aubry, J. L. Harousseau, F. Jotereau, R. Bataille (2000) The cancer germ-line genes MAGE-1, MAGE-3 and PRAME are co㎜only expressed by human myeloma cells. Eur. J. Immunol. 30 : 803 - 809. Jan H. Kessler, Nico J. Beekman, Sandra A. Bres-Vloemans, Pauline Verdijk, Peter A. van Veelen, Antoinette M. Kloosterman-Joosten, Debby C. J. Vissers, George J. A. ten Bosch, Michel G. D. Kester, Alice Sijts, Jan Wouter Drijfhout, Ferry Ossendorp, Rienk Offringa, Cornelis J. M. Melief, (2001), Efficient Identification of Novel Hla-A*0201-Presented Cytotoxic T Lymphocyte Epitopes in the Widely Expressed Tumor Antigen Prameby Proteasome-Mediated Digestion Analysis, JEM, 193(1). Concetta Quintarelli, Gianpietro Dotti, Sayyeda T. Hasan, Biagio De Angelis, Valentina Hoyos, Santa Errichiello, Martha Mims, Luigia Luciano, Jessica Shafer, Ann M. Leen, Helen E. Heslop, Cliona M. Rooney, Fabrizio Pane, Malcolm K. Brenner, and Barbara Savoldo, (2011), High-avidity cytotoxic T lymphocytes specific for a new PRAME-derived peptide can target leukemic and leukemic precursor cells, Blood vol.117(12), 3353 - 3362. Hideyuki Ikeda, Bernard Lethe, Frederic Lehmann, Nicolas Van Baren, Jean-Franc, ois Baurain, CharlesDe Smet, Herve' Chambost, Massimo Vitale, Alessandro Moretta, Thierry Boon, (1997), Characterization of an Antigen That is Recognized on a Melanoma Showing Partial HLA Loss by CTL Expressing an NK Inhibitory Receptor, Immunity, vol.6, 199 - 208. Yasushi Akahori, Linan Wang, Motohiro Yoneyama, Naohiro Seo, Satoshi Okumura, Yoshihiro Miyahara, Yasunori Amaishi, Sachiko Okamoto, Junichi Mineno, Hiroaki Ikeda, Takehiro Maki, Hiroshi Fujiwara, Yoshiki Akatsuka, Takuma Kato, and Hiroshi Shiku, 2018, Antitumor activity of CAR-T cells targeting the intracellular oncoprotein WT1 can be enhanced by vaccination, Blood, 132(11), 1134 - 1145. Yasushi Akahori, Gene Kurosawa, Mariko Sumitomo, Miwa Morita, Chiho Muramatsu, Keiko Eguchi, Miho Tanaka, Kazuhiro Suzuki, Mototaka Sugiura, Yoshitaka Iba, Atsushi Sugioka, Yoshikazu Kurosawa, (2008), Isolation of antigen/antibody complexes through organic solvent (ICOS) method, Biochemical and Biophysical Research Communications, 11, 129.

본 발명은, PRAME 결합성 분자를 제공하는 것을 과제로 한다.

본 발명자는 상기 과제를 감안하여, HLA-A24 PRAMEp301-309 pMHC 복합체를 인식하는 항체를 단리하여, 그것을 사용한 CAR 을 제조하는 것을 시도하였다. 본 발명자는 더욱 연구를 진행시킨 결과, 서열 번호 1 로 나타내는 아미노산 서열을 포함하는 중사슬 CDR1, 서열 번호 2 로 나타내는 아미노산 서열을 포함하는 중사슬 CDR2, 및 서열 번호 3 으로 나타내는 아미노산 서열을 포함하는 중사슬 CDR3 을 포함하는 중사슬 가변 영역, 그리고/혹은 서열 번호 9 로 나타내는 아미노산 서열을 포함하는 경사슬 CDR1, 서열 번호 10 으로 나타내는 아미노산 서열을 포함하는 경사슬 CDR2, 및 서열 번호 11 로 나타내는 아미노산 서열을 포함하는 경사슬 CDR3 을 포함하는 경사슬 가변 영역을 포함하는, PRAME 결합성 분자이면, 상기 과제를 해결할 수 있는 것을 알아내었다. 이 지견에 기초하여 더욱 연구를 진행시킨 결과, 본 발명이 완성되었다. 즉, 본 발명은 하기의 양태를 포함한다.

항 1. 서열 번호 1 로 나타내는 아미노산 서열을 포함하는 중사슬 CDR1, 서열 번호 2 로 나타내는 아미노산 서열을 포함하는 중사슬 CDR2, 및 서열 번호 3 으로 나타내는 아미노산 서열을 포함하는 중사슬 CDR3 을 포함하는 중사슬 가변 영역, 그리고/혹은

서열 번호 9 로 나타내는 아미노산 서열을 포함하는 경사슬 CDR1, 서열 번호 10 으로 나타내는 아미노산 서열을 포함하는 경사슬 CDR2, 및 서열 번호 11 로 나타내는 아미노산 서열을 포함하는 경사슬 CDR3 을 포함하는 경사슬 가변 영역

을 포함하는, PRAME 결합성 분자.

항 2. 상기 중사슬 가변 영역 및 상기 경사슬 가변 영역을 포함하는, 항 1 에 기재된 PRAME 결합성 분자.

항 3. HLA-A24 PRAMEp301-309 pMHC 복합체에 대해 결합성을 갖는, 항 1 또는 2 에 기재된 PRAME 결합성 분자.

항 4. 서열 번호 19 로 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드, 서열 번호 20 으로 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드, 서열 번호 21 로 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드, 서열 번호 23 으로 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드, 서열 번호 24 로 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드, 서열 번호 25 로 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드, 및 서열 번호 26 으로 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드에 대한 결합성이, 서열 번호 17 로 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드에 대한 결합성의 1/2 이하인, 항 1 ∼ 3 중 어느 하나에 기재된 PRAME 결합성 분자.

항 5. 키메라 항원 수용체인, 항 1 ∼ 4 중 어느 하나에 기재된 PRAME 결합성 분자.

항 6. 상기 중사슬 가변 영역 및 상기 경사슬 가변 영역을 포함하는 scFv 도메인, 막관통 도메인, 그리고 TCR 의 세포내 도메인을 포함하는 코어 영역을 포함하는, 항 5 에 기재된 PRAME 결합성 분자.

항 7. 상기 코어 영역이 추가로 공자극 인자의 세포내 도메인을 포함하는, 항 6 에 기재된 PRAME 결합성 분자.

항 8. 항체인, 항 1 ∼ 4 중 어느 하나에 기재된 PRAME 결합성 분자.

항 9. 항 1 ∼ 8 중 어느 하나에 기재된 PRAME 결합성 분자를 코드하는, 폴리뉴클레오티드.

항 10. 항 9 에 기재된 폴리뉴클레오티드를 함유하는, 세포.

항 11. 항 5 ∼ 7 중 어느 하나에 기재된 PRAME 결합성 분자를 코드하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는, 림프구 세포.

항 12. 항 11 에 기재된 림프구 세포, 또는 항 8 에 기재된 PRAME 결합성 분자를 함유하는, 의약 조성물.

항 13. 암의 진단, 치료 또는 예방용인, 항 12 에 기재된 의약 조성물.

본 발명에 의하면, PRAME 결합성 분자를 제공할 수 있다. 본 발명의 PRAME 결합성 분자는, 특정한 CDR 서열을 갖고 있고, 이 때문에, PRAME 에 대한 결합성이 우수하고, 또, 특히 키메라 항원 수용체로 했을 경우가 우수한 항암 효과를 발휘할 수 있다.

도 1a 는, 항체 라이브러리 스크린의 방법 (마그넷 비드 스크린법) 의 개략도를 나타낸다 (시험예 1). Dynabeads MyOne Streptavidin T1 (Invitrogen) 에, 인공적으로 제조한 HLA-A24 PRAMEp301-309 를 결합시키고, 이것에 인간 항체 라이브러리를 반응시켜, 항체 클론의 농축을 실시하였다.
도 1b 는, 항체 라이브러리 스크린의 방법 (세포 스크린) 의 개략도를 나타낸다 (시험예 1). 도 1a 의 방법으로 얻어진 폴리클론 항체 클론에 대해, PRAME p301-309 를 펩티드 펄스한 T2A24 세포를 반응시키고, 이것을 유기 용매를 사용하여 수층과 세포 펠릿으로 나누어, 세포에 결합한 항체 클론을 선별하였다.
도 2 는, 시험예 1 에서 얻어진 각 클론의 항체의 ELISA 결과를 나타낸다. 세로축은, 발색 강도의 상대값을 나타내고, 가로축에 클론 번호를 나타낸다.
도 3 은, #98 scFvCL-cp3 에 대해, 각종 HLA-A24 관련 pMHC 에 대한 인식을 ELISA 로 검토한 결과를 나타낸다 (시험예 1). PRAME 이외의 pMHC 로 백그라운드 (none) 의 1.5 배 이상의 반응이 없는 것을 확인하였다. 세로축은, 발색 강도의 상대값을 나타내고, 가로축에 사용한 HLA-A24 관련 pMHC 를 나타낸다.
도 4 는, 펩티드 펄스가 없는 A24-LCL 세포와, 10 micro molar 의 PRAMEp301-309 로 펩티드 펄스를 실시한 A24-LCL 세포를 준비하고, #98 scFvCL-cp3 항체를 반응시킨 후 항 cp3 항체 (MBL 특제) 를 반응시키고, 또한 Alexa488 표지 항마우스 IgG (Invitrogen) 를 반응시키고, FACS CANT 로 측정을 실시한 결과를 나타낸다 (시험예 1).
도 5 는, 알라닌 치환 검토의 결과를 나타낸다 (시험예 2). 세로축은 사용한 펩티드에 있어서의 치환 부위 및 치환 후의 아미노산을 나타내고, 가로축은 평균 형광 강도를 나타낸다.
도 6 은, #98 에 대한 SPR 법에 의한 affinity 측정 결과를 나타낸다 (시험예 3).
도 7 은, CAR 도입의 레트로바이러스 벡터의 모식도를 나타낸다 (시험예 4).
도 8a 는, CAR 비도입 세포의 FACS 결과를 나타낸다 (시험예 4).
도 8b 는, CAR 도입 세포의 FACS 결과를 나타낸다 (시험예 4).
도 9 는, CAR 도입 세포에 대한 알라닌 치환 검토의 결과를 나타낸다 (시험예 5). 세로축은 사용한 펩티드에 있어서의 치환 부위 및 치환 후의 아미노산을 나타내고, 가로축은 IFN gamma 농도를 나타낸다.
도 10 은, IFNg 염색한 CAR 도입 세포의 FACS 결과를 나타낸다 (시험예 5). 세로축은, IFNg 양성률을 나타내고, 가로축은 펩티드 펄스에 있어서의 PRAME p301-309 농도를 나타낸다.
도 11a 는, 시험예 7 및 8 의 타깃 세포의 PRAME 발현 해석 결과를 나타낸다. 세로축은, PREME mRNA 량의 상대값을 나타내고, 가로축에 타깃 세포를 나타낸다.
도 11b 는, 시험예 7 및 8 의 타깃 세포의 HLA-A24 발현 해석 결과를 나타낸다. 세로축은, HLA-A24 에 대한 평균 형광 강도를 나타내고, 가로축에 타깃 세포를 나타낸다.
도 12 는, 시험예 7 및 8 의 ELISA 에 의한 IFN gamma 농도의 측정 결과를 나타낸다. 세로축은 IFN gamma 농도를 나타내고, 가로축은 타깃 세포를 나타낸다.
도 13a 는, 음성 타깃 세포 (NW-MEL-38 (PRAME 양성 HLA-A24 음성)) 에 각 이펙터 세포를 작용시켜, xCelligence 에 의한 index 변화를 관찰한 결과를 나타낸다. 세로축은, 이펙터 세포와 공배양하기 직전의 NW-MEL-38 세포수를 1 로서 표준화한, A24 NW-MEL-38 세포수를 나타낸다. 가로축은, 배양 개시로부터의 경과 시간을 나타낸다. 범례는 이펙터 세포를 나타낸다.
도 13b 는, 양성 타깃 세포 (HLA-A24 도입 NW-MEL-38 세포 (A24+PRAME+)) 에 각 이펙터 세포를 작용시켜, xCelligence 에 의한 index 변화를 관찰한 결과를 나타낸다. 세로축은, 이펙터 세포와 공배양하기 직전의 NW-MEL-38 세포수를 1 로서 표준화한, A24 NW-MEL-38 세포수를 나타낸다. 가로축은, 배양 개시로부터의 경과 시간을 나타낸다. 범례는 이펙터 세포를 나타낸다.
도 13c 는, 양성 타깃 세포 (SK-MEL-124 세포(A24+PRAME+)) 에 각 이펙터 세포를 작용시켜, xCelligence 에 의한 index 변화를 관찰한 결과를 나타낸다. 세로축은, 이펙터 세포와 공배양하기 직전의 NW-MEL-38 세포수를 1 로서 표준화 한, A24 NW-MEL-38 세포수를 나타낸다. 가로축은, 배양 개시로부터의 경과 시간을 나타낸다. 범례는 이펙터 세포를 나타낸다.
도 14a 는, 시험예 10 의 시험 개요를 나타낸다.
도 14b 는, 시험예 10 의 종양 영역 면적의 측정 결과를 나타낸다. 세로축은 종양 영역의 면적을 나타내고, 가로축은 SK-MEL-124 세포 접종으로부터의 경과 일수를 나타낸다.
도 14c 는, 시험예 10 의 체중 측정 결과를 나타낸다. 세로축은 체중의 상대값을 나타내고, 가로축은 SK-MEL-124 세포 접종으로부터의 경과 일수를 나타낸다.
도 15a 는, 시험예 11 의 시험 개요를 나타낸다.
도 15b 는, 시험예 11 의 종양 사이즈의 측정 결과를 나타낸다. 세로축은 종양 사이즈를 나타내고, 가로축은 SK-MEL-124 세포 접종 (-10) 으로부터의 경과 일수를 나타낸다.
도 15c 는, 시험예 11 의 CAR-T 세포 비율의 측정 결과를 나타낸다. 세로축은 말초혈 중의 CAR-T 세포의 비율을 나타내고, 가로축은 SK-MEL-124 세포 접종으로부터의 경과 일수를 나타낸다.
도 16 은, 표 2 의 펩티드, CMV, DMSO 를 T2A24 에 펄스하고, #98CAR-T 세포와 공배양하고, 배양 상청 중에 분비되는 IFNg 량을 ELISA 로 측정한 결과를 나타낸다 (시험예 5). 세로축은 IFNg 량을 나타내고, 가로축에 사용한 펩티드를 나타낸다. 또한, e alone 은 effector 세포만을 나타낸다.

1. 정의

본 명세서 중에 있어서, 「함유」 및 「포함하는」 이라는 표현에 대해서는, 「함유」, 「포함하는」, 「실질적으로 이루어지는」 및 「만으로 이루어지는」 이라는 개념을 포함한다.

아미노산 서열의 「동일성」 이란, 2 이상의 대비 가능한 아미노산 서열의, 서로에 대한 아미노산 서열의 일치의 정도를 말한다. 따라서, 어느 2 개의 아미노산 서열의 일치성이 높을수록, 그들 서열의 동일성 또는 유사성은 높다. 아미노산 서열의 동일성의 레벨은, 예를 들어, 서열 분석용 툴인 FASTA 를 사용하고, 디폴트 파라미터를 사용하여 결정된다. 혹은, Karlin 및 Altschul 에 의한 알고리즘 BLAST (KarlinS, Altschul SF. "Methods for assessing the statistical significance of molecular sequence features by using general scoringschemes "Proc Natl Acad Sci USA. 87 : 2264 - 2268(1990), KarlinS, Altschul SF. "Applications and statistics for multiple high-scoring segments in molecular sequences." Proc Natl Acad Sci USA. 90 : 5873 - 7(1993)) 를 사용하여 결정할 수 있다. 이와 같은 BLAST 의 알고리즘에 기초한 BLASTX 라고 불리는 프로그램이 개발되고 있다. 이들 해석 방법의 구체적인 수법은 공지이고, National Center of Biotechnology Information (NCBI) 의 웹사이트 (http : //www.ncbi.nlm.nih.gov/) 를 참조하면 된다. 또, 염기 서열의 『동일성』 도 상기에 준하여 정의된다.

본 명세서 중에 있어서, 「보존적 치환」 이란, 아미노산 잔기가 유사한 측사슬을 갖는 아미노산 잔기로 치환되는 것을 의미한다. 예를 들어, 리신, 아르기닌, 히스티딘과 같은 염기성 측사슬을 갖는 아미노산 잔기끼리에서 치환되는 것이, 보존적인 치환에 해당한다. 그 밖에, 아스파르트산, 글루탐산과 같은 산성 측사슬을 갖는 아미노산 잔기 ; 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 스레오닌, 티로신, 시스테인과 같은 비대전성 극성 측사슬을 갖는 아미노산 잔기 ; 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판과 같은 비극성 측사슬을 갖는 아미노산 잔기 ; 스레오닌, 발린, 이소류신과 같은 beta-분지 측사슬을 갖는 아미노산 잔기 ; 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘과 같은 방향족 측사슬을 갖는 아미노산 잔기끼리에서의 치환도 동일하게, 보존적인 치환에 해당한다.

본 명세서 중에 있어서, 「CDR」 이란, Complementarity Determining Region 의 약어이고, 상보성 결정 영역이라고도 칭해진다. CDR 이란, 이뮤노글로불린의 가변 영역에 존재하는 영역이고, 항체가 갖는 항원에 대한 특이적인 결합에 깊게 관여하는 영역이다. 그리고, 「경사슬 CDR」 이란 이뮤노글로불린의 경사슬 가변 영역에 존재하는 CDR 이고, 「중사슬 CDR」 이란 이뮤노글로불린의 중사슬 가변 영역에 존재하는 CDR 을 의미한다.

본 명세서 중에 있어서, 「가변 영역」 이란, CDR1 ∼ CDR3 (이하, 간단히 「CDRs1-3」 이라고 한다) 을 포함하는 영역을 의미한다. 이들 CDRs1-3 의 배치 순서는 특별히 한정되지는 않지만, 바람직하게는, N 말단측으로부터 C 말단측의 방향으로, CDR1, CDR2, 및 CDR3 의 순서이거나, 혹은 이 반대의 순서로, 연속 또는 후술하는 프레임 워크 영역 (FR) 이라고 칭해지는 다른 아미노산 서열을 개재하여, 배치된 영역을 의미한다. 그리고 「중사슬 가변 영역」 이란, 상기 서술한 중사슬 CDRs1-3 이 배치된 영역이고, 「경사슬 가변 영역」 이란, 상기 서술한 경사슬 CDRs1-3 이 배치된 영역이다.

각 가변 영역의 상기 CDR1-3 이외의 영역은, 상기 서술하는 바와 같이 프레임 워크 영역 (FR) 이라고 칭해진다. 특히 가변 영역의 N 말단과 상기 CDR1 사이의 영역을 FR1, CDR1 과 CDR2 사이의 영역을 FR2, CDR2 와 CDR3 사이의 영역을 FR3, CDR3 과 가변 영역의 C 말단 사이를 FR4 로 각각 정의된다.

2. PRAME 결합성 분자

본 발명은, 그 일 양태에 있어서, 서열 번호 1 로 나타내는 아미노산 서열을 포함하는 중사슬 CDR1, 서열 번호 2 로 나타내는 아미노산 서열을 포함하는 중사슬 CDR2, 및 서열 번호 3 으로 나타내는 아미노산 서열을 포함하는 중사슬 CDR3 을 포함하는 중사슬 가변 영역, 그리고/혹은 서열 번호 9 로 나타내는 아미노산 서열을 포함하는 경사슬 CDR1, 서열 번호 10 으로 나타내는 아미노산 서열을 포함하는 경사슬 CDR2, 및 서열 번호 11 로 나타내는 아미노산 서열을 포함하는 경사슬 CDR3 을 포함하는 경사슬 가변 영역을 포함하는, PRAME 결합성 분자 (본 명세서에 있어서, 「본 발명의 PRAME 결합성 분자」 라고 나타내는 경우도 있다.) 에 관한 것이다. 이하에 이것에 대해 설명한다.

본 발명의 PRAME 결합성 분자는, 서열 번호 1 로 나타내는 아미노산 서열을 포함하는 중사슬 CDR1, 서열 번호 2 로 나타내는 아미노산 서열을 포함하는 중사슬 CDR2, 및 서열 번호 3 으로 나타내는 아미노산 서열을 포함하는 중사슬 CDR3 을 포함하는 중사슬 가변 영역, 그리고/혹은 서열 번호 9 로 나타내는 아미노산 서열을 포함하는 경사슬 CDR1, 서열 번호 10 으로 나타내는 아미노산 서열을 포함하는 경사슬 CDR2, 및 서열 번호 11 로 나타내는 아미노산 서열을 포함하는 경사슬 CDR3 을 포함하는 경사슬 가변 영역을 포함하는 것으로서, PRAME 에 대해 결합성을 갖는 분자인 한, 특별히 제한되지 않는다.

본 발명의 PRAME 결합성 분자는, 1 종의 폴리펩티드로 이루어지는 분자여도 되고, 2 종 이상의 폴리펩티드의 복합체로 이루어지는 분자여도 된다. 또, 본 발명의 PRAME 결합성 분자는, 폴리펩티드 또는 그 복합체로 이루어지는 분자여도 되고, 폴리펩티드 또는 그 복합체에, 다른 물질 (예를 들어 형광 물질, 방사성 물질, 무기 입자 등) 이 연결되어 이루어지는 것이어도 된다.

PRAME 에 대한 결합성은, 공지된 방법에 따라서, 예를 들어 ELISA 법에 의해 (구체적으로는, 예를 들어 시험예 2 의 방법에 의해) 측정할 수 있다. 본 발명의 PRAME 결합성 분자의 PRAME 에 대한 결합성은, 예를 들어, 후술하는 실시예의#98 항체의 PRAME 에 대한 결합성 100 ％ 에 대해, 예를 들어 20 ％ 이상, 50 ％ 이상, 70 ％ 이상, 80 ％ 이상, 90 ％ 이상, 95 ％ 이상, 99 ％ 이상이다.

본 발명의 PRAME 결합성 분자는, 바람직하게는 상기 중사슬 가변 영역 및 상기 경사슬 가변 영역을 양방 포함한다.

중사슬 가변 영역은, 바람직하게는, 서열 번호 4 로 나타내는 아미노산 서열, 또는 서열 번호 4 로 나타내는 아미노산 서열에 대해 90 ％ 이상 (바람직하게는 95 ％ 이상, 바람직하게는 98 ％ 이상, 바람직하게는 99 ％ 이상) 의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중사슬 가변 영역이다. 경사슬 가변 영역은, 바람직하게는, 서열 번호 12 로 나타내는 아미노산 서열, 또는 서열 번호 12 로 나타내는 아미노산 서열에 대해 90 ％ 이상 (바람직하게는 95 ％ 이상, 바람직하게는 98 ％ 이상, 바람직하게는 99 ％ 이상) 의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경사슬 가변 영역이다. 서열 번호 4 또는 12 에서 아미노산 변이가 있는 경우, 그 변이는, 아미노산 치환인 것이 바람직하고, 아미노산의 보존적 치환인 것이 보다 바람직하다.

본 발명의 PRAME 결합성 분자는, HLA-A24 PRAMEp301-309 pMHC 복합체에 대해 결합성을 가질 수 있다. HLA-A24 PRAMEp301-309 pMHC 복합체는, HLA-A24 와 PRAME 의 부분 펩티드 (p301-309 : 서열 번호 17) 의 복합체이다. 복합체의 양태는, HLA 가 펩티드를 항원 제시할 때의 양태이고, 이 한정에 있어서 특별히 제한되지 않는다.

본 발명의 PRAME 결합성 분자는, PRAMEp301-309 (서열 번호 17) 를 특이적으로 인식할 수 있다. 이 관점에서, 본 발명의 PRAME 결합성 분자는, PRAMEp301-309 를 일부 변이하여 이루어지는 펩티드 (서열 번호 19 로 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드, 서열 번호 20 으로 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드, 서열 번호 21 로 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드, 서열 번호 23 으로 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드, 서열 번호 24 로 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드, 서열 번호 25 로 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드, 및 서열 번호 26 으로 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드) 의 적어도 1 종 (바람직하게는, 2 종 이상, 3 종 이상, 4 종 이상, 5 종 이상, 6 종 이상, 7 종 (모두)) 에 대한 결합성이, PRAMEp301-309 (서열 번호 17) 에 대한 결합성의 1/2 이하 (바람직하게는, 1/5 이하, 1/10 이하, 1/20 이하, 1/100 이하, 1/500 이하, 1/2000 이하, 1/10000 이하) 인 것이 바람직하다.

본 발명의 PRAME 결합성 분자는 화학 수식된 것이어도 된다. 본 발명의 PRAME 결합성 분자를 구성하는 폴리펩티드는, C 말단이 카르복실기 (-COOH), 카르복실레이트 (-COO-), 아미드 (-CONH₂) 또는 에스테르 (-COOR) 중 어느 것이어도 된다. 여기서 에스테르에 있어서의 R 로는, 예를 들어, 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸 등의 C_1-6 알킬기 ; 예를 들어, 시클로펜틸, 시클로헥실 등의 C_3-8 시클로알킬기 ; 예를 들어, 페닐, α-나프틸 등의 C_6-12 아릴기 ; 예를 들어, 벤질, 페네틸 등의 페닐-C_1-2 알킬기 ; α-나프틸메틸 등의 α-나프틸-C_1-2 알킬기 등의 C_7-14 아르알킬기 ; 피발로일옥시메틸기 등이 사용된다. 본 발명의 PRAME 결합성 분자를 구성하는 폴리펩티드는, C 말단 이외의 카르복실기 (또는 카르복실레이트) 가 아미드화 또는 에스테르화되어 있어도 된다. 이 경우의 에스테르로는, 예를 들어 상기한 C 말단의 에스테르 등이 사용된다. 또한, 본 발명의 PRAME 결합성 분자를 구성하는 폴리펩티드에는, N 말단의 아미노산 잔기의 아미노기가 보호기 (예를 들어, 포르밀기, 아세틸기 등의 C_1-6 알카노일 등의 C_1-6 아실기 등) 로 보호되어 있는 것, 생체 내에서 절단되어 생성할 수 있는 N 말단의 글루타민 잔기가 피로글루탐산화된 것, 분자 내의 아미노산의 측사슬 상의 치환기 (예를 들어 -OH, -SH, 아미노기, 이미다졸기, 인돌기, 구아니디노기 등) 가 적당한 보호기 (예를 들어, 포르밀기, 아세틸기 등의 C_1-6 알카노일기 등의 C_1-6 아실기 등) 로 보호되어 있는 것도 포함된다.

본 발명의 PRAME 결합성 분자는, 공지된 단백질 태그, 시그널 서열 등의 단백질 또는 펩티드가 부가된 것이어도 된다. 단백질 태그로는, 예를 들어 비오틴, His 태그, FLAG 태그, Halo 태그, MBP 태그, HA 태그, Myc 태그, V5 태그, PA 태그, 형광 단백질 태그 등을 들 수 있다.

본 발명의 PRAME 결합성 분자는, 산 또는 염기와의 약학적으로 허용되는 염의 형태여도 된다. 염은, 약학적으로 허용되는 염인 한 특별히 한정되지 않고, 산성염, 염기성염 모두 채용할 수 있다. 예를 들어 산성염의 예로는, 염산염, 브롬화수소산염, 황산염, 질산염, 인산염 등의 무기산염 ; 아세트산염, 프로피온산염, 타르타르산염, 푸마르산염, 말레산염, 말산염, 시트르산염, 메탄술폰산염, 파라톨루엔술폰산염 등의 유기산염 ; 아스파르트산염, 글루탐산염 등의 아미노산염 등을 들 수 있다. 또, 염기성염의 예로서, 나트륨염, 칼륨염 등의 알칼리 금속염 ; 칼슘염, 마그네슘염 등의 알칼리 토금속염 등을 들 수 있다.

본 발명의 PRAME 결합성 분자는, 용매화물의 형태여도 된다. 용매는, 약학적으로 허용되는 것이면 특별히 한정되지 않고, 예를 들어 물, 에탄올, 글리세롤, 아세트산 등을 들 수 있다.

2-1. 항체

본 발명의 PRAME 결합성 분자는, 바람직한 일 양태에 있어서, 항체이다 (본 명세서에 있어서, 항체인 본 발명의 PRAME 결합성 분자에 대해, 「본 발명의 항체」 라고 나타내는 경우도 있다.).

본 발명의 항체는 모노클로날 항체이다.

본 발명의 항체의 분자량은, 특별히 제한되지 않지만, 하한은, 예를 들어 20,000, 바람직하게는 50,000, 바람직하게는 100,000, 보다 바람직하게는 120,000 이고, 상한은, 예를 들어 1,000,000, 바람직하게는 500,000, 보다 바람직하게는 200,000 이다.

본 발명의 항체의 구조는, 특별히 제한되지 않는다. 본 발명의 항체는, 정상 영역을 포함하는 것이어도 되고, 정상 영역을 포함하지 않는 것이어도 된다. 정상 영역을 포함하는 경우, 중사슬의 정상 영역 (CH1, CH2, 및 CH3) 그리고 경사슬의 정상 영역 (CL) 모두를 포함하고 있어도 되고, 이들 중 임의의 1 종 또는 2 종 이상의 조합을 포함하고 있어도 된다.

본 발명의 항체의 구조의 구체예로는, 이뮤노글로불린, Fab, F(ab')₂, 미니보디 (minibody), scFv-Fc, Fv, scFv, 디아보디 (diabody), 트리아보디 (triabody), 테트라보디 (tetrabody) 등을 들 수 있다. 이들 중에서도, 본 발명의 효과의 관점에서, 바람직하게는 이뮤노글로불린을 들 수 있다.

이뮤노글로불린은, 중사슬 가변 영역 및 중사슬 정상 영역을 갖는 1 개의 중사슬과 경사슬 가변 영역 및 경사슬 정상 영역을 갖는 1 개의 경사슬로 이루어지는 구조가 2 개 조합된 구조를 갖는다.

Fab 란, 중사슬 가변 영역 및 중사슬 정상 영역 중의 CH1 을 포함하는 중사슬의 단편과, 경사슬 가변 영역 및 경사슬 정상 영역 (CL) 을 포함하는 경사슬을 포함하고, 중사슬 가변 영역과 경사슬 가변 영역이 상기 서술하는 비공유 결합성의 분자간 상호 작용에 의해 회합하거나, 또는 디술파이드 결합에 의해 결합하여 이루어지는 구조를 갖는다. Fab 에 있어서, CH1 과 CL 은, 각각에 존재하는 시스테인 잔기의 티올기끼리에서 디술파이드 결합하고 있어도 된다.

F(ab')₂ 란, 2 쌍의 상기 Fab 를 갖고, CH1 끼리가 이들에 포함되는 시스테인 잔기의 티올기끼리에서 디술파이드 결합하여 이루어지는 구조이다.

미니보디란, 하기 scFv 를 구성하는 중사슬 가변 영역에 CH3 이 결합한 단편 2 개가, CH3 끼리에서 비공유 결합성의 분자간 상호 작용에 의해 회합한 구조이다.

scFv-Fc 란, 하기 scFv, CH2, 및 CH3 을 포함하는 항체 단편 2 개가, 상기 미니보디와 동일하게 CH3 끼리에서 비공유 결합성의 분자간 상호 작용에 의해 회합하여, 각각의 CH3 에 포함되는 시스테인 잔기의 티올기끼리에서 디술파이드 결합한 구조이다.

Fv 란, 항체의 최소 구조 단위라고도 일컬어지고, 중사슬 가변 영역과 경사슬 가변 영역이 비공유 결합성의 분자간 상호 작용에 의해 회합한 구조이다. Fv 에 있어서, 중사슬 가변 영역 및 경사슬 가변 영역 내에 존재하는 시스테인 잔기의 티올기끼리가 디술파이드 결합하고 있어도 된다.

scFv 란, 중사슬 가변 영역의 C 말단과 경사슬 가변 영역의 N 말단이 링커로 연결된 구조, 또는 중사슬 가변 영역의 N 말단과 경사슬 가변 영역의 C 말단이 링커로 연결된 구조이고, 단사슬 항체라고도 불린다.

디아보디, 트리아보디, 및 테트라보디란, 각각 상기 scFv 가 2 량체, 3 량체 및 4 량체를 형성하고, Fv 등과 동일하게 가변 영역끼리의 비공유 결합성의 분자간 상호 작용 등에 의해, 구조적으로 안정적인 상태로 회합한 구조이다.

본 발명의 항체가 이뮤노글로불린인 경우, 그 클래스는 특별히 제한되지 않는다. 그 클래스로는, 예를 들어 IgA, IgD, IgE, IgG, IgM 등, 나아가서는 이들 서브 클래스를 들 수 있다. 바람직한 클래스로는, 예를 들어 IgG, IgM 등을 들 수 있고, 바람직하게는 IgG 를 들 수 있고, 보다 바람직하게는 IgG1 을 들 수 있다.

본 발명의 항체의 유래는 특별히 제한되지 않는다. 본 발명의 항체는, 예를 들어 인간 유래 항체, 마우스 유래 항체, 래트 유래 항체, 토끼 유래 항체, 원숭이 유래 항체, 침팬지 유래 항체 등일 수 있다. 또, 본 발명의 항체는, 키메라 항체 (예를 들어 인간 이외의 생물 (마우스 등) 유래 항체의 정상 영역의 아미노산 서열을 인간 유래 항체의 정상 영역의 아미노산 서열로 치환되어 이루어지는 항체), 인간화 항체, 완전 인간화 항체 등이어도 된다.

본 발명의 항체는, 예를 들어, 본 발명의 항체를 코드하는 폴리뉴클레오티드에 의해 형질 전환시킨 숙주를 배양하고, 본 발명의 항체를 포함하는 획분을 회수하는 공정을 포함하는 방법에 의해 제조할 수 있다.

본 발명의 항체를 코드하는 폴리뉴클레오티드는, 본 발명의 항체를 발현 가능한 상태로 포함하는 한 특별히 제한되지 않고, 본 발명의 항체의 코드 서열 이외에, 다른 서열을 포함하고 있어도 된다. 다른 서열로는, 본 발명의 항체 코드 서열에 인접하여 배치되는 분비 시그널 펩티드 코드 서열, 프로모터 서열, 인핸서 서열, 리프레서 서열, 인슐레이터 서열, 복제 기점, 약제 내성 유전자 코드 서열 등을 들 수 있다. 또, 본 발명의 항체를 코드하는 폴리뉴클레오티드는, 직사슬형의 폴리뉴클레오티드여도 되고, 고리형의 폴리뉴클레오티드 (벡터 등) 여도 된다.

폴리뉴클레오티드의 구체예로는, (I) 본 발명의 항체의 중사슬, 중사슬 가변 영역, 및 중사슬 CDRs1-3 으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종을 코드하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, (II) 본 발명의 항체의 경사슬, 경사슬 가변 영역, 및 경사슬 CDRs1-3 으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종을 코드하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, (III) 본 발명의 항체의 중사슬, 중사슬 가변 영역, 및 중사슬 CDRs1-3 으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종을 코드하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 그리고 본 발명의 항체의 경사슬, 경사슬 가변 영역, 및 경사슬 CDRs1-3 으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종을 코드하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 등을 들 수 있다.

숙주는, 특별히 제한되지 않고, 예를 들어 곤충 세포, 진핵 세포, 포유류 세포 등을 들 수 있다. 그 중에서도, 항체를 보다 효율적으로 발현시키는 관점에서, 포유류 세포인 HEK 세포, CHO 세포, NS0 세포, SP2/O 세포, P3U1 세포 등이 바람직하다. 형질 전환, 배양, 및 회수의 방법은, 특별히 제한되지 않고, 항체 제조에 있어서의 공지된 방법을 채용할 수 있다. 회수 후에는, 필요에 따라 본 발명의 항체를 정제해도 된다. 정제는, 항체 제조에 있어서의 공지된 방법, 예를 들어 크로마토그래피, 투석 등에 의해 실시할 수 있다.

2-2. 키메라 항원 수용체

본 발명의 PRAME 결합성 분자는, 바람직한 일 양태에 있어서, 키메라 항원 수용체이다 (본 명세서에 있어서, 키메라 항원 수용체인 본 발명의 PRAME 결합성 분자에 대해, 「본 발명의 키메라 항원 수용체」 라고 나타내는 경우도 있다.).

키메라 항원 수용체 (CAR) 란, 대표적으로는, 모노클로날 항체 가변 영역의 경사슬 (VL) 과 중사슬 (VH) 을 직렬로 결합시킨 단사슬 항체 (scFv) 를, 항원에 대한 결합성을 담당하는 영역으로서 N 말단측에 갖고, 또한 T 세포 수용체 (TCR) ζ 사슬을 C 말단측에 갖는 키메라 단백이다. CAR 을 발현시킨 T 세포는, CAR-T 세포라고 불린다.

본 발명의 키메라 항원 수용체에 있어서, 항원 (PRAME) 에 대한 결합성을 담당하는 영역 (PRAME 결합성 영역) 은, 서열 번호 1 로 나타내는 아미노산 서열을 포함하는 중사슬 CDR1, 서열 번호 2 로 나타내는 아미노산 서열을 포함하는 중사슬 CDR2, 및 서열 번호 3 으로 나타내는 아미노산 서열을 포함하는 중사슬 CDR3 을 포함하는 중사슬 가변 영역, 그리고/혹은 서열 번호 9 로 나타내는 아미노산 서열을 포함하는 경사슬 CDR1, 서열 번호 10 으로 나타내는 아미노산 서열을 포함하는 경사슬 CDR2, 및 서열 번호 11 로 나타내는 아미노산 서열을 포함하는 경사슬 CDR3 을 포함하는 경사슬 가변 영역을 포함하는 한, 특별히 제한되지 않는다.

PRAME 결합성 영역은, scFv 구조를 취하는 것이 바람직하다. 중사슬 가변 영역과 경사슬 가변 영역을 연결하는 링커는, 키메라 항원 수용체로서의 기능이 유지되는 한 특별히 제한되지 않고, 임의이다. 링커로는, 바람직하게는 글리신 단독 혹은 글리신과 세린으로 이루어지는 링커를 들 수 있다. 링커의 아미노산 잔기수는, 예를 들어 5 ∼ 30, 바람직하게는 10 ∼ 20, 보다 바람직하게는 15 이다.

본 발명의 키메라 항원 수용체는, 통상, 중사슬 가변 영역 및 경사슬 가변 영역을 포함하는 scFv 도메인, 막관통 도메인, 그리고 TCR 의 세포내 도메인을 포함하는 코어 영역을 포함한다. 그 코어 영역에 있어서는, 통상, N 말단측으로부터, scFv 도메인, 막관통 도메인, TCR 의 세포내 도메인이 순서대로, 직접 또는 다른 도메인을 개재하여 배치된다.

막관통 도메인의 종류는, 키메라 항원 수용체의 기능을 저해하지 않는 한 제한되지 않는다. 예를 들어, T 세포 등으로 발현하는 CD28, CD3zeta, CD4, CD8alpha 등을 사용할 수 있다. 이들 막관통 도메인은, 키메라 항원 수용체의 기능을 저해하지 않는 한, 적절히 변이가 도입되어 있어도 된다.

TCR 의 세포내 도메인은, 예를 들어, TCR ζ 사슬이라고도 불리는 CD3 등에서 유래하는 세포내 도메인일 수 있다. CD3 은, 키메라 항원 수용체의 기능을 저해하지 않는 한, 적절히 변이가 도입되어 있어도 된다. CD3 에 변이를 도입하는 경우에는, ITAM (immunoreceptor tyrosine-based activation motif) 이 포함되도록 실시하는 것이 바람직하다.

본 발명의 키메라 항원 수용체는, scFv 도메인과 막관통 도메인 사이에 스페이서 서열이 배치되어 있는 것이 바람직하다. 스페이서 서열의 길이 및 그것을 구성하는 아미노산 잔기의 종류는, 키메라 항원 수용체의 기능을 저해하지 않는 한 제한되지 않는다. 예를 들어, 스페이서 서열은, 10 개 ∼ 200 개 정도의 아미노산 잔기가 되도록 설계할 수 있다. 스페이서 서열로는, 경사슬의 정상 영역의 서열을 채용하는 것이 바람직하다.

본 발명의 키메라 항원 수용체에 있어서는, 코어 영역이 추가로 공자극 인자의 세포내 도메인을 포함하는 것이 바람직하다. 공자극 인자의 세포내 도메인은, T 세포 등이 갖는 공자극 인자에서 유래하는 세포내 도메인이면 되고 특별히 한정되지는 않는다. 예를 들어, OX40, 4-1BB, GITR, CD27, CD278 및 CD28 등으로 이루어지는 군에서 선택되는 1 종 이상을 적절히 선택하여 사용할 수 있다. 이들 공자극 인자의 세포내 도메인은, 키메라 항원 수용체의 기능을 저해하지 않는 한, 적절히 변이가 도입되어 있어도 된다. 공자극 인자의 세포내 도메인의 위치는, 막관통 도메인의 C 말단측인 한 특별히 제한되지 않고, TCR 의 세포내 도메인의 세포막측 및 세포막과는 반대측 중 어느 것이어도 된다. 본 발명의 바람직한 일 양태에 있어서는, 공자극 인자의 세포내 도메인은 TCR 의 세포내 도메인의 세포막과는 반대측에 배치되는 것이 바람직하다.

본 발명의 키메라 항원 수용체에 있어서는, 코어 영역의 C 말단측에, 자기 절단 펩티드 도메인을 개재하여 GITRL 도메인, 4-1BBL 도메인, ICOSL 도메인 등의 각종 리간드 도메인을 포함하는 것이 바람직하다. 이로써, 키메라 항원 수용체의 발현 효율이나, 이것을 포함하는 CAR-T 세포의 세포 상해 활성을 보다 높이는 것이 가능해진다.

본 명세서에 있어서 「자기 절단 펩티드」 란, 펩티드 서열 자체 중의 2 개의 아미노산 잔기 사이에 발생하는 절단 활성을 따르는 펩티드 서열을 의미한다. 자기 절단 펩티드로는, 예를 들어 2A 펩티드 또는 2A 형 펩티드가 예시된다. 예를 들어 2A 펩티드 또는 2A 형 펩티드에서는, 절단은 이들 펩티드 상의 글리신 잔기와 프롤린 잔기 사이에서 발생한다. 이것은 번역 동안에, 글리신 잔기와 프롤린 잔기 사이의 정상적인 펩티드 결합의 형성이 실시되지 않는 「리보솜 스킵 기구」 에 의해 발생하고, 하류의 번역에는 영향을 미치는 일은 없다. 리보솜 스킵 기구는 당 분야에 있어서 알려져 있고, 그리고 1 분자의 메신저 RNA (mRNA) 에 의해 코드되는 복수의 단백질의 발현을 위해서 사용된다. 본 발명에서 사용하는 자기 절단 펩티드는, 바이러스의 2A 펩티드 또는 그것과 동등한 기능을 갖는 2A 형 펩티드로부터 얻는 것이 가능하다. 예를 들어, 구제역 바이러스 (FMDV) 유래의 2A 펩티드 (F2A), 말 비염 A 바이러스 (ERAV) 유래의 2A 펩티드 (E2A), Porcine teschovirus (PTV-1) 유래의 2A 펩티드 (P2A) 및 Thosea asigna virus (TaV) 유래의 2A 펩티드 (T2A) 로 이루어지는 군에서 선택할 수 있다. 자기 절단 펩티드 도메인은, 그 활성이 현저하게 저해되지 않는 한, 적절히 변이가 도입되어 있어도 된다.

키메라 항원 수용체 및 그것을 발현하는 CAR-T 세포를 제조하는 기술은 공지이다. 이들은, 공지된 방법에 따라서 또는 준하여, 제조할 수 있다.

3. 폴리뉴클레오티드

본 발명은, 그 일 양태에 있어서, 본 발명의 PRAME 결합성 분자를 코드하는, 폴리뉴클레오티드 (본 명세서에 있어서, 「본 발명의 폴리뉴클레오티드」 라고 나타내는 경우도 있다.) 에 관한 것이다. 이하, 이것에 대해 설명한다.

본 발명의 폴리뉴클레오티드는, 본 발명의 PRAME 결합성 분자의 코드 서열 이외에, 다른 서열을 포함하고 있어도 된다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드는, 본 발명의 PRAME 결합성 분자를 발현 가능한 상태로 포함하는 것이 바람직하다. 다른 서열로는, 프로모터 서열, 인핸서 서열, 리프레서 서열, 인슐레이터 서열, 복제 기점, 리포터 단백질 (예를 들어, 형광 단백질 등) 코드 서열, 약제 내성 유전자 코드 서열 등을 들 수 있다. 또, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는, 직사슬형의 폴리뉴클레오티드여도 되고, 고리형의 폴리뉴클레오티드 (벡터 등) 여도 된다. 벡터는, 플라스미드 벡터, 또는 바이러스 벡터 (예를 들어, 아데노바이러스, 또는 레트로바이러스) 일 수 있다. 또, 벡터는, 예를 들어, 클로닝용 벡터 또는 발현용 벡터일 수 있다. 발현용 벡터로는, 대장균, 또는 방선균 등의 원핵 세포용의 벡터, 혹은, 효모 세포, 곤충 세포, 또는 포유류 세포 등의 진핵 세포용의 벡터를 들 수 있다.

본 발명의 폴리뉴클레오티드는, DNA, RNA 뿐만 아니라, 이들에, 다음에 예시하는 바와 같이, 공지된 화학 수식이 실시된 것도 포함한다. 뉴클레아제 등의 가수분해 효소에 의한 분해를 방지하기 위해, 각 뉴클레오티드의 인산 잔기 (포스페이트) 를, 예를 들어, 포스포로티오에이트 (PS), 메틸포스포네이트, 포스포로디티오네이트 등의 화학 수식 인산 잔기로 치환할 수 있다. 또, 각 리보뉴클레오티드의 당 (리보스) 의 2 위치의 수산기를, -OR (R 은, 예를 들어 CH3(2'-O-Me), CH₂CH₂OCH₃(2'-O-MOE), CH₂CH₂NHC(NH)NH₂, CH₂CONHCH₃, CH₂CH₂CN 등을 나타낸다) 로 치환해도 된다. 또한, 염기 부분 (피리미딘, 퓨린) 에 화학 수식을 실시해도 되고, 예를 들어, 피리미딘 염기의 5 위치로의 메틸기나 카티온성 관능기의 도입, 혹은 2 위치의 카르보닐기의 티오카르보닐로의 치환 등을 들 수 있다. 나아가서는, 인산 부분이나 하이드록실 부분이, 예를 들어, 비오틴, 아미노기, 저급 알킬아민기, 아세틸기 등으로 수식된 것 등을 들 수 있지만, 이것에 한정되지 않는다. 또, 「폴리뉴클레오티드」 의 단어는, 천연의 핵산 뿐만 아니라, BNA (Bridged Nucleic Acid), LNA (Locked Nucleic Acid), PNA (Peptide Nucleic Acid) 등 모두 포함한다.

4. 세포

본 발명은, 그 일 양태에 있어서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 함유하는, 세포 (본 명세서에 있어서, 「본 발명의 세포」 라고 나타내는 경우도 있다.) 에 관한 것이다. 이하, 이것에 대해 설명한다.

본 발명의 세포의 유래 세포는, 특별히 제한되지 않는다. 본 발명의 세포를, 본 발명의 PRAME 결합성 분자의 제조에 있어서 사용할 목적이면, 유래 세포로는, 단백질 발현에 사용할 수 있는 세포 (예를 들어, 곤충 세포, 진핵 세포, 포유류 세포 등) 등을 들 수 있다.

본 발명의 세포가, 본 발명의 키메라 항원 수용체를 코드하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 경우, 세포는 바람직하게는 림프구 세포 (예를 들어, T 세포 (예를 들어 CD4 양성 CD8 음성 T 세포, CD4 음성 CD8 양성 T 세포, iPS 세포로부터 조제된 T 세포, αβ-T 세포, γδ-T 세포 등), NK 세포, NKT 세포 등) 이다. 그 림프구 세포는, 바람직하게는 본 발명의 키메라 항원 수용체를 발현하는 세포이고, 보다 구체적인 양태에 있어서는, 그 림프구 세포는, 본 발명의 키메라 항원 수용체가 세포막 상에 발현되어 있고, 바람직하게는 본 발명의 키메라 항원 수용체가 PRAME 결합성 영역을 세포막 외에 노출된 상태로 발현하고 있다.

키메라 항원 수용체를 발현하는 림프구 세포 등은 PRAME 결합성 영역에서 PRAME 를 인식한 후, 그 인식 시그널을 T 세포 등의 내부에 전달하여, 세포 상해 활성을 야기시키는 시그널을 작동시키고, 이것에 연동하여 그 세포가 PRAME 를 발현하는 다른 세포 또는 조직에 대해 공격 또는 세포 상해 활성을 발휘할 수 있다.

이와 같은 기능을 발휘하는 세포가 CTL 인 경우, 키메라 항원 수용체 T 세포 (CAR-T 세포) 라고 불린다. NK 세포 등의 세포 상해 활성을 발휘할 가능성을 갖는 세포도 키메라 항원 수용체 T 세포와 동일하게, PRAME 결합성 영역이 PRAME 와 결합함으로써, 세포 상해 활성을 발휘할 수 있다. 따라서, 키메라 항원 수용체를 코드하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포 (특히, 세포 상해 활성을 갖는 숙주 세포) 는, 의약 조성물의 유효 성분으로서 유용하다.

이와 같은 림프구 세포 등은, 암조직 (종양 조직) 을 특이적으로 인식하기 위해, 암 등의 치료 또는 예방에 유용하다. 암의 종류는 특별히 제한되지 않고, 혈액암 및 고형암을 포함한다. 혈액암으로는, 예를 들어 각종 B 세포성 악성 림프종 (B 세포성 급성 림프성 백혈병, 여포성 림프종, 미만성 림프종, 맨틀 세포 림프종, MALT 림프종, 혈관내 B 세포성 림프종, CD20 양성 호지킨 림프종 등), 골수 증식성 질환, 골수 이형성/골수 증식성 종양 (CMML, JMML, CML, MDS/MPN-UC), 골수 이형성 증후군, 급성 골수성 백혈병, 다발성 골수종 등을 들 수 있다. 고형암으로는, 예를 들어, 폐암, 대장암, 난소암, 유방암, 뇌종양, 위암, 간암, 설암, 갑상선암, 신장암, 전립선암, 자궁암, 골육종, 연골 육종, 횡문근 육종, 흑색종, 신경아종, 방광암 등을 들 수 있다.

본 발명의 세포는, 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 세포에 도입함으로써 얻을 수 있다. 필요에 따라, 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 세포를 농축해도 되고, 특정한 마커 (CD8 등의 CD 항원) 를 지표로 하여 농축해도 된다.

5. 의약 조성물

본 발명은, 그 일 양태에 있어서, 본 발명의 키메라 항원 수용체를 코드하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 림프구 세포, 또는 본 발명의 항체를 함유하는, 의약 조성물 (본 명세서에 있어서, 「본 발명의 의약 조성물」 이라고 나타내는 경우도 있다.) 에 관한 것이다. 이하, 이것에 대해 설명한다.

의약 조성물 중의 상기 세포나 항체의 함유량은, 대상으로 하는 질환 (예를 들어, 고형암) 의 종류, 목적으로 하는 치료 효과, 투여 방법, 치료 기간, 환자의 연령, 및 환자의 체중 등을 고려하여 적절히 설정할 수 있다. 예를 들어, 의약 조성물 중의 항체의 함량은, 의약 조성물 전체를 100 중량부로 하여 0.001 중량부 ∼ 10 중량부 정도로 할 수 있다. 의약 조성물 중의 세포의 함유량은, 예를 들어, 1 세포/mL ∼ 10^4 세포/mL 정도로 할 수 있다.

의약 조성물의 투여 형태는, 원하는 효과가 얻어지는 한 특별히 제한되지 않고, 경구 투여, 및 비경구 투여 (예를 들어 정맥 주사, 근육 주사, 피하 투여, 직장 투여, 경피 투여, 국소 투여) 중 어느 투여 경로로 인간을 포함하는 포유류에 투여할 수 있다. 유효 성분은 세포이기 때문에, 바람직한 투여 형태는 비경구 투여이고, 보다 바람직하게는 정맥 주사이다. 경구 투여 및 비경구 투여를 위한 제형 및 그 제조 방법은 당업자에게 주지이고, 본 발명에 의한 항체 또는 세포를, 약학적으로 허용되는 담체 등과 혼합 등을 함으로써, 통상적인 방법에 따라 제조할 수 있다.

비경구 투여를 위한 제형은, 주사용 제제 (예를 들어, 점적 주사제, 정맥 주사제, 근육 주사제, 피하 주사제, 피내 주사제), 외용제 (예를 들어, 연고제, 파프제, 로션제), 좌제 흡입제, 안제, 안연고제, 점비제, 점이제, 리포솜제 등을 들 수 있다. 예를 들어, 주사용 제제는, 항체 또는 세포를 주사용 증류수에 용해 또는 현탁하여 조제하고, 필요에 따라 용해 보조제, 완충제, pH 조정제, 등장화제, 무통화제, 보존제, 및 안정화제 등을 첨가할 수 있다. 의약 조성물은, 용시 (用時) 조제용의 동결 건조 제제로 할 수도 있다.

의약 조성물은, 질환의 진단, 치료, 또는 예방에 유효한 다른 약제를 추가로 함유하고 있어도 된다. 또, 의약 조성물은, 필요에 따라 살균제, 소염제, 세포 부활제, 비타민류, 및 아미노산 등의 성분을 배합할 수도 있다.

의약 조성물의 제제화에 사용하는 담체에는, 당해 기술 분야에 있어서 통상 사용되는 부형제, 결합제, 붕괴제, 활택제, 착색제, 교미 교취제나, 필요에 따라 안정화제, 유화제, 흡수 촉진제, 계면 활성제, pH 조정제, 방부제, 항산화제, 증량제, 습윤화제, 표면 활성화제, 분산제, 완충제, 보존제, 용해 보조제, 무통화제 등을 사용할 수 있다.

의약 조성물을 사용하여 진단, 치료, 또는 예방하는 질환의 종류는, 그 진단, 치료, 또는 예방을 달성할 수 있는 한 특별히 한정되지 않는다. 구체적인 대상 질환으로서 예를 들어, 암을 들 수 있다. 암의 종류는 특별히 제한되지 않고, 혈액암 및 고형암을 포함한다. 혈액암으로는, 예를 들어 각종 B 세포성 악성 림프종 (B 세포성 급성 림프성 백혈병, 여포성 림프종, 미만성 림프종, 맨틀 세포 림프종, MALT 림프종, 혈관내 B 세포성 림프종, CD20 양성 호지킨 림프종 등), 골수 증식성 질환, 골수 이형성/골수 증식성 종양 (CMML, JMML, CML, MDS/MPN-UC), 골수 이형성 증후군, 급성 골수성 백혈병, 다발성 골수종 등을 들 수 있다. 고형암으로는, 예를 들어, 폐암, 대장암, 난소암, 유방암, 뇌종양, 위암, 간암, 설암, 갑상선암, 신장암, 전립선암, 자궁암, 골육종, 연골 육종, 횡문근 육종, 흑색종, 신경아종, 방광암 등을 들 수 있다.

의약 조성물의 투여 대상 (피험체) 은, 예를 들어, 상기 질환에 이환된 동물 또는 이환될 가능성이 있는 동물이다. 「이환될 가능성이 있는」 이란, 공지된 진단 방법으로 결정할 수 있다. 동물이란, 예를 들어, 포유류 동물이고, 바람직하게는 인간이다.

의약 조성물의 투여량은, 예를 들어, 투여 경로, 질환의 종류, 증상의 정도, 환자의 연령, 성별, 체중, 질환의 중독도 (重篤度), 약물 동태 및 독물학적 특징 등의 약리학적 지견, 약물 송달계의 이용의 유무, 그리고 다른 약물의 조합의 일부로서 투여되는지 등 여러 가지 인자를 바탕으로, 임상 의사에 의해 결정할 수 있다. 의약 조성물의 투여량은, 예를 들어, 유효 성분이 항체인 경우, 1 일당, 1 micro gram/㎏ (체중) ∼ 10 g/㎏ (체중) 정도로 할 수 있다. 또, 유효 성분이 세포인 경우, 10^4 세포/㎏ (체중) ∼ 10^9 세포/㎏ (체중) 정도로 할 수 있다. 의약 조성물의 투여 스케줄도, 그 투여량과 동일한 요인을 감안하여 결정할 수 있다. 예를 들어, 상기의 1 일당 투여량으로, 1 일 ∼ 1 월에 1 회 투여할 수 있다.

실시예

이하에, 실시예에 기초하여 본 발명을 상세하게 설명하지만, 본 발명은 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

시험예 1. HLA-A24-PRAME 를 인식하는 항체 #98 의 단리와 평가

자작 (自作) 의 인간 항체 라이브러리를 사용하여, 인공적으로 제조한 HLA-A24 PRAMEp301-309 (서열 번호 17) pMHC 복합체(이후 A24-PRAME 로 약기한다) 를 표적으로 하여 항체 라이브러리 스크린을 실시하여, A24-PRAME 를 인식하는 복수의 항체를 단리하였다. 그 방법은 비특허문헌 7 에 나타내는 방법에 따랐다. 즉, 항체의 단리는, 파지 디스플레이법을 사용하였다. 이 방법에서는, 파지 코트 단백 cp3 의 일부로서 scFvCL 가 제시되고, 항원에 대해 결합성이 높은 클론을 ELISA 에 의해 좁힐 수 있다. 도 1a 에 나타내는 magnet beads 스크린을 2 회 실시한 후, 도 1b 에 나타내는 세포 스크린을 실시하고 (비특허문헌 8), 약 400 의 클론을 픽업한 후 배양 상청을 조제하고, 얻어진 scFvCL-CP3 에 대한 ELISA 를 실시하였다.

그리고, 포지티브 타깃인 A24-PRAME 에 반응하고, 네거티브 타깃인 A24-CMV 에 반응하지 않는 것 40 개를 선택하고, 그것들에 대해 2 종류의 농도의 A24-PRAME 와 1 종류의 농도의 A24-CMV 에 대한 인식을 ELISA 로 검토하였다 (도 2). 구체적으로는, 다음과 같다. 40 개의 클론에 대해, 대장균 배양 상청을 조제하고, 20 ul 의 sup 를 사용하여, A24-PRAME 100 ng/well (적색), 50 ng/well (흑색), A24-CMV 100 ng/well (백색) 에 대한 인식을 ELISA 검토하였다. Maxisorp plate (NUNC) 에 neutravidin (Thermo) 을 고상화한 후, 소정의 pMHC 를 반응시켜 고상화하고, 이것에 각 클론의 배양 상청을 반응시킨 후 세정하고, 이것에 마우스 항 cp3 항체 (MBL 특제) 를 반응시키고, HRP 표지 항마우스 항체 (330, MBL) 를 반응시켜, TMB 를 사용한 발색에 의해 판정하였다. 이들에 대해, 서열 해석을 실시하여, 13 종류의 항체가 얻어지고 있는 것을 알 수 있었다.

이들 항체에 대해, 결합 특이성의 검토를 실시하기 위해, 복수의 펩티드-HLA-A24 복합체 (pMHC) 를 사용하여 ELISA 를 실시하였다. A24-PRAME p301, PRAME p412, EBNA3A p246, MAGE-A3 p195, MAGE-A4 p143, SAGE p715, CMV p30, HTLV-1 p301, NY-ESO-1 p158, Foxp3 p323, Foxp3 p363, IDO p144, IDO p269, hTERT p461, WT1 p235 의 각 HLA-A24 pMHC 를 고상화하고, 선택한 항체로 ELISA 를 실시하였다. 도 3 에 ELISA 의 결과를 나타낸다. 이 결과, #98 에 대해서는, 크로스 인식이 확인되지 않고, 인식의 특이성이 높은 것을 알 수 있었다.

다음으로, 세포 발현의 HLA-A24 와 PRAMEp301-309 사이에서 형성되는 pMHC 복합체를 인식할지 여부를 조사할 목적으로, PRAMEp301-309 펩티드 펄스 A24-LCL 세포에 대한 인식을 검토하였다. 결과를 도 4 에 나타낸다. #98 에 대해 충분한 인식이 일어나고 있는 것을 알 수 있었다.

항체 #98 의 아미노산 서열, 및 그 항체를 코드하는 염기 서열을 해석한 결과를 이하에 나타낸다. 또한, CDR 의 서열은 IMGIT 로 추정하였다.

<중사슬>

중사슬 CDR1 아미노산 서열 : GGTFSSYA (서열 번호 1)

중사슬 CDR2 아미노산 서열 : IIPIFGTA (서열 번호 2)

중사슬 CDR3 아미노산 서열 : ARHHSNYYYYGMDV (서열 번호 3)

중사슬 가변부 아미노산 서열 :

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGTANYAQKFQGRVTITADESTGTAYMELSSLRSEDTAVYYCARHHSNYYYYGMDVWGQGTTVTVSR (서열 번호 4)

중사슬 CDR1 염기 서열 : GGAGGCACCTTCAGCAGCTATGCT (서열 번호 5)

중사슬 CDR2 염기 서열 : ATCATCCCTATCTTTGGTACAGCA (서열 번호 6)

중사슬 CDR3 염기 서열 : GCGAGACACCACAGTAACTACTACTACTACGGTATGGACGTC (서열 번호 7)

중사슬 가변부 염기 서열 :

CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGTCCTCGGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCTGGAGGCACCTTCAGCAGCTATGCTATCAGCTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGAGGGATCATCCCTATCTTTGGTACAGCAAACTACGCACAGAAGTTCCAGGGCAGAGTCACGATTACCGCGGACGAATCCACGGGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGACACCACAGTAACTACTACTACTACGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCGAGA (서열 번호 8).

<경사슬>

경사슬 CDR1 아미노산 서열 : NIGSKN (서열 번호 9)

경사슬 CDR2 아미노산 서열 : RDS (서열 번호 10)

경사슬 CDR3 아미노산 서열 : QVWDSSHV (서열 번호 11)

경사슬 가변부 아미노산 서열 :

SYELTQPLSVSVALGQTARITCGGNNIGSKNVHWYQQKPGQAPVLVIYRDSNRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRAQAGDEADYYCQVWDSSHVFGTGTKVTVL (서열 번호 12)

경사슬 CDR1 염기 서열 : AACATTGGAAGTAAAAAT (서열 번호 13)

경사슬 CDR2 염기 서열 : AGGGATAGC (서열 번호 14)

경사슬 CDR3 염기 서열 : CAGGTGTGGGACAGCAGCCATGTC (서열 번호 15)

경사슬 가변부 염기 서열 :

TCCTATGAGCTGACTCAGCCACTCTCAGTGTCAGTGGCCCTGGGACAGACGGCCAGGATTACCTGTGGCGGAAACAACATTGGAAGTAAAAATGTGCACTGGTACCAGCAGAAGCCAGGCCAGGCCCCTGTGCTGGTCATCTATAGGGATAGCAACCGGCCCTCTGGGATCCCTGAGCGATTCTCTGGCTCCAACTCGGGGAACACGGCCACCCTGACCATCAGCAGAGCCCAAGCCGGGGATGAGGCTGACTATTACTGTCAGGTGTGGGACAGCAGCCATGTCTTCGGAACTGGGACCAAGGTCACCGTCCTA (서열 번호 16).

시험예 2. #98 scFvCL-cp3 에 의한 A24-PRAME 의 특이적 인식

LCL 세포는, MHC-ClassI 의 발현이 높기 때문에, 펩티드를 펄스하면, 펩티드가 LCL 세포 상의 HLA-A24 상에 트랩되어, pMHC 로서 제시된다. 따라서, PRAME, CMV 의 각 펩티드 및 DMSO 를 펄스한 LCL 세포에, #98 을 반응시켜, FACS 로 충분한 인식이 일어나고 있는 것을 확인하였다.

다음으로, 항체의 인식에 관여하는 아미노산을 조사하기 위해, PRAME p301-309 (LYVDSLFFL, 표 1, 서열 번호 17) 의 아미노산을 1 개씩 다른 아미노산 (주로 알라닌) 으로 치환한 펩티드를 제조하였다 (표 1 서열 번호 2 - 10). 2Y, 9L 에 대해서는, 앵커 아미노산인 것이 예상되었으므로, 펩티드의 결합을 안정화시키는 2F, 2W, 9F, 9I (표 1 서열 번호 11 - 14) 에 대해서도 검토를 실시하여, 펩티드 변화에 의한 항체 인식 변화를 검토하였다. 구체적으로는, 다음과 같다. wild type, DMSO, 1A, 2A, 3A, 4A, 5A, 6A, 7A, 8A, 9A, 2F, 2W, 9F, 9I 의 각 펩티드를 준비하고, 이것을 A24-LCL 에 10 micro molar 의 농도로 펩티드 펄스하고, 거기에 #98 scFvCL-cp3 을 반응시키고, 다음으로 마우스 항 cp3 항체를 반응시킨 후, Alexa488 표지 항마우스 항체를 반응시켜 FACS CANT 로 측정을 실시하였다.

그 결과, 도 5 에 나타내는 바와 같이, #98 에서는 2A, 3A, 4A, 6A, 7A, 8A, 9A 에서는 MFI 의 수치가 낮아져, 이들 7 개의 아미노산이 항체의 인식에 필수인 것을 알 수 있었다. 9F, 9I 에서는 MFI 가 낮아지지 않았기 때문에, 이들 아미노산이면 인식할 수 있는 것을 알 수 있었다 (도 5). 따라서, 리스크 검색의 모티프로서, xYVDxLFFL, xYVDxLFFF, xYVDxLFFI 가 생각되었다.

시험예 3. #98 scFvCL-pp의 결합 정수의 측정

다음으로, #98 scFvCL-cp3 을 pp form 으로 변환하여 제조한 #98 scFvCL-cp3 pp 에 대해, BiacoreX100 에 의한 KD 값의 측정을 실시하였다. Biacore 에서의 KD 값은, 시간 경과에 대한 검출 감도 (레저넌스, 칩 상의 질량 변화를 반영한다) 의 동적 변화를 측정함으로써 구하였다. 동적 변화의 커브로부터 해리 속도 정수 (Kd) 와 결합 속도 정수 (Ka) 를 구하고, 그 2 개의 정수의 비로부터 그 결합 정수를 구하였다. 구체적으로는, 다음과 같다. 각 scFv-cp3 발현 플라스미드를 제한 효소 SalI 로 절단한 후 self ligation 을 실시하고, 이것을 사용하여 대장균 DH5a 를 형질 전환하여 scFv-pp 를 산생하는 클론을 얻었다. 이것을 IPTG 를 포함하는 배지에서 배양하고, 상청을 회수하여 유안 (硫安) 으로 농축하고, IgG Sepharose 6 Fast Flow 로 정제하고, PBS 로 투석한 후, SDS-PAGE 로 농도를 estimation 하였다. BIAcoreX100 을 사용한 SPR 측정은 Biotin Capture Kit (GE) 를 사용하여, 메이커의 지시에 따라서 실시하였다. 즉, 먼저 센서 칩에 A24 PRAMEp301-309 를 ligand 로서 고상화하였다. 다음으로 500 nM, 250 nM, 125 nM, 62.5 nM, 31.25 nM 의 5 단계의 농도의 scFv-pp 를 순서대로 반응시켜, association 과 dissociation 을 측정하였다. 이에 대해 Global fit 을 실시하여 Kon, Koff, KD 를 산정하였다. 측정의 결과, #98 scFvCL-pp 의 결합 정수는 5.3 nM 이었다 (도 6).

시험예 4. 레트로바이러스 벡터의 제조, PBMC 로의 도입, 발현 검토

항상적인 CAR 의 발현을 위해서 레트로바이러스에 의한 유전자 도입을 실시하였다. CAR 도입의 레트로바이러스 벡터를 구축하고 (도 7), packaging 세포 Plat-A 에 의해 레트로바이러스를 제조하고, PBMC 에 감염시킴으로써, CAR-T 세포를 제조하였다. CAR 의 발현은, 테트라머 염색에 의해 확인하였다. 구체적으로는, 다음과 같다. 인간 PBMC 를 OKT3 과 레트로넥틴으로 자극하여 배양하고, day 3, day 4 에 제조한 레트로바이러스를 감염시켜 배양하여, CAR T 세포를 제조하였다 (도 8). 이들 세포에 대해 PRAME tetramer 및 항 CD4 항체, 항 CD8 항체에 의한 염색을 실시하고, FACS CANT 로 측정을 실시하였다. 그 결과, CAR-T 세포의 CAR 양성률은 CD8 이 52.0 ％, CD4 가 51.7 ％ 였다 (도 8).

시험예 5. #98 zG CAR T 세포에 대한 alanine scan 검토, 리스크 평가

시험예 2 에서 서술한 alanine scan 펩티드를 펄스한 T2A24 세포를 사용하여, 이것과 #98 zG CAR T 세포를 공배양하고, 배양 상청 중에 분비되는 IFNg 량을 ELISA 로 측정하였다 (도 9). 구체적으로는, 다음과 같다. #98 CAR 에 대해, 도 5 에서 나타낸, 아미노산 치환 펩티드 펄스의 A24-LCL 1 x 10^5 와, 동수의 각각의 CAR T 세포를 공배양하고, 24 시간에 산생되는 IFNg 의 양을 ELISA 로 검출하여 비교하였다. 패턴은 1A, 5A, 9F, 9I 에 대한 분명한 인식이 있는 것은 scFvCL-cp3 을 사용한 alanine scan 과 동일하였다. 따라서, xYVDxLFFL, xYVDxLFFF, xYVDxLFFI 의 모티프를 사용한 BLAST 검색을 실시하였다. 그 결과, 이들 모티프에 합치하는 펩티드는 추출되지 않았다.

또한, BLAST 검색한 중에서 PRAMEp301-309 의 아미노산 서열이 3 개 상이한 유전자를 표 2 에 나타낸다. 이들 펩티드, CMV, DMSO 를 T2A24 에 펄스하고, #98CAR-T 세포와 공배양하였다. 배양 상청 중에 분비되는 IFNg 량을 ELISA 로 측정하였다. 또한, e alone 은 effector 세포만을 나타낸다 (도 16). 표 2 에 나타낸 펩티드에 대해 #98 CAR-T 세포의 반응은 확인되지 않았다.

시험예 6. #98 zG CAR 에 대한 인식 avidity 평가

T2A24 세포에 대해, 상이한 농도의 PRAME peptide 에서의 펄스를 실시하고, 이것을 #98 zG CAR T 세포와 공배양하고 IFNg 의 세포내 염색을 실시하여, #98 zG CAR T 세포의 인식을 측정하였다. 이것이 avidity 이다. 구체적으로는, 다음과 같다. T2A24 세포에 대해 10, 1, 0.1, 0.01, 0.001 micro molar 의 PRAME p301-309, CMV 10 micro molar, DMSD 로 펩티드 펄스를 실시하고, 이것에 #98 CAR T 세포를 반응시켜 6 시간의 공배양을 실시하고, PEcy7 표지 CD8+ RPE 표지 tetramer+ 의 CAR T 세포에 대해 APC 표지 항 IFNg 항체로 염색하고, FACS CANT 로 반응한 CAR T 세포를 측정하였다. IC50 은 약 10 nM 으로, 충분한 인식 활성이 있는 것을 알 수 있었다 (도 10).

시험예 7. #98 zG CAR T 세포에 의한 A24+PRAME+의 표적 세포의 특이적 인식

본 시험에 사용한 타깃 세포의 PRAME 발현을 해석하였다. 구체적으로는 다음과 같다. RNA extraction kit (Promega) 를 사용하여 배양 세포로부터 Total RNA 를 추출한 후, 역전사 반응을 실시하였다. RT-PCR 에는 Applied Biosystems 로부터 판매되고 있는 TaqMan gene expression assay reagents 인 PRAME (Hs01022301_m1) 와 GAPDH CONTROL MIX (REF 4325792) 를 사용하였다. PRAME 의 발현 레벨은 GAPDH 의 발현 레벨로 normalize 하였다.

또한, 본 시험에 사용한 타깃 세포의 HLA-A24 발현을 해석하였다. 구체적으로는 다음과 같다. b) T2A24 및 SK-MEL-124, NW-MEL-38 은 일차 항체로서 Bulk Monoclonal Antibody A23, 24 IgG2b (ONE LAMBDA. INC), 이차 항체로서 Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG(H+L) (Invitrogen) 에 의해 염색하였다. Flow cytometry 에 의해 측정하였다.

결과를 도 11a, b 에 나타낸다. A24 도입 NW-MEL-38, SK-MEL-124 는 HLA-A24 와 PRAME 을 발현하고 있고, 양성의 타깃이다. 한편, NW-MEL-38 은 HLA-A24 가 발현하고 있지 않기 때문에 음성 타깃이다. T2A24 세포는 PRAME 를 발현하고 있지 않다.

레트로바이러스에 의해 유전자 도입한 CAR-T 세포와 펩티드 펄스를 실시한 타깃 세포를 24 시간 공배양하고, 배양 상청 중에 포함되는 IFN-γ 를 측정한 결과, PRAME 를 펄스한 LCL 세포 특이적으로 IFN-γ 의 산출이 증대되었다. 음성 컨트롤인 CMV 펄스 T2A24 세포와의 공배양에서는 IFN-γ 의 산생을 볼 수 없었다 (도 12). 또, 타깃 세포인 A24 양성 PRAME 양성의 SK-MEL-124, A24 유전자 도입 NW-MEL-38 에서는, 종양 특이적인 IFN-γ 의 산출이 보이고, 오프타깃인 NW-MEL-38 과는 분명한 차이가 관찰되었다 (도 12). 따라서, 레트로바이러스 벡터에 의한 CAR 유전자의 도입으로, CAR 이 발현하여, 특이적으로 종양을 인식하고, IFN-γ 를 산출하는 것을 확인할 수 있었다.

시험예 8. PRAME#98 CAR 을 유전자 도입한 CAR-T 세포에 의한 타깃 암세포의 특이적 인식

#98 CAR T 세포는, PRAMEp301-309 를 펩티드 펄스한 T2A24 세포와의 공배양에서 IFNg 의 산생이 확인되어, 양성 타깃에 대한 인식이 일어나고 있는 것이 나타났다. 한편, CMV 펩티드 펄스 T2A24 세포 및 펩티드 펄스 없음의 T2A24 세포와의 공배양에서는 IFNg 의 산생이 확인되지 않고, 따라서 이들 음성 타깃에 대한 인식이 일어나고 있지 않은 것이 나타났다 (도 12).

다음으로, 배양 암세포에 대한 인식에 대한 검토를 실시하였다. 사용한 배양 세포의 PRAME 발현을 도 11a 에, 또, HLA-A24 발현을 도 11b 에 나타낸다. NW-MEL-38-HLA-A24 (NW-MEL-38 세포에 대해 HLA-A24 유전자를 레트로바이러스에 의해 도입하여, HLA-A24 를 강제 발현시킨 것, PRAME 양성 HLA-A24 양성) 및 SK-MEL-124 (PRAME 양성 HLA-A24 양성) 는 양성 타깃 세포이고, 한편, NW-MEL-38 (PRAME 양성 HLA-A24 음성) 은 음성 타깃 세포이다. 도 12 에 나타내는 바와 같이, #98 CAR T 세포는 양성 세포와의 공배양에서 IFNg 의 산생이 보이고, 음성 세포와의 공배양에서는 IFNg 의 산생이 관찰되지 않았다. 따라서 타깃 세포에 대한 인식은 특이적으로 실시되고 있는 것이 나타났다.

시험예 9. PRAME#98 CAR 을 유전자 도입한 CAR-T 세포에 의한 타깃 암세포의 특이적 인식

양성 타깃 세포로서 NW-MEL-38-HLA-A24 (NW-MEL-38 세포에 대해 HLA-A24 유전자를 레트로바이러스에 의해 도입하여, HLA-A24 를 강제 발현시킨 것, PRAME 양성 HLA-A24 양성), SK-MEL-124 (PRAME 양성 HLA-A24 양성), 음성 타깃 세포로서 NW-MEL-38 (PRAME 양성 HLA-A24 음성) 을 E-plate 에 뿌리고, 24.5 시간 후에 effector 세포로서 #98 CAR T cell 을 작용시켜, xCelligence 에 의한 index 변화를 관찰하였다. 구체적으로는, 이하와 같다.

음성 타깃 세포 NW-MEL-38 (A24-PRAME+) 7000 개를 E-plate 상에서 24.5 시간 배양한 후, 각 effector 세포 100000 개를 첨가 배양하고, cell index 를 계시적으로 추적하였다. Cell index 는 E-plate 상의 A24 NW-MEL-38 세포수를 반영한다. Normalized cell index 는, 이펙터 세포와 공배양하기 직전의 NW-MEL-38 세포수를 1 로서 표준화하였다. 결과를 도 13a 에 나타낸다. 그래프는 평균값 (n = 3) 을 나타낸다. #98 CAR T 세포에 의한 세포 상해는 경미하였다.

HLA-A24 도입 NW-MEL-38 세포 (A24+PRAME+) 7000 개를 E-plate 상에서 24.5 시간 배양한 후, 각 effector 세포 100000 개를 첨가 배양하고, cell index 를 계시적으로 추적하였다. Cell index 는 E-plate 상의 A24 NW-MEL-38 세포수를 반영한다. Normalized cell index 는, 이펙터 세포와 공배양하기 직전의 A24 NW-MEL-38 세포수를 1 로서 표준화하였다. 결과를 도 13b 에 나타낸다. 그래프는 평균값 (n = 3) 을 나타낸다. #98 zG CAR T 세포에 의한 세포 상해가 관찰되고, CD19 zG CAR T 세포, CAR 도입이 없는 PBMC 에 의한 세포 상해는 관찰되지 않았다.

SK-MEL-124 세포 (A24+PRAME+) 7000 개를 E-plate 상에서 24.5 시간 배양한 후, 각 effector 세포 100000 개를 첨가 배양하고, cell index 를 계시적으로 추적하였다. Cell index 는 E-plate 상의 SK-MEL-124 세포수를 반영한다. Normalized cell index 는, 이펙터 세포와 공배양하기 직전의 A24 NW-MEL-38 세포수를 1 로서 표준화하였다. 결과를 도 13c 에 나타낸다. 그래프는 평균값 (n = 3) 을 나타낸다. #98 zG CAR T 세포에 의한 세포 상해가 관찰되고, CD19 zG, CAR 도입이 없는 PBMC 에 의한 세포 상해는 관찰되지 않았다.

이상 도면 13a, b, c 에 나타내는 바와 같이, A24+PRAME+ 인 NW-MEL-38-HLA-A24, SK-MEL-124 에 대한 세포 상해 작용이 확인되고, A24- 인 NW-MEL-38 에 대한 세포 상해 작용은 확인되지 않았다. 따라서 #98 CAR T 세포의 세포 상해성은 양성 타깃 세포 특이적인 것이 나타났다.

시험예 10. #98 zG CAR T 세포에 의한 암 억제 1

NOG 마우스는 코먼 γ 리셉터를 결손하고 있으므로, NK 세포가 존재하지 않는다. 이 때문에, 인간 세포나 인간 조직의 생착성이 NOD-SCID 마우스와 비교하여 현저하게 높아, 인간의 암이나 인간 정상 조직을 고율로 생착시킨다. 또, 인간 조혈 줄기 세포 이식 후에, 인간 T 세포의 분화가 확인되기 때문에, 인간 면역계 모델 마우스로서의 수요가 높아지고 있다. NOG 마우스의 특징으로서, T 세포 및 B 세포의 결실, 내추럴 킬러 세포 (NK) 세포의 결실, 수상 세포 기능의 저하, 매크로파지 기능의 저하, 보체 활성의 결실, 노화에 수반하는 T 세포 및 B 세포의 누출 (leakiness) 이 확인되지 않은 것을 들 수 있다. NOG 마우스에 대해, 우체측에 NW-MEL-124 (A24 양성 PRAME 양성) 를 4 × 10^6 개/마리를 이식하였다. 7 일째에 항 lambda 항체로 소트한 PRAME#98 CAR-T 세포를 세포수 8 × 10^6 개/마리, 미정맥으로부터 수주 (輸注) 하였다. 구체적으로는, 다음과 같다 (개요는 도 14a). 7 주령의 암컷의 NOG 마우스를 구입하여 1 주간 훈화 (訓化) 시켜, SK-MEL-124 세포 4 x 10^6 을 피하주 (皮下注) 로 이식하였다. Effector 세포에 대해서는, 항 lambda 항체 반응 후 RPE 표지 항토끼 항체를 반응시켜, 항 PE 비드로 소트를 실시하고, 순화된 effector 세포를, 타깃 세포 접종 후 7 일째에 정맥 투여로 수주하였다. 컨트롤에는 아무것도 수주하지 않은 것을 사용하였다.

CAR-T 세포로의 유전자 도입은, 시험예 8 의 방법에 따랐다. CD8 과 CD4 의 존재비 95.2 ％ 와 2.1 ％ 에서 CAR 양성 비율은 CD8 이 97 ％, CD4 가 98.8 ％ 였다.

CAR-T 세포 수주군 (n = 3), 무처치군 (n = 3) 에서 실험을 실시하여, 종양 직경을 3 - 4 일 간격으로 측정하였다. 측정은 종양 이식 후 50 일째까지 실시하였다.

그 결과, CAR-T 세포 수주군에서는, 3 마리의 마우스로 SK-MEL-124 세포 (A24 양성 PRAME 양성) 의 증식 억제가 확인되었다 (도 14b). 한편 무처치군에서는 암의 증식이 확인되었다. 따라서 이번에 관찰된 수주 세포에 의한 항종양 효과는 #98 CAR T 세포에 의한 것으로 생각된다. 마우스에서는 특히 체중 감소는 일어나지 않고, 눈에 띄는 GVHD 작용은 관찰되지 않았다 (도 14c).

시험예 11. #98 zG CAR T 세포에 의한 암 억제 2

시험예 10. #98 zG CAR T 세포에 의한 암 억제 NOG 마우스는 코먼 γ 리셉터를 결손하고 있으므로, NK 세포가 존재하지 않는다. 이 때문에, 인간 세포나 인간 조직의 생착성이 NOD-SCID 마우스와 비교해서 현저하게 높아, 인간의 암이나 인간 정상 조직을 고율로 생착시킨다. 또, 인간 조혈 줄기 세포 이식 후에, 인간 T 세포의 분화가 확인되기 때문에, 인간 면역계 모델 마우스로서의 수요가 높아지고 있다. NOG 마우스의 특징으로서, T 세포 및 B 세포의 결실, 내추럴 킬러 (NK) 세포의 결실, 수상 세포 기능의 저하, 매크로파지 기능의 저하, 보체 활성의 결실, 노화에 수반하는 T 세포 및 B 세포의 누출 (leakiness) 이 확인되지 않는 것을 들 수 있다. NOG 마우스에 대해, 우체측의 측면에 SK-MEL-1 24 (A24 양성 PRAME 양성) 를 4 × 10^6 개/마리를 이식하였다. 이식 후 10 일째에 NGM 및 PRAME#98 CAR-T 세포를 세포수 4 × 10^6 개/마리, 미정맥으로부터 수주하였다. 구체적으로는, 다음과 같다 (개요는 도 15a). 7 주령의 암컷의 NOG 마우스를 구입하고 3 주간 훈화시켜, SK-MEL-124 세포 4 × 10^6 을 피하주로 이식하였다. 타깃 세포 접종 후 10 일째에 정맥 투여로 수주하였다. 컨트롤에는 NGM 을 수주하였다.

CAR-T 세포로의 유전자 도입은, 시험예 8 의 방법에 따랐다. CD8 과 CD4 의 존재 91.0 ％ 와 6.5 ％ 에서 CAR 양성 비율은 CD8 이 78.5 ％, CD4 가 56.9 ％ 였다.

CAR-T 세포 수주군 (n = 3), NGM 군 (n = 3) 으로 실험을 실시하여, 종양 직경을 3 - 4 일 간격으로 측정하였다. 측정은 종양 이식 46 일째까지 실시하였다.

그 결과, CAR-T 세포 수주군에서는, 3 마리의 마우스에서 SK-MEL-124 세포 (A24 양성 PRAME 양성) 의 증식 억제가 확인되었다 (도 15b). 한편 NGM 군에서는 암의 증식이 확인되었다. 따라서 이번에 관찰된 수주 세포에 의한 항종양 효과는 #98 CAR T 세포에 의한 것으로 생각된다. NGM, CAR-T 세포를 수주 후, day7, day14, day23 에 안와 채혈하여 PBMC 를 단리하고, hCD45, CD8 CD4 CAR 을 염색하고 FACS 로 해석하였다. Day23 에 있어서도 말초혈 중에 CAR-T 세포의 존재가 확인되었다 (도 15c).

SEQUENCE LISTING <110> MIE UNIVERSITY <120> PRAME binding molecule <130> P21-199WO <150> JP 2020-205384 <151> 2020-12-10 <160> 30 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> H CDR1 <400> 1 Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr Ala 1 5 <210> 2 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> H CDR2 <400> 2 Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala 1 5 <210> 3 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> H CDR3 <400> 3 Ala Arg His His Ser Asn Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val 1 5 10 <210> 4 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> H variable region <400> 4 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Gly Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg His His Ser Asn Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Arg 115 120 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H CDR1 <400> 5 ggaggcacct tcagcagcta tgct 24 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H CDR2 <400> 6 atcatcccta tctttggtac agca 24 <210> 7 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H CDR3 <400> 7 gcgagacacc acagtaacta ctactactac ggtatggacg tc 42 <210> 8 <211> 363 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H variable region <400> 8 caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 60 tcctgcaagg cttctggagg caccttcagc agctatgcta tcagctgggt gcgacaggcc 120 cctggacaag ggcttgagtg gatgggaggg atcatcccta tctttggtac agcaaactac 180 gcacagaagt tccagggcag agtcacgatt accgcggacg aatccacggg cacagcctac 240 atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagacaccac 300 agtaactact actactacgg tatggacgtc tggggccaag ggaccacggt caccgtctcg 360 aga 363 <210> 9 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> L CDR1 <400> 9 Asn Ile Gly Ser Lys Asn 1 5 <210> 10 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> L CDR2 <400> 10 Arg Asp Ser 1 <210> 11 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> L CDR3 <400> 11 Gln Val Trp Asp Ser Ser His Val 1 5 <210> 12 <211> 105 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> L variable region <400> 12 Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Leu Ser Val Ser Val Ala Leu Gly Gln 1 5 10 15 Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asn Asn Ile Gly Ser Lys Asn Val 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr 35 40 45 Arg Asp Ser Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Ala Gln Ala Gly 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ser Ser His Val Phe 85 90 95 Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu 100 105 <210> 13 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> L CDR1 <400> 13 aacattggaa gtaaaaat 18 <210> 14 <211> 9 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> L CDR2 <400> 14 agggatagc 9 <210> 15 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> L CDR3 <400> 15 caggtgtggg acagcagcca tgtc 24 <210> 16 <211> 315 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> L variable region <400> 16 tcctatgagc tgactcagcc actctcagtg tcagtggccc tgggacagac ggccaggatt 60 acctgtggcg gaaacaacat tggaagtaaa aatgtgcact ggtaccagca gaagccaggc 120 caggcccctg tgctggtcat ctatagggat agcaaccggc cctctgggat ccctgagcga 180 ttctctggct ccaactcggg gaacacggcc accctgacca tcagcagagc ccaagccggg 240 gatgaggctg actattactg tcaggtgtgg gacagcagcc atgtcttcgg aactgggacc 300 aaggtcaccg tccta 315 <210> 17 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PRAMEp301-309 <400> 17 Leu Tyr Val Asp Ser Leu Phe Phe Leu 1 5 <210> 18 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PRAME p301-1A <400> 18 Ala Tyr Val Asp Ser Leu Phe Phe Leu 1 5 <210> 19 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PRAME p301-2A <400> 19 Leu Ala Val Asp Ser Leu Phe Phe Leu 1 5 <210> 20 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PRAME p301-3A <400> 20 Leu Tyr Ala Asp Ser Leu Phe Phe Leu 1 5 <210> 21 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PRAME p301-4A <400> 21 Leu Tyr Val Ala Ser Leu Phe Phe Leu 1 5 <210> 22 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PRAME p301-5A <400> 22 Leu Tyr Val Asp Ala Leu Phe Phe Leu 1 5 <210> 23 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PRAME p301-6A <400> 23 Leu Tyr Val Asp Ser Ala Phe Phe Leu 1 5 <210> 24 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PRAME p301-7A <400> 24 Leu Tyr Val Asp Ser Leu Ala Phe Leu 1 5 <210> 25 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PRAME p301-8A <400> 25 Leu Tyr Val Asp Ser Leu Phe Ala Leu 1 5 <210> 26 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PRAME p301-9A <400> 26 Leu Tyr Val Asp Ser Leu Phe Phe Ala 1 5 <210> 27 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PRAME p301-2W <400> 27 Leu Trp Val Asp Ser Leu Phe Phe Leu 1 5 <210> 28 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PRAME p301-2F <400> 28 Leu Phe Val Asp Ser Leu Phe Phe Leu 1 5 <210> 29 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PRAME p301-9F <400> 29 Leu Tyr Val Asp Ser Leu Phe Phe Phe 1 5 <210> 30 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PRAME p301-9I <400> 30 Leu Tyr Val Asp Ser Leu Phe Phe Ile 1 5

Claims

서열 번호 1 로 나타내는 아미노산 서열을 포함하는 중사슬 CDR1, 서열 번호 2 로 나타내는 아미노산 서열을 포함하는 중사슬 CDR2, 및 서열 번호 3 으로 나타내는 아미노산 서열을 포함하는 중사슬 CDR3 을 포함하는 중사슬 가변 영역, 그리고/혹은
서열 번호 9 로 나타내는 아미노산 서열을 포함하는 경사슬 CDR1, 서열 번호 10 으로 나타내는 아미노산 서열을 포함하는 경사슬 CDR2, 및 서열 번호 11 로 나타내는 아미노산 서열을 포함하는 경사슬 CDR3 을 포함하는 경사슬 가변 영역을 포함하는, PRAME 결합성 분자.
제 1 항에 있어서,
상기 중사슬 가변 영역 및 상기 경사슬 가변 영역을 포함하는, PRAME 결합성 분자.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
HLA-A24 PRAMEp301-309 pMHC 복합체에 대해 결합성을 갖는, PRAME 결합성 분자.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
서열 번호 19 로 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드, 서열 번호 20 으로 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드, 서열 번호 21 로 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드, 서열 번호 23 으로 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드, 서열 번호 24 로 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드, 서열 번호 25 로 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드, 및 서열 번호 26 으로 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드에 대한 결합성이, 서열 번호 17 로 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드에 대한 결합성의 1/2 이하인, PRAME 결합성 분자.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
키메라 항원 수용체인, PRAME 결합성 분자.
제 5 항에 있어서,
상기 중사슬 가변 영역 및 상기 경사슬 가변 영역을 포함하는 scFv 도메인, 막관통 도메인, 그리고 TCR 의 세포내 도메인을 포함하는 코어 영역을 포함하는, PRAME 결합성 분자.
제 6 항에 있어서,
상기 코어 영역이 추가로 공자극 인자의 세포내 도메인을 포함하는, PRAME 결합성 분자.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
항체인, PRAME 결합성 분자.
제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 기재된 PRAME 결합성 분자를 코드하는, 폴리뉴클레오티드.
제 9 항에 기재된 폴리뉴클레오티드를 함유하는, 세포.
제 5 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 기재된 PRAME 결합성 분자를 코드하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는, 림프구 세포.
제 11 항에 기재된 림프구 세포, 또는 제 8 항에 기재된 PRAME 결합성 분자를 함유하는, 의약 조성물.
제 12 항에 있어서,
암의 치료 또는 예방용인, 의약 조성물.