KR20230118864A - 항원 결합 분자 및 이의 용도 - Google Patents

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KR20230118864A
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사만다 제이. 버스필드
매튜 제이. 윌슨
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스카우트 바이오, 인코포레이티드
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Abstract

본 개시내용은 인터루킨-31 (IL-31)에 특이적으로 결합하는 항원 결합 분자로서, 여기서, 항원 결합 분자는 면역글로불린 중쇄 가변 도메인 및 면역글로불린 경쇄 가변 도메인을 포함하는 항원 결합 분자에 관한 것이다.

Description

항원 결합 분자 및 이의 용도
관련 출원
본 출원은 2020년 11월 23일 출원된 미국 가출원 번호 63/117,383의 우선권 및 이익을 주장한다. 상기 언급된 특허 출원의 내용은 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다.
기술 분야
본 발명은 일반적으로 항원 결합 분자(antigen-binding molecule)에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 인터루킨 31 (IL-31)에 특이적으로 결합하고, 그 활성을 중화시키는 항원 결합 분자 및 비정상적인 IL-31 발현 및/또는 활성과 연관된 병태(condition), 예컨대, 만성 염증, 아토피성 피부염(atopic dermatitis), 습진, 소양증(pruritis), 기도 과민증 및 염증성 장 증후군의 치료를 위한 이의 용도에 관한 것이다.
서열 목록
본 출원은 EFS-Web을 통해 ASCII 포맷으로 제출된 서열 목록을 포함하며, 이는 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다. 2021년 11월 22일에 작성된 상기 ASCII 사본의 명칭은 "SCTB-012-01WO_SeqList_ST25.txt"이고, 크기는 61 KB이다.
배경
본 명세서에 인용된 임의의 특허 또는 특허 출원을 포함하는 모든 참고문헌은 본 발명의 완전한 이해를 가능하게 하기 위해 본원에서 참조로 포함된다. 그럼에도 불구하고, 상기 참고문헌은 이러한 문헌들 중 임의의 것이 호주 또는 임의의 다른 국가에서 기술 분야의 일반적인 일반 지식의 일부를 형성한다는 것을 인정하는 것으로 해석되지 않아야 한다.
문헌 [Sinem Bagci and Ruzicka (2018, J. Allergy Clin . Immunol.; 141(3):858-866)]에 의해 논의된 바와 같이, IL-31은 많은 인간 조직에서 발현되고, Th2-편향된 염증 반응에 연루된 시토카인이다. IL-31은 IL-31 수용체 α와 온코스타틴 M 수용체 β로 구성된 수용체 복합체를 통해 신호를 전달한다. 연구 결과, IL-31은 예컨대, 아토피성 습진과 같은 만성 소양성 피부 장애와 강하게 연관되어 있으며, 직접 약물 요법의 새로운 표적을 나타내는 것으로 밝혀졌다.
IL-31은, 백혈병 억제 인자, 온코스타틴 M (OSM), 카디오트로핀-1, 섬모신경영양 인자, 카디오트로핀 유사 시토카인, IL-6, 및 IL-11을 또한 포함하는 당단백질 130 (gp130)/IL-6 시토카인 패밀리에 속한다. 상기 패밀리의 구성원은 다단위 수용체에서 gp130의 공통 쇄를 공유하며, 신경 성장, 뼈 대사, 심장 발달 및 면역 조절, 예컨대, T 세포 분화에 관여한다. 인간에서, IL-31을 코딩하는(encoding) 유전자는 염색체 12q24.31에 위치하고, 164개의 아미노산 전구체, 및 4개의 α-나선 구조를 포함하는 예측된 141개의 아미노산 성숙한 폴리펩티드를 코딩하는 오픈 리딩 프레임으로 구성된다. IL-31은 또한 예컨대, 알레르기성 천식 및 비염, 염증성 장 질환, 악성 종양 (예컨대, 암) 및 골다공증과 같은 비피부과적 병태와도 연루되었다.
치료적 관점에서, IL-31 신호전달차단을 조사하는 최초의 인간 시험 중 하나는 인간화 항-인간 IL-31RA 단일클론 항체인 네몰리주맙 (CIM331)을 사용하여 건강한 대상체(subject) 및 아토피성 피부염을 앓는 환자에서 수행되었다. 연구에서는 위약을 받은 환자와 비교하여 네몰리주맙을 받은 환자에서 특히, 비록 아토피성 피부염 및 말초 부종 악화를 비롯한 유해 사례가 보고되기는 하였지만, 네몰리주맙의 단일 피하 투여가 소양증에 대한 시각 아날로그 척도 (VAS) 점수 및 국소 스테로이드 사용을 유의적으로 감소시켰을 뿐만 아니라, 수면 효율을 증가시킨 것으로 밝혀졌다.
따라서, 과도한 IL-31 수준 및/또는 활성과 연관된 병태, 예컨대 소양증 및 다른 피부과 및 비-피부과 병태를 치료하기 위한 개선된 치료 전략법이 여전히 긴급하게 요구되고 있다.
요약
본 개시내용은 적어도 부분적으로 천연 IL-31에 특이적으로 결합할 수 있고, 이의 프레임워크(framework) 영역은 천연 IL-31에 대한 결합 특이성 및 선택성의 손실 없이 표적 종과의 화합성을 위해 변형될 수 있는 상보성 결정 영역(complementarity determining region; CDR)을 포함하는 항-IL-31 결합 분자에 입각한 것이다. 따라서, 본원에 개시된 IL-31 결합 분자는, 이의 예시적인 예로서 소양증 및 아토피성 피부염을 포함하는, 비정상적인 IL-31 수준 및/또는 활성과 연관된 병태의 치료 및 예방에서 쉽게 사용될 수 있다.
따라서, 본원에 개시된 한 측면에서, 인터루킨-31 (IL-31)에 특이적으로 결합하는 항원 결합 분자로서, 여기서, 항원 결합 분자는 면역글로불린 중쇄 가변 도메인 (VH) 및 면역글로불린 경쇄 가변 도메인 (VL)을 포함하고, 여기서, VH는 서열 번호: 6의 아미노산 서열, 또는 이와 적어도 80%의 서열 동일성(sequence identity)을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정 영역 1 (VH CDR1), 서열 번호: 7의 아미노산 서열, 또는 이와 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2, 및 서열 번호: 8의 아미노산 서열, 또는 이와 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3을 포함하고; 여기서, VL은 서열 번호: 9의 아미노산 서열, 또는 이와 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정 영역 1 (VL CDR1), 서열 번호: 10의 아미노산 서열, 또는 이와 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2, 및 서열 번호: 11의 아미노산 서열, 또는 이와 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함하고, 여기서, CDR의 아미노산 서열은 IMGT 넘버링(numbering)을 기반으로 하는 항원 결합 분자를 제공한다.
본 개시내용은 또한 적어도 부분적으로 본원에 개시된 IL-31 결합 분자는 공지된 항-IL-31 항체 분자의 결합 영역으로 확인되지 않은 개과(canine) IL-31의 영역에 특이적으로 결합한다는 본 발명자의 발견에 입각한 것이다. 따라서, 본원에서 개시된 또 다른 측면에서, (i) 서열 번호: 1의 아미노산 위치 13, 15, 20 및 26에 상응하는 IL-31의 영역에 특이적으로 결합하는 IL-31 결합 분자, 또는 (ii) 서열 번호: 1의 아미노산 위치 76, 77, 80, 81, 및 84에 상응하는 IL-31의 영역에 특이적으로 결합하는 IL-31 결합 분자와 IL-31에의 결합에 대하여 경쟁하지 않는 항원 결합 분자를 제공한다.
본 개시내용은 또한 이의 중쇄 및 경쇄 서열을 포함하는 본원에 기술된 항원 결합 분자 및 이의 IL-31 결합 단편을 코딩하는 핵산 서열로 확장된다.
따라서, 한 측면에서, 본원에 기술된 항원 결합 분자를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 단리된(isolated) 핵산 분자를 제공한다.
본원에서는 또한 본원에 기술된 항원 결합 분자를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 발현 작제물(expression construct)을 개시한다. 핵산 서열은 하나 이상의 조절 서열에 작동가능하게 연결될 수 있다.
본 개시내용은 또한 본원에 기술된 발현 작제물을 포함하는 숙주 세포로 확장된다.
본 개시내용은 또한 본원에 기술된 항원 결합 분자를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 벡터(vector)로 확장된다.
본 개시내용은 또한 본원에 기술된 항원 결합 분자, 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물로 확장된다.
본원에 개시된 또 다른 측면에서, IL-31의 발현 증가 및/또는 이의 활성 증가와 연관된 병태의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에게 본원에 기술된 바와 같은, 항원 결합 분자, 벡터 또는 제약 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, IL-31의 발현 증가 및/또는 이의 활성 증가와 연관된 병태를 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다.
본 개시내용은 또한 본원에 기술된 항원 결합 분자, 벡터 또는 제약 조성물을 포함하는 키트(kit)로 확장된다.
본원에 개시된 또 다른 측면에서, IL-31의 발현 증가 및/또는 이의 활성 증가와 연관된 병태의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 IL-31의 발현 증가 및/또는 이의 활성 증가와 연관된 병태를 치료 또는 예방하기 위한 의약 제조에서의, 본원에 기술된 항원 결합 분자 또는 벡터의 용도를 제공한다.
본 개시내용은 또한 IL-31의 발현 증가 및/또는 이의 활성 증가와 연관된 병태의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 IL-31의 발현 증가 및/또는 이의 활성 증가와 연관된 병태의 치료 또는 예방에서 사용하기 위한 본원에 기술된 항원 결합 분자, 벡터 또는 제약 조성물로 확장된다.
본 개시내용은 또한 IL-31에 의해 증식하도록 유도된 종양(tumour) 및 이와 연관된 병태의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 IL-31에 의해 증식하도록 유도된 종양 및 이와 연관된 병태의 치료 또는 예방에서 사용하기 위한 본원에 기술된 항원 결합 분자, 벡터 또는 제약 조성물로 확장된다.
본 개시내용은 또한 서열 번호: 1의 아미노산 잔기 L29, Y32, Q33 및 P40을 포함하는 개과 IL-31의 에피토프(epitope)에 특이적으로 결합하는 항원 결합 분자로 확장된다.
본 개시내용은 또한 본원에 기술된 항원 결합 분자와, 서열 번호: 1의 개과 IL-31에의 결합에 대해 본원에 기술된 항원 결합 분자와 경쟁하는 항원 결합 분자로 확장된다.
본 개시내용은 또한 IL-31에 대한 면역 반응을 일으킬 수 있는 면역원성 조성물로서, 여기서, 조성물은 (i) IL-31의 B 세포 에피토프를 포함하는 면역원(immunogen) 및 (ii) 제약상 허용되는 담체를 포함하고, 여기서, B 세포 에피토프는 서열 번호: 1의 아미노산 위치 29-40에 상응하는 아미노산 서열, 또는 이와 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 여기서, 면역원은 천연 IL-31 분자의 아미노산 서열을 포함하지 않는 것인, 면역원성 조성물로 확장된다.
도면의 간단한 설명
이하, 본 발명의 실시양태는 첨부된 도면을 참조하여 오직 비제한적인 예로서만 기술된다:
도 1은 개과 IL-31에의 RA4의 결합을 보여주는 것이다. ELISA에 의해 측정된 바, 개과 IL-31에의 키메라 모노클로날 항체 RA4 (chRA4)의 결합을 보여주는 용량 반응 곡선. 제시된 결과는 배경 대비 특이적 결합의 405 nm에서의 흡광도 비이다.
도 2는 개과 DH82 세포에서의 개과 IL-31-유도된 STAT-3 인산화의 억제를 보여주는 것이다. 상이한 농도의 chRA4 모노클로날 항체를 개과 IL-31과 미리 인큐베이션시킨 후, DH82 세포에 첨가하였다. 본 데이터는 RA4가 용량에 의존적 방식으로 IL-31-유도된 STAT-3 인산화를 강력하게 억제시킬 수 있다는 것을 보여준다. 관찰된 IC50은 1.5 ㎍/mL였다.
도 3은 ELISA에 의해 측정된 바, 항-IL-31 항체 chRA4, M14 및 34D03의 개과 IL-31 (caIL-31), 고양이과 IL-31 (feIL-31), 개과 IL-31 돌연변이체 1 및 개과 IL-31 돌연변이체 2에의 결합을 보여주는 것이다. 본 데이터는 키메라 RA4가 개과 IL-31, 고양이과 IL-31에 및 2개의 개과 IL-31 돌연변이체 (돌연변이체 1 및 2)에 동등하게 잘 결합한다는 것을 보여주는 것이다. M14는 개과 IL-31 및 개과 IL-31 돌연변이 1에 결합하지만, 개과 IL-31 돌연변이 2에는 결합하지 않는다. 고양이과 IL-31에의 M14 결합도 감소되었다. 34D03은 또한 개과 IL-31과, 더 적은 정도로 고양이과 IL-31에 결합하였지만, 개과 IL-31 돌연변이 단백질 중 어느 것에도 결합하지 않았다.
도 4a는 개과/인간 키메라 단백질 ca/huIL-31_c123_h4, cahuIL-31_c12_h34 및 cahuIL-31_c1_h234를 나타낸 개략도를 보여주는 것이다. 도 4b는 ELISA에 의해 측정된 바, 개과 IL-31 (caIL-31), 인간 IL-31 (hIL-31) 및 키메라 개과/인간 IL-31 단백질 (c123_h4, c12_h34 및 c1_h234)에의 모노클로날 항체 RA4 결합의 용량 반응 곡선을 보여주는 것이다.
도 5a는 개과 IL-31의 N-말단 서열을 커버하는 말단절단된 오버랩핑 펩티드 시리즈를 나타낸 개략도를 보여주는 것이다. 도 5b는 ELISA에 의해 측정된 바, 전장 개과 IL-31 (Full ca IL-31) 및 개과 IL-31의 N-말단으로부터 유래된 오버랩핑 펩티드에의 RA4 및 앞서 기술된 두 항-IL-31 모노클로날 항체, M14 및 34D03의 결합을 보여주는 것이다.
도 6은 RA4 mAb 결합에 중요한 개과 IL-31의 N-말단 영역 중의 잔기의 확인을 보여주는 것이다. 개과 IL-31의 N-말단 도메인의 25개 아미노산 영역의 알라닌 스캐닝 라이브러리를 생성하였다. 각 변형된 (알라닌 치환된) 펩티드에의 RA4 mAb의 결합을 ELISA에 의해 평가하였다. 각 변형된 펩티드에의 결합을 X축의 왼쪽 끝 (이소류신) 대비 시리즈로 제1 펩티드에의 결합으로 정규화하였다.
도 7은 RA4 mAb가 개과 IL-31의 N-말단의 별개의 고유한 영역에 결합한다는 것을 보여주는 것이다. 단일 알라닌 치환 또는 4개의 모든 알라닌 치환의 조합이 있는 전장 개과 IL-31 단백질을 사용하여 ELISA에 의해 RA4 mAb (a) 또는 M14 mAb (b)의 결합을 평가하였다. 야생형 개과 IL-31 (caIL-31; 서열 번호: 1)은 대조군으로서 포함되었다.
상세한 설명
본원 다른 곳에 기술된 바와 같이, 본 개시내용은 적어도 부분적으로 천연 IL-31에 특이적으로 결합할 수 있고, 이의 프레임워크 영역은 천연 IL-31에 대한 결합 특이성 및 선택성의 손실 없이 표적 종과의 화합성을 위해 변형될 수 있는 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함하는 항-IL-31 결합 분자에 입각한 것이다. 따라서, 본원에 개시된 IL-31 결합 분자는, 이의 예시적인 예로서 소양증 및 아토피성 피부염을 포함하는, 비정상적인 IL-31 수준 및/또는 활성과 연관된 병태의 치료 및 예방에서 쉽게 사용될 수 있다.
따라서, 본원에서는 인터루킨-31 (IL-31)에 특이적으로 결합하는 항원 결합 분자로서, 여기서, 항원 결합 분자는 면역글로불린 중쇄 가변 도메인 (VH) 및 면역글로불린 경쇄 가변 도메인 (VL)을 포함하고, 여기서, VH는 서열 번호: 6의 아미노산 서열, 또는 이와 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정 영역 1 (VH CDR1), 서열 번호: 7의 아미노산 서열, 또는 이와 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2, 및 서열 번호: 8의 아미노산 서열, 또는 이와 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3을 포함하고; 여기서, VL은 서열 번호: 9의 아미노산 서열, 또는 이와 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정 영역 1 (VL CDR1), 서열 번호: 10의 아미노산 서열, 또는 이와 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2, 및 서열 번호: 11의 아미노산 서열, 또는 이와 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함하고, 여기서, CDR의 아미노산 서열은 IMGT 넘버링을 기반으로 하는 항원 결합 분자를 개시한다.
달리 언급되지 않는 한, 본원에서 개시된 CDR 서열은 IMGT 넘버링을 기반으로 한다.
본 개시내용은 또한 적어도 부분적으로 본원에 개시된 IL-31 결합 분자는 공지된 항-IL-31 항체 분자에 대해 확인되지 않은 IL-31의 영역에 특이적으로 결합한다는 본 발명자의 발견에 입각한 것이다. 따라서, 본원에 개시된 한 측면에서, (i) 서열 번호: 1의 아미노산 위치 13, 15, 20 및 26에 상응하는 IL-31의 영역에 특이적으로 결합하는 IL-31 결합 분자, 또는 (ii) 서열 번호: 1의 아미노산 위치 76, 77, 80, 81, 및 84에 상응하는 IL-31의 영역에 특이적으로 결합하는 IL-31 결합 분자와 IL-31에의 결합에 대하여 경쟁하지 않는 항원 결합 분자를 제공한다.
"~에 상응하는"이라는 용어는 서열 번호: 1의 개과 IL-31 펩티드 서열과 정렬될 때, 서열 번호: 1의 잔기와 정렬되는 아미노산 잔기를 포함하는 IL-31 펩티드 서열의 영역을 지칭한다. 예를 들어, 서열 번호: 1의 아미노산 위치 13, 15, 20 및 26에 상응하는 IL-31의 영역은 서열 번호: 1의 개과 IL-31 펩티드 서열과 정렬될 때, 서열 번호: 1의 위치 13, 15, 20 및 26의 잔기와 정렬되는 아미노산 잔기를 포함하는 IL-31 펩티드 서열의 영역을 지칭한다. 유사하게, 서열 번호: 1의 아미노산 위치 76, 77, 80, 81, 및 84에 상응하는 IL-31의 영역은 서열 번호: 1의 개과 IL-31 펩티드 서열과 정렬될 때, 서열 번호: 1의 위치 76, 77, 80, 81, 및 84의 잔기와 정렬되는 아미노산 잔기를 포함하는 IL-31 펩티드 서열의 영역을 지칭한다.
본원 다른 곳에 기술되어 있는 바와 같이, 본 발명자들은 또한 본원에 개시된 IL-31 결합 분자가 서열 번호: 1의 아미노산 잔기 L29, Y32, Q33 및 P40을 포함하는 IL-31의 에피토프에 결합한다는 것을 발견하게 되었다. 따라서, 본원에서는 서열 번호: 1의 아미노산 잔기 L29, Y32, Q33 및 P40을 포함하는 개과 IL-31의 에피토프에 특이적으로 결합하는 항원 결합 분자를 개시한다.
본 개시내용은 또한 서열 번호: 1의 개과 IL-31에의 결합에 대해 본원에 기술된 항원 결합 분자와 경쟁하는 항원 결합 분자로 확장된다.
본원에서 사용되는 바, "~와 경쟁하는"이라는 용어는 2개 이상의 항원 결합 분자가 한 항원 (예컨대, IL-31)에의 결합에 대해 경쟁한다는 것을 의미한다. 한 예시적인 검정법에서, IL-31을 고체 기판 상에 코팅하고, 제1 항원 결합 분자에 결합할 수 있도록 한 후, 제2 항원 결합 분자를 첨가한다. 제1 항원 결합 분자의 존재가 제2 항원 결합 분자의 IL-31에의 결합을 감소시킨다면, 이때 항원 결합 분자는 IL-31에의 결합에 대해 경쟁하는 것으로 확인된다. "~와 경쟁하는"이라는 용어는 또한, 한 항원 결합 분자가 또 다른 항원 결합 분자의 결합을 감소시키되, 항원 결합 분자를 역순으로 첨가하였을 때에는 경쟁이 관찰되지 않는, 항원 결합 분자의 조합도 포함한다. 그러나, 일부 실시양태에서, 제1 및 제2 항원 결합 분자는 그가 첨가되는 순서와 상관없이, 서로 항원에의 결합을 억제시킨다. 한 실시양태에서, 한 항원 결합 분자는 항원에의 또 다른 항원 결합 분자의 결합을 적어도 20%만큼, 바람직하게, 적어도 30%만큼, 바람직하게, 적어도 40%만큼, 바람직하게, 적어도 50%만큼, 바람직하게, 적어도 60%만큼, 바람직하게, 적어도 70%만큼, 바람직하게, 적어도 80%만큼, 바람직하게, 적어도 90%만큼, 또는 더욱 바람직하게, 적어도 95%만큼 감소시킨다.
본원에서 사용되는 바, 용어 "항원 결합 분자"는 표적 항원에 대해 결합 특이성을 갖는 분자를 지칭한다. 상기 용어는 항원 결합 활성을 나타내는 면역글로불린, 면역글로불린 단편 및 비면역글로불린 유래된 단백질 프레임워크로 확장된다는 것을 이해할 것이다. 적합한 항원 결합 분자의 예시적인 예는 항체 및 이의 항원 결합 단편을 포함한다. 바람직하게, 항원 결합 분자는 IL-31 활성을 중화시키거나, 또는 실질적으로 중화시키기 위해 IL-31에 특이적으로 결합한다. "중화시키다"라는 용어는 항원 결합 분자가 IL-31에 결합하고, IL-31 분자가 이의 천연 수용체에 결합하는 능력을 억제, 감소, 폐기, 차단 또는 다르게는 방지할 것임을 의미하는 것으로 이해된다. 일부 실시양태에서, 항원 결합 분자는 항원 결합 분자의 부재와 비교할 때, IL-31 활성이 없거나, 또는 무시할 수 있도록 IL-31의 활성을 (생체내 또는 시험관내에서) 완전히 중화시킬 것이다. 다른 실시양태에서, 항원 결합 분자는 항원 결합 분자의 부재와 비교할 때, 더 적은 IL-31 활성이 존재하도록 IL-31의 활성을 (생체내 또는 시험관내에서) 부분적으로 중화시킬 것이다.
본원에서 사용되는 바, 용어 "항체"는 표적 항원에 특이적으로 결합하거나, 또는 이와 특이적으로 상호작용하는 적어도 하나의 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함하는 임의의 항원 결합 분자 또는 분자 복합체를 의미하는 것으로 이해된다. 용어 "항체"는 디술피드 결합에 의해 상호 연결된 2개의 중쇄 (H) 및 2개의 경쇄 (L)를 포함하는 전장 면역글로불린 분자 뿐만 아니라, 이의 다량체 (예컨대, IgM)를 포함한다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역 (HCVR, VH 또는 VH로 약칭될 수 있다) 및 중쇄 불변 영역을 포함한다. 중쇄 불변 영역은 전형적으로 3개 도메인 - CH1, CH2 및 CH3을 포함한다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역 LCVR, VL, VK, VK 또는 VL로 약칭될 수 있다) 및 경쇄 불변 영역을 포함한다. 경쇄 불변 영역은 전형적으로 1개의 도메인 (CL1)을 포함할 것이다. VH 및 VL 영역은 프레임워크 영역 (FR)으로도 또한 지칭되는, 더욱 보존되는 영역이 산재되어 있는, 상보성 결정 영역 (CDR)으로 명명되는 초가변 영역으로 추가로 세분화될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 전형적으로 아미노 말단에서 카르복시 말단까지 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4 순서로 배열된, 3개의 CDR 및 4개의 FR을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기술된 항원 결합 분자의 FR은 표적 종 (즉, 본원에 기술된 바와 같은 항원 결합 분자 또는 이의 항원 결합 단편이 투여되는 종)의 생식계열 서열의 FR과 동일할 수 있다. 일부 실시양태에서, FR은 자연적으로 또는 인공적으로 변형될 수 있다. 일반적으로, 각각의 FR 서열이 표적 종의 대상체에게 투여시 결합 분자에 대해 발생하는 면역 반응을 최소화하는 것을 포함하여 표적 종의 면역글로불린 분자로부터 유래된 FR 서열과 동일한 것이 바람직하지만, 일부 실시양태에서, 항원 결합 분자 또는 이의 항원 결합 단편은 표적 종으로부터의 하나 이상의 FR에서 상응하는 위치에서 외래일 하나 이상의 이의 FR 서열에 걸쳐 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 바람직하게, 항원 결합 분자 또는 이의 항원 결합 단편이 표적 종의 상응하는 위치에서 외래일 하나 이상의 이의 FR 서열에 걸쳐 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 경우, "외래" 아미노산 잔기는 (i) 천연 IL-31을 포함하는 IL-31에 대한 항원 결합 분자 또는 이의 항원 결합 단편의 결합 특이성에 불리하게 영향을 미치지 않고/거나, (ii) 표적 종의 대상체에게 투여되었을 때, 항원 결합 분자 또는 항원 결합 단편에 대한 면역 반응을 일으키지 않을 것이다.
적합한 항체는 개과 IgGA, IgGB, IgGC 및 IgGD, 및 고양이과 IgG1a, IgG1b 및 IgG2 (이의 하위부류 포함)를 포함한다. 상이한 부류의 면역글로불린의 서브유닛 구조 및 3차원 입체배치는 당업자에게 널리 공지되어 있을 것이다.
본원에서 사용되는 바, 용어 "상보성 결정 영역" (CDR)은 표적 항원을 인식하고, 그에 결합하는 면역글로불린 가변 도메인의 영역을 지칭한다. 각각의 가변 도메인은 CDR1, CDR2 및 CDR3으로 식별되는 최대 3개의 CDR 서열을 포함할 수 있다. 각각의 CDR의 아미노산 서열은 종종 카바트(Kabat) 넘버링에 의해 (예컨대, 대략적으로, 경쇄 가변 도메인의 잔기 24-34 (L1), 50-56 (L2) 및 89-97 (L3) 및 중쇄 가변 도메인의 잔기 31-35 (H1), 50-65 (H2) 및 95-102 (H3); 문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)]) 및 코티아(Chothia) 넘버링 (예컨대, 대략적으로, 경쇄 가변 도메인의 잔기 26-32 (L1), 50-52 (L2) 및 91-96 (L3), 및 중쇄 가변 도메인의 26-32 (H1), 53-55 (H2) 및 96-101 (H3); 문헌 [Chothia and Lesk J. Mol . Biol. 196:901-917 (1987)] 참조)에 의해 정의된다. 본원에 개시된 CDR 서열은 달리 언급되지 않는 한 IMGT 넘버링을 기반으로 한다.
한 실시양태에서, 본원에 기술된 바와 같은 항원 결합 분자는 기능성 모이어티 (예컨대, 독소), 검출가능한 모이어티 (예컨대, 형광 분자, 방사성동위원소), 소분자 약물 및 폴리펩티드를 포함하는 또 다른 분자 또는 모이어티에 접합된다.
본원에 기술된 항원 결합 분자의 결합 특이성에 불리한 영향을 미치지 않으면서, CDR 서열을 포함하여 본원에 기술된 항원 결합 분자에 변형이 이루어질 수 있다는 것을 이해하여야 한다. 따라서, 본 개시내용은 본원에 개시된 IL-31 결합 분자의 기능성 변이체로 확장된다. 본원에서 사용되는 바, 용어 "기능성 변이체"는 하나 이상의 (예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21개 등의) 아미노산 결실, 삽입 및/또는 치환에 의해 모체 또는 컴퍼레이터 서열 (예컨대, VH 및/또는 VL)과 상이한 아미노산 서열을 포함하는 IL-31 결합 분자로서, 상기 차이는 IL-31에 결합하는 변이체의 능력을 폐지하지 않거나, 완전히 폐지하지 않는다는 것을 의미하는 것으로 이해되어야 한다.
변이체가 상기 기능을 유지하는지 여부를 결정하는 적합한 방법은 당업자에게 친숙할 것이며, 이의 예시적인 예는 본원 다른 곳에 기술되어 있다. 기능성 변이체는 컴퍼레이터 서열 (예컨대, 서열 번호: 12 및 13)과 상이한 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 기능성 변이체는 변이의 비교 대상이 되는 참조 분자 (예컨대, VH 및 VL 또는 서열 번호: 12 및 13을 포함하는 항원 결합 분자)와 비교하여 항원 결합 분자의 IL-31에의 결합 친화도를 증진시키는 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 기능성 변이체는 본원 다른 곳에 기술되어 있는 바와 같이, 하나 이상의 보존적 아미노산 치환에 의해 컴퍼레이터와 상이하다.
"적어도 80%의 서열 동일성"이라고 언급하는 것은 예를 들어, 최적의 정렬 또는 최적합 분석 후, 참조 서열 (예컨대, 서열 번호: 6-13 중 어느 하나의 것)과의 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 포함한다. 따라서, 한 실시양태에서, 항원 결합 분자의 기능성 변이체는 예를 들어, 최적의 정렬 또는 최적합 분석 후, 서열 번호: 12 또는 서열 번호: 13과 적어도 80%, 바람직하게, 적어도 85%, 바람직하게, 적어도 86%, 바람직하게, 적어도 87%, 바람직하게, 적어도 88%, 바람직하게, 적어도 89%, 바람직하게, 적어도 90%, 바람직하게, 적어도 91%, 바람직하게, 적어도 92%, 바람직하게, 적어도 93%, 바람직하게, 적어도 94%, 바람직하게, 적어도 95%, 바람직하게, 적어도 96%, 바람직하게, 적어도 97%, 바람직하게, 적어도 98%, 바람직하게, 적어도 99% 또는 바람직하게, 100%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 그로 구성되거나, 또는 본질적으로 그로 구성된다. 또 다른 실시양태에서, 항원 결합 분자의 기능성 변이체의 CDR 서열은 예를 들어, 최적의 정렬 또는 최적합 분석 후, 서열 번호: 6-11 중 어느 하나와 적어도 80%, 바람직하게, 적어도 85%, 바람직하게, 적어도 86%, 바람직하게, 적어도 87%, 바람직하게, 적어도 88%, 바람직하게, 적어도 89%, 바람직하게, 적어도 90%, 바람직하게, 적어도 91%, 바람직하게, 적어도 92%, 바람직하게, 적어도 93%, 바람직하게, 적어도 94%, 바람직하게, 적어도 95%, 바람직하게, 적어도 96%, 바람직하게, 적어도 97%, 바람직하게, 적어도 98%, 바람직하게, 적어도 99% 또는 바람직하게, 100%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 그로 구성되거나, 또는 본질적으로 그로 구성된다.
한 실시양태에서, (i) VH는 서열 번호: 6과 적어도 80%, 바람직하게, 적어도 85%, 바람직하게, 적어도 86%, 바람직하게, 적어도 87%, 바람직하게, 적어도 88%, 바람직하게, 적어도 89%, 바람직하게, 적어도 90%, 바람직하게, 적어도 91%, 바람직하게, 적어도 92%, 바람직하게, 적어도 93%, 바람직하게, 적어도 94%, 바람직하게, 적어도 95%, 바람직하게, 적어도 96%, 바람직하게, 적어도 97%, 바람직하게, 적어도 98%, 바람직하게, 적어도 99% 또는 바람직하게, 100%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정 영역 1 (VH CDR1), 서열 번호: 7과 적어도 80%, 바람직하게, 적어도 85%, 바람직하게, 적어도 86%, 바람직하게, 적어도 87%, 바람직하게, 적어도 88%, 바람직하게, 적어도 89%, 바람직하게, 적어도 90%, 바람직하게, 적어도 91%, 바람직하게, 적어도 92%, 바람직하게, 적어도 93%, 바람직하게, 적어도 94%, 바람직하게, 적어도 95%, 바람직하게, 적어도 96%, 바람직하게, 적어도 97%, 바람직하게, 적어도 98%, 바람직하게, 적어도 99% 또는 바람직하게, 100%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2, 및 서열 번호: 8과 적어도 80%, 바람직하게, 적어도 85%, 바람직하게, 적어도 86%, 바람직하게, 적어도 87%, 바람직하게, 적어도 88%, 바람직하게, 적어도 89%, 바람직하게, 적어도 90%, 바람직하게, 적어도 91%, 바람직하게, 적어도 92%, 바람직하게, 적어도 93%, 바람직하게, 적어도 94%, 바람직하게, 적어도 95%, 바람직하게, 적어도 96%, 바람직하게, 적어도 97%, 바람직하게, 적어도 98%, 바람직하게, 적어도 99% 또는 바람직하게, 100%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3을 포함하고; (ii) VL은 서열 번호: 9와 적어도 80%, 바람직하게, 적어도 85%, 바람직하게, 적어도 86%, 바람직하게, 적어도 87%, 바람직하게, 적어도 88%, 바람직하게, 적어도 89%, 바람직하게, 적어도 90%, 바람직하게, 적어도 91%, 바람직하게, 적어도 92%, 바람직하게, 적어도 93%, 바람직하게, 적어도 94%, 바람직하게, 적어도 95%, 바람직하게, 적어도 96%, 바람직하게, 적어도 97%, 바람직하게, 적어도 98%, 바람직하게, 적어도 99% 또는 바람직하게, 100%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정 영역 1 (VL CDR1), 서열 번호: 10과 적어도 80%, 바람직하게, 적어도 85%, 바람직하게, 적어도 86%, 바람직하게, 적어도 87%, 바람직하게, 적어도 88%, 바람직하게, 적어도 89%, 바람직하게, 적어도 90%, 바람직하게, 적어도 91%, 바람직하게, 적어도 92%, 바람직하게, 적어도 93%, 바람직하게, 적어도 94%, 바람직하게, 적어도 95%, 바람직하게, 적어도 96%, 바람직하게, 적어도 97%, 바람직하게, 적어도 98%, 바람직하게, 적어도 99% 또는 바람직하게, 100%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2, 및 서열 번호: 11과 적어도 80%, 바람직하게, 적어도 85%, 바람직하게, 적어도 86%, 바람직하게, 적어도 87%, 바람직하게, 적어도 88%, 바람직하게, 적어도 89%, 바람직하게, 적어도 90%, 바람직하게, 적어도 91%, 바람직하게, 적어도 92%, 바람직하게, 적어도 93%, 바람직하게, 적어도 94%, 바람직하게, 적어도 95%, 바람직하게, 적어도 96%, 바람직하게, 적어도 97%, 바람직하게, 적어도 98%, 바람직하게, 적어도 99% 또는 바람직하게, 100%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함한다.
한 실시양태에서, VH는 서열 번호: 6과 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정 영역 1 (VH CDR1), 서열 번호: 7과 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2, 및 서열 번호: 8과 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3을 포함하고; VL은 서열 번호: 9와 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정 영역 1 (VL CDR1), 서열 번호: 10과 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2, 및 서열 번호: 11과 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함한다.
한 실시양태에서, VH는 서열 번호: 6의 아미노산 서열을 포함하거나, 그로 구성되거나, 또는 본질적으로 그로 구성된 상보성 결정 영역 1 (VH CDR1), 서열 번호: 7의 아미노산 서열을 포함하거나, 그로 구성되거나, 또는 본질적으로 그로 구성된 VH CDR2 및 서열 번호: 8의 아미노산 서열을 포함하거나, 그로 구성되거나, 또는 본질적으로 그로 구성된 VH CDR3을 포함하고; VL은 서열 번호: 9의 아미노산 서열을 포함하거나, 그로 구성되거나, 또는 본질적으로 그로 구성된 상보성 결정 영역 1 (VL CDR1), 서열 번호: 10의 아미노산 서열을 포함하거나, 그로 구성되거나, 또는 본질적으로 그로 구성된 VL CDR2, 및 서열 번호: 11의 아미노산 서열을 포함하거나, 그로 구성되거나, 또는 본질적으로 그로 구성된 VL CDR3을 포함하거나, 그로 구성되거나, 또는 본질적으로 그로 구성된다.
한 실시양태에서, 본원에 기술된 항원 결합 분자는 서열 번호: 12의 아미노산 서열, 또는 이와 적어도 80%, 바람직하게, 적어도 85%, 바람직하게, 적어도 90%, 바람직하게, 적어도 95%, 또는 더욱 바람직하게, 적어도 98%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH)을 포함한다. 한 실시양태에서, 본원에 기술된 항원 결합 분자는 서열 번호: 13의 아미노산 서열, 또는 이와 적어도 80%, 바람직하게, 적어도 85%, 바람직하게, 적어도 90%, 바람직하게, 적어도 95%, 또는 더욱 바람직하게, 적어도 98%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VH)을 포함한다.
한 실시양태에서, 본원에 기술된 항원 결합 분자는 (a) 서열 번호: 12의 아미노산 서열, 또는 이와 적어도 80%, 바람직하게, 적어도 85%, 바람직하게, 적어도 90%, 바람직하게, 적어도 95%, 또는 더욱 바람직하게, 적어도 98%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH), 및 (b) 서열 번호: 13의 아미노산 서열, 또는 이와 적어도 80%, 바람직하게, 적어도 85%, 바람직하게, 적어도 90%, 바람직하게, 적어도 95%, 또는 더욱 바람직하게, 적어도 98%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함한다.
한 실시양태에서, 본원에 기술된 항원 결합 분자는 (a) 서열 번호: 12의 아미노산 서열, 또는 이와 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH), 및 (b) 서열 번호: 13의 아미노산 서열, 또는 이와 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함한다.
한 실시양태에서, 중쇄 가변 영역 (VH)은 서열 번호: 12의 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄 가변 영역 (VL)은 서열 번호: 13의 아미노산 서열을 포함한다.
한 실시양태에서, 중쇄 가변 영역 (VH)은 서열 번호: 12의 아미노산 서열로 구성되거나, 또는 본질적으로 그로 구성되고, 경쇄 가변 영역 (VL)은 서열 번호: 13의 아미노산 서열로 구성되거나, 또는 본질적으로 그로 구성된다.
본원에서 사용되는 바, 용어 "동일성," "유사성," "서열 동일성," "서열 유사성," "상동성," "서열 상동성" 등은 정렬된 서열 중의 임의의 특정 아미노산 잔기 위치의 아미노산 잔기는 정렬된 서열 사이에서 동일하는 것을 의미한다. 본원에서 사용되는 바, 용어 "유사성" 또는 "서열 유사성"은 정렬된 서열 중의 임의의 특정 위치에서 아미노산 잔기가 서열 간에 유사한 타입이라는 것을 나타낸다. 예를 들어, 류신은 이소류신 또는 발린 잔기로 치환될 수 있다. 이는 보존적 치환으로 지칭될 수 있다. 한 실시양태에서, 아미노산 서열은 그 안에 함유된 임의의 아미노산 잔기의 보존적 치환에 의해 변형될 수 있으므로, 변형은 비변형된 폴리펩티드와 비교할 때 변형된 폴리펩티드의 결합 특이성 또는 기능적 활성에 영향을 미치지 않는다.
일부 실시양태에서, 펩티드 서열에 대한 서열 동일성은 최대 상동성(%)에 도달하도록 서열을 정렬하고, 필요한 경우, 갭을 도입한 후, 및 임의의 보존적 치환을 서열 동일성의 일부로서 고려하지 않으면서, 상응하는 펩티드 서열의 잔기와 동일한 후보 서열 내의 아미노산 잔기의 백분율에 관한 것이다. N- 또는 C-말단 연장도, 삽입도 서열 동일성 또는 상동성을 감소시키는 것으로 해석되지 않아야 한다. 2개 이상의 아미노산 서열의 정렬을 수행하고, 이의 서열 동일성 또는 상동성을 결정하기 위한 방법 및 컴퓨터 프로그램은 당업자에게 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 두 아미노산 서열의 동일성(%) 또는 유사성(%)은 알고리즘, 예를 들어, BLAST, FASTA, 또는 스미쓰-워터맨(Smith-Waterman) 알고리즘을 사용하여 쉽게 계산될 수 있다.
아미노산 서열 "유사성"을 결정하는 기술은 당업자에게 널리 공지되어 있다. 일반적으로, "유사성"은 아미노산이 동일하거나, 유사한 화학적 및/또는 물리적 특성, 예컨대, 전하 또는 소수성을 소유하는 경우, 2개 이상의 펩티드 서열의, 또는 적절한 위치에서의 정확한 아미노산 대 아미노산 유사를 의미한다. 이어서, 소위 "유사성(%)"이라는 것은 비교된 펩티드 서열 사이에서 결정될 수 있다. 일반적으로, "동일성"은 두 펩티드 서열의 정확한 아미노산 대 아미노산 일치를 지칭한다.
2개 이상의 펩티드 서열은 또한 이의 "동일성(%)"을 결정함으로써 비교될 수 있다. 두 서열의 동일성(%)은 정렬된 두 서열 사이의 정확한 매치 개수를 짧은 서열의 길이로 나누고, 그에 100을 곱하여 얻은 값으로 기술될 수 있다. 핵산 서열에 대한 대략적인 정렬은 문헌 [Smith and Waterman, Advances in Applied Mathematics 2:482-489 (1981)]의 국부 상동성 알고리즘에 의해 제공된다. 상기 알고리즘은 문헌 [Dayhoff, Atlas of Protein Sequences and Structure, M. O. Dayhoff ed., 5 suppl. 3:353-358, National Biomedical Research Foundation, Washington, D.C., USA, and normalized by Gribskov, Nucl. Acids Res. 14(6):6745-6763 (1986)]에 의해 개발된 스코어링 매트릭스를 사용하여 펩티드 서열과 함께 사용하도록 확장될 수 있다. 서열 간의 동일성(%) 또는 유사성(%)를 계산하는 데 적합한 프로그램은 일반적으로 당업계에 공지되어 있다.
비교창을 정렬하기 위한 서열의 최적 정렬은 알고리즘 (미국 위스콘신주 매디슨 사이언스 드라이브 575 소재의 제네틱스 컴퓨터 그룹(Genetics Computer Group)의 위스콘신 제네틱스 소프트웨어 패키지 릴리스 7.0(Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0)의 GAP, BESTFIT, FASTA, 및 TFASTA)의 컴퓨터화된 구현에 의해, 또는 선택된 다양한 방법 중 임의의 것에 의해 생성된 검사 및 최적의 정렬 (즉, 이로써, 비교창에 걸쳐 최고의 상동성(%)을 얻을 수 있다)에 의해 수행될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Altschul et al., 1997, Nucl. Acids Res.25:3389]에 개시된 바와 같은 BLAST 패밀리의 프로그램도 참조할 수 있다. 서열 분석에 관한 상세한 논의는 문헌 [Unit 19.3 of Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons Inc, 1994-1998, Chapter 15]에서 살펴볼 수 있다.
일부 실시양태에서, 기능성 변이체는 CDR 서열의 임의의 하나 이상의 것 중에 적어도 하나의 (예컨대, 1, 2, 3, 4 또는 5개의) 아미노산 치환, 바람직하게, 보존적 아미노산 치환을 포함한다. 한 실시양태에서, 항원 결합 분자는 CDR 서열의 임의의 하나 이상의 것 중에 1, 2, 또는 3개의 아미노산 치환을 포함한다. 다른 실시양태에서, 기능성 변이체는 VH 및/또는 VL 서열의 비CDR 영역 중 (예컨대, 프레임워크 영역 중) 하나 이상의 아미노산 치환, 삽입 및/또는 결실을 포함한다.
IL-31에 특이적으로 결합할 수 있는 기능성 변이체를 스크리닝하고, 확인하는 것은 당업자의 능력 범위 내에 있을 것이다. 적합한 스크리닝 방법의 예시적인 예는 본원 다른 곳에 기술되어 있다.
바람직한 실시양태에서, 아미노산 치환은 보존적 아미노산 치환이다. "보존적 아미노산 치환"은 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 대체되는 치환을 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기 패밀리는 당업계에 정의되어 있으며, 이는 일반적으로 하기 표 "아미노산 분류"에 제시된 바와 같이 하위 분류될 수 있다:
보존적 아미노산 치환은 또한 측쇄에 기초한 그룹화를 포함한다. 예를 들어, 지방족 측쇄를 갖는 아미노산 그룹은 글리신, 알라닌, 발린, 류신 및 이소류신이고; 지방족-하이드록실 측쇄를 갖는 아미노산 그룹은 세린 및 트레오닌이고; 아미드 함유 측쇄를 갖는 아미노산 그룹은 아스파라긴 및 글루타민이고; 방향족 측쇄를 갖는 아미노산 그룹은 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판이고; 염기성 측쇄를 갖는 아미노산 그룹은 리신, 아르기닌 및 히스티딘이고; 황 함유 측쇄를 갖는 아미노산 그룹은 시스테인 및 메티오닌이다. 예를 들어, 류신을 이소류신 또는 발린으로, 아스파르테이트를 글루타메이트로, 트레오닌을 세린으로의 대체, 또는 아미노산을 구조적으로 관련된 아미노산으로의 유사한 대체는 생성된 변이체 폴리펩티드의 특성에 큰 영향을 미치지 않을 것이라고 예상하는 것은 타당한다. 아미노산 변이가 기능성 폴리펩티드를 생성하는지 여부는 그 활성을 검정함으로써 쉽게 결정할 수 있다.
보존적 치환은 또한 하기 표 (예시적 아미노산 치환 및 바람직한 아미노산 치환)에 제시되어 있다. 본 발명의 범주 내에 포함되는 아미노산 치환은 일반적으로 (a) 치환 영역에서 펩티드 백본의 구조, (b) 표적 부위에서 분자의 전하 또는 소수성, 또는 (c) 측쇄의 벌크를 유지하는 데 미치는 이의 효과에 있어서 크게 다르지 않은 치환을 선택함으로써 달성된다. 치환 도입 후, 변이체는 본원 다른 곳에 기술된 방법을 포함하여 당업자에게 공지된 방법을 사용하여 IL-31에 특이적으로 결합할 수 있는 이의 능력에 대해 스크리닝될 수 있다.
한 실시양태에서, 본원에 기술된 항원 결합 분자는 개과 IL-31에 특이적으로 결합한다. 한 실시양태에서, 본원에 기술된 항원 결합 분자는 고양이과 IL-31에 특이적으로 결합한다.
본 개시내용은 천연 IL-31 (즉, 자연적으로 발생된 IL-31) 뿐만 아니라, 이의 변이체에 특이적으로 결합하는 항원 결합 분자로 확장된다. 상기 변이체는 하나 이상의 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입에 의해 자연적으로 발생된 (야생형) 분자와 상이한 IL-31 분자를 포함할 수 있다. 상기 타입의 변이체 IL-31 분자는 자연적으로 발생된 형태 또는 합성 (예컨대, 재조합) 형태일 수 있다. 그러나, 바람직한 실시양태에서, 본원에 기술된 항원 결합 분자는 천연 형태의 IL-31에 특이적으로 결합한다는 것을 이해하여야 한다.
용어 "항원 결합 단편," "항원 결합부," "항원 결합 도메인," "항원 결합 부위" 등은 본원에서 상호교환적으로 사용되며, 표적 항원, 즉, 천연 IL-31을 비롯한, IL-31에 결합할 수 있는 능력을 보유하는 항원 결합 분자의 부분을 지칭한다. 상기 용어는 IL-31에 특이적으로 결합하여 복합체를 형성하는, 자연적으로 발생된, 효소적으로 수득가능한, 합성 또는 유전자 조작된 (재조합) 폴리펩티드 및 당단백질을 포함한다.
항원 결합 단편은 예를 들어, 당업자에게 공지된 임의의 적합한 방법을 사용하여 자연적으로 유도된 면역글로불린 분자로부터 유래될 수 있고, 이의 예시적인 예는 단백질분해적 분해 또는 항체 가변 및 임의적으로 불변 도메인을 코딩하는 핵산 서열의 조작 및 발현을 포함하는 재조합 유전 공학 기술을 포함한다. 적합한 핵산 서열은 공지되어 있고/거나, 예컨대, 상업적 공급원, DNA 라이브러리 (예컨대, 파지-항체 라이브러리 포함)로부터 쉽게 입수할 수 있거나, 합성될 수 있다. 핵산 서열은 시퀀싱될 수 있고, 예를 들어, 하나 이상의 가변 및/또는 불변 도메인을 적합한 입체배치로 정렬하거나, 또는 코돈을 도입하거나, 시스테인 장기를 생성하거나, 아미노산을 변형, 부가, 또는 결실시키는 등, 그를 수행하기 위해 화학적으로, 또는 분자 생물학 기술을 사용함으로써 조작될 수 있다.
적합한 항원 결합 단편의 비제한적인 예로는 (i) Fab 단편; (ii) F(ab')2 단편; (iii) Fd 단편; (iv) Fv 단편; (v) 단일 쇄 Fv (scFv) 분자; (vi) dAb 단편; 및 (vii) 항체의 초가변 영역을 모방하는 아미노산 잔기로 구성된 최소 인식 단위(예컨대, 단리된 CDR, 예컨대, CDR3 펩티드) 또는 제약된 FR3-CDR3-FR4 펩티드를 포함한다. 본원에서 사용되는 바, 다른 조작된 분자, 예컨대, 도메인 특이적 항체, 단일 도메인 항체, 도메인 결실된 항체, 키메라 항체, CDR 이식된 항체, 1 아암(armed) 항체, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, 미니바디, 나노바디 (예컨대, 1가 나노바디, 2가 나노바디 등), 및 소형 모듈형 면역제약 (SMIP) 또한 용어 "항원 결합 단편"에 포함된다.
한 실시양태에서, 항원 결합 단편은 적어도 하나의 면역글로불린 가변 도메인을 포함한다. 가변 도메인은 임의의 적합한 길이 또는 조성의 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 일반적으로 하나 이상의 프레임워크 서열에 인접하거나, 또는 이와 프레임 내에 있는 적어도 하나의 CDR을 포함할 것이다. 항원 결합 단편이 VH 도메인 및 VL 도메인을 포함하는 경우, VH 및 VL 도메인은 임의의 적합한 배열로 서로에 대해 위치할 수 있다. 예를 들어, 가변 영역은 이량체 가변 영역일 수 있고, VH-VH, VH-VL 또는 VL-VL 이량체를 함유할 수 있다. 대안적으로, 항체의 항원 결합 단편은 단량체 VH 또는 VL 도메인을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 항원 결합 단편은 적어도 하나의 불변 도메인에 공유 연결된 적어도 하나의 가변 도메인을 포함할 수 있다. 항원 결합 단편 내에서 발견될 수 있는 가변 및 불변 도메인의 비제한적인 입체배치는 (i) VH-CH1; (ii) VH-CH2; (iii) VH-CH3; (iv) VH-CH1-CH2; (v) VH-CH1-CH2-CH3, (vi) VH-CH2-CH3; (vii) VH-CL; (viii) VL-CH1; (ix) VL-CH2, (x) VL-CH3; (xi) VL-CH1-CH2; (xii) VL-CH1-CH2-CH3; (xiii) VL-CH2-CH3; 및 (xiv) VL-CL을 포함한다. 상기 열거된 예시적 입체배치 중 임의의 것을 포함하는 가변 및 불변 도메인의 임의의 입체배치에서, 가변 및 불변 도메인은 서로 직접 연결될 수 있거나, 전체 또는 부분 힌지 또는 링커 영역에 의해 연결될 수 있다. 힌지 영역은 단일 폴리펩티드 분자에서 인접한 가변 및/또는 불변 도메인 사이에 가요성 또는 반가요성 연결을 생성하는 적어도 2개 (예컨대, 5, 10, 15, 20, 40, 60개 이상)의 아미노산으로 구성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기술된 바와 같은 항원 결합 단편은 서로 및/또는 하나 이상의 단량체 VH 또는 VL 도메인과 (예컨대, 디술피드 결합(들)에 의해) 비공유적으로 회합된 상기 열거된 가변 및 불변 도메인 입체배치 중 임의의 것의 동종이량체 또는 이종이량체 (또는 다른 다량체)를 포함할 수 있다. 다중특이적 항원 결합 분자는 전형적으로 적어도 2개의 상이한 가변 도메인을 포함할 것이며, 여기서, 각각의 가변 도메인은 별개의 항원 또는 동일한 항원 상의 상이한 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있다. 이중특이적 항원 결합 분자 포맷을 비롯한, 임의의 다중특이적 항원 결합 분자 포맷은 당업계에서 이용가능한 통상의 기술을 사용하여 본 개시내용의 항체의 항원 결합 단편과 관련하여 사용하기 위해 적합화될 수 있다.
용어 "가변 영역" 또는 "가변 도메인"은 표적 항원에의 결합에 관여하는 면역글로불린 중쇄 또는 경쇄의 도메인을 지칭한다. 천연 면역글로불린 분자의 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인 (각각 VH 및 VL)은 일반적으로 유사한 구조를 가질 것이며, 각각의 도메인은 4개의 보존된 프레임워크 영역 및 3개의 초가변 영역 (HVR)을 포함한다. 예컨대, 문헌 [Kindt et al., Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., page 91 (2007)]을 참조한다. 단일 VH 또는 VL 도메인은 항원 결합 특이성을 부여하는 데 충분할 수 있다.
본원에 기술된 항원 결합 분자는 예를 들어, 표적 종에게로의 투여 후, 항원 결합 분자에 대해 생성되는 면역 반응을 최소화하거나, 또는 다르게는 회피하기 위해 상기 표적 종과의 화합성을 위해 적절하게 변형될 수 있다. 한 실시양태에서, 항원 결합 분자는 개과화된(caninized), 고양이과화된(felinized) 또는 말과화된(equinized) 것이다.
"개과화된"이란, 항원 결합 분자가 개과와 화합성인 아미노산 서열을 포함하고, 이로써, 아미노산 서열이 개과 대상체의 면역계에 의해 외래의 것으로 간주될 가능성은 없다는 것을 의미한다. 한 실시양태에서, 개과화된 항원 결합 분자는 하나 이상의 개과 면역글로불린 분자로부터 유래된 하나 이상의 면역글로불린 프레임워크 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 개과화된 항원 결합 분자의 모든 프레임워크 영역은 하나 이상의 개과 면역글로불린 분자로부터 유래된 것이 될 것이다. 개과화된 항체는 임의적으로 개과 면역글로불린 분자로부터 유래된 면역글로불린 중쇄 불변 영역을 포함할 수 있다. 따라서, 한 실시양태에서, 항원 결합 분자는 개과화된 항원 결합 분자이다.
"고양이과화된"이란, 항원 결합 분자가 고양이과와 화합성인 아미노산 서열을 포함하고, 이로써, 아미노산 서열이 고양이과 대상체의 면역계에 의해 외래의 것으로 간주될 가능성은 없다는 것을 의미한다. 한 실시양태에서, 고양이과화된 항원 결합 분자는 하나 이상의 고양이과 면역글로불린 분자로부터 유래된 하나 이상의 면역글로불린 프레임워크 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 고양이과화된 항원 결합 분자의 모든 프레임워크 영역은 하나 이상의 고양이과 면역글로불린 분자로부터 유래된 것이 될 것이다. 고양이과화된 항체는 임의적으로 고양이과 면역글로불린 분자로부터 유래된 면역글로불린 중쇄 불변 영역을 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 항원 결합 분자는 고양이과화된 항원 결합 분자이다.
"말과화된"이란, 항원 결합 분자가 말과 화합성인 아미노산 서열을 포함하고, 이로써, 아미노산 서열이 말과 대상체의 면역계에 의해 외래의 것으로 간주될 가능성은 없다는 것을 의미한다. 한 실시양태에서, 말과화된 항원 결합 분자는 하나 이상의 말과 면역글로불린 분자로부터 유래된 하나 이상의 면역글로불린 프레임워크 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 말과화된 항원 결합 분자의 모든 프레임워크 영역은 하나 이상의 말과 면역글로불린 분자로부터 유래된 것이 될 것이다. 말과화된 항체는 임의적으로 말과 면역글로불린 분자로부터 유래된 면역글로불린 중쇄 불변 영역을 포함할 수 있다.
본 개시내용은 또한 개과, 고양이과 및 말과 이외의 다른 종과 화합성인 항원 결합 분자로 확장된다는 것을 이해하여야 한다. 이러한 맥락에서, 항원 결합 분자는 분자가 투여되는 표적 종을 지칭하는 "종별화(speciesized)"로 지칭될 수 있다.
표적 종과 화합성인 재조합 항체 또는 항원 결합 분자를 디자인하고, 생성하는 적합한 방법은 당업자에게 친숙할 것이며, 이의 예시적 예는 문헌 [Cattaneo (2010; Curr . Op. Mol . Ther. 12(1):94-106)], WO 2006/131951, WO 2012/153122, WO 2013/034900, WO 2012/153121 및 WO 2012/153123 (상기 문헌의 내용은 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다)에 기술되어 있다.
한 실시양태에서, 항원 결합 분자는 개과화된 것이다. 한 실시양태에서, 개과화된 항원 결합 분자는
(i) (a) 서열 번호: 18, 22, 26, 30 및 34로 구성된 군으로부터 선택되는 중쇄 가변 도메인 프레임워크 영역 1 (VHFR1) 아미노산 서열과 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 VHFR1 아미노산 서열,
(b) 서열 번호: 19, 23, 27, 31 및 35로 구성된 군으로부터 선택되는 VHFR2 아미노산 서열과 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 VHFR2 아미노산 서열,
(c) 서열 번호: 20, 24, 27, 32 및 36으로 구성된 군으로부터 선택되는 VHFR3 아미노산 서열과 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 VHFR3 아미노산 서열, 및
(d) 서열 번호: 21, 25, 28, 33 및 37로 구성된 군으로부터 선택되는 VHFR4 아미노산 서열과 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 VHFR4 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 (VH); 및/또는
(ii) (e) 서열 번호: 38, 42, 46 및 50으로 구성된 군으로부터 선택되는 중쇄 가변 도메인 프레임워크 영역 1 (VLFR1) 아미노산 서열과 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 VLFR1 아미노산 서열,
(f) 서열 번호: 39, 43, 47 및 51로 구성된 군으로부터 선택되는 VLFR2 아미노산 서열과 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 VLFR2 아미노산 서열,
(g) 서열 번호: 40, 44, 48 및 52로 구성된 군으로부터 선택되는 VLFR3 아미노산 서열과 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 VLFR3 아미노산 서열,
(h) 서열 번호: 41, 45, 49 및 53으로 구성된 군으로부터 선택되는 VLFR4 아미노산 서열과 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 VLFR4 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 (VL)을 포함한다.
한 실시양태에서, 개과화된 항원 결합 분자는
(i) (a) 서열 번호: 81 또는 서열 번호: 85의 중쇄 가변 도메인 프레임워크 영역 1 (VHFR1) 아미노산 서열과 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 VHFR1 아미노산 서열,
(b) 서열 번호: 82 또는 서열 번호: 86의 VHFR2 아미노산 서열과 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 VHFR2 아미노산 서열,
(c) 서열 번호: 83 또는 서열 번호: 87의 VHFR3 아미노산 서열과 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 VHFR3 아미노산 서열, 및
(d) 서열 번호: 84 또는 서열 번호: 88의 VHFR4 아미노산 서열과 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 VHFR4 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 (VH); 및/또는
(ii) (e) 서열 번호: 89의 중쇄 가변 도메인 프레임워크 영역 1 (VLFR1) 아미노산 서열과 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 VLFR1 아미노산 서열,
(f) 서열 번호: 90의 VLFR2 아미노산 서열과 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 VLFR2 아미노산 서열,
(g) 서열 번호: 91의 VLFR3 아미노산 서열과 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 VLFR3 아미노산 서열, 및
(h) 서열 번호: 92의 VLFR4 아미노산 서열과 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 VLFR4 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 (VL)을 포함한다.
한 실시양태에서, 개과화된 항원 결합 분자는 서열 번호: 99 또는 서열 번호: 100의 중쇄 가변 도메인 (VH) 아미노산 서열과 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함한다.
한 실시양태에서, 개과화된 항원 결합 분자는 서열 번호: 101의 경쇄 가변 도메인 (VL) 아미노산 서열과 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다.
한 실시양태에서, 항원 결합 분자는 고양이과화된 것이다. 한 실시양태에서, 고양이과화된 항원 결합 분자는
(i) (a) 서열 번호: 54의 중쇄 가변 도메인 프레임워크 영역 1 (VHFR1) 아미노산 서열과 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 VHFR1 아미노산 서열,
(b) 서열 번호: 55의 VHFR2 아미노산과 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 VHFR2 아미노산 서열,
(c) 서열 번호: 56의 VHFR3 아미노산과 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 VHFR3 아미노산 서열, 및
(d) 서열 번호: 57의 VHFR4 아미노산과 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 VHFR4 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 (VH); 및/또는
(ii) (e) 서열 번호: 58의 경쇄 가변 도메인 프레임워크 영역 1 (VLFR1) 아미노산 서열과 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 VLFR1 아미노산 서열,
(f) 서열 번호: 59의 VLFR2 아미노산 서열과 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 VLFR2 아미노산 서열,
(g) 서열 번호: 60의 VLFR3 아미노산 서열과 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 VLFR3 아미노산 서열, 및
(h) 서열 번호: 61의 VLFR4 아미노산 서열과 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 VLFR4 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 (VL)을 포함한다.
개과, 고양이과 및 말과를 포함하는 표적 종과의 화합성을 위해 본원에 개시된 항원 결합 분자를 변형시킬 때 사용될 수 있는 다른 적합한 프레임워크 영역 서열은 당업자에게 친숙할 것이며, 이의 예시적인 예는 문헌 [Cattaneo (2010; 상기 문헌 동일)], WO 2006/131951, WO 2012/153122, WO 2013/034900, WO 2012/153121 및 WO 2012/153123에 기술되어 있다.
"특이적으로 결합한다" 또는 "특이적 결합"이라는 어구는 생리학적 조건하에서 배경의 적어도 2배, 및 더욱 전형적으로, 배경 분자 회합의 10 내지 100배 초과인 두 분자 사이의 결합 반응을 지칭한다. 단백질인 하나 이상의 검출가능한 결합제를 사용하는 경우, 특이적 결합은 단백질 및 다른 생물제제로 이루어진 이종 집단에서 단백질의 존재를 결정짓는다. 따라서, 지정된 면역검정 조건하에서, 특정된 항원 결합 분자는 특정 항원 결정기에 결합하여 이의 존재를 확인시켜 준다. 상기 조건하에서 항원 결정기에의 특이적 결합은 상기 결정기에의 이의 특이성에 대해 선택된 항원 결합 분자를 필요로 한다. 이 선택은 다른 분자와 교차 반응하는 항원 결합 분자를 공제함으로써 달성될 수 있다. 특정 항원과 특이적인 면역반응성을 띠도록 다양한 면역검정 포맷을 사용하여 항원 결합 분자(예컨대, 면역글로불린)를 선택할 수 있다. 예를 들어, 고체상 ELISA 면역검정법은 단백질과 특이적으로 면역반응성인 항체를 선택하기 위해 통상적으로 사용된다 (예컨대, 문헌 [Harlow & Lane, Antibodies, A Laboratory Manual (1988) for a description of immunoassay formats and conditions that can be used to determine specific immunoreactivity] 참조). 결합 친화도 및 특이성을 결정하는 방법은 또한 당업계에 널리 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Harlow and Lane, 상기 문헌 동일]; [Friefelder, "Physical Biochemistry: Applications to biochemistry and molecular biology" (W.H. Freeman and Co. 1976)] 참조).
"친화도" 또는 "결합 친화도"는 분자 (예컨대, 항원 결합 분자)의 단일 결합 부위와 이의 결합 파트너 (예컨대, 항원) 사이의 전체 비공유 상호작용의 강도를 지칭한다. 달리 명시하지 않는 한, 본원에서 사용되는 바, "결합 친화도"는 결합 쌍의 구성원, 예컨대, 항원 결합 분자 사이의 1:1 상호작용을 반영하는 고유 결합 친화도를 지칭한다. 분자 X의 이의 파트너 Y에 대한 친화도는 일반적으로 해리 상수와 회합 속도 상수 (각각 koff 및 kon)의 비인 해리 상수 (Kd)로 표현될 수 있다. 따라서, 등가 친화도는 속도 상수의 비가 동일하게 유지되는 한, 다른 속도 상수를 포함할 수 있다. 친화도는 본원에 기술된 것을 포함하여 당업계에 공지된 통상적인 방법에 의해 측정될 수 있다. 친화도를 측정하는 특정 방법은 표면 플라즈몬 공명 (SPR)이다.
용어 "폴리펩티드," "펩티드" 또는 "단백질"은 인접한 잔기의 알파-아미노 기 및 카르복시 기 사이의 펩티드 결합에 의해 서로 연결된 일련의 선형 아미노산 잔기를 지정하는 것으로 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 아미노산 잔기는 일반적으로 천연 "L" 이성질체 형태이다. 그러나, "D" 이성질체 형태의 잔기는 원하는 기능적 특성이 폴리펩티드에 의해 유지되는 한, 임의의 L 아미노산 잔기로 대체될 수 있다
본원에서 사용되는 바, 용어 "변형된 항체"는 자연 발생적이지 않도록 변경된 합성 형태의 항체, 예컨대, 완전한 두 중쇄가 아닌 적어도 2개의 중쇄 부분을 포함하는 항체 (예컨대, 도메인 결실 항체 또는 미니바디); 2개 이상의 상이한 항원에 또는 단일 항원 상의 상이한 에피토프에 결합하도록 변경된 다중특이적 형태의 항체 (예컨대, 이중특이적, 삼중특이적 등); scFv 분자에 연결된 중쇄 분자 등을 포함한다. ScFv 분자는 당업계에 공지되어 있고, 예컨대, 미국 특허 번호 5,892,019에 기술되어 있다. 추가로, 용어 "변형된 항체"는 항체의 다가 형태의 항체 (예컨대, 3가, 4가 등, 동일한 항원의 3개 이상의 카피에 결합하는 항체)를 포함한다.
한 실시양태에서, 항원 결합 분자는 본원 다른 곳에 기술되어 있는 바와 같이, 항체, 또는 이의 항원 결합 단편이다. 한 실시양태에서, 항원 결합 단편은 Fab 단편, scFab, Fab', 단일 쇄 가변 단편 (scFv) 및 1 아암 항체로 구성된 군으로부터 선택된다.
한 실시양태에서, 항원 결합 분자는 면역글로불린 분자의 중쇄 및/또는 경쇄 불변 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, 항원 결합 분자는 개과, 고양이과 또는 말과 면역글로불린 분자의 중쇄 및/또는 경쇄 불변 영역을 포함한다.
한 실시양태에서, 항원 결합 분자는 개과 면역글로불린 분자의 중쇄 불변 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, 항원 결합 분자는 개과 면역글로불린 분자의 경쇄 불변 영역을 포함한다. 추가의 한 실시양태에서, 항원 결합 분자는 개과 면역글로불린 분자의 중쇄 및 경쇄 불변 영역을 포함한다.
한 실시양태에서, 항원 결합 분자는 IgGA, IgGB, IgGC 및 IgGD로 구성된 군으로부터 선택되는 개과 면역글로불린 분자의 중쇄 불변 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, 항원 결합 분자는 IgGA, IgGB, IgGC 및 IgGD로 구성된 군으로부터 선택되는 개과 면역글로불린 분자의 경쇄 불변 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, 항원 결합 분자는 IgGA, IgGB, IgGC 및 IgGD로 구성된 군으로부터 선택되는 개과 면역글로불린 분자의 중쇄 및 경쇄 불변 영역을 포함한다.
한 실시양태에서, 항원 결합 분자는 개과 IgGA 분자의 중쇄 불변 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, 항원 결합 분자는 개과 IgGA 분자의 경쇄 불변 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, 항원 결합 분자는 개과 IgGA 분자의 중쇄 및 경쇄 불변 영역을 포함한다.
한 실시양태에서, 항원 결합 분자는 개과 IgGB 분자의 중쇄 불변 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, 항원 결합 분자는 개과 IgGB 분자의 경쇄 불변 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, 항원 결합 분자는 개과 IgGB 분자의 중쇄 및 경쇄 불변 영역을 포함한다.
한 실시양태에서, 항원 결합 분자는 개과 IgGC 분자의 중쇄 불변 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, 항원 결합 분자는 개과 IgGC 분자의 경쇄 불변 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, 항원 결합 분자는 개과 IgGC 분자의 중쇄 및 경쇄 불변 영역을 포함한다.
한 실시양태에서, 항원 결합 분자는 개과 IgGD 분자의 중쇄 불변 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, 항원 결합 분자는 개과 IgGD 분자의 경쇄 불변 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, 항원 결합 분자는 개과 IgGD 분자의 중쇄 및 경쇄 불변 영역을 포함한다.
한 실시양태에서, 개과 면역글로불린 분자는 서열 번호: 2의 아미노산 서열, 또는 이와 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 그로 구성되거나, 또는 본질적으로 그로 구성된 개과 IgGA이다. 한 실시양태에서, 개과 IgGA는 서열 번호: 2의 아미노산 서열을 포함하거나, 그로 구성되거나, 또는 본질적으로 그로 구성된다.
한 실시양태에서, 항원 결합 분자는 서열 번호: 16의 아미노산 서열, 또는 이와 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 그로 구성되거나, 또는 본질적으로 그로 구성된 면역글로불린 중쇄를 포함한다.
한 실시양태에서, 항원 결합 분자는 서열 번호: 17의 아미노산 서열, 또는 이와 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 그로 구성되거나, 또는 본질적으로 그로 구성된 면역글로불린 경쇄를 포함한다.
한 실시양태에서, 항원 결합 분자는 서열 번호: 16의 아미노산 서열을 포함하거나, 그로 구성되거나, 또는 본질적으로 그로 구성된 면역글로불린 중쇄를 포함한다.
한 실시양태에서, 항원 결합 분자는 서열 번호: 17의 아미노산 서열을 포함하거나, 그로 구성되거나, 또는 본질적으로 그로 구성된 면역글로불린 경쇄를 포함한다.
한 실시양태에서, VH는 서열 번호: 14의 핵산 서열에 의해 코딩된다. 한 실시양태에서, VH는 서열 번호: 15의 핵산 서열에 의해 코딩된다.
한 실시양태에서, 키메라 항체, 또는 이의 IL-31 결합 단편은 IgG1a, IgG1b 및 IgG2로 구성된 군으로부터 선택되는 고양이과 면역글로불린 분자의 중쇄 불변 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, 키메라 항체, 또는 이의 IL-31 결합 단편은 IgG1a, IgG1b 및 IgG2로 구성된 군으로부터 선택되는 고양이과 면역글로불린 분자의 경쇄 불변 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, 키메라 항체, 또는 이의 IL-31 결합 단편은 IgG1a, IgG1b 및 IgG2로 구성된 군으로부터 선택되는 고양이과 면역글로불린 분자의 중쇄 및 경쇄 불변 영역을 포함한다.
한 실시양태에서, 키메라 항체, 또는 이의 IL-31 결합 단편은 고양이과 IgG1a 분자의 중쇄 불변 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, 키메라 항체, 또는 이의 IL-31 결합 단편은 고양이과 IgG1a 분자의 경쇄 불변 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, 키메라 항체, 또는 이의 IL-31 결합 단편은 고양이과 IgG1a 분자의 중쇄 및 경쇄 불변 영역을 포함한다.
한 실시양태에서, 키메라 항체, 또는 이의 IL-31 결합 단편은 고양이과 IgG1b 분자의 중쇄 불변 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, 키메라 항체, 또는 이의 IL-31 결합 단편은 고양이과 IgG1b 분자의 경쇄 불변 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, 키메라 항체, 또는 이의 IL-31 결합 단편은 고양이과 IgG1b 분자의 중쇄 및 경쇄 불변 영역을 포함한다.
한 실시양태에서, 키메라 항체, 또는 이의 IL-31 결합 단편은 고양이과 IgG2 분자의 중쇄 불변 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, 키메라 항체, 또는 이의 IL-31 결합 단편은 고양이과 IgG2 분자의 경쇄 불변 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, 키메라 항체, 또는 이의 IL-31 결합 단편은 고양이과 IgG2 분자의 중쇄 및 경쇄 불변 영역을 포함한다.
본원에서는 또한 본원에 기술된 바와 같은, IL-31 결합 분자, 및 이종성 모이어티를 포함하는 키메라 분자를 개시한다. 일부 실시양태에서, 이종성 모이어티는 검출가능한 모이어티, 반감기 연장 모이어티, 또는 치료 모이어티일 수 있다. 따라서, 본원에서 사용되는 바, "키메라" 분자는 하나 이상의 비관련 타입의 성분을 포함하거나, 또는 서로 접합, 융합, 연결, 번역, 링커를 통해 부착, 화학적으로 합성, 핵산 서열로부터 발현 등이 이루어질 수 있는 2개 이상의 화학적으로 별개의 영역을 함유하는 분자이다. 예를 들어, 펩티드 및 핵산 서열, 펩티드 및 검출가능한 표지, 비관련 펩티드 서열 등. 키메라 분자가 상이한 기원의 아미노산 서열을 포함하는 실시양태에서, 키메라 분자는 (1) 자연에서 함께 발견되지 않는 폴리펩티드 서열 (즉, 아미노산 서열 중 적어도 하나는 이의 다른 아미노산 서열 중 적어도 하나에 대해 이종성이다), 또는 (2) 자연적으로 인접하지 않은 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, 본원에서 사용되는 바, "키메라" 항체"는 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정 공급원 또는 종으로부터 유래되고, 중쇄 및/또는 경쇄의 나머지는 상이한 공급원 또는 종으로부터 유래된 항체를 지칭한다.
한 실시양태에서, 본원에 기술된 항원 결합 분자는 항체 또는 이의 IL-31 결합 단편이다. 한 실시양태에서, 항체는 키메라 항체이다. 키메라 항체의 예시적인 예는 VH 및 VL 서열이 마우스로부터 유래되고, 중쇄 및 경쇄 불변 영역이 마우스 이외의 종으로부터 유래된 (예컨대, 중쇄 및 경쇄 불변 영역이 개과, 고양이과, 말과 면역글로불린 분자로부터 유래) 항체 분자를 포함한다.
한 실시양태에서, 키메라 항체, 또는 이의 IL-31 결합 단편은 개과 면역글로불린 분자의 중쇄 불변 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, 키메라 항체, 또는 이의 IL-31 결합 단편은 개과 면역글로불린 분자의 경쇄 불변 영역을 포함한다. 추가의 한 실시양태에서, 키메라 항체, 또는 이의 IL-31 결합 단편은 개과 면역글로불린 분자의 중쇄 및 경쇄 불변 영역을 포함한다.
한 실시양태에서, 키메라 항체, 또는 이의 IL-31 결합 단편은 IgGA, IgGB, IgGC 및 IgGD로 구성된 군으로부터 선택되는 개과 면역글로불린 분자의 중쇄 불변 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, 키메라 항체, 또는 이의 IL-31 결합 단편은 IgGA, IgGB, IgGC 및 IgGD로 구성된 군으로부터 선택되는 개과 면역글로불린 분자의 경쇄 불변 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, 키메라 항체, 또는 이의 IL-31 결합 단편은 IgGA, IgGB, IgGC 및 IgGD로 구성된 군으로부터 선택되는 개과 면역글로불린 분자의 중쇄 및 경쇄 불변 영역을 포함한다.
한 실시양태에서, 키메라 항체, 또는 이의 IL-31 결합 단편은 개과 IgGA 분자의 중쇄 불변 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, 키메라 항체, 또는 이의 IL-31 결합 단편은 개과 IgGA 분자의 경쇄 불변 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, 키메라 항체, 또는 이의 IL-31 결합 단편은 개과 IgGA 분자의 중쇄 및 경쇄 불변 영역을 포함한다.
한 실시양태에서, 키메라 항체, 또는 이의 IL-31 결합 단편은 개과 IgGB 분자의 중쇄 불변 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, 키메라 항체, 또는 이의 IL-31 결합 단편은 개과 IgGB 분자의 경쇄 불변 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, 키메라 항체, 또는 이의 IL-31 결합 단편은 개과 IgGB 분자의 중쇄 및 경쇄 불변 영역을 포함한다.
한 실시양태에서, 키메라 항체, 또는 이의 IL-31 결합 단편은 개과 IgGC 분자의 중쇄 불변 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, 키메라 항체, 또는 이의 IL-31 결합 단편은 개과 IgGC 분자의 경쇄 불변 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, 키메라 항체, 또는 이의 IL-31 결합 단편은 개과 IgGC 분자의 중쇄 및 경쇄 불변 영역을 포함한다.
한 실시양태에서, 키메라 항체, 또는 이의 IL-31 결합 단편은 개과 IgGD 분자의 중쇄 불변 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, 키메라 항체, 또는 이의 IL-31 결합 단편은 개과 IgGD 분자의 경쇄 불변 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, 키메라 항체, 또는 이의 IL-31 결합 단편은 개과 IgGD 분자의 중쇄 및 경쇄 불변 영역을 포함한다.
한 실시양태에서, 개과 면역글로불린 분자는 개과 면역글로불린 감마 중쇄 A이다. 한 실시양태에서, 개과 면역글로불린 감마 중쇄 A는 서열 번호: 2의 아미노산 서열, 또는 이와 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 그로 구성되거나, 또는 본질적으로 그로 구성된다. 한 실시양태에서, 개과 면역글로불린 감마 중쇄 A는 서열 번호: 2의 아미노산 서열을 포함하거나, 그로 구성되거나, 또는 본질적으로 그로 구성된다.
한 실시양태에서, 키메라 항체는 서열 번호: 16의 아미노산 서열, 또는 이와 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하거나, 그로 구성되거나, 또는 본질적으로 그로 구성된다.
한 실시양태에서, 키메라 항체는 서열 번호: 17의 아미노산 서열, 또는 이와 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하거나, 그로 구성되거나, 또는 본질적으로 그로 구성된다.
한 실시양태에서, 키메라 항체는 서열 번호: 16의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하거나, 그로 구성되거나, 또는 본질적으로 그로 구성된다.
한 실시양태에서, 키메라 항체는 서열 번호: 17의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하거나, 그로 구성되거나, 또는 본질적으로 그로 구성된다.
한 실시양태에서, VH는 서열 번호: 14의 핵산 서열에 의해 코딩된다. 한 실시양태에서, VH는 서열 번호: 15의 핵산 서열에 의해 코딩된다.
또 다른 실시양태에서, 키메라 항체, 또는 이의 IL-31 결합 단편은 고양이과 면역글로불린 분자의 중쇄 불변 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, 키메라 항체, 또는 이의 IL-31 결합 단편은 고양이과 면역글로불린 분자의 경쇄 불변 영역을 포함한다. 추가의 한 실시양태에서, 키메라 항체, 또는 이의 IL-31 결합 단편은 고양이과 면역글로불린 분자의 중쇄 및 경쇄 불변 영역을 포함한다.
한 실시양태에서, 키메라 항체, 또는 이의 IL-31 결합 단편은 IgG1a, IgG1b 및 IgG2로 구성된 군으로부터 선택되는 고양이과 면역글로불린 분자의 중쇄 불변 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, 키메라 항체, 또는 이의 IL-31 결합 단편은 gG1a, IgG1b 및 IgG2로 구성된 군으로부터 선택되는 고양이과 면역글로불린 분자의 경쇄 불변 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, 키메라 항체, 또는 이의 IL-31 결합 단편은 gG1a, IgG1b 및 IgG2로 구성된 군으로부터 선택되는 고양이과 면역글로불린 분자의 중쇄 및 경쇄 불변 영역을 포함한다.
한 실시양태에서, 키메라 항체, 또는 이의 IL-31 결합 단편은 고양이과 IgG1a 분자의 중쇄 불변 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, 키메라 항체, 또는 이의 IL-31 결합 단편은 고양이과 IgG1a 분자의 경쇄 불변 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, 키메라 항체, 또는 이의 IL-31 결합 단편은 고양이과 IgG1a 분자의 중쇄 및 경쇄 불변 영역을 포함한다.
한 실시양태에서, 키메라 항체, 또는 이의 IL-31 결합 단편은 고양이과 IgG1b 분자의 중쇄 불변 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, 키메라 항체, 또는 이의 IL-31 결합 단편은 고양이과 IgG1b 분자의 경쇄 불변 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, 키메라 항체, 또는 이의 IL-31 결합 단편은 고양이과 IgG1b 분자의 중쇄 및 경쇄 불변 영역을 포함한다.
한 실시양태에서, 키메라 항체, 또는 이의 IL-31 결합 단편은 고양이과 IgG2 분자의 중쇄 불변 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, 키메라 항체, 또는 이의 IL-31 결합 단편은 고양이과 IgG2 분자의 경쇄 불변 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, 키메라 항체, 또는 이의 IL-31 결합 단편은 고양이과 IgG2 분자의 중쇄 및 경쇄 불변 영역을 포함한다.
본 개시내용은 또한 예를 들어, 안정성 및 혈청 반감기를 개선시키기 위해 변형된 중쇄 및 경쇄 불변 영역 서열의 용도로 확장된다.
비인간 종 (예컨대, 개과, 고양이과 및 말과)의 변형된 서열을 포함하는 적합한 중쇄 및 경쇄 불변 영역 서열은 당업자에게 친숙할 것이며, 이의 예시적인 예는 WO 2019/035010 (이의 전체 내용이 본원에서 참조로 포함된다)에 기술되어 있다.
본원에서는 또한 본원에 기술된 항원 결합 분자를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자를 개시한다. 한 실시양태에서, (i) 서열 번호: 12와 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 면역글로불린 중쇄 가변 영역을 코딩하는 핵산 서열, 및/또는 (ii) 서열 번호: 13과 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 면역글로불린 경쇄 가변 영역을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자를 제공한다.
한 실시양태에서, 면역글로불린 중쇄 가변 영역을 코딩하는 핵산 서열은 서열 번호: 14의 핵산 서열을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 면역글로불린 경쇄 가변 영역을 코딩하는 핵산 서열은 서열 번호: 15의 핵산 서열을 포함한다.
용어 "폴리뉴클레오티드" 또는 "핵산"은 mRNA, RNA, cRNA, cDNA 또는 DNA일 수 있는 뉴클레오티드의 중합체를 지칭하기 위해 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 본 용어는 전형적으로 길이가 적어도 10개 염기로 이루어진, 리보뉴클레오티드 또는 데옥시뉴클레오티드 또는 두 타입의 뉴클레오티드의 변형된 형태인, 중합체 형태의 뉴클레오티드를 지칭한다. 본 용어는 단일 및 이중 가닥 형태의 DNA를 포함한다.
본원에서는 또한 본원에 개시된 바와 같이, IL-31 결합 분자를 코딩하는 핵산을 포함하는 발현 벡터를 개시한다.
"벡터"란, 예를 들어 핵산 서열이 삽입되거나, 또는 클로닝될 수 있는 플라스미드, 박테리오파지 또는 바이러스로부터 유래된 핵산 분자, 바람직하게, DNA 분자를 의미한다. 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 고유한 제한 부위를 포함하고, 표적 세포 또는 조직 또는 이의 전구 세포 또는 조직을 포함하는 정의된 숙주 세포에서 자율 복제가 가능하거나, 또는 정의된 숙주의 게놈과 통합될 수 있고, 이로써, 클로닝된 서열은 재생가능하다. 따라서, 벡터는 자율 복제 벡터, 즉, 복제가 염색체 복제와 독립적인 염색체외 엔티티로서 존재하는 벡터, 예컨대, 선형 또는 폐쇄 고리형 플라스미드, 염색체외 요소, 미니염색체, 또는 인공 염색체일 수 있다. 벡터는 자기 복제를 보장하는 임의의 수단을 포함할 수 있다. 대안적으로, 벡터는 숙주 세포 내로 도입될 때, 게놈에 통합되고, 이의 통합이 이루어진 염색체(들)와 함께 복제되는 것일 수 있다. 벡터 시스템은 단일 벡터 또는 플라스미드, 숙주 세포의 게놈에 도입되는 전체 DNA를 함께 함유하는 2개 이상의 벡터 또는 플라스미드, 또는 트랜스포존을 포함할 수 있다. 벡터의 선택은 전형적으로 벡터가 도입될 숙주 세포와 벡터의 적합성에 따라 달라질 것이다. 벡터는 또한 적합한 형질전환체의 선별에 사용될 수 있는 항생제 내성 유전자와 같은 선별 마커를 포함할 수 있다. 상기 내성 유전자의 예는 당업자에게 널리 공지되어 있다.
한 실시양태에서, 벡터는 본원에 기술된 바와 같은 IL-31 결합 분자가 대상체에게 안전하게 투여되고, 대상체에서 IL-31 결합 분자가 지속적으로 발현될 수 있도록 하는 아데노-연관 바이러스 (AAV) 벡터이다.
아데노-연관 바이러스는 파르보비리다에(Parvoviridae) 과의 구성원이며, 약 5,000개 미만의 뉴클레오티드로 이루어진 선형 단일 가닥 DNA 게놈을 포함한다. AAV는 효율적인 복제를 위해 헬퍼 바이러스 (즉, 아데노바이러스 또는 헤르페스 바이러스)와의 공동 감염 또는 헬퍼 유전자의 발현을 필요로 한다. 치료용 핵산 투여에 사용되는 AAV 벡터는 전형적으로 모체 게놈의 대략 96%가 결실되어 있고, 이로써, DNA 복제 및 패키징에 대한 인식 신호를 포함하는 말단 반복부 (ITR)만이 그대로 유지되어 있다. 이는 바이러스 유전자의 발현으로 인한 면역학적 또는 독성 부작용을 제거한다. 추가로, 특정 AAV 단백질을 생산 세포에 전달하면, 원하는 경우, AAV ITR을 포함하는 AAV 벡터를 세포 게놈의 특정 영역으로 통합시킬 수 있다 (예컨대, 미국 특허 번호 6,342,390 및 6,821,511 참조). 통합된 AAV 게놈을 포함하는 숙주 세포는 세포 성장 또는 형태의 변화를 보이지 않는다 (예를 들어, 미국 특허 번호 4,797,368 참조).
AAV ITR은 비구조적 복제 (Rep) 단백질 및 구조적 캡시드 (Cap) 단백질 (비리온 단백질 (VP)로도 공지)에 대한 고유한 코딩 뉴클레오티드 서열 측면에 위치한다. 말단 145개의 뉴클레오티드는 자기 상보적이며, 조직화되어 있고, 이로써, T자형 헤어핀을 형성하는 에너지적으로 안정적인 분자내 이중체가 형성될 수 있다. 상기 헤어핀 구조는 세포 DNA 폴리머라제 복합체의 프라이머로서 작용함으로써 바이러스 DNA 복제 기점으로서의 역할을 한다. Rep 유전자는 Rep 단백질 Rep78, Rep68, Rep52, 및 Rep40을 코딩한다. Rep78 및 Rep68은 p5 프로모터로부터 전사되고, Rep 52 및 Rep40은 p19 프로모터로부터 전사된다. Rep78 및 Rep68 단백질은 생산적 복제 동안 헬리카제 및 니카제 기능을 수행하여 AAV 말단이 분해될 수 있도록 허용하는 다기능성 DNA 결합 단백질이다 (예컨대, 문헌 [Im et al., Cell, 61: 447-57 (1990)] 참조). 상기 단백질은 또한 내인성 AAV 프로모터 및 헬퍼 바이러스 내의 프로모터로부터의 전사를 조절한다 (예컨대, 문헌 [Pereira et al., J. Virol., 71: 1079-1088 (1997)] 참조). 다른 Rep 단백질은 Rep78 및 Rep68의 기능을 변형시킨다. cap 유전자는 캡시드 단백질 VP1, VP2, 및 VP3을 코딩한다. cap 유전자는 p40 프로모터로부터 전사된다.
본원에서는 또한 하나 이상의 조절 서열에 작동가능하게 연결된, 본원에 개시된 바와 같은 IL-31 결합 분자를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 발현 작제물을 개시한다.
용어 "구축물"은 상이한 공급원으로부터의 하나 이상의 단리된 핵산 서열을 포함하는 재조합 유전 분자를 지칭한다. 따라서, 구축물은 기원이 다른 2개 이상의 핵산 서열이 단일 핵산 분자로 어셈블리된 키메라 분자이며, (1) 자연에서 함께 발견되지 않는 조절 및 코딩 서열을 포함하는 핵산 서열 (즉, 뉴클레오티드 서열 중 적어도 하나는 이의 다른 뉴클레오티드 서열 중 적어도 하나에 대해 이종성이다), 또는 (2) 기능성 RNA 분자의 부분, 또는 자연적으로 인접하지 않은 단백질을 코딩하는 서열, 또는 (3) 자연적으로 인접하지 않은 프로모터의 부분을 함유하는 임의의 구축물을 포함한다. 대표적인 구축물은 임의의 공급원으로부터 유래되고, 게놈 통합 또는 자율 복제가 가능하고, 하나 이상의 핵산 분자가 작동가능하게 연결되어 있는 핵산 분자를 포함하는, 임의의 재조합 핵산 분자, 예컨대, 플라스미드, 코스미드, 바이러스, 자율 복제 폴리뉴클레오티드 분자, 파지, 또는 선형 또는 고리형 단일 가닥 또는 이중 가닥 DNA 또는 RNA 핵산 분자를 포함한다. 본 발명의 구축물은 일반적으로 예컨대, 예를 들어, 표적 핵산 서열 또는 조정인자 핵산 서열과 같은 구축물에 또한 함유되어 있는 관심 핵산 서열의 발현을 지시하는 데 필요한 요소를 포함할 것이다. 상기 요소는 (관심 핵산 서열의 전사를 지시하기 위해) 관심 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터와 같은 제어 요소 또는 조절 서열을 포함할 수 있으며, 종종 폴리아데닐화 서열도 또한 포함한다. 본 발명의 특정 실시양태 내에서, 구축물은 벡터 내에 포함될 수 있다. 구축물의 성분 외에도, 벡터는 예를 들어, 하나 이상의 선별가능한 마커, 하나 이상의 복제 기점, 예컨대, 원핵생물 및 진핵생물의 기점, 적어도 하나의 다중 클로닝 부위, 및/또는 구축물의 숙주 세포의 게놈 내로의 안정적인 통합을 용이하게 하는 요소를 포함할 수 있다. 2개 이상의 구축물은 단일 핵산 분자, 예컨대, 단일 벡터 내에 포함될 수 있거나, 또는 22개 이상의 별개의 핵산 분자, 예컨대, 2개 이상의 별개의 벡터 내에 포함될 수 있다. "발현 작제물"은 일반적으로 관심 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 적어도 제어 서열을 적어도 포함한다. 이러한 방식으로, 예를 들어, 발현되는 뉴클레오티드 서열과 작동가능하게 연결된 프로모터는 숙주 세포를 포함하는 유기체 또는 이의 일부에서의 발현을 위해 발현 작제물에 제공된다. 본 발명의 실시를 위해, 구축물 및 숙주 세포를 제조하고, 사용하기 위한 통상적인 조성물 및 방법은 당업자에게 널리 공지되어 있고, 예를 들어, [Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edition Volumes 1, 2, and 3. J. F. Sambrook, D. W. Russell, and N. Irwin, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2000]을 참조한다.
본원에서 사용되는 바, "제어 요소," "제어 서열," "조절 서열" 등은 특정 숙주 세포에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열의 발현에 필요한 핵산 서열 (예컨대, DNA)을 의미한다. 예를 들어, 원핵 세포에 적합한 제어 서열은 프로모터, 및 임의적으로, 시스 작용 서열, 예컨대, 오퍼레이터 서열 및 리보솜 결합 부위를 포함한다. 진핵 세포에 적합한 제어 서열은 전사 제어 서열, 예컨대, 프로모터, 폴리아데닐화 신호, 전사 인핸서, 번역 제어 서열, 예컨대, 번역 인핸서 및 내부 리보솜 결합 부위 (IRES), mRNA 안정성을 조정하는 핵산 서열 뿐만 아니라, 전사된 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된 생성물을 세포 내의 세포내 구획으로 또는 세포외 환경으로 표적화하는 표적화 서열을 포함한다.
본원에서는 또한 본원에서 정의된 바와 같은 구축물을 포함하는 숙주 세포를 개시한다.
용어 "숙주," "숙주 세포," "숙주 세포주" 및 "숙주 세포 배양물"은 상호교환적으로 사용되고, 이는 외인성 핵산이 도입된 세포 (상기 세포의 자손 포함)를 지칭한다. 숙주 세포는 1차 형질전환된 세포 및 계대수에 관계없이, 이로부터 유래된 자손을 포함하여, "형질전환체" 및 "형질전환된 세포"를 포함한다. 자손은 핵산 함량이 모체 세포와 완전히 동일하지 않을 수 있지만, 돌연변이를 포함할 수 있다. 원래 형질전환된 세포에서 스크리닝되거나, 선택된 것과 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 갖는 돌연변이체 자손이 본원에 포함된다. 숙주 세포는 본 발명의 항원 결합 분자를 생성하는 데 사용될 수 있는 임의의 타입의 세포 시스템이다. 숙주 세포는 몇 가지 예를 들자면, 배양된 세포, 예컨대, 포유동물 배양된 세포, 예컨대, CHO 세포, BHK 세포, NS0 세포, SP2/0 세포, YO 골수종 세포, P3X63 마우스 골수종 세포, PER 세포, PER.C6 세포 또는 하이브리도마 세포, 효모 세포, 곤충 세포 및 식물 세포 뿐만 아니라, 트랜스제닉 동물, 트랜스제닉 식물 또는 배양된 식물 또는 동물 조직 내에 포함된 세포도 포함한다. 한 실시양태에서, 숙주 세포는 CHO 또는 HEK293 세포주이다.
본원에 개시된 숙주 세포를 배양하는 단계, 및 숙주 세포 또는 배양 배지로부터 IL-31 결합 분자를 회수하는 단계를 포함하는, 본원에 기술된 바와 같은 변형된 IL-31 결합 분자를 제조하는 방법 또한 제공한다.
본원에서는 또한 본원에 기술된 바와 같은 IL-31 결합 분자 또는 벡터, 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물도 개시한다.
본원 다른 곳에서 언급된 바와 같이, 본 발명자들은 본원에 개시된 IL-31 결합 분자가 임의의 공지된 IL-31 항원 결합 분자에 의해 결합되지 않는 IL-31의 에피토프에; 구체적으로, 서열 번호: 1의 아미노산 잔기 L29, Y32, Q33 및 P40을 포함하는 IL-31의 에피토프에 결합한다는 것을 발견하였다. 상기 IL-31의 에피토프를 확인함에 따라 유리하게는 확인된 에피토프 또는 이의 유사체를 면역원성 조성물이 대상체에게 투여될 때 면역 반응을 유도하기 위한 면역원성 조성물로서 사용할 수 있게 허용된다. 따라서, 본원에 개시된 한 측면에서, IL-31에 대한 면역 반응을 일으킬 수 있는 면역원성 조성물로서, 여기서, 조성물은 (i) IL-31의 B 세포 에피토프를 포함하는 면역원 및 (ii) 제약상 허용되는 담체를 포함하고, 여기서, B 세포 에피토프는 서열 번호: 1의 아미노산 위치 29-40에 상응하는 아미노산 서열, 또는 이와 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 여기서, 면역원은 천연 IL-31 분자의 아미노산 서열을 포함하지 않는 것인, 면역원성 조성물을 제공한다. 한 실시양태에서, 면역원은 서열 번호: 1의 아미노산 위치 29-40에 상응하는 아미노산 서열, 또는 이와 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 구성된다. 또 다른 실시양태에서, 면역원은 서열 번호: 1의 아미노산 위치 29-40에 상응하는 아미노산 서열로 구성된다. 본원 다른 곳에서 언급된 바와 같이, "적어도 80%의 서열 동일성"에 대한 언급은 예를 들어, 최적의 정렬 또는 최적합 분석 후, 참조 서열과의 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 포함한다.
"제약상 허용되는 담체"는 생물학적으로 또는 달리 비바람직한 것이 아닌 물질로 구성된 제약 비히클을 의미하며, 즉, 물질은 임의의 또는 실질적인 부작용을 일으키지 않고 선택된 활성제와 함께 대상체에게 투여될 수 있다. 담체는 부형제, 및 다른 첨가제, 예컨대, 희석제, 계면활성제, 착색제, 습윤화제 또는 유화제, pH 완충화제, 보존제 등을 포함할 수 있다.
당업계의 숙련가에게 공지되어 있는 바와 같이, 대표적인 제약상 허용되는 담체는 임의의 모든 용매, 분산 매질, 코팅, 계면활성제, 항산화제, 보존제 (예컨대, 항박테리아제, 항진균제), 등장화제, 흡수 지연제, 염, 보존제, 약물, 약물 안정화제, 겔, 결합제, 부형제, 붕해제, 윤활제, 감미제, 향미제, 염료, 예컨대, 유사 물질 및 이의 조합을 포함한다 (예를 들어, 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company, 1990, pp. 1289-1329] (본원에서 참조로 포함) 참조)). 단, 임의의 통상적인 담체가 활성 성분(들)과 양립하지 없는 한, 제약 조성물에서의 이의 사용이 고려된다.
제약 조성물은 다양한 형태일 수 있다. 이는 예를 들어, 액체, 반고체 및 고체 투여 형태, 예컨대, 액상 액제 (예컨대, 주사액 및 주입액), 분산제 또는 현탁제, 리포솜 및 좌제를 포함한다. 바람직한 형태는 의도된 투여 모드 및 치료 적용에 의존한다. 적합한 제약 조성물은 정맥내, 피하 또는 근육내로 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 조성물은 주사가능하거나, 또는 주입가능한 액제 형태이다. 바람직한 투여 모드는 비경구 (예컨대, 정맥내, 피하, 복강내, 근육내) 투여이다. 구체적인 실시양태에서, 제약 조성물은 정맥내 주입 또는 주사에 의해 투여된다. 다른 실시양태에서, 제약 조성물은 근육내 또는 피하 주사에 의해 투여된다.
본원에서 사용되는 바, "비경구 투여" 및 "비경구적으로 투여된"이라는 어구는 일반적으로 주사에 의한 장내 및 국소 투여 이외의 투여 모드를 의미하며, 제한 없이, 정맥내, 근육내, 동맥내, 척수강내, 피막내, 안와내, 심장내, 피내, 복강내, 기관내, 피하, 표피하, 관절내, 피막하, 지주막하, 척수내, 경막외 및 흉골내 주사 및 주입을 포함한다.
비경구 투여용 제제는 멸균 수성 또는 비수성 액제, 현탁제 및 에멀젼을 포함한다. 비수성 용매의 예로는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 식물성 오일, 예컨대, 올리브 오일 및 주사가능한 유기 에스테르, 예컨대, 에틸 올레이트가 있다. 수성 담체로는 물, 알콜성/수성 용액, 에멀젼 또는 현탁액 (염수 및 완충처리된 매질 포함)을 포함한다. 본 발명에서, 제약상 허용되는 담체는 0.01-0.1 M 및 바람직하게, 0.05 M 포스페이트 완충제 또는 0.8% 염수를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 다른 일반적인 비경구 비히클로는 인산나트륨 용액, 링거 덱스트로스, 덱스트로즈 및 염화나트륨, 락테이트 링거 또는 고정 오일을 포함한다. 정맥내 주사 비히클은 유체 및 영양 보충제, 예컨대, 링거 덱스트로스에 기초한 것과 같은 전해질 보충제 등을 포함한다. 예컨대, 예를 들어, 항미생물제, 항산화제, 킬레이트제 및 불활성 가스 등과 같은 보존제 및 다른 첨가제 또한 존재할 수 있다.
더욱 특히, 주사용에 적합한 제약 조성물은 멸균 수성 액제 (수용성인 경우) 또는 분산제, 및 멸균 주사용 액제 또는 분산제의 즉석 제조를 위한 멸균 산제를 포함한다. 상기 경우, 조성물은 멸균 상태여야 하고, 쉽게 주사할 수 있을 정도로 유동적이어야 한다. 이는 제조 및 보관 조건하에서 안정적이어야 하며, 바람직하게는 예컨대, 박테리아 및 진균과 같은 미생물의 오염 작용으로부터 보존될 것이다. 담체는 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올 (예컨대, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등) 및 이의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 적절한 유동성은 예를 들어, 예컨대, 레시틴과 같은 코팅의 사용 및/또는 필요한 입자 크기의 유지에 의해 유지될 수 있다. 구체적인 실시양태에서, 본 개시내용의 작용제는 세포 전달을 위한 비히클에 접합될 수 있다. 상기 실시양태에서, 작용제는 작용제의 표적 세포로의 전달을 돕기 위해, 작용제의 안정성을 증가시키기 위해, 또는 작용제의 잠재적인 독성을 최소화시키기 위해 적합한 비히클에 캡슐화될 수 있다. 당업자에 의해 인식되는 바와 같이, 다양한 비히클이 본 개시내용의 작용제를 전달하는 데 적합하다. 적합한 구조화된 유체 전달 시스템의 비제한적 예는 나노입자, 리포솜, 마이크로에멀젼, 미셀, 덴드리머 및 다른 인지질 함유 시스템을 포함할 수 있다. 본 개시내용의 작용제를 전달 비히클로 도입시키는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 다양한 실시양태가 하기 제시되지만, 본원에 기술된 바와 같은 항원 결합 분자를 전달 비히클로 도입시키는 당업계에 공지된 다른 방법이 고려된다는 것을 이해할 것이다.
투여 요법은 최적의 원하는 반응 (예컨대, 치료 반응)을 제공하도록 조정된다. 예를 들어, 단일 볼루스가 투여될 수 있거나, 수 개의 분할된 용량이 시간 경과에 따라 투여될 수 있거나, 또는 용량은 치료 상황의 긴급성에 의해 지시된 바와 같이 비례적으로 감소 또는 증가될 수 있다. 본 개시내용의 항원 결합 분자는 수 회에 걸쳐 투여될 수 있다. 단일 투여 사이의 간격은 매일, 매주, 매월 또는 매년일 수 있다. 간격은 환자에서의 변형된 폴리펩티드 또는 항원의 혈중 수치를 측정함으로써 지시되는 바와 같이 불규칙적일 수도 있다. 대안적으로, 항원 결합 분자는 서방성 제제로 투여될 수 있으며, 이 경우 덜 빈번한 투여가 요구된다. 투여량과 빈도는 환자에서의 폴리펩티드 반감기에 따라 달라진다.
투여의 용이성 및 투여량의 균일성을 위해 투여 단위 형태로 조성물을 제제화하는 것이 유리할 수 있다. 본원에서 사용되는 바, 투여 단위 형태는 치료하고자 하는 대상체에 대한 단일 투여량으로 적합화된 물리적으로 분리된 단위를 지칭하며; 각 단위는 필요한 제약상 허용되는 담체와 함께 원하는 치료 효과를 생성하도록 계산된 미리 결정된 양의 활성 화합물을 함유한다. 본 발명의 투여 단위 형태에 대한 사양은 (a) 활성 화합물의 고유한 특징 및 달성하고자 하는 특정 치료 효과, 및 (b) 개체의 민감성 치료를 위한 상기 활성 화합물을 배합하는 분야에 내재된 제한에 의해 지시되고, 직접적으로 의존한다.
항원 결합 분자의 투여량 및 치료 요법은 당업자에 의해 결정될 수 있다. 특정 실시양태에서, 항원 결합 분자는 약 0.01 내지 40 mg/kg, 예컨대, 0.01 내지 0.1 mg/kg, 예컨대, 약 0.1 내지 1 mg/kg, 약 1 내지 5 mg/kg, 약 5 내지 25 mg/kg, 약 10 내지 40 mg/kg, 또는 약 0.4 mg/kg의 용량으로 (예컨대, 피하 또는 정맥내) 주사에 의해 투여된다. 투여 스케줄링은 예컨대, 주 1회 내지 2, 3 또는 4주마다 1회로 다양할 수 있다. 한 실시양태에서, 항원 결합 분자는 격주로 약 10 내지 20 mg/kg의 용량으로 투여된다. 본 개시내용의 항원 결합 분자의 유효량에 대한 예시적이고 비제한적인 범위는 0.01-5 mg/kg, 더욱 적합하게, 0.03-2 mg/kg이다.
투여량 값은 완화시키고자 하는 병태의 유형 및 중증도에 따라 달라질 수 있음에 주의하여야 한다. 임의의 특정 대상체에 대한 특정 투여 요법은 개인의 필요 및 조성물을 투여하거나, 투여를 감독하는 사람의 전문적 판단에 따라 시간에 따라 조정되어야 하며, 본원에 제시된 투여량 범위는 단지 예시적인 것이고, 청구된 조성물의 범주 및 실행을 제한하려는 의도가 아님을 추가로 이해하여야 한다.
본 발명의 제약 조성물은 유효량의 본원에 개시된 작용제 (즉, IL-31 결합 분자)를 포함할 수 있다. 유효량은 "치료 유효량" 또는 "예방 유효량"일 수 있다. "치료 유효량"은 원하는 치료 결과를 달성하기 위해 필요한 기간 동안 투여량에서 효과적인 양을 지칭한다. 작용제의 치료 유효량은 개체의 질환 상태, 연령, 성별 및 체중, 및 개체에서 원하는 반응을 유도할 수 있는 작용제의 능력과 같은 인자에 따라 달라질 수 있다. 치료 유효량은 또한 작용제의 임의의 독성 또는 해로운 효과를 치료상 유익한 효과가 능가하는 양이다. 대안적으로, 조성물의 이러한 특성은 예를 들어, 숙련된 실무자에게 공지된 검정에 의해 시험관내에서 화합물의 억제 능력을 조사함으로써 평가될 수 있다.
대조적으로, "예방 유효량"은 원하는 예방적 결과를 달성하기 위해 필요한 기간 동안 투여량에서 효과적인 양을 지칭한다. 전형적으로, 예방 용량은 질환 이전 또는 질환의 초기 단계에서 대상체에서 사용되기 때문에, 예방 유효량은 치료 유효량보다 적을 것이다.
본원에서는 또한 IL-31의 발현 증가 및/또는 이의 활성 증가와 연관된 병태의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에게 본원에 기술된 바와 같은, 항원 결합 분자, 벡터 또는 제약 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, IL-31의 발현 증가 및/또는 이의 활성 증가와 연관된 병태를 치료 또는 예방하는 방법도 개시한다.
본원에서 사용되는 바, "치료하는"이라는 용어는 (1) 병태의 하나 이상의 증상의 출현을 지연시키는 것; (2) 병태 또는 병태의 하나 이상의 증상의 발생을 억제시키는 것; (3) 병태를 경감시키는 것, 즉, 병태 또는 병태의 적어도 하나 이상의 증상의 퇴행을 유발하는 것; 및/또는 (4) 병태 또는 병태의 하나 이상의 증상의 중증도를 감소시키는 것을 지칭할 수 있다.
용어 "치료하는," "치료" 등은 본원에서 상호교환적으로 사용하며, 병태의 하나 이상의 증상을 포함하여, 증상을 경감, 감소, 완화, 호전, 또는 다르게는 억제시키는 것을 의미한다. 용어 "예방하다," "예방하는," "예방," "예방적," "방지적" 등은 본원에서 상호교환적으로 사용하며, 병태의 발병 또는 병태의 발생 위험을 예방하거나, 또는 지연시키는 것을 의미한다.
용어 "치료하는," "치료" 등은 또한 적어도 일정 기간 동안 병태의 효과를 경감, 감소, 완화, 호전, 또는 다르게는 억제시키는 것을 포함한다. 용어 "치료하는," "치료" 등은 병태 또는 이의 증상이 영구적으로 경감, 감소, 완화, 호전, 또는 다르게는 억제됨을 의미하지 않으며, 따라서, 병태 또는 이의 증상의 일시적인 경감, 감소, 완화, 호전, 또는 다르게는 억제도 포함한다는 것도 이해하여야 한다.
본원에서 상호교환적으로 사용되는 용어 "대상체," "환자," "숙주" 또는 "개체"는 치료가 필요한 임의의 동물을 지칭한다. 대상체는 전형적으로 포유동물, 조류 및 어류를 포함하나, 이에 제한되지 않는, 비인간 대상체를 포함할 것이고, 적합하게는 가축, 농장, 동물원 및 야생 동물, 예컨대, 예를 들어, 소, 돼지, 말, 염소, 양 또는 다른 유제 동물, 개, 고양이, 닭, 오리, 비인간 영장류, 기니아 피그, 토끼, 흰족제비, 래트, 햄스터 및 마우스를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 한 실시양태에서, 대상체는 개과, 고양이과 및 말과로 구성된 군으로부터 선택된다. 한 실시양태에서, 대상체는 개과이다. 한 실시양태에서, 대상체는 고양이과이다. 한 실시양태에서, 대상체는 말과이다.
IL-31의 비정상적인 (예컨대, 증가된) 수준 및/또는 비정상적인 (예컨대, 증가된) 활성과 연관된 병태는 당업자에게 친숙할 것이며, 이의 예시적인 예로는 만성 소양성 피부 장애, 예컨대, 아토피성 습진, 및 비피부과적 병태, 예컨대, 알레르기성 천식 및 비염, 염증성 장 질환, 악성 종양 (예컨대, 암), 및 골다공증을 포함한다.
한 실시양태에서, IL-31의 발현 증가 및/또는 이의 활성 증가와 연관된 병태는 소양증 및 피부염(dermatitis)으로 구성된 군으로부터 선택된다. 한 실시양태에서, 병태는 아토피성 피부염이다. 한 실시양태에서, 병태는 소양증이다.
본원에서는 또한 대상체에서 IL-31의 발현 증가 및/또는 이의 활성 증가와 연관된 병태의 치료, 억제 또는 호전에서 사용하기 위한 본원에 기술된 항원 결합 분자, 또는 벡터도 개시한다.
본원에서는 또한 본원에 기술된 바와 같이 IL-31의 비정상적인 (예컨대, 증가된) 수준 및/또는 비정상적인 (예컨대, 증가된) 활성과 연관된 병태의 치료, 억제 또는 호전을 필요로 하는 대상체에서 IL-31의 비정상적인 (예컨대, 증가된) 수준 및/또는 비정상적인 (예컨대, 증가된) 활성과 연관된 병태의 치료, 억제 또는 호전용 의약 제조에서의 본원에 기술된 IL-31 결합 분자, 또는 벡터의 용도도 제공한다.
본원에서는 또한 IL-31의 발현 증가 또는 IL-31에 대한 감수성 증가에 의해 유발되거나, 이와 연관되거나, 또는 이로부터 발생한 병태의 치료 또는 예방을 필요로 하는 개과 대상체에게 본원에 기술된 IL-31 결합 분자, 또는 벡터를 투여하는 단계를 포함하는, IL-31의 발현 증가 또는 IL-31에 대한 감수성 증가에 의해 유발되거나, 이와 연관되거나, 또는 이로부터 발생한 병태의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 IL-31의 발현 증가 또는 IL-31에 대한 감수성 증가에 의해 유발되거나, 이와 연관되거나, 또는 이로부터 발생한 병태를 치료 또는 예방하는 방법도 개시한다.
본원에서는 또한 대상체에서 IL-31의 발현 증가 또는 IL-31에 대한 감수성 증가에 의해 유발되거나, 이와 연관되거나, 또는 이로부터 발생한 병태의 치료에서 사용하기 위한, 본원에 기술된 IL-31 결합 분자, 또는 벡터 또는 제약 조성물도 개시한다.
본 개시내용은 또한 대상체에서 IL-31의 발현 증가 또는 IL-31에 대한 감수성 증가에 의해 유발되거나, 이와 연관되거나, 또는 이로부터 발생한 병태 치료용 의약 제조에서의 본원에 기술된 IL-31 결합 분자, 또는 벡터의 용도로 확장된다.
본 개시내용은 또한 IL-31에 의해 증식하도록 유도된 종양 및 이와 연관된 병태의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에게 본원에 기술된 IL-31 결합 분자, 또는 벡터 또는 제약 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, IL-31에 의해 증식하도록 유도된 종양 및 이와 연관된 병태를 치료 또는 예방하는 방법으로 확장된다.
본원에서는 또한 IL-31에 의해 증식하도록 유도된 종양 및 이와 연관된 병태의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에서의 IL-31에 의해 증식하도록 유도된 종양 및 이와 연관된 병태의 치료 또는 예방에서 사용하기 위한 본원에 기술된 IL-31 결합 분자, 또는 벡터 또는 제약 조성물도 제공한다.
본 개시내용은 또한 IL-31에 의해 증식하도록 유도된 종양 및 이와 연관된 병태의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에서의 IL-31에 의해 증식하도록 유도된 종양 및 이와 연관된 병태를 치료 또는 예방하기 위한 의약 제조에서의, 본원에 기술된 IL-31 결합 분자, 또는 벡터의 용도로 확장된다.
본 개시내은 또한 본원에 기술된 IL-31 결합 분자, 또는 벡터 또는 제약 조성물을 포함하는 키트로 확장된다.
본원에서는 또한 샘플 중 IL-31 검출을 위한, 본원에 기술된 IL-31 결합 분자, 또는 벡터의 용도도 개시한다.
본원에서 사용되는 바, "및/또는"은 연관된 열거된 항목 중 하나 이상의 것의 임의의 및 모든 가능한 조합 뿐만 아니라, 대안 (또는)으로 해석될 때, 조합의 결여를 지칭하고, 포함한다.
본 출원에서 사용되는 바, "하나"("a," "an") 및 "그"라는 단수 형태는 문맥상 명백하게 달리 지시하지 않는 한, 복수의 지시 대상을 포함한다. 예를 들어, "작용제"라는 용어는 이들의 혼합물을 포함하는 복수의 작용제를 포함한다.
"약"은 참조 정량, 수준, 값, 수치, 빈도, 백분율, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이 대비 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1% 정도만큼 상이한 정량, 수준, 값, 수치, 빈도, 백분율, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이를 의미한다.
문맥이 달리 요구하지 않는 한, 본 명세서 및 이어지는 진술 전체에 걸쳐, 단어 "포함하다(comprise)" 및 예컨대, "포함하다(comprises)" 및 "포함하는"과 같은 어미 변형은 언급된 정수 또는 단계 또는 정수들 또는 단계들 그룹의 포함을 암시하지만, 임의의 다른 정수 또는 단계 또는 정수들 또는 단계들 그룹의 제외를 암시하는 것은 아님을 이해할 것이다.
본 명세서에서의 임의의 선행 공개문헌 (또는 이로부터 얻은 정보) 또는 공지된 임의의 사안에 대한 참조는 상기 선행 공개문헌 (또는 이로부터 얻은 정보) 또는 공지된 사안이 본 명세서와 관련된 노력의 분야에서 통상의 일반 지식의 일부를 형성한다는 것의 인정 또는 시인 또는 임의의 형태의 제안으로 간주되지 않고, 이와 같이 간주되지 않아야 한다.
당업자는 본 명세서에 기술된 본 발명이 구체적으로 기술된 것 이외의 변형 및 수정이 가능하다는 것을 이해할 것이다. 본 발명은 정신 및 범주 내에 속하는 상기 모든 변형 및 수정을 포함한다는 것을 이해하여야 한다. 본 발명은 또한 본 명세서에서 개별적으로 또는 집합적으로 언급되거나 지시된 모든 단계, 특징, 조성물 및 화합물, 및 상기 단계 또는 특징 중 임의의 둘 이상의 임의의 및 모든 조합을 포함한다.
이제 본 발명의 특정 실시양태는 단지 예시 목적으로 의도되고, 본원 상기 기술된 일반성의 범주를 제한하려는 것으로 의도되지 않는 하기 실시예를 참조하여 기술될 것이다.
실시예
실시예 1: 개과 인터루킨 31 (IL- 31)을 인식하는 마우스 모노클로날 항체 생성
C-말단에 6 아미노산 His-태그에 융합된 142개의 아미노산 (수탁 번호(Accession no.) NP_001159386; 서열 번호: 1의 아미노산 잔기 24-159)을 포함하는, Sf9 바큘로바이러스 세포에서 생산된 재조합 개과 IL-31 (프로스펙-타니(ProSpec-Tany: 이스라엘))을 Balb/c 마우스에서 항체를 생성하기 위한 면역원으로서 사용하였다.
개과 IL-31 단백질
효소 결합 면역흡착 검정법 (ELISA)을 사용하여 면역화된 마우스로부터의 항체 역가는 측정하였다. 개과 IL-31 (100 ng/웰)을 폴리스티렌 마이크로플레이트에 고정시키고, 포획 항원으로 사용하고, PBS/0.05% 트윈 20/1% BSA로 차단하였다. 코팅된 웰을 PBS/0.05% 트윈 20/1% BSA (100 ㎕/웰) 중에 희석된 모노클로날 항체 (mAb)와 함께 실온에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 1000 ng/ml 내지 1.37 ng/ml 범위의 mAb 농도를 사용하여 표준 곡선을 확립하였다. 세척 후, 플레이트를 PBS/0.05% 트윈 20/1% BSA 중의 알칼리성 포스파타제-접합된 어피니퓨어(AffiniPure) 염소 항-마우스 IgG (서브클래스 1+2a+2b+3), Fcg 단편 특이 (잭슨 이뮤노 리서치 라보라토리즈, 인크.(Jackson Immuno Research Laboratories, Inc.)) 또는 알칼리성 포스파타제-접합된 토끼 항-개 IgG (전체 분자; 시그마(Sigma))의 1/10,000 희석액과 함께 인큐베이션시켰다. 플레이트를 PBS/0.05% 트윈 20으로 세척하고, 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘 (TMB) 기질을 첨가하여 발색시켰다. 100 ㎕ 2 M H2SO4를 첨가하여 발색을 정지시키고, 450 nm의 광학 밀도 (OD)에서 각 웰의 흡광도를 측정하였다.
개과 IL-31 단백질 (서열 번호: 1)로 면역화된 3마리 마우스의 비장을 표준 기술을 사용하여 단리시키고, 하이브리도마 생성을 위해 개별적으로 사용하였다 (예를 들어, 문헌 [Albitar (2007; Methods in Molecular Biology; Monoclonal Antibodies Volume 378 || Development and Characterization of Mouse Hybridomas, 10.1007/978-1-59745-323-3 (Chapter 1)] 참조). 융합 후, 하이브리도마를 다중웰 플레이트에 플레이팅하였다. 마이크로어레이 ELISA 포맷을 이용하여 6000개의 웰을 개과 IL-31에의 결합에 대해 스크리닝하였다.
스크리닝 동안 확인된 후보 중 한 하이브리도마는 개과 IL-31에의 우수한 결합 및 개과 IL-31 활성의 우수한 억제를 나타내었다. 이어서, 상기 하이브리도마를 클로닝되고, 시퀀싱하였다 (클론 명칭 RA4.D2).
RA4.D2에 대한 서브클론의 중쇄 가변 영역 (VH) 및 경쇄 가변 영역 (VL)의 서열은 하이브리도마로부터 수득된 cDNA로부터의 VH 및 VL 영역의 PCR 증폭에 의해 수득하였다. IMGT/V-Questprogram (더 인터내셔널 이뮤노제네틱스 인포메이션 시스템(The International Immunogenetics Information System); http://www.imgt.org/IMGT_vquest/vquest)을 이용하여 VH 및 VL 유전자 서열의 분석을 수행하였다.
키메라 항체, chRA4를 제조하기 위해, 하기 제시된 바와 같이, 뮤린 모노클로날 항체 RA4의 중쇄 가변 서열을 (진뱅크(GenBank): AAL35301의 아미노산 위치 138-468에 상응하는) 서열 번호: 2의 개과 면역글로불린 감마 중쇄 A의 불변 영역에 융합시키고, 경쇄 가변 서열을 IMGT (수탁 번호 IMGT000067)로부터의 IGKC*01 대립유전자에 상응하는 불변 영역에 융합시켰다:
뮤린 모노클로날 항체 RA4.D2 중쇄 ( VH ) 및 경쇄 ( VL ) 가변 영역의 아미노산 서열 (CDR 서열 (IMGT 확인)은 밑줄체로 표시)
뮤린 모노클로날 항체 RA4.D2의 중쇄 ( VH ) 및 경쇄 ( VL ) 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열
키메라 RA4.D2 항체의 중쇄 (HC) 및 경쇄 (LC) 영역의 아미노산 서열
개과화된 RA4 모노클로날 항체를 제조하기 위해, 뮤린 모노클로날 항체 RA4의 중쇄 및 경쇄 가변 서열의 프레임워크 영역을 개과 중쇄 및 경쇄 프레임워크 영역으로 치환하였다. BLAST 검색 알고리즘을 사용하여 뮤린 중쇄 및 경쇄 가변 도메인과 비교하기 위해 개과 항체 서열을 검색하였고, 상위 200개의 BLAST 결과로부터 후보 개과 가변 도메인을 선택하였다. 중요한 프레임워크 잔기 및 정규 루프 구조를 유지하면서, 프레임워크 상동성의 조합을 기반으로 상위 후보를 선택하였다.
개과화된 RA4 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 하기 제시되어 있다:
RA4 개과화된 중쇄
RA4 개과화된 경쇄
고양이과화된 RA4 모노클로날 항체를 제조하기 위해, 뮤린 모노클로날 항체 RA4의 중쇄 및 경쇄 가변 서열의 프레임워크 영역을 고양이과 중쇄 및 경쇄 프레임워크 영역 서열로 치환하였다. BLAST 검색 알고리즘을 사용하여 뮤린 중쇄 및 경쇄 가변 도메인과 비교하기 위해 고양이과 항체 서열을 검색할 것이고, 상위 200개의 BLAST 결과로부터 후보 고양이과 가변 도메인을 선택할 것이다. 중요한 프레임워크 잔기 및 정규 루프 구조를 유지하면서, 프레임워크 상동성의 조합을 기반으로 상위 후보를 선택할 것이다.
실시예 2: 모노클로날 항체 RA4의 개과 IL-31, 고양이과 IL-31 및 개과 IL-31 돌연변이체에의 결합 측정
뮤린 모노클로날 항체 RA4가 이전에 공개된 항-IL-31 항체, M14 (미국 특허 번호 10,093,731 B2에 기술) 및 mAb 34D03 (미국 특허 번호 8790651 B2에 기술)에 의해 표적화된 개과 IL-31의 영역에 결합하였는지 여부를 평가하기 위해, (i) 서열 번호: 1의 아미노산 위치 76, 77, 80, 81 및 84 (개과 IL-31 돌연변이체 1; 서열 번호: 62) 및 (ii) 서열 번호: 1의 아미노산 위치 13, 15, 20 및 26 (개과 IL-31 돌연변이체 2; 서열 번호: 63)에 도입된 알라닌 치환을 이용하여 2개의 돌연변이체 개과 IL-31 단백질을 생성하였다. 알라닌 치환을 위해 표적화된 개과 IL-31 돌연변이체 1 및 2의 아미노산 위치는 이전에 각각 개과 IL-31에의 34D03 및 M14의 결합에 관여하는 것으로 확인되었다.
개과 IL-31 돌연변이체 1 및 2, 및 고양이과 IL-31 단백질의 아미노산 서열은 하기 제공되어 있다:
개과 IL-31 돌연변이체 1 (알라닌 치환은 굵은 밑줄체 텍스트로 식별 표시되어 있다).
개과 IL-31 돌연변이체 2 (알라닌 치환은 굵은 밑줄체 텍스트로 식별 표시되어 있다).
고양이과 IL-31
정제된 뮤린 RA4 및 재조합 키메라 RA4 mAb를 상기 기술된 바와 같이 ELISA에 의해 개과 IL-31에의 결합에 대하여 분석하였다. 도 1에 제시된 바와 같이, 키메라 항체 RA4 (chRA4)는 ELISA에 의해 측정된 바와 같이, 용량에 의존하는 방식으로 개과 IL-31에 결합하였다. 상기 결합 데이터와 일관되게, chRA4는 개과 DH82 세포에서 개과 IL-31-유도된 STAT-3 인산화의 억제에 의해 입증되는 바와 같이, 시험관내에서 개과 IL-31 활성을 중화시키는 것으로 나타났다 (도 2). 개과 단핵구 세포주에서 IL-31 매개 pSTAT3 신호전달을 중화시킬 수 있는 RA4 mAb의 능력을 하기와 같이 평가하였다: 개과 DH-82 세포를 10 ng/mL의 개과 감마 인터페론으로 24시간 동안 전처리한 후, 이어서, 2시간 동안 혈청을 고갈시켰다. 세포 상청액을 60분 동안 개과 IL-31 (160 ng/mL)과 함께 인큐베이션시켰다. 이어서, RA4/IL-31 믹스를 5 min 동안 세포에 첨가하고, pSTAT3 ELISA (STAT-3 (포스포) [pY705] 다종 ELISA 키트, 인비트로겐(Invitrogen))를 이용하여 STAT 인산화를 평가하였다.
RA4 mAb가 이전에 공개된 항-IL-31 항체 M14 및 34D03에 의해 표적화된 개과 IL-31의 영역에 결합하였는지 여부를 평가하기 위해, (i) 서열 번호: 1의 아미노산 위치 76, 77, 80, 81 및 84 (개과 IL-31 돌연변이체 1; 서열 번호: 62) 및 (ii) 서열 번호: 1의 아미노산 위치 13, 15, 20 및 26 (개과 IL-31 돌연변이체 2; 서열 번호: 63)에 도입된 알라닌 치환을 이용하여 2개의 돌연변이체 개과 IL-31 단백질을 생성하였다.
도 3에 제시된 바와 같이, RA4는 개과 IL-31, 고양이과 IL-31 (서열 번호: 64)에, 및 개과 IL-31 돌연변이체 단백질, 돌연변이체 1 (서열 번호: 62) 및 돌연변이체 2 (서열 번호: 63), 둘 모두에 결합하였다. M14는 개과 IL-31 및 개과 IL-31 돌연변이체 1에 결합하였지만, 개과 IL-31 돌연변이체 2에 대해서는 유의적인 결합을 보이지 않았다. M14는 고양이과 IL-31에 대해서는 최소 결합을 보인다. 34D03은 또한 개과 IL-31에 결합하였고, 더 적은 정도로 고양이과 IL-31에 결합하였지만, 돌연변이체 1 또는 돌연변이체 2 중 어느 것에도 유의적인 결합을 보이지 않았다. 본 연구에서 RA4는 인간 IL-31에 결합하지 않았다.
실시예 3: 항- caIL -31 mAb 클론 RA4에 대한 개과 인터루킨 31 ( caIL -31) 상의 결합 에피토프 확인
상기 실시예 2에서 언급된 바와 같이, 뮤린 RA4 mAb는 항-개과 IL-31 mAb M14 및 34D03의 결합에 관여하는 중요한 잔기에 결합하지 않는다.
RA4에 결합하는 개과 IL-31의 영역을 정의하기 위해, 하기 제시되는 바와 같이, 다수의 키메라 및 말단절단된 개과 IL-31 펩티드를 생성하였다 (도 4a 또한 참조). 인간 IL-31 유래된 아미노산 서열은 밑줄체 텍스트로 식별 표시되어 있다:
도 5에서 확인된 개과 IL-31 단백질의 아미노산 서열은 하기와 같다:
도 7에서 확인된 개과 IL-31 단백질의 아미노산 서열은 하기와 같다:
다양한 IL-31 단백질 및 펩티드에의 결합을 ELISA에 의해 평가하였다. IL-31 단백질 또는 펩티드 (100 ng/웰)를 포획 항원으로서 폴리스티렌 마이크로플레이트에 고정화시켰다. 웰을 PBS/0.05% 트윈 20/1% BSA로 차단하였다. 코팅된 웰을 PBS/0.05% 트윈 20/1% BSA (100 ㎕/웰) 중에 희석된 항-IL-31 mAb와 함께 실온에서 1 h 동안 인큐베이션시켰다. 세척 후, 플레이트를 PBS/0.05% 트윈 20/1% BSA 중의 알칼리성 포스파타제-접합된 토끼 항-개 IgG (전체 분자) (시그마)의 1/10,000 희석액과 함께 인큐베이션시켰다. 플레이트를 PBS/0.05% 트윈 20으로 세척하고, TMB 기질을 첨가하여 발색시켰다. 100 ul ELISA 정지액 (인비트로겐)을 첨가하여 발색을 정지시키고, 450 nm의 광학 밀도 (OD)에서 각 웰의 흡광도를 측정하였다.
도 4b에 제시된 바와 같이, RA4 mAb는 IL-31의 나선 A를 도입하는 개과 IL-31의 처음 49개의 아미노산 (서열 번호: 1)을 함유하는 키메라 개과/인간 IL-31 단백질에 결합한다. 나선 B, C 및 D에 대한 개과 서열을 인간 서열로 대체해도 결합이 중단되지 않았으며, 이는 RA4 mAb의 에피토프가 개과 IL-31의 N-말단 영역에 존재한다는 것을 입증하는 것이다.
RA4 mAb의 에피토프를 추가로 정의하기 위해 20개의 아미노산의 오버랩핑 펩티드를 생성하였다 (도 5a). 도 5b의 ELISA 데이터에 의해 제시된 바와 같이, RA4 mAb는 개과 IL-31의 처음 50개의 아미노산을 함유하는 펩티드, 및 성숙한 개과 IL-31의 아미노산 잔기 30-40을 함유하는 펩티드 3에 결합한다. RA4 mAb가 결합하는 에피토프는 항-개과 IL-31 항체 M14 및 34D03에 의해 표적화되는 에피토프와 상이하다. 34D03은 도 3에서의 데이터와 일관되게, 개과 IL-31의 N-말단 영역에 결합하는 것으로 보이지 않으며, 이는 34D03이 결합하는 에피토프는 나선 B/C에서 발견된다는 것을 제안한다. 그에 반해, M14는 오직 개과 IL-31의 아미노산 잔기 1-20을 포함하는 펩티드 1에만 결합하였다. 본 데이터는 RA4 mAb는 이전에 M14 및 34D03에 대해 기술되지 않은, 개과 IL-31의 고유한 에피토프에 결합한다는 것을 나타낸다.
각각이 상이한 잔기에서 단일 알라닌 돌연변이를 포함하는, 25개의 펩티드로 이루어진, 서열 번호: 1의 아미노산 잔기 18-42를 포함하는 영역의 알라닌-스캐닝 펩티드 라이브러리를 생성하였다 (IILELQPLSRGLLEDYQKKETGVPES; 서열 번호: 79). 상기 설명된 바와 같이, RA4 mAb의 각 펩티드에의 결합을 ELISA에 의해 측정하였다.
각 펩티드에의 결합이 시리즈로 제1 펩티드에의 결합 대비 상대적인 비율로서 제시된 도 6에 제시된 바와 같이, 본 데이터는 알라닌으로 치환되었을 때, RA4의 개과 IL-31에의 결합에 심각한 영향을 미친 4개의 중요한 잔기를 입증한다. L29A, Y32A, Q33A 및 P40A에 상응하는 알라닌 돌연변이 모두 개과 IL-31 펩티드에의 결합을 제1 펩티드 대비 15% 미만으로 감소시켰다. 알라닌 잔기로 치환되었을 때, 결합을 50% 미만으로 감소시킨 (K35A, V39A 및 S42A) 3개의 추가 잔기 또한 개과 IL-31에의 결합에 중요한 것으로 밝혀졌다.
상기 확인된 4개의 주요 잔기가 각각 알라닌으로 치환된 것, 및 4개의 잔기가 모두 조합하여 알라닌으로 치환된 버전을 포함하는 전장 개과 IL-31 단백질에의 RA4 mAb의 결합을 평가함으로써 RA4 mAb에 의해 표적화된 고유한 에피토프를 확인하였다. 일시적인 형질감염 후 포유동물 세포에서 히스티딘-태그부착된 단백질이 생성되었고, 니켈 친화성 크로마토그래피를 통해 정제하였다. 각 단백질에의 RA4 mAb 및 M14 mAb의 결합을 상기 설명된 바와 같이 ELISA에 의해 측정하였다. 도 7에 제시된 바와 같이, 키메라 RA4 mAb는 야생형 개과 IL-31 단백질에의 결합과 비교할 때, 단일 아미노산 알라닌 치환으로 모든 단백질에 결합할 수 있었다 (도 7a). 4개의 잔기가 모두 (L29, Y32, Q33, 및 P40) 조합하여 알라닌으로 치환되었을 때, 개과 IL-31에의 결합이 검출되지 않았다. 그에 반해, M14 mAb는 모든 돌연변이체 단백질 및 야생형 개과 IL-31 단백질에 동일하게 잘 결합하였다. 상기 데이터는 개과 IL-31의 아미노산 잔기 L29, Y32, Q33 및 P40을 포함하는 에피토프 (서열 번호: 1)가 RA4 mAb에 대해 고유하다는 것을 보여주는 것이다.
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<400> 2 Ala Ser Thr Thr Ala Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Cys Gly 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Ser Thr Val Ala Leu Ala Cys Leu Val Ser Gly Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ser Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ser Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu His Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Met Val Thr Val Pro Ser Ser Arg Trp Pro Ser Glu Thr 65 70 75 80 Phe Thr Cys Asn Val Val His Pro Ala Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Pro Val Phe Asn Glu Cys Arg Cys Thr Asp Thr Pro Pro Cys Pro Val 100 105 110 Pro Glu Pro Leu Gly Gly Pro Ser Val Leu Ile Phe Pro Pro Lys Pro 115 120 125 Lys Asp Ile Leu Arg Ile Thr Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val 130 135 140 Leu Asp Leu Gly Arg Glu Asp Pro Glu Val Gln Ile Ser Trp Phe Val 145 150 155 160 Asp Gly Lys Glu Val His Thr Ala Lys Thr Gln Ser Arg Glu Gln Gln 165 170 175 Phe Asn Gly Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Pro Ile Glu His Gln 180 185 190 Asp Trp Leu Thr Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn His Ile Asp 195 200 205 Leu Pro Ser Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Ala Arg Gly Arg Ala 210 215 220 His Lys Pro Ser Val Tyr Val Leu Pro Pro Ser Pro Lys Glu Leu Ser 225 230 235 240 Ser Ser Asp Thr Val Ser Ile Thr Cys Leu Ile Lys Asp Phe Tyr Pro 245 250 255 Pro Asp Ile Asp Val Glu Trp Gln Ser Asn Gly Gln Gln Glu Pro Glu 260 265 270 Arg Lys His Arg Met Thr Pro Pro Gln Leu Asp Glu Asp Gly Ser Tyr 275 280 285 Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Ser Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly 290 295 300 Asp Pro Phe Thr Cys Ala Val Met His Glu Thr Leu Gln Asn His Tyr 305 310 315 320 Thr Asp Leu Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys 325 330 <210> 3 <400> 3 000 <210> 4 <400> 4 000 <210> 5 <400> 5 000 <210> 6 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> monoclonal antibody RD4.D2 - HC_CDR1 <400> 6 Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Ser 1 5 <210> 7 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> monoclonal antibody RD4.D2 - HC_CDR2 <400> 7 Ile Asn Thr Glu Thr Gly Lys Thr 1 5 <210> 8 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> monoclonal antibody RD4.D2 - HC_CDR3 <400> 8 Ala Ser Gly Arg Pro Asp Tyr 1 5 <210> 9 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> monoclonal antibody RD4.D2 - LC_CDR1 <400> 9 Glu Ser Val Glu Tyr Tyr Gly Thr Ser Leu 1 5 10 <210> 10 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> monoclonal antibody RD4.D2 - LC_CDR2 <400> 10 Ala Ala Ser 1 <210> 11 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> monoclonal antibody RD4.D2 - LC_CDR3 <400> 11 Gln Gln Ser Arg Lys Val Pro Tyr Thr 1 5 <210> 12 <211> 114 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> murine monoclonal antibody RA4.D2 - VH <400> 12 Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Ser Met His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Arg Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Glu Thr Gly Lys Thr Ile His Ala Glu Asp Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Ser Gly Arg Pro Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val 100 105 110 Ser Ser <210> 13 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> murine monoclonal antibody RA4.D2 - VL <400> 13 Asp Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Glu Tyr Tyr 20 25 30 Gly Thr Ser Leu Met Gln Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Gly Val Glu Ser Gly Val Pro Ala 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Ile Ile His 65 70 75 80 Pro Val Glu Glu Asp Asp Ile Ala Met Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Arg 85 90 95 Lys Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 110 Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser 115 120 <210> 14 <211> 342 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> murine monoclonal antibody RA4.D2 - Heavy-chain variable region (VH) <400> 14 Cys Ala Gly Ala Thr Cys Cys Ala Gly Thr Thr Gly Gly Thr Gly Cys 1 5 10 15 Ala Gly Thr Cys Thr Gly Gly Ala Cys Cys Thr Gly Ala Gly Cys Thr 20 25 30 Gly Ala Ala Gly Ala Ala Gly Cys Cys Ala Gly Gly Ala Gly Ala Gly 35 40 45 Ala Cys Ala Gly Thr Cys Ala Ala Gly Ala Thr Cys Thr Cys Cys Thr 50 55 60 Gly Cys Ala Ala Gly Gly Cys Thr Thr Cys Thr Gly Gly Thr Thr Ala 65 70 75 80 Thr Ala Cys Cys Thr Thr Cys Ala Cys Ala Gly Ala Cys Thr Ala Thr 85 90 95 Thr Cys Ala Ala Thr Gly Cys Ala Cys Thr Gly Gly Gly Thr Gly Ala 100 105 110 Ala Gly Cys Ala Gly Gly Cys Thr Cys Cys Ala Gly Gly Ala Ala Ala 115 120 125 Gly Gly Gly Thr Thr Thr Ala Ala Gly Gly Thr Gly Gly Ala Thr Gly 130 135 140 Gly Gly Cys Thr Gly Gly Ala Thr Ala Ala Ala Cys Ala Cys Thr Gly 145 150 155 160 Ala Gly Ala Cys Thr Gly Gly Thr Ala Ala Gly Ala Cys Ala Ala Thr 165 170 175 Ala Cys Ala Cys Gly Cys Ala Gly Ala Ala Gly Ala Cys Thr Thr Cys 180 185 190 Ala Ala Gly Gly Gly Ala Cys Gly Gly Gly Thr Thr Gly Cys Cys Thr 195 200 205 Thr Cys Thr Cys Thr Thr Thr Gly Gly Ala Ala Ala Cys Cys Thr Cys 210 215 220 Thr Gly Cys Cys Ala Gly Cys Ala Cys Thr Gly Cys Cys Thr Ala Thr 225 230 235 240 Thr Thr Gly Cys Ala Gly Ala Thr Cys Ala Ala Cys Ala Ala Cys Cys 245 250 255 Thr Cys Ala Ala Ala Ala Ala Thr Gly Ala Gly Gly Ala Cys Ala Cys 260 265 270 Gly Gly Cys Thr Ala Cys Ala Thr Ala Thr Thr Thr Cys Thr Gly Thr 275 280 285 Gly Cys Thr Ala Gly Cys Gly Gly Gly Cys Gly Gly Cys Cys Thr Gly 290 295 300 Ala Cys Thr Ala Cys Thr Gly Gly Gly Gly Cys Cys Ala Ala Gly Gly 305 310 315 320 Cys Ala Cys Cys Ala Cys Thr Cys Thr Cys Ala Cys Ala Gly Thr Cys 325 330 335 Thr Cys Cys Thr Cys Ala 340 <210> 15 <211> 336 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> murine monoclonal antibody RA4.D2 - Light-chain variable region (VL); (kappa light chain) <400> 15 Gly Ala Cys Ala Thr Thr Gly Thr Gly Cys Thr Cys Thr Cys Cys Cys 1 5 10 15 Ala Ala Thr Cys Thr Cys Cys Ala Gly Cys Thr Thr Cys Thr Thr Thr 20 25 30 Gly Gly Cys Thr Gly Thr Gly Thr Cys Thr Cys Thr Ala Gly Gly Gly 35 40 45 Cys Ala Gly Ala Gly Ala Gly Cys Cys Ala Cys Cys Ala Thr Cys Thr 50 55 60 Cys Cys Thr Gly Cys Ala Gly Ala Gly Cys Cys Ala Gly Thr Gly Ala 65 70 75 80 Ala Ala Gly Thr Gly Thr Thr Gly Ala Ala Thr Ala Thr Thr Ala Thr 85 90 95 Gly Gly Cys Ala Cys Ala Ala Gly Thr Thr Thr Gly Ala Thr Gly Cys 100 105 110 Ala Gly Thr Gly Gly Thr Ala Cys Cys Ala Ala Cys Ala Gly Ala Ala 115 120 125 Gly Cys Cys Ala Gly Gly Ala Cys Ala Gly Cys Cys Ala Cys Cys Cys 130 135 140 Ala Ala Ala Cys Thr Cys Cys Thr Cys Ala Thr Cys Thr Ala Thr Gly 145 150 155 160 Cys Thr Gly Cys Ala Thr Cys Cys Gly Gly Cys Gly Thr Ala Gly Ala 165 170 175 Ala Thr Cys Thr Gly Gly Gly Gly Thr Cys Cys Cys Thr Gly Cys Cys 180 185 190 Ala Gly Gly Thr Thr Thr Ala Gly Thr Gly Gly Cys Ala Gly Thr Gly 195 200 205 Gly Gly Thr Cys Thr Gly Gly Gly Ala Cys Ala Gly Ala Cys Thr Thr 210 215 220 Cys Ala Gly Cys Cys Thr Cys Ala Thr Cys Ala Thr Cys Cys Ala Thr 225 230 235 240 Cys Cys Thr Gly Thr Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Gly Ala Thr Gly 245 250 255 Ala Thr Ala Thr Thr Gly Cys Ala Ala Thr Gly Thr Ala Thr Thr Thr 260 265 270 Cys Thr Gly Thr Cys Ala Gly Cys Ala Ala Ala Gly Thr Ala Gly Gly 275 280 285 Ala Ala Gly Gly Thr Thr Cys Cys Gly Thr Ala Cys Ala Cys Gly Thr 290 295 300 Thr Cys Gly Gly Ala Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ala Cys Cys Ala Ala 305 310 315 320 Ala Cys Thr Gly Gly Ala Ala Ala Thr Ala Ala Ala Ala Cys Gly Gly 325 330 335 <210> 16 <211> 445 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> chimeric RA4.D2 antibody - heavy chain (HC) <400> 16 Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Ser Met His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Arg Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Glu Thr Gly Lys Thr Ile His Ala Glu Asp Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Ser Gly Arg Pro Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val 100 105 110 Ser Ser Ala Ser Thr Thr Ala Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser 115 120 125 Cys Gly Ser Thr Ser Gly Ser Thr Val Ala Leu Ala Cys Leu Val Ser 130 135 140 Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ser Leu 145 150 155 160 Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ser Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu 165 170 175 His Ser Leu Ser Ser Met Val Thr Val Pro Ser Ser Arg Trp Pro Ser 180 185 190 Glu Thr Phe Thr Cys Asn Val Val His Pro Ala Ser Asn Thr Lys Val 195 200 205 Asp Lys Pro Val Phe Asn Glu Cys Arg Cys Thr Asp Thr Pro Pro Cys 210 215 220 Pro Val Pro Glu Pro Leu Gly Gly Pro Ser Val Leu Ile Phe Pro Pro 225 230 235 240 Lys Pro Lys Asp Ile Leu Arg Ile Thr Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 245 250 255 Val Val Leu Asp Leu Gly Arg Glu Asp Pro Glu Val Gln Ile Ser Trp 260 265 270 Phe Val Asp Gly Lys Glu Val His Thr Ala Lys Thr Gln Ser Arg Glu 275 280 285 Gln Gln Phe Asn Gly Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Pro Ile Glu 290 295 300 His Gln Asp Trp Leu Thr Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn His 305 310 315 320 Ile Asp Leu Pro Ser Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Ala Arg Gly 325 330 335 Arg Ala His Lys Pro Ser Val Tyr Val Leu Pro Pro Ser Pro Lys Glu 340 345 350 Leu Ser Ser Ser Asp Thr Val Ser Ile Thr Cys Leu Ile Lys Asp Phe 355 360 365 Tyr Pro Pro Asp Ile Asp Val Glu Trp Gln Ser Asn Gly Gln Gln Glu 370 375 380 Pro Glu Arg Lys His Arg Met Thr Pro Pro Gln Leu Asp Glu Asp Gly 385 390 395 400 Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Ser Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln 405 410 415 Gln Gly Asp Pro Phe Thr Cys Ala Val Met His Glu Thr Leu Gln Asn 420 425 430 His Tyr Thr Asp Leu Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys 435 440 445 <210> 17 <211> 221 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> chimeric RA4.D2 antibody - light chain (LC) <400> 17 Asp Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Glu Tyr Tyr 20 25 30 Gly Thr Ser Leu Met Gln Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Gly Val Glu Ser Gly Val Pro Ala 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Ile Ile His 65 70 75 80 Pro Val Glu Glu Asp Asp Ile Ala Met Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Arg 85 90 95 Lys Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 110 Asn Asp Ala Gln Pro Ala Val Tyr Leu Phe Gln Pro Ser Pro Asp Gln 115 120 125 Leu His Thr Gly Ser Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Ser Phe Tyr 130 135 140 Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Val Asp Gly Val Ile Gln Asp 145 150 155 160 Thr Gly Ile Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Lys Asp Ser Thr Tyr 165 170 175 Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Met Ser Ser Thr Glu Tyr Leu Ser His 180 185 190 Glu Leu Tyr Ser Cys Glu Ile Thr His Lys Ser Leu Pro Ser Thr Leu 195 200 205 Ile Lys Ser Phe Gln Arg Ser Glu Cys Gln Arg Val Asp 210 215 220 <210> 18 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Caninized VH Framework Region (FR) - VH1 FR1 <400> 18 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser 20 25 <210> 19 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Caninized VH Framework Region (FR) - VH1 FR2 <400> 19 Trp Val Arg Gln Arg Thr Gly Arg Gly Leu Glu Trp Met Gly 1 5 10 <210> 20 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Caninized VH Framework Region (FR) - VH1 FR3 <400> 20 Arg Leu Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ala Lys Ser Gln Val Ser Leu Gln 1 5 10 15 Met Ser Ser Met Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg 20 25 30 <210> 21 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Caninized VH Framework Region (FR) - VH1 FR4 <400> 21 Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 <210> 22 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Caninized VH Framework Region (FR) - VH2 FR1 <400> 22 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser 20 25 <210> 23 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Caninized VH Framework Region (FR) - VH2 FR2 <400> 23 Trp Val Arg Gln Arg Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Met Gly 1 5 10 <210> 24 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Caninized VH Framework Region (FR) - VH2 FR3 <400> 24 Arg Leu Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ala Lys Ser Gln Val Ser Leu Gln 1 5 10 15 Met Ser Ser Met Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg 20 25 30 <210> 25 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Caninized VH Framework Region (FR) - VH2 FR4 <400> 25 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 <210> 26 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Caninized VH Framework Region (FR) - VH3 FR1 <400> 26 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser 20 25 <210> 27 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Caninized VH Framework Region (FR) - VH3 FR3 <400> 27 Trp Val Arg Gln Arg Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Met Gly 1 5 10 <210> 28 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Caninized VH Framework Region (FR) - VH3 FR3 <400> 28 Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ala Lys Ser Gln Val Ser Leu Gln 1 5 10 15 Leu Ser Ser Met Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg 20 25 30 <210> 29 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Caninized VH Framework Region (FR) - VH3 FR4 <400> 29 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 <210> 30 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Caninized VH Framework Region (FR) - VH4 FR1 <400> 30 Glu Val Thr Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser 20 25 <210> 31 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Caninized VH Framework Region (FR) - VH4 FR2 <400> 31 Trp Val Arg Gln Arg Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Met Gly 1 5 10 <210> 32 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Caninized VH Framework Region (FR) - VH4 FR3 <400> 32 Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ala Lys Asn Gln Val Ser Leu Gln 1 5 10 15 Leu Ser Ser Met Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg 20 25 30 <210> 33 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Caninized VH Framework Region (FR) - VH4 FR4 <400> 33 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 <210> 34 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Caninized VH Framework Region (FR) - VH5 FR1 <400> 34 Glu Val Thr Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Val Val Ser 20 25 <210> 35 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Caninized VH Framework Region (FR) - VH5 FR2 <400> 35 Trp Val Arg Gln Arg Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Met Gly 1 5 10 <210> 36 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Caninized VH Framework Region (FR) - VH5 FR3 <400> 36 Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ala Lys Asn Gln Val Ser Leu Gln 1 5 10 15 Leu Ser Ser Met Thr Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg 20 25 30 <210> 37 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Caninized VH Framework Region (FR) - VH5 FR4 <400> 37 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 <210> 38 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Caninized VL Framework Region (FR) - VL1 FR1 <400> 38 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Leu Ser Gln Glu 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys 20 <210> 39 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Caninized VL Framework Region (FR) - VL1 FR2 <400> 39 Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 1 5 10 15 <210> 40 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Caninized VL Framework Region (FR) - VL1 FR3 <400> 40 Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser 1 5 10 15 Phe Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ser Glu Asp Val Ala Ser Tyr Phe Cys 20 25 30 <210> 41 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Caninized VL Framework Region (FR) - VL1 FR4 <400> 41 Phe Gly Ala Gly Thr Lys Val Glu Leu Lys 1 5 10 <210> 42 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Caninized VL Framework Region (FR) - VL2 FR1 <400> 42 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Leu Ser Gln Glu 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys 20 <210> 43 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Caninized VL Framework Region (FR) - VL2 FR2 <400> 43 Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 1 5 10 15 <210> 44 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Caninized VL Framework Region (FR) - VL2 FR3 <400> 44 Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser 1 5 10 15 Phe Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Val Ala Ser Tyr Phe Cys 20 25 30 <210> 45 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Caninized VL Framework Region (FR) - VL2 FR4 <400> 45 Phe Gly Ala Gly Thr Lys Val Glu Leu Lys 1 5 10 <210> 46 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Caninized VL Framework Region (FR) - VL3 FR1 <400> 46 Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Leu Ser Gln Glu 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys 20 <210> 47 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Caninized VL Framework Region (FR) - VL3 FR2 <400> 47 Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 1 5 10 15 <210> 48 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Caninized VL Framework Region (FR) - VL3 FR3 <400> 48 Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser 1 5 10 15 Phe Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Val Ala Ser Tyr Phe Cys 20 25 30 <210> 49 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Caninized VL Framework Region (FR) - VL3 FR4 <400> 49 Phe Gly Ala Gly Thr Lys Val Glu Leu Lys 1 5 10 <210> 50 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Caninized VL Framework Region (FR) - VL4 FR1 <400> 50 Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Leu Ser Gln Glu 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys 20 <210> 51 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Caninized VL Framework Region (FR) - VL4 FR2 <400> 51 Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 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Gly Thr Asp Phe Ser Phe Thr Ile Ser 65 70 75 80 Ser Leu Glu Pro Glu Asp Val Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Arg 85 90 95 Lys Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110

Claims (53)

  1. 인터루킨-31 (IL-31)에 특이적으로 결합하는 항원 결합 분자(antigen-binding molecule)로서, 여기서, 항원 결합 분자는 면역글로불린 중쇄 가변 도메인 (VH) 및 면역글로불린 경쇄 가변 도메인 (VL)을 포함하고, 여기서, VH는 서열 번호: 6의 아미노산 서열, 또는 이와 적어도 80%의 서열 동일성(sequence identity)을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정 영역(complementarity determining region) 1 (VH CDR1), 서열 번호: 7의 아미노산 서열, 또는 이와 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2, 및 서열 번호: 8의 아미노산 서열, 또는 이와 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3을 포함하고; 여기서, VL은 서열 번호: 9의 아미노산 서열, 또는 이와 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정 영역 1 (VL CDR1), 서열 번호: 10의 아미노산 서열, 또는 이와 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2, 및 서열 번호: 11의 아미노산 서열, 또는 이와 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함하고, 여기서, CDR의 아미노산 서열은 IMGT 넘버링(numbering)을 기반으로 하는 항원 결합 분자.
  2. 서열 번호: 1의 아미노산 잔기 L29, Y32, Q33 및 P40을 포함하는 개과(canine) IL-31의 에피토프(epitope)에 특이적으로 결합하는 항원 결합 분자.
  3. 서열 번호: 1의 개과 IL-31에의 결합에 대해 제1항 또는 제2항의 항원 결합 분자와 경쟁하는 항원 결합 분자.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, VH가 서열 번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열 번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2 및 서열 번호: 8의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3을 포함하고; 여기서, VL은 서열 번호: 9의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, 서열 번호: 10의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2, 및 서열 번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함하는 항원 결합 분자.
  5. 제4항에 있어서, VH가 서열 번호: 6의 아미노산 서열로 구성된 VH CDR1, 서열 번호: 7의 아미노산 서열로 구성된 VH CDR2 및 서열 번호: 8의 아미노산 서열로 구성된 VH CDR3을 포함하고; 여기서, VL은 서열 번호: 9의 아미노산 서열로 구성된 VL CDR1, 서열 번호: 10의 아미노산 서열로 구성된 VL CDR2, 및 서열 번호: 11의 아미노산 서열로 구성된 VL CDR3을 포함하는 항원 결합 분자.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 결합 분자가 IL-31에의 결합에 대하여 (i) 서열 번호: 1의 아미노산 위치 13, 15, 20 및 26에 상응하는 IL-31의 영역에 특이적으로 결합하는 IL-31 결합 분자, 또는 (ii) 서열 번호: 1의 아미노산 위치 76, 77, 80, 81, 및 84에 상응하는 IL-31의 영역에 특이적으로 결합하는 IL-31 결합 분자와 경쟁하지 않는 항원 결합 분자.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 분자가 개과화된(caninized), 고양이과화된(felinized) 또는 말과화된(equinized) 항원 결합 분자인 항원 결합 분자.
  8. 제7항에 있어서, 분자가 개과화된 항원 결합 분자인 항원 결합 분자.
  9. 제8항에 있어서, 개과화된 항원 결합 분자가
    (i) (a) 서열 번호: 18, 22, 26, 30 및 34로 구성된 군으로부터 선택되는 중쇄 가변 도메인 프레임워크(framework) 영역 1 (VHFR1) 아미노산 서열과 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 VHFR1 아미노산 서열,
    (b) 서열 번호: 19, 23, 27, 31 및 35로 구성된 군으로부터 선택되는 VHFR2 아미노산 서열과 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 VHFR2 아미노산 서열,
    (c) 서열 번호: 20, 24, 27, 32 및 36으로 구성된 군으로부터 선택되는 VHFR3 아미노산 서열과 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 VHFR3 아미노산 서열, 및
    (d) 서열 번호: 21, 25, 28, 33 및 37로 구성된 군으로부터 선택되는 VHFR4 아미노산 서열과 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 VHFR4 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 (VH); 및/또는
    (ii) (e) 서열 번호: 38, 42, 46 및 50으로 구성된 군으로부터 선택되는 중쇄 가변 도메인 프레임워크 영역 1 (VLFR1) 아미노산 서열과 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 VLFR1 아미노산 서열,
    (f) 서열 번호: 39, 43, 47 및 51로 구성된 군으로부터 선택되는 VLFR2 아미노산 서열과 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 VLFR2 아미노산 서열,
    (g) 서열 번호: 40, 44, 48 및 52로 구성된 군으로부터 선택되는 VLFR3 아미노산 서열과 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 VLFR3 아미노산 서열,
    (h) 서열 번호: 41, 45, 49 및 53으로 구성된 군으로부터 선택되는 VLFR4 아미노산 서열과 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 VLFR4 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 (VL)을 포함하는 항원 결합 분자.
  10. 제8항에 있어서, 개과화된 항원 결합 분자가
    (i) (i) 서열 번호: 81 또는 서열 번호: 85의 중쇄 가변 도메인 프레임워크 영역 1 (VHFR1) 아미노산 서열과 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 VHFR1 아미노산 서열,
    (j) 서열 번호: 82 또는 서열 번호: 86의 VHFR2 아미노산 서열과 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 VHFR2 아미노산 서열,
    (k) 서열 번호: 83 또는 서열 번호: 87의 VHFR3 아미노산 서열과 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 VHFR3 아미노산 서열, 및
    (l) 서열 번호: 84 또는 서열 번호: 88의 VHFR4 아미노산 서열과 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 VHFR4 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 (VH); 및/또는
    (ii) (m) 서열 번호: 89의 중쇄 가변 도메인 프레임워크 영역 1 (VLFR1) 아미노산 서열과 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 VLFR1 아미노산 서열,
    (n) 서열 번호: 90의 VLFR2 아미노산 서열과 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 VLFR2 아미노산 서열,
    (o) 서열 번호: 91의 VLFR3 아미노산 서열과 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 VLFR3 아미노산 서열, 및
    (p) 서열 번호: 92의 VLFR4 아미노산 서열과 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 VLFR4 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 (VL)을 포함하는 항원 결합 분자.
  11. 제8항에 있어서, 중쇄 가변 도메인 (VH)이 서열 번호: 99 또는 서열 번호: 100의 VH 아미노산 서열과 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 항원 결합 분자.
  12. 제8항에 있어서, 경쇄 가변 도메인 (VL)이 서열 번호: 101의 VL 아미노산 서열과 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 항원 결합 분자.
  13. 제7항에 있어서, 분자가 고양이과화된 항원 결합 분자인 항원 결합 분자.
  14. 제13항에 있어서, 고양이과화된 항원 결합 분자가
    (i) (a) 서열 번호: 54의 중쇄 가변 도메인 프레임워크 영역 1 (VHFR1) 아미노산 서열과 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 VHFR1 아미노산 서열,
    (b) 서열 번호: 55의 VHFR2 아미노산과 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 VHFR2 아미노산 서열,
    (c) 서열 번호: 56의 VHFR3 아미노산과 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 VHFR3 아미노산 서열, 및
    (d) 서열 번호: 57의 VHFR4 아미노산과 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 VHFR4 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 (VH); 및/또는
    (ii) (e) 서열 번호: 58의 경쇄 가변 도메인 프레임워크 영역 1 (VLFR1) 아미노산 서열과 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 VLFR1 아미노산 서열,
    (f) 서열 번호: 59의 VLFR2 아미노산 서열과 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 VLFR2 아미노산 서열,
    (g) 서열 번호: 60의 VLFR3 아미노산 서열과 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 VLFR3 아미노산 서열, 및
    (h) 서열 번호: 61의 VLFR4 아미노산 서열과 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 VLFR4 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 (VL)을 포함하는 항원 결합 분자.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 결합 분자가 항체 또는 이의 IL-31 결합 단편인 항원 결합 분자.
  16. 제15항에 있어서, IL-31 결합 단편이 Fab 단편, scFab, Fab', 단일 쇄 가변 단편 (scFv) 및 1 아암 항체로 구성된 군으로부터 선택되는 항원 결합 분자.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 결합 분자가 개과, 고양이과 또는 말과 면역글로불린 분자의 중쇄 및/또는 경쇄 불변 영역을 포함하는 항원 결합 분자.
  18. 제17항에 있어서, 면역글로불린 분자가 고양이과 면역글로불린인 항원 결합 분자.
  19. 제18항에 있어서, 고양이과 면역글로불린 분자가 IgG1a, IgG1b 및 IgG2로 구성된 군으로부터 선택되는 항원 결합 분자.
  20. 제17항에 있어서, 면역글로불린 분자가 개과 면역글로불린 분자인 항원 결합 분자.
  21. 제20항에 있어서, 개과 면역글로불린 분자가 IgGA, IgGB, IgGC 및 IgGD로 구성된 군으로부터 선택되는 항원 결합 분자.
  22. 제21항에 있어서, 개과 면역글로불린 분자가 개과 IgGA인 항원 결합 분자.
  23. 제22항에 있어서, 개과 면역글로불린 분자가 서열 번호: 2의 아미노산 서열, 또는 이와 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 항원 결합 분자.
  24. 제22항 또는 제23항에 있어서, 항체가 서열 번호: 16의 아미노산 서열, 또는 이와 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는 항원 결합 분자.
  25. 제22항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 서열 번호: 17의 아미노산 서열, 또는 이와 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항원 결합 분자.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항의 항원 결합 분자를 코딩하는(encoding) 핵산 서열을 포함하는 단리된(isolated) 핵산 분자.
  27. 제26항의 핵산 서열을 포함하는 발현 작제물(expression construct).
  28. 제27항의 발현 작제물을 포함하는 숙주 세포.
  29. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항의 항원 결합 분자를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 벡터(vector).
  30. 제29항에 있어서, 벡터가 AAV 벡터인 벡터.
  31. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항의 항원 결합 분자, 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물.
  32. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항의 항원 결합 분자, 제29항 또는 제30항의 벡터, 또는 제31항의 제약 조성물을 포함하는 키트(kit).
  33. IL-31의 발현 증가 및/또는 이의 활성 증가와 연관된 병태(condition)의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체(subject)에게 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항의 항원 결합 분자, 제29항 또는 제30항의 벡터, 또는 제31항의 제약 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, IL-31의 발현 증가 및/또는 이의 활성 증가와 연관된 병태를 치료 또는 예방하는 방법.
  34. 제33항에 있어서, IL-31의 발현 증가 및/또는 이의 활성 증가와 연관된 병태가 소양증(pruritis) 및 피부염(dermatitis)으로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
  35. 제34에 있어서, 병태가 아토피성 피부염(atopic dermatitis)인 방법.
  36. 제34항에 있어서, 병태가 소양증인 방법.
  37. IL-31에 의해 증식하도록 유도된 종양(tumour) 및 이와 연관된 병태의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에게 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항의 항원 결합 분자, 제29항 또는 제30항의 벡터, 또는 제31항의 제약 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, IL-31에 의해 증식하도록 유도된 종양 및 이와 연관된 병태를 치료 또는 예방하는 방법.
  38. 제33항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 개과, 고양이과 및 말과로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
  39. IL-31의 발현 증가 및/또는 이의 활성 증가와 연관된 병태의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 IL-31의 발현 증가 및/또는 이의 활성 증가와 연관된 병태를 치료 또는 예방하기 위한 의약 제조에서의, 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항의 항원 결합 분자, 또는 제29항 또는 제30항의 벡터의 용도.
  40. 제39항에 있어서, IL-31의 발현 증가 및/또는 이의 활성 증가와 연관된 병태가 소양증 및 피부염로 구성된 군으로부터 선택되는 용도.
  41. 제40항에 있어서, 병태가 아토피성 피부염인 용도.
  42. 제40항에 있어서, 병태가 소양증인 용도.
  43. IL-31에 의해 증식하도록 유도된 종양 및 이와 연관된 병태의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 IL-31에 의해 증식하도록 유도된 종양 및 이와 연관된 병태를 치료 또는 예방하기 위한 의약 제조에서의, 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항의 항원 결합 분자, 또는 제29항 또는 제30항의 벡터의 용도.
  44. 제39항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 개과, 고양이과 및 말과로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
  45. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서; 제29항 또는 제30항에 있어서; 또는 제31항에 있어서, IL-31의 발현 증가 및/또는 이의 활성 증가와 연관된 병태의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 IL-31의 발현 증가 및/또는 이의 활성 증가와 연관된 병태의 치료 또는 예방에서 사용하기 위한 항원 결합 분자; 벡터; 또는 제약 조성물.
  46. 제45항에 있어서, IL-31의 발현 증가 및/또는 이의 활성 증가와 연관된 병태가 소양증 및 피부염으로 구성된 군으로부터 선택되는, 사용하기 위한 항원 결합 분자; 벡터; 또는 제약 조성물.
  47. 제46항에 있어서, 병태가 아토피성 피부염인, 사용하기 위한 항원 결합 분자; 벡터; 또는 제약 조성물.
  48. 제46항에 있어서, 병태가 소양증인, 사용하기 위한 항원 결합 분자; 벡터; 또는 제약 조성물.
  49. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서; 제29항 또는 제30항에 있어서; 또는 제31항에 있어서, IL-31에 의해 증식하도록 유도된 종양 및 이와 연관된 병태의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 IL-31에 의해 증식하도록 유도된 종양 및 이와 연관된 병태의 치료 또는 예방에서 사용하기 위한 항원 결합 분자; 벡터; 또는 제약 조성물.
  50. 제45항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 개과, 고양이과 및 말과로 구성된 군으로부터 선택되는, 사용하기 위한 항원 결합 분자; 벡터; 또는 제약 조성물.
  51. IL-31에 대한 면역 반응을 일으킬 수 있는 면역원성 조성물로서, 여기서, 조성물은 (i) IL-31의 B 세포 에피토프를 포함하는 면역원(immunogen) 및 (ii) 제약상 허용되는 담체를 포함하고, 여기서, B 세포 에피토프는 서열 번호: 1의 아미노산 위치 29-40에 상응하는 아미노산 서열, 또는 이와 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 여기서, 면역원은 천연 IL-31 분자의 아미노산 서열을 포함하지 않는 면역원성 조성물.
  52. 제51항에 있어서, 면역원이 서열 번호: 1의 아미노산 위치 29-40에 상응하는 아미노산 서열, 또는 이와 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 구성되는 면역원성 조성물.
  53. 제51항에 있어서, 면역원이 서열 번호: 1의 아미노산 위치 29-40에 상응하는 아미노산 서열로 구성되는 면역원성 조성물.
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