KR20230113489A - 재조합 이중발현벡터 및 이를 이용한 키메릭 페리틴 케이지의 제조방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 키메릭 페리틴 케이지를 제조하기 위한 재조합 이중발현벡터에 관한 것이며, 상기 재조합 이중발현벡터로 형질전환된 형질전환체, 상기 형질전환체를 이용한 자가조립 페리틴 케이지 제조방법 및 이에 의해 제조된 자가조립 페리틴 케이지에 관한 것이다.
본 발명은 서로 다른 2 이상의 페리틴 단량체로 구성되는 키메릭 페리틴 케이지를 제조함에 있어서 재조합 이중발현벡터를 이용함으로써, 종래 극한 조건 하에서 수행되는 페리틴 케이지의 분리 및 재조립에 따른 단백질 손상, 구조 변화 및 기능성 상실 등을 방지하여 목적하는 키메릭 페리틴 케이지를 안정적인 수율로 제조할 수 있는 이점이 있다. 또한, 본 발명의 재조합 이중발현벡터를 이용하여 페리틴 케이지를 제조하는 경우, 숙주 내에서 서로 다른 2종 이상의 페리틴 단량체가 상당 정도의 단량체 구성 비율적 균일성을 나타내며 자가조립을 이루어, 균일성이 높은 보다 우수한 고-기능성 및 고-효능 키메릭 페리틴 케이지를 제조할 수 있는 이점이 있다.
본 발명은 서로 다른 2 이상의 페리틴 단량체로 구성되는 키메릭 페리틴 케이지를 제조함에 있어서 재조합 이중발현벡터를 이용함으로써, 종래 극한 조건 하에서 수행되는 페리틴 케이지의 분리 및 재조립에 따른 단백질 손상, 구조 변화 및 기능성 상실 등을 방지하여 목적하는 키메릭 페리틴 케이지를 안정적인 수율로 제조할 수 있는 이점이 있다. 또한, 본 발명의 재조합 이중발현벡터를 이용하여 페리틴 케이지를 제조하는 경우, 숙주 내에서 서로 다른 2종 이상의 페리틴 단량체가 상당 정도의 단량체 구성 비율적 균일성을 나타내며 자가조립을 이루어, 균일성이 높은 보다 우수한 고-기능성 및 고-효능 키메릭 페리틴 케이지를 제조할 수 있는 이점이 있다.
Description
본 발명은 페리틴 케이지를 제조하기 위한 재조합 발현벡터 시스템 및 이를 이용하는 방법에 관한 것이다.
단백질 케이지(cage)는 생체 내에 존재하는 단백질을 이용하여 생체 적합성이 높고 독성이 낮아 나노 구조체 분야에서 활발히 활용되고 있다. 그 중 페리틴(Ferritin)은 24개의 단량체(monomer)가 자가조립되어 만들어지는 구형의 단백질로, 화학적 처리를 통하여 구조를 가역적으로 재조립할 수 있는 장점이 있다. 페리틴은 내부의 빈 공간에 유용한 물질을 적재하거나, 각 단량체에 다양한 기능적 표면 개질을 가함으로써 항암제 등을 전달하는 표적형 약물 전달체, 백신용 항원 전달체, 체내 표적형 진단 센서, 기타 바이오센서 등으로 다양하게 활용될 수 있다.
이러한 페리틴을 활용함에 있어서, 자가조립된 페리틴 케이지를 단량체로 분리하기 위해서는 극한의 pH 조건을 부여하거나, 고농도의 화학적 처리가 요구된다. 예를 들어, 극히 낮은 pH (< pH 2) 또는 극히 높은 pH (> pH 11) 조건이 필요하거나, 또는 우레아(urea)와 같은 화합물을 고농도로 처리하여야 한다. 그러나 이러한 조건은 단백질에 손상을 주어 구조 변화를 유발하며, 이에 적정한 수율을 기대하기 어렵게 된다. 특히 다양한 기능을 갖는 펩타이드 또는 단백질 서열 등의 연장 또는 추가를 통하여 각 단량체 단백질의 유전적 개질을 적용한 다기능 나노입자(multi-functional nanoparticle)를 제작하는 경우, 단백질의 손상에 따른 치명적인 기능성 상실이 유발될 수밖에 없다. 또한, 극한의 pH 조건 또는 고농도 화학 처리 이후의 후속적인 실험이나 공정을 위하여, 적정 pH 및 농도로 재조정하기 위한 염의 제거 및 화학물질 제거 추가 공정이 필수적으로 요구되어, 공정 효율성을 저하시키는 문제가 있다.
이에, 표면 개질 등을 통하여 다양한 기능성을 부여한 페리틴 단량체들을 단백질 손상 또는 변형없이 안정적인 조건에서 케이지로 제작하는 기술 개발이 절실히 요구되고 있다.
본 발명은 상기와 같은 종래의 문제점을 해결하기 위하여, 재조합 이중발현벡터를 이용하여 키메릭 페리틴 케이지를 제조하는 방법을 제공하는 것을 주된 목적으로 한다.
구체적으로 본 발명은 서로 다른 제1 페리틴(ferritin) 단량체(monomer) 및 제2 페리틴 단량체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 이중발현벡터를 제공하는 것을 하나의 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 이중발현벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공하는 것을 하나의 목적으로 한다.
또한 본 발명은 형질전환체를 배양하는 단계를 포함하는, 자가조립 페리틴 케이지 제조방법을 제공하는 것을 하나의 목적으로 한다.
또한 본 발명은 상기 방법으로 제조된 자가조립 페리틴 케이지를 제공한다.
본 발명의 목적은 상기의 기재에 국한되지 않으며 본 발명을 활용하여 적절한 효과를 얻을 수 있는 모든 경우를 목적으로 하여 제공된다.
본 발명자들은 표면 개질 등을 통해 다양한 기능성이 부여된 페리틴 단량체들을 이용하여 페리틴 케이지, 특히 서로 다른 기능성이 부여된 페리틴 단량체가 함께 구조체를 이루는 키메릭 페리틴 케이지를 제조함에 있어서, 단백질 손상 또는 변형이 발생하지 않도록 극한의 pH 조건 또는 고농도 화학 처리없이 안정적인 조건에서 키메릭 페리틴 케이지를 제조하기 위한 연구를 수행하였으며, 이에 본 발명을 완성하였다.
구체적으로 본 발명은 서로 다른 제1 페리틴(ferritin) 단량체(monomer) 및 제2 페리틴 단량체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하며, 상기 제1 페리틴 단량체 및 제2 페리틴 단량체 중, 적어도 1 이상은 N-말단 또는 C-말단에 목적 펩타이드 또는 단백질이 융합된 융합 페리틴 단량체인 것인, 재조합 이중발현벡터를 제공한다.
또한 본 발명은 상기 목적 펩타이드 또는 단백질이 실리카 형성 펩타이드(silica forming peptide), 항원, 항체, 리간드 펩타이드, 단백질 약물, 세포독성 단백질 및 형광 단백질로 이루어진 군에서 선택되는 1 종 이상인 것인, 재조합 이중발현벡터를 제공한다.
또한 본 발명은 상기 제1 페리틴 단량체가 N-말단에 실리카 형성 펩타이드가 융합된 융합 페리틴 단량체인 것인, 재조합 이중발현벡터를 제공한다.
또한 본 발명은 상기 제1 페리틴 단량체가 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열 및 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것인, 재조합 이중발현벡터를 제공한다.
또한 본 발명은 상기 제1 페리틴 단량체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드가 서열번호 2로 표시되는 염기서열 및 서열번호 4로 표시되는 염기서열을 포함하는 것인, 재조합 이중발현벡터를 제공한다.
또한 본 발명은 상기 재조합 이중발현벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공한다.
또한 본 발명은 상기 형질전환체를 배양하는 단계를 포함하는, 자가조립 페리틴 케이지 제조방법을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 방법으로 제조된 자가조립 페리틴 케이지를 제공한다.
이하에서, 본 발명에 관하여 보다 자세히 설명한다.
본 발명은 구체적인 일 양태로서, 서로 다른 제1 페리틴(ferritin) 단량체(monomer) 및 제2 페리틴 단량체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하며, 상기 제1 페리틴 단량체 및 제2 페리틴 단량체 중, 적어도 1 이상은 N-말단 또는 C-말단에 목적 펩타이드 또는 단백질이 융합된 융합 페리틴 단량체인 것인, 재조합 이중발현벡터를 제공한다.
본 발명에서 페리틴(ferritin)은 세포 내 단백질의 일종으로,생체 내에서 철을 저장하고 방출하는 역할을 한다. 페리틴은 자가조립 능력이 있어, 일반적을 생체 내에서 속이 빈 구형의 케이지(cage) 형태를 형성하고 있다. 상기 케이지는 24개의 페리틴 단량체(monomer)로 구성되며, 상기 단량체는 그 구조에 따라 중쇄(heavy chain)와 경쇄(light chain)로 구분된다.
본 발명에서 페리틴 케이지를 구성하는 페리틴 단량체는 그 유래, 중쇄 및 경쇄 여부 등은 특별히 제한되지 않는다. 본 발명의 구체적인 일실시예에서, 상기 페리틴 단량체로 인간 유래 중쇄 페리틴(human Ferritin heavy chain)을 사용하였으며, 상기 페리틴 단량체의 아미노산 서열(서열번호 1) 및 이를 암호화하는 염기서열(서열번호 2)은 하기 [표 1]과 같다.
| 페리틴 단량체 아미노산서열 (서열번호 1) |
MTTASTSQVRQNYHQDSEAAINRQINLELYASYVYLSMSYYFDRDDVALKNFAKYFLHQSHEEREHAEKLMKLQNQRGGRIFLQDIKKPDCDDWESGLNAMECALHLEKNVNQSLLELHKLATDKNDPHLCDFIETHYLNEQVKAIKELGDHVTNLRKMGAPESGLAEYLFDKHTLGDSDNES |
| 페리틴 단량체 염기서열 (서열번호 2) |
ATGACGACCGCGTCTACCTCTCAAGTGCGTCAAAACTATCATCAGGACTCGGAAGCTGCCATCAACCGCCAAATCAATCTGGAACTGTACGCAAGCTATGTGTACCTGAGCATGTCTTATTACTTTGATCGTGATGACGTGGCACTGAAAAACTTTGCTAAGTATTTCCTGCATCAGTCGCACGAAGAACGCGAACATGCTGAAAAACTGATGAAGCTGCAGAATCAACGTGGCGGTCGCATTTTCCTGCAAGATATTAAAAAGCCGGACTGCGATGACTGGGAAAGTGGCCTGAACGCGATGGAATGTGCCCTGCATCTGGAAAAGAACGTTAATCAGTCCCTGCTGGAACTGCACAAACTGGCAACCGATAAGAACGACCCGCATCTGTGCGATTTTATTGAAACGCACTACCTGAATGAACAAGTGAAAGCGATCAAGGAACTGGGCGACCACGTTACCAATCTGCGTAAAATGGGTGCCCCGGAATCTGGTCTGGCTGAATACCTGTTTGATAAGCATACGCTGGGTGACTCCGACAATGAATCGTGA |
본 발명에서 페리틴 케이지를 구성하는 페리틴 단량체는 서로 다른 2종 이상의 페리틴 단량체일 수 있다. 페리틴 단량체가 서로 다르다는 것은 예를 들어, 페리틴 단량체의 N-말단 또는 C-말단에 기능성을 갖는 다양한 펩타이드 또는 단백질이 융합됨으로써 염기서열, 아미노산 서열, 구조 및/또는 기능성 등이 상이해진 2종 이상의 페리틴 단량체를 의미할 수 있다. 서로 다른 페리틴 단량체의 구체적인 예로, 2 종 이상의 페리틴 단량체가 N-말단 또는 C-말단에 특정 기능성 부여를 위한 목적 펩타이드 또는 단백질이 융합된 제1 페리틴 단량체 및 별도 기능성 펩타이드가 융합되지 않은 제2 페리틴 단량체인 경우, 또는 N-말단 또는 C-말단에 제1 목적 펩타이드가 융합된 제1 페리틴 단량체 및 N-말단 또는 C-말단에 제2 목적 펩타이드가 융합된 제2 페리틴 단량체인 경우일 수 있다.
본 발명에서 상기 페리틴 단량체의 N-말단 또는 C-말단에 융합될 수 있는 목적 펩타이드 또는 단백질은 재조합 발현벡터에 해당 펩타이드 또는 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 삽입하여 숙주세포에서 발현이 가능한 단백질로, 숙주세포에서 페리틴 단량체에 융합(결합)된 형태로 발현되어 생체 내에서 기능을 발휘할 수 있는 기능성 펩타이드 또는 단백질일 수 있다. 상기 목적 펩타이드 또는 단백질의 비제한적인 예로, 실리카 형성 펩타이드(silica forming peptide), 항원, 항체, 리간드 펩타이드, 단백질 약물, 세포독성 단백질 및 형광 단백질 등일 수 있다.
본 발명에서 상기 실리카 형성 펩타이드(silica forming peptide, SFP)는 일반적으로 실리카 전구체와 반응하여 실리카를 합성(형성)할 수 있는 펩타이드를 말한다, 상기 실리카 형성 펩타이드의 종류는 특별히 제한되지 않으며, Kpt, R5, EctP1 및 EctP2 등을 사용할 수 있다. 본 발명의 구체적인 일실시예에서, 상기 실리카 형성 펩타이드로 Kpt를 사용하였으며, 상기 실리카 형성 펩타이드의 아미노산 서열(서열번호 3) 및 이를 암호화하는 염기서열(서열번호 4)은 하기 [표 2]와 같다.
| Kpt 아미노산서열 (서열번호 3) |
KPTHHHHHHDGS |
| Kpt 염기서열 (서열번호 4) |
AAGCCGACCCACCATCACCATCATCATGATGGCAGT |
본 발명에서 상기 항원의 종류는 특별히 제한되지 않으며, 페리틴 모노머의 N-말단 또는 C-말단에 융합될 수 있는 단백질성 항원일 수 있다.
본 발명에서 상기 항체의 종류는 특별히 제한되지 않으며, 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체, 키메라 항체, 인간화된 항체, Fv-단편, Fab-단편, F(ab')2-단편 및 scFv 단편 등 일 수 있다. 또한, 상기 항체는 전체(whole) 항체 형태 뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함하는 개념일 수 있다. 상기 전체 항체는 일반적으로 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 구조이며 각각의 경쇄는 중쇄와 다이설파이드 결합으로 연결되어 있다. 상기 항체 분자의 기능적인 단편은 일반적으로 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 말하며, Fab, F(ab'), F(ab')2, Fv 및 scFv 등을 포함한다.
본 발명에서 상기 리간드 펩타이드는 페리틴 단량체와 융합된 이후에 표적 세포의 수용체에 특이적으로 결합할 수 있는 펩타이드를 말한다. 예를 들어, 상기 리간드 펩타이드는 병리학적 상태를 매개하는 호르몬 수용체, 사이토카인 수용체 또는 성장인자 수용체 등에 특이적으로 결합할 수 있는 리간드일 수 있다.
본 발명에서 상기 단백질 약물은 생체 내에서 다양한 질병 치료를 위한 약리작용을 나타내는 단백질 제제 등으로, 그 비제한적인 예로, 비알부민, 인슐린, 에리트로포이에틴(erythropoietin, EPO), 인슐린 성장인자, 혈소판 유래 성장인자, 변형 성장인자 알파, 변형 성장인자 베타 및 뼈형성 단백질 등일 수 있다.
본 발명에서 상기 세포독성 단백질은 암 세포의 사멸을 유도하여 항암효과를 나타내는 단백질을 말한다. 상기 세포독성 단백질의 비제한적인 예로, 라스트주맙(trastuzumab), 리투시맙(rituximab), 베바시주맙(bevacizumab), 세투시맙(cetuximab), 보테조밉(bortezomib), 엘로티닙(erlotinib), 제피티닙(gefitinib), 이매티닙 메실레이트(imatinib mesylate), 수니티닙(sunitinib), L-아스파라지나제(L-asparaginase), 트리톨레린 아세테이트(triptorelin acetate), 메제스트롤 아세테이트(megestrol acetate), 플루타미드(flutamide), 비카루타마이드(bicalutamide), 고세레린(goserelin), 시토크롬 씨(cytochrome c), p53 단백질 등을 들 수 있다.
본 발명에서 상기 형광 단백질은 일반적으로 물리적 조건 변화 또는 화학적 처리 등에 의해 빛을 발생하는 물질을 말한다. 상기 형광 단백질의 비제한적인 예로, 녹색 형광 단백질(green fluorescent protein, GFP), 황색 형광 단백질(Yellow fluorescent protein, YFP), 적색형광단백질(Red fluorescent protein, RFP)과 같은 형광 단백질(fluorescent protein), 발광 단백질(photoprotein), 루시퍼라제(luciferase) 등일 수 있다.
본 발명에서 재조합 발현벡터는 일반적으로 적합한 숙주 세포에서 목적하는 재조합 단백질을 발현할 수 있도록 제조된 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동 가능하게 연결된 조절 요소 등을 포함하는 선형 또는 원형의 유전자 작제물을 말한다. 상기 "작동 가능하게 연결(operably linked)"되었다는 것은 일반적 기능을 수행하도록 핵산 발현 조절 서열과 목적하는 단백질을 코딩하는 핵산 서열이 기능적으로 연결(functional linkage)되어 있는 것을 말한다. 예를 들어, 프로모터와 단백질을 코딩하는 핵산 서열이 작동 가능하게 연결되어 프로모터에서 전사가 개시되고 목적하는 단백질의 암호화 서열을 통해 종료암호로 진행하도록 단편이 배열되는 것을 의미할 수 있다. 재조합 벡터와의 작동적, 기능적 연결은 당해 기술 분야에서 공지된 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용할 수 있다.
본 발명에서 사용될 수 있는 벡터의 비제한적인 예로, 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오파아지 벡터, 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 아데노-연관 바이러스 벡터 등일 수 있다. 본 발명에서 상기 발현벡터는 프로모터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서 등과 같은 발현 조절 요소, 막 표적화 또는 분비를 위한 신호서열 또는 리더 서열 등을 포함할 수 있으며 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 본 발명의 상기 발현벡터는 숙주세포 내로 형질전환 된 후, 숙주세포의 게놈과 무관하게 복제되거나 숙주세포의 게놈 내로 통합될 수 있다.
본 발명에서 재조합 발현벡터는 핵산을 적당한 벡터에 연결(삽입)하여 획득할 수 있다. 상기 핵산을 벡터로 삽입하기 위하여, 정제된 DNA를 적당한 제한효소로 절단하여 적당한 벡터 DNA의 제한 부위 또는 클로닝 부위에 삽입하는 방법이 사용될 수 있다. 상기 핵산은 벡터에 작동 가능하게 연결되는 것이 바람직하다. 상기 재조합 발현벡터는 프로모터 및 핵산 외에 인핸서(enhancer)와 같은 시스 요소(cis element), 스플라이싱 시그널(splicing signal), 폴리 A 추가 시그널(poly A addition signal), 선택 마커(selection marker), 라이보좀 결합 서열(ribosome binding sequence, SD sequence) 등을 추가로 포함할 수 있으며, 상기 예들에 의해 작동 가능하도록 연결되는 추가적 구성요소가 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 프로모터는 본 발명의 프로모터는 본 발명의 핵산을 대장균 등과 같은 숙주에서 발현하도록 하는 프로모터라면 특별한 제한없이 사용될 수 있다. 상기 프로모터의 비제한적인 예로, T7 프로모터, trp 프로모터, lac 프로모터, PL 프로모터, PR 프로모터 등이 사용될 수 있다. 상기 선택 마커의 비제한적인 예로, 클로람페니콜 저항 핵산, 암피실린 저항 핵산, 디하이드로폴레이트 환원효소(dihydrofolate reductase), 네오마이신 저항 핵산 등이 사용될 수 있다.
본 발명에서 재조합 이중발현벡터는 재조합 단백질 유전자를 삽입할 수 있는 부위(multi cloning site, MCS)를 2 곳 이상 포함하고 있어, 2 종 이상의 재조합 단백질을 동시에 발현할 수 있는 발현벡터를 말한다. 본 발명에서 상기 재조합 이중발현벡터는 2 종 이상의 재조합 단백질을 동시에 발현할 수 있는 발현벡터라면 특별한 제한없이 사용 가능하며, 그 비제한적인 예로, pETDuet-1, pRSFDuet-1, pCOLADuet-1 등을 사용할 수 있다. 본 발명의 구체적인 일실시예에서, 상기 재조합 이중발현벡터로 pETDuet-1 벡터를 사용하였다.
본 발명에서 상기 재조합 이중발현벡터는 제1 MCS 및 제2 MCS에 서로 다른 제1 페리틴 단량체 및 제2 페리틴 단량체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 각각 포함할 수 있다. 본 발명의 구체적인 일 실시예에서, 상기 재조합 이중발현벡터에 포함되는 서로 다른 제1 페리틴 단량체 및 제2 페리틴 단량체에 있어서, 상기 제1 페리틴 단량체는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 페리틴 단량체의 N-말단에, 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 실리카 형성 펩타이드(SFP)가 융합된 융합 페리틴 단량체를 이용하였으며, 상기 제2 페리틴 단량체로는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하며, 별도의 목적 단백질 등이 융합되지 않은 페리틴 단량체를 이용하였다. 상기 일 구체예에서 상기 제1 페리틴 단량체(SFP-융합 페리틴 단량체)를 암호화하는 폴리펩타이드는 서열번호 2 및 서열번호 4의 염기서열을 포함하며, 재조합 이중발현벡터의 제1 1 MCS에 도입되도록 제작하였고, 상기 제2 페리틴 단량체를 암호화하는 폴리펩타이드는 서열번호 2의 염기서열을 포함하며, 재조합 이중발현벡터의 제2 MCS에 도입되도록 제작하여 이용하였다.
본 발명에서 재조합 단백질(recombinant protein) 또는 융합 단백질(fusion protein)은 어떤 단백질 서열의 N-말단 또는 C-말단에 다른 단백질이 연결되거나 다른 아미노산 서열이 부가된 단백질을 의미한다.
본 발명에서 단백질(protein)은 펩타이드(peptide) 또는 폴리펩타이드(polypeptide) 와 호환성 있게 사용될 수 있으며, 예를 들어, 자연상태의 단백질에서 일반적으로 발견되는 바와 같이 아미노산 잔기의 중합체를 의미한다.
본 발명은 구체적인 또 다른 일 양태로서, 본 발명의 재조합 이중발현벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공한다.
본 발명에서 형질전환(transformation) 또는 형질주입은 일반적으로 DNA를 숙주 내로 도입하여 DNA가 염색체의 인자로서 또는 염색체 통합완성에 의해 복제 가능하게 되는 것으로, 외부의 DNA를 세포 내로 도입하여 인위적으로 유전적인 변화를 일으키는 현상을 말한다. 본 발명에서 재조합 벡터를 이용하여 대장균 등의 숙주를 형질전환시키는 방법은 특별히 제한되지 않으며, 상기 재조합 벡터가 숙주 세포에 도입되어 발현될 수 있도록 처리하는 방법이라면 당해 기술 분야에서 사용될 수 있는 모든 형질전환 방법을 포함한다. 상기 형질전환 방법의 비제한적인 예로, 미세사출법(microprojectile bombardment), 전기충격유전자전달법(electroporation), 인산 칼슘(CaPO4) 침전법, 염화칼슘(CaCl2) 침전법, CaCl2 방법에 DMSO (dimethyl sulfoxide)라는 환원물질을 사용함으로써 효율을 높인 Hanahan 방법, PEG-매개 융합법(PEG-mediated fusion), 미세주입법(microinjection), 리포좀 매개법(liposome-mediated method), 아그로박테리움 매개법(Agrobacterium-mediated method), 원형질 융합법,실리콘 카바이드 섬유를 이용한 교반법, 덱스트란 설페이트, 리포펙타민 및 건조/억제 매개된 형질전환 방법 등일 수 있다.
본 발명에서 재조합 발현벡터가 도입되어 형질전환되는 숙주세포는 목적하는 단백질 종류 또는 발현량 등에 따라 적합한 숙주세포를 선택하여 사용할 수 있다. 본 발명에서 사용할 수 있는 숙주세포의 비제한적인 예로, 대장균(Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 슈도모나스(Pseudomonas), 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis) 또는 스타필로코쿠스 (Staphylococcus) 등과 같은 원핵 숙주 세포일 수 있고, 진균(예를 들어, 아스페르길러스(Aspergillus)), 효모(예를 들어, 피치아 파스토리스(Pichia pastoris), 사카로마이세스 세르비시애 (Saccharomyces cerevisiae), 쉬조사카로마세스(Schizosaccharomyces), 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa)) 등과 같은 하등 진핵 세포일 수 있으며, 곤충 세포, 식물 세포, 포유동물 등을 포함하는 고등 진핵생물 유래의 세포를 숙주세포로 사용할 수 있다. 본 발명의 구체적인 일 실시예에서, 형질전환되는 숙주세포로 대장균을 사용하였다.
본 발명은 구체적인 또 다른 일 양태로서, 본 발명의 재조합 이중발현벡터로 형질전환된 형질전환체를 배양하는 단계를 포함하는, 자가조립 페리틴 케이지 제조방법 및 상기 방법으로 제조된 자기조립 페리틴 케이지를 제공한다.
본 발명에서 상기 형질전환체를 배양하는 방법은 특별히 제한되지 않으며, 당해 기술분야에서 공지된 방법 및 조건에 따라 수행될 수 있으며, 형질전환체(재조합 발현벡터가 도입된 숙주세포)의 종류, 목적하는 단백질 발현량, 단백질 발현 속도 등에 따라 방법 및 조건을 적절히 선택하거나 조절하여 수행될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 상기 재조합 이중발현벡터로 형질전환된 형질전환체는 다양한 배지에서 배양할 수 있으며, 유가식(fed-batch) 배양 및 연속 배양 등을 수행할 수 있으나, 상기 예에 의해 본 발명의 형질전환체의 배양방법이 제한되는 것은 아니다. 또한, 숙주 세포의 생장을 위하여 배지 중에 포함될 수 있는 탄소원은 제조된 형질전환체의 종류에 따라 당업자의 판단에 의해 적절하게 선택될 수 있고, 배양 시기 및 양을 조절하기 위해 적당한 배양 조건을 채택할 수 있다. 적절한 숙주 세포를 선택하여 배지 조건을 조성하여 주면 형질전환체는 목적하는 단백질을 생산하게 되며, 상기 단백질은 숙주 세포의 세포질 내, 페리플라즈믹 스페이스(periplasmic space) 또는 세포 외로 분비될 수 있다.
본 발명에서 상기와 같이 숙주 세포 내 또는 외에서 발현된 단백질은 당해 분야에서 통상적으로 수행하는 공지된 방식으로 정제될 수 있다. 정제 방법의 비제한적인 예로는 염석(예를 들어, 황산암모늄 침전, 인산 나트륨 침전 등), 용매 침전(예를 들어, 아세톤, 에탄올 등을 이용한 단백질 분획 침전 등), 투석, 겔 여과, 이온 교환, 역상 컬럼 크로마토그래피와 같은 크로마토그래피 및 한외여과 등의 기법을 단독 또는 조합 적용하여 단백질을 정제할 수 있다.
본 발명의 상기 재조합 이중발현벡터를 이용하여 서로 다른 2 이상의 페리틴 단량체로 구성되는 키메릭 페리틴 케이지를 제조하는 경우, 종래 키메릭 페리틴 케이지를 제조하기 위하여 요구되었던 극한 조건 하의 별도 공정없이 생체 내(숙주세포)에서 온화한 조건 하에 자가조립된 키메릭 페리틴 케이지를 제조할 수 있다.
구체적으로, 종래에는 키메릭 페리틴 케이지를 제조하기 위해서는 제1 페리틴 단량체로 구성된 제1 자가조립 페리틴 케이지 및 또 다른 제2 페리틴 단량체로 구성된 제2 자가조립 페리틴 케이지를 각각에 수득한 후, 극한의 pH 조건 또는 고농도 화학적 처리가 요구되는 별도의 필수 공정을 통해 상기 제1 및 제2 자가조립 페리틴 케이지를 분리하여 다시 각각의 제1 및 제2 페리틴 단량체를 수득한 다음, 케이지 분리를 위해 앞서 처리한 극한 조건을 제거하는 별도의 필수 공정을 수행한 후, 다시 제1 및 제2 페리틴 단량체를 함께 이용한 케이지 재조립을 유도하기 위하여 이들 각 단량체를 혼합하고 자가조립 가능한 조건을 설정하는 등의 별도의 필수 공정이 필요한 문제가 있다. 이러한 과정에서 단백질 손상이 발생하게 되며, 이에 안정적인 수율로 키메릭 페리틴 케이지를 제조하기 어려울 뿐만 아니라, 케이지 구조의 변형, 페리틴에 융합되거나 케이지 내부에 담지된 기능성 물질(단백질 등)의 기능성이 상실되는 등 치명적인 문제가 발생하게 된다.
이와 달리, 본 발명의 상기 방법에 의하여 키메릭 페리틴 케이지를 제조하는 경우, 온화한 조건 하에서 숙주세포 내에서 키메릭 페리틴 케이지가 자가조립되어 안정적인 수율로 고-기능성의 케이지를 수득할 수 있으며, 나아가 숙주 내에서 서로 다른 2종 이상의 페리틴 단량체가 상당 정도의 균일성(서로 다른 단량체의 개수 비율이 바람직하게는 약 1:1 내외인 구성 비율적 균일성)을 나타내며 자가조립을 이루어 균일성이 높은 보다 우수한 고-기능성 및 고-효능의 키메릭 페리틴 케이지를 제조할 수 있다. 본 발명의 구체적인 실시예에서 페리틴 단량체의 구성 비율은 24개의 단량체 중 서로 다른 제1 및 제2 페리틴 케이지 단량체의 비율이 11:13 또는 12:12 또는 13:11로 약 1:1 내외의 구성 비율적 균일성을 나타내었다.
본 발명에서 페리틴 케이지(cage)는 페리틴 단량체(monomer)들의 자가조립 성질에 의하여 형성되며, 일반적으로 페리틴 단량체 24개가 구형을 이루며 모여, 내부에 공간을 가지는 단백질로 된 케이지 형태의 나노입자를 의미한다. 본 발명에서 상기 자가조립(self-assembly)은 일반적으로 어떤 분자들이 외부의 특별한 자극이나 인위적인 유도 없이, 스스로 자발적으로 특정한 구조를 형성하는 성질을 의미한다.
본 발명의 상기 방법에 의하여 자가조립 페리틴 케이지를 제조하는 경우, 서로 다른 제1 페리틴 단량체 및 제2 페리틴 단량체가 함께 케이지를 구성하는 키메릭 페리틴 케이지를 제조할 수 있다. 본 발명의 상기 키메릭 페리틴 케이지는 1 페리틴 단량체 및 제2 페리틴 단량체가 상당 정도의 균일성, 더욱 상세하게는 약 1:1 내외의 비율로 분포되어 구성된 키메릭 페리틴 케이지일 수 있다.
본 발명에서 달리 정의되지 않은 용어들은 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 의미를 갖는 것으로 해석한다. 또한, 본 발명에 기재된 “또는” 이라는 표현은 별도의 언급이 없는 경우, “및"을 포함하는 개념으로 해석될 수 있다.
본 발명에서 개시되는 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한되지 않으며, 본 발명에서 개시되는 각각의 설명 및 실시 형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 발명에서 개시되는 다양한 요소들의 모든 가능한 조합이 본 발명의 범주에 속하는 것으로 해석된다. 또한, 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 통상의 실험을 통하여 본 발명의 특정 실시예에 대한 다수의 등가물을 인지하거나 확인할 수 있으며, 이러한 등가물은 본 발명의 범주에 속하는 것으로 해석된다.
본 발명은 키메릭 페리틴 케이지 제조를 위한 재조합 이중발현벡터에 관한 것이며, 상기 재조합 이중발현벡터로 형질전환된 형질전환체, 상기 형질전환체를 이용한 자가조립 페리틴 케이지 제조방법 및 이에 의해 제조된 자가조립 페리틴 케이지에 관한 것이다.
본 발명은 서로 다른 2 이상의 페리틴 단량체로 구성되는 키메릭 페리틴 케이지를 제조함에 있어서 재조합 이중발현벡터를 이용함으로써, 종래 키메릭 페리틴 케이지를 제조하기 위하여 자가조립된 페리틴 케이지에 극한의 pH 조건 또는 고농도 화학적 처리를 통해 분리하는 과정 및 단량체 개질 후 다시 자가조립을 위해 앞서 처리한 극한 조건을 제거하는 과정을 반복하여야 하는 문제를 해결하였다.
이에, 종래 극한 조건에 의한 단백질 손상에 따른 구조 변화 및 기능성 상실 등을 방지하여 목적하는 키메릭 페리틴 케이지를 안정적인 수율로 제조할 수 있는 이점이 있다.
또한, 본 발명의 재조합 이중발현벡터를 이용하여 페리틴 케이지를 제조하는 경우, 숙주 내에서 서로 다른 2종 이상의 페리틴 단량체가 상당 정도의 균일성(서로 다른 단량체의 개수 비율이 바람직하게는 약 1:1 내외인 구성 비율적 균일성 및 서로 번갈아가며 이웃하여 연결되는 구조 형태적 균일성)을 나타내며 자가조립을 이루어 균일성이 높은 보다 우수한 고-기능성 및 고-효능 키메릭 페리틴 케이지를 제조할 수 있는 이점이 있다.
도 1은 본 발명의 재조합 이중발현벡터의 구조 및 이를 이용하여 제조되는 자가조립 키메릭 페리틴 케이지를 개략적으로 도시한 도면이다.
도 2는 본 발명의 재조합 이중발현벡터의 상세 구조를 도시한 도면이다.
도 3은 본 발명의 재조합 이중발현벡터를 이용하여 숙주 내에서 자가조립 키메릭 페리틴 케이지가 형성되는 과정을 개략적으로 도시한 도면이다.
도 4는 종래 키메릭 페리틴 케이지를 제조하는 과정을 개략적으로 도시한 도면이다.
도 5는 본 발명의 실시예 3에 따른 두 가지 gel 타입의 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동(Polyacrylamide gel electrophoresis, PAGE) 결과를 나타낸 것으로, 도 5a는 SDS- PAGE, 도 5b는 Native-PAGE 결과를 나타낸 것이다. 도 5a 및 5b에서 숫자로 표시된 1, 2, 3 및 4 밴드는 각각 다음의 단백질로 PAGE 수행한 결과 나타난 밴드이다. 1: 마커(marker), 2: 실리카 형성 펩타이드(SFP)가 융합되지 않은 페리틴 단량체만으로 구성된 페리틴 케이지, 3: SFP가 융합된 페리틴 단량체만으로 구성된 SFP-융합 페리틴 케이지, 4: 실시예 2-3에서 분리 및 정제한 본 발명의 키메릭 페리틴 케이지.
도 6은 본 발명의 실시예 4에 따라 형성된 실리카 입자의 크기를 입도 분석기를 이용하여 측정한 결과를 나타낸 것으로, 도 6a는 실시예 3의 대조군 3인 SFP-융합 페리틴 케이지, 도 6b는 실시예 2-3에서 분리 및 정제한 본 발명의 키메릭 페리틴 케이지를 각각 실리카 전구체와 반응시켜 페리틴을 중심으로 실리카 입자를 형성시킨 뒤, 입자의 크기를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 재조합 이중발현벡터의 상세 구조를 도시한 도면이다.
도 3은 본 발명의 재조합 이중발현벡터를 이용하여 숙주 내에서 자가조립 키메릭 페리틴 케이지가 형성되는 과정을 개략적으로 도시한 도면이다.
도 4는 종래 키메릭 페리틴 케이지를 제조하는 과정을 개략적으로 도시한 도면이다.
도 5는 본 발명의 실시예 3에 따른 두 가지 gel 타입의 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동(Polyacrylamide gel electrophoresis, PAGE) 결과를 나타낸 것으로, 도 5a는 SDS- PAGE, 도 5b는 Native-PAGE 결과를 나타낸 것이다. 도 5a 및 5b에서 숫자로 표시된 1, 2, 3 및 4 밴드는 각각 다음의 단백질로 PAGE 수행한 결과 나타난 밴드이다. 1: 마커(marker), 2: 실리카 형성 펩타이드(SFP)가 융합되지 않은 페리틴 단량체만으로 구성된 페리틴 케이지, 3: SFP가 융합된 페리틴 단량체만으로 구성된 SFP-융합 페리틴 케이지, 4: 실시예 2-3에서 분리 및 정제한 본 발명의 키메릭 페리틴 케이지.
도 6은 본 발명의 실시예 4에 따라 형성된 실리카 입자의 크기를 입도 분석기를 이용하여 측정한 결과를 나타낸 것으로, 도 6a는 실시예 3의 대조군 3인 SFP-융합 페리틴 케이지, 도 6b는 실시예 2-3에서 분리 및 정제한 본 발명의 키메릭 페리틴 케이지를 각각 실리카 전구체와 반응시켜 페리틴을 중심으로 실리카 입자를 형성시킨 뒤, 입자의 크기를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
이하, 구체적인 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 설명하기 위한 예시에 불과하며, 이들 실시예에 의해 본 발명의 범위가 어떠한 의미로든 한정되는 것으로 해석되어서는 아니된다.
실시예 1: 재조합 이중발현벡터의 제작
pETDuet-1 벡터(Novagen Inc.)에 실리카를 형성할 수 있는 펩타이드(SFP)를 유전적 개질(genetic modification)한 페리틴 단량체를 MCS 1 (Multi-cloning site 1)에 삽입하고 별도의 기능성을 부여하지 않은 페리틴 단량체를 MCS 2에 삽입하였다.
구체적으로, 인간의 중쇄 페리틴(human Ferritin heavy chain: Fn) 유전자는 pUC57-Fn OPT (GenScript USA Inc.)를 주형으로 PCR을 수행하여 준비하였다. 그 다음, 상기 PCR 산물로 확보된 Fn 유전자를 pET-42b 벡터에 삽입하여 pET-Fn 플라스미드를 제조하였다. 상기 PCR 수행을 위한 정방향 프라이머(서열변호 5) 및 역방향 프라이머(서열번호 6)의 구체적인 정보는 하기 표 3과 같다.
| F-Fn 프라이머 (서열번호 5) |
CATATGACGACCGCGTCTACCTCTCAAGTG |
| R-Fn 프라이머 (서열번호 6) |
CCACTGAGGCTGTTACTTAGCACTGAGCTC |
그 다음, SFP이 융합된 페리틴(SFP-페리틴)을 제조하기 위하여, pUC57-Fn OPT 플라스미드를 주형으로 하여 SFP 중 Kpt (서열번호 3, 4)를 Fn의 아미노 말단에 도입하기 위한 정방향 프라이머 3개를 하기 [표 4]와 같이 제작하였다.
| F1-Kpt 프라이머 (서열번호 7) |
CATCATGATGGCAGTACGACCGCGTCTAC |
| F2-Kpt 프라이머 (서열번호 8) |
CCCACCATCACCATCATCATGATGGCAGT |
| F3-Kpt 프라이머 (서열번호 9) |
CATATGA AGCCGACCCACCATCACCATC |
상기 F1과 R-Fn으로 첫 PCR을 수행 후 그 산물을 다시 주형으로 F2와 R-Fn으로 PCR을 수행하고 그 산물을 다시 주형으로 하여 마지막 F3와 R-Fn으로 PCR을 수행하여 Kpt-Fn 유전자를 얻은 후 T-벡터인 pGEM-T Easy vector (Promega Co., Madison, WI)에 서브 클로닝 하였다. 제한 효소 NdeI / XhoI으로 상기 서브 클로닝된 T-벡터로부터 Kpt-Fn 유전자 단편을 절단하고, 같은 제한 효소로 처리된 pET-42b 벡터를 이용하여 pET-Kpt-Fn을 발현 벡터를 제조하였다. 삽입된 모든 DNA 염기 서열은 자동화된 DNA 시퀀싱(Cosmo Genetech Co.,Seoul)에 의해 확인하였다.
그 다음, 상기 pET-Kpt-Fn 벡터에 삽입된 SFP-융합 페리틴을 주형으로 하여 하기 [표 5]의 정방향 프라이머(서열번호 10) 및 역방향 프라이머(서열번호 11)를 사용해 PCR을 수행하여 얻은 PCR 산물을 제한효소인 NcoI / HindIII를 처리 후 같은 효소로 처리한 pETDuet-1 벡터의 MCS 1에 삽입하였다.
| F-Kpt-Fn 프라이머 (서열번호 10) |
5'-TATACCATGGGCAAGCCGACC-3' |
| R-Kpt-Fn 프라이머 (서열번호 11) |
5'-GGCCGCAAGCTTACGATTCATTGTCGGAGTCAC-3' |
개질되지 않은 페리틴은 서열이 삽입된 pET-42b 벡터(pET-Fn)에 제한효소인 NdeI / XhoI 처리 후, 같은 효소를 처리한 SFP 융합 페리틴(SFP-페리틴)이 삽입된 pETDuet-1 벡터의 MCS 2에 삽입하여 이중발현벡터를 제조하였다.
실시예 2: 자가조립 키메릭 페리틴 구조체의 형성
실시예 2-1: 재조합 이중발현벡터를 이용한 형질전환
pETDuet-1 벡터가 가지고 있는 T7 프로모터(promoter)를 이용하기 위하여, T7 RNA 폴리머라제를 가지고 있는 대장균(BL21(DE3))에 상기 실시예 1에서 제조한 이중발현벡터를 형질전환하여 키메릭 페리틴 생산 균주를 제조하였다.
실시예 2-2: 단백질의 발현
상기 실시예 2-1에서 수득한 키메릭 페리틴 이중발현벡터로 형질전환된 대장균(BL21(DE3))을 암피실린(50ug/ml)이 포함된 LB 액체 배지에 37℃ 조건에서 배양하여 600 nm 흡광도가 0.4 내지 0.6 (au) 정도에 이를 때까지 성장시킨 후, 최종 농도 0.1 mM이 되도록 IPTG (Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside)를 첨가하였다. 그 다음, 37℃에서 4시간 동안 배양하여 키메릭 단백질 발현을 유도하였다. 이어서, 균주를 원심분리기로 회수하여 초음파 처리로 파쇄하고, 4℃에서 13,000 rpm으로 원심분리한 후 가라앉은 불순물을 제거하고 상층액만 회수하였다. 상기 상층액을 60℃에서 10분간 처리하여 침전된 불필요한 단백질을 위 조건과 동일하게 원심분리하여 최종 단백질 용액을 회수하였다.
실시예 2-3: 단백질의 분리 및 정제
Kpt 펩타이드는 아미노산 서열(서열번호 3) 상으로 히스티딘(Histidine, His)이 6개가 존재하여 흔히 알려진 His-tag 처럼 니켈수지에 결합할 수 있다. 이를 이용해 친화성 크로마토그래피(affinity chromatography)를 진행하여 분리 및 정제하였다. 니켈수지를 사용하였으며 불순물 제거 및 회수를 위해 이미다졸(Imidazole)이 첨가된 완충용액을 사용하였다.
실시예 3: 자가조립 키메릭 페리틴 케이지 형성의 확인
상시 실시예 2-3에서 분리 및 정제한 단백질이 키메릭 페리틴 케이지 구조를 형성하고 있는 지 확인하기 위하여, 하기와 같은 두 가지 겔(gel) 타입에서 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동(Polyacrylamide gel electrophoresis, PAGE)을 수행하였다. 하기 두 가지 PAGE 수행 시 사용된 대조군은 다음과 같다:
대조군 1: 마커(marker)로, 크기를 알고 있는 물질로 구성되어 있어, gel 분석 시 샘플과 함께 분석하여 위치를 비교함으로써 샘플의 크기를 유추할 수 있도록 도와준다.
대조군 2: 실리카 형성 펩타이드(SFP)가 융합되지 않은 페리틴 단량체만으로 구성된 페리틴 케이지로, SFP를 포함하지 않는다.
대조군 3: SFP가 융합된 페리틴 단량체만으로 구성된 SFP-융합 페리틴 케이지로, 모든 페리틴 단량체 표면에 SFP가 융합되어 있어, 1개 페리틴 케이지에 총 24개의 SFP가 포함되어 있다.
실시예 3-1: SDS (Sodium dodecyl sulfate)-PAGE
SDS는 친수성과 소수성을 모두 가진 물질로, 3차 구조의 단백질이 SDS와 반응하면 1차 구조로 풀어지면서 크기에 따라 분리될 수 있도록 도와준다. 이에 페리틴 케이지를 이용하여 SDS-PAGE를 수행하는 경우, 각 페리틴 케이지가 각각의 단량체로 분리되게 되므로 단량체의 크기를 확인할 수 있다.
실험에서 사용한 SDS-PAGE gel은 30% acryl/bis-acryl amide를 기준으로 5% staking gel과 12% separating gel을 제작하여 사용하였으며 구성에는 SDS (Sodium Dodecyl Sulfate), APS (Ammonium Persulfate) 및 TEMED (Tetramethyl ethylenediamine)가 첨가되며, 각 gel의 pH를 유지하기 위한 완충용액은 Tris를 이용하였고 staking gel은 pH 6.8, separating gel은 pH 8.8로 제작하였다.
실험 결과, 마커(도 5a, 1번 밴드)와 비교할 때, 대조군 2는 SFP가 융합되지 않은 페리틴 케이지로서, 단량체의 크기가 약 21 kDa으로 가장 낮은 곳에 밴드가 형성되었으며(도 5a, 2번 밴드), 대조군 3은 SFP가 융합된 페리틴 케이지로서, SFP-융합 페리틴 단량체의 크기가 약 23 kDa으로 가장 높은 곳에 밴드가 형성되었다(도 5a, 3번 밴드). 상기 실시예 2에서 분리 및 정제하여 수득한 본 발명의 키메릭 페리틴 케이지의 경우, 약 21 kDa 및 24 kDa 모두에서 밴드가 형성되는 것으로 확인되어(도 5a, 4번 밴드), SFP가 융합되지 않은 페리틴 단량체 및 SFP-융합 페리틴 단량체가 함께 자가조립된 키메릭 페리틴 케이지임이 확인되었다.
실시예 3-2: Native-PAGE
Native PAGE는 SDS가 포함되지 않은 gel 타입의 분석으로서, 단백질 3차 구조가 분리되지 않고 그대로 진행된다. 이에 단백질의 크기나 표면 물질 등에 따라 내려가는 속도가 다르므로 이를 이용하여 크기를 비교할 수 있으며, 본 실시예에서는 각 군의 페리틴 케이지의 크기를 확인할 수 있다.
실험에서 사용한 Native-PAGE gel은 30% Acrylamide/Bis-acrylamide를 기준으로 4% staking gel과 5% separating gel을 제작하여 사용하였으며 구성에는 30% Acrylamide/Bis-acrylamide, APS (Ammonium Persulfate) 및 TEMED (Tetramethyl ethylenediamine)가 첨가되며, 각 gel의 pH를 유지하기 위한 완충용액은 Tris를 이용하였고 staking gel은 pH 6.8, separating gel은 pH 8.8로 제작하였다.
실험 결과, 마커(도 5b, 1번 밴드)와 비교할 때, 대조군 2는 SFP가 융합되지 않은 페리틴 케이지로서 약 480 kDa으로 가장 낮은 곳에 밴드가 형성되었으며(도 5b, 2번 밴드), 대조군 3은 SFP가 융합된 페리틴 케이지로서 크기가 약 536 kDa으로 가장 높은 곳에 밴드가 형성되었다(도 5b, 3번 밴드). 상기 실시예 2에서 분리 및 정제하여 수득한 본 발명의 키메릭 페리틴 케이지의 경우, 대조군 2 및 대조군 3에서 형성된 밴드의 사이에 위치한 약 508 kDa에서 밴드가 형성되는 것으로 확인되어(도 5b, 4번 밴드), SFP가 융합되지 않은 페리틴 단량체 및 SFP-융합 페리틴 단량체가 함께 자가조립된 키메릭 페리틴 케이지임이 확인되었다. 이에 나아가, 본 발명의 키메릭 페리틴 케이지의 경우 단일 밴드가 형성된 것으로 미루어, 서로 다른 두가지 단량체가 상당 정도로 일정 비율로 구성된 키메릭 페리틴 케이지가 형성되었음을 확인할 수 있다.
실시예 4: 실리카 입자 크기 비교를 통한 자가조립 키메릭 페리틴 케이지 형성의 확인
실시카 전구체와 실리카 형성 팹타이드(SFP)가 반응하여 실리카 입자를 형성하는 경우, SFP의 수에 따라 형성되는 실리카 입자의 크기가 달라지게 된다. 이에 키메릭 페리틴 케이지를 이용하여 실리카 입자를 형성하는 경우, SFP-융합 페리틴 단량체만으로 구성된 SFP-융합 페리틴 케이지와 비교할 때, SFP를 적은 수로 포함하므로 실리콘 입자가 작게 형성될 것으로 예측할 수 있다. 위의 사항을 바탕으로, 본 발명의 상시 실시예 2-3에서 분리 및 정제한 단백질(키메릭 페리틴 케이지)과 상기 실시예 3의 대조군 3인 SFP-융합 페리틴 케이지 각각을 실리카 전구체와 함께 반응시켜 페리틴을 중심으로 실리카 입자를 형성시킨 뒤, 입도 분석기를 이용해 입자의 크기를 측정하여, 본 발명에서 수득한 단백질이 키메릭 페리틴 케이지 구조를 형성하고 있는 지 여부를 확인하였다. 구체적인 실험 방법은 하기와 같다.
1 M의 TMOS (Tetramethyl orthosilicate)에 HCl을 첨가하여 10분간 반응시킨 후, TMOS 100 mM과 페리틴 단백질 400 ug/ml를 혼합하여 실온에서 5분간 진탕 반응시켰다. 그 다음, 원심 분리하여 실리카로 코팅된 페리틴 입자를 가라앉힌 뒤, 상층액을 버리고 증류수로 3회 세척하였다.
실험 결과, SFP-융합 페리틴 단량체만으로 구성된 대조군 3의 SFP-융합 페리틴 케이지의 경우, 약 3,969 nm에서 피크가 형성되었으며 평균 입자 크기는 약 3,949 nm (표준편차 801.9)인 것으로 확인되었다(도 6a). 상기 실시예 2에서 분리 및 정제하여 수득한 본 발명의 키메릭 페리틴 케이지의 경우, 예상대로 대조군 3의 케이지 보다 크기가 작은 것으로 확인되었으며, 구체적으로 약 569 nm에서 피크가 형성되었으며 평균 입자 크기는 약 486.8 nm (표준편차 216.8)인 것으로 확인되어(도 6b), SFP가 융합되지 않은 페리틴 단량체 및 SFP-융합 페리틴 단량체가 함께 자가조립된 키메릭 페리틴 케이지임이 확인되었다.
실시예 5: 자가조립 키메릭 페리틴 케이지의 각 단량체의 구성 비율 확인
키메릭 페리틴 내 SFP-융합 페리틴 단량체 및 SFP가 융합되지 않은 페리틴 단량체의 구성 비율을 확인하기 위하여 정제된 페리틴 단백질 1 mg/ml를 가수분해 및 유도체화 처리 후 건조한 시료를 다시 녹여 아미노산 조성분석기(제조사: Agilent, 제품명: 1260 infinity UHPLC)로 아미노산 조성 분석을 진행하였다. SFP가 융합되지 않은 페리틴과 SFP 융합-페리틴(도 5b, 2번 및 3번 밴드)의 아미노산 서열상 아미노산 비율과 키메릭 페리틴의 아미노산 조성 분석 값을 비교했을 때 키메릭 페리틴이 가지는 24개의 단량체 중 SFP-융합 페리틴 단량체는 약 12.6개로 계산되었으며, Native-PAGE (도 5b) 결과와 함께 분석하였을 때 균일한 크기와 비율을 가지는 키메릭 페리틴이 제작된다는 것이 확인되었다.
본 명세서는 본 발명의 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 충분히 인식하고 유추할 수 있는 내용은 그 상세한 기재를 생략하였으며, 본 명세서에 기재된 구체적인 예시들 이외에 본 발명의 기술적 사상이나 필수적 구성을 변경하지 않는 범위 내에서 보다 다양한 변형이 가능하다. 따라서 본 발명은 본 명세서에서 구체적으로 설명하고 예시한 것과 다른 방식으로도 실시될 수 있으며, 이는 본 발명의 기술 분야에 통상의 지식을 가진 자이면 이해할 수 있는 사항이다.
Claims (8)
- 서로 다른 제1 페리틴(ferritin) 단량체(monomer) 및 제2 페리틴 단량체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하며, 상기 제1 페리틴 단량체 및 제2 페리틴 단량체 중, 적어도 1 이상은 N-말단 또는 C-말단에 목적 펩타이드 또는 단백질이 융합된 융합 페리틴 단량체인 것인, 재조합 이중발현벡터.
- 제1항에 있어서, 상기 목적 펩타이드 또는 단백질은 실리카 형성 펩타이드(silica forming peptide), 항원, 항체, 리간드 펩타이드, 단백질 약물, 세포독성 단백질 및 형광 단백질로 이루어진 군에서 선택되는 1 종 이상인 것인, 재조합 이중발현벡터.
- 제1항에 있어서, 상기 제1 페리틴 단량체는 N-말단에 실리카 형성 펩타이드가 융합된 융합 페리틴 단량체인 것인, 재조합 이중발현벡터.
- 제3항에 있어서, 상기 제1 페리틴 단량체는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열 및 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것인, 재조합 이중발현벡터.
- 제3항에 있어서, 상기 제1 페리틴 단량체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 2로 표시되는 염기서열 및 서열번호 4로 표시되는 염기서열을 포함하는 것인, 재조합 이중발현벡터.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 하나의 항에 따른 재조합 이중발현벡터로 형질전환된 형질전환체.
- 제6항의 형질전환체를 배양하는 단계를 포함하는, 자가조립 페리틴 케이지 제조방법.
- 제7항의 방법으로 제조된, 자가조립 페리틴 케이지.
Applications Claiming Priority (2)
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Publications (1)
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|---|---|
| KR20230113489A true KR20230113489A (ko) | 2023-07-31 |
Family
ID=87458416
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020230006758A KR20230113489A (ko) | 2022-01-21 | 2023-01-17 | 재조합 이중발현벡터 및 이를 이용한 키메릭 페리틴 케이지의 제조방법 |
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Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20140133478A (ko) | 2013-05-10 | 2014-11-19 | 고려대학교 산학협력단 | 표적 지향성 펩타이드를 포함하는 재조합 자기조립성 단백질 및 그의 용도 |
-
2023
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Patent Citations (1)
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