KR20230109483A

KR20230109483A - 리셉터 티로신 키나제 저해제를 탐색하는 방법

Info

Publication number: KR20230109483A
Application number: KR1020220005505A
Authority: KR
Inventors: 한봉관
Original assignee: 팔라디바이오텍 주식회사; 한봉관
Priority date: 2022-01-13
Filing date: 2022-01-13
Publication date: 2023-07-20

Abstract

리셉터 티로신 키나제 저해제를 탐색하는 방법 및 리셉터 티로신 키나제 저해제를 탐색하는데 사용하기 위한 조성물을 제공한다.

Description

리셉터 티로신 키나제 저해제를 탐색하는 방법{Method of screening receptor tyrosine kinase inhibitor}

리셉터 티로신 키나제 저해제를 탐색하는 방법 및 리셉터 티로신 키나제 저해제를 탐색하는데 사용하기 위한 조성물에 관한 것이다.

리셉터 티로신 키나제(Receptor tyrosine kinase, RTK)는 세포 주기 및 증식(cell cycle/cell proliferation) 신호의 발생을 활성화(activation)시키는 성장인자의 리셉터 단백질이다. RTK는 세포외부 도메인(extra-cellular domain), 막 통과 도메인 (transmembrane domain), 및 세포 내부 티로신 키나제 도메인(intracellular tyrosine kinase domain) 등 크게 세 부분으로 구성되어 있다.

RTK는 돌연변이 혹은 과발현(overexpression) 등으로 인한 세포증식 신호의 발생을 과활성화(hyperactivation)시킴으로써 암 발생과 밀접한 연관이 있다. 예를 들면 RTK 패밀리의 하나인 EGFR의 돌연변이에 의한 과도한 세포 증식신호 발생은 비소세포폐암(non-small-cell lung cancer), 소세포폐암(small cells lung carcinoma), 갑상선 수질암 (medullary thyroid cancer) 등의 암 발생과 밀접한 연관이 있다. 또 다른 예로는 RTK 패밀리인 HER2의 과도한 발현 혹은 과도한 활성화가 유방암 발생의 원인이 된다.

RTK의 과발현 혹은 과활성화가 암 발생의 원인이 됨이 현재 잘 밝혀져 있기 때문에 RTK는 현재 항암치료제 개발의 주요 타겟이 되고 있다. 예를 들면, 항암치료제인 Eylea (Regeneron/Bayer 사)와 Avastin (Roche 사)은 VEGFR를 타겟으로 하고 항암치료제인 Herceptin (Genentech 사)은 HER2를 타겟으로 한다.

RTK는 세포표면 막에 모노머의 비활성 상태(inactive state)로 존재하다가 세포 외부로부터 성장인자(growth factor)와 결합할 경우 다이머 복합체(dimer complex)를 형성하여 활성화 상태로 변환된다. 다이머 복합체를 형성한 RTK는 리셉터 내의 1068, 1148, 및 1173 위치의 티로신을 인산화시킴으로써 세포증식 신호 발생을 활성화시킨다. RTK 타겟 항암치료제는 RTK 활성화에 의한 세포증식 신호를 막음으로서 암 세포의 증식을 막고 이를 통해 항암효과를 나타내게 된다.

RTK는 이와 같이 탁월한 항암치료제 타겟이지만, RTK 타겟 항암물질의 스크린을 위한 효과적인 인 비트로 생화학적 분석 시스템(in vitro biochemical assay system)을 구축하는 것은 매우 어렵다. RTK는 인 비트로 생화학적 분석 시스템 구축을 위해 분리/정제 시, 막 통과 단백질이기 때문에 완충수용액(buffer solution) 내에서 본래의 3차 구조를 유지하지 못하는 특성을 가지고 있다.

따라서, 종래 기술에 의하더라도 리셉터 티로신 키나제 저해제를 탐색하는 방법이 요구되고 있다.

일 양상은 리셉터 티로신 키나제(receptor tyrosine kinase, RTK)의 세포내 세포질 도메인(inctracellular cytosolic domain, ICD)과 테스트 화합물의 혼합물을 인큐베이션하여 상기 ICD의 자가인산화 티로신 잔기(tyrosine residue of autophosphorylation) 중 하나 이상의 잔기를 인산화시키는 단계; 및 상기 ICD 중의 인산화된 티로신 잔기의 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 리셉터 티로신 키나제 저해제를 탐색하는 방법을 제공한다.

다른 양상은 상기 ICD가 코팅된 기판을 포함하는 리셉터 티로신 키나제 저해제를 탐색하는데 사용하기 위한 조성물을 제공한다.

상기 RTK는 VEGFR1, VEGFR2, VEGFR3, VEGFR4, PDGFR, FGFR, 또는 EGFR인 것일 수 있다. 상기 RTK 또는 ICD는 재조합된 것일 수 있다. 상기 ICD는 적어도 하나의 태그 서열을 포함할 수 있다. 상기 태그는 His, GST, a-tubulin, B-tag, E-tag, c-myc, FLAG 에피토프, HA, HSV, PK-tag, Protein C, T7, 또는 VSV-G인 것일 수 있다.

상기 ICD는 세포외 도메인(ectodomain), 및 막투과 도메인(transmembrane domain)을 포함하지 않는 것일 수 있다. 상기 ICD는 자가인산화 티로신 잔기에 인산을 부가하는 활성을 갖는 것일 수 있다. 상기 ICD는 서열번호 1의 669 내지 1210번 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 상기 ICD는 결합된 라벨을 포함하지 않는 것일 수 있다.

상기 ICD는 하나 이상의 변경된 아미노산을 갖는 것일 수 있다. 상기 ICD는 예를 들면, L858R, K868A, C1045S, C1045A, C773S, T790M, 또는 이들의 조합 치환을 포함하는 것일 수 있다.

상기 방법은 측정된 인산화된 티로신 잔기의 수준을 대조군 실험에서 측정된 인산화된 티로신 잔기의 수준과 비교하는 단계를 더 포함할 수 있다.

상기 대조군 실험은 상기 방법 중 상기 혼합물을 인큐베이션하는 단계에서, 상기 테스트 화합물의 부존재, 또는 상기 테스트 화합물이 대조군 화합물로 치환된 것일 수 있다. 상기 대조군 화합물은 RTK 저해제인 것일 수 있다. 상기 RTK 저해제는 예를 들면, AG1478, HER2를 과발현하는 유방암 치료에 허가된 항-HER2 항체인herceptin, cetuximab, 전이성 대장암 치료에 대하여 허가된 항-EGFR 항인 pantumumab, gefitinib, erlotinib, 또는 lapatinib일 수 있다.

상기 방법은 측정된 인산화된 티로신 잔기의 수준이 대조군 실험에서 측정된 인산화된 티로신 잔기의 수준에 비하여 감소된 경우, 상기 테스트 화합물을 RTK 저해제로 결정하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 감소는 예를 들면, 측정된 인산화된 티로신 잔기의 수준이 대조군 실험에서 측정된 인산화된 티로신 잔기의 수준에 비하여 10, 30, 50, 70, 100, 150, 200, 300, 500, 700, 1000, 2000, 5000, 또는 10,0000% 감소된 것일 수 있다.

상기 방법에 있어서, 상기 혼합물을 인큐베이션하는 단계는 상기 ICD의 자가인산화 티로신 잔기(tyrosine residue of autophosphorylation) 중 하나 이상의 잔기의 인산화가 일어나도록 하는 조건에서 수행하는 것일 수 있다. 상기 조건은 RTK의 키나제 활성에 의하여 티로신 잔기가 인산화도록 하는 기질, 보조인자, pH, 및 온도에 대한 조건일 수 있다. 상기 기질은 별도 유리된 기질을 포함하지 않고, 상기 ICD가 기판에 코팅 또는 고정된 경우, 고정된 다른 ICD 분자일 수 있다. 상기 인큐베이션은 액체 매질 중에서 수행되는 것일 수 있다. 상기 액체 매질은 수성 용액, 예를 들면, 물, 염수, 또는 버퍼일 수 있다. 상기 인큐베이션은 ATP, Mg²⁺, 환원제, 또는 둘 모두의 존재하에서 수행하는 것일 수 있다. 상기 환원제는 DTT일 수 있다. 상기 인큐베이션은 티로신 키나제 반응 완충용액(tyrosine kinase reaction buffer solution)을 포함하는 용액에서 수행될 수 있다. 상기 완충용액은 50 mM HEPES pH 7.4, 37.5 mM NaCl, 1 mM DTT, 5% 글리세롤, 62.5 ㎍/mL BSA, 10 mM MgCl₂및 100 μM ATP를 포함할 수 있다.

상기 ATP는 1nM 내지 10 mM으로 첨가되는 것일 수 있다. 상기 Mg2+는 5mM 내지 20mM, 5mM 내지 15mM, 또는 7.5mM 내지 12.5mM으로 첨가되는 것일 수 있다.

상기 방법에 있어서, 상기 ICD는 기판 상에 코팅된 것일 수 있다. 상기 코팅은 상기 ICD가 기판 상에 비공유 결합에 의하여 고정된 것일 수 있다. 상기 비공유 결합은 소수성 결합, 이온화 결합, 흡착, 수소 결합, 또는 그 조합을 포함할 수 있다. 상기 기판은 소수성 플라스틱 재질, 예를 들면, 폴리스티렌 재질을 갖는 것일 수 있다. 상기 기판은 웰 플레이트 또는 멀티-웰 플레이트인 것일 수 있다.

상기 방법은 상기 혼합물을 인큐베이션하는 단계 전에, 기판을 상기 ICD 함유 수성 용액 중에서 인큐베이션하여 ICD를 기판 표면에 코팅하는 단계를 포함하는 것일 수 있다. 상기 용액은 완충용액일 수 있다. 상기 완충용액은 PBS일 수 있다. 상기 PBS는 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na₂HPO₄, 및 1.8 mM KH₂PO₄를 포함하는 것일 수 있다

상기 기판은 소수성 플라스틱 재질, 예를 들면, 폴리스티렌 재질을 갖는 것일 수 있다. 상기 기판은 웰 플레이트 또는 멀티-웰 플레이트인 것일 수 있다.

상기 방법에 있어서, 상기 ICD 중의 인산화된 티로신 잔기의 수준을 측정하는 단계는 인큐베이션된 상기 ICD를 인산화된 티로신 잔기를 포함하는 상기 ICD에 결합하는 항체를 인큐베이션하는 단계, 및 인산화된 티로신 잔기를 포함하는 상기 ICD의 양을 검출하는 단계를 포함하는 것일 수 있다. 상기 항체는 인산화된 티로신 잔기에 특이적으로 결합하는 항체일 수 있다.

상기 ICD의 양을 검출하는 단계는 라벨이 결합된, 상기 항체에 결합하는 항체와 상기 항체를 인큐베이션하는 단계를 포함할 수 있다. 인큐베이션은 상기 항체에 결합하는 항체와 상기 항체가 결합하도록 하는 조건에서 액체 매질 중에서 수행될 수 있다. 상기 라벨은 형광 라벨, 효소, 형광단(fluorophores), 발색단(chromophores), 방사능동의원소(radioisotope), 색소(dye), 콜로이드 입자, 콜로이드 탄소(colloidal carbon), 락테스 입자, 화학발광제(chemiluminescent agent), 또는 이들의 조합인 것일 수 있다. 상기 효소는 예를 들면, HRP일 수 있다.

상기 혼합물을 인큐베이션하는 단계는 유리된 RTK의 자가인산화 잔기를 포함하지 않는 조건에서 수행되는 것일 수 있다.

다른 양상은 상기 ICD가 코팅된 기판을 포함하는 리셉터 티로신 키나제 저해제를 탐색하는데 사용하기 위한 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 ATP, Mg2+, 또는 상기 ICD의 효소 반응에 필요한 보조인자를 포함할 수 있다.

일 양상에 따른 리셉터 티로신 키나제 저해제를 탐색하는 방법에 의하면, 리셉터 티로신 키나제 저해제를 효율적으로 탐색할 수 있다.

다른 양상에 따른 리셉터 티로신 키나제 저해제를 탐색하는데 사용하기 위한 조성물은 리셉터 티로신 키나제 저해제를 탐색하는데 사용될 수 있다.

도 1은 EGFR, EGFR_cyto 및 EGFR_cyto_L858R의 도메인 구조를 나타낸 도면이다.
도 2는 마이크로플레이트의 웰 표면에 코팅된 EGFR_cyto_L858R 단백질을 EGFR 저해제인 AG1478의 존재하에서 인산화 반응을 시키고 인산화된 티로신 잔기를 항-포스포-Tyr 항체에 결합하는 HRP-접합된 항체를 사용하여 검출한 결과를 나타낸다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: EGFR의 세포내 세포질 도메인(ICD)을 이용한 RTK 저해제 탐색

본 실시예에서는 대표적인 RTK 중의 하나인 EGFR을 모델로 하여, 세포외 도메인과 막 통과 도메인이 제거된 세포내 세포질 도메인을 얻고, 이를 기판에 코팅한 후 테스트 화합물의 존재하에서 인산화 반응을 수행하고, 인산화되는 정도를 대조군과 비교하여 EGFR 저해제를 탐색하였다.

(1) EGFR의 세포내 세포질 도메인(ICD)

상기 ICD의 예로서 EGFR 전체 단백질 중 669-1210 아미노산 서열로 구성된 단편을 사용하였다. 이를 이하 EGFR_cyto라 한다. EGFR_cyto는 세포 외 도메인(extracellular domain, ECD)(1-645 a.a)과 막 통과 도메인(transmembrane domain, TM)(646-668 a.a)을 제외한, 티로신 키나제 도메인(tyrosine kinase domain, TKD)(712-979 a.a)이 포함된 세포 내 세포질 도메인(intracellular cytosolic domain, ICD) (669-1210 a.a)이다. 도 1은 EGFR, EGFR_cyto, EGFR_cyto_L858R 및 GST-EGFR_cyto_L858R의 도메인 구조를 나타낸 도면이다.

또한, 변경된 아미노산을 갖는 EGFR의 예로서 L858R을 갖는 것을 사용하였다. EGFR L858R 돌연변이는 활성화 증진된 EGFR 형태이다. 활성화된 EGFR은 자체 티로신 키나제 (tyrosine kinase) 활성에 의해 1068, 1148, 1173, 또는 이들의 조합 위치의 티로신을 인산화(phosphorylation)시킬 수 있다.

상기 EGFR, EGFR_cyto 및 EGFR_cyto_L858R는 각각 서열번호 1, 3, 및 5의 아미노산 서열을 갖고, 상기 EGFR, EGFR_cyto 및 EGFR_cyto_L858R을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 각각 서열번호 2, 4, 및 6의 뉴클레오티드 서열을 가질 수 있다. 또한, EGFR_cyto_L858R 단백질 분리 및 정제를 위하여 EGFR_cyto_L858R의 N-말단에 GST 태그를 융합시킨 GST-EGFR_cyto_L858R 유전자를 제작하였다. 서열번호 7 및 8은 GST-EGFR_cyto_L858R의 아미노산 서열 및 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.

GST-EGFR_cyto_L858R은 그를 코딩하는 재조합 유전자를 포함하는 재조합 미생물을 사용하여 준비하였다. 구체적으로, 미생물은 효모(Saccharomyces cerevisiae CEN.PK2-1K strain)를 사용하였고, GST-EGFR_cyto_L858R 유전자를 pRS426 GPD 벡터의 BamHI과 XhoI 제한효소 부위에 도입한 재조합 벡터 pPal-16을 얻었다. 재조합 벡터 pPal-16을 리튬-아세테이트 형질전환방법에 의하여 상기 미생물에 도입하고, 재조합 미생물을 Ura-drop-out synthetic complete 배지 중에 30^oC 온도의 200rpm 교반조건에서 8 시간 동안 배양하여 GST-EGFR_cyto_L858R을 발현시켰다. 배양물로부터 GST 친화성 정제 방법에 의하여 GST-EGFR_cyto_L858R을 분리 및 정제하였다.

(2) EGFR의 세포내 세포질 도메인(ICD)을 이용한 EGFR 저해제 탐색

(1)에서 얻어진 GST-EGFR_cyto_L858R을 사용하여 EGFR 저해제를 탐색하였다.

먼저 폴리스티렌 재질의 마이크로플레이트(microplate)(Nunc MaxiSorp 96 well plate (M5785, Sigma-Aldrich))에 인산완충생리식염수 (Phosphate-buffered saline,　PBS) 중 정제한 GST-EGFR_cyto_L858R 단백질 100uL를 넣고 4^oC에서 18시간 정치 상태로 인큐베이션하여 마이크로플레이트의 웰 표면에 GST-EGFR_cyto_L858R 단백질을 코팅하였다.

이후, 0.05% Tween-20 함유한 인산완충생리식염수 (Phosphate-buffered saline with 0.05% Tween,　PBS-T) (이후 세척완충용액1으로 명명) 200 uL를 각 웰에 첨가하여 2회 세척하였다. 상기 웰에, 티로신 키나제 반응 완충용액 (Tyrosine kinase reaction buffer solution) 100uL를 각 웰에 첨가하고 30^oC에서 45분 동안 정치 인큐베이션하여 EGFR의 자체 티로신 키나제 활성에 의한 자체 인산화 반응(autophosphorylation)을 진행시켰다. 그 결과, GST-EGFR_cyto_L858R 단백질의 1068, 1148, 및 1173 위치의 티로신 중 하나 이상이 인산화(phosphorylation)되도록 하였다. 이하 이를 대조군 실험이라고 한다. 상기 티로신 키나제 반응 완충용액은 50 mM HEPES pH7.4, 37.5 mM NaCl, 1 mM DTT, 5% 글리세롤, 62.5 μg/mL BSA, 10 mM MgCl₂, 및 100 μM ATP를 포함한다.

이때 EGFR의 티로신 키나제(tyrosine kinase) 저해제(inhibitor) 탐색을 위한 테스트 화합물의 예로서 EGFR의 티로신 키나제 저해제로 알려진 AG1478(InSolution AG1478, Sigma-Aldrich 658548-1MG) (50~200μM)을 첨가하여 동일한 조건에서 인큐베이션하였다. 이하를 이를 실험군이라고 한다. 이상의 티로신 키나제 반응 후, 세척완충용액1 200uL를 각 웰에 첨가하여 2회 세척하였다.

다음으로, 각 웰에 EGFR의 1068, 1148, 및 1173 위치 중 하나 이상의 위치의 티로신이 인산화된 에피토프(epitope)에 특이적으로 결합하는 항-포스포-Tyr 항체 즉, p-EGFR 항체 (9H2/15A2/10G12)(Santa Cruz Biotechnology, sc-57545/sc-81488/sc-81487, 이하 "1차 항체"라함)를 함유한 항체 반응 완충용액 즉 1% BSA 함유 PBS-T 용액에 각 항체를 1:100 희석한 용액 100uL를 첨가 후 25^oC에서 45분 동안 정치 인큐베이션하여 인산화된 티로신에 상기 항체를 결합시켰다. 사용된 각 항체 최종농도: sc-57545=1.0 ug/mL, sc-81488=1.0 ug/mL, sc-81487=1.0 ug/mL. 이후, 세척완충용액1 200uL를 각 웰에 첨가하여 4회 세척하였다.

다음으로, 각 웰에 항-포스포-Tyr 항체에 결합하는 HRP-접합된 항체(HRP-conjugated antibody, 2차 항체)를 첨가하고 25^oC에서 45분 동안 정치 인큐베이션하였다. HRP는 호스래디시 퍼옥디사제(horseradish peroxidase)를 나타낸다.

이후, 세척완충용액1(PBS-T) 200uL를 각 웰에 첨가하여 2회 세척한 다음, 세척완충용액2(PBS) 200uL를 각 웰에 첨가하여 2회 세척하였다.

각 웰에 TMB 기질(TMB substrate solution, standard, GenDEPOT, T3550-050) 100uL를 첨가하여 HRP 효소에 의한 발색 반응을 1분 동안 진행 후 발색 결과 이미지를 획득하였다.

이에 따라 웰에 존재하는 HRP의 양을 발색 반응으로 탐지함으로써 EGFR의 활성 및 저해를 분석하였다. 각 실험은 3배수로 진행하였다.

도 2는 마이크로플레이트의 웰 표면에 코팅된 EGFR_cyto_L858R 단백질을 EGFR 저해제인 AG1478의 존재하에서 인산화 반응을 시키고 인산화된 티로신 잔기를 항-포스포-Tyr 항체에 결합하는 HRP-접합된 항체를 사용하여 검출한 결과를 나타낸다. 도 2에서, no는 저해제 무첨가 대조군, AG1478은 저해제 AG1478 첨가 실험군을 나타낸다.

도 2에 나타낸 바와 같이, 대조군에 비하여 실험군에서 발색이 현저하게 감소되었다. 이는 기판에 코팅된 GST-EGFR_cyto_L858R 단백질을 ATP 존재하에서 인산화 반응시키더라도 인접하는 EGFR_cyto_L858R 단백질의 자가인산화 티로신 잔기를 인산화시킬 수 있다는 것을 나타낸다. 그러나, 청구발명이 특정 기작에 한정되는 것은 아니다.

또한, 이러한 인산화 정도는 EGFR의 티로신 키나제 활성 저해제인 AG1478 존재하에서 감소될 수 있고, 이는 저해제 부존재 또는 알려진 저해제 존재하에서의 인산화 정도와 미지의 테스트 화합물 존재하에서 인산화 정도를 비교하고, 그 인산화 정도가 감소하는 경우 상기 미지의 테스트 화합물을 EGFR 저해제로서 결정할 수 있다는 것을 나타낸다. 확인된 EGFR 저해제는 EGFR 타겟 항암치료제로 후보로 사용될 수 있다.

SEQUENCE LISTING <110> Palade Biotech Inc. <120> Method of screening receptor tyrosine kinase inhibitor <130> PN142538KR <160> 8 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 1210 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Arg Pro Ser Gly Thr Ala Gly Ala Ala Leu Leu Ala Leu Leu Ala 1 5 10 15 Ala Leu Cys Pro Ala Ser Arg Ala Leu Glu Glu Lys Lys Val Cys Gln 20 25 30 Gly Thr Ser Asn Lys Leu Thr Gln Leu Gly Thr Phe Glu Asp His Phe 35 40 45 Leu Ser Leu Gln Arg Met Phe Asn Asn Cys Glu Val Val Leu Gly Asn 50 55 60 Leu Glu Ile Thr Tyr Val Gln Arg Asn Tyr Asp Leu Ser Phe Leu Lys 65 70 75 80 Thr Ile Gln Glu Val Ala Gly Tyr Val Leu Ile Ala Leu Asn Thr Val 85 90 95 Glu Arg Ile Pro Leu Glu Asn Leu Gln Ile Ile Arg Gly Asn Met Tyr 100 105 110 Tyr Glu Asn Ser Tyr Ala Leu Ala Val Leu Ser Asn Tyr Asp Ala Asn 115 120 125 Lys Thr Gly Leu Lys Glu Leu Pro Met Arg Asn Leu Gln Glu Ile Leu 130 135 140 His Gly Ala Val Arg Phe Ser Asn Asn Pro Ala Leu Cys Asn Val Glu 145 150 155 160 Ser Ile Gln Trp Arg Asp Ile Val Ser 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Claims

리셉터 티로신 키나제(receptor tyrosine kinase, RTK)의 세포내 세포질 도메인(inctracellular cytosolic domain, ICD)과 테스트 화합물의 혼합물을 인큐베이션하여 상기 ICD의 자가인산화 티로신 잔기(tyrosine residue of autophosphorylation) 중 하나 이상의 잔기를 인산화시키는 단계로서, 상기 ICD는 기판 상에 코팅된 것인 단계;
상기 ICD 중의 인산화된 티로신 잔기의 수준을 측정하는 단계;
측정된 인산화된 티로신 잔기의 수준을 대조군 실험에서 측정된 인산화된 티로신 잔기의 수준과 비교하는 단계; 및
측정된 인산화된 티로신 잔기의 수준이 대조군 실험에서 측정된 인산화된 티로신 잔기의 수준에 비하여 감소된 경우, 상기 테스트 화합물을 RTK 저해제로 결정하는 단계를 포함하는, 리셉터 티로신 키나제 저해제를 탐색하는 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 대조군 실험은 상기 혼합물을 인큐베이션하는 단계에서, 상기 테스트 화합물의 부존재, 또는 상기 테스트 화합물이 대조군 화합물로 치환된 것인 방법.
청구항 3에 있어서, 상기 대조군 화합물은 RTK 저해제인 것인 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 혼합물을 인큐베이션하는 단계는 상기 ICD의 자가인산화 티로신 잔기(tyrosine residue of autophosphorylation) 중 하나 이상의 잔기의 인산화가 일어나도록 하는 조건에서 수행하는 것인 방법.
청구항 4에 있어서, 상기 인큐베이션은 ATP, Mg²⁺, 또는 둘 모두의 존재하에서 수행하는 것인 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 혼합물을 인큐베이션하는 단계 전에, 기판을 상기 ICD 함유 용액 중에서 인큐베이션하여 ICD를 기판 표면에 코팅하는 단계를 포함하는 것인 방법.
청구항 6에 있어서, 상기 기판은 폴리스티렌 재질로 된 것인 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 ICD 중의 인산화된 티로신 잔기의 수준을 측정하는 단계는 인큐베이션된 상기 ICD를 인산화된 티로신 잔기를 포함하는 상기 ICD에 결합하는 항체를 인큐베이션하는 단계, 및 인산화된 티로신 잔기를 포함하는 상기 ICD의 양을 검출하는 단계를 포함하는 것인 방법.
청구항 8에 있어서, 상기 ICD의 양을 검출하는 단계는 라벨이 결합된, 상기 항체에 결합하는 항체와 상기 항체를 인큐베이션하는 단계를 포함하는 것인 방법.
청구항 5에 있어서, 상기 ATP는 5mM 내지 15 mM으로 첨가되는 것인 방법.
청구항 5에 있어서, 상기 Mg2+는 10μM 내지 20μM로 첨가되는 것인 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 RTK는 VEGFR1, VEGFR2, VEGFR3, VEGFR4, PDGFR, FGFR, 또는 EGFR인 것인 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 ICD는 적어도 하나의 태그 서열을 포함하는 것인 방법.
청구항 13에 있어서, 상기 태그는 His, GST, a-tubulin, B-tag, E-tag, c-myc, FLAG 에피토프, HA, HSV, PK-tag, Protein C, T7, 또는 VSV-G인 것인 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 혼합물을 인큐베이션하는 단계는 유리된 RTK의 자가인산화 잔기를 포함하지 않는 조건에서 수행하는 것인 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 ICD는 세포외 도메인(ectodomain), 및 막투과 도메인(transmembrane domain)을 포함하지 않는 것인 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 ICD는 서열번호 1의 669 내지 1210번 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 ICD는 결합된 라벨을 포함하지 않는 것인 방법.
상기 ICD가 코팅된 기판을 포함하는 리셉터 티로신 키나제 저해제를 탐색하는데 사용하기 위한 조성물.
청구항 19에 있어서, ATP, Mg2+, 또는 상기 ICD의 효소 반응에 필요한 보조인자를 포함하는 것인 조성물.