KR20230108175A

KR20230108175A - 피크노제놀과 trail을 유효성분으로 포함하는 항암용 조성물

Info

Publication number: KR20230108175A
Application number: KR1020220003663A
Authority: KR
Inventors: 이대희; 이정은
Original assignee: 강릉원주대학교산학협력단
Priority date: 2022-01-10
Filing date: 2022-01-10
Publication date: 2023-07-18

Abstract

본 발명은 피크노제놀과 TRAIL을 유효성분으로 포함하는 항암용 조성물을 제공한다.

Description

피크노제놀과 TRAIL을 유효성분으로 포함하는 항암용 조성물{Anti cancer composition comprising pycnogenol and TRAIL as active ingredients}

본 발명은 항암용 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 TRAIL과 피크노제놀의 조합처리를 통해 암세포의 세포사멸을 유도하여 암세포, 특히 대장암 세포를 상승적으로 억제할 수 있을 뿐만 아니라 부작용을 감소시켜 항암제로서 매우 유용한 신규 항암용 조성물에 관한 것이다.

대장암은 결장과 직장에 생기는 악성종양을 말한다. 대장암의 발병 원인으로는 과도한 음주, 잘못된 식습관으로 인한 비만 등이 있다. WHO에 따르면 현재 우리나라는 2017년을 기준으로 아시아권에서 연간 1인당 알코올 섭취량이 1위로 음주량이 높은 나라이다. 또한 세계 연간 1인당 알코올 섭취량이 약 6.4 L, 우리나라가 약 16.7 L로 세계 평균을 한참 벗어난 섭취량을 보였다. 뿐만 아니라 우리나라 비만율은 2018년을 기준으로 2016년부터 3년 새 비만은 약 5%, 고도비만은 약 20%나 증가하였다. 이러한 결과를 바탕으로 현재 우리나라의 대장암 발병률은 2018년도 기준 암 중에서 4위로 꽤 높은 순위이며, 세계 대장암 발병률은 2018년 기준 10만 명당 45명으로 우리나라가 1위이다(National cancer center 2020). 이러한 대장암은 초기에 발견하면 수술이 간단하지만, 초기에는 증상이 뚜렷하지 않아 발견하기 쉽지 않다. 이로 인해 초기에 치료하지 못한 대장암은 다른 장기들과 접촉해 있는 대장에서 종양이 생기기 때문에 전이의 위험이 높다. 전이성 대장암은 수술 불가능하며, 항암 치료에서는 비 선택적인 항암제 치료로 인한 혈액학적 부작용, 구토, 복통, 발진, 탈모, 식욕부진 등 다양한 부작용이 나타나게 되며, 지속적인 치료로 인해 항암제에 대해 저항성이 높아져 내성이 생겨 치료 효과가 낮다 (Korean society of coloproctology 2017).

항암 치료는 수술 요법, 항암 약물 요법, 방사선 요법이 주된 치료법으로 그 중 항암 약물 요법은 장기간에 걸쳐 진행되며 항암제의 비 선택적 작용에 따른 부작용 및 항암 약물에 대한 암세포의 저항성 증가로 치료 효과가 낮다. 이를 극복하기 위한 항암제 저항성 경감 및 부작용 억제를 위한 새로운 항암제 연구가 필요하다. 또한 기존 항암제는 정상세포와 암세포를 구별하지 않아 세포 분열이 빠른 골수 세포나 혈구 세포, 모낭 세포에도 독성을 갖는다. 이로 인해 항암제 치료 과정에서 환자들의 항암제 순응도가 좋지 않다(Meegan, M. J., & O'Boyle, N. M. 2019). 하지만 종양괴사인자 상과(Superfamily)에 속하는 종양괴사인자 관련 세포사멸을 유도하는 리간드인 TRAIL은 정상세포에 대해서는 무해하면서, 선택적으로 암세포의 사멸을 유도할 수 있다고 알려져 있다. 정상세포에서 독성이 없는 이유로는 일반 정상세포에만 존재하는 수용체인 1, 2 (DcR1, DcR2)의 기능 때문이다(Noesel MM, Bezouw S, Salomons GS, Pieters R, Baylin SB, Herman JG, Versteeg R.2002). DcR1, DcR2는 TRAIL과 결합은 가능하지만, 세포 내에 신호전달 부분이 결여되어 있어 일반 세포들은 TRAIL에 의한 세포사멸 유도가 일어나지 않는다. 이러한 선택적인 암세포 사멸 유도의 특징을 가진 TRAIL은 새로운 암 치료제로 주목받고 있다. TRAIL은 고유의 TRAIL 유도 신호전달경로를 통해 암세포에서의 세포사멸을 유도한다. TRAIL은 TRAIL만의 수용체인 DR5라는 수용체와 결합하게 되면 그 즉시 세포사멸이 일어나는 기전을 갖고 있다. TRAIL 신호전달경로는 트라이머인 TRAIL이 TRAIL 수용체(DR5)에 결합하는 것에 의해 개시되어, 세포사멸 관련 도메인(FADD)이 활성 되어 pro-caspase-8을 활성화한다. 활성화된 caspase-8은 방출되어 caspase-3 와 BH3 결합영역 사멸 효능제(BH3 interacting-domain death agonist, Bid)를 절단한다. 절단된 Bid(tBid)는 미토콘드리아로 옮겨져 Bcl-2 관련 단백질(BAX)를 활성화하고, 사이토크롬 c를 방출한다. 방출된 사이토크롬 c, 세포사멸 프로테아제 활성인자 1(APAF1), 및 pro-caspase-9이 모여 세포자살체(apoptosome)을 형성하고, caspase-9를 활성화하여 caspase-3 절단을 증진해 세포사멸을 이끈다(Wang, S., El-Deiry, W. 2003). 하지만 TRAIL은 치료 시 혈장에서 짧은 반감기를 보이며, 유방암, 전립선암, 자궁암, 폐암, 간암, 뇌종양 등 다수의 암에서 TRAIL 내성이 나타나고 있다. 또한 TRAIL을 암세포에 지속해서 처리 시 TRAIL에 대해 감수성을 보이던 암세포들도 TRAIL에 대해 내성을 가지는 것으로 밝혀졌다. 하지만 기존의 항암제를 TRAIL과 병용 치료한 경우 TRAIL에 의한 독성 효과가 한층 증강됨으로써, 단독 처리 시에는 저항성을 갖던 암세포들이 독성을 보인 것이 밝혀졌다(Zhang, L., Fang, B. 2005). 이러한 결과를 보았을 때, 정상세포에는 영향이 없는 TRAIL의 병용 처리 연구가 중요하다. 앞서 말한 연구에서는 기존의 항암제와 병용 처리하였다. 이렇듯 TRAIL을 항암제와 병용 치료한 예시는 있지만, 부작용이 적은 천연물질과의 병용 치료에 관한 연구는 활발히 진행되고 있지 않다.

본 발명은 전술한 종래 기술의 문제점을 해결하기 위하여 제안된 것으로, 그 목적은 TTRAIL과 피크노제놀의 조합처리를 통해 암세포의 세포사멸을 유도하여 암세포, 특히 대장암 세포를 상승적으로 억제하면서도 부작용이 감소된 신규한 항암용 조성물을 제공함에 있다.

본 발명의 해결하고자 하는 과제는 이상에서 언급한 것으로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 해결하고자 하는 과제는 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기한 바와 같은 본 발명의 기술적 과제는 다음과 같은 수단에 의해 달성되어진다.

(1) 피크노제놀과 TRAIL을 유효성분으로 포함하는 항암용 조성물.

(2) 상기 (1)에 있어서, 대장암 치료용 조성물인 것을 특징으로 하는 항암용 조성물.

(3) 상기 (1) 또는 (2)에 의한 조성물을 비인간 동물에 투여하여 대장암을 억제 및 치료하는 것을 특징으로 하는 비인간 동물의 대장암 치료방법.

상술한 바와 같이 본 발명은 TRAIL과 피크노제놀의 조합처리를 통해 암세포의 세포사멸을 유도하여 암세포, 특히 대장암 세포를 상승적으로 억제하면서도 부작용이 감소된 신규한 항암용 조성물을 제공할 수 있다.

도 1은 피크노제놀과 TRAIL의 병용 처리에 의한 대장암 세포의 세포 증식 억제 효과에 대한 실험결과.
도 2는 피크노제놀과 TRAIL의 병용 처리에 의한 대장암 세포의 세포사멸 효과에 대한 실험결과.
도 3은 피크노제놀과 TRAIL의 병용 처리에 의한 대장암 세포의 EMT 관련 단백질 억제 효과에 대한 실험결과.
도 4는 피크노제놀로 유도된 TRAIL 수용체 DR5의 발현 변화에 대한 실험결과.
도 5는 피크노제놀과 TRAIL의 병용 처리에 의한 대장암 세포사멸 관련 단백질 억제 효과에 대한 실험결과.
도 6은 피크노제놀과 TRAIL의 병용 치료로 인한 대장암 유도 마우스들의 종양 억제 효과에 대한 실험결과.

본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 첨부되는 도면과 함께 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 수 있으며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하고, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.

본 발명의 실시예들을 설명함에 있어서 공지 기능 또는 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략할 것이다. 그리고 후술되는 용어들은 본 발명의 실시예에서의 기능을 고려하여 정의된 용어들로서 이는 사용자, 운용자의 의도 또는 관례 등에 따라 달라질 수 있다. 그러므로 그 정의는 본 명세서 전반에 걸친 내용을 토대로 내려져야 할 것이다.

이하, 첨부된 도면들을 참조하여 본 발명의 실시예에 대해 살펴보기로 한다.

본 발명에 따른 항암용 조성물은 피크노제놀과 TRAIL을 유효성분으로 포함한다. 피크노제놀은 프랑스 남서부 볼드 지방에서 생육하는 프랑스 해안 소나무의 수피에서 추출한 천연의 항산화 영양식품이다. 피크노제놀은 짙은 갈색의 분말로서, 대단히 높은 생리활성을 발휘하는 프로안소시아니딘을 비롯한 40종류 이상의 유기산을 포함한 특수한 플라보노이드 특성을 가진 활성산소제거제(Free Radical Terminater)로 저분자의 항산화물질인 폴리페놀 그룹에 속한다.

상기 본 발명에서 항암용 조성물은 바람직하게는 인간 대장암에 대한 억제 내지 치료용 조성물이며, 기존 대장암 세포에 대한 TRAIL 유도 세포사멸 과정에 있어서 피크노제놀을 조합처리함으로써 대장암세포의 증식억제 내지 암세포 세포사멸에 대한 상승적 효과를 제공한다.

본 발명에 의하면 피크노제놀은 대장암 세포주인 HCT116 세포에서 유의미하게 세포 증식을 억제한다(도 1A). 하지만 정상 세포인 CCD-18Co 세포에서는 증식 억제가 나타나지 않는다(도 1B). 또한 HCT116, HT-29, DLD-1에서 TRAIL과 피크노제놀을 병용 처리한 세포에서 세포 증식 억제 효과가 증가하는 것으로 나타난다(도 1C). 이것은 피크노제놀이 TRAIL과의 병용 처리가 대장암 세포 증식 억제에 영향을 미친다는 것을 알 수 있다. 뿐만아니라 FACS 결과에서 피크노제놀과 TRAIL의 병용 처리로 대장암 세포에서 세포사멸이 증가하는 것을 확인할 수 있다(도 2A, B).

또한, 피크노제놀의 EMT 관련 단백질 발현 억제 효과에 대하여, 피크노제놀은 농도 의존적으로 EMT 관련 단백질인 트위스트1(twist1)과 스네일(snail)의 발현을 억제하는 것으로 확인된다(도 3A). 또한 피크노제놀과 TRAIL의 병용 처리에서 단독으로 처리된 경우보다 트위스트1과 스네일에 대한 더욱 높은 억제 효과를 보여준다(도 3B). 이러한 결과로 피크노제놀이 대장암 세포의 전이를 억제시킴을 확인할 수 있다.

피크노제놀의 프로-아폽토시스(pro-apoptosis)와 안티-아폽토시스(anti-apoptosis), 수용체 DR5에 대하여, TRAIL 수용체인 DR5를 농도 의존적으로 증가시키며, 이러한 결과는 피크노제놀의 처리로 인해 TRAIL 수용체의 발현을 높여 TRAIL만 처리하였을 때와 비교하여 대장암 세포에서 세포사멸이 더욱 높게 증가됨을 확인해준다. 또한 프로-아폽토시스인 bax는 증가하하며, 안티-아폽토시스 bcl-2는 변화가 없다(도 4A). 또한 피크노제놀과 TRAIL의 병용 처리에서 세포사멸 관련 단백질인 클리브드 PARP와 클리브드 카스파제-8, 클리브드 카스파제-3를 증가시켰다. 또한 안티 아폽토시스인 bcl-2는 감소한다(도 5A, B, C). PARP은 DNA의 손상을 회복하는 역할을 하는 단백질로 카스파제-3의 활성화에 의하여 절단된다(Zhang, F., Lau, S. S., & Monks, T. J. 2012). 카스파제-8은 TRAIL 기전에서 세포사멸로 가는 신호전달 역할을 한다. 카스파제-3는 사이토크롬 c의 방출로 생성된 아폽토좀을 통해 활성화되어 세포사멸을 실행한다(Wang, S., El-Deiry, W. 2003). 이러한 결과는 피크노제놀이 대장암 세포의 전이를 억제하는 효과에 제한되는 것이 아닌 TRAIL의 수용체인 DR5의 발현에 영향을 미치며, 이로 인해 TRAIL의 세포사멸에 관여하는 카스파제-8, 카스파제-3이 활성화되어 TRAIL 저농도에서 피크노제놀에 의해 높은 세포사멸 효과를 보여주는 것이다.

이러한 사실로부터 본 발명에 의한 피크노제놀은 대장암 세포사멸 효과에 깊게 관여하며 그 효과를 증대시켜 시너지 효과가 있음이 확인되었다. 또한 피크노제놀은 대장암 유도 마우스 모델에서 TRAIL 단독 처리 군보다 병용 처리한 군에서 종양 생성 억제 효과를 보여주었다. 본 발명에 의하면 마우스들은 피크노제놀과 TRAIL의 병용 치료군에서 모든 군이 종양 크기가 비슷한 시점에서 치료하였음에도 불구하고, 종양 생성이 크게 억제되었으며, 이는 치료 시작 후 22일째부터 단독으로 치료한 군보다 종양 크기가 눈에 띄게 감소한 것을 확인할 수 있다(도 6A, B). 이러한 결과는 피크노제놀과 TRAIL의 병용 처리가 대장암 세포뿐만 아니라 대장암이 유도된 동물에서도 항암 치료의 가능성이 있음을 강력히 시사한다.

상기 본 발명에 따른 항암용 조성물은 약제학적 조성물이며, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.

상기 항암제에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토오즈, 덱스트로오즈, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.

제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calciumcarbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명에서 피크노제놀과 TRAIL의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 본 발명의 경우 1일 0.0001 내지 100mg/kg으로, 바람직하게는 0.001 내지 100mg/kg으로 투여하는 것이 좋으며, 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 피크노제놀과 TRAIL을 유효성분으로 함유하는 식품조성물을 포함한다. 상기 화합물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강보조 식품류 등이 있다. 이 때, 식품 또는 음료 중의 상기 화합물의 양은 일반적으로 본 발명의 조성물의 경우는 전체 식품 중량의 0.1 내지 20 중량%, 바람직하게는 1 내지 15 중량%로 가할 수 있으며, 음료 조성물에는 100 ㎖를 기준으로 1 내지 25 g, 바람직하게는 2 내지 15 g의 비율로 가할 수 있다. 본 발명의 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 화합물들을 함유하는 외에는 액체성분에는 특별한 제한은 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리스리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등), 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다.

상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드, 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다.

그 밖에 본 발명의 조성물들은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부당 0 내지 약 30 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

이하 본 발명의 내용을 실시예를 참조하여 보다 구체적으로 설명하고자 하나, 이들 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위해 제시된 것일 뿐 본 발명의 권리범위가 이에 한정되는 것으로 해석되어져서는 아니될 것이다.

[실시예]

[실험방법]

1. 실험 시약 및 항체

피크노제놀(Pycnogenol)은 ㈜대산에서 공급받았다. TRAIL(TNF-related apoptosis-inducing ligand)은 R&D 시스템즈에서 구매하였다. 클리브드 PARP(Cleaved PARP), 클리브드 카스파제-3(Cleaved Caspase-3), 클리브드 카스파제-8(Cleaved caspase-8), bcl-2, bax, 트위스트1(twist1), 스네일 항체는 셀시그날링테크놀로지(댄버, MA, 미국)에서 구매하였으며. β-액틴은 시그마알드리치(세인트루이스, MO, 미국)에서 구매하였다. 2차 항체인 항마우스 IgG 호오스래디쉬 퍼옥시다제 (HRP)와 항래빗 IgG HRP는 셀시그날링테크놀로지에서 구매하였다. EZ-Cytox는 도젠바이오에서 구매하여 사용하였으며, 아넥신 V-FITC 세포사멸 검출키트는 코마 바이오테크에서 구매하였다.

2. 세포 배양

인간 대장암 세포주 HCT116, HT-29, DLD-1, HCT116-루시퍼라제와 인간 정상 결장 세포주인 CCD-18Co을 ATCC에서 분양받았다. 세포들은 10% 소태아혈청(FBS, HyClone, Logan, 미국)을 함유한 Mccoy's 5a 배지(Gibco, Logan, 미국)과 RPMI1640 배지(인비트로젠, Carlsbad, CA, 미국) 배지에서 배양하였다. 모든 세포는 5% CO₂의 인큐베이터에서 37℃에 배양하였다.

2.1. 피크노제놀과 TRAIL의 세포 증식 억제 효과

대장암에서 피크노제놀의 세포 증식 억제 효과를 확인하기 위해 사람 대장암 세포주인 HCT116 세포를 96웰 플레이트에 1.0×10⁴ cell/well로 24시간 배양한 후 피크노제놀을 농도 2.5, 5, 10μg/ml로 처리한 후 24시간 관찰하였다. 또한 TRAIL과 피크노제놀의 병용 처리에 의한 세포 증식 억제 효과를 확인하기 위해 3개의 대장암 세포주와 1개의 정상 대장 세포주의 세포들을 96웰 플레이트에 24시간 배양한 후, 피크노제놀을 농도 5, 10μg/ml로 20시간 처리한 후 TRAIL을 2.5, 5ng/ml로 4시간 처리하였다. 또한 대조군으로 피크노제놀과 TRAIL을 각각 처리하였다. 모든 약물 처리 후 EZ-Cytox을 이용하여 측정하였다. EZ-Cytox 용액을 10μl 처리한 후 2시간 동안 37℃에 배양하였다. 그 후 ELISA를 이용하여 450nm에서 흡광도를 측정하였다.

3. 피크노제놀과 TRAIL의 대장암 세포사멸 효과

TRAIL과 피크노제놀의 세포사멸 효과를 확인하기 위해 유세포분석기(fluorescence activated cell sorting, FACS)를 진행하였다. HCT116 세포를 6웰 플레이트에 1.5×10⁵ cell/well로 24시간 배양하였다. 피크노제놀을 농도 5, 10μg/ml로 20시간 처리한 후 TRAIL을 농도 2.5, 5ng/ml로 4시간 처리하였다. 또한 대조군은 피크노제놀과 TRAIL을 각각 앞의 농도와 같이 처리하였다. 약물 처리 완료 후 트립신 EDTA로 세포를 수거하여 1000rpm으로 5분간 원심분리하였다. 상등액을 제거하고 차가운 PBS로 세척하여 1000rpm으로 5분간 원심분리하였다. 이후 DW로 희석된 바인딩버퍼 500μl로 모든 세포를 현탁하였다. 현탁된 세포에 아넥신 v를 각 농도 5μg/ml로 처리하고 상온 암실에 15분간 두었다. 다음으로 1000 X g 5분간 원심분리한 후 상등액은 제거하고 PI 농도 10μl로 세포를 현탁하여 처리한 다음 즉시 유세포 분석기(beckman cytoflex)를 사용하여 세포사멸을 측정하였다.

4. 피크노제놀과 TRAIL의 세포사멸 관련 단백질 발현 변화

세포를 60mm 플레이트에 3.5×10⁵ cells/well로 24시간 배양하였다. 피크노제놀을 농도 5, 10μg/ml로 20시간 처리한 후 TRAIL을 농도 2.5, 5ng/ml로 4시간 처리하였다. 또한 대조군은 피크노제놀과 TRAIL을 각각 앞의 농도와 같이 처리하였다. 약물 처리가 끝난 세포를 차가운 PBS로 한번 세척한 후 트립신 EDTA를 사용하여 세포를 수거하였다. 수거된 세포를 1500rpm에서 5분간 원심분리한 후 상등액을 제거하고 PBS를 사용하여 다시 현탁한 후 1500rpm으로 5분간 원심분리하였다. 세포를 2X SDS-샘플버퍼 100μl를 사용하여 용해하였다. 용해가 완료된 샘플을 100℃에 7분간 끓여주었다. BCA 용액 A, B 시약을 1:0.2의 비율로 희석하여 96웰 플레이트에 98μl씩 처리한 뒤 단백질 샘플을 각 웰에 2μl씩 처리하여 60℃에서 5분간 반응시켰다. 5분 뒤 단백질량을 확인하였다. 흡광도 측정은 시너지 htx(biotek) 장비를 사용하여 572nm에서 흡광도를 측정하여 정량하였다. SDS-PAGE를 통해 단백질을 분리한 후, PVDF 막을 사용하여 트랜스퍼를 진행하였다. 트랜스퍼가 완료된 막은 5% 스킴밀크를 TBST에 녹여 1시간 동안 상온에서 블로킹하였다. 1차 항체는 5% BSA를 TBST에 녹인 후 항체(클리브드 PARP, 클리브드 카스파제-3, 클리브드 카스파제-8, bcl-2, bax, 트위스트, 스네일, β-액틴)를 1000:1의 비율로 4℃에서 12시간 동안 반응시켰다. 2차 항체는 5% 스킴밀크로 1시간 동안 상온에서 반응시켰다. 항체 반응 후 케미독 (amersham imagequant 800)를 사용하여 ECL 용액으로 단백질 발현을 측정하였다.

5. 피크노제놀과 TRAIL의 대장암 종양 억제 효과

5.1. 실험동물

실험동물은 4주령 암컷 balb/c 누드마우스 들을 오리엔트 바이오(성남, 한국)로부터 구매하였다. 고형사료와 물을 자유롭게 섭취였으며, 일주일 동안의 적응 기간 후 실험하였다. 실험동물은 군당 3마리로 약물을 투여하지 않은 대장암 유도군, 피크노제놀과 TRAIL의 단일 치료군 및 두 약물의 병용 치료군으로 나누었으며, 종양 생성 후 종양 크기가 비슷한 실험동물을 선별하여 군당 종양 크기를 비슷하게 진행하였다.

5.2. 종양 생성 및 피크노제놀과 TRAIL 치료

실험동물의 종양 생성을 위해 대장암 세포주인 HCT116을 1ㅧ10⁷의 세포들을 실험 동물에게 피하주사하고 종양을 약 1주일간 길렀다. 실험동물 치료는 대장암 유도군은 생리식염수, 단일 치료군과 병용 치료군은 농도 피크노제놀 5mg/kg, TRAIL 2ng/kg로 치료하였으며, 병용 치료의 경우는 두 약물을 함께 복강 주사하였다. 치료는 주 2회 복강 주사하여 약 4주간 치료하였다.

5.3. 종양 크기 측정

유도된 종양 크기는 종양 생성 후 이틀에 한 번 켈리퍼로 측정되었으며, 종양 크기는 다음 공식을 이용하여 계산하였다. : 1/2×길이×(폭)² 계산하였다.

6. 통계 처리

통계 분석을 위해 GraphPad InStat 6 소프트웨어를 사용하였다. 그룹 간 비교를 위해 one-way ANOVA followed by tukey's post-hoc tests 방법을 이용하였다. 또한 그룹 간의 유의성 평가로 t-test 방법을 이용하였다. p-value 값은 *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001로 유의성을 평가하였다.

[실험 결과]

1. 피크노제놀과 TRAIL의 병용 처리에 의한 대장암 세포의 세포 증식 억제 효과

피크노제놀 처리는 대장암 세포의 감소된 생존도와 상관관계를 가진다. WST 실험을 통하여 대장암 세포에서 피크노제놀의 세포 증식 억제 효과를 확인하기 위해 대장암 세포주인 HCT116 세포에 피크노제놀을 농도 2.5, 5, 10μg/ml로 처리한 후 24시간 보았다(도 1A). 그 결과 농도 의존적으로 세포 증식을 억제하였다. 따라서 본 실험에서는 TRAIL과의 병용 치료 효과를 보기 위해 HCT116 세포에서 약 20% 정도의 세포 증식 억제를 보이는 5μg/ml로 진행하였으며, 그 외에 세포는 10μg/ml로 진행하였다. 그 이유로는 다른 연구 결과를 참고하였을 때 HCT116 세포는 다른 대장암 세포들보다 예민하여 약물의 저농도에서도 영향을 미친다는 점을 고려하였다. 이와 마찬가지로 TRAIL 또한 다른 연구 결과에서 TRAIL을 처리하였을 때, HCT116은 저농도에서의 효과를 보여주어 다른 세포들보다 낮은 농도로 진행하였다. 피크노제놀과 TRAIL의 병용 처리에 의한 대장암 세포의 세포 증식 억제 효과를 확인하기 위해 피크노제놀을 HCT116 5μg/ml, HT-29와 DLD-1은 10μg/ml로 24시간 처리한 후 TRAIL을 HCT116 2.5μg/ml, HT-29와 DLD-1 5ng/ml로 4시간 처리하였다. 또한 두 약물의 정상 세포에서의 세포 증식 억제를 확인하기 위해 대장 정상 세포 CCD-18Co 세포에 피크노제놀(10μg/ml)과 TRAIL(5ng/ml)를 처리하였다(도 1B, C). 그 결과 모든 세포에서 피크노제놀과 TRAIL을 각각 처리한 세포보다 두 약물을 병용 처리한 세포에서 더 높게 세포 증식이 억제되었다. 하지만 정상 대장 세포(CCD18-Co)는 피크노제놀(10μg/ml)과 TRAIL(5ng/ml)의 처리에 의한 영향을 받지 않았다. 피크노제놀과 TRAIL에 의한 대장암 세포의 처리는 대조군 정상 대장 세포(CCD18-Co)(도 1B)와 비교하였을 때, 세포 증식을 억제시켰다. 피크노제놀(10μg/ml)과 TRAIL(5ng/ml, 25ng/ml)의 병용 처리된 대장암세포의 세포 증식 억제는 피크노제놀 혹은 TRAIL 중 단독으로 처리된 세포보다 증가하였다.

2. 피크노제놀과 TRAIL의 병용 처리에 의한 대장암 세포의 세포사멸 효과

피크노제놀과 TRAIL로 처리된 대장암 세포에서 세포사멸 효과를 확인하기 위해 유세포분석기(FACS)를 진행하였다. HCT116 세포에 피크노제놀은 5μg/ml 20시간, TRAIL 2.5ng/ml 4시간으로 처리하였다. 그 결과 HCT116 세포에서 피크노제놀만 처리한 세포는 2.09%, TRAIL만 처리한 세포는 5.95%의 세포사멸을 보였으며, 피크노제놀과 TRAIL을 병용 치료한 세포에서는 15%로 각각 처리한 세포보다 약 3배 정도의 높은 세포사멸로 시너지효과를 확인하였다(도 2A). 또한 HCT116 세포와 같이 HT-29, DLD-1 세포에서도 피크노제놀과 TRAIL 중 각각 처리된 세포보다 병용 처리한 세포에서 세포사멸 비율이 증가하였다(도 2B).

3. 피크노제놀과 TRAIL에 의한 세포사멸 관련 단백질 발현 변화

3.1 피크노제놀과 TRAIL의 병용 처리에 의한 대장암 세포의 EMT 관련 단백질 억제 효과

피크노제놀로 처리된 HCT116 세포에서 EMT 관련 단백질인 트위스트1과 스네일의 발현을 확인하였다. 먼저, 피크노제놀의 EMT 관련 단백질 억제 효과를 확인하기 위해 피크노제놀을 2.5, 5, 10μg/ml 20시간 처리하여 BCA 방법으로 단백질을 정량한 후 웨스턴블롯을 진행하였다. 그 결과 피크노제놀을 처리한 세포에서 EMT 관련 단백질인 트위스트1과 스네일에서 농도 의존적으로 감소하는 것을 확인하였다(도 3A). 또한 피크노제놀과 TRAIL의 EMT 관련 단백질 억제 효과를 확인하기 위해 피크노제놀을 5μg/ml 20시간, TRAIL 2.5ng/ml 4시간을 처리하였다. 결과로는 피크노제놀과 TRAIL을 각각 처리한 세포보다 병용 처리한 세포에서 트위스트1과 스네일이 현저하게 감소한 것을 확인하였다(도 3B). 또한 도 3A와 도 3B를 비교하였을 때, 피크노제놀이 같은 농도인 5μg/ml에도 불구하고 병용 치료한 세포에서 현저히 감소시킨 것을 확인하였다.

3.2. 피크노제놀로 유도된 TRAIL 수용체 DR5의 발현 변화

피크노제놀을 단독 처리한 세포에서 TRAIL 관련 수용체인 DR5에 대한 영향과 프로-아폽토시스, 안티-아폽토시스 관련 단백질의 발현량을 확인하였다. 피크노제놀을 2.5, 5, 10μg/ml 20시간 처리하여 BCA 정량 방법으로 단백질을 정량한 후 웨스턴블롯을 진행하였다. 그 결과 수용체 DR5의 발현량이 피크노제놀 농도 의존적으로 증가하였다. 또한 프로-아폽토시스인 bax도 증가하였으며, 안티-아폽토시스인 bcl-2에는 증가하거나 감소시키는 영향은 없었다(도 4).

3.3. 피크노제놀과 TRAIL의 병용 처리에 의한 대장암 세포사멸 관련 단백질 억제 효과

피크노제놀의 TRAIL의 병용 처리에 의한 세포사멸 관련 기전에 대한 메커니즘을 추가로 확인하기 위해 HCT116 세포에서 TRAIL 관련 세포사멸 기전에 관여하는 단백질의 발현을 확인하였다. 피크노제놀을 5μg/ml 20시간, TRAIL 2.5ng/ml 4시간을 처리하였다. 그 결과 세포사멸의 유발자로 알려진 클리브드 PARP는 피크노제놀과 TRAIL을 각각 처리한 세포보다 병용 처리한 세포에서 증가한 단백질 발현량을 보여주었으며, TRAIL의 수용체 DR5 또한 병용 처리한 세포에서 증가함을 확인하였다(도 5A). 다음으로 세포사멸에서 신호전달 역할을 하는 클리브드 카스파제-8과 세포사멸의 실행에 관여하는 클리브드 카스파제-3의 발현량도 피크노제놀과 TRAIL을 병용 처리한 세포에서 증가하였다(도 5B). 마지막으로 프로-아폽토시스인 bax의 눈에 띄는 변화는 없었지만, 안티-아폽토시스인 bcl-2에는 감소하였다(도 5C).

4. 피크노제놀과 TRAIL의 병용 치료로 인한 대장암 유도 마우스들의 종양 억제 효과

피크노제놀과 TRAIL의 병용 치료가 대장암 유도 마우스들의 치료 효과를 확인하기 위해 생체내(in vivo) 실험을 진행하였다. 먼저 HCT116(1.0×10⁷) 세포를 balb/c 누드마우스 들에 피하주사하였다. 약 일주일 간의 종양 생성 후 종양 크기가 비슷한 마우스들을 선별하여 4개의 군으로 나누고, 피크노제놀(5mg/kg)과 TRAIL(2ng/kg)로 일주일에 두 번 치료하였다. 종양 크기 측정 결과 피크노제놀과 TRAIL을 각각 치료한 군보다 병용 치료한 군에서 종양 성장을 현저하게 감소시킨 것을 확인하였다(도 6).

이상의 설명은 본 발명의 기술 사상을 예시적으로 설명한 것에 불과한 것으로서, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 다양한 수정 및 변형이 가능할 것이다. 따라서, 본 발명에 개시된 실시예들은 본 발명의 기술 사상을 한정하기 위한 것이 아니라 설명하기 위한 것이고, 이러한 실시예에 의하여 본 발명의 기술 사상의 범위가 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 보호 범위는 아래의 청구범위에 의하여 해석되어야 하며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 기술사상은 본 발명의 권리범위에 포함되는 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims

피크노제놀과 TRAIL을 유효성분으로 포함하는 항암용 조성물.
제 1항에 있어서,
대장암 치료용 조성물인 것을 특징으로 하는 항암용 조성물.
제 1항 또는 제 2항에 의한 조성물을 비인간 동물에 투여하여 대장암을 억제 및 치료하는 것을 특징으로 하는 비인간 동물의 대장암 치료방법.