KR20230104377A - 새우젓으로부터 분리된 유산균 및 그의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 새우젓으로부터 분리되고, 황색포도상구균(Staphylococcus aureus), 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) 및 대장균(E. coli)에 대해 항균활성을 가지며, 항생제 내성 병원성 미생물, 구체적으로는 메티실린 내성 황색포도상구균(Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus, MRSA)에 대해 항균활성을 가지는 웨이셀라 속 균주(Weissella sp.)와 상기 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액 및 상기 배양액의 건조물로 이루어지는 군에서 선택된 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 항균조성물, 상기 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액 및 상기 배양액의 건조물로 이루어지는 군에서 선택된 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 항생제 내성 병원성 미생물에 대한 항균 조성물, 상기 균주, 상기 균주의 배양액 및 상기 배양액의 농축액으로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상을 유효성분으로 포함하는 생균활성제(probiotics)에 관한 것으로, 본 발명의 경우 위해 미생물에 대한 항균활성이 뛰어날 뿐만 아니라, 항생제 내성을 갖는 위해 미생물에 대한 항균활성도 뛰어나, 다양한 산업분야에 이용될 수 있다.
Description
본 발명은 위해 미생물, 특히 항생제 내성 균주인 MRSA(Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus)에 대한 항균 활성을 가지는 유산균 균주 및 상기 유산균 균주를 이용한 항균 조성물에 관한 것이다.
항생제는 병원균에 의한 감염증을 치료하는 약물로, 감염 증세에 뛰어난 효능을 보이나, 상기 항생제를 반복하여 사용하게 되는 경우, 해당 항생제에 내성을 가진 균주들이 살아남거나 돌연변이를 통하여 항생제에 대한 저항성을 가진 균주들이 생겨나게 되어 점점 더 항생제에 내성력이 강해진 병원균들이 생겨나게 된다.
이러한 항생제 내성으로 인해 항생제에 대해 저항할 수 있는 박테리아를 슈퍼박테리아라고 한다. 상기 슈퍼박테리아는 항생제의 잦은 사용에 저항할 수 있어 강력한 항생제에도 죽지 않는 박테리아를 의미하며, 1961 년 영국에서 MRSA (Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus, 메티실린 내성 황색포도상구균)이, 1996년 일본에서는 VRSA (Vancomycin-Resistant Staphylococcus aureus, 반코마이신 내성 황색포도상구균)이 보고 되었다.
상기 MRSA (methicillin resistant Staphylococcus aureus)는 메티실린 내성 황색포도상구균이라고 하며, 병원 감염의 주범으로서 항생제를 많이 사용하는 대형 종합병원에서 주로 발견되는데, 공기 중이나 의사, 간호사의 신체 부위, 메스, 병원 담요, 튜브 등 의료기구에 붙어서도 3시간 가량 생존할 수 있는 등 생존능력과 번식력이 강한 것으로 알려져 있다. 호흡기 계통과 수술 환자의 환부에 침투해 고열과 오한, 혈압 저하 등의 증상을 일으키는 것으로 알려져 있다.
감염과 음식물 부패의 원인이 되는 황색포도상구균에 대한 치료를 위해 개발된 항생제인 페니실린과 메티실린뿐만 아니라, 현재 개발되어 시판되는 항생제 중 가장 강력하다고 알려진 반코마이신에 대한 항생제 내성을 갖는 세균들이 발견되면서, 박테리오신(Bacteriocins)과 같은 위해 미생물에 대한 살균 효과를 가지거나 성장 억제 효과를 가지는 펩타이드 또는 단백질성 물질에 대한 연구의 필요성이 증대되고 있다.
또한, 유산균은 당류를 발효해서 50% 이상 젖산을 생성하는 세균으로, 인간이 이용할 수 있는 가장 유익한 미생물이다. 음식물뿐만 아니라 포유동물의 구강과 소화관, 토양 등 자연계에 널리 분포하고 있으며, 식품의 보존과 관능적 특성과 관련된 중요한 역할 등을 수행하는 인간생활에 유익한 균주이다. 전 세계적으로 오랜 기간에 걸쳐 유산균 함유 발효 식품으로 널리 식품으로 사용된 유산균은 최근에 GRAS (Generally Recognized As Safe) 미생물로 안정성을 인정받고 있다.
이러한 유산균의 안정성 및 유산균이 건강에 좋다는 인식을 기초로 하여 유산균 함유 식품을 통하여 건강을 유지하고, 질병을 예방하려는 노력이 증대되었으며, 최근 유산균을 기능성 식품에 사용하기 위하여 잠재력을 평가하기 위한 프로바이오틱 유산균에 대한 연구가 전 세계적으로 광범위하게 진행되고 있다. 또한, 박테리오신과 같은 위해 미생물 억제를 위한 연구를 위해 유산균 유래 물질에 대한 연구가 진행되고 있다.
한편, 젓 또는 젓갈(fermented seafood)은 날것인 동물성 재료, 주로 바다에서 나는 해산물을 소금에 절인 것으로, 해산물 등의 동물성 재료를 항아리에 넣은 다음 재료들이 완전히 덮일 때까지 소금을 들이 붓고, 숙성시킨 것 또는 숙성된 것을 각종 양념으로 버무린 것을 말한다.
우리나라는 삼면이 바다로 이루어져 있어서 해산물이 풍부하였으나, 과거에는 교통망이 제한적이어서, 해산물을 깊숙한 내륙 지방까지 유통하거나 장기간 보관하기 위하여서는 염장이 필수였으며, 이로 인해 한국 특유의 젓갈 문화가 발달되었다.
상기 젓갈은 그 자체가 반찬으로 이용되기도 하지만, 간장과 같은 장류로 사용되기도 하고 김치를 담그거나 국을 끓이는 등의 조미료로 사용되기도 한다.
현재, 대중적으로 즐겨 먹는 젓갈은 주로 새우젓, 명란젓, 조개젓, 오징어젓, 낙지젓, 멸치젓 등과 멸치액젓, 까나리액젓 등의 액젓이 있다. 이 중 새우젓은 김장이나 양념에 사용될 뿐만 아니라 반찬으로도 자주 사용되며, 새우의 어획 시기에 따라 오젓, 육젓, 추젓으로 불리우는 대표적인 젓갈 중 하나이다.
본 발명은 우리나라의 대표적인 발효식품 중 하나인 젓갈, 그 중에서도 가장 대중적인 젓갈에 해당되는 새우젓으로부터 분리되고 위해 미생물에 대한 항균활성을 가지는 균주를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한 본 발명은 상기 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액 및 상기 배양액의 건조물로 이루어지는 군에서 선택된 하나 이상을 활성성분으로 포함하는 항균조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한 본 발명은 상기 균주, 이의 배양액 및 상기 배양액의 농축액으로 이루어지는 군에서 선택된 하나 이상을 활성성분으로 포함하는 생균활성제(probiotics)를 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 새우젓으로부터 분리되고 위해 미생물에 대한 항균활성을 가진 웨이셀라 속 균주(Weissella sp.)를 제공한다. 바람직하게는 상기 위해 미생물은 황색포도상구균(Staphylococcus aureus), 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) 및 대장균(E. coli)에 대한 항균 활성을 갖는 균주일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 균주, 이의 배양액 상기 배양액의 농축액 및 상기 배양액의 건조물로 이루어지는 군에서 선택된 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 항균조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 균주, 이의 배양액 상기 배양액의 농축액 및 상기 배양액의 건조물로 이루어지는 군에서 선택된 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 항생제 내성 병원성 미생물에 대한 항균 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 균주, 이의 배양액 및 상기 배양액의 농축액으로 이루어지는 군에서 선택된 하나 이상을 활성성분으로 포함하는 생균활성제(probiotics)를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명에 있어서, 배양물이란 특정 미생물을 배양배지 또는 배양액에서 배양한 것을 의미하며, 상기 배양물은 상기 특정 미생물을 포함하는 것일 수 있다. 상기 배양물은 그 제형이 한정되지 아니하고, 일 예로 액체 또는 고체일 수 있다. 이러한 측면에서, 배양액이란 액체배지에 특정 미생물을 접종하여 배양한 것을 의미한다. 또한, 본 발명에 있어서, 배양액의 농축액이란 상기 배양액을 농축한 것을 말하고, 배양액의 건조물이란 상기 배양액의 물기를 없앤 것 또는 제거한 것을 의미한다.
상기 배양배지란 동물세포나 식물세포 또는 세균 따위를 기르는 데 필요한 영양소가 들어 있는 고체 또는 액체를 의미한다. 상기 배지는 배양대상 즉, 배양체가 되는 미생물이나 세포가 필요로 하는 영양물질을 포함하는 것으로, 특수한 목적을 위한 물질이 추가로 첨가되어 혼합된 것일 수 있다. 상기 배지는 배양기 또는 배양액이라고도 불리우며, 천연배지, 합성배지 또는 선택배지를 모두 포함하는 개념이다.
본 발명에 있어서, 항균 조성물이란 항미생물제를 총칭하는 의미일 수 있고, 항균제, 방부제, 생물학적 보존제 또는 천연 보존제와 같은 의미일 수 있으며, 구체적으로 그람양성균, 그람음성균, 진균(효모 및 곰팡이)으로 이루어진 군에서 선택된 1 종 이상의 발육과 생활 기능을 저지 또는 억제할 수 있는 물질 즉, 항세균 및/또는 항진균 효력이 있는 물질을 의미한다.
본 발명에 있어서, 생균활성제란 사람과 가축의 장내 미생물 균총의 개선으로 건강에 유익한 효능을 갖는 생균제재를 의미한다.
본 발명의 발명자는 기존 외국에서 동정된 유산균이 아닌 우리 유산균 특히, 우리나라의 대표적인 전통 발효식품 중 하나로 3면이 바다인 우리나라에 풍부한 해산물로부터 제조되는 발효식품인 젓갈 유래 항균 활성, 특히나 항생제 내성으로 인해 기존 개발된 항생제만으로 제어가 힘든 항생제 내성 균주를 통제하기 위해 항생제 내성 균주에 대한 항균 활성을 갖는 유산균을 동정하기 위해 연구하던 중, 우리나라에서 가장 많이 사용되는 젓갈 중 하나인 새우젓으로부터 다양한 위해 미생물에 대한 항균 활성이 가질 뿐만 아니라 대표적 항생제 내성 균주인 메티실린 내성 황색포도상구균(Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus, MRSA)에 대해 분리된 균주 중 가장 우수한 항균 활성을 갖는 균주인 LSH-3을 분리하였고, 상기 균주를 동정하여 GRAS (Generally regarded as safe) 미생물인 유산균에 속하는 웨이셀라 속 균주(Weissella sp.)임을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 새우젓으로부터 분리되고 위해 미생물에 대한 항균활성이 있는 웨이셀라 속 균주(Weissella sp.), 보다 구체적으로는 웨이셀라 속 균주 LSH-3(Weissella sp. LSH-3)에 관한 것이다.
본 발명의 웨이셀라 속 균주 LSH-3은 젓갈, 구체적으로 새우젓으로부터 분리되었고, 식품 부패나 식중독 등과 관련된 위해 미생물에 대한 항균활성이 있으며, 하기와 같은 균학적 성질을 갖는 균주이다.
구체적으로, 상기 깍두기로부터 분리된 LSH-3 균주는 그람 양성(Gram-positive)의 유산균으로 16S rDNA 염기서열 분석결과, Weissella cibaria CMU와 97%의 서열상동성을 나타내어, 최종적으로 웨이셀라 속 균주로 동정되어, 웨이셀라 속 균주 LSH-3로 명명되었다.
상기 웨이셀라 속 균주 LSH-3(Weissella sp. LSH-3)은 한국생명공학연구원 생물자원센터에 2021년 12월 16일자로 기탁하여, 2021년 12월 21일에 수탁번호 KCTC 18967P를 부여 받았다.
상기 웨이셀라 속 균주는 바람직하게는 웨이셀라 속 균주 LSH-3, 더욱 바람직하게는 새우젓으로부터 분리되고 위해미생물에 대해 항균활성이 있으며, 기탁번호 KCTC 18967P를 갖는 웨이셀라 속 균주(Weissella sp. KCTC 18967P)일 수 있다.
상기 웨이셀라 속 균주 LSH-3은 위해 미생물에 대한 항균 활성을 갖는다. 상기 위해 미생물은 식품과 관련하여 식품을 오염하여 부패의 원인이 되고, 식중독 등의 원인이 되는 미생물인 식품 오염 미생물 또는 식중독 원인균일 수 있고, 상기 식품 오염 미생물은 황색포도상구균 (Staphylococcus aureus), 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) 또는 대장균(E. coli)일 수 있으며, 특히 항생제 내성 병원성 미생물, 구체적으로 메티실린 내성 황색포도상구균(Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus, MRSA)일 수 있다.
이러한 측면에서, 상기 웨이셀라 속 균주 LSH-3은 바람직하게는 황색포도상구균 (Staphylococcus aureus), 바실러스 세레우스 균주(Bacillus cereus) 및 대장균(E. coli)에 대한 항균활성을 가지는 것일 수 있으며, 항생제 내성 병원성 미생물, 바람직하게는 메티실린 내성 황색포도상구균(Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus, MRSA)에 대한 항균활성을 가지는 것일 수 있다.
이러한 측면에서, 본 발명은 상기 웨이셀라 속 균주 LSH-3, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액, 상기 배양액의 건조물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 포함하는 위해 미생물에 대한 항균 조성물에 관한 것이다.
상기 웨이셀라 속 균주 LSH-3은 바람직하게는 기탁번호 KCTC 18967P를 갖는 웨이셀라 속 균주(Weissella sp. KCTC 18967P)일 수 있다.
상기 항균 조성물은 상기 위해 미생물에 대한 미생물 감염의 예방 및 개선용 조성물로 사용될 수 있고, 의약용 조성물이나 식품 조성물 등으로 응용될 수 있다.
또한, 상기 웨이셀라 속 균주 LSH-3 또는 상기 균주를 배양한 배양배지는 위해 미생물에 대한 항균활성을 갖는다. 상기 균주를 배양한 배양배지는 일 예로 상기 균주가 배양된 배양액일 수 있다.
구체적으로, 상기 위해 미생물은 일 예로 식품 부패의 원인균 또는 식중독의 원인균인 황색포도상구균(Staphylococcus aureus), 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) 및 대장균(E. coli)일 수 있다.
상기 항균조성물에 포함되는 상기 유효성분의 함량은 사용목적 및 사용방법 등을 고려하여 적절하게 선택될 수 있으며, 예를 들어 전제 조성물을 기준으로 0.01 내지 99 중량부, 바람직하게는 0.1 내지 90 중량부, 더욱 바람직하게는 1 내지 75 중량부일 수 있다. 상기 항균조성물에는 통상적으로 사용되는 첨가제를 더욱 포함할 수 있다.
또한, 상기 웨이셀라 속 균주 LSH-3가 생산하는 박테리오신은 항생제 내성 병원성 미생물인 메티실린 내성 황색포도상구균 (Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus, MRSA)에 대한 항균 활성을 가지므로, 이러한 측면에서, 본 발명은 상기 웨이셀라 속 균주 LSH-3, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액, 상기 배양액의 건조물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 포함하는 항생제 내성 병원성 미생물에 대한 항균 조성물에 관한 것이다.
상기 웨이셀라 속 균주 LSH-3은 바람직하게는 기탁번호 KCTC 18967P를 갖는 웨이셀라 속 균주(Weissella sp. KCTC 18967P)일 수 있다.
상기 항균 조성물은 상기 항생제 내성 병원성 미생물에 대한 미생물 감염의 예방 및 개선용 조성물로 사용될 수 있고, 의약용 조성물이나 식품 조성물 등으로 응용될 수 있다.
또한, 상기 웨이셀라 속 균주 LSH-3 또는 상기 균주를 배양한 배양배지는 위해 미생물에 대한 항균활성을 갖는다. 상기 균주를 배양한 배양배지는 일 예로 상기 균주가 배양된 배양액일 수 있다.
구체적으로, 상기 항생제 내성 병원성 미생물은 메티실린 내성 황색포도상구균일 수 있다.
상기 항균조성물에 포함되는 상기 유효성분의 함량은 사용목적 및 사용방법 등을 고려하여 적절하게 선택될 수 있으며, 예를 들어 전제 조성물을 기준으로 0.01 내지 99 중량부, 바람직하게는 0.1 내지 90 중량부, 더욱 바람직하게는 1 내지 75 중량부일 수 있다. 상기 항균조성물에는 통상적으로 사용되는 첨가제를 더욱 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 웨이셀라 속 균주 LSH-3, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액, 상기 배양액의 건조물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 포함하는 생균활성제를 제공한다.
상기 웨이셀라 속 균주 LSH-3은 바람직하게는 기탁번호 KCTC 18967P를 갖는 웨이셀라 속 균주(Weissella sp. KCTC 18967P)일 수 있다.
본 발명에서 생균활성제란 사람과 가축의 장내 미생물 균총의 개선으로 건강에 유익한 효능을 갖는 생균제재를 의미한다.
상기 생균활성제에 포함되는 항균 효과를 갖는 유효성분, 구체적으로 상기 웨이셀라 속 균주 LSH-3, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액, 상기 배양액의 건조물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 함량은 사용목적 및 사용방법 등을 고려하여 적절하게 선택될 수 있으며, 바람직하게는 전제 조성물을 기준으로 0.01 중량부 내지 99 중량부, 더욱 바람직하게는 0.1 중량부 내지 90 중량부일 수 있다. 상기 생균활성제에는 통상적으로 사용되는 첨가제를 더욱 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 생균활성제가 포함된 식품을 제공한다. 상기 생균활성제는 식품 부패 또는 변패의 원인균이나 식중독의 원인균인 황색포도상구균 균주(Staphylococcus aureus), 바실러스 세레우스 균주(Bacillus cereus) 및 대장균(E. coli)에 대한 항균활성을 가지므로 식품의 부패 또는 변패를 저지 또는 완화할 수 있으며, 식중독의 예방 또는 개선효과를 가질 뿐만 아니라, 기존 항생제에 대한 내성을 가지고 있어 항생제만으로 유효한 약리효과를 가지기 힘든 항생제 내성 병원성 미생물, 구체적으로 메티실린 내성 황색포도상구균(Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus, MRSA)에 대한 항균 활성을 가지므로 항생제 내성 병원성 미생물에 의한 질병의 치료, 개선 또는 완화 효과를 가지고 있다.
본 발명에서 식품이란 영양소를 한 가지 또는 그 이상 함유하고 있는 천연물 또는 가공품을 의미하며, 바람직하게는 어느 정도의 가공 공정을 거쳐 직접 먹을 수 있는 상태가 된 것을 의미하며 그 예로는 과일, 야채, 과일이나 야채의 건조제품이나 절단제품, 과일주스, 야채주스, 이들의 혼합주스 이거나 칩류, 면류, 축산가공식품, 수산가공식품, 유가공식품, 발효식품, 두류식품, 곡류식품, 미생물발효식품, 제과제빵, 양념류, 육가공류, 산성음료수, 감초류, 허브류 등이 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 식품은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 생균활성제를 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며, 통상의 식품과 같이 여러 가지 향미제 또는 탄수화물 등을 추가 성분으로 함유할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 상기의 생균활성제는 식품류, 음료, 건강음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강 기능성 식품류의 제조 시 원료 물질에 첨가되거나 조리된 식품에 적절히 혼합하는 방법으로 첨가될 수 있으며, 식품학적으로 허용 가능한 식품 보조 첨가제와 함께 첨가될 수 있다. 이 때, 식품 또는 음료 중의 상기 생균활성제의 양은 전체 식품 중량의 0.01 중량% 내지 90 중량%로 가할 수 있으며, 음료의 경우 100 mL를 기준으로 0.02 g 내지 20 g, 바람직하게는 0.5 g 내지 10 g의 비율로 가할 수 있다.
상기 식품은 일 예로 발효식품, 건강식품 또는 음료일 수 있다.
본 발명에서 발효식품이란 유산균이나 효모 등 미생물을 한 가지 또는 둘 이상 첨가하고 상기 미생물의 발효 작용을 이용하여 만든 식품을 의미하며, 상세하게는 식품 기재에 발효식품용 종균을 첨가하고 숙성시켜 제조하는 식품을 의미한다. 상기 발효식품으로는 주류, 빵류, 새우젓, 젖갈, 된장, 간장, 치즈, 버터, 요구르트 등 비살균 개방형 발효식품 모두가 포함된다.
또한, 상기 생균활성제는 발효식품용 종균으로 사용될 수 있으며, 바람직하게는 새우젓 등 젓갈 발효의 종균으로 사용될 수 있다. 이 때, 종균의 사용량은 발효식품의 종류 및 종균의 종류에 따라 적절히 조절하는 것이 좋다. 바람직하기로는 식품 주재료 100 중량을 기준으로 0.0001 내지 0.01 중량부(습윤 중량부)로 접종하는 것이다.
본 발명에서 기능성 식품이란 식품에 물리적, 생화학적, 생물공학적 수법 등을 이용하여 해당 식품의 기능을 특정 목적에 작용, 발현하도록 부가가치를 부여한 식품군이나 식품 조성이 갖는 생체방어리듬조절, 질병방지와 회복 등에 관한 체조절기능을 생체에 대하여 충분히 발현하도록 설계하여 가공한 식품을 의미한다.
본 발명에서 음료란 갈증을 해소하거나 맛을 즐기기 위하여 마시는 것의 총칭을 의미하고 주류, 청량음료, 물, 시럽, 차, 커피, 과실음료 등이 이에 해당되며 유산균 음료를 포함한다. 유산균 음료란 유산균을 배양하여 유산발효시킨 것에 살균수를 가해서 희석하고 당분, 향료 등을 가한 음료를 의미한다. 상기 음료는 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 생균활성제를 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.
이상 살펴본 바와 같이, 본 발명에 따른 웨이셀라 속 균주 LSH-3 (Weissella sp. LSH-3)은 다양한 위해 미생물, 구체적으로 황색포도상구균 균주, 바실러스 세레우스 균주 및 대장균에 대한 항균활성을 가질 뿐만 아니라, 항생제 내성 병원성 미생물, 구체적으로는 메티실린 내성 황색포도상구균(MRSA)에 대해 항균활성을 가지므로, 식품의 부패 및 식중독의 원인이 되는 다양한 균에 대한 항균 활성을 가지어, 식품의 부패를 억제하고, 다양한 위해 미생물에 의한 질병을 개선 또는 예방할 수 있을 뿐만 아니라, 항생제 내성으로 인해 심각한 질환의 원인이 되는 항생제 내성 균주를 효과적으로 억제할 수 있으므로, 본 발명은 식품 산업을 포함한 위해 미생물 제어가 요구되는 다양한 산업 분야에 활용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 웨이셀라 속 균주 LSH-3의 16S rRNA의 염기서열을 기초로 한 다른 세균(bacteria)과의 계통발생론적 관계를 나타내는 그림이다.
도 2은 본 발명의 일 실시예에 따른 웨이셀라 속 균주 LSH-3의 pH에 따른 생육활성을 나타낸 그래프이고, 도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 웨이셀라 속 균주 LSH-3의 염 농도에 따른 생육활성을 나타낸 그래프이다. 도 2 및 도 3에서 □는 LSH-1 균주를 의미하고, ○는 LSH-2 균주를 의미하며, ●는 LSH-3 균주를 의미한다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 웨이셀라 속 균주 LSH-3의 다양한 위해 미생물, 구체적으로 메티실린 내성 황색포도상구균(Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus, MRSA, A), 황색포도상구균(Staphylococcus aureus, B), 바실러스 세레우스 (Bacillus cereus, C) 및 대장균(E. coli, D)에 대한 항균 활성을 다른 균주인 LSH-1 및 LSH-2와 비교하여 확인한 것으로, 비교예로 항생제인 암피실린(ampicillin 10 mg/ml, Amp), 가나마이신(kanamycin 30 mg/ml, Kan)과 MRS 배지(MRS broth medium containing 5% NaCl (w/v), Med)를 처리한 군과 비교하였다.
도 2은 본 발명의 일 실시예에 따른 웨이셀라 속 균주 LSH-3의 pH에 따른 생육활성을 나타낸 그래프이고, 도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 웨이셀라 속 균주 LSH-3의 염 농도에 따른 생육활성을 나타낸 그래프이다. 도 2 및 도 3에서 □는 LSH-1 균주를 의미하고, ○는 LSH-2 균주를 의미하며, ●는 LSH-3 균주를 의미한다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 웨이셀라 속 균주 LSH-3의 다양한 위해 미생물, 구체적으로 메티실린 내성 황색포도상구균(Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus, MRSA, A), 황색포도상구균(Staphylococcus aureus, B), 바실러스 세레우스 (Bacillus cereus, C) 및 대장균(E. coli, D)에 대한 항균 활성을 다른 균주인 LSH-1 및 LSH-2와 비교하여 확인한 것으로, 비교예로 항생제인 암피실린(ampicillin 10 mg/ml, Amp), 가나마이신(kanamycin 30 mg/ml, Kan)과 MRS 배지(MRS broth medium containing 5% NaCl (w/v), Med)를 처리한 군과 비교하였다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 인용문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
이하 본 발명의 실시예를 기재한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 유산균주의 분리 및 동정
1-1 유산균주의 분리
새우젖 10 g에 1.0% (w/v)의 펩톤(peptone)이 첨가된 멸균 증류수 10 ml를 첨가하고 잘 섞은 후, 5% (w/v) NaCl, 0.1% (w/v) nystatin (Merk, USA) 및 0.1% (w/v) polymyxin B (Duchefa, 네덜란드)가 혼합된 MRS (Difco, USA) 고체 배지(agar plate)에 분주하고 30℃에서 1일 동안 배양하였다. 상기 항진균 활성을 갖는 nystatin와 그람 음성 미생물에 대한 항균 활성을 갖는 polymyxin B을 통해 새우젓 유래 그람 양성 미생물, 즉 유산균으로 유추되는 균주를 분리하였다.
이 후, 분리된 균주를 선별하고, (주)자연과학기술(대한민국)으로부터 수득한 위해 미생물인 황색포도상구균(Staphylococcus aureus, B), 바실러스 세레우스(Bacillus cereus, C) 및 대장균(E. coli, D)에 대한 항균 활성을 확인하였다.
상기 항균 활성을 확인한 결과, 항균 활성이 가장 우수한 것으로 확인된 3개의 균주를 선택하여, LSH-1, LSH-2 및 LSH-3으로 명명하였다.
1-2 유산균주의 동정
상기 실시예 1-1에서 분리된 3종의 균주인 , LSH-1, LSH-2 및 LSH-3에 대해 그람염색을 수행한 결과, 그람 양성으로 확인되어, 유산균으로 유추되었으며, 구체적인 균주 동정을 위해 16S rDNA 염기서열 분석을 통하여 동정하였다.
또한, 상기 16S rDNA 염기서열 분석을 통한 동정을 수행하였다. 구체적으로, 상기 3종의 분리균주로부터 Wizard Genomic DNA Isolation Kit (Promega, USA)를 이용하여 유전자(Genomic DNAs)를 추출하였고, 추출된 16S ribosomal RNA를 하기 표 1에 기재된 프라이머 쌍을 이용하여 PCR을 수행함으로써 16S rRNA 염기서열 분석을 수행하였다.
| Primers | 서열 (5′→3′) |
| 27F | AGAGTTTGATCCTGG CTCAG |
| 1492R | GGTTACCTTGTTACGACTT |
상기 결정된 염기서열을 기초로 염기서열의 검사는 3730 XL 염기서열분석기(Applied Biosystems, USA)를 사용하여 분석하였으며, BLAST 프로그램(BLAST program (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/))을 이용하여 각 균주의 상동성을 비교하였다. 상기 16S rRNA 염기서열 분석을 통해 결정된 서열을 이용하여 상동성 검색을 실시한 결과를 기초로 다른 세균과의 계통발생론적 관계를 도 1에 나타내었다. 상기 도 3에 나타낸 바와 같이, Weissella cibaria CMU (CP013936)과 97% 이상의 가장 높은 유사성을 나타내어, 상기 분리된 3종의 균주는 웨이셀라 속 균주로 확인되었으며, 상기 결과로부터 상기 분리된 3종의 균주는 프로바이오틱으로 활용가능한 것으로 유추되었다.
<실시예 2> 웨이셀라 속 균주 LSH-3의 생육 활성 확인
상기 실시예 1에서 확인된 3종의 균주의 생육 활성을 확인하기 위하여, 다양한 pH 조건 및 염도(Nacl) 조건에 따른 내산성 및 내염성을 확인하였다.
우선, 상기 실시예 1의 3종의 웨이셀라 속 균주의 pH에 따른 생육활성을 확인하기 위하여, 상기 균주들을 회수한 후, 동량의 균주를 pH를 달리한 MRS 액체 배지 100 ml에 접종시킨 후, 12시간 동안 배양하였다. 상기 pH의 조절은 1N HCl 또는 1N NaOH를 이용하여 조절하였다. 상기 배양 후, 세포 생육 정도는 분광 광도계(Spectrophotometer, X-ma 3000, 대한민국)를 이용하여 600 nm 조건에서 흡광도를 측정하여 확인하였으며, 그 결과를 도 2에 나타내었다.
상기 도 2에 나타낸 바와 같이, 3종의 웨이셀라 속 균주 모두 pH 5 내지 pH 9의 조건에서 잘 생육하는 것으로 확인되었으며, 최적 생육 pH는 pH 7 내지 pH 8로 확인되었다.
또한, 상기 실시예 1의 3종의 웨이셀라 속 균주의 염 농도에 따른 생육활성을 확인하기 위하여, 상기 균주들을 회수한 후, 동량의 균주를 염 농도를 달리한 MRS 액체 배지 100 ml에 접종시킨 후, 12시간 동안 배양하였다. 상기 배양 후, 세포 생육 정도는 분광 광도계(Spectrophotometer, X-ma 3000, 대한민국)를 이용하여 600 nm 조건에서 흡광도를 측정하여 확인하였으며, 그 결과를 도 3에 나타내었다.
상기 도 3에 나타낸 바와 같이, 3종의 웨이셀라 속 균주 모두 NaCl 5% (w/v) 농도까지는 우수한 생육 농도가 확인되었고, 7% (w/v)부터 생육이 저해되는 것으로 확인되었으며, 11% (w/v)에서는 생육이 완전히 억제되는 것으로 확인되었다. 상기 결과로부터 3종의 웨이셀라 속 균주 모두 내염성을 가지는 것으로 확인되어, 젓갈 등과 같은 염장 식품의 제저 또는 고염도의 발효식품의 종균으로 활용할 수 있을 것으로 평가되었다.
<실시예 3> 위해 미생물에 대한 항균 활성 측정
상기 실시예 1에서 동정된 3종의 웨이셀라 속 균주의 항균활성의 확인은 4종의 지시 균주 각각에 대한 paper-disc 실험을 통하여 수행하였다. 구체적인 실험방법은 하기와 같다.
우선, 상기 지시 균주, 구체적으로 황색포도상구균(Staphylococcus aureus, B), 바실러스 세레우스(Bacillus cereus, C), 대장균(E. coli, D) 및 메티실린 내성 황색포도상구균(Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus, MRSA)를 TS 배양배지(TS (tryptic soy (TS) broth media (Difco, USA)) 4 ml에 접종 후, 37℃에서 12시간 동안 배양하였다. 상기 배양된 각 위해 미생물의 배양액을 TS 고체배지(TS Agar plate)에 문지르고 배양하였다. 5% (w/v) NaCl이 포함된 MRS 배지(Difco, USA) 4 ml에서 배양한 상기 3종의 웨이셀라 속 균주 배양액 10 ul씩을 각각 디스크에 추가한 후, 각각의 디스크를 상기 위해 미생물의 배양액을 도포한 TS 고체배지 위에 올려 놓은 후, 12시간 동안 배양하고, 배양 결과를 확인하였다. 양성 대조군으로 암피실린(ampicillin, 10 mg/ml)과 가나마이신(kanamycin, 30 mg/ml)을 사용하였고, 음성 대조군으로 5% (w/v) NaCl이 포함된 MRS 배지를 사용하였다. 상기 확인 결과를 도 4에 나타내었다.
상기 도 4에 나타낸 바와 같이, 메티실린 내성 황색포도상구균에 대해 LSH-3의 경우 6.5 mm의 저해환이 확인되었고, LSH-1의 경우 4.0 mm, LSH-2의 경우 3.5 mm의 저해환이 확인되어, 모두 메티실린 내성 황색포도상구균에 대한 항균 활성이 확인되었으며, 특히, LSH-3이 가장 우수한 항균 활성을 가지는 것으로 확인되었다. 또한, 황색포도상구균에 대해서도 LSH-1, LSH-2 및 LSH-3의 순서대로 2.0 mm, 3.0 mm 및 3.5 mm의 저해환 크기가 확인되었고, 바실러스 세레우스에 대해서도 순서대로 2.0 mm, 1.0 mm 및 2.0 mm의 저해환 크기가 확인되었으며, 대장균에 대해서도 순서대로 0.5 mm, 0.5 mm 및 1.0 mm의 저해환 크기가 확인되어, 모든 균과 관련하여 LSH-3 균주가 가장 우수한 항균 활성을 가지는 것으로 확인되었고, 특히, 메티실린 내성 황색포도상구균에 대해서 특히 우수한 항균 활성을 갖는 것으로 확인되었다.
상기 결과로부터, 최적의 메티실린 내성 황색포도상구균에 대한 항균 균주로, LSH-3 균주를 선택하였으며, 상기 분석 결과, Weissella sp. 로 동정된 LSH-3 균주를 2021년 12월 16일에 한국생명공학연구원 생물자원센터에 기탁하여 2021년 12월 21일에 수탁번호 KCTC 18967P를 부여 받았다.
<실시예 4> 위해 미생물에 대한 항균 활성 특성 확인
상기 실시예 3에서 항균 활성이 가장 우수한 것으로 확인된 LSH-3 균주가 가지는 항균 활성의 특징을 확인하기 위하여, 다양한 열처리 조건, pH 조건 및 유기용매에 따른 항균 활성의 유지 여부를 확인하였다.
우선, 항균 활성을 확인하기 위해 LSH-3 균주가 생산하는 항균 물질 즉, 박테리오신(bacteriocin)으로 추정되는 물질은 다음과 같은 방법으로 수득하였다. 구체적으로, 실시예 3에서 확인된 LSH-3 균주를 MRS 배지 200 ml 및 30℃에서 24시간 동안 배양한 후, 상기 배양액을 4℃ 및 3,000 x g 조건으로 15분 동안 원심분리하여 상등액을 수득하였다. 상기 수득된 상등액 200 ml에 600 ml 아세톤을 첨가하고 4℃로 냉각한 후, -20℃에서 24시간 동안 방치하였다. 이 후, 침전된 단백질을 4℃ 및 3,000 x g 조건으로 15분 동안 원심분리하여 수득한 후, 냉동건조하였다. 상기 냉동건조된 단백질은 MRS 배지에 녹여 시료로 사용하였다.
우선, 상기 실시예 3에서 항균 활성이 가장 우수한 것으로 확인된 LSH-3 균주로부터 수득한 항균 물질(bacteriocin)의 열 안정성을 확인하기 위하여, 다양한 가열 조건에서도 메티실린 내성 황색포도상구균에 대한 항균 활성이 유지되는지 여부를 확인하였다. 상기 열처리는 상기 MRS 배지로 녹인 항균물질 시료를 37℃, 50℃, 70℃ 및 100℃에서 각각 30분간 열처리한 후, 상기 실시예 3과 같이 MRSA 균주에 대해 disc diffusion method로 항균 활성의 유지 정도를 열처리 하지 않은(4℃) 대조군 대비하여 확인하였으며, 그 결과를 하기 표 2에 나타내었다.
| 열 처리 조건(℃) | 항균 활성(%) |
| 4 | 100 |
| 37 | 100 |
| 50 | 75 |
| 70 | 75 |
| 100 | 49 |
상기 표 2에 나타낸 바와 같이, 모든 열처리 조건에서 항균 활성이 유지되어, LSH-3 균주가 생성하는 항균 물질의 메티실린 내성 황색포도상구균에 대한 항균 활성은 열 안정성이 매우 우수한 것으로 확인되었다. 특히, 37℃에서도 100%의 항균 활성이 유지되었고, 70℃까지에서도 약 75%의 항균 활성이 유지되어, 산업적으로 활용도가 높은 것으로 평가되었다.
또한, 상기 LSH-3 균주로부터 수득한 항균 물질(bacteriocin)의 pH 안정성을 확인하기 위하여, 다양한 pH 조건에서도 메티실린 내성 황색포도상구균에 대한 항균 활성이 유지되는지 여부를 확인하였다. 상기 pH조건은 pH 3 내지 pH 5의 경우 20 mM sodium acetate, pH 7의 경우 20 mM Tris-HCl, pH 9 내지 pH 11의 경우 20 mM GTA로 조절하였으며, 상기 MRS 배지로 녹인 항균물질 시료를 각각의 pH 조건에서 각각 24시간 동안 처리한 후, 상기 실시예 3과 같이 MRSA 균주에 대해 disc diffusion method로 항균 활성의 유지 정도를 아무런 pH 처리를 하지 않은 대조군 대비하여 확인하였으며, 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다
| pH | 항균 활성(%) |
| 3 | 100 |
| 5 | 100 |
| 7 | 75 |
| 9 | 75 |
| 10 | 49 |
| 11 | 0 |
상기 표 2에 나타낸 바와 같이, LSH-3 균주가 생성하는 항균 물질의 메티실린 내성 황색포도상구균에 대한 항균 활성은 pH 3 내지 pH 10의 조건에서 항균 활성이 유지되어 pH 안정성이 매우 우수한 것으로 확인되었다. 특히, pH 3 및 pH 5에서 100%의 항균 활성이 유지되었고, pH 7 및 pH 9에서 약 75%의 항균 활성이 유지되어, LSH-3 균주가 생육 가능한 거의 모든 pH 조건에서 항균 활성이 유지되어 해당 균주 자체를 산업적으로 이용하는 것(Probiotics)이 유효할 것으로 평가되었다.
추가로, 상기 LSH-3 균주로부터 수득한 항균 물질(bacteriocin)의 용매 안정성을 확인하기 위하여, 다양한 용매에서도 메티실린 내성 황색포도상구균에 대한 항균 활성이 유지되는지 여부를 확인하였다. 상기 용매에 따른 안정성은 다양한 유기용매에 상기 MRS 배지로 녹인 항균물질 시료를 첨가한 후, 30℃에서 1시간 동안 방치한 후, 상기 실시예 3과 같이 MRSA 균주에 대해 disc diffusion method로 항균 활성의 유지 정도를 아무런 유기용매 처리를 하지 않고, MRS 배양배지에 녹인 대조군 대비하여 확인하였으며, 그 결과를 하기 표 4에 나타내었다
| 유기용매 종류 | 항균 활성(%) |
| 아세톤(Acetone) | 75 |
| 클로로포름(Chloroform) | 75 |
| 에탄올(Ethanol) | 100 |
| 헥산(Hexane) | 49 |
| 이소프로판올(Isopropanol) | 100 |
| 메탄올(Methanol) | 75 |
상기 표 4에 나타낸 바와 같이, LSH-3 균주가 생성하는 항균 물질의 메티실린 내성 황색포도상구균에 대한 항균 활성은 모든 유기 용매에서도 항균 활성이 유지되어 다양한 유기 용매에 응용할 수 있을 것으로 평가되었다. 특히, 가장 많이 사용되는 유기 용매인 에탄올 등에서 항균 활성이 100% 유지되어, 균주 자체로 활용되는 것뿐만 아니라 항균 물질 자체를 활용하는 경우에도 다양한 유기 용매와 함께 활용될 수 있으므로, 산업적으로 다양하게 활용될 수 있을 것으로 평가되었다.
Claims (8)
- 새우젓으로부터 분리되고, 황색포도상구균(Staphylococcus aureus), 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) 및 대장균(E. coli)에 대해 항균활성을 가지며, 기탁번호 KCTC 18967P를 갖는 웨이셀라 속 균주(Weissella sp. KCTC 18967P).
- 제1항에 있어서,
상기 웨이셀라 속 균주는 항생제 내성 병원성 미생물의 생장을 억제하는 것인 웨이셀라 속 균주(Weissella sp. KCTC 18967P). - 제2항에 있어서,
상기 항생제 내성 병원성 미생물은 메티실린 내성 황색포도상구균 (Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus, MRSA)인 것인 웨이셀라 속 균주(Weissella sp. KCTC 18967P). - 제1항의 균주, 상기 균주의 배양액, 상기 배양액의 농축액 및 상기 배양액의 건조물로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상을 유효성분으로 포함하는 항균조성물.
- 제4항에 있어서,
상기 항균조성물은 황색포도상구균(Staphylococcus aureus), 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) 및 대장균(E. coli)에 대해 항균활성을 가지는 것을 특징으로 하는 항균조성물. - 제1항의 균주, 상기 균주의 배양액, 상기 배양액의 농축액 및 상기 배양액의 건조물로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상을 유효성분으로 포함하는 항생제 내성 병원성 미생물에 대한 항균 조성물.
- 제6항에 있어서,
상기 항생제 내성 병원성 미생물에 대한 항균 조성물은 메티실린 내성 황색포도상구균(Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus, MRSA)에 대해 항균활성을 가지는 것을 특징으로 하는 항균조성물. - 제1항의 균주, 상기 균주의 배양액 및 상기 배양액의 농축액으로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상을 유효성분으로 포함하는 생균활성제(probiotics).
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