KR20230095154A - 거대 및 미세 다공구조의 폴리카프로락톤-오리발 유래 콜라겐 골 이식재 및 이의 제조방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 폴리카프로락톤-오리발 유래 콜라겐을 이용한 골 재생을 위한 지지체 제조 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 거대 및 미세 다공성 구조의 폴리카프로락톤-오리발 유래 콜라겐 복합 골 대체용 지지체를 제조하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명의 골 이식재는 치료가 필요한 골에 이식이 가능하고, 이식된 조직 내에서는 조성물의 섬유형 다공성 구조로 세포 증식을 유도할 수 있으며, 하이드록시아파타이트로 생리활성능력을 증가시켜 골 조직 수복 효과가 충분히 발휘될 수 있어 뛰어난 치료 효과를 얻을 수 있다.
Description
본 발명은 폴리카프로락톤-오리발 유래 콜라겐을 이용한 골 재생을 위한 지지체 제조 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 거대 및 미세 다공성 구조의 폴리카프로락톤-오리발 유래 콜라겐 복합 골 대체용 지지체 제작방법과 이를 이용하여 손상된 골에 매우 효과적인 재생을 유도하는 골이식재에 관한 것이다.
골은 골격을 이루는 가장 단단한 조직으로서 세포군과 골 기질로 분류된다. 골 기질은 50-70% 무기 성분, 20-40% 유기 성분 및 5-10% 물로 구성되어 있다. 유기 성분은 인장 강도를 제공하며 주로 1형 콜라겐(collagen type I, COL1)과 비 콜라겐성 단백질로 구성되고, 압축에 강성을 부여하는 무기 성분에는 주로 하이드록시아파타이트 (hydroxyapatite)이 있기 때문에 압축 강성과 같은 골의 생체 역학적 특성을 갖는다.
다른 조직과 달리 골은 1차 또는 2차 치유 과정을 통해 재생이 가능하지만 자가 치유가 불가능한 큰 결손은 수술 혹은 비수술적 치료법을 요한다. 비수술적 치료에는 체외충격파 등이 시행되었으며 수술적 치료에는 자가 또는 동종 조직 이식 등이 시행되어 왔다. 그러나 골 유착, 면역 거부반응 및 공여자 부족으로 인해 새로운 재생 의학적 치료법이 강구되어 왔다.
재생 의학에서는 손상된 조직을 대체하기 위하여 생체활성 분자의 저장소 역할을 하고 세포에 적절한 미세 환경을 제공하는 생체적합성 및 생분해성 지지체가 사용된다. 골 재생을 위해 다양한 종류의 재생 의학 및 조직 공학적 접근이 이루어졌으며 합성 생분해성 섬유형 다공성 지지체가 다양한 세포 유형에서 세포 접착, 증식, 이동 및 분화를 향상시킨다는 것이 입증되었다. 또한 섬유성 지지체에 대한 단백질 흡착 증가는 세포 접착력을 향상시키고 세포 성장에 필수적인 것으로 알려져있다.
폴리카프로락톤 (polycaprolactone, PCL)은 생분해성, 생체적합성 고분자로 우수한 기계적 특성을 갖고 있어 재생 의학 분야에서 조직 대체 지지체로서 널리 사용되고 있다. 그러나 소수성이며 세포 접착력이 약하다는 한계점을 가지고 있다. 이를 개선하는 방법으로는 폴리카프로락톤 함량을 조절하는 방법이 있으나 기계적 강도와 물리화학적 특성에 영향을 끼친다.
따라서 이를 보완하기 위해 세포 부착성이 뛰어난 콜라겐을 혼합한다면 폴리카프로락톤의 소수성을 개선시킬 수 있을 뿐만 아니라 세포 부착성을 증가 시킬 수 있다. 콜라겐은 인체에서 가장 풍부한 불용성 섬유질 단백질이기 때문에 면역 반응이 낮다는 장점을 가지고 있지만, 소와 쥐 꼬리에서 얻어야 한다는 문제점을 갖고 있다. 광우병 등의 동물성 전염병의 위험이 있을 뿐만 아니라 쥐 꼬리에서 얻은 상업용 콜라겐은 낮은 수율로 인하여 가격이 매우 고가이다.
오리발 유래 콜라겐 (duck feet collagen, DC)은 축산부산물로서 저렴한 비용으로 대량의 콜라겐을 얻을 수 있다. 또한 DC는 자연적으로 유도된 생체재료로서 생체적합성과 생분해성의 장점을 가지고 있다. 이뿐만 아니라 DC 기반 지지체는 생체 내에서 세포 성장, 이동, 증식, 골 형성 및 재생을 촉진한 것으로 알려져있다.
골 재생을 위한 다공성 지지체의 제조 방법에는 전기방사 (electrospinning), 적층 제조 기술 (additive manufacturing technologies, AM) 및 자가 조립 (self-assembly) 등이 있으나 이는 복잡한 공정과 고가의 장비를 필요하다는 한계점을 가지고 있다. 반면에 PCL/DC 지지체는 비용매 유도 상분리(non-solvent-induced phase separation, NIPS)와 열 유도 상분리(thermal-induced phase separation, TIPS), 용매 주조 및 미립자 침출 (solvent casting and particulate leaching, SCPL) 및 가스 생성법(gas foaming)을 결합하여 방법이 간단하고 비용이 저렴한 기술을 통해 세포가 상호작용 할 수 있는 섬유형태로 가공된 다공성 구조를 제작했다. 이는 천연 조직의 세포외 기질 (extracellularmatrix, ECM)을 모방하여 세포 증식에 효과적인 미세 환경을 제공한다.
(특허문헌 01) 국제등록특허 제10-1999-0050922호
(비특허문헌 01) Song, J. E., Tian, J., Kook, Y. J., Thangavelu, M., Choi, J. H., & Khang, G. A BMSCs-laden quercetin/duck's feet collagen/hydroxyapatite sponge for enhanced bone regeneration. J. Biomed. Mater. Res. - Part A 108, 784-794 (2020).
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본 발명의 목적은 폴리카프로락톤 오리발 유래 콜라겐 지지체를 골이식용 조성물로 제공하는 데 있다.
또한, 본 발명의 목적은 이식용 조성물인 오리발 유래 콜라겐을 포함하는 폴리카프로락톤 지지체의 섬유형태를 이용한 거대 및 미세 다공성 제조방법을 제공하는 데 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 골수유래줄기세포를 배양하여 오리발 유래 콜라겐을 포함하는 폴리카프로락톤 지지체에 파종하여 골 이식재로 제공하는데 있다.
본 발명은 상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 오리발 유래 콜라겐 및 폴리카프로락톤을 섬유형태로 가공하여 거대 및 미세 다공성을 갖는 지지체로 제작후, 골수유래줄기세포를 포함된 골 이식용 조성물을 제공한다.
상기 오리발 유래 콜라겐 (duck feet collagen :DC)은 DC로 명시된다.
상기 DCS (duck feet collagen solution : DCS)는 DC를 녹인 수용액으로 DCS로 명시된다.
상기 DCS 함량은 PCL 조성물의 0.1-1.5중량%일 수 있다. 더욱 바람직하게는 0.2-0.8중량%으로 구성될 수 있다.
상기 DCS가 함유된 PCL 지지체의 전체 조성물 구성은 10-11.5중량%일 수 있다. 더욱 바람직하게는 10.2-10.8중량%으로 구성될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 골 이식재로서 생리활성물질, 골형성 단백질, 약물 중에 하나이상, 바람직하게는 골세포, 골수유래줄기세포 중에 하나이상을 포함할 수 있다.
상기 조성물에 세포는 1*104-1*108 cells가 파종될 수 있다. 더욱 바람직하게는 1*105-1*107 cells가 파종될 수 있다.
본 발명은 상기 조성물로 이루어진 골 이식재를 포함한다. 이러한 조성물은 고체 형태로 구성된다.
상기 조성물은 수용성 고분자 지지체를 추가로 첨가될 수 있다.
상기 수용성 고분자 지지체는 알긴산 (alginic acid), 히알루론산 (hyaluronic acid), 아가로스 (agarose), 콘드로이틴황산 (chondroitin sulfate), 덱스트란 (dextran), 메틸셀룰로스 (methylcellulose), 키토산 (chitosan), 콜라겐 (collagen), 젤라틴 (gelatin), 실크 (silk)로 이루어진 구성물 중에서 선택되는 1종 이상일 수 있다.
또한, 상기 조성물은 합성 고분자 지지체를 추가로 첨가될 수 있다.
상기 합성 고분자 지지체는 폴리에틸렌글리콜 (poly ethylene glycol: PEG), 폴리락틱산 (poly lactic acid), 폴리글리콜산 (poly glycol acid), 폴리락트산코글리콜산 (poly lactic-co-glycolic acid), 폴리비닐알코올 (poly vinyl alcohol: PVA), 폴록사머 (poloxamer), 폴리비닐피로리돈 (polyvinylpyrrolidone), 폴리이미드 (polyimide), 폴리아크릴레이트 (polyacrylate), 폴리우레탄 (polyurathane)로 이루어진 구성물 중에서 선택되는 1종 이상일 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 골절, 골다공증, 골연화증, 구루병, 골종양 치료용으로 사용할 수 있다.
또한, 본 발명은
(a) 오리발에서 콜라겐을 추출하는 단계:
(b) DC를 DCS로 제조하는 단계:
(c) 거대 및 미세 다공성을 갖는 PCL/DC지지체를 제조하는 단계:
(d) 상기 조성물에 생리활성물질, 세포 중에 하나 이상의 골 재생 유도물질을 적용하는 단계:
를 포함하는 골 이식재 제조방법을 제공한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, (a) -60 ℃에서 급속 냉동시킨 오리발을 증류수에 48시간 동안 해동시켜 핏물을 제거한 뒤 절단하는 단계; 0.5 M NaOH 수용액을 교체시켜주고, 메탄올 : 클로로포름을 3 : 1 비율로 혼합하여 세척 하여 지방을 제거하는 단계; 5%의 시트르산을 첨가하여 조직을 믹서기로 분쇄하여 오리발 용액 2 L에 펩신 3 g을 첨가하여 24시간 동안 교반시킨 뒤 콜라겐 용액을 추출하는 단계; 거즈면에 걸러 녹지 않은 조직을 제거하는 단계; 4℃에서 10분간 10000 rpm으로 원심 분리하여 침전된 콜라겐을 알코올로 처리하고 다시 3500 rpm에서 5 분 동안 원심 분리하여 콜라겐 수집하는 단계; -80 ℃에서 24 시간 동안 보관하고 7일간 동결 건조하여 콜라겐 생성물을 제조하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, (b) DC를 DCS를 제조하는 단계에서는 0.1 M 아세트산 (acetic acid)에 상기 생성물을 상온에서 24시간 교반시켜 생성물을 제조하는 단계(NIPS단계)를 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, (c) DSC을 1,4-다이옥세인 (1,4-dioxane)에 40℃ 온도에서 교반시킨 PCL에 첨가 후 425 μm 이하 NaCl과 45-75 μm NaHCO3를 혼합하는 단계 (SCPL단계); 혼합 조성물을 실리콘 몰드에 넣어 -20℃에서 4시간동안 냉동시키고 -20℃ 에탄올에서 48시간 동안 1,4-다이옥세인을 제거하는단계 (TIPS단계); 상온에서 pH를 4.0으로 조절한 염산 수용액에 8시간 반응시켜 가스를 생성하는 단계 (gas foaming단계), 72시간 동안 증류수를 통해 NaCl 및 다이옥세인을 제거하는 단계, 상온에서 48시간동안 건조시킨 뒤, 24시간 동안 동결건조 시켜 다공성 PCL/DC 조성물을 제조하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, (d) 상기 조성물을 골 이식재로서 생리활성물질, 세포 중에 하나 이상의 골 재생 유도물질을 적용하는 단계에서는 상기 생성물에 모의 체액 (simulated body fluid, SBF)을 침전시켜 하이드록시아파타이트 (hydroxyapatite : HA)로 지지체를 코팅하거나 세포를 파종하여 골 이식재를 제조하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명은 골 재생 유도물질을 포함하는 다공성 골 이식재에 관한 것으로, 보다 자세하게는 생체적합적인 PCL에 DCS를 혼합하여 세포친화적인 구조 생성으로 세포 부착 및 생체활성 물질의 이동이 용이한 환경을 만들고, 향상된 미세 환경에서 파종된 세포들의 성장과 증식이 향상되는 효과가 있다.
따라서 본 발명의 골 이식재는 통증 완화 및 치료가 필요한 골 조직에 이식이 가능하고, 이식된 조직 내에서는 조성물의 섬유형 다공성 구조로 세포 증식을 유도할 수 있으며, 하이드록시아파타이트로 생리활성능력을 증가시켜 골 수복 효과가 충분히 발휘될 수 있어 뛰어난 치료 효과를 얻을 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 실시예에 따라 제조된 지지체의 SEM 사진을 나타낸다.
도 2은 실시예에 따라 제조된 지지체의 FE-SEM과 EDS 분석을 비교하여 나타낸 사진이다.
도 3은 실시예에 따라 제조된 지지체의 XRD 분석을 비교하여 나타낸 그래프이다.
도 4는 실시예에 따라 제조된 지지체의 압축강도를 비교 평가한 그래프를 나타낸다.
도 5은 실시예에 따라 제조된 지지체의 독성을 평가한 그래프 사진이다.
도 6는 실시예에 따라 제조된 지지체의 독성평가를 live/dead 염색 기법으로 관찰한 결과 사진이다.
도 7은 실시예에 따라 제조된 지지체의 유전자 발현율을 비교 분석한 그래프 사진을 보여준다.
도 2은 실시예에 따라 제조된 지지체의 FE-SEM과 EDS 분석을 비교하여 나타낸 사진이다.
도 3은 실시예에 따라 제조된 지지체의 XRD 분석을 비교하여 나타낸 그래프이다.
도 4는 실시예에 따라 제조된 지지체의 압축강도를 비교 평가한 그래프를 나타낸다.
도 5은 실시예에 따라 제조된 지지체의 독성을 평가한 그래프 사진이다.
도 6는 실시예에 따라 제조된 지지체의 독성평가를 live/dead 염색 기법으로 관찰한 결과 사진이다.
도 7은 실시예에 따라 제조된 지지체의 유전자 발현율을 비교 분석한 그래프 사진을 보여준다.
이하, 본 발명을 하나의 구현예로서 더욱 구체적으로 상세하게 설명하면 다음과 같다.
본 발명은 PCL의 미세 구조와 생리활성능력을 향상시키기 위하여 DC를 혼합하였다.
본 발명에서는 DC를 PCL에 혼합하기 위해 0.1 M 아세트산 (acetic acid)를 혼합하여 DCS를 제조하였다.
본 발명에서는 DCS를 PCL에 0, 0.2, 0.4, 0.8 중량%로 혼합하였으며, 각각 PCL/DC 0.2%, PCL/DC 0.4%, PCL/DC 0.8%로 표현하였다.
본 발명에서는 제조된 PCL, PCL/DC 0.2%, PCL/DC 0.4%, PCL/DC 0.8%에 하이드록시아파타이트 (hydroxyapatite : HA)를 코팅하였으며 용도에 따라 HA 양은 달라질 수 있다. HA가 코팅된 조성물은 각각 C-PCL, C-PCL/DC 0.2%, C-PCL/DC 0.4%, C-PCL/DC 0.8%로 표현하였다.
본 발명의 조성물은 본질적으로는 스폰지 형태로서, 몰드를 이용하여 성형체를 만들지만, 용도에 따라서 필름으로 사용이 가능하다.
본 발명의 조성물은 골 이식재로서 골수유래줄기세포가 파종되었지만 골수유래줄기세포 이외에 골세포가 파종될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것이며, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: DC 제조
오리발에서 DC를 추출하기 위해서 -60 ℃에서 급속 냉동시킨 오리발을 증류수에 48시간 동안 해동시켜 핏물을 제거한 뒤 절단한 오리발의 0.5 M NaOH 수용액을 교체시켜주며 하루 교반하여 지방 제거를 한 뒤 메탄올 : 클로로포름을 3 : 1 비율로 혼합하여 세척 후 5%의 시트르산을 2 L를 첨가하여 24시간 동안 200 rpm으로 교반하여 조직에 함유된 콜라겐을 산성용액으로 용해시킨 뒤 믹서기로 분쇄하여 오리발 용액 2 L에 펩신 3 g을 첨가하여 24시간 동안 교반시킨 뒤 용해된 콜라겐 용액을 거즈면에 걸러 녹지 않은 조직을 수거하고 4℃에서 10분간 10000 rpm으로 원심 분리하여 침전된 콜라겐을 알코올로 처리하고 다시 3500 rpm에서 5 분 동안 원심 분리한 뒤 -80 ℃에서 24 시간 동안 보관하고 7일간 동결 건조하여 스펀지 형태로 수득하였다.
실시예 2: DCS 제조
2, 4, 8중량% DC를 0.1M의 아세트산 (acetic acid)에 첨가하여 DC가 균일하게 용해되도록 실온에서 24시간동안 교반하여 생성물을 수득하였다.
실시예 3: 지지체 제조
10중량% PCL을 40 ℃ 온도의 1,4-다이옥세인 (1,4-dioxane)에 충분히 교반시킨 뒤 10중량%의 아세트산 혹은 2, 4, 8 중량%의 DCS를 첨가하였으며 제조된 용액에 <425 μm NaCl : 45-75 μm NaHCO3을 3 : 1로 1 mg/mL 혼합한 뒤 조성물을 실리콘 몰드에 넣어 -20℃에서 4시간 동안 냉동시키고 -20 ℃ 에탄올에서 48시간 동안 1,4-다이옥세인을 제거한 뒤 상온에서 pH를 4.0으로 조절한 염산 수용액에 8시간 반응시킨 후 72시간동안 증류수에 상온에서 48시간 동안 건조시킨 뒤 24시간 동안 동결건조 시켜 다공성 조성물을 제조하였다.
실시예 4: HA가 코팅된 지지체 제조
HA가 코팅된 조성물을 제조하기 위해서 상기 제조된 지지체를 10X SBF용액에 침전하였으며 7일간 37℃에서 인큐베이팅 시켜 생리활성물질을 첨가한 지지체를 수득하였다.
실시예 5: 골수유래줄기세포 분리
골수유래줄기세포는 20% 소태아혈청 및 1.5% 페니실린/스트렙토마이신이 포함된 α-DMEM 미디엄에 5% CO2 및 37 ℃에서 배양되었다. 골수유래줄기세포는 6 주령 암컷 뉴질랜드 흰토끼에서 대퇴골과 경골의 골수에서 분리하여 사용하였다. 분리된 뼈를 1X 인신완충식염수와 1.5% 페니실린/스트렙토마이신으로 5회 세척하였으며 연골 부위는 가위를 이용하여 제거하였다. 절단된 대퇴골과 경골에서 골수를 채취하였다. 추출한 골수를 α-DMEM 미디엄에 재현탁 시킨 뒤 세포배양 접시에 배양했다 (step 1). 3시간 후 100 μm cell strainer를 이용하여 골수를 새로운 배양 접시에 갈아준 뒤 배양하였다 (step 2). 3시간 뒤 배양된 상층액을 흡입하여 새로운 배양 접시에 배양하였다 (step 3). 3개의 배양 접시를 매 3일마다 새로운 용액으로 교체하고 passage 2인 세포를 실험에 사용했다.
실시예 6: 토끼 골수유래줄기세포 파종 전 준비
지지체 내 골수유래줄기세포를 파종하기 위해서 모든 지지체는 70% 에탄올에 침지하고 20분 동안 UV를 조사시켜 멸균시킨 후 PBS에 15분 동안 3회 침지시켜 잔류 에탄올을 세척하였고 α-DMEM에 침지시켜 하루 동안 5% CO2 및 37 ℃에서 배양하여 멸균하였다.
실시예 7: 지지체 내 토끼 골수유래줄기세포 파종
지지체 내 골수유래줄기세포를 파종하기 위해서 실시예3과 실시예4와 같이 지지체를 제조하였으며 실시예 6으로 멸균 후 실시예 5에서 제시된 바와 같이 배양된 골수유래줄기세포를 1X 트립신 (trypsin)에 3분간 처리하여 멸균된 지지체당 1×105 cells으로 파종하였다.
실험예 1 : 지지체의 모폴로지 확인
상기 실시예3에서 제작된 지지체의 다공 및 다공크기를 확인하기 위해 SEM 관찰을 실시하였다. 각 샘플들은 카본데이프가 붙여져 있는 금속판에 고정시키고 아르곤 가스 하에서 2분 동안 프라즈마 스퍼터 (Model SC 500K, Emscope, UK)로 200 두께의 백금 코팅하였다. 이를 주사전자현미경 (Hitachi Co, Model S-2250N, Japan)을 이용하여 측정하였다.
본 평가를 통해서, 모든 지지체는 골수유래줄기세포의 생장에 적절한 438.8 μm의 기공과 5.39 μm의 미세기공 구조를 나타내었다. 이는 표면적을 증가시키고 단백질 흡착을 촉진하며 세포 부착을 용이하게 하여 시험관 내 혹은 생체 에서 세포와 조직에 영양분과 산소 공급에 긍정적인 영향을 끼칠 수 있다.
도 1는 실시예에 따라 제조된 지지체의 SEM 사진을 내나타낸다.
실험예 2 : 지지체의 FE-SEM과 EDS 분석
실시예4에서 제작된 지지체를 에너지분산형광도계 (EDS) 검출기가 부착된 전계 방사형 주사 전자 현미경 FE-SEM으로 생체활성평가에 따른 지지체 표면의 화학적 변화를 분석하였다.
본 평가를 통해, DC의 함량에 따라 거친 표면과 더 많은 양의 인회석 핵 생성을 보였으며 DC 함량이 증가함에 따라 많은 양의 Ca 및 P 원소가 검출되었다.
도 2은 실시예에 따라 제조된 지지체의 FE-SEM과 EDS 분석을 비교하여 나타낸 사진이다.
실험예 3 : 지지체의 XRD 분석
실시예4에서 제작된 지지체를 X선 회절계를 이용하여 바이오세라믹의 위상을 분석하였다. 시료 분석을 위한 회절각은 0-90°(2θ)로 전압은 40 kV, 전류는 30 mA, 스캔 속도는 2°min-1으로 측정하였다.
본 평가를 통해서, 폴리카프로락톤의 결정형태에 의해 발생하는 21°와 23°에서 유의적인 피크가 나타났다. 29°,31°,40°에서의 피크의 출현은 수산화인회석의 형성에 기인하며 DC 함량이 높을수록 이러한 피크의 강도가 높게 나타났다.
도 3은 실시예에 따라 제조된 지지체의 XRD 분석을 비교하여 나타낸 그래프이다. (1:폴리카프로락톤, 2:하이드록시아파타이트)
실험예 4 : 압축강도 평가
지지체의 기계적 특성을 평가하기 위해 실시예3에서 제작된 지지체의 압축강도를 측정하였다. 지지체는 두께 5 mm, 직경 10 mm의 크기로 제조하여 동결건조 시켰으며 측정 거리는 1 mm, 측정 속도는 2.0 mm/min, 측정 힘은 10 N으로 설정하였다. 지지체의 높이와 너비를 바탕으로 응력-변형 곡선을 계산하였다. 압축 계수는 5-10% 변형율에서 계산 되었다.
본 평가를 통해서 지지체의 압축강도가 DC 농도가 증가함에 따라 향상하는 경향을 보였다. 지지체의 압축계수 또한 DC 함량이 높을수록 증가하였다. PCL과 비교하여 PCL/DC 0.8%가 6배 높은 차이를 보였으며 이는 콜라겐이 갖고 있는 연성과 같은 물리적 특성 때문으로 사료된다. 이후 실험은 PCL, PCL/DC 0.8%, C-PCL, C-PCL/DC 0.8%를 이용하여 실험을 진행하였다.
도 4는 실시예에 따라 제조된 지지체의 압축강도를 비교 평가한 그래프를 나타낸다.
실험예 5 : 지지체의 독성평가
지지체의 생체적합성을 평가하기 위해 실시예7에 따라 세포가 파종된 지지체에 MTT (3- [4, -dimethylthiazol-2-yl] -2,5-diphenylterazolium bromide; thiazolyl blue) 용액을 사용하여 세포 생존력과 증식을 분석했다. 파종 후 1, 3, 7, 14일째에 지지체를 MTT (3- [4, -dimethylthiazol-2-yl] -2,5-diphenylterazolium bromide; thiazolyl blue) 용액을 처리하고 4시간 동안 37 ℃ 및 5% CO2 인큐베이터에 보관한 뒤 상층액을 제거하고 다이메틸설폭사이드 (dimethyl sulfoxide: DMSO)를 첨가하여 포르마잔 결정을 용해시켰다. 생존도는 마이크로플레이트 리더기로 570 nm의 흡광도에서 96-웰 플레이트에 측정했다.
1일에서 14일까지 지지체 내 세포 배양후 광밀도 값을 측정한 결과, 모든군에서 5배 이상 증가한 것을 확인하였다. 이는 제작된 지지체가 세포 독성이 없어 세포가 잘 증식되었다는 것을 나타낸다.
도 5은 실시예에 따라 제조된 지지체의 독성을 평가한 그래프 사진이다.
실험예 6 : 지지체 내 파종된 골수유래줄기세포의 독성평가
지지체 내 파종된 골수유래줄기세포의 세포 사멸도를 live/dead 염색을 통해 확인하였다. 실시예7에서 제시된 골수유래줄기세포가 파종된 지지체를 세포 이미징 키트로 5% CO2와 37 ℃에서 30분간 처리하여 live/dead 염색했다. 염색된 지지체는 고분해능 공초점 레이저 주사현미경을 이용하여 Z-stack mode로 촬영하여 배양 3일, 14일 후의 세포의 생존도를 분석하였다.
본 평가를 통하여, 배양 3일 후 14일 후에는 모든 군에서 배양 3일후와 비교했을 때 더 많은 양의 세포가 관찰되었고 DC와 수산화인회석의 세포들이 증식하기에 적합한 환경을 제공하여 이러한 결과가 나타났다고 간주된다.
도 6는 실시예에 따라 제조된 지지체의 독성평가를 live/dead 염색 기법으로 관찰한 결과 사진이다.
실험예 7 : 지지체 내에 파종된 골수유래줄기세포의 유전자 발현율 평가
지지체 내에 파종된 골수유래줄기세포를 배양한 뒤 3, 14일차에 인산완충생리식염수로 3번 세척하였다. 트리졸에 샘플을 균질화하고 클로로포름을 첨가하여 12,000 x g에서 4 ℃에 15분 동안 원심분리를 진행했다. 상층액을 다른 튜브에 옮긴 후 RNeasy Mini Kit를 프로토콜에 따라 사용하여 고품질의 mRNA을 추출했다. 추출한 mRNA는 PCR을 이용하여 역전사 반응을 수행하여 cDNA로 합성했다. Real-time PCR은 제조사의 지시에 따라 SYBERTM Green PCR Master Mix와 StepOnePlus Real-Time PCR 시스템을 사용하여 수행했다. 골 특이적 유전자인 골형성 특이적 유전자인 오스테오칼신 (Osteocalcin, OCN), 런트 관련 전사 인자2 (Runt-related transcription factor 2, RUNX2), 1형 콜라겐 (Collagen type 1, COL1), 알칼리인산분해효소 (Alkaline phosphatase, ALP)을 연구에 사용하였고, GAPDH를 하우스 키핑 유전자로 사용 하였다.
본 평가를 통하여, C-PCL/DC 0.8%에서는 PCL와 PCL/DC에 비해 더 높은 발현율을 나타냈다. 골형성의 초기에 분비되는 생물학적 표지자이며 골모세포에 의해서만 발현되는 유전인자로 보고된 OCN의 발현율은 C-PCL/DC 0.8%에서 순수 PCL보다 8배 높은 발현수준을 보였다. 이는 C-PCL/DC 0.8%에서 BMSC가 증식되었을 뿐만 아니라 골모세포로 잘 분화되었음을 나타낸다. 골아세포 분화와 골 형성 과정에서 세포외 기질 단백질 유전자의 발현을 조절하는 다기능 전사인자인 RUNX2는 C-PCL/DC과 C-PCL/DC 0.8%에서 BMSC의 분화와 성장이 훨씬 효과적으로 일어나는 것을 보여주었으며 골의 주요 성분이며 골아세포 특이적 단백질인 COL1은 C-PCL/DC 0.8%가 확연히 높은 발현 수준을 보였다. 이는 SBF 코팅으로 인하여 천연 조직의 세포외 기질과 유사한 미세 환경에서 COL1의 발현을 증가시키는 것으로 예상된다. 뼈, 신장 특이적 효소이며 초기 골 분화 시 발현되는 유전인자인 ALP는 14일 동안 배양한 C-PCL/DC 0.8%는 다른 골 형성 특이적 유전자와 일치하게 다른 그룹에 비해 현저하게 높은 발현 수준을 보였다. 이러한 결과를 바탕으로 C-PCL/DC 0.8%가 골 전도성 및 골 유도성 미세 환경을 효과적으로 제공하며 골수유래줄기세포의 분화에 긍정적인 영향이 있을 것으로 예상된다.
도 7은 실시예에 따라 제조된 지지체의 유전자 발현율을 비교 분석한 그래프 사진을 보여준다.
Claims (7)
- 오리발 유래 콜라겐 및 골수유래줄기세포를 포함하는 다공성 폴리카프로락톤 지지체로 구성된 골 이식용 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 하드록시아파타이트 (hydroxyapatite : HA)이나 생리활성물질, 골 형성 단백질, 약물로 코팅된 폴리카프로락톤 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 상기 DC가 함유된 폴리카프로락톤 지지체는 섬유형 거대 및 미세 다공성 구조를 특징으로 하는 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 상기 DCS 함량은 PCL 조성물의 0.1-1.5중량%일 수 있다. 더욱 바람직하게는 0.2-0.8중량%으로 구성된 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 상기 DCS가 함유된 PCL 지지체의 전체 조성물 구성은 10-11.5중량%일 수 있다. 더욱 바람직하게는 10.2-10.8중량%으로 구성된 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 상기 DCS가 함유된 PCL 지지체에 골수유래줄기세포 혹은 골세포가 파종된 조성물이며 파종된 세포는 1*104-1*108 cells/mL이며 더욱 바람직하게는 1*105-1*107 cells/mL가 파종된 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 상기 골 재생 유도물질로서 생리활성물질, 골 형성 단백질, 골수유래줄기세포, 골세포, 수용성 고분자 지지체, 지용성 고분자 지지체 중에 하나 이상을 포함하는 골 대체용 조성물.
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