KR20230090916A - 미세조류 나노클로롭시스 속 g1-5 균주 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부개선용 조성물 - Google Patents
미세조류 나노클로롭시스 속 g1-5 균주 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부개선용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 미세조류 나노클로롭시스 속 G1-5 균주(Nannochloropsis sp. G1-5, 기탁번호: KCTC 14309BP) 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부개선용 조성물에 관한 것으로, G1-5 균주 추출물이 생체안전성이 우수하고 항산화 및 항염 효과가 있으며, 1000㎍/mL 이하의 농도에서 멜라닌(melanin) 생성 감소, 콜라겐(collagen) 생성 촉진, 엘라스타제(elastase) 활성 저해 및 히알루론산(hyaluronic acid) 합성 촉진 효과가 있음을 확인함으로써, 피부개선용 화장료 조성물, 건강기능식품 조성물 또는 의약외품 조성물로 활용될 수 있다.
Description
본 발명은 미세조류 나노클로롭시스 속 G1-5 균주(Nannochloropsis sp . G1-5, 기탁번호: KCTC 14309BP) 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부개선용 조성물에 관한 것이다.
인간의 피부는 외부로부터 몸을 보호하고, 수분 손실 방지, 노폐물 배출, 체온 유지, 비타민 D 합성 등을 수행하는 중요 기관이다. 피부는 세월이 흐르며 노화가 진행되며, 과도한 햇빛에 노출되어 화상, 기미, 주근깨화 같은 노화가 나타난다. 노화의 원인으로는 중금속, 환경적인, 자외선 등이 존재한다. 또한 나이가 들어가며 체내에 활성 산소 생성량이 증가하며 피부는 노화되어가며, 노화가 진행되면서 피부의 표피층은 수분 부족으로 거칠어지며 각질형성세포의 각화주기에 이상이 생기며 비정상적인 각질층이 형성된다.
진피층에서는 진피섬유아세포의 콜라겐 합성 저해로 인해 진피층의 구조 변형이 일어난다. 이러한 구조 변형은 피부의 탄력을 감소시키며 주름을 생성하게 만든다. 피부에는 주로 타입 Ⅰ 콜라겐(Type Ⅰ collagen)이 존재하며, 프로콜라겐(procollagen) 유전자로부터 발현된 프로콜라겐은 세포 밖으로 분비되어 서로 결합하여 타입 1 콜라겐을 형성한다. 엘라스틴은 콜라겐과 함께 피부를 구성하는 주요 단백질이며 생합성의 저해로 피부 탄력이 저하된다. 엘라스틴을 분해하는 엘라스타제(elastase)의 경우 자외선에 의해 활성이 증가되며 피부 탄력성섬유의 3차원적 구조를 변형시킨다. 진피섬유아세포에서 발현되는 엘라스타제로는 Matrix metallopeptidase 12(MMP12)로, 엘라스틴 내의 p-니트로벤질에스테르(p-Nitrobenzyl ester) 펩타이드를 가수분해하여 엘라스틴을 분해한다. 콜라겐과 엘라스틴 섬유 주변을 교차하여 진피층의 구조를 지탱하는 Glycosaminoglycans(GAGs)은 주로 히알루론산과 무코다당류들로 이루어져 있으며, 노화가 진행됨에 따라 히알루론산이 감소하여 콜라겐과 엘라스틴의 해리가 일어나며 수분이 감소하여 피부에 주름이 생기고 탄력이 줄어들게 된다. 히알루론산은 섬유아세포 및 각질형성세포에서 형성되며 히알루론산 합성을 촉진하는 효소(Hyaluronic acid synthase, HAS) 중 HAS2가 결정적인 역할을 한다. 히알루론산은 물 분자의 결합과 유지에 관여하여 수분을 함유할 후 있으며, 피부장벽 기능 조절과 세포외 기질을 수화시키고 조직 내 수분의 항상성을 유지시키는 역할을 한다.
외적인 요인 중 자외선은 인간의 피부에서 멜라닌 색소 합성을 유도하는데 이렇게 생성된 멜라닌은 피부에서 발생하는 활성산소와 자유라디칼(free radical)을 제거하며, 피부가 자외선을 흡수하는 것을 차단한다. 멜라닌은 자외선 등과 같은 외부 유해인자를 차단하여 신체를 보호하는 역할을 수행하지만 과도한 멜라닌의 생성은 색소 침착증이나 피부암과 같은 질병을 유발할 수 있다. 멜라닌은 멜라닌소체(melanosome)에서 합성되며, 정상적인 멜라닌을 생성하는데 필요한 특이적 효소들을 함유하고 있다. 그 중 타이로시나제는 멜라닌 생성과정에서 중요한 초기 속도 결정에 관여하는 중요한 효소이다. 멜라닌 생성은 유전적 요인뿐만 아니라 자외선(UV), 열, 화학약제, 염증 등이 있다. 특히 자외선은 피부 노화를 촉진시키며 오래 노출되면 α-melanocyte stimulating hormone(α-MSH), endothelin-1(ET-1), nitric oxide(NO) 등의 멜라닌생성촉진인자가 분비된다. 이러한 멜라닌생성에 중요한 역할을 하는 타이로시나제의 활성 및 멜라닌 생성속도를 저해하는 정도로 미백성분의 효과를 검증할 수 있으며, 지금까지 알려진 대표적인 미백 물질로는 알부틴(Arbutin), 코직산(Kojic acid), 알파비사보롤(α-bisabolol), 아스코빅산(Ascobic acid), 나이아신아마이드(Niacinamide), 하이드로퀴논(hydroquinone) 등 다양한 물질이 있다. 그러나 이러한 미백 물질들의 경우 피부자극, 알레르기 유발, 독성, 불안정성 등의 문제가 제기되고 있다.
미세조류는 당질, 지질, 단백질, 색소, 비타민, 스테로이드, 기타 의약성분 등의 유용성분과 수소, 탄화수소, 생화학 연료 등의 다양한 물질들을 생산한다. 또한, 광합성 효율이 높고 성장속도가 빠르며 지질 생산성이 높다. 미세조류는 광합성을 통해 생태계의 1차 생산자 역할을 함으로써, 해양 생물 양식에서 잠재적인 식품 소재로 이용될 수 있다. 또한, 대체에너지원, 식품, 건강보조식품, 수산 양식용 사료, 의약 원료물질, 생화학 물질 등 미세조류의 응용분야가 넓어지고 있다.
해양 단세포 미세조류인 나노클로롭시스는 진안점조강(Eustigmatophyceae)의 일종으로 직경이 2-4㎛ 정도인 식물 플랑크톤이다. 나노클로롭시스 속 미세조류는 단세포 녹조류로 양식용 사료로 이용되며, 최적영양조건이 충족될 경우, 지질함량이 다른 미세조류에 비해 매우 높고, 광합성 미세조류로서 배양이 용이하고 스테롤(sterol) 또는 EPA(eicosapentaenoic acid)의 지질 함량이 높아 고부가가치 기능성 식품으로서 이용가치가 높다. 또한, 나노클로롭시스 속 미세조류 중 하나인 나노클로롭시스 오세아니카(Nannochloropsis oceanica)는 클로로필 a를 다량 함유하는데, 클로로필 a는 세포재생, 항암, 미백, 주름개선 등에 효과가 있는 것으로 알려져 있다.
현재까지 나노클로롭시스 속 미세조류에 대한 연구는 산업적 생산을 위한 대량 배양에 초점이 맞춰져 있고, 나노클로롭시스 속 미세조류의 기능성을 이용한 화장품 개발은 미미한 상태이다. 따라서, 나노클로롭시스로부터 추출한 새로운 생리 활성 물질을 통한 기능성 제품 개발이 필요한 실정이다.
본 발명의 목적은 미세조류 나노클로롭시스 속 G1-5 균주(nannochloropsis sp. G1-5, 기탁번호: KCTC 14309BP) 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부개선용 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 미세조류 나노클로롭시스 속 G1-5 균주(nannochloropsis sp. G1-5, 기탁번호: KCTC 14309BP) 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부개선용 화장료 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 미세조류 나노클로롭시스 속 G1-5 균주(nannochloropsis sp. G1-5, 기탁번호: KCTC 14309BP) 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 미세조류 나노클로롭시스 속 G1-5 균주(nannochloropsis sp . G1-5, 기탁번호: KCTC 14309BP) 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부개선용 의약외품 조성물을 제공한다.
본 발명에 따르면, 미세조류 나노클로롭시스 속 G1-5 균주(nannochloropsis sp. G1-5, 기탁번호: KCTC 14309BP) 추출물이 생체안전성이 우수하고 항산화 및 항염 효과가 있으며, 1000㎍/mL 이하의 농도에서 멜라닌(melanin) 생성 감소, 콜라겐(collagen) 생성 촉진, 엘라스타제(elastase) 활성 저해 및 히알루론산(hyaluronic acid) 합성 촉진 효과가 있음을 확인함으로써, 피부개선용 화장료 조성물, 건강기능식품 조성물 또는 의약외품 조성물로 활용될 수 있다.
도 1은 미세조류 나노클로롭시스 속 G1-5 균주의 chloroplast genome sequence를 분석하여 얻은 유사종과의 계통도를 나타낸다.
도 2는 미세조류 나노클로롭시스 속 G1-5 및 나노클로롭시스 가디타나 CCMP526 균주의 최적 배양온도를 분석한 결과를 나타낸다.
도 3은 고농도 NaCl(54g/L)를 추가한 F/2 배양액에서 미세조류 나노클로롭시스 속 G1-5 및 나노클로롭시스 가디타나 CCMP526 균주의 바이오매스 수율을 분석한 결과를 나타낸다.
도 4는 미세조류 나노클로롭시스 속 G1-5 유래 추출물을 처리했을 때 인간진피섬유아세포(NHDFs)의 세포 생존율 측정 결과를 나타낸다.
도 5는 미세조류 나노클로롭시스 속 G1-5 유래 추출물을 처리했을 때 인간진피섬유아세포(NHDFs)의 Type 1 Collagen(COL1A1) 유전자 발현 변화를 나타낸다.
도 6은 미세조류 나노클로롭시스 속 G1-5 유래 추출물을 처리했을 때 인간진피섬유아세포(NHDFs)의 콜라게나제(MMP1) 유전자 발현 변화를 나타낸다.
도 7은 미세조류 나노클로롭시스 속 G1-5 유래 추출물을 처리했을 때 인간진피섬유아세포(NHDFs)의 엘라스타제(elastase) 저해 활성 측정 결과를 나타낸다.
도 8은 미세조류 나노클로롭시스 속 G1-5 유래 추출물을 처리했을 때 인간진피섬유아세포(NHDFs)의 히알루론산 합성효소(Hyaluronan synthase 2,HAS2)의 유전자 발현변화 측정결과를 나타낸다.
도 9는 미세조류 나노클로롭시스 속 G1-5 유래 추출물을 처리했을 때 멜라닌형성세포(B16F10 melanoma cells)의 세포 생존율 측정 결과를 나타낸다.
도 10은 미세조류 나노클로롭시스 속 G1-5 유래 추출물을 처리했을 때 멜라닌형성세포(B16F10 melanoma cells) 내 멜라닌 생성량 변화를 나타낸다.
도 11은 미세조류 나노클로롭시스 속 G1-5 유래 추출물을 처리했을 때 DPPH free radical 소거능 측정 결과를 나타낸다.
도 12는 미세조류 나노클로롭시스 속 G1-5 유래 추출물을 처리했을 때 L-tyrosine에 대한 tyrosinase 저해 활성 측정결과를 나타낸다.
도 13은 미세조류 나노클로롭시스 속 G1-5 유래 추출물을 처리했을 때 NF-kB Luciferase Reporter NIH3T3 Stable cell의 세포 생존율 측정 결과를 나타낸다.
도 14는 미세조류 나노클로롭시스 속 G1-5 유래 추출물을 처리했을 때 NF-kB Luciferase Reporter NIH3T3 Stable cell의 NF-kB 활성 측정결과를 나타낸다.
도 15는 미세조류 나노클로롭시스 속 G1-5 유래 추출물을 처리했을 때 인간피부섬유아세포(CCD986sk)의 세포 생존율 측정 결과를 나타낸다.
도 16은 미세조류 나노클로롭시스 속 G1-5 유래 추출물을 처리 후 자외선을 조사 후 인간피부섬유아세포(CCD986sk)의 세포 생존율 측정 결과를 나타낸다.
도 2는 미세조류 나노클로롭시스 속 G1-5 및 나노클로롭시스 가디타나 CCMP526 균주의 최적 배양온도를 분석한 결과를 나타낸다.
도 3은 고농도 NaCl(54g/L)를 추가한 F/2 배양액에서 미세조류 나노클로롭시스 속 G1-5 및 나노클로롭시스 가디타나 CCMP526 균주의 바이오매스 수율을 분석한 결과를 나타낸다.
도 4는 미세조류 나노클로롭시스 속 G1-5 유래 추출물을 처리했을 때 인간진피섬유아세포(NHDFs)의 세포 생존율 측정 결과를 나타낸다.
도 5는 미세조류 나노클로롭시스 속 G1-5 유래 추출물을 처리했을 때 인간진피섬유아세포(NHDFs)의 Type 1 Collagen(COL1A1) 유전자 발현 변화를 나타낸다.
도 6은 미세조류 나노클로롭시스 속 G1-5 유래 추출물을 처리했을 때 인간진피섬유아세포(NHDFs)의 콜라게나제(MMP1) 유전자 발현 변화를 나타낸다.
도 7은 미세조류 나노클로롭시스 속 G1-5 유래 추출물을 처리했을 때 인간진피섬유아세포(NHDFs)의 엘라스타제(elastase) 저해 활성 측정 결과를 나타낸다.
도 8은 미세조류 나노클로롭시스 속 G1-5 유래 추출물을 처리했을 때 인간진피섬유아세포(NHDFs)의 히알루론산 합성효소(Hyaluronan synthase 2,HAS2)의 유전자 발현변화 측정결과를 나타낸다.
도 9는 미세조류 나노클로롭시스 속 G1-5 유래 추출물을 처리했을 때 멜라닌형성세포(B16F10 melanoma cells)의 세포 생존율 측정 결과를 나타낸다.
도 10은 미세조류 나노클로롭시스 속 G1-5 유래 추출물을 처리했을 때 멜라닌형성세포(B16F10 melanoma cells) 내 멜라닌 생성량 변화를 나타낸다.
도 11은 미세조류 나노클로롭시스 속 G1-5 유래 추출물을 처리했을 때 DPPH free radical 소거능 측정 결과를 나타낸다.
도 12는 미세조류 나노클로롭시스 속 G1-5 유래 추출물을 처리했을 때 L-tyrosine에 대한 tyrosinase 저해 활성 측정결과를 나타낸다.
도 13은 미세조류 나노클로롭시스 속 G1-5 유래 추출물을 처리했을 때 NF-kB Luciferase Reporter NIH3T3 Stable cell의 세포 생존율 측정 결과를 나타낸다.
도 14는 미세조류 나노클로롭시스 속 G1-5 유래 추출물을 처리했을 때 NF-kB Luciferase Reporter NIH3T3 Stable cell의 NF-kB 활성 측정결과를 나타낸다.
도 15는 미세조류 나노클로롭시스 속 G1-5 유래 추출물을 처리했을 때 인간피부섬유아세포(CCD986sk)의 세포 생존율 측정 결과를 나타낸다.
도 16은 미세조류 나노클로롭시스 속 G1-5 유래 추출물을 처리 후 자외선을 조사 후 인간피부섬유아세포(CCD986sk)의 세포 생존율 측정 결과를 나타낸다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
본 발명자는 기존의 나노클로롭시스 속 미세조류를 이용한 기능성 화장품 개발이 미미한 상황에서 상기 미세조류를 이용한 피부개선용 기능성 제품 개발에 예의 노력한 결과, 나노클로롭시스 속 G1-5 균주(nannochloropsis sp . G1-5, 기탁번호: KCTC 14309BP)를 기반으로 하여, 항산화, 항염, 멜라닌 생성 감소, 콜라겐 생성 증가 등의 효과를 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 미세조류 나노클로롭시스 속 G1-5 균주(nannochloropsis sp . G1-5, 기탁번호: KCTC 14309BP) 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부개선용 화장료 조성물을 제공한다.
상기 추출물은 미리스트산, 팔미트산, 팔미톨레산, 스테아르산, 리놀레산, 감마리놀렌산, 아라키돈산, 에이코사트리에논산 및 에이코사펜타엔산(EPA)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 지방산; 바우케리아잔틴, 비올라잔틴, 아스트잔틴, 지아잔틴, 칸타잔틴, 클로로필a 및 베타카로틴으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 카로티노이드, 페놀류화합물 및 플라보노이드를 포함한다.
또한, 상기 추출물은 물, 탄소수 1 내지 4의 저급 알콜, 메틸렌클로라이드, 에틸렌, 아세톤, 헥산, 에테르, 클로로포름, 디클로로메탄, 트리클로로메탄, 에틸아세테이트, 부틸아세테이트, N,N-디메틸포름아미드(DMF), 디메틸설폭사이드(DMSO), 1,3-부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 또는 이들의 혼합 용매로 이루어진 군에서 선택된 용매로 추출되지만 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 상기 추출물은 항산화, 항염, 피부 미백, 피부주름개선, 피부보습, 자외선에 의한 세포 손상 보호, 피부트러블 개선, 피부노화방지, 피부재생 및 피부탄력 증진 효과 중 하나 이상을 가지는 것을 특징으로 하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 상기 추출물은 1000㎍/mL 이하의 농도에서 콜라겐(collagen) 생성 촉진, 콜라게나제(collagenase) 생성 저해, 인간진피섬유아세포 내 엘라스타제(elastase) 활성 저해, 히알루론산(hyaluronic acid) 합성 촉진, 멜라닌(melanin) 생성 저해, 항산화 또는 항염 효과를 가지는 것을 특징으로 한다.
상기 콜라겐(collagen) 생성 촉진은 COL1A1(Collagen, type I, alpha 1) mRNA 발현 증가에 의한 것을 특징으로 갖는다.
상기 콜라게나제(collagenase) 생성 저해는 MMP(Matrix metalloproteinase 1) mRNA 발현 감소에 의한 것을 특징으로 갖는다.
상기 히알루론산(hyaluronic acid) 합성 촉진은 HAS2(Hyaluronan synthase 2)의 mRNA 발현 증가에 의한 것을 특징으로 갖는다.
상기 항염 효과는 NF-kB Luciferase 유전자가 삽입된 NIH3T3 세포주(NF-kB Luciferase Reporter NIH3T3 Stable cell) 내 NF-kB 활성 감소에 의한 것을 특징으로 갖는다.
상기 멜라닌 생성 저해는 멜라닌형성세포(B16F10 melanoma cells) 또는 Tyrosinase 활성 저해에 의한 것을 특징으로 한다.
본 발명에서는 서남해 해안에서 채취한 해수로부터 미세조류를 분리하여 동정한 결과 나노클로롭시스(Nannochloropsis sp .) 속의 신규 미세조류 균주임을 확인하고 Nannochloropsis sp . G1-5(Nannochloropsis sp . strain G1-5)로 명명하였다.
본 발명에 따른 상기 균주는 한국생명공학연구원(KCTC)에 2020년 9월 11일자로 기탁하였다(기탁번호: KCTC 14309BP, 출원번호: 10-2020-0135268).
상기 “유효성분으로 포함하는”은 피부 개선 효과를 나타낼 수 있는, 예컨대, 주름개선효능과 관련된 콜라겐 합성, 탄력 개선 또는 자외선에 의한 피부 노화 방지, 피부 자극 완화, 피부 진정 효과 등을 나타낼 수 있는 정도의 유효량을 함유하는 것을 의미할 수 있다.
상기 “주름 개선”은 엘라스틴으로 구성된 탄력섬유가 콜라겐과 함께 존재하며, 상기 엘라스틴과 콜라겐이 충분히 존재하는 상태에서 피부 탄력이 유지 또는 향상되는 현상을 의미한다. 또한 상기 "주름 개선"은 피부에 주름이 생성되는 것을 억제 또는 저해하거나, 이미 생성된 주름이 완화되는 현상을 의미한다.
상기 “항산화”는 산화를 억제하는 작용을 의미하는 것으로, 인체는 산화촉 진물질과 산화억제물질이 균형을 이루고 있으나, 여러 가지 요인들로 인하여 이러한 균형 상태를 잃고 산화를 촉진하는 방향으로 기울게 되면, 생체 내에 산화적 스트레스(oxidative stress)가 유발되어 세포손상 및 병리적 질환을 유발할 수 있다.
산화적 스트레스의 직접적 원인이 되는 활성 산소종(reactive oxygen species, ROS)은 화학적으로 불안정하고 반응성이 높아 DNA, 단백질, 지질 및 탄수화물과 같은 여러 생체물질과 쉽게 반응할 수 있으며, 생체 내 고분자들을 공격하여 세포와 조직에 비가역적인 손상을 일으키거나 돌연변이, 세포독성 및 암 등을 초래하게 되고, 노화의 직접적인 원인이 되기도 한다. 상기 활성 산소종을 제거하거나 감소시킴으로써 항산화 효과를 얻어 노화를 방지하고 건강을 유지할 수 있다.
상기 “항염”은 염증 개선 효과를 의미한다. 상기 “염증”은 생체나 조직에 물리적 작용이나 화학적 물질, 세균 감염 등의 어떠한 기질적 변화를 가져오는 침습이 가해질 때 그 손상부위를 수복 재생하려는 기전으로, 일단 자극이 가해지면 국소적으로 히스타민, 세로토닌, 브라디키닌, 프로스타글란딘, HETE(hydroxyeicosatetraenoic acid), 류코트리엔과 같은 혈관 활성 물질이 유리되어 혈관 투과성이 증대되면서 염증이 유발될 수 있다.
상기 “피부 보습”은 피부의 수분 손실(수분 증발) 등을 적절히 조절하여 피부조직의 항상성을 유지하는 모든 행위를 의미한다. 상기 피부 보습 효과는 각질 개선효과, 피부자극 감소효과 등 다양한 측면의 추가적인 피부 개선 효과를 수반할 수 있다.
상기 화장료 조성물은 유연화장수, 영양화장수, 수분크림, 영양크림, 마사지크림, 에센스, 앰플, 젤, 아이크림, 클렌징크림, 클렌징폼, 클렌징워터, 팩, 스프레이 및 파우더로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상으로 제형화될 수 있다.
구체적으로, 상기 화장료 조성물은 일반적인 유화 제형 및 가용화 제형으로 제조할 수 있다. 예컨대, 유연 화장수 또는 영양 화장수 등의 화장수; 훼이셜 로션, 바디로션 등의 유액; 영양 크림, 수분 크림, 아이 크림 등의 크림; 에센스; 화장연고; 스프레이; 젤; 팩; 선 스크린; 메이크업 베이스; 액체 타입, 고체 타입 또는 스프레이 타입 등의 파운데이션; 파우더; 클렌징 크림, 클렌징 로션, 클렌징 오일 등의 메이크업 제거제; 또는 클렌징 폼, 비누, 바디워시 등의 세정제로 제형화될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 또한 상기 피부 외용제는, 연고, 패치, 겔, 크림 또는 분무제로 제형화될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 화장료 조성물은 각각의 제형에 있어서 상기 필수성분 외에 제형의 종류 또는 사용 목적 등에 따라 본 발명에 따른 목적을 저해하지 않는 범위 내에서 다른 성분들이 적절히 배합될 수 있다.
상기 화장료 조성물은 통상적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있으며, 예컨대 유분, 물, 계면활성제, 보습제, 저급 알코올, 증점제, 킬레이트제, 색소, 방부제, 향료 등을 적절히 배합할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 허용 가능한 담체는 제형에 따라 달리할 수 있다. 예컨대, 연고, 페이스트, 크림 또는 젤로 제형화될 때 담체 성분으로서 동물성 유, 식물성 유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크, 산화아연 또는 이들의 추출물이 사용될 수 있다.
상기 화장료 조성물은 파우더 또는 스프레이로 제형화될 때, 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄히드록사이드, 칼슘 실케이트, 폴리아미드 파우더 또는 이들의 추출물이 사용될 수 있고, 스프레이의 경우 클로로플루오로히드로카본, 프로판, 부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진제를 더 포함할 수 있다.
상기 화장료 조성물은 용액 또는 유탁액으로 제형화될 때, 담체 성분으로서 용매, 용해화제, 또는 유탁화제가 사용될 수 있고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-브틸글리콜 오일이 사용될 수 있고, 특히, 목화씨 오일, 땅콩 오일, 옥수수 배종 오일, 올리브 오일, 피마자 오일 및 참깨 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 사용될 수 있다.
상기 화장료 조성물은 현탁액으로 제형화될 때, 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리 옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 사용될 수 있다.
상기 화장료 조성물이 비누로 제형화될 때, 담체 성분으로서 지방산의 알칼리 금속 염, 지방산 헤미에스테르염, 지방산 단백질 히드롤리제이트, 이세티오네이트, 라놀린 유도체, 지방족 알코올, 식물성 유, 글리세롤, 당 등이 사용될 수 있다.
상기 화장료 조성물은 최종 제품의 품질이나 기능에 따라 업계에서 통상적으로 사용되는 지방 물질, 유기용매, 용해제, 농축제, 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온봉 쇄제, 킬레이트화제, 보존제, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 화장품에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 같은 화장품 학 또는 피부과학 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 추가적으로 함유할 수 있다.
다만, 상기 보조제 및 그 혼합 비율은 본 발명에 따른 화장료 조성물의 바람직한 성질에 영향을 미치지 않도록 적절히 선택할 수 있다.
또한, 상기 추출물은 내염성이 강한 것을 특징으로 갖는다.
또한, 본 발명은 미세조류 나노클로롭시스 속 G1-5 균주(nannochloropsis sp. G1-5, 기탁번호: KCTC 14309BP) 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
본 발명은 통상적으로 이용되는 식품으로써 일반적으로 사용될 수 있다.
본 발명의 식품 조성물은 건강기능식품으로서 사용될 수 있다. 상기 "건강기능 식품"이라 함은 건강기능 식품에 관한 법률에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 의미하며, "기능성"이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다.
상기 건강기능식품 조성물은 통상의 식품 첨가물을 포함할 수 있으며, 상기 "식품 첨가물"로서의 적합 여부는 다른 규정이 없는 한, 식품의약품안전처에 승인된 식품 첨가물 공전의 총칙 및 일반시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하여 판정한다.
상기 "식품 첨가물 공전"에 수재된 품목으로는 예를 들어, 케톤류, 글리신, 구연산칼륨, 니코틴산, 계피산 등의 화학적 합성물, 감색소, 감초추출물, 결정셀룰로오스, 고량색소, 구아검 등의 천연첨가물, L-글루타민산나트륨 제제, 면류첨가알칼리제, 보존료제제, 타르색소제제 등의 혼합제제류들을 들 수 있다.
본 발명의 식품 조성물은 정제, 캡슐, 분말, 과립, 액상, 환 등의 형태로 제조 및 가공할 수 있다. 예를 들어, 캡슐 형태의 건강기능 식품 중 경질 캡슐제는 통상의 경질 캡슐에본 발명에 따른 조성물을 부형제 등의 첨가제와 혼합 및 충진하여 제조할 수 있으며, 연질 캡슐제는 본 발명에 따른 조성물을 부형제 등의 첨가제와 혼합하고 젤라틴 등 캡슐기제에 충진하여 제조할 수 있다. 상기 연질 캡슐제는 필요에 따라 글리세린 또는 소르비톨 등의 가소제, 착색제, 보존제 등을 함유할 수 있다.
상기 부형제, 결합제, 붕해제, 활택제, 교미제, 착향제 등에 대한 용어 정의는 당업계에 공지된 문헌에 기재된 것으로 그 기능 등이 동일 내지 유사한 것들을 포함한다. 상기 식품의 종류에는 특별한 제한이 없으며, 통상적인 의미에서의 건강기능식품을 모두 포함한다.
본 발명에서 용어 “예방”이란 본 발명에 따른 조성물의 투여로 질환의 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 말한다. 본 발명에서 용어 “치료”는 본 발명에 따른 조성물의 투여로 질환의 증세가 호전되거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 말한다. 본 발명에서 "개선"이란 본 발명의 조성물을 개체에 투여하거나 섭취시켜 질환의 나쁜 상태를 좋게 하는 모든 행위를 의미한다.
또한, 본 발명은 미세조류 나노클로롭시스 속 G1-5 균주(nannochloropsis sp. G1-5, 기탁번호: KCTC 14309BP) 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부개선용 의약외품 조성물을 제공한다.
본 발명의 용어, "의약외품"은 사람이나 동물의 질병을 진단, 치료, 개선, 경감, 처치 또는 예방할 목적으로 사용되는 물품들 중 의약품보다 작용이 경미한 물품들을 의미한다. 예를 들어, 약사법에 따른 의약외품은 의약품의 용도로 사용되는 물품을 제외한 것으로, 사람 및 동물의 질병 치료나 예방에 쓰이는 제품, 인체에 대한 작용이 경미하거나 직접 작용하지 않는 제품 등이 포함된다.
본 발명의 미세조류 나노클로롭시스 속 G1-5 균주(nannochloropsis sp . G1-5, 기탁번호: KCTC 14309BP) 추출물을 의약외품 첨가물로 사용할 경우, 다른 의약외품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합 양은 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다.
본 발명에 따른 화장료, 건강기능식품 또는 의약외품 조성물은 미세조류 나노클로롭시스 속 G1-5 균주(nannochloropsis sp . G1-5, 기탁번호: KCTC 14309BP) 추출물과 함께 피부개선 효과를 갖는 공지의 유효성분을 1종 이상 더 함유할 수 있다.
본 발명의 조성물은 피부개선을 위하여 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 또는 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.
이하, 실시예 등을 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예 등은 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예 등에 한정되는 것은 아니다.
[실시예 1] 미세조류의 동정
상기 균주 나노클로롭시스 속 G1-5(Nannochloropsis sp . G1-5; 이하 G1-5라 함)의 genomic DNA로부터 얻은 chloroplast genome sequence를 NCBI의 데이터베이스 및 상동성 검색을 수행하여 계통학적 위치를 분석한 결과, 나노클로롭시스 가디타나 CCMP526(Nannochloropsis gaditana CCMP526; 이하 CCMP526라 함) 균주와 99.85%로 가장 높은 상동성을 보이는 것으로 나타났다(도 1).
상기 균주 G1-5와 가장 유사종인 CCMP526 균주와의 배양 특성을 비교 분석하기 위해, F/2 배지 성분 중 NaNO3 및 NaH2PO4 ·2H2O의 농도를 2배 조정한 배지(NaNO3 150mg, NaH2PO4 ·2H2O 11.3mg, Na2EDTA 4.16mg, FeCl3 ·6H2O 3.15mg, CuSO4 ·5H2O 0.01mg, ZnSO4 ·7H2O 0.022mg, CoCl2 ·6H2O 0.01mg, MnCl2 ·4H2O 0.18mg, Na2MoO4 ·2H2O 0.006mg, Thiamine HCl 0.1mg, Cyanocobalamin 0.5μg, Biotin 0.5μg 및 1L 인공해수(Sea salt 32g/L))에 두 균주를 50μmol m-2s-1 광조건에서 20, 25, 30 및 33℃의 4가지 온도 조건에서 배양한 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, CCMP526 균주는 25℃에서 최대 성장을 보이는 반면, G1-5 균주는 30℃에서 최대 성장을 보임으로써 두 균주의 배양 최적온도가 다른 것으로 나타났다.
또한, 상기 배지에 54g/L의 NaCl을 첨가한 배지에서 두 균주를 배양했을 때 최종 바이오매스를 측정한 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, CCMP526 균주가 1.67g/L의 수율을 보이는 반면, G1-5 균주는 2.83g/L의 수율을 보임으로써, 고농도의 염에 대한 내성이 강한 것으로 나타났다.
[실시예 2] G1-5 균주의 배양
서남해 연안에서 채취한 해수로부터 분리한 G1-5 균주를 실시예 1에서 사용한 배지 1200ml에 초기농도를 OD800 0.2로 맞춘 후 23℃, 80μmol m-2s-1에서 10일간 진탕 배양하였다. 10일간 배양 후 미세조류에 스트레스를 주어 카로티노이드 등 항산화물질 축적을 위해 F/2배지에 NACl 27g/L을 추가 한 배지로 교체하여 20일간 더 배양하였다.
[실시예 3] G1-5 균주의 추출
실시예 2에서 배양한 미세조류의 추출하기 위해, 배양액을 30ml씩 50ml 팔콘 튜브(falcon tube)에 넣어 세포를 원심분리를 이용하여 회수한 뒤 -80℃에서 2~3일 동안 동결시켰다. 동결시킨 세포에 에탄올 15ml을 넣은 후 15분간 vortexing 후 원심 분리하여 상등액을 분리 후 남은 세포에 에탄올 15ml을 다시 넣어 총 두 번 추출을 진행하였다. 추출이 완료된 상등액은 주사기 필터(PTFE syringe filer, pore size 0.2㎛)로 여과하여 추출액을 회수하였다. 회수한 추출액은 진공원심농축기를 이용해 추출 용매를 제거하여 건조시켰다.
[실시예 4] 콜라겐 생성 증가에 대한 효력 시험
인간진피섬유아세포인 Nomal Human Dermal Fibroblast 세포(NHDFs; CELLnTEC, Switzer-land)를 Fibroblast Basal Medium(Lonza, USA)에 FGMTM-2 singleQuotsTM(hGFG, insulin, FBS and gentamicin/amphotericin-B; Lonza, USA)을 함유한 배지에서 배양 후 96 well plate에 4×10³cell/well로 분주하여 24시간 배양 후, 시료를 0~1500㎍/mL 농도로 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 그 후 WST-1 assay solution(EZ-CYTOX; DOGEN,Korea)을 배재양의 10%씩 첨가하여 추가적으로 0.5~1시간 37℃에서 반응시킨 후, Microplate reader system(SpectraMax® i3X Multi-Mode Detection platform; Molecular Devices, USA)를 이용하여 450nm에서 흡광도를 측정하였다.
세포생존율을 확인한 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, 1000㎍/mL 이하(100, 250, 500 및 1000㎍/mL) 농도에서 음성대조군 대비 각각 100.68%, 101.01%, 98.95% 및 96.30%로 세포생존율이 감소하지 않는 것으로 나타났고, 이를 통해 세포독성이 없는 것을 확인하였다.
콜라겐 생성 증가 측정은 Type 1 collagen의 대표 구성 요소인 COL1A1 유전자의 발현수준을 quantitative real-time PCR(qRT-PCR) 분석법을 통해 확인하였다(Peter, 2008). 인간진피섬유아세포(NHDFs)를 6 well culture plate에 3×105 cells/well로 분주하여 24시간 배양 후 시료를 1000㎍/mL 이하(100, 250, 500 및 1000㎍/mL) 농도로 처리 후 24시간 추가 배양하였으며, 양성대조물질로 TGF-β(5 ng/mL)를 사용하였다. 세포를 수확 후 1ml TRIzol reagent(Invitrogen, USA)를 첨가하여 세포 용해 및 total mRNA를 추출하였다. 유전자 발현변화는 β-actin 대조군 유전자 발현량과 비교하여 측정하였다. qRT-PCR 시험에 사용된 primer 정보는 표 1에 나타난 바와 같다.
| Gene | Forward pimers | Reverse primers |
| COL1A1 | 5’-AGGGCCAAGACGAAGACATC-3’ | 5’-AGATCACGTCATCGCACAACA-3’ |
| β-actin | 5’-GGATTCCTATGTGGGCGACGA-3’ | 5’-CGCTCGGTGAGGATCTTCATG-3’ |
도 5에 나타난 바와 같이, 시료를 1000㎍/mL 이하(250, 500 및 1000㎍/mL) 농도로 처리 시 COL1A1 mRNA 발현이 음성대조군과 비교하여 최대 15.43±2.74% 증가하였고(P<0.05), 양성대조군인 TGF-β(5ng/mL)의 경우 음성대조군 대비 70.25±3.95% 증가하였다(P<0.05). 이는 G1-5 균주에서 추출한 추출물이 1000㎍/mL 이하의 농도에서 농도 의존적으로 콜라겐 생성을 증가시킴을 입증한다.
[실시예 5] 콜라게나제 생성 저해 효력 시험
콜라게나제 생성 저해 측정은 콜라겐 분해에 관여하는 대표적인 효소인 MMP1(Matrix metalloproteinase 1) 유전자의 발현수준을 quantitative real-time PCR(qRT-PCR) 분석법을 통해 확인하였다(Peter, 2008). 인간진피섬유아세포인 Nomal Human Dermal Fibroblast 세포(NHDFs; CELLnTEC, Switzer-land)를 Fibroblast Basal Medium(Lonza, USA)에 FGMTM-2 singleQuotsTM (hGFG, insulin, FBS and gentamicin/amphotericin-B; Lonza, USA)을 함유한 배지에서 배양 후 6 well culture plate에 3×105 cells/well로 분주하여 24시간 배양 후 시료를 1000㎍/mL 이하(100, 250, 500 및 1000㎍/mL) 농도로 처리 후 24시간 추가 배양하였으며, 양성대조물질로 TGF-β(5ng/mL)를 사용하였다. 세포를 수확 후 1ml TRIzol reagent(Invitrogen, USA)를 첨가하여 세포 용해 및 total mRNA를 추출하였다. 유전자 발현변화는 β-actin 대조군 유전자 발현량과 비교하여 측정하였다. qRT-PCR 시험에 사용된 primer 정보는 표 2에 나타난 바와 같다.
| Gene | Forward pimers | Reverse primers |
| MMP1 | 5’-TCTGACGTTGATCCCAGAGAGCAG-3’ | 5’-CAGGGTGACACCAGTGACTGCAC-3’ |
| β-actin | 5’-GGATTCCTATGTGGGCGACGA-3’ | 5’-CGCTCGGTGAGGATCTTCATG-3’ |
도 6에 나타난 바와 같이, 시료를 1000㎍/mL 이하(250, 500 및 1000㎍/mL) 농도로 처리 시 MMP1 mRNA 발현이 음성대조군과 비교하여 감소하는 것으로 나타났다. 1000㎍/mL 농도에서 음성대조군과 비교하여 26.74±0.90% 감소하였고(P<0.05), 양성대조군인 TGF-β(5ng/mL)의 경우 음성대조군 대비 31.20±0.87% 감소하였다(P<0.05). 이는 G1-5 균주에서 추출한 추출물이 1000㎍/mL 이하의 농도에서 농도의존적으로 콜라게나제 생성을 저해함을 입증한다.
[실시예 6] 엘라스타제 활성 억제에 대한 효력 시험
엘라스타제 활성 억제 정도를 평가하기 위하여, In vitro Elastase inhibition assay를 통해 확인하였다. 인간진피섬유아세포인 Nomal Human Dermal Fibroblast 세포(NHDFs; CELLnTEC, Switzer-land)를 Fibroblast Basal Medium(Lonza, USA)에 FGMTM-2 singleQuotsTM(hGFG, insulin, FBS and gentamicin/amphotericin-B; Lonza, USA)을 함유한 배지에서 배양하였다. 세포를 PBS로 세척한 후, 0.1% triton X-100·0.2M Tris-HCl(pH 8.0) 용액을 사용하여 세포를 용해하고 초음파 분쇄기(sonicator)로 세포를 균질화한 후 원심분리를 수행하였다. 상층액만 취하여 세포 내 엘라스타제를 포함하는 효소액으로 사용하였다. 1000㎍/mL 이하(250, 500 및 1000㎍/mL) 농도의 시료와 엘라스타제 효소액을 96 well plate에 분주 후, 기질로 0.2M Tris-HCl buffer(pH 8.0)에 녹인 50mM STANA(N-succinyl-tri-alanyl-p-nitroanillide)를 추가로 첨가하여 37℃에서 90분간 반응시켰다. 양성대조군으로 phosphoramidon disodium salt(10μM)을 사용하였다. 90분간 반응 후 Microplate reader system(SpectraMax® i3X Multi-Mode Detection platform; Molecular Devices, USA)를 이용하여 410nm에서 흡광도를 측정하였으며, 엘라스타제 저해 활성(Elastase inhibition activity)은 하기 식에 따라 계산하였다.
[수학식 1]
도 7에 나타난 바와 같이, 시료를 1000㎍/mL 이하(250, 500 및 1000㎍/mL) 농도로 처리 시 HAS2 mRNA 발현이 음성대조군과 비교하여 증가하는 것으로 나타났다. 1000㎍/mL 농도에서 음성대조군과 비교하여 24.60±0.66% 증가하였고(P<0.05), 양성대조군인 phosphoramidon disodium salt(10μM)의 경우 음성대조군 대비 41.81±1.15% 증가하였다(P<0.05). 이는 G1-5 균주에서 추출한 추출물이 1000㎍/mL 이하의 농도에서 농도 의존적으로 인간진피섬유아세포 내 엘라스타제 활성을 억제함을 입증한다.
[실시예 7] 히알루론산 합성효소 생성 증가에 대한 효력 시험
히알루론산 합성을 촉진하는 대표 효소인 HAS2(Hyaluronan synthase 2) 유전자의 발현 수준을 quantitative real-time PCR(qRT-PCR) 분석법을 통해 확인하였다(Keller KE et al, 2012). 인간진피섬유아세포인 Nomal Human Dermal Fibroblast 세포(NHDFs; CELLnTEC, Switzer-land)를 Fibroblast Basal Medium(Lonza, USA)에 FGMTM-2 singleQuotsTM(hGFG, insulin, FBS and gentamicin/amphotericin-B; Lonza, USA)을 함유한 배지에서 배양 후 6 well culture plate에 3×105 cells/well로 분주하여 24시간 배양 후 시료를 1000㎍/mL 이하(250, 500 및 1000㎍/mL)의 농도로 처리 후 24시간 추가 배양하였으며, 양성대조물질로 Retinoic acid(50nM)을 사용하였다. 세포를 수확 후 1ml TRIzol reagent(Invitrogen, USA)를 첨가하여 세포 용해 및 total mRNA를 추출하였다. 유전자 발현변화는 β-actin 대조군 유전자 발현량과 비교하여 측정하였다. qRT-PCR 시험에 사용된 primer 정보는 표 3에 나타난 바와 같다.
| Gene | Forward pimers | Reverse primers |
| HAS2 | 5’-GAAAGGGCCTGTCAGTCTTATTT-3’ | 5’-TTCGTGAGATGCCTGTCATCACC-3’ |
| β-actin | 5’-GGATTCCTATGTGGGCGACGA-3’ | 5’-CGCTCGGTGAGGATCTTCATG-3’ |
도 8에 나타난 바와 같이, 시료를 1000㎍/mL 이하(250, 500 및 1000㎍/mL) 농도로 처리 시 HAS2 mRNA 발현이 음성대조군과 비교하여 증가하는 것으로 나타났다. 1000㎍/mL 농도에서 음성대조군과 비교하여 174.50±1.36% 증가하였고(P<0.05), 양성대조군인 Retinoic acid(50nM)의 경우 음성대조군 대비 216.23±8.89% 증가하였다(P<0.05). 이는 G1-5 균주에서 추출한 추출물이 1000㎍/mL 이하의 농도에서 HAS2 mRNA 발현이 농도 의존적으로 증가됨에 따라 히알루론산 합성효소 생성을 증가시킴을 입증한다.
[실시예 8] 멜라닌형성세포 내 멜라닌 생성 저해 효력 시험
멜라닌 생성 저해 실험에 사용할 농도를 정하기 위해 세포생존율을 확인하였다. melanoma 세포주인 B15F10 세포(ATCC, USA)를 Dulbecco’s Modified Eagle Medium(DMEM; Biowest, USA)에 10% fetal bovine serum(FBS; Biowest; USA), 1% penicillin/streptomycin(penicillin 100IU/mL, streptomycin 100㎍/mL; Life Technologies, USA)을 함유한 배지를 사용하여 배양하였으며, 배양한 세포를 96 well plate에 1.5×10³cell/well로 분주하여 24시간 배양 후, 시료를 0~1500㎍/mL 농도로 처리하여 72시간 동안 배양하였다. 그 후 WST-1 assay solution(EZ-CYTOX; DOGEN,Korea)을 배재양의 10%씩 첨가하여 추가적으로 0.5~1시간 37℃에서 반응시킨 후, Microplate reader system(SpectraMax® i3X Multi-Mode Detection platform; Molecular Devices, USA)를 이용하여 450nm에서 흡광도를 측정하였다.
세포생존율을 확인한 결과, 도 9에 나타난 바와 같이, 1000㎍/mL 이하(100, 250, 500 및 1000㎍/mL) 농도에서 음성대조군 대비 각각 101.03%, 99,23%, 96,40% 및 96.37%로 세포생존율이 감소하지 않은 것으로 세포독성을 확인하였다.
멜라닌 생성의 증감 여부를 확인하기 위해, 멜라닌 형성세포(B16F10 melanoma cells)의 세포내 멜라닌 생성량 변화를 확인하였다. 멜라닌 생성 유도물질인 α-MSH를 처리하여 멜라닌 생성을 유도한 후, 시료를 1000㎍/mL 이하(100, 250, 500 및 1000㎍/mL) 농도로 처리하여 72시간 동안 배양하였다. 그 후 melain cotents 시험법을 통해 세포 내의 멜라닌 생성량 변화 및 멜라닌 함량(lysate) 색 변화를 측정하였으며, Arbutin을 양성대조물질로 사용하였다.
도 10에 나타난 바와 같이, 시료를 처리한 세포 내 멜라닌 생성량이 α-MSH를 단독으로 처리한 세포 대비 감소하는 것으로 나타났다. 처리농도 1000㎍/mL에서 멜라닌 생성량은 α-MSH를 단독 처리 대비 48.07±1.48%(P<0.05) 감소하였고, 양성대조군인 Arbutin(300μM)을 처리한 세포내 멜라닌 생성량은 α-MSH를 단독 처리 대비 64.36±0.61% 감소하였다(P<0.05). 이는 G1-5 균주에서 추출한 추출물이 1000㎍/mL 이하의 농도에서 멜라닌 생성을 저해함을 입증한다.
[실시예 9] 항산화 효과에 대한 in vitro 효력 시험
추출물에 대한 항산화 효과를 평가하기 위해, DPPH(1, 1-diphenyl-2-picryl hydrazyl) free radical 소거능을 측정하였다. 시료의 농도는 1000㎍/mL 이하(100, 250, 500, 750 및 1000㎍/mL) 농도로 사용하였으며 양성대조군으로 L-Ascorbic acid(BioXtra, ≥99.0%, Sigma-Aldrich, USA)를 사용하였다. 메탄올에 1mM DPPH로 ?瑛? 용액을 시료와 혼합 후, 30분간 암반응을 진행하였다. 30분 반응 후 Microplate reader system(SpectraMax® i3X Multi-Mode Detection platform; Molecular Devices, USA)를 이용하여 517nm에서 흡광도를 측정하였으며, DPPH free radical 소거능은 아래 식에 따라서 계산하였다(Kang MH et al, 2002).
[수학식 2]
도 11에 나타난 바와 같이, DPPH free radical 소거활성은 1000㎍/mL 이하(100, 250, 500, 750 및 1000㎍/mL) 농도에서 음성대조군 대비 8.71±1.38%, 20.12±1.38%, 51.65±1.88%, 54.83±1.98% 및 57.51±0.44% 증가하였고(P<0.05), 양성대조군인 L-Ascorbic acid(5㎍/mL)은 음성대조군 대비 54.86±0.31% 증가하였다(P<0.05). 특히, 1000μg/mL에서 양성대조군인 L-Ascorbic acid(5μg/mL)보다 더 높은 DPPH free radical 소거활성을 나타내는 것으로 나타났다. 이는 G1-5 균주에서 추출한 추출물이 1000㎍/mL 이하의 농도에서 DPPH free radical 소거능을 보임에 따라, 항산화 효과가 있음을 입증한다.
[실시예 10] Tyrosinase 활성 저해 효과에 대한 In vitro 효력 시험
Tyrosinase 활성 저해 효과를 확인하기 위해, 멜라닌 합성 과정에 관여하는 tyrosinase 효소의 L-tyrosine에 대한 활성 저해 정도를 In vitro tyrosinase inhibition assay를 통해 확인하였다. 1000㎍/mL 이하(100, 250, 500, 750 및 1000㎍/mL) 농도의 시료 또는 양성대조군인 Arbutin(300μM) 및 1000U/mL mushroom tyrosinase(Sigma-Ardrich)을 96 well plate에 분주 후, 50mM Potassium phosphate buffer(pH 6.8)에 녹인 2mM L-tyrosine(Sigma-Aldrich) 용액을 추가로 첨가하여 37℃에서 30분간 반응시켰다. 그 후 Microplate reader system(SpectraMax® i3X Multi-Mode Detection platform; Molecular Devices, USA)을 이용하여 490nm에서 흡광도를 측정하였으며, Tyrosinase 효소 반응에 의해 L-tyrosine에서 생성되는 DOPAchrome의 흡광도를 측정한 것으로 시료에 대한 L-tyrosine의 tyrosinase 활성 저해 효과를 평가하였다. L-tyrosine에 대한 tyrosinase 활성 저해는 하기 식에 따라 계산하였다.
[수학식 3]
도 12에 나타난 바와 같이, tyrosinase 활성 저해능은 1000㎍/mL 이하(100, 250, 500, 750 및 1000㎍/mL) 농도에서 음성대조군 대비 7.84±2.53%, 19.71±2.64%, 26.30±1.14%, 40.34±0.69% 및 59.17±0.42% 증가하였고(P<0.05), 양성대조군인 Arbutin(300μM)은 음성대조군 대비 47.61±3.13% 증가하였다(P<0.05). 특히, 1000μg/mL 농도에서 양성대조군인 Arbutin(300μM)보다 더 높은 tyrosinase 저해 활성을 나타내는 것으로 나타났다. 이는 G1-5 균주에서 추출한 추출물이 1000㎍/mL 이하의 농도에서 tyrosinase에 의해 L-tyrosine이 DOPAchrome으로 생성되는 반응이 저해됨에 따라, In vitro tyrosinase 활성 저해 효과가 있음을 입증한다.
[실시예 11] 항염 효과에 대한 효력 시험
염증반응을 유발하는 인자인 nuclear factor kappa B(NF-kB) Luciferase 유전자가 삽입된 NIH3T3 세포주(NF-kB Luciferase Reporter NIH3T3 Stable cell, Panomics, USA)을 이용하여 NF-kB 활성 저해에 효력을 확인하였다. NF-kB Luciferase Reporter NIH3T3 Stable cell을 Dulbecco’s Modified Eagle Medium(DMEM; Biowest, USA)에 10% fetal bovine serum(FBS; Biowest; USA) 및 1% penicillin/streptomycin(penicillin 100IU/mL, streptomycin 100㎍/mL; Life Technologies, USA)을 함유한 배지를 사용하여 배양하였으며, 배양한 세포를 96 well plate에 3×10³ cell/well로 분주하여 24시간 배양 후, 시료를 0~1500㎍/mL 농도로 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 그 후 WST-1 assay solution(EZ-CYTOX; DOGEN,Korea)을 배재양의 10%씩 첨가하여 추가적으로 0.5~1시간 37℃에서 반응시킨 후, Microplate reader system(SpectraMax® i3X Multi-Mode Detection platform; Molecular Devices, USA)을 이용하여 450nm에서 흡광도를 측정하였다.
도 13에 나타난 바와 같이, 1000㎍/mL 이하(100, 250, 500 및 1000㎍/mL) 농도에서 음성대조군 대비 각각 99.77%, 96.77%, 95.54% 및 94.33%로 세포생존율이 감소하지 않은 것을 통해 세포독성을 확인하였다.
세포 내 NF-kB 활성 저해능 측정은 NF-kB promoter luciferase assay를 통해 확인하였다. NF-kB Luciferase Reporter NIH3T3 Stable cell을 6 well plate에 2×105 cell/well로 분주하여 24시간 배양 후, 시료를 1000㎍/mL 이하(250, 500 및 1000㎍/mL) 농도 처리한 후, 염증 유도물질인 TNF-α(50ng/mL)를 처리하여 8시간 추가 배양하였다. 대조군으로 TNF-α(50ng/mL)만을 처리한 세포를 이용하였다. 배양된 세포를 회수 후 passive lysis buffer(Promega, USA)를 첨가하여 세포 용해 및 원심분리를 수행함으로써 세포 내의 luciferase를 추출하였다. 상층액만 취하여 black 96 well plate에 분주하고 luciferin(Promega, USA)을 첨가한 후 Microplate reader system(SpectraMax® i3X Multi-Mode Detection platform; Molecular Devices, USA)을 이용하여 luciferin의 발광정도를 측정하였으며, BCA Protein assay Kit(Thermo Fisher Scientific,USA)를 이용하여 총 단백질양을 산출하였다(Lin et al., 2011).
도 14에 나타난 바와 같이, 시료 처리 시 TNF-α(50ng/mL)에 의해 유도된 NF-kB Luciferase Reporter NIH3T3 Stable cell의 NF-kB 활성이 감소하였고, 1000㎍/mL 농도에서의 활성은 TNF-α(50ng/mL) 단독 처리군 대비 15.40±0.38% 감소하였다(P<0.05). 이는 G1-5 균주에서 추출한 추출물이 1000㎍/mL 이하의 농도에서 NF-kB Luciferase 유전자가 삽입된 NIH3T3 세포주(NF-kB Luciferase Reporter NIH3T3 Stable cell) 내 NF-kB 활성이 감소함에 따라, 항염 효과(NF-kB 활성 저해)가 있음을 입증한다.
[실시예 12] 자외선 조사에 따른 세포 보호 효력 시험
인간피부섬유아세포(CCD986sk, 한국세포주은행)를 Dulbecco’s Modified Eagle Medium(DMEM; Biowest, USA)에 10% fetal bovine serum(FBS; Biowest; USA) 및 1% penicillin/streptomycin(penicillin 100IU/mL, streptomycin 100㎍/mL; Life Technologies, USA)을 함유한 배지를 사용하여 배양하였으며, 배양한 세포를 96 well plate에 2×10³cell/well로 분주하여 24시간 배양 후, 시료를 0~1000㎍/mL 농도로 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 시료가 첨가된 배지를 제거 후 새로운 배지 100㎕에 PBS로 5mg/ml이 되도록 녹인 MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)- 2,5-diphenyltetrazoliumbromide)를 10㎕ 첨가하여 37℃에서 4시간 반응시켰다. 그 후 0.01M HCl에 녹인 SDS(sodium dodecyl sulfate)를 100㎕ 첨가하여 4시간 추가 반응 후 570nm에서 흡광도를 측정하였다.
도 15에 나타난 바와 같이, 1000㎍/mL 이하 농도에서 대조군 대비 각각 102.39%, 99.44%, 109.47%, 111.78% 및 112.16%로 세포 생장율이 감소하지 않은 것을 통해 세포독성을 확인하였다.
자외선 조사에 따른 세포 보호 효력 측정은 자외선을 조사한 후, MTT assay를 통해 세포생존율로 확인하였다. 인간피부섬유아세포(CCD986sk)를 96 well plate에 2×10³cell/well로 분주하여 24시간 배양 후 배양 배지를 제거하고 PBS로 2회 세척하여 잔존하는 배지를 제거하였다. 그 후 PBS로 1000㎍/mL 이하 농도로 조절한 시료를 첨가 후 UVB(30mJ/cm2)로 조사하였다. 시료를 제거 후 배지를 첨가하여 24시간 추가 배양하였다. 배양 배지를 제거 후 새로운 배지 100㎕에 PBS로 5mg/ml이 되도록 녹인 MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5 -diphenyltetrazoliumbromide)를 10㎕ 첨가하여 37℃에서 4시간 반응시켰다. 그 후 0.01M HCl에 녹인 SDS(sodium dodecyl sulfate)를 100㎕ 첨가하여 4시간 추가 반응 후 570nm에서 흡광도를 측정하였다.
도 16에 나타난 바와 같이, 자외선을 조사하지 않은 대조군 대비 1000㎍/mL 이하 농도에서 각각 87.49%, 89.00%, 97.17%, 100.45% 및 109.48%로 세포생존율을 확인하였다. 이는 G1-5 균주에서 추출한 추출물이 자외선 노출에 대한 세포보호 효과가 있음을 입증한다.
[
실시예
13] G1-5 균주 추출물의 카로티노이드, 지방산, 총 플라보노이드 및 총 페놀류 함량 분석
상기 추출물의 카로티노이드 성분은 HPLC(high performance liquid chromatography)를 이용하여 분석하였다. 분석컬럼은 Horizon C18/PFP column, 150mm X 4.6mm, 3μm를 사용하였고 컬럼 온도는 33℃이며 이동상은 A(메탄올 225mM: 암모늄아세테이트 (82:18, v:v)) 및 B(에탄올)을 사용하여 하기 표 4와 같은 gradient 조건에서 분석하였다. 추출물의 카로티노이드 성분은 표준물질의 Retention time과 UV spectra를 통해 분석하였다. 성분별 정량은 표준물질(Violaxanthin, Astaxanthin, Zeaxanthin, Canthaxanthin, beta-carotene, Chlorophyll a)의 peak area의 표준곡선을 이용하거나 흡광계수를 이용하여 계산하였다. 함량은 추출물 중량을 기준으로 계산하였다(표 5).
| 시간 (분) | 이동상A | 이동상 B |
| 0 | 100 | 0 |
| 20 | 61.8 | 38.2 |
| 22 | 25 | 75 |
| 33 | 20 | 80 |
| 36 | 10 | 90 |
| 37 | 0 | 100 |
| 40 | 0 | 100 |
| 42 | 100 | 0 |
| Carotenoid component | content (mg/g 추출물) |
| Vaucheriaxanthin | 0.82 ± 0.02 |
| Violaxanthin | 1.81 ± 0.04 |
| Astaxanthin | 0.78 ± 0.02 |
| Zeaxanthin | 0.13 ± 0.00 |
| Canthaxanthin | 1.93 ± 0.04 |
| Chlorophyll a | 5.39 ± 0.11 |
| beta-Carotene | 5.28 ± 0.21 |
| Sum | 16.13 ± 0.44 |
상기 추출물을 헥산 1ml에 재현탁하고 3%의 메탄올-황산 용액(methanolic sulfuric acid) 2ml을 넣어 95℃에서 90분 동안 반응한 후 생성된 지방산메틸에스테르(FAME)를 헥산 2ml를 넣고 추출하여 GC(Gas chromatography)로 분석하였다. 지방산 성분은 Supelco 37 Component FAME Mix와의 비교를 통해 분석하였다. 분석결과 상기추출물 내 주요 지방산 함량은 표 6에 나타난 바와 같고, 함량은 추출물 중량을 기준으로 계산하였다.
| FAME component | content (mg/g 추출물) |
| Myristic acid(C14:0) | 22.93 ± 0.21 |
| Palmitic acid(C16:0) | 215.85 ± 2.80 |
| Palmitoleic acid(C16:1 ω7) | 188.95 ± 2.56 |
| Stearic acid(C18:0) | 7.56 ± 0.02 |
| Oleic acid(C18:1 ω9) | 91.40 ± 1.22 |
| Linoleic acid(C18:2 ω6) | 4.63 ± 0.06 |
| γ-Linolenic acid(C18:3 ω6) | 2.21 ± 0.03 |
| Eicosatrienoic acid(C20:3 ω6) | 1.10 ± 0.02 |
| Arachidonic acid(C20:4 ω6) | 16.02 ± 0.25 |
| Eicosapentaenoic acid(C20:5 ω3) | 31.53 ± 0.58 |
| Sum | 582.19 ± 7.70 |
상기 추출물의 총 페놀류 함량은 Folin-Ciocalteu method에 따라 측정하였다. 100μl의 갈릭산 혹은 추출물희석액을 메탄올에 녹인 후 200μl 10% Folin-Ciocalteu reagent, 800μl Na2CO3(700mM)와 혼합한 후 상온에서 2시간 반응시켰다. 765nm에서 흡광도를 측정하고 갈릭산을 이용하여 표준곡선을 얻은 후 결과는 mg Gallic acid equivalents(GAE)/g dry weight로 표현하였다(표 7).
상기 추출물의 총 플라보노이드 함량은 aluminium chloride colometric assay를 통해 측정하였다. 100μl of 2% aluminium trichloride(AlCl3) 메탄올 용액을 같은 부피의 시료액과 혼합 후 10분 후에 415nm에서 흡광도를 측정하였다. 공시험는 100μl 메탄올과 같은 부피의 시료액을 혼합 후 측정하였다. 0~250μg/ml 농도의 quercetin 메탄올 용액을 이용하여 표준곡선을 구하였다. 총 플라보노이드 함량은 mg quercetin equivalent(QE)/g dry weight로 표현하였다(표 7).
| 총 폐놀류 함량(mg GAE/g 추출물) | 총 플라보노이드 함량(mg QE/g 추출물) |
| 77.29 ± 1.25 | 20.15 ± 0.28 |
이상으로, 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그것들의 등가물에 의해서 정의된다고 할 것이다.
Claims (8)
- 미세조류 나노클로롭시스 속 G1-5(Nannochloropsis sp G1-5) 균주 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부개선용 화장료 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 상기 추출물은 미리스트산, 팔미트산, 팔미톨레산, 스테아르산, 리놀레산, 감마리놀렌산, 아라키돈산, 에이코사트리에논산(cis-8,11,14-Eicosatrienoic acid) 및 에이코사펜타엔산(EPA)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 지방산; 바우케리아잔틴, 비올라잔틴, 아스트잔틴, 지아잔틴, 칸타잔틴, 클로로필a 및 베타카로틴으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 카로티노이드, 페놀류화합물 및 플라보노이드를 포함하는 화장료 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 상기 추출물은 물, 탄소수 1 내지 4의 저급 알콜, 메틸렌클로라이드, 에틸렌, 아세톤, 헥산, 에테르, 클로로포름, 디클로로메탄, 트리클로로메탄, 에틸아세테이트, 부틸아세테이트, N,N-디메틸포름아미드(DMF), 디메틸설폭사이드(DMSO), 1,3-부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 또는 이들의 혼합 용매로 이루어진 군에서 선택된 용매로 추출된 화장료 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 상기 추출물은 항산화, 항염, 피부 미백, 피부주름개선, 피부보습, 자외선에 의한 세포 손상 보호, 피부트러블 개선, 피부노화방지, 피부재생 및 피부탄력 증진 효과 중 하나 이상을 가지는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 상기 조성물은 유연화장수, 영양화장수, 수분크림, 영양크림, 마사지크림, 에센스, 앰플, 젤, 아이크림, 클렌징크림, 클렌징폼, 클렌징워터, 팩, 스프레이 및 파우더로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상으로 제형화된 화장료 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 상기 추출물은 내염성이 강한 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
- 미세조류 나노클로롭시스 속 G1-5(Nannochloropsis sp G1-5) 균주 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부개선용 건강기능식품 조성물.
- 미세조류 나노클로롭시스 속 G1-5(Nannochloropsis sp G1-5) 균주 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부개선용 의약외품 조성물.
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