KR20230088002A - 바실루스 엔도피티쿠스 s2-11 균주 배양물의 에틸아세테이트 분획물을 유효성분으로 함유하는 항염증용 조성물 - Google Patents
바실루스 엔도피티쿠스 s2-11 균주 배양물의 에틸아세테이트 분획물을 유효성분으로 함유하는 항염증용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명의 항염증용 조성물은 수탁번호 KACC 92371P로 기탁된 바실루스 엔도피티쿠스(Bacillus endophyticus) S2-11 균주 배양물의 에틸아세테이트 분획물을 유효성분으로 함유한다. 또한 본 발명의 항염증성 물질의 생산 방법은 상기 균주를 배양하는 단계; 및 균주 배양액을 에틸아세테이트로 분획하여 에틸아세테이트 분획물을 수득하는 단계;를 포함한다.
Description
본 발명은 바실루스 엔도피티쿠스 S2-11 균주 배양물의 에틸아세테이트 분획물을 유효성분으로 함유하는 항염증용 조성물에 관한 것으로, 구체적으로 세포독성이 낮으면서, 대식세포의 일산화질소 생성 저해 활성, 프로스타글란딘 E2 생성 저해 활성, 유도형 산화질소 합성효소(iNOS) 및 사이클로옥시게나제-2(COX-2)의 발현 억제 활성, 종양괴사인자-알파(TNF-α), 인터루킨 6(IL-6) 및 인터루킨 1 베타(IL-1β)의 생성 억제 활성과 같은 우수한 항염증 활성을 나타낼 수 있는 항염증용 조성물 및 상기와 같은 우수한 항염증 활성을 갖는 물질을 쉽게 생산할 수 있는 방법에 관한 것이다.
염증은 물리적 화학적 자극에 의한 외상이나 조직 손상으로부터 신체를 방어하기 위한 생체 조직의 면역 반응으로, 다양한 면역세포에 의해 진행되는 일련의 생물학적 과정이다. 일반적으로 염증 반응은 손상된 조직에서 여러 면역 관련 세포들이 분비하는 일산화질소(NO), 프로스타글란딘(prostaglandin, PG) 및 TNF-α(tumor necrosis factor-α), IL-6(interleukin-6), IL-1β(interleukin-1β)와 같은 전염증성 사이토카인(Pro-inflammatory cytokines)을 포함한 다양한 염증 촉진성 매개 물질에 의해 유도되는데, 이들은 통증, 부종, 열 등의 염증성 증상을 발현하여 다양한 질병의 매개체 역할을 한다.
체내의 주요 염증 세포로 알려진 대식세포(macrophage)는 세포 표면에 발현하는 TLR(toll-like receptor)을 통해 그람 음성 세균의 외부 세포막 독소 물질인 LPS(lipopoly-saccharide)를 인식하여 세포 내 전사 인자 NF-κB(nuclear factor-κB)의 신호 전달 경로를 활성화하는데, 대식세포의 핵 안으로 이동한 NF-κB는 염증 관련 유전자 iNOS(inducible nitric oxide synthase) 및 COX-2(cyclooxygenase-2)의 발현을 유도함으로써 NO 및 PGE2와 같은 염증 매개 물질의 생성을 증가시킨다. 그 중 NO는 고 반응성 라디칼(radical)의 일종으로, 낮은 농도에서는 신호 전달 및 박테리아의 사멸을 통한 면역 작용 등의 인체의 중요한 생리적역할을 수행하지만, 과 발현될 경우 체내에 적절하지 않은 염증을 유발하여 유전자의 변이, 조직과 신경의 손상을 야기하는 것으로 알려져 있다. 또한 COX-2의 촉매적 활성을 증가시키고, 신호전달 캐스케이드를 촉발하는 등 COX-2의 급성적인 발현을 유도하여 PGE2의 생성을 증가시킴으로써 여러 난치성 질환을 유발하는 것으로도 보고되었다. 이러한 염증성 질환의 원인이 되는 과도한 NO 및 PGE2의 생성이 유도형 iNOS 및 COX-2에 의한 것임을 고려할 때, iNOS와 COX-2 유전자 발현을 억제하는 물질이 염증반응조절 소재로서의 활용 가능성이 높다고 볼 수 있다.
본 발명자들은 다양한 자연계 시료로부터 발굴된 미생물을 활용하여 상기와 같은 염증과 관련된 활성을 효과적으로 조절함으로써 우수한 항염증 활성을 나타낼 수 있는 물질의 생산에 관해 연구하였다.
따라서 본 발명의 주된 목적은 미생물을 활용한 조성물로서 우수한 항염증 활성을 나타낼 수 있는 항염증용 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 미생물을 활용하여 우수한 항염증 활성을 갖는 물질을 생산하는 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 수탁번호 KACC 92371P로 기탁된 바실루스 엔도피티쿠스(Bacillus endophyticus) S2-11 균주 배양물의 에틸아세테이트 분획물을 유효성분으로 함유하는 항염증용 조성물을 제공한다.
본 발명의 항염증용 조성물에 있어서, 상기 균주 배양물은 상기 S2-11 균주를 마린(marine) 배지에서 배양하여 수득한 것이 바람직하다.
본 발명의 항염증용 조성물에 있어서, 상기 균주 배양물은 상기 S2-11 균주를 25 내지 35℃에서 1 내지 5일 동안 배양하여 수득한 것이 바람직하다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 수탁번호 KACC 92371P로 기탁된 바실루스 엔도피티쿠스(Bacillus endophyticus) S2-11 균주를 배양하는 단계; 및 균주 배양액을 에틸아세테이트로 분획하여 에틸아세테이트 분획물을 수득하는 단계;를 포함하는 항염증성 물질의 생산 방법을 제공한다.
본 발명의 항염증성 물질의 생산 방법에 있어서, 상기 배양하는 단계는 상기 S2-11 균주를 마린(marine) 배지에서 배양하는 단계인 것이 바람직하다.
본 발명의 항염증성 물질의 생산 방법에 있어서, 상기 배양하는 단계는 상기 S2-11 균주를 25 내지 35℃에서 1 내지 5일 동안 배양하는 단계인 것이 바람직하다.
본 발명의 항염증용 조성물은 세포독성이 낮으면서, 대식세포의 일산화질소 생성 저해 활성, 프로스타글란딘 E2 생성 저해 활성, 유도형 산화질소 합성효소(iNOS) 및 사이클로옥시게나제-2(COX-2)의 발현 억제 활성, 종양괴사인자-알파(TNF-α), 인터루킨 6(IL-6) 및 인터루킨 1 베타(IL-1β)의 생성 억제 활성과 같은 우수한 항염증 활성을 나타낼 수 있다. 또한 본 발명의 방법을 사용하면 상기와 같은 우수한 항염증 활성을 갖는 물질을 쉽게 생산할 수 있다.
도 1은 본 발명에서 사용되는 바실루스 엔도피티쿠스(Bacillus endophyticus) S2-11 균주의 미생물 수탁증을 나타낸다.
도 2는 S2-11 균주의 16S rRNA 유전자 서열을 나타낸다.
도 3은 S2-11 균주의 16S rRNA 유전자 염기서열을 토대로 제작된 최대 가능성 계통수(maximum-likelihood phylogenetic tree)를 나타낸다.
도 4는 S2-11 균주의 균체를 투과 전자 현미경으로 촬영한 사진이다.
도 5는 S2-11 균주를 고체 배양한 사진이다.
도 6은 RAW 264.7 세포를 대상으로 S2-11 균주 배양액의 에틸아세테이트 분획물(S2-11)의 세포 독성을 실험한 결과이다. 결과를 대조군에서 얻은 값에 비교한 백분율로 나타냄.
도 7은 RAW 264.7 세포를 대상으로 S2-11 균주 배양액의 에틸아세테이트 분획물(S2-11)의 일산화질소(NO) 생성 저해 활성을 실험한 결과이다. 결과를 대조군에서 얻은 값에 비교한 백분율로 나타냄(*p<0.05, **p<0.01).
도 8은 RAW 264.7 세포를 대상으로 S2-11 균주 배양액의 에틸아세테이트 분획물(S2-11)의 프로스타글란딘 E2(PGE2) 생성 저해 활성을 실험한 결과이다. 결과를 대조군에서 얻은 값에 비교한 백분율로 나타냄. 결과값을 3회 반복 실험의 평균±표준편차로 나타냄(*p<0.05, **p<0.01).
도 9는 RAW 264.7 세포를 대상으로 S2-11 균주 배양액의 에틸아세테이트 분획물(S2-11)의 유도형 산화질소 합성효소(iNOS) 발현 저해 활성을 실험한 결과이다. β-엑틴을 대조군으로 사용함(*p<0.05, **p<0.01).
도 10은 RAW 264.7 세포를 대상으로 S2-11 균주 배양액의 에틸아세테이트 분획물(S2-11)의 사이클로옥시게나제-2(COX-2) 발현 저해 활성을 실험한 결과이다. β-엑틴을 대조군으로 사용함(*p<0.05, **p<0.01).
도 11은 RAW 264.7 세포를 대상으로 S2-11 균주 배양액의 에틸아세테이트 분획물(S2-11)의 종양괴사인자-알파(TNF-α) 생성 저해 활성을 실험한 결과이다. 결과를 대조군에서 얻은 값에 비교한 백분율로 나타냄(*p<0.05).
도 12는 RAW 264.7 세포를 대상으로 S2-11 균주 배양액의 에틸아세테이트 분획물(S2-11)의 인터루킨 6(IL-6) 생성 저해 활성을 실험한 결과이다. 결과를 대조군에서 얻은 값에 비교한 백분율로 나타냄(*p<0.05, **p<0.01).
도 13은 RAW 264.7 세포를 대상으로 S2-11 균주 배양액의 에틸아세테이트 분획물(S2-11)의 인터루킨 1 베타(IL-1β) 생성 저해 활성을 실험한 결과이다. 결과를 대조군에서 얻은 값에 비교한 백분율로 나타냄(*p<0.05, **p<0.01).
도 2는 S2-11 균주의 16S rRNA 유전자 서열을 나타낸다.
도 3은 S2-11 균주의 16S rRNA 유전자 염기서열을 토대로 제작된 최대 가능성 계통수(maximum-likelihood phylogenetic tree)를 나타낸다.
도 4는 S2-11 균주의 균체를 투과 전자 현미경으로 촬영한 사진이다.
도 5는 S2-11 균주를 고체 배양한 사진이다.
도 6은 RAW 264.7 세포를 대상으로 S2-11 균주 배양액의 에틸아세테이트 분획물(S2-11)의 세포 독성을 실험한 결과이다. 결과를 대조군에서 얻은 값에 비교한 백분율로 나타냄.
도 7은 RAW 264.7 세포를 대상으로 S2-11 균주 배양액의 에틸아세테이트 분획물(S2-11)의 일산화질소(NO) 생성 저해 활성을 실험한 결과이다. 결과를 대조군에서 얻은 값에 비교한 백분율로 나타냄(*p<0.05, **p<0.01).
도 8은 RAW 264.7 세포를 대상으로 S2-11 균주 배양액의 에틸아세테이트 분획물(S2-11)의 프로스타글란딘 E2(PGE2) 생성 저해 활성을 실험한 결과이다. 결과를 대조군에서 얻은 값에 비교한 백분율로 나타냄. 결과값을 3회 반복 실험의 평균±표준편차로 나타냄(*p<0.05, **p<0.01).
도 9는 RAW 264.7 세포를 대상으로 S2-11 균주 배양액의 에틸아세테이트 분획물(S2-11)의 유도형 산화질소 합성효소(iNOS) 발현 저해 활성을 실험한 결과이다. β-엑틴을 대조군으로 사용함(*p<0.05, **p<0.01).
도 10은 RAW 264.7 세포를 대상으로 S2-11 균주 배양액의 에틸아세테이트 분획물(S2-11)의 사이클로옥시게나제-2(COX-2) 발현 저해 활성을 실험한 결과이다. β-엑틴을 대조군으로 사용함(*p<0.05, **p<0.01).
도 11은 RAW 264.7 세포를 대상으로 S2-11 균주 배양액의 에틸아세테이트 분획물(S2-11)의 종양괴사인자-알파(TNF-α) 생성 저해 활성을 실험한 결과이다. 결과를 대조군에서 얻은 값에 비교한 백분율로 나타냄(*p<0.05).
도 12는 RAW 264.7 세포를 대상으로 S2-11 균주 배양액의 에틸아세테이트 분획물(S2-11)의 인터루킨 6(IL-6) 생성 저해 활성을 실험한 결과이다. 결과를 대조군에서 얻은 값에 비교한 백분율로 나타냄(*p<0.05, **p<0.01).
도 13은 RAW 264.7 세포를 대상으로 S2-11 균주 배양액의 에틸아세테이트 분획물(S2-11)의 인터루킨 1 베타(IL-1β) 생성 저해 활성을 실험한 결과이다. 결과를 대조군에서 얻은 값에 비교한 백분율로 나타냄(*p<0.05, **p<0.01).
본 발명의 항염증용 조성물은 수탁번호 KACC 92371P로 기탁된 바실루스 엔도피티쿠스(Bacillus endophyticus) S2-11 균주 배양물의 에틸아세테이트 분획물을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에서 사용하는 S2-11 균주는 2021년 10월 29일자로 출원된 한국특허출원 제10-2021-0146682호에 개시된 균주로, 상기 특허출원의 내용 전체는 참조에 의해 본 명세서에 원용된다. 상기 S2-11 균주는 제주도 하도리(철새도래지) 내 퇴적물 시료에서 분리되어 국립농업과학원 미생물은행(Korean Agricultural Culture Collection, KACC)에 수탁번호 KACC 92371P로 기탁되어 있으며(도 1), 서열번호 1의 16S rRNA 유전자 서열을 가진다(도 2). 유사한 균주로 분류되는 바실루스 엔도피티쿠스 2DT(표준 균주, type stain)와 비교하여 시트르산염(citrate)과 D-솔비톨(D-sorbitol)의 이용가능여부에서 차이가 있다. 구체적으로, S2-11 균주는 시트르산염을 기질로 이용할 수 없지만 2DT 균주는 시트르산염을 기질로 이용할 수 있으며, S2-11 균주는 D-솔비톨을 기질로 이용할 수 있지만 2DT 균주는 D-솔비톨을 기질로 이용할 수 없다.
본 발명의 균주 배양물은 S2-11 균주를 통상적인 바실루스 속 미생물 배양 배지에서 배양하여 수득할 수 있다. 바람직하게는 마린(marine) 배지에서 배양하여 수득한 것으로, 이에 따르면 에틸아세테이트 분획물에서 보다 우수한 항염증 활성을 나타낼 수 있다.
본 발명의 균주 배양물은 S2-11 균주를 통상적인 바실루스 속 미생물 배양 조건으로 배양하여 수득할 수 있다. 바람직하게는 25 내지 35℃의 온도 조건에서 1 내지 5일의 배양 기간 동안 배양하여 수득한 것이다. 상기 온도 조건은 보다 바람직하게는 26 내지 34℃이고, 보다 바람직하게는 27 내지 33℃이고, 보다 바람직하게는 28 내지 32℃이고, 보다 바람직하게는 29 내지 31℃이다. 상기 배양 기간은 보다 바람직하게는 2 내지 4일이다. 상기와 같은 배양 조건에 따르면 에틸아세테이트 분획물에서 보다 우수한 항염증 활성을 나타낼 수 있다. 본 발명의 균주 배양물을 얻기 위한 S2-11 균주의 배양은 정치 배양 및 진탕 배양 모두 가능하지만, 바람직하게는 정치 배양하여 배양액을 수득한다.
본 발명의 에틸아세테이트 분획물, 즉 본 발명 균주 배양물의 에틸아세테이트 분획물은 S2-11 균주 배양물을 에틸아세테이트로 분획하는 통상의 용매 분획 방법, 예를 들어 S2-11 균주 배양액에 1 내지 3배 부피의 에틸아세테이트를 첨가한 다음 정치시켜 분획이 이루어지도록 하고 이후 에틸아세테이트층을 수득하는 방법을 통해 수득할 수 있다. 바람직하게는 본 발명의 에틸아세테이트 분획물은 용매, 즉 에틸아세테이트가 제거된 상태이다. 용매의 제거는 통상의 용매 제거 방법, 예를 들어 감압 농축 방법을 사용하여 이루어질 수 있다.
에틸아세테이트 분획은 비교적, 예를 들어 일반적인 화합물 정제 방법과 비교하여, 매우 간단하고 적용하기 쉬운 처리 방법이다. 따라서 이러한 에틸아세테이트 분획만으로 우수한 생리 활성을 나타낼 수 있다는 것은, 예를 들어 적용의 용이성, 관련 제품 생산의 용이성, 제품 생산 비용 절감 등의 측면에서 매우 큰 장점이 될 수 있다.
연구 결과에 따르면, S2-11 균주 배양물의 에틸아세테이트 분획물은 높은 농도에서도 대식세포에 대해 세포 독성을 거의 나타내지 않을 수 있다. 예를 들어, 대식세포인 RAW 264.7 세포에 200㎍/㎖의 농도로 처리한 경우에도 대조군 RAW 264.7 세포와 비교하여 80% 이상의 세포 생존율을 나타낼 수 있다.
연구 결과에 따르면, S2-11 균주 배양물의 에틸아세테이트 분획물은 대식세포에서 농도 의존적으로 일산화질소(NO)의 생성을 저해할 수 있다.
연구 결과에 따르면, S2-11 균주 배양물의 에틸아세테이트 분획물은 대식세포에서 프로스타글란딘 E2(PGE2)의 생성을 저해할 수 있다.
연구 결과에 따르면, S2-11 균주 배양물의 에틸아세테이트 분획물은 대식세포에서 농도 의존적으로 유도형 산화질소 합성효소(iNOS)의 발현을 저해할 수 있다.
연구 결과에 따르면, S2-11 균주 배양물의 에틸아세테이트 분획물은 대식세포에서 농도 의존적으로 사이클로옥시게나제-2(COX-2)의 발현을 저해할 수 있다.
연구 결과에 따르면, S2-11 균주 배양물의 에틸아세테이트 분획물은 대식세포에서 농도 의존적으로 종양괴사인자-알파(TNF-α)의 생성을 저해할 수 있다.
연구 결과에 따르면, S2-11 균주 배양물의 에틸아세테이트 분획물은 대식세포에서 농도 의존적으로 인터루킨 6(IL-6)의 생성을 저해할 수 있다.
연구 결과에 따르면, S2-11 균주 배양물의 에틸아세테이트 분획물은 대식세포에서 농도 의존적으로 인터루킨 1 베타(IL-1β)의 생성을 저해할 수 있다.
상기와 같은 인자들, 즉 일산화질소, 프로스타글란딘 E2, 유도형 산화질소 합성효소, 사이클로옥시게나제-2, 종양괴사인자-알파, 인터루킨 6 및 인터루킨 1 베타는 염증 반응에 중요한 역할을 하는 인자들로, S2-11 균주 배양물의 에틸아세테이트 분획물은 이러한 인자들을 효과적으로 조절함으로써 우수한 항염증 활성을 나타낼 수 있다.
본 발명의 항염증용 조성물은 조성물의 형태, 용도 등의 다양한 목적에 따라 상기 분획물을 다양한 정도로 포함할 수 있다. 예를 들어, 조성물 중 상기 분획물을 0.01 내지 100중량%로 함유할 수 있으나, 이로 제한되지 않는다.
본 발명의 항염증용 조성물은 S2-11 균주 배양물의 에틸아세테이트 분획물 만을 유효성분으로 함유할 수 있으며, 또한 다른 항염증성 물질을 함께 함유할 수도 있다.
일 실시형태에서, 본 발명의 항염증용 조성물은 S2-11 균주 배양물의 에틸아세테이트 분획물 만을 유효성분으로 함유하며, 다른 항염증 활성 물질, 예를 들어 기존에 항염증 활성이 알려진 화합물 또는 S2-11 균주가 아닌 다른 미생물, 상기 다른 미생물의 배양물 또는 상기 다른 미생물의 배양물의 추출물을 함유하지 않는다.
다른 실시형태에서, 본 발명의 항염증용 조성물은 S2-11 균주 배양물의 에틸아세테이트 분획물과 함께 다른 항염증 활성 물질, 예를 들어 기존에 항염증 활성이 알려진 화합물 또는 S2-11 균주가 아닌 다른 미생물, 상기 다른 미생물의 배양물 또는 상기 다른 미생물의 배양물의 추출물을 더 함유한다.
본 발명의 항염증용 조성물은 항염증용 약학 조성물, 항염증용 식품 조성물 또는 항염증용 화장료 조성물일 수 있다.
또한, 상기와 같은 항염증 효과를 바탕으로, 본 발명의 조성물은 염증성 질환의 예방, 치료 또는 개선용 조성물(예를 들어, 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 염증성 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물 또는 염증성 질환(염증성 피부 질환)의 예방 또는 개선용 화장료 조성물)일 수 있다.
이때 염증성 질환은 염증을 주병변으로 하는 질환을 의미하는 것으로, 예를 들어 위염, 장염, 간염, 폐렴, 신장염, 방광염, 관절염, 피부염, 알레르기, 아토피, 결막염, 치주염, 비염, 중이염 및 인후염으로 이루어진 군으로부터 선택된 질환일 수 있으나, 이로 제한되지 않는다.
본 발명의 항염증용 조성물은 본 발명의 에틸아세테이트 분획물 그 자체, 또는 약학적, 식품학적 또는 화장품학적으로 허용된 담체와 혼합한 조성물일 수 있다.
본 발명의 항염증용 조성물은 임상 투여 시에 경구 또는 비경구로 투여가 가능하며, 비경구 투여시 복강내주사, 직장내주사, 피하주사, 정맥주사, 근육내주사, 자궁내 경막주사, 뇌혈관내 주사 또는 흉부내 주사에 의해 투여될 수 있고, 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있을 것이다.
본 발명의 항염증용 조성물은 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있을 것이다.
본 발명 항염증용 조성물의 일일 투여량은 예를 들어 조성물에 함유된 S2-11 균주 배양물의 에틸아세테이트 분획물을 기준으로 체중 1㎏ 당 약 0.0001 내지 200㎎일 수 있으며, 하루 1회 내지 수회 나누어 투여될 수 있으나 투여대상의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양할 것이다.
본 발명의 항염증성 물질의 생산 방법은 수탁번호 KACC 92371P로 기탁된 바실루스 엔도피티쿠스(Bacillus endophyticus) S2-11 균주를 배양하는 단계; 및 균주 배양액을 에틸아세테이트로 분획하여 에틸아세테이트 분획물을 수득하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 한다.
상기 배양하는 단계는 S2-11 균주를 배양 배지에 접종하고 S2-11 균주가 생장할 수 있는 조건 하에서 배양하는 단계일 수 있다. 바람직하게는 S2-11 균주를 마린(marine) 배지에서 배양하는 단계로, 이에 따르면 항염증성 물질을 보다 효율적으로 생산할 수 있다. 또한 바람직하게는 25 내지 35℃의 온도 조건에서 1 내지 5일의 배양 기간 동안 배양하는 단계이다. 상기 온도 조건은 보다 바람직하게는 26 내지 34℃이고, 보다 바람직하게는 27 내지 33℃이고, 보다 바람직하게는 28 내지 32℃이고, 보다 바람직하게는 29 내지 31℃이다. 상기 배양 기간은 보다 바람직하게는 2 내지 4일이다. 상기와 같은 조건에 따르면 항염증성 물질을 보다 효율적으로 생산할 수 있다. 상기 배양은 정치 배양 및 진탕 배양 모두 가능하지만, 바람직하게는 정치 배양이다.
상기 에틸아세테이트 분획물을 수득하는 단계는 바람직하게는 S2-11 균주 배양물에 1 내지 3배 부피의 에틸아세테이트를 첨가한 다음 정치시켜 분획이 이루어지도록 하고 이후 에틸아세테이트층을 수득하는 단계이다.
본 발명의 항염증성 물질의 생산 방법은 상기 에틸아세테이트 분획물을 수득하는 단계 이전에 배양액에서 균체를 제거하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 균체를 제거하는 단계는 배양액에 통상의 균체 제거를 위해 사용되는 방법, 예를 들어 원심분리 또는 여과를 적용하는 단계일 수 있다.
또한 본 발명의 항염증성 물질의 생산 방법은 상기 에틸아세테이트 분획물을 수득하는 단계 이후에 에틸아세테이트 분획물에서 항염증성 물질을 추가 정제하는 단계를 더 포함할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
[실시예]
실시예 1. 균주 배양 및 배양액의 에틸아세테이트 분획
바실루스 엔도피티쿠스(Bacillus endophyticus) S2-11 균주를 마린 액체 배지(Marine broth, MB)(DifcoTM Marine broth 2216)[배지 1ℓ 당 Peptone 5.0g, Yeast Extract 1.0g, Ferric Citrate 0.1g, Sodium Chloride 19.45g, Magnesium Chloride 5.9g, Magnesium Sulfate 3.24g, Calcium Chloride 1.8g, Potassium Chloride 0.55g, Sodium Bicarbonate 0.16g, Potassium Bromide 0.08g, Strontium Chloride 34.0㎎, Boric Acid 22.0㎎, Sodium Silicate 4.0㎎, Sodium Fluoride 2.4㎎, Ammonium Nitrate 1.6㎎, Disodium Phosphate 8.0㎎ 함유]에 접종하여 30℃에서 3일간 정치 배양하였다.
상기 배양으로 수득된 배양액을 4000rpm으로 15분 동안 원심분리하여 균체를 제거하고, 상등액을 5.0㎛의 공극 크기를 갖는 필터(TOYO, 일본 소재)로 여과하여 여과액을 수득하였다. 이후 여과액의 2배 부피의 에틸아세테이트(ethyl acetate)를 사용하여 분획한 뒤, 에틸아세테이트층을 감압농축기로 농축하여 분말화하였다.
실시예 2. 항염증 활성 평가
2-1. 방법
2-1-1. 시료의 제조
상기 실시예 1에서 수득한 분말화된 에틸아세테이트 분획물을 DMSO(dimethyl sulfoxide, Sigma-Aldrich, 미국 미주리주 세인트루이스 소재)를 용매로 사용하여 100㎎/㎖의 스톡(stock)으로 제조하였으며, DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's medium, Welgene, 한국 경산 소재)으로 희석하여 50, 100 및 200㎍/㎖의 농도로 실험을 진행하였다.
2-1-2. 실험재료 및 세포배양
실험에 사용된 LPS(lipopolysaccharide)는 Sigma-Aldrich(미국 미주리주 세인트루이스 소재)에서 구입하였으며, RAW 264.7 세포는 한국세포주은행에서 분양받아 10% FBS(fetal bovine serum)와 100U/㎖ 페니실린(penicillin), 100㎍/㎖ 스트렙토마이신(streptomycin)을 DMEM에 첨가한 배지를 사용하여 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양하였으며, 2일을 주기로 계대 배양하였다.
2-1-3. RAW 264.7 세포 독성 평가
24-웰 플레이트에 RAW 264.7 세포를 7.0×104 세포/웰 만큼 분주하여 37℃, 5%, CO2 조건의 배양기에서 24시간 전배양한 뒤, 시료와 LPS(1㎍/㎖)를 동시 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 이후 MTT 시약(thiazolyl blue tetrazolium bromide)을 첨가하여 37℃에서 3시간 동안 반응시킨 뒤, 상층액을 제거한 세포를 DMSO로 용해시키고, 96-웰 플레이트에 옮겨 담아 ELISA 리더를 사용하여 570㎚에서 흡광도를 측정하였다. 각 처리군에 대한 평균 흡광도를 측정하였으며, 대조군의 흡광도 측정값과 비교하여 세포독성을 평가하였다.
2-1-4. NO 생성 억제 활성 측정
24-웰 플레이트에 RAW 264.7 세포를 7.0×104 세포/웰 만큼 분주하고 37℃, 5% CO2 조건의 배양기에서 24시간 전배양하였다. 이후 시료와 LPS(1㎍/㎖)를 동시 처리하여 24시간 배양한 후 상층액 100㎕와 Griess 시약[1%(w/v) sulfanilamide, 0.1%(w/v) naphylethylenediamine in 2.5%(v/v) phosphoric acid] 100㎕를 96-웰 플레이트에서 동량 혼합한 뒤, 10분간 암반응시키고 ELISA 리더를 사용하여 540㎚에서 흡광도를 측정하였다.
2-1-5. PGE2 생성 억제 활성 측정
24-웰 플레이트에 RAW 264.7 세포를 7.0×104 세포/웰 만큼 분주하여 24시간 전배양한 뒤, 시료와 LPS(1㎍/㎖)를 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 이후 배양 배지를 10,000rpm에서 3분 동안 원심분리하여 침전물을 제거한 뒤 상등액을 회수하였다. 회수한 상등액에서 PGE2(Prostaglandin E2)의 함량을 ELISA 키트(mouse enzyme-linked immnunosorbent assay kit, R&D Systems Inc., 미국 미네소타주 미니애폴리스 소재)를 이용하여 측정하였다.
2-1-6. 웨스턴 블롯
RAW 264.7 세포를 4.0×105 세포/웰 만큼 분주하여 24시간 동안 전배양한 후 시료와 LPS(1㎍/㎖)를 동시 처리하여 24시간 배양하였다. 이후 세포를 PBS로 2회 세척하고 용해 완충액(lysis buffer)[1×RIPA(Upstate Cell Signaling Solution, 미국 뉴욕 소재), 1mM phenylmethylsulfonyl fluoride(PMSF), 1mM Na3VO4, 1mM NaF, 1㎍/㎖ aprotinin, 1㎍/㎖ pepstatin 및 1㎍/㎖ leupeptin]으로 1시간 동안 용해시킨 후 원심 분리하여 단백질 상층액을 분리하였다. 단백질 농도는 BCA 키트(Bio-Rad, 미국 소재)를 사용하여 정량하였다. 정량한 단백질을 10%의 폴리아크릴아마이드 겔(polyacrylamide gel)에 전기영동하고 PVDF(poly-vinylidene difluoride) 멤브레인(Milipore, 미국 매사추세츠주 버링턴 소재)에 200mA, 2시간 동안 전이시켰다. 단백질이 전이된 멤브레인을 5% 탈지분유를 포함한 0.05% 트윈 20/Tris-buffered saline (0.05% T/TBS)에 넣고 상온에서 1시간 블로킹시킨 후, 1차 항체와 반응시켰다. 1차 항체 반응은 iNOS 항체(1:1,000, Bio-Rad, 미국 소재), COX-2 항체(1:1,000, Rockland Immunochemicals, Inc., 미국 소재), β-엑틴 항체 클론 AC-74(1:5,000, Sigma, 미국 소재)를 이용하여 4℃에서 밤새 반응시켰다. 이후 0.05% T/TBS 용액으로 3회 세척 한 후 2차 항체(Jackson ImmunoResearch, 미국 소재)를 1:10,000으로 희석하여 상온에서 2시간 반응시킨 뒤, 0.05% T/TBS 용액으로 3회 세척한 멤브레인을 ECL 키트(Bio-Rad, 미국 소재)와 반응시켜 이미지 덴시토미터(imaging densitometer)(model GS-700, Bio-rad, 미국 소재)를 통해 현상하였으며, 이미지J 프로그램(NIH, 미국 메릴랜드주 베세즈다 소재)을 이용하여 β-엑틴 대비 iNOS와 COX-2의 발현량의 면적을 정량화하여 그래프로 나타내었다.
2-1-7. 전염증성 사이토카인(TNF-α, IL-6, IL-1β) 생성 억제 활성 측정
24-웰 플레이트에 RAW 264.7 세포를 7.0×104 세포/웰의 농도로 분주하여 37℃, 5% CO2 조건에서 24시간 동안 전배양한 후, 농도별 시료와 LPS(1㎍/㎖)를 동시에 처리하여 24시간 배양하였다. 이후 배양 배지를 원심분리(10,000rpm, 3분)하여 침전물을 제거하였고, 상등액을 회수하여 전염증성 사이토카인의 생성량을 측정하였다. 상등액에서의 전염증성 사이토카인 생성량은 Mouse TNF-α ELISA 키트(Invitrogen, 미국 캘리포니아 소재), Mouse IL-6 ELISA 키트(BD Biosciences, 미국 캘리포니아 소재), Mouse IL-1β ELISA 키트(R&D Systems Inc., 미국 미네소타주 미니애폴리스 소재)를 이용하여 측정하였다.
2-1-8. 통계처리
모든 실험은 3회 반복하여 측정하였고, 그 결과는 평균값±표준편차로 나타냈으며 통계적 분석은 각 처리 구간의 유의성(*p<0.05; **p<0.01) 검증을 위해 분산분석(analysis of variance, ANOVA) 후 student's t-test로 다중 비교를 실시하였다.
2-2. 결과
2-2-1. 세포 독성(MTT) 및 NO 저해 활성 측정
RAW 264.7 세포에 실시예 2-1-1의 시료를 50, 100, 200㎍/㎖ 농도로 처리한 결과, 모든 처리군에서 80% 이상의 세포 생존율이 확인되었다(도 6). 따라서 이후 진행될 실험은 50, 100, 200㎍/㎖ 농도를 사용하여 진행하였다.
해당 농도에 대하여 실시예 2-1-1의 시료가 NO 생성량에 미치는 영향을 조사한 결과, 실시예 2-1-1의 시료는 농도 의존적으로 NO의 발현을 억제시키는 경향을 나타내었으며, 최고농도인 200㎍/㎖ 처리군에서는 LPS 미처리군과 유사한 수준까지 NO의 발현을 억제시켰다(도 7).
2-2-2. PGE2 생성 억제 활성 측정
실시예 2-1-1의 시료를 50, 100, 200㎍/㎖의 농도로 처리하여 PGE2의 생성을 조사한 결과, 실험 농도 내에서 유의한 감소 경향을 나타내었으며, LPS 처리군 대비 50㎍/㎖ 농도에서는 약 30%, 100㎍/㎖ 농도에서는 약 40% 만큼 발현을 저해하였다. 또한 200㎍/㎖ 농도에서는 무처리군과 유사한 수준까지 PGE2를 저해하는 것으로 나타났다(도 8).
2-2-3. iNOS 및 COX-2 발현 억제
웨스턴 블롯 진행 결과, 50, 100, 200㎍/㎖ 농도로 실시예 2-1-1의 시료를 처리한 RAW264.7 세포에서 iNOS의 발현이 감소하는 것을 확인하였다(도 9). iNOS의 발현이 상기 실시예 2-2-1에서의 NO와 유사한 경향으로 감소하는 것을 볼 때, 실시예 2-1-1의 시료 처리에 의한 NO의 감소는 iNOS의 발현 감소에 의한 것으로 판단된다. 뿐만 아니라 실시예 2-1-1의 시료는 COX-2의 발현 또한 농도 의존적으로 감소시켰으며(도 10), 하위 기전인 PGE2와 같은 경향을 보이는 것으로 나타났다.
2-2-4. 전염증성 사이토카인(TNF-α, IL-6, IL-1β) 생성 억제 활성
세포 독성 실험 결과를 바탕으로 실시예 2-1-1의 시료를 처리하여 전염증성 사이토카인인 TNF-α, IL-6, IL-1β의 생성을 측정하였다. 측정 결과, 실시예 2-1-1의 시료를 처리한 RAW264.7 세포에서 TNF-α, IL-6, IL-1β 모두 농도 의존적으로 감소하는 경향을 보였으며, IL-6과 IL-1β의 경우 가장 고농도인 200㎍/㎖에서 무처리군과 유사한 수준의 저해 활성을 나타내었다(도 11 내지 13).
<110> National Institute of Biological Resources
<120> Anti-inflammatory composition comprising ethylacetate fraction of
Bacillus endophyticus S2-11 strain culture as an active
ingredient
<130> ALP21031
<160> 1
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 1499
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> Bacillus endophyticus S2-11
<400> 1
tttttttgcc tggctcagga cgaacgctgg cggcgtgcct aatacatgca agtcgagcgg 60
agttttgaaa agcttgcttt tcaaaactta gcggcggacg ggtgagtaac acgtgggcaa 120
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gagatgttgg gttaagtccc gcaacgagcg caacccttga tcttagttgc cagcatttag 1140
ttgggcactc taaggtgact gccggtgaca aaccggagga aggtggggat gacgtcaaat 1200
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tgaggtaacc ttttggagcc agccgccgaa ggtgggacag atgattgggg tgaagtcta 1499
Claims (6)
- 수탁번호 KACC 92371P로 기탁된 바실루스 엔도피티쿠스(Bacillus endophyticus) S2-11 균주 배양물의 에틸아세테이트 분획물을 유효성분으로 함유하는 항염증용 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 균주 배양물은 상기 S2-11 균주를 마린(marine) 배지에서 배양하여 수득한 것인, 항염증용 조성물. - 제2항에 있어서,
상기 균주 배양물은 상기 S2-11 균주를 25 내지 35℃에서 1 내지 5일 동안 배양하여 수득한 것인, 항염증용 조성물. - 수탁번호 KACC 92371P로 기탁된 바실루스 엔도피티쿠스(Bacillus endophyticus) S2-11 균주를 배양하는 단계; 및
균주 배양액을 에틸아세테이트로 분획하여 에틸아세테이트 분획물을 수득하는 단계;를 포함하는 항염증성 물질의 생산 방법. - 제4항에 있어서,
상기 배양하는 단계는 상기 S2-11 균주를 마린(marine) 배지에서 배양하는 단계인, 항염증성 물질의 생산 방법. - 제5항에 있어서,
상기 배양하는 단계는 상기 S2-11 균주를 25 내지 35℃에서 1 내지 5일 동안 배양하는 단계인, 항염증성 물질의 생산 방법.
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| KR20230061929A (ko) * | 2021-10-29 | 2023-05-09 | 대한민국(환경부 국립생물자원관장) | 신규 바실루스 엔도피티쿠스 s2-11 균주 |
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