KR102068470B1 - 항진균 및 항염증 활성을 갖는 신균주 아쓰리니움 js0567 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 항진균 및 항염증 활성을 갖는 아쓰리니움 속 균주 및 이의 용도에 관한 것이다.
본 발명에 따른 내생균주 또는 그 배양액은 유해 미생물에 직접 영향을 미치는 것을 통해 탁월한 항진균 활성을 나타내고, 항염증 활성을 보유하고 있으므로 약학적 조성물, 화장료 조성물, 식품 또는 사료 보존용 방부제 등의 용도로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

항진균 및 항염증 활성을 갖는 신균주 아쓰리니움 JS0567 및 이의 용도{Novel Strain of Arthrinium sp. JS0567 Having Anti-Fungal and Anti- inflammatory Activity, and Uses thereof}

본 발명은 항진균 및 항염증 활성을 나타내는 것을 특징으로 하는 아쓰리니움 속 신균주 JS0567 및 이를 유효성분으로 함유하는 항진균 및 항염증 조성물에 관한 것이다.

생물체의 항상성(homeostasis)을 유지하기 위한 과정에서 중요한 역할을 담당하고 있는 물질들 중 일부가 각종 생물체 유래의 생리 활성 물질이다. 지금까지 수많은 생리 활성 물질에 대해 많은 연구가 진행되고 있으며, 그 중, 항진균 및 항염증 물질에 관한 연구는 생명과학 및 의학 분야에서 매우 중요한 영역이다.

모든 생명체는 생존을 위하여 항균 물질을 생산하는 것으로 알려져 있는데, 항진균 물질을 생산하는 미생물에 대해서 많은 연구가 이루어지고 있으며, 항진균 및 항균 물질을 생산하는 미생물 또는 이들에게서 분리된 물질을 이용해 항균제 또는 항진균제를 개발하려는 연구들이 오래전부터 시도되고 있다.

한편, 산화질소(NO, Nitric oxide)는 면역시스템에서 다양한 생리학적 메커니즘을 조절하는데 관여하는 중요한 세포내 및 세포간 신호전달 분자이다. 산화질소는 수퍼옥사이드와 반응하여 퍼옥시나이트라이트(peroxynitrite) 이온을 생성하고, 생성된 이온은 과도한 염증 활성을 유도하며, 패혈증(sepsis), 궤양성 대장염(ulcerative colitis), 관절염(arthritis), 루푸스(systemic lupus erythematosus, SLE) 및 쇼그렌증후군(Sjogren's syndrome, SS) 등의 질환을 발생시키는 것으로 알려져 있다. 활성산소종(Reactive oxygen species, ROS) 및 산화질소(nitric oxide, NO)는 신호전달과정의 중간 매개자로서 매우 중요한 생리학적 역할을 담당한다. 그러나, 내인성 및/또는 외인성 ROS 및 NO의 과도한 생성은 염증성 질환 및 암의 발병에 관련되어 있다. 또한, 산화환원-민감성 전사인자인 NF-κB는 산화스트레스, 외인성 ROS와 산화질소(NO, Nitric oxide) 등과 같은 염증성 매개자에 의해 활성화된다. NF-κB가 활성화되면, IκB는 IκB 키나아제(IKK) 복합체에 의해 인산화되고, IκB는 유비퀴틴화(ubiquitinated)되어 분해된다. IκB로부터 분리된 자유 NF-κB는 핵 속으로 이동하고, 핵 내에서 세포 성장조절, 에이팝토시스, 면역반응, 염증 및 암에 관련된 유전자를 전사시킨다. 또한, NF-κB는 만성염증성질환 및 다양한 인간 암의 발병기전에 중요한 역할을 한다고 보고되었다.

따라서, NF-κB 활성을 유발하는 NO 발생을 억제하는 물질을 탐색하면, 다양한 염증성 질환의 예방 및 치료에 효과적인 물질로 판명할 수 있다는 것을 의미한다.

한편, 식물 내생균은 생활사의 일부가 건강한 식물 조직에 외형적 변형을 일으키지 않고 공존하는 미생물이다. 내생균의 공생은 기주식물과의 상호관계, 즉 내생균과 기주식물 파트너의 특성이나 환경적 영향에 따라 공생, 편리 공생 및 기생 등의 형태(balanced symbiotic continuum)로 정의될 수 있다.

내생균은 기주식물의 생장 촉진, 병해충 저항성 증대, 냉해나 건조 등의 환경변화에 대한 적응력 증대, 대사물질 형성 촉진 등 식물에 이로운 영향을 주기도 하나, 일부 내생균의 경우 기주식물에 잠복하여 병원균으로 작용하는 등 해로운 영향을 주기도 하고, 죽은 식물 조직의 일차 분해자로 작용하여 생태계 물질 순환을 촉진하는 역할을 하기도 한다.

또한, 식물 내생균은 그 자체가 항암 또는 항균 등의 활성을 갖는 유용한 이차대사산물을 생산하는 것으로 알려져 있는데, 가장 대표적인 예로는 주목나무에서 분리된 탁소미세스 속 내생균(Taxomyces andreanae)으로 차세대 항암제로 주목받고 있는 택솔(paclitaxel)을 생산하는 내생균이다. 이러한 내생균의 상업적 성공으로 인해 다양한 약리적 효능을 가진 신규 생리활성 물질을 보유한 새로운 식물 내생균을 찾기 위한 연구개발 노력이 지속적으로 이루어지고 있다.

그러나, 이러한 연구결과에도 불구하고 아직까지 식물 내생균을 이용한 신규 약제 개발과 관련된 연구 성과는 미미한 상태이다.

이러한 배경 하에서, 본 발명자들은 우수한 약리 활성을 갖는 신규 내생균을 찾기 위해 예의 노력한 결과, 우리나라 전역에서 서식하고 있는 식물체인 갈대 잎에서 분리된 아쓰리니움 속 신규 내생균주가 진균의 성장을 효과적으로 억제하고, 산화질소의 발생을 효과적으로 억제하여, 항진균제 및 항염증제로 유용하게 활용될 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 주된 목적은 항진균 및 항염증 활성을 갖는 아쓰리니움(Arthrinium) 속 신규 내생균을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 식물 내생균을 이용한 항진균 및 항염증 조성물을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 항진균 및 항염증 활성을 갖는 아쓰리니움(Arthrinium) 속 균주 JS0567(수탁번호: KACC 83015BP)을 제공한다.

본 발명의 용어 "아쓰리니움(Arthrinium) 속 균주 JS0567"은 국내 자생 식물인 갈대에서 본 발명자들에 의해 새롭게 분리 동정된 신규한 아쓰리니움 균주로서, "JS0567 균주" 또는 "JS0567"과 혼용하여 사용할 수 있다.

본 발명자들은 신규 항균제나 항진균제의 개발을 위해 국내에서 자생하는 여러 식물체에서 분리된 내생균의 항진균 및 항균 효과에 대해 수년간 조사 분석하였고, 그 결과 한국 자생 갈대에서 유래된 내생균주의 항진균 및 항염증 효과를 검증하였다(도 1 내지 도 3 참조).

본 발명의 상기 아쓰리니움(Arthrinium) 속 균주 JS0567(수탁번호: KACC 83015BP)은 서열번호 1의 ITS 유전자 서열 또는 서열번호 2의 LSU(Large subunit of ribosomal DNA) 유전자 서열을 갖는 것을 특징으로 한다.

본 발명자들은 상기 유전자 서열을 종래 공지된 균주들의 유전자 서열들과 비교 분석한 결과, 본 발명의 균주가 아쓰리니움 속에 속하는 새로운 균주임을 확인하여 아쓰리니움 속 균주 JS0567로 명명하였고, 국립농업과학원 농업유전자원정보센터에 2017년 12월 11일자로 기탁하고, 수탁번호 KACC 83015BP를 부여받았다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 아쓰리니움(Arthrinium) 속 균주 JS0567, 또는 그 배양액을 유효성분으로 포함하는 항진균 및 항염증 조성물을 제공한다.

본 발명에서, 상기 아쓰리니움 속 JS0567 균주 또는 그 배양액은 그 자체로 항진균 및 항염증 활성을 나타내는 것을 특징으로 한다.

상기 아쓰리니움 속 균주 JS0567 또는 그 배양액은 다양한 진균류에 대해 항진균 활성이 있으며, 구체적으로는 칸디다 속 진균에 대해 항진균 활성을 갖고, 보다 구체적으로는 칸디다 알비칸스(Candida albicans)에 대해 항진균 활성이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다(도 1 참조).

또한, 상기 아쓰리니움 속 균주 JS0567 또는 그 배양액은 다양한 균류에 대해 항균 활성이 있다. 본 발명의 균주 또는 그 배양액은 그람 양성균, 그람 음성균 및 항생제 내성 균주에 대하여 항균 활성을 갖고 있다.

본 발명의 일 실시예에서는 본 발명에 따른 내생균 배양액의 추출물이 다양한 병원성 진균 및 병원성 세균에 대해 생장억제 효능이 있는 것을 확인하였다.

또한, 본 발명에서, 상기 아쓰리니움 속 JS0567 균주 또는 그 배양액의 항염증 활성은 산화질소(Nitric oxide, NO)의 생성 억제를 통해 이루어지는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 일 실시예에서는 상기 아쓰리니움 속 JS0567 균주 또는 그 배양액이 염증 유발 인자인 산화질소(NO)의 생산 및 분비를 억제하는 효과가 우수함을 확인함으로써, 염증성 질환의 치료 및 예방 효과가 우수함을 확인할 수 있었다.

본 발명에서, 상기 염증성 질환은 부종, 피부염, 알레르기, 아토피, 천식, 결막염, 치주염, 비염, 중이염, 인후염, 편도염, 폐렴, 위궤양, 위염, 크론병, 대장염, 치질, 통풍, 강직성 척추염, 류마티스 열, 루프스, 섬유근통(fibromyalgia), 건선관절염, 골관절염, 류마티스관절염, 견관절주위염, 건염, 건초염, 근육염, 간염, 방광염, 신장염, 쇼그렌 증후군(sjogren's syndrom), 다발성 경화증 등의 염증성 질환일 수 있다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 아쓰리니움 속 균주 JS0567 또는 그 배양액을 유효성분으로 포함하는 항진균 및 항염증 약학적 조성물을 제공한다. 본 발명의 아쓰리니움 속 균주 JS0567 또는 그 배양액은 유해 미생물에 직접 영향을 미치는 것을 통해 탁월한 항진균 및 항염증 활성을 나타내므로 항진균 및 항염증 약학적 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.

한편, 본 발명의 아쓰리니움 속 균주 배양액의 추출물은 약학적으로 허용 가능한 염의 형태로 제조될 수 있다. 구체적으로 산을 첨가함으로써 염을 형성할 수 있고, 예를 들어 무기산(예: 염산, 하이드로브롬산, 인산, 질산, 황산 등), 유기 카르복실산(예: 아세트산, 트리플루오로아세트산과 같은 할로 아세트산, 프로피온산, 말레산, 숙신산, 말산, 시트르산, 타르타르산, 살리실산), 및 산성 당(글루쿠론산, 갈락투론산, 글루콘산, 아스코르브산), 산성 폴리사카리드(예: 히알우론산, 콘드로이틴 술페이트, 아르기닌산), 콘드로이틴 설페이트와 같은 술폰산 당 에스테르를 포함하는 유기 술폰산(예: 메탄, 술폰산, p-톨루엔 술폰산) 등을 첨가하여 염을 형성할 수 있다.

본 발명의 아쓰리니움 속 균주 JS0567 또는 그 배양액은 식용 가능한 갈대 잎에서 분리된 내생균으로 임상 투여시 경구 또는 비경구로 투여가 가능하며 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다.

즉, 본 발명의 신균주 JS0567 또는 그 배양액은 실제로 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제형화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 리우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

또한, 본 발명의 신균주 JS0567 또는 그 배양액은 생리식염수 또는 유기용매와 같이 약제로 허용된 여러 전달체(carrier)와 혼합하여 사용될 수 있고, 안정성이나 흡수성을 증가시키기 위하여 글루코오스, 수크로오스 또는 덱스트란과 같은 카보하이드레이트, 아스코르브 산(ascorbic acid) 또는 글루타치온과 같은 항산화제(anti-oxidants), 킬레이트화제(chelating agents), 저분자 단백질 또는 다른 안정화제(stabilizers)들이 약제로 사용될 수 있다.

본 발명의 신균주 JS0567 또는 그 배양액의 유효용량은 0.01 내지 10 ㎎/㎏이고, 바람직하게는 0.1 내지 1 ㎎/㎏ 이며, 하루 1회 내지 3회 투여될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물에서 또는 그 배양액은 총 유효량은 볼루스(bolus) 형태 혹은 상대적으로 짧은 기간 동안 주입(infusion) 등에 의해 단일 투여량(single does)으로 환자에게 투여될 수 있으며, 다중 투여량(multiple does)이 장기간 투여되는 분할 치료 방법(fractionated treatment protocol)에 의해 투여될 수 있다. 상기 농도는 약의 투여 경로 및 치료 횟수뿐만 아니라 환자의 나이 및 건강상태 등 다양한 요인들을 고려하여 환자의 유효 투여량이 결정되는 것이므로 이러한 점을 고려할 때, 이 분야의 통상적인 지식을 가진 자라면 본 발명의 신균주 JS0567 또는 그 배양액의 약학적 조성물로서의 특정한 용도에 따른 적절한 유효 투여량을 결정할 수 있을 것이다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 항진균 및 항염증 활성을 갖는 아쓰리니움(Arthrinium) 속 균주 JS0567 또는 그 배양액를 유효성분으로 함유하는 항진균 및 항염증 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명의 신균주 JS0567 또는 그 배양액은 유해 미생물에 직접 영향을 미치는 것을 통해 탁월한 항진균 및 항염증 활성을 나타므로 항진균 및 항염증 화장료 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 유효성분으로 상기 신균주 JS0567 또는 그 배양액 이외에 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들이 포함되며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함한다.

본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화 될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 유연 화장수(스킨), 영양 화장수(밀크로션), 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이크림, 클렌징크림, 클렌징폼, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.

본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성 유, 식물성 유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라가칸타, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토오스, 탈크, 실리카, 알루미늄 하이드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로하이드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소 결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라가칸타 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클렌징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 화장품의 구체예로서는 세안크림, 세안폼, 클렌징크림, 클렌징밀크, 클렌징로션, 마사지크림, 콜드크림, 모이스처크림, 유액, 화장수, 팩, 에프터세이빙크림, 썬텐방지크림, 썬텐용 오일, 비누, 보디샴푸, 헤어샴푸, 헤어린스, 헤어트리트먼트, 양모료, 육모료, 헤어크림, 헤어리퀴드, 세트로션, 헤어스프레이, 헤어브리지, 컬러린스, 컬러스프레이, 퍼머넌트웨이브액, 프레스파우더, 루스파우더, 아이섀도, 핸드크림, 립스틱 등을 들 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 항진균 및 항염증 활성을 갖는 아쓰리니움(Arthrinium) 속 균주 JS0567 또는 그 배양액을 유효성분으로 함유하는 식품 또는 사료 보존용 조성물을 제공한다.

식품이나 사료의 보존제는 식품이나 사료의 변질, 부패, 변색 및 화학변화를 방지하기 위해 사용되는 첨가물로서 살균제, 산화방지제가 이에 포함되며, 세균, 곰팡이, 효모 등 미생물의 증식을 억제하여 식품, 사료, 화장품, 의약품 등에서 부패미생물의 발육저지 또는 살균작용을 하는 등의 기능성 항균제도 포함된다. 이러한 식품이나 사료의 방부제의 이상적인 조건으로는 독성이 없어야 하며, 미량으로도 효과가 있어야 한다. 본 발명의 아쓰리니움(Arthrinium) 속 균주 JS0567 또는 그 배양액은 유해 미생물에 직접 영향을 미치는 것을 통해 탁월한 항진균 및 항염증 활성을 나타므로 상기의 식품이나 사료의 보존제, 화장품 보존제 및 의약품 보존제 등에 폭넓게 사용될 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 아쓰리니움(Arthrinium) 속 균주 JS0567 또는 그 배양액을 함유하는 조성물을 치료를 필요로 하는 개체에 투여하여 병원성 세균을 사멸시키는 단계를 포함하는, 인간을 제외한 동물의 세균 또는 진균성 감염 질환을 치료하는 방법을 제공한다.

또한, 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 아쓰리니움(Arthrinium) 속 균주 JS0567 또는 그 배양액을 함유하는 조성물을 치료를 필요로 하는 개체에 투여하여 염증성 질환을 치료 또는 예방하는 단계를 포함하는, 인간을 제외한 동물의 염증성 질환을 치료하는 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 상기 치료방법은 비록 인간을 제외한 동물을 치료하는 방법이나, 인간에 있어 이러한 치료방법이 효과가 없음을 의미하는 것은 아니다. 또한, 인간의 경우 있어서 본 발명에 따른 치료용 조성물의 투여에 의해 세균 또는 진균 감염이나, 염증성 질환에 대한 증상이 호전될 수 있음을 고려할 때, 인간의 치료에 있어서도 충분히 사용될 수 있다.

본 발명에서 상기 "염증성 질환"은 염증을 주병변으로 하는 질병을 총칭하는 의미로서, 이에 제한되지는 않으나, 바람직하게는 부종, 피부염, 알레르기, 아토피, 천식, 결막염, 치주염, 비염, 중이염, 인후염, 편도염, 폐렴, 위궤양, 위염, 크론병, 대장염, 치질, 통풍, 강직성 척추염, 류마티스 열, 루푸스, 섬유근통(fibromyalgia), 건선관절염, 골관절염, 류마티스 관절염, 견관절주위염, 건염, 건초염, 근육염, 간염, 방광염, 신장염, 쇼그렌 증후군(sjogren's syndrome) 또는 다발성 경화증일 수 있다.

본 발명에서 용어 "인간을 제외한 동물"은 본 발명에 따른 치료용 조성물의 투여에 의해 증상이 호전될 수 있는 세균 또는 진균의 감염에 의해 유발되는 질환이나 염증성 질환을 갖는 인간만을 제외한 말, 양, 돼지, 염소, 낙타, 영양, 개 등의 동물을 의미한다. 본 발명에 따른 치료용 조성물을 인간을 제외한 동물에게 투여함으로써, 세균 및 진균 감염에 의한 질환이나 염증성 질환을 효과적으로 예방 및 치료할 수 있다.

본 발명에서 용어 "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 동물에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며, 본 발명에 따른 치료용 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 경구 또는 비경구 투여될 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 치료용 조성물은 유효성분이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.

본 발명에 따른 치료용 조성물의 바람직한 투여량은 치료 대상 동물의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나, 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 약학적 조성물은 0.01 내지 10 ㎎/㎏이고, 바람직하게는 0.1 내지 1 ㎎/㎏ 이며, 하루 1회 내지 3회 투여할 수 있다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(ⅰ) 본 발명은 갈대 잎에서 유래한 아쓰리니움 속 JS0567 균주 또는 그 배양액을 유효성분으로 포함하는 항진균 및 항염증 조성물을 제공한다.

(ⅱ) 본 발명의 아쓰리니움 속 JS0567 균주 또는 그 배양액을 포함하는 조성물은 유해세균에 의해 발생하는 다양한 세균 감염증에 적용이 가능하며, 산화질소의 분비를 효과적으로 억제함으로써 염증성 질환에 적용이 가능하다.

(ⅲ) 또한, 본 발명의 조성물은 화장료 조성물, 식품 또는 사료 보존용 첨가제 조성물 등의 다양한 분야에서 항진균 및 항염증 목적으로 유용하게 이용가능하다.

도 1은 Candida albicans에 대한 아쓰리니움 속 JS0567 균주의 항균활성 시험 결과를 나타낸 그래프이다.
도 2는 아쓰리니움 속 JS0567 균주의 배양액이 산화질소(NO) 생성 억제를 통해 항염증 활성을 나타내는 것을 보여주는 그래프이다.
도 3은 아쓰리니움 속 JS0567 균주의 배양액에 대한 세포독성 실험 결과를 나타내는 그래프이다.
도 4는 아쓰리니움 속 JS0567 균주가 감자설탕한천배지 상에서 생장하는 모습(좌: 평판배지 윗면, 우: 평판배지 뒷면)을 촬영한 사진이다.
도 5는 아쓰리니움 속 JS0567 균주의 배지 조건에 따른 균주 생장 모습을 촬영한 사진이다.
도 6은 아쓰리니움 속 JS0567 균주의 ITS 염기서열 정보를 바탕으로 시행한 계통분석 그래프이다.
도 7은 아쓰리니움 속 JS0567 균주의 LSU 염기서열 정보를 바탕으로 시행한 계통분석 그래프이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1. 균주 분리

항진균 및 항염증 활성이 있는 식물 내생균을 수집하기 위해 먼저 식물 시료로 갈대를 확보하였다.

갈대는 전라북도 무주군에서 채집하였다. 채집한 식물 시료는 흐르는 수돗물로 표면에 붙은 흙먼지를 씻고 물기를 닦은 후, 내생균 분리에 사용하였다. 먼저, 잎 조직은 5mm×5mm 크기의 단편으로, 가지, 줄기 및 뿌리는 1 내지 2mm 폭으로 작게 조각내어 샘플을 채취한 후, 1.5% NaOCl 용액에 3분 동안 살균하고, 다시 70% 에탄올에서 2분간 표면 살균하였다. 살균된 샘플 증류수에 1분간 침지한 후 멸균된 페이퍼 타올로 물기를 닦아내고, 균주 분리용 배지에 치상하였다.

배지는 50ppm 로즈 벵갈(Rose Bengal), 100ppm 카나마이신(Kanamycin), 및 100ppm 스트렙토마이신(Streptomycin)을 첨가한 PDA(potato dextrose agar) 배지와 MEA(malt extract agar) 배지를 사용하였다. 5 내지 10일간 배양 후 식물조직에서 자라나오는 균총의 가장자리에서 어린균사를 새로운 PDA 배지에 옮겨 순수 분리하고, 분리된 균주를 넘버링 하였다.

실시예 2. 균주 배양 및 유효성분 추출

감자한천액체배지(PDB: potato dextrose broth) 250ml에서 상기 실시예 1의 PDA(potato dextrose agar) 배지에서 자란 균사가 함유된 한천조각을 약 1mm²의 크기로 잘게 잘라서 접종하고, 24℃, 180rpm으로 3주간 진탕 배양하였다.

배양 후, 미라클로스(miracloth)를 이용하여 균사체를 걸러내고 배양여액을 에틸아세테이트(Ethyl acetate)용매로 추출하였다. 추출은 배양여액과 같은 부피의 에틸아세테이트(Ethyl acetate)로 20분씩 2회 진행하였다. 추출물은 감압농축하여 건조한 후 정량하고, DMSO 용액에 재용해한 후 활성 분석에 사용하였다.

실시예 3. 항진균 활성 검정

식물 내생균의 항진균 활성 실험은 마이크로 플레이트를 이용한 표준 분석 방법이 사용되었다(Serrone PD and Nicoletti M, 2013).

칸디다증을 유발하는 병원성 진균인 칸디다 알비칸스(Candida albicans)는 SDB(Sabouraud dexrtrose browth) 배지에서 30℃, 200rpm 조건으로 24시간 동안 배양하였다. 상기 병원성 진균을 1 X 10⁵(conidia/ml) 농도로 희석하여 96 웰 플레이트(well plate)에 접종하고, 상기 실시예 2의 방법으로 추출된 추출물을 50ppm 농도로 처리하고, 30℃, 200rpm 조건에서 24시간 동안 배양하였다. 대조군으로 암포테리신 B(Amphotericin B) 10ppm을 양성대조군으로 사용하였다.

항균 활성을 측정하기 위해 마이크로플레이트 리더기를 사용해 600nm에서 OD 값을 측정하였고, 시료 처리를 하지 않은 음성대조군과 비교하여 진균의 생장율을 계산하였다. 각 실험은 3번 반복해서 진행되었다. 균주 생장률은 아래 공식을 이용하여 계산하였다.

Relative growth rate(%) = [(Control_Abs Treatment_Abs)/Control_Abs] x 100

그 결과, 상기 실시예 1에서 분리되어 JS0567로 넘버링 된 내생균의 추출물을 50ppm으로 처리한 실험군은 무처리군 대비 1.29 ± 0.05%로 생장하여, 매우 우수한 항진균 효과가 있음이 관찰되었다. 이러한 항진균 효과는 양성대조군인 Amphotericin B 10ppm 처리군의 생장률인 0.29 ± 0.02%의 항진균 활성 결과와 유사한 결과를 갖는 것으로 확인되었다(도 1 참조).

실시예 4. 항염증 활성 검정

식물 내생균 추출물의 항염증 활성은 LPS(Lipopolysaccharide)에 의해 활성화된 생쥐 미세아교세포(BV-2 Microglial)의 염증반응을 상대적 산화질소(NO; nitric oxide) 생성 정도(relative extracellular NO level)로 측정하였다. LPS를 처리하지 않은 세포와 LPS를 처리한 세포에서 생성되는 NO를 측정하고, 추출물에 의해 감소되는 NO 생성 정도와 비교하여 항염증활성을 확인하였다. 항염증활성 검정 후 MTS(sigma)를 이용하여 추출물에 의한 세포독성을 확인하였다.

구체적으로 실험을 위해서, BV-2 세포를 37℃, CO₂ incubator에서 10% FBS가 포함된 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium) 배지에 배양하였다. 96 well plate의 well 당 5 X 10⁴/200ul의 세포 농도로 접종하고, 24시간 배양하였다.

배지를 걷어내고 추출물을 적정농도를 처리한 0.5% FBS가 포함된 DMEM 배지로 교체한 후, 3시간 후에 LPS를 처리하여 염증반응을 유도하였다. 24시간 반응 후, 배지 50ul를 새로운 plate로 옮기고, Griess reagent(Enzo) 50ul를 넣은 뒤, 호일로 싸서 빛을 차단하고, 5분 동안 상온에서 보관하고, 540nm에서의 흡광도를 측정하여 NO 생성 정도를 비교하였다.

또한, 세포독성을 검정하기 위해서는 NO 생성확인이 끝난 plate의 배지를 모두 제거하고, MTS 20ul와 배지 100ul 섞은 용액 120ul를 처리하였다. 혼합용액을 37℃, CO₂ incubator에서 1시간 30분 반응시킨 후, 흡광도(490nm)를 측정하여 세포독성을 확인하였다. 항염증 활성 검정을 위해 LPS 및 본 발명의 추출물을 처리하지 않은 실험군과, LPS를 처리하고 본 발명의 추출물을 처리하지 않은 실험군을 대조군으로 하여, 염증반응 정도를 상대적인 NO 생산량으로 확인하였다.

그 결과, LPS를 처리하지 않은 실험군(negative control)의 상대적 NO 생성량을 100%로 볼 때, LPS만을 처리한 실험군(positive control)에서는 5300 ± 172.9%의 산화질소가 생성되어 염증반응이 유발됨을 확인하였다.

한편, 본 발명의 아쓰리니움(Arthrinium) 속 JS0567 추출물 50ppm을 처리한 후, LPS로 염증반응을 일으킨 실험군에서는 산화질소 생성 수준이 1,715 ± 172.9%로 나타나, LPS만을 처리한 실험군에 비해 산화질소의 생성량이 약 32% 수준으로 감소하여 통계적으로도 유의한 차이를 나타냈다.

이러한 항염증 활성은 추출물의 농도 의존적으로 관찰되었는데, 추출물 농도가 감소함에 따라 항염증활성도 감소됨을 확인하였다(도 2 참조).

한편, 세포의 생존율은 LPS를 처리하지 않은 실험군(negative control)의 세포 생존율을 100%로 볼 때, 본 발명의 아쓰리니움(Arthrinium) 속 JS0567 추출물을 50ppm의 농도로 처리한 군에서는 무처리군의 세포사멸 정도와 동일한 결과를 나타내는 바, 아쓰리니움(Arthrinium) 속 JS0567에 의한 세포독성이 없음을 확인할 수 있었다(도 3 참조).

실시예 5. 탄소원에 따른 생장특성 검증

아쓰리니움(Arthrinium) 속 JS0567 균주의 배지에 따른 생장 특성을 파악하고자, CDA(Czapek Dox Agar) 배지에 탄소원을 다르게 처리하여 탄소원별 생장특성을 확인하였다. 탄소원은 프록토오스(Fructose), 글루코오스(Glucose), 이노시톨(Inositol), 만니톨(Mannitol), 만노오스(Mannose), 솔비톨(Sorbitol), 수크로오스(Sucrose), 및 자일로오스(Xylose)를 각각 2% 농도로 처리하였다. 이외에 영양배지인 PDA, V8, 및 오트밀(Oatmeal)의 3종 배지와 함께 비교하였다.

실험은 6 웰 플레이트에 각각의 배지를 5ml씩 넣은 후, 아쓰리니움(Arthrinium) 속 JS0567을 접종하고, 1주에서 4주 동안 배양하여 비교하였다.

그 결과, 배지에 따라 균사 생장속도가 다르고, 자라는 형태, 균사와 배지의 색이 다양하게 관찰되었다.

배양 1주일째 관찰결과, 탄소원이 없는 CDA 배지에서는 균사가 가늘고 길게 자라는데 비해 프록토오스(Fructose), 글루코오스(Glucose), 만노오스(Mannose), 및 수크로오스(Sucrose)가 탄소원으로 제공된 CDA 배지에서는 균사가 길게 자라지 못하고 접종원 주변에 머물러 있었다. 자일로오스(Xylose)가 탄소원으로 제공된 배지의 경우는 상기 4종 배지에 비해 길게 자라지만, 다른 배지에 비하면 생장 속도가 느린 것으로 관찰되었다.

영양배지인 PDA, V8, 오트밀 배지의 경우 일주일 만에 플레이트를 가득 채우면서 자랐다. 오트밀 배지에서는 공중 균사(aerial mycelia)가 많이 생기는 반면, V8과 PDA는 공중 균사가 형성되지 않았다.

배양 4주 후 관찰 결과, 이노시톨(Inositol)이 탄소원으로 제공된 배지에서 자라는 균사의 형태는 탄소원이 없는 배지에서 자라는 형태가 유사한 것으로 관찰되었다. 이를 통해, JS0567 균주는 이노시톨을 탄소원으로 이용하지 못하는 것으로 추정된다.

대부분의 경우에서 배지 색을 변화 시키는 물질생성은 없었으나 Sorbitol과 Xylose가 탄소원으로 제공된 경우 배지색이 붉게 변하는 것을 관찰하였다.

12 종의 배지 배양 실험 결과, JS0567 균주는 다양한 생장 속도와 형태를 보이는 바, 탄소원이 균주의 생장과 물질생산에 주요한 역할을 하는 것으로 여겨진다(도 4 및 도 5 참조).

실시예 6. 내생균주의 염기서열 분석을 통한 동정

상기 실시예 3 및 4에서 항진균 및 항염증 효과가 검증된 JS0567 균주의 PDA 고체배지 상에서의 생장모습과 포자형성유무를 확인하고, 균체로부터 DNA를 분리하였다. 본 균주는 PDA 상에서 무성포자를 형성하지 않았다.

분리된 DNA를 주형으로 서열번호 3의 ITS1F(CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA) 프라이머와 서열번호 4의 LR5(ATCCTGAGGGAAACTTC) 프라이머를 이용하여 ITS(Internal Transcribed Spacer)와 LSU(Large subunit of ribosomal DNA) 영역 일부를 증폭하고, ABI PRISM 3730 XL analyzer(마크로젠) 플랫폼으로, ITS1F, ITS3, ITS4, LR0R, LR5 프라이머를 이용하여 염기서열을 확보하였다(Gardes and Bruns, 1993; White et al., 1990). PCR 증폭과 시퀀싱에 사용된 프라이머 서열은 하기 표 1과 같다.

프라이머	서열(5‘-3’)	비고
ITS1F	CTT GGT CAT TTA GAG GAA GTA A	PCR증폭, 시퀀싱
ITS3	GCATCGATGAAGAACGCAGC	시퀀싱
ITS4	TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC	시퀀싱
LR0R	GTA CCC GCT GAA CTT AAG C	시퀀싱
LR5	ATC CTG AGG GAA ACT TC	PCR증폭, 시퀀싱

JS0567 균주에서 추출된 genomic DNA를 주형으로 하여 ITS와 LSU rDNA region을 대상으로 유전자증폭(PCR)을 실시하였다. PCR 조건은 다음과 같다. 유전자증폭은 Thermal cycler(Applied Biosystems 2720)를 이용하여, ① 95℃, 5min, ② 90℃, 1min, ③ 50℃, 1min, ④ 72℃, 2min, 및 ② 내지 ④ 과정을 30 cycle 반복한 후, ⑤ 72℃, 10min의 프로그램으로 진행하였다. 상기 PCR 산물을 1.3% agarose gel에서 전기영동 후, 겔다큐멘테이션(Bio-Rad)을 이용하여 결과를 확인한 후, PCR purification kit(K-3034, Bioneer)를 이용하여 증폭된 단편을 정제하였다.

확보된 염기서열은 Sequencher 프로그램으로 고품질 영역을 추출하고 조립하여 consensus sequence를 확정하고, NCBI의 ntDB를 대상으로 BLASTn 알고리즘으로 상동성을 검색하였다.

ITS 영역(ITS1F-ITS4 사이)과 LSU 영역의 서열(LR0R과 LR5 사이)을 각각 나누고, 상동성 검색결과 나온 근연종의 서열과 다중정렬(multiple alignment)한 후, 계통수를 그려 계통관계를 확인하였다. 다중정렬은 ClustalW 프로그램을 이용하였고, 계통수는 MEGA version 6.06(Tamura et al., 2011)의 neighbor-joining method(Saitou and Nei, 1987)를 이용하여 작성하였으며, 1,000번의 bootstrap을 통해 신뢰도를 제고하였다.

그 결과, ITS1과 LR5 프라이머를 이용하여 증폭된 단편의 크기는 약 1,500bp 정도로 확인되었다. 상기 5개의 primer를 이용하여 얻은 염기서열은 SEQUENCHER^TM (GeneCodes Corporation) program을 이용하여 ITS region 에서 LSU 영역까지 하나의 콘티그(contiguous sequence)로 만들고, 각 영역의 서열로 나누었다.

그 결과 확보된 ITS 영역의 서열은 서열번호 1의 632bp 서열로 나타났고, LSU 영역의 서열은 서열번호 2의 1185bp 서열로 나타났다.

또한, JS0567 균주의 ITS 서열을 이용한 상동성 검색 결과, 아쓰리니움(Arthrinium) 속[Ascomycota 문; Pezizomycotina 아문; Sordariomycetes 강; Xylariales 목; Apiosporaceae 과] 균주들의 ITS 서열과 가장 높은 상동성을 보였다.

근연종의 ITS 서열과 계통수를 그려본 결과, 아쓰리니움(Arthrinium) 속 균주들과 단계통을 이루고 있는 것으로 나타났다(도 6 참조). 또한, LSU 서열을 이용한 상동성 검색에서도 아쓰리니움(Arthrinium) 속 균주들과 가장 높은 상동성을 보였으며, 이들과 단일계통을 이루는 것으로 나타났다(도 7 참조). 이러한 결과를 바탕으로 JS0567 균주는 아쓰리니움(Arthrinium) 속에 속하는 균주임을 확인할 수 있었다.

본 발명자들은 우수한 항진균 및 항염증 활성을 갖는 본 발명의 균주를 아쓰리니움 (Arthrinium ) 속 JS0567로 명명하고, 국립농업과학원 농업유전자원정보센터에 기탁번호(KACC 83015BP)로 기탁하였다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

농업생명공학연구원 KACC83015BP 20171211

<110> National Institute of Biological Resources <120> Novel Strain of Ceratobasidium sp. JS1289 Having Anti-Fungal and Anti- inflammatory Activity, and Uses thereof <130> PN20170059AN <160> 4 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 632 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Arthrinium sp. <400> 1 gaagtaaaag tcgtaacaag gtctccgttg gtgaaccagc ggagggatca ttacagagtt 60 atacaactcc cataccattt gtaaacttta ctcagttatg cctcggcgtg aactgcgtac 120 ggagtgtaga gtggtgttac ccggtagctt accctgtagg ttaccctgta gcgctaccct 180 gcatcgctcc cgcgcagccc gccggtggta cactaaactc ttgttttatt ttatattctg 240 agcgtattat tttaataatt aaaactttca acaacggatc tcttggttct ggcatcgatg 300 aagaacgcag cgaaatgcga taagtaatgt gaattgcaga attcagtgaa tcatcgaatc 360 tttgaacgca cattgcgccc atcagtattc tggtgggcat gcctgttcga gcgtcatttc 420 aacccttaag cctagcttag tgttgggaat ctactgtatt gtagttcctt aaagacagtg 480 gcggagcgat agttgtcctc tgagcgtagt aaatttattt ctcgcttctg taaggctcta 540 ttctcccgcc ataaaacccc caatttttta gtggttgacc tcggatcagg taggaatacc 600 cgctgaactt aagcatatca ataagcggag ga 632 <210> 2 <211> 1185 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Arthrinium sp. <400> 2 aaagaaacca acagggattc ccctagtaac ggcgagtgaa gcgggaacag ctcaaatttg 60 aaatctggcc cttgggtccg agttgtaatt tcagaggatg cttttggtgc ggtgccttcc 120 gagttccctg gaacgggacg ccttagaggg tgagagcccc gtacggttgg acaccaagcc 180 tatgtaaagc tccttcgacg agtcgagtag tttgggaatg ctgctcaaaa tgggaggtat 240 atttcttcta aagctaaata ttggccagag accgatagcg cacaagtaga gtgatcgaaa 300 gatgaaaagc actttgaaaa gagggttaaa tagcacgtga aattgttgaa agggaaggat 360 ttatgaccag actttttctg gggggatcat ccggtgttct caccggtgca cttcccccag 420 ttgaggccag catcggtttc tgtcgaggga taaaagcttt aggaatgtgg ctcctttcgg 480 ggagtgttat agcctgttgc ataatacctt gacggggacc gaggttcgcg cattgcaagg 540 atgctggcgt aatggttatt aatcacccgt cttgaaacac ggaccaagga gtcgaacatt 600 tgtgcgagtg tttgggtgtt aaaccctcac gcgtaatgaa agtgaacgga ggtgagagcc 660 tttaggggtg catcatcgac cgatcctgat gtcttcggat ggatttgagt aagagcataa 720 ctgttcggac ccgaaagatg gtgaactatg cgtggatagg gtgaagccag aggaaactct 780 ggtggaggct cgcagcggtt ctgacgtgca aatcgatcgt caaatctgcg catgggggcg 840 aaagactaat cgaaccattg accagcggtc aaaacaatca ctaggtggtt aagagggggt 900 ccgcgaggac catttgaaaa acctaggctg tgcccggtta ccctgtagcg ttaccctgta 960 gcgctacccg gtaccgagcc ggccgacacc gctaaaatgc ggggacatcc ctttacaggg 1020 ccaaaggcta ccgccacgcg ctgaaaagcg tgctggcacc gaggatagtg acctcgggta 1080 tggtaataac gcctgcggct gggacgacct gcagccaacc ccgcccaggg gagagttcac 1140 agactaaaca gcggtgggtt ggcagtgcct ttcggggcct gccat 1185 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ITS1F primer <400> 3 cttggtcatt tagaggaagt aa 22 <210> 4 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LR5 primer <400> 4 atcctgaggg aaacttc 17

Claims (9)

1. 서열번호 1의 ITS 유전자 서열 또는 서열번호 2의 LSU(Large subunit of ribosomal DNA) 유전자 서열을 갖는 것을 특징으로 하고,
   산화질소(Nitric oxide, NO) 매개 염증성 질환에 항염증 활성을 갖고,
   칸디다 알비칸스(Candida albicans)에 항균 활성을 갖는 것을 특징으로 하는,
   아쓰리니움(Arthrinium) 속 균주 JS0567(수탁번호: KACC 83015BP).
2. 삭제
3. 제1항의 균주, 또는 그 배양액을 유효성분으로 함유하고,
   산화질소(Nitric oxide, NO) 매개 염증성 질환에 대한 항염증 활성을 갖는 것을 특징으로 하는,
   항염증 조성물.
4. 삭제
5. 삭제
6. 삭제
7. 삭제
8. 제3항의 항염증 조성물을 치료를 필요로 하는 개체에 투여하여 산화질소(Nitric oxide, NO) 매개 염증성 질환을 치료하는 단계를 포함하는, 인간을 제외한 동물의 염증성 질환을 치료하는 방법.
9. 삭제

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