KR20230088001A - Skin whitening composition comprising bioconversion product of Dendropanax morbiferus callus extract as an active ingredient - Google Patents
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Abstract
본 발명의 피부 미백용 조성물은 황칠나무 캘러스 추출물을 바실러스 속(Bacillus sp.) JD3-7로 생물전환한 생물전환산물을 유효성분으로 함유한다. 또한, 본 발명의 황칠나무 캘러스 추출물의 생물전환 방법은 황칠나무 캘러스 추출물과 바실러스 속 JD3-7의 균체를 혼합하여 생물전환 반응용 조성물을 생성하는 단계; 및 상기 생물전환 반응용 조성물을 항온처리하는 단계;를 포함한다.The composition for skin whitening of the present invention contains a bioconversion product obtained by bioconversion of hwangchil tree callus extract to Bacillus sp. JD3-7 as an active ingredient. In addition, the bioconversion method of Hwangchil tree callus extract of the present invention comprises the steps of mixing Hwangchil tree callus extract and cells of the genus Bacillus JD3-7 to produce a composition for bioconversion reaction; and incubating the composition for the bioconversion reaction.
Description
본 발명은 황칠나무 캘러스 추출물의 생물전환산물을 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 조성물에 관한 것으로, 구체적으로 세포독성이 낮으면서 멜라닌 세포의 멜라닌 합성을 저해하고, 티로시나제 활성을 저해하고, 멜라닌 생성에 관여하는 인자인 TRP-1, TRP-2, 티로시나제 및 MITF의 발현을 억제함으로써 우수한 피부 미백 효과를 나타낼 수 있는 피부 미백용 조성물, 및 황칠나무 캘러스 추출물을 상기와 같은 우수한 피부 미백 활성을 갖는 물질로 생물전환할 수 있는 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a composition for skin whitening containing a bioconversion product of hwangchil tree callus extract as an active ingredient. A skin whitening composition capable of exhibiting an excellent skin whitening effect by inhibiting the expression of TRP-1, TRP-2, tyrosinase and MITF, which are involved factors, and a Hwangchil tree callus extract as a substance having excellent skin whitening activity as described above It's about biotransformation.
식물 재료의 생리활성에 대한 다양한 연구가 이루어지면서 이들의 특정 생리활성을 여러 분야에서 활용하고 있다. 하지만, 식물 재료의 생산에는 지리적인 문제, 병충해 등 많은 환경적인 요인으로 인한 문제와 수확까지 많은 시간이 소요되는 문제, 재료의 질적인 차이 등의 문제로 재료를 안정적으로 공급하는데 많은 어려움이 있다. 이러한 문제를 해소하기 위해, 캘러스(callus)와 같은 식물세포를 배양하여 이를 재료로 이용하기 위한 기술들이 연구되고 있다. 식물세포를 배양하여 이용할 경우 환경적인 문제를 최소화할 수 있고, 비교적 빠른 시간 내에 생산이 가능하며, 균일한 품질의 재료를 공급받을 수 있다는 장점이 있다.As various studies on the physiological activity of plant materials have been conducted, their specific physiological activity has been utilized in various fields. However, in the production of plant materials, there are many difficulties in stably supplying materials due to problems caused by many environmental factors such as geographical problems, pests and diseases, a problem that takes a long time to harvest, and a difference in quality of materials. In order to solve this problem, techniques for culturing plant cells such as callus and using them as materials have been studied. When plant cells are cultivated and used, environmental problems can be minimized, production is possible in a relatively short time, and materials of uniform quality can be supplied.
한편, 황칠나무(Dendropanax morbifera)는 두릅나무과에 속하는 난대성 상록교목으로, 예부터 이 황칠나무의 수액을 정제하여 염료로 사용하였다. 이 황칠나무는 해독작용 및 간기능 개선에 효과가 있는 것으로 보고된 바 있으며, 이의 추출물을 중금속 인체 축적으로 인한 질환의 치료 및 예방의 용도로 사용하는 기술이 개시된 바 있다.On the other hand, hwangchil tree ( Dendropanax morbifera ) is a temperate evergreen tree belonging to Araliaceae, and since ancient times, the sap of this hwangchil tree has been purified and used as a dye. This hwangchil tree has been reported to be effective in detoxification and liver function improvement, and a technique for using its extract for the treatment and prevention of diseases caused by heavy metal accumulation in the human body has been disclosed.
미백은 기능성 화장품 분야에서 매우 큰 관심을 나타내고 있는 주제로, 자연계의 다양한 물질들로부터 이러한 미백 효과를 발휘할 수 있는 물질의 발굴이 이루어지고 있다. 일반적으로 미백 효과는 멜라닌의 형성을 억제하는 것이 중요하므로, 멜라닌 형성의 조절과 관련된 인자들을 대상으로 하는 실험을 통해 미백 활성을 조사할 수 있다. 이와 관련하여, 멜라닌 생성의 초기 단계에 관여하는 효소인 티로시나제(tyrosinase)의 활성 및/또는 발현에 대한 영향, 그리고 마찬가지로 멜라닌의 생성에 관여하는 것으로 알려진 TRP-1(tyrosinase related protein 1), TRP-2(tyrosinase related protein 2) 및 MITF(microphthalmia associated transcription factor)에 대한 영향을 조사함으로써 후보물질의 미백 효과를 확인할 수 있다.Whitening is a subject of great interest in the field of functional cosmetics, and materials capable of exhibiting such a whitening effect are being discovered from various materials in the natural world. In general, suppressing the formation of melanin is important for a whitening effect, so the whitening activity can be investigated through experiments targeting factors related to the regulation of melanin formation. In this regard, the effect on the activity and / or expression of tyrosinase, an enzyme involved in the early stage of melanin production, and TRP-1 (tyrosinase related protein 1), which is known to be involved in the production of melanin, TRP- 2 (tyrosinase related protein 2) and MITF (microphthalmia associated transcription factor), the whitening effect of the candidate substance can be confirmed.
본 발명자는 생물자원, 특히 황칠나무를 보다 적극적으로 활용하기 위한 기술로서, 상기와 같은 식물세포 배양을 통해 보다 용이하고 안정적으로 공급받을 수 있는 황칠나무 유래 재료를 활용하면서, 특히 친환경적이며 안전한 가공 방법인 미생물의 생물전환을 통해 새로운 생리활성 또는 보다 우수한 생리활성, 특히 피부 미백과 같은 화장품에 유용한 생리활성을 나타내도록 할 수 있는 기술을 개발하고자 하였다.The present inventor is a technology for more actively utilizing biological resources, in particular, Hwangchil tree, using a material derived from Hwangchil tree that can be more easily and stably supplied through plant cell culture as described above, and a particularly environmentally friendly and safe processing method. Through the bioconversion of phosphorus microorganisms, it was attempted to develop a technology capable of exhibiting new physiological activities or better physiological activities, especially useful physiological activities for cosmetics such as skin whitening.
따라서 본 발명의 주된 목적은 황칠나무의 식물세포 배양으로 수득되는 재료를 이용하고 미생물 생물전환을 이용한 새로운 생리활성 조성물로서 우수한 피부 미백 활성을 나타낼 수 있는 피부 미백용 조성물을 제공하는데 있다.Therefore, the main object of the present invention is to provide a skin whitening composition that can exhibit excellent skin whitening activity as a new physiologically active composition using a material obtained by culturing plant cells of Hwangchil tree and using microbial bioconversion.
본 발명의 다른 목적은 미생물을 이용하여 황칠나무의 식물세포 배양으로 수득되는 재료를 우수한 생리활성을 갖는 물질로 생물전환하는 방법을 제공하는데 있다.Another object of the present invention is to provide a method for bioconverting a material obtained by culturing plant cells of Hwangchil tree using microorganisms into a material having excellent physiological activity.
본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 황칠나무 캘러스 추출물을 바실러스 속(Bacillus sp.) JD3-7로 생물전환한 생물전환산물을 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 조성물을 제공한다.According to one aspect of the present invention, the present invention provides a composition for skin whitening containing, as an active ingredient, a bioconversion product obtained by bioconversion of hwangchil tree callus extract to Bacillus sp. JD3-7.
본 발명의 피부 미백용 조성물에 있어서, 상기 황칠나무 캘러스 추출물은 황칠나무 캘러스의 열수추출물인 것이 바람직하다.In the composition for skin whitening of the present invention, the hwangchil tree callus extract is preferably a hot water extract of hwangchil tree callus.
본 발명의 피부 미백용 조성물에 있어서, 상기 생물전환산물은 인산염을 10 내지 100mM로 포함하고 글리세린을 0.5 내지 5%(w/v)로 포함하고 pH가 6.5 내지 8인 반응액 중에서 생물전환한 것이 바람직하다.In the skin whitening composition of the present invention, the bioconversion product is bioconverted in a reaction solution containing phosphate at 10 to 100 mM and glycerin at 0.5 to 5% (w/v) and having a pH of 6.5 to 8. desirable.
본 발명의 피부 미백용 조성물에 있어서, 상기 생물전환산물은 상기 황칠나무 캘러스 추출물을 500 내지 600㎎/ℓ로 포함하고 상기 바실러스 속 JD3-7의 균체를 2.5 내지 3g/ℓ로 포함하는 반응액 중에서 생물전환한 것이 바람직하다.In the skin whitening composition of the present invention, the bioconversion product is a reaction solution containing 500 to 600 mg / L of the hwangchil tree callus extract and 2.5 to 3 g / L of the cells of the genus Bacillus JD3-7 Preferably bioconverted.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 황칠나무 캘러스 추출물과 바실러스 속(Bacillus sp.) JD3-7의 균체를 혼합하여 생물전환 반응용 조성물을 생성하는 단계; 및 상기 생물전환 반응용 조성물을 항온처리하는 단계;를 포함하는 황칠나무 캘러스 추출물의 생물전환 방법을 제공한다.According to another aspect of the present invention, the present invention comprises the step of producing a composition for bioconversion reaction by mixing the hwangchil tree callus extract and the cells of the genus Bacillus ( Bacillus sp.) JD3-7; And incubating the composition for bioconversion reaction; it provides a method for bioconversion of hwangchil tree callus extract comprising.
본 발명의 황칠나무 캘러스 추출물의 생물전환 방법에 있어서, 상기 황칠나무 캘러스 추출물은 황칠나무 캘러스의 열수추출물인 것이 바람직하다.In the method for bioconversion of hwangchil tree callus extract of the present invention, the hwangchil tree callus extract is preferably a hot water extract of hwangchil tree callus.
본 발명의 황칠나무 캘러스 추출물의 생물전환 방법에 있어서, 상기 생물전환 반응용 조성물을 생성하는 단계는 인산염을 10 내지 100mM로 포함하고 글리세린을 0.5 내지 5%(w/v)로 포함하고 pH가 6.5 내지 8이 되도록 생물전환 반응용 조성물을 생성하는 단계인 것이 바람직하다.In the bioconversion method of H. hwangchil tree callus extract of the present invention, the step of generating the composition for bioconversion includes phosphate at 10 to 100 mM, glycerin at 0.5 to 5% (w/v), and pH is 6.5. It is preferably a step of generating a composition for bioconversion reaction so that it is 8 to 8.
본 발명의 황칠나무 캘러스 추출물의 생물전환 방법에 있어서, 상기 생물전환 반응용 조성물을 생성하는 단계는 상기 황칠나무 캘러스 추출물을 500 내지 600㎎/ℓ로 포함하고 상기 바실러스 속 JD3-7의 균체를 2.5 내지 3g/ℓ로 포함하도록 생물전환 반응용 조성물을 생성하는 단계인 것이 바람직하다.In the bioconversion method of H. hwangchil tree callus extract of the present invention, the step of generating the bioconversion reaction composition includes the H. hwangchil tree callus extract at 500 to 600 mg / L and the Bacillus JD3-7 cells at 2.5 It is preferably a step of generating a composition for bioconversion reaction to contain from 3 g / ℓ.
본 발명의 피부 미백용 조성물은 황칠나무의 캘러스(callus)를 이용하여 제조되는 것으로서 보다 안정적인 생산이 가능하고 세포독성이 낮으면서 멜라닌 세포의 멜라닌 합성을 저해하고, 티로시나제 활성을 저해하고, 멜라닌 생성에 관여하는 인자인 TRP-1, TRP-2, 티로시나제 및 MITF의 발현을 억제함으로써 우수한 피부 미백 효과를 나타낼 수 있다. 또한 본 발명의 생물전환방법에 따르면 황칠나무의 캘러스 추출물을 상기와 같이 우수한 피부 미백 활성을 갖는 물질로 생물전환할 수 있다.The skin whitening composition of the present invention is prepared using the callus of Hwangchil tree, and can be produced more stably, has low cytotoxicity, inhibits melanin synthesis in melanocytes, inhibits tyrosinase activity, and inhibits melanin production. By inhibiting the expression of TRP-1, TRP-2, tyrosinase, and MITF, which are related factors, an excellent skin whitening effect can be exhibited. In addition, according to the bioconversion method of the present invention, the callus extract of hwangchil tree can be bioconverted into a substance having excellent skin whitening activity as described above.
도 1은 본 발명에서 생물전환 균주로 사용되는 바실러스 속(Bacillus sp.) JD3-7 균주의 미생물 수탁증을 나타낸다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 황칠나무 캘러스 추출물의 생물전환산물(황칠BR)을 생물전환 이전의 황칠나무 캘러스 추출물(황칠)과 비교하여 HPLC로 분석한 결과이다. 'B. sp. JD3-7'은 추출물이 포함되지 않은 반응액(대조군)의 HPLC 분석 결과.
도 3은 B16F10 세포를 대상으로 본 발명의 일 실시예에 따른 생물전환산물(황칠 BR)의 세포 독성을 생물전환 이전의 추출물(황칠)과 비교하여 실험한 결과이다. 결과를 대조군에서 얻은 값에 비교한 백분율로 나타냄. 결과값을 평균±표준편차로 나타냄.
도 4는 B16F10 세포에서 본 발명의 일 실시예에 따른 생물전환산물(황칠 BR)의 멜라닌 합성 억제 활성을 생물전환 이전의 추출물(황칠)과 비교하여 실험한 결과이다. 결과값을 평균±표준편차로 나타냄.
도 5는 B16F10 세포에서 본 발명의 일 실시예에 따른 생물전환산물(황칠 BR)의 티로시나제 활성 저해 활성을 생물전환 이전의 추출물(황칠)과 비교하여 실험한 결과이다. 결과값을 평균±표준편차로 나타냄.
도 6은 B16F10 세포에서 본 발명의 일 실시예에 따른 생물전환산물(DMBR)의 TRP-1(tyrosinase related protein 1) 발현 억제 활성을 생물전환 이전의 추출물(DM)과 비교하여 실험한 결과이다. β-엑틴을 대조군으로 사용함. 결과값을 평균±표준편차로 나타냄.
도 7은 B16F10 세포에서 본 발명의 일 실시예에 따른 생물전환산물(DMBR)의 TRP-2(tyrosinase related protein 2) 발현 억제 활성을 생물전환 이전의 추출물(DM)과 비교하여 실험한 결과이다. β-엑틴을 대조군으로 사용함. 결과값을 평균±표준편차로 나타냄.
도 8은 B16F10 세포에서 본 발명의 일 실시예에 따른 생물전환산물(DMBR)의 티로시나제 발현 억제 활성을 생물전환 이전의 추출물(DM)과 비교하여 실험한 결과이다. β-엑틴을 대조군으로 사용함. 결과값을 평균±표준편차로 나타냄.
도 9는 B16F10 세포에서 본 발명의 일 실시예에 따른 생물전환산물(DMBR)의 MITF(microphthalmia associated transcription factor) 발현 억제 활성을 생물전환 이전의 추출물(DM)과 비교하여 실험한 결과이다. β-엑틴을 대조군으로 사용함. 결과값을 평균±표준편차로 나타냄.Figure 1 shows the microbial accession of the Bacillus sp. JD3-7 strain used as a bioconversion strain in the present invention.
Figure 2 is a result of HPLC analysis by comparing the bioconversion product (Hwangchil BR) of Hwangchil tree callus extract according to an embodiment of the present invention with Hwangchil tree callus extract (Hwangchil) before bioconversion. 'B. sp. JD3-7' is the HPLC analysis result of the reaction solution (control group) without the extract.
Figure 3 is the result of the experiment by comparing the cytotoxicity of the bioconversion product (Hwangchil BR) according to an embodiment of the present invention to the extract (Hwangchil) before bioconversion to B16F10 cells. Results are expressed as percentages compared to values obtained in the control group. Results are expressed as mean ± standard deviation.
Figure 4 is the result of the experiment by comparing the melanin synthesis inhibitory activity of the bioconversion product (Hwangchil BR) according to an embodiment of the present invention in B16F10 cells with the extract (Hwangchil) before bioconversion. Results are expressed as mean ± standard deviation.
Figure 5 is the result of the experiment by comparing the tyrosinase activity inhibitory activity of the bioconversion product (Hwangchil BR) according to an embodiment of the present invention in B16F10 cells with the extract (Hwangchil) before bioconversion. Results are expressed as mean ± standard deviation.
Figure 6 is the result of the experiment by comparing the TRP-1 (tyrosinase related protein 1) expression inhibitory activity of the bioconversion product (DMBR) according to an embodiment of the present invention in B16F10 cells with the extract (DM) before bioconversion. β-actin was used as a control. Results are expressed as mean ± standard deviation.
Figure 7 is the result of the experiment by comparing the TRP-2 (tyrosinase related protein 2) expression inhibitory activity of the bioconversion product (DMBR) according to an embodiment of the present invention in B16F10 cells with the extract (DM) before bioconversion. β-actin was used as a control. Results are expressed as mean ± standard deviation.
Figure 8 is the result of the experiment by comparing the tyrosinase expression inhibitory activity of the bioconversion product (DMBR) according to an embodiment of the present invention in B16F10 cells with the extract (DM) before bioconversion. β-actin was used as a control. Results are expressed as mean ± standard deviation.
Figure 9 is an experimental result by comparing the activity of the microphthalmia associated transcription factor (MITF) expression inhibitory activity of the bioconversion product (DMBR) according to an embodiment of the present invention in B16F10 cells with the extract (DM) before bioconversion. β-actin was used as a control. Results are expressed as mean ± standard deviation.
본 발명의 피부 미백용 조성물은 황칠나무 캘러스 추출물을 바실러스 속(Bacillus sp.) JD3-7로 생물전환한 생물전환산물을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 한다.The composition for skin whitening of the present invention is characterized in that it contains a bioconversion product obtained by bioconversion of hwangchil tree callus extract to Bacillus sp. JD3-7 as an active ingredient.
본 발명의 황칠나무 캘러스는 황칠나무를 대상으로 통상의 캘러스 유도 방법을 통해 수득할 수 있다. 바람직하게는 황칠나무의 성숙 종자로부터 유도된 캘러스이다.Hwangchil tree callus of the present invention can be obtained through a conventional callus induction method for Hwangchil tree. It is preferably a callus derived from mature seeds of Hwangchil tree.
본 발명의 황칠나무 캘러스 추출물은 황칠나무 캘러스를 추출 원료로 사용한 통상의 추출 방법을 통해 수득할 수 있다. 예를 들어, 용매를 사용한 열탕 추출, 초음파 추출, 환류 추출 등 당업계의 통상적인 추출 방법으로 제조될 수 있다. 바람직하게는 물, C1 내지 C4의 저급 알코올 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 용매를 사용하여 추출한 것이며, 보다 바람직하게는 물, 에탄올 또는 이들의 혼합 용매로 추출한 것이며, 보다 바람직하게는 물 또는 물과 에탄올의 혼합 용매로 추출한 것이며, 보다 바람직하게는 물로 추출한 것이다.Hwangchil tree callus extract of the present invention can be obtained through a conventional extraction method using Hwangchil tree callus as an extraction raw material. For example, it may be prepared by conventional extraction methods in the art, such as hot water extraction using a solvent, ultrasonic extraction, and reflux extraction. It is preferably extracted using a solvent selected from the group consisting of water, C1 to C4 lower alcohols and mixtures thereof, more preferably extracted with water, ethanol or a mixed solvent thereof, more preferably water or water It is extracted with a mixed solvent of and ethanol, more preferably extracted with water.
본 발명의 황칠나무 캘러스 추출물 제조 시 바람직하게는 추출 원료인 황칠나무 캘러스를 건조하여 사용하며, 보다 바람직하게는 건조한 다음 분말화하여 사용한다. 또한 추출물 제조 시 사용하는 용매의 양은 추출 원료, 즉 황칠나무 캘러스의 중량(예를 들어, 건조 중량) 1g 기준 바람직하게는 500㎖ 내지 1.5ℓ, 보다 바람직하게는 800㎖ 내지 1.2ℓ로 한다. 추출 온도는 바람직하게는 100 내지 130℃, 보다 바람직하게는 110 내지 125℃로 한다. 추출 시간은 바람직하게는 20 내지 45분 동안, 보다 바람직하게는 30 내지 40분 동안으로 한다.In preparing the hwangchil tree callus extract of the present invention, it is preferable to dry and use Hwangchil tree callus, which is an extraction raw material, and more preferably to use after drying and then powdering. In addition, the amount of the solvent used in preparing the extract is preferably 500 ml to 1.5 L, more preferably 800 ml to 1.2 L based on 1 g of the weight (eg, dry weight) of the extraction raw material, that is, Hwangchil tree callus. The extraction temperature is preferably 100 to 130°C, more preferably 110 to 125°C. The extraction time is preferably 20 to 45 minutes, more preferably 30 to 40 minutes.
본 발명의 추출물은 상기와 같은 추출 과정 이후 여과, 농축, 감압건조, 동결건조 등의 과정을 추가로 거친 것일 수 있다.The extract of the present invention may be further subjected to processes such as filtration, concentration, vacuum drying, and lyophilization after the above extraction process.
상기와 같은 추출 조건에 따른 추출물의 적용은 본 발명에서 목적으로 하는 효과가 보다 안정적이며 보다 좋게 발현되도록 할 수 있다.The application of the extract according to the above extraction conditions can ensure that the desired effect in the present invention is expressed more stably and better.
본 발명의 생물전환에 사용되는 균주인 바실러스 속 JD3-7은 2021년 4월 27일자로 출원된 한국특허출원 제10-2021-0054567호에 개시된 균주로, 상기 특허출원의 내용 전체는 참조에 의해 본 명세서에 원용된다. 상기 균주는 제주도의 콩 재래 간장으로부터 분리된 것으로 국립농업과학원 미생물은행(Korean Agricultural Culture Collection, KACC)에 수탁번호 KACC 92346P로 기탁되어 있다(도 1). JD3-7 균주는 16S rRNA 유전자 염기서열을 바탕으로 바실러스 아밀로리퀘파시엔스(Bacillus amyloliquefacience), 바실러스 시아멘시스(B. siamensis) 및 바실러스 벨레젠시스(B. velezensis)와 같은 계통으로 분류되며, 특히 바실러스 시아멘시스와 유사한 것으로 분류되지만(표 1), 생화학적 특성에서 명확한 차이가 있다(표 2).Bacillus genus JD3-7, which is a strain used for bioconversion of the present invention, is a strain disclosed in Korean Patent Application No. 10-2021-0054567 filed on April 27, 2021, the entire content of which is by reference incorporated herein by reference. The strain was isolated from conventional soybean sauce in Jeju Island and deposited in the Korean Agricultural Culture Collection (KACC) under accession number KACC 92346P (FIG. 1). The JD3-7 strain is classified into lineages such as Bacillus amyloliquefacience , Bacillus siamensis and Bacillus velezensis based on the 16S rRNA gene sequence, In particular, it is classified as similar to Bacillus siamensis (Table 1), but there are clear differences in biochemical properties (Table 2).
JD3-7 균주는 바실러스 속의 미생물을 배양하는 통상의 배양조건에 따라 배양할 수 있다. 예를 들어 LB(Luria Bertani) 배지 또는 NB(nutrient broth) 배지에서 25 내지 35℃의 온도조건으로 배양할 수 있다.The JD3-7 strain can be cultured according to conventional culture conditions for culturing microorganisms of the genus Bacillus. For example, it may be cultured in a temperature condition of 25 to 35° C. in LB (Luria Bertani) medium or NB (nutrient broth) medium.
본 발명의 생물전환산물은 황칠나무 캘러스 추출물을 JD3-7 균주로 생물전환한 것으로, 미생물을 사용하여 대상 물질을 생물전환하기 위해 사용되는 통상의 생물전환 방식을 사용하여 수득할 수 있다. 예를 들어 황칠나무 캘러스 추출물과 바실러스 속 JD3-7 균주의 균체가 혼합된 조성물, 즉 생물전환이 이루어지도록 하기 위한 생물전환 반응용 조성물을 제조하고, 이 조성물을 항온 처리하는 방식으로 수득할 수 있다.The bioconversion product of the present invention is obtained by bioconversion of hwangchil tree callus extract into JD3-7 strain, and can be obtained using a conventional bioconversion method used for bioconversion of a target material using microorganisms. For example, it can be obtained by preparing a composition in which a hwangchil tree callus extract and the cells of the JD3-7 strain of Bacillus are mixed, that is, a composition for bioconversion reaction to achieve bioconversion, and incubating the composition. .
이때 바람직하게는 생물전환 반응용 조성물의 초기 pH를 맞추고 이후 반응 시 조성물 중의 pH 변화를 조절할 수 있도록 생물전환 반응용 조성물에 pH 완충제가 포함된다. 바람직하게는 생물전환 반응용 조성물의 초기 pH가 6.5 내지 8, 보다 바람직하게는 pH 7 내지 7.5가 되고, 생물전환 반응 중에 상기 pH가 유지될 수 있도록 pH 완충제가 포함된다. 바람직하게는 완충제로 인산염(phosphate)이 포함되며, 바람직하게는 10 내지 100mM의 농도로 인산염이 포함되고, 보다 바람직하게는 20 내지 80mM의 농도로, 보다 바람직하게는 30 내지 70mM의 농도로, 보다 바람직하게는 40 내지 60mM의 농도로 인산염이 포함된다. 바람직하게는 완충제와 함께 글리세린(glycerin)이 포함되며, 바람직하게는 0.5 내지 5%(v/v)의 농도로, 보다 바람직하게는 1 내지 3%(v/v)의 농도로, 보다 바람직하게는 1.5 내지 2.5%(v/v)의 농도로 글리세린이 포함된다.At this time, preferably, a pH buffering agent is included in the composition for bioconversion reaction to adjust the initial pH of the composition for bioconversion reaction and to adjust the pH change in the composition during the subsequent reaction. Preferably, the initial pH of the composition for bioconversion reaction is 6.5 to 8, more preferably pH 7 to 7.5, and a pH buffer is included so that the pH can be maintained during the bioconversion reaction. Preferably, phosphate is included as a buffer, preferably at a concentration of 10 to 100 mM, more preferably at a concentration of 20 to 80 mM, more preferably at a concentration of 30 to 70 mM, and more preferably at a concentration of 30 to 70 mM. Phosphate is preferably included at a concentration of 40 to 60 mM. Preferably, glycerin is included together with a buffer, preferably at a concentration of 0.5 to 5% (v / v), more preferably at a concentration of 1 to 3% (v / v), more preferably contains glycerin at a concentration of 1.5 to 2.5% (v/v).
또한 이때 바람직하게는 생물전환 반응용 조성물에 황칠나무 캘러스 추출물이 400 내지 650㎎/ℓ, 보다 바람직하게는 500 내지 600㎎/ℓ로 포함된다. 바실러스 속 JD3-7의 균체는 바람직하게는 2 내지 4g/ℓ, 보다 바람직하게는 2.5 내지 3g/ℓ로 포함된다.In addition, at this time, the Hwangchil tree callus extract is preferably included in the bioconversion composition at 400 to 650 mg/L, more preferably at 500 to 600 mg/L. Bacillus JD3-7 cells are contained preferably at 2 to 4 g/L, more preferably at 2.5 to 3 g/L.
생물전환산물을 수득하기 위한 생물전환 반응용 조성물의 항온 처리는 바람직하게는 20 내지 40℃, 보다 바람직하게는 25 내지 35℃, 보다 바람직하게는 27 내지 33℃, 보다 바람직하게는 29 내지 31℃의 항온처리 온도로 수행하며, 바람직하게는 1시간 내지 10일 동안, 보다 바람직하게는 12시간 내지 7일 동안, 보다 바람직하게는 1 내지 5일 동안, 보다 바람직하게는 2 내지 4일 동안의 항온처리 시간으로 수행한다.The incubation of the composition for bioconversion reaction to obtain a bioconversion product is preferably from 20 to 40°C, more preferably from 25 to 35°C, more preferably from 27 to 33°C, more preferably from 29 to 31°C. The incubation temperature is preferably 1 hour to 10 days, more preferably 12 hours to 7 days, more preferably 1 to 5 days, more preferably 2 to 4 days. Do it with processing time.
상기와 같은 생물전환 반응 조건에 따른 생물전환산물의 적용은 본 발명에서 목적으로 하는 효과가 보다 안정적이며 보다 좋게 발현되도록 할 수 있다.Application of the bioconversion product according to the bioconversion reaction conditions as described above can make the desired effect in the present invention more stable and better expressed.
본 발명의 피부 미백용 조성물은 조성물의 형태, 적용 방식 등의 다양한 목적에 따라 본 발명의 황칠나무 캘러스 추출물의 생물전환산물을 다양한 정도로 포함할 수 있다. 바람직하게는 세포 독성에 대해 안전한 것으로 실험적으로 확인되었으며 미백 효과 또한 실험적으로 확인된 5 내지 25㎍/㎖의 실험 농도를 기준으로, 피부 세포에 상기 농도의 본 발명의 황칠나무 캘러스 추출물의 생물전환산물이 적용될 수 있도록 포함된다.The composition for skin whitening of the present invention may contain the bioconversion product of the H. hwangchil tree callus extract of the present invention to various degrees depending on various purposes such as the shape of the composition and the method of application. Preferably, based on an experimental concentration of 5 to 25 μg / ml, which was experimentally confirmed to be safe for cytotoxicity and also experimentally confirmed to have a whitening effect, the bioconversion product of the hwangchil tree callus extract of the present invention at the concentration above in skin cells included for this to apply.
본 발명의 피부 미백용 조성물은 본 발명의 황칠나무 캘러스 추출물의 생물전환산물 만을 유효성분으로 함유할 수 있으며, 또한 다른 피부 미백 활성 물질을 함께 함유할 수도 있다.The composition for skin whitening of the present invention may contain only the bioconversion product of the hwangchil tree callus extract of the present invention as an active ingredient, and may also contain other skin whitening active substances together.
일 실시형태에서, 본 발명의 피부 미백용 조성물은 본 발명의 황칠나무 캘러스 추출물의 생물전환산물 만을 유효성분으로 함유하며, 다른 피부 미백 활성 물질, 예를 들어 기존에 피부 미백 활성이 알려진 화합물, 황칠나무가 아닌 다른 재료 유래의 피부 미백 활성 물질 및/또는 황칠나무 유래이지만 본 발명과 같은 생물전환을 거치지 않거나 다르게(예를 들어, 다른 미생물을 사용하여) 가공된 피부 미백 활성 물질을 함유하지 않는다.In one embodiment, the skin whitening composition of the present invention contains only the bioconversion product of the hwangchil tree callus extract of the present invention as an active ingredient, and other skin whitening active substances, for example, a compound known to have skin whitening activity, hwangchil It does not contain skin lightening active substances derived from materials other than wood and / or skin lightening active substances derived from Hwangchil tree but not subjected to bioconversion or otherwise processed (eg, using other microorganisms) as in the present invention.
다른 실시형태에서, 본 발명의 피부 미백용 조성물은 본 발명의 황칠나무 캘러스 추출물의 생물전환산물과 함께 다른 피부 미백 활성 물질, 예를 들어 기존에 피부 미백 활성이 알려진 화합물, 황칠나무가 아닌 다른 재료 유래의 피부 미백 활성 물질 및/또는 황칠나무 유래이지만 본 발명과 같은 생물전환을 거치지 않거나 다르게(예를 들어, 다른 미생물을 사용하여) 가공된 피부 미백 활성 물질을 더 함유한다.In another embodiment, the skin whitening composition of the present invention is a bioconversion product of the hwangchil tree callus extract of the present invention along with other skin whitening active substances, for example, compounds previously known to have skin whitening activity, materials other than Hwangchil tree It further contains a skin whitening active substance derived from and/or a skin whitening active substance derived from Hwangchil tree but not subjected to bioconversion as in the present invention or processed differently (eg, using other microorganisms).
본 발명의 피부 미백용 조성물은 피부 미백용 화장료 조성물일 수 있다. 이 경우 조성물은 본 발명의 황칠나무 캘러스 추출물의 생물전환산물 만으로 이루어질 수 있으며, 이 밖에 화장품학적으로 허용된 성분을 더 포함할 수 있다.The composition for skin whitening of the present invention may be a cosmetic composition for skin whitening. In this case, the composition may consist only of the bioconversion product of the hwangchil tree callus extract of the present invention, and may further include cosmetically acceptable ingredients.
본 발명의 피부 미백용 화장료 조성물은 이 분야에서 통상적으로 제조하는 제형으로 제조될 수 있다. 예를 들어 용액, 현탁액, 에멀션, 분말, 페이스트, 겔, 크림 등으로 제형화될 수 있으나, 이로 제한되지 않는다. 보다 구체적으로는 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 폼, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.The cosmetic composition for skin whitening of the present invention may be prepared in a formulation commonly prepared in the field. For example, it may be formulated as a solution, suspension, emulsion, powder, paste, gel, cream, etc., but is not limited thereto. More specifically, it may be prepared in the form of flexible lotion, nutrient lotion, nutrient cream, massage cream, essence, eye cream, cleansing cream, cleansing foam, cleansing water, pack, spray or powder.
본 발명의 피부 미백용 화장료 조성물은 단독으로, 또는 다른 피부용 제품과 병용하여 사용할 수 있을 것이다.The cosmetic composition for skin whitening of the present invention may be used alone or in combination with other skin products.
본 발명의 생물전환 방법은 우수한 피부 미백 효과를 나타낼 수 있는 본 발명의 황칠나무 캘러스 추출물의 생물전환산물을 제조할 수 있는 방법으로서, 황칠나무 캘러스 추출물과 바실러스 속 JD3-7의 균체를 혼합하여 생물전환 반응용 조성물을 생성하는 단계; 및 상기 생물전환 반응용 조성물을 항온처리하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 한다.The bioconversion method of the present invention is a method for preparing a bioconversion product of the hwangchil tree callus extract of the present invention, which can exhibit an excellent skin whitening effect, by mixing the hwangchil tree callus extract and the cells of the genus Bacillus JD3-7. generating a composition for a conversion reaction; and incubating the composition for bioconversion reaction.
본 발명의 생물전환 방법에서 황칠나무 캘러스 추출물에 관한 사항 및 바실러스 속 JD3-7에 관한 사항은 위에서 설명한 바와 같다.In the bioconversion method of the present invention, the matters related to the hwangchil tree callus extract and the Bacillus genus JD3-7 are as described above.
상기 생물전환 반응용 조성물을 생성하는 단계에서 바람직하게는 물을 기반으로 하는 용매 중에서 상기 황칠나무 캘러스 추출물과 바실러스 속 JD3-7의 균체가 혼합되도록 한다. 바람직하게는 생물전환 반응용 조성물 중의 pH 변화를 조절할 수 있도록 pH 완충제를 포함시켜 생물전환 반응용 조성물을 생성한다. 예를 들어, 황칠나무 캘러스 추출물 및 바실러스 속 JD3-7의 균체와 함께 pH 완충액을 혼합하여 생물전환 반응용 조성물을 생성한다.In the step of generating the composition for the bioconversion reaction, preferably, the hwangchil tree callus extract and the cells of the genus JD3-7 of Bacillus are mixed in a water-based solvent. Preferably, the composition for bioconversion reaction is produced by including a pH buffer so as to control the pH change in the composition for bioconversion reaction. For example, a composition for bioconversion reaction is created by mixing a pH buffer with H. hwangchil tree callus extract and the cells of the genus Bacillus JD3-7.
바람직하게는 생물전환 반응용 조성물의 초기 pH가 6.5 내지 8, 보다 바람직하게는 pH 7 내지 7.5가 되고, 생물전환 반응 중에 상기 pH가 유지될 수 있도록 pH 완충제를 포함시킨다. 바람직하게는 완충제로 인산염(phosphate)을 사용하며, 바람직하게는 생물전환 반응용 조성물의 인산염 농도가 10 내지 100mM이 되도록, 보다 바람직하게는 20 내지 80mM이 되도록, 보다 바람직하게는 30 내지 70mM이 되도록, 보다 바람직하게는 40 내지 60mM이 되도록 한다. 바람직하게는 생물전환 반응용 조성물에 완충제와 함께 글리세린(glycerin)을 포함시킨다. 바람직하게는 생물전환 반응용 조성물의 글리세린 농도가 0.5 내지 5%(v/v)가 되도록, 보다 바람직하게는 1 내지 3%(v/v)가 되도록, 보다 바람직하게는 1.5 내지 2.5%(v/v)가 되도록 한다.Preferably, the initial pH of the composition for bioconversion reaction is 6.5 to 8, more preferably pH 7 to 7.5, and a pH buffer is included so that the pH can be maintained during the bioconversion reaction. Preferably, phosphate is used as a buffer, and the phosphate concentration of the composition for bioconversion reaction is preferably 10 to 100 mM, more preferably 20 to 80 mM, and more preferably 30 to 70 mM. , more preferably 40 to 60 mM. Preferably, glycerin is included in the composition for bioconversion reaction together with a buffer. Preferably, the glycerin concentration of the bioconversion reaction composition is 0.5 to 5% (v / v), more preferably 1 to 3% (v / v), more preferably 1.5 to 2.5% (v / v) /v).
또한, 상기 생물전환 반응용 조성물을 생성하는 단계에서 바람직하게는 생물전환 반응용 조성물에 황칠나무 캘러스 추출물이 400 내지 650㎎/ℓ, 보다 바람직하게는 500 내지 600㎎/ℓ로 포함되도록 한다. 바실러스 속 JD3-7의 균체는 바람직하게는 2 내지 4g/ℓ, 보다 바람직하게는 2.5 내지 3g/ℓ로 포함되도록 한다.In addition, in the step of generating the composition for bioconversion reaction, preferably, the Hwangchil tree callus extract is included in the composition for bioconversion reaction at 400 to 650 mg/L, more preferably at 500 to 600 mg/L. Bacillus JD3-7 cells are preferably included in an amount of 2 to 4 g/L, more preferably 2.5 to 3 g/L.
상기와 같은 조건에 따라 생물전환 반응용 조성물을 생성하면 본 발명에서 의도하는 생물전환, 즉 우수한 피부 미백 활성을 갖는 생물전환산물이 생성되도록 하는 생물전환이 보다 효율적으로 이루어지도록 할 수 있다.If the composition for bioconversion reaction is produced according to the above conditions, the bioconversion intended in the present invention, that is, the bioconversion to produce a bioconversion product having excellent skin whitening activity can be performed more efficiently.
상기 항온처리하는 단계에서 바람직하게는 20 내지 40℃, 보다 바람직하게는 25 내지 35℃, 보다 바람직하게는 27 내지 33℃, 보다 바람직하게는 29 내지 31℃로 항온처리한다. 또한, 바람직하게는 1시간 내지 10일 동안, 보다 바람직하게는 12시간 내지 7일 동안, 보다 바람직하게는 1 내지 5일 동안, 보다 바람직하게는 2 내지 4일 동안 항온처리한다. 이러한 조건에 따르면 본 발명에서 의도하는 생물전환이 보다 효율적으로 이루어지도록 할 수 있다.In the above incubation step, the incubation is performed at preferably 20 to 40°C, more preferably 25 to 35°C, more preferably 27 to 33°C, more preferably 29 to 31°C. Further, the incubation is preferably performed for 1 hour to 10 days, more preferably for 12 hours to 7 days, more preferably for 1 to 5 days, and even more preferably for 2 to 4 days. According to these conditions, the bioconversion intended in the present invention can be performed more efficiently.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail through examples. Since these examples are intended to illustrate the present invention only, the scope of the present invention is not to be construed as being limited by these examples.
[실시예][Example]
실시예 1. 황칠나무 캘러스 추출물의 생물전환산물 제조Example 1. Preparation of Bioconversion Products of Hwangchil Tree Callus Extract
1-1. 황칠나무 캘러스 추출물 제조1-1. Hwangchil tree callus extract manufacturing
황칠나무(Dendropanax morbiferus) 캘러스(callus)를 한국생명공학연구원 생물자원센터로부터 제공받았다. 황칠나무 성숙 종자의 표면을 75% 에탄올을 이용하여 살균한 후, 5±1㎜로 절취하여 영양물질과 호르몬을 보완한 다음와 같은 조성의 배지와 24℃ 조건에서 약 20일간 암배양하여 황칠나무 성숙 종자로부터 캘러스를 유도하였다: 0.215%(w/v) Murashige & Skoog 배지, 미오-이노시톨(myo-inositol), 3%(w/v) 수크로스(sucrose), 0.4%(w/v) 겔라이트(gelrite)(Duchefa Biochemie, 네덜란드 하를렘 소재), 0.4㎎/ℓ 티아민 HCl(thiamine HCl), 2,4-다이클로로페녹시아세트산(2,4-dichlorophenoxyacetic acid, 2,4-D), 1㎎/ℓ 6-벤질아미노퓨린(6-benzylaminopurine)(Sigma-Aldrich, 미국 미주리주 세인트루이스 소재). Dendropanax morbiferus callus was provided by the Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology, Biological Resources Center. After sterilizing the surface of mature Hwangchil tree seeds using 75% ethanol, cut them into 5±1 mm, supplement nutrients and hormones, and culture them in the dark for about 20 days at 24℃ for about 20 days to mature Hwangchil tree. Callus was induced from the seeds: 0.215% (w/v) Murashige & Skoog medium, myo-inositol, 3% (w/v) sucrose, 0.4% (w/v) Gelite (gelrite) (Duchefa Biochemie, Haarlem, The Netherlands), 0.4 mg/L thiamine HCl, 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D), 1 mg/L L 6-benzylaminopurine (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO).
효과적인 생장조절을 위해서 상기와 같은 조성의 배지를 사용하여 6개월간 한 달 주기로 계대배양하였으며 24℃ 조건에서 암배양하였다. 배양된 캘러스를 건조 분쇄한 다음 분쇄물 1g에 증류수 1ℓ를 첨가하고 121℃에서 추출하였다. 추출액을 페이퍼 필터(paper filter, ADVANTEC, 일본 도쿄 소재)로 여과한 후 감압 농축하고 -110℃에서 동결 건조하여 분말화하였다. DMSO(dimethyl sulfoxide, Sigma Aldrich, 미국 미주리주 세인트루이스 소재)를 용매로 사용하여 100mM 스톡(stock)을 제조하고 이후 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's medium, Welgene, 한국 경산 소재)으로 희석하여 5, 10 및 25㎍/㎖ 농도로 실험을 진행하였다.For effective growth control, subcultures were subcultured at a monthly cycle for 6 months using the medium of the above composition, and cultured in the dark at 24 ° C. The cultured callus was dried and pulverized, and 1 liter of distilled water was added to 1 g of the pulverized product, followed by extraction at 121°C. The extract was filtered with a paper filter (ADVANTEC, Tokyo, Japan), concentrated under reduced pressure, and lyophilized at -110 ° C to powder. A 100 mM stock was prepared using DMSO (dimethyl sulfoxide, Sigma Aldrich, St. Louis, Missouri, USA) as a solvent, and then diluted with DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's medium, Welgene, Gyeongsan, Korea) to obtain 5, 10, and 25 μg The experiment was conducted at a concentration of / ml.
1-2. 생물전환 미생물 준비 및 생물전환 반응1-2. Preparation of bioconversion microorganisms and bioconversion reactions
생물전환 미생물로 바실러스 속(Bacillus sp.) JD3-7 균주(KACC 92346P)를 사용하였다. JD3-7 균주를 영양 액체 배지(nutrient broth)(0.3% beef extract, 0.5% peptone)(Thermo Fisher Scientific, 영국 햄프셔 소재)에서 37℃, 200rpm으로 18시간 동안 배양하고 4,500rpm으로 15분 동안 원심분리하여 미생물 펠렛을 수득한 후 PG 완충액(50mM Phosphate buffer, 2% Glycerin, pH 7.2)으로 3회 세척하였다. PG 완충액에 미생물 펠렛을 2.5g/ℓ의 농도로 현탁하고 상기 1-1의 황칠나무 캘러스 추출물 건조 시료 100㎎을 미생물 현탁액 200㎖에 혼합하여 30℃에서 72시간 동안 생물전환하였다. 이후 원심분리하여 얻은 상등액을 감압 농축하고 -110℃에서 동결건조하여 분말화한 후 실험에 사용하였다. Bacillus sp. JD3-7 strain (KACC 92346P) was used as a bioconversion microorganism. The JD3-7 strain was cultured in nutrient broth (0.3% beef extract, 0.5% peptone) (Thermo Fisher Scientific, Hampshire, UK) at 37°C at 200 rpm for 18 hours and centrifuged at 4,500 rpm for 15 minutes. After obtaining a microbial pellet, it was washed three times with PG buffer (50 mM Phosphate buffer, 2% Glycerin, pH 7.2). Microbial pellets were suspended in PG buffer at a concentration of 2.5 g/L, and 100 mg of the dry sample of H. hwangchil tree callus extract of 1-1 was mixed with 200 ml of the microbial suspension, followed by bioconversion at 30° C. for 72 hours. Then, the supernatant obtained by centrifugation was concentrated under reduced pressure and lyophilized at -110 ° C. to be powdered and used in the experiment.
실시예 2. 생물전환산물의 HPLC 분석Example 2. HPLC analysis of bioconversion products
황칠나무 캘러스 추출물의 생물전환을 확인하기 위하여 LC-2030C PLUS UV(Shimadzu, 일본 교토 소재) HPLC 분석 기기를 사용하고 Shim-pack GIS C18 컬럼(5㎛ ODS, 250×4.6㎜ id, Sigma-Aldrich)을 이용하였다. 이동상으로는 0.1% TFA(trifluoroacetic acid, SAMCHUN, 한국 소재)를 함유한 H2O(A 용매)와 아세토니트릴(acetonitrile, B 용매, Sigma-Aldrich, 미국 세인트루이스 소재)을 사용하여 0분에서 30분까지 B 용매를 10%에서 100%로 증가시키는 구배 조건으로 분석하였으며 컬럼 온도는 40℃, 유속은 1.0㎖/분으로 설정하고 254㎚의 파장에서 검출하였다.To confirm the bioconversion of H. hwangchil tree callus extract, LC-2030C PLUS UV (Shimadzu, Kyoto, Japan) HPLC analysis instrument was used and Shim-pack GIS C18 column (5㎛ ODS, 250 × 4.6㎜ id, Sigma-Aldrich) was used. As a mobile phase, H 2 O (solvent A) and acetonitrile (solvent B, Sigma-Aldrich, St. Louis, USA) containing 0.1% TFA (trifluoroacetic acid, SAMCHUN, Korea) were used from 0 to 30 minutes. Solvent B was analyzed under conditions of an increasing gradient from 10% to 100%, and the column temperature was set at 40° C. and the flow rate was set at 1.0 ml/min, and detection was performed at a wavelength of 254 nm.
상기 1-1의 황칠나무 캘러스 추출물(황칠), 상기 1-2의 황칠나무 캘러스 추출물 생물전환산물(황칠BR) 및 생물전환 반응에 사용한 미생물 현탁액의 상등액(B. sp. JD3-7, 대조군)을 분석하였다. 이의 결과 생물전환산물 분석 결과의 머무른 시간(retention time) 10 내지 20분에서 추출물에서는 검출되지 않았던 신규 피크(peak)의 생성을 확인하였다(도 2). 이는 생물전환에 의해 미지의 물질이 생성되어 나타난 것으로 사료된다.Hwangchil tree callus extract (Hwangchil) of 1-1, Hwangchil tree callus extract bioconversion product (Hwangchil BR) of 1-2 above, and supernatant of microbial suspension used for bioconversion reaction (B. sp. JD3-7, control) was analyzed. As a result, it was confirmed that a new peak, which was not detected in the extract, was generated at a retention time of 10 to 20 minutes in the bioconversion product analysis result (FIG. 2). It is believed that this is due to the production of unknown substances by bioconversion.
실시예 3. 생물전환산물의 세포 독성 및 미백 활성 평가Example 3. Evaluation of cytotoxicity and whitening activity of bioconversion products
2-1. 실험 방법2-1. Experiment method
2-1-1. 실험 재료 및 세포 배양2-1-1. Experimental materials and cell culture
본 실험에서 사용된 쥐의 B16F10 흑색종 세포는 ATCC(American Type Cell Culture, 미국 소재)에서 분양받아 DMEM 배지에 10% FBS(fetal bovine serum, Welgene, 한국 경산 소재)와 100유닛/㎖ 페니실린-스트렙토마이신(penicillin-streptomycin, P/S, Welgene, 한국 경산 소재)을 첨가한 배지를 사용하여 37℃, 5% CO₂ 조건에서 배양하였다.The mouse B16F10 melanoma cells used in this experiment were purchased from ATCC (American Type Cell Culture, USA) and mixed with 10% FBS (fetal bovine serum, Welgene, Gyeongsan, Korea) and 100 units/ml penicillin-strepto in DMEM medium. It was cultured at 37℃ and 5% CO₂ conditions using a medium supplemented with mycin (penicillin-streptomycin, P/S, Welgene, Gyeongsan, Korea).
2-1-2. 세포 독성 평가2-1-2. Cytotoxicity assessment
24-웰 플레이트에 B16F10 세포를 1.0×104 세포/웰로 분주하고 37℃, 5%, CO2 조건의 배양기에서 24시간 전 배양하였다. 이후 시료와 α-MSH(200nM, Sigma-Aldrich, 미국 미주리주 세인트루이스 소재)를 동시 처리하여 72시간 동안 배양하고 2㎎/㎖ MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide, Sigma-Aldrich, 미국 미주리주 세인트루이스 소재) 시약을 첨가하여 2시간 동안 반응시킨 다음 염색된 포마잔(formazan) 결정을 DMSO로 용해시켜 96 웰 플레이트로 옮긴 후 ELISA 리더(multiwell microplate reader)를 사용하여 570㎚에서 흡광도를 측정하였으며 대조군의 흡광도 측정값과 비교하여 세포독성을 평가하였다.B16F10 cells were dispensed in a 24-well plate at 1.0×10 4 cells/well and cultured for 24 hours in an incubator at 37° C., 5%, CO 2 conditions. Thereafter, the sample and α-MSH (200 nM, Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA) were co-treated and incubated for 72 hours, followed by 2 mg/ml MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyltetrazolium bromide, Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA) reagent was added and reacted for 2 hours, and then the stained formazan crystals were dissolved in DMSO, transferred to a 96-well plate, and then transferred to an ELISA reader (multiwell microplate reader). ) was used to measure the absorbance at 570 nm, and the cytotoxicity was evaluated by comparing with the measured absorbance value of the control group.
2-1-3. 멜라닌 합성 억제 활성 측정2-1-3. Measurement of melanin synthesis inhibitory activity
6-웰 플레이트에 B16F10 세포를 4.0×104 세포/웰로 분주하고 37℃, 5% CO2 조건의 배양기에서 24시간 전 배양한 뒤 시료와 α-MSH(200nM)를 동시 처리하고 96시간 동안 배양하였다. PBS(phosphate buffered saline, Sigma-Aldrich, 미국 미주리주 세인트루이스 소재)로 1회 세척한 후에 0.5× 트립신(trypsin)-EDTA(Gibco, 미국 뉴욕주 그랜드 아일랜드 소재)로 세포를 수거하였다. 13,000rpm에서 3분 동안 원심분리하여 얻은 펠렛에 1% 프로테아제 억제제(Sigma-Aldrich, 미국 미주리주 세인트루이스 소재)를 함유한 방사선면역침전 분석 완충액(Sigma-Aldrich, 미국 미주리주 세인트루이스 소재)을 100㎕씩 첨가하고 원심분리하였다. 수득한 펠렛에 10% DMSO를 함유한 1N NaOH를 500㎕ 넣고 90℃의 가열 블록에서 1시간 동안 용해시켰다. 이후 ELISA 리더를 사용하여 405㎚에서 흡광도를 측정하였다.B16F10 cells were dispensed in a 6-well plate at 4.0×10 4 cells/well, cultured in an incubator at 37°C and 5% CO 2 for 24 hours, and then the sample and α-MSH (200nM) were simultaneously treated and cultured for 96 hours. did After washing once with PBS (phosphate buffered saline, Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA), cells were harvested with 0.5× trypsin-EDTA (Gibco, Grand Island, New York, USA). 100 μl of radioimmunoprecipitation assay buffer (Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA) containing 1% protease inhibitor (Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA) was added to the pellet obtained by centrifugation at 13,000 rpm for 3 minutes. added and centrifuged. 500 μl of 1N NaOH containing 10% DMSO was added to the obtained pellet and dissolved in a heating block at 90° C. for 1 hour. Then, absorbance was measured at 405 nm using an ELISA reader.
2-1-4. 티로시나제 저해 활성 측정2-1-4. Measurement of tyrosinase inhibitory activity
6-웰 플레이트에 B16F10 세포를 4.0×104 세포/웰로 분주하고 37℃, 5% CO2 조건의 배양기에서 24시간 전 배양한 후 시료와 α-MSH(200nM)를 동시 처리하고 72시간 동안 배양하였다. 이후 상기 2-1-3의 멜라닌 실험과 동일한 방법으로 용해하고 4℃, 13,000rpm에서 30분 동안 원심분리하여 상층액을 사용하였다. BCA 키트(Thermo Scientific, 미국 소재)를 이용하여 단백질 정량하였고, 100mM 인산나트륨 완충액(pH 6.8)과 2㎎/㎖ L-DOPA(Sigma-Aldrich, 미국 미주리주 세인트루이스 소재)를 첨가하여 37℃에서 2시간 반응시켰다. 이후 ELISA 리더를 사용하여 490㎚에서 흡광도를 측정하였다.B16F10 cells were dispensed in a 6-well plate at 4.0×10 4 cells/well, cultured in an incubator at 37°C and 5% CO 2 for 24 hours, and then the sample and α-MSH (200nM) were simultaneously treated and cultured for 72 hours. did After dissolving in the same way as in the melanin experiment of 2-1-3, the supernatant was used by centrifugation at 4° C. and 13,000 rpm for 30 minutes. Protein was quantified using a BCA kit (Thermo Scientific, USA), and 100 mM sodium phosphate buffer (pH 6.8) and 2 mg/mL L-DOPA (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) were added and incubated at 37°C for 2 time reacted. Then, absorbance was measured at 490 nm using an ELISA reader.
2-1-5. 웨스턴 블롯 분석2-1-5. Western blot analysis
6-웰 플레이트에 B16F10 세포를 4.0×104 세포/웰로 분주하고 37℃, 5% CO2 조건의 배양기에서 72시간 전 배양하였다. 이후 시료와 α-MSH(200nM)를 동시 처리하고 24시간 후 세포를 수거하였다. 수득한 세포에 세포 용해액(1×RIPA 완충액, 100mM phenylmethylsulfonyl fluoride(PMSF), 200mM Na3VO4 및 프로테아제 억제제) 100㎕를 첨가하고 4℃, 13,000rpm에서 30분 동안 원심분리하여 상층액을 얻었다. BCA 키트(Thermo Scientific, 미국 소재)를 사용하여 단백질을 정량하고 2× Laemmli 시료 완충액(65.8mM Tris-HCl, pH 6.8, 2.1% SDS, 26.3%(w/v) glycerol, 0.01% bromophenol blue)과 동량 혼합하여 10% SDS-PAGE 겔에 전기영동한 후 PVDF(poly-vinylidene difluoride) 멤브레인(Bio-rad, 미국 소재)에 전이시켰다. 상온에서 1시간 동안 5% 탈지유를 함유한 TBST(10% 10× TBS, 1% tween 20)에 블로킹시킨 다음 TBST를 사용하여 10분 간격으로 4회 세척하였고 1차 항체인 TRP-1, TRP-2, 티로시나제(1:1,000, Santa cruz Biotechnology, 미국 소재), MITF(1:500, Santa cruz Biotechnology, 미국 소재)를 처리하여 4℃에서 밤새 반응시켰다. 반응이 끝난 후 TBST로 4회 세척한 후 2차 항체인 HRP(horseradish peroxidase)가 결합된 항-쥐 IgG(anti-mouse IgG, 1:1,000)를 사용하여 상온에서 1시간 반 동안 반응시켰다. 다시 TBST로 4회 세척한 후 ECL 키트(Bio-Rad, 미국 소재)를 사용하여 이미징 덴시토미터(model GS-700, Bio-rad, 미국 소재)를 통해 측정하였다. 측정 후 β-엑틴 대비 MITF, TRP1, TRP2, 티로시나제 단백질 발현량에 대한 면적값을 이미지J 프로그램(NIH, 미국 메릴랜드주 베데스다 소재)을 이용하여 수치화한 뒤 그래프로 나타내었다.B16F10 cells were dispensed in a 6-well plate at 4.0×10 4 cells/well and cultured for 72 hours in an incubator at 37° C. under 5% CO 2 conditions. Thereafter, the sample and α-MSH (200 nM) were co-treated, and the cells were harvested after 24 hours. 100 μl of cell lysate (1 × RIPA buffer, 100 mM phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF), 200 mM Na 3 VO 4 and protease inhibitors) was added to the obtained cells and centrifuged at 4 ° C and 13,000 rpm for 30 minutes to obtain a supernatant. . Proteins were quantified using the BCA kit (Thermo Scientific, USA) and purified in 2× Laemmli sample buffer (65.8 mM Tris-HCl, pH 6.8, 2.1% SDS, 26.3% (w/v) glycerol, 0.01% bromophenol blue). The mixture was mixed in equal amounts, electrophoresed on a 10% SDS-PAGE gel, and then transferred to a PVDF (poly-vinylidene difluoride) membrane (Bio-rad, USA). Blocked in TBST (10% 10× TBS, 1% tween 20) containing 5% skim milk for 1 hour at room temperature, washed 4 times at 10-minute intervals using TBST, and the primary antibodies, TRP-1 and TRP- 2, tyrosinase (1:1,000, Santa cruz Biotechnology, USA) and MITF (1:500, Santa cruz Biotechnology, USA) were treated and reacted overnight at 4°C. After the reaction was completed, the mixture was washed 4 times with TBST, and reacted at room temperature for 1.5 hours using anti-mouse IgG (1:1,000) coupled with horseradish peroxidase (HRP) as a secondary antibody. After washing again with
2-2. 결과2-2. result
2-2-1. 세포 독성 평가2-2-1. Cytotoxicity assessment
황칠나무 캘러스 추출물(황칠)과 황칠나무 캘러스 추출물의 생물전환산물(황칠 BR)을 5, 10, 25㎍/㎖의 농도로 처리한 결과, 모든 처리군에서 89% 이상의 세포 생존율이 확인되었다(도 3).Hwangchil tree callus extract (Hwangchil) and the bioconversion product of Hwangchil tree callus extract (Hwangchil BR) were treated at concentrations of 5, 10, and 25 μg/ml, and cell viability of 89% or more was confirmed in all treatment groups (Fig. 3).
2-2-2. 멜라닌 합성 저해 활성2-2-2. Melanin synthesis inhibitory activity
α-MSH 자극에 의해 증가한 B16F10 흑색종 세포에서의 멜라닌 합성량이 황칠나무 캘러스 추출물(황칠) 처리 시 유의미한 저해를 보이지 않았으나, 황칠나무 캘러스 추출물의 생물전환산물(황칠 BR) 처리 시 농도의존적인 저해를 보였으며, 특히 최고농도의 25㎍/㎖에서는 무처리군(대조군)보다 낮은 멜라닌 생성량을 나타냈다(도 4).The amount of melanin synthesis in B16F10 melanoma cells, which was increased by α-MSH stimulation, was not significantly inhibited when treated with Hwangchil tree callus extract (Hwangchil), but concentration-dependent inhibition was observed when treated with Hwangchil tree callus extract (Hwangchil BR). In particular, at the highest concentration of 25 μg/ml, the amount of melanin produced was lower than that of the untreated group (control group) (FIG. 4).
2-2-3. 티로시나제 활성 저해 활성2-2-3. Tyrosinase activity inhibitory activity
B16F10 흑색종 세포에 대하여 황칠나무 캘러스 추출물 및 황칠나무 캘러스 추출물의 생물전환산물의 티로시나제 활성 저해 활성을 확인하기 위하여 B16F10 세포에서의 도파-크롬(dopa-chrome) 형성을 흡광도로 측정하여 도파 산화효소(dopa oxidase) 활성을 측정하였다. 그리고 이로부터 상대적인 티로시나제 저해 활성을 평가한 결과 황칠나무 캘러스 추출물의 생물전환산물(황칠 BR) 처리 시 유의적인 티로시나제 활성의 저해가 나타났다(도 5). 티로시나제는 멜라닌 생성의 속도결정단계인 초기반응에 작용하며 멜라닌 형성에 작용하는 주요 효소 중 하나로서 황칠나무 캘러스 추출물의 생물전환산물 처리 시 티로시나제 활성의 저해는 멜라닌 합성이 억제된 주요 원인으로 판단된다.In order to confirm the tyrosinase activity inhibitory activity of H. hwangchil tree callus extract and the bioconversion product of H. h. d. h. callus extract against B16F10 melanoma cells, dopa-chrome formation in B16F10 cells was measured by absorbance to detect dopa oxidase ( dopa oxidase) activity was measured. And as a result of evaluating the relative tyrosinase inhibitory activity from this, significant inhibition of tyrosinase activity was found when the bioconversion product of hwangchil tree callus extract (hwangchil BR) was treated (FIG. 5). Tyrosinase acts on the initial reaction, which is the rate-determining step of melanin production, and is one of the main enzymes that act on melanin formation. Inhibition of tyrosinase activity during the bioconversion product treatment of hwangchil tree callus extract is considered to be the main cause of suppression of melanin synthesis.
2-2-4. 멜라닌 형성 관련 인자의 발현 측정2-2-4. Measurement of the expression of melanogenesis-related factors
멜라닌 합성과 관련된 TRP-1, TRP-2, 티로시나제 단백질의 발현량과 전사인자 MITF 활성을 조사하였다. 그 결과 α-MSH 자극에 의해 멜라닌 합성 관여인자의 발현이 증가하였고 황칠나무 캘러스 추출물(DM) 처리 시 멜라닌 합성 관여인자들의 발현이 유기적인 억제를 보이지 않았지만 황칠나무 캘러스 추출물의 생물전환산물(DMBR) 처리 시 억제를 보였다(도 6 내지 9). 특히, TRP-2, 티로시나제 및 MITF의 발현은 무처리군 수준으로 저해되었다. 이러한 결과는 황칠나무 캘러스 추출물의 생물전환산물이 멜라닌 형성 관여인자의 발현을 억제하여 멜라닌 합성 저해가 유도되었을 가능성을 시사한다.The expression levels of TRP-1, TRP-2, and tyrosinase proteins related to melanin synthesis and the activity of the transcription factor MITF were investigated. As a result, the expression of factors involved in melanin synthesis was increased by α-MSH stimulation, and the expression of factors involved in melanin synthesis was not organically suppressed when treated with H. d. d. callus extract (DMBR). Inhibition was seen upon treatment (Figures 6-9). In particular, the expressions of TRP-2, tyrosinase and MITF were inhibited to the level of the untreated group. These results suggest that the bioconversion product of H. hwangchil tree callus extract suppresses the expression of factors involved in melanin formation, thereby inducing melanin synthesis inhibition.
Claims (8)
상기 황칠나무 캘러스 추출물은 황칠나무 캘러스의 열수추출물인, 피부 미백용 조성물.According to claim 1,
The hwangchil tree callus extract is a hot water extract of hwangchil tree callus, a composition for skin whitening.
상기 생물전환산물은 인산염을 10 내지 100mM로 포함하고 글리세린을 0.5 내지 5%(w/v)로 포함하고 pH가 6.5 내지 8인 반응액 중에서 생물전환한 것인, 피부 미백용 조성물.According to claim 1,
The bioconversion product is bioconverted in a reaction solution containing phosphate at 10 to 100 mM and glycerin at 0.5 to 5% (w / v) and having a pH of 6.5 to 8, a composition for skin whitening.
상기 생물전환산물은 상기 황칠나무 캘러스 추출물을 500 내지 600㎎/ℓ로 포함하고 상기 바실러스 속 JD3-7의 균체를 2.5 내지 3g/ℓ로 포함하는 반응액 중에서 생물전환한 것인, 피부 미백용 조성물.According to claim 1,
The bioconversion product is bioconverted in a reaction solution containing 500 to 600 mg / L of the hwangchil tree callus extract and 2.5 to 3 g / L of the cells of the genus Bacillus JD3-7, skin whitening composition .
상기 생물전환 반응용 조성물을 항온처리하는 단계;를 포함하는 황칠나무 캘러스 추출물의 생물전환 방법.Generating a composition for bioconversion reaction by mixing hwangchil tree callus extract and Bacillus sp. JD3-7 cells; and
Bioconversion method of hwangchil tree callus extract comprising; incubating the composition for the bioconversion reaction.
상기 황칠나무 캘러스 추출물은 황칠나무 캘러스의 열수추출물인, 황칠나무 캘러스 추출물의 생물전환 방법.According to claim 5,
The hwangchil tree callus extract is a hot water extract of hwangchil tree callus, a bioconversion method of hwangchil tree callus extract.
상기 생물전환 반응용 조성물을 생성하는 단계는 인산염을 10 내지 100mM로 포함하고 글리세린을 0.5 내지 5%(w/v)로 포함하고 pH가 6.5 내지 8이 되도록 생물전환 반응용 조성물을 생성하는 단계인, 황칠나무 캘러스 추출물의 생물전환 방법.According to claim 5,
The step of producing a composition for bioconversion reaction includes phosphate at 10 to 100 mM, glycerin at 0.5 to 5% (w / v), and the pH is 6.5 to 8. A step of generating a composition for bioconversion reaction , Biotransformation method of hwangchil tree callus extract.
상기 생물전환 반응용 조성물을 생성하는 단계는 상기 황칠나무 캘러스 추출물을 500 내지 600㎎/ℓ로 포함하고 상기 바실러스 속 JD3-7의 균체를 2.5 내지 3g/ℓ로 포함하도록 생물전환 반응용 조성물을 생성하는 단계인, 황칠나무 캘러스 추출물의 생물전환 방법.According to claim 5,
The step of generating the composition for bioconversion reaction includes the hwangchil tree callus extract at 500 to 600 mg / L and the cells of the Bacillus genus JD3-7 at 2.5 to 3 g / Produce a composition for bioconversion reaction Step, bioconversion method of Hwangchil tree callus extract.
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