KR20230077620A - 미생물 헴단백 추출물을 포함하는, 정장 및 비만 개선용 조성물 - Google Patents

미생물 헴단백 추출물을 포함하는, 정장 및 비만 개선용 조성물 Download PDF

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Abstract

헴단백 함량이 높은 미생물 또는 그의 배양물의 정장 및 체중조절 용도에 관한 것으로서, 구체적으로, 헴단백 함량이 높은 미생물의 배양에 의해 수득된 헴단백 추출물에 의한 장내균총의 활성화, 개선 및 체중조절용 조성물에 관한 것이다.

Description

미생물 헴단백 추출물을 포함하는, 정장 및 비만 개선용 조성물{Composition comprising extract of microbial hemeproteins for improving gut health and obesity condition}
헴단백의 함량이 높은 미생물, 그의 배양물, 또는 그의 헴단백 추출물의 정장 및 비만 개선 용도에 관한 것으로서, 구체적으로, 헴단백의 함량이 높은 미생물 배양에 의해 수득된 미생물 헴단백 추출물에 의한 장내균총의 활성화, 개선 및 비만 개선용 조성물에 관한 것이다.
비만은 단순하게 체중 증가를 의미하는 것이 아니라 체지방이 과도하게 체내에 축적된 상태를 말한다. 비만이 전세계적으로 증가하는 추세이며, 미관상의 문제뿐만 아니라 고혈압, 당뇨병, 심혈관계 질환, 유방암, 대장암 등과 같은 질병들을 일으키는 시발점이 되기도 하며, 합병증도 일으키기도 한다. 세계보건기구(WHO)에서는 이러한 비만을 치료를 받아야하는 질병의 대상으로 보고 있다.
비만의 원인으로는 식욕을 억제하는 단백질인 렙틴(leptin)에 문제가 있는 유전적 요인, 심리적/생리적 욕구를 음식섭취로 해결하는 정신적 요인, 음식의 섭취과잉 및 서구화와 같은 사회적 요인, 운동량 부족과 같은 생활 습관에서 기인하는 요인 등 여러가지 요인들이 있다.
소화기 말단인 대장은 동물 내 관으로써 역할 외에는 크게 주목받지 못하다가 최근 들어서 많은 수의 뉴런이 존재하고, 95% 이상의 세로토닌을 생성한다는 결과가 알려지면서 제2의 뇌라고 지칭할 정도로 중요성이 심화되어 인식되기 시작했다. 인간 대장의 길이와 표면적은 각각 1.5 m, 300 m2로 알려져 있으며, 인간의 대장 관track)에 존재하는 전체 미생물 군집(flora)의 수는 약 1013-14 개 이상이다. 인간의 장내균총은 후벽균문 (Firmicutes), 의간균문 (Bacteroidetes), 프로테오박테리아문(Proteobacteria), 방선균문 (Actinobacteria) 등의 여러 문(phylum)으로 구성되어 있으며, 그 종(species)은 400 여종 이상인 것으로 알려져 있다. 또한 분변 고형물의 약 30% 이상을 차지할 정도로 비율이 높으며 이러한 장내 균총의 활성은 인체의 면역, 약효, 소화대사 등 많은 영향을 미치는 것으로 알려지고 있다. 특히 유산균 종들의 지방대사 연관관계에 따른 항 비만 역할도 하는 것으로 알려져, 주목을 받고 있다.
헴철은 보결분자단(prosthetic group)으로서 단백질과 결합된 여러 종류의 헴단백 (hemoprotein = heme-conjugated protein)의 형태로 자연계에 분포하며, 산소 분자 (O2)의 전달 (적혈구 내 헤모글로빈, 근육 내 미오글로빈, 콩과식물의 레그헤모글로빈), 전자의 전달 (여러 종류의 시토크롬류, 리덕타제, 옥시게나제 등), 독성 산소의 제거 (카탈라제, 페옥시다제 등)와 같은 생명체의 에너지 생산과정이나 활성산소종 (ROS: reactive oxygen species)에 대한 제거에 필수적인 역할을 담당한다. 하지만 유산균은 이러한 헴철을 생합성하는 경로를 갖지 않기 때문에 발효대사를 사용하며, 산소에 취약하다는 단점을 갖는다. 자연상태에서의 유산균은 헴철을 외부에서 가져와서 자신에게 필요한 헴단백으로 이용한다. 따라서 외부의 헴철을 포함하는 헴단백 영양원의 공급은 유산균의 생존을 늘려주고 장내의 환경에서는 정장작용을 일으킬 수 있다. 그러나 이러한 육류에서 유래단 동물성 헴단백은 체중의 관리 측면에서는 바람직하지 않다.
한국특허출원공개 제2018-0049612호는 미생물 헴단백을 포함하는 유산균 성장 촉진 또는 보존력 강화용 조성물에 관한 것으로서, 미생물 헴단백 추출물이 유산균 바이오매스 생산을 증가시키고, 생존력의 증가를 통해 보존력을 강화한다는 것을 개시한다. 그러나, 미생물 헴단백 추출물에 의한 정장이나 체중조절에 관해서는 개시하거나 암시하지 않는다.
본 발명자들은 유산균을 이용하여 정장 및 비만 예방 또는 치료를 개선할 수 있는 방법에 대한 연구를 수행하여, 미생물의 배양에 의해 수득되는 헴철 추출물이 정장 및 체중조절에 대한 우수한 효과를 갖는다는 것을 발견하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 미생물 헴단백 추출물을 포함하는, 정장 및 비만 개선용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 또한, 미생물 헴단백 추출물을 포함하는, 정장 및 비만 개선용 사료 첨가제를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 일 양태는 미생물 헴단백 추출물을 포함하는 정장 및 비만용 조성물을 제공한다.
본 명세서에서 사용된 용어, "헴단백"은 헴철이 결합된 단백질을 의미하며, 헴철 생산능을 갖는 미생물에 의해 생성되어 미생물의 내부에 축적되거나 외부로 방출되어 배양액 중에 존재할 수 있고, 미생물 자체 또는 그의 배양액 또는 그로부터 추출된 헴단백의 함량이 높은 미생물 단백질(single cell protein) 또는 그의 추출물일 수 있다. 헴단백은 미생물에 의해 생산된 헴철 또는 그를 포함하는 단백질 또는 미생물 균체를 포함하며, 미생물에서 유래되므로 "미생물 헴단백" 또는 "미생물 헴단백 추출물"과 호환적으로 사용된다.
본 명세서에서 사용된 용어, "헴철"은 포르피린의 철 착염을 의미하며, 헴(heme)과 호환적으로 사용된다. 헴철은 동물, 식물, 미생물 등 모든 호흡대사 생명체에서 발견되는 분자로서, 포르피린과 철 이온의 배위결합 구조를 기본으로 하여 다양한 곁사슬을 갖는 분자들의 총칭이다.
본 명세서에서 사용된 용어, "헴단백 추출물", "미생물 유래 헴단백 추출물" 또는 "미생물 헴단백"은 헴단백 함량이 높은 미생물의 배양물, 그로부터 분리되거나 추출된 헴단백을 포함하는 추출물, 헴단백 또는 헴철 자체, 또는 그를 포함하는 조성물을 의미한다. 본 명세서에서, 용어 헴단백 추출물과 헴단백은 호환적으로 사용된다.
본 명세서에서 사용된 용어, "헴단백의 함량이 높은 미생물"은 배양시 내외부에 헴단백을 축적시켜서, 헴철 생산능이 없거나 낮은 미생물에 비해 높은 헴단백 함량을 갖는 미생물을 의미한다. 본 명세서에서 "헴단백의 함량이 높은 미생물"은 "헴철 생산능을 갖는 미생물"과 호환적으로 사용된다. 헴단백 함량이 높은 미생물은 유전자 조작 없이, 높은 생장 속도 및 그에 따른 높은 생합성능을 갖는 미생물을 선택하기 위한 적응진화에 의해 선별된 것일 수 있다. 예를 들면, 한국특허 제2210764호에 개시된 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) HemoP1 또는 한국특허 제2118083호에 개시된 클렙시엘라 바리콜라(Klebsiella variicola)HemoC1일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "정장"은 장내 균총의 개선을 통해 장의 전반적인 기능을 개선하는 것을 의미한다. 장내 균총의 개선은 장내 균총 중 유산균과 같은 유용한 균의 종류 및 수를 증가시키고, 유해한 균의 종류 및 수를 감소시키는 것을 의미한다.
본 명세서에서 사용된 용어, "체중조절" 또는 "체중조절 보조"는 체중 감량 또는 체중증가 억제를 통해 정상 체중을 회복하고 유지하는 것을 지원하거나 보조하는 것을 의미하고, 체지방의 감소, 체지방 축적 억제, 등에 의한 비만의 치료 또는 예방 효과일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "비만 조절" 또는 "비만 개선"은 비만을 초래하거나 악화시키는 체중 증가나 체지방 축적 등을 조절하거나 감소시키는 것을 의미한다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 헴단백 추출물은 헴철 생산능을 갖는 미생물의 배양에 의해 수득된 미생물 배양액, 그로부터 분리된 미생물 균체, 또는 그로부터 분리되고 정제된 헴단백의 형태일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 헴철 생산능을 갖는 미생물 또는 헴단백의 함량이 높은 미생물은 유전자 조작 없이, 생장 속도 및 헴철 생산능에 대한 적응진화에 의해 선별되어 모균주에 비해 높은 헴단백 함량을 갖는 미생물일 수 있고, 예를 들면, 한국특허 제2210764호에 개시된 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) HemoP1 또는 한국특허 제2118083호에 개시된 클렙시엘라 바리콜라(Klebsiella variicola)HemoC1일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 헴단백의 함량이 높은 미생물은 인위적인 유전조작 없이 에너지 대사 또는 활성 산소 해독에 관여하는 효소의 활성 또는 발현량이 자연적으로 증가된 상태로 자연계에서 분리된 미생물, 예를 들면, 코리네박테리움 속 미생물일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 헴단백의 함량이 높은 미생물은 건강한 장내 균총에서 유래하였으며, 에너지 대사가 높아 생장 속도가 빠르면서 동시에 산화 스트레스에 대한 저항성이 높고 파쇄하였을 때 적색소를 나타내어 일반 미생물보다 높은 함량의 헴단백류를 포함하는 코리네박테리움 글루타미쿰일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 코리네박테리움 글루타미쿰은 한국특허 제2210764호에 개시된 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) HemoP1 일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "모균주"는 재조합 방법, 돌연변이, 또는 적응진화에 의해 변형되기 이전의 원래의 균주를 의미한다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 헴단백 추출물은 코리네박테리움 글루타미쿰의 배양물, 상기 배양물의 건조물, 상기 배양물의 추출물, 또는 상기 배양물로부터 정제된 헴단백 추출물의 형태일 수 있다. 상기 코리네박테리움 글루타미쿰의 배양에 의해 수득된 배양물은 코리네박테리움 글루타미쿰에 의해 생산된 헴단백을 포함하므로, 그 자체로 단백질이나 헴철의 공급원으로 이용되거나, 또는 그로부터 헴단백 또는 헴철을 추출하는 단계를 더 수행하여 수득된 헴단백 추출물 또는 헴철 추출물로 이용되거나, 또는 추출 후 정제단계를 거쳐 수득된 헴단백 또는 헴철로 이용될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 헴단백 추출물은 클렙시엘라 바리콜라의 배양물, 상기 배양물의 건조물, 상기 배양물의 추출물, 또는 상기 배양물로부터 정제된 헴단백 추출물의 형태일 수 있다. 상기 클렙시엘라 바리콜라의 배양에 의해 수득된 배양물은 클렙시엘라 바리콜라에 의해 생산된 헴단백을 포함하므로, 그 자체로 단백질이나 헴철의 공급원으로 이용되거나, 또는 그로부터 헴단백 또는 헴철을 추출하는 단계를 더 수행하여 수득된 헴단백 추출물 또는 헴철 추출물로 이용되거나, 또는 추출 후 정제단계를 거쳐 수득된 헴단백 또는 헴철로 이용될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 조성물은 장내 균총 중 후벽균문(Firmicutes)의 비율을 증가시키는 것일 수 있다. 후벽균문은 유산균이 속하는 그룹으로, 후벽균문에 속하는 장내 균충의 비율 증가는 장 기능의 개선을 가져온다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 헴단백 추출물은 상기 미생물 배양액으로부터 미생물 균체를 회수하는 단계, 회수된 미생물 균체를 재현탁시키고, 파쇄시키는 단계, 및 파쇄된 현탁액을 원심분리하거나, 건조시키는 단계에 의해 수득되는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 헴단백의 함량이 높은 미생물을 배양하는 단계는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 공지된 배지를 이용하여 수행될 수 있다. 배양 방법 및 조건은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 선택될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 조성물은 체중 대비 지방조직 중량의 비율을 감소시켜 체중조절에 기여할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 조성물은 정장이나 체중조절 또는 비만개선 효과를 갖는 유효성분을 더 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 조성물은 사료 원료, 식품 원료, 또는 건강기능식품 일 수 있고, 산제, 과립제, 환, 정제, 캡슐제, 식품, 음료 등의 형태로 이용될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 조성물 중 헴단백 추출물의 함량은 조성물 총 중량을 기준으로 0.01 중량% 내지 70 중량%일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 조성물은 헴단백 추출물을 1일 0.0001 내지 100 mg/kg으로, 바람직하게는 0.001 내지 100 mg/kg으로 투여하는 양으로 투여될 수 있다. 본 발명의 미생물 헴단백 추출물의 바람직한 투여량은 개체의 상태 및 체중, 비만의 정도, 조성물의 제형, 투여경로 및 기간에 따라 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다.
본 발명의 또 다른 양태는, 헴단백 추출물을 포함하는, 정장 및 비만 개선용 사료 첨가제를 제공한다.
본 명세서에서 사용된 용어, "사료 첨가제"는 특정한 기능성이나 영양 강화 등의 목적으로 사료에 첨가되는 물질을 의미하며, 사료와 조합되어 함께 투여되거나, 또는 단독으로 투여될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 헴단백 추출물은 헴단백의 함량이 높은 미생물의 배양에 의해 수득된 미생물 배양액 또는 그로부터 수득된 헴단백 추출물일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 사료 첨가제는 사료 요구율을 개선하는 것일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "사료 요구율"은 사료의 영양가를 평가하는 지표로서, 사육대상 동물의 체중 1 kg을 증가시키기 위해 요구되는 사료의 양(kg)을 의미하고, 사료섭취량/체중증가량으로 계산되며, 사료 효율과 호환적으로 사용된다.
본 발명의 일 구체예에 따른 사료 첨가제는 분말 또는 과립형태로 제조될 수 있고, 필요에 따라, 구연산, 푸마르산, 아디프산, 젖산, 사과산 등의 유기산이나 인산나트륨, 인산칼륨, 산성 피로인산염, 폴리인산염 등의 인산염이나, 폴리페놀, 카테킨, 알파-토코페롤, 로즈마리 추출물, 비타민 C, 녹차 추출물, 감초 추출물, 키토산, 탄닌산, 피틴산 등의 천연 항산화제 중 어느 하나 또는 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따른 사료 첨가제는 곡물, 예를 들면 분쇄 또는 파쇄된 밀, 귀리, 보리, 옥수수 및 쌀; 식물성 단백질 사료, 예를 들면 평지, 콩, 및 해바라기를 주성분으로 하는 사료; 동물성 단백질 사료, 예를 들면 혈분, 육분, 골분 및 생선분; 당분 및 유제품, 예를 들면 각종 분유 및 유장 분말로 이루어지는 건조 성분 등을 더 포함할 수 있으며, 이외에도 영양 보충제, 소화 및 흡수 향상제, 성장 촉진제 등을 더 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따른 사료 첨가제는 보존제, 안정화제, 습윤제 또는 유화제, 용액 촉진제 등을 함유할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따른 헴단백 추출물을 포함하는 정장 및 비만 개선용 조성물 및 사료 첨가제는 헴철 생산능을 갖는 미생물의 배양에 의해 안전하고 경제적으로 수득된 헴단백을 이용하여 장내 균총의 개선 및 그에 따른 정장 작용 및 체중증가 감소를 통해 효과적으로 비만을 개선시킬 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 구체예에 따른 헴단백 추출물에 의한 마우스의 장내 균총에 대한 효과를 비교한 그래프이다.
도 2는 본 발명의 일 구체예에 따른 헴단백 추출물을 포함하는 식이의 2주간 급이 완료 후 정상 대조군 (N), 비만 대조군 (C), 헴단백 추출물 0.5g/kg 혼합 급이한 군 (SL), 및 헴단백 추출물 5 g/kg 혼합 급이한 군 (HL) 마우스를 보여준다.
도 3은 본 발명의 일 구체예에 따른 헴단백 추출물에 의한 마우스의 지방 조직 중량에 대한 효과를 보여준다. (a) 내지 (d)는 각각 부고환 주위 지방, 신장 주위 지방, 후복강 지방 및 장간막 지방 조직 중량을 나타낸다.
도 4는 본 발명의 일 구체예에 따른 헴단백 추출물에 의한 마우스 개체에 대해 체중 대비 지방조직 중량의 비율에 대한 효과를 보여준다. (a) 내지 (d)는 각각 체중 대비 부고환 주위 지방, 신장 주위 지방, 후복강 지방 및 장간막 지방 조직 중량의 비를 나타낸다.
도 5는 본 발명의 일 구체예에 따른 헴단백 추출물에 의한 반려견의 장내 균총에 대한 효과를 비교한 그래프이다.
실시예 1. 미생물 헴단백 추출물의 제조
높은 미생물 헴단백 함량을 갖는 것으로 확인된 코리네박테리움 글루타미쿰 HemoP1 (대한민국 특허 10-2210764) 또는 클렙시엘라 바리콜라 HemoC1 (대한민국 특허 10-2118083) 균주의 단일 콜로니를 15 mL의 YS 배지 (효모 추출물 0.5%w/v, 소이톤 1%w/v, 글루코오스 1%w/v)가 포함된 테스트 튜브에 접종한 후 30℃에서 250 rpm으로 16 시간동안 진탕 배양 후 3 L의 동일 배지를 포함하는 5 L 발효기(jar fermentor)로 옮겼다. 48 시간 동안 0.5 vvm 및 250 rpm으로 통기 및 교반하면서 30℃에서 배양 후, 수득된 배양물을 4℃에서 3,000g로 15분 동안 원심분리하여 균체를 회수하고, 증류수로 2회 세척하였다. 회수된 균체는 100 mL의 증류수에 현탁시킨 후, 15,000 psi로 운전되는 고압분산기 (high pressure homogenizer; EmulfsiFlex-C3, Sonic corp. Stratford, CT, USA)로 3회 반복 분사하여 세포를 파쇄하여 내부의 헴단백들이 용출되도록 하였다. 파쇄 후 현탁액은 105℃ 오븐에서 24시간동안 건조하여 미생물 헴단백을 수득하였다.
실시예 2. 미생물 헴단백을 식이한 마우스의 체중조절 및 정장 효과
실시예 1에서 수득된 미생물 헴단백이 포함된 식이를 이용하여 체중 변화 및 정장 효과를 조사하였다.
구체적으로, 12주령의 ICR 수컷 마우스(하나바이오테크, 경기도 안산, 한국) 20 마리를 분양받아 ㈜동남의화학연구원 동물사 (동물시설등록증 제 412호)에서 7 일간 검역과 순화, 사육을 거친 건강한 동물로 시험하였다. 케이지 내에서는 귀 천공(ear punching)으로 개체를 식별하였고, 각 군(group)간 평균 체중 및 표준편차가 균일하도록 군 분리를 진행하였다. 사료는 실험동물용 일반 사료 (샘타코바이오코리아, 경기도 오산시, 한국)를 자유섭취로 급이시켰다. 동물들은 4개의 군, 일반 사료 파우더(MF), 일반 사료 + 1%(w/w) 유산균 파우더 (하루케어, CJ제일제당) 혼합사료(MF+LAB 1%(w/w)), 일반사료 + 1%(w/w) 유산균 파우더+ 1%(w/w) HemoP1 헴단백 추출물 파우더 혼합 사료(MF+LAB+HP(P) 1%(w/w)), 및 일반사료+ 1%(w/w) 시중 유산균 파우더 + 1%(w/w) HemoC1 헴단백 추출물 파우더 혼합 사료(MF+LAB+HP(C) 1%(w/w))으로 분류하고, 5일 동안 사육하였다. 사육의 개시 전후의 체중을 측정하고, 분변 시료를 채취하였다. 통계적 검정은 Statview 통계프로그램을 이용하여 p<0.05 이하, p<0.001 일 경우 통계적으로 유의한 것으로 검정하였다. 각 항목에 대한 유의한 차이를 나타내는지의 비교 분석은 t 검정 일원 ANOVA(t-test one-way ANOVA)를 이용하여 통계적 유의성을 검증하였다.
하기 표 1에 각 식이에 따른 체중 측정의 결과가 기재된다. 체중은 각 군(n=5)의 평균 및 표준편차로 표시된다.
일반 식이 사육 5일 후 체중(g) 사육 5일 후 체중 증감량 (g)
MF 32.103±0.535 +0.352
MF+LAB 1%, 생균 31.632±1.164 +0.119
MF+LAB+HP(P) 1% 31.490±0.941 -0.261
MF+LAB+HP(C) 1% 31.781±0.889 -0.030
*12주령 수컷 마우스 20 마리의 초기 평균 체중: 31.751±0.868
표 1에 표시된 바와 같이, 일반 사료를 급이했을 때 5일 후의 체중 증가는 0.352 g이었고 유산균만을 추가한 경우(MF+LAB)에는 0.119 g이었다. 유산균과 함께 HemoP1 균주의 헴단백 추출물(MF+LAB+HP(P)) 또는 HemoC1 균주의 헴단백 추출물(MF+LAB+HP(C))을 첨가하였을 때는 각각 0.261 g과 0.030 g이 감량되었다. 5일 후 채취된 분변은 육안으로 관찰하였을 때 모두 통상적인 형태나 모양이었으나, 일반 사료에 유산균만을 추가한 군(MF+LAB)에 속한 마우스 케이지에서 채취한 분변은 수분 함량이 약간 높은 것으로 관찰되었다.
또한, 정장 효과를 확인하기 위해 5일 후 채취한 분변 시료의 장내 세균총 분포는 16S rRNA 서열을 기반으로 분석하였다(천랩 마이크로비옴 분석실, 서울, 한국). 그 결과가 도 1에 도시된다.
일반 사료를 급이한 군(MF)과 대비하여 1%의 유산균 파우더를 함께 급이한 군(MF+LAB)의 분변에서는 장내 균총의 분포는 유산균이 다수 속하는 후벽균문(Firmicutes(Clostridiales)) 균총 비중이 61%에서 29%로 크게 감소하였고, 8%였던 대장균 등이 속하는 프로테오박테리아문(Proteobacteria(Enterobateriales))의 비중이 55%로 크게 증가하였다. 이러한 결과는 시중 유산균 파우더에 포함된 유산균의 장내 정착에 비하여 유산균 파우더에 포함된 당류 성분들에 의해 당류 이용 속도가 높은 프로테오박테리아군의 균총이 빠르게 증가한 것으로 추정되었으며, 육안으로 관찰되었던 분변의 수분함량 증가 결과와도 일치하였다. 반면 HemoP1이나 HemoC1 유래의 미생물 헴단백(HP)이 시중 유산균 파우더와 함께 공급된 군의 경우, 후벽균문이 각각 72% 및 63%이어서, 일반 사료(MF) 군이나 일반 사료와 유산균 파우더를 공급한 군보다 모두 증가한 것을 확인하였다.
실시예 3. 미생물 헴단백 추출물에 의한 닭의 체중조절 및 정장 효과
본 실시예에서는 육계 및 산란계에 실시예 1에서 수득된 미생물 헴단백을 사료 첨가제로 공급하여 그에 따른 체중조절 및 정장 효과를 확인하였다.
3-1. 육계 1차
미생물 헴단백의 체중조절 및 정장에 대한 효과를 확인하는 실험을 위한 동물로 육계 1일령 160수 (ROSS 308)를 이용하여 총 32일 동안 식이 시험을 수행하였다(신소재연구소 시험농장, 경기도 덕소, 한국). 군당 10수의 닭으로 4개의 군, 일반 사료(BD, basal diet, 중앙축산 육계사료), 일반사료와 hemoP1 헴단백 1 ppm(BD+헴단백1ppm), 일반사료와 hemoP1 헴단백 10 ppm(BD+헴단백 10ppm), 일반사료와 유기태철(BTRAX M-Fe) 50ppm(BD+유기태철(BTRAX M-Fe) 50ppm)을 구성하고 총 4회 반복으로 진행하였다. 이 기간 동안 육계의 증체량과 사료 섭취량을 측정하였고, 맹장을 적출한 후 NB 및 MRS 배지에 도말하여 유산균의 CFU를 측정하였다.
식이 FCR
(feed intake/weight gain)		 FCR 비율(%) 맹장중 유산균(108cfu/g) 체중 증가(g) 체중 증가율(%)
BD 1.42±0.08 100.0 3.7 1579.3±21.4 100
BD+헴단백1ppm 1.33±0.06 106.8 6.9 1553.9±31.0 97.1
BD+헴단백 10ppm 1.34±0.04 106.0 8.8 1559.0±43.6 98.7
BD+유기태철(BTRAX M-Fe) 50ppm 1.32±0.05 107.6 2.1 1582.6±44.1 100.2
표 2에 기재된 바와 같이, 각각 1 ppm 및 10 ppm의 헴단백을 일반 사료(BD)와 함께 식이하였을 때 육계의 체중은 일반 사료(BD)만 식이한 육계보다 각각 2.9% 및 1.3% 작은 체중 증가율을 나타냈다. 음성 대조군으로써 유기태 철이 포함된 식이(BD+유기태철(BTRAX M-Fe) 50ppm)를 공급받은 육계에서는 일반 사료 군과 비교하여 체중 증가율이 거의 변화가 없었다. 도축 이후 적출한 맹장속의 유산균의 CFU 또한 각각 6.9 x 108 cfu/g, 8.8 x 108 cfu/g로 일반 사료 대비 3.2 x 108 cfu/g, 5.1 x 108 cfu/g 만큼 증가하였다. 음성 대조군에 속한 유기태철 포함 사료를 식이한 육계의 맹장에서는 2.1 x 108 cfu/g로 오히려 일반 식이군보다 유산균 총 CFU가 낮았다.
3-2. 육계 2차
3-1에서와 마찬가지로 육계 1일령 240수 (ROSS 308)를 이용하여 총 32일 동안 식이 시험을 수행하였다(신소재연구소 시험농장, 경기도 덕소, 한국). 군당 10수의 닭으로 4개의 군, 일반 사료(BD, basal diet, 중앙축산 육계사료), 일반사료와 hemoP1 헴단백 0.5ppm(BD+헴단백 0.5ppm), 일반사료와 hemoP1 헴단백 1ppm(BD+헴단백 1ppm), 일반사료와 hemoP1 배양액 건조물(hemoP1 배양액 전체를 건조한 분말) 5 ppm(BD+헴단백배양물 5ppm)을 구성하고 총 6회 반복으로 진행하였다. 이 기간 동안 육계의 증체량과 사료 섭취량을 측정하였고, 맹장을 적출한 후 NB(Nutrient Broth) 및 MRS 배지에 도말하여서 유산균의 CFU를 측정하였다.
식이 FCR
(feed intake/weight gain)		 FCR 비율(%) 맹장 중 유산균(108cfu/g) 체중 증가(g) 체중 증가율(%)
BD 1.58±0.06 100.0 0.5 1514.1±69.4 100
BD+헴단백 0.5ppm 1.56±0.06 101.3 6.83 1435.9±52.7 94.8
BD+헴단백 1ppm 1.56±0.07 101.3 1.79 1454.1±31.8 96.1
BD+헴단백배양물 5ppm 1.55±0.08 101.9 7.25 1473.2±58.3 97.3
0.5 ppm, 1ppm의 hemoP1 헴단백이나 혹은 hemoP1 배양액 건조물 5ppm을 일반 사료와 같이 식이하였을 때는 일반 사료만을 식이한 육계와 비교하여 체중이 각각 5.2%, 3.9%, 2.7% 감소한 것을 확인하였으며, 맹장속의 유산균의 CFU도 각각 6.83 * 108 cfu/g, 1.79 * 108 cfu/g, 7.25 * 108 cfu/g로 일반사료 대비 각각 13.66배, 3.58배, 14.5배 높은 것으로 재확인되였다.
3-3. 산란계
78주령의 산란 노계 42마리를 이용하여 8주 (2/24/20 ~ 4/20/20) 동안 실험하였다. 총 2개의 군, 일반사료를 급이한 군(BD)과 일반사료와 헴단백 1ppm을 같이 급이한 군(BD+헴단백 1 ppm)으로 진행하였다. 이 기간 동안 산란된 계란을 모아서 알의 중량을 측정하였으며, 실험이 끝난 후에는 맹장을 분리해서 MRS 배지에 도말한 후 유산균의 CFU를 측정하였다.
식이 계란 중량(g) 계란 중량 비율 (%) 맹장 중 유산균
(108cfu/g)
BD 64±2.2 100.0 3.3
BD+헴단백 1ppm 62±1.4 96.8 4.5
일반사료에 비해서 햄단백 1ppm을 같이 식이했을 때 알의 중량이 3.2% 감소하였고, 맹장 중 유산균의 CFU가 36% 증가하였음을 확인하였다.
실시예 4. 미생물 헴단백 추출물에 의한 비만 마우스에서의 체중조절 및 정장 효과 (1차 비만 마우스 실험)
본 실시예에서는 고지방 식이(high fat diet: HFD)에 의해 비만을 유도한 마우스에서 미생물 헴단백 추출물에 의한 체중 조절, 즉, 체중 증가 억제 및 정장 효과를 확인하였다.
미생물 헴단백 추출물은 실시예 1에 기재된 바와 같이 제조된 hemoP 시료로, 60% HFD에 0.5 g/kg (HFD) 및 5 g/kg (HFD)로 혼합하여 자유 섭취시켰다.
정상 대조군은 기본 식이인 AIN 93G diet를 자유 섭취시켰고, 비만 대조군에는 60% HFD (kcal당 지방 60%, Research Diets Inc., New Brunswick, NJ, USA)를 자유 섭취시켰다 (표 5).
하나바이오(한국)로부터 C57BL/6 마우스 5주령 수컷을 분양받아 (주)동남의화학연구원 동물사에서 7 일간 검역과 순화, 사육을 거친 건강한 동물로 시험하였다. 사육 시 조명시간은 12시간 주기로 설정하고, 식이와 급수는 자유 섭취시켰다. 본 실험은 (주)동남의화학연구원 동물실험윤리위원회 (No. SEMI-22-001, Institutional Animal Care and Use Committee)의 방침 및 법규에 따라 수행하였다.
4-1. 마우스에서 비만 유도
비만 유도를 위해 정상군(N, n=5)을 제외한 실험동물 (n=20)에 8주간 하기 표 5에 표시된 조성을 갖는 고지방 식이(HFD)를 섭취시켰다. 정상군(N)에는 일반적 사료인 AIN 93G diet를 자유 섭취시켰다.
성분 HFD (D12492)
g kcal
카세인, 30 메쉬 200 800
L-시스테인 3 12
옥수수 전분 0 0
말토덱스트린 10 125 500
수크로오스 68.8 275
셀룰로오스, BW 200 50 0
대두유 25 225
라드 245 2205
미네랄 믹스 S10026 10 0
인산 이칼슘 13 0
탄산칼슘 5.5 0
포타슘 시트레이트 일수화물 16.5 0
비타민 믹스 V10001 10 40
콜린 비타르트레이트 2 0
FD&C Red Dye #40 0 0
FD&C Blue Dye #1 0.05 0
FD&C Yellow Dye #40 0 0
총합 773.85 4057
비만 유도 후 군간 평균 체중 및 표준편차가 균일하도록 HFD 단독 투여 군(비만 대조군, C), HFD와 hemoP 0.5 g/kg (0.05%) 투여 군(SL), 및 HFD와 hemoP 5 g/kg (0.5%) 투여 군(SH)으로 분류하였다 (각 군당 5마리). 고지방 식이와 hemoP를 섭취시키는 기간에 실험동물의 체중, 사료 섭취량 및 음수량을 3일마다 측정하였다.
4-2. 부검 및 조직 적출
실험 종료 후에, 실험 동물을 CO2로 마취하여 희생시키고, 군별 지방량 비교를 위해 부고환 주위 지방, 신장 주위 지방, 후복강 지방과 장간막 지방을 적출하여 중량을 측정하였다.
4-3. 결과
(1) 비만 유도
4-1에 기재된 바와 같이 고지방 식이를 8주간 급여한 20마리의 마우스(비만군)는 고지방 식이를 급여하는 동안 체중이 지속적으로 증가하였으며, 8주 후 평균 체중이 40g이 넘었다. 정상적인 식이를 급여한 정상 군(N) 대비 비만 군의 체중 증가량은 약 172%였고, 이에 의해 비만이 유도된 것으로 확인하였다.
(2) 헴단백 추출물에 의한 효과
-체중
(1)에서 확인된 고지방 식이 급이로 비만 마우스 모델 제작 후 헴단백 추출물을 혼합한 식이를 2주간 급이하였다. 헴단백 추출물을 혼합한 식이를 급이하는 동안 마우스의 체중변화를 관찰하였다. 표 6에 체중 측정 결과가 표시된다. 각 값은 5회 측정의 평균 ± 표준 편차로 표시된다. 혼합 급이 군 SL 및 SH는 각각 헴단백 추출물 hemoP 0.5 g/kg 및 5 g/kg을 고지방 식이에 혼합하여 급이하였다.
주 체중 (g)
정상 대조군(N) 비만 대조군 (C) 혼합 급이군 (SL) 혼합 급이군 (SH)
초기 26.799 ± 0.315 41.866 ± 1.769 41.720 ± 0.380 41.795 ± 2.363
1주차 27.346 ± 0.341 43.911 ± 1.292 41.570 ± 0.404 41.943 ± 2.310
2주차 27.760 ± 0.291 46.722 ± 1.099 43.771 ± 0.299 44.324 ± 2.146
체중 변화 0.961 4.856 2.051 2.529
도 2는 2주간 급이 완료 후 정상 대조군 (N), 비만 대조군 (C), 헴단백 추출물 0.5g/kg 혼합 급이한 군 (SL), 및 헴단백 추출물 5 g/kg 혼합 급이한 군 (SH) 마우스를 보여준다. 비만 대조군 (C) 대비 헴단백 추출물을 혼합 급이한 SL 및 SH 군은 체중 증가량이 유의하게 더 낮고, 외형상으로도 더 슬림했다.
- 지방 조직 중량
고지방 식이를 급이한 모든 군의 지방 조직 중량이 정상군 대비 증가하였다. 정상 대조군(N)은 비만 대조군(C) 대비 부고환 주위 지방, 신장 주위 지방, 후복강 지방 및 장간막 지방 조직 중량이 모두 감소하였고, 헴단백 추출물을 혼합 급이한 SL 및 SH 군도 비만 대조군 대비 지방 중량이 감소하는 경향을 보였다. 도 3에 결과가 도시된다. 도 3의 (a) 내지 (d)는 각각 부고환 주위 지방, 신장 주위 지방, 후복강 지방 및 장간막 지방 조직 중량을 나타낸다.
- 체중 대비 지방조직 중량 비율
각 군의 마우스 개체에 대해 체중 대비 지방 조직 중량의 비율을 측정하였다. 도 4에 그 결과가 도시된다. 정상 대조군의 체중 대비 지방 조직 중량의 비율은 비만 대조군 대비 부고환 주위 지방, 신장 지방, 후복강 지방, 및 장간막 지방 모두에서 유의하게 감소하였다. 또한, 헴단백 추출물을 혼합 급이한 SL 및 SH군도 비만 대조군 대비 체중 대비 지방 조직 중량의 비율 감소를 보였다.
- 장내 균총 중 아커만시아(Akkermensia) 속 미생물의 비율
아커만시아(Akkermensia) 속 미생물은 절대혐기성 장내미생물로써, 일반적으로 비만인 경우에 균총에서의 비중이 감소하고, 정상 체중일수록 균총에서의 비중이 증가하는 것으로 최근 연구에서 보고되었다( https://microbiome.chunlab.com/wiki/akkermansia-muciniphila/).
부검 전에 비만 대조군, 혼합 급이군 SL, 및 SH의 마우스 케이지에서 분변을 즉각 채취한 후, 16S rRNA 서열 기반으로 장내 균총에 포함된 Akkermensia 속 장내 미생물의 양을 측정하였다(CJ라이프사이언스 마이크로비옴 분석실, 수원, 한국). 그 결과가 표 7에 표시된다.
Akkermentia속 미생물의 비율 (%)
비만 대조군 (C) 혼합 급이군 (SL) 혼합 급이군 (SH)
4.24 15.16 11.33
비만 대조군에서 4.24%에 불과하던 Akkermensia 속 미생물의 비중은 혼합 급이군에서 각각 15.16%, 11.33%로 더 높게 나타났으며, 비만과 역비례 하는 경향을 나타냈다.
실시예 5. 미생물 헴단백 추출물에 의한 비만 마우스에서의 체중조절 효과 (2차 비만 마우스 실험)
실시예 4에서 확인된 고지방 식이(high fat diet: HFD)에 의해 비만을 유도한 마우스에서 미생물 헴단백 추출물에 의한 체중 조절, 즉, 체중 증가 억제 및 정장 효과를 재확인하기 위해 실시예 4와 동일한 방법으로 2차 실시하였다. 부검 이후 지방 조직 적출에서 피하 지방을 추가로 적출하여 중량을 측정하였다. 그 결과가 표 8 및 표 9에 표시된다. 표 8 및 표 9는 각각 비만 유도 마우스에서 고지방 식이에 각각 중량 기준 0.05% 및 0.5%의 헴단백 추출물이 혼합된 사료를 자유급식한 마우스의 10일간 체중 변화 및 희생 후 적출한 지방 조직의 중량을 보여준다.
주 체중 (g)
정상 대조군(N) 비만 대조군 (C) 혼합 급이군 (SL) 혼합 급이군 (SH)
초기 24.801 ± 1.033 34.906 ± 2.228 34.723 ± 2.563 34.648 ± 2.338
5일차 25.466 ± 0.684 36.359 ± 2.355 35.477 ± 2.732 35.927 ± 2.797
10일차 25.341 ± 0.934 37.840 ± 2.488 36.469 ± 2.943 37.401 ± 2.862
체중 변화 0.540 2.934 1.746 2.753
조직 지방조직 중량 (g)
정상 대조군(N) 비만 대조군 (C) 혼합 급이군 (SL) 혼합 급이군 (SH)
부고환지방 0.491 ± 0.084 2.581 ± 0.347 2.290 ± 0.364 2.282 ± 0.392
신장지방 0.056 ± 0.015 0.238 ± 0.052 0.203 ± 0.054 0.230 ± 0.045
장간막지방 0.399 ± 0.040 1.078 ± 0.130 0.922 ± 0.521 0.984 ± 0.226
후복강지방 0.110 ± 0.023 0.751 ± 0.144 0.737 ± 0.178 0.726 ± 0.102
피하지방 0.297 ± 0.045 2.373 ± 0.571 1.313 ± 0.305 1.596 ± 0.390
고지방 식이를 공급한 세 군 (C, SL, SH) 모두 정상 대조군 (N)보다 높은 체중 및 지방조직 중량을 나타냈다. 고지방 식이 군 중에서는 헴단백과 혼합 급이한 두 군 (SL, SH)의 체중 및 모든 지방 조직의 중량이 비만 대조군 (C)보다 낮아졌다. 따라서 헴단백 공급에 의한 비만 마우스에서의 체중 감량 및 지방조직 감량 효과를 재확인하였다.
실시예 6. 미생물 헴단백 추출물 임의 급이에 의한 반려견에서의 정장 효과
미생물 헴단백 추출물에 의한 반려견에서의 정장 효과를 확인하기 위해 각 견주의 자유 판단에 따른 개별적 급이 방법으로 정상적인 사료의 급이와 함께 미생물 헴단백 추출물을 포함하는 간식 제품(상품명: 바이오-트릿; 사료등록번호: 서울-28372호; 종류: 혼합성 단미사료; 성분량: 조단백질 10.1%, 조지방 5%, 조섬유 0.7%, 조회분 2.3%, 수분 18%; 원료의 명칭: 황태 20%, 단호박 14.8%, 오리 10%, 당근 10%, 현미 5%, 연어 5%, 홍합 5%, 양배추 4%, 고구마 5%, 브로콜리 3%, 코코넛 3%, 타피오카 전분 10%, 글리세린 5%, 헴단백[코리네박테리움 발효부산물] 0.2%; 제조원: ㈜하이텍코리아; 판매원: ㈜헤모랩)을 임의로 제공하면서 2주 동안 각 견주 소유 반려견의 분변 시료를 채취하였다.
간식의 제공 전에 채취된 분변 시료와 1봉의 간식제품(총 중량: 100g)을 모두 급이한 이후 분변 시료를 수득하여 균총을 조사하였다. 분변 시료의 장내 세균총 분포는 16S rRNA 서열을 기반으로 분석하였다(CJ라이프사이언스 마이크로비옴 분석실, 수원, 한국). 그 결과가 도 5에 도시된다.
헴단백 추출물을 포함하는 간식을 제공하기 전 분변 시료 대비 헴단백 추출물을 포함하는 간식을 섭취한 후 채취된 분변 시료는 유익균인 유산균이 다수 속하는 후벽균문(Firmicutes) 균총 비중이 크게 증가하고, 대장균 등이 속하는 프로테오박테리아문(Proteobacteria)의 비중이 감소된 것으로 확인되었다. 헴단백 추출물의 임의공급에 의한 섭취에 의해서도 반려견의 장내 세균총이 유익균의 비율을 높이는 방향으로 개선된 것을 확인하였다.
이러한 결과는 미생물 헴단백 또는 미생물 헴단백의 함량이 높은 미생물 배양물로부터 수득된 건조물이 정장 효과 및 지방 조직의 중량 감소 효과를 갖는다는 것을 보여준다.

Claims (7)

  1. 미생물 헴단백 추출물을 포함하는 정장 및 비만 개선용 조성물.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 미생물 헴단백 추출물은 헴철 생산능을 갖는 미생물의 배양에 의해 수득된 미생물 배양액, 그로부터 분리된 미생물 균체, 또는 그로부터 분리되고 정제된 헴단백의 형태인 것인 조성물.
  3. 청구항 2에 있어서, 상기 미생물은 유전자 조작 없이, 생장 속도 및 헴철 생산능에 대한 적응진화에 의해 선별되어 모균주에 비해 높은 헴단백 함량을 갖는 미생물인 것인 조성물.
  4. 청구항 2에 있어서, 상기 미생물 헴단백 추출물은 상기 미생물 배양액으로부터 미생물 균체를 회수하는 단계, 회수된 미생물 균체를 재현탁시키고, 파쇄시키는 단계, 및 파쇄된 현탁액을 원심분리하거나, 건조시키는 단계를 포함하는 방법에 의해 수득되는 것인 조성물.
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 조성물은 사료 원료, 식품 원료, 또는 건강보조식품으로 사용되는 것인 조성물.
  6. 청구항 1에 있어서, 상기 조성물은 체중 대비 지방 비율을 감소시켜 비만을 개선하는 것인 조성물.
  7. 청구항 1 내지 6 중 어느 한 항에 따른 조성물을 포함하는, 정장 및 비만 개선용 사료 첨가제.
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