KR20230077252A - Primer set for detecting broad bean wilt virus using the loop-mediated isothermal amplification reaction and uses thereof - Google Patents
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Abstract
본 발명은 잠두위조바이러스에 감염된 고추에서 발현되는 RNA2 유전자의 특정 부위에 특이적인 프라이머 세트를 이용함으로써 다른 바이러스와의 간섭 현상 없이 높은 감도로 정밀하면서 신속하게 잠두위조바이러스를 검출할 수 있다.In the present invention, by using a primer set specific to a specific region of the RNA2 gene expressed in peppers infected with the filamentous soybean sham virus, it is possible to accurately and quickly detect the fava schizovirus with high sensitivity without interference with other viruses.
Description
본 발명은 잠두위조바이러스(broad bean wilt virus 2; BBWV2)를 검출할 수 있는 루프-매개 등온증폭반응 (loop-mediated isothermal amplification; LAMP)용 프라이머 세트와 이를 포함하는 키트에 관한 것이다. The present invention relates to a primer set for loop-mediated isothermal amplification (LAMP) capable of detecting broad bean wilt virus 2 (BBWV2) and a kit including the same.
잠두위조바이러스(broad bean wilt virus; BBWV)는 코모비리대(Comoviridae) 과 파바바이러스(Fabavirus) 속에 속하는 직경 25 내지 30nm의 구형 바이러스를 말하며, 선형 게놈을 가지고 있고, 2종류의 외피 단백질을 포함한다. 1947년 잠두에서 처음 분리하여 보고된 이래, 다양한 국가들에서 서식하는 여러 작물에 문제를 일으키고 있으며, 우리나라에서도 90년대 전북 지역에 첫 발병이 보고된 이후로, 2000년대 이후에는 전남 및 경남 지역 등으로 전파되어 전국 각지 등으로 확산되어 고추, 콩과 식물, 시금치, 들깨, 샐러리 등에 감염된 것으로 보고되고 있다. BBWV2는 종자 전염은 되지 않지만, 즙액 전염이 용이하고 진딧물에 의해 쉽게 전파되는 특징으로 인해 다양한 원예 및 관상용 작물에 큰 경제적 피해를 초래한다. Broad bean wilt virus (BBWV) refers to a spherical virus with a diameter of 25 to 30 nm belonging to the genus Comoviridae and Fabavirus, and has a linear genome and contains two types of envelope proteins. . Since it was first isolated and reported from broad bean in 1947, it has caused problems in various crops in various countries. It has been reported that it spreads to various parts of the country and is infected with peppers, legumes, spinach, perilla seeds, and celery. Although BBWV2 is not transmitted by seeds, it causes great economic damage to various horticultural and ornamental crops due to its easy sap transmission and easy propagation by aphids.
특히, 고추에서 발생하는 잠두위조바이러스는 혈청학적으로 BBWV1과 BBWV2로 나뉘지만, 국내에서는 잠두위조바이러스(broad bean wilt virus 2; BBWV2)만 발생한 것으로 확인된 바 있다. 상기 바이러스는 치료제가 없기에 주기적인 감염 여부 진단을 통해 바이러스 확산을 미연에 방지하는 것이 무엇보다도 중요하고, 이를 위해서는 빠른 선제적 진단이 필수적으로 요구되는 실정이다. 현재, 잠두위조바이러스 감염 여부의 진단은 일반 PCR을 통해 이루어지고 있어 진단 결과를 확인하기까지 오랜 시간이 소요되는 문제점이 존재한다. In particular, broad bean wilt virus from red pepper is serologically divided into BBWV1 and BBWV2, but only broad bean wilt virus 2 (BBWV2) has been confirmed to have occurred in Korea. Since there is no treatment for the virus, it is most important to prevent the spread of the virus in advance through periodic diagnosis of infection, and for this, rapid preemptive diagnosis is essential. Currently, diagnosis of bovine bean falsification virus infection is performed through general PCR, so there is a problem in that it takes a long time to confirm the diagnosis result.
본 발명의 LAMP 진단법은 2000년 Notomi 등이 처음으로 개발한 등온 유전자 증폭법으로 기존의 PCR 기반 진단법에서 사용되는 Taq DNA 중합효소와 달리 목표유전자를 사슬 치환 (strand displacement) 방식에 의해 대량 증폭할 수 있는 Bst DNA 중합효소를 이용함으로써 유전자 증폭 효율이 월등하게 높다. 현장 진단법으로 활용하기 위해서는 현장에서 반응 결과를 정확하고 손쉽게 판독할 수 있어야 하는데, 등온 조건에서 반응이 이루어지는 LAMP의 특성상 일정한 온도가 유지되는 항온 장비만 있어도 손쉽게 검사가 가능하기 때문에 고가의 특수 장비나 전문 인력이 없는 농가에서도 용이하게 이용될 수 있다.The LAMP diagnostic method of the present invention is an isothermal gene amplification method first developed by Notomi et al. in 2000. Unlike Taq DNA polymerase used in conventional PCR-based diagnostic methods, the target gene can be massively amplified by the strand displacement method. By using the Bst DNA polymerase that is available, the efficiency of gene amplification is remarkably high. In order to be used as an on-site diagnostic method, it is necessary to be able to accurately and easily read the reaction results on site. Due to the nature of LAMP, which reacts under isothermal conditions, it is easy to test even with constant temperature equipment that maintains a constant temperature, so expensive special equipment or specialized experts It can be easily used even in farms without manpower.
본 발명의 일 목적은 잠두위조바이러스의 검출을 위한 루프-매개 등온증폭반응(Loop-Mediated Isothermal Amplification; LAMP)용 프라이머 세트를 제공하는 것이다. One object of the present invention is to provide a primer set for Loop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP) for detection of bovine soybean falsification virus.
본 발명의 다른 목적은 상기 프라이머 세트를 포함하는 잠두위조바이러스의 검출용 조성물을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a composition for detecting bovine soybean falsification virus comprising the primer set.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 프라이머 세트를 포함하는 잠두위조바이러스의 검출용 키트를 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a kit for detecting bovine soybean falsification virus comprising the primer set.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 프라이머 세트를 이용하여 잠두위조바이러스의 감염증을 진단하기 위한 정보 제공 방법을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a method for providing information for diagnosing an infection of bovine soybean falsification virus using the primer set.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.However, the technical problem to be achieved by the present invention is not limited to the above-mentioned problems, and other problems not mentioned will be clearly understood by those skilled in the art from the following description.
이하, 본원에 기재된 다양한 구체예가 도면을 참조로 기재된다. 하기 설명에서, 본 발명의 완전한 이해를 위해서, 다양한 특이적 상세사항, 예컨대, 특이적 형태, 조성물 및 공정 등이 기재되어 있다. 그러나, 특정의 구체예는 이들 특이적 상세 사항 중 하나 이상 없이, 또는 다른 공지된 방법 및 형태와 함께 실행될 수 있다. 다른 예에서, 공지된 공정 및 제조 기술은 본 발명을 불필요하게 모호하게 하지 않게 하기 위해서, 특정의 상세사항으로 기재되지 않는다. "한 가지 구체예" 또는 "구체예"에 대한 본 명세서 전체를 통한 참조는 구체예와 결부되어 기재된 특별한 특징, 형태, 조성 또는 특성이 본 발명의 하나 이상의 구체예에 포함됨을 의미한다. 따라서, 본 명세서 전체에 걸친 다양한 위치에서 표현된 "한 가지 구체예에서" 또는 "구체예"의 상황은 반드시 본 발명의 동일한 구체예를 나타내지는 않는다. 추가로, 특별한 특징, 형태, 조성, 또는 특성은 하나 이상의 구체예에서 어떠한 적합한 방법으로 조합될 수 있다.Hereinafter, various embodiments described herein are described with reference to the drawings. In the following description, numerous specific details are set forth, such as specific forms, compositions and processes, etc., in order to provide a thorough understanding of the present invention. However, certain embodiments may be practiced without one or more of these specific details, or with other known methods and forms. In other instances, well known processes and manufacturing techniques have not been described in specific detail in order not to unnecessarily obscure the present invention. Reference throughout this specification to “one embodiment” or “an embodiment” means that a particular feature, form, composition or characteristic described in connection with the embodiment is included in one or more embodiments of the invention. Thus, the appearances of "in one embodiment" or "an embodiment" in various places throughout this specification do not necessarily refer to the same embodiment of the invention. Additionally, particular features, forms, compositions, or properties may be combined in one or more embodiments in any suitable way.
본 발명 내 특별한 정의가 없으면 본 명세서에 사용된 모든 과학적 및 기술적인 용어는 본 발명이 속하는 기술분야에서 당업자에 의하여 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다.Unless there is a specific definition within the present invention, all scientific and technical terms used herein have the same meaning as commonly understood by a person skilled in the art to which the present invention belongs.
본 발명의 일 구현 예에 따르면, 잠두위조바이러스(broad bean wilt virus 2; BBWV2)의 검출용 프라이머 세트에 관한 것이다. According to one embodiment of the present invention, it relates to a primer set for detecting broad bean wilt virus 2 (BBWV2).
본 발명에서 상기 "잠두위조바이러스(BBWV)"는 코모비리대(Comoviridae) 과 파바바이러스(Fabavirus) 속에 속하며, 직경 25 내지 30nm의 구형 바이러스이며, 입자는 감염 세포 내의 세포질 및 액포에 결정체로 존재하고, 세포질 내에 세포 봉입체를 함유한다. 혈청학적 및 분자적 연구에 의해 BBWV는 잠두위조바이러스 1(BBWV1)과 잠두위조바이러스 2(BBWV2)의 두 그룹으로 분류된다. 2분절 선상 게놈을 가지고 있으며, 2종류의 외피단백질을 가지고 있다. 종자 전염은 되지 않으나, 즙액 전염이 용이하며, 진딧물, 주로 Aphis gossypii 및 Myzus persicae에 의해 전파되며 감염률은 60 내지 90 %이며, 13과 약 80종의 식물에 감염성이 있는 것으로 알려져 숙주 범위가 매우 넓다.In the present invention, the "BBWV" belongs to the genus Fabavirus of the family Comoviridae, and is a spherical virus with a diameter of 25 to 30 nm, and the particles exist as crystals in the cytoplasm and vacuoles in the infected cell, , and contain cell inclusion bodies within the cytoplasm. Serological and molecular studies have classified BBWV into two groups: broad bean sham sham virus 1 (BBWV1) and broad sham sham virus 2 (BBWV2). It has a two-segment linear genome and has two types of envelope proteins. It is not transmitted by seeds, but it is easily transmitted by sap, and it is transmitted by aphids, mainly Aphis gossypii and Myzus persicae. .
본 발명에서 잠두위조바이러스 중 BBWV1과 BBWV2의 게놈은 서로 유사한 게놈 구조와 기능을 보이고 있지만 이들 사이의 뉴클레오티드(nt) 서열 동일성은 39 내지 67 % 수준으로 제한적이다. 상기 잠두위조바이러스의 게놈은 2 개의 단일 가닥 포지티브 센스 RNA 분자, RNA-1 및 RNA-2로 구성되며, 상기 분자는 20면체 비리온으로 개별적으로 캡슐화된다. 국내에서는 BBWV1은 아직 검출되지 않았지만, BBWV2에 의한 질병 발생이 보고되고 있다. BBWV2의 RNA-1 및 RNA-2 유전자는 각각 길이가 약 6kb 및 4kb 뉴클레오티드로 구성되고, 단일 오픈 리딩 프레임(ORF)을 포함하고 따라서 기능적 단백질이 단백질 분해 절단에 의해 생성되는 단일 폴리단백질 전구체로 번역된다. RNA-1은 보조인자 프로테아제(Co-pro), NTP-결합 모티프(NTBM), 게놈 연결 바이러스 단백질(VPg), 프로테아제(Pro) 및 RNA-의존성 RNA 중합효소(RdRp)를 포함하는 5개의 단백질을 인코딩하는 반면 RNA2는 3개의 단백질인 운동 단백질(MP), 큰 코트 단백질(LCP) 및 작은 코트 단백질(SCP)을 인코딩한다. 현재까지 다양한 기주 식물에서 분리된 8개의 BBWV2 분리주의 완전한 뉴클레오티드 서열과 25개의 분리된 BBWV2 분리주의 부분 서열이 보고되었다.In the present invention, the genomes of BBWV1 and BBWV2 among broad bean sham viruses show similar genomic structures and functions, but the nucleotide (nt) sequence identity between them is limited to 39 to 67%. The genome of the broad bean falsification virus consists of two single-stranded positive sense RNA molecules, RNA-1 and RNA-2, which are individually encapsulated in icosahedral virions. Although BBWV1 has not yet been detected in Korea, diseases caused by BBWV2 have been reported. The RNA-1 and RNA-2 genes of BBWV2 consist of approximately 6 kb and 4 kb nucleotides in length, respectively, and contain a single open reading frame (ORF), so the functional protein is translated into a single polyprotein precursor produced by proteolytic cleavage. do. RNA-1 is made up of five proteins, including cofactor protease (Co-pro), NTP-binding motif (NTBM), genome-linked viral protein (VPg), protease (Pro), and RNA-dependent RNA polymerase (RdRp). whereas RNA2 encodes three proteins: motor protein (MP), large coat protein (LCP) and small coat protein (SCP). To date, complete nucleotide sequences of 8 BBWV2 isolates isolated from various host plants and partial sequences of 25 isolated BBWV2 isolates have been reported.
본 발명에서 상기 "검출"은 잠두위조바이러스(broad bean wilt virus; BBWV), 바람직하게는 잠두위조바이러스2(broad bean wilt virus 2; BBWV2)의 감염 여부를 판정하는 것으로, 보다 구체적으로 잠두위조바이러스2(BBWV2)의 감염 여부를 모니터링하여 진단하는 것을 포함하는 개념이다.In the present invention, the "detection" refers to determining whether or not infected with broad bean wilt virus (BBWV), preferably broad bean wilt virus 2; BBWV2, and more specifically, broad bean wilt virus 2 (BBWV2) is a concept that includes monitoring and diagnosing the infection.
본 발명에서 상기 "프라이머"는 짧은 자유 3' 말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로서, 카피하고자 하는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥의 올리고뉴클레오티드 서열을 의미한다. 상보적인 주형(template)과 염기 쌍(base pair)을 형성할 수 있고 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하여 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 프라이머는 적절한 완충 용액 및 온도에서 중합반응을 위한 시약(DNA 중합효소 또는 역전사효소) 및 상이한 4 가지 NTP(nucleoside triphospate)의 존재 하에 DNA 합성을 개시할 수 있다. 또한, 프라이머 디자인을 수행할 때에는 표적 DNA의 염기서열의 반복성 정도에 따라서 목표 DNA 내의 유사한 다른 염기서열에서 잘못된 결합이 일어나는 것을 방지하기 위해서 프라이머 염기서열이 매우 주의 깊게 선택되어야 한다. 적절한 프라이머 디자인을 위해 통상적으로 사용되는 방법의 일 예로써 BLAST 검색법이 있으며, 프라이머 자체뿐 아니라 뉴클레오티드 서열도 BLAST에 의해 검색될 수 있다. NCBI 웹도구인 Primer-BLAST 역시 프라이머 디자인에 자주 이용되고 있으며, 기타 상업적인 소프트웨어 도구들도 프라이머 디자인에 이용될 수 있다.In the present invention, the "primer" is a nucleic acid sequence having a short free 3' terminal hydroxyl group, and refers to a single-stranded oligonucleotide sequence complementary to a nucleic acid strand to be copied. It can form a base pair with a complementary template and serve as a starting point for copying the template strand, thereby serving as a starting point for the synthesis of extension products. Primers can initiate DNA synthesis in the presence of a reagent (DNA polymerase or reverse transcriptase) and four different nucleoside triphospates (NTPs) for polymerization at an appropriate buffer solution and temperature. In addition, when designing a primer, the primer sequence must be selected very carefully to prevent erroneous binding to other similar sequences in the target DNA according to the degree of repetitiveness of the sequence of the target DNA. One example of a commonly used method for designing appropriate primers is a BLAST search method, and nucleotide sequences as well as primers themselves can be searched by BLAST. The NCBI web tool Primer-BLAST is also frequently used for primer design, and other commercial software tools can be used for primer design.
본 발명의 프라이머 세트는 프라이머의 크기, Tm 값, 프라이머의 GC 함량, 프라이머 내의 자가-상보적 서열(self-complementary sequence)에 의한 프라이머의 복합체(dimer) 형성 방지, 같은 염기 서열의 3 회 이상 반복금지 등을 충분히 고려하고, 잠두위조바이러스(BBWV2)의 특정 유전자의 민감도와 특이도를 최대화할 수 있도록 세심하게 디자인된 것을 포함한다.The primer set of the present invention includes primer size, Tm value, GC content of the primer, prevention of primer dimer formation by self-complementary sequence in the primer, repetition of the same nucleotide sequence three or more times It includes those carefully designed to maximize the sensitivity and specificity of a specific gene of BBWV2, while fully considering the prohibition.
본 발명의 상기 프라이머는 기본 성질을 변화시키지 않은 추가의 특징을 혼입할 수 있다. 즉 핵산 서열이 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형될 수 있다. 이러한 변형의 예로는 메틸화, 캡화, 뉴클레오티드의 하나 이상의 동족체로의 치환 및 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트 또는 카바메이트 등의 하전되지 않은 연결체나 포스포로티오에이트 또는 포스포로디티오에이트 등의 하전된 연결체로의 뉴클레오티드의 변형이 가능하다. The primers of the present invention may incorporate additional features that do not alter the basic properties. That is, nucleic acid sequences can be modified using a number of means known in the art. Examples of such modifications are methylation, capping, substitution of nucleotides with one or more homologues, and uncharged linkages such as phosphonates, phosphotriesters, phosphoroamidates, or carbamates, or phosphorothioates or phosphorodithioates. Modification of nucleotides into charged linkages such as
본 발명에서 "핵산"은 단일가닥 또는 이중 가닥의 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것으로, 임의의 형태의 하나 이상의 뉴클레오티드를 포함하는 RNA 또는 DNA 분자 또는 그 유사체 및 그 유도체일 수 있다. 또한, 본 발명의 프라이머 세트가 사용되는 잠두위조바이러스의 핵산은 신종 잠두위조바이러스(BBWV2) 유래의 RNA, 예를 들면 유전체의 전부 또는 일부를 포함하고, 또는 이에 상응하는 DNA를 포함하는 것일 수 있다.In the present invention, "nucleic acid" includes single-stranded or double-stranded oligonucleotides or polynucleotides, and may be RNA or DNA molecules containing one or more nucleotides in any form or analogues and derivatives thereof. In addition, the nucleic acid of the broad bean spoofing virus for which the primer set of the present invention is used may include RNA derived from the novel BBWV2, for example, all or part of the genome, or DNA corresponding thereto. .
본 발명의 상기 프라이머는 올리고뉴클레오티드 및 폴리뉴클레오티드와 혼용되어 사용될 수 있으며, 핵산(RNA 또는 DNA), 앱타머 등을 포함할 수 있다. The primers of the present invention may be used in combination with oligonucleotides and polynucleotides, and may include nucleic acids (RNA or DNA), aptamers, and the like.
본 발명에서 상기 프라이머는 잠두위조바이러스2(BBWV2)의 타겟 유전자에 위치하는 서열과 상보적인 서열일 수 있으며, 잠두위조바이러스, 바람직하게는 잠두위조바이러스2(BBWV2) 감염 작물에서 발현되는 타겟 유전자인 RNA2 유전자의 전부 또는 일부에 상보적으로 결합하는 서열일 수 있고, 상기 RNA2 유전자는 서열번호 7로 표시되는 염기서열을 포함하는 것일 수 있다. In the present invention, the primer may be a sequence complementary to a sequence located in a target gene of BBWV2, and is a target gene expressed in crops infected with BBWV2, preferably BBWV2. It may be a sequence that complementarily binds to all or part of the RNA2 gene, and the RNA2 gene may include the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 7.
본 발명에서 상기 프라이머는 루프-매개 등온증폭반응 (Loop-Mediated Isothermal Amplification; LAMP)에 사용되는 것일 수 있고, 바람직하게는 역전사 루프-매개 등온증폭반응 (Reverse transcription Loop-Mediated Isothermal Amplification; RT-LAMP)에 사용되는 것일 수 있다. In the present invention, the primers may be those used for Loop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP), and preferably, reverse transcription Loop-Mediated Isothermal Amplification (RT-LAMP). ) may be used.
본 발명에서 상기 "루프-매개 등온증폭반응 (Loop-Mediated Isothermal Amplification; LAMP)"은 표적 유전자에서 DNA 중합효소 6 내지 8 개의 영역을 특이적으로 인식하도록 제작된 4 내지 6 개의 프라이머를 선택 및 조합 사용하여 사슬 치환 반응을 이용해 증폭시키는 방법으로 감수성 및 특이성을 갖춘 분자 진단학적 방법이다. 프라이머의 설계에서 처음의 증폭 산물의 프라이머 결합 부위에 루프 구조를 생기게 한다. 루프 부분은 한 가닥이므로, 다음의 프라이머가 결합할 수 있다. 사슬 치환 활성이 높은 특수한 DNA 합성효소는 진행 방향에 있는 두 가닥 DNA를 해리 시키면서, 스스로의 신장 반응을 진행해간다. 최종적으로 원래의 표적 서열의 약 정수배의 길이의 증폭 산물이 65 ℃ 1 시간 정도의 반응에서 축적된다. LAMP의 결과는 증폭 산물을 전기 영동하여 특징적인 사다리꼴 모양의 증폭 산물을 확인하거나 증폭 산물의 탁도를 육안으로 확인 또는 리얼 타임 탁도계 (real time turbidometer)를 이용하여 실시간으로 측정하여 판독할 수 있다. 또한, SYBR green과 같은 DNA 염색액을 이용하여 반응이 끝난 증폭 산물을 염색하여 판독할 수도 있다. 본 발명에서 루프-매개 등온증폭법은 기존의 PCR법이 변성(denaturation), 접합(annealing), 신장(extension)의 3 단계를 거치면서 온도의 변화를 주어야 하는 반면, LAMP를 포함한 등온증폭법은 일정한 온도에서 접합 및 신장이 가능하다. 또한, 증폭반응을 위하여 등온 조건으로 약 60 내지 65 ℃ 정도 범위 내에서 한 가지 온도가 사용되며 기존 PCR법에서는 1 쌍의 프라이머를 사용하지만, LAMP법은 2 또는 3 쌍의 프라이머를 사용하여 특이도를 훨씬 높였으며, 증폭 산물의 양 또한 기존 PCR법에 비해 약 1,000 배 정도 높다. 루프-매개 등온증폭법은 기존의 PCR법에서 사용되는 Taq DNA 중합효소 (Taq DNA polymerase) 대신 지오바실러스 스테아로써모필러스 (Geobacillus stearothermophilus)에서 분리한 Bst DNA 중합효소 (Bst DNA polymerase)를 사용하며, 오토-사이클링 DNA 합성에 의존한다. Bst DNA 중합효소 큰 절편(Bst DNA polymerase large fragment)은 5'-3' polymerase 활성을 보유하고 있으나 5'-3' exonuclease 활성을 보유하고 있지 않는다. 특히, Bst DNA 중합효소는 매우 높은 활성을 갖고 있기 때문에 짧은 시간 내에 상당량의 분자량이 큰 DNA를 합성할 수 있으며, 중합 반응은 약 60 내지 65 ℃에서 가장 잘 일어나므로 한 가지 온도 조건 하에서도 대량으로 DNA를 증폭할 수 있어 LAMP법의 주요한 핵심 요소로 이용된다. 본 발명의 루프-매개 등온증폭(LAMP)법은 주형 DNA를 변성시키지 않으면서 유전자 복제를 등온적으로 달성하기 위해 사용될 수 있다. In the present invention, the "Loop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP)" selects and combines 4 to 6 primers designed to specifically recognize 6 to 8 regions of DNA polymerase in a target gene. It is a molecular diagnostic method with sensitivity and specificity as a method of amplification using chain displacement reaction. In the design of primers, a loop structure is created at the primer binding site of the first amplification product. Because the loop portion is single stranded, the following primers can bind to it. A special DNA synthetase with high chain displacement activity proceeds with its own elongation reaction while dissociating the two-stranded DNA in the forward direction. Finally, an amplification product with a length of about an integer multiple of the original target sequence is accumulated in a reaction at 65°C for about 1 hour. The result of LAMP can be read by electrophoresis of the amplification product to confirm the characteristic trapezoidal amplification product, visually checking the turbidity of the amplification product, or measuring in real time using a real time turbidometer. In addition, the amplification product after the reaction can be stained and read using a DNA staining solution such as SYBR green. In the present invention, the loop-mediated isothermal amplification method requires a change in temperature while going through three stages of denaturation, annealing, and extension in the conventional PCR method, whereas the isothermal amplification method including LAMP Bonding and elongation are possible at a constant temperature. In addition, for the amplification reaction, one temperature within the range of about 60 to 65 ° C is used as an isothermal condition, and the conventional PCR method uses one pair of primers, but the LAMP method uses 2 or 3 pairs of primers to achieve specificity. is much higher, and the amount of amplification products is about 1,000 times higher than that of conventional PCR methods. The loop-mediated isothermal amplification method uses Bst DNA polymerase isolated from Geobacillus stearothermophilus instead of Taq DNA polymerase used in conventional PCR methods, It is dependent on auto-cycling DNA synthesis. Bst DNA polymerase large fragment has 5'-3' polymerase activity, but does not have 5'-3' exonuclease activity. In particular, since Bst DNA polymerase has a very high activity, it can synthesize a considerable amount of high molecular weight DNA in a short time, and since the polymerization reaction occurs best at about 60 to 65 ° C, a large amount can be produced even under one temperature condition. Since DNA can be amplified, it is used as a key element of the LAMP method. The loop-mediated isothermal amplification (LAMP) method of the present invention can be used to achieve gene replication isothermally without denaturing the template DNA.
본 발명에서 상기 프라이머는 LAMP용 또는 RT-LAMP용 프라이머 세트로 구성될 수 있다. 본 발명에서 상기 LAMP법 또는 RT-LAMP법에 사용 가능한 프라이머 세트 중 기본 4 종의 프라이머는 외부 프라이머(outer primer) 2 종과 내부 프라이머(internal primer) 2 종으로 구성될 수 있다. 외부 프라이머는 전방 외부(forward outer; F3) 프라이머와 후방 외부(backward outer; B3) 프라이머 2 종으로 구성되고 반응의 비순환기(non-cyclic step)동안 DNA 이중 가닥을 풀어주는 역할을 한다. 또한, 내부 프라이머(inner primer)는 전방 내부(forward inner; FIP) 프라이머와 후방 내부(forward inner; BIP) 프라이머 2 종으로 구성되고 루프-매개 등온증폭반응에 필수적인 고리(loop)를 만들 수 있도록 순방향 또는 역방향 염기서열에 해당하는 뉴클레오티드로 구성될 수 있다. 본 발명에서 상기 추가 2 종의 프라이머는 전방 고리(forward loop; LF) 프라이머와 후방 고리 (backward loop; LB) 프라이머 2 종으로 구성되며 내부 프라이머가 결합하지 않는 염기서열에 부착하여 루프-매개 등온증폭반응을 가속화시킨다. In the present invention, the primer may be composed of a primer set for LAMP or RT-LAMP. In the present invention, among the primer sets usable for the LAMP method or the RT-LAMP method, the basic 4 types of primers may consist of 2 types of outer primers and 2 types of internal primers. The outer primer consists of two types of primers, a forward outer (F3) primer and a backward outer (B3) primer, and serves to unwind the DNA double strand during the non-cyclic step of the reaction. In addition, the inner primer consists of two types of forward inner (FIP) primer and forward inner (BIP) primer, and is forward inner to create a loop essential for loop-mediated isothermal amplification reaction. Alternatively, it may be composed of nucleotides corresponding to reverse nucleotide sequences. In the present invention, the additional two primers are composed of a forward loop (LF) primer and a backward loop (LB) primer, and are attached to a nucleotide sequence to which the internal primer does not bind, resulting in loop-mediated isothermal amplification accelerate the reaction.
본 발명에 있어서 상기 프라이머는 길이가 최소 15 뉴클레오티드이며, 전방 외부 프라이머(F3)와 후방 외부 프라이머(B3)의 경우 최소 10 뉴클레오티드이며, 전방 내부 프라이머(FIP)와 후방 내부 프라이머(BIP)의 경우 최소 25 뉴클레오티드이며, 전방 고리 프라이머(LF)와 후방 고리 프라이머(LB)의 경우 최소 10 뉴클레오티드일 수 있다. In the present invention, the primers are at least 15 nucleotides in length, at least 10 nucleotides in the case of the forward external primer (F3) and the reverse external primer (B3), and at least 10 nucleotides in the case of the forward internal primer (FIP) and the reverse internal primer (BIP). 25 nucleotides, and may be at least 10 nucleotides for forward loop primers (LF) and backward loop primers (LB).
본 발명의 상기 프라이머는 표적 핵산의 상응하는 부분으로, 즉, 상기 RNA2 유전자의 전부 또는 일부와 최소 70 %의 상보성, 특히 80 % 상보성, 더욱 90 % 상보성, 더더욱 특히 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % 또는 100 % 상보성을 가질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.The primers of the present invention have at least 70% complementarity, in particular 80% complementarity, better 90% complementarity, even more particularly 95%, 96%, 97% with the corresponding part of the target nucleic acid, i.e. with all or part of the RNA2 gene. , 98%, 99% or 100% complementarity, but is not limited thereto.
본 발명에서, 상기 프라이머는 RNA2 유전자에 위치하는 서열과 상보적인 서열일 수 있으며, 바람직하게는 서열번호 1 내지 6 중 적어도 하나로 표시되는 프라이머 또는 이와 실질적으로 동일한 것을 포함할 수 있다. 상기 실질적으로 동일한 서열의 프라이머는 서열번호 1 내지 6 각각으로 표시되는 프라이머와 70 %, 바람직하게는 80 %, 더욱 바람직하게는 90 %, 가장 바람직하게는 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % 또는 100 % 상보성을 가지는 것일 수 있다. In the present invention, the primer may be a sequence complementary to a sequence located in the RNA2 gene, and preferably may include a primer represented by at least one of SEQ ID NOs: 1 to 6 or one substantially identical thereto. The primers having substantially the same sequence are 70%, preferably 80%, more preferably 90%, and most preferably 95%, 96%, 97%, 98% of the primers represented by SEQ ID NOs: 1 to 6, respectively. , may have 99% or 100% complementarity.
본 발명에서, 상기 프라이머는 서열번호 1의 서열 내의 20 개의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. In the present invention, the primer may include an oligonucleotide consisting of a segment of 20 consecutive nucleotides in the sequence of SEQ ID NO: 1.
본 발명에서 상기 프라이머는 서열번호 2의 서열 내의 18 개의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다.In the present invention, the primer may include an oligonucleotide consisting of a segment of 18 consecutive nucleotides in the sequence of SEQ ID NO: 2.
본 발명에서, 상기 프라이머는 서열번호 3의 서열 내의 두 개의 다른 부위의 40 개의 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 것일 수 있으며, 앞부분 21 개의 역방향 연속 뉴클레오티드의 절편과 뒷부분 19 개의 순방향 연속 뉴클레오티드로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. In the present invention, the primer may be composed of a fragment of 40 nucleotides at two different sites in the sequence of SEQ ID NO: 3, including an oligonucleotide consisting of a fragment of 21 reverse contiguous nucleotides at the front and 19 contiguous forward nucleotides at the end can do.
본 발명에서, 상기 프라이머는 서열번호 4의 서열 내의 두 개의 다른 부위의 42 개의 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 것일 수 있으며, 앞부분 23 개의 순방향 연속 뉴클레오티드의 절편과 뒷부분 19 개의 순방향 연속 뉴클레오티드로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. In the present invention, the primer may be composed of a segment of 42 nucleotides at two different sites in the sequence of SEQ ID NO: 4, including an oligonucleotide consisting of a segment of 23 forward contiguous nucleotides in the front part and 19 forward contiguous nucleotides in the back part can do.
본 발명에서, 상기 프라이머는 서열번호 5의 서열 내의 18 개의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. In the present invention, the primer may include an oligonucleotide consisting of a segment of 18 consecutive nucleotides in the sequence of SEQ ID NO: 5.
본 발명에서, 상기 프라이머는 서열번호 6의 서열 내의 23 개의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. In the present invention, the primer may include an oligonucleotide consisting of a segment of 23 consecutive nucleotides in the sequence of SEQ ID NO: 6.
본 발명에서, 상기 서열번호 1로 표시되는 프라이머는 외부 프라이머(outer primer)일 수 있으며, 보다 바람직하게는 전방 외부 프라이머(forward outer; F3)일 수 있다. In the present invention, the primer represented by SEQ ID NO: 1 may be an outer primer, more preferably a forward outer primer (F3).
본 발명에서, 상기 서열번호 2로 표시되는 프라이머는 외부 프라이머일 수 있으며, 보다 바람직하게는 후방 외부 프라이머(backward outer; B3) 일 수 있다. In the present invention, the primer represented by SEQ ID NO: 2 may be an external primer, more preferably a backward outer primer (B3).
본 발명에서, 상기 서열번호 3으로 표시되는 프라이머는 내부 프라이머(inner primer)일 수 있으며, 보다 바람직하게는 전방 내부 프라이머(forward inner; FIP)일 수 있다. In the present invention, the primer represented by SEQ ID NO: 3 may be an inner primer, more preferably a forward inner primer (FIP).
본 발명에서, 상기 서열번호 4로 표시되는 프라이머는 내부 프라이머(inner primer)일 수 있으며, 보다 바람직하게는 후방 내부 프라이머(forward inner; BIP)일 수 있다. In the present invention, the primer represented by SEQ ID NO: 4 may be an inner primer, more preferably a forward inner primer (BIP).
본 발명에서, 상기 서열번호 5로 표시되는 프라이머는 고리 프라이머(loop primer)일 수 있으며, 보다 바람직하게는 전방 고리 프라이머(forward loop; LF)일 수 있다. In the present invention, the primer represented by SEQ ID NO: 5 may be a loop primer, more preferably a forward loop primer (LF).
본 발명에서, 상기 서열번호 6으로 표시되는 프라이머는 고리 프라이머(loop primer)일 수 있으며, 보다 바람직하게는 후방 고리 프라이머(backward loop; LB)일 수 있다. In the present invention, the primer represented by SEQ ID NO: 6 may be a loop primer, more preferably a backward loop primer (LB).
본 발명에서 상기 프라이머는, 주형 DNA(template DNA)의 특정 6 부위 중 4 내지 6 부위 모두에 특이적인 4 종 또는 6 종의 프라이머로서, 서열번호 1 내지 6으로 표시되는 프라이머 중 적어도 4 개 이상을 포함하는 프라이머 세트일 수 있고, 바람직하게는 서열번호 1 내지 4로 표시되는 프라이머로 구성된 4 종의 프라이머 세트일 수 있으며, 보다 바람직하게는 서열번호 1 내지 6으로 표시되는 프라이머로 구성된 6 종의 프라이머를 모두 포함하는 프라이머 세트일 수 있다. In the present invention, the primers are 4 or 6 types of primers specific to all 4 to 6 sites out of 6 specific sites of template DNA, and at least 4 or more of the primers represented by SEQ ID NOs: 1 to 6 are used. It may be a primer set including, preferably, it may be a set of 4 primers composed of primers represented by SEQ ID NOs: 1 to 4, and more preferably 6 types of primers composed of primers represented by SEQ ID NOs: 1 to 6. It may be a primer set that includes all.
본 발명의 상기 프라이머는 잠두위조바이러스 감염 작물, 특히는 잠두위조바이러스2(BBWV2) 감염 작물에서 나타나는 RNA2 유전자를 특이적으로 민감도 있게 증폭할 수 있고, 현장에서 잠두위조바이러스 감염 의심 작물에 대하여 루프-매개 등온증폭 반응(LAMP)을 이용하여 신속하고 빠르게 감염 여부를 진단할 수 있다. The primers of the present invention can specifically and sensitively amplify the RNA2 gene appearing in crops infected with bovine bovine wilt virus, in particular, in crops infected with bovine wilt wilt virus 2 (BBWV2), and loop- Infection can be rapidly and rapidly diagnosed using the mediated isothermal amplification reaction (LAMP).
본 발명의 다른 구현 예에 따르면, 본 발명에서 제공하는 프라이머 세트를 포함하는, 잠두위조바이러스의 검출용 조성물에 관한 것이다.According to another embodiment of the present invention, it relates to a composition for detecting bovine soybean falsification virus, including the primer set provided in the present invention.
본 발명에서 상기 검출용 조성물은 LAMP PCR 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 더 포함할 수 있다. 보다 구체적인 시약의 예로써 반응 완충액, 중합효소 및 주형 RNA(Template RNA)가 포함될 수 있다. In the present invention, the detection composition may further include a reagent for performing a LAMP PCR amplification reaction. Examples of more specific reagents may include a reaction buffer, polymerase, and template RNA.
본 발명에서 상기 검출용 조성물은 검출의 편의성을 높이기 위해, 검출용 표지 화합물이 더 함유될 수도 있다. 이 때, 표지되는 화합물은 증폭 과정에서 증폭 산물에 포함되거나, 증폭 산물에 물리적으로 삽입되어 통상적인 방식으로 증폭 산물의 밀도, 농도, 양 등을 확인할 수 있는 화합물, 생체 분자 또는 생체 분자 유사체 등일 수 있으며, SYBR green, FAM, VIC, TET, JOE, HEX, CY3, CY5, ROX, RED610, TEXAS RED, RED670, TYE563 및 NED 등의 형광 염료(Fluorescent Dye)가 사용될 수도 있다. 후술하는 실시예에서는 작업의 용이성, 검출 민감도 등을 고려하여 표지 화합물로 형광 염료를 사용하였으나, 표지 화합물은 앞서 열거한 물질 중 경우에 따라 자유롭게 선택될 수 있으며, 당업계에서 통상적으로 사용되는 물질에 해당한다면 이에 제한되는 것은 아니다. 이외에도 등온증폭반응 또는 역전사 등온증폭반응을 수행하는데 부수적으로 필요한 도구나 시약 등이 더 포함될 수 있다. 상술한 내용은 검출용 조성물의 일부만을 열거한 것으로, 본 발명의 검출용 조성물이 이에 특별히 제한되는 것은 아니다.In the present invention, the composition for detection may further contain a labeling compound for detection in order to increase the convenience of detection. In this case, the labeled compound may be a compound, biomolecule, or biomolecular analogue that is included in the amplification product during the amplification process or physically inserted into the amplification product to confirm the density, concentration, amount, etc. of the amplification product in a conventional manner. In addition, fluorescent dyes such as SYBR green, FAM, VIC, TET, JOE, HEX, CY3, CY5, ROX, RED610, TEXAS RED, RED670, TYE563 and NED may be used. In the examples to be described later, a fluorescent dye was used as a labeling compound in consideration of ease of work, detection sensitivity, etc., but the labeling compound may be freely selected according to the case from the materials listed above, and may be a material commonly used in the art. If applicable, it is not limited thereto. In addition, tools or reagents incidentally necessary for carrying out the isothermal amplification reaction or the reverse transcription isothermal amplification reaction may be further included. The above description lists only a part of the composition for detection, and the composition for detection of the present invention is not particularly limited thereto.
본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 본 발명에서 제공하는 검출용 조성물을 포함하는, 잠두위조바이러스 검출용 키트에 관한 것이다. According to another embodiment of the present invention, it relates to a kit for detecting bovine soybean falsification virus, including the composition for detection provided by the present invention.
본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 본 발명에서 제공하는 프라이머 세트를 이용하여 잠두위조바이러스 감염증을 진단하기 위한 정보 제공 방법에 관한 것이다.According to another embodiment of the present invention, it relates to a method for providing information for diagnosing bovine soybean falsification virus infection using the primer set provided in the present invention.
본 발명에서 상기 방법은 목적하는 개체로부터 얻어진 시료로부터 RNA를 추출하는 단계; 추출된 RNA를 주형으로 하여 본 발명에서 제공하는 프라이머를 이용하여 표적서열을 증폭시키는 단계; 및 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함할 수 있다.In the present invention, the method comprises the steps of extracting RNA from a sample obtained from a subject of interest; Amplifying a target sequence using the extracted RNA as a template and using the primers provided in the present invention; and detecting the amplification product.
본 발명에서 상기 "목적하는 개체"란 식물일 수 있고, 외떡잎 식물과 쌍떡잎 식물을 포함하며, 비제한적인 예시로는 고추, 땅콩, 후추, 감자, 호박, 토마토 및 파프리카로 구성된 군으로부터 선택될 수 있고, 바람직하게는 고추일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.In the present invention, the "object of interest" may be a plant, including monocotyledonous plants and dicotyledonous plants, and non-limiting examples may be selected from the group consisting of peppers, peanuts, peppers, potatoes, pumpkins, tomatoes, and paprika. And, preferably, it may be red pepper, but is not limited thereto.
본 발명에서 상기 "시료"란 개체로부터 얻어지거나 개체로부터 유래된 임의의 물질, 즙액, 조직 또는 세포를 의미하는 것으로, 보다 바람직하게는 식물의 유전자 정보를 확인할 수 있는 모든 시료를 의미할 수 있고, 구체적으로 잎, 줄기, 뿌리, 종자 등으로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.In the present invention, the "sample" means any material, sap, tissue, or cell obtained from or derived from an individual, more preferably any sample from which genetic information of a plant can be confirmed, Specifically, it may be at least one selected from the group consisting of leaves, stems, roots, seeds, etc., but is not limited thereto.
본 발명에서 상기 증폭 산물을 검출하는 단계는 탁도계, 형광 시약, 스핀다운에 의한 침전물 또는 전기 영동(electrophoresis)을 이용하여 증폭된 DNA를 확인하여 수행될 수 있고, 이를 통하여 표적 DNA의 루프-매개 등온증폭(LOOP-mediated isothermal amplification; LAMP) 반응을 모니터링할 수 있다.In the present invention, the step of detecting the amplification product may be performed by confirming the amplified DNA using a turbidimeter, fluorescent reagent, precipitate by spin-down, or electrophoresis, through which loop-mediated isothermal detection of the target DNA The LOOP-mediated isothermal amplification (LAMP) reaction can be monitored.
본 발명의 상기 방법에서 상기 표적서열은 RNA2 유전자의 전부 또는 일부일 수 있다. In the method of the present invention, the target sequence may be all or part of the RNA2 gene.
본 발명의 상기 방법에서 잠두위조바이러스 감염증은 고추 작물에서 발생하는 잠두위조바이러스2(BBWV2)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.In the method of the present invention, the bovine wilt virus infection may be bovine wilt virus 2 (BBWV2) occurring in pepper crops, but is not limited thereto.
본 발명에서는 잠두위조바이러스 감염 작물에서 발현되는 RNA2 유전자를 특이적으로 증폭하는 프라이머 세트를 이용함으로써 다른 바이러스와의 간섭 현상 없이 높은 감도로 정밀하면서 신속하게 잠두위조바이러스를 검출할 수 있다. In the present invention, by using a primer set that specifically amplifies the RNA2 gene expressed in crops infected with filamentous soybean falsification virus, it is possible to accurately and quickly detect fenugreek falsification virus with high sensitivity without interference with other viruses.
도 1은 실시예 2에서 본 발명의 일 실시예에 따른 잠두위조바이러스(BBWV2)의 진단을 위한 LAMP용 프라이머 세트를 이용하여 잠두위조바이러스 외 다른 여러 고추 관련 바이러스에 대한 간섭 실험을 통하여 특이도를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 2는 실시예 3에서 본 발명의 일 실시예에 따른 잠두위조바이러스(BBWV2)의 진단을 위한 LAMP용 프라이머 세트의 민감도를 확인한 도이다.
도 3은 실시예 4에서 본 발명의 일 실시예에 따른 증폭 플롯(amplification plot)을 분석하여 RNA2 유전자의 최소 검출 한계를 확인한 도이다.1 shows specificity in Example 2 through an interference test for various pepper-related viruses other than BBWV2 using a primer set for LAMP for diagnosis of BBWV2 according to an embodiment of the present invention. It is a diagram showing the confirmed result.
2 is a diagram confirming the sensitivity of the LAMP primer set for diagnosis of BBWV2 according to an embodiment of the present invention in Example 3.
Figure 3 is a diagram confirming the minimum detection limit of the RNA2 gene by analyzing an amplification plot according to an embodiment of the present invention in Example 4.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail through examples. These examples are only for explaining the present invention in more detail, and it will be apparent to those skilled in the art that the scope of the present invention is not limited by these examples according to the gist of the present invention. .
실시예 1: 타겟 DNA의 염기서열에 맞는 LAMP 프라이머의 디자인Example 1: Design of LAMP primers suitable for nucleotide sequence of target DNA
본 발명자들은 잠두위조바이러스(broad bean wilt virus 2; BBWV2)의 진단을 위한 RT-LAMP용 프라이머 세트로서 공통적으로 가장 변이가 없는 RNA2 유전자의 가장 안정적인 부위를 찾기 위하여 Genbank에 등록되어 있는 서열들을 참고하여 프라이머를 구상하였다. 상기 segment RNA2 유전자의 염기서열은 서열번호 7로 표시되는 서열로 구성된다. 본 실시예에서 제작한 각각의 외부, 내부 순환 프라이머 (F3, B3, FIP, BIP, LB, LB)들에 대하여 잠두위조바이러스(BBWV2)의 명칭과 조합하여 각각 BBWV2-F3, BBWV2-B3, BBWV2-FIP, BBWV2-BIP, BBWV2-LF, BBWV2-LB로 명명하였다.The present inventors, as a primer set for RT-LAMP for the diagnosis of broad bean wilt virus 2 (BBWV2), refer to the sequences registered in Genbank to find the most stable region of the RNA2 gene with the least mutation in common. A primer was conceived. The nucleotide sequence of the segment RNA2 gene is composed of the sequence represented by SEQ ID NO: 7. For each of the external and internal circulation primers (F3, B3, FIP, BIP, LB, LB) prepared in this example, BBWV2-F3, BBWV2-B3, BBWV2, respectively -FIP, BBWV2-BIP, BBWV2-LF, and BBWV2-LB were named.
1.1 외부 프라이머 2 종의 설계1.1 Design of two external primers
전방 외부 프라이머(F3)로서, 이를 잠두위조바이러스(BBWV2)의 명칭과 결합하여 이하 BBWV2-F3 프라이머로 명명한다. 상기 BBWV2-F3 프라이머는 잠두위조바이러스의 segment RNA2 유전자의 9-28 번째의 순방향 염기서열에 해당되는 20 개의 뉴클레오티드로 제작하였다(서열번호 1). 또한 후방 외부 프라이머(B3)로서, 이를 잠두위조바이러스(BBWV2)의 명칭과 결합하여 이하 BBWV2-B3 프라이머로 명명한다. 상기 BBWV2-B3 프라이머는 잠두위조바이러스의 segment RNA2 유전자의 11-28 번째의 역방향으로 상보적인 염기서열에 해당하는 18 개의 뉴클레오티드로 제작하였다(서열번호 2).As the forward external primer (F3), it is hereinafter referred to as the BBWV2-F3 primer by combining it with the name of BBWV2. The BBWV2-F3 primer was prepared with 20 nucleotides corresponding to the 9th to 28th forward nucleotide sequence of segment RNA2 gene of broad bean falsification virus (SEQ ID NO: 1). In addition, as a reverse external primer (B3), it is named BBWV2-B3 primer hereinafter by combining it with the name of BBWV2. The BBWV2-B3 primer was prepared with 18 nucleotides corresponding to the reverse complementary nucleotide sequence of the 11th to 28th positions of the segment RNA2 gene of the broad bean falsification virus (SEQ ID NO: 2).
1.2 내부 프라이머 2 종의 설계1.2 Design of two types of internal primers
전방 내부 프라이머(FIP)로서, 이를 잠두위조바이러스(BBWV2)의 명칭과 결합하여 이하 BBWV2-FIP 프라이머로 명명한다. 상기 BBWV2-FIP 프라이머는 두 개의 서로 다른 부위의 염기서열을 토대로 설계된 프라이머로 40 개의 뉴클레오티드로 구성되며 프라이머 앞부분 21 개의 뉴클레오티드는 segment RNA2 유전자의 112-132 번째의 염기서열에 대해 역방향으로 상보적인 염기에 해당하며 전방 내부 프라이머 뒷부분은 segment RNA2 유전자의 29-47 번째 염기에 대한 순방향 염기서열에 해당하는 19 개의 뉴클레오티드를 결합해서 프라이머를 제작하였다(서열번호 3). 또한 후방 내부 프라이머(BIP)로서, 이를 잠두위조바이러스(BBWV2)의 명칭과 결합하여 이하 BBWV2-BIP 프라이머로 명명한다. 상기 BBWV2-BIP 프라이머는 두 개의 서로 다른 부위의 염기서열을 토대로 만들어진 프라이머로 42 개의 뉴클레오티드로 구성되며 프라이머 앞부분 23 개의 뉴클레오티드는 segment RNA2 유전자의 90-112 번째 염기의 순방향 염기서열에 해당하는 뉴클레오티드와 프라이머 뒷부분은 segment RNA2 유전자의 29-47 번째 염기에 대해 역방향으로 상보적인 염기서열에 해당하는 19 개의 뉴클레오티드를 결합해서 프라이머를 제작하였다(서열번호 4).As a forward internal primer (FIP), it is hereinafter referred to as BBWV2-FIP primer by combining it with the name of BBWV2. The BBWV2-FIP primer is a primer designed based on the nucleotide sequences of two different sites and consists of 40 nucleotides, and the 21 nucleotides in front of the primer are complementary to the base sequence in the reverse direction to the 112-132 nucleotide sequence of the segment RNA2 gene. Correspondingly, the rear part of the forward internal primer was prepared by combining 19 nucleotides corresponding to the forward nucleotide sequence for bases 29-47 of the segment RNA2 gene (SEQ ID NO: 3). Also, as a reverse internal primer (BIP), it is hereinafter referred to as BBWV2-BIP primer by combining it with the name of BBWV2. The BBWV2-BIP primer is a primer made based on the nucleotide sequences of two different sites and consists of 42 nucleotides, and the 23 nucleotides in front of the primer are nucleotides corresponding to the forward nucleotide sequence of the 90-112 base of the segment RNA2 gene and the primer The rear part was prepared by combining 19 nucleotides corresponding to the complementary nucleotide sequence in reverse direction to bases 29-47 of the segment RNA2 gene (SEQ ID NO: 4).
1.3 추가 2 종 루프(고리) 프라이머의 설계1.3 Design of additional two-loop (ring) primers
전방 고리 프라이머(LF)로서, 이를 잠두위조바이러스(BBWV2)의 명칭과 결합하여 이하 BBWV2-LF 프라이머로 명명한다. 상기 BBWV2-LF 프라이머는 내부 및 외부 프라이머가 부착되지 않는 부위 135-152 번째 염기의 역방향으로 상보적인 염기서열에 해당하는 18 개의 뉴클레오티드로 제작하였다(서열번호 5). 또한 후방 고리 프라이머(LB)로서, 이를 잠두위조바이러스(BBWV2)의 명칭과 결합하여 이하 BBWV2-LB 프라이머로 명명한다. 상기 BBWV2-LB 프라이머는 전방 고리 프라이머와 마찬가지로 내부 및 외부 프라이머가 부착되지 않는 부위 122-144 번째 염기의 순방향 염기서열에 해당하는 23 개의 뉴클레오티드로 구성되어진 프라이머로 제작하였다(서열번호 6).As the forward loop primer (LF), it is hereinafter referred to as BBWV2-LF primer by combining it with the name of BBWV2. The BBWV2-LF primer was prepared with 18 nucleotides corresponding to a nucleotide sequence complementary to the reverse direction of bases 135-152 where the internal and external primers are not attached (SEQ ID NO: 5). Also, as a rear loop primer (LB), it is hereinafter referred to as BBWV2-LB primer by combining it with the name of BBWV2. Like the forward loop primer, the BBWV2-LB primer was prepared as a primer composed of 23 nucleotides corresponding to the forward nucleotide sequence of bases 122-144 to which no internal and external primers are attached (SEQ ID NO: 6).
최종적으로 본 발명자들이 디자인한 segment RNA2 유전자에 특이적인 프라이머 세트는 아래의 표 1과 같다. 하기 표 1은 잠두위조바이러스(BBWV2) 감염증의 진단을 위한 루프-매개 등온증폭반응용 프라이머 6 종의 명칭 및 염기서열을 나타낸 것이다.Finally, the primer set specific to the segment RNA2 gene designed by the present inventors is shown in Table 1 below. Table 1 below shows the names and base sequences of six primers for loop-mediated isothermal amplification reaction for the diagnosis of BBWV2 infection.
또한, 신속 진단을 위한 LAMP용 BBWV2-F3, BBWV2-B3, BBWV2-FIP, BBWV2-BIP 프라이머들은 프라이머 익스플로어 V4 소프트웨어(http://primerexplorer.jp/elamp4.0.0/)를 이용하여 용해 온도(melting temperature; Tm)를 60 내지 65 ℃ 사이로 구성하였다. Tm, GC 비율 및 헤어핀 구조 등의 퀄리티는 Integrated DNA Technologies OligoAnalyzer version 3.1 software를 사용하여 검증한 후 제작하였다.In addition, the BBWV2-F3, BBWV2-B3, BBWV2-FIP, and BBWV2-BIP primers for LAMP for rapid diagnosis were prepared using Primer Explorer V4 software (http://primerexplorer.jp/elamp4.0.0/) at the dissolution temperature ( melting temperature; Tm) was configured between 60 and 65 ° C. Quality such as Tm, GC ratio and hairpin structure was verified using Integrated DNA Technologies OligoAnalyzer version 3.1 software and then produced.
실시예 2. 잠두위조바이러스(BBWV2)의 진단을 위한 LAMP용 프라이머 세트의 특이도 평가Example 2. Evaluation of specificity of a primer set for LAMP for the diagnosis of bovine bovine bogus virus (BBWV2)
잠두위조바이러스 감염 진단 용도로 제작한 LAMP PCR용 프라이머의 민감도를 확인하기 위하여, 상기에서 디자인한 6 종의 프라이머를 이용하여 잠두위조바이러스(BBWV2)에 대한 루프-매개 등온증폭반응을 수행하였다. 상기의 루프-매개 등온증폭반응은 문헌(Mol Cell Probes. 2002 Jun;16(3):223-9.)에 기재된 방법을 기초로 하여 실시하였다. In order to confirm the sensitivity of the LAMP PCR primers designed for diagnosis of bovine soybean bogus virus infection, a loop-mediated isothermal amplification reaction was performed for BBWV2 using the six types of primers designed above. The loop-mediated isothermal amplification reaction was carried out based on the method described in the literature (Mol Cell Probes. 2002 Jun; 16(3):223-9.).
상기 표 1의 프라이머 세트는 높은 상동성을 갖는 잠두위조바이러스(BBWV2)의 감염 시 발현되는 유전자인 RNA2 유전자의 전부 또는 일부를 증폭하도록 설계된 것이다. 이에 따라, 잠두위조바이러스(BBWV2)의 RNA2 유전자 특이성이 있는 서열로 이루어진 프라이머 세트에 해당하는지 검증을 위하여 하기 표 2와 같이 다른 간섭 물질들의 결과를 비교하여 실험하였다(도 1 참조).The primer sets in Table 1 are designed to amplify all or part of the RNA2 gene, which is a gene expressed during infection with BBWV2 having high homology. Accordingly, in order to verify whether it corresponds to a primer set consisting of a sequence having RNA2 gene specificity of BBWV2, the results of other interfering substances were compared and tested as shown in Table 2 below (see FIG. 1).
도 1을 참조하면, 사이클(1 cycle = 45 sec)에 따른 검출 여부를 확인한 결과, 잠두위조바이러스(BBWV2)의 경우에만 양성으로 검출되었음을 알 수 있다. 이를 통하여 상기 프라이머 세트가 간섭 물질에 영향을 전혀 받지 않는다는 사실을 확인함으로써 잠두위조바이러스(BBWV2) 특이성을 검증하였다. Referring to FIG. 1, as a result of checking the detection according to the cycle (1 cycle = 45 sec), it can be seen that only the BBWV2 was detected as positive. Through this, it was confirmed that the primer set was not affected at all by interfering substances, thereby verifying the specificity of bovine bean spoofed virus (BBWV2).
실시예 3. 잠두위조바이러스(BBWV2)의 진단을 위한 LAMP용 프라이머 세트의 민감도 평가Example 3. Sensitivity evaluation of primer set for LAMP for diagnosis of bovine bovine bogus virus (BBWV2)
잠두위조바이러스 감염 진단 용도로 제작한 LAMP PCR용 프라이머의 RNA2 유전자 검출에 있어 LAMP PCR의 민감도를 확인하기 위하여, 동일한 양의 게놈 DNA를 주형으로 사용하여 상기 표 1에서 제작한 LAMP용 프라이머 세트에 대한 테스트를 수행하였으며, 최종 5 uL 부피로 2.5 uL의 Isothermal Master Mix (OptiGene, Japan)를 사용하였다. LAMP PCR은 Thermal Cycler Dice Real Time System TP850 (Takara, Japan)를 이용하여 수행하였으며, 각 LAMP PCR 프라이머 농도는 1 uL(5 pmol)의 외부 프라이머(BBWV2-F3, BBWV2-B3), 1 uL(1.5 pmol)의 내부 프라이머(BBWV2-FIP, BBWV2-BIP)를 사용하였다. PCR 반응은 65 ℃에서 45 초간 초기변성(pre-denaturation) 후, 65 ℃에서 40 사이클을 반복하여 얻어진 LAMP PCR 결과로써, 게놈 DNA를 각각 1, 0.1, 0.01, 0.001, 0.0001, 0.00001 또는 0.000001 ng으로 정량하여 LAMP PCR을 수행한 결과를 도 2에 나타내었다. 증폭 반응의 실시간 검출과 관련하여 사용된 ΔR 값(fluorescence signal)은 염료의 형광 방출 강도로 나눈 리포터 염료의 형광 방출 강도를 나타내는 것으로, 초기 PCR 순환에 대한 주형 또는 표적을 비롯한 모든 성분들을 포함하는 반응의 값을 나타낸다. In order to confirm the sensitivity of the LAMP PCR in detecting the RNA2 gene of the LAMP PCR primer prepared for the purpose of diagnosing bovine bovine bogus virus infection, the same amount of genomic DNA was used as a template for the LAMP primer set prepared in Table 1. The test was performed, and 2.5 uL of Isothermal Master Mix (OptiGene, Japan) was used in a final volume of 5 uL. LAMP PCR was performed using Thermal Cycler Dice Real Time System TP850 (Takara, Japan), and each LAMP PCR primer concentration was 1 uL (5 pmol) of external primers (BBWV2-F3, BBWV2-B3), 1 uL (1.5 pmol) pmol) of internal primers (BBWV2-FIP, BBWV2-BIP) were used. The PCR reaction is the result of LAMP PCR obtained by repeating 40 cycles at 65 ° C after pre-denaturation at 65 ° C for 45 seconds. Quantitatively, LAMP PCR was performed, and the results are shown in FIG. 2 . The ΔR value (fluorescence signal) used in relation to the real-time detection of an amplification reaction represents the fluorescence emission intensity of the reporter dye divided by the fluorescence emission intensity of the dye, which is the reaction containing all components including the template or target for the initial PCR cycle. represents the value of
(단위:ng)density
(Unit: ng)
실험 결과를 상기 표 3 및 도 2에 나타내었다. 도 2에서 보는 바와 같이, 동일한 게놈 DNA의 정량적 조건을 달리하여 검출 민감도를 측정한 결과 1 fg(0.000001 ng)의 BBWV2 RNA 농도까지도 실시간으로 검출이 가능함을 확인하였다. The experimental results are shown in Table 3 and FIG. 2 above. As shown in FIG. 2, as a result of measuring the detection sensitivity under different quantitative conditions of the same genomic DNA, it was confirmed that even a BBWV2 RNA concentration of 1 fg (0.000001 ng) could be detected in real time.
실시예 4. 잠두위조바이러스(BBWV2)의 진단을 위한 LAMP용 프라이머 세트의 검출 효율 평가Example 4. Evaluation of Detection Efficiency of Primer Set for LAMP for Diagnosis of BBWV2
RNA2 유전자 검출에 있어 LAMP PCR의 검출 효율을 비교하기 위하여 분리한 게놈 DNA를 각각 107, 106, 105, 104, 103, 102, 101 및 100 까지 단계적으로 희석(serial dilution)하여 LAMP PCR을 추가적으로 수행하였다. 표준 시료를 대상으로 개발한 LAMP PCR법의 검출 효율을 평가하기 위하여 증폭 산물의 양을 비교하였으며, 최저 검출 한계치(limit of detection; LoD)의 확인을 위해 주형의 양을 달리하여 PCR을 수행한 후 그 산물을 추가로 확인하였다. 실시예 3에서와 같은 방식으로 수행하였으며, 각 LAMP PCR 프라이머 농도는 1 uL(5 pmol)의 외부 프라이머(BBWV2-F3, BBWV2-B3), 1 uL(1.5 pmol)의 내부 프라이머(BBWV2-FIP, BBWV2-BIP)를 사용하였다. PCR 반응은 65 ℃에서 45 초간 초기변성(pre-denaturation) 후, 65 ℃에서 40 사이클을 반복하여 얻어진 LAMP PCR 결과를 표 4 및 도 3에 나타내었다.In order to compare the detection efficiency of LAMP PCR in RNA2 gene detection, the isolated genomic DNA was diluted stepwise to 10 7 , 10 6 , 10 5 , 10 4 , 10 3 , 10 2 , 10 1 and 10 0 , respectively (serial dilution ) to perform additional LAMP PCR. To evaluate the detection efficiency of the LAMP PCR method developed for standard samples, the amount of amplification products was compared, and PCR was performed with different amounts of template to confirm the lowest limit of detection (LoD). The product was further confirmed. It was performed in the same manner as in Example 3, and each LAMP PCR primer concentration was 1 uL (5 pmol) of external primers (BBWV2-F3, BBWV2-B3), 1 uL (1.5 pmol) of internal primers (BBWV2-FIP, BBWV2-BIP) was used. In the PCR reaction, after pre-denaturation at 65 ° C. for 45 seconds, LAMP PCR results obtained by repeating 40 cycles at 65 ° C. are shown in Table 4 and FIG. 3 .
도 3에서 보는 바와 같이, LAMP PCR 결과 RNA2 유전자의 최소 검출 한계치(LoD)는 100 카피/uL 로 측정되었으며, 107, 106, 105, 104, 103, 102, 101, 100 농도까지 증폭이 된 것을 확인할 수 있다(도 3 참조). As shown in FIG. 3, as a result of LAMP PCR, the minimum detection limit (LoD) of the RNA2 gene was measured as 10 0 copies/uL, 10 7 , 10 6 , 10 5 , 10 4 , 10 3 , 10 2 , 10 1 , It can be confirmed that the amplification was performed up to a concentration of 10 0 (see FIG. 3).
이를 통해 루프-매개 등온증폭법을 이용하여 단시간 내에 전문적인 장비 없이도 효과적으로 잠두위조바이러스(broad bean wilt virus2; BBWV2)를 검출할 수 있다. 또한, 고농도의 SYBR Green I을 이용하여 자연광 하에서 육안으로 신속하게 진단할 수 있기에 빠르게 전파하는 감염병을 현장에서 바로 진단함으로써 초기 방역에 기여할 수 있을 것으로 기대된다.Through this, it is possible to effectively detect broad bean wilt virus 2 (BBWV2) in a short time without specialized equipment using the loop-mediated isothermal amplification method. In addition, since high-concentration SYBR Green I can be quickly diagnosed with the naked eye under natural light, it is expected to contribute to early quarantine by diagnosing rapidly spreading infectious diseases on the spot.
이상에서 본 발명에 대하여 상세하게 설명하였지만 본 발명의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고, 청구범위에 기재된 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 다양한 수정 및 변형이 가능하다는 것은 당 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게는 자명할 것이다.Although the present invention has been described in detail above, the scope of the present invention is not limited thereto, and various modifications and variations are possible without departing from the technical spirit of the present invention described in the claims. It will be self-evident to those who have knowledge of
<110> LEE, Hyeong Woo <120> Primer set for detecting broad bean wilt virus using the loop-mediated isothermal amplification reaction and uses thereof <130> PDPB214437 <160> 7 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BBWV2-F3 <400> 1 caaatggcac aacttgagaa 20 <210> 2 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BBWV2-B3 <400> 2 cagctttagc acgaacct 18 <210> 3 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BBWV2-FIP <400> 3 atcgcaccaa ctgcaatctc tgcaaattga gcaagaatgc 40 <210> 4 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BBWV2-BIP <400> 4 gtcaggtgca ggaaacacta aattgtctgg caatctgtca tc 42 <210> 5 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BBWV2-LF <400> 5 cgtcgtgacg tagctagg 18 <210> 6 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BBWV2-LB <400> 6 cagttgtgga gaagtacact gag 23 <210> 7 <211> 200 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> broad bean wilt virus 2 <400> 7 gaaatggaca aatggcacaa cttgagaagc aaattgagca agaatgctcc tagctacgtc 60 acgacgtcag agattgcagt tggtgcgatg tcaggtgcag gaaacactaa attggcgata 120 ccagttgtgg agaagtacac tgaggaagtg gcagatgaca gattgccaga caaggttcgt 180 gctaaagctg atcagataat 200 <110> LEE, Hyeong Woo <120> Primer set for detecting broad bean wilt virus using the loop-mediated isothermal amplification reaction and uses its <130> PDPB214437 <160> 7 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> BBWV2-F3 <400> 1 caaatggcac aacttgagaa 20 <210> 2 <211> 18 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> BBWV2-B3 <400> 2 cagctttagc acgaacct 18 <210> 3 <211> 40 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> BBWV2-FIP <400> 3 atcgcaccaa ctgcaatctc tgcaaattga gcaagaatgc 40 <210> 4 <211> 42 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> BBWV2-BIP <400> 4 gtcaggtgca ggaaacacta aattgtctgg caatctgtca tc 42 <210> 5 <211> 18 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> BBWV2-LF <400> 5 cgtcgtgacg tagctag 18 <210> 6 <211> 23 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> BBWV2-LB <400> 6 cagttgtgga gaagtacact gag 23 <210> 7 <211> 200 <212> DNA <213> unknown <220> <223> broad bean wilt virus 2 <400> 7 gaaatggaca aatggcacaa cttgagaagc aaattgagca agaatgctcc tagctacgtc 60 acgacgtcag agattgcagt tggtgcgatg tcaggtgcag gaaacactaa attggcgata 120 ccagttgtgg agaagtacac tgaggaagtg gcagatgaca gattgccaga caaggttcgt 180 gctaaagctg atcagataat 200
Claims (15)
상기 잠두위조바이러스는 잠두위조바이러스 2(broad bean wilt virus 2; BBWV2)인, 프라이머 세트.According to claim 1,
The primer set, wherein the broad bean wilt virus is broad bean wilt virus 2; BBWV2.
상기 프라이머는 RNA2 유전자의 전부 또는 일부에 특이적인 것인, 프라이머 세트.According to claim 1,
The primers are specific to all or part of the RNA2 gene, the primer set.
상기 프라이머는 루프-매개 등온증폭반응 (Loop-Mediated Isothermal Amplification; LAMP) 또는 역전사 루프-매개 등온증폭반응 (Reverse transcription Loop-Mediated Isothermal Amplification; RT-LAMP)에 사용되는 것인, 프라이머 세트.According to claim 1,
The primer is used for loop-mediated isothermal amplification (LAMP) or reverse transcription loop-mediated isothermal amplification (RT-LAMP), primer set.
상기 프라이머 세트는 서열번호 1 내지 4로 표시되는 프라이머를 포함하는 것인, 프라이머 세트.According to claim 1,
The primer set comprising the primers represented by SEQ ID NOs: 1 to 4, the primer set.
상기 프라이머 세트는 서열번호 1 내지 6으로 표시되는 프라이머를 포함하는 것인, 프라이머 세트.According to claim 1,
The primer set comprising the primers represented by SEQ ID NOs: 1 to 6, the primer set.
상기 잠두위조바이러스는 잠두위조바이러스 2(broad bean wilt virus 2; BBWV2)인, 조성물.According to claim 7,
Wherein the broad bean wilt virus is broad bean wilt virus 2; BBWV2.
상기 검출용 조성물은 반응 완충액, 중합효소, 주형 RNA(Template RNA) 및 검출용 표지 화합물을 추가로 포함하는 것인, 조성물.According to claim 7,
The composition for detection further comprises a reaction buffer, a polymerase, a template RNA (Template RNA) and a labeling compound for detection.
상기 검출용 표지 화합물은 SYBR green, FAM, VIC, TET, JOE, HEX, CY3, CY5, ROX, RED610, TEXAS RED, RED670, TYE563 및 NED으로 구성된 형광 염료(Fluorescent Dye) 군에서 선택된 적어도 하나를 추가로 포함하는 것인, 조성물.According to claim 9,
The labeled compound for detection is at least one selected from the fluorescent dye group consisting of SYBR green, FAM, VIC, TET, JOE, HEX, CY3, CY5, ROX, RED610, TEXAS RED, RED670, TYE563 and NED. To include as, the composition.
추출된 RNA를 주형으로 하여 제 1항의 프라이머 세트를 이용하여 표적서열을 증폭시키는 단계; 및
상기 증폭 산물을 검출하는 단계;를 포함하는 잠두위조바이러스 2(broad bean wilt virus 2; BBWV2)의 감염 또는 감염 질환을 진단하기 위한 정보 제공 방법. Extracting RNA from a biological sample obtained from a subject of interest;
Amplifying a target sequence using the extracted RNA as a template and using the primer set of claim 1; and
A method for providing information for diagnosing an infection or an infectious disease of broad bean wilt virus 2 (BBWV2), comprising: detecting the amplification product.
상기 생물학적 시료는 전혈 (whole blood), 백혈구 (leukocytes), 말초혈액 단핵 세포 (peripheral blood mononuclear cells), 백혈구 연층 (buffy coat), 혈장 (plasma), 혈청 (serum), 객담 (sputum), 눈물 (tears), 점액 (mucus), 세비액 (nasal washes), 비강 흡인물 (nasal aspirate), 호흡 (breath), 소변 (urine), 정액 (semen), 침 (saliva), 복강 세척액 (peritoneal washings), 복수 (ascites), 낭종액 (cystic fluid), 뇌척수막 액 (meningeal fluid), 양수 (amniotic fluid), 선액 (glandular fluid), 췌장액 (pancreatic fluid), 림프액 (lymph fluid), 흉수 (pleural fluid), 유두 흡인물 (nipple aspirate), 기관지 흡인물 (bronchial aspirate), 활액 (synovial fluid), 관절 흡인물 (joint aspirate), 기관 분비물 (organ secretions), 세포 (cell), 세포 추출물 (cell extract) 및 뇌척수액 (cerebrospinal fluid)으로 이루어진 군에서 선택된 1 종 이상인, 방법.According to claim 12,
The biological sample includes whole blood, leukocytes, peripheral blood mononuclear cells, buffy coat, plasma, serum, sputum, tears ( tears, mucus, nasal washes, nasal aspirate, breath, urine, semen, saliva, peritoneal washings, Ascites, cystic fluid, meningeal fluid, amniotic fluid, glandular fluid, pancreatic fluid, lymph fluid, pleural fluid, nipple Nipple aspirate, bronchial aspirate, synovial fluid, joint aspirate, organ secretions, cells, cell extract and cerebrospinal fluid ( cerebrospinal fluid) at least one selected from the group consisting of, a method.
상기 표적서열을 증폭시키는 단계는 루프-매개 등온증폭반응 (Loop-Mediated Isothermal Amplification; LAMP) 또는 역전사 루프-매개 등온증폭반응 (Reverse transcription Loop-Mediated Isothermal Amplification; RT-LAMP)으로 수행되는 것인, 방법.According to claim 12,
Amplifying the target sequence is performed by Loop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP) or Reverse Transcription Loop-Mediated Isothermal Amplification (RT-LAMP), method.
상기 증폭 산물을 검출하는 단계는 형광발색, 탁색도, 스핀다운에 의한 침전물 생성 또는 전기영동을 통해 수행되는 것인, 방법.According to claim 12,
Wherein the step of detecting the amplification product is performed through fluorescence, turbidity, precipitate generation by spin-down, or electrophoresis.
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| KR1020210164318A KR20230077252A (en) | 2021-11-25 | 2021-11-25 | Primer set for detecting broad bean wilt virus using the loop-mediated isothermal amplification reaction and uses thereof |
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