KR102514966B1 - Method for detection and quantification of Human parechovirus using real-time polymerase chain reaction - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 실시간 중합효소연쇄반응을 이용한 파에코바이러스(Human parechovirus) 1, 2, 3 검출 및 정량 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a method for detecting and quantifying
파에코바이러스(Human parechovirus) 는 Picornaviridae과의 바이러스로 RNA 형태의 유전정보를 가지고 있으며 19개의 유전형이 존재하다. 아직 감염 시 증상이 잘 알려지지 않은 유전형들이 많이 존재하며 주요한 유전형은 파에코바이러스 1, 3이며 특히 파에코바이러스 3은 중추신경계에 감염을 일으키는 것으로 알려져있다. 현재 파에코바이러스 1, 2는 Echovirus 22 와 23에 해당한다.Human parechovirus is a virus of the Picornaviridae family that has genetic information in the form of RNA and has 19 genotypes. There are still many genotypes with unknown symptoms when infected, and the main genotypes are Paechovirus 1 and 3, and Paecovirus 3 is known to cause infection in the central nervous system. Currently, Paechoviruses 1 and 2 correspond to Echoviruses 22 and 23.
파에코바이러스(Human parechovirus)는 전 세계적으로 유행하며 초기 소아기 아이들에게 잘 감염되는 것으로 알려져 있으나 아직 국내에는 유병률에 대한 조사가 많이 이루어지지 않은 실정이다. 또한, 잠복기가 밝혀지지 않았으며 감염 시 증상은 열, 피부발진, 패혈증, 뇌수막염, 뇌염 등 엔테로바이러스와 임상적 증상이 유사하여 구분이 쉽지 않다.Human parechovirus is known to be prevalent all over the world and infects children in early childhood. In addition, the incubation period has not been revealed, and the symptoms upon infection are similar to those of enterovirus, such as fever, skin rash, sepsis, meningitis, and encephalitis, so it is not easy to distinguish them.
이러한 이유로 신속하고 정확한 진단 방법인 Real-time PCR법을 이용한 시스템 개발 필요성이 제기되었다.For this reason, the need to develop a system using the real-time PCR method, which is a rapid and accurate diagnostic method, has been raised.
본 발명은 파에코바이러스 1, 2, 3을 특이적으로 검출하기 위해 각 파에코바이러스 1, 2, 3의 complete genome을 이용하여 분석 수행한 결과 가장 공통적인 지역에 프라미어 프로브를 디자인하여 프라이머 및 프로브를 개발하였다. 또한 이를 이용한 실시간 유전자 검출 검사법을 개발하였으며, 이는 기존제품과 달리 파에코바이러스 1, 2, 3을 검출할 경우 민감도와 특이도가 향상된 효과를 확인하여 본 발명을 완성하였다.In the present invention, in order to specifically detect Paecoviruses 1, 2, and 3, analysis was performed using the complete genome of each Paecovirus 1, 2, and 3, and as a result, a primer probe was designed in the most common region, and primers and probe was developed. In addition, a real-time gene detection test method using this was developed, which, unlike existing products, confirmed the effect of improved sensitivity and specificity when detecting
본 발명의 목적은 실시간 중합효소연쇄반응을 이용한 파에코바이러스(Human parechovirus) 1, 2, 3 검출 및 정량 방법을 제공하는 것으로, 구체적으로 파에코바이러스(Human parechovirus) 1, 2, 3 검출용 프라미어 세트 및 프로브를 제작하여 개발한 실시간 유전자 검출 검사법은 기존 진단법에 비해 민감도가 향상된 효과를 나타내므로, 파에코바이러스(Human parechovirus) 1, 2, 3 검출 및 정량 방법으로 사용될 수 있다.An object of the present invention is to provide a method for detecting and quantifying
위와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1, 2, 3 및 4의 염기서열로 이루어진 파에코바이러스 1(Human parechovirus 1) 의 검출용 프라이머 세트를 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention provides a primer set for detecting Paechovirus 1 (Human parechovirus 1) consisting of the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 1, 2, 3 and 4.
위와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 6, 7 및 8의 염기서열로 이루어진 파에코바이러스 2(Human parechovirus 2) 의 검출용 프라이머 세트를 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention provides a primer set for detecting Paechovirus 2 (Human parechovirus 2) consisting of the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 6, 7 and 8.
위와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 10, 11 및 12의 염기서열로 이루어진 파에코바이러스 3(Human parechovirus 3) 의 검출용 프라이머 세트를 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention provides a primer set for detecting Paechovirus 3 (Human parechovirus 3) consisting of the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 10, 11 and 12.
본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는 파에코바이러스(Human parechovirus)의 검출 또는 정량용 조성물을 제공한다.The present invention provides a composition for detecting or quantifying a human parechovirus comprising the primer set.
본 발명의 일 실시예에 있어서, “조성물”은 서열번호 4, 서열번호 9 또는 서열번호 13의 염기서열로 이루어진 프로브를 추가적으로 더 포함하는 것을 특징으로하나 이에 한정되는 것은 아니다.In one embodiment of the present invention, "composition" is characterized in that it further comprises a probe consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 9 or SEQ ID NO: 13, but is not limited thereto.
본 발명의 일 실시예에 있어서, “프로브”는 5'-말단에 형광 표지인자(reporter dye)가 결합되어 있는 것을 특징으로하나 이에 한정되는 것은 아니다.In one embodiment of the present invention, "probe" is characterized in that a fluorescent marker (reporter dye) is bound to the 5'-end, but is not limited thereto.
본 발명의 일 실시예에 있어서, “형광 표지인자”는 FAM(6-carboxyfluorescein), JOE, HEX(hexachloro-6- carboxyfluorescein), TET(tetrachlorofluorescein), 텍사스 레드(texas red), 로다민 그린(rhodamine green), 로다민 레드(rhodamine red), 테트라메틸로다민(tetramethylrhodamine), NED(N-(1-naphthyl ethylenediamine), Cy5(cyanine-5) 및 Cy3(cyanine-3), VIC 또는 ROX로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로하나 이에 한정되는 것은 아니다.In one embodiment of the present invention, the "fluorescent marker" is FAM (6-carboxyfluorescein), JOE, HEX (hexachloro-6-carboxyfluorescein), TET (tetrachlorofluorescein), Texas red (texas red), rhodamine green (rhodamine) green), rhodamine red, tetramethylrhodamine, NED (N-(1-naphthyl ethylenediamine), Cy5 (cyanine-5) and Cy3 (cyanine-3), VIC or ROX It is characterized by being selected from, but is not limited thereto.
본 발명은 상기 조성물을 포함하는 파에코바이러스(Human parechovirus)의 검출 또는 정량용 키트를 제공한다.The present invention provides a kit for detecting or quantifying a paechovirus (Human parechovirus) comprising the composition.
본 발명의 일 실시예에 있어서, “키트”는 DNA 중합효소, dNTP, 버퍼 또는 EPC를 추가적으로 더 포함하는 것을 특징으로 하나 이에 한정되는 것은 아니다.In one embodiment of the present invention, the "kit" is characterized in that it further comprises DNA polymerase, dNTP, buffer or EPC, but is not limited thereto.
본 발명의 일 실시예에 있어서, “키트”는 실시간 중합효소연쇄반응(real-time polymerase chain reaction) 방법으로 수행되는 것을 특징으로 하나 이에 한정되는 것은 아니다.In one embodiment of the present invention, the “kit” is characterized in that it is performed by a real-time polymerase chain reaction method, but is not limited thereto.
본 발명은 시료로부터 분리된 RNA에 대하여 서열번호 1, 2, 3 및 4의 염기서열로 이루어진 검출용 프라이머 세트, 서열번호 6, 7 및 8의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트 또는 서열번호 10, 11 및 12의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트; 및 서열번호 4, 서열번호 9 또는 서열번호 13의 염기서열로 이루어진 프로브를 이용하여 실시간 중합효소연쇄반응(real-time polymerase chain reaction) 을 수행하고 분석하는 단계를 포함하는 파에코바이러스(Human parechovirus) 의 검출 방법을 제공한다.The present invention is a detection primer set consisting of the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 1, 2, 3 and 4, a primer set consisting of the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 6, 7 and 8, or SEQ ID NOs: 10, 11 and A primer set consisting of 12 nucleotide sequences; And performing and analyzing a real-time polymerase chain reaction using a probe consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 9 or SEQ ID NO: 13 Human parechovirus (Human parechovirus) A detection method is provided.
본 발명의 일 실시예에 있어서, “분석하는 단계”는 Ct 값이 확인되면 시료 내에 파에코바이러스(Human parechovirus)가 존재하는 것으로 판단하는 것을 특징으로 하나 이에 한정되는 것은 아니다.In one embodiment of the present invention, the "analyzing step" is characterized by determining that a human parechovirus is present in the sample when the Ct value is confirmed, but is not limited thereto.
본 발명은 시료로부터 분리된 RNA에 대하여 서열번호 1, 2, 3 및 4의 염기서열로 이루어진 검출용 프라이머 세트, 서열번호 6, 7 및 8의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트 또는 서열번호 10, 11 및 12의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트; 및 서열번호 4, 서열번호 9 또는 서열번호 13의 염기서열로 이루어진 프로브를 이용하여 실시간 중합효소연쇄반응(real-time polymerase chain reaction) 을 수행하여 얻은 Ct 값을 표준 검량선에 대입하는 단계를 포함하는 파에코바이러스(Human parechovirus) 의 정량 방법을 제공한다.The present invention is a detection primer set consisting of the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 1, 2, 3 and 4, a primer set consisting of the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 6, 7 and 8, or SEQ ID NOs: 10, 11 and A primer set consisting of 12 nucleotide sequences; And substituting the Ct value obtained by performing a real-time polymerase chain reaction using a probe consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 9 or SEQ ID NO: 13 to a standard calibration curve A method for quantifying human parechovirus is provided.
본 발명은 실시간 중합효소연쇄반응을 이용한 파에코바이러스(Human parechovirus) 1, 2, 3 검출 및 정량 방법을 제공하는 것으로, 구체적으로 파에코바이러스(Human parechovirus) 1, 2, 3의 검출용 프라미어 세트 및 프로브를 제작하여 기존 진단법에 비해 민감도 및 특이도가 향상된 효과를 나타내므로, 파에코바이러스(Human parechovirus) 1, 2, 3 검출 및 정량 방법으로 우수한 효과가 있다.The present invention provides a method for detecting and quantifying
도 1은 파에코바이러스 검출용 표적 지역 확인 결과에 대한 도이다.
도 2는 본 발명의 파에코바이러스 1 검출용 프라이머 및 프로브 디자인에 대한 도이다.
도 3은 본 발명의 파에코바이러스 2 검출용 프라이머 및 프로브 디자인에 대한 도이다.
도 4는 본 발명의 파에코바이러스 3 검출용 프라이머 및 프로브 디자인에 대한 도이다.
도 5는 본 발명의 파에코바이러스 1, 2, 3 각 단일 프라이머 및 프로브의 검출효율에 대한 도이다.
도 6은 본 발명의 최종 확립된 파에코바이러스 1의 프라이머 및 프로브 세트의 효율 확인 시험에 대한 도이다.
도 7은 본 발명의 최종 확립된 파에코바이러스 2의 프라이머 및 프로브 세트의 효율 확인 시험에 대한 도이다.
도 8은 본 발명의 최종 확립된 파에코바이러스 3의 프라이머 및 프로브 세트의 효율 확인 시험에 대한 도이다.
도 9는 본 발명의 단일 파에코바이러스 1, 2, 3의 Master mix 별 검출효율 비교 테스트 결과에 대한 도이다.
도 10은 본 발명의 파에코바이러스 1, 2, 3 단일 유전자 검출 검사법의 직선성 확인 결과에 대한 도이다.
도 11은 본 발명의 최종 확립된 파에코바이러스 다중 검출 검사법의 프라이머 및 프로브 세트의 효율 확인 시험 결과에 대한 도이다.
도 12는 본 발명의 파에코바이러스 1, 2, 3 다중 실시간 유전자 검출법의 직선성 확인 결과에 대한 도이다.1 is a diagram of the result of confirming the target region for detecting Paechovirus.
Figure 2 is a diagram of the design of primers and probes for detecting
Figure 3 is a diagram of the design of primers and probes for detecting
Figure 4 is a diagram of the design of primers and probes for detecting Paechovirus 3 of the present invention.
Figure 5 is a diagram of the detection efficiency of each single primer and probe of
Figure 6 is a diagram of the efficiency confirmation test of the primer and probe set of the finally established
Figure 7 is a diagram of the efficiency confirmation test of the primer and probe set of the finally established
Figure 8 is a diagram of the efficiency confirmation test of the primer and probe set of the finally established
Figure 9 is a diagram of the test results for comparison of detection efficiency for each master mix of
10 is a diagram showing the linearity confirmation result of the
11 is a diagram of test results for confirming the efficiency of the primer and probe set of the finally established Paechovirus multiplex detection test method of the present invention.
12 is a diagram of the linearity confirmation result of the
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 구현예로 본 발명을 상세히 설명하기로 한다. 다만, 하기 구현 예는 본 발명에 대한 예시로 제시되는 것으로, 당업자에게 주지 저명한 기술 또는 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략할 수 있고, 이에 의해 본 발명이 제한되지는 않는다. 본 발명은 후술하는 특허 청구범위의 기재 및 그로부터 해석되는 균등 범주 내에서 다양한 변형 및 응용이 가능하다.Hereinafter, the present invention will be described in detail as an embodiment of the present invention with reference to the accompanying drawings. However, the following implementation examples are presented as examples of the present invention, and if it is determined that a detailed description of a well-known technology or configuration may unnecessarily obscure the gist of the present invention, the detailed description may be omitted. , the present invention is not limited thereby. Various modifications and applications of the present invention are possible within the description of the claims described later and equivalent scopes interpreted therefrom.
또한, 본 명세서에서 사용되는 용어(terminology) 들은 본 발명의 바람직한 실시 예를 적절히 표현하기 위해 사용된 용어들로서, 이는 사용자, 운용자의 의도 또는 본 발명이 속하는 분야의 관례 등에 따라 달라질 수 있다. 따라서 본 용어들에 대한 정의는 본 명세서 전반에 걸친 내용을 토대로 내려져야 할 것이다. 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 “포함”한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.In addition, the terminology used in this specification is a term used to appropriately express a preferred embodiment of the present invention, which may vary according to the intention of a user or operator or customs in the field to which the present invention belongs. Therefore, definitions of these terms should be made based on the contents throughout this specification. Throughout the specification, when a certain component is said to "include", it means that it may further include other components without excluding other components unless otherwise stated.
일 측면에서, 본 발명은 서열번호 1, 2, 3 및 4의 염기서열로 이루어진 파에코바이러스 1(Human parechovirus 1) 의 검출용 프라이머 세트를 제공한다.In one aspect, the present invention provides a primer set for detecting
일 측면에서, 본 발명은 서열번호 6, 7 및 8의 염기서열로 이루어진 파에코바이러스 2(Human parechovirus 2) 의 검출용 프라이머 세트를 제공한다.In one aspect, the present invention provides a primer set for detecting
일 측면에서, 본 발명은 서열번호 10, 11 및 12의 염기서열로 이루어진 파에코바이러스 3(Human parechovirus 3) 의 검출용 프라이머 세트를 제공한다.In one aspect, the present invention provides a primer set for detecting
본 발명에서의 용어, "프라이머"는 짧은 자유 3'-말단 수산화기(free 3' hydroxyl group) 를 가지는 염기서열로서, 상보적인 주형(template)과 염기쌍 을 형성할 수 있고, 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로서 작용하는 짧은 염기서열을 말한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응을 위한 시약(DNA 중합효소 또는 역전사효소) 및 상이한 4가지 dNTP(Deoxynucleoside triphosphate) 의 존재 하에 DNA 합성을 개시할 수 있다.As used herein, the term "primer" is a base sequence having a short free 3'-terminal hydroxyl group, capable of forming base pairs with a complementary template, and a starting point for template strand copying. A short sequence of bases that serves as a point. The primers can initiate DNA synthesis in the presence of a reagent (DNA polymerase or reverse transcriptase) and four different deoxynucleoside triphosphates (dNTPs) for polymerization at an appropriate buffer solution and temperature.
본 발명의 프라이머 세트는 파에코바이러스(Human parechovirus) 1, 2, 3에 특이적으로 존재하는 유전자를 증폭을 위하여 각각 정방향(forward) 및 역방향(reverse) 프라이머로 구성되어 있다. 본 발명의 프라이머 세트는 프라이머의 길이, Tm 값, 프라이머의 GC 함량, 및 프라이머 내의 자가-상보적 서열에 의 한 프라이머의 복합체(dimer) 형성 방지와 같은 조건들을 충분히 고려하고 판 파에코바이러스(Human parechovirus) 의 검출에 대한 민감도 및 특이도를 최대화할 수 있도록 세심하게 디자인된 것이다.The primer set of the present invention consists of forward and reverse primers, respectively, to amplify genes specifically present in
본 발명의 프라이머 세트는 파에코바이러스(Human parechovirus) 1, 2, 3 고체 지지체 합성법이나 기타 널리 공지된 방법을 이용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 염기서열은 또한 당해 기술분야에 공지된 다양한 방법을 통해 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오티드 하나 이상의 동족체로의 치환 및 뉴클레오티드 간의 변형, 예를 들면 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스 포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등) 로의 변형이 있다. 또 한, 본 발명의 프라이머 세트의 염기서열은 검출 가능한 시그날을 직접적 또는 간 접적으로 제공할 수 있는 표지를 이용하여 변형시킬 수 있다.The primer set of the present invention can be chemically synthesized using a
일 측면에서, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는 파에코바이러스(Human parechovirus)의 검출 또는 정량용 조성물을 제공한다.In one aspect, the present invention provides a composition for detecting or quantifying a human paechovirus comprising the primer set.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 조성물은 서열번호 5, 서열번호 9 또는 서열번호 13의 염기서열로 이루어진 프로브를 추가적으로 더 포함하는 것을 특징으로 한다.In one embodiment of the present invention, the composition is characterized in that it further comprises a probe consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 9 or SEQ ID NO: 13.
본 발명의 프로브는 프로브의 말단에 형광물질로 표지될 수 있다. 프로브의 5'-말단에는 형광 표지인자(reporter dye)가 결합될 수 있다.The probe of the present invention may be labeled with a fluorescent substance at the end of the probe. A fluorescent marker (reporter dye) may be bound to the 5'-end of the probe.
상기 형광 표지인자로는 현재까지 개발된 어떠한 물질을 사용하여도 무방하며, 예를 들어, FAM(6-carboxyfluorescein), HEX(hexachloro-6-carboxyfluorescein), JOE, TET(tetrachlorofluorescein), 텍사스 레드(texas red), 로 다민 그린(rhodamine green), 로다민 레드(rhodamine red), 테트라메틸로다 민(tetramethylrhodamine), NED(N-(1-naphthyl) ethylenediamine), Cy5(cyanine-5), Cy3(cyanine-3), VIC 또는 ROX가 사용될 수 있고, 바람직하게는 FAM(6-carboxyfluorescein), VIC 또는 ROX를 사용할 수 있다.Any material developed to date may be used as the fluorescent marker, for example, FAM (6-carboxyfluorescein), HEX (hexachloro-6-carboxyfluorescein), JOE, TET (tetrachlorofluorescein), Texas Red (texas red) red), rhodamine green, rhodamine red, tetramethylrhodamine, NED (N-(1-naphthyl) ethylenediamine), Cy5 (cyanine-5), Cy3 (cyanine- 3), VIC or ROX may be used, and preferably FAM (6-carboxyfluorescein), VIC or ROX may be used.
일 측면에서, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 파에코바이러스(Human parechovirus)의 검출 또는 정량용 키트를 제공한다.In one aspect, the present invention provides a kit for detecting or quantifying a human parechovirus comprising the composition.
일 측면에서, 본 발명은 시료로부터 분리된 RNA에 대하여 서열번호 1, 2, 3 및 4의 염기서열로 이루어진 검출용 프라이머 세트, 서열번호 6, 7 및 8의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트 또는 서열번호 10, 11 및 12의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트; 및 서열번호 4, 서열번호 9 또는 서열번호 13의 염기서열로 이루어진 프로브를 이용하여 실시간 중합효소연쇄반응(real-time polymerase chain reaction)을 수행하고 분석하는 단계를 포함하는 파에코바이러스(Human parechovirus) 의 검출 또는 정량방법을 제공한다.In one aspect, the present invention provides a detection primer set consisting of the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 1, 2, 3 and 4, a primer set consisting of the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 6, 7 and 8, or SEQ ID NO: Primer sets consisting of nucleotide sequences of 10, 11 and 12; And performing and analyzing a real-time polymerase chain reaction using a probe consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 9 or SEQ ID NO: 13 Human parechovirus (Human parechovirus) A detection or quantification method is provided.
본 발명에서 중합효소연쇄반응은 (i) 초기 변성(denaturation) 단계; (ii) 변성(denaturation), 부착(annealing) 및 연장(extension)으로 이루어지는 한 싸이클을 수회 내지 수십 회 반복하는 단계; 및 (iii) 최종 열처리 단계; 또는 이들 단계를 적합하게 변형한 열 싸이클(thermal cycle) 프로그램을 통해 수행될 수 있 다.In the present invention, the polymerase chain reaction includes (i) an initial denaturation step; (ii) repeating one cycle consisting of denaturation, annealing, and extension several to dozens of times; and (iii) a final heat treatment step; or through a thermal cycle program with suitable modifications of these steps.
구체적으로, 본 발명에서의 PCR 조건으로는 50℃에서 30분간 역전사 처리 과정을 진행하고 95℃에서 10분간 중합효소(Taq polymerase)를 활성화시킨 후, 95℃ 15초 및 60℃ 1분을 1 cycle로 하여 총 40 cycle을 수행하였다.Specifically, the PCR conditions in the present invention include reverse transcription at 50 ° C for 30 minutes, activation of the polymerase (Taq polymerase) at 95 ° C for 10 minutes, followed by 1 cycle of 95 ° C for 15 seconds and 60 ° C for 1 minute. A total of 40 cycles were performed.
본 발명에서 PCR 증폭 산물의 크기의 분석은 당업계에 알려진 임의의 방법이 사용될 수 있다. 예를 들면, 아가로즈 또는 폴리아크릴아미드 젤 전기영동에 의하 여 표적 크기 마커와의 비교를 통하여 증폭 산물의 크기를 알 수 있다In the present invention, any method known in the art may be used to analyze the size of the PCR amplification product. For example, the size of the amplification product can be determined by comparison with a target size marker by agarose or polyacrylamide gel electrophoresis.
본 발명에서 실시간 중합효소연쇄반응은 타겟 DNA의 증폭과 동시에 형광 방출에 의한 타겟 DNA의 절대 또는 상대적인 정량이 가능한 실험방법으로서, 전기영동하여 분석하는 단계가 생략되고, 증폭산물의 증폭정도를 자동화, 수치화시켜 신 속하고 정확하게 검출 및 정량이 가능하다. 상기 방법을 수행하는 경우 타겟 DNA 내의 증폭된 서열에 특이적으로 결합하고 형광 표지인자 및 형광 억제물질이 태깅 되어 있는 프로브를 사용하여 수행될 수 있고, 프로브의 사용없이 SYBR-Green 등의 형광물질을 사용하여 수행될 수도 있다. 실시간 중합효소연쇄반응에 대한 결과는 Ct(cycle threshold) 값을 이용하여 분석될 수 있다.In the present invention, real-time polymerase chain reaction is an experimental method capable of absolute or relative quantification of target DNA by fluorescence emission simultaneously with amplification of target DNA. By digitizing, it is possible to detect and quantify quickly and accurately. In the case of performing the above method, it can be performed using a probe that specifically binds to the amplified sequence in the target DNA and is tagged with a fluorescent marker and a fluorescent inhibitor, and a fluorescent substance such as SYBR-Green is used without using a probe. It can also be done using Results for real-time polymerase chain reaction can be analyzed using Ct (cycle threshold) values.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시 예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail through examples. These examples are intended to explain the present invention in more detail, and the scope of the present invention is not limited to these examples.
실시예 1. 파에코바이러스 1, 2, 3에 대한 단일 실시간 유전자 검출 검사법 개발Example 1. Development of a single real-time gene detection assay for
1-1. 파에코바이러스 1, 2, 3에 대한 실시간 유전자 검출 검사법의 프라이머 및 프로브 개발1-1. Development of primers and probes for real-time gene detection assays for
ㄱ. 파에코바이러스 1 실시간 유전자 검출 검사법의 프라이머 및 프로브 설계go. Design of primers and probes for
파에코바이러스 1의 전장유전체(complete genome) 다중서열정렬 결과 VP3 지역이 다른 표적 유전자보다 상대적으로 공통적인 부분이 많은 지역임을 확인하였으며 다른 유전형들과 구분되도록 특이적 프라이머 및 프로브 디자인을 수행하였다(도 1). 파에코바이러스 1 검출용 프라이머 및 피로브 정보는 하기 표 1에 기재하였다.As a result of multiple sequence alignment of the complete genome of
/Probe/Probe
(%)(%)
(mer)(mer)
설계한 프라이머 및 프로브의 포괄성을 확인하기 위해 총 61개의 서열 분석을 통해 검출 가능한 서열의 개수를 확인하였으며 정방향 및 역방향 프라이머를 두 개씩 디자인하여 검출률을 높였다(도 2).To confirm the comprehensiveness of the designed primers and probes, the number of detectable sequences was confirmed through a total of 61 sequence analysis, and the detection rate was increased by designing two forward and reverse primers (FIG. 2).
ㄴ. 파에코바이러스 2 실시간 유전자 검출 검사법의 프라이머 및 프로브 설계you. Design of primers and probes for
파에코바이러스 2의 전장유전체(complete genome) 분석을 수행한 결과, 파에코바이러스 1과 동일하게 가장 공통적인 지역이 VP3인 것을 확인하였으며 이를 표적 유전자로 결정하였고 다른 유전형들과 구분 가능하도록 프라이머 및 프로브를 디자인하였으며 검출 가능한 서열의 개수를 확인하였다. 또한 검출률을 높이고자 정방향 프라이머를 두 개씩 디자인하였다(도 3). 파에코바이러스 2 검출용 프라이머 및 프로브 정보는 표 2에 기재하였다. As a result of the complete genome analysis of
/Probe/Probe
(%)(%)
(mer)(mer)
ㄷ. 파에코바이러스 3 실시간 유전자 검출 검사법의 프라이머 및 프로브 설계do. Design of primers and probes for
파에코바이러스 3은 가장 in silico상의 서열정보가 가장 많고 유사성을 보이는 유전형으로 전장유전체(complete genome)를 분석하여 가장 공통적인 지역에 프라이머 및 프로브를 디자인하였다(도 4).
파에코바이러스 3 검출용 프라이머 및 프로브 정보는 표 3에 기재하였다.Primers and probe information for detecting
/Probe/Probe
(%)(%)
(mer)(mer)
ㄹ. 파에코바이러스 1, 2, 3에 대한 실시간 유전자 검출 검사법의 최종 프라이머/프로브 세트L. Final primer/probe set for real-time gene detection assay for
종적으로 파에코바이러스 1, 2, 3을 특이적으로 검출할 수 있는 프라이머 및 프로브를 디자인하였으며 3종류의 단일 검출 검사법 모두 프라이머 조합을 2개 이상 사용하였으며 degeneracy를 이용하여 검출률을 높이고자 하였고 파에코바이러스 1, 2, 3 각 단일 검출 검사법의 구성을 표적 바이러스와 내부양성대조군인 EPC로 구성하였다.Specifically, primers and probes capable of specifically detecting
파에코바이러스 1, 2, 3 단일 검출용 프라이머 및 프로브 염기서열은 표 4에 기재하였다.Primers and probe sequences for single detection of
/Probe/Probe
sizesize
virus 1
(VP3)Parecho
(VP3)
virus 2
(VP3)Parecho
(VP3)
virus 3
(VP0)Parecho
(VP0)
1-2. 파에코바이러스 1, 2, 3 실시간 유전자 검출 검사법의 반응조건 최적화1-2. Optimization of reaction conditions for
ㄱ. 파에코바이러스 1, 2, 3에 대한 실시간 유전자 검출 검사법의 프라이머 및 프로브 성능 확인 go. Confirmation of primer and probe performance of real-time gene detection assay for
파에코바이러스 1, 2, 3 및 EPC 검출용 프라이머와 프로브의 올리고를 합성하였으며 이때 표적 바이러스와 EPC의 다중검출을 구성하기 위해 TaqMan 프로브의 형광물질을 파에코바이러스 1, 2, 3은 각 FAM으로, EPC에 JOE를 사용하였다.Primers and probe oligos for detecting
합성된 프라이머 및 프로브 세트를 이용해 각 파에코바이러스 1, 2, 3 양성 시료에 대한 실시간 증폭 곡선을 확인한 결과 각 프라이머 및 프로브에 대해 파에코바이러스 1, 2, 3 genomic RNA가 정상적으로 증폭곡선을 나타내었다(도 5).As a result of checking the real-time amplification curve for each
구체적으로 Real-time PCR 반응액은 5 pmol/μL로 희석한 정방향 및 역방향 프라이머 각 1 μL 와 2 pmol/μL로 희석한 TaqMan 프로브 1 μL, 2X RT-PCR Master Mix 5 μL에 주형 RNA 10 μL 및 TE buffer를 첨가하여 최종 볼륨을 20 μL로 맞추었고 이때 사용한 주형 RNA는 ATCC에서 구매한 파에코바이러스 1, 2, 3의 배양액에서 추출한 genomic RNA을 사용하였다. PCR 조건은 50℃에서 30분간 역전사 과정을 진행하고 95℃에서 10분간 Taq polymerase를 활성화 시킨 후, 95℃ 15초 및 60℃ 1분을 1 cycle로 하여 총 40 cycle을 수행하였다.Specifically, the real-time PCR reaction solution consisted of 1 μL each of forward and reverse primers diluted to 5 pmol/μL, 1 μL of TaqMan probe diluted to 2 pmol/μL, 5 μL of 2X RT-PCR Master Mix, 10 μL of template RNA, and TE buffer was added to adjust the final volume to 20 μL, and the template RNA used at this time was genomic RNA extracted from the culture medium of
ㄴ. 파에코바이러스 1, 2, 3 실시간 유전자 검출 검사법의 프라이머 및 프로브 농도 조건 확립you. Establishment of primer and probe concentration conditions for
농도 조건 최적화 시 고려할 사항은 각 표적 지역의 증폭곡선의 △Rn 값 및 linear phase의 기울기를 조절하고, 각 TaqMan 프로브의 형광 물질들의 상호교차 현상을 최소화하기 위해서 프로브의 농도를 조절할 것, 단일 프라이머 및 프로브 조건에서와 증폭 효율을 유사하게 맞출 것을 고려하였다.Matters to be considered when optimizing concentration conditions include adjusting the △Rn value of the amplification curve of each target region and the slope of the linear phase; It was considered to match the amplification efficiency similarly to that of the probe conditions.
각 파에코바이러스 1, 2, 3 단일 프라이머 및 프로브 세트 반응액과 내부양성대조군이 혼합된 프라이머 및 프로브 세트 반응액 간에 증폭 곡선의 효율을 Ct 값과 증폭곡선 모양을 통해서 비교하였으며 최종 조건을 확립하였다. 조건 확립시 사용한 시료는 파에코바이러스 2, 3의 RNA를 사용하였다. The efficiency of the amplification curve between each
내부양성대조군인 EPC는 파에코바이러스의 증폭 효율에 지장을 주지 않도록 최적화된 프라이머 및 프로브 농도 조건을 사용하였다(표 5, 표 6 및 표 7은 각각 파에코바이러스 1, 2, 3 단일 검출 검사법의 최종 확립된 프라이머 및 프로브 농도 조건임).EPC, an internal positive control, used primer and probe concentration conditions optimized so as not to interfere with the amplification efficiency of Paecovirus (Table 5, Table 6, and Table 7, respectively, of
ㄷ. 파에코바이러스 1, 2, 3 Master Mix 선정 및 최적화do.
최적의 성능을 확보할 수 있는 Real-time RT-PCR Master Mix를 선정하기 위해서 동일한 프라이머 및 프로브 혼합 조건을 이용해 네 가지의 Master Mix 간의 성능 비교 테스트를 수행하였다.In order to select a Real-time RT-PCR Master Mix that can secure optimal performance, a performance comparison test was performed between the four Master Mixes using the same primer and probe mixing conditions.
Real-time PCR Master Mix A 반응액은 각 농도로 혼합한 프라이머 및 프로브 시약 4 μL, ２X RT-PCR Master Mix 10 μL, 25X RT enzyme buffer 0.8 μL와 단계적으로 희석한 RNA 5 μL 및 TE buffer를 첨가하여 최종 볼륨을 20 μL로 맞추었다.Real-time PCR Master Mix A reaction solution contains 4 μL of primer and probe reagents mixed at each concentration, 10 μL of 2X RT-PCR Master Mix, 0.8 μL of 25X RT enzyme buffer, and 5 μL of gradually diluted RNA and TE buffer. to adjust the final volume to 20 μL.
Real-time PCR Master Mix B 반응액은 각 농도로 혼합한 프라이머 및 프로브 시약 4 μL, 1.2X Rox dye 1 μL, 2X Real-time Master Mix 10 μL와 단계적으로 희석한 RNA 5 μL 및 TE buffer를 첨가하여 최종 볼륨을 20 μL로 맞추었다.Real-time PCR Master Mix B reaction solution is 4 μL of primer and probe reagent mixed at each concentration, 1 μL of 1.2X Rox dye, 10 μL of 2X Real-time Master Mix, and 5 μL of gradually diluted RNA and TE buffer are added. to adjust the final volume to 20 μL.
Real-time PCR Master Mix C 반응액은 각 농도로 혼합한 프라이머 및 프로브 시약 4 μL, 2X Real-time Master Mix 10 μL와 단계적으로 희석한 RNA 5 μL 및 TE buffer를 첨가하여 최종 볼륨을 20 μL로 맞추었다.Real-time PCR Master Mix C reaction solution was prepared by adding 4 μL of primer and probe reagents at each concentration, 10 μL of 2X Real-time Master Mix, 5 μL of gradually diluted RNA, and TE buffer to make the
Real-time PCR Master Mix D 반응액은 각 농도로 혼합한 프라이머 및 프로브 시약 4 μL, 2X Real-time Master Mix 11 μL와 단계적으로 희석한 RNA 5 μL 및 TE buffer를 첨가하여 최종 볼륨을 20 μL로 맞추었다.Real-time PCR Master Mix D reaction solution was prepared by adding 4 μL of primer and probe reagents at each concentration, 11 μL of 2X Real-time Master Mix, 5 μL of gradually diluted RNA, and TE buffer to make the
PCR 조건은 50℃에서 30분간 역전사 처리 과정을 진행하고 95℃에서 10분간 Taq polymerase를 활성화시킨 후, 95℃ 15초 및 60℃ 1분을 1 cycle로 하여 총 40 cycle을 수행하였다.For PCR conditions, a reverse transcription process was performed at 50 ° C for 30 minutes, Taq polymerase was activated at 95 ° C for 10 minutes, and 95 ° C for 15 seconds and 60 ° C for 1 minute were performed as one cycle, for a total of 40 cycles.
파에코바이러스 1, 2, 3 양성시료를 이용한 Master Mix 별 성능 비교 시험결과 Maser mix B 반응액 사용 시 상대적으로 빠른 Ct 값을 확인하였다(도 9 참고).As a result of the performance comparison test for each Master
따라서 가장 좋은 검출효율을 나타낸 Real-time PCR Master Mix B 시약을 본 연구개발의 주 성분으로 최종 결정하였으며, Mater mix B는 Thermo Fisher사의 One step RT-PCR Master mix를 최적화한 2X Real-time RT-PCR Master Mix를 제품개발에 사용하였다.Therefore, Real-time PCR Master Mix B reagent, which showed the best detection efficiency, was finally decided as the main component of this research and development, and Mater mix B is 2X Real-time RT-PCR optimized for Thermo Fisher's One step RT-PCR Master mix. PCR Master Mix was used for product development.
최종적으로 파에코바이러스 1, 2, 3의 조건 확립된 프라이머 및 프로브의 농도 조건과 Master mix를 확립하였다(표 8, 표 9 및 표 10은 각각 파에코바이러스 1, 2, 3 단일 검출 검사법의 최종 결정된 Real-time RT-PCR 반응액 조성임).Finally, the conditions for
(μL)(μL)
(Final Conc.: F primer 1, 2 각 250 nM, R primer 1. 2 각 250 nM, Probe 100 nM)
(Final Conc.:
(Final Conc.: F primer 75 nM, R primer 75 nM, Probe 75 nM)EPC Primer/probe mix
(Final Conc.: F primer 75 nM, R primer 75 nM, Probe 75 nM)
(μL)(μL)
(Final Conc.: F primer 1, 2 각 250 nM, R primer 250 nM, Probe 100 nM)
(Final Conc.:
(Final Conc.: F primer 50 nM, R primer 50 nM, Probe 50 nM)EPC Primer/probe mix
(Final Conc.:
(μL)(μL)
(Final Conc.: F primer 1, 2 각 250 nM, R primer 250 nM, Probe 100 nM)
(Final Conc.:
(Final Conc.: F primer 50 nM, R primer 50 nM, Probe 50 nM)EPC Primer/probe mix
(Final Conc.:
파에코바이러스 1, 2, 3의 Master mix 별 검출효율 비교 테스트 결과는 도 9와 같다.The test results for comparison of detection efficiencies for each Master mix of
1-3. 파에코바이러스 1, 2, 3 실시간 유전자 검출 검사법의 성능평가1-3. Performance evaluation of
ㄱ. 파에코바이러스 1, 2, 3 실시간 유전자 검출 검사법의 분석적 특이도go. Analytical specificity of
개발한 파에코바이러스 1, 2, 3 단일 실시간 유전자 검출 검사법의 특이성을 교차반응시험을 통해 확인하였다. 유사한 증상의 원인이 될 수 있는 다른 병인체 및 human genomic RNA를 포함한 핵산을 이용하여 Real-time RT-PCR을 수행한 후 각각의 시료에 대한 검출 결과를 분석하였고 시험에 사용한 물질은 용역과제 주관기관, NCCP 국가병원체자원은행, KCTC 생물자원센터(Korean Collection for Type cultures), ATCC (American Type Culture Collection)에서 분양 받거나 Vircell S.L (Santafe, Spain)에서 핵산을 구입하여 사용하였다. The specificity of the developed
교차반응 시험 결과 파에코바이러스 1, 2, 3, 각 단일 키트 모두 해당 시료에서만 형광 채널에서 검출반응이 일어났고 다른 종의 핵산에서는 검출반응이 일어나지 않았고, IC는 모든에서 증폭반응을 일으켜 검사 샘플 질평가를 위한 확인되었으며 본 연구 과제용 시약의 특이성을 입증하였다(표 11, 12, 13은 각각 파에코바이러스 1, 2, 3 단일 유전자 검출 검사법의 교차반응 시험 결과임).As a result of the cross-reaction test, the detection reaction occurred in the fluorescence channel only in the corresponding sample for each single kit of
(JOE)(JOE)
parechovirus 1parechovirus 1
parechovirus 2Human
parechovirus 3Human
parechovirus 3
Simplex virus 1Herpes
Simplex virus 2Herpes
virus 1Parainfluenza
virus 2Parainfluenza
virus 3Parainfluenza
syncytial virus ARespiratory
syncytial virus A
syncytial virus BRespiratory
syncytial virus B
(H1N1)Influenza virus A
(H1N1)
Coronavirus
NL63human coronavirus
NL63
229Ehuman coronavirus
229E
OC43human coronavirus
OC43
NL63human coronavirus
NL63
(FAM)HpeV-2
(FAM)
(JOE)(JOE)
parechovirus 1Human
parechovirus 1
parechovirus 2
parechovirus 3Human
parechovirus 3
Simplex virus 1Herpes
Simplex virus 2Herpes
virus 1Parainfluenza
virus 2Parainfluenza
virus 3Parainfluenza
syncytial virus ARespiratory
syncytial virus A
syncytial virus BRespiratory
syncytial virus B
(H1N1)Influenza virus A
(H1N1)
Coronavirus
NL63human coronavirus
NL63
229Ehuman coronavirus
229E
OC43human coronavirus
OC43
NL63human coronavirus
NL63
(FAM)HpeV-3
(FAM)
(JOE)(JOE)
parechovirus 1Human
parechovirus 1
parechovirus 2Human
parechovirus 2
parechovirus 3
Simplex virus 1Herpes
Simplex virus 2Herpes
virus 1Parainfluenza
virus 2Parainfluenza
virus 3Parainfluenza
syncytial virus ARespiratory
syncytial virus A
syncytial virus BRespiratory
syncytial virus B
(H1N1)Influenza virus A
(H1N1)
Coronavirus
NL63human coronavirus
NL63
229Ehuman coronavirus
229E
OC43human coronavirus
OC43
NL63human coronavirus
NL63
ㄴ. 파에코바이러스 1, 2, 3에 대한 실시간 유전자 검출 검사법의 직선성 확인you. Linearity confirmation of real-time gene detection assay for
시험법에 있어 직선성이란 검체 중에 함유되어있는 분석 대상물질(target analyte)의 양에 정비례하는 결과를 제공할 수 있는 능력을 말하며 시험 기준은 1/10씩 단계 희석한 시험물질을 이용하며 표준곡선을 작성하였다.In the test method, linearity refers to the ability to provide results that are directly proportional to the amount of the target analyte contained in the sample. was written.
표준곡선 검사용 RNA를 사용하여 얻은 Ct값 평균을 Y축으로 각각의 농도에 log를 취한 값 Log(concentration) 을 X축으로 하여 작성한 표준곡선 결과를 검증한 후 농도정보가 없는 바이러스 시료의 농도를 측정 가능하다. 표준곡선의 선형도(R2값) 과 선형의 기울기값을 통한 PCR efficency를 통해 파에코바이러스 1, 2, 3 프라이머/프로브 세트가 정량에 사용가능 여부를 검증하며 표준곡선의 선형도(R2값)가 0.98 이상일 때 적합함을 의미한다.The average of the Ct values obtained using RNA for standard curve testing is Y-axis, the value obtained by taking the log of each concentration as the X-axis, and after verifying the result of the standard curve prepared, the concentration of the virus sample without concentration information is calculated. measurable The linearity of the standard curve (R 2 value) and the linearity of the standard curve (R 2 value) is 0.98 or more, it means that it is suitable.
농도(copies/μL)를 알고 있는 합성유전자(표적지역을 포함하는 올리고뉴클레오티드)를 이용해서 작성한 파에코바이러스 1, 2, 3의 표준곡선의 선형도가 적합함을 확인한 후 ATCC에서 구매한 파에코바이러스의 배양액에서 추출한 RNA의 농도를 측정하였으며 정량을 수행하였다.After confirming that the linearity of the standard curve of
Copy 수를 확인한 시료를 이용하여 총 3종류의 RNA에 대해 직선성을 측정하였고, 각 시료를 TE buffer를 이용해 10배씩 순차적으로 희석한 뒤, 주형 RNA로 사용하여 PCR을 수행하여 얻은 Ct값 평균을 Y축으로 각각의 농도에 log를 취한 값 Log (concentration)을 X축으로 하여 작성한 표준곡선 결과, 표준곡선의 선형도(R2값)이 0.98 이상으로 모두 적합한 것을 확인하였다. 또한, 표준곡선의 기울기 값을 이용하여 계산된 PCR 효율도 100%에 근접한 것으로 나타나 시스템의 직선성과 효율성을 확인하였다(표 14, 15, 16은 각각 파에코바이러스 1, 2, 3 단일 유전자 검출 검사법의 직선성 확인 Ct 측정값임).Linearity was measured for a total of three types of RNA using samples whose number of copies was confirmed, and each sample was serially diluted 10-fold using TE buffer, and then PCR was performed using the template RNA to calculate the average Ct value. As a result of the standard curve prepared with the value Log (concentration) taken as the Y-axis for each concentration as the X-axis, it was confirmed that the linearity (R2 value) of the standard curve was 0.98 or more, all of which were suitable. In addition, the PCR efficiency calculated using the slope of the standard curve was also found to be close to 100%, confirming the linearity and efficiency of the system (Tables 14, 15, and 16
[계산식] PCR Efficiency = 10(-1/slope)-1[Calculation] PCR Efficiency = 10 (-1/slope) -1
ㄷ. 파에코바이러스 1, 2, 3에 대한 실시간 유전자 검출 검사법의 최소검출한계 및 판정기준치 확인do. Confirmation of the minimum detection limit and criterion of the real-time gene detection test method for
판정기준치(cut-off)는 경계치 이상을 양성으로 경계 미만을 음성으로 볼 수 있는 경계 값을 말하는데 민감도로 추정되는 3구간을 20 반복 수행하여 결정하였다. 앞서, 직선성 테스트 결과를 기반으로, 10 copies/μL 농도의 각 파에코바이러스 1, 2, 3 RNA를 기준으로 아래로 3배씩 희석한 민감도 부근의 3.33, 1.11, 0.37 copies/μL의 시료를 각각 20회 반복 수행하여 20개가 모두 검출되는 가장 낮은 농도의 copy 수를 최소검출로 결정하였다(표 17, 18, 19는 각각 파에코바이러스 1, 2 ,3 검출 검사법의 예상 최소검출한계(LoD) 3구간을 20회 반복 수행한 Ct 값임).The cut-off refers to the threshold value that can be regarded as positive if above the threshold and negative if below the threshold, and was determined by performing 20 repetitions of 3 sections estimated by sensitivity. Previously, based on the results of the linearity test, samples of 3.33, 1.11, and 0.37 copies/μL near the sensitivity diluted 3-fold based on each
[계산식] 판정기준치 = Ct값 평균 + (2 x Ct값의 표준편차)[Calculation] Criterion value = average of Ct values + (2 x standard deviation of Ct values)
1-4. 파에코바이러스 1, 2, 3에 대한 실시간 유전자 검출 검사법의 임상적 성능1-4. Clinical Performance of Real-Time Genetic Detection Assays for
파에코바이러스 검사를 위한 주요 시료인 분변시료는 병원체 감염이 확인되지 않은 음성시료를 이용하여 핵산을 추출하였다. 추출한 핵산 시료를 음성 매트릭스로 사용하여 농도를 측정한 파에코바이러스 genomic RNA를 첨가하여 조제양성시료를 준비하였다. Nucleic acid was extracted from the fecal sample, which is the main sample for the Paecovirus test, using a negative sample in which pathogen infection was not confirmed. A prepared positive sample was prepared by adding Paechovirus genomic RNA whose concentration was measured using the extracted nucleic acid sample as a negative matrix.
ㄱ. 파에코바이러스 1 실시간 유전자 검출 검사법의 임상적 성능go. Clinical Performance of
파에코바이러스 1의 최소검출한계 농도 3배(3xLoD) 15개, 2배(2xLoD) 15개, 1.5배(1.5xLoD) 20개로 조제된 양성시료와 음성시료를 사용하여 시험한 결과, 조제한 양성시료에 대한 양성 일치율 100% (민감도 확인), 음성시료 50개에 대한 일치율 100% (특이도) 확인하였다(표 18 : 파에코바이러스 1 단일 검출 검사법의 임상적 성능 결과, 표 19 : 파에코바이러스 1 단일 검출 검사법의 양성 시료 50개 Ct값, 표 20 : 파에코바이러스 1 단일 검출 검사법의 음성 시료 50개 Ct값).As a result of testing using positive and negative samples prepared at 3 times (3xLoD) 15, 2 times (2xLoD) 15, and 1.5 times (1.5xLoD) 20 minimum detection limit concentrations of
ㄴ. 파에코바이러스 2 실시간 유전자 검출 검사법의 임상적 성능you. Clinical Performance of
파에코바이러스 2의 최소검출한계 농도 3배(3xLoD) 15개, 2배(2xLoD) 15개, 1.5배(1.5xLoD) 20개로 조제된 양성시료와 음성시료를 사용하여 시험한 결과, 조제한 양성시료에 대한 양성 일치율 100% (민감도 확인), 음성시료 50개에 대한 일치율 100% (특이도) 확인하였다(표 20 : 파에코바이러스 2 단일 검출 검사법의 임상적 성능 결과, 표 21 : 파에코바이러스 2 단일 검출 검사법의 양성 시료 50개 Ct값, 표 22 : 파에코바이러스 2 단일 검출 검사법의 음성 시료 50개 Ct값).As a result of testing using positive and negative samples prepared at 3 times (3xLoD) 15 pieces, 2 times (2xLoD) 15 pieces, and 1.5 times (1.5xLoD) 20 pieces, the minimum detection limit concentration of
검사법 결과 (qPCR)Assay results (qPCR)
(Positive Agreement Percent)(Positive Agreement Percent)
(Positive Agreement Percent)(Positive Agreement Percent)
ㄷ. 파에코바이러스 3 실시간 유전자 검출 검사법의 임상적 성능 c . Clinical Performance of
파에코바이러스 3의 최소검출한계 농도 3배(3xLoD) 15개, 2배(2xLoD) 15개, 1.5배(1.5xLoD) 20개로 조제된 양성시료와 음성시료를 사용하여 시험한 결과, 조제한 양성시료에 대한 양성 일치율 100% (민감도 확인), 음성시료 50개에 대한 일치율 100% (특이도) 확인하였다(표 23 : 파에코바이러스 3 단일 검출 검사법의 임상적 성능 결과, 표 24 : 파에코바이러스 3 단일 검출 검사법의 양성 시료 50개 Ct값, 표 25 : 파에코바이러스 3 단일 검출 검사법의 음성 시료 50개 Ct값).As a result of testing using positive and negative samples prepared at 3 times (3xLoD) 15 pieces, 2 times (2xLoD) 15 pieces, and 1.5 times (1.5xLoD) 20 pieces, the minimum detection limit concentration of
검사법 결과 (qPCR)Assay results (qPCR)
(Positive Agreement Percent)(Positive Agreement Percent)
(Positive Agreement Percent)(Positive Agreement Percent)
실시예 2. 파에코바이러스 1, 2, 3에 대한 다중 실시간 유전자 검출 검사법 개발Example 2. Development of multiple real-time gene detection assays for
2-1. 파에코바이러스 1, 2, 3 다중 실시간 유전자 검출 검사법의 프라이머 및 프로브 농도 조건 확립 및 반응조건 최적화2-1. Establishment of primer and probe concentration conditions and optimization of reaction conditions for
앞서 단일 키트로 개발 완료하였던 파에코바이러스 1, 2, 3 키트와 동일한 프라이머와 프로브를 이용하여 다중검출 키트를 개발(표 26)하였고 내부양성대조군으로 EPC를 사용하여 다중 검출 키트를 구성하였다.A multiple detection kit was developed (Table 26) using the same primers and probes as the
파에코바이러스 1, 2, 3 및 EPC 검출용 프라이머와 프로브의 올리고를 합성하였으며 유병률이 높은 혈청형순으로 파에코바이러스 3에는 FAM으로 파에코바이러스 1에는 VIC으로 파에코바이러스 2는 ROX로 마지막으로 EPC는 Cy5로 형광물질을 다르게 구성하였고 또한 다중키트에 사용된 Master mix는 단일 키트에서 가장 좋은 효율을 보여주었던 Master mix을 동일하게 사용하여 조건 확립을 진행Primers and probe oligos for detecting
농도 조건 최적화 시 고려할 사항은 각 표적 지역의 증폭곡선의 △Rn 값 및 linear phase의 기울기를 조절하고, 각 TaqMan 프로브의 형광 물질들의 상호교차 현상을 최소화하기 위해서 프로브의 농도를 조절할 것, 단일 프라이머 및 프로브 조건에서와 증폭 효율을 유사하게 맞출 것을 고려하였다.Matters to be considered when optimizing concentration conditions include adjusting the △Rn value of the amplification curve of each target region and the slope of the linear phase; It was considered to match the amplification efficiency similarly to that of the probe conditions.
내부양성대조군인 EPC는 파에코바이러스의 증폭 효율에 지장을 주지 않도록 최적화된 프라이머 및 프로브 농도 조건을 사용하였다(도 11, 표 27 참고).EPC, an internal positive control, used primer and probe concentration conditions optimized so as not to interfere with the amplification efficiency of Paecovirus (see FIG. 11 and Table 27).
각 파에코바이러스 1, 2, 3 다중 프라이머 및 프로브 세트 반응액과 내부양성대조군이 혼합된 프라이머 및 프로브 세트 반응액 간에 증폭 곡선의 효율을 Ct value와 증폭곡선 모양을 통해서 각 파에코바이러스 혈청형마다 비교하였으며 최적의 조건을 최종 조건으로 확립하였다.The efficiency of the amplification curve between each
구체적으로 Real-time PCR Master Mix 반응액은 각 농도로 혼합한 프라이머 및 프로브 시약 4 μL, 1.2X Rox dye 1 μL, 2X Real-time RT-PCR Master Mix 10 μL와 단계적으로 희석한 RNA 5 μL 및 TE buffer를 첨가하여 최종 볼륨을 20 μL로 맞추었고 PCR 조건은 50℃에서 30분간 역전사 처리 과정을 진행하고 95℃에서 10분간 Taq polymerase를 활성화시킨 후, 95℃ 15초 및 60℃ 1분을 1 cycle로 하여 총 40 cycle을 수행하였다.Specifically, the Real-time PCR Master Mix reaction solution contains 4 μL of primer and probe reagents mixed at each concentration, 1 μL of 1.2X Rox dye, 10 μL of 2X Real-time RT-PCR Master Mix, and 5 μL of stepwise diluted RNA and TE buffer was added to adjust the final volume to 20 μL, and the PCR conditions were reverse transcription at 50 ° C for 30 minutes, Taq polymerase activated at 95 ° C for 10 minutes, 95 ° C for 15 seconds and 60 ° C for 1 minute 1 A total of 40 cycles were performed as a cycle.
/Probe/Probe
size
(VP 3)Parecho virus 1
(VP 3)
(VP 3)Parecho virus 2
(VP 3)
(VP 0)Parecho virus 3
(VP 0)
파에코바이러스 1, 2, 3 다중 실시간 유전자 검출 검사법에 대한 최종 조건을 확립하였으면 반응액 조성은 표 28에 기재하였다.When the final conditions for the
(μL)(μL)
(Final conce.: F primer 1, 2 각 250 nM, R primer 1. 2 각 250 nM, Probe 200 nM)
(Final conce.:
(Final conce.: F primer 1, 2 각 250 nM, R primer 250 nM, Probe 200 nM)
(Final conce.:
(Final conce.: F primer 1, 2 각 250 nM, R primer 250 nM, Probe 100 nM)
(Final conce.:
(Final conce.: F primer 50 nM, R primer 50 nM, Probe 50 nM)EPC Primer/probe mix
(Final conce.:
2-2. 파에코바이러스 1, 2, 3 다중 실시간 유전자 검출 검사법의 성능평가2-2. Performance evaluation of
ㄱ. 파에코바이러스 1, 2, 3 다중 실시간 유전자 검출 검사법의 분석적 특이도go. Analytical specificity of
개발한 파에코바이러스 1, 2, 3 다중 실시간 유전자 검출 검사법의 특이성을 교차반응시험을 통해 확인하였다. 유사한 증상의 원인이 될 수 있는 다른 병인체 및 human genomic RNA를 포함한 핵산을 이용하여 Real-time RT-PCR을 수행한 후 각각의 시료에 대한 검출 결과를 분석하였고 시험에 사용한 물질은 용역과제 주관기관, NCCP 국가병원체자원은행, KCTC 생물자원센터(Korean Collection for Type cultures), ATCC (American Type Culture Collection)에서 분양 받거나 Vircell S.L (Santafe, Spain)에서 핵산을 구입하여 사용하였다. The specificity of the developed
교차반응 시험 결과 파에코바이러스 1, 2, 3, 다중 키트 모두 해당 시료에서만 형광 채널에서 검출반응이 일어났고 다른 종의 핵산에서는 검출반응이 일어나지 않았고, IC는 모든에서 증폭반응을 일으켜 검사 샘플 질평가를 위한 확인되었으며 본 연구 과제용 시약의 특이성을 입증하였다. 파에코바이러스 1, 2, 3 다중 검출용 Real-time RT-PCR 시스템의 교차반응 시험 결과는 표 29에 기재하였다.As a result of the cross-reaction test, the detection reaction occurred in the fluorescence channel only in the corresponding sample in all of the
(VIC)(VIC)
(ROX)(ROX)
(FAM)(FAM)
(Cy5)(Cy5)
parechovirus 1
parechovirus 2parechovirus 2
parechovirus 3parechovirus 3
Simplex virus 1Herpes
Simplex virus 2Herpes
virus 1Parainfluenza
virus 2Parainfluenza
virus 3Parainfluenza
syncytial virus ARespiratory
syncytial virus A
syncytial virus BRespiratory
syncytial virus B
(H1N1)Influenza virus A
(H1N1)
Coronavirus
NL63human coronavirus
NL63
229Ehuman coronavirus
229E
OC43human coronavirus
OC43
NL63human coronavirus
NL63
ㄴ. 파에코바이러스 1, 2, 3 다중 실시간 유전자 검출 검사법의 직선성 확인you. Confirmation of linearity of
시험법에 있어 직선성이란 검체 중에 함유되어있는 분석 대상물질(target analyte)의 양에 정비례하는 결과를 제공할 수 있는 능력을 말하며 시험 기준은 1/10씩 단계 희석한 시험물질을 이용하며 표준곡선을 작성하였다.In the test method, linearity refers to the ability to provide results that are directly proportional to the amount of the target analyte contained in the sample. was written.
표준곡선 검사용 RNA를 사용하여 얻은 Ct값 평균을 Y축으로 각각의 농도에 log를 취한 값 Log(concentration) 을 X축으로 하여 작성한 표준곡선 결과를 검증한 후 농도정보가 없는 바이러스 시료의 농도를 측정 가능하다. 표준곡선의 선형도(R2값) 과 선형의 기울기값을 통한 PCR efficency를 통해 파에코바이러스 1, 2, 3 프라이머/프로브 세트가 정량에 사용가능 여부를 검증하며 표준곡선의 선형도(R2값)가 0.98 이상일 때 적합함을 의미한다.The average of the Ct values obtained using RNA for standard curve testing is Y-axis, the value obtained by taking the log of each concentration as the X-axis, and after verifying the result of the standard curve prepared, the concentration of the virus sample without concentration information is calculated. measurable The linearity of the standard curve (R 2 value) and the linearity of the standard curve (R 2 value) is 0.98 or more, it means that it is suitable.
농도(copies/μL)를 알고 있는 합성유전자(표적지역을 포함하는 올리고뉴클레오티드)를 이용해서 작성한 파에코바이러스 1, 2, 3의 표준곡선의 선형도가 적합함을 확인한 후 주관부서로부터 제공받은 판 파에코바이러스의 RNA의 농도를 측정하였으며 정량을 수행하였다.After confirming that the linearity of the standard curve of
농도를 측정한 파에코바이러스 1, 2, 3의 RNA를 이용해 파에코바이러스 1, 2, 3 다중 검출 검사법에 대한 직선성 평가를 수행하였고(도 12), 각 시료를 TE buffer를 이용해 10배씩 순차적으로 희석한 뒤, 주형 RNA로 사용하여 PCR을 수행하여 얻은 Ct값 평균을 Y축으로 각각의 농도에 log를 취한 값 Log (concentration)을 X축으로 하여 작성한 표준곡선 결과, 표준곡선의 선형도(R2값)이 0.98 이상으로 모두 적합한 것을 확인하였다(표 30, 31, 32는 각각 파에코바이러스 1, 2, 3 다중 실시간 유전자 검출법의 HpeV-1 직선성 확인 Ct 값임).Linearity evaluation was performed for the
ㄷ. 파에코바이러스 1, 2, 3 다중 실시간 유전자 검출 검사법의 최소검출한계 및 판정기준치 확인do. Confirmation of minimum detection limit and cutoff value of
판정기준치(cut-off)는 경계치 이상을 양성으로 경계 미만을 음성으로 볼 수 있는 경계 값을 말하는데 민감도로 추정되는 3구간을 20 반복 수행하여 결정하였다. 앞서, 직선성 테스트 결과를 기반으로, 10 copies/μL 농도의 각 파에코바이러스 1, 2, 3 RNA를 기준으로 아래로 3배씩 희석한 민감도 부근의 3.33, 1.11, 0.37 copies/μL의 시료를 각각 20회 반복 수행하여 20개가 모두 검출되는 가장 낮은 농도의 copy 수를 최소검출한계로 결정하였다.The cut-off refers to the threshold value that can be viewed as positive if above the threshold and negative if below the threshold, and was determined by performing 20 repetitions of 3 sections estimated by sensitivity. Previously, based on the results of the linearity test, samples of 3.33, 1.11, and 0.37 copies/μL near the sensitivity diluted 3-fold based on each
[계산식] 판정기준치 = Ct값 평균 + (2 x Ct값 표준편차)[Calculation] Criterion value = average of Ct values + (2 x standard deviation of Ct values)
20 반복 결과 파에코바이러스 1, 2, 3 다중 검출 검사법 각 유전형의 최소검출한계는 3.33 copies/μL으로 단일검출시스템과 동일하게 결정되었으며 판정기준치는 계산식에 따라 파에코바이러스 1은 Ct 38.4, 파에코바이러스 2는 Ct 36.8, 파에코바이러스 3은 Ct 35.8로 결정되었다(표 33, 34, 35는 각각 파에코바이러스 1, 2 ,3 다중 검출 검사법의 예상 최소검출한계 3구간을 20회 반복 수행한 Ct 값임).20 repeated
2-3. 파에코바이러스 1, 2, 3 다중 실시간 유전자 검출 검사법의 임상적 성능2-3. Clinical Performance of
파에코바이러스 검사를 위한 주요 시료인 분변시료는 병원체 감염이 확인되지 않은 음성시료를 이용하여 핵산을 추출하였다. 추출한 핵산 시료를 음성 매트릭스로 사용하여 농도를 측정한 파에코바이러스 genomic RNA를 첨가하여 조제양성시료를 준비하였다. Nucleic acid was extracted from the fecal sample, which is the main sample for the Paecovirus test, using a negative sample in which pathogen infection was not confirmed. A prepared positive sample was prepared by adding Paechovirus genomic RNA whose concentration was measured using the extracted nucleic acid sample as a negative matrix.
구체적으로 파에코바이러스 1의 최소검출한계 농도 3배(3xLoD) 15개, 2배(2xLoD) 15개, 1.5배(1.5xLoD) 20개로 구성된 양성 50개, 파에코바이러스 2의 최소검출한계 농도 3배(3xLoD) 15개, 2배(2xLoD) 15개, 1.5배(1.5xLoD) 20개로 구성된 양성 50개, 파에코바이러스 3의 최소검출한계 농도 3배(3xLoD) 15개, 2배(2xLoD) 15개, 1.5배(1.5xLoD) 20개로 구성된 양성 50개, HPeV-1, 2, 3에 대한 음성 50개로 구성된 조제된 양성시료와 음성시료를 사용하여 시험한 결과 조제한 양성시료에 대한 양성 일치율 100% (민감도 확인), 음성시료 50개에 대한 일치율 100% (특이도) 확인하였다(표 36 : 파에코바이러스 1, 2, 3 다중 검출 검사법의 임상적 성능 결과, 표 37 : 파에코바이러스 1, 2, 3 다중 검출 검사법의 파에코바이러스 1 양성 시료 50개 Ct값, 표 38 : 파에코바이러스 1, 2, 3 다중 검출 검사법의 파에코바이러스 2 양성 시료 50개 Ct값, 표 39 : 파에코바이러스 1, 2, 3 다중 검출 검사법의 파에코바이러스 3 양성 시료 50개 Ct값, 표 40 : 파에코바이러스 1, 2, 3 다중 검출 검사법의 음성 시료 50개 Ct값).Specifically, 50 positives consisting of 3 times (3xLoD) 15, 2 times (2xLoD) 15, and 1.5 times (1.5xLoD) 20 minimum detection limit concentrations of
검사법 결과 (qPCR)Assay results (qPCR)
(Positive Agreement Percent)(Positive Agreement Percent)
(Positive Agreement Percent)(Positive Agreement Percent)
<110> Korea Disease Control and Prevention Agency
<120> Method for detection and quantification of Human parechovirus
using real-time polymerase chain reaction
<130> PN2109-466
<160> 16
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 1
tgtatcccct atgttgctga c 21
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<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> F-primer 2
<400> 2
tgyatcccct aygtmgctga c 21
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<213> Artificial Sequence
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<223> R-primer 1
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<212> DNA
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<220>
<223> R-primer 2
<400> 4
gataaaggwg tccaaacrta gacctt 26
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 5
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> F-primer 1
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 7
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<212> DNA
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<223> Probe
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<220>
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<110> Korea Disease Control and Prevention Agency
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using real-time polymerase chain reaction
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<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> F-
Claims (13)
상기 파에코바이러스는 파에코바이러스 1, 파에코바이러스 2 및 파에코바이러스 3인 것을 특징으로 하는, 조성물.a primer set comprising the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 1, 2, 3 and 4 and a probe comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5; a primer set comprising the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 6, 7 and 8 and a probe comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 9; And a primer set consisting of the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 10, 11 and 12 and a probe consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 13;
The composition characterized in that the Paecovirus is Paecovirus 1, Paechovirus 2 and Paecovirus 3.
상기 서열번호 1, 2, 3 및 4의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트 및 서열번호 5의 염기서열로 이루어진 프로브;의 표적 유전자는 파에코 바이러스 1(Parecho virus 1)의 VP3 유전자인 것을 특징으로 하는, 조성물.According to claim 1,
The target gene of the primer set consisting of the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 1, 2, 3 and 4 and the probe consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5; characterized in that the VP3 gene of Parecho virus 1, composition.
상기 서열번호 6, 7 및 8의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트 및 서열번호 9의 염기서열로 이루어진 프로브;의 표적 유전자는 파에코 바이러스 2(Parecho virus 2)의 VP3 유전자인 것을 특징으로 하는, 조성물.According to claim 1,
The target gene of the primer set consisting of the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 6, 7 and 8 and the probe consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 9; characterized in that the VP3 gene of Paecho virus 2 (Parecho virus 2) composition.
상기 서열번호 10, 11 및 12의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트 및 서열번호 13의 염기서열로 이루어진 프로브;의 표적 유전자는 파에코 바이러스 3(Parecho virus 3)의 VP0 유전자인 것을 특징으로 하는, 조성물.According to claim 1,
The primer set consisting of the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 10, 11 and 12 and the probe consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 13; characterized in that the target gene is the VP0 gene of Parecho virus 3, Composition.
상기 프로브는 5'-말단에 형광 표지인자(reporter dye) 가 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 조성물. According to claim 1,
The probe is a composition characterized in that a fluorescent marker (reporter dye) is bound to the 5'-end.
상기 형광 표지인자는 FAM(6-carboxyfluorescein), JOE, HEX(hexachloro-6- carboxyfluorescein), TET(tetrachlorofluorescein), 텍사스 레드(texas red), 로다민 그린(rhodamine green), 로다민 레드(rhodamine red), 테트라메틸로다민(tetramethylrhodamine), NED(N-(1-naphthyl ethylenediamine), Cy5(cyanine-5) 및 Cy3(cyanine-3), VIC 또는 ROX로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물. According to claim 6,
The fluorescent markers include 6-carboxyfluorescein (FAM), JOE, hexachloro-6-carboxyfluorescein (HEX), tetrachlorofluorescein (TET), texas red, rhodamine green, and rhodamine red. , Tetramethylrhodamine (tetramethylrhodamine), NED (N- (1-naphthyl ethylenediamine), Cy5 (cyanine-5) and Cy3 (cyanine-3), a composition characterized in that selected from the group consisting of VIC or ROX.
상기 키트는 DNA 중합효소, dNTP, 버퍼 또는 EPC를 추가적으로 더 포함하는 것을 특징으로 하는 키트. According to claim 8,
The kit further comprises a DNA polymerase, dNTP, buffer or EPC.
상기 키트는 실시간 중합효소연쇄반응(real-time polymerase chain reaction) 방법으로 수행되는 것을 특징으로 하는 키트. According to claim 8,
The kit is characterized in that carried out by a real-time polymerase chain reaction (real-time polymerase chain reaction) method.
상기 파에코바이러스는 파에코바이러스 1, 파에코바이러스 2 및 파에코바이러스 3인 것을 특징으로 하는, 방법.A primer set comprising the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 1, 2, 3 and 4 and a probe comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5 for the RNA isolated from the sample; a primer set comprising the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 6, 7 and 8 and a probe comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 9; And a primer set consisting of the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 10, 11, and 12 and a probe consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 13; performing and analyzing a real-time polymerase chain reaction using In the multiple detection method of human parechovirus,
Characterized in that the Paecovirus is Paecovirus 1, Paecovirus 2 and Paecovirus 3, the method.
상기 파에코바이러스는 파에코바이러스 1, 파에코바이러스 2 및 파에코바이러스 3인 것을 특징으로 하는, 방법.A primer set comprising the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 1, 2, 3 and 4 and a probe comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5 for the RNA isolated from the sample; a primer set comprising the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 6, 7 and 8 and a probe comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 9; And a primer set consisting of the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 10, 11, and 12 and a probe consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 13; the Ct value obtained by performing a real-time polymerase chain reaction using a standard In a method for quantifying a human parechovirus comprising the step of substituting into a calibration curve,
Characterized in that the Paecovirus is Paecovirus 1, Paecovirus 2 and Paecovirus 3, the method.
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|---|---|---|---|---|
| KR102200925B1 (en) | 2019-07-30 | 2021-01-13 | 대한민국(질병관리청장) | Method of testing genes in real-time pcr for rapid detecting 15 species of bio terror phatogens and subspecies phatogens comprising clostridium botulinum neurotoxin a |
-
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|---|---|---|---|---|
| KR102200925B1 (en) | 2019-07-30 | 2021-01-13 | 대한민국(질병관리청장) | Method of testing genes in real-time pcr for rapid detecting 15 species of bio terror phatogens and subspecies phatogens comprising clostridium botulinum neurotoxin a |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Alho 등, JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY, Vol. 41, No. 6, 페이지 2294-2299 (2003.06.)* * |
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