KR20230075878A - 유기물질 기반 나노유체 소포제 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 유기물질 기반 나노유체 소포제에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 키토산이 도입된 지질화합물 나노입자가 매질에 분산되어 있는 나노유체를 포함하는 소포제를 미생물 배양공정에 도입함으로써 가스를 이용하는 미생물 배양공정에서 발생하는 거품을 억제하고 거품발생에 의한 가스의 물질전달 저해 효과를 감축시켜 미생물 배양공정의 안정성을 향상시키는 유기물질 기반 나노유체 소포제 및 대사산물의 생산성 향상 방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 유기물질 기반 나노유체 소포제에 관한 것으로, 보다 상세하게는 키토산이 도입된 지질화합물 나노입자가 매질에 분산되어 있는 나노유체를 포함하는 소포제를 거품(foam)이 발생하는 미생물 배양공정에 도입함으로써 미생물 배양공정에서 발생하는 거품을 억제하고 거품발생에 의한 가스의 물질전달 저해 효과를 감축시켜 미생물 배양공정의 안정성을 향상시키는 유기물질 기반 나노유체 소포제 및 이를 이용한 대사산물의 생산성 향상 방법에 관한 것이다.
미생물 발효 공정을 이용한 화학 물질의 생산은 기존의 화학적 생산 방법의 한계점을 극복할 수 있는 기술로 여겨지고 있으며, 이러한 미생물 기반 화학물질 생산의 가격 경쟁력을 높이기 위해서 값싸고 풍부한 탄소원을 활용하고자 하는 연구가 활발히 진행되고 있다.
미생물을 이용한 바이오 에너지 및 바이오 기반 화학물질 생산을 위해서는 미생물을 증폭하는 단계인 배양 공정이 반드시 필요하며 미생물을 이용한 바이오 에너지 및 바이오 기반 화학물질 생산 공정이 경제적으로 완성되기 위해서는 초반 단계인 배양 공정이 높은 생산성을 유지하면서도 안정적인 공정으로 확립될 필요가 있다. 일반적으로 일산화탄소(CO)와 같은 C1 가스를 기질로 하여 바이오 수소(H2)를 생산하는 생물 공정의 경우에는, 물에 잘 녹는 당(Sugar)을 사용하는 전통적인 발효 공정과 다르게 기질(가스)의 물에 대한 용해도가 낮아, 수소 생산성을 향상시키기 위해서는 가스의 물질전달 속도를 높이기 위한 별도의 노력이 필요하다.
그러나 가스를 이용하는 미생물 배양 공정은 화학공정과 달리, 저온 저압조건에서 가스를 고부가가치 유용산물로 전환할 수 있는 장점에도 불구하고, 미생물 배양 시 대량으로 발생하는 거품(foam)에 의해 안정적인 공정의 운영이 어렵다는 문제점이 존재해왔다. 미생물을 배양하면서 필연적으로 발생되는 현상으로 주로 미생물이 증폭하는 대수기나 배양이 끝나가는 후반부에 주로 발생하고, 포도당과 같은 당을 기질로 사용하는 미생물의 배양보다 일산화탄소(CO), 이산화탄소(CO2), 메탄(CH4) 등의 가스를 기질로 이용하는 배양과정에서 가스 전달 속도를 높이기 위해 가스 유량을 올릴 시 더욱더 심하게 발생하여 경우에 따라 배양기 외부로 거품이 넘쳐 생성된 가스를 포집 또는 분석하는 기기에 악영향을 미친다. 이를 해결하지 못하는 경우 거품이 차지하는 부피로 인해 반응기의 용액 부피를 거품 부피까지 포함하여 적은 부피로 미생물을 배양을 해야 하기 때문에 공정의 생산성과 안정성에 영향을 받는다. 미생물 배양 공정 내 대량 발생하는 거품은 배양 배지 내 존재하는 고농도의 전해질, 미생물 배양에 따른 대사산물의 축적 및 미생물 사멸에 따른 단백질 용출 등에 의해 반응기 내부 기-액 간 계면에서 거품이 대량 발생하는 것으로 알려져 있으며, 거품 발생으로 인해 기-액 간 물질-전달(mass-transfer)을 떨어트릴 뿐 만 아니라, 거품 생성에 의한 배지가 배양기 외부로 넘치게 되어 분석기기에 오염 또는 고장을 일으키는 문제점을 가지고 있다.
이러한 종래 기술의 문제점들을 해결하기 위해 여러 노력들이 수행되어 왔는데, 대한민국 등록특허 제10-1880129호 및 대한민국 등록특허 제10-1927809호는 에어리프트(airlift) 타입의 생물반응기는 교반을 위해 임펠러를 대신하여 스파저(sparger)를 사용한다. 그러나 종래의 에어리프트 타입의 생물반응기의 경우 일체형으로 이루어져 스파저 교환이 어렵고, 분리 또한 어려워 스파저 기공 사이에 낀 잔여물들을 세척하는데 문제가 있다. 또한, 생물공정 시 각각의 미생물에 따라 미생물에 따라 요구되는 생장 환경과 최적의 조건이 다름에도 불구하고, 이러한 조건들을 맞추기 위한 스파저의 기공 사이즈 및 평판형 또는 환형 등의 스파저의 형태 변경이 불가능한 문제점이 있다.
또한, 미생물 배양 과정 중에서 발생하는 거품을 제거하기 위해 미생물 배지 내 화학 합성물인 실리콘 및 폴리프로필렌-글라이콜 기반 소포제 등과 같은 소포제를 사용하는 화학적인 방법이 거품 제거에 효과적이어서 널리 사용되고 있다. 하지만 이러한 거품 억제를 위해 도입되는 화학합성물 기반의 소포제의 경우, 반응기 내부에 직접 도포 시 특히 화학물질에 비교적 약한 미생물의 경우에 소포제의 성분이 배지 용액의 물성이나 미생물 생장에 영향을 미쳐 활용이 제한되고 전체적인 배양에 영향을 줄 수 있으며 반응기 내 배양액의 부피가 클수록 희석되는 비율이 높기 때문에 상대적으로 많은 양의 소포제가 요구되어 미량으로는 기-액 물질-전달 효율을 기대할 수 없다는 문제점이 있다.
한편, 나노유체(nanofluid)란 나노미터 크기의 입자를 포함하는 유체로, 통상적으로 직경이 100 nm보다 작거나 유사한 수준의 나노입자들이 안정적으로 분산된 분산액을 의미한다. 최근에는 표면이 기능화된 나노입자를 도입한 나노유체(nanofluid)를 도입하여 다양한 생물학적 목적으로 이용하고자 하는 연구가 진행되고 있다(George, J. et al., Nanotechnol. Sci. Appl. 8, 45-54 (2015)). 최근, 나노입자를 도입한 나노유체를 통하여 기/액 시스템에서의 물질전달계수 및 용해도를 향상시키고자 하는 연구가 진행되고 있다. 지금까지 나노유체에 대한 연구는 1995년 처음 보고된 이래로 나노유체를 주제로 한 연구보고가 증가하는 추세이며, 적용범위는 주로 열전달 효율의 향상과 관련된 이론적 해석을 중심으로 이루어져 왔고, 최근 물질전달 확산계수의 증가 효과도 기대할 수 있음이 보고되고 있다.
구체적으로 나노유체를 이용한 연구는 대부분 무기물 중심의 산화물, 질화물 및 카바이드 세라믹스, 금속 및 금속산화물, 카본 나노튜브 기반 나노입자를 활용하여, 산소, 암모니아, 이산화탄소의 물질전달 효율 향상 연구가 주를 이루고 있고, 보일러 현상(boiling-phenomena), 촉매(catalyst), 계면 부분(surface-area), 대류 현상(conductivity), 물질 전달(mass-transfer), 생체 약품(bio-medical) 등 넓은 분야에 걸쳐 연구가 진행되고 있고, 특히 물질 전달 측면으로 볼 때, 기-액 평형(vapor-liquid)부분에서 기체의 용해도 향상 효과(gas absorption)에 대한 여러 연구 보고가 되어있다(Y. Kang et al., International Journal of Coal Geology, s154-155, pp. 123-135, 2016; J.S. Lee et al., Applied Energy, Vol. 143, pp.119-129, 2015).
나노유체에 의한 물질 전달 향상에 대한 이유로는 여러 가설이 존재하지만, 그 중 가장 유력한 가설에는 1) 나노유체에 의한 기포 크기 감소, 2) 나노유체에 의한 기/액 계면의 두께 감소, 3) 나노유체를 구성하는 나노 입자 표면에서 C1가스 흡착/탈착에 의한 운반 효과, 4) 나노 입자의 추가적인 대류확산에 의한 액상에서의 물질전달에 의한 것으로 여겨지고 있다.
이에 본 발명자들은 상기 문제점을 해결하고 미생물 배양 시 대량으로 발생하는 거품을 효율적이고 안정적으로 제거하기 위하여 예의 노력한 결과, 키토산이 도입된 지질화합물 나노입자가 매질에 분산되어 있는 나노유체를 포함하는 소포제를 미생물 배양공정에 도입하여 사용할 경우 가스를 이용하는 미생물 배양공정에서 발생하는 거품을 억제하여 배양 효율을 향상시키고 공정의 안정성 및 경제성을 높일 수 있다는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
Bernat Ollι Pocurull, M.S.C.E.P., Massachusetts Institute of Technology, Cambridge, MA (2005)
Bernard P. Blinks et al. Angew. Chem. Int. Ed. 2005, 44, 3722 -3725
본 발명의 목적은 가스를 이용하는 미생물 배양공정에서 발생하는 거품을 억제하고 거품발생에 의한 가스의 물질전달 저해 효과를 감축시켜 미생물 배양공정의 안정성을 향상시키는 유기물질 기반 나노유체 소포제를 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 가스를 이용하는 미생물 배양 시 배양 배지 내 발생하는 거품을 억제하는 소포제로서의 나노유체의 활용 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 유기물질 기반 나노유체 소포제를 사용하여 미생물 배양 공정 내 발생하는 거품을 억제함으로써 거품발생에 의한 가스의 물질전달 저해 효과를 감축시키고, 미생물 배양 공정 내 공급되는 가스 버블의 크기 감소를 통해 미생물 배양공정의 안정성을 향상시키고, 대사산물 생산성 향상 방법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 키토산이 도입된 지질화합물 나노입자가 매질에 분산되어 있는 나노유체를 포함하는 소포제를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 소포제를 함유하는 배지에서 미생물을 배양하는 단계를 포함하는 미생물의 대사산물 생산성 향상 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 본 발명의 키토산/지질화합물이 혼합된 바이오폴리머 기반 나노유체를 미생물 배양공정에 도입함으로써 얻은 거품 억제 결과는 가스를 이용하는 미생물 배양공정의 안정성 및 경제성을 높일 수 있으며, 미생물 배양을 통한 고부가가치 물질의 생산 등의 분야에서 다양하게 활용될 수 있다.
본 발명에 의한 나노유체 도입을 통한 미생물 배양에 발생하는 거품을 억제하는 방안은 가스를 이용하는 미생물 배양에 광범위하게 활용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조한 키토산/올레아미드 나노유체 구성 나노입자의 푸리에 변환 적외선 분광 분석(Fourier-transform infrared spectroscopy) 결과를 나타낸 그래프이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따라 키토산/올레아미드 나노유체 첨가에 따른 미생물 배양 배지 내 (a) 가스 버블의 형태 및 크기, (b) 가스 주입부 가스 버블의 크기 차이를 관찰한 그래프이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따라 키토산/올레아미드 나노유체 첨가농도에 따른 미생물 배양 배지 내 표면장력 및 점도 변화를 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따라 키토산/올레아미드 나노유체 도입 유무에 따른 미생물 배지 내 거품 제거현상을 비교, 나타낸 그래프이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따라 키토산/올레아미드 나노유체 도입 유무에 따른 미생물 배양공정 시 거품 억제 효과를 육안으로 비교, 나타낸 사진이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따라 거품 억제에 필요한 키토산/올레아미드 나노유체의 사용 양을 시중 소포제와 비교하기 위해, 미생물 배양공정 시 소재 사용 양에 따른 거품 억제 효과를 비교, 나타낸 그래프이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따라 키토산/올레아미드 나노유체 첨가에 따른 미생물 배양 배지 내 (a) 가스 버블의 형태 및 크기, (b) 가스 주입부 가스 버블의 크기 차이를 관찰한 그래프이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따라 키토산/올레아미드 나노유체 첨가농도에 따른 미생물 배양 배지 내 표면장력 및 점도 변화를 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따라 키토산/올레아미드 나노유체 도입 유무에 따른 미생물 배지 내 거품 제거현상을 비교, 나타낸 그래프이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따라 키토산/올레아미드 나노유체 도입 유무에 따른 미생물 배양공정 시 거품 억제 효과를 육안으로 비교, 나타낸 사진이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따라 거품 억제에 필요한 키토산/올레아미드 나노유체의 사용 양을 시중 소포제와 비교하기 위해, 미생물 배양공정 시 소재 사용 양에 따른 거품 억제 효과를 비교, 나타낸 그래프이다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법 및 이하에 기술하는 실험 방법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
가스를 이용하는 미생물 배양공정에 있어서, 대량의 거품 발생은 안정적인 공정을 운용하는데 있어서 큰 문제점 중 하나인데, 키토산이 도입된 올레아미드 등의 지질화합물 나노입자가 매질에 분산되어 있는 나노유체를 미생물 배양 배지에 미량 도입할 경우 배양 공정 내 거품을 억제하여 미생물 배양에서 발생하는 거품 생성의 근본적인 문제를 해결할 수 있었다. 또한, 상기 나노유체는 거품 억제를 위한 상용 소포제와 비교해 보았을 때, 미량으로도 상용 소포제의 소포 효과를 나타내는 것을 확인하였다.
따라서, 본 발명은 일 관점에서 키토산이 도입된 지질화합물 나노입자가 매질에 분산되어 있는 나노유체를 포함하는 소포제에 관한 것이다.
본 발명에서, 상기 키토산은 (1->4) 2-amino-2-deoxy-
-D-glucan의 구조를 가지는 천연에 존재하는 매우 안전한 양이온성 다당류이다. 키토산은 천연의 갑각류 등으로부터 얻어지는 키틴 (chitin)을 탈아세틸화하여 유리 아민기를 생성시킨 폴리머 형태이다. 여기서 키토산은 분자량 1~500kDa이고 유리 아민기가 50% 이상일 수 있으며, 바람직하게는 키토산의 분자량이 150~400kDa이고 유리 아민기가 80% 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 키토산의 가용화 측면에서 수용성 키토산 및 불용성 키토산, 키토산의 분자를 변화시킨 키토산 유도체도 본 발 명의 키토산 범주에 포함될 수 있으며, 바람직하게는 수용성 키토산을 사용할 수 있다. 상기 수용성 키토산은 키토산 HCl, 키토산 아세테이트, 키토산 글루타메이트, 키토산 락테이트 중에서 선택된 하나 이상일 수 있다. 수용성 키토산은 분자구조 내의 아민기가 염산 또는 초산, 글루탐산, 젖산 등의 산성 물 질과 당량비로 염을 형성하고 있어 물에 용해가 가능하다. 수용성 키토산은 이물질 제거가 용이하다는 등의 장점이 있다. 이 외에도, 동일 분자 구조를 갖는 키토산 역시 모두 제한되지 않고 이에 포함될 수 있다.
본 발명에서 상기 지질 화합물은 항균성을 갖는 것으로 보고된 지질 및 이와 기능적으로 유사한 지질 유도체를 지칭한다. 바람직하게는 올레산(oleic acid) 및 라우릭산(lauric acid)과 같은 탄소수 6-18개 사이의 지방족 잔기를 갖는 지방산(fatty acid), 올레아미드(oleamide)와 에루카미드(erucamide) 및 지방 알콜과 같은 지방산 유도체 또는 모노글리세라이드, 스핑고신(sphingosine) 등의 지질 화합물 및 그 유도체를 말하며, 더욱 바람직하게는 올레아미드 및 에루카미드, 가장 바람직하게는 올레아미드와 구조적 동일성을 갖는 것을 의미하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 나노유체는 (a) 키토산과 지질화합물을 유기용매 단독 또는 유기용매와 산성용매의 혼합용매에 용해시킨 용액을 방사시켜 나노섬유로 제조하는 단계; 및 (b) 상기 제조된 나노섬유를 pH 9 이하의 수용액에서 파쇄하여 수득할 수 있으며, 바람직하게는 상기 키토산이 도입된 지질화합물 나노입자가 매질에 분산되어 있는 나노유체는 (a) 키토산과 지질 화합물을 산성 용매에 혼합하여 제조된 용액을 전기방사법에 의해 나노섬유로 제조하는 단계; 및 (b) 제조된 나노섬유를 pH 9이하의 수용액에서 파쇄시켜 제조하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 전기방사법은 고분자 용액이나 용융된 고분자를 소정 전압으로 하전시킬 때 발생하는 전기적 인력 및 척력을 이용하여 섬유를 형성하는 기술이다. 전기방사 공정은 수 nm ~ 수천 nm 크기의 다양한 직경을 갖는 섬유를 제조할수 있고 장비 구조가 간단하고 광범위한 재료에 적용이 가능하며 대량생산이 용이하다는 장점이 있다. 구체적으로, 전기방사 공정을 수행하기 위하여 먼저 키토산과 지질 화합물을 유기용매 단독 또는 유기용매와 산성용매의 혼합용매에 용해시킬 수 있다.
방사 공정은 적절한 전압에서 인가하면서 적절한 방사 장치를 이용하여 수행할 수 있다. 방사 공정 시 인가되는 전압은 10 내지 40 kV, 보다 바람직하게 20 내지 30 kV의 범위 내로 설정하는 것이 안정적인 방사공정을 수행할 수 있다. 또한 분출 속도 0.2 ㎖/시간 내지 0.9㎖/시간, 보다 바람직하게 0.4 ㎖/시간 내지 0.8㎖/시간이 바람직하다.
본 발명에 있어서, 상기 산성 용매는 트리플루오로아세트산, 헥사플루오로이소프로판올, 헥사플루오로프로판올, 아세트산, 및 염산으로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 산을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 키토산이 도입된 지질화합물 나노입자의 평균 직경은 200nm 이하인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 매질은 극성용매인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 미생물 배양 시 대량으로 발생하는 거품에 의해 안정적인 공정의 운영이 어려운 문제점을 해결하기 위해 키토산/지질화합물이 혼합된 바이오폴리머 기반 나노유체를 사용할 경우 배양 배지 내 발생하는 거품을 억제하는 소포제로서 작용하여 기존의 소포제와 비교하였을 때, 낮은 농도로도 더 효과적으로 미생물 배양 공정 내 발생하는 거품을 억제함으로써 거품발생에 의한 가스의 물질전달 저해 효과를 감축시키고, 미생물 배양 공정 내 공급되는 가스 버블의 안정화 효과를 통해 미생물 배양공정의 안정성을 향상시키는 것을 확인하였다. 더욱이 가스를 이용하는 미생물 배양의 경우 일반적인 미생물 배양에서보다 거품이 더 많이 발생하는데, 이러한 경우에도 거품이 더욱 효과적으로 제거되는 것을 확인하였다.
따라서, 본 발명은 다른 관점에서 상기 소포제를 함유하는 배지내 미생물을 배양하는 단계를 포함하는 미생물의 대사산물 생산성 향상 방법에 관한 것이다.
본 발명의 바람직한 일 실시예로서 가스를 이용하여 거품이 다량 발생하는 미생물 배양 공정에서 상기 소포제를 함유하는 배지에서 미생물을 배양하여 거품을 효과적으로 제거하면서 미생물 배양공정의 안정성 및 대사산물의 생산성을 향상시킬 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 가스는 일산화탄소(CO), 이산화탄소(CO2) 또는 메탄(CH4)일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시하나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범주 및 기술사상 범위 내에서 다양한 변경 및 수정이 가능함은 당업자에게 있어서 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 특허청구범위에 속하는 것도 당연한 것이다.
[실시예]
제조예 1: 키토산-지질복합체가 도입된 나노유체의 제조
0.5g의 키토산과 0.5g의 지질복합체인 올레아미드를 6.5 ㎖ 1:1 비율의 TFA: HFIP 공-용매(Co-solvent)가 담긴 10 ㎖ 유리바이알에 첨가해준 후 50℃의 온도에서 20분동안 교반하여, 전기방사 용액을 준비하였다. 그 뒤, 무극성 계면활성제인 tween20 용액을 준비된 전기방사 용액에 115uL 첨가한 다음, 상온에서 20분동안 교반하였고, 10시간동안 전기방사를 수행하여 키토산 올레마이드 복합체가 도입된 나노섬유를 제조하였다.
이후 제조한 나노섬유를 멸균된 증류수에 추가하여 초음파 분쇄기를 통해 나노입자를 분산시켜 나노유체를 제조하였다. 다음으로, 제조한 나노 유체를 50 ㎖ 폴리프로필렌-튜브(Polypropylene-tube)로 옴겨 담아, 진공 건조기 내부에서 70℃로 2일간 보관, 건조 하여, 키토산/올레아미드 나노유체 구성 나노 입자를 회수하였다. 이어서, 건조한 나노 입자; 및 나노 입자를 구성하는 키토산 및 올레아미드를 푸리에 변환 적외선 분광분석을 이용하여 표면 분석을 진행하여 결과를 도 1에 나타내었다.
도 1에 나타낸 바와 같이 키토산/올레아미드 나노입자는 키토산에서 관찰되는 일차 아민(-NH3 +)피크 및 올레아미드에서 나타나는 지방족(Aliphatic group)의 C-H 스트레치(stretch) 피크가 모두 나타나는 것을 통해 제조한 나노유체 및 구성 나노입자가 키토산 및 올레아미드를 모두 함유하고 있는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 1: 미생물 배양 배지에 키토산/올레아미드 나노유체의 도입에 따른 가스 버블의 변화 확인
제조예 1과 같은 방식으로 제조된 키토산/올레아미드 나노유체를 가스를 이용하는 미생물 배양 배지에 도입 하였을 때, 공급되는 가스버블의 형태 및 크기를 확인하기 위해, 1L 배양시스템 내 키토산/올레아미드 나노유체 도입 유무에 따른 가스 버블의 변화를 확인하였다.
1L 배양시스템의 경우, 크게 가스 공급기, 발효조, 유량측정기, 용액 내 산소 측정장치 5가지로 나뉘며, CNS사의 발효조 시스템의 센서 미터(sensor meter)를 이용하여 발효조 내부의 온도를 항온상태(25℃로 유지하였다. 실험 장치는 세부적으로 공급기로부터 가스가 주입되어 용액과 반응이 일어나는 발효조(reactor), 발효조 내부로 공급되는 가스의 압력 및 외부로 빠져나가는 가스의 유량을 측정, 조절해주는 유량 측정기(Mass Flow meter) 및 실제 용액 내 용존 산소를 측정하는 용존산소 측정 장치(dissolved oxygen probe), 공급 및 외부로 빠져나가는 가스의 유량을 측정 조절하는 유량 측정기로 이루어져 있고, 물질전달계수 측정 분석에 이용되는 에어 가스통과 메탄 가스통, 레귤레이터 등이 있으며, 발효조 내부에는 공급기로부터 공급되는 가스가 실제 용액과 접촉하도록 구경 1/5 inch 크기의 스테인리스 가스 공급관(sparger)이 설치되어 있다.
미생물 배양 배지는 NMS 배지(멸균수 1L 당 MgSO4·7H2O 1g, KNO3 1g, CaCl2·2H2O 0.2g, iron-chelate 0.0038g, Na2MoO4·2H2O 0.0006g, KH2PO4 0.26g, Na2HPO4·7H2O 0.62g, CuSO4·5H2O 2.5㎎, biotin 0.02㎎, folic acid 0.02㎎, thiamine hydrochloride 0.05㎎ Ca-pantothenate 0.05㎎, vitamin-B12 0.001㎎, riboflavin 0.05㎎, nicotiamide 0.05㎎, FeSO4·7H2O 0.5㎎, ZnSO4·7H2O 0.4㎎, MnCl2·7H2O 0.02㎎, CoCl2·6H2O 0.05㎎, NiCl2·6H2O 0.01㎎, boric acid 0.015㎎, EDTA 0.25㎎ 포함)를 사용하였으며, 실제 가스 버블의 측정은 NMS 0.3 L 내에 나노유체 적용 유무에 따른 측정을 진행하였다.
다음으로는 1L 배양시스템 내부로 CH4 가스를 0.4 L/min 속도로 주입 해주면서, 초고속 카메라를 이용하여 나노유체 도입에 따른 NMS 배양 배지 내 가스 버블의 형태 및 변화를 확인 측정하였다.
배지의 깊이에 따른 버블의 크기 변화를 측정한 도 2의 (a)에 나타낸 바와 같이, 배지의 기저로부터 5 cm, 10 cm, 및 15 cm에서의 깊이에서의 버블의 형태를 측정한 결과, 나노유체를 적용한 실험군(CS/OA nanofluid)과 음성 대조군인 나노유체가 적용되지 않은 미생물 배양 배지(NMS medium only)를 비교해 보았을 때, 실험군에서는 버블이 구형의 형태를 띄고 동시에 비교적 작은 버블이 일부 형성되는 것을 확인 하였으며, 또한, 가스 도입부 에서는 가스 버블의 도입시 시간이 경과함(0.00 s, 0.01 s, 0.02 s, 0.03 s)에 따른 가스 버블의 크기도 상당히 감소된 것을 확인할 수 있었다(도 2의 (b)).
실시예 2: 미생물 배양 배지에 키토산/올레아미드 나노유체의 도입에 따른 표면장력 및 점도의 변화 확인
실시예 1의 키토산/올레아미드 나노유체의 미생물 배양배지내 도입에 의한 도입 버블크기 감소 및 안정화 효과가 나노유체 구성 도입에 따른 유체 특성의 변화에 의한 것인지 확인하기 위해, 키토산/올레아미드 나노유체의 미생물 배양 배지내 도입 농도에 따른 배지의 표면장력과 점도를 측정하였다. 표면장력 측정은 표면장력 측정기(Surface tension meter; DCA-200, ㈜에스이오)를 이용하여 측정하였으며, 점도 측정은 레오미터(Rheometer; RheolabQC, Anton Paar)를 이용하여 측정하였다. 구체적으로 NMS 배지 에 키토산/올레아미드 나노유체를 0~10*10-3 % (w/v) 농도로 분주 한 뒤, SEO사의 표면장력 측정기를 이용하여 표면장력을 측정하였다. 이어서, 점도 측정은 키토산/올레아미드 나노유체를 0~10*10-3 (%) [w/v] 농도로 NMS 배양배지에 분주 한 후, anton paar사의 레오미터를 이용하여, 전단 속도 100~700 s-1 범위에서 전단응력의 변화량을 측정, 계산하여, 키토산/올레아미드 나노유체 도입농도에 따른 NMS 배양배지의 표면장력 변화와 점도의 변화를 도 3에 나타내었다.
도 3에 나타낸 바와 같이 키토산/올레아미드 나노유체가 도입유무에 따른 점도는 차이가 없었으나, 표면장력의 경우 대조군인 NMS 배양배지의 표면장력이 71.72 mN/m로 측정된 반면, NMS 배양배지 내 키토산/올레아미드 나노유체 적용 농도가 0.1*10-3, 1*10-3, 10*10-3 (%) [w/v]으로 높아짐에 따라, 각각 표면장력이 71.19, 63.09, 49.30 mN/m로 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 실시예 1의 키토산/올레아미드 나노유체의 미생물 배양배지 도입에 따른 가스버블 크기 감소 효과는 키토산/올레아미드 나노유체의 도입에 따른 NMS 배양배지 표면장력 감소에 의한 것으로 예상된다.
실시예 3: 미생물 배양 배지에 키토산/올레아미드 나노유체의 도입에 따른 거품 제거 현상 확인
고농도 전해질이 포함된 미생물 배양 배지에서도 키토산/올레아미드 나노유체 적용시 거품 억제 및 거품 제거가 가능한지 살펴 보기 위해, 고농도 전해질이 포함되어 있는 Thermooccus onnurinues NA1 배양배지 (이하 MM1배지)을 제조하였다. MM1배지 제조는 멸균수 1L 당 NaCl 35g, KCl 0.7g, CaCl2·2H2O 0.4g, NH4Cl 0.3g, Cystein-HCl 0.5g, YeastExtract 10g, CuSO4·5H2O 0.04g, ZnSO4·7H2O 0.4g, CoCl2·6H2O 0.02g, MnCl2·4H2O 0.8g, Na2MoO4·2H2O 0.4g, KBr 0.2g, KI 0.2g, H3BO3 0.4g, NaF 0.2g, LiCl 0.2g, Al2(SO4)3 0.2g, NiCl2·6H2O 0.04g, VOSO4·2H2O 0.02g, H2WO4 0.02g, Na2SeO4 0.02g, SrCl·6H2O 0.02g, BaCl2 0.02g, P-aminobenzoicAcid 0.005g, Biotin 0.002g, Calcium Pentothenate 0.005g, Cyanobalamin (Vitamin-B12) 0.0001g, Folicacid 0.002g, Nicotinicacid 0.005g, Pyridoxine 0.01g, Riboflavin 0.005g, Thiamine-HCl 0.005g 및 Lipoic Acid 0.005g를 포함하여 제조하였다. 제조한 MM1 배양배지에 키토산/올레아미드 나노유체 최종 적용농도 0~0.1*10-3 % (w/v)가 되도록 현탁 한 후, 제조한 배지를 110 ㎖ 유리 세럼병에 40 ㎖ 씩 분주하여 주었다. 이후, 고무 스토퍼와 알루미늄 씰을 이용하여 유리 세럼병의 입구를 막은 다음, 일산화탄소(CO)가스를 100 ㏄/min의 속도로 30분 동안 공급하여 시료를 준비하였다.
키토산/올레아미드 나노유체의 도입에 따른 거품 억제 및 제거능을 확인하기 위해, 준비된 시료를 4초 정도 흔들어 주어 배양배지 내 거품이 생성되도록 한 후, 배지 내부의 시간에 따른 거품 제거를 고속 카메라를 이용하여 10 초간 사진을 촬영하였다. 촬영한 사진들은 이미지 분석툴(Image J)을 이용하여, 배지내 키토산/올레아미드 나노유체의 도입시 시간에 따른 거품 제거비율을 확인, 도 4에 나타내었다.
도 4에 나타낸 바와 같이 나노유체를 적용한 실험군 (CS/OA nanofluid, 0.1 x 10-3 % (w/v)과 음성 대조군인 나노유체가 적용되지 않은 미생물 배양 배지(MM1 medium only)를 비교해 보았을 때, 기존 미생물 배양 배지의 경우 배양 배지 부피 높이 비례 30% (v/v)의 거품이 생성된 후, 3.06 초 동안 발생된 거품이 10 % (v/v) 가량 감소되는 것을 확인 할 수 있었으나, 키토산/올레아미드 나노유체 0.1*10-3 % (w/v) 가 포함된 MM1 배양배지의 경우, 초기 배양 배지 부피 높이 비례 5 % (v/v)의 거품이 생성된 후, 1.02초 안에 발생된 거품이 대부분 감소되는 것을 확인할 수 있었다. 본 결과를 통해, 키토산/올레아미드 나노유체는 전해질이 고농도로 포함된 배지 내에서도 거품억제 효과 및 거품제거 효과를 나타내는 것을 확인 할 수 있었다.
실시예 4: 미생물 배양 배지에 키토산/올레아미드 나노유체의 도입에 따른 거품 억제 효과 비교 확인
나노유체를 적용한 NMS 배양 배지 내 거품 제거 효과를 확인하기 위해, 키토산/올레아미드 나노유체 도입 유무에 따른 미생물 배양 배지 내 거품 제거 효과를 육안으로 비교하였다.
구체적으로, 메탄과 산소를 소모하여 증식하는 메탄전환균(Methanotroph)중 하나인 Methylosinus trichosporium . OB3b를 모델 균주로 선정하여, 두개의 3L 발효기에, 실시예 2와 같이 제조된 NMS 1.5L 에 키토산/올레아미드 나노유체를 0, 0.3125*10-3(%) [w/v] 적용농도가 되도록 현탁한 후, OB3b seed를 50㎖ 씩 각각의 3L 반응기에 접종하였다. 3L 발효기 내부로는 메탄, 에어 가스 가 공급될 수 있도록 47L 가스 실린더에 연결된 MFC (5850EM; Brooks Instrument)를 이용하여 메탄(CH4) 가스와 공기가 3:7 비율 로 혼합된 혼합가스가 600 ㎖/min 속도로 공급될 수 있도록 설정하였다. 배양은 30℃, pH 6.85-7.05, 300rpm 조건으로 진행하였다. 배양 48시간 이후, 미생물 배양 공정시 발생하는 거품의양을 육안으로 도 5의 A와 B와 같이 비교하였다.
도 5에 나타낸 바와 같이, 음성 대조군인 나노유체가 적용되지 않은 미생물 배양 배지(NMS medium only, 도 5의 A)와 나노유체를 적용한 실험군(CS/OA nanofluid, 도 5의 B)를 비교해 보았을 때, 실험군에서 거품 제거 효과가 월등히 나타나는 것을 확인할 수 있다.
실시예 5: 미생물 배양 배지에 키토산/올레아미드 나노유체의 도입(사용량)에 따른 거품 억제 효과 비교 확인
거품 억제에 필요한 키토산/올레아미드 나노유체의 사용 양을 시중 소포제와 비교하기 위해, 미생물 배양공정 시 소재 사용 양에 따른 거품 억제 효과를 비교하였다.
구체적으로 키토산/올레아미드 나노유체의 미생물 배양배지 도입 유무에 따른 미생물 배양 공정 내 발생하는 거품억제를 확인하기 위해, 두개의 5L 발효기에, 실시예 2와 같이 제조된 NMS 3 L에 키토산/올레아미드 나노유체; 및 이를 구성 하는 나노입자가 0, 0.3125*10-3(%) [w/v] 적용농도가 되도록 각각 주입한 후, 종-배양을 통해 회수한 DH-1 seed를 190 ㎖씩 각각의 5 L 반응기에 접종하였다. 발효기 내부로는 47L 가스 실린더에 연결된 MFC (5850EM; Brooks Instrument)를 이용하여 메탄(CH4) 가스와 공기가 4:6 비율 로 혼합된 혼합가스를 320 ㎖/min 속도로 공급될 수 있도록 설정하였다. 배양은 30℃, pH 6.85-6.95, 800rpm 조건으로 배치 배양을 진행하였다. 배양 12시간 이후, 대조군인 키토산/올레아미드 나노유체가 적용되지 않은 NMS배양 배지를 사용한 반응기 에서는 거품이 대량 발생하여, 시중 소포제(Antifoam emulsion B; Sigma-aldrich)를 배양기 내부로 0.1㎖/min 속도로 제공하여, 거품이 사라질 때 까지 들어가는 소포제의 총양을 측정한 후, 도 6의 A와 B와 같이 비교하였다.
도 6에 나타낸 바와 같이, 양성 대조군인 종래의 PDMS (polydimethylsiloxane) 성분 기반 소포제(Antifoam emulsion B, Sigma Aldrich®, 도 6의 A) 와 나노유체를 적용한 실험군(CS/OA nanofluid, 도 6의 B)를 비교해 보았을 때, 실험군에서 거품 제거 효과가 월등히 나타나는 것을 확인할 수 있다.
또한, 종래의 소포제(Antifoam emulsion B, 시그마 알드리치사, 도 6의 A)와 키토산/올레아미드 나노유체를 적용한 실험군(CS/OA nanofluid, 도 6의 B)의 최소 적용 농도를 표 1에 나타내었다.
| 거품 억제 비교 소재 | 최소 적용 농도 |
| A: Antifoam emulsion B (Sigma Aldrich®) |
6.25*10-3%(v/v) |
| B: 키토산/올레아미드 나노유체 | 0.3125*10-3%(w/v) |
표 1에 나타낸 바와 같이, 키토산/올레아미드 나노유체를 적용한 실험군은 종래의 소포제보다 가스를 이용하는 미생물 배양배지 내 훨씬 적은 양으로 동일한 소포 효과를 나타낼 수 있는 것을 확인하였다.
키토산 올레아미드 지질화합물 기반 나노유체를 미생물 배양 배지에 미량 도입하여도 배양 공정 내 거품을 억제하는 특징을 지니며, 미생물 배양에서 발생하는 거품 생성의 문제를 근본적으로 해결할 수 있다. 또한, 상기 나노유체는 거품 억제를 위한 상용 소포제와 비교해 보았을 때, 미량으로도 상용 소포제의 소포 효과를 나타내는 것을 확인하였다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
Claims (8)
- 키토산이 도입된 지질화합물 나노입자가 매질에 분산되어 있는 나노유체를 포함하는 소포제.
- 제1항에 있어서, 상기 키토산은 수용성 키토산, 불용성 키토산 및 키토산 유도체로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 소포제.
- 제2항에 있어서, 상기 수용성 키토산은 키토산 HCl, 키토산 아세테이트, 키토산 글루타메이트 및 키토산 락테이트로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 소포제.
- 제1항에 있어서, 상기 지질화합물은 올레산, 라우릭산, 올레아미드 및 에루카미드로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 소포제.
- 제1항에 있어서, 상기 나노유체는 (a) 키토산과 지질화합물을 유기용매 단독 또는 유기용매와 산성용매의 혼합용매에 용해시킨 용액을 방사시켜 나노섬유로 제조하는 단계; 및 (b) 상기 제조된 나노섬유를 pH 9 이하의 수용액에서 파쇄하여 수득하는 것을 특징으로 하는 소포제.
- 제5항에 있어서, 상기 산성 용매는 트리플루오로아세트산, 헥사플루오로이소프로판올, 헥사플루오로프로판올, 아세트산, 및 염산으로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 산을 포함하는 소포제.
- 제1항에 있어서, 상기 키토산이 도입된 지질화합물 나노입자의 평균 직경은 200 nm 이하인 것을 특징으로 하는 소포제.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 소포제를 함유하는 배지에서 미생물을 배양하는 단계를 포함하는 미생물의 대사산물 생산성 향상 방법.
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