KR20230074798A - 암 치료를 위한 대안적으로 형식화된 항-메조텔린 항체의 조성물 및 용도 - Google Patents

암 치료를 위한 대안적으로 형식화된 항-메조텔린 항체의 조성물 및 용도 Download PDF

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KR20230074798A
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루이기 그라쏘
니콜라스 씨. 니콜라이데스
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Abstract

종양은 숙주의 항종양 면역 반응을 피하기 위해 여러 메커니즘을 활용한다. 체액 면역억제는 메커니즘 중 하나이다. 종양은 자신의 생존을 향상시키기 위해 항체 또는 보체 매개 면역 반응을 억제할 수 있는 순환 인자를 생성한다. 메조텔린은 면역억제된 미세 환경을 나타내는 종양과 관련된 여러 암 유형에 의해 과발현되는 세포 표면 단백질이다. 항-메조텔린 항체는 종종 이러한 면역억제 미세환경에 노출된다. 그러나, 대안적으로 형식화된 항-메조텔린 항체는 종양 미세환경 면역 상태에 관계없이 메조텔린-발현 암을 사멸하는 데 효과적이다.

Description

암 치료를 위한 대안적으로 형식화된 항-메조텔린 항체의 조성물 및 용도
본 발명은 면역능숙하고(immunoproficient) 면역억제된 종양 미세환경에서 메조텔린-발현 암의 특이적 표적화에 효과적인 치료용 항체의 영역에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 미세환경 면역 상태와 관계없이 암 성장을 억제하는 개선된 치료 효능을 갖는 항체 기반 제제를 함유하는 방법, 키트 및 조성물에 관한 것이다.
종양 형성의 메커니즘은 조절되지 않는 세포 성장을 향상시키는 돌연변이 유전자의 결합된 축적과 영향을 받은 환자 내에서 생존을 가능하게 하는 면역 회피 메커니즘의 생성을 포함한다. 세포성(주로 T 세포 매개를 지칭함) 및 체액성(주로 항체 매개를 지칭함) 면역은 척추동물 숙주 유기체가 감염성 병원체 및 조절 장애 숙주 세포에 대해 방어하는 주요 메커니즘이다. 지난 몇 년 동안, 억제된 세포 매개 면역을 극복할 수 있는 면역 체크포인트 억제제의 사용은 종양의 하위 집합에 대한 활성화된 CD8+ T 세포 사멸을 촉발하는 데 있어서 강력한 효과를 입증했다(문헌[Hodi FS, et al. N Engl J Med 363:711-723, 2010]). 최근 중개 연구 결과에 따르면 종양은 또한 항체 의존성 세포 독성(ADCC), 보체 매개 세포 독성(CDC) 및 옵소닌화와 같은 항체 매개 메커니즘에 의해 종양 사멸 효과를 억제하는 체액 면역 경로를 억제하는 인자를 생성하는 것으로 나타났다(문헌[Vergote I, et al. J Clin Oncol 34:2271-2278]; 문헌[Kline JB, et al. J Clin Oncol 5:15, 2018]; 문헌[Wang W et al. Cytogenet Genome Res 152:169-179, 2017]; 문헌[Kline JB et al. Eur J Immunol. 48:1872-1882, 2018];문헌[Dai S, et al. PLos Pathog 9:e1003114, 2013]; 문헌[Melero I, et al. Nat Reviews Cancer 7:95-106, 2007]). 체액-면역 경로를 억제하는 인자는 리툭시맙, 오비누투주맙, 트라스투주맙, 페르투주맙, 세툭시맙, 알렘투주맙뿐만 아니라 다수의 실험적 항체를 포함하나 이에 제한되지 않는 ADCC 및 CDC를 통해 종양 사멸 효과를 나타내는 것으로 보고된 임상적으로 사용되는 치료용 항체의 효과를 억제한다(문헌[DiLillo DJ, Ravetech JV, Cancer Immunol Res 3:704-713, 2015]; 문헌[Ruck T, et al. Int J Mol Sci 16:16414―16439, 2015]; 문헌[Pelaia C, et al. Biomed Res Int 4839230:1-9, 2018]; 문헌[Zhou X, et al. Oncologist 13:954-966, 2008];문헌[Hsu YF, et al. Mol Cancer 9:-8, 2010]; 문헌[Spiridon CI, et al. Clin Cancer Res 8:1720-1730, 2002]; 문헌[Kline JB, et al. Eur J Immunol 48:1872-1882, 2018]; 문헌[Yamashita-Kashima Y, et al. Clin Cancer Res 17:5060-5070, 2011]). 항체 매개 체액성 면역 반응은 항체와 세포 표면 항원의 결합 조정에 의해 지배된다. 이 상호작용이 최적일 때, 세포 표면 결합 항체는 자연 살해(NK) 세포 또는 수지상/골수/단핵구 세포의 Fc-γ-활성화 수용체와 결합한다(ADCC에 참여하는 임의의 세포는 이 문서에서 "면역 이펙터 세포"로 지칭됨). 이 결합은 ADCC를 개시할 뿐만 아니라 C1q 보체 개시 단백질과 결합하여 고전적인 보체 CDC 경로를 통해 뿐만 아니라 식세포를 통한 옵소닌화를 통해 항체 결합 세포의 사멸을 유발한다(문헌[Reuschenbach M, et al. Cancer Immunol Immunother 58:1535-1544, 2009]). 체액성 면역 반응의 억제제는 이러한 메커니즘을 사용하는 치료 항체의 능력을 감소시키고 결과적으로 치료 효능을 감소시킨다(문헌[Wang W, et al. Cytogenet Genome Res 152:169-179, 2017]; 문헌[Kline JB, et al. Eur J Immunol 48:1872-1882, 2018]; 문헌[Felder M, et al. Gyn Oncol 152:618-628, 2019]).
MUC16/CA125 단백질(여기서는 CA125로 지칭됨)은 SIGLEC 계열의 음성 면역 조절 수용체에 결합하여 NK 세포 활성화를 억제하고(문헌[Belisle JA, et al. Mol Cancer 9:1476-4598, 2010]), IgG1, IgG3 및 IgM 유형 항체의 하위 집합에 직접 결합하여 체액성 면역 반응을 억제한다. 항체에 대한 결합은 Fc 영역을 교란시켜 면역-이펙터 세포에서 IgG1 및 IgG3 유형 항체가 Fc-γ-활성화 수용체 FCGR2A(CD32a로도 지칭됨) 및 FCGR3A(CD16a로도 지칭됨)와 결합하는 것을 덜 효과적으로 만들고/만들거나 C1q를 포함하여 보체-매개 단백질과 결합하는 세 가지 항체 부류 모두의 능력을 교란시킨다(문헌[Pantankar MS, et.al. Gyncol Oncol 99:704-713, 2005]; 문헌[Kline JB, et al. OncoTarget 8:52045-52060, 2017]; 문헌[Kline JB, et al. J. Clin. Oncol. 5:15, 2018]; 문헌[Wang W, et al. Cytogenet Genome Res 152:169-179, 2017]; 문헌[Kline JB, et al. Eur J Immunol. 48:1872-1882, 2018]). 이러한 연구에는 약리학적 활성을 위해 면역 이펙터 메커니즘에 의존하는 실험적 항암 항체의 임상 시험이 포함된다. 이러한 임상 연구에서 CA125 수준은 임상 결과와 상관관계가 있는 것으로 밝혀졌다(문헌[Vergote I, et al. J Clin Oncol 34:2271-2278, 2016]; 문헌[Nicolaides NC, et al. Cancer Biol Ther 13:1-22, 2018]). 여포성 림프종 환자에서 임상적으로 사용된 리툭시맙 항체를 포함하는 연구에서 CA125 수준이 정상 범위보다 높은 경우에 비해 CA125 수치가 정상 범위에 있을 때 5년 무진행 생존율이 31.4% 개선된 것으로 관찰되었다(문헌[Prochazka V, et al. Int J Hematol 96:58-64, 2012]). 면역능숙할 뿐만 아니라 면역억제된 미세환경으로 종양을 효과적으로 사멸시킬 수 있는 제제를 개발하기 위한 당업계의 요구가 계속되고 있다.
메조텔린은 중피종, 폐암, 췌장암, 난소암, 결장직장암, 담관암, 위암 및 자궁내막 암종을 포함하는 다수의 종양 유형에 의해 과발현되는 세포 표면 단백질이다. 이러한 종양 유형 중 일부는 체액성 면역 억제를 갖는 것으로 밝혀졌으며, 이는 잠재적으로 항체 기반 항-메조텔린 요법의 효능을 감소시킨다(문헌[Rump A, et al. J Biol Chem 279:9190-9198, 2004]; 문헌[Hassan R, et al. Cancer Immunol 7:20-30, 2007]; 문헌[Kaneko O, et al. J Biol Chem 284:3739-3749, 2009]; 문헌[Hassan R. Lung Cancer 68:455-459, 2010]; 문헌[Kelly RJ, et al. J Clin Oncol suppl 32:61, 2014]). 특히 폐암, 난소암, 췌장암 및 중피종 암은 체액성 면역억제 CA125 단백질을 발현하는 것으로 보고되었다(문헌[Vergote I, et al. J Clin Oncol 34:2271-2278, 2016]; 문헌[Nicolaides NC, et al. Cancer Biol Ther 13:1-22, 2018]; 문헌[Liu L, Oncotarget. 7:5943-5956, 2016]; 문헌[Cedres S, et.al. Clin Lung Cancer 12:172-179, 2011]; 문헌[Emoto S, et al. Gastric Cancer 15:154-161, 2012]). Nicolaides 등(2018)은 항-메조텔린 항체 아마툭시맙과 표준 치료를 사용한 1차 중피종의 2상 임상 시험 결과에 대한 체액성 면역억제를 보고했다. 그 시험에서 CA125가 상승된 아마툭시맙으로 치료받은 환자는 CA125가 낮은 환자보다 무진행 생존(PFS) 및 전체 생존(OS) 결과가 더 나빴으므로, 체액성 면역 기능에 의존하는 항-메조텔린 항체가 위에 나열된 것과 같은 체액성 면역억제 암에서 더 낮은 임상적 이점을 제공할 것이라는 개념을 뒷받침한다. 이 메커니즘을 잠재적으로 극복하고 체액 억제 암 유무에 관계없이 환자에게 더 넓은 치료 옵션을 제공하려면 새로운 항체 기반 제제를 개발하기 위한 대안적인 전략이 필요하다. 체액성 면역억제 표현형을 나타내는(예를 들어, 면역억제 CA125 단백질 등을 발현함) 메조텔린-발현 종양 유형을 사멸시키는 데 효과적일 뿐만 아니라 면역능숙한 조성물 및 방법이 당업계에 필요하다.
일 실시형태는 항체-약물 접합체(ADC)이다. 이는 SEQ ID NO: 7-12에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하는 항-메조텔린 항체를 포함한다. 이러한 항-메조텔린 항체 중 하나는 SEQ ID NO:1 및 SEQ ID NO:2를 포함한다. ADC는 또한 토포이소머라제 억제제를 포함한다.
또 다른 실시형태는 항체-약물 접합체(ADC)의 일부로서 CA125에 결합하지 않는 항-메조텔린 항체를 사용하는 방법이다. 항-메조텔린 항체는 SEQ ID NO: 7-12에 나타낸 아미노산을 갖는 CDR을 포함한다. 항-메조텔린 항체의 세포 흡수는 가용성 또는 막 결합 형태로 CA125에 결합하는 항-메조텔린 항체의 세포 흡수보다 더 크다. 사용될 수 있는 CA125에 결합하지 않는 이러한 항-메조텔린 항체 중 하나는 SEQ ID NO: 1 및 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열을 포함한다. 방법은 항-메조텔린 요법을 필요로 하는 인간에게 ADC를 투여하는 것을 포함한다. 방법은 또한 표적 세포에서 메조텔린 에피토프를 검출하기 위해 ADC를 사용하는 것을 포함할 수 있다.
또 다른 실시형태는 메조텔린-발현 종양을 갖는 암 환자를 치료하는 방법이다. 환자는 SEQ ID NO: 7-12에 나타낸 아미노산을 갖는 CDR을 포함하는 항-메조텔린 항체 및 토포이소머라제 억제제를 포함하는 항체-약물 접합체(ADC)를 환자에게 투여함으로써 치료된다. 사용될 수 있는 이러한 항-메조텔린 항체 중 하나는 SEQ ID NO:1 및 SEQ ID NO:2를 포함한다.
또 다른 실시형태는 SEQ ID NO: 7-12의 아미노산 서열을 포함하는 메조텔린-결합 부분 및 인간 세포 표면 항원 CD3-결합 부분을 포함하는 이중특이적 항체(BSP)이다.
또 다른 실시형태는 환자에서 메조텔린-발현 암을 치료하는 방법이다. 아미노산 서열 SEQ ID NO: 7-12를 포함하는 메조텔린-결합 부분 및 인간 세포 표면 항원 CD3-결합 부분을 포함하는 이중특이적 항체(BSP)가 환자에게 투여되어 메조텔린-발현 암을 치료한다.
본 발명의 한 양태는 SEQ ID NO: 1[MES 경쇄] 및 SEQ ID NO: 2[MES 중쇄]에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 항체이다. 상당히 적은 양의 항체가 면역억제 CA125 단백질에 의해 결합되기 때문에 항체는 향상된 내재화를 즐긴다. 이는 항체가 항체-약물 접합체의 일부일 때 ADC 매개 종양 세포 사멸에 특히 유용하다.
본 발명의 또 다른 양태는 SEQ ID NO: 1[MES 경쇄] 및 SEQ ID NO: 2[MES 중쇄]에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 항체이며, 항체는 면역억제된 메조텔린-발현 암 세포뿐만 아니라 면역적격(immunocompetent) 세포를 사멸하는 능력에 대해 선택된 세포독성 화합물에 접합된다. 세포독성 화합물은 토포이소머라제 억제제, 미세소관 억제제, 알킬화제 또는 키나제 억제제일 수 있다. 접합체는 "MES-ADC"로 지칭된다.
본 발명의 또 다른 양태는 세포주에 의해 생성되고 선택적으로 이후에 세포독성제에 화학적으로 연결된 부모 MES-1 항체를 코딩하는 SEQ ID NO: 19[MES 경쇄] 및 SEQ ID NO: 5[MES 중쇄]에 나타낸 뉴클레오티드 서열을 갖는 포유동물 발현 벡터를 함유하는 안정한 세포주이다.
본 발명의 또 다른 양태는 건강한 인간 집단과 비교하여 상승된 수준의 CA125를 또한 발현하는 메조텔린-발현 암 세포를 갖는 환자를 치료하는 방법이다. MES-ADC 항체가 환자에게 투여된다. MES-ADC 항체는 아미노산 서열 SEQ ID NO:1 및 SEQ ID NO: 2로 구성되고 세포독성 토포이소머라제 억제제 SN38에 결합된다. 항체-세포독소는 선택적으로 절단가능한 링커에 의해 공유 결합된다.
본 발명의 또 다른 양태는 건강한 인간 집단과 비교하여 상승된 수준의 CA125를 또한 발현하는 메조텔린-발현 암 세포를 갖는 환자를 치료하는 방법이다. MES-ADC 항체가 환자에게 투여된다. MES-ADC 항체는 아미노산 서열 SEQ ID NO:1 및 SEQ ID NO: 2로 구성되고 세포독성 토포이소머라제 억제제 PNU159682에 결합된다. 항체-세포독소는 절단 가능한 링커에 의해 공유 결합될 수 있다.
일 양태에서, MES-ADC는 세포독성 PNU159682 또는 SN38 토포이소머라제 억제제에 연결된 SEQ ID NO: 1 및 SEQ ID NO: 2로 구성된 항체를 포함한다. 부분 환원에 의해 생성된 상기 항체 상의 유리 시스테인에 대한 연결을 통한 화학적 결찰을 통해 2개 이상의 세포독소가 항체에 결합될 수 있다. 시스테인은 면역글로불린 서열에 고유하거나 부모 항체 서열 내로 조작될 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에서, MES-ADC 화학적 결찰은 Val-Cit-PAB, MA-PEG4-VC-PAB-DMAE, Fmoc-Val-Cit-PAB, Fmoc-Val-Cit-PAB-PNP, MC-Val-Cit-PAB-PNP, Phe-Lys(Trt)-PAB, Fmoc-Phe-Lys(Trt)-PAB, Fmoc-Phe-Lys(Trt)-PAB-PNP, Ala-Ala-Asn-PAB TFA 염, Fmoc-Ala-Ala-Asn-PAB-PNP, Fmoc-Gly3-Val-Cit-PAB, Fmoc-Gly3-Val-Cit-PAB-PNP, Py-ds-Prp-OSu, Py-ds-dmBut-OSu, Py-ds-dmBut-OPFP, Py-ds-Prp-OPFP, PEG8-트리아졸-PABC-펩티드-mc 등(그 화학 구조는 당업계에 알려져 있음)과 같으나 이에 제한되지는 않는 절단 가능한 링커를 이용한다.
본 발명의 또 다른 양태에서, MES-ADC 화학적 결찰은 SMCC, MAL-HA-OSu, MAL-디-EG-OPFP, MAL-트리-EG-OPFP, MAL-테트라-EG-OPFP, N3-디-EG-OPFP, N3-트리-EG-OPFP, N3-테트라-EG-OPFP, ALD-BZ-OSu, ALD-디-EG-OSu, ALD-테트라-EG-OSu, ALD-디-EG-OPFP, ALD-테트라-EG-OPFP, MC-EDA, PHA-디-EG-OPFP, PHA-테트라-EG-OPFP 등(그 화학 구조는 당업계에 알려져 있음)과 같으나 이에 제한되지는 않는 비효소 절단 가능한 링커를 이용한다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 링커는 (a) 세포독소에 대한 항체 접합; (b) 전신 순환, 기관 실질/기질 및 종양 미세환경에서의 안정성; 및/또는 (c) MES-ADC에 의한 면역억제 종양의 개선된 사멸에 대해 최적화된다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 세포독소는 항-메조텔린 항체의 경쇄 및 중쇄와 함께 함유된 하나 이상의 라이신 잔기에 연결된다. 이러한 항체 중 하나는 SEQ ID NO: 1 및/또는 SEQ ID NO: 2에 나타낸 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 세포독소는 트랜스-아미드화를 통해 SEQ ID: 2에 함유된 중쇄의 C-말단에 연결된다.
본 발명의 또 다른 양태는 SEQ ID NO: 3 및 SEQ ID NO: 2에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 이중특이적 항체, 즉 각각 MES-1 경쇄 및 MES-1 중쇄에 융합된 단일 사슬 항-CD3이다. 이중특이적 항체는 면역적격 세포뿐만 아니라 면역억제된 메조텔린-발현 암 세포를 사멸시킬 수 있다. 단일 사슬 항-CD3 항체는 CD3+ 및/또는 CD8+ 림프구 상에서 발현되는 세포 표면 항원을 인식한다. 이중특이적 항체는 본원에서 MES-BSP, 즉 메조텔린을 표적으로 하는 이중특이적 항체로 지칭된다.
본 발명의 또 다른 양태는 항체가 CA125 면역억제 단백질에 의해 결합되지 않는 메조텔린을 표적으로 하는 이중특이적 항체이다. 이러한 항체 중 하나는 SEQ ID NO: 3 및 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열을 포함한다. 이중특이적 항체는 메조텔린-발현 암 또는 메조텔린 발현과 관련된 다른 질환을 치료하기 위해 사용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태는 제2 항체에 유전적으로 연결된 SEQ ID NO: 19[MES 경쇄 cDNA] 및 SEQ ID NO: 5[MES 중쇄 cDNA]에 나타낸 항체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 하나 이상의 포유동물 발현 벡터를 함유하는 안정한 세포주이다.
본 발명의 또 다른 양태는 건강한 인간 집단과 비교하여 상승된 수준의 CA125를 또한 발현하는 메조텔린-발현 암 세포를 갖는 환자를 치료하는 방법이다. MES-BSP 항체가 환자에게 투여된다. MES-BSP 항체는 SEQ ID NO: 3 및 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열로 구성되며; 이중특이적 항체는 인간 CD3 단백질뿐만 아니라 메조텔린을 인식한다.
본 발명의 또 다른 양태는 건강한 인간 집단과 비교하여 상승된 수준의 CA125를 또한 발현하는 메조텔린-발현 암 세포를 갖는 환자를 치료하는 방법이다. MES-BSP 항체가 환자에게 투여된다. MES-BSP 항체는 아미노산 서열 SEQ ID NO:1 및 SEQ ID NO:2 및 인간 CD8 단백질을 인식할 수 있는 항체를 포함한다.
본 발명의 또 다른 양태에서, SEQ ID NO:1의 아미노산 서열 및 SEQ ID NO:2의 아미노산 서열을 포함하는 항체가 SEQ ID NO:6의 아미노산 서열을 포함하는 단일 사슬 항체에 융합되고, 이는 인간 IgG1 경쇄의 N-말단(SEQ ID NO: 1) 및/또는 IgG 중쇄의 N 말단(SEQ ID: 2)에 융합되어, 메조텔린(Entrez Gene ID: 10232) 및 CD3 입실론(CD3E) 단백질(Entrez Gene ID: 916)에 결합할 수 있는 이중특이적 항체를 야기하며, 여기서 MES-BSP로 지칭된다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 링커를 통해 연결된 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열과 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열의 융합은 SEQ ID NO: 3으로 이루어진 경쇄 융합 폴리펩티드를 생성하며 이는 SEQ ID NO: 2와 조합되어 (a) CA125의 존재 또는 부재 하에 표적 암 세포 상의 메조텔린 및 (b) 림프계 세포 상의 CD3E에 결합하여 표적 세포를 사멸시킬 수 있는 기능성 MES-BSP를 생성한다. 링커는 아미노산, 폴리펩티드 또는 비생물학적 화합물일 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태는 SEQ ID NO: 7, 8, 9; SEQ ID NO: 10, 11, 12; SEQ ID NO: 13, 14, 15; 및 SEQ ID NO: 16, 17, 18의 아미노산 서열을 갖는 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하는 MES-BSP이다(최대 3개의 아미노산이 하나 이상의 CDR 내에서 변경될 수 있음).
본 발명의 또 다른 양태에서, SEQ ID NO: 3의 링커는 (a) IgG1 중쇄(SEQ ID NO: 2)를 갖는 표준 항체 형성 및/또는 (b) MES-BSP에 의한 면역억제 종양의 개선된 사멸에 대해 최적화되어, 링커는 항-메조텔린 경쇄(SEQ ID NO: 1) 및 항-CD3E 단일 사슬(SEQ ID NO: 6)의 공간적 거리를 최대화하기 위해 20개의 자연 발생 아미노산 단위의 임의의 조합을 포함한다.
본 발명의 또 다른 양태에서, MES-BSP는 SEQ ID: 2의 중쇄의 N-말단에 유전적으로 연결된 항-CD3E 단일 사슬을 포함한다. 링커는 (a) IgG1 경쇄(SEQ ID NO: 1)를 갖는 표준 항체 형성 및/또는 (b) MES-BSP에 의한 면역억제 종양의 개선된 사멸에 대해 최적화되어, 링커는 항-메조텔린 중쇄(SEQ ID NO: 2) 및 항-CD3E 단일 사슬(SEQ ID NO: 6)의 공간적 거리를 최대화하기 위해 20개의 자연 발생 아미노산 단위의 임의의 조합을 포함한다.
본 발명의 또 다른 양태는 제2 항체에 유전적으로 연결된 MES-1 항체를 코딩하는 SEQ ID NO:5 및 SEQ ID NO:4에 나타낸 뉴클레오티드 서열을 갖는 포유동물 발현 벡터를 함유하는 안정한 세포주이다.
본 발명의 또 다른 양태는 토끼 IgG 백본(여기서 rMES-1로 지칭됨)에 이식된 SEQ ID NO: 7-12의 CDR 아미노산 서열을 갖는 항체이다. 항체는 CA125 단백질에 의해 결합되지 않는다.
본 발명의 또 다른 양태는 CA125에 의해 결합되지 않는 항체를 사용하는 환자에서 메조텔린을 발현하는 종양을 모니터링하는 방법이다. 환자의 체액 또는 조직 샘플을 항체 rMES-1과 같은 SEQ ID NO: 7-12의 CDR을 함유하는 항체와 접촉시킨다. 메조텔린에 대해 양성인 환자는 MES-ADC 또는 MES-BSP로 치료될 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 면역능숙 및 면역억제 메조텔린 암을 치료하기 위한 키트가 제공된다. 키트는 바람직하게는 설치류 IgG 백본에 이식된 SEQ ID NO: 7-12의 CDR을 함유하는 항체를 포함한다. 항체는 생검된 조직에 대한 면역조직화학(IHC) 또는 순환 종양 세포(CTC)에 대한 유세포 분석을 통해 메조텔린 발현에 대해 종양을 모니터링하는 데 사용될 수 있다. 양성 신호가 감지되면 환자는 세포독소에 화학적으로 연결된 SEQ ID NO: 1 및 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열을 포함하는 MES-ADC로 치료될 수 있으며, 세포독소는 토포이소머라제 억제제일 수 있다. 진단용 항체와 치료용 항체가 모두 키트에 제공될 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 면역능숙 및 면역억제 메조텔린 암을 치료하기 위한 키트가 제공된다. 키트는 우선적으로 설치류 IgG 백본에 이식된 SEQ ID NO: 7-12에 따른 CDR을 함유하는 항체를 포함한다. 항체는 생검 조직에서 IHC를 통해 또는 순환 종양 세포(CTC)에서 유세포 분석을 통해 메조텔린 발현에 대해 종양을 모니터링하는 데 사용될 수 있다. 양성 신호가 감지되면 환자는 SEQ ID NO: 2 및 SEQ ID NO: 3으로 이루어진 MES-BSP로 치료될 수 있다. 진단용 항체와 치료용 항체가 모두 키트에 제공된다.
본 발명의 또 다른 양태는 MES-ADC가 단일 제제로서 또는 서브세트가 CA125를 발현하는 환자에게 표준 치료 화학요법과 조합으로 투여되는 MES-ADC의 용도이다. CA125 발현은 당업계에 알려진 방법을 통해 혈청 분석 또는 생검을 사용하여 결정될 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태는 MES-BSP를 단일 제제로서 또는 표준 치료 화학요법과 조합으로 서브세트가 CA125를 발현하는 환자에게 투여하는 MES-BSP의 용도이다. CA125 발현은 당업계에 알려진 방법을 통한 혈청 분석 또는 생검을 사용하여 결정된다.
본 명세서를 읽을 때 당업자에게 명백할 본 발명의 이러한 양태 및 다른 양태는 종양 미세환경의 면역 상태에 관계없이 메조텔린-발현 암 환자의 치료 반응을 개선하는 데 사용하기 위한 방법, 조성물 및 키트를 제공한다. CA125 억제와 관련된 MES-ADC 및/또는 MES-BSP 제제의 불응성 특성은 이러한 치료 개선에 기여한다.
도 1a. 면역억제 CA125 단백질에 의해 결합되지 않은 항-메조텔린 항체에 대한 스크리닝; MES-1 항체(SEQ ID NO: 1 및 2)의 식별. 간단히 말해서, 96-웰 ELISA 플레이트를 15 KU/mL의 가용성 CA125, 양성 대조군으로서 1 ㎍/mL의 재조합 인간 메조텔린 단백질 및 음성 대조군으로서 1 ㎍/mL의 인간 혈청 알부민(HSA)으로 코팅하고 CA125에 의해 결합되는지 결정하기 위해 2.5 ㎍/mL의 다양한 항-메조텔린 항체로 조사하였다. 웰을 세척하고 2차 항-인간 또는 항-설치류 Fc-홀스래디시 퍼옥시다제(HRP) 접합 항체 및 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘(TMB) 기질을 통한 결합에 대해 검출했다. 반응을 0.1 N H2SO4로 중단하고 450 nm에서 다중 웰 플레이트 판독기(Varioskan™, ThermoFisher)를 사용하여 웰을 정량화했다. 나타낸 바와 같이, SEQ ID NO: 1 및 2[Ab-3(레인 3)]로 이루어진 항체 MES-1은 CA125에 의해 결합되지 않은 반면, 시험된 다른 4개의 항-메조텔린 항체는 모두 CA125에 의해 결합되었다. 3중 웰의 평균으로부터 값을 결정하였다. 스튜던트 T-검정을 사용하여 통계 분석을 수행했다. 도 1b. 이들 결과는 CA125에 의해 결합된 항-메조텔린 항체(도 1a Ab-4 참조)와 대조적으로 CA125에 의해 결합되지 않은 항-메조텔린 항체(도 1a Ab-3 참조)의 향상된 흡수를 입증한다. 항체 내재화를 측정하기 위해, pHrodo™ 형광 분석법(ThermoFisher)을 사용하여 pH 민감성 형광 염료를 CA125 불응성 Ab-3(여기서 MES-1으로도 지칭됨) 및 CA125 민감성 Ab-4 항체에 접합했다. 메조텔린 및 막 결합된 CA125를 발현하는 인간 난소암 세포주 OVCAR3과 각각을 인큐베이팅함으로써 흡수에 대해 항체를 시험하였다. 부모 계통을 사용하여 shRNA(OVCAR3-KO로 지칭됨)를 통해 동질유전자 CA125 녹다운 계통을 생성했다. Ab-3 및 Ab-4 흡수는 Varioskan™ 플레이트 판독기에서 세포내 형광을 측정하는 24시간 과정에 걸쳐 검은색 96-웰 마이크로플레이트에서 복제로 측정되었다. 도시된 바와 같이, Ab-3(MES-1)은 두 세포주에서 유사한 흡수를 보인 반면 Ab-4는 OVCAR-KO 세포에서 Ab-3과 유사한 흡수를 가졌으나 CA125를 발현하는 부모 OVCAR3는 그렇지 않았으며, 이는 CA125 불응성 Ab-3과 대조적으로 CA125를 통한 Ab-4 흡수의 부정적인 영향을 입증한다. 통계 분석은 양측 스튜던트 T-검정을 사용하여 수행되었다.
도 2a 내지 도 2c. 세포독성 페이로드 및 링커는 면역능숙하고 면역억제된 메조텔린 발현 암 세포의 최적 사멸을 위한 재형식화된(reformatted) MES-1 항체를 개발하기 위해 조사되었다. 도 2a는 면역억제 및 면역능숙 메조텔린 발현 표적 세포에 대해 시험된 다양한 유형의 세포독성 페이로드(즉, 미세소관 억제제, DNA 알킬화제, 토포이소머라제 억제제, 및 단백질 키나제 억제제, 예를 들어, 문헌[Yaghoubi S, et al. J Cell Physiol 235:31-64, 2019; Wang RE, et al. J Am Chem Soc 137:3229-3232, 2015] 참조)의 화학 구조를 제공한다. 도 2b는 면역억제 및 면역능숙 메조텔린 발현 표적 세포에 대한 MES-ADC를 생성하기 위해 시험된 다양한 효소 및 비-효소 절단 가능 및 절단 불가능 링커의 화학 구조를 제공한다. 도 2c는 메조텔린 발현 암 세포 또는 대조군 세포주에 대한 잠재적인 ADC 페이로드의 세포독성의 개요를 제공한다(표 1). 간단히 말해서, 96-웰 조직 배양 플레이트에 100 μL의 RPMI + 7.5% 열 불활성화 우태아 혈청(FBS) 중 5,000 세포/웰의 메조텔린-양성 NCI-N87(CA125+ 위암), SW1990(CA125+ 췌장암), HAY(CA125+ 중피종), YOU(CA125- 중피종), OVCAR3(CA125+ 난소암) 및 A549 (메조텔린 음성 폐암) 세포, 및 0.0001 내지 500 ng/mL의 세포독소 또는 음성 대조군을 시딩하였다. 배양물을 5% CO2에서 37℃에서 72시간 동안 인큐베이팅한 다음 크리스탈 바이올렛 염색을 사용하여 생존율을 정량화했다. 건조된 염색된 웰은 인산염 완충 식염수(PBS)에서 1% SDS를 사용하여 용해되었고 570 nm에서 Varioskan™ 멀티웰 플레이트 판독기의 비색 밀도계로 정량화되었다. 시험된 몇몇 세포독소는 CA125 발현 뿐만 아니라 비-메조텔린 발현 대조군 세포 A549 및 CHO(나타내지 않음)와 관계없이 메조텔린 표적 세포를 유의하게 사멸시킬 수 있었다. 제시된 바와 같이, 미세소관 억제제 MMAE 뿐만 아니라 토포이소머라제 억제제 SN38 및 PNU159682는 0.008 내지 5 ng/mL 범위의 EC50으로 최고의 효능을 갖는 것으로 밝혀졌다. 실험은 최소 삼중 웰을 나타낸다. 통계 분석은 양측 스튜던트 T-검정을 사용하여 수행되었다.
도 3a 내지 도 3c. MES-1 및 MES-ADC 조성물, 정제 및 구조 분석. 도 3a, 생산된 CHO-GS 및 단백질 A 정제된 MES-1 항체의 분석. 정제된 MES-1의 크기 배제(SEC) HPLC 분석은 원하는 약물:항체 비(DAR)로 균질한 항체 약물 접합체를 생산하기 위한 전제 조건인 고도로 균질한 항체 종을 입증한다. 도 3b는 절단 가능한 링커를 사용하는 SN38-MES-ADC 및 PNU-MES-ADC 조성물의 개략도를 제공한다. 도 3c, 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC-HPLC) 및 크기 배제 크로마토그래피(SEC-HPLC)에 의해 결정된 SN38-MES-ADC 및 PNU-MES-ADC DAR 균질성. 두 MES-ADC는 MES-1과 시스테인 결찰의 부분적 감소를 통해 생성되었다. DAR은 HIC 피크 면적과 머무름 시간으로부터 계산되었다. 도시된 바와 같이, SN38-MES-ADC 및 PNU-MES-ADC는 원하는 DAR이 2-6인 이들 ADC를 모두 생성하기 위한 재현성의 대표적인 프로파일을 제공한다.
도 4a 내지 도 4e. MES-ADC 접합체 형식 및 시험관내 및 생체내에서 표적 세포 사멸. 도 4a, 도 2c의 유리-세포독소 독성 검정으로부터 관찰된 2개의 가장 강력한 세포독소, SN38 및 PNU159682를 함유하는 MES-ADC를 통한 표적 세포 사멸. MES-ADC는 절단 가능한 링커를 사용하여 생성되었으며 표 1에 나열된 다양한 표적 및 대조군 세포주의 사멸에 대해 시험되었다. 검정은 도 2c에 설명된 대로 수행되었다. 간단히 말해서, 96-웰 조직 배양 플레이트에 5,000개 세포/웰의 메조텔린-양성 NCI-N87, SW1990, HAY, YOU, OVCAR3, CHO-MES 뿐만 아니라 음성 대조군으로서 메조텔린 음성 A549 및 CHO 세포를 시딩하였다. 세포는 제한 희석(0.01 내지 100 ng/mL 범위) 또는 음성 대조군 화합물을 통해 다양한 MES-ADC 농도로 100 μL의 RPMI + 7.5% 열 불활성화 우태아 혈청(FBS)에 플레이팅되었다. 배양물을 37℃에서 5% CO2에서 72시간 동안 인큐베이팅한 다음 크리스탈 바이올렛 염색을 통해 생존 세포를 정량화했다. 건조된 염색된 웰은 PBS에서 1% SDS를 사용하여 용해되었고 570 nm에서 Varioskan™ 멀티웰 플레이트 판독기의 비색 밀도계로 정량화되었다. 도시된 바와 같이, SN38-MES-ADC 및 PNU-MES-ADC는 CA125 발현 상태에 관계없이 메조텔린을 발현하는 모든 표적 세포에 걸쳐 가장 유의한 세포 사멸을 보인 반면, 메조텔린-음성 계통 A549 또는 CHO(나타내지 않음)는 영향을 받지 않았는데, 이는 메조텔린-발현 세포에 대한 두 ADC의 선택성 및 효능을 입증한다. 다음으로 다른 링커 형식으로 리드 MES-ADC를 시험했다(도 4b). NCI-N87 및 SW1990 세포를 표적 세포로 사용하였고 PNU-MES-ADC를 대표적인 MES-ADC로 사용하여 효소 절단 가능 또는 비효소 절단 가능 링커 형식의 역가 분석을 수행했다. 제한 희석을 통해 각 PNU-MES-ADC의 다양한 농도로 위에 기재된 대로 세포를 플레이팅하고 성장시켰다. 도시된 바와 같이, 효소 분해 가능 형식의 PNU-MES-ADC는 비효소 분해 가능 형식의 PNU-MES-ADC보다 훨씬 더 강력했다(회색 및 파란색 선). A549 메조텔린 음성 세포는 어느 ADC에 의해서도 영향을 받지 않았으며(나타내지 않음), MES-ADC 효능 및 표적 특이성을 다시 입증하였다. 도 4c: NCI-N87, SW1990 종양 세포주 및 PDX 유래 종양 패널은 rMES-1 검출기 항체 및 CA125 상업용 항체를 사용하여 IHC를 통해 메조텔린 발현에 대해 스크리닝하여 이 두 가지 주요 단백질의 발현 프로파일이 생체내에서 유지되도록 했다. 이종이식에서 종양 단편으로 제거된 NCI-N87 및 SW1990 세포주 모두 두 단백질의 발현을 유지했다. 여러 샘플을 스크리닝한 후, 2개의 PDX 종양 단편이 유사한 수준의 메조텔린 발현을 갖는 것으로 확인되었으며, 이에 의해 하나는 강력한 수준의 CA125(중피종 # PXF1118)를 발현하는 반면, 다른 하나는 검출할 수 없는 발현(비소세포 폐 선암(NSCLC) # LXFA983)을 나타냈다. 도 4d: 생체내 SN38-MES-ADC 및 PNU-MES-ADC의 시험. 먼저, SW1990 세포의 경우 다중 무흉선 누드 마우스 또는 N87 세포의 경우 SCID 마우스의 옆구리에 1 × 107 종양 세포를 주사하였다. 측정 가능한 종양 병변(>100 ㎣)이 확립되면 마우스를 그룹화하고 절단 가능 및 절단 불가능 PNU-MES-ADC 형식, SN38-MES-ADC 및 PBS를 음성 대조군으로 사용하여 종양 사멸에 대해 시험했다. 도시된 바와 같이, 절단 가능한 SN38-MES-ADC 및 PNU-MES-ADC 형식은 모두 비효소적 절단 가능 형식(나타내지 않음)보다 생체내에서 훨씬 더 효과적인 것으로 밝혀졌으며(상단 패널: 10 mg/㎏에서 SN38-MES-ADC P < 0.049 및 20 mg/㎏에서 P < 0.0003; 하단 패널: PNU-MES-ADC P < 0.011), 이는 시험관내 표적 세포 사멸 효과를 반영한다. 도 4e: 절단 가능한 PNU-MES-ADC를 면역능숙 LXFA983(CA125 낮음) 및 면역억제 PXF1118(CA125 높음) PDX 유래 종양 이종이식편에 대해 시험하여 이러한 독특한 종양 유형에 대한 효능을 결정했다. 종양 단편을 무흉선 누드 마우스의 옆구리에 이식하고 PNU-MES-ADC 또는 PBS 대조군으로 처리하였다. 도시된 바와 같이, PNU-MES-ADC는 미세환경 면역(CA125 발현) 상태와 관계없이 두 종양 모두를 사멸시키고 퇴행시키는 데 동등하게 효과적이었다(P < 0.012). 실험은 시험관내 검정의 경우 최소 3개의 웰과 생체내 검정의 경우 최소 5명의 대상체를 나타낸다. 통계 분석은 양측 스튜던트 T-검정을 사용하여 수행되었다.
도 5. CA125 양성, 메조텔린-발현 PXF1118 종양에 대한 절단 가능한 PNU-MES-ADC의 단일 및 다중 투여 및 항-종양 효과. 종양 단편을 무흉선 누드 마우스의 옆구리에 이식하고 평균 크기 100 ㎣로 성장시켰다. 유사한 종양 크기 세트를 가진 마우스를 각각 6마리 마우스 4세트로 그룹화하고 랜덤화 후 1일차, 8일차 및 15일차에 PBS, 0.25 mg/㎏ PNU-MES-ADC 또는 30 ㎍/㎏의 유리 PNU159682로 처리했다. 0.75 mg/㎏ PNU-MES-ADC를 사용하는 네 번째 아암은 랜덤화 후 1일차에 단일 용량을 제공받았고 마우스는 50일 넘게 종양 성장에 대해 모니터링되었다. 도시된 바와 같이, 단일 용량 PNU-MES-ADC는 PBS 또는 유리 약물로 처리된 마우스와 대조적으로 다중 용량 PNU-MES-ADC 처리된 마우스와 유사하게 종양의 사멸 및 퇴행 유발에 동등하게 효과적이었고 50일 넘게 지속적인 반응을 유지했다(P ≤ 0.0061). 실험은 그룹당 6명의 대상체를 나타낸다. 통계 분석은 양측 스튜던트 T-검정을 사용하여 수행되었다.
도 6a 및 도 6b. MES-BSP의 ADCC 활성 및 면역억제된 암세포에 대한 대조군 항체. 면역억제된 암 세포의 MES-BSP 면역 매개 표적화의 효과를 시험하기 위해, 1차 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 사용하는 ADCC 검정 및 Jurkat-CD16a ADCC 리포터 검정을 사용했다. 도 6a, MES-BSP, MES-1 및 항-메조텔린 메조-Ab-4(도 1a, 레인 4 참조) 항체는 인간 OVCAR3 난소암 세포주의 PBMC 면역-매개 사멸에 대해 시험되었고, 이는 메조텔린을 발현하고 많은 양의 면역억제 CA125 단백질을 생성한다. 간단히 말해서, 10,000개의 OVCAR3 세포를 96-웰 블랙 플레이트에 65 μL RPMI + 7.5% 우태아 혈청 및 1% L-글루타민(R7.5)에서 밤새 플레이팅했다. 다음날, 35 μL의 다양한 농도의 MES-BSP, MES-1 및 메조-Ab-4 + R7.5 배지의 2.5 × 107 PBMC를 각 웰에 첨가하고 플레이트를 37℃에서 5% CO2에서 72시간 동안 인큐베이팅했다. 그런 다음 웰을 250 μL R7.5 배지로 3회 세척하여 PBMC를 제거하고 부착된 OVCAR3 표적 세포 생존력을 제조업체의 지침(Promega)에 따라 Cell Titer GLO®를 통해 Varioskan™ 발광 플레이트 판독기에서 정량화했다. 도시된 바와 같이, MES-1 및 MES-BSP 항체 모두 메조-Ab-4와 대조적으로 종양 세포 사멸을 나타냈지만, MES-BSP는 표적 세포 사멸이 상당히 높았으며, 따라서 면역 매개 표적화를 사용할 때 BSP 형식의 MES-1이 부모 MES-1 단독보다 향상된 사멸을 제공하는 능력을 입증했다. 면역억제 CA125 단백질이 ADCC 활성에 미치는 영향을 결정하기 위해, MES-1 및 메조-Ab-4 항체를 이전에 설명한 대로(문헌[Kline JB, et.al. OncoTarget 8:52045-52060, 2017]) shRNA 벡터 TRCN0000262686(Sigma-Aldrich)을 사용하여 생성된 OVCAR3 세포 및 OVCAR3-CA125 녹다운(OVCAR-KO) 세포주와 제조업체의 지침(Promega Corp)에 따라 Jurkat-CD16a ADCC 리포터 세포주에 대해 시험했다. Jurkat ADCC 시스템은 루시퍼라제 판독값을 사용하며, 루시퍼라제 신호 강도는 표적 세포에 대한 항체의 ADCC 활성을 나타낸다. 도 6b에 나타낸 바와 같이, MES-1은 메조-Ab-4보다 OVCAR3에 대해 상당히 높은 ADCC 활성을 나타냈지만, MES-1 및 메조-Ab-4 둘 모두 OVCAR-KO 세포주에 대해 유사한 ADCC 활성을 가졌고, 따라서 면역억제 종양 세포를 효과적으로 사멸시킬 수 있는 제제로서 대안적 형식 MES-1(즉, ADC 또는 BSP)의 천연 CA125 불응성 MES-1 부모 항체의 유용성을 입증한다. MES-BSP는 OVCAR3 및 OVCAR-KO 계통 모두에 대해 동등하게 효과적이었다. 모든 실험은 세 번 수행되었다. 통계 분석은 양측 스튜던트 T-검정을 사용하여 수행되었다.
도 7. MES-BSP는 인간화 PBMC 누드 마우스 및 메조텔린 양성 CA125 발현 인간 중피종 세포주를 사용하여 생체내에서 시험되었다. 무흉선 누드 마우스에 0일차에 8 × 106 중피종 세포를 이식했다. 평균 병변이 ~50 ㎣인 11일차에, 1 × 107 인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 복강내로 투여했다. 다음날, 3 mg/㎏의 MES-BSP 또는 PBS를 3주 동안 3 × QOD로 투여하고 종양의 성장을 모니터링했다(N = 5). 도시된 바와 같이, MES-BSP는 대조군 처리된 마우스와 비교하여 CA125-양성 중피종 종양의 70% 감소를 야기하였다(P = 0.033). 통계 분석은 양측 스튜던트 T-검정을 사용하여 수행되었다.
본 발명자들은 종양 세포 미세환경 면역 상태와 관계없이 메조텔린-양성 암 세포를 효과적으로 사멸시킬 수 있는 새로운 치료제를 개발하였다. 특정 이론이나 행동 메커니즘에 제한되지 않고, 출원인은 SEQ ID NO: 1 및 2(여기서 MES-1 항체라고 함) 및 SEQ ID NO: 2 및 3(MES-BSP 항체라고 함)에 의해 코딩된 아미노산 서열이 (a) 항체 매개 면역 반응(문헌[Kline JB, et.al. OncoTarget 8:52045-52060, 2017]; 문헌[Kline JB, et al. Eur J Immunol 48:1872-1882, 2018]; 문헌[Kline JB, et al. J Clin Oncol 5:15, 2018]; 문헌[Nicolaides NC, et al. Cancer Biol Ther 13:1-22, 2018]) 및 (b) 항체 약물 접합체 (ADC) 흡수 및 세포독성제의 내부 전달(이는 ADC를 통한 강력한 표적 세포 사멸의 전제 조건임)(미국 특허 출원 제16/984,444호(Nicolaides NC, et. al.); 문헌[Chalouni C and Doll S. J Exp Clin Cancer Res 37:20-32, 2018])에 부정적인 영향을 미치는 면역억제 CA125 단백질에 의한 결합에 대해 불응성이라고 생각한다. 이 면역억제 메커니즘은 영향을 받은 항체에 대한 CA125의 직접적인 결합을 포함하는 것으로 보인다(문헌[Nicolaides NC, et al. Cancer Biol Ther 13:1-22, 2018]).
또한, 본 출원은 미세 환경 면역 상태에 관계없이 종양에 효과적인 추가 항체 기반 요법을 식별하는 방법을 제공한다. 여기에는 CA125와 같은 종양 생성 면역억제 단백질에 대한 결합에 대한 부모항체의 시험이 포함된다. 이러한 항체는 항체-약물 접합체 또는 이중특이적 형식으로 형식화될 수 있으며 유전 융합 및 화학적 링커뿐만 아니라 다양한 페이로드를 사용하여 면역억제된 미세 환경에서 종양을 사멸시키는 효과를 최적화하기 위해 경험적으로 시험될 수 있다.
여기에 설명된 방법 및 키트는 당업계에 알려진 항원 발현 시험에 대한 방법을 사용하여 CDR 아미노산 서열 SEQ ID NO: 7-12를 함유하는 항체로 환자 종양 세포를 시험함으로써 MES-ADC 또는 MES-BSP로 치료하기에 적합한 메조텔린을 발현하는 환자의 적합성을 모니터링하고 확인하는 데 사용될 수 있다.
방법, 조성물 및 키트는 항체 형식화의 2가지 범주로 나누어질 수 있다. 한 범주에서, 세포독성제에 화학적으로 연결된 면역글로불린 경쇄(SEQ ID NO: 1) 및 중쇄(SEQ ID NO: 2)를 포함하는 MES-ADC가 개발된다. 항체 성분에 대한 CA125의 직접 결합은 낮거나 없다. 항체 분자당 세포독소 모이어티의 수[약물: 항체 비(DAR)로 지칭됨]는 접합 방법에 따라 달라질 수 있으며, 최소 DAR은 2이고 최대 DAR은 12이며, 2, 3, 4, 5 또는 6이 바람직하다. 세포독성제는 토포이소머라제 억제제 SN38 또는 PNU159682일 수 있지만 이에 제한되지 않는다. 세포독소 모이어티는 화학적 또는 펩티드 링커에 의해 항체에 연결된다. 링커는 당업자에게 알려진 바와 같이 절단 가능한 또는 절단 불가능한 유형일 수 있다. 링커, 세포독소 및 DAR의 원하는 조합은 시험관내 및/또는 생체내에서 메조텔린 종양 세포 사멸에 대한 MES-ADC의 활성을 최적화하기 위해 경험적으로 결정될 수 있다. 종양 세포 생존력은 당업계에서 사용되는 방법을 사용하여 결정될 수 있다.
적합한 세포독소는 안전하고 바람직하게는 생분해성인 것을 제한 없이 포함한다. 이들은 하기를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다: 모노메틸 돌라스타틴 10, 오리스타틴 E, 모노메틸 오리스타틴 E(MMAE), 오리스타틴 F, 모노메틸 오리스타틴 F, HTI-286, 튜불리신 M, 메이탄시노이드 AP-3, 메이탄시놀, DM1, DM4, Boc-Val-Dil-Dap-OH, Boc-Val-Dil-Dap-Phe-Ome, Boc-Val-Dil-Dap-Doe, Boc-Val-Dil-Dap-Nrp, Boc-N-Me-Val-Val-Dil-Dap-OH, 튜불리신 IM-1, 튜불리신 IM-2, 튜불리신 IM-3, 다사티닙, 두오카르마이신 SA, 두오카르마이신 TM, 두오카르마이신 MA, 두오카르마이신 DM, 네모루비신, PNU-159682, 칼리케아미신 γ1, N-Acetyl-칼리케아미신 γ1, α-아마니틴, PBD-이량체 등(그의 구조는 당업계에 알려져 있음).
적합한 링커는 안전하고 바람직하게는 생분해성인 것을 제한 없이 포함한다. 이들은 하기를 포함하나 이에 제한되지는 않는다: Val-Cit-PAB, Fmoc-Val-Cit-PAB, Fmoc-Val-Cit-PAB-PNP, MC-Val-Cit-PAB-PNP, Phe-Lys(Trt)-PAB, Fmoc-Phe-Lys(Trt)-PAB, Fmoc-Phe-Lys(Trt)-PAB-PNP, Ala-Ala-Asn-PAB TFA 염, Fmoc-Ala-Ala-Asn-PAB-PNP, Fmoc-Gly3-Val-Cit-PAB, Fmoc-Gly3-Val-Cit-PAB-PNP, MAC 글루쿠로나이드 페놀, Py-ds-Prp-OSu, Py-ds-dmBut-OSu, Py-ds-dmBut-OPFP, Py-ds-Prp-OPFP, SMCC, MAL-HA-OSu, MAL-디-EG-OPFP, MAL-트리-EG-OPFP, MAL-테트라-EG-OPFP, MA-PEG4-VC-PAB-DMAE, MC-EDA, N3-디-EG-OPFP, N3-트리-EG-OPFP, N3-테트라-EG-OPFP, ALD-BZ-OSu, ALD-디-EG-OSu, ALD-테트라-EG-OSu, ALD-디-EG-OPFP, ALD-테트라-EG-OPFP, PHA-디-EG-OPFP, PHA-테트라-EG-OPFP, PEG8-트리아졸-PABC-펩티드-mc 등(그 화학 구조는 당업계에 알려져 있음).
일 실시형태는 낮은 CA125 결합을 갖고 MA-PEG4-VC-PAB-DMAE 절단 가능한 링커에 의해 PNU159682 토포이소머라제 억제제에 공유 결합된 MES-1 항체(SEQ ID NO: 1 및 2)를 포함하는 MES-ADC이다.
다른 실시형태는 낮은 CA125 결합을 갖고 MAC 글루쿠로나이드 페놀 또는 PEG8-트리아졸-PABC-펩티드-mc 절단 가능한 링커에 의해 SN38 토포이소머라제 억제제에 공유 결합된 MES-1 항체(SEQ ID NO: 1 및 2)를 포함하는 MES-ADC이다.
항체 형식화의 또 다른 범주에서, MES-BSP(이중특이적 항체)는 MES-1 항체의 면역글로불린 중쇄(SEQ ID NO: 2)와 낮은 CA125 결합을 갖는 키메라 경쇄(SEQ ID NO: 3)를 포함한다. 키메라 경쇄는 MES-1 경쇄(SEQ ID NO: 1)에 융합된 항-CD3 단일 사슬 항체(SEQ ID NO: 6)의 유전적 융합(아미노에서 카복실 순서로)이다. 항-CD3 단일 사슬 항체 부분은 20개의 알려진 천연 또는 변형된 아미노산 중 임의의 하나를 포함하는 스페이서를 통해 유전적으로 연결되며, 이에 의해 링커는 당업계에 알려진 바와 같이 단일 사슬로부터 경쇄를 분리하는 2개 이상의 아미노산일 수 있다. 원하는 링커 아미노산 조성 및 길이는 인간 CD3+ 림프구의 존재 하에 시험관내 및/또는 생체내에서 메조텔린 종양 세포 사멸에 대한 MES-BSP의 활성을 최적화하기 위해 실험적으로 결정될 수 있다. 종양 세포 생존력은 당업계에 알려진 임의의 다양한 방법을 사용하여 결정될 수 있다.
치료 적용을 위해, MES-ADC 또는 MES-BSP는 단독 요법으로 또는 표준 치료 요법과 조합으로 투여될 수 있다.
방법을 수행하는 과정에서 조성물이 형성될 수 있다. 이들은 미리 형성되고 개별적으로 패키징될 수 있고 예를 들어 세포독소를 MES-1 항체에 연결하기 위해 다양한 링커를 사용할 수 있거나 스크리닝할 세포독소 라이브러리를 가진 실체에 제공될 수 있다. 유사하게, 본원에 설명된 검정 및 방법의 구성요소는 용기에 함께 패키징되어 키트로 판매될 수 있다. 키트의 구성요소는 반드시 그럴 필요는 없지만 함께 혼합될 수 있다. 이들은 예를 들어 별도의 용기 또는 분할 용기에 제공될 수 있다. 검출기 항체의 임의의 선택 및 본원에 기술된 MES-ADC 또는 MES-BSP는 조성물 또는 키트로 제형화될 수 있다.
CA125 면역억제에 민감한 몇 가지 알려진 항체가 있지만, 본원에 기재된 조성물은 MES-ADC 또는 MES-BSP로 종양 미세환경 면역 상태와 관계없이 메조텔린 발현 암 환자를 치료하는 데 유용하다. 이들 각각은 CA125 결합에 불응성인 하나 이상의 MES-1 부모 서열(SEQ ID NO: 1-3)을 가지며 따라서 MES-ADC 형식일 때 ADC 내재화 및 사멸에 효과적이거나 MES-BSP 형식일 때 면역 관련 사멸에 효과적이다.
일부 경우에, MES-ADC는 메조텔린-발현 암을 갖는 환자에서 치료 윈도우를 향상시키기 위해 리포솜으로 제형화될 필요가 있을 수 있다. MES-ADC의 전달을 위한 임의의 리포솜 제형은 환자를 치료하는 데 사용될 수 있다. 기존의 리포솜은 양이온성, 음이온성 또는 중성(포스포)지질 및 콜레스테롤로 구성된 지질 이중층으로 이루어지며, 이는 수성 부피를 둘러싼다. 리포솜의 적합한 조성물은 코리피드 디올레오일 포스파티딜에탄올아민(DOPE)과 조합된 구아니디늄-콜레스테롤 양이온성 지질 비스(구아니디늄)-트렌-콜레스테롤(BGTC)을 제한 없이 포함한다. 적합한 리포솜 제형의 또 다른 예는 이미다졸-기반 헬퍼 지질 MM27과 관련된 아미노글리코사이드 지질 디올레일 숙시닐 파로모마이신(DOSP)이다. 리포솜은 예를 들어 리포솜을 코팅하기 위해 폴리에틸렌 글리콜을 사용하여 입체적으로 안정화될 수 있다.
메조텔린-양성 암 환자를 식별하고 MES-ADC 또는 MES-BSP로 치료하기 위한 조성물, 키트 및 방법을 제공한다. 방법은 CDR SEQ ID NO: 7-12를 포함하는 CA125 불응성 MES-1 검출기 항체를 사용하여 메조텔린 발현에 대해 환자의 종양을 진단하는 단계를 포함할 수 있다. 이 검정에서 양성인 경우, 종양은 선택적으로 토포이소머라제 억제제인 세포독소에 연결된 MES-ADC(SEQ ID NO: 1 및 2) 또는 MES-BSP(SEQ ID NO: 2 및 3)로 치료될 수 있다. 진단 및 치료 단계는 독립적이거나 함께 수행될 수 있다. 메조텔린이 과도하게 발현되는 암에서 이러한 사전 스크리닝의 사용은 선택적일 수 있다.
또 다른 실시형태는 MES-ADC 함유 CDR(SEQ ID NO: 7-12)이며, 이들 CDR 서열 중 임의의 것은 CA125 불응성을 유지하는 한 개별적으로 또는 조합으로 최대 3개의 아미노산에 의해 변형될 수 있다.
다른 실시형태에서, MES-ADC의 세포독소는 절단 가능한 링커에 연결된 SN38 또는 PNU159682이다. 링커는 SN38에 연결된 PEG8-트리아졸-PABC-펩티드-mc 링커(C50H79N9O16)(전체 구축물은 SN38-MES-ADC-1로 지칭됨), SN38에 연결된 MAC 글루쿠로나이드 페놀-링커(전체 구축물은 SN38-MES-ADC-2로 지칭됨) 또는 PNU159682에 연결된 MA-PEG4-VC-PAB-DMAE 링커(전체 구축물은 PNU-MES-ADC로 지칭됨)일 수 있다.
다른 실시형태에서, MES-1 경쇄(SEQ ID NO: 1)는 아미노산 GGGGS(SEQ ID NO: 20)로 구성된 아미노산 링커 단위를 사용하여 CD3 단일 사슬(SEQ ID NO: 6)에 연결된다. 링커는 하나 이상의 링커 단위로 구성된다. 일 예로서, 길이 또는 아미노산 조성에 제한되는 것은 아니지만, MES-1 경쇄 및 항-CD3 단일 사슬은 1개, 2개, 3개 또는 그 이상의 단위에 연결될 수 있다. 링커 최적화는 본원에 기재된 바와 같이 종양 세포 사멸을 측정하기 위해 당업계에서 사용되는 임의의 방법을 사용하여 CD3+ 림프구의 존재 하에 메조텔린 표적 세포의 최적 사멸에 의해 결정될 수 있다.
또 다른 실시형태에서, 링커 단위는 알려진 천연 또는 변형된 아미노산과 면역능숙 또는 면역억제 미세환경 및 인간 CD3+ 림프구를 갖는 메조텔린 양성 종양에서 종양 세포 사멸을 최적화하기 위해 경험적으로 시험될 수 있는 항-CD3 단일 사슬에 MES-1 경쇄를 유전적으로 연결할 수 있는 임의의 길이의 임의의 조합을 포함한다.
또 다른 실시형태는 SEQ ID NO: 7-18의 아미노산 서열을 함유하는 MES-BSP를 가지며, 이에 의해 이들 서열 중 임의의 것은 CA125 결합에 불응성을 유지하는 한 개별적으로 또는 조합으로 최대 3개의 아미노산에 의해 변형될 수 있다.
일부 실시형태에서, 기능적 방법은 다양한 유전적 링커를 사용하여 CD3+ 림프구의 존재 하에 메조텔린-양성 종양 세포를 사멸시키는 MES-BSP의 효과를 최적화하기 위해 사용된다. "효과"라는 용어는 일반적으로 CD3+ 림프구와 비교하여 제제가 단독으로 인큐베이팅될 때 표적 세포 사멸의 10% 이상의 변화를 지칭한다. 사용된 항체 및 제제에 따라 대조군과 비교하여 적어도 5%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 70%, 또는 75%의 변화를 나타낼 수도 있다.
또 다른 실시형태는 약동학적(PK), 약력학적(PD) 또는 약리학적(PL) 활성(세포 내재화 포함)에 대해 다양한 세포독소 및/또는 링커로 항체 약물 접합체(ADC)를 스크리닝하는 방법을 포함한다. 일부 실시형태에서, ADC는 시험관내에서 세포에 첨가되고 표적 세포 사멸에 대해 시험된다. 유의한 사멸 효과를 갖는 ADC는 치료 시험에 적합하다. 다시, 효과라는 용어는 사용된 항체 및 제제에 따라 대조군과 비교하여 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 70%, 또는 75%의 변화를 의미할 수 있다.
동봉된 설명의 양태와 관련된 다양한 용어 및 술어("용어들")는 본 문서의 명세서 및 청구범위 전반에 걸쳐 사용된다. 이러한 용어는 달리 구체적으로 나타내지 않는 한 당업계에서 통상적인 의미로 부여되어야 한다. 구체적으로 정의된 기타 용어는 제공된 정의와 일치하는 방식으로 해석되어야 한다.
본 명세서 및 첨부된 청구범위에 사용된 바와 같이, 단수 형태는 또한 내용이 달리 명확하게 명시되지 않는 한 복수의 언급도 포함한다. 예를 들어, "세포"에 대한 언급은 2개 이상의 세포의 조합 등을 포함할 수 있다. "프로브"에 대한 언급은 검출기 항체, MES-ADC, MES-BSP 또는 당업계에 알려진 임의의 분석 방법을 통해 종양 미세환경 면역 상태를 모니터링하기 위한 독립적인 프로브를 포함할 수 있다.
양, 기간 등과 같은 정량화된 값을 지칭할 때 사용되는 "약"이라는 용어는 지정된 값에서 최대 ±9%의 변동을 포함하는 것을 의미하는데, 이러한 변형은 개시된 방법을 수행하기에 적절하기 때문이다. 달리 나타내지 않는 한, 명세서 및 청구범위에 사용된 분자량, 몰농도, 반응 조건, 백분율 등과 같은 시약의 양을 나타내는 모든 값은 모든 경우에 "약"이라는 용어로 정량화되는 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 달리 나타내지 않는 한, 하기 명세서 및 열거된 청구범위에 기재된 수치는 조성물 제제의 원하는 특성 및/또는 본 발명에 의해 수득하고자 하는 방법에 따라 달라질 수 있는 근사치이다. 최소한, 그리고 본 출원의 범위를 제한하려는 시도가 아니라, 각 수치 값은 적어도 보고된 유효 숫자에 의해 그리고 당업계에 알려진 일반적인 반올림 방법을 통해 평가되어야 한다.
사용된 용어 "항체"는 넓은 의미를 의미하고 면역글로불린("Ig"로도 지칭됨) 또는 폴리클론 항체(pAb로도 지칭됨)를 포함하는 항체 분자, 뮤린, 인간, 인간화 및 키메라화 mAb를 포함하는 모노클론 항체(mAb로도 지칭됨), 이중특이적 항체(BSP로도 지칭됨), 항체 약물 접합체(ADC로도 지칭됨), 항체 융합 면역독소 및 항체 단편을 포함한다. 일반적으로, 항체는 특정 항원에 결합하는 단백질 또는 폴리펩티드 사슬이다. 항원은 소정의 항체에 의해 특이적으로 인식되는 구조이다. 표준 항체는 이황화 결합과 수소 결합의 복합체를 통해 늘어선 2개의 경쇄와 2개의 중쇄로 구성된 이종사량체 글리코실화 단백질을 포함한다. 용어 "이황화 브릿지"는 당업계에 알려진 바와 같이 중쇄 힌지 영역 내에 함유된 이황화 브릿지를 지칭한다. 각 중쇄는 가변 도메인(가변 영역)(VH)을 가지며, 이어서 여러 개의 불변 도메인(Fc 도메인으로 지칭됨)을 갖는다. 각 경쇄는 가변 도메인(VL)과 불변 도메인을 갖는다; 경쇄의 불변 도메인은 중쇄의 제1 불변 도메인과 정렬되고 경쇄 VL은 중쇄의 가변 도메인과 정렬된다. 임의의 종의 항체 경쇄는 불변 도메인 내의 아미노산 서열, 즉 카파(κ)와 람다(λ)에 따라 두 가지 별개의 유형 중 하나로 지정된다.
용어 "단일 사슬"은 당업계에 알려진 구조를 갖는 단일 사슬 항체를 지칭한다.
면역글로불린 경쇄(LC) 또는 중쇄(HC)는 보고된 서열 가변성에 기초하여 상보성 결정 영역(CDR)으로도 지칭되는 3개의 "항원-결합 부위"에 의해 중단된 "프레임워크" 영역을 포함한다(문헌[Wu TT, Kabat EA. J Exp Med 132:211-250, 1970]). 일반적으로, 항원 결합 부위는 VH에 위치된 3개(CDRH1, CDRH2, CDRH3) 그리고 VL에 3개(CDRL1, CDRL2, CDRL3)가 있는 6개의 CDR로 구성된다(문헌[Kabat EA, et al. 5th Ed. PHS, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1991]).
"특이적 결합" 또는 "특이적으로 결합한다"는 항체 또는 항원-결합 단편이 다른 항원보다 더 큰 친화도로 항원(항체 자체 내에 함유된 서열 포함)에 결합하는 것을 지칭한다. 전형적으로, 특정 항체 또는 항원-결합 단편은 약 5×10-6 M 이하의 평형 해리 상수 KD로 표적 항원에 결합한다.
"항체 유도체" 또는 "대안적인 형식"은 펩티드 화학(즉, 아미드화 등), 유전적 융합 및/또는 일반적으로 항체와 관련되지 않은 번역 후 모이어티(즉, 글리코실, 아세틸 및/또는 포스포릴) 등을 통해 다른 분자의 공유 부착에 의해 변형되는, 위에서 정의한 항체를 의미한다.
용어 "항체 동적 구조"는 항체 기능, CA125 결합 또는 포 내재화에 영향을 미칠 수 있는 구조의 임의의 변화를 지칭한다.
"모노클론 항체 (mAb)"라는 용어는 임의의 진핵 또는 원핵 세포 클론 또는 파지 클론을 포함하는 단일 세포 클론으로부터 유래된 항체를 지칭하며, 그것이 생산되는 방법은 포함하지 않는다. 따라서, "모노클론 항체"라는 용어는 하이브리도마 기술을 통해 생산된 항체에 제한되지 않고 재조합 방법도 포함할 수 있다.
"Fab 도메인"은 당업계에 알려진 항체 힌지 디설파이드 영역에 대한 N-말단의 임의의 항체 서열을 지칭한다.
"Fc 도메인"은 당업계에 알려진 항체 힌지 디설파이드 영역을 포함하는 C-말단의 임의의 항체 서열을 지칭한다.
"메조텔린"은 메조텔린 단백질(GenBank: AAH03512.1)의 전체 단백질 또는 자연적으로 변형된 형태를 지칭한다.
"항원"은 항체 또는 항체 단편이 특이적으로 결합하는 실체이다. 이는 관심 있는 항체 또는 단백질에 대한 결합을 포함한다.
용어 "CA125"는 MUC16 유전자(HGNC: 15582; OMIM: 606154)에 의해 생산되는 유전자 산물을 지칭하며, 이는 가용성 및 막 결합 형태로 발견된다. Fab 도메인 내의 항체에 결합하고 결합된 항체의 체액성 면역 기능(문헌[Kline JB, et al. Oncotarget 8:52045-52060, 2017]) 및 ADC 흡수에 영향을 미치는 것으로 보고되었다.
용어 "CA125 불응성"은 당업계에 알려진 임의의 방법을 사용하여 측정할 때 CA125 단백질에 대한 결합이 낮거나 없는 항체를 지칭한다.
용어 "CD3" 및 "CD3E"는 인간 림프구 상에서 발현되는 CD3-엡실론 단백질을 지칭한다.
용어 "암", "악성", "조절 장애" 및 "종양"은 당업계에 잘 알려져 있으며 조절되지 않은 세포 성장 및 유사한 기원의 정상 세포 유형과 다른 형태학적 특징을 가진 세포(조절이상 세포로도 지칭됨)의 존재를 지칭한다. 악성은 이환 및/또는 사멸을 유발할 수 있는 암 세포를 지칭한다. 사용된 바와 같이, "암 및 종양"은 전암성 및 악성 유형을 포함한다.
사용된 바와 같이, 용어 "가용성"은 세포의 세포막에 부착되지 않은 단백질 또는 비단백질 제제를 지칭한다. 예를 들어, 가용성인 제제는 정상 또는 암성 세포로부터 종양을 포함하는 세포의 혈청, 전혈, 혈장, 소변 또는 미세유체를 포함하는 생물학적 유체로 유출, 분비 또는 수출될 수 있다.
사용된 바와 같이, CA125를 포함하는 특정 단백질 또는 비-단백질 제제의 "수준"은 시험관내 또는 생체내에서 단백질 및/또는 비-단백질 제제 수준의 측정에 대하여 당업계에 알려진 임의의 방법을 사용하여 결정된 제제의 수준 또는 수준들을 지칭한다. 이러한 방법은 겔 전기영동, 모세관 전기영동, 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC), 박층 크로마토그래피(TLC), 과확산 크로마토그래피, 유체 또는 겔 침전 반응, 흡수 분광법, 비색 분석, 분광광도 분석, 유세포 분석, 면역확산(단일 또는 이중), 용액 상상 분석, 면역전기영동, 웨스턴 블로팅, 방사면역검정(RIA), 효소 결합 면역흡착 검정(ELISA), 면역형광 검정, 형광 공명 에너지 전달(FRET), 포스터 공명 에너지 전달, 전기화학발광 면역검정 등을 포함한다. 일 실시형태에서, CA125의 수준은 보다 상세히 기재된 바와 같이 프로브 기반 기술을 사용하여 결정된다.
용어 "체액성 면역억제"는 CA125에 의해 직접 결합되고 그의 동적 구조가 변경된 임의의 항체, 항체 단편, 이중특이적 항체(BSP) 또는 항체 약물 접합체(ADC)를 지칭한다. 난소암종 및 중피종과 같은 악성 세포에 의해 생성되고(문헌[Nicolaides NC, et al. Cancer Biol Ther 19:622-630, 2018]) 정상 주변 상피 세포의 림프종에 의해 유도되는(문헌[Sanusi et al. Perit Dial Int. 21:495―500, 2001]) CA125는 특정 항체에 결합하여 동적 구조를 변경하여 ADCC, CDC, 옵소닌화, 내재화 및/또는 PK, PD 및 PL 프로파일을 포함한 생물학적 활성에 영향을 미칠 수 있는 것으로 보고되었다.
용어 "항체 약물 접합체(ADC)"는 세포에 독성 활성을 갖는 화학 물질, 폴리펩티드, 핵산 또는 방사성 핵종에 접합되거나 융합된 임의의 항체를 지칭한다.
용어 "절단가능한 링커"는 효소 또는 프로테아제 분해, 산 분해, pH, 화학적 환원, 화학적 산화, 가수분해 등과 같으나 이에 제한되지는 않는 임의의 일반적인 메커니즘에 의해 세포외 또는 세포내에서 절단될 수 있는 화학적 또는 아미노산 링커를 의미한다.
용어 "절단 불가능한 링커" 효소 또는 프로테아제 분해, 화학적 환원, 화학적 산화, 가수분해 등과 같으나 이에 제한되지는 않는 일반적인 메커니즘에 의해 일반적으로 세포외에서 절단되지 않는 화학적 또는 아미노산 링커를 의미한다.
용어 "효소 절단 가능한 링커" 및 "효소 절단 불가능한 링커"는 효소 또는 프로테아제에 의해 절단 가능하거나 절단 불가능한 링커를 의미한다.
용어 "이중특이적 항체(BSP)"는 둘 이상의 상이한 항원을 결합할 수 있는 임의의 항체를 지칭한다. BSP는 적어도 2개의 전장 항체들, 전장 항체 및 단일 사슬 항체, 또는 2개의 단일 사슬 항체들을 포함할 수 있으나 이들로 제한되는 것은 아니며, 여기서 각각은 상이한 항원들에 또는 동일한 항원에 대해 상이한 에피토프에 결합할 수 있다.
용어 "표준 항체"는 면역글로불린 중쇄에 연결된 면역글로불린 경쇄를 지칭하며, 이에 의해 항체는 상기 항원을 특이적으로 인식할 수 있다. 표준 항체는 제2 항원을 특이적으로 인식할 수 있는 또 다른 항체에 융합될 수 있다.
용어 "면역억제 미세환경", 면역-억제 미세환경", "면역억제된 종양 미세환경", "면역-억제된 종양 미세환경"은 각각 PDL1 또는 CA125와 같으나 이에 제한되지는 않는 세포 또는 체액성 면역 기능 및 활성을 억제하는 인자를 생성하거나 발현하는 종양을 지칭한다.
용어 "면역적격 미세환경", "면역-적격 미세환경", "면역유능 종양 미세환경", "면역-유능 종양 미세환경", "면역-능숙", "면역능숙", "면역-능숙한"은 세포 또는 체액성 면역 기능 또는 활성을 억제하는 인자를 생성 또는 발현하지 않는 종양을 지칭한다.
"면역 또는 면역미세환경 상태", "미세환경 면역 상태"는 종양이 면역적격 또는 면역억제인지 결정하는 것을 지칭한다. 용어는 또한 면역억제 단백질을 생성하는 종양을 지칭하며 이러한 단백질을 생성하는 종양은 면역억제된 미세환경을 갖는 것으로 간주된다.
용어 "항체 의존 세포성 세포독성(ADCC)"은 항체가 세포의 표면 상 항원에 결합한 다음 항체의 Fc 도메인 내 서열을 통해 면역-이펙터 세포와 결합하고 결국 결합된 세포를 사멸할 수 있는 독소의 방출을 이끌 수 있는 시험관내 또는 생체내 과정을 지칭한다.
용어 "보체 의존 세포독성(CDC)"은 항체가 진핵 또는 원핵 세포의 표면 상 항원에 결합한 다음 항체의 Fc 도메인 내 서열을 통해 C1q 단백질과 결합하여 결국 결합된 세포를 사멸할 수 있는 고전적인 보체 캐스케이드(cascade)의 개시를 이끌 수 있는 시험관내 또는 생체내 과정을 지칭한다.
용어 "내재화"는 항체, 항체 단편 또는 ADC가 세포 표면의 항원에 결합한 다음 당업자에게 알려진 메커니즘을 통해 내재화할 수 있는 과정을 지칭한다.
용어 "약동학적(PK)"은 대상체에 투여 시 항체가 이것의 정상-상태 농도를 유지하는 시간을 지칭한다.
용어 "약력학적(PD)"은 항체-기반 약물의 생화학적 및 생리학적 효과 및 이것의 작용 메커니즘에 대한 연구를 지칭하며, 여기에는 이들이 대상체에 투여 시 이들의 생화학적 구조와 이들의 작용 및 효과의 상호관계가 포함된다.
용어 "약리학적(PL)"은 시험관내 또는 생체내 질환 세포를 관리하거나 사멸시키는 것에 대한 항체가 갖는 알려진 효과를 지칭한다.
용어 "샘플"은 대상체로부터 단리된 유사한 유체, 세포 또는 조직뿐 아니라 대상체 내 존재하는 유체, 세포 또는 조직의 집합을 지칭한다. 유체는 세포 및 오르가노이드 배양 배지, 소변, 타액, 세척액 등을 포함해 대상체 또는 생물학적 공급원과 접촉된 액체 용액을 포함하는 생물학적 유체를 포함할 수 있다.
사용된 바와 같이 용어 "대조군 샘플"은 예를 들어 그 부모 세포와 상이한 세포 또는 특정 암 유형에 걸리지 않은 건강한 대상체로부터의 샘플을 포함한 임의의 임상적으로 또는 비임상적으로 관련된 대조군 샘플을 지칭한다.
용어 "대조군 수준"은 시험관내 검정에서 사용되거나 대상체로부터 유래된 샘플에서 동일 제제의 수준과 비교하는 데 사용되는 단백질 또는 비-단백질 제제의 허용되거나 미리 결정된 수준을 지칭한다.
사용된 바와 같이, 치료용 항체 대 대조군의 신호 사이의 "차이"는 일반적으로 당업계에서 통상적으로 사용되는 통계적 방법을 사용하여 통계적으로 결정될 수 있는 임의의 차이이고 대조군과 비교하여 최소 10% 이상의 차이이다. 항체 및 사용된 프로브에 따라 적어도 5%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 70%, 또는 75%의 변화를 나타낼 수도 있다.
용어 "저해하다" 또는 "의 저해"는 통계적으로 측정가능한 양만큼 감소시키거나 완전히 방지하는 것을 의미한다.
용어 "기능적"은 설명된 방법에 따라 사용되는 항체, 항체 함유 모이어티(즉, BSP, ADC 등)의 맥락에서 항체가 각각 항원 또는 CA125에 결합할 수 있고/있거나 시험관내 또는 생체내에서 표적 세포에 결합하여 사멸시킬 수 있음을 나타낸다.
용어 "표적 세포"는 특정 항체 또는 항체-함유 모이어티에 대한 항원을 발현하는 진핵 또는 원핵 세포 또는 세포들의 집단을 지칭한다.
용어 "치료 윈도우"는 관리 가능한 내독성 용량 내에서 종양 성장을 억제하는 약물의 효능을 의미한다.
용어 "약학적으로 허용되는"은 약리학적뿐 아니라 독성학적 측면에서 환자에게 투여하기에 허용되는 물질을 지칭하며 당업계에 알려진 접근법을 사용하여 제조된다. 이것들은 연방 또는 주 정부의 규제 기관에서 승인되거나 미국 약전 또는 일반적으로 동물 및 인간에 사용하기에 인정되는 기타 약전에 등재된 제제를 포함한다. 용어 "약학적으로 적합한 성분"은 항암제와 함께 투여되는 약학적으로 허용되는 희석제, 보조제, 부형제 또는 매트릭스 비히클을 지칭한다. "약학적으로 허용되는 담체"는 활성 성분(들)의 생물학적 활성의 유효성을 방해하지 않고 숙주에 무독성인 매트릭스를 지칭한다.
용어 "유효량" 및 "치료적으로 유효한"은 상호 교환적으로 사용되고, 환자에게 향상된 임상 결과를 생성하기에 충분한 양으로 약제를 투여하는 맥락에서 사용된다. 유효량의 제제는 "유효 요법"에서 본원에 기재된 방법에 따라 투여된다. 용어 "유효 요법"은 특정 암 환자에게 향상된 임상 결과를 달성하기에 적절한 제제의 양 및 투여 빈도의 조합을 지칭한다. 향상된 효능은 유효 요법의 임상적 결과를 향상시킬 수 있는 부모 화합물 또는 제제보다 이환을 더 잘 극복할 수 있는 제제를 환자에게 투여할 때 개선된 임상 결과이다.
용어 "환자" 및 "대상체"는 치료제 치료를 받는 수의학 대상체를 포함하는 인간 및 기타 비-인간 동물을 지칭하는 데 상호 교환적으로 사용된다. 용어 "비-인간 동물"은 모든 척추동물을 포함한다. 일 실시형태에서, 대상체는 인간이다.
"치료제"는 전형적으로 바람직하지 않은 오염물이 실질적으로 없다. 이는 제제가 전형적으로 적어도 약 50% w/w(중량/중량) 순수할뿐 아니라 간섭(interfering) 단백질 및 오염물이 실질적으로 없는 것을 의미한다.
용어 "면역-이펙터 세포"는 항체-결합된 표적 세포에 결합 시 항체 의존 세포성 세포독성(ADCC) 또는 식세포작용(옵소닌화)을 부여할 수 있는 NK, 골수, 단핵구, 또는 수지상 세포를 포함하나 이에 제한되지 않는 임의의 세포를 지칭한다. 세포는 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)의 형태로 혼합물로 존재하거나 정제될 수 있다.
용어 "조절이상 세포"는 부모 세포에 대하여 비정상인 것으로 간주되는 임의의 세포를 지칭한다. 이들은 형질전환된 세포, 악성 세포, 바이러스 감염된 세포, 자가조절을 통해 자율적으로 성장하는 세포, 또는 원핵 병원체를 포함한다.
용어 "체액성 반응"은 시험 항체에 의한 표적 세포 내로의 항체의 ADCC, CDC, 옵소닌화 또는 내재화를 지칭한다.
용어 "제제"는 항-메조텔린 ADC 또는 BSP를 지칭한다.
용어 "유의미한(하게)"은 스튜던트 T-검정을 포함한 임의의 수의 프로그램에 의해 결정된 바와 같은 P 값이 0.05 미만인 통계적 결과를 지칭한다.
검출기 항체, 치료용 MES-ADC 및 MES-BSP의 조성물; 암을 발현하는 메조텔린을 갖는 환자를 치료하기 위한 키트 및 방법
MES-ADC 및 MES-BSP(둘 모두 제제로 지칭됨) 및 rMES-1 (검출기 항체로 지칭됨)의 조성물, 미세환경 면역 상태에 관계없이 메조텔린-양성 암을 효과적으로 억제할 수 있는 이러한 제제를 식별하기 위한 키트 및 방법이 본원에 제공된다. 본원에 기술된 최적의 MES-ADC 및 MES-BSP를 식별하기 위한 방법의 일부 실시형태에서, 방법은 CA125 불응성이며 이의 임의의 음성 종양 세포 사멸 활성(즉, ADC의 종양 흡수, 이중특이적 항체의 면역 반응 등)을 피할 수 있는 ADC 및/또는 BSP의 항체 성분을 식별하는 것을 수반한다. 다른 실시형태서 CA125 불응성 MES-ADC는 절단 가능 또는 절단 불가능 링커를 통해 연결된 2개 이상의 세포독소로 구성되며 MES-ADC가 면역억제 표적 세포를 발현하는 메조텔린에 대해 유의하게 개선된 세포독성을 갖고 면역능숙 표적 세포에 대해서도 효과적인지 시험한다. 일부 실시형태에서, MES-ADC 세포독소는 SN38 또는 PNU159682 부류의 토포이소머라제 억제제이다. 또 다른 실시형태에서, MES-ADC는 링커 MAC 글루쿠로나이드 페놀 또는 PEG8-트리아졸-PABC-펩티드-mc를 통해 SN38에 접합된 MES-1 항체를 2:6의 약물:항체 비(DAR)로 포함한다. 또 다른 실시형태에서, MES-ADC는 링커 MA-PEG4-VC-PAB-DMAE를 통해 PNU159682에 접합된 MES-1 항체를 2 내지 6의 DAR로 포함한다. 예는 도 3b에 개략적으로 도시되어 있다. 키트는 당업계에서 사용되는 스크리닝 검정을 통해 면역억제 및 면역능숙 메조텔린 발현 종양 유형에 대한 ADC 사멸 분석을 사용하여 최적의 ADC 형식(세포독소 및 링커)을 식별할 수 있는 MES-ADC로 구성된다. 또한 키트는 최적의 MES-ADC와 rMES-1 검출기 항체로 구성되며, 둘 모두 CA125의 존재 또는 부재 시 메조텔린에 결합하여 종양 미세환경 면역 상태와 관계없이 MES-ADC로 치료할 메조텔린 발현 암 환자를 식별할 수 있다.
다른 실시형태는 최적의 MES-BSP를 식별하는 방법이다. 방법은 최적화된 MES-BSP를 생성하는 것을 수반하며, 여기서 MES-BSP 경쇄는 SEQ ID NO: 1에 나열된 아미노산 또는 N-말단에서 항-CD3 단일 사슬 항체(SEQ ID NO: 6)에 연결된 SEQ ID NO: 2에 나열된 아미노산을 갖는 중쇄를 포함한다. 다른 실시형태에서, MES-BSP는 유전적으로 연결된 스페이서를 통해 항-CD3 단일 사슬에 융합된 MES-1 경쇄를 포함한다. 스페이서는 천연 또는 변형된 아미노산의 임의의 조합 및 길이로 이루어질 수 있지만, MES-1 경쇄와 CD3 단일 사슬 사이의 하나의 선택적 연결은 유전적으로 코딩된 링커 단위(들) "GGGGS(SEQ ID NO: 20)"를 통해 이루어진다. 연결은 하나 또는 여러 단위로 이루어질 수 있다. 최적의 스페이서 단위는 당업계에서 일반적으로 사용되는 검정을 사용하여 면역억제 및 면역능숙 메조텔린-발현 표적 세포의 기능적 사멸 분석을 사용하여 결정될 수 있다. 스크리닝의 예는 실시예 3에서 논의되고 결과는 도 6에 도시되어 있다. 또 다른 실시형태에서, 키트는 종양 미세환경 면역 상태와 상관없이 MES-BSP로 치료하기 위한 메조텔린-발현 암 환자를 식별하기 위해 최적의 MES-BSP + rMES-1 검출기 항체로 구성된다.
최적 활성 MES-ADC 또는 MES-BSP 제제를 식별하는 방법에서, 항체는 표적 세포가 자연적으로 또는 재조합적으로 면역억제 단백질을 발현하는 메조텔린-발현 표적 세포의 배양물에 첨가된다. MES-ADC 또는 MES-BSP 처리 vs 대조군 처리된 세포에 대한 반응을 비교하는 배양물을 표준 사멸 검정을 사용하여 표적 세포 생존력에 대해 모니터링한다. 적어도 10%의 변화는 일반적으로 의미 있는 효과로 간주된다. 사용된 제제 및 검정에 따라, 의미 있는 효과는 또한 적어도 5%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 70% 또는 75%의 변화로 정의될 수 있다.
최적 활성 MES-ADC 또는 MES-BSP를 식별하기 위한 일부 방법에서, 제제는 표적 세포가 자연적으로 CA125를 발현하는 메조텔린 발현 표적 세포의 배양물에 첨가되거나 가용성 CA125 단백질이 외인성으로 첨가된다. MES-ADC 또는 MES-BSP + CA125로 처리된 것 vs 대조군으로 처리되거나 CA125 없이 처리된 것의 반응을 비교하는 배양물을 표준 사멸 검정을 사용하여 표적 세포 생존력에 대해 모니터링한다. 적어도 10% 향상된 사멸의 변화는 일반적으로 ADCC, CDC 및/또는 ADC 표적 세포 사멸에 대한 의미 있는 효과인 것으로 간주된다. 사용된 제제 및 검정에 따라, 의미 있는 효과는 또한 적어도 5%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 70% 또는 75%의 변화로 정의될 수 있다.
MES-ADC 또는 MES-BSP 제제로 암 대상체를 치료하는 방법도 본원에 제공된다. 예를 들어, 환자는 중피종, 결장직장암, 폐암, 난소암, 췌장암, 담관암 또는 자궁내막 암종과 같으나 이에 제한되지 않는 메조텔린-발현 암을 가질 수 있다. 몇 가지 항-메조텔린 항체는 CA125(도 1 참조)에 의해 결합되거나 영향을 받지 않는 MES-ADC 또는 MES-BSP를 사용하는 것이 바람직한 실체인 ADC로서의 내재화를 교란시키거나 BSP로서 면역 사멸 효과를 억제할 수 있는 CA125에 의해 결합되는 것으로 보고되었다.
MES-ADC 또는 MES-BSP 제제로 대상체를 치료하는 방법의 일부 실시형태에서, CA125와 같은 면역억제 단백질을 발현하여 종양 미세환경이 면역억제된 암 환자는 MES-ADC 또는 MES-BSP 제제 단독으로 또는 표준 치료 요법과 조합으로 치료될 수 있다. 면역억제된 미세환경을 갖는 대상체를 치료하는 방법의 일부 실시형태에서, CA125를 발현하는 것으로 알려진 메조텔린-발현 암이 본원에 기재되어 있다. MES-ADC 또는 MES-BSP 제제가 대상체에게 투여되며, 대상체는 정상 범위를 초과하는 기준 CA125 수준을 갖는다. 본원에 기재된 CA125-발현 암을 갖는 대상체를 치료하는 방법의 일부 실시형태에서, 방법은 MES-ADC 또는 MES-BSP 제제를 단독으로 투여하는 것을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, MES-ADC 또는 MES-BSP 제제는 화학요법과 조합으로 투여된다. 화학요법은 대상체가 치료되는 시점에 표준 치료로 간주되는 임의의 화학요법 또는 생물학적 제제일 수 있다. 본원에 기재된 치료 방법에서, CA125 발현 수준은 당업계에 알려진 임의의 수단에 의해 결정될 수 있고 당업계의 정상 범위 내 또는 그 이상으로 정의될 수 있다.
다른 실시형태에서, 환자는 rMES-1 검출기 항체를 사용하여 메조텔린-발현 암을 갖는 것으로 식별되고, rMES에 의해 양성으로 결합된 환자는 MES-ADC 또는 MES-BSP가 면역억제 및 면역능숙 미세 환경 둘 모두에서 효과적이기 때문에 종양 미세환경 면역 상태를 결정하지 않고 MES-ADC 또는 MES-BSP 제제로 치료된다. 본원에 기재된 메조텔린-발현 암을 갖는 대상체를 치료하는 방법의 일부 실시형태에서, 방법은 MES-ADC 또는 MES-BSP 제제를 단독으로 투여하는 것을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, MES-ADC 또는 MES-BSP 제제는 화학요법과 조합으로 투여된다. 화학요법은 대상체가 치료되는 시점에 표준 치료로 간주되는 임의의 화학요법 또는 생물학적 제제일 수 있다.
본원에 기재된 치료 방법의 일부 실시형태에서, 메조텔린을 발현하는 것으로 알려진 예시적인 암은 중피종, 폐암, 결장직장암, 난소암, 자궁내막암, 담관암, 위암, 유방암 및 췌장암을 포함하나 이에 제한되지 않으며, 이들 중 많은 암이 CA125를 생성하는 것으로 보고되었다.
본 발명의 방법은 수술(예를 들어, 종양 축소 수술), 방사선, 표적 요법, 화학요법, 면역요법, 성장 인자 억제제의 사용, 또는 항-혈관신생 인자와 같은 다른 치료 수단과 조합될 수 있다. MES-ADC 또는 MES-BSP 제제는 수술, 화학요법 또는 방사선 요법 치료를 받는 환자에게 동시에 투여될 수 있다. 대안적으로, 환자는 MES-ADC 또는 MES-BSP 제제의 투여 전 또는 후에 표준 치료 요법의 투여 전 또는 후에 적어도 1시간 및 최대 수개월까지 수술, 화학요법 또는 방사선 요법을 받을 수 있다. 본원에 제공된 치료 방법의 일부 실시형태는 종양 특이적 항원 또는 면역 체크포인트 단백질에 대한 항체 유무에 관계없이 MES-ADC 또는 MES-BSP 제제 외에 치료적 유효량의 백금-기반 화학요법 및/또는 엽산 항대사물질 및/또는 PARP 억제제를 대상체에게 투여하는 것을 포함한다.
본원에 기재된 치료 방법의 일부 실시형태에서, 대상체는 MES-ADC 또는 MES-BSP 제제의 투여 전에 종양의 1차 외과적 절제, 1차 백금-기반 요법, 1차 엽산 항대사물질-기반 요법, 1차 백금 및 엽산 항대사물질-기반 요법, 암 치료를 위한 PARP 억제제 및/또는 면역 체크포인트 억제제를 받았을 수 있다.
본원에 기재된 치료 방법에 따른 치료제(MES-ADC 또는 MES-BSP 제제, 엽산 항대사제, 백금-기반 화학요법제, PARP 억제제 및/또는 면역 체크포인트 억제제 포함)의 투여는 당업계에 알려진 임의의 수단일 수 있다.
또 다른 실시형태에서, 표준 항체 형식 외에 IMGT®(the international ImMunoGeneTics information system®)에 따라 번호가 지정된 SEQ ID NO: 7-12 내에 함유된 CDR 서열을 포함하는 MES-ADC 또는 MES-BSP 제제가 사용될 수 있다. 이러한 변형된 MES-ADC 또는 MES-BSP 제제의 투여는 임의의 추가적인 표준 치료의 투여 전, 동시 또는 후일 수 있다. 치료에는 수술뿐만 아니라 치료 시점에 사용되는 현재의 표준 치료에 의한 치료가 포함될 수 있다.
필요한 경우 피내, 근육내, 복강내, 정맥내, 피하, 비강내, 경막외 및 경구 경로를 포함하는 다양한 전달 시스템을 사용하여 치료제(MES-ADC 또는 MES-BSP 제제 포함)를 투여할 수 있다. 제제는 예를 들어 주입 또는 볼루스 주사에 의해, 전신 또는 국소 접근을 통해 상피 또는 피부 점막 라이닝(예를 들어, 구강 점막, 직장 및 장 점막 등)을 통한 흡수에 의해 투여될 수 있다.
치료제는 주사기, 카테터, 좌약 또는 임의의 이식 가능한 매트릭스 또는 장치를 통한 주사에 의해 투여될 수 있다.
본원에 기재된 바와 같이 사용하기 위한 치료제 및 이의 약학 조성물은 캡슐, 정제, 수성 현탁액, 용액 등과 같은 임의의 허용되는 투여 형태로 경구 투여될 수 있다.
치료제의 적합한 투여 방법은 효과적인 치료에 적합한 최종 농도의 정맥내 주사 및 복강내 투여를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
다른 약물과 조합된 MES-ADC 또는 MES-BSP 제제는 치료적 또는 예방적 유효량의 치료제(들) 및 하나 이상의 약학적으로 허용되거나 상용성인 성분을 포함하는 약학 조성물로서 투여될 수 있다.
암의 치료 또는 예방에 효과적인 치료제의 양은 표준 임상 기술에 의해 결정될 수 있다. 또한, MES-ADC 또는 MES-BSP 제제에 필요한 최적의 투여량 범위를 식별하는 데 도움이 되도록 시험관내 검정을 선택적으로 사용할 수 있다. 유효 용량은 시험관내 세포 기반 검정, 동물 모델 또는 기타 비인간 시험 시스템에서 유래된 MES-ADC 또는 MES-BSP 제제의 용량-반응 곡선에서 추정될 수 있다.
예를 들어, 약제의 독성 및 치료 효능은 LD50(집단의 50%에 치명적인 용량) 및 ED50(집단의 50%에서 치료적으로 효과적인 용량) 값을 결정하기 위한 표준 약학 절차에 의해 세포 배양 또는 실험 동물에서 결정될 수 있다. 독성 효과와 치료 효과 사이의 용량 비는 치료 지수 또는 윈도우이며 LD50/ED50 비로 표현될 수 있다. 큰 치료 지수를 나타내는 제제가 적합하다. 제제가 독성 부작용을 나타낼 때, 영향을 받는 조직 부위에 제제를 표적으로 하는 전달 시스템을 사용하여 비-메조텔린-발현 세포에 대한 잠재적인 손상을 최소화하여 부작용을 줄일 수 있다. 대안적으로, 리포솜 캡슐화와 같으나 이에 제한되지는 않는 제형이 필요한 경우 치료 지수를 개선하기 위해 사용될 수 있다.
투여 및 투여 일정은 대상체의 필요에 따라 달라질 수 있는 활성 약물 농도에 따라 달라질 수 있다.
또 다른 실시형태는 MES-ADC 또는 MES-BSP 제제로 치료하는 동안 또는 치료 후 시험관내 또는 제자리에서 메조텔린-발현 종양 세포의 상태를 검출 및/또는 모니터링하기 위해 진단 적용을 위한 CA125 발현 또는 비-발현 종양에서 메조텔린-발현 세포의 검출을 위한 rMES-1 검출기 항체를 라벨링한다. 라벨링은 당업계에 알려진 진단 모니터링을 위해 항체를 라벨링하기 위해 사용되는 임의의 방법일 수 있다.
MES-ADC 및 MES-BSP의 활성을 최적화하기 위한 키트의 조성물
면역억제 및 면역능숙 메조텔린 발현 종양을 사멸시키는 데 적합한 최적화된 MES-ADC 및 MES-BSP 제제를 제조하기 위한 키트가 본원에 추가로 제공된다.
키트는 미세환경 면역 상태에 관계없이 2개 이상의 유형의 메조텔린 발현 세포 또는 종양을 사멸시킬 수 있는 SEQ ID NO: 1 및 2로 구성된 항체에 연결된 세포독소를 함유하는 MES-ADC 작용제를 포함할 수 있으며, 세포독소는 ≤ 100 μM의 IC50으로 토포이소머라제 억제 활성을 갖는다.
키트는 면역억제 및 면역능숙한 메조텔린 발현 세포 또는 종양을 사멸시킬 수 있는 항-CD3 단일 사슬(SEQ ID NO: 6)에 연결된 SEQ ID NO: 7-12를 갖는 항체 또는 항체 단편을 함유하는 MES-BSP 제제를 포함할 수 있으며, 항-메조텔린 항체와 항-CD3 항체 사이의 연결은 ≤ 100 ㎍/mL의 IC50에서 메조텔린 발현 세포를 사멸시키는 최적화된 스페이서를 통해 이루어진다.
상기 개시내용은 일반적으로 본 발명을 기술한다. 본원에 공개된 모든 참고문헌은 참조로 명시적으로 포함된다. 보다 완전한 이해는 단지 예시의 목적으로 본원에 제공되고 본 발명의 범위를 제한하려는 의도가 아닌 하기 특정 실시예를 참조함으로써 얻을 수 있다.
실시예 1 - 면역억제 종양-생성 단백질에 자연적으로 불응성인 항-메조텔린 항체에 대한 스크리닝.
여러 연구에서 CA125에 의해 결합된 항체가 표적 세포의 ADC 매개 면역 사멸뿐만 아니라 체액 매개 면역 사멸을 유도하는 데 부정적인 영향을 미친다고 보고했다(문헌[Kline JB, et.al. OncoTarget 8:52045-52060, 2017]; 문헌[Kline JB, et al. Eur J Immunol 48:1872-1882, 2018]; 문헌[Kline JB, et al. J Clin Oncol 5:15, 2018]; 문헌[Nicolaides NC, et al. Cancer Biol Ther 13:1-22, 2018]; 문헌[Nicolaides et.al. USPTO application 1698444]). CA125에 자연적으로 결합하지 않는 항-메조텔린 항체를 식별하기 위한 시도에서, 우리는 학술 및 상업적 출처(National Cancer Institute, Creative Biolabs, Novus 등)로부터 다수의 항-메조텔린 항체를 입수하여 CA125 결합에 대해 시험했다. 도 1은 CA125에 의한 상이한 항-메조텔린 항체의 결합을 스크리닝하기 위한 효소 결합 면역 분석(ELISA)의 대표적인 결과를 보여준다. 재조합 메조텔린을 양성 대조군으로 사용하였고 인간 혈청 알부민(HSA)을 음성 대조군으로 사용하였다. 간단히 말해서, 96-웰 플레이트를 0.05 M 카보네이트 완충액, pH 9.5에서 4℃에서 밤새 50 μL/웰의 15 KU/mL 인간 CA125 단백질, 1 ㎍/mL의 메조텔린 또는 1 ㎍/mL의 HSA로 코팅했다. 다음날, 플레이트를 125 uL의 0.05 M 인산염 완충액, pH 7.2로 3회 세척한 다음 실온에서 1시간 동안 5% 소혈청 알부민을 포함하는 0.05 M 인산염 완충액에서 차단했다. 그런 다음 웰을 125 μL의 0.05 M 포스페이트 완충액, pH 7.2로 세 번 세척하고 2.5 ㎍/mL의 다양한 항-메조텔린 항체(메조-Ab1에서 메조-Ab5)로 조사했다. 도 1에 도시된 바와 같이, 여러 항-메조텔린 항체가 CA125에 의해 결합된 반면, MES-1 항체(SEQ ID NO:1 및 SEQ ID NO:2)로 구성된 메조-Ab3(레인 3)은 예기치 않게 결합하지 않았다. 모든 항체는 유사한 값으로 메조텔린 단백질에 결합한 반면 HSA 음성 대조군에는 결합하지 않았다. 이러한 결과는 MES-1이 자연적으로 발생하는 CA125-불응성 결합 항체임을 확인했으며 이러한 면역억제 인자를 생성하는 암 세포 또는 종양을 치료하기 위한 이러한 항체의 사용을 제안한다. CA125 결합이 MES-1(도 1a Ab-3) vs CA125 Ab-4에 의해 결합된 항-메조텔린 항체(도 1a)의 내재화에 차별적으로 영향을 미쳤는지 확인하기 위해, 막 결합 CA125를 자연적으로 과발현하는 OVCAR3 세포(문헌[Kline JB, et.al. OncoTarget 8:52045-52060, 2017])와 Kline 등이 보고한 것과 유사한 전략을 사용하여 생성된 shRNA를 통해 OVCAR3 CA125 녹다운 라인을 발현하는 메조텔린을 사용하여 내재화 분석을 수행하여 비교를 위해 동질유전자 세포(OVCAR-KO로 지칭됨)를 생성했다. 제조업체의 프로토콜(ThermoFisher, thermofisher.com/adcdiscovery)에 따라 pH 민감성 pHrodo 형광 염료 시스템을 사용하여 두 항체 모두 형광 표지되었다. 이어서 항체를 24시간 동안 96-웰 마이크로플레이트에서 모조물의 OVCAR3 또는 OVCAR-KO 세포와 함께 인큐베이팅하고 Varioskan™ 플레이트 판독기(ThermoFisher)를 사용하여 형광을 통해 세포 흡수에 대해 정량화했다. 도 1b에 도시된 바와 같이, MES-1 Ab(Ab-3)는 Ab-4와 대조적으로 CA125 발현 OVCAR3 및 CA125 녹다운 OVCAR-KO 세포 둘 모두에서 효율적으로 흡수되었으며, MES-1 항체를 코딩하는 서열이 자연적으로 CA125 불응성이라는 예상치 못한 발견을 뒷받침하며, 이는 본원에 교시된 방법을 사용하여 CA125 발현 종양 세포를 치료하기 위한 적합한 항체 ADC 성분이 되게 한다.
실시예 2 - 면역억제 및 면역능숙 메조텔린 발현 암 세포를 사멸시킬 수 있는 항-메조텔린 항체 약물 접합체(ADC)의 생성.
MES-1이 CA125의 면역억제 효과 및 잠재적으로 메조텔린-발현 종양 세포에 의해 생성된 다른 면역억제 단백질에 불응성인지 결정하기 위해, MES-1을 ADC 형식으로 구성하고, CA125-발현, 면역억제, 메조텔린-발현 암세포를 사멸시키는 효과를 시험했다. 여기서 우리는 MES-1 및 MES-ADC 조성물의 생화학적 분석과 면역억제 및 면역능숙 메조텔린-발현 종양 세포를 효과적으로 사멸시키는 데 필요한 다양한 형식의 MES-ADC의 효능 예를 제공한다. 우리는 면역억제된 표적 세포의 사멸을 최대화하기 위해 특정 페이로드 및 특정 링커 유형에 연결된 CA125 비-결합, 항-메조텔린 항체(SEQ ID NO: 1 및 SEQ ID NO: 2)의 사용을 제공한다. 위에서 논의한 바와 같이, 문헌[Nicolaides et.al. Cancer Biol Ther 19:622-630, 2018]; 미국 특허 출원 제16/981,444호(Nicolaides et.al.)는 CA125가 항-메조텔린 항체 아마툭시맙에 결합하면 체액성 면역 기능이 억제되고 CA125에 의해 결합되지 않은 것과 비교하여 감소된 종양 흡수로 인해 CA125에 결합된 임의의 표적 항원에 대한 ADC에 의한 ADC 사멸이 감소한다고 보고했다. ADC 형식의 MES-1 항체가 면역능숙 및 면역억제 미세환경을 가진 종양에 대해 가질 수 있는 최대 효능을 결정하기 위해, 우리는 다양한 세포 독성 페이로드와 다양한 링커 조합에 연결된 여러 MES-1 기반 ADC를 시험관내에서 시험한 다음 인간 종양 이종이식편에서 시험했다. 이러한 ADC를 생성하기 위해, 먼저 동종 MES-1 단백질을 생산하는 시스템에서 재조합 MES-1을 생성해야 했다. 재조합 중국 햄스터 난소(CHO) 세포는 재조합 MES-1 생산에 사용되었는데, 이 시스템은 이전에 대량의 균질 항체를 생산하는 데 사용되었기 때문이다. MES-1 경쇄(SEQ ID NO: 4) 및 MES-1 중쇄(SEQ ID NO: 5)를 코딩하는 cDNA는 중합효소 연쇄 반응(PCR)에 의해 합성되었고 PCR 단편은 2개의 CMV 구동 발현 클로닝 카세트 및 여기서 pNAV0047로 지칭되는 글루타민 합성효소(GS) 유전자 카세트를 갖는 pXC 벡터에 클로닝되었다. 안정적인 재조합 융합 단백질 생산 세포주를 생성하기 위해, 녹아웃된 내인성 GS 유전자를 함유하는 CHOK1SV-GSKO 세포를 CD-CHO 배지(Irving Scientific) + 6 mM L-글루타민에서 6 × 105 세포/mL로 밤새 37℃에서 5% CO2에서 배양하였다. 다음날, 2.0 ×107 세포를 총 부피 700 μL의 CD-CHO 배지에서 발현 플라스미드 pNAV0047 20 ㎍으로 재현탁하고 0.4 cm 전기천공 큐벳으로 옮기고 BioRad GenePulser II를 사용하여 300 V/900 μF에서 전기천공했다. 세포를 30 mL의 따뜻한 CD-CHO 배지 + 6 mM L-글루타민을 함유하는 플라스크로 즉시 옮기고 진탕 플랫폼 인큐베이터에서 37℃에서 5% CO2에서 밤새 인큐베이팅했다. 다음 날, 세포를 수확하고 50 μM MSX를 함유하는 30 mL CD-CHO/SP4 배지에 재현탁하여 2주 선택 기간 동안 고역가 생산 클론을 선택했다. 그런 다음 선택된 풀을 제한 희석으로 서브클로닝하고 재조합 MES-1 항체 생산에 대해 시험한 클론을 확립하였다. 생산적인 서브클론(1 mg/mL 초과 발현)을 확장하고 항체 생산 및 품질(ELISA에 의한 표적 항원 결합 및 SEC-HPLC에 의한 단백질 균질성)에 대해 분석했다. 그런 다음 최고 품질의 클론을 확장하고 PBS 완충액에서 투석 후 단백질 A 컬럼 친화성 크로마토그래피를 사용하여 배양 배지에서 항체를 정제했다. 크기 배제 크로마토그래피(SEC-HPLC) 및 항원 결합을 통해 항체를 정량화하고 균질성에 대해 분석했다. 도 3a에 도시된 바와 같이, MES-1 생산 라인은 고품질의 균일한 항체를 생성할 수 있었고 ADC 생성에 사용되었다.
여기서 우리는 면역억제 및 면역능숙 표적 암 세포에 대해 동등하게 효과적으로 작용하는 효과적인 세포독성-링커 조합에 대한 스크리닝을 설명한다. 이 기준을 충족하는 최상의 후보를 식별하기 위해, 먼저 DNA 알킬화제, 미세소관 억제제 및 토포이소머라제 억제제를 포함하는 다양한 부류의 세포독소를 시험했다(도 2a). 또한, 효능에 영향을 미치는지 결정하기 위해 서로 다른 링커 조합(절단 가능 vs 절단 불가능)을 사용했다(도 2b). 이들의 효능을 시험하기 위해, 면역억제 CA125 단백질을 공동 발현하는 일부 메조텔린 발현 종양 세포주를 사용했다. 이 세포주는 표 1에 나열되어 있다.
[표 1]
Figure pct00001
우리의 스크린에서 확인된 가장 강력한 세포독소는 오리스타틴 미세소관 억제제 MMAE(평균 EC50 1.39 ng/mL)(문헌[Li C, et.al. MAbs 12:1699768, 2020]), 2개의 토포이소머라제 억제제 SN38(평균 EC50 2.44 ng/mL)(문헌[Meyer-Losic F, et.al. Clin Cancer Res 14:2145-2155, 2008]) 및 PNU159682(평균 EC50 0.014 ng/mL)(여기서 PNU로 지칭됨)(문헌[Quintieri L, et.al. Clin Cancer Res 11:1608-1617, 2005]; 문헌[Carlson RH. Oncol Times 38:8-10, 2016])(도 2c)였다. 이러한 결과를 바탕으로 다음으로 표준 절단 가능한 링커를 사용하여 리드 세포독소를 ADC 형식으로 조작하고 표 1에 표시된 종양 세포주 패널에 대해 다시 시험했다. 이전 보고서에서 약물:항체 비(DAR)가 ADC 표적 세포 사멸에 중요한 특징인 것으로 나타났지만, 또한 부분 환원 및 유리 시스테인에 대한 화학적 연결을 사용할 때 제조 중에 제어하기 어려운 매개변수이기도 한다(문헌[Farras M, et.al. Mabs. 12:1702262, 2020]). SN38-MES-ADC 및 PNU-MES-ADC의 개략도는 도 3b에 제공되어 있다. 많은 경우 DAR의 재현성의 제어는 시작 항체 구조 및 순도에 고유한 것이다. 도 3a에 도시된 바와 같이, 제조 시스템에서 MES-1 항체를 정제하여 균질한 시작 항체를 생성할 수 있었고 부분적으로 변성되었을 때 통상적으로 DAR이 2 내지 4 또는 4 내지 6인 ADC를 생성했다(도 3c). 절단 가능한 링커를 사용하는 예비 MES-ADC의 세포 사멸 검정은 SN38- 및 PNU-MES-ADC가 교란되지 않은 세포 흡수로 인해 CA125 상태와 관계없이 모든 메조텔린 발현 계통의 가장 강력한 표적 사멸 효과를 나타낸 반면 메조텔린을 발현하지 않는 계통은 영향을 받지 않았다는 것을 발견하였다(도 4a). PNU-MES-ADC가 가장 강력한 사멸 활동을 보였기 때문에, 다음으로 절단 가능(MA-PEG4-VC-PAB-DMAE) 및 비-효소 절단 가능 형식(MC-EDA)에서 PNU-MES-ADC를 테스트했고, 예기치 않게, 분해 가능한 형식이 비-효소적 분해 가능한 형식보다 거의 100배 더 강력하다는 것을 발견했다(도 4b).
생체내 리드 MES-ADC 제제 효능을 결정하기 위해, 다음으로 메조텔린 및 CA125 발현 종양 세포주 NCI-N87 및 SW1990뿐만 아니라 CA125 발현 유무에 관계없이 메조텔린-발현 종양을 갖는 환자 유래 종양 이종이식편(PDX)을 사용하여 마우스 이종이식 모델에서 SN38-MES-ADC 및 PNU-MES-ADC 절단 가능 및 비-효소적 절단 가능 형식의 치료 효능을 시험했다. 이종이식 및 PDX 종양에서 메조텔린 및 CA125 발현을 확인하기 위해 각각 토끼 IgG 백본 상에 SEQ ID NO: 7-12를 함유하는 rMES-1 검출기 항체 및 상업적 항-CA125 항체를 사용하여 면역조직화학(IHC)을 통해 이종이식편-유래 단편을 시험하였다(도 4c). 간단히 말해서, 파라핀 포매된 종양 단편의 5 μM 절편을 절단한 다음 유리 슬라이드에 부착했다. 절편을 탈파라핀화하고 10분 동안 끓는 10 mM 소듐 시트레이트(pH 6.0)에서 항원 검색을 위해 준비한 다음 인산염 완충 식염수-0.05% 트윈-20(PBS-T)으로 평형화했다. 그런 다음 섹션을 0.3% 퍼옥시다제/메탄올을 사용하여 10분 동안 내인성 퍼옥시다제 활성에 대해 켄칭하고 PBS-T 중 10% 염소 혈청에서 1시간 동안 차단했다. 다음으로, 슬라이드를 PBS-T로 헹구고 rMES-1 또는 토끼 항-CA125(Novus)를 통해 메조텔린에 대해 1.5시간 동안 차단 완충액에 희석된 3 mg/mL의 각 1차 항체를 사용하여 프로빙한(probe) 다음, 세척하고, 1시간 동안 2차 차단 및 5 ㎍/mL의 항-토끼-홀스래디시 과산화효소(HRP) 접합된 2차 항체로 1시간 동안 프로빙한다. 대조군 슬라이드는 1차 항체 없이 인큐베이팅되었다. 슬라이드를 PBS-T에서 세척한 다음 제조업체(ThermoScientific)에서 권장하는 대로 eBioscience™ DAB 고급 발색 기질을 사용하여 노출했다. 마지막으로, 샘플을 헤마톡실린으로 대비염색하고, 커버 슬립하고, 광학 현미경 하에서 항원 발현에 대해 분석하였다. NCI-N87 및 SW1990 이종이식 종양 모두 메조텔린 및 CA125를 공동-발현하는 것으로 밝혀졌고(나타내지 않음), 비소세포 폐 선암종 PDX #LXFA983 및 중피종 PDX #PXF1118은 동일한 수준의 메조텔린을 발현하는 것으로 밝혀졌으며 PDX #PXF118만이 CA125 양성을 나타냈다(도 4c, 상단 패널). 그런 다음 마우스 CDX(세포주 유래 이종이식) 및 PDX(환자 유래 이종이식) 생체내 분석에서 이 계통을 사용했다.
SW1990 췌장암 CDX 모델의 경우, 1 x 107개의 종양 세포를 다수의 무흉선 누드 마우스의 옆구리에 주사했다. 종양이 확립된 마우스(136 내지 154 ㎣)를 10 또는 20 mg/㎏ 또는 PBS로 이식 후 8일차, 9일차 및 10일차에 SN38-MES-ADC로 랜덤화하고 정맥내 처리했다. SN38-MES-ADC 처리는 39일차에 비히클 처리군에 비해 10 또는 20 mg/㎏에서 각각 25% 또는 53%까지 종양 성장을 감소시켰고 그 차이는 통계적으로 유의했다(10 mg/㎏ 에서 P ≤ 0.049; 20 mg/㎏에서 P ≤ 0.0003)(도 4d, 상단 패널).
NCI-N87 위암 CDX 모델의 경우, 1 x 107개의 종양 세포를 여러 SCID 마우스의 옆구리에 주사했다. 확립된 종양(126 ㎣)이 있는 마우스를 랜덤화하고 아래에 표시된 대로 정맥내 처리되었다. 효소 절단 가능한 형식의 PNU-MES-ADC는 랜덤화 후 1일차, 8일차, 15일차, 25일차, 32일차 및 44일차에 0.25 또는 0.5 mg/㎏으로 투여되었다. PNU-MES-ADC 절단 가능한 형식 처리는 0.5 mg/㎏에서 종양 성장을 45%까지 감소시켰고 그 차이는 통계적으로 유의했다(p ≤ 0.050)(도 4d, 하단 패널). 동일한 NCI-N87 위암 CDX 모델에서, 확립된 종양(126 ㎣)이 있는 마우스를 랜덤화하고, 랜덤화 후 1일차, 3일차, 5일차, 7일차, 9일차, 11일차, 13일차, 15일차에 SN38-MES-ADC로 20 mg/㎏, PNU-MES-ADC 비-효소 분해 가능 형식(1일차에 0.625 mg/㎏, 5일차에 1.25 mg/㎏, 9일차에 2.5 mg/㎏, 13일차에 5 mg/㎏) 또는 PBS로 정맥내 처리되었다. SN38-MES-ADC 처리는 종양 성장을 48%까지 감소시켰고 그 차이는 통계적으로 유의했다(p ≤ 0.011)(나타내지 않음). PNU-MES-ADC 비-효소 절단 가능 형식 처리는 종양 성장을 36% 감소시켰고 그 차이는 효소 절단 가능한 형식을 가진 PNU-MES-ADC보다 덜 효과적이기는 하지만 통계적으로 유의했다(P ≤ 0.033).
LXFA983 NSCLC PDX 모델의 경우, 종양 단편을 여러 무흉선 누드 마우스의 옆구리에 이식했다. 확립된 종양(128 ㎣)이 있는 마우스를 랜덤화하고, 랜덤화 후 1일차, 4일차, 8일차, 12일차 및 16일차에 0.625 mg/㎏(1일차, 4일차, 및 8일차) 또는 0.4 mg/㎏(12일차 및 16일차)에서 PNU-MES-ADC 절단 가능 형식 또는 PBS로 정맥내 처리했다. PNU-MES-ADC 절단 가능한 형식은 통계적으로 유의미한(p ≤ 0.0003) 종양 퇴행을 유도했다(도 4e, 상단 패널).
PXF1118 메조텔린 PDX 모델의 경우, 종양 단편을 여러 무흉선 누드 마우스의 옆구리에 이식했다. 확립된 종양(117-124 ㎣)이 있는 마우스를 랜덤화하고, 랜덤화 후 1일차, 4일차, 8일차, 12일차, 16일차, 및 20일차에 0.625 mg/㎏(1일차, 4일차, 및 8일차) 또는 0.4 mg/㎏(12일차, 16일차 및 20일차)에서 PNU-MES-ADC 절단 가능 형식 또는 PBS로 정맥내 처리했다. PNU-MES-ADC 절단 가능한 형식은 통계적으로 유의미한(p ≤ 0.012) 종양 퇴행을 유도했다(도 4e, 하단 패널).
감소된 단일 PNU-MES-ADC 투여의 효능을 추가로 결정하기 위해 위에 기재된 바와 같은 모델 설계에서 CA125 발현 PXF1118 PDX 계통을 사용하여 생체내 반복 실험을 수행하였다. 간단히 말해서, 무흉선 누드 마우스를 상기와 같이 준비하고 일단 확립된 종양이 확인되면 각각 6마리의 마우스로 이루어진 4개의 그룹으로 그룹화하였다. 그런 다음 마우스를 1일차, 8일차 및 15일차에 PBS, 0.25 mg/㎏ PNU-MES-ADC 또는 30 ㎍/㎏ 유리 PNU159682(0.25 mg/㎏ PNU-MES-ADC 용량과 동등한 독소량)로 처리하거나 1일차에 0.75 mg/㎏ PNU-MES-ADC로 1회 처리했다. 종양 반응과 건강에 대해 50일 이상 마우스를 추적했다. 49일차에 도 5에 도시된 바와 같이, 절단 가능한 형식의 0.75 mg/㎏에서 MES-ADC의 단일 용량은 PBS 또는 유리 PNU159682(PN-유리) 처리된 마우스와 대조적으로 확립된 종양 성장을 상당히 감소시키고(P ≤ 0.0061) 0.25 mg/㎏에서 PNU-MES-ADC의 3주 용량과 유사한 지속적인 반응을 유지하기에 충분했으며, 이는 CA125 발현 유무에 관계없이 메조텔린-발현 종양을 치료하기 위한 이러한 형식 및 조성물의 효능을 입증한다. 약물 치료는 모든 그룹에서 내약성이 양호하였다.
이러한 데이터는 절단 가능한 형식의 PNU-MES-ADC 및 SN38-MES-ADC를 함유하는 물질의 조성물이 면역억제 및 면역능숙 종양 미세 환경으로 종양을 효과적으로 사멸시킬 수 있다는 교시를 뒷받침한다. MMAE 미세소관 억제제와 같은 다른 페이로드 또는 비효소 절단 가능한 MC-EDA와 같은 링커가 덜 효과적이라는 발견은, 종양 표적화 ADC의 일반적인 사용은 단순히 종양 면역억제를 극복할 수 없다는 것과 오히려 다음을 교시한다: 여기에 교시된 본 발명에 기술된 바와 같이 면역억제 및 면역능숙 종양을 치료할 수 있는 강력하고 효과적인 ADC 제제를 개발하기 위해서는, 1) CA125와 같은 면역억제 인자에 의해 결합되지 않은 항체에 대한 능동 스크리닝, 2) 최적 페이로드 세포독성에 대한 스크리닝, 및 3) 최적의 링커에 대한 스크리닝이 필요함.
실시예 3 - 면역억제 및 면역능숙 메조텔린-발현 암 세포를 사멸시킬 수 있는 항-메조텔린 이중특이적 항체(MES-BSP)의 생성.
종양 세포를 표적으로 하는 항체의 사용은 일반적으로 종양 세포 성장을 억제하기 위한 사이토카인 수용체에 대한 사이토카인 결합의 차단 및/또는 ADCC, CDC 및/또는 면역 이펙터 세포 옵소닌화를 통한 체액성 매개 면역 사멸의 사용을 포함한다. 위에 기재된 바와 같이, 종양 생성 CA125 단백질 및 기타 종양 생성 단백질(후자는 N.C.N, J.B.K. L.G. 개인 관찰임)은 표적 세포의 체액 매개 항체 사멸을 억제하는 능력을 갖는다. 면역억제 단백질의 결합에 자연적으로 반응하지 않는 항체를 사용하면 이러한 단백질이 있는 경우에도 종양 세포를 사멸할 수 있다. 실시예 1에 기술된 바와 같이, MES-1 항체는 CA125 결합을 회피하는 능력에 대해 항-메조텔린 항체를 스크리닝함으로써 확인되었다.MES-1의 면역 매개 사멸을 향상시키기 위해, 표적 세포의 근위 표면에 CD3+ 세포독성 T 세포를 모집하고 BSP 항체 종양 세포 사멸에 중요한 기능인 후속 T 세포 활성화를 통해 잠재적으로 면역 매개 사멸을 사용할 수 있도록 조작하였다(문헌[Staerz UD, et al. Nature 314;628-631, 1985]). 본 발명자들은 여기서 종양 미세 환경 면역 상태에 관계없이 개선된 면역 매개 종양 세포 사멸을 유도하는 T-림프구 상에서 발현되는 세포 표면 항원에 결합할 수 있는 두 번째 항체를 유전적으로 융합한 CA125 비-결합 항-메조텔린 항체의 사용을 교시한다. 일 예로서, MES-1 항체에 융합된 T 세포 상의 CD3 항원에 결합할 수 있는 단일 사슬 항체의 사용을 보여준다. 실시예 2에서 논의된 바와 같이, 문헌[Nicolaides et.al. Cancer Biol Ther 19:622-630, 2018]은 이전에 항-메조텔린 항체 아마툭시맙에 결합하는 CA125가 체액성 면역 기능을 억제한다는 것을 보여주었다. BSP 형식의 MES-1 항체가 면역능숙 및 면역억제 미세환경을 가진 종양에 대해 가질 수 있는 최대 효능을 결정하기 위해, 항-CD3 단일 사슬 항체(SEQ ID NO: 6)를 MES-1 경쇄(SEQ ID NO: 1) 또는 중쇄(SEQ ID NO: 2)에 연결하는 여러 MES-BSP 형식을 고려하고 SEQ ID NO: 3에 나타낸 바와 같은 아미노산 링커 GGGS 및 표준 MES-1 중쇄(SEQ ID NO: 2)를 사용하여 MES-1 경쇄의 N-말단에 CD3 단일 사슬의 융합을 진행하였다. 그런 다음 아래에 설명된 대로 재조합 MES-BSP 항체를 생성하고 CA125 단백질에 의해 면역능숙하고 면역억제된 암 세포주에 대한 활성을 시험하였다.
고품질 MES-BSP를 생산하기 위해, 대규모 생산을 위해 MES-BSP를 발현하도록 재조합 중국 햄스터 난소(CHO) 세포를 조작했다. CD3 단일 사슬 항체는 SEQ ID NO: 3에 제시된 아미노산 GGGGS를 코딩하는 유전자 링커를 통해 MES-1 경쇄의 성숙한 N-말단 도메인의 업스트림에 클로닝되었다. MES-1 경쇄-CD3 단일 사슬 융합 cDNA 및 MES-1 중쇄 cDNA를 2개의 CMV 구동 발현 카세트 및 여기서 pNAV0071로 지칭되는 글루타민 신타제(GS) 유전자 카세트를 갖는 pXC 벡터에 클로닝하였다. 안정적인 재조합 융합 단백질 생산 세포주를 생성하기 위해, 녹아웃된 내인성 GS 유전자를 함유하는 CHOK1SV-GSKO 세포를 CD-CHO(Irving Scientific) + 6 mM L-글루타민에서 6 × 105 세포/mL로 밤새 37℃, 5% CO2에서 배양하였다. 다음날, 2.0×107 세포를 총 부피 700 μL 일반 CD-CHO에서 20 ㎍ 발현 플라스미드 pNAV0071로 재현탁한 다음, 0.4 cm 전기천공 큐벳으로 옮기고 BioRad GenePulser II를 사용하여 300 V/900 μF에서 전기천공했다. 세포를 30 mL의 따뜻한 CD-CHO와 6 mM L-글루타민을 함유하는 플라스크로 즉시 옮기고 진탕 플랫폼 인큐베이터에서 37℃, 5% CO2에서 밤새 인큐베이팅했다. 다음날, 세포를 수확하고 선택을 위해 50 μM MSX를 함유하는 30 mL CD-CHO/SP4에 재현탁시켰다. 다음으로, 선택된 풀을 제한 희석에 의해 서브클로닝하고 컨디셔닝된 배지를 항-인간 Fc-HRP를 프로브로 사용하여 ELISA를 통해 확립된 클론으로부터 재조합 MES-BSP 항체 생산에 대해 시험하였다. 생산적인 서브클론(0.5 mg/mL 초과 생산)을 확장하고 항체 생산 및 품질(표적 항원 결합 및 단백질 균질성)에 대해 분석했다. 그런 다음 최고 품질의 클론을 확장하고 MES-BSP 항체를 단백질 A 컬럼 친화성 크로마토그래피 및 PBS 완충액에서 투석을 사용하여 배양 배지에서 정제했다. 이어서 MES-BSP 항체를 정량화하고 SDS-PAGE 분석을 통해 균질성에 대해 분석하고 ELISA를 통해 항원 결합을 분석하였다. 그런 다음 다양한 종양 세포주에 대한 효능에 대해 고품질 프렙(prep)을 시험했다.
MES-BSP는 ADCC를 통한 체액성 면역 사멸에 대해 처음으로 시험되었으며, CA125 단백질 및 인간 PBMC를 자연적으로 과발현하는 메조텔린-발현 면역억제 OVCAR3 종양 세포주의 존재 하에 부모 MES-1 항체 및 체액성 면역억제 메조-Ab-4 항체(Ab-4, 레인 4, 도 1)와 비교하였다. 도 6a에 도시된 바와 같이, MES-BSP는 MES-1 또는 메조-Ab-4와 비교하여 CA125 생산 OVCAR-3 세포주에 대해 상당히 더 높은 사멸을 보였고, 후자는 사멸 활성을 나타내지 않았다. 이는 메조-Ab-4의 ADCC 활성이 OVCAR3CA125 녹다운 OVCAR-KO 세포주에 대한 MES-1의 활성과 유사하기 때문에 구동된 CA125인 것으로 보인다(도 6b). 이 검정에서, Jurkat-CD16a ADCC 리포터 세포주를 사용하여 제조업체(Promega Corp)의 지침에 따라 루시퍼라제 판독값을 통해 ADCC 활동을 모니터링했다. 유사한 계통이 이전에 발표되었으며 부모 OVCAR 세포와 대조적으로 CA125 영향을 받은 항체에 의해 항체 매개 체액 반응이 상당히 향상된 것으로 나타났다(문헌[Kline JB, et al. OncoTarget 8:52045-52060, 2017]; 문헌[Nicolaides NC, et al. Cancer Biol Ther 13:1-22, 2018]). 마지막으로, 메조텔린-발현 CA125 양성 종양 세포에 대한 MES-BSP의 생체내 효능을 입증하기 위해, 인간화 PBMC 마우스 모델을 사용하여 무흉선 누드 마우스에 메조텔린과 CA125를 모두 발현하는 중피종 유래 종양 세포를 이식했다. 종양이 확립되면 마우스에 인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 이식한 후 MES-BSP 또는 대조군 처리를 실시했다. 도 7에 도시된 바와 같이, MES-BSP는 통계적으로 종양 성장을 억제할 수 있었고, 이는 CA125 면역억제된 종양 미세환경에서 메조텔린-발현 세포를 치료하는 데 유용함을 확인시켜주었다. 여기에서 우리는 CA125가 결합할 수 있는 면역 매개 사멸을 사용하여 CA125가 항체의 효능에 상당한 영향을 미칠 수 있다고 교시한다. 또한, 우리는 항-메조텔린 BSP 항체가 면역억제된 종양 세포를 효과적으로 사멸시킬 수 있는 조성물을 제공한다.
[표 2]
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
SEQUENCE LISTING <110> Grasso, Luigi Nicolaides, Nicholas Klein, J. Bradford <120> COMPOSITION AND USE OF ALTERNATIVELY FORMATTED ANTI-MESOTHELIN ANTIBODIES FOR THE TREATMENT OF CANCER <130> 008966.00008 <140> 63/084,542 <141> 2020-09-28 <160> 20 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 218 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 1 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Arg Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Gly Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Ala Tyr Phe Asp Ser 85 90 95 Asn Asn Trp His Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 110 Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln 115 120 125 Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 130 135 140 Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser 145 150 155 160 Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr 165 170 175 Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys 180 185 190 His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro 195 200 205 Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 2 <211> 453 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 2 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asp Leu Gly Phe Tyr 20 25 30 Phe Tyr Ala Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 35 40 45 Val Ser Cys Ile Tyr Thr Ala Gly Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Ser 50 55 60 Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Arg Ser Thr Ala Asn Thr Arg Ser Thr Tyr Tyr Leu Asn 100 105 110 Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys 115 120 125 Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly 130 135 140 Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro 145 150 155 160 Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr 165 170 175 Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val 180 185 190 Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn 195 200 205 Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro 210 215 220 Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu 225 230 235 240 Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 245 250 255 Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp 260 265 270 Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly 275 280 285 Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn 290 295 300 Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp 305 310 315 320 Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro 325 330 335 Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu 340 345 350 Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn 355 360 365 Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile 370 375 380 Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 385 390 395 400 Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys 405 410 415 Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys 420 425 430 Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu 435 440 445 Ser Leu Ser Pro Gly 450 <210> 3 <211> 468 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> modified antibody sequences by fusion <400> 3 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr 20 25 30 Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 115 120 125 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr 130 135 140 Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile 145 150 155 160 Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln 165 170 175 Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Leu 180 185 190 Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp 195 200 205 Tyr Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr 210 215 220 Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Phe Thr Phe Gly Cys Gly Thr 225 230 235 240 Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln 245 250 255 Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr 260 265 270 Cys Gln Ala Ser Gln Arg Ile Ser Ser Tyr Leu Ser Trp Tyr Gln Gln 275 280 285 Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Leu 290 295 300 Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp 305 310 315 320 Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Val Ala Thr Tyr 325 330 335 Tyr Cys Gln Ser Tyr Ala Tyr Phe Asp Ser Asn Asn Trp His Ala Phe 340 345 350 Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser 355 360 365 Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala 370 375 380 Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val 385 390 395 400 Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser 405 410 415 Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr 420 425 430 Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys 435 440 445 Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn 450 455 460 Arg Gly Glu Cys 465 <210> 4 <211> 1464 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> modified antibody sequences by fusion <400> 4 atgtctgtgc ctacccaggt gctgggactg ctgctgctgt ggctgacaga cgcccgctgt 60 caagtgcagt tggtggaatc agggggagga gtcgtgcagc cgggaagatc attgagactg 120 tcgtgcgcgg cgtccggtta caccttcacc cggtatacta tgcactgggt gcgccaggcc 180 cctggcaaat gcctggagtg gatcggttac attaacccga gcagggggta caccaactac 240 aaccagaagg tcaagggccg cttcaccatc tcccgggata actccaagaa caccgcatac 300 ctccaaatga actccctgcg ggccgaagat acggccgtgt actactgtgc ccggtactac 360 gacgaccatt actgccttga ctactggggc cagggcactc tggtgactgt gtccagcggg 420 ggcggtggaa gcgggggggg aggctccgga ggaggcggat cgggtggcgg cggcagcgac 480 atccaaatga cccagtcccc gtcctcactt tccgcatccg tcggcgatcg cgtgaccatt 540 acttgttccg cgtcgtcgtc cgtgagctac atgaactggt atcagcagaa gccaggaaag 600 gccccgaaac tgctgatcta cgacacttcc aagctggctt ctggagtgcc cagcagattc 660 agcggatcag ggtccggtac cgactacacc ttcaccattt cgtccctgca acccgaagat 720 atcgccacct actactgcca gcagtggtcg agcaaccctt ttacgttcgg ctgtggcacc 780 aagctcgaga tcaaaggtgg cggcggtagc gacatccaga tgacacaatc tccttcatct 840 ctcagtgctt ccgtaggaga tagagttact ataacctgtc aagcatctca aaggatctct 900 tcctatctca gttggtatca acagaaaccg ggaaaagtgc ccaaacttct tatctacggt 960 gctagtacac ttgcttccgg ggtcccctca aggttcagcg gcagcggttc tggaacagac 1020 tttaccctga cgatctcaag tctccagcca gaagacgtgg ctacatacta ctgccagtct 1080 tacgcatact tcgatagcaa taactggcac gccttcggtg gcggaaccaa agttgaaata 1140 aaacgaactg tggctgcacc atctgtcttc atcttcccgc catctgatga gcagttgaaa 1200 tctggaactg cctctgttgt gtgcctgctg aataacttct atcccagaga ggccaaagta 1260 cagtggaagg tggataacgc cctccaatcg ggtaactccc aggagagtgt cacagagcag 1320 gacagcaagg acagcaccta cagcctcagc agcaccctga cgctgagcaa agcagactac 1380 gagaaacaca aagtctacgc ctgcgaagtc acccatcagg gcctgagctc gcccgtcaca 1440 aagagcttca acaggggaga gtgt 1464 <210> 5 <211> 1416 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> modified antibody sequences with leader sequence <400> 5 atggaatgga gctgggtgtt cctgttcttt ctgtccgtga ccacaggcgt gcattctgaa 60 gtgcaactcg tggagtcagg cgggggtctg gttcagccgg gcggcagtct tcggcttagt 120 tgtgccgcaa gcggctttga cctcgggttt tatttctacg cctgttgggt aaggcaggca 180 cctggaaagg gtctggaatg ggtctcttgc atatatacgg caggtagcgg ctccacgtat 240 tacgcaagtt gggccaaggg ccggttcaca atatctaggg acaattccaa aaataccctg 300 tacctgcaaa tgaacagtct cagggctgaa gacactgctg tctactattg cgctcgctca 360 acggctaata cccggtccac ttattacttg aacctctggg gtcagggaac tttggtaaca 420 gtatcatccg catccaccaa gggcccatcg gtcttccccc tggcaccctc ctccaagagc 480 acctctgggg gcacagcggc cctgggctgc ctggtcaagg actacttccc cgaaccggtg 540 acggtgtcgt ggaactcagg cgccctgacc agcggcgtgc acaccttccc ggctgtccta 600 cagtcctcag gactctactc cctcagcagc gtggtgaccg tgccctccag cagcttgggc 660 acccagacct acatctgcaa cgtgaatcac aagcccagca acaccaaggt ggacaagaaa 720 gttgagccca aatcttgtga caaaactcac acatgcccac cgtgcccagc acctgaactc 780 ctggggggac cgtcagtctt cctcttcccc ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc 840 cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag 900 ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag 960 cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg 1020 aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa 1080 accatctcca aagccaaagg gcagccccga gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc 1140 cgggatgagc tgaccaagaa ccaggtcagc ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatccc 1200 agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat gggcagccgg agaacaacta caagaccacg 1260 cctcccgtgc tggactccga cggctccttc ttcttatatt caaagctcac cgtggacaag 1320 agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac 1380 cactacacgc agaagagcct ctccctgtct ccgggt 1416 <210> 6 <211> 245 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> modified antibody sequences by fusion <400> 6 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr 20 25 30 Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 115 120 125 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr 130 135 140 Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile 145 150 155 160 Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln 165 170 175 Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Leu 180 185 190 Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp 195 200 205 Tyr Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr 210 215 220 Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Phe Thr Phe Gly Cys Gly Thr 225 230 235 240 Lys Leu Glu Ile Lys 245 <210> 7 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker <400> 7 Gln Ala Ser Gln Arg Ile Ser Ser Tyr Leu Ser 1 5 10 <210> 8 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> llinker <400> 8 Gly Ala Ser Thr Leu Ala Ser 1 5 <210> 9 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker <400> 9 Gln Ser Tyr Ala Tyr Phe Asp Ser Asn Asn Trp His Ala 1 5 10 <210> 10 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker <400> 10 Gly Phe Asp Leu Gly Phe Tyr Phe Tyr Ala Cys 1 5 10 <210> 11 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker <400> 11 Cys Ile Tyr Thr Ala Gly Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala 1 5 10 15 Lys Gly <210> 12 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker <400> 12 Ser Thr Ala Asn Thr Arg Ser Thr Tyr Tyr Leu Asn Leu 1 5 10 <210> 13 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker <400> 13 Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr Thr Met His 1 5 10 <210> 14 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker <400> 14 Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln 1 5 10 15 Lys Val Lys Gly 20 <210> 15 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker <400> 15 Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr 1 5 10 <210> 16 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker <400> 16 Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr 1 5 10 <210> 17 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker <400> 17 Leu Leu Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser 1 5 10 <210> 18 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker <400> 18 Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Phe Thr 1 5 <210> 19 <211> 720 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> modified antibody sequences with modifified leader sequence <400> 19 atgtctgtgc ctacccaggt gctgggactg ctgctgctgt ggctgacaga cgcccgctgt 60 gacatacaga tgactcagtc cccttcaagc ctcagtgcat cagtaggtga ccgggttacc 120 attacctgcc aggccagtca acgaatatca tcctacctct cctggtacca gcagaagccg 180 gggaaggtgc ctaagctctt gatctacggc gccagtacgc ttgcaagcgg ggtcccatca 240 cggttctccg gtagtggctc tggaacagat tttacgctca cgatttccag ccttcaaccg 300 gaggatgttg cgacttacta ctgtcaatcc tatgcgtatt tcgattccaa taactggcac 360 gcattcggtg ggggaaccaa agtggagatt aaacgaactg tggctgcacc atctgtcttc 420 atcttcccgc catctgatga gcagttgaaa tctggaactg cctctgttgt gtgcctgctg 480 aataacttct atcccagaga ggccaaagta cagtggaagg tggataacgc cctccaatcg 540 ggtaactccc aggagagtgt cacagagcag gacagcaagg acagcaccta cagcctcagc 600 agcaccctga cgctgagcaa agcagactac gagaaacaca aagtctacgc ctgcgaagtc 660 acccatcagg gcctgagctc gcccgtcaca aagagcttca acaggggaga gtgtctgcac 720 <210> 20 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker <400> 20 Gly Gly Gly Gly Ser 1 5

Claims (34)

  1. SEQ ID NO: 7-12에 나타낸 바와 같은 아미노산을 갖는 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하는 항-메조텔린 항체 및 토포이소머라제 억제제를 포함하는 항체-약물 접합체(ADC).
  2. 제1항에 있어서, 항체가 SEQ ID NO:1 및 SEQ ID NO:2의 아미노산 서열을 포함하는, ADC.
  3. 제1항에 있어서, 항체가 토포이소머라제 억제제에 공유 결합된, ADC.
  4. 제1항에 있어서, 항체가 절단 가능한 링커를 통해 토포이소머라제 억제제에 연결된, ADC.
  5. 제4항에 있어서, 리포솜에 캡슐화된 ADC.
  6. 제3항에 있어서, 토포이소머라제 억제제가 (2S,4S)-2,5,12-트리하이드록시-7-메톡시-4-{[(1S,3R,4aS,9S,9aR,10aS)-9-메톡시-1-메틸옥타하이드로-1H-피라노[4',3':4,5][1,3]옥사졸로[2,3-c][1,4]옥사진-3-일]옥시}-6,11-디옥소-1,2,3,4,6,11-헥사하이드로테트라센-2-카복실산(PNU159682)인, ADC.
  7. 제6항에 있어서, PNU159682가 링커 말레이미도카프로일-발린-시트룰린-p-아미노벤조일옥시카보닐(MA-PEG4-VC-PAB-DMAE)을 통해 항-메조텔린 항체에 공유 결합되는, ADC.
  8. 제7항에 있어서, 링커가 항-메조텔린 항체에서 시스테인에 연결된, ADC.
  9. 제7항에 있어서, 항체가 SEQ ID NO:1 및 SEQ ID NO:2의 아미노산 서열을 포함하는, ADC.
  10. 제9항에 있어서, ADC의 DAR이 2 내지 6(경계값 포함)인, ADC.
  11. 제7항에 있어서, 토포이소머라제 억제제가 (2S,3S,4S,5R,6S)-6-[[(19S)-10,19-디에틸-19-하이드록시-14,18-디옥소-17-옥사-3,13-디아자펜타시클로[11.8.0.02,11.04,9.015,20]헤니코사-1(21),2,4(9),5,7,10,15(20)-헵타엔-7-일]옥시]-3,4,5-트리하이드록시옥산-2-카복실산(SN38)인, ADC.
  12. 제11항에 있어서, SN38이 링커 메틸 (2S,3S,4S,5R,6S)-3,4,5-트리아세틸옥시-6-[2-아미노-4-(하이드록시메틸)페녹시]옥산-2-카복실레이트(MAC-글루쿠로나이드)를 통해 항-메조텔린 항체에 공유 결합되는, ADC.
  13. 제11항에 있어서, SN38이 링커 PEG8 트리아졸-PABC-펩티드-MC를 통해 항-메조텔린 항체에 공유 결합되는, ADC.
  14. 제11항에 있어서, SN38이 항-메조텔린 항체에서 시스테인에 공유 결합된, ADC.
  15. 제11항에 있어서, 항-메조텔린 항체가 아미노산 서열 SEQ ID NO:1 및 SEQ ID NO: 2를 포함하는, ADC.
  16. 제15항에 있어서, 2 내지 6(경계값 포함)의 DAR을 갖는, ADC.
  17. 하기를 포함하는, 메조텔린-발현 종양을 갖는 암 환자를 치료하는 방법:
    SEQ ID NO: 7-12에 나타낸 바와 같은 아미노산을 포함하는 항-메조텔린 항체 및 토포이소머라제 억제제를 포함하는 항체-약물 접합체(ADC)를 환자에게 투여하는 단계.
  18. 제17항에 있어서, 암이 중피종, 유방암, 폐암, 결장직장암, 위장관암, 자궁내막암, 담관암 및 췌장암으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  19. 제17항에 있어서, 하기 단계를 추가로 포함하는, 방법:
    환자로부터의 신체 샘플을 SEQ ID NO: 7-12의 아미노산 서열을 포함하는 항체와 접촉시킴으로써 환자에서 메조텔린 에피토프의 존재를 검출하는 단계.
  20. 제17항에 있어서, 환자가 건강한 인간 집단에 비해 높은 수준의 CA125를 갖는, 방법.
  21. 제17항에 있어서, 복수의 환자가 이중특이적 항체를 투여함으로써 치료되고, 당해 복수의 환자는 건강한 인간 집단에 비해 높은 수준의 CA125를 갖는 적어도 1명의 환자 및 정상 수준의 CA125를 갖는 적어도 1명의 환자를 포함하는, 방법.
  22. 아미노산 서열 SEQ ID NO: 7-12를 포함하는 메조텔린-결합 부분 및 세포 표면 항원 CD3-결합 부분을 포함하는 이중특이적 항체(BSP).
  23. 제22항에 있어서, 세포 표면 항원 CD3-결합 부분이 CDR 아미노산 서열 SEQ ID NO: 13-18을 포함하는, 이중특이적 항체.
  24. 제22항에 있어서, SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열을 포함하는 인간 세포 표면 항원 CD3을 인식하는 단일 사슬 항체에 융합된 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열을 포함하는 항-메조텔린 항체의 경쇄를 포함하는 이중특이적 항체.
  25. 제22항에 있어서, 이중특이적 항체는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열을 포함하는 항-메조텔린 항체의 경쇄를 포함하고, 상기 경쇄는 아미노산 GGGGS(SEQ ID NO: 20)의 하나 이상의 단위를 포함하는 스페이서 단위에 의해 CD3 단일 사슬 항체에 연결되는, 이중특이적 항체.
  26. 제22항의 이중특이적 항체를 코딩하는 핵산 벡터.
  27. 제26항에 있어서, SEQ ID NO: 4 및 SEQ ID NO: 5의 핵산 서열을 포함하는, 핵산 벡터.
  28. 제22항의 이중특이적 항체를 코딩하는 하나 이상의 핵산을 포함하는 안정한 세포주.
  29. 제28항에 있어서, 하나 이상의 핵산이 SEQ ID NO: 4 및 SEQ ID NO: 5의 핵산 서열을 포함하는, 안정한 세포주.
  30. 하기를 포함하는, 환자에서 메조텔린-발현 암을 치료하는 방법:
    환자에게 제22항의 이중특이적 항체를 투여하여 메조텔린-발현 암을 치료하는 단계.
  31. 제30항에 있어서, 메조텔린-발현 암이 중피종, 유방암, 폐암, 결장직장암, 위장관암, 자궁내막암, 담관암 및 췌장암으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  32. 제30항에 있어서, 하기 단계를 추가로 포함하는, 방법:
    환자의 신체 샘플을 SEQ ID NO: 7-12의 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하는 항체와 접촉시켜 환자를 시험하여 환자의 암에서 메조텔린 에피토프를 검출하는 단계.
  33. 제30항에 있어서, 복수의 환자가 이중특이적 항체를 투여함으로써 치료되고, 당해 복수의 환자는 건강한 인간 집단에 비해 높은 수준의 CA125를 갖는 적어도 1명의 환자 및 정상 수준의 CA125를 갖는 적어도 1명의 환자를 포함하는, 방법.
  34. 제30항에 있어서, 환자가 건강한 인간 집단에 비해 높은 수준의 CA125를 갖는, 방법.
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