JP2023546791A - がん治療のための代替的にフォーマット化された抗メソテリン抗体の組成物及び使用 - Google Patents

がん治療のための代替的にフォーマット化された抗メソテリン抗体の組成物及び使用 Download PDF

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Abstract

腫瘍は、宿主の抗腫瘍免疫応答を回避するために複数の機構を利用する。体液性免疫抑制は、その機構の１つである。腫瘍は、抗体又は補体媒介性免疫応答を抑制して自身の生存を強化することができる循環因子を産生する。メソテリンは、免疫抑制性微小環境を呈する腫瘍に関連するいくつかのがん型によって過剰発現される細胞表面タンパク質である。抗メソテリン抗体は、多くの場合、このような免疫抑制性微小環境に供される。しかしながら、代替的にフォーマット化された抗メソテリン抗体は、腫瘍微小環境免疫状態にかかわらず、メソテリン発現がんを殺傷するのに有効である。TIFF2023546791000022.tif102170

Description

発明の技術分野
本発明は、免疫能のある及び免疫抑制性腫瘍微小環境におけるメソテリン発現がんの特異的標的化に有効な治療抗体の分野に関する。特に、本発明は、微小環境免疫状態にかかわらず、がん増殖の阻害において改善された治療有効性を有する抗体ベースの薬剤を含む方法、キット、及び組成物に関する。
発明の背景
腫瘍形成の機構は、調節不全の細胞増殖を増強する変異遺伝子の蓄積と、罹患した患者内での生存を可能にする免疫回避機構の生成との組み合わせを含む。細胞性（主にＴ細胞媒介性を指す）及び体液性（主に抗体媒介性を指す）免疫は、脊椎動物宿主生物が感染性病原体及び調節不全の宿主細胞に対して防御する主要な機構である。過去数年にわたり、がん生物学において、抑制された細胞媒介性免疫を克服できる免疫チェックポイント阻害剤の使用は、腫瘍のサブセットに対する活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞殺傷を引き起こすのに強力な効果を示してきた（Ｈｏｄｉ ＦＳ，ｅｔ ａｌ．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３６３：７１１－７２３，２０１０）。最近のトランスレーショナル研究の結果により、腫瘍は、体液性免疫経路を抑制する因子も産生し、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、補体媒介性細胞傷害（ＣＤＣ）及びオプソニン化などの抗体媒介性機構による腫瘍殺傷効果を抑制することが示されている（Ｖｅｒｇｏｔｅ Ｉ，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ３４：２２７１－２２７８；Ｋｌｉｎｅ ＪＢ，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ５：１５，２０１８；Ｗａｎｇ Ｗ ｅｔ ａｌ．Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ １５２：１６９－１７９，２０１７；Ｋｌｉｎｅ ＪＢ ｅｔ ａｌ．Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．４８：１８７２－１８８２，２０１８；Ｄａｉ Ｓ，ｅｔ ａｌ．ＰＬｏｓ Ｐａｔｈｏｇ ９：ｅ１００３１１４，２０１３；Ｍｅｌｅｒｏ Ｉ，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｃａｎｃｅｒ ７：９５－１０６，２００７）。体液性免疫経路を抑制する因子は、ＡＤＣＣ及びＣＤＣを介して腫瘍殺傷効果を示すことが報告されている臨床的に使用される治療抗体、例えば、限定されないが、リツキシマブ、オビヌツズマブ、トラスツズマブ、ペルツズマブ、セツキシマブ、アレムツズマブ、及びいくつかの実験的抗体などの効果を阻害する（ＤｉＬｉｌｌｏ ＤＪ，Ｒａｖｅｔｅｃｈ ＪＶ，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｓ ３：７０４－７１３，２０１５；Ｒｕｃｋ Ｔ，ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔ Ｊ Ｍｏｌ Ｓｃｉ １６：１６４１４－１６４３９，２０１５；Ｐｅｌａｉａ Ｃ，ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｍｅｄ Ｒｅｓ Ｉｎｔ ４８３９２３０：１－９，２０１８；Ｚｈｏｕ Ｘ，ｅｔ ａｌ．Ｏｎｃｏｌｏｇｉｓｔ １３：９５４－９６６，２００８；Ｈｓｕ ＹＦ，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ ９：－８，２０１０；Ｓｐｉｒｉｄｏｎ ＣＩ，ｅｔ ａｌ．Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ８：１７２０－１７３０，２００２；Ｋｌｉｎｅ ＪＢ，ｅｔ ａｌ．Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ４８：１８７２－１８８２，２０１８；Ｙａｍａｓｈｉｔａ－Ｋａｓｈｉｍａ Ｙ，ｅｔ ａｌ．Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １７：５０６０－５０７０，２０１１）。抗体媒介性体液性免疫応答は、抗体と細胞表面抗原との会合の協調によって制御される。この相互作用が最適な場合、細胞表面に結合した抗体は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞又は樹状／骨髄／単球細胞（本明細書において、ＡＤＣＣに関与する細胞はいずれも「免疫エフェクター細胞」と称される）上の活性型Ｆｃγ受容体と会合する。この会合は、ＡＤＣＣを開始するだけでなく、Ｃ１ｑ補体開始タンパク質と会合して古典的補体ＣＤＣ経路を介して、及び食細胞によるオプソニン化を通じて、抗体結合細胞の殺傷を引き起こす（Ｒｅｕｓｃｈｅｎｂａｃｈ Ｍ，ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ ５８：１５３５－１５４４，２００９）。体液性免疫応答の阻害剤は、治療抗体がこれらの機構を使用する能力を低下させ、その治療有効性を減少させる（Ｗａｎｇ Ｗ，ｅｔ ａｌ．Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ １５２：１６９－１７９，２０１７；Ｋｌｉｎｅ ＪＢ，ｅｔ ａｌ．Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ４８：１８７２－１８８２，２０１８；Ｆｅｌｄｅｒ Ｍ，ｅｔ ａｌ．Ｇｙｎ Ｏｎｃｏｌ １５２：６１８－６２８，２０１９）。
ＭＵＣ１６／ＣＡ１２５タンパク質（本明細書ではＣＡ１２５と称される）は、ＳＩＧＬＥＣファミリーの負の免疫調節受容体に結合して、ＮＫ細胞の活性化を抑制することにより（Ｂｅｌｉｓｌｅ ＪＡ，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ ９：１４７６－４５９８，２０１０）、並びにＩｇＧ１、ＩｇＧ３及びＩｇＭ型抗体のサブセットに直接結合することにより、体液性免疫応答を抑制する。抗体への結合により、Ｆｃ領域が撹乱され、ＩｇＧ１及びＩｇＧ３型抗体が免疫エフェクター細胞上の活性型Ｆｃγ受容体ＦＣＧＲ２Ａ（ＣＤ３２ａとも称される）及びＦＣＧＲ３Ａ（ＣＤ１６ａとも称される）と会合する効果が低下し、かつ／又は３つ全ての抗体クラスがＣ１ｑを含む補体媒介性タンパク質と会合する能力が撹乱される（Ｐａｎｔａｎｋａｒ ＭＳ，ｅｔ．ａｌ．γＧｙｎｃｏｌ Ｏｎｃｏｌ ９９：７０４－７１３，２００５；Ｋｌｉｎｅ ＪＢ，ｅｔ ａｌ．ＯｎｃｏＴａｒｇｅｔ ８：５２０４５－５２０６０，２０１７；Ｋｌｉｎｅ ＪＢ，ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．５：１５，２０１８；Ｗａｎｇ Ｗ，ｅｔ ａｌ．Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ １５２：１６９－１７９，２０１７；Ｋｌｉｎｅ ＪＢ，ｅｔ ａｌ．Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．４８：１８７２－１８８２，２０１８）。これらの研究には、免疫エフェクター機構にその薬理学的活性を依存している実験的な抗がん抗体の臨床試験が含まれる。これらの臨床研究において、ＣＡ１２５レベルが臨床転帰と相関することが見出されている（Ｖｅｒｇｏｔｅ Ｉ，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ３４：２２７１－２２７８，２０１６；Ｎｉｃｏｌａｉｄｅｓ ＮＣ，ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌ Ｔｈｅｒ １３：１－２２，２０１８）。濾胞性リンパ腫を有する患者における臨床的に使用されるリツキシマブ抗体に関する研究では、ＣＡ１２５レベルが正常範囲にある場合、ＣＡ１２５レベルが正常範囲を上回る患者と比較して、５年の無増悪生存期間で３１．４％の改善が観察された（Ｐｒｏｃｈａｚｋａ Ｖ，ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔ Ｊ Ｈｅｍａｔｏｌ ９６：５８－６４，２０１２）。免疫能のある及び免疫抑制性微小環境を有する腫瘍を効果的に殺傷することができる薬剤を開発することは、当該技術分野において引き続き必要である。
メソテリンは、中皮腫、肺がん、膵臓がん、卵巣がん、結腸直腸がん、胆管がん、胃がん及び子宮内膜がんを含むいくつかの腫瘍型によって過剰発現される細胞表面タンパク質である。これらの腫瘍型の中には、体液性免疫抑制を呈することが見出されているものがあり、これは、抗体ベースの抗メソテリン療法の効果を減弱させる可能性を秘めている（Ｒｕｍｐ Ａ，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７９：９１９０－９１９８，２００４；Ｈａｓｓａｎ Ｒ，ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ ７：２０－３０，２００７；Ｋａｎｅｋｏ Ｏ，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８４：３７３９－３７４９，２００９；Ｈａｓｓａｎ Ｒ．Ｌｕｎｇ Ｃａｎｃｅｒ ６８：４５５－４５９，２０１０；Ｋｅｌｌｙ ＲＪ，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ｓｕｐｐｌ ３２：６１，２０１４）。特に、肺がん、卵巣がん、膵臓がん、及び中皮腫は、体液性免疫抑制性ＣＡ１２５タンパク質を発現することが報告されている（Ｖｅｒｇｏｔｅ Ｉ，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ３４：２２７１－２２７８，２０１６；Ｎｉｃｏｌａｉｄｅｓ ＮＣ，ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌ Ｔｈｅｒ １３：１－２２，２０１８；Ｌｉｕ Ｌ，Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ．７：５９４３－５９５６，２０１６；Ｃｅｄｒｅｓ Ｓ，ｅｔ．ａｌ．Ｃｌｉｎ Ｌｕｎｇ Ｃａｎｃｅｒ １２：１７２－１７９，２０１１；Ｅｍｏｔｏ Ｓ，ｅｔ ａｌ．Ｇａｓｔｒｉｃ Ｃａｎｃｅｒ １５：１５４－１６１，２０１２）。Ｎｉｃｏｌａｉｄｅｓ ｅｔ ａｌ（２０１８）は、抗メソテリン抗体であるアマツキシマブに標準治療をプラスして使用した第一選択中皮腫治療における第２相臨床試験からの知見において、体液性免疫抑制を報告した。その試験において、アマツキシマブで治療され、ＣＡ１２５が高レベルの患者は、ＣＡ１２５が低レベルの患者よりも無増悪生存期間（ＰＦＳ）及び全生存期間（ＯＳ）の転帰が悪かったため、上に列挙したような体液性免疫抑制がんでは、体液性免疫機能に依存する抗メソテリン抗体の臨床効果は低くなるという考えが支持されている。この機構を克服し、体液性免疫抑制がんの有無にかかわらず、患者に幅広い治療選択肢を提供できる可能性のある新規な抗体ベースの薬剤を開発するための代替戦略が求められている。当該技術分野において、体液性免疫抑制性表現型（例えば、免疫抑制性ＣＡ１２５タンパク質の発現など）を示すメソテリン発現腫瘍型と免疫能のあるメソテリン発現腫瘍型とを殺傷するのに有効な組成物及び方法が必要とされている。
一実施形態は、抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）である。それは、配列番号７～１２に示されるアミノ酸配列を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む抗メソテリン抗体を含む。このような抗メソテリン抗体の１つは、配列番号１及び配列番号２を含む。当該ＡＤＣは、トポイソメラーゼ阻害剤も含む。
別の実施形態は、抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）の一部として、ＣＡ１２５に結合しない抗メソテリン抗体を使用する方法である。この抗メソテリン抗体は、配列番号７～１２に示されるアミノ酸を有するＣＤＲを含む。この抗メソテリン抗体の細胞取り込みは、可溶型又は膜結合型のいずれかのＣＡ１２５に結合する抗メソテリン抗体の細胞取り込みよりも大きい。使用可能な、ＣＡ１２５に結合しないそのような抗メソテリン抗体の１つは、配列番号１及び配列番号２のアミノ酸配列を含む。本方法は、抗メソテリン療法を必要とするヒトにＡＤＣを投与することを含む。本方法はまた、標的細胞中のメソテリンエピトープを検出するためにＡＤＣを使用することも含み得る。
別の実施形態は、メソテリン発現腫瘍を有するがん患者を治療する方法である。患者は、配列番号７～１２に示されるアミノ酸を有するＣＤＲを含む抗メソテリン抗体とトポイソメラーゼ阻害剤とを含む抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）を、患者に投与することにより治療される。使用可能な１つのそのような抗メソテリン抗体は、配列番号１及び配列番号２を含む。
別の実施形態は、配列番号７～１２のアミノ酸配列を含むメソテリン結合部分と、ヒト細胞表面抗原ＣＤ３結合部分とを含む二重特異性抗体（ＢＳＰ）である。
別の実施形態は、患者においてメソテリン発現がんを治療する方法である。配列番号７～１２のアミノ酸配列を含むメソテリン結合部分と、ヒト細胞表面抗原ＣＤ３結合部分とを含む二重特異性抗体（ＢＳＰ）は、患者に投与され、それによりメソテリン発現がんを治療する。
本発明の一態様は、配列番号１［ＭＥＳ軽鎖］及び配列番号２［ＭＥＳ重鎖］に示されるアミノ酸配列を含む抗体である。免疫抑制性ＣＡ１２５タンパク質によって結合される抗体は著しく減少するので、抗体の内在化が増強される。これは、この抗体が抗体－薬物コンジュゲートの一部である場合、ＡＤＣ媒介性腫瘍細胞殺傷に特に有用である。
本発明の別の態様は、配列番号１［ＭＥＳ軽鎖］及び配列番号２［ＭＥＳ重鎖］に示されるアミノ酸配列を含む抗体であって、該抗体は、免疫応答性及び免疫抑制性メソテリン発現がん細胞を殺傷するその能力について選択された細胞傷害性化合物にコンジュゲートされている。細胞傷害性化合物は、トポイソメラーゼ阻害剤、微小管阻害剤、アルキル化剤又はキナーゼ阻害剤であり得る。このコンジュゲートは「ＭＥＳ－ＡＤＣ」と称される。
本発明の別の態様は、配列番号１９［ＭＥＳ軽鎖］及び配列番号５［ＭＥＳ重鎖］に示されるヌクレオチド配列を有する哺乳動物発現ベクターを含有する安定な細胞株であって、この細胞株によって産生され、その後任意選択で細胞傷害剤に化学的に結合している親ＭＥＳ－１抗体をコードする、細胞株である。
本発明の別の態様は、メソテリン発現がん細胞を有し、かつ健康なヒト集団と比較して高いレベルのＣＡ１２５を発現する患者を治療する方法である。ＭＥＳ－ＡＤＣ抗体が患者に投与される。ＭＥＳ－ＡＤＣ抗体は、配列番号１及び配列番号２のアミノ酸配列から構成され、細胞傷害性トポイソメラーゼ阻害剤ＳＮ３８に結合している。抗体－細胞毒は、任意選択で、切断可能リンカーによって共有結合されている。
本発明の更に別の態様は、メソテリン発現がん細胞を有し、かつ健康なヒト集団と比較して高いレベルのＣＡ１２５を発現する患者を治療する方法である。ＭＥＳ－ＡＤＣ抗体が患者に投与される。ＭＥＳ－ＡＤＣ抗体は、配列番号１及び配列番号２のアミノ酸配列から構成され、細胞傷害性トポイソメラーゼ阻害剤ＰＮＵ１５９６８２に結合している。抗体－細胞毒は、切断可能リンカーによって共有結合されていてもよい。
一態様では、ＭＥＳ－ＡＤＣは、細胞傷害性ＰＮＵ１５９６８２又はＳＮ３８トポイソメラーゼ阻害剤に結合した配列番号１及び配列番号２から構成される抗体を含む。部分的還元によって生成される上記抗体上の遊離システインへの連結による化学ライゲーションを介して、２以上の細胞毒が抗体に結合されてもよい。システインは、免疫グロブリン配列に内在するものであってもよく、親抗体配列中に組み込まれたものでもよい。
本発明の別の態様では、ＭＥＳ－ＡＤＣ化学ライゲーションは、切断可能リンカー、例えば、限定されないが、Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ＰＡＢ、ＭＡ－ＰＥＧ４－ＶＣ－ＰＡＢ－ＤＭＡＥ、Ｆｍｏｃ－Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ＰＡＢ、Ｆｍｏｃ－Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ＰＡＢ－ＰＮＰ、ＭＣ－Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ＰＡＢ－ＰＮＰ、Ｐｈｅ－Ｌｙｓ（Ｔｒｔ）－ＰＡＢ、Ｆｍｏｃ－Ｐｈｅ－Ｌｙｓ（Ｔｒｔ）－ＰＡＢ、Ｆｍｏｃ－Ｐｈｅ－Ｌｙｓ（Ｔｒｔ）－ＰＡＢ－ＰＮＰ、Ａｌａ－Ａｌａ－Ａｓｎ－ＰＡＢ ＴＦＡ塩、Ｆｍｏｃ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ａｓｎ－ＰＡＢ－ＰＮＰ、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ３－Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ＰＡＢ、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ３－Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ＰＡＢ－ＰＮＰ、Ｐｙ－ｄｓ－Ｐｒｐ－ＯＳｕ、Ｐｙ－ｄｓ－ｄｍＢｕｔ－ＯＳｕ、Ｐｙ－ｄｓ－ｄｍＢｕｔ－ＯＰＦＰ、Ｐｙ－ｄｓ－Ｐｒｐ－ＯＰＦＰ、ＰＥＧ８－トリアゾール－ＰＡＢＣ－ペプチド－ｍｃなどを利用する。これらの化学構造は当該技術分野において公知である。
本発明の別の態様では、ＭＥＳ－ＡＤＣ化学ライゲーションは、酵素的切断不可能リンカー、例えば、限定されないが、ＳＭＣＣ、ＭＡＬ－ＨＡ－ＯＳｕ、ＭＡＬ－ｄｉ－ＥＧ－ＯＰＦＰ、ＭＡＬ－ｔｒｉ－ＥＧ－ＯＰＦＰ、ＭＡＬ－ｔｅｔｒａ－ＥＧ－ＯＰＦＰ、Ｎ３－ｄｉ－ＥＧ－ＯＰＦＰ、Ｎ３－ｔｒｉ－ＥＧ－ＯＰＦＰ、Ｎ３－ｔｅｔｒａ－ＥＧ－ＯＰＦＰ、ＡＬＤ－ＢＺ－ＯＳｕ、ＡＬＤ－ｄｉ－ＥＧ－ＯＳｕ、ＡＬＤ－ｔｅｔｒａ－ＥＧ－ＯＳｕ、ＡＬＤ－ｄｉ－ＥＧ－ＯＰＦＰ、ＡＬＤ－ｔｅｔｒａ－ＥＧ－ＯＰＦＰ、ＭＣ－ＥＤＡ、ＰＨＡ－ｄｉ－ＥＧ－ＯＰＦＰ、ＰＨＡ－ｔｅｔｒａ－ＥＧ－ＯＰＦＰなどを利用する。これらの化学構造は当該技術分野において公知である。
本発明の別の態様では、リンカーは、（ａ）細胞毒への抗体コンジュゲーション；（ｂ）体循環、臓器の実質／間質、及び腫瘍微小環境における安定性；並びに／又は（ｃ）ＭＥＳ－ＡＤＣによる免疫抑制性腫瘍の殺傷の改善、のために最適化されている。
本発明の別の態様では、細胞毒は、抗メソテリン抗体の軽鎖及び重鎖に含まれる１つ以上のリジン残基に結合している。１つのそのような抗体は、配列番号１及び／又は配列番号２に示されるアミノ酸配列を含む。
本発明の別の態様では、細胞毒は、トランスアミド化を介して、配列番号２に含まれる重鎖のＣ末端に結合している。
本発明の別の態様は、配列番号３及び配列番号２（それぞれＭＥＳ－１軽鎖に融合した一本鎖抗ＣＤ３及びＭＥＳ－１重鎖）に示されるアミノ酸配列を含む二重特異性抗体である。二重特異性抗体は、免疫応答性及び免疫抑制性メソテリン発現がん細胞を殺傷することができる。一本鎖抗ＣＤ３抗体は、ＣＤ３＋及び／又はＣＤ８＋リンパ球上に発現される細胞表面抗原を認識する。二重特異性抗体は、本明細書においてＭＥＳ－ＢＳＰ、すなわち、メソテリンを標的とする二重特異性抗体と称される。
本発明の別の態様は、メソテリンを標的とする二重特異性抗体であって、該抗体がＣＡ１２５免疫抑制性タンパク質によって結合されない、二重特異性抗体である。１つのそのような抗体は、配列番号３及び配列番号２のアミノ酸配列を含む。二重特異性抗体を使用して、メソテリン発現がん又はメソテリン発現に関連する他の疾患を治療することができる。
本発明の別の態様は、第２の抗体に遺伝的に結合した配列番号１９［ＭＥＳ軽鎖ｃＤＮＡ］及び配列番号５［ＭＥＳ重鎖ｃＤＮＡ］に示される抗体をコードするヌクレオチド配列を有する、１つ又は複数の哺乳動物発現ベクターを含有する安定な細胞株である。
本発明の別の態様は、メソテリン発現がん細胞を有し、かつ健康なヒト集団と比較して高いレベルのＣＡ１２５を発現する患者を治療する方法である。ＭＥＳ－ＢＳＰ抗体が患者に投与される。ＭＥＳ－ＢＳＰ抗体は、配列番号３及び配列番号２のアミノ酸配列から構成され、二重特異性抗体は、メソテリン及びヒトＣＤ３タンパク質を認識する。
本発明の別の態様は、メソテリン発現がん細胞を有し、かつ健康なヒト集団と比較して高いレベルのＣＡ１２５を発現する患者を治療する方法である。ＭＥＳ－ＢＳＰ抗体が患者に投与される。ＭＥＳ－ＢＳＰ抗体は、配列番号１及び配列番号２のアミノ酸配列と、ヒトＣＤ８タンパク質を認識することができる抗体とを含む。
本発明の更に別の態様では、配列番号１のアミノ酸配列及び配列番号２のアミノ酸配列を含む抗体が、ヒトＩｇＧ１軽鎖（配列番号１）のＮ末端及び／又はＩｇＧ重鎖（配列番号２）のＮ末端に融合された配列番号６のアミノ酸配列を含む一本鎖抗体に融合され、これにより、メソテリン（Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ ＩＤ：１０２３２）及びＣＤ３イプシロン（ＣＤ３Ｅ）タンパク質（Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ ＩＤ：９１６）に結合することができる二重特異性抗体がもたらされる。これを本明細書ではＭＥＳ－ＢＳＰと称する。
本発明の別の態様では、リンカーを介して結合した配列番号１のアミノ酸配列と配列番号６のアミノ酸配列との融合により、配列番号３からなる軽鎖融合ポリペプチドがもたらされ、これは配列番号２と組み合わされて、（ａ）ＣＡ１２５の存在又は非存在下で標的がん細胞上のメソテリンに、及び（ｂ）リンパ系細胞上のＣＤ３Ｅに、結合することができ、標的細胞の殺傷をもたらす、機能的ＭＥＳ－ＢＳＰが作製される。リンカーは、アミノ酸、ポリペプチド又は非生物学的な化学化合物であり得る。
本発明の更に別の態様は、配列番号７、８、９；配列番号１０、１１、１２；配列番号１３、１４、１５；及び配列番号１６、１７、１８（最大３つのアミノ酸が１つ以上のＣＤＲ内で改変され得る）のアミノ酸配列を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むＭＥＳ－ＢＳＰである。
本発明の別の態様では、配列番号３中のリンカーは、（ａ）ＩｇＧ１重鎖（配列番号２）との標準的な抗体形成、及び／又は（ｂ）ＭＥＳ－ＢＳＰによる免疫抑制性腫瘍の殺傷の改善のために最適化され、該リンカーは、抗メソテリン軽鎖（配列番号１）及び抗ＣＤ３Ｅ一本鎖（配列番号６）の空間距離を最大化するために、２０個の天然アミノ酸単位の任意の組み合わせを含む。
本発明の別の態様では、ＭＥＳ－ＢＳＰは、配列番号２の重鎖のＮ末端に遺伝的に結合した抗ＣＤ３Ｅ一本鎖を含む。リンカーは、（ａ）ＩｇＧ１軽鎖（配列番号１）との標準的な抗体形成、及び／又は（ｂ）ＭＥＳ－ＢＳＰによる免疫抑制性腫瘍の殺傷の改善のために最適化され、該リンカーは、抗メソテリン重鎖（配列番号２）及び抗ＣＤ３Ｅ一本鎖（配列番号６）の空間距離を最大化するために、２０個の天然アミノ酸単位の任意の組み合わせを含む。
本発明の別の態様は、第２の抗体に遺伝的に結合したＭＥＳ－１抗体をコードする配列番号５及び配列番号４に示されるヌクレオチド配列を有する哺乳動物発現ベクターを含有する安定な細胞株である。
本発明の別の態様は、ウサギＩｇＧ骨格にグラフトされた配列番号７～１２のＣＤＲアミノ酸配列を有する抗体である（本明細書ではｒＭＥＳ－１と称される）。当該抗体は、ＣＡ１２５タンパク質によって結合されない。
本発明の別の態様は、ＣＡ１２５によって結合されない抗体を用いて、患者においてメソテリンを発現する腫瘍を監視するための方法である。患者由来の体液又は組織試料を、配列番号７～１２のＣＤＲを含有する抗体、例えば、抗体ｒＭＥＳ－１と接触させる。メソテリン陽性の患者は、ＭＥＳ－ＡＤＣ又はＭＥＳ－ＢＳＰで治療され得る。
本発明の別の態様では、免疫能のある及び免疫抑制性メソテリンがんを治療するためのキットが提供される。キットは、好ましくは齧歯類ＩｇＧ骨格にグラフトされた配列番号７～１２のＣＤＲを含有する抗体を含む。抗体は、生検組織での免疫組織化学（ＩＨＣ）を介して、又は循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）でのフローサイトメトリを介して、腫瘍のメソテリン発現について監視するために使用され得る。陽性シグナルが検出された場合、患者は細胞毒に化学的に結合した配列番号１及び配列番号２のアミノ酸配列を含むＭＥＳ－ＡＤＣで治療され得、該細胞毒はトポイソメラーゼ阻害剤であり得る。診断用抗体及び治療用抗体の両方が、キット中に提供され得る。
本発明の別の態様では、免疫能のある及び免疫抑制性メソテリンがんを治療するためのキットが提供される。キットは、齧歯類ＩｇＧ骨格に優先的にグラフトされた配列番号７～１２のＣＤＲを含有する抗体を含む。抗体は、生検組織でのＩＨＣを介して、又は循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）でのフローサイトメトリを介して、腫瘍のメソテリン発現について監視するために使用され得る。陽性シグナルが検出された場合、患者は配列番号２及び配列番号３からなるＭＥＳ－ＢＳＰで治療され得る。診断用抗体及び治療用抗体の両方が、キット中に提供される。
本発明の別の態様は、ＭＥＳ－ＡＤＣの使用であって、該ＭＥＳ－ＡＤＣが、単剤として、又は標準治療化学療法と組み合わせて、サブセットがＣＡ１２５を発現する患者に投与される、ＭＥＳ－ＡＤＣの使用である。ＣＡ１２５の発現は、当業者によって使用される方法を介して血清分析又は生検を使用して決定され得る。
本発明の別の態様は、ＭＥＳ－ＢＳＰの使用であって、該ＭＥＳ－ＢＳＰが、単剤として、又は標準治療化学療法と組み合わせて、サブセットがＣＡ１２５を発現する患者に投与される、ＭＥＳ－ＢＳＰの使用である。ＣＡ１２５の発現は、当該技術分野で既知の方法を介して血清分析又は生検を使用して決定され得る。
本明細書を読めば当業者に明らかとなる本発明のこれら及び他の態様は、腫瘍微小環境の免疫状態にかかわらず、メソテリン発現がんを有する患者における治療応答を改善するのに使用するための方法、組成物、及びキットを提供するものである。ＣＡ１２５阻害に関するＭＥＳ－ＡＤＣ及び／又はＭＥＳ－ＢＳＰ薬剤の不応性は、この治療の改善に寄与している。
免疫抑制性ＣＡ１２５タンパク質によって結合されない抗メソテリン抗体についてのスクリーニング；ＭＥＳ－１抗体（配列番号１及び２）の同定。簡単に説明すると、９６ウェルＥＬＩＳＡプレートを１５ＫＵ／ｍＬの可溶性ＣＡ１２５、陽性対照として１μｇ／ｍＬの組換えヒトメソテリンタンパク質、陰性対照として１μｇ／ｍＬのヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）でコーティングし、２．５μｇ／ｍＬの異なる抗メソテリン抗体でプローブし、ＣＡ１２５によって結合されるかどうかを判定した。ウェルを洗浄し、二次抗ヒト又は抗齧歯類Ｆｃ－西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲート抗体と、３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質を介して結合を検出した。０．１ＮのＨ２ＳＯ４を使用して反応を停止し、マルチウェルプレートリーダー（Ｖａｒｉｏｓｋａｎ（商標），ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して４５０ｎｍでウェルを定量した。示されるように、配列番号１及び２からなる抗体ＭＥＳ－１［Ａｂ－３（レーン３）］は、ＣＡ１２５によって結合されなかったが、試験された他の４つの抗メソテリン抗体は全て、ＣＡ１２５によって結合された。値は、３連のウェルの平均から決定した。統計分析はスチューデントのＴ検定を使用して実施した。 これらの結果は、ＣＡ１２５によって結合される抗メソテリン抗体（図１ＡのＡｂ－４を参照）とは対照的に、ＣＡ１２５によって結合されない抗メソテリン抗体（図１ＡのＡｂ－３を参照）の取り込みが増強されたことを実証する。抗体の内在化を測定するために、ｐＨｒｏｄｏ（商標）蛍光アッセイ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用し、ｐＨ感受性蛍光色素をＣＡ１２５不応性Ａｂ－３（本明細書ではＭＥＳ－１とも称される）及びＣＡ１２５感受性Ａｂ－４抗体にコンジュゲートした。抗体は、メソテリン及び膜結合型ＣＡ１２５を発現するヒト卵巣がん細胞株ＯＶＣＡＲ３と共にそれぞれをインキュベートすることによって、取り込みについて試験した。親株を使用して、ｓｈＲＮＡによる同質遺伝子ＣＡ１２５ノックダウン株（ＯＶＣＡＲ３－ＫＯと称される）を作出した。Ａｂ－３及びＡｂ－４取り込みの両方を、黒色９６ウェルマイクロプレート中、反復実験で（in replica）、２４時間にわたって細胞内蛍光をＶａｒｉｏｓｋａｎ（商標）プレートリーダーで測定することで測定した。図示されるように、Ａｂ－３（ＭＥＳ－１）は両細胞株において同様に取り込まれたが、一方、Ａｂ－４はＯＶＣＡＲ－ＫＯ細胞においてはＡｂ－３と同様に取り込まれたものの、ＣＡ１２５を発現する親ＯＶＣＡＲ３においては同様ではなかった。これは、ＣＡ１２５不応性Ａｂ－３とは対照的な、ＣＡ１２５を介したＡｂ－４取り込みの悪影響を示している。統計分析は、両側スチューデントＴ検定を使用して実施した。 細胞傷害性ペイロード及びリンカーを、免疫能のある及び免疫抑制性メソテリン発現がん細胞の最適な殺傷のための再フォーマット化されたＭＥＳ－１を開発するために試験した。図２Ａは、免疫抑制性及び免疫能のあるメソテリン発現標的細胞に対して試験された様々なタイプの細胞傷害性ペイロード（すなわち、微小管阻害剤、ＤＮＡアルキル化剤、トポイソメラーゼ阻害剤、及びプロテインキナーゼ阻害剤。例えば、Ｙａｇｈｏｕｂｉ Ｓ，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ ２３５：３１－６４，２０１９Ｗａｎｇ ＲＥ，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ １３７：３２２９－３２３２，２０１５を参照）の化学構造を提供する。図２Ｂは、免疫抑制性及び免疫能のあるメソテリン発現標的細胞に対するＭＥＳ－ＡＤＣを作製するために試験された様々な酵素的切断可能及び酵素的切断不可能及び切断不可能であるリンカーの化学構造を提供する。図２Ｃは、メソテリン発現がん細胞又は対照細胞株（表１）に対する、可能性のあるＡＤＣペイロードの細胞傷害性の概要を提供する。簡単に説明すると、９６ウェル組織培養プレートに、７．５％熱不活性化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加した１００μＬのＲＰＭＩ中、５，０００細胞／ウェルのメソテリン陽性ＮＣＩ－Ｎ８７（ＣＡ１２５＋胃がん）、ＳＷ１９９０（ＣＡ１２５＋膵臓がん）、ＨＡＹ（ＣＡ１２５＋中皮腫）、ＹＯＵ（ＣＡ１２５－中皮腫）、ＯＶＣＡＲ３（ＣＡ１２５＋卵巣がん）及びＡ５４９（メソテリン陰性肺がん）細胞と、０．０００１～５００ｎｇ／ｍＬの細胞毒又は陰性対照を播種した。培養物を３７℃、５％ＣＯ２で７２時間インキュベートし、次いで、クリスタルバイオレット染色を使用して生存率について定量化した。乾燥させた染色したウェルを、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の１％ＳＤＳを使用して可溶化し、５７０ｎｍで、Ｖａｒｉｏｓｋａｎ（商標）マルチウェルプレートリーダーで比色デンシトメトリーによって定量化した。試験したいくつかの細胞毒は、ＣＡ１２５発現にかかわらず、メソテリン標的細胞を有意に殺傷することができ、非メソテリン発現対照細胞Ａ５４９及びＣＨＯ（図示せず）も同様であった。示されるように、微小管阻害剤ＭＭＡＥ、並びにトポイソメラーゼ阻害剤ＳＮ３８及びＰＮＵ１５９６８２は、０．００８～５ｎｇ／ｍＬの範囲のＥＣ５０で最高の効力を有することが見出された。実験は、少なくとも３連のウェルを表す。統計分析は、両側スチューデントＴ検定を使用して実施した。 図２Ａの説明を参照。 図２Ａの説明を参照。 ＭＥＳ－１及びＭＥＳ－ＡＤＣ組成物、精製、及び構造分析。図３Ａは、ＣＨＯ－ＧＳ産生及びプロテインＡ精製ＭＥＳ－１抗体の分析を示す。精製されたＭＥＳ－１のサイズ排除（ＳＥＣ）ＨＰＬＣ分析により、高度に均質な抗体種が実証され、これは、所望の薬物：抗体比（ＤＡＲ）を有する均質な抗体薬物コンジュゲートを作製するための必要条件である。図３Ｂは、切断可能リンカーを使用したＳＮ３８－ＭＥＳ－ＡＤＣ及びＰＮＵ－ＭＥＳ－ＡＤＣ組成物の概略図を提供する。図３Ｃは、疎水性相互作用クロマトグラフィ（ＨＩＣ－ＨＰＬＣ）及びサイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ－ＨＰＬＣ）によって決定されたＳＮ３８－ＭＥＳ－ＡＤＣ及びＰＮＵ－ＭＥＳ－ＡＤＣのＤＡＲ均質性を示す。いずれのＭＥＳ－ＡＤＣも、ＭＥＳ－１の部分的還元及びシステインライゲーションによって作製された。ＤＡＲは、ＨＩＣピーク面積及び保持時間から計算した。示されるように、ＳＮ３８－ＭＥＳ－ＡＤＣ及びＰＮＵ－ＭＥＳ－ＡＤＣは、これらのＡＤＣの両方を所望のＤＡＲ２～６で作製するための再現性の代表的なプロファイルを提供する。 図３Ａの説明を参照。 図３Ａの説明を参照。 ＭＥＳ－ＡＤＣコンジュゲートフォーマット、並びにインビトロ及びインビボでの標的細胞殺傷。図４Ａは、図２Ｃの遊離細胞毒毒性アッセイから観察された２つの最も強力な細胞毒、ＳＮ３８及びＰＮＵ１５９６８２を含有するＭＥＳ－ＡＤＣを介した標的細胞殺傷を示す。切断可能リンカーを使用してＭＥＳ－ＡＤＣを作製し、表１に列挙される様々な標的及び対照細胞株の殺傷について試験した。アッセイは図２Ｃに記載のように行った。簡単に説明すると、９６ウェル組織培養プレートに、５，０００細胞／ウェルのメソテリン陽性ＮＣＩ－Ｎ８７、ＳＷ１９９０、ＨＡＹ、ＹＯＵ、ＯＶＣＡＲ３、ＣＨＯ－ＭＥＳと、陰性対照としてメソテリン陰性Ａ５４９及びＣＨＯ細胞を播種した。細胞を、７．５％熱不活性化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加した１００μＬのＲＰＭＩ中、限界希釈（０．０１～１００ｎｇ／ｍＬの範囲）を介した様々な濃度のＭＥＳ－ＡＤＣと共に、又は陰性対照化合物と共に、培養した。培養物を３７℃、５％ＣＯ２で７２時間インキュベートし、次いで、クリスタルバイオレット染色によって生細胞を定量化した。乾燥させた染色したウェルを、ＰＢＳ中の１％ＳＤＳを使用して可溶化し、５７０ｎｍで、Ｖａｒｉｏｓｋａｎ（商標）マルチウェルプレートリーダーで比色デンシトメトリーによって定量化した。示されるように、ＳＮ３８－ＭＥＳ－ＡＤＣ及びＰＮＵ－ＭＥＳ－ＡＤＣは、ＣＡ１２５発現状態にかかわらず、メソテリンを発現する全ての標的細胞にわたって最も有意な細胞殺傷を示したが、メソテリン陰性株Ａ５４９又はＣＨＯ（図示せず）は影響を受けず、メソテリン発現細胞に対する両方のＡＤＣの選択性及び効力が実証された。次に、本発明者らは、リードＭＥＳ－ＡＤＣを異なるリンカーフォーマットで試験した（図４Ｂ）。ＮＣＩ－Ｎ８７及びＳＷ１９９０細胞を標的細胞として用い、ＰＮＵ－ＭＥＳ－ＡＤＣを代表的なＭＥＳ－ＡＤＣとして用い、酵素的切断可能又は酵素的切断不可能リンカーフォーマットでの効力分析を行った。限界希釈を介して各ＰＮＵ－ＭＥＳ－ＡＤＣの濃度を変えて、上記のように細胞を培養し、増殖させた。示されるように、酵素的切断可能フォーマットのＰＮＵ－ＭＥＳ－ＡＤＣは、非酵素切断可能フォーマットのＰＮＵ－ＭＥＳ－ＡＤＣよりも有意に強力であった（灰色及び青色線）。Ａ５４９メソテリン陰性細胞は、いずれのＡＤＣによっても影響を受けず（図示せず）、ＭＥＳ－ＡＤＣの効力及び標的特異性が再び実証された。図４Ｃ：ＮＣＩ－Ｎ８７、ＳＷ１９９０腫瘍細胞株と、ＰＤＸ由来腫瘍のパネルを、ｒＭＥＳ－１検出抗体及びＣＡ１２５市販抗体を使用してＩＨＣを介してメソテリン発現についてスクリーニングして、これら２つの重要なタンパク質の発現プロファイルがインビボで維持されているかを確認した。異種移植片から腫瘍断片として取り出されたＮＣＩ－Ｎ８７及びＳＷ１９９０細胞株の両方は、両方のタンパク質の発現を維持した。複数の試料をスクリーニングした後、２つのＰＤＸ腫瘍断片が、同様のレベルのメソテリン発現を有するものとして同定され、一方は、強いレベルのＣＡ１２５も発現した（中皮腫＃ＰＸＦ１１１８）が、他方は、検出不可能な発現を示した（非小細胞肺腺がん（ＮＳＣＬＣ）＃ＬＸＦＡ９８３）。図４Ｄ：インビボでのＳＮ３８－ＭＥＳ－ＡＤＣ及びＰＮＵ－ＭＥＳ－ＡＤＣの試験。最初に、１×１０７個の腫瘍細胞を、ＳＷ１９９０細胞の場合は複数の無胸腺ヌードマウス、Ｎ８７細胞の場合はＳＣＩＤマウスの側腹部に注射した。測定可能な腫瘍病変（１００ｍｍ３超）が確立されたら、マウスを群に分け、切断可能及び切断不可能ＰＮＵ－ＭＥＳ－ＡＤＣフォーマット、ＳＮ３８－ＭＥＳ－ＡＤＣ、及び陰性対照としてＰＢＳを使用して、腫瘍殺傷について試験した。示されるように、切断可能なＳＮ３８－ＭＥＳ－ＡＤＣ及びＰＮＵ－ＭＥＳ－ＡＤＣフォーマットの両方が、酵素的切断不可能フォーマット（図示せず）よりも、インビボで有意により有効であることが判明し（上パネル：ＳＮ３８－ＭＥＳ－ＡＤＣ １０ｍｇ／ｋｇでＰ＜０．０４９、２０ｍｇ／ｋｇでＰ＜０．０００３；下パネル：ＰＮＵ－ＭＥＳ－ＡＤＣ Ｐ＜０．０１１）、これは、インビトロ標的細胞殺傷効果を反映している。図４Ｅ：切断可能なＰＮＵ－ＭＥＳ－ＡＤＣを、免疫能のあるＬＸＦＡ９８３（ＣＡ１２５低）及び免疫抑制性ＰＸＦ１１１８（ＣＡ１２５高）のＰＤＸ由来腫瘍異種移植片に対して試験し、これらの異なる腫瘍型に対する効力を判定した。腫瘍断片を無胸腺ヌードマウスの側腹部に移植し、ＰＮＵ－ＭＥＳ－ＡＤＣ又はＰＢＳ対照で処置した。示されるように、ＰＮＵ－ＭＥＳ－ＡＤＣは、微小環境免疫（ＣＡ１２５発現）状態にかかわらず、両方の腫瘍を殺傷し、退縮を引き起こすことにおいて等しく有効であった（Ｐ＜０．０１２）。実験は、インビトロアッセイの場合は少なくとも３連のウェルを表し、インビボアッセイの場合は少なくとも５体の対象を表す。統計分析は、両側スチューデントＴ検定を使用して実施した。 図４Ａの説明を参照。 図４Ａの説明を参照。 図４Ａの説明を参照。 図４Ａの説明を参照。 ＣＡ１２５陽性メソテリン発現ＰＸＦ１１１８腫瘍に対する切断可能なＰＮＵ－ＭＥＳ－ＡＤＣの単回投与及び複数回投与並びにその抗腫瘍効果。腫瘍断片を無胸腺ヌードマウスの側腹部に移植し、平均サイズが１００ｍｍ３になるまで成長させた。同様の腫瘍サイズのセットを有するマウスを６匹ずつ４セットに群分けし、無作為化後１日目、８日目、１５日目にＰＢＳ、０．２５ｍｇ／ｋｇのＰＮＵ－ＭＥＳ－ＡＤＣ又は３０μｇ／ｋｇの遊離型ＰＮＵ１５９６８２で処置した。０．７５ｍｇ／ｋｇのＰＮＵ－ＭＥＳ－ＡＤＣを使用する第４の群には、無作為化後１日目に単回用量を与え、腫瘍増殖について５０日を超えてマウスを監視した。示されるように、単回投与ＰＮＵ－ＭＥＳ－ＡＤＣは、ＰＢＳ又は遊離薬物で処置されたマウスとは対照的に、複数回投与ＰＮＵ－ＭＥＳ－ＡＤＣ処置マウスと同様に、腫瘍を殺傷し、退縮を引き起こし、５０日を超えて持続的応答を維持するのに等しく有効であった（Ｐ≦０．００６１）。実験は、１群当たり６体の対象を表す。統計分析は、両側スチューデントＴ検定を使用して実施した。 免疫抑制性がん細胞に対するＭＥＳ－ＢＳＰ及び対照抗体のＡＤＣＣ活性。免疫抑制性がん細胞のＭＥＳ－ＢＳＰ免疫媒介性標的化の効果を試験するために、初代末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を用いたＡＤＣＣアッセイ及びＪｕｒｋａｔ－ＣＤ１６ａ ＡＤＣＣレポーターアッセイを採用した。図６Ａでは、ＭＥＳ－ＢＳＰ、ＭＥＳ－１及び抗メソテリンｍｅｓｏ－Ａｂ－４（図１Ａ、レーン４を参照）抗体を、メソテリンを発現し、多量の免疫抑制性ＣＡ１２５タンパク質を産生するヒトＯＶＣＡＲ３卵巣がん細胞株のＰＢＭＣ免疫媒介性殺傷について試験した。簡単に説明すると、９６ウェル黒色プレートにおいてウェル当たり１０，０００個のＯＶＣＡＲ３細胞を、７．５％ウシ胎児血清及び１％Ｌ－グルタミン（Ｒ７．５）を添加した６５μＬのＲＰＭＩ中で一晩培養した。翌日、Ｒ７．５培地中、３５μＬの様々な濃度のＭＥＳ－ＢＳＰ、ＭＥＳ－１、及びｍｅｓｏ－Ａｂ－４と２．５×１０７個のＰＢＭＣを各ウェルに加え、プレートを３７℃、５％ＣＯ２で７２時間インキュベートした。その後、ウェルを２５０μＬのＲ７．５培地で３回洗浄してＰＢＭＣを除去し、付着したＯＶＣＡＲ３標的細胞の生存率を、製造元（Ｐｒｏｍｅｇａ）の指示に従いＣｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ ＧＬＯ（登録商標）を介して、Ｖａｒｉｏｓｋａｎ（商標）発光プレートリーダーで定量化した。示されるように、ＭＥＳ－１抗体及びＭＥＳ－ＢＳＰ抗体は両方とも、ｍｅｓｏ－Ａｂ－４とは対照的に腫瘍細胞殺傷を示したが、ＭＥＳ－ＢＳＰは、有意に最も高い標的細胞殺傷を示した。これにより、ＢＳＰフォーマットのＭＥＳ－１の能力が、免疫媒介性標的化を利用した場合に親ＭＥＳ－１単独よりも増強された殺傷を提供することが実証された。ＡＤＣＣ活性に対する免疫抑制性ＣＡ１２５タンパク質の影響を決定するために、ＭＥＳ－１及びｍｅｓｏ－Ａｂ－４抗体を、ＯＶＣＡＲ３細胞と、前述のようにｓｈＲＮＡベクターＴＲＣＮ００００２６２６８６（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて作出されたＯＶＣＡＲ３－ＣＡ１２５ノックダウン（ＯＶＣＡＲ－ＫＯ）細胞株（Ｋｌｉｎｅ ＪＢ，ｅｔ．ａｌ．ＯｎｃｏＴａｒｇｅｔ ８：５２０４５－５２０６０，２０１７）について、製造元の指示（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ）に従ってＪｕｒｋａｔ－ＣＤ１６ａ ＡＤＣＣレポーター細胞株を使用して試験した。Ｊｕｒｋａｔ ＡＤＣＣシステムは、ルシフェラーゼリードアウトを採用しており、ルシフェラーゼシグナル強度は、標的細胞に対する抗体のＡＤＣＣ活性を表す。図６Ｂに示されるように、ＭＥＳ－１は、ｍｅｓｏ－Ａｂ－４よりもＯＶＣＡＲ３に対して有意に高いＡＤＣＣ活性を有したが、ＭＥＳ－１及びｍｅｓｏ－Ａｂ－４の両方が、ＯＶＣＡＲ－ＫＯ細胞株に対して同様のＡＤＣＣ活性を有した。これにより、免疫抑制性腫瘍細胞を効果的に殺傷することができる薬剤としてＭＥＳ－１代替フォーマット（すなわち、ＡＤＣ又はＢＳＰ）の天然ＣＡ１２５不応性ＭＥＳ－１親抗体の有用性が実証された。ＭＥＳ－ＢＳＰは、ＯＶＣＡＲ３株及びＯＶＣＡＲ－ＫＯ株の両方に対して等しく有効であった。全ての実験は３連で行った。統計分析は、両側スチューデントＴ検定を使用して実施した。 図６Ａの説明を参照。 ヒト化ＰＢＭＣヌードマウス及びメソテリン陽性ＣＡ１２５発現ヒト中皮腫細胞株を使用して、ＭＥＳ－ＢＳＰをインビボで試験した。０日目に８×１０６個の中皮腫細胞を無胸腺ヌードマウスに移植した。平均病変が約５０ｍｍ３であった１１日目に、１×１０７個のヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を腹腔内投与した。翌日、３ｍｇ／ｋｇのＭＥＳ－ＢＳＰ又はＰＢＳを３週間、３回ＱＯＤで投与し、腫瘍の増殖を監視した（Ｎ＝５）。示されるように、ＭＥＳ－ＢＳＰは、対照処置マウスと比較して、ＣＡ１２５陽性中皮腫腫瘍の７０％の減少を引き起こした（Ｐ＝０．０３３）。統計分析は、両側スチューデントＴ検定を使用して実施した。
発明の詳細な説明
本発明者らは、腫瘍細胞微小環境免疫状態にかかわらず、メソテリン陽性がん細胞を効果的に殺傷することができる新規な治療薬を開発した。特定の理論又は作用機序に限定されることを望まないが、本出願人らは、配列番号１及び２（本明細書ではＭＥＳ－１抗体と称される）並びに配列番号２及び３（本明細書ではＭＥＳ－ＢＳＰ抗体と称される）によってコードされるアミノ酸配列が、以下の両方に負の影響を及ぼす免疫抑制性タンパク質ＣＡ１２５による結合に対して不応性であると考えている。（ａ）抗体媒介性免疫応答（Ｋｌｉｎｅ ＪＢ，ｅｔ．ａｌ．ＯｎｃｏＴａｒｇｅｔ ８：５２０４５－５２０６０，２０１７；Ｋｌｉｎｅ ＪＢ，ｅｔ ａｌ．Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ４８：１８７２－１８８２，２０１８；Ｋｌｉｎｅ ＪＢ，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ５：１５，２０１８；Ｎｉｃｏｌａｉｄｅｓ ＮＣ，ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌ Ｔｈｅｒ １３：１－２２，２０１８）と、（ｂ）抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）の取り込み及び内部への細胞傷害剤の送達（これはＡＤＣを介した強力な標的細胞殺傷の必要条件である）（Ｎｉｃｏｌａｉｄｅｓ ＮＣ，ｅｔ．ａｌ．米国特許出願第１６／９８４，４４４号；Ｃｈａｌｏｕｎｉ Ｃ ａｎｄ Ｄｏｌｌ Ｓ．Ｊ Ｅｘｐ Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ３７：２０－３２，２０１８）。この免疫抑制機構は、影響を受けた抗体へのＣＡ１２５の直接結合が関与していると考えられる（Ｎｉｃｏｌａｉｄｅｓ ＮＣ，ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌ Ｔｈｅｒ １３：１－２２，２０１８）。
加えて、本出願は、腫瘍の微小環境免疫状態にかかわらず腫瘍に対して有効である更なる抗体ベース療法を同定するための方法を提供する。これらには、ＣＡ１２５などの腫瘍産生免疫抑制性タンパク質への結合について親抗体を試験することが含まれる。そのような抗体は、抗体－薬物コンジュゲート又は二重特異性フォーマットにフォーマット化することができ、様々なペイロード並びに遺伝子融合体及び化学リンカーを用いることによって、免疫抑制性微小環境を有する腫瘍の殺傷時の効果を最適化するために経験的に試験することができる。
本明細書に記載の方法及びキットは、当該技術分野で公知の抗原発現試験のための方法を使用して、配列番号７～１２のＣＤＲアミノ酸配列を含有する抗体を用いて患者の腫瘍細胞を試験することによって、ＭＥＳ－ＡＤＣ又はＭＥＳ－ＢＳＰによる治療に適したメソテリン発現患者の適格性を監視及び確認するために使用され得る。
方法、組成物、及びキットは、２つのカテゴリーの抗体フォーマットに分類され得る。１つのカテゴリーでは、細胞傷害剤に化学的に結合した免疫グロブリン軽鎖（配列番号１）及び重鎖（配列番号２）を含むＭＥＳ－ＡＤＣが開発される。ＣＡ１２５による抗体成分への直接結合は、低いか又はゼロである。抗体分子当たりの細胞毒部分の数［薬物：抗体比（ＤＡＲ）と称される］は、コンジュゲーションの方法に応じて変動し得、最小ＤＡＲは２、最大ＤＡＲは１２であり、好ましくは２、３、４、５、又は６である。細胞傷害剤は、トポイソメラーゼ阻害剤ＳＮ３８又はＰＮＵ１５９６８２であり得るが、これらに限定されない。細胞毒部分は、化学リンカー又はペプチドリンカーによって抗体に結合している。リンカーは、当業者に公知であるように、切断可能型又は切断不可能型であり得る。リンカー、細胞毒、及びＤＡＲの所望の組み合わせは、インビトロ及び／又はインビボでのメソテリン腫瘍細胞殺傷に対するＭＥＳ－ＡＤＣの活性を最適化するように経験的に決定することができる。腫瘍細胞生存率は、当該技術分野で使用される方法を用いて決定することができる。
好適な細胞毒には、安全で、好ましくは生分解性のものが含まれるが、これらに限定されない。これらには、モノメチルドラスタチン１０、アウリスタチンＥ、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、アウリスタチンＦ、モノメチルアウリスタチンＦ、ＨＴＩ－２８６、ツブリシンＭ、メイタンシノイドＡＰ－３、メイタンシノール、ＤＭ１、ＤＭ４、Ｂｏｃ－Ｖａｌ－Ｄｉｌ－Ｄａｐ－ＯＨ、Ｂｏｃ－Ｖａｌ－Ｄｉｌ－Ｄａｐ－Ｐｈｅ－Ｏｍｅ、Ｂｏｃ－Ｖａｌ－Ｄｉｌ－Ｄａｐ－Ｄｏｅ、Ｂｏｃ－Ｖａｌ－Ｄｉｌ－Ｄａｐ－Ｎｒｐ、Ｂｏｃ－Ｎ－Ｍｅ－Ｖａｌ－Ｖａｌ－Ｄｉｌ－Ｄａｐ－ＯＨ、ツブリシンＩＭ－１、ツブリシンＩＭ－２、ツブリシンＩＭ－３、ダサチニブ、デュオカルマイシンＳＡ、デュオカルマイシンＴＭ、デュオカルマイシンＭＡ、デュオカルマイシンＤＭ、ネモルビシン、ＰＮＵ－１５９６８２、カリケアミシンγ１、Ｎ－アセチル－カリケアミシンγ１、α－アマニチン、ＰＢＤ－二量体などが含まれるが、これらに限定されない。これらの構造は当該技術分野において公知である。
好適なリンカーには、安全で、好ましくは生分解性のものが含まれるが、これらに限定されない。これらには、Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ＰＡＢ、Ｆｍｏｃ－Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ＰＡＢ、Ｆｍｏｃ－Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ＰＡＢ－ＰＮＰ、ＭＣ－Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ＰＡＢ－ＰＮＰ、Ｐｈｅ－Ｌｙｓ（Ｔｒｔ）－ＰＡＢ、Ｆｍｏｃ－Ｐｈｅ－Ｌｙｓ（Ｔｒｔ）－ＰＡＢ、Ｆｍｏｃ－Ｐｈｅ－Ｌｙｓ（Ｔｒｔ）－ＰＡＢ－ＰＮＰ、Ａｌａ－Ａｌａ－Ａｓｎ－ＰＡＢ ＴＦＡ塩、Ｆｍｏｃ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ａｓｎ－ＰＡＢ－ＰＮＰ、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ３－Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ＰＡＢ、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ３－Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ＰＡＢ－ＰＮＰ、ＭＡＣグルクロニドフェノール、Ｐｙ－ｄｓ－Ｐｒｐ－ＯＳｕ、Ｐｙ－ｄｓ－ｄｍＢｕｔ－ＯＳｕ、Ｐｙ－ｄｓ－ｄｍＢｕｔ－ＯＰＦＰ、Ｐｙ－ｄｓ－Ｐｒｐ－ＯＰＦＰ、ＳＭＣＣ、ＭＡＬ－ＨＡ－ＯＳｕ、ＭＡＬ－ｄｉ－ＥＧ－ＯＰＦＰ、ＭＡＬ－ｔｒｉ－ＥＧ－ＯＰＦＰ、ＭＡＬ－ｔｅｔｒａ－ＥＧ－ＯＰＦＰ、ＭＡ－ＰＥＧ４－ＶＣ－ＰＡＢ－ＤＭＡＥ、ＭＣ－ＥＤＡ、Ｎ３－ｄｉ－ＥＧ－ＯＰＦＰ、Ｎ３－ｔｒｉ－ＥＧ－ＯＰＦＰ、Ｎ３－ｔｅｔｒａ－ＥＧ－ＯＰＦＰ、ＡＬＤ－ＢＺ－ＯＳｕ、ＡＬＤ－ｄｉ－ＥＧ－ＯＳｕ、ＡＬＤ－ｔｅｔｒａ－ＥＧ－ＯＳｕ、ＡＬＤ－ｄｉ－ＥＧ－ＯＰＦＰ、ＡＬＤ－ｔｅｔｒａ－ＥＧ－ＯＰＦＰ、ＰＨＡ－ｄｉ－ＥＧ－ＯＰＦＰ、ＰＨＡ－ｔｅｔｒａ－ＥＧ－ＯＰＦＰ、ＰＥＧ８－トリアゾール－ＰＡＢＣ－ペプチド－ｍｃなどが含まれるが、これらに限定されない。これらの化学構造は当該技術分野において公知である。
一実施形態は、低いＣＡ１２５結合性を有し、ＭＡ－ＰＥＧ４－ＶＣ－ＰＡＢ－ＤＭＡＥ切断可能リンカーによってＰＮＵ１５９６８２トポイソメラーゼ阻害剤に共有結合しているＭＥＳ－１抗体（配列番号１及び２）を含む、ＭＥＳ－ＡＤＣである。
別の実施形態は、低いＣＡ１２５結合性を有し、ＭＡＣグルクロニドフェノール又はＰＥＧ８－トリアゾール－ＰＡＢＣ－ペプチド－ｍｃ切断可能リンカーによってＳＮ３８トポイソメラーゼ阻害剤に共有結合しているＭＥＳ－１抗体（配列番号１及び２）を含む、ＭＥＳ－ＡＤＣである。
抗体フォーマットの別のカテゴリーでは、ＭＥＳ－ＢＳＰ（二重特異性抗体）は、低いＣＡ１２５結合性を有する、ＭＥＳ－１抗体の免疫グロブリン重鎖（配列番号２）及びキメラ軽鎖（配列番号３）を含む。キメラ軽鎖は、ＭＥＳ－１軽鎖（配列番号１）に融合した抗ＣＤ３一本鎖抗体（配列番号６）の遺伝子融合体（アミノからカルボキシルの順）である。抗ＣＤ３一本鎖抗体部分は、２０個の公知の天然又は修飾されたアミノ酸のいずれか１つを含むスペーサーを介して遺伝的に連結され、リンカーは、当該技術分野で公知のように、軽鎖を一本鎖から分離する２つ以上のアミノ酸のものであってもよい。所望のリンカーアミノ酸の組成及び長さは、ヒトＣＤ３＋リンパ球の存在下でのインビトロ及び／又はインビボでのメソテリン腫瘍細胞殺傷に対するＭＥＳ－ＢＳＰの活性を最適化するように経験的に決定することができる。腫瘍細胞生存率は、当該技術分野で公知の様々な方法のいずれかを用いて決定することができる。
治療用途では、ＭＥＳ－ＡＤＣ又はＭＥＳ－ＢＳＰは、単剤療法として、又は標準治療と組み合わせて投与することができる。
本方法を実施する過程で組成物が形成され得る。それらは、予め形成されて、個別にパッケージ化され、スクリーニングするための細胞毒ライブラリを有する実体、又は例えば、ＭＥＳ－１抗体に細胞毒を連結するために様々なリンカーを用いることができる実体に提供され得る。同様に、ここで記載するアッセイ及び方法の構成要素は、一緒に容器にパッケージ化され、キットとして販売され得る。キットの構成要素は、必須ではないが、一緒に混合することができる。それらは、例えば、別々の容器又は分割された容器で提供することができる。任意の検出抗体のセレクション及び本明細書に記載のＭＥＳ－ＡＤＣ又はＭＥＳ－ＢＳＰが、組成物又はキットとして構築され得る。
ＣＡ１２５免疫抑制に感受性の高いいくつかの公知の抗体が存在するが、本明細書に記載される組成物は、ＭＥＳ－ＡＤＣ又はＭＥＳ－ＢＳＰによって、腫瘍微小環境免疫状態にかかわらず、メソテリン発現がんを有する患者を治療するのに有用である。これらの各々は、ＣＡ１２５結合に対して不応性であるＭＥＳ－１親配列（配列番号１～３）のうちの１つ以上を有するため、ＭＥＳ－ＡＤＣフォーマットの場合ＡＤＣ内在化及び殺傷に効果的であり、ＭＥＳ－ＢＳＰフォーマットの場合免疫関連殺傷に効果的である。
いくつかの例において、ＭＥＳ－ＡＤＣは、メソテリン発現がんを有する患者においてその治療域を増強するためにリポソーム中に製剤化される必要があり得る。ＭＥＳ－ＡＤＣの送達のための任意のリポソーム製剤が、患者を治療するために使用されてもよい。従来のリポソームは、カチオン性、アニオン性、又は中性（リン）脂質及びコレステロールで構成される脂質二重層からなり、水性体積を封入する。リポソームの好適な組成物には、共脂質ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）と組み合わされたグアニジニウム－コレステロールカチオン性脂質ビス（グアニジニウム）－ｔｒｅｎ－コレステロール（ＢＧＴＣ）が含まれるが、これに限定されない。好適なリポソーム製剤の別の例は、イミダゾールベースのヘルパー脂質ＭＭ２７を伴うアミノグリコシド脂質ジオレイルスクシニルパロモマイシン（ＤＯＳＰ）である。リポソームは、例えば、ポリエチレングリコールを使用してリポソームをコーティングすることにより、立体的に安定化することができる。
本発明者らは、メソテリン陽性がんを有する患者を同定し、ＭＥＳ－ＡＤＣ又はＭＥＳ－ＢＳＰで治療するための、組成物、キット及び方法を提供する。本方法は、配列番号７～１２のＣＤＲを含むＣＡ１２５不応性ＭＥＳ－１検出抗体を使用して、メソテリン発現について患者の腫瘍を診断するステップを含み得る。このアッセイにおいて陽性である場合、腫瘍は、任意選択でトポイソメラーゼ阻害剤である細胞毒に結合したＭＥＳ－ＡＤＣ（配列番号１及び２）、又はＭＥＳ－ＢＳＰ（配列番号２及び３）で治療され得る。診断及び治療ステップは、独立していてもよいし、連携して実施されてもよい。メソテリンが高度に過剰発現されるがんでは、このような予備スクリーニングの使用は任意であり得る。
別の実施形態は、ＣＤＲ（配列番号７～１２）を含有するＭＥＳ－ＡＤＣであり、これらのＣＤＲ配列のいずれも、それらがＣＡ１２５不応性のままである限り、個別に又は組み合わせで最大３個のアミノ酸によって修飾されてもよい。
別の実施形態では、ＭＥＳ－ＡＤＣの細胞毒は、切断可能リンカーに結合したＳＮ３８又はＰＮＵ１５９６８２である。リンカーは、ＳＮ３８に結合したＰＥＧ８－トリアゾール－ＰＡＢＣ－ペプチド－ｍｃリンカー（Ｃ５０Ｈ７９Ｎ９Ｏ１６）（構築物全体はＳＮ３８－ＭＥＳ－ＡＤＣ－１と称される）、ＳＮ３８に結合したＭＡＣグルクロニドフェノール－リンカー（構築物全体はＳＮ３８－ＭＥＳ－ＡＤＣ－２と称される）、又はＰＮＵ１５９６８２に結合したＭＡ－ＰＥＧ４－ＶＣ－ＰＡＢ－ＤＭＡＥリンカー（構築物全体はＰＮＵ－ＭＥＳ－ＡＤＣと称される）であり得る。
別の実施形態では、ＭＥＳ－１軽鎖（配列番号１）は、アミノ酸ＧＧＧＧＳ（配列番号２０）から構成されるアミノ酸リンカー単位を使用して、ＣＤ３一本鎖（配列番号６）に結合している。リンカーは、１つ以上のリンカー単位で構成される。長さ又はアミノ酸組成に限定されることを望まないが、例として、ＭＥＳ－１軽鎖及び抗ＣＤ３一本鎖は、１つ、２つ、３つ、又はそれ以上の単位に結合し得る。リンカーの最適化は、本明細書に記載の腫瘍細胞殺傷を測定するために当該技術分野で使用される任意の方法を使用して、ＣＤ３＋リンパ球の存在下でメソテリン標的細胞を最適に殺傷することによって決定することができる。
更に別の実施形態では、リンカー単位は、ＭＥＳ－１軽鎖を、免疫能のある又は免疫抑制性微小環境とヒトＣＤ３＋リンパ球とを有するメソテリン陽性腫瘍において腫瘍細胞殺傷を最適化するために経験的に試験され得る抗ＣＤ３一本鎖に遺伝的に連結し得る、既知の天然又は修飾されたアミノ酸の任意の組み合わせ、及び任意の長さを含む。
別の実施形態は、配列番号７～１８のアミノ酸配列を含有するＭＥＳ－ＢＳＰを有し、これらの配列のいずれも、それらがＣＡ１２５結合に対して不応性のままである限り、個別に又は組み合わせで最大３個のアミノ酸によって修飾されてもよい。
いくつかの実施形態では、機能的方法を使用して、様々な遺伝子リンカーを使用してＣＤ３＋リンパ球の存在下でのメソテリン陽性腫瘍細胞の殺傷に対するＭＥＳ－ＢＳＰの効果を最適化する。「効果」という用語は、一般に、ＣＤ３＋リンパ球と比較して、薬剤が単独でインキュベートされた場合の標的細胞殺傷の１０％以上の変化を指す。使用される抗体及び薬剤に応じて、対照と比較して、少なくとも５％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、７０％、又は７５％の変化を指す場合もある。
更に別の実施形態は、様々な細胞毒及び／又はリンカーを有する抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）を、細胞内在化を含む、薬物動態（ＰＫ）、薬力学（ＰＤ）、又は薬理学的（ＰＬ）活性についてスクリーニングするための方法を含む。いくつかの実施形態では、ＡＤＣは、細胞にインビトロで添加され、標的細胞殺傷について試験される。著しい殺傷効果を有するＡＤＣは、治療試験に適している。同様に、効果という用語は、使用される抗体及び薬剤に応じて、対照と比較して、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、７０％、又は７５％の変化を指す場合もある。
本明細書に含まれる態様に関連する様々な用語及び専門用語（「用語」）が、本書の明細書及び特許請求の範囲全体で使用されている。そのような用語は、特に明記しない限り、当該技術分野においてそれらの通常の意味を与えられるべきである。他の具体的に定義された用語は、提供された定義と一致する様式で解釈されるべきである。
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用されるように、「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、及び「その（ｔｈｅ）」という単数形はまた、内容が明確に別段の指示をしない限り、複数形の参照を含む。例として、「細胞（ａ ｃｅｌｌ）」への言及は、２つ以上の細胞の組み合わせ等を含み得る。「プローブ」への言及は、検出抗体、ＭＥＳ－ＡＤＣ、ＭＥＳ－ＢＳＰ、又は当該技術分野で公知の任意の分析方法を介して腫瘍微小環境免疫状態を監視するための独立したプローブを含み得る。
量、期間等の定量化された値を指す時に使用される「約」という用語は、指定された値から最大±９％の変動を包含することを意味しており、なぜなら、開示された方法を実行するためにそのような変動が適切であるからである。別段の指示がない限り、本明細書及び特許請求の範囲で使用される分子量、モル濃度、反応条件、パーセンテージなどの試薬の量を表す全ての値は、全ての場合において「約」という用語によって定量化されるものとして理解されるべきである。したがって、反対の指示がない限り、以下の明細書及び記載された特許請求の範囲に記載の数値は、本発明によって得られることが求められる組成物、薬剤及び／又は方法の所望の特性に応じて変化し得る近似値である。少なくとも、及び本出願の範囲を制限しようとするのではなく、各数値は、報告された有効数字によって、及び当該技術分野で公知の通常の丸め方法によって少なくとも評価されるべきである。
使用される「抗体」という用語は、広い意味で意味され、免疫グロブリン（「Ｉｇ」とも言及される）、又はポリクローナル抗体（ｐＡｂとも言及される）、マウス、ヒト、ヒト化、及びキメラ化ｍＡｂを含むモノクローナル抗体（ｍＡｂとも言及される）、二重特異性抗体（ＢＳＰとも言及される）、抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣとも言及される）、抗体融合免疫毒素、及び抗体断片を含む抗体分子を含む。一般に、抗体は、特定の抗原に結合するタンパク質又はポリペプチド鎖である。抗原は、所与の抗体によって特異的に認識される構造である。標準的な抗体は、ジスルフィド結合及び水素結合の複合を介して並べられた（lined）２つの軽鎖と２つの重鎖で構成されるヘテロテトラマーグリコシル化タンパク質で構成されている。「そのジスルフィド架橋」という用語は、当該技術分野で公知の、重鎖ヒンジ領域内に含まれるジスルフィド架橋を指す。各重鎖には、可変ドメイン（可変領域）（ＶＨ）と、それに続く多数の定常ドメイン（Ｆｃドメインと呼ばれる）がある。各軽鎖には、可変ドメイン（ＶＬ）及び定常ドメインがあり、軽鎖の定常ドメインは重鎖の最初の定常ドメインと整列し、軽鎖ＶＬは重鎖の可変ドメインと整列する。任意の種の抗体軽鎖は、定常ドメイン内のアミノ酸配列に基づいて、２つの異なるタイプ、すなわちカッパ（κ）及びラムダ（λ）のうちの１つに割り当てられる。
「一本鎖」という用語は、当該技術分野で公知の構造を有する一本鎖抗体を指す。
免疫グロブリン軽鎖（ＬＣ）又は重鎖（ＨＣ）は、報告されている配列の変動性に基づいて相補性決定領域（ＣＤＲ）とも称される３つの「抗原結合部位」を間に挟んだ「フレームワーク」領域を含む（Ｗｕ ＴＴ，Ｋａｂａｔ ＥＡ．Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １３２：２１１－２５０，１９７０）。一般に、抗原結合部位は６つのＣＤＲで構成され、３つはＶＨ内にあり（ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３）、３つはＶＬ内にある（ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３）（Ｋａｂａｔ ＥＡ，ｅｔ ａｌ．５ｔｈ Ｅｄ．ＰＨＳ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．，１９９１）。
「特異的結合」又は「特異的に結合する」とは、抗体又は抗原結合断片が、他の抗原に対するよりも高い親和性で抗原（抗体自体に含まれる配列を含む）に結合することを指す。典型的には、特異的抗体又は抗原結合断片は、約５×１０－６Ｍ以下の平衡解離定数ＫＤで標的抗原に結合する。
「抗体誘導体」又は「代替フォーマット」は、ペプチド化学（すなわち、アミド化など）、遺伝子融合、及び／又は典型的には抗体と関連しない翻訳後部分（すなわち、グリコシル、アセチル及び／又はホスホリル）などを介して、別の分子の共有結合によって修飾される、上記で定義される抗体を意味する。
「抗体の動的構造」という用語は、抗体の機能、ＣＡ１２５結合性、又は細胞内在化に影響を与える可能性のある構造の任意の変化を指す。
「モノクローナル抗体（ｍＡｂ）」という用語は、真核生物又は原核生物の細胞クローン、又はファージクローンを含む単一の細胞クローンに由来する抗体を指し、それが産生される方法ではない。したがって、「モノクローナル抗体」という用語は、ハイブリドーマ技術によって産生された抗体に限定されず、組換え法も含み得る。
「Ｆａｂドメイン」は、当該技術分野で公知の、Ｎ末端から抗体ヒンジジスルフィド領域までの任意の抗体配列を指す。
「Ｆｃドメイン」は、当該技術分野で公知の、Ｃ末端から抗体ヒンジジスルフィド領域までの抗体ヒンジジスルフィド領域を含む任意の抗体配列を指す。
「メソテリン」は、メソテリンタンパク質（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＨ０３５１２．１）の全タンパク質又は天然に改変された形態を指す。
「抗原」は、抗体又は抗体断片が特異的に結合する実体である。これには、目的の抗体又はタンパク質への結合が含まれる。
「ＣＡ１２５」という用語は、ＭＵＣ１６遺伝子（ＨＧＮＣ：１５５８２；ＯＭＩＭ：６０６１５４）が産生する遺伝子産物を指し、可溶型と膜結合型が存在する。これは抗体にＦａｂドメイン内で結合し、結合した抗体の体液性免疫機能（Ｋｌｉｎｅ ＪＢ，ｅｔ ａｌ．Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ ８：５２０４５－５２０６０，２０１７）とＡＤＣ取り込みに影響を与えることが報告されている。
「ＣＡ１２５不応性」という用語は、当該技術分野で公知の任意の方法を使用して測定した場合に、ＣＡ１２５タンパク質への結合が低いか又は結合しない抗体を指す。
「ＣＤ３」及び「ＣＤ３Ｅ」という用語は、ヒトリンパ球上で発現されるＣＤ３－イプシロンタンパク質を指す。
「がん」、「悪性」、「調節不全」、及び「腫瘍」という用語は当該技術分野でよく知られており、調節不全細胞とも称される、同様の起源の正常な細胞型とは異なる未制御の細胞増殖及び形態学的特徴を有する細胞の存在を指す。悪性とは、病的状態及び／又は死亡を引き起こす可能性のあるがん細胞を指す。使用される場合、「がん及び腫瘍」には、前がん性及び悪性のタイプが含まれる。
使用される場合、「可溶性」という用語は、細胞の細胞膜に付着していないタンパク質又は非タンパク質剤を指す。例えば、可溶性の薬剤は、正常又はがん性の細胞から、血清、全血、血漿、尿、又は腫瘍を含む細胞の微小流体を含む生体液に放出、分泌、又は輸出され得る。
使用される場合、指定されるタンパク質又は非タンパク質剤（ＣＡ１２５を含む）の「レベル」は、インビトロ又はインビボでのタンパク質及び／又は非タンパク質剤レベルの測定のための当該技術分野で知られている任意の方法を使用して決定される薬剤の１つ以上のレベルを指す。このような方法には、ゲル電気泳動法、キャピラリー電気泳動法、高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）、薄層クロマトグラフィ（ＴＬＣ）、高拡散（ｈｙｐｅｒｄｉｆｆｕｓｉｏｎ）クロマトグラフィ、流体又はゲル内沈降反応、吸収分光法、比色分析法、分光光度分析法、フローサイトメトリ、免疫拡散法（単一又は二重）、液相アッセイ、免疫電気泳動法、ウエスタンブロッティング、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、免疫蛍光アッセイ、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）、フェルスター共鳴エネルギー移動、電気化学発光免疫測定法等が含まれる。一実施形態では、ＣＡ１２５のレベルは、より詳細に記載されるように、プローブベースの技術を使用して決定される。
「体液性免疫抑制（humoral immunosuppression）又は体液性免疫抑制（humoral immunesuppression）」という用語は、ＣＡ１２５によって直接結合され、動的構造が改変される任意の抗体、抗体断片、二重特異性抗体（ＢＳＰ）、又は抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）を指す。卵巣がん及び中皮腫などの悪性細胞によって産生され（Ｎｉｃｏｌａｉｄｅｓ ＮＣ，ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌ Ｔｈｅｒ １９：６２２－６３０，２０１８）、また正常な周囲の上皮細胞からリンパ腫によって誘発される（Ｓａｎｕｓｉ ｅｔ ａｌ．Ｐｅｒｉｔ Ｄｉａｌ ２１：４９５－５００，２００１）ＣＡ１２５は、特定の抗体に結合してその動的構造を変化させ、そのようにしてＡＤＣＣ、ＣＤＣ、オプソニン化、内在化などの生物学的活性、並びに／又はＰＫ、ＰＤ、及びＰＬプロファイルに影響を与える可能性があることが報告されている。
「抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）」という用語は、細胞に対して毒性活性を有する化学物質、ポリペプチド、核酸、又は放射性核種にコンジュゲート又は融合された任意の抗体を指す。
「切断可能リンカー」という用語は、酵素又はプロテアーゼ消化、酸分解、ｐＨ、化学的還元、化学的酸化、加水分解などであるがこれらに限定されない任意の一般的な機構によって細胞外又は細胞内で切断され得る化学的リンカー又はアミノ酸リンカーを意味する。
「切断不可能リンカー」という用語は、酵素又はプロテアーゼ消化、化学的還元、化学的酸化、加水分解などであるがこれらに限定されない一般的な機構によって、一般に細胞外で切断されない化学的リンカー又はアミノ酸リンカーを意味する。
「酵素的切断可能リンカー」及び「酵素的切断不可能リンカー」という用語は、酵素又はプロテアーゼによって切断可能又は切断不可能であるリンカーを意味する。
「二重特異性抗体（ＢＳＰ）」という用語は、２つ以上の異なる抗原に結合することができる任意の抗体を指す。ＢＳＰは、限定されないが、少なくとも２つの全長抗体、１つの全長抗体及び１つの一本鎖抗体、又は２つの一本鎖抗体を含むことができ、各々が異なる抗原に、又は同じ抗原上の異なるエピトープに結合する。
「標準的な抗体」という用語は、免疫グロブリン重鎖に結合した免疫グロブリン軽鎖を指し、該抗体は上記抗原を特異的に認識することができる。標準的な抗体は、第２の抗原を特異的に認識することができる別の抗体に融合され得る。
「免疫抑制性微小環境（immunosuppressed microenvironment）」、「免疫抑制性微小環境（immune-suppressed microenvironment）」、「免疫抑制性腫瘍微小環境（immunosuppressed tumor microenvironment）」、「免疫抑制性腫瘍微小環境（immune-suppressed tumor microenvironment）」という用語は、細胞性又は体液性免疫機能及び活性を抑制する因子、例えば、これらに限定されないが、それぞれＰＤＬ１又はＣＡ１２５などを産生又は発現する腫瘍を指す。
「免疫応答性微小環境（immunocompetent microenvironment）」、「免疫応答性微小環境（immune-competent microenvironment）」、「免疫応答性腫瘍微小環境（immunocompetent tumor microenvironment）」、「免疫応答性腫瘍微小環境（immune-competent tumor microenvironment）」、「免疫能のある（immune-proficient）」、「免疫能のある（immunoproficient）」、「免疫能のある（immune-proficient）」という用語は、細胞性又は体液性免疫機能又は活性を抑制する因子を産生又は発現しない腫瘍を指す。
「免疫微小環境状態（Immune or immunomicroenvironment status）」、「微小環境免疫状態」は、腫瘍が免疫応答性であるか又は免疫抑制性であるかの判定を指す。この用語はまた、免疫抑制性タンパク質を産生する腫瘍であって、そのようなタンパク質を産生する腫瘍が免疫抑制性微小環境を有すると考えられる腫瘍も指す。
「抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）」という用語は、抗体が細胞表面の抗原に結合し、次に抗体のＦｃドメイン内の配列を介して免疫－エフェクター細胞と会合することができ、その結果、毒素を放出し、結合した細胞を殺傷し得るインビトロ又はインビボプロセスを指す。
「補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）」という用語は、抗体が真核細胞又は原核細胞表面上の抗原に結合し、次に抗体のＦｃドメイン内の配列を介してＣ１ｑタンパク質と会合することができ、その結果、古典的補体カスケードが開始されて結合した細胞を殺傷し得るインビトロ又はインビボプロセスを指す。
「内在化」という用語は、抗体、抗体断片、又はＡＤＣが細胞の表面上の抗原に結合し、次に当業者に知られているメカニズムを介して内在化することができるプロセスを指す。
「薬物動態（ＰＫ）」という用語は、対象に投与された時に抗体がその定常状態濃度を維持する時間を指す。
「薬力学（ＰＤ）」という用語は、抗体ベースの薬物の生化学的及び生理学的効果とその作用機序の研究を指し、対象に投与された時のそれらの作用及び効果とそれらの生化学的構造との相関を含む。
「薬理学（ＰＬ）」という用語は、抗体がインビトロ又はインビボで疾患細胞を管理する又は殺傷するのに及ぼす既知の効果を指す。
「試料」という用語は、対象から単離された類似の液体、細胞又は組織、並びに対象内に存在する液体、細胞又は組織、の集合を指す。液体は、細胞及びオルガノイド培地、尿、唾液、洗浄液等を含む、対象又は生物学的供給源と接触した液体溶液を含む生体液を含み得る。
使用される場合、「対照試料」という用語は、例えば、特定のがん型に罹患していない健康な対象からの試料又はその親細胞とは異なる細胞を含む、臨床的又は非臨床的に関連する任意の対照試料を指す。
「対照レベル」という用語は、対象に由来する又はインビトロアッセイで使用される試料中の同じ薬剤のレベルと比較するために使用される、タンパク質又は非タンパク質剤の許容される又は所定のレベルを指す。
使用される場合、治療抗体と対照のシグナル間の「差」は、一般に、当該技術分野で一般的に使用される統計的方法を使用して統計的に決定され得る任意の差であり、対照と比較して少なくとも１０％以上の差である。使用される抗体及びプローブに応じて、少なくとも５％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、７０％、又は７５％の変化を指す場合もある。
「阻害する」又は「の阻害」という用語は、統計的に測定可能な量だけ低減すること、又は完全に防ぐことを意味する。
記載された方法に従って使用される抗体、抗体含有部分（すなわち、ＢＳＰ、ＡＤＣなど）に関連する「機能的」という用語は、抗体がそれぞれ抗原若しくはＣＡ１２５に結合できること、及び／又はインビトロ若しくはインビボで標的細胞に結合して殺傷できることを示す。
「標的細胞」という用語は、特定の抗体又は抗体含有部分に対する抗原を発現する真核細胞若しくは原核細胞又は細胞集団を指す。
「治療域」という用語は、管理可能な耐容毒性用量内で腫瘍増殖を抑制する薬物の有効性を意味する。
「薬学的に許容される」という用語は、薬理学的及び毒物学的側面から患者に投与することが許容され、当該技術分野で公知の手法を使用して製造される物質を指す。これらには、連邦政府又は州政府の規制機関によって承認された、あるいは米国薬局方又はその他の一般的に認められている動物及びヒトでの使用のための薬局方に記載されている薬剤が含まれる。「薬学的に適合性のある成分」という用語は、抗がん剤を投与するのに用いられる薬学的に許容される希釈剤、アジュバント、賦形剤又はマトリックスビヒクルを指す。「薬学的に許容される担体」とは、活性成分（複数可）の生物学的活性の有効性を妨げず、宿主に対して無毒であるマトリックスを指す。
「有効量」及び「治療上有効」という用語は交換可能に使用され、患者において増強された臨床転帰をもたらすのに十分な量で医薬品を投与することに関連して使用される。有効量の薬剤は、本明細書に記載される方法に従って、「効果的なレジメン」で投与される。「効果的なレジメン」という用語は、特定のがんを有する患者に対して増強された臨床転帰を達成するのに十分な薬剤の量及び投与頻度の組み合わせを指す。増強された有効性は、患者が、親化合物よりも病的状態をよりよく克服することができる薬剤、又は効果的なレジメンの臨床転帰を増強することができる薬剤を投与された場合の改善された臨床転帰である。
「患者」及び「対象」という用語は、治療剤治療を受けるヒト及び獣医学的対象を含む他の非ヒト動物を指すために交換可能に使用される。「非ヒト動物」という用語には、全ての脊椎動物が含まれる。一実施形態では、対象はヒトである。
「治療剤」は、通常、望ましくない汚染物質を実質的に含まない。これは、薬剤が通常、少なくとも約５０％ｗ／ｗ（重量／重量）純粋であり、かつ妨害タンパク質及び汚染物質を実質的に含まないことを意味する。
「免疫エフェクター細胞」という用語は、抗体結合標的細胞への結合時に抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）又は食作用（オプソニン化）をもたらす可能性のある、ＮＫ、骨髄、単球、又は樹状細胞を含むが、これらに限定されない任意の細胞を指す。細胞は、精製されるか、又は末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の形態の混合で存在し得る。
「調節不全細胞」という用語は、親細胞に対して異常であるとみなされる任意の細胞を指す。これらには、形質転換細胞、悪性細胞、ウイルス感染細胞、自己調節を介した自律的に増殖する細胞、又は原核生物の病原体が含まれる。
「体液性応答」という用語は、ＡＤＣＣ、ＣＤＣ、オプソニン化、又は試験抗体による、標的細胞への抗体の内在化を指す。
「薬剤」という用語は、抗メソテリンＡＤＣ又はＢＳＰを指す。
「有意（に）」という用語は、スチューデントのＴ検定を含む任意の数のプログラムによって決定されたＰ値が０．０５未満である統計結果を指す。
検出抗体、治療用ＭＥＳ－ＡＤＣ及びＭＥＳ－ＢＳＰの組成物；メソテリン発現がんを有する患者を治療するためのキット及び方法
本明細書では、ＭＥＳ－ＡＤＣ及びＭＥＳ－ＢＳＰ（両方とも薬剤と称される）及びｒＭＥＳ－１（検出抗体と称される）の組成物、キット、並びにメソテリン陽性がんを、それらの微小環境免疫状態にかかわらず効果的に抑制することができるそのような薬剤を同定するための方法が提供される。本明細書に記載の最適なＭＥＳ－ＡＤＣ及びＭＥＳ－ＢＳＰを同定するための方法のいくつかの実施形態では、当該方法は、ＣＡ１２５不応性であり、その負の腫瘍細胞殺傷活性（すなわち、ＡＤＣの腫瘍取り込み、二重特異性抗体の免疫応答など）のいずれかを回避することができるＡＤＣ及び／又はＢＳＰの抗体成分を同定することを含む。他の実施形態では、ＣＡ１２５不応性ＭＥＳ－ＡＤＣは、切断可能リンカー又は切断不可能リンカーを介して連結された２つ以上の細胞毒から構成され、ＭＥＳ－ＡＤＣの能力が、メソテリン発現免疫抑制性標的細胞に対して細胞傷害性を有意に改善し、免疫能のある標的細胞に対しても有効であるかどうかを試験する。いくつかの実施形態では、ＭＥＳ－ＡＤＣ細胞毒は、ＳＮ３８又はＰＮＵ１５９６８２クラスのトポイソメラーゼ阻害剤である。別の実施形態では、ＭＥＳ－ＡＤＣは、薬物：抗体比（ＤＡＲ）が２～６であり、ＭＡＣグルクロニドフェノール又はＰＥＧ８－トリアゾール－ＰＡＢＣ－ペプチド－ｍｃリンカーを介してＳＮ３８にコンジュゲートされたＭＥＳ－１抗体を含む。更に別の実施形態では、ＭＥＳ－ＡＤＣは、ＤＡＲが２～６であり、ＭＡ－ＰＥＧ４－ＶＣ－ＰＡＢ－ＤＭＡＥリンカーを介してＰＮＵ１５９６８２にコンジュゲートされたＭＥＳ－１抗体を含む。例を図３Ｂに概略的に示す。キットは、当該分野で使用されるスクリーニングアッセイを介して、免疫抑制性及び免疫能のあるメソテリン発現腫瘍型に対するＡＤＣ殺傷アッセイを使用することによって、最適なＡＤＣフォーマット（細胞毒及びリンカー）を同定することができるＭＥＳ－ＡＤＣから構成される。加えて、キットは、最適なＭＥＳ－ＡＤＣとｒＭＥＳ－１検出抗体から構成され、これらは両方とも、ＣＡ１２５の存在下又は非存在下でメソテリンに結合して、腫瘍微小環境免疫状態にかかわらず、ＭＥＳ－ＡＤＣによる治療のための、メソテリン発現がんを有する患者を同定することができる。
別の実施形態は、最適なＭＥＳ－ＢＳＰを同定するための方法である。この方法は、最適化されたＭＥＳ－ＢＳＰであって、ＭＥＳ－ＢＳＰ軽鎖が、配列番号１に列挙されるアミノ酸を含むか、又はＮ末端で抗ＣＤ３一本鎖抗体（配列番号６）に結合した配列番号２に列挙されるアミノ酸を有する重鎖を含む、ＭＥＳ－ＢＳＰを作製することを含む。他の実施形態では、ＭＥＳ－ＢＳＰは、遺伝的に連結されたスペーサーを介して抗ＣＤ３一本鎖に融合されたＭＥＳ－１軽鎖を含む。スペーサーは、天然又は修飾されたアミノ酸の任意の組み合わせ及び長さからなり得るが、ＭＥＳ－１軽鎖とＣＤ３一本鎖との間の１つの任意選択の連結は、遺伝的にコードされたリンカー単位（複数可）「ＧＧＧＧＳ（配列番号２０）」を介するものである。連結は、１つ又は複数の単位を介してであり得る。最適なスペーサーユニットは、当該分野で一般的に使用されるアッセイを使用して、免疫抑制性及び免疫能のあるメソテリン発現標的細胞の機能的殺傷アッセイを使用して決定され得る。スクリーニングの例は実施例３で考察され、結果は図６に示されている。別の実施形態では、キットは、最適なＭＥＳ－ＢＳＰとｒＭＥＳ－１検出抗体から構成され、腫瘍微小環境免疫状態にかかわらず、ＭＥＳ－ＢＳＰによる治療のための、メソテリン発現がんを有する患者を同定する。
最適に活性なＭＥＳ－ＡＤＣ又はＭＥＳ－ＢＳＰ薬剤を同定するための方法では、天然に又は組換えにより免疫抑制性タンパク質を発現するメソテリン発現標的細胞の培養物に、抗体を添加する。ＭＥＳ－ＡＤＣ又はＭＥＳ－ＢＳＰ処置細胞と対照処置細胞に対する応答を比較する培養物を、標準的な殺傷アッセイを用いて標的細胞生存率について監視する。少なくとも１０％の変化が、典型的には、有意義な効果であるとみなされる。用いられる薬剤及びアッセイに応じて、有意義な効果はまた、少なくとも５％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、７０％、又は７５％の変化として定義され得る。
最適に活性なＭＥＳ－ＡＤＣ又はＭＥＳ－ＢＳＰを同定するためのいくつかの方法では、ＣＡ１２５を天然に発現するメソテリン発現標的細胞の培養物に、薬剤を添加するか、又は可溶性ＣＡ１２５タンパク質を外因的に添加する。ＭＥＳ－ＡＤＣ又はＭＥＳ－ＢＳＰとＣＡ１２５で処置したものと、対照又はＣＡ１２５なしで処置したものとの応答を比較する培養物を、標準的な殺傷アッセイを用いて標的細胞生存率について監視する。少なくとも１０％の変化が、典型的には、ＡＤＣＣ、ＣＤＣ、及び／又はＡＤＣの標的細胞殺傷に対する有意義な効果であるとみなされる。用いられる薬剤及びアッセイに応じて、有意義な効果はまた、少なくとも５％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、７０％、又は７５％の変化として定義され得る。
ＭＥＳ－ＡＤＣ又はＭＥＳ－ＢＳＰ薬剤を用いてがん対象を治療する方法も本明細書で提供される。例えば、患者は、これらに限定されないが、中皮腫、結腸直腸がん、肺がん、卵巣がん、膵臓がん、胆管がん、又は子宮内膜がんなどのメソテリン発現がんを有し得る。いくつかの抗メソテリン抗体は、ＣＡ１２５によって結合されることが報告されており（図１参照）、これは、ＡＤＣとしてのそれらの内在化を撹乱させるか、又はＢＳＰとしてのそれらの免疫殺傷効果を抑制し得るため、ＣＡ１２５によって結合又は影響されないＭＥＳ－ＡＤＣ又はＭＥＳ－ＢＳＰの使用が望ましいものとなる。
ＭＥＳ－ＡＤＣ又はＭＥＳ－ＢＳＰ薬剤で対象を治療する方法のいくつかの実施形態では、ＣＡ１２５などの免疫抑制性タンパク質を発現し、その腫瘍微小環境を免疫抑制させるがんを有する患者は、ＭＥＳ－ＡＤＣ又はＭＥＳ－ＢＳＰ薬剤単独で、又は標準治療と組み合わせて治療され得る。免疫抑制性微小環境を有する対象を治療する方法のいくつかの実施形態では、ＣＡ１２５を発現することが知られているメソテリン発現がんが本明細書に記載される。ＭＥＳ－ＡＤＣ又はＭＥＳ－ＢＳＰ薬剤は、対象が正常範囲を超えるベースラインＣＡ１２５レベルを有する場合に対象に投与される。本明細書に記載のＣＡ１２５発現がんを有する対象を治療する方法のいくつかの実施形態では、方法は、ＭＥＳ－ＡＤＣ又はＭＥＳ－ＢＳＰ薬剤を単独で投与することを含む。更に別の実施形態では、ＭＥＳ－ＡＤＣ又はＭＥＳ－ＢＳＰ薬剤は、化学療法と組み合わせて投与される。化学療法は、対象が治療される時点で標準治療とみなされる任意の化学療法剤又は生物学的薬剤であり得る。本明細書に記載の治療方法において、ＣＡ１２５発現レベルは、当該技術分野で既知の任意の手段によって決定され得、当該技術分野で正常範囲内又はそれを上回ると定義され得る。
他の実施形態では、患者は、ｒＭＥＳ－１検出抗体を用いてメソテリン発現がんを有することが同定され、ｒＭＥＳによって陽性に結合された患者は、免疫抑制性微小環境及び免疫能のある微小環境の両方において、ＭＥＳ－ＡＤＣ又はＭＥＳ－ＢＳＰが有効であることから、腫瘍微小環境免疫状態を判定することなく、ＭＥＳ－ＡＤＣ又はＭＥＳ－ＢＳＰ薬剤で治療される。本明細書に記載のメソテリン発現がんを有する対象を治療する方法のいくつかの実施形態では、方法は、ＭＥＳ－ＡＤＣ又はＭＥＳ－ＢＳＰ薬剤を単独で投与することを含む。更に別の実施形態では、ＭＥＳ－ＡＤＣ又はＭＥＳ－ＢＳＰ薬剤は、化学療法と組み合わせて投与される。化学療法は、対象が治療される時点で標準治療とみなされる任意の化学療法剤又は生物学的薬剤であり得る。
本明細書に記載の治療方法のいくつかの実施形態では、メソテリンを発現することが知られている例示的ながんとしては、中皮腫、肺がん、結腸直腸がん、卵巣がん、子宮内膜がん、胆管がん、胃がん、乳がん、及び膵臓がんが挙げられるが、これらに限定されない。これらの多くは、ＣＡ１２５を産生することが報告されている。
本発明の方法は、外科手術（例えば、減量手術）、放射線、標的療法、化学療法、免疫療法、増殖因子阻害剤の使用、又は抗血管新生因子などの他の治療手段と組み合わせることができる。ＭＥＳ－ＡＤＣ又はＭＥＳ－ＢＳＰ薬剤は、手術、化学療法、又は放射線療法の治療を受けている患者に同時に投与することができる。あるいは、患者は、ＭＥＳ－ＡＤＣ又はＭＥＳ－ＢＳＰ薬剤の投与前又は投与後の少なくとも１時間から最大数ヶ月まで、標準治療の投与の前又は後に、手術、化学療法、又は放射線療法を受けることができる。本明細書に提供される治療方法のいくつかの実施形態は、ＭＥＳ－ＡＤＣ又はＭＥＳ－ＢＳＰ薬剤に加えて、腫瘍特異的抗原又は免疫チェックポイントタンパク質に対する抗体と共に又はそれなしで、治療上有効量の白金ベースの化学療法及び／又は葉酸代謝拮抗剤及び／又はＰＡＲＰ阻害剤を対象に投与することを含む。
本明細書に記載の治療方法のいくつかの実施形態では、対象は、ＭＥＳ－ＡＤＣ又はＭＥＳ－ＢＳＰ薬剤を投与する前に、がんの治療のために、腫瘍の第一選択外科的切除、第一選択白金ベース療法、第一選択葉酸代謝拮抗剤ベース療法、第一選択白金及び葉酸代謝拮抗剤ベース療法、ＰＡＲＰ阻害剤及び／又は免疫チェックポイント阻害剤を投与されていてもよい。
本明細書に記載の治療方法による治療薬（ＭＥＳ－ＡＤＣ又はＭＥＳ－ＢＳＰ薬剤、葉酸代謝拮抗剤、白金ベースの化学療法、ＰＡＲＰ阻害剤及び／又は免疫チェックポイント阻害剤を含む）の投与は、当該技術分野で既知の任意の手段によるものであり得る。
更に別の実施形態では、標準的な抗体フォーマット以外の、ＩＭＧＴ（登録商標）（ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ（登録商標））に従って番号付けされた配列番号７～１２内に含まれるＣＤＲ配列を含むＭＥＳ－ＡＤＣ又はＭＥＳ－ＢＳＰ薬剤を使用してもよい。これらの修飾されたＭＥＳ－ＡＤＣ又はＭＥＳ－ＢＳＰ薬剤の投与は、任意の追加の標準治療の投与の前、それと同時、又はその後であり得る。治療は、手術、及び治療時に使用される現在の標準治療による治療を含むことができる。
必要に応じて、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外、及び経口経路を含む、様々な送達系を使用して治療薬（ＭＥＳ－ＡＤＣ又はＭＥＳ－ＢＳＰ薬剤を含む）を投与することができる。薬剤は、例えば、注入又はボーラス注射によって、全身的又は局所的アプローチを介して、上皮又は粘膜皮膚内層（例えば、口腔粘膜、直腸、及び腸粘膜など）を介した吸収によって投与され得る。
治療薬は、注射器、カテーテル、坐剤、又は任意の移植可能なマトリックス若しくはデバイスを介した注射によって投与することができる。
本明細書に記載される使用のための治療薬及びその薬学的組成物は、カプセル、錠剤、水性懸濁液、溶液などの任意の許容可能な剤形で経口投与することができる。
治療薬の好適な投与方法には、効果的な治療に好適な最終濃度での静脈内注射及び腹腔内投与が含まれるが、これらに限定されない。
他の薬物と組み合わせたＭＥＳ－ＡＤＣ又はＭＥＳ－ＢＳＰ薬剤は、治療上又は予防上有効量の治療剤（複数可）及び１つ又は複数の薬学的に許容される又は適合性のある成分を含む医薬組成物として投与することができる。
がんの治療又は予防に有効な治療薬の量は、標準的な臨床技術によって決定することができる。更に、インビトロアッセイを任意選択で用いて、ＭＥＳ－ＡＤＣ又はＭＥＳ－ＢＳＰ薬剤に必要な最適な投与量範囲を同定するのを助けることができる。有効量は、インビトロ細胞ベースアッセイ、動物モデル又は他の非ヒト試験システムから得られたＭＥＳ－ＡＤＣ又はＭＥＳ－ＢＳＰ薬剤の用量応答曲線から推定することができる。
例えば、薬剤の毒性及び治療効果は、ＬＤ５０（集団の５０％に対する致死用量）及びＥＤ５０（集団の５０％で治療上有効な用量）値を決定するための標準的な薬学的手順によって、細胞培養又は実験動物で決定することができる。毒性効果と治療効果との間の用量比は治療指数又は治療域であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０比として表すことができる。大きな治療指数を示す薬剤が好適である。薬剤が毒性の副作用を示す場合、影響を受けた組織の部位に薬剤を標的とする送達系を使用して、非メソテリン発現細胞への潜在的な損傷を最小限に抑え、それによって副作用を低減することができる。あるいは、必要に応じて、これらに限定されないが、リポソーム封入などの製剤を使用して、治療指数を改善することができる。
投薬及び投薬スケジュールは、対象の必要性に依存し得る活性薬物濃度に応じて変化し得る。
別の実施形態は、ＭＥＳ－ＡＤＣ又はＭＥＳ－ＢＳＰ薬剤による治療中又は治療後に、インビトロ又はインサイチュでメソテリン発現腫瘍細胞の状態を検出及び／又は監視する診断用途のために、ＣＡ１２５発現又は非発現腫瘍におけるメソテリン発現細胞を検出するためのｒＭＥＳ－１検出抗体を標識する。標識は、当該技術分野で公知の診断的監視用の抗体を標識するために使用される任意の方法であり得る。
ＭＥＳ－ＡＤＣ及びＭＥＳ－ＢＳＰの活性を最適化するためのキットの構成
免疫抑制性及び免疫能のあるメソテリン発現腫瘍を殺傷するのに適した最適化されたＭＥＳ－ＡＤＣ及びＭＥＳ－ＢＳＰ薬剤を作製するためのキットが、本明細書で更に提供される。
キットは、微小環境免疫状態にかかわらず、２つ以上のタイプのメソテリン発現細胞又は腫瘍を殺傷することができる配列番号１及び２からなる抗体に結合した細胞毒を含有するＭＥＳ－ＡＤＣ薬剤を含んでもよく、細胞毒は、１００μＭ以下のＩＣ５０を有するトポイソメラーゼ阻害活性を有する。
キットは、免疫抑制性及び免疫能のあるメソテリン発現細胞又は腫瘍を殺傷することができる抗ＣＤ３一本鎖（配列番号６）に結合した配列番号７～１２を有する抗体又は抗体断片を含有するＭＥＳ－ＢＳＰ薬剤を含んでもよく、抗メソテリン抗体と抗ＣＤ３抗体との間の連結は、最適化されたスペーサーを介したものであり、メソテリン発現細胞を１００μｇ／ｍＬ以下のＩＣ５０で殺傷する。
上記の開示は、本発明を広義に記述するものである。本明細書中に開示される全ての参考文献は、参照により明示的に組み込まれる。以下の具体的な実施例を参照することにより、より完全な理解を得ることができるが、これらの実施例は、例示のみを目的として本明細書に提供されるのであって、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
実施例１－免疫抑制性腫瘍産生タンパク質に対して天然に不応性である抗メソテリン抗体のスクリーニング
いくつかの研究では、ＣＡ１２５によって結合される抗体が、標的細胞の体液媒介性免疫殺傷及びＡＤＣ媒介性殺傷の誘発において負の影響を受けることが報告されている（Ｋｌｉｎｅ ＪＢ，ｅｔ．ａｌ．ＯｎｃｏＴａｒｇｅｔ ８：５２０４５－５２０６０，２０１７；Ｋｌｉｎｅ ＪＢ，ｅｔ ａｌ．Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ４８：１８７２－１８８２，２０１８；Ｋｌｉｎｅ ＪＢ，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ５：１５，２０１８；Ｎｉｃｏｌａｉｄｅｓ ＮＣ，ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌ Ｔｈｅｒ １３：１－２２，２０１８；Ｎｉｃｏｌａｉｄｅｓ ｅｔ．ａｌ．米国特許出願第１６９８４４４号）。ＣＡ１２５によって天然に結合されない抗メソテリン抗体を同定するために、本発明者らは、学術的及び商業的供給源（米国国立がん研究所、Ｃｒｅａｔｉｖｅ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｎｏｖｕｓなど）からいくつかの抗メソテリン抗体を入手し、ＣＡ１２５結合性について試験した。図１は、ＣＡ１２５による異なる抗メソテリン抗体の結合についてスクリーニングするための酵素結合免疫アッセイ（ＥＬＩＳＡ）の代表的な結果を示す。組換えメソテリンを陽性対照として使用し、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を陰性対照として使用した。簡単に説明すると、９６ウェルプレートを、５０μＬ／ウェルの１５ＫＵ／ｍＬのヒトＣＡ１２５タンパク質、１μｇ／ｍＬのメソテリン、又は１μｇ／ｍＬのＨＳＡ（０．０５Ｍの炭酸緩衝液（ｐＨ９．５）中）で、４℃で一晩、コーティングした。翌日、プレートを１２５μＬの０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）で３回洗浄し、次いで、０．０５Ｍのリン酸緩衝液中、５％ウシ血清アルブミンで室温で１時間ブロッキングした。次いで、ウェルを１２５μＬの０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）で３回洗浄し、２．５μｇ／ｍＬの様々な抗メソテリン抗体（ｍｅｓｏ－Ａｂ１～ｍｅｓｏ－Ａｂ５）でプローブした。図１に示すように、いくつかの抗メソテリン抗体はＣＡ１２５によって結合されたが、ＭＥＳ－１抗体（配列番号１及び配列番号２）から構成されるｍｅｓｏ－Ａｂ３（レーン３）は予想に反して結合されなかった。全ての抗体が同様の値でメソテリンタンパク質に結合したが、ＨＳＡ陰性対照に結合した抗体はなかった。これらの結果により、ＭＥＳ－１が天然に存在するＣＡ１２５不応性結合抗体として同定され、そのような抗体がそのような免疫抑制因子を産生するがん細胞又は腫瘍の治療のために利用されることが示唆される。ＣＡ１２５結合が、ＭＥＳ－１（図１ＡのＡｂ－３）の内在化に、ＣＡ１２５によって結合される抗メソテリン抗体Ａｂ－４と比べて異なる影響を及ぼした（図１Ａ）ことを確認するために、本発明者らは、膜結合型ＣＡ１２５を天然に過剰発現するメソテリン発現ＯＶＣＡＲ３細胞（Ｋｌｉｎｅ ＪＢ，ｅｔ．ａｌ．ＯｎｃｏＴａｒｇｅｔ ８：５２０４５－５２０６０，２０１７）と、比較のために同質遺伝子細胞を作製するためのＫｌｉｎｅ ｅｔ ａｌ．の報告と同様の戦略を使用して作出されたｓｈＲＮＡによるＯＶＣＡＲ３ ＣＡ１２５ノックダウン株（ＯＶＣＡＲ－ＫＯと称される）とを用いて、内在化アッセイを実施した。両抗体を、ｐＨ感受性ｐＨｒｏｄｏ蛍光色素システムを製造元のプロトコル（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ．ｃｏｍ／ａｄｃｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）に従って使用して、蛍光標識した。次いで、抗体を９６ウェルマイクロプレート中、反復実験で、ＯＶＣＡＲ３又はＯＶＣＡＲ－ＫＯ細胞と共に２４時間にわたってインキュベートし、Ｖａｒｉｏｓｋａｎ（商標）プレートリーダー（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して蛍光により細胞取り込みについて定量した。図１Ｂに示されるように、ＭＥＳ－１ Ａｂ（Ａｂ－３）は、Ａｂ－４とは対照的に、ＣＡ１２５発現ＯＶＣＡＲ３及びＣＡ１２５ノックダウンＯＶＣＡＲ－ＫＯ細胞の両方において効率的に取り込まれた。これによりＭＥＳ－１抗体をコードする配列が天然にＣＡ１２５不応性であるという予想外の知見が支持され、本明細書に教示される方法を使用してＣＡ１２５発現腫瘍細胞を治療するための抗体ＡＤＣ成分として適格であるものとされた。
実施例２－免疫抑制性及び免疫能のあるメソテリン発現がん細胞を殺傷することができる抗メソテリン抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）の作製
ＭＥＳ－１が、ＣＡ１２５、及びメソテリン発現腫瘍細胞によって産生される潜在的な他の免疫抑制性タンパク質の免疫抑制効果に対して不応性であるかどうかを決定するために、本発明者らは、ＭＥＳ－１をＡＤＣフォーマットに構成し、ＣＡ１２５を発現する免疫抑制性メソテリン発現がん細胞の殺傷におけるその有効性を試験した。ここでは、ＭＥＳ－１及びＭＥＳ－ＡＤＣ組成物の生化学分析と、免疫抑制性及び免疫能のあるメソテリン発現腫瘍細胞を効果的に殺傷するために必要とされる様々なフォーマットのＭＥＳ－ＡＤＣの効力の例が提供される。本発明者らは、免疫抑制性標的細胞の殺傷を最大化するための、特定のペイロード及び特定のリンカータイプに結合したＣＡ１２５非結合抗メソテリン抗体（配列番号１及び配列番号２）の使用を提供する。上述したように、Ｎｉｃｏｌａｉｄｅｓら（Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌ Ｔｈｅｒ １９：６２２－６３０，２０１８；Ｎｉｃｏｌａｉｄｅｓ ｅｔ．ａｌ．米国特許出願第１６／９８１，４４４号）により、ＣＡ１２５が抗メソテリン抗体アマツキシマブに結合すると体液性免疫機能が抑制されると共に、ＣＡ１２５によって結合されないものと比較して、腫瘍取り込みが減少したため、ＣＡ１２５によって結合される標的抗原に対するＡＤＣによるＡＤＣ殺傷が低下することが報告されている。ＡＤＣフォーマットのＭＥＳ－１抗体が免疫能のある及び免疫抑制性微小環境を有する腫瘍に対して有し得る最大効力を決定するために、本発明者らは、様々な細胞傷害性ペイロード及び様々なリンカーの組み合わせに結合したいくつかのＭＥＳ－１ベースＡＤＣを、インビトロで、次いでヒト腫瘍異種移植片において、試験した。これらのＡＤＣを作製するために、本発明者らは最初に、均質なＭＥＳ－１タンパク質を産生する系において組換えＭＥＳ－１を作製する必要があった。組換えＭＥＳ－１産生には、以前からこの系を使用して多量の均質な抗体が産生されてきたことから組換えチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を使用した。ＭＥＳ－１軽鎖（配列番号４）及びＭＥＳ－１重鎖（配列番号５）をコードするｃＤＮＡをポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって合成し、ＰＣＲ断片を、２つのＣＭＶ駆動発現クローニングカセット及びグルタミンシンテターゼ（ＧＳ）遺伝子カセットを有するｐＸＣベクター（本明細書ではｐＮＡＶ００４７と称される）にクローニングした。安定な組換え融合タンパク質産生細胞株を作製するために、ノックアウト内在性ＧＳ遺伝子を含有するＣＨＯＫ１ＳＶ－ＧＳＫＯ細胞を６×１０５細胞／ｍＬで、６ｍＭのＬ－グルタミンを添加したＣＤ－ＣＨＯ培地（Ｉｒｖｉｎｇ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中、３７℃、５％ＣＯ２で一晩培養した。翌日、２．０×１０７個の細胞を２０μｇの発現プラスミドｐＮＡＶ００４７と共に再懸濁し、ＣＤ－ＣＨＯ培地中総容量７００μＬとし、０．４ｃｍのエレクトロポレーションキュベットに移し、ＢｉｏＲａｄ ＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒ ＩＩを使用して３００Ｖ／９００μＦでエレクトロポレーションした。細胞を直ちに、６ｍＭのＬ－グルタミンを添加した３０ｍＬのＣＤ－ＣＨＯ培地を含有するフラスコに移し、３７℃、５％ＣＯ２で一晩、振盪プラットフォームインキュベーター中でインキュベートした。翌日、細胞を回収し、５０μＭのＭＳＸを含有する３０ｍＬのＣＤ－ＣＨＯ／ＳＰ４培地に再懸濁して、２週間の選択期間をかけて高力価の産生クローンを選択した。次いで、選択されたプールを限界希釈によってサブクローニングし、確立されたクローンを組換えＭＥＳ－１抗体産生について試験した。生産的サブクローン（１ｍｇ／ｍＬ超を発現する）を増殖させ、抗体産生及び品質について分析した（ＥＬＩＳＡによる標的抗原結合及びＳＥＣ－ＨＰＬＣによるタンパク質均質性）。次いで、最良品質のクローンを増殖させ、ＰＢＳ緩衝液中で透析した後、プロテインＡカラムアフィニティークロマトグラフィを使用して抗体を培養培地から精製した。抗体を、サイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ－ＨＰＬＣ）及び抗原結合によって、定量し、均質性について分析した。図３Ａに示されるように、ＭＥＳ－１産生株は、高品質で均質な抗体を産生することができ、ＡＤＣ作製に使用した。
ここでは、免疫抑制性及び免疫能のある標的がん細胞に対して等しく効果的に作用する有効な細胞毒－リンカーの組み合わせについてのスクリーニングについて記載する。この基準を満たす最良の候補を同定するために、まず、ＤＮＡアルキル化剤、微小管阻害剤、及びトポイソメラーゼ阻害剤を含む様々なクラスの細胞毒を試験した（図２Ａ）。加えて、異なるリンカー（切断可能と切断不可能）の組み合わせも使用して、それらが有効性に影響を及ぼすかどうかを判定した（図２Ｂ）。それらの有効性を試験するために、いくつかのメソテリン発現腫瘍細胞株（そのサブセットも免疫抑制性ＣＡ１２５タンパク質を共発現する）を使用した。これらの細胞株を表１に列挙する。
（表１）ＭＥＳ－ＡＤＣ殺傷について試験した細胞株
Figure 2023546791000002
本発明者らのスクリーニングにおいて同定された最も強力な細胞毒は、アウリスタチン微小管阻害剤ＭＭＡＥ（平均ＥＣ５０ １．３９ｎｇ／ｍＬ）（Ｌｉ Ｃ，ｅｔ．ａｌ．ｍＡｂｓ １２：１６９９７６８，２０２０）、２つのトポイソメラーゼ阻害剤ＳＮ３８（平均ＥＣ５０ ２．４４ｎｇ／ｍＬ）（Ｍｅｙｅｒ－Ｌｏｓｉｃ Ｆ，ｅｔ．ａｌ．Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １４：２１４５－２１５５，２００８）及びＰＮＵ１５９６８２（平均ＥＣ５０ ０．０１４ｎｇ／ｍＬ）（本明細書ではＰＮＵと称される）（Ｑｕｉｎｔｉｅｒｉ Ｌ，ｅｔ．ａｌ．Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １１：１６０８－１６１７，２００５；Ｃａｒｌｓｏｎ ＲＨ．Ｏｎｃｏｌ Ｔｉｍｅｓ ３８：８－１０，２０１６）であった（図２Ｃ）。これらの結果に基づいて、本発明者らは次に、標準的な切断可能リンカーを使用してリード細胞毒をＡＤＣフォーマットに組み込み、それらを表１に示す腫瘍細胞株パネルに対して再試験した。これまでの報告では、薬物：抗体比（ＤＡＲ）がＡＤＣ標的細胞殺傷にとって重要な特徴であることが示されているが、それは、部分的還元及び遊離システインへの化学的連結を使用する場合、製造時の制御が困難な場合があるパラメータでもある（Ｆａｒｒａｓ Ｍ，ｅｔ．ａｌ．Ｍａｂｓ．１２：１７０２２６２，２０２０）。ＳＮ３８－ＭＥＳ－ＡＤＣ及びＰＮＵ－ＭＥＳ－ＡＤＣの概略図を図３Ｂに提供する。多くの場合、ＤＡＲの再現性の制御は、出発抗体の構造及び純度に固有のものである。図３Ａに示されるように、本発明者らの製造システムによるＭＥＳ－１抗体の精製は、本発明者らが均質な出発抗体を作製することを可能にし、部分的に変性させると、ＤＡＲが２～４又は４～６のＡＤＣが規定どおりに作製された（図３Ｃ）。切断可能リンカーを使用する予備的なＭＥＳ－ＡＤＣの細胞殺傷アッセイは、ＳＮ３８－及びＰＮＵ－ＭＥＳ－ＡＤＣが、撹乱されていない細胞取り込みにおそらく起因して、ＣＡ１２５状態に関係なく、全てのメソテリン発現株の最も強力な標的指向性殺傷効果を示し、メソテリンを発現しない株は影響を受けなかったことを見出した（図４Ａ）。ＰＮＵ－ＭＥＳ－ＡＤＣが最も強力な殺傷活性を示したので、次に、切断可能フォーマット（ＭＡ－ＰＥＧ４－ＶＣ－ＰＡＢ－ＤＭＡＥ）及び酵素的切断不可能フォーマット（ＭＣ－ＥＤＡ）でＰＮＵ－ＭＥＳ－ＡＤＣを試験し、予想に反して、切断可能フォーマットが酵素的切断不可能フォーマットよりもほぼ１００倍強力であることが見出された（図４Ｂ）。
リードＭＥＳ－ＡＤＣ薬剤のインビボでの効力を決定するために、本発明者らは次に、メソテリン及びＣＡ１２５発現腫瘍細胞株ＮＣＩ－Ｎ８７及びＳＷ１９９０を使用したマウス異種移植モデルと、ＣＡ１２５発現と非発現のメソテリン発現腫瘍を有する患者由来腫瘍異種移植片（ＰＤＸ）において、ＳＮ３８－ＭＥＳ－ＡＤＣとＰＮＵ－ＭＥＳ－ＡＤＣの切断可能及び酵素的切断不可能フォーマットの治療有効性を試験した。異種移植片及びＰＤＸ腫瘍におけるメソテリン及びＣＡ１２５発現を確認するために、本発明者らは、ウサギＩｇＧ骨格上に配列番号７～１２を含有するｒＭＥＳ－１検出抗体及び市販の抗ＣＡ１２５抗体をそれぞれ使用して、免疫組織化学（ＩＨＣ）を介して異種移植片由来断片を試験した（図４Ｃ）。簡単に説明すると、５μＭのパラフィン包埋腫瘍断片の切片を切り出し、次いでスライドガラスに接着させた。切片を脱パラフィン処理し、沸騰した１０ｍＭのクエン酸ナトリウム（ｐＨ６．０）中で１０分間、抗原賦活化のために調製し、次いでリン酸緩衝生理食塩水－０．０５％ｔｗｅｅｎ－２０（ＰＢＳ－Ｔ）で平衡化した。次いで、０．３％のペルオキシダーゼ／メタノールを１０分間使用して内因性ペルオキシダーゼ活性について切片をクエンチし、ＰＢＳ－Ｔ中の１０％ヤギ血清中で１時間ブロッキングした。次に、スライドをＰＢＳ－Ｔですすぎ、ブロッキング緩衝液で希釈した３ｍｇ／ｍＬの各一次抗体を用いてｒＭＥＳ－１又はウサギ抗ＣＡ１２５（Ｎｏｖｕｓ）を介してメソテリンについて１．５時間プローブし、続いて洗浄し、二次ブロッキングを１時間行い、５μｇ／ｍＬの抗ウサギ－西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲート二次抗体で１時間プローブした。対照スライドを、一次抗体なしでインキュベートした。スライドをＰＢＳ－Ｔで洗浄し、次いで、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（商標）ＤＡＢアドバンスト発色基質を製造元（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の推奨どおりに使用して曝露した。最後に、試料をヘマトキシリン対比染色し、カバーガラスをかけ、光学顕微鏡下で抗原発現について分析した。ＮＣＩ－Ｎ８７及びＳＷ１９９０異種移植腫瘍は両方とも、メソテリン及びＣＡ１２５を共発現することが見出されたが（図示せず）、非小細胞肺腺がんＰＤＸ ＃ＬＸＦＡ９８３及び中皮腫ＰＤＸ ＃ＰＸＦ１１１８では、等しいレベルのメソテリンの発現が見られ、ＰＤＸ ＃ＰＸＦ１１８のみがＣＡ１２５陽性を示した（図４Ｃ、上パネル）。次いで、本発明者らは、これらの株を、マウスＣＤＸ（細胞株由来異種移植片）及びＰＤＸ（患者由来異種移植片）インビボアッセイにおいて使用した。
ＳＷ１９９０膵臓がんＣＤＸモデルでは、１×１０７個の腫瘍細胞を複数の無胸腺ヌードマウスの側腹部に注射した。確立された腫瘍（１３６～１５４ｍｍ３）を有するマウスを無作為化し、移植後８日目、９日目、及び１０日目に、１０ｍｇ／ｋｇ若しくは２０ｍｇ／ｋｇのいずれかでＳＮ３８－ＭＥＳ－ＡＤＣを、又はＰＢＳを静脈内投与した。ＳＮ３８－ＭＥＳ－ＡＤＣ処置は、３９日目に、それぞれ１０ｍｇ／ｋｇ又は２０ｍｇ／ｋｇで、ビヒクル処置群に対して腫瘍増殖を２５％又は５３％減少させ、その差は統計的に有意であった（１０ｍｇ／ｋｇでＰ≦０．０４９；２０ｍｇ／ｋｇでＰ≦０．０００３）（図４Ｄ、上パネル）。
ＮＣＩ－Ｎ８７胃がんＣＤＸモデルでは、１×１０７個の腫瘍細胞を複数のＳＣＩＤマウスの側腹部に注射した。確立された腫瘍（１２６ｍｍ３）を有するマウスを無作為化し、以下に示すように静脈内投与した。酵素的切断可能フォーマットのＰＮＵ－ＭＥＳ－ＡＤＣを、無作為化後１日目、８日目、１５日目、２５日目、３２日目、及び４４日目に０．２５ｍｇ／ｋｇ又は０．５ｍｇ／ｋｇで投与した。ＰＮＵ－ＭＥＳ－ＡＤＣ切断可能フォーマット処置は、０．５ｍｇ／ｋｇで腫瘍増殖を４５％減少させ、その差は統計的に有意であった（ｐ≦０．０５０）（図４Ｄ、下パネル）。同じＮＣＩ－Ｎ８７胃がんＣＤＸモデルにおいて、確立された腫瘍（１２６ｍｍ３）を有するマウスを無作為化し、無作為化後１日目、３日目、５日目、７日目、９日目、１１日目、１３日目、１５日目に２０ｍｇ／ｋｇでＳＮ３８－ＭＥＳ－ＡＤＣ、ＰＮＵ－ＭＥＳ－ＡＤＣ酵素的切断不可能フォーマット（１日目に０．６２５ｍｇ／ｋｇ、５日目に１．２５ｍｇ／ｋｇ、９日目に２．５ｍｇ／ｋｇ、１３日目に５ｍｇ／ｋｇ）、又はＰＢＳのいずれかを静脈内投与した。ＳＮ３８－ＭＥＳ－ＡＤＣ処置は、腫瘍増殖を４８％減少させ、その差は、統計的に有意であった（ｐ≦０．０１１）（図示せず）。ＰＮＵ－ＭＥＳ－ＡＤＣ酵素的切断不可能フォーマット処置は、腫瘍増殖を３６％減少させ、その差は、酵素的切断可能フォーマットを有するＰＮＵ－ＭＥＳ－ＡＤＣよりも効果が弱いものではあったが、統計的に有意であった（ｐ≦０．０３３）。
ＬＸＦＡ９８３ ＮＳＣＬＣ ＰＤＸモデルでは、腫瘍断片を複数の無胸腺ヌードマウスの側腹部に移植した。確立された腫瘍（１２８ｍｍ３）を有するマウスを無作為化し、無作為化後１日目、４日目、８日目、１２日目、及び１６日目に、０．６２５ｍｇ／ｋｇ（１日目、４日目、及び８日目）又は０．４ｍｇ／ｋｇ（１２日目及び１６日目）で、ＰＮＵ－ＭＥＳ－ＡＤＣ切断可能フォーマット又はＰＢＳのいずれかを静脈内投与した。ＰＮＵ－ＭＥＳ－ＡＤＣ切断可能フォーマットは、統計的に有意な（ｐ≦０．０００３）著しい腫瘍退縮を誘導した（図４Ｅ、上パネル）。
ＰＸＦ１１１８メソテリンＰＤＸモデルでは、腫瘍断片を複数の無胸腺ヌードマウスの側腹部に移植した。確立された腫瘍（１１７～１２４ｍｍ３）を有するマウスを無作為化し、無作為化後１日目、４日目、８日目、１２日目、１６日目、及び２０日目に、０．６２５ｍｇ／ｋｇ（１日目、４日目、及び８日目）又は０．４ｍｇ／ｋｇ（１２日目、１６日目、及び２０日目）で、ＰＮＵ－ＭＥＳ－ＡＤＣ切断可能フォーマット又はＰＢＳのいずれかを静脈内投与した。ＰＮＵ－ＭＥＳ－ＡＤＣ切断可能フォーマットは、統計的に有意な（ｐ≦０．０１２）著しい腫瘍退縮を誘導した（図４Ｅ、下パネル）。
ＰＮＵ－ＭＥＳ－ＡＤＣの減量投与及び単回投与の有効性を更に判定するために、上記のモデルデザインにおいてＣＡ１２５発現ＰＸＦ１１１８ ＰＤＸ株を用いて反復インビボ実験を行った。簡単に説明すると、無胸腺ヌードマウスを上記のように調製し、確立された腫瘍が確認されたら、それぞれ６匹のマウスからなる４つの群に分けた。その後、マウスは１日目、８日目、及び１５日目に、ＰＢＳ、０．２５ｍｇ／ｋｇのＰＮＵ－ＭＥＳ－ＡＤＣ、若しくは３０μｇ／ｋｇの遊離型ＰＮＵ１５９６８２（０．２５ｍｇ／ｋｇのＰＮＵ－ＭＥＳ－ＡＤＣ投与時と同等の毒素量）で、又は１日目に０．７５ｍｇ／ｋｇのＰＮＵ－ＭＥＳ－ＡＤＣで１回、処置された。腫瘍応答及び健康状態について、マウスを５０日を超えて追跡調査した。４９日目に図５に示されるように、０．７５ｍｇ／ｋｇでの切断可能フォーマットのＭＥＳ－ＡＤＣの単回投与は、確立された腫瘍増殖を有意に減少させ（Ｐ≦０．００６１）、ＰＢＳ又は遊離型ＰＮＵ１５９６８２（ＰＮ－遊離型）処置マウスとは対照的に、０．２５ｍｇ／ｋｇでのＰＮＵ－ＭＥＳ－ＡＤＣの３回の週１投与と同様の持続的応答を維持するのに十分であり、このフォーマット及び組成物が、ＣＡ１２５発現の有無にかかわらずメソテリン発現腫瘍の処置に対して有効であることが実証された。薬物処置は、全ての群で良好な忍容性を示した。
これらのデータは、切断可能フォーマットのＰＮＵ－ＭＥＳ－ＡＤＣ及びＳＮ３８－ＭＥＳ－ＡＤＣを含有する物質の組成が、免疫抑制性及び免疫能のある腫瘍微小環境を有する腫瘍を効果的に殺傷することができるという教示を支持する。ＭＭＡＥ微小管阻害剤などの他のペイロード又は酵素的切断不可能ＭＣ－ＥＤＡなどのリンカーがあまり有効でないという知見は、腫瘍標的化ＡＤＣの一般的な使用が、腫瘍免疫抑制を単純に克服できないことを教示しており、むしろ、１）ＣＡ１２５などの免疫抑制因子によって結合されない抗体に関する能動的スクリーニングと、２）最適なペイロードの細胞傷害性に関するスクリーニングと、３）最適なリンカーに関するスクリーニングが、本明細書で教示される発明に記載されるように、免疫抑制性及び免疫能のある腫瘍を処置することができる強力かつ効果的なＡＤＣ薬剤の開発に求められている。
実施例３－免疫抑制性及び免疫能のあるメソテリン発現がん細胞を殺傷することができる抗メソテリン二重特異性抗体（ＭＥＳ－ＢＳＰ）の作製
腫瘍細胞を標的とする抗体の使用は、典型的には、腫瘍細胞増殖を抑制するためのサイトカイン受容体へのサイトカイン結合の遮断、並びに／又はＡＤＣＣ、ＣＤＣ、及び／若しくは免疫エフェクター細胞のオプソニン化を介した体液媒介性免疫殺傷の使用を含んでいた。上記のように、腫瘍産生ＣＡ１２５タンパク質、更には他の腫瘍産生タンパク質（後者はＮ．Ｃ．Ｎ、Ｊ．Ｂ．Ｋ．Ｌ．Ｇの個人的見解）は、標的細胞の体液媒介性抗体殺傷を抑制する能力を有する。免疫抑制性タンパク質の結合に対して天然に不応性である抗体を使用すると、そのようなタンパク質の存在下であっても、腫瘍細胞殺傷が可能になる。実施例１に記載したように、ＣＡ１２５結合を回避する能力について抗メソテリン抗体をスクリーニングすることによって、ＭＥＳ－１抗体を同定した。ＭＥＳ－１の免疫媒介性殺傷を増強するために、本発明者らは、ＢＳＰ抗体腫瘍細胞殺傷にとって重要な特徴である、標的細胞の近位表面へのＣＤ３＋細胞傷害性Ｔ細胞の動員と、その後のＴ細胞活性化を介した免疫媒介性殺傷を利用できる可能性があるようにＭＥＳ－１を操作した（Ｓｔａｅｒｚ ＵＤ，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ３１４；６２８－６３１，１９８５）。本発明者らは、本明細書において、腫瘍微小環境免疫状態にかかわらず改善された免疫媒介性腫瘍細胞殺傷をもたらす、Ｔリンパ球上に発現される細胞表面抗原に結合することができる第２の抗体と遺伝的に融合したＣＡ１２５非結合抗メソテリン抗体の使用を教示する。一例として、ＭＥＳ－１抗体に融合した、Ｔ細胞上のＣＤ３抗原に結合することができる一本鎖抗体の使用を実証する。実施例２で説明されるように、Ｎｉｃｏｌａｉｄｅｓ ｅｔ．ａｌ．（Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌ Ｔｈｅｒ １９：６２２－６３０，２０１８）は、抗メソテリン抗体アマツキシマブへのＣＡ１２５結合が、抑制された体液性免疫機能をもたらすことをすでに示している。ＢＳＰフォーマットのＭＥＳ－１抗体が免疫能のある及び免疫抑制性微小環境を有する腫瘍に対して有し得る最大効力を決定するために、本発明者らは、抗ＣＤ３一本鎖抗体（配列番号６）をＭＥＳ－１軽鎖（配列番号１）又は重鎖（配列番号２）に連結するいくつかのＭＥＳ－ＢＳＰフォーマットを検討し、配列番号３に示されるアミノ酸リンカーＧＧＧＳを用いてＭＥＳ－１軽鎖のＮ末端に融合したＣＤ３一本鎖と標準的なＭＥＳ－１重鎖（配列番号２）とを用いて進めた。次いで、本発明者らは、以下に記載されるように組換えＭＥＳ－ＢＳＰ抗体を作製し、免疫能のある、及びＣＡ１２５タンパク質によって免疫抑制されるがん細胞株に対するその活性を試験した。
高品質のＭＥＳ－ＢＳＰを作製するために、組換えチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を操作し、大規模生産用のＭＥＳ－ＢＳＰを発現させた。ＣＤ３一本鎖抗体を、配列番号３に示されるアミノ酸ＧＧＧＧＳをコードする遺伝子リンカーを介して、ＭＥＳ－１軽鎖の成熟Ｎ末端ドメインの上流にクローニングした。ＭＥＳ－１軽鎖－ＣＤ３一本鎖融合ｃＤＮＡ及びＭＥＳ－１重鎖ｃＤＮＡを、２つのＣＭＶ駆動発現カセット及びグルタミンシンターゼ（ＧＳ）遺伝子カセットを有するｐＸＣベクター（本明細書ではｐＮＡＶ００７１と称される）にクローニングした。安定な組換え融合タンパク質産生細胞株を作製するために、ノックアウト内在性ＧＳ遺伝子を含有するＣＨＯＫ１ＳＶ－ＧＳＫＯ細胞を、６×１０５細胞／ｍＬで、６ｍＭのＬ－グルタミンを添加したＣＤ－ＣＨＯ（Ｉｒｖｉｎｇ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中、３７℃、５％ＣＯ２で一晩培養した。翌日、２．０×１０７個の細胞を２０μｇの発現プラスミドｐＮＡＶ００７１と共に再懸濁し、プレーンＣＤ－ＣＨＯ中総容量７００μＬとし、０．４ｃｍのエレクトロポレーションキュベットに移し、ＢｉｏＲａｄ ＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒ ＩＩを使用して３００Ｖ／９００μＦでエレクトロポレーションした。細胞を直ちに、６ｍＭのＬ－グルタミンを添加した３０ｍＬの温かいＣＤ－ＣＨＯを含有するフラスコに移し、３７℃、５％ＣＯ２で一晩、振盪プラットフォームインキュベーター中でインキュベートした。翌日、細胞を回収し、選択のために５０μＭのＭＳＸを含有する３０ｍＬのＣＤ－ＣＨＯ／ＳＰ４に再懸濁した。次いで、選択されたプールを限界希釈によってサブクローニングし、馴化培地を、抗ヒトＦｃ－ＨＲＰをプローブとして使用するＥＬＩＳＡを介して、確立されたクローンからの組換えＭＥＳ－ＢＳＰ抗体産生について試験した。生産的サブクローン（０．５ｍｇ／ｍＬ超を産生する）を増殖させ、抗体産生及び品質（標的抗原結合及びタンパク質均質性）について分析した。次いで、最良品質のクローンを増殖させ、プロテインＡカラムアフィニティークロマトグラフィ及びＰＢＳ緩衝液中での透析を使用して、ＭＥＳ－ＢＳＰ抗体を培養培地から精製した。次いで、ＭＥＳ－ＢＳＰ抗体を定量し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を介して均質性について分析し、ＥＬＩＳＡを介して抗原結合について分析した。次いで、高品質の調製物を、種々の腫瘍細胞株に対する効力について試験した。
ＭＥＳ－ＢＳＰをまず、ＣＡ１２５タンパク質を天然に過剰発現するメソテリン発現免疫抑制性ＯＶＣＡＲ３腫瘍細胞株及びヒトＰＢＭＣの存在下で、親ＭＥＳ－１抗体及び体液性免疫抑制ｍｅｓｏ－Ａｂ－４抗体（Ａｂ－４，レーン４，図１）と比較して、ＡＤＣＣを介した体液性免疫殺傷について試験した。図６Ａに示されるように、ＭＥＳ－ＢＳＰは、ＭＥＳ－１又はｍｅｓｏ－Ａｂ－４と比較して、ＣＡ１２５産生ＯＶＣＡＲ－３細胞株に対して有意に高い殺傷を示し、ｍｅｓｏ－Ａｂ－４は殺傷活性を示さなかった。これは、ｍｅｓｏ－Ａｂ－４のＡＤＣＣ活性が、ＯＶＣＡＲ３ＣＡ１２５ノックダウンＯＶＣＡＲ－ＫＯ細胞株に対するＭＥＳ－１の活性と同様であったので、ＣＡ１２５に起因するものと思われた（図６Ｂ）。このアッセイでは、Ｊｕｒｋａｔ－ＣＤ１６ａ ＡＤＣＣレポーター細胞株を使用して、製造元（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ）の指示に従ってルシフェラーゼのリードアウトを介してＡＤＣＣ活性を監視した。同様の株が以前に発表され、親ＯＶＣＡＲ細胞とは対照的に、ＣＡ１２５の影響を受けた抗体による抗体媒介性体液性応答が大幅に増強されることが示されている（Ｋｌｉｎｅ ＪＢ，ｅｔ ａｌ．ＯｎｃｏＴａｒｇｅｔ ８：５２０４５－５２０６０，２０１７；Ｎｉｃｏｌａｉｄｅｓ ＮＣ，ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌ Ｔｈｅｒ １３：１－２２，２０１８）。最後に、メソテリン発現ＣＡ１２５陽性腫瘍細胞に対するＭＥＳ－ＢＳＰのインビボ有効性を実証するために、本発明者らはヒト化ＰＢＭＣマウスモデルを使用し、無胸腺ヌードマウスに、メソテリン及びＣＡ１２５の両方を発現する中皮腫由来腫瘍細胞を移植した。腫瘍が確立したら、マウスにヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を移植し、続いてＭＥＳ－ＢＳＰ又は対照処置を行った。図７に示すように、ＭＥＳ－ＢＳＰは、腫瘍増殖を統計的に有意に抑制することができ、ＣＡ１２５免疫抑制性腫瘍微小環境におけるメソテリン発現細胞の処置に有用であることが確認された。ここで、ＣＡ１２５が結合することができる免疫媒介性殺傷を用いて、ＣＡ１２５が抗体の有効性に対して有意な影響を及ぼし得ることが教示される。更に、本発明者らは、抗メソテリンＢＳＰ抗体が免疫抑制性腫瘍細胞を効果的に殺傷することができる組成物を提供する。
（表２）配列の特定（全ての配列はＮからＣ末端）
下線は、抗メソテリン指向抗体における抗体ＣＤＲを示す。
下線イタリック体は、抗ＣＤ３指向抗体におけるＣＤＲを示す。
太字は、軽鎖又は重鎖定常領域を表す。
太字イタリック体は、ＣＤ３単一軽鎖と重鎖との間、及びＣＤ３単一鎖と抗メソテリン軽鎖融合体との間のスペーサーを表す。
配列番号１（ＭＥＳ軽鎖）
Figure 2023546791000003
配列番号２（ＭＥＳ重鎖）
Figure 2023546791000004
配列番号３（ＭＥＳ－ＢＳＰ：ＭＥＳ軽鎖に融合した一本鎖抗ＣＤ３）
Figure 2023546791000005
抗ＣＤ３ ＶＨは第１のＧＧＧＧＳｘリンカーの前にあり、抗ＣＤ３ ＶＬは第１のリンカーと第２のリンカーとの間にあり、抗メソテリンＶＬは第２のリンカーの後にある。
修飾されたリーダー配列に下線を付した配列番号４（ＭＥＳ－ＢＳＰ：ＭＥＳ軽鎖に融合した一本鎖抗ＣＤ３）
Figure 2023546791000006
修飾されたリーダー配列に下線を付した配列番号５（ＭＥＳ重鎖）
Figure 2023546791000007
配列番号６［抗ＣＤ３ ＨＣ及びＬＣ一本鎖］
Figure 2023546791000008
配列番号７
Figure 2023546791000009
配列番号８
Figure 2023546791000010
配列番号９
Figure 2023546791000011
配列番号１０
Figure 2023546791000012
配列番号１１
Figure 2023546791000013
配列番号１２
Figure 2023546791000014
配列番号１３
Figure 2023546791000015
配列番号１４
Figure 2023546791000016
配列番号１５
Figure 2023546791000017
配列番号１６
Figure 2023546791000018
配列番号１７
Figure 2023546791000019
配列番号１８
Figure 2023546791000020
修飾されたリーダー配列に下線を付した配列番号１９［ＭＥＳ軽鎖ｃＤＮＡ］
Figure 2023546791000021
本明細書を読めば当業者に明らかとなる本発明のこれら及び他の態様は、腫瘍微小環境の免疫状態にかかわらず、メソテリン発現がんを有する患者における治療応答を改善するのに使用するための方法、組成物、及びキットを提供するものである。ＣＡ１２５阻害に関するＭＥＳ－ＡＤＣ及び／又はＭＥＳ－ＢＳＰ薬剤の不応性は、この治療の改善に寄与している。
[本発明1001]
配列番号7～12に示されるアミノ酸を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む抗メソテリン抗体と、トポイソメラーゼ阻害剤とを含む、抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）。
[本発明1002]
前記抗体が、配列番号1及び配列番号2のアミノ酸配列を含む、本発明1001のＡＤＣ。
[本発明1003]
前記抗体が、前記トポイソメラーゼ阻害剤に共有結合している、本発明1001のＡＤＣ。
[本発明1004]
前記抗体が、切断可能リンカーを介してトポイソメラーゼ阻害剤に結合している、本発明1001のＡＤＣ。
[本発明1005]
リポソームに封入されている、本発明1004のＡＤＣ。
[本発明1006]
前記トポイソメラーゼ阻害剤が、（2Ｓ，4Ｓ）－2，5，12－トリヒドロキシ－7－メトキシ－4－｛［（1Ｓ，3Ｒ，4ａＳ，9Ｓ，9ａＲ，10ａＳ）－9－メトキシ－1－メチルオクタヒドロ－1Ｈ－ピラノ［4’，3’：4，5］［1，3］オキサゾロ［2，3－ｃ］［1，4］オキサジン－3－イル］オキシ｝－6，11－ジオキソ－1，2，3，4，6，11－ヘキサヒドロテトラセン－2－カルボン酸（ＰＮＵ159682）である、本発明1003のＡＤＣ。
[本発明1007]
ＰＮＵ159682が、リンカーであるマレイミドカプロイル－バリン－シトルリン－ｐ－アミノベンゾイルオキシカルボニル（ＭＡ－ＰＥＧ4－ＶＣ－ＰＡＢ－ＤＭＡＥ）を介して前記抗メソテリン抗体に共有結合している、本発明1006のＡＤＣ。
[本発明1008]
前記リンカーが、前記抗メソテリン抗体中のシステインに結合している、本発明1007のＡＤＣ。
[本発明1009]
前記抗体が、配列番号1及び配列番号2のアミノ酸配列を含む、本発明1007のＡＤＣ。
[本発明1010]
前記ＡＤＣのＤＡＲが2以上6以下である、本発明1009のＡＤＣ。
[本発明1011]
前記トポイソメラーゼ阻害剤が、（2Ｓ，3Ｓ，4Ｓ，5Ｒ，6Ｓ）－6－［［（19Ｓ）－10，19－ジエチル－19－ヒドロキシ－14，18－ジオキソ－17－オキサ－3，13－ジアザペンタシクロ［11．8．0．02，11．04，9．015，20］ヘンイコサ－1（21），2，4（9），5，7，10，15（20）－ヘプタエン－7－イル］オキシ］－3，4，5－トリヒドロキシオキサン－2－カルボン酸（ＳＮ38）である、本発明1007のＡＤＣ。
[本発明1012]
ＳＮ38が、リンカーであるメチル（2Ｓ，3Ｓ，4Ｓ，5Ｒ，6Ｓ）－3，4，5－トリアセチルオキシ－6－［2－アミノ－4－（ヒドロキシメチル）フェノキシ］オキサン－2－カルボキシレート（ＭＡＣ－グルクロニド）を介して前記抗メソテリン抗体に共有結合している、本発明1011のＡＤＣ。
[本発明1013]
ＳＮ38が、リンカーであるＰＥＧ8トリアゾール－ＰＡＢＣ－ペプチド－ＭＣを介して前記抗メソテリン抗体に共有結合している、本発明1011のＡＤＣ。
[本発明1014]
ＳＮ38が、前記抗メソテリン抗体中のシステインに共有結合している、本発明1011のＡＤＣ。
[本発明1015]
前記抗メソテリン抗体が、配列番号1及び配列番号2のアミノ酸配列を含む、本発明1011のＡＤＣ。
[本発明1016]
2以上6以下のＤＡＲを有する、本発明1015のＡＤＣ。
[本発明1017]
メソテリン発現腫瘍を有するがん患者を治療する方法であって、
配列番号7～12に示されるアミノ酸を含む抗メソテリン抗体とトポイソメラーゼ阻害剤とを含む抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）を、前記患者に投与すること
を含む、方法。
[本発明1018]
前記がんが、中皮腫、乳がん、肺がん、結腸直腸がん、胃腸がん、子宮内膜がん、胆管がん、及び膵臓がんからなる群から選択される、本発明1017の方法。
[本発明1019]
前記患者からの身体試料を、配列番号7～12のアミノ酸配列を含む抗体と接触させることによって、前記患者においてメソテリンエピトープの存在を検出するステップ
を更に含む、本発明1017の方法。
[本発明1020]
前記患者が、健康なヒトの集団と比較して高レベルのＣＡ125を有する、本発明1017の方法。
[本発明1021]
二重特異性抗体を投与することによって複数の患者が治療され、前記複数の患者が、健康なヒトの集団と比較して高レベルのＣＡ125を有する少なくとも1人の患者と、正常レベルのＣＡ125を有する少なくとも1人の患者とを含む、本発明1017の方法。
[本発明1022]
配列番号7～12のアミノ酸配列を含むメソテリン結合部分と、細胞表面抗原ＣＤ3結合部分とを含む、二重特異性抗体（ＢＳＰ）。
[本発明1023]
前記細胞表面抗原ＣＤ3結合部分が、配列番号13～18のＣＤＲアミノ酸配列を含む、本発明1022の二重特異性抗体。
[本発明1024]
配列番号6のアミノ酸配列を含むヒト細胞表面抗原ＣＤ3を認識する一本鎖抗体に融合された、配列番号1のアミノ酸配列を含む抗メソテリン抗体の軽鎖
を含む、本発明1022の二重特異性抗体。
[本発明1025]
前記二重特異性抗体が、配列番号1のアミノ酸配列を含む抗メソテリン抗体の軽鎖を含み、前記軽鎖が、アミノ酸ＧＧＧＧＳ（配列番号20）の1つ以上の単位を含むスペーサー単位によって前記ＣＤ3一本鎖抗体に結合している、本発明1022の二重特異性抗体。
[本発明1026]
本発明1022の二重特異性抗体をコードする、核酸ベクター。
[本発明1027]
配列番号4及び配列番号5の核酸配列を含む、本発明1026の核酸ベクター。
[本発明1028]
本発明1022の二重特異性抗体をコードする1つ以上の核酸を含む、安定な細胞株。
[本発明1029]
前記1つ以上の核酸が、配列番号4及び配列番号5の核酸配列を含む、本発明1028の安定な細胞株。
[本発明1030]
患者においてメソテリン発現がんを治療するための方法であって、
本発明1022の二重特異性抗体を前記患者に投与し、それによって前記メソテリン発現がんを治療すること
を含む、方法。
[本発明1031]
前記メソテリン発現がんが、中皮腫、乳がん、肺がん、結腸直腸がん、胃腸がん、子宮内膜がん、胆管がん、及び膵臓がんからなる群から選択される、本発明1030の方法。
[本発明1032]
前記患者の身体試料を、配列番号7～12のアミノ酸配列を含む相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む抗体と接触させ、それによって、前記患者の前記がんにおいてメソテリンエピトープを検出することにより、前記患者を試験するステップ
を更に含む、本発明1030の方法。
[本発明1033]
前記二重特異性抗体を投与することによって複数の患者が治療され、前記複数の患者が、健康なヒトの集団と比較して高レベルのＣＡ125を有する少なくとも1人の患者と、正常レベルのＣＡ125を有する少なくとも1人の患者とを含む、本発明1030の方法。
[本発明1034]
前記患者が、健康なヒトの集団と比較して高レベルのＣＡ125を有する、本発明1030の方法。

Claims (34)

  1. 配列番号７～１２に示されるアミノ酸を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む抗メソテリン抗体と、トポイソメラーゼ阻害剤とを含む、抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）。
  2. 前記抗体が、配列番号１及び配列番号２のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のＡＤＣ。
  3. 前記抗体が、前記トポイソメラーゼ阻害剤に共有結合している、請求項１に記載のＡＤＣ。
  4. 前記抗体が、切断可能リンカーを介してトポイソメラーゼ阻害剤に結合している、請求項１に記載のＡＤＣ。
  5. リポソームに封入されている、請求項４に記載のＡＤＣ。
  6. 前記トポイソメラーゼ阻害剤が、（２Ｓ，４Ｓ）－２，５，１２－トリヒドロキシ－７－メトキシ－４－｛［（１Ｓ，３Ｒ，４ａＳ，９Ｓ，９ａＲ，１０ａＳ）－９－メトキシ－１－メチルオクタヒドロ－１Ｈ－ピラノ［４’，３’：４，５］［１，３］オキサゾロ［２，３－ｃ］［１，４］オキサジン－３－イル］オキシ｝－６，１１－ジオキソ－１，２，３，４，６，１１－ヘキサヒドロテトラセン－２－カルボン酸（ＰＮＵ１５９６８２）である、請求項３に記載のＡＤＣ。
  7. ＰＮＵ１５９６８２が、リンカーであるマレイミドカプロイル－バリン－シトルリン－ｐ－アミノベンゾイルオキシカルボニル（ＭＡ－ＰＥＧ４－ＶＣ－ＰＡＢ－ＤＭＡＥ）を介して前記抗メソテリン抗体に共有結合している、請求項６に記載のＡＤＣ。
  8. 前記リンカーが、前記抗メソテリン抗体中のシステインに結合している、請求項７に記載のＡＤＣ。
  9. 前記抗体が、配列番号１及び配列番号２のアミノ酸配列を含む、請求項７に記載のＡＤＣ。
  10. 前記ＡＤＣのＤＡＲが２以上６以下である、請求項９に記載のＡＤＣ。
  11. 前記トポイソメラーゼ阻害剤が、（２Ｓ，３Ｓ，４Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）－６－［［（１９Ｓ）－１０，１９－ジエチル－１９－ヒドロキシ－１４，１８－ジオキソ－１７－オキサ－３，１３－ジアザペンタシクロ［１１．８．０．０２，１１．０４，９．０１５，２０］ヘンイコサ－１（２１），２，４（９），５，７，１０，１５（２０）－ヘプタエン－７－イル］オキシ］－３，４，５－トリヒドロキシオキサン－２－カルボン酸（ＳＮ３８）である、請求項７に記載のＡＤＣ。
  12. ＳＮ３８が、リンカーであるメチル（２Ｓ，３Ｓ，４Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）－３，４，５－トリアセチルオキシ－６－［２－アミノ－４－（ヒドロキシメチル）フェノキシ］オキサン－２－カルボキシレート（ＭＡＣ－グルクロニド）を介して前記抗メソテリン抗体に共有結合している、請求項１１に記載のＡＤＣ。
  13. ＳＮ３８が、リンカーであるＰＥＧ８トリアゾール－ＰＡＢＣ－ペプチド－ＭＣを介して前記抗メソテリン抗体に共有結合している、請求項１１に記載のＡＤＣ。
  14. ＳＮ３８が、前記抗メソテリン抗体中のシステインに共有結合している、請求項１１に記載のＡＤＣ。
  15. 前記抗メソテリン抗体が、配列番号１及び配列番号２のアミノ酸配列を含む、請求項１１に記載のＡＤＣ。
  16. ２以上６以下のＤＡＲを有する、請求項１５に記載のＡＤＣ。
  17. メソテリン発現腫瘍を有するがん患者を治療する方法であって、
    配列番号７～１２に示されるアミノ酸を含む抗メソテリン抗体とトポイソメラーゼ阻害剤とを含む抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）を、前記患者に投与すること
    を含む、方法。
  18. 前記がんが、中皮腫、乳がん、肺がん、結腸直腸がん、胃腸がん、子宮内膜がん、胆管がん、及び膵臓がんからなる群から選択される、請求項１７に記載の方法。
  19. 前記患者からの身体試料を、配列番号７～１２のアミノ酸配列を含む抗体と接触させることによって、前記患者においてメソテリンエピトープの存在を検出するステップ
    を更に含む、請求項１７に記載の方法。
  20. 前記患者が、健康なヒトの集団と比較して高レベルのＣＡ１２５を有する、請求項１７に記載の方法。
  21. 二重特異性抗体を投与することによって複数の患者が治療され、前記複数の患者が、健康なヒトの集団と比較して高レベルのＣＡ１２５を有する少なくとも１人の患者と、正常レベルのＣＡ１２５を有する少なくとも１人の患者とを含む、請求項１７に記載の方法。
  22. 配列番号７～１２のアミノ酸配列を含むメソテリン結合部分と、細胞表面抗原ＣＤ３結合部分とを含む、二重特異性抗体（ＢＳＰ）。
  23. 前記細胞表面抗原ＣＤ３結合部分が、配列番号１３～１８のＣＤＲアミノ酸配列を含む、請求項２２に記載の二重特異性抗体。
  24. 配列番号６のアミノ酸配列を含むヒト細胞表面抗原ＣＤ３を認識する一本鎖抗体に融合された、配列番号１のアミノ酸配列を含む抗メソテリン抗体の軽鎖
    を含む、請求項２２に記載の二重特異性抗体。
  25. 前記二重特異性抗体が、配列番号１のアミノ酸配列を含む抗メソテリン抗体の軽鎖を含み、前記軽鎖が、アミノ酸ＧＧＧＧＳ（配列番号２０）の１つ以上の単位を含むスペーサー単位によって前記ＣＤ３一本鎖抗体に結合している、請求項２２に記載の二重特異性抗体。
  26. 請求項２２に記載の二重特異性抗体をコードする、核酸ベクター。
  27. 配列番号４及び配列番号５の核酸配列を含む、請求項２６に記載の核酸ベクター。
  28. 請求項２２に記載の二重特異性抗体をコードする１つ以上の核酸を含む、安定な細胞株。
  29. 前記１つ以上の核酸が、配列番号４及び配列番号５の核酸配列を含む、請求項２８に記載の安定な細胞株。
  30. 患者においてメソテリン発現がんを治療するための方法であって、
    請求項２２に記載の二重特異性抗体を前記患者に投与し、それによって前記メソテリン発現がんを治療すること
    を含む、方法。
  31. 前記メソテリン発現がんが、中皮腫、乳がん、肺がん、結腸直腸がん、胃腸がん、子宮内膜がん、胆管がん、及び膵臓がんからなる群から選択される、請求項３０に記載の方法。
  32. 前記患者の身体試料を、配列番号７～１２のアミノ酸配列を含む相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む抗体と接触させ、それによって、前記患者の前記がんにおいてメソテリンエピトープを検出することにより、前記患者を試験するステップ
    を更に含む、請求項３０に記載の方法。
  33. 前記二重特異性抗体を投与することによって複数の患者が治療され、前記複数の患者が、健康なヒトの集団と比較して高レベルのＣＡ１２５を有する少なくとも１人の患者と、正常レベルのＣＡ１２５を有する少なくとも１人の患者とを含む、請求項３０に記載の方法。
  34. 前記患者が、健康なヒトの集団と比較して高レベルのＣＡ１２５を有する、請求項３０に記載の方法。
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