KR20230071882A - 돌배 추출물의 플라보노이드 및/또는 폴리페놀을 유효성분으로 하는 FOXO3a 유전자의 활성화를 통한 인간 세포노화 및 피부노화 억제용 조성물 - Google Patents
돌배 추출물의 플라보노이드 및/또는 폴리페놀을 유효성분으로 하는 FOXO3a 유전자의 활성화를 통한 인간 세포노화 및 피부노화 억제용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 돌배 추출물을 유효성분으로 험유하는 인간 세포노화 및 피부노화 억제용 조성물에 관한 것으로, 본 발명에 따르면 돌배 추출물의 플라보노이드 및/또는 폴리페놀을 유효성분으로 함유함으로써 FoxO3a 유전자의 발현 및/또는 활성화를 유도할 수 있는 조성물을 제공하고, 상기 FoxO3a 유전자의 활성화를 통하여 노화 방지에 효과적인 약학적 조성물, 화장료 조성물 및 식품 조성물을 제공한다.
Description
본 발명은 돌배 추출물을 유효성분으로 인간 세포노화 및 피부노화 억제용 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는, 돌배 추출물 또는 돌배 추출물 유래 폴리페놀을 유효성분으로 함유함으로써 FoxO3a 유전자의 발현 증가 및/또는 활성화를 유도를 통한 인간 세포노화 및 피부노화 억제용 조성물에 관한 것이다.
노화는 나이가 들면서 모든 조직과 기관의 기능이 쇠퇴하면서 나타나는 현상으로 인간이 살아가는 동안 필연적으로 수반되는 현상이다. 노화가 일어나는 과정 및 기전은 아직도 많은 연구에도 불구하고 정확하게 밝혀지지 않은 상태다. 특히 인간 개체 수준의 노화 연구는 매우 오랜 시간이 걸리기 때문에 연구가 힘들고, 기관과 조직의 노화 과정 또한 각기 다르기 때문에 아직 더 많은 연구가 필요한 상태이다.
노화와 관련된 유력한 가설인 산화적 스트레스 이론(oxidative stress theory)에 따르면, 평상시에 숨을 쉴 때 공기 중의 산소를 흡입하여 미토콘드리아에서 포도당을 산화하여 에너지를 얻는 호흡 과정과 동시에 만들어지는 활성산소에 의해 우리 몸의 조직과 기관 및 그를 구성하는 세포를 파괴할 수 있다. 또한, 활성산소에 의한 세포의 공격은 유전자, 단백질, 지방을 분해시키고, 변형을 유발하며, 특히 유전자의 공격은 돌연변이를 유발하여 암의 발생을 유발 및 노화를 진행시키는 것으로 보고되어 있다.
정상 인간 피부 섬유아세포는 약 50번 정도의 분열을 하다가 세포노화를 보여주면서 세포 모양이 커지고 분열속도가 점차 늦어지다 최종적으로 멈추게 되는데, 이 현상을 세포노화(cellular senescence)라 알려져 있다. 인간섬유아세포의 경우는 일반적으로 세포노화 현상을 나타낼 때까지 약 50번의 최대분열수 (maximum population doubling number)를 보여준다. 이때 세포노화의 표지자의 하나로 SA-
-Gal (senescence-associated beta- galatosidase)이라는 효소가 증가하는데 이 효소의 활성을 x-Gal이라는 반응물로 염색하면 노화된 세포에서만 핵 주변에 파랗게 염색된다. 이 염색 정도를 통하여 인간 피부섬유아세포의 노화 정도를 측정할 수 있으며, 항노화물질을 피부섬유아세포 배양에 첨가하고 나타나는 최대분열수 및 SA-
-Gal염색정도를 측정하여 항노화물질의 노화억제 효과를 측정할 수 있다.
FoxO3a는 장수유전자로 알려진 FoxO3(Forhead box O3)에 의해 인코딩되는 단백질이며, 인슐린 신호전달경로에 위치하는 전사인자로서 MnSOD 및 Catalase와 같은 효소 발현에 작용하는 단백질이다. FoxO3a가 활성화되면 생체 내 방어 기작이 활성화되는데, 이런 작용을 통해 항노화 효능이 발휘된다.
한편, 돌배나무(Pyrus pyrifolia (Burm.) Nakai)는 장미과의 '낙엽 큰 잎 작은 키 나무'다. 돌처럼 딱딱한 배가 열리는 나무에서 이름이 붙여졌다. 중부 이남 표고 700 m 이하의 산록에 자생한다. 꼭지돌배나무, 돌배, 산배나무라고도 부른다. 원산지는 한국, 중국, 일본이다. 잎은 어긋나기를 하고 달걀모양의 타원형 또는 달걀형이다. 잎의 길이는 7~12 ㎝, 너비는 4~6.5 ㎝이다. 잎의 양면은 털이 없거나 혹은 어릴 때 갈색의 솜털이 있다. 꽃은 암수한몸 양성화(兩性花)로 4~5월에 백색으로 피는데, 6~9개의 작은 꽃이 산형화서로 달린다. 꽃의 지름은 3.5~4 ㎝이고, 꽃줄기에는 어릴 때 작고 가는 털이 있다. 줄기는 곧게 선다. 어린 가지는 통통하고 암갈색인데, 처음에는 털이 있다가 후에 떨어진다. 많은 개량종이 있으며 변종으로 일본배나무가 있다.
이러한 돌배(나무)는 가을에 익은 열매를 따서 생과일을 먹거나, 즙을 내어 마시거나, 말려서 기침, 설사 및 갈증이 나는데 쓰이기도 한다. 또한, 돌배의 섬유소가 혈중 콜레스테롤 농도를 저하시키는 효능이 있는 것으로 알려져 있을 뿐이다.
본 발명자들은 상기 돌배의 추출물 또는 돌배 추출물 유래 폴리페놀이 FoxO3a 유전자의 발현 증가 및/또는 활성화를 유도한다는 것을 발견하고, 상기 FoxO3a 유전자의 활성화가 인간 세포노화 및 피부노화에 대한 탁월한 억제 효과가 있음을 발견함으로써, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 일 목적은 돌배 추출물을 이용하여 FoxO3a 유전자의 활성화를 유도할 수 있는 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 FoxO3a 유전자의 활성화를 유도할 수 있는 조성물을 유효성분으로 함유함으로써, 세포노화 및 피부노화 방지에 효과적인 약학적 조성물, 화장료 조성물 및 식품 조성물을 제공하는데 있다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 일 실시예에서, 돌배 추출물을 유효성분으로 함유하는 FoxO3a 유전자 활성화용 조성물을 제공한다.
본 발명은 다른 일 실시예에서, 상기 돌배 추출물을 유효성분으로 함유하는 세포노화 억제용 약학 조성물, 화장료 조성물 및 식품 조성물을 제공한다.
본 발명은 또 다른 일 실시예에서, 상기 돌배 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부노화 억제용 약학 조성물, 화장료 조성물 및 식품 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 돌배 추출물을 유효성분으로 함유하는 조성물은 FoxO3a 유전자의 발현 및/또는 활성화를 유도함으로써, 인간 세포노화에 대한 우수한 억제 효과가 있다. 이에 따라, 세포노화 및 피부노화 방지에 효과적인 약학적 조성물, 화장료 조성물 및 식품 조성물로서 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 웨스턴 블롯 분석(Western blot assay) 결과를 나타낸 것이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 실시적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
본 발명자들은 FoxO3a 유전자를 활성화시키기 위한 연구를 거듭한 결과, 돌배 추출물에 포함되어 있는 폴리페놀(polyphenols)이 FoxO3a 유전자의 발현 증가 및/또는 활성화를 유도함으로써, MnSOD 효소가 활성화되고, 이에 따라 활성산소를 효과적으로 제거 가능함을 확인하고, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
본 발명에서 사용된 돌배는, 그 형태에 특별한 제한이 없으며, 본 발명의 조성물은 돌배로부터 얻어진 추출물을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에서 용어, "추출물"은 천연물로부터 분리된 활성 성분을 의미하며, 여기서는 상기 돌배로부터 분리된 물질을 의미한다.
상기 돌배 추출물은 돌배에 물, C1 내지 C4의 직쇄 또는 분지형 알코올, 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 용매를 가하여 통상의 추출방법으로 얻어진 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 유효성분의 높은 추출 수율 및 우수한 항산화 활성 효과를 달성하기 위하여, 상기 추출물은 돌배에 20 내지 80 %(v/v) 에탄올을 가하여 얻어진 에탄올 추출물일 수 있다.
상기 통상의 추출 방법은, 예컨대 침지추출, 열수추출, 가열추출, 가압추출, 환류추출, 온침추출, 임계추출, 초음파추출 등에 따른 것일 수 있으며, 바람직하게는 침지추출 방법에 의할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
추출 시 온도는 실온, 즉 섭씨 25 내지 27 ℃에서 수행될 수 있으며, 추출 시간은 1일 내지 7 일일 수 있다. 당 업계의 추출 방법은 1회 내지 5회 반복하여 추출될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에서는 돌배 추출물을 유효성분으로 포함하는 FoxO3a 유전자 활성화용 조성물을 제공한다. 바람직하게는 상기 유효성분은 폴리페닐(polyphenol)일 수 있고, 바람직하게는 플라보노이드(flavonoid) 일 수 있으며, 더 바람직하게는 안토시아닌일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
단, 본 발명에 있어서, 상기 "플라보노이드(flavonoid)"란, 비질소성의 생물색소에 해당하며, 식물에서 광범위하게 나타난다. 상기 성분은 폴리페놀 화합물에 해당하는 것으로, 멜라닌 색소의 생성을 완화시켜 미백효과를 낼 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서 상기 조성물은 FoxO3a 유전자의 인산화를 증진시킴으로써, FoxO3a 유전자의 발현 및/또는 활성화를 유도할 수 있다. 바람직하게는 상기 인산화는 FoxO3a 단백질의 413번 자리에 인산화 되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
단, 본 발명에 있어서, 상기 " FoxO3a"란, 장수 유전자로 알려진 Forhead box O family 유전자 (FOXO1, FOXO3a, FOXO4, FOXO6)의 하나로 여러 신호 또는 자극에 의해 단백질 변형이 이루어져 전사 활성이 조절된다.
본 발명에 따른 상기 조성물은 활성 산소종(reactive oxygen species; ROS)의 생성을 억제함으로써 항산화 효능을 발휘할 수 있으므로, 세포노화 억제용 조성물로 사용될 수 있다. 여기서 상기 노화 억제용 조성물은 화장료, 식료품, 의약품 또는 의약부외품용으로 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
단, 본 발명에 있어서 상기 "항산화"란, 활성산소종의 생성을 억제함으로써 발휘되는 효능을 의미한다. 상기 활성산소종은 산소가 자유 라디칼(free radical)을 가져 안정되지 못한 상태를 의미하며, 그로 인해 강한 활성을 갖는다는 특징이 있다. 활성산소종은, 체내 효소계, 환원대사, 화학약품, 공해물질 및 광화학반응 등의 각종 물리적, 화학적 및 환경적 요인 등에 의하여 생성된다. 또한, 세포구성 성분인 지질, 단백질, 당 및 DNA 등에 대하여 비선택적, 비가역적인 파괴작용을 함으로써, 세포노화 또는 암을 비롯한 각종 질병을 일으키는 것으로 알려져 있다. 활성산소종이 과잉되면, 생체에 대해 독성 즉, 산화적 손상(oxidative stress)을 가져오는 것으로 보고되어 있다.
또한, 본 발명에 따른 상기 조성물은 상기 활성 산소를 제거하는 효과가 우수하여, 피부노화 억제용 조성물로 사용될 수 있다. 여기서 상기 피부노화 억제용 조성물은 화장료, 식료품 또는 의약부외품용으로 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
단, 본 발명에 있어서, 상기 "피부 노화"이란, 노화에 수반되는 피부에 나타내는 증상으로 예를 들면 피부 주름, 피부 늘어짐, 피부 탄력의 저하를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
단, 상기 노화 억제는 FoxO3a 유전자의 활성으로 인하여 MnSOD 및 카탈라아제(catalase) 유전자의 전사를 활성화시켜 활성 산소를 제거하고, 유전자 손상을 저해하여 기관과 조직의 노화를 지연시키는 역할을 할 수 있다(Nature 419, 316-321(19 September 2002).
또한, 본 발명에 따른 조성물은 상기한 바와 같이, 의약품 또는 의약부외품용 등과 같은 약학 조성물로 사용될 수 있다. 여기서, 상기 약학 조성물은 캡슐, 정제, 과립, 주사제, 연고제, 분말 또는 음료 형태임을 특징으로 할 수 있으며, 상기 약학 조성물은 인간을 대상으로 하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 이들로 한정되는 것은 아니지만, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 캡슐, 정제, 수성 현탁액 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 상기 약학적으로 허용되는 담체는 경구 투여 시에는 결합제, 활탁제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소, 향료 등을 사용할 수 있으며, 주사제의 경우에는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제, 안정화제 등을 혼합하여 사용할 수 있으며, 국소투여용의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제, 보존제 등을 사용할 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물의 제형은 상술한 바와 같은 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 다양하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 경구 투여시에는 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭서(elixir), 서스펜션, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 제조할 수 있으며, 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다수회 투약 형태로 제조할 수 있다. 기타, 용액, 현탁액, 정제, 캡슐, 서방형 제제 등으로 제형할 수 있다.
한편, 제제화에 적합한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말디톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 또는 광물유 등이 사용될 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물의 투여 경로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 구강, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장이 포함된다. 경구 또는 비경구 투하가 바람직하다. 본원에 사용된 용어 "비경구"는 피하, 피내, 정맥내, 근육내, 관절내, 활액낭내, 흉골내, 경막내, 병소내 및 두개골내 주사 또는 주입기술을 포함한다. 본 발명의 약학 조성물은 또한 직장 투여를 위한 좌제의 형태로 투여될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 사용된 특정 화합물의 활성, 연령, 체중, 일반적인 건강, 성별, 정식, 투여시간, 투여경로, 배출율, 약물 배합 및 예방 또는 치료될 특정 질환의 중증을 포함한 여러 요인에 따라 다양하게 변할 수 있고, 상기 약학 조성물의 투여량은 환자의 상태, 체중, 질병의 정도, 약무형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있고, 1일 0.0001 내지 50 mg/kg 또는 0.001 내지 50 mg/kg으로 투여할 수 있다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다. 본 발명에 따른 의약 조성물은 환제, 당의정, 캡슐, 액제, 겔, 시럽, 슬러리, 현탁제로 제형될 수 있다.
본 발명의 다른 일 실시예에서는, 본 발명에 따른 상기 조성물이 세포노화 및 피부노화 억제용 등의 화장료 조성물로 사용될 수 있다. 여기서, 상기 화장료 조성물은 화장수, 영양로션, 영양에센스, 마사지 크림, 미용목욕물첨가제, 바디로션, 바디밀크, 배스오일, 베이비오일, 베이비파우더, 샤워겔, 샤워크림, 썬스크린로션, 썬스크린크림, 썬탠크림, 스킨로션, 스킨크림, 자외선차단용 화장품, 크렌징, 탈모제화장용, 페이스 및 바디로션, 페이스 및 바디크림, 피부미백크림, 핸드로션, 헤어로션, 화장용크림, 오일, 목욕비누, 물비누, 미용비누, 샴푸, 손세정제(핸드클리너), 워시, 세정제, 샴푸, 린스, 치아미백용 겔, 치약 등의 형태로 제조될 수 있다. 이를 위해 본 발명의 조성물은 화장료 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 용매나, 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물 내에 더 추가될 수 있는 용매의 종류는 특별히 한정하지 않으나, 예를 들어, 물, 식염수, DMSO 또는 이들의 조합을 사용할 수 있고, 담체, 부형제 또는 희석제로는 정제수, 오일, 왁스, 지방산, 지방산 알콜, 지방산 에스테르, 계면활성제, 흡습제(humectant), 증점제, 항산화제, 점도 안정화제, 킬레이팅제, 완충제, 저급 알콜 등이 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 필요에 따라 미백제, 보습제, 비타민, 자외선 차단제, 향수, 염료, 항생제, 항박테리아제, 항진균제를 포함할 수 있다.
상기 오일로서는 수소화 식물성유, 피마자유, 면실유, 올리브유, 야자인유, 호호바유, 아보카도유가 이용될 수 있으며, 왁스로는 밀랍, 경랍, 카르나우바, 칸델릴라, 몬탄, 세레신, 액체 파라핀, 라놀린이 이용될 수 있다.
지방산으로는 스테아르산, 리놀레산, 리놀렌산, 올레산이 이용될 수 있고, 지방산 알콜로는 세틸 알콜, 옥틸 도데칸올, 올레일 알콜, 판텐올, 라놀린 알콜, 스테아릴 알콜, 헥사데칸올이 이용될 수 있으며, 지방산 에스테르로는 이소프로필 미리스테이트, 이소프로필 팔미테이트, 부틸 스테아레이트가 이용될 수 있다. 계면 활성제로는 당업계에 알려진 양이온 계면활성제, 음이온 계면활성제 및 비 이온성 계면활성제가 사용가능하며 가능한 한 천연물 유래의 계면활성제가 바람직하다.
그 외에도 화장품 분야에서 널리 알려진 흡습제, 증점제, 항산화제 등을 포함할 수 있으며, 이들의 종류와 양은 당업계에 공지된 바에 따른다.
본 발명의 또 다른 실시예에서는, 본 발명에 따른 조성물은 상기한 바와 같이 세포노화 및 피부노화 억제용 식품 조성물로 사용될 수 있다. 여기서 상기 식품 조성물은 각종 식품류, 예를 들어, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 분말, 과립, 정제, 캡슐, 과자, 떡, 빵 등의 형태로 제조될 수 있다. 본 발명의 식품 조성물은 독성 및 부작용이 거의 없는 식물추출물로 구성된 것이므로 예방 목적으로 장기간 복용 시에도 안심하고 사용할 수 있다.
본 발명의 상기 화합물이 식품 조성물에 포함될 때 그 양은 전체 중량의 0.1 내지 50%의 비율로 첨가할 수 있다.
여기서, 상기 식품 조성물이 음료 형태로 제조되는 경우 지시된 비율로 상기 식품 조성물을 함유하는 것 외에 특별한 제한점은 없으며 통상의 음료와 같이 여러가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 즉, 천연 탄수화물로서 포도당 등의 모노사카라이드, 과당 등의 디사카라이드, 슈크로스 등의 및 폴리사카라이드, 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜 등을 포함할 수 있다. 상기 향미제로서는 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등) 등을 들 수 있다.
그 외 본 발명의 식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다.
이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 본 발명의 핵심적인 요소에 해당하지 아니하지만, 본 발명의 식품 조성물 100 중량부 당 0.1 내지 약 50 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의거하여 더욱 상세히 설명하지만, 이는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 이에 한정되는 것은 아니다.
실시예. 돌배 추출물의 제조
돌배 2종(작은 돌배, 큰 돌배) 준비하고 각각을 추출하여 추출물을 얻었다. 먼저 돌배 표피의 이물질을 물로 세척하여 건조시켰다. 상기 돌배를 4 등분하여, 1 kg을 유리 용기에 넣고, 여기에 3 리터의 80% 또는 20% 에탄올(주정)을 넣어, 실온(섭씨 25 내지 27 ℃)에서 7일간 방치하여 침출하는 과정을 2회 실시하였다. 이어, 7일 후에 감압필터로 여과처리한 추출물을 얻었다. 이 추출물을 진공회전증발기(rotary evaporator)로 감압농축하여 용매를 제거하여 돌배 추출물을 얻었다. 추출에 사용한 돌배의 종과 추출 용매를 정리하여 표 1에 나타내었다.
| 구분 | 돌배 종류 | 추출 용매(에탄올 농도) |
| 실시예 1 | 작은 돌배 | 80% EtOH |
| 실시예 2 | 작은 돌배 | 20% EtOH |
| 실시예 3 | 큰 돌배 | 80% EtOH |
| 실시예 4 | 큰 돌배 | 20% EtOH |
표 1에서와 같이, 얻어진 추출물은 돌배의 종류별, 추출 용매인 에탄올의 농도별로 작은 돌배 80% 에탄올 추출물(실시예 1, 비극성추출물 16.5g, 수율 1.65%, Small P1), 작은 돌배 20% 에탄올 추출물(실시예 2, 극성추출물 17.2g, 수율 1.72%, Small P2), 큰 돌배 80% 에탄올 추출물(실시예 3, 비극성추출물 9.3g, 수율 0.93%, Large P1), 큰 돌배 20% 에탄올 추출물(실시예 4, 극성추출물 11.2g, 수율 1.12%, Large P2)이다.
실험예 1. 인간피부섬유아세포 배양
서울대학교병원 피부과학교실에서 2세 어린아이의 포경수술로부터 제조한 인간피부섬유아세포를 10% fetal bovine serum을 함유하는 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium)을 사용하여 CO2 배양기에서 5% CO2, 37 ℃에서 계대배양하였다.
1:4의 비율로 분주한 세포에 24시간 후, 돌배 추출물을 최종 농도로 10 mg/ml가 되도록 첨가하고, 24시간 경과 후에 세포를 트립신으로 처리하여 수득하고, PBS(phosphate buffered saline)으로 2회 세척한 뒤, 이후 실험에 사용하였다.
세포노화 억제 실험을 위해서 20분열수 (20 population doubling)에서 돌배 추출물 (Small P2, Large P2)을 최종 농도로 10 mg/ml가 되도록 첨가하고, 1:4로 세포를 계대배양 할 때마다 새로이 같은 농도로 첨가하였다.
실험예 2. 단백질 발현 효과
상기 실험예 1에서 돌배 추출물 첨가에 따른 단백질 발현 변화를 확인하기 위하여, 웨스턴 블롯 분석(Western blot assay)을 수행하였다. 상기 분석은 다음의 과정과 같다.
먼저, 상기 웨스턴 블롯 분석에 사용된 단백질의 준비 방법은 하기와 같다. 상기 실시예 1의 돌배추출물을 처리한 세포주에 PBS를 처리하여 수득하고, PBS로 세척 후 단백질 분해 억제제가 포함되어 있는 세포 용해 버퍼((10 mMTris-HCl, pH 7.4, 100 mM NaCl, 5 mM EDTA, 10% glycerol, and 1% NP-40 containing a mixture of protease inhibitors)를 이용하여 얼음에서 30분간 용해시킨 뒤, 초음파 발생 장치(sonication)로 30초간 3회 처리하여 세포를 용해시켰다. 상기 용해된 용액을 원심분리기를 이용하여 전체 용액을 분획한 뒤, 단백질이 포함된 용액만을 추출하였다. 상기 추출된 단백질은 브래드포드(Bradford) 방법에 의해 정량화 하였다. 정량화를 통해 80μg 농도의 단백질을 SDS-폴리아크릴아미드(polyacrylamide) 겔 전기영동을 수행하여 분리한 뒤, 전기이동 (electro transfer) 방법에 의해 PVDF 막에 옮겼다. 단백질이 옮겨진 막은 비 특이적 결합을 줄이기 위하여 5% 탈지유(non-fat milk)가 포함된 TBS-T(Tris-buffered saline/0.05% Tween-20)용액으로 상온에서 1시간 동안 차단(blocking)한 후, 1차 항체를 4 ℃ 조건에서 하룻밤(overnight) 동안 반응시킨 뒤, 2차 항체를 40분 동안 상온에서 반응시켰다. 시각화를 위해서는 PIERCE 제품의 강화된 화학발광 시스템(Enhanced chemiluminescence system)을 이용하였다.
웨스턴 블롯 분석은 FoxO3a, phospho-FoxO3a (S413), AMPK, phospho-AMPK, MnSOD 및 actin 마커(대조군)를 이용하여 수행하였고, 그 결과를 도 1에 도시하였다.
도 1에서 볼 수 있는 바와 같이, 실시예 1 내지 4의 돌배 추출물 모두 10 mg/ml 농도에서 FoxO3a, AMPK, p-AMPK 및 p-FoxO3a의 발현이 상당히 증가되는 것을 확인할 수 있다. 상기 결과를 통하여 돌배 추출물에 의해 AMPK의 활성화 형태인 p-AMPK이 증가됨에 따라 FoxO3a 단백질의 발현이 증가되고, FoxO3a의 활성화(p-FoxO3a)가 증가되는 것을 알 수 있다. 또한, FoxO3a의 표적 유전자라고 알려져 있는 MnSOD의 발현이 증가되어 있는 것을 통하여 활성산소 제거를 통한 항산화 활성이 나타나는 것을 확인할 수 있다.
실험예 3. 인간피부섬유아세포의 노화억제 효과
돌배 추출물 첨가에 따른 세포의 최대분열수 및 SA-β-Gal 염색 인간피부섬유아세포의 노화억제 효과를 측정하기 위하여, 인간피부섬유아세포의 배양에 실시예 2 및 4의 돌배 추출물을 1 mg/ml 첨가하면서 세포의 노화가 나타나는 시점(더 이상 세포분열을 하지 않을 때)까지의 최대분열수를 3회 반복하여 측정하였다.
인간피부섬유아세포의 배양에 실시예 2 및 4의 돌배 추출물을 첨가하고 계대배양을 하여 분열수 50(population doubling 50)에서 세포를 인간피부섬유아세포의 대조군은 아무것도 첨가하지 않은 세포배양의 최대분열수이다. 또한, 세포노화 표지자를 사용한 세포노화 억제효과의 측정은 SA-β-Gal 염색을 사용하였다. 이를 위해 senescence detection kit(sigma, USA)를 사용하였다. 배양된 세포는 배지를 제거하고 1 mL PBS로 1회 세척 후 0.5 mL 고정용액을 첨가하여 상온에서 15분 방치하여 고정화 하였다. 고정된 세포는 다시 1 mL PBS로 2번 세척한 후, 착색용액 혼합액(착색용액 470 μL, 염색 보충제 5 μL, 20 mg/mL X-galin 디메틸포름아미드 25 μL)를 0.5 mL씩 첨가하고 37 ℃ 에서 24시간 동안 염색을 하였다. 염색된 세포는 1 mL PBS로 세척 후 1 mL 70% 글리세롤을 넣고 광학현미경(Olympus,Japan)을 통하여 염색된 세포 수를 측정하였다. 그 결과를 하기 표 2에 나타내었다.
| 처리군 | 최대분열수 | SA-β-Gal 염색율(%) at 50 PD |
| 대조군 (무처리) | 53 ± 1.5 | 60 ± 1.3 |
| 실시예 2 처리군 (1 mg/ml 처리) |
58 ± 1.0 | 54 ± 1.0 |
| 실시예 4 처리군 (1 mg/ml 처리) |
58 ± 1.5 | 55 ± 1.2 |
그 결과, 표 2에서 볼 수 있는 바와 같이, 실시예 2 및 실시예 4의 돌배 추출물은 각각 최대분열수가 대조군 53에 비해 58로 9.4%의 증가를 보여 약 9,4%의 향상된 세포노화 억제효과를 확인할 수 있다. 또한, 분열수 50에서 SA-β-Gal 염색율은 대조군 60%에 비해 각각 55, 54%로 감소하는 것으로, 이는 대조군에 비해 각각 8.3%, 10% 향상된 세포노화 억제효과를 확인할 수 있다.
이상에서 본 발명에 대하여 상세하게 설명하였지만 본 발명의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고, 청구범위에 기재된 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 다양한 수정 및 변형이 가능하다는 것은 당 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게는 자명할 것이다.
Claims (7)
- 돌배에 20 내지 80 %(v/v) 에탄올을 가하여 추출된 플라보노이드(flavonoid) 및/또는 폴리페놀(polyphenol)을 포함하는 돌배 추출물을 유효성분으로 하는 FOXO3a 단백질의 413번에 인산화를 유도하는 FOXO3a 유전자 활성화용 조성물.
- 제 1항의 조성물을 유효성분으로 함유하는 세포노화 억제용 약학 조성물.
- 제 1항의 조성물을 유효성분으로 함유하는 세포노화 억제용 화장료 조성물.
- 제 1항의 조성물을 유효성분으로 함유하는 세포노화 억제용 식품 조성물.
- 제 1항의 조성물을 유효성분으로 함유하는 피부노화 억제용 약학 조성물.
- 제 1항의 조성물을 유효성분으로 함유하는 피부노화 억제용 화장료 조성물.
- 제 1항의 조성물을 유효성분으로 함유하는 피부노화 억제용 식품 조성물.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020210157303A KR20230071882A (ko) | 2021-11-16 | 2021-11-16 | 돌배 추출물의 플라보노이드 및/또는 폴리페놀을 유효성분으로 하는 FOXO3a 유전자의 활성화를 통한 인간 세포노화 및 피부노화 억제용 조성물 |
Applications Claiming Priority (1)
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|---|---|---|---|
| KR1020210157303A KR20230071882A (ko) | 2021-11-16 | 2021-11-16 | 돌배 추출물의 플라보노이드 및/또는 폴리페놀을 유효성분으로 하는 FOXO3a 유전자의 활성화를 통한 인간 세포노화 및 피부노화 억제용 조성물 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20230071882A true KR20230071882A (ko) | 2023-05-24 |
Family
ID=86540864
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020210157303A KR20230071882A (ko) | 2021-11-16 | 2021-11-16 | 돌배 추출물의 플라보노이드 및/또는 폴리페놀을 유효성분으로 하는 FOXO3a 유전자의 활성화를 통한 인간 세포노화 및 피부노화 억제용 조성물 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR20230071882A (ko) |
-
2021
- 2021-11-16 KR KR1020210157303A patent/KR20230071882A/ko not_active Application Discontinuation
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