KR20230069171A - 신규 항-a2ap 항체 및 그의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 인간 A2AP에 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편에 관한 것이다. 본 발명에 따른 단리된 항체 또는 항원-결합 단편은 i) 토끼 및/또는 시노몰구스 A2AP와 교차-반응하고, ii) 인간 플라스민 활성을 억제하지 않고, iii) A2AP의 존재 하에 플라스민 매개된 혈병 용해를 증가시킨다.

Description

신규 항-A2AP 항체 및 그의 용도
본 발명은 인간 알파 2 항플라스민 (A2AP)에 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다. 본 발명에 따른 단리된 항체 또는 항원-결합 단편은 i) 토끼 및/또는 시노몰구스 A2AP와 교차-반응하고/거나, ii) 인간 플라스민에 결합하지 않고 / 인간 플라스민 활성을 억제하지 않고/거나, iii) A2AP를 세린 프로테아제 억제제로부터 세린 프로테아제 기질로 전환시키지 않고/거나, iv) 서열식별번호(SEQ ID NO): 1의 아미노산 40 - 491의 서열의 인간 A2AP에 ≤100 nM, ≤ 50 nM, ≤ 25 nM, ≤10 nM, ≤1 nM, 또는 ≤ 0.5 nM의 해리 상수 (KD)로 결합하고/거나; v) 서열식별번호: 1의 아미노산 40 - 491의 서열의 인간 A2AP에 ≤ 500 nM, ≤ 250 nM, ≤ 100 nM, ≤ 50 nM, ≤ 25 nM, ≤ 10 nM, ≤ 1 nM, 또는 ≤ 0.5 nM의 EC50으로 결합하고/거나; vi) 서열식별번호: 1의 아미노산 40 - 491의 인간 A2AP의 활성을 ≤ 500 nM, ≤ 250 nM, ≤ 100 nM, ≤ 50 nM, ≤ 25 nM, ≤ 10 nM, ≤ 1 nM, 또는 ≤ 0.5 nM의 EC50으로 억제하고/거나; A2AP의 존재 하에 플라스민 매개된 혈병 용해를 증가시킨다.
본 발명은 상기 항체 또는 항원-결합 단편을 코딩하는 단리된 핵산 서열 및 그를 포함하는 벡터, 상기 항체 또는 항원-결합 단편을 발현하는 단리된 세포, 상기 항체 또는 항원-결합 단편을 생산하는 방법, 및 상기 항체 또는 항원-결합 단편을 포함하는 제약 조성물 및 키트를 추가로 제공한다.
본 발명에 따른 항체는 부분 또는 완전 혈관 폐쇄로 인한 허혈성 사건과 연관된 질환, 예컨대 허혈성 졸중, 급성 관상동맥 증후군, 말초 동맥 질환, 심근경색, 심부 정맥 혈전증, 폐 색전증, 정맥 혈전증, 또는 단락 혈전증의 치료에 사용될 수 있다.
혈관 내부에서의 혈병 형성은 허혈성 졸중, 급성 관상동맥 증후군, 말초 동맥 질환, 심근경색, 심부 정맥 혈전증, 폐 색전증, 정맥 혈전증, 또는 단락 혈전증과 같은 다수의 중증 질환을 유발할 수 있다. 혈병 생성 및 지속성은 피브린 및 혈소판에 의한 그의 형성 속도 및 용해 시스템에 의한 그의 용해 속도에 의해 영향을 받는다. 현행 표준 관리는 혈전증의 만성 예방을 위한 항응고에 초점을 맞추며, 이는 여전히 출혈 위험을 동반하는 비-비타민 K 길항제 경구 항응고제 (NOAC)에 의한 모든 개선에도 불구하고 혈병 해소에 대해 단지 간접적인 효과만을 갖는다.
허혈성 또는 색전성 사건을 앓고 있는 환자에 대한 1차 치료 목표는 혈류의 적시 회복이다. 정맥내 (IV) 재조합 조직 플라스미노겐 활성화제 (tPA) 및 혈관내 개입, 예컨대 기계적 혈전절제술 (MT)을 포함한 혈전용해를 사용하는 재관류 요법은, 예를 들어 허혈성 졸중을 앓고 있는 환자를 위한 유일한 승인된 치료이다. 그러나, 둘 다의 치료 옵션은 한계가 있다. 특히 단기-작용 tPA의 경우에, 그의 사용은 강한 출혈 위험의 증가, 신경독성 효과 및 제한된 효능 시간 윈도우로 인해 제한된다.
대조적으로, 주요 내인성 플라스민 억제제 알파2-항플라스민 (a2Ap)의 억제는 출혈 위험을 동반하지 않으면서 병리학적 파라미터를 개선시키는 것으로 보고되었다. 따라서, 알파2-항플라스민의 억제는 혈병 용해의 가속화 및 (2차) 혈전성 사건의 예방을 위한 혁신적인 치료 옵션일 수 있다.
알파2-항플라스민은 세르핀 슈퍼패밀리의 구성원이다. 이는 세린 프로테아제 플라스민의 주요 생리학적 억제제이다. 다음으로 플라스민은 섬유소용해 및 다양한 다른 단백질의 분해에 참여하는 중요한 효소이다. (Tone M, Kikuno R, Kume-Iwaki A, Hashimoto-Gotoh T. Structure of human alpha 2-plasmin inhibitor deduced from the cDNA sequence. J Biochem. 1987;102(5):1033-1041; Silverman GA, Bird PI, Carrell RW, et al., The serpins are an expanding superfamily of structurally similar but functionally diverse proteins. Evolution, mechanism of inhibition, novel functions, and a revised nomenclature. J Biol Chem. 2001;276(36):33293-33296).
알파2-항플라스민은 27개의 아미노산 신호 펩티드를 갖는 491개의 아미노산 전구체로서 합성된다. 분비된 형태는 짧은 프로-펩티드 (잔기 28-39) 및 성숙 쇄 (잔기 40-491)를 나타낸다. 간 및 신장은 a2Ap 생산의 주요 부위이지만, 또한 다른 조직, 예컨대 근육, 장, 중추 신경계, 및 태반도 또한 그의 mRNA를 중간 수준으로 발현한다.
알파2-항플라스민의 혈장 농도는 약 1 마이크로몰 (~70 마이크로그램/ml)이고, 혈장에서의 반감기는 2.6일로 결정된다. (Collen D, Wiman B. Turnover of antiplasmin, the fast-acting plasmin inhibitor of plasma. Blood. 1979;53(2):313-324).
α2-항플라스민의 실험적 치료적 불활성화는 미세혈관 혈전증, 허혈성 뇌 손상, 뇌 종창, 뇌 출혈 및 혈전색전성 졸중 후 사망을 현저하게 감소시킨다 (Reed GL, Houng AK, Wang D. Microvascular thrombosis, fibrinolysis, ischemic injury, and death after cerebral thromboembolism are affected by levels of circulating α2-antiplasmin. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2014;34(12):2586-2593).
미무로(Mimuro) 등은 JPTI-1, A2AP 항체를 기재한다. 사전형성된 A2AP-플라스민-복합체에 대한 JPTI-1의 결합력은 유리 A2AP에 대한 것보다 더 낮았다. JPTI-1은 A2AP-플라스민-복합체의 형성을 방해함으로써 A2AP 활성을 억제하였다. 그러나, 미무로 등은 혈병 용해를 증진시키기 위한 JPTI-1의 사용에 대해서는 침묵한다 (Mimuro, J. et al., Blood 1987; 69:446-453).
선행 기술의 가장 잘 특징화된 공지된 항체 중 1종은 문헌 [Reed et al., (Reed GL. Functional characterization of monoclonal antibody inhibitors of alpha 2-antiplasmin that accelerate fibrinolysis in different animal plasmas. Hybridoma. 1997;16(3):281-286; WO 98/12334, WO 98/12329)]에 기재된, 전형적 마우스 면역화 접근법으로부터 유래된 항체인 77A3이다. 이러한 항체가 뮤린 기원의 것이라는 사실로 인해, 적어도 인간화 캠페인이 수행되었다.
다른 기능 차단 항-알파2-항플라스민 항체는 비-인간 항체로서의 그의 기원으로 인해 (예를 들어 염소로부터 유래된 세르핀 F2 /알파 2-항플라스민 항체 (알앤디(R&D), 카탈로그 번호 AF1484-SP)), 그의 특이성으로 인해 (예를 들어 각각 마우스 특이적 항체 클론 27C9, 4H9, 및 CBYY-I0956 (마이바이오소스(MyBioSource), 카탈로그 번호 MBS135095 및 MBS135076, 크리에이티브 바이오랩스(Creative Biolabs), 카탈로그 번호 CBMAB-I2124-YY)), 또는 이들 항체가 폴리클로날이라는 사실로 인해 (인비트로젠(Invitrogen), 카탈로그 번호 PA5-47142) 치료제로서 적합하지 않다.
따라서, 지금까지 충족되지 않은 부분 또는 완전 혈관 폐쇄로 인한 허혈성 사건과 연관된 질환의 치료에 유용한 신규 치료 A2AP 항체에 대한 큰 필요가 존재한다.
본 발명의 목적
선행 기술에 비추어, 본 발명의 목적은 선행 기술의 A2AP 항체의 단점을 극복한 신규 치료 A2AP 항체를 제공하는 것이다. 특히, 본 발명의 목적은 인간 A2AP의 고친화도 결합제인 신규 A2AP 항체를 제공하는 것이다. 바람직한 A2AP 항체는 토끼 및/또는 시노몰구스 A2AP에 대해 교차-반응성이다. 이는 인간 요법에서 비-면역원성이며, 즉 이는 인간 또는 인간화 항체이다. 바람직한 A2AP 항체는 A2AP에 대해 선택적이며, 특히 이는 인간 플라스민에 결합하지 않고 이를 억제하지 않는다. 그리고 이는 A2AP의 존재 하에 플라스민 매개된 혈병 용해를 증가시킬 수 있다.
이러한 신규 A2AP 항체는 부분 또는 완전 혈관 폐쇄로 인한 허혈성 사건과 연관된 질환, 예컨대 허혈성 졸중, 급성 관상동맥 증후군, 말초 동맥 질환, 심근경색, 심부 정맥 혈전증, 폐 색전증, 정맥 혈전증 또는 단락 혈전증의 치료에서 주요 진전을 제공할 것이다.
발명의 개요
상기 언급된 목적 및 다른 목적은 본 발명의 교시에 의해 달성된다. 본 발명은 알파2-항플라스민에 대해 특이적 친화도를 갖고 대상체에게 치료 이익을 전달할 수 있는 신규 항체의 발견에 기초한다.
따라서, 제1 측면에서, 본 발명은 인간 A2AP에 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편에 관한 것이며, 여기서 상기 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은
i) 토끼 및/또는 시노몰구스 A2AP와 교차반응하고/거나,
ii) 인간 플라스민 활성을 억제하지 않고/거나,
iii) A2AP를 세린 프로테아제 억제제로부터 세린 프로테아제 기질로 전환시키지 않고/거나,
iv) 서열식별번호: 1의 아미노산 40 - 491의 서열의 인간 A2AP에 ≤100 nM, ≤ 50 nM, ≤ 25 nM, ≤10 nM, ≤1 nM, 또는 ≤ 0.5 nM의 해리 상수 (KD)로 결합하고/거나;
v) 서열식별번호: 1의 아미노산 40 - 491의 서열의 인간 A2AP에 ≤ 500 nM, ≤ 250 nM, ≤ 100 nM, ≤ 50 nM, ≤ 25 nM, ≤ 10 nM, ≤ 1 nM, 또는 ≤ 0.5 nM의 EC50으로 결합하고/거나;
vi) 서열식별번호: 1의 아미노산 40 - 491의 인간 A2AP의 활성을 ≤ 500 nM, ≤ 250 nM, ≤ 100 nM, ≤ 50 nM, ≤ 25 nM, ≤ 10 nM, ≤ 1 nM, 또는 ≤ 0.5 nM의 EC50으로 억제하고/거나;
A2AP의 존재 하에 플라스민 매개된 혈병 용해를 증가시킨다.
본 발명에 따른 단리된 항체 또는 항원-결합 단편은 기능 차단 항-알파2-항플라스민 항체 또는 항원-결합 단편이며, 이는 다른 혈전용해촉진 화합물에 전형적인 것으로서 출혈과 같은 원치 않는 부작용으로 이어지지 않으면서 시험관내뿐만 아니라 생체내에서 가속화된 혈병 용해를 유도한다. 따라서, 본 발명에 따른 단리된 항체 또는 항원-결합 단편은 혈관 부분 또는 완전 폐쇄로 인한 허혈성 사건과 연관된 질환, 예컨대 허혈성 졸중, 급성 관상동맥 증후군, 말초 동맥 질환, 심근경색, 심부 정맥 혈전증, 폐 색전증, 정맥 혈전증 또는 단락 혈전증의 치료에 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 단리된 항체 또는 항원-결합 단편은 추가로 A2AP-관련 장애의 진단에 사용될 수 있다.
추가 측면에서, 본 발명은 A2AP에 결합하고 A2AP의 활성을 억제할 수 있는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편에 관한 것이며, 여기서 상기 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 플라스민 활성을 억제하지 않는다.
추가 측면에서, 본 발명은 인간 A2AP에 결합하고 A2AP의 활성을 억제할 수 있는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편에 관한 것이며, 여기서 상기 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열식별번호: 1의 아미노산 402 - 408 (SRMSLSS)을 포함하는 A2AP의 에피토프에 결합한다.
추가 측면에서, 본 발명은 A2AP에 대한 결합에 대해 상기 단리된 항체 또는 항원-결합 단편과 경쟁하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편에 관한 것이다.
추가 측면에서, 본 발명은 본 발명에 따른 단리된 항체 또는 항원 결합 단편을 포함하는 항체 접합체에 관한 것이다.
추가 측면에서, 본 발명은 본 발명에 따른 항체 또는 항원-결합 단편을 코딩하는 단리된 핵산 서열에 관한 것이다.
추가 측면에서, 본 발명은 본 발명에 따른 핵산 서열을 포함하는 벡터에 관한 것이다.
추가 측면에서, 본 발명은 본 발명에 따른 항체 또는 항원-결합 단편을 발현하고/거나 본 발명에 따른 핵산 또는 본 발명에 따른 벡터를 포함하는 단리된 세포에 관한 것이다.
추가 측면에서, 본 발명은 본 발명에 따른 세포의 배양 및 임의로 항체 또는 항원-결합 단편의 정제를 포함하는, 본 발명에 따른 단리된 항체 또는 항원-결합 단편을 생산하는 방법에 관한 것이다.
추가 측면에서, 본 발명은 본 발명에 따른 단리된 항체 또는 항원-결합 단편 또는 본 발명에 따른 항체 접합체를 포함하는 제약 조성물에 관한 것이다.
추가 측면에서, 본 발명은 질환의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 본 발명에 따른 단리된 항체 또는 항원-결합 단편 또는 본 발명에 따른 접합체 또는 본 발명에 따른 제약 조성물에 관한 것이다.
추가 측면에서, 본 발명은 진단제로서 사용하기 위한 본 발명에 따른 단리된 항체 또는 항원-결합 단편 또는 본 발명에 따른 접합체에 관한 것이다.
추가 측면에서, 본 발명은 부분 또는 완전 혈관 폐쇄로 인한 허혈성 사건과 연관된 장애 또는 질환, 예컨대 허혈성 졸중, 급성 관상동맥 증후군, 말초 동맥 질환, 심근경색, 심부 정맥 혈전증, 폐 색전증, 정맥 혈전증, 또는 단락 혈전증의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 본 발명에 따른 단리된 항체 또는 항원-결합 단편 또는 본 발명에 따른 접합체 또는 본 발명에 따른 제약 조성물에 관한 것이다.
추가 측면에서, 본 발명은 특히 응고 캐스케이드의 억제제, 항응고제 및 혈소판 응집 억제제로부터 선택된 1종 이상의 추가의 치료 활성 화합물과 동시, 개별, 또는 순차적 조합으로 사용하기 위한 본 발명에 따른 단리된 항체 또는 항원-결합 단편 또는 본 발명에 따른 접합체 또는 본 발명에 따른 제약 조성물에 관한 것이다.
추가 측면에서, 본 발명은 본 발명에 따른 단리된 항체 또는 항원-결합 단편 또는 본 발명에 따른 접합체 및 사용에 대한 지침서를 포함하는 키트에 관한 것이다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 본 발명의 하기 상세한 설명 및 그에 포함된 예를 참조하여 보다 용이하게 이해될 수 있다.
정의
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 과학 용어는 본 발명이 속하는 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 의미를 갖는다. 그러나, 하기 참고문헌은 본 발명이 속하는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 본 발명에 사용된 많은 용어의 일반적 정의를 제공할 수 있고, 이러한 정의가 관련 기술분야에서 통상적으로 이해되는 의미와 일치하는 한 참조되고 사용될 수 있다. 이러한 참고문헌은 문헌 [Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (2nd ed. 1994); The Cambridge Dictionary of Science and Technology (Walker ed., 1988); Hale & Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology (1991); and Lackie et al., The Dictionary of Cell & Molecular Biology (3d ed. 1999); 및 Cellular and Molecular Immunology, Eds. Abbas, Lichtman and Pober, 2nd Edition, W.B. Saunders Company]을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 관련 기술분야에서 통상적으로 이해되는 의미를 갖는 본원에 사용된 용어의 정의를 제공하는, 관련 기술분야의 통상의 기술자가 입수가능한 임의의 추가의 기술적 자원을 참고할 수 있다. 본 발명의 목적을 위해, 하기 용어가 추가로 정의된다. 추가의 용어는 상세한 설명의 다른 곳에서 정의된다. 본원 및 첨부된 청구범위에 사용된 단수 형태는 문맥이 달리 명백하게 지시하지 않는 한 복수 지시대상을 포함한다. 따라서, 예를 들어, "유전자"에 대한 언급은 1개 이상의 유전자에 대한 언급이고, 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 그의 등가물 등을 포함한다.
본 발명의 문맥에서, 용어 "포함하다" 또는 "포함하는"은 "포함하나 이에 제한되지는 않는"을 의미한다. 용어는 임의의 언급된 특색, 요소, 정수, 단계 또는 성분의 존재를 명시하기 위해 개방형인 것으로 의도되지만, 하나 이상의 다른 특색, 요소, 정수, 단계, 성분 또는 그의 군의 존재 또는 부가를 배제하지는 않는 것으로 의도된다. 따라서, 용어 "포함하는"은 보다 제한적인 용어 "이루어진" 및 "본질적으로 이루어진"을 포함한다. 한 실시양태에서, 본 출원 전반에 걸쳐, 특히 청구범위 내에서 사용된 용어 "포함하는"은 용어 "이루어진"으로 대체될 수 있다.
이와 관련하여, 용어 "약" 또는 "대략"은 주어진 값 또는 범위의 80% 내지 120% 이내, 대안적으로 90% 내지 110% 이내, 예컨대 95% 내지 105% 이내를 의미한다.
용어 "폴리펩티드" 및 "단백질"은 아미노산 잔기의 중합체를 지칭하는 것으로 본원에서 상호교환가능하게 사용된다. 상기 용어는 1개 이상의 아미노산 잔기가 상응하는 자연 발생 아미노산의 인공 화학적 모방체인 아미노산 중합체, 뿐만 아니라 자연 발생 아미노산 중합체 및 비-자연 발생 아미노산 중합체에 적용된다. 달리 나타내지 않는 한, 특정한 폴리펩티드 서열은 또한 그의 보존적으로 변형된 변이체를 함축적으로 포괄한다.
본원에 사용된 "A2AP"는 "세르핀F2" (세르핀 패밀리 F 구성원 2), AAP, API, PLI, 또는 알파-2-PI로도 공지된 "알파2-항플라스민"을 나타낸다. A2AP는 세르핀 슈퍼패밀리의 구성원이다. 이는 세린 프로테아제 플라스민의 주요 생리학적 억제제이다. A2AP는 27개의 아미노산 신호 펩티드를 갖는 491개의 아미노산 전구체로서 합성된다. 분비된 형태는 짧은 프로-펩티드 (잔기 28-39) 및 성숙 쇄 (잔기 40-491)를 나타낸다. 인간 A2AP에 대한 참조 서열은 유니프롯KB(UniProtKB)/스위스-프롯(Swiss-Prot) 데이터 베이스로부터 수탁 번호 P08697-1 (서열식별번호: 1) 하에 입수가능하고, 이는 신호 펩티드 (위치 1-27), 프로-펩티드 (잔기 28-39) 및 성숙 쇄 (잔기 40-491)를 포함한다 (넘버링은 위치 1의 메티오닌에 따름).
인간 A2AP (서열식별번호: 1):
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본원에 사용된 "플라스민"은 "플라스민"을 나타낸다. 플라스민은 예를 들어 혈병에서 피브린을 용해시키는 작용을 하는 것이다. 플라스민은 플라스미노겐 (PLG)으로 불리는 전구효소로서 간으로부터 전신 순환으로 방출된다. 플라스미노겐의 2종의 주요 당형태가 인간에서 존재하며 - 유형 I 플라스미노겐은 2개의 글리코실화 모이어티 (N289에 N-연결되고 T346에 O-연결됨)를 함유하는 반면, 유형 II 플라스미노겐은 단지 단일 O-연결된 당 (T346에 O-연결됨)을 함유한다. 유형 II 플라스미노겐은 유형 I 당형태보다 세포 표면으로 우선적으로 동원된다. 반대로, 유형 I 플라스미노겐은 혈병으로 보다 용이하게 동원되는 것으로 보인다. 순환에서, 플라스미노겐은 폐쇄된, 활성화-저항성 입체형태를 채택한다. 혈병 또는 세포 표면에의 결합 시, 플라스미노겐은 개방 형태를 채택하며, 이는 예를 들어 조직 플라스미노겐 활성화제 (tPA)를 포함한 다양한 효소에 의해 활성 플라스민으로 전환될 수 있다. 피브린은 조직 플라스미노겐 활성화제에 의한 플라스미노겐 활성화를 위한 보조인자이다. 플라스미노겐의 플라스민으로의 전환은 Arg-561과 Val-562 사이의 펩티드 결합의 절단을 수반한다 (위키피디아).
인간 플라스민에 대한 참조 서열은 유니프롯KB/스위스-프롯 데이터 베이스로부터 수탁 번호 P00747-1 하에 입수가능하다 (넘버링은 위치 1의 메티오닌에 따름).
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용어 "항-A2AP 항체" 또는 "항-알파2-항플라스민 항체" 및 "알파2-항플라스민에 결합하는 항체" 또는 "A2AP에 결합하는 항체"는 항체가 알파2-항플라스민의 표적화에 있어서 진단제 및/또는 치료제로서 유용하도록 충분한 친화도로 알파2-항플라스민에 결합할 수 있는 항체를 지칭한다. 한 실시양태에서, 비관련, 비-알파2-항플라스민 단백질에 대한 항 알파2-항플라스민 항체의 결합의 정도는, 예를 들어 표준 ELISA 절차에 의해 측정된 바와 같이, 알파2-항플라스민에 대한 항체의 결합의 약 10% 미만, 약 5% 미만, 또는 약 2% 미만이다. 특정 실시양태에서, 알파2-항플라스민에 결합하는 항체는 ≤ 1μM, ≤ 100 nM, ≤ 10 nM, ≤ 1 nM, ≤ 0.1 nM, ≤ 0.01 nM, 또는 ≤ 0.001 nM (예를 들어 10-8 M 이하, 예를 들어 10-8 M 내지 10-13 M, 예를 들어 10-9M 내지 10-13 M)의 결합 활성 (EC50)을 갖는다. 특정 실시양태에서, 항-알파2-항플라스민 항체는 상이한 종으로부터의 알파2-항플라스민 사이에 보존된 알파2-항플라스민의 에피토프에 결합한다.
본원에 사용된 용어 "항체"는 이뮤노글로불린 분자를 지칭하는 것으로 의도된다. 항체는 전형적으로 디술피드 결합에 의해 상호-연결된 4개의 폴리펩티드 쇄, 2개의 중쇄 (H) (약 50-70 kDa) 및 2개의 경쇄 (L) (약 25 kDa)를 포함할 수 있다. 특정한 실시양태에서, 항체는 폴리펩티드 쇄의 2개의 동일한 쌍으로 구성된다. 각각의 쇄의 아미노-말단 부분은 주로 항원 인식을 담당하는 약 100 내지 110개 또는 그 초과의 아미노산의 "가변" 영역을 포함한다. 중쇄 가변 영역은 본원에서 VH로 약칭되고, 경쇄 가변 영역은 본원에서 VL로 약칭된다. 각각의 쇄의 카르복실-말단 부분은 주로 이펙터 기능을 담당하는 불변 영역을 규정한다. 중쇄 불변 영역은 예를 들어 3개의 도메인 CH1, CH2 및 CH3을 포함할 수 있다. 경쇄 불변 영역은 1개의 도메인 (CL)으로 구성된다. VH 및 VL 영역은 프레임워크 영역 (FR)으로 불리는 보다 보존된 영역이 사이에 배치되어 있는, 상보성 결정 영역 (CDR)으로 불리는 초가변 영역으로 추가로 세분될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 전형적으로 아미노-말단에서 카르복시-말단으로, 예를 들어 하기 순서: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4로 배열된 3개의 CDR 및 최대 4개의 FR로 구성된다.
본원에 사용된 용어 "상보성 결정 영역" (CDR; 예를 들어, CDR1, CDR2, 및 CDR3)은 그의 존재가 항원 결합에 필요한 항체 가변 도메인의 아미노산 잔기를 지칭한다. 각각의 가변 도메인은 전형적으로 CDR1, CDR2 및 CDR3으로 확인되는 3개의 CDR을 갖는다. 각각의 상보성 결정 영역은 카바트(Kabat)에 의해 정의된 바와 같은 "상보성 결정 영역"으로부터의 아미노산 잔기 (예를 들어, 경쇄 가변 도메인 내의 약 잔기 23-36 (L1), 52-58 (L2) 및 91-101 (L3) 및 중쇄 가변 도메인 내의 31-35 (H1), 50-65 (H2) 및 98-110 (H3); (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)) 및/또는 "초가변 루프"로부터의 그러한 잔기 (예를 들어, 경쇄 가변 도메인 내의 약 잔기 26-32 (L1), 50-52 (L2) 및 91-96 (L3) 및 중쇄 가변 도메인 내의 26-32 (H1), 53-55 (H2) 및 96-101 (H3) (Chothia and Lesk; J Mol Biol 196: 901-917 (1987))를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 상보성 결정 영역은 카바트에 따라 정의된 CDR 및 초가변 루프 둘 다로부터의 아미노산을 포함할 수 있다.
"프레임워크" 또는 FR 잔기는 초가변 영역 잔기 이외의 가변 도메인 잔기이다.
어구 "불변 영역"은 이펙터 기능을 부여하는 항체 분자의 부분을 지칭한다.
본원에서 용어 "Fc 영역"은 불변 영역의 적어도 한 부분을 함유하는 이뮤노글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 정의하는데 사용된다. 상기 용어는 천연 서열 Fc 영역 및 변이체 Fc 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 Cys226 또는 Pro230으로부터 중쇄의 카르복실-말단으로 연장된다. 그러나, Fc 영역의 C-말단 리신 (Lys447)은 존재할 수 있거나 또는 존재하지 않을 수 있다. 본원에서 달리 명시되지 않는 한, Fc 영역 또는 불변 영역 내의 아미노산 잔기의 넘버링은 문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991]에 기재된 바와 같은, EU 인덱스로도 불리는 EU 넘버링 시스템에 따른다.
이뮤노글로불린은 그의 중쇄의 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라 상이한 부류로 할당될 수 있다. 중쇄는 뮤 (μ), 델타 (Δ), 감마 (γ), 알파 (α), 및 엡실론 (ε)으로 분류되고, 항체의 이소형을 각각 IgM, IgD, IgG, IgA 및 IgE로 규정한다. 특정한 실시양태에서, 본 발명에 따른 항체는 IgG 항체이다. 이들 중 몇몇은 하위부류 또는 이소형, 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2로 추가로 나뉠 수 있다. 특정한 실시양태에서, 본 발명에 따른 항체는 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 항체, 보다 특히 IgG1 또는 IgG4 항체이다. 상이한 이소형은 상이한 이펙터 기능을 가질 수 있다. 인간 경쇄는 카파 (K) 및 람다 (λ) 경쇄로 분류된다. 경쇄 및 중쇄 내에서, 가변 및 불변 영역은 약 12개 이상의 아미노산의 "J" 영역에 의해 연결되고, 중쇄는 또한 약 10개 이상의 아미노산의 "D" 영역을 포함한다. 일반적으로, 문헌 [Fundamental Immunology, Ch. 7 (Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y. (1989))]을 참조한다.
본원에서 항체/이뮤노글로불린의 "기능적 단편" 또는 "항원-결합 항체 단편"은 항원-결합 영역을 보유하는 항체/이뮤노글로불린의 단편 (예를 들어, IgG의 가변 영역)으로서 정의된다. 항체의 "항원-결합 영역"은 전형적으로 항체의 1개 이상의 초가변 영역(들), 예를 들어 CDR1, -2, 및/또는 -3 영역에서 발견되지만; 가변 "프레임워크" 영역은 또한 예컨대 CDR에 대한 스캐폴드를 제공함으로써 항원 결합에서 중요한 역할을 할 수 있다. 바람직하게는, "항원-결합 영역"은 적어도 가변 경쇄 (VL)의 아미노산 잔기 4 내지 103 및 가변 중쇄 (VH)의 5 내지 109, 보다 바람직하게는 VL의 아미노산 잔기 3 내지 107 및 VH의 4 내지 111을 포함하고, 완전한 VL 및 VH 쇄 (VL의 아미노산 위치 1 내지 109 및 VH의 1 내지 113; WO 97/08320에 따른 넘버링)가 특히 바람직하다.
"기능적 단편" 또는 "항원-결합 항체 단편"의 비제한적 예는 Fab, Fab', F(ab')2, Fv 단편, 도메인 항체 (dAb), 상보성 결정 영역 (CDR) 단편, 단일-쇄 항체 (scFv), 단일 쇄 항체 단편, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, 미니바디, 선형 항체 (Zapata et al., Protein Eng.,8 (10): 1057-1062 (1995)); 킬레이팅 재조합 항체, 트리바디 또는 비바디, 인트라바디, 나노바디, 소형 모듈 면역제약 (SMIP), 항원-결합-도메인 이뮤노글로불린 융합 단백질, 낙타화 항체, VHH 함유 항체, 또는 뮤테인 또는 그의 유도체, 및 항체가 목적하는 생물학적 활성을 보유하는 한, 폴리펩티드에 특이적 항원 결합을 부여하기에 충분한 이뮤노글로불린의 적어도 한 부분, 예컨대 CDR 서열을 함유하는 폴리펩티드; 및 다중특이적 항체, 예컨대 항체 단편으로부터 형성된 이중- 및 삼중특이적 항체 (C. A. K Borrebaeck, editor (1995) Antibody Engineering (Breakthroughs in Molecular Biology), Oxford University Press; R. Kontermann & S. Duebel, editors (2001) Antibody Engineering (Springer Laboratory Manual), Springer Verlag)를 포함한다. "이중특이적" 또는 "이중기능적" 항체 이외의 항체는 각각의 그의 결합 부위가 동일한 것으로 이해된다. F(ab')2 또는 Fab는 CH1 및 CL 도메인 사이에 발생하는 분자간 디술피드 상호작용을 최소화하거나 완전히 제거하도록 조작될 수 있다. 항체의 파파인 소화는 각각 단일 항원-결합 부위를 갖는 "Fab" 단편으로 불리는 2개의 동일한 항원-결합 단편, 및 그의 명칭이 용이하게 결정화되는 그의 능력을 반영하는 것인 나머지 "Fc" 단편을 생산한다. 펩신 처리는 2개의 "Fv" 단편을 갖는 F(ab')2 단편을 생성한다. "Fv" 단편은 완전한 항원 인식 및 결합 부위를 함유하는 최소 항체 단편이다. 이 영역은 단단하게 비-공유 회합된 1개의 중쇄 및 1개의 경쇄 가변 도메인의 이량체로 이루어진다. 각각의 가변 도메인의 3개의 CDR이 상호작용하여 VH-VL 이량체의 표면 상에 항원 결합 부위를 규정하는 것은 이러한 구성이다. 집합적으로, 6개의 CDR은 항체에 항원-결합 특이성을 부여한다. 그러나, 심지어 단일 가변 도메인 (또는 항원에 특이적인 3개의 CDR만을 포함하는 Fv의 절반)도 항원을 인식하고 결합하는 능력을 갖는다.
"단일-쇄 Fv" 또는 "sFv" 또는 "scFv" 항체 단편은 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함하며, 여기서 이들 도메인은 단일 폴리펩티드 쇄로 존재한다.
바람직하게는, Fv 폴리펩티드는 Fv가 항원 결합을 위한 목적하는 구조를 형성할 수 있게 하는, VH 및 VL 도메인 사이의 폴리펩티드 링커를 추가로 포함한다. Fv의 검토를 위해, 문헌 [Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)]을 참조한다.
Fab 단편은 또한 경쇄의 불변 도메인 및 중쇄의 제1 불변 도메인 (CH1)을 함유한다. Fab 단편은 항체 힌지 영역으로부터 1개 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 중쇄 CH1 도메인의 카르복실 말단에서 수개의 잔기가 부가된다는 점에서 Fab' 단편과 상이하다. Fab'-SH는 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)가 유리 티올 기를 보유하는 Fab'에 대한 본원의 명칭이다. F(ab')2 항체 단편은 원래, 힌지 시스테인 잔기가 사이에 있는 Fab' 단편의 쌍으로서 생산되었다.
용어 "뮤테인" 또는 "변이체"는 상호교환가능하게 사용될 수 있고, 뮤테인 또는 변이체가 목적하는 결합 친화도 또는 생물학적 활성을 보유하는 한, 가변 영역 또는 가변 영역과 등가인 부분에 적어도 1개의 아미노산 치환, 결실, 또는 삽입을 함유하는 항체 또는 항원-결합 단편을 지칭한다. 본 발명에서 고려되는 항체 또는 항원-결합 항체 단편의 변이체는 항체 또는 항원-결합 항체 단편의 결합 활성이 유지되는 분자이다.
"키메라 항체" 또는 그의 항원-결합 단편은 가변 도메인이 비-인간 기원으로부터 유래되고 일부 또는 모든 불변 도메인이 인간 기원으로부터 유래된 것으로 본원에 정의된다.
"인간화 항체"는 예를 들어 임의의 필요한 프레임워크 복귀-돌연변이와 함께 인간 서열-유래 V 영역 내로 생착된 비-인간 종, 예컨대 마우스로부터 유래된 CDR 영역을 함유한다. 따라서, 대부분의 경우에, 인간화 항체는 수용자의 초가변 영역으로부터의 잔기가 목적하는 특이성, 친화도, 및 능력을 갖는 비-인간 종 (공여자 항체), 예컨대 마우스, 래트, 토끼 또는 비-인간 영장류의 초가변 영역으로부터의 잔기로 대체된 인간 이뮤노글로불린 (수용자 항체)이다. 예를 들어, 각각 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 번호 5,225,539; 5,585,089; 5,693,761; 5,693,762; 5,859,205를 참조한다. 일부 경우에, 인간 이뮤노글로불린의 프레임워크 잔기는 상응하는 비-인간 잔기에 의해 대체된다 (예를 들어, 각각 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 번호 5,585,089; 5,693,761; 5,693,762 참조). 또한, 인간화 항체는 수용자 항체 또는 공여자 항체에서는 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이들 변형은 항체 성능을 추가로 정밀화하기 위해 (예를 들어, 목적하는 친화도를 수득하기 위해) 이루어진다. 일반적으로, 인간화 항체는 적어도 1개, 전형적으로 2개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 것이며, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 초가변 영역은 비-인간 이뮤노글로불린의 것에 상응하고, 모든 또는 실질적으로 모든 프레임워크 영역은 인간 이뮤노글로불린 서열의 것이다. 인간화 항체는 또한 임의로 이뮤노글로불린 불변 영역 (Fc)의 적어도 한 부분, 전형적으로 인간 이뮤노글로불린의 것을 포함할 것이다. 추가의 세부사항에 대해서는, 각각 본원에 참조로 포함되는 문헌 [Jones et al., Nature 331:522-25 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-27 (1988); 및 Presta, Curr. Opin. Struct. Biol. 2:593-96 (1992)]을 참조한다.
"인간 항체" 또는 "완전 인간 항체"는 인간 유래 CDR, 즉 인간 기원의 CDR을 포함한다. 완전 인간 항체는 IMGT 데이터베이스 (http://www.imgt.org)에 기초하여 결정된 가장 가까운 인간 배선 참조와 비교하여 적은 수의 배선 편차를 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 따른 완전 인간 항체는 가장 가까운 인간 배선 참조와 비교하여 CDR에서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 배선 편차를 포함할 수 있다. 완전 인간 항체는 세포 풍부화 또는 불멸화 단계와 조합된 클로닝 기술에 의해 인간 유래 B 세포로부터 발생될 수 있다. 그러나, 대다수의 완전 인간 항체는 인간 IgG 유전자좌에 대해 트랜스제닉인 면역화된 마우스로부터 또는 파지 디스플레이에 의해 정교화된 조합 라이브러리로부터 단리된다 (Brueggemann M., Osborn M.J., Ma B., Hayre J., Avis S., Lundstrom B. and Buelow R., Human Antibody Production in Transgenic Animals, Arch Immunol Ther Exp (Warsz.) 63 (2015), 101-108; Carter P.J., Potent antibody therapeutics by design, Nat Rev Immunol 6 (2006), 343-357; Frenzel A., Schirrmann T. and Hust M., Phage display-derived human antibodies in clinical development and therapy, MAbs 8 (2016), 1177-1194; Nelson A.L., Dhimolea E. and Reichert J.M., Development trends for human monoclonal antibody therapeutics, Nat Rev Drug Discov 9 (2010), 767-774.)).
완전 인간 항체를 생성하기 위해 여러 기술이 이용가능하다 (WO2008/112640 A3 참조). 캠브리지 안티바디 테크놀로지스(Cambridge Antibody Technologies) (CAT) 및 다이액스(Dyax)는 면역화된 인간으로부터 단리된 말초 B 세포로부터 항체 cDNA 서열을 수득하고, 특정한 특이성의 인간 가변 영역 서열의 확인을 위한 파지 디스플레이 라이브러리를 고안하였다. 간략하게, 항체 가변 영역 서열은 M13 박테리오파지의 유전자 III 또는 유전자 VIII 구조와 융합된다. 이들 항체 가변 영역 서열은 각각의 서열을 보유하는 파지의 팁에서 Fab 또는 단일 쇄 Fv (scFv) 구조로서 발현된다. 상이한 수준의 항원 결합 조건 (엄격도)을 사용하는 패닝 과정의 라운드를 통해, 관심 항원에 특이적인 Fab 또는 scFv 구조를 발현하는 파지를 선택하고 단리할 수 있다. 이어서, 선택된 파지의 항체 가변 영역 cDNA 서열을 표준 서열분석 절차를 사용하여 규명할 수 있다. 이어서, 이들 서열은 확립된 항체 조작 기술을 사용하여 목적하는 이소형을 갖는 전체 항체의 재구축을 위해 사용될 수 있다. 이러한 방법에 따라 구축된 항체는 완전 인간 항체 (CDR 포함)로 간주된다. 선택된 항체의 면역반응성 (항원 결합 친화도 및 특이성)을 개선시키기 위해, 상이한 중쇄 및 경쇄의 조합 회합, 중쇄 및 경쇄의 CDR3에서의 결실/부가/돌연변이 (V-J, 및 V-D-J 재조합을 모방하기 위함), 및 무작위 돌연변이 (체세포 과다돌연변이를 모방하기 위함)를 포함한 시험관내 성숙 과정이 도입될 수 있다. 이러한 방법에 의해 생성된 "완전 인간" 항체의 예는 항종양 괴사 인자 α 항체, 휴미라 (아달리무맙)이다.
"휴먼 엔지니어드(Human Engineered)™" 항체는 미국 특허 번호 5,766,886 (Studnicka et al.)에 제시된 방법에 따라 모 서열을 변경시키는 것에 의해 생성되었다.
본 발명의 항체는 재조합 항체 유전자 라이브러리로부터 유래될 수 있다. 재조합 인간 항체 유전자의 레퍼토리의 제조 기술, 및 사상 박테리오파지의 표면 상의 코딩된 항체 단편의 디스플레이 기술의 개발은 인간 항체를 직접 제조하고 선택하기 위한 재조합 수단을 제공하였고, 이는 또한 인간화, 키메라, 뮤린 또는 뮤테인 항체에 적용될 수 있다. 파지 기술에 의해 생산된 항체는 박테리아에서 항원 결합 단편 - 통상적으로 Fv 또는 Fab 단편 - 으로서 생산되고, 따라서 이펙터 기능이 결여되어 있다. 이펙터 기능은 2가지 전략 중 1가지에 의해 도입될 수 있으며: 단편은 포유동물 세포에서의 발현을 위한 완전 항체로, 또는 이펙터 기능을 촉발할 수 있는 제2 결합 부위를 갖는 이중특이적 항체 단편으로 조작될 수 있다. 전형적으로, 항체의 Fd 단편 (VH-CH1) 및 경쇄 (VL-CL)는 PCR에 의해 개별적으로 클로닝되고, 조합 파지 디스플레이 라이브러리에서 무작위로 재조합되며, 이는 이어서 특정한 항원에 대한 결합에 대해 선택될 수 있다. Fab 단편은 파지 표면 상에서 발현되며, 즉 이를 코딩하는 유전자에 물리적으로 연결된다. 따라서, 항원 결합에 의한 Fab의 선택은 Fab 코딩 서열을 동시에 선택하고, 이 서열은 후속적으로 증폭될 수 있다. 패닝으로 불리는 절차인 여러 라운드의 항원 결합 및 재-증폭에 의해, 항원에 특이적인 Fab가 풍부화되고, 최종적으로 단리된다.
파지-디스플레이 라이브러리로부터 유래된 인간 항체에 대한 다양한 절차가 기재되어 있다. 이러한 라이브러리는 단일 마스터 프레임워크 상에 구축될 수 있으며, 그 내에서 다양한 생체내-형성된 (즉, 인간-유래된) CDR이 문헌 [Carlsson and Soederlind Exp. Rev. Mol. Diagn. 1 (1), 102-108 (2001), Soederlin et al., Nat. Biotech. 18, 852-856 (2000)] 및 미국 특허 번호 6,989,250에 기재된 바와 같이 재조합되는 것이 가능하다. 대안적으로, 이러한 항체 라이브러리는 인 실리코 설계되고 합성에 의해 생성된 핵산에 의해 코딩된 아미노산 서열에 기초할 수 있다. 항체 서열의 인 실리코 설계는, 예를 들어 인간 서열의 데이터베이스를 분석하고 그로부터 수득된 데이터를 이용하여 폴리펩티드 서열을 고안함으로써 달성된다. 인 실리코-생성된 서열을 설계하고 수득하는 방법은, 예를 들어 문헌 [Knappik et al., J. Mol. Biol. (2000) 296:57; Krebs et al., J. Immunol. Methods. (2001) 254:67]; 및 미국 특허 번호 6,300,064에 기재되어 있다. 파지 디스플레이 스크리닝의 검토를 위해 (예를 들어, 문헌 [Hoet RM et al., Nat Biotechnol 2005;23(3):344-8] 참조), 널리 확립된 하이브리도마 기술 (예를 들어, 문헌 [Koehler and Milstein Nature. 1975 Aug 7;256(5517):495-7] 참조) 또는 마우스의 면역화, 특히 hMAb 마우스의 면역화 (예를 들어, 벨로크이뮨 마우스(VelocImmune mouse)®).
본원에 사용된 용어 "모노클로날 항체"는 실질적으로 동종인 항체 집단으로부터 수득된 항체를 지칭하며, 즉 집단을 구성하는 개별 항체는 미량으로 존재할 수 있는 가능한 돌연변이, 예를 들어 자연 발생 돌연변이를 제외하고는 동일하다. 따라서, 용어 "모노클로날"은 별개의 항체의 혼합물이 아닌 것으로서 항체의 특징을 나타낸다. 전형적으로 상이한 결정기 (에피토프)에 대해 지시된 상이한 항체를 포함하는 폴리클로날 항체 제제와는 대조적으로, 모노클로날 항체 제제의 각각의 모노클로날 항체는 항원 상의 단일 결정기에 대해 지시된다. 그의 특이성에 더하여, 모노클로날 항체 제제는 전형적으로 다른 이뮤노글로불린에 의해 오염되지 않는다는 점에서 유리하다. 용어 "모노클로날"은 임의의 특정한 방법에 의한 항체의 생산을 필요로 하는 것으로 해석되어서는 안된다. 예를 들어, 사용되는 모노클로날 항체는 문헌 [Kohler et al., Nature, 256: 495 [1975]]에 최초로 기재된 하이브리도마 방법에 의해 제조될 수 있거나, 또는 재조합 DNA 방법 (예를 들어, 미국 특허 번호 4,816,567 참조)에 의해 제조될 수 있다. "모노클로날 항체"는 또한 예를 들어 재조합, 키메라, 인간화, 인간, 휴먼 엔지니어드™, 또는 항체 단편일 수 있다.
"단리된" 항체는 이를 발현하는 세포의 성분으로부터 확인 및 분리된 것이다. 세포의 오염 성분은 항체의 진단 또는 치료 용도를 방해할 물질이고, 효소, 호르몬, 및 다른 단백질성 또는 비-단백질성 용질을 포함할 수 있다.
"단리된" 핵산은 그의 자연 환경의 성분으로부터 확인 및 분리된 것이다. 단리된 핵산은 핵산 분자를 통상적으로 함유하는 세포에 함유된 핵산 분자를 포함하지만, 핵산 분자는 염색체외에 또는 그의 천연 염색체 위치와 상이한 염색체 위치에 존재한다.
본원에 사용된 바와 같이, 관심 항원, 예를 들어 A2AP에 "특이적으로 결합하거나", "그에 대해 특이적이거나" 또는 "특이적으로 인식하는" 항체는, 항체가 항원을 발현하는 세포 또는 조직을 표적화하는데 있어서 치료제로서 유용하도록 충분한 친화도로 항원에 결합하고, 상기 언급된 항원 표적의 오르토로그 및 변이체 (예를 들어 돌연변이체 형태, 스플라이스 변이체, 또는 단백질분해적으로 말단절단된 형태) 이외의 단백질과 유의하게 교차-반응하지 않는 것이다. 본원에 사용된 용어 특정한 폴리펩티드 또는 특정한 폴리펩티드 표적 상의 에피토프를 "특이적으로 인식한다" 또는 "그에 특이적으로 결합한다" 또는 "그에 대해 특이적이다"는 예를 들어 항원에 대해 약 10-4 M 미만, 대안적으로 약 10-5 M 미만, 대안적으로 약 10-6 M 미만, 대안적으로 약 10-7 M 미만, 대안적으로 약 10-8 M 미만, 대안적으로 약 10-9 M 미만, 대안적으로 약 10-10 M 미만, 대안적으로 약 10-11 M 미만, 대안적으로 약 10-12 M 미만, 또는 그 미만의 1가 KD를 갖는 항체 또는 그의 항원-결합 단편에 의해 나타내어질 수 있다. 항체가 항원과 1개 이상의 참조 항원(들)을 구별할 수 있는 경우에, 이러한 항체는 이러한 항원에 "특이적으로 결합하거나", "그에 대해 특이적이거나" 또는 "특이적으로 인식한다". 그의 가장 일반적인 형태에서, "특이적 결합", "그에 특이적으로 결합한다", "그에 대해 특이적이다" 또는 "특이적으로 인식한다"는, 예를 들어 하기 방법 중 하나에 따라 결정된 바와 같은, 관심 항원과 비관련 항원을 구별하는 항체의 능력을 지칭한다. 이러한 방법은 표면 플라즈몬 공명 (SPR), 웨스턴 블롯, ELISA-, RIA-, ECL-, IRMA-시험 및 펩티드 스캔을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 예를 들어, 표준 ELISA 검정을 수행할 수 있다. 표준 색 발현에 의해 점수화가 수행될 수 있다 (예를 들어, 2차 항체와 양고추냉이 퍼옥시다제 및 테트라메틸 벤지딘과 과산화수소). 특정 웰에서의 반응은, 예를 들어 450 nm에서의 광학 밀도에 의해 점수화된다. 전형적인 배경 (=음성 반응)은 0.1 OD일 수 있고; 전형적인 양성 반응은 1 OD일 수 있다. 이는 양성/음성 차이가 5-배, 10-배, 50-배 초과, 바람직하게는 100-배 초과임을 의미한다. 전형적으로, 결합 특이성의 결정은 단일 참조 항원이 아니라, 약 3 내지 5가지의 비관련 항원, 예컨대 분유, BSA, 트랜스페린 등의 세트를 사용함으로써 수행된다.
"결합 친화도" 또는 "친화도"는 분자의 단일 결합 부위와 그의 결합 파트너 사이의 비-공유 상호작용의 강도의 총 합계를 지칭한다. 달리 나타내지 않는 한, 본원에 사용된 "결합 친화도"는 결합 쌍의 구성원 (예를 들어, 항체 및 항원) 사이의 1:1 상호작용을 반영하는 고유 결합 친화도를 지칭한다. 해리 상수 "KD"는 통상적으로 분자 (예컨대 항체)와 그의 결합 파트너 (예컨대 항원) 사이의 친화도, 즉 리간드가 특정한 단백질에 얼마나 단단하게 결합하는지를 기재하는 데 사용된다. 리간드-단백질 친화도는 2개의 분자 사이의 비-공유 분자간 상호작용에 의해 영향을 받는다. 친화도는 본원에 기재된 방법을 포함한, 관련 기술분야에 공지된 통상의 방법에 의해 측정될 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명에 따른 "KD" 또는 "KD 값"은 비아코어 T200 기기 (지이 헬스케어 비아코어, 인크.(GE Healthcare Biacore, Inc.))를 사용하여 표면 플라즈몬 공명 검정을 사용하는 것에 의해 측정된다. 다른 적합한 장치는 비아코어 T100, 비아코어(R)-2000, 비아코어 4000, 비아코어 (R)-3000 (비아코어, 인크., 뉴저지주 피스카타웨이), 또는 프로테온(ProteOn) XPR36 기기 (바이오-라드 래보러토리즈, 인크.(Bio-Rad Laboratories, Inc.))이다.
본원에 사용된 용어 "에피토프"는 이뮤노글로불린 또는 T-세포 수용체에 특이적으로 결합할 수 있는 임의의 단백질 결정기를 포함한다. 에피토프 결정기는 통상적으로 분자의 화학적으로 활성인 표면 기, 예컨대 아미노산 또는 당 측쇄, 또는 그의 조합으로 이루어지고, 통상적으로 특이적 3차원 구조적 특징, 뿐만 아니라 특이적 전하 특징을 갖는다.
참조 항체와 "동일한 에피토프에 결합하는 항체" 또는 참조 항체와 "결합에 대해 경쟁하는 항체"는 경쟁 검정에서 참조 항체의 그의 항원에 대한 결합을 10%, 20%, 30%, 40%, 50% 또는 그 초과로 차단하는 항체를 지칭하고, 반대로 참조 항체는 경쟁 검정에서 항체의 그의 항원에 대한 결합을 10%, 20%, 30%, 40%, 50% 또는 그 초과로 차단한다.
용어 "성숙 항체" 또는 "성숙 항원-결합 단편", 예컨대 성숙 Fab 변이체 또는 "최적화된" 변이체는 주어진 항원, 예컨대 표적 단백질의 세포외 도메인에 대해 보다 강한 결합 - 즉 증가된 친화도에 의한 결합 - 을 나타내는 항체 또는 항체 단편의 유도체를 포함한다. 성숙은 항체 또는 항체 단편의 6개의 CDR 내의 소수의 돌연변이를 확인하여 이러한 친화도 증가를 유발하는 과정이다. 성숙 과정은 항체 내로의 돌연변이의 도입을 위한 분자 생물학 방법 및 개선된 결합제를 확인하기 위한 스크리닝의 조합이다.
참조 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열 각각에 대한 "퍼센트 (%) 서열 동일성"은 서열을 정렬하고 필요한 경우에 갭을 도입하여 최대 퍼센트 서열 동일성을 달성한 후에 참조 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열 각각 내의 핵산 또는 아미노산 잔기 각각과 동일한 후보 서열 내의 핵산 또는 아미노산 잔기 각각의 백분율로서 정의된다. 보존적 치환은 서열 동일성의 일부로서 간주되지 않는다. 갭이 없는 정렬이 바람직하다. 퍼센트 아미노산 서열 동일성을 결정하기 위한 목적의 정렬은 관련 기술분야의 기술 내에 있는 다양한 방식으로, 예를 들어 공중 이용가능한 컴퓨터 소프트웨어, 예컨대 BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 메갈라인(Megalign) (DNASTAR) 소프트웨어를 사용하여 달성될 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 비교되는 서열의 전장에 걸쳐 최대 정렬을 달성하는데 필요한 임의의 알고리즘을 포함한, 서열을 정렬하기 위한 적절한 파라미터를 결정할 수 있다.
"서열 상동성"은 동일하거나 또는 보존적 아미노산 치환을 나타내는 아미노산의 백분율을 나타낸다.
"길항작용" 항체 또는 "차단" 항체는 그것이 결합하는 항원의 생물학적 활성을 유의하게 (부분적으로 또는 완전히) 억제하는 것이다. 특정한 실시양태에서, 본 발명에 따른 항체 또는 항원-결합 단편은 A2AP 차단 항체 또는 항원-결합 단편이다.
용어 "항체 접합체"는 약물 - 이 경우에 항체 접합체는 "항체-약물 접합체" ("ADC")로 지칭됨 - 및 고분자량 분자, 예컨대 펩티드 또는 단백질을 포함한 1종 이상의 분자에 접합된 항체를 지칭한다.
아미노산은 본원에서 그의 통상적으로 공지된 3문자 기호에 의해 또는 IUPAC-IUB 생화학적 명명 위원회에 의해 권장되는 1-문자 기호에 의해 지칭될 수 있다. 마찬가지로, 뉴클레오티드도 그의 통상적으로 허용되는 단일-문자 코드에 의해 지칭될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "벡터"는 그에 연결된 또 다른 핵산을 증식시킬 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 상기 용어는 자기-복제 핵산 구조로서의 벡터 뿐만 아니라 그것이 도입된 숙주 세포의 게놈 내로 혼입된 벡터를 포함한다. 특정 벡터는 그것이 작동가능하게 연결된 핵산의 발현을 지시할 수 있다. 이러한 벡터는 본원에서 "발현 벡터"로 지칭된다.
용어 "숙주 세포", "숙주 세포주" 및 "숙주 세포 배양물"은 상호교환가능하게 사용되고, 적어도 1개의 외인성 핵산이 도입된 세포를, 이러한 세포의 자손을 포함하여 지칭한다. 숙주 세포는 "형질전환체" 및 "형질전환된 세포", "형질감염체" 및 "형질감염된 세포" 및 "형질도입된 세포"를 포함하며, 이는 1차 형질전환된/형질감염된/형질도입된 세포 및 계대 횟수와 관계 없이 그로부터 유래된 자손을 포함한다. 자손은 모 세포와 핵산 함량이 완전히 동일하지 않을 수 있지만, 돌연변이를 함유할 수 있다. 원래의 형질전환된 세포에 대해 스크리닝 또는 선택된 것과 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 갖는 돌연변이체 자손이 본원에 포함된다.
본원에 사용된 어구 "치료 유효량"은 목적하는 치료 요법에 따라 투여되는 경우에, 질환의 이러한 증상의 일부 또는 전부를 완화시키거나 또는 질환에 대한 소인을 감소시키는 것을 포함하여, 목적하는 치료 또는 예방 효과 또는 반응을 도출하는데 적절할 치료 또는 예방 항체의 양을 지칭하는 것으로 의도된다.
용어 "제약 제제" / "제약 조성물"은 그 안에 함유된 활성 성분의 생물학적 활성이 효과적이도록 하는 형태로 존재하고, 제제가 투여될 대상체에게 허용되지 않는 독성인 추가의 성분은 함유하지 않는 제제를 지칭한다.
본 발명에 따른 항체
한 측면에서, 본 발명은 인간 A2AP에 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편에 관한 것이며, 여기서 상기 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 토끼 및/또는 시노몰구스 A2AP와 교차-반응한다. 특정한 실시양태에서, 본 발명에 따른 단리된 항체 또는 항원-결합 단편은 인간 A2AP에 대한 것과 100-배 미만, 특히 30-배 미만, 보다 더 특히 15-배 미만, 가장 특히 5-배 미만으로 상이한, 토끼 A2AP에 대한 친화도를 갖는다. 특정한 이러한 실시양태에서, 상기 친화도는 서열식별번호: 1의 아미노산 40 - 491의 인간 A2AP 및 서열식별번호: 2의 아미노산 28-491의 토끼 A2AP에 대한 것이다. 특정한 실시양태에서, 본 발명에 따른 단리된 항체 또는 항원-결합 단편은 인간 A2AP에 대한 것과 100-배 미만, 특히 30-배 미만, 보다 더 특히 15-배 미만, 가장 특히 5-배 미만으로 상이한, 시노몰구스 A2AP에 대한 친화도를 갖는다. 특정한 이러한 실시양태에서, 상기 친화도는 서열식별번호: 1의 아미노산 40 - 491의 인간 A2AP 및 서열식별번호: 3의 아미노산 28 - 491의 시노몰구스 A2AP에 대한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 인간 A2AP에 결합하고 A2AP의 활성을 억제할 수 있는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편에 관한 것이며, 여기서 상기 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 플라스민 활성을 억제하지 않는다.
특정한 실시양태에서, 본 발명에 따른 상기 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 플라스민에 대한 A2AP의 결합을 막음으로써 A2AP의 활성을 억제한다.
A2AP의 내인성 혈장 농도가 비교적 높다 (각각 1 μM; 및 70 μg/ml)는 사실로 인해, A2AP 활성을 차단하기 위해 높은 농도의 중화 항체가 필요할 것이다. 따라서, A2AP 항체가 항체의 고농도까지 플라스민 활성을 억제하지 않는 것이 유리하다. 놀랍게도, 본 발명에 따른 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 시험관내 플라스민 억제 검정에서 10 μM의 농도까지 플라스민 활성을 억제하지 않은 반면, 항체 77A3은 동일한 검정에서 1.7 μM의 IC50으로 플라스민 활성을 억제하였다 (실시예 11, 도 16 참조).
특정한 실시양태에서, 본 발명에 따른 상기 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 높은 마이크로몰 농도로 존재하더라도 인간 플라스민, 특히 서열식별번호: 118 (플라스민 중쇄 A) 및 서열식별번호: 119 (플라스민 경쇄 B)를 포함하는 인간 플라스민의 활성을 억제하지 않는다.
특정한 실시양태에서, 본 발명에 따른 상기 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 시험관내 플라스민 억제 검정에서 1 μM, 2 μM, 5 μM 또는 10 μM의 상기 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 농도까지 플라스민 활성을 억제하지 않는다.
특정한 실시양태에서, 본 발명에 따른 상기 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 플라스민의 단백질분해 활성의 억제를 결정하는 시험관내 플라스민 억제 검정에서 1 μM, 2 μM, 5 μM 또는 10 μM의 상기 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 농도까지 플라스민 활성을 억제하지 않는다.
이러한 시험관내 플라스민 억제 검정은 실시예 11에 기재된 바와 같이 플라스민의 단백질분해 활성의 억제를 결정하는 검정일 수 있다. 이러한 검정을 위해, 플라스민 및 플라스민 단백질분해 활성에 대한 표지된 기질, 예컨대 형광원성 기질 I-1275 (바켐(Bachem); MeOSuc-Ala-Phe-Lys-AMC 트리플루오로아세테이트 염; 카탈로그 번호 I-1275)가 사용될 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 인간 A2AP에 결합하고 A2AP의 활성을 억제할 수 있는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편에 관한 것이며, 여기서 상기 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열식별번호: 1의 아미노산 402 - 408 (SRMSLSS)을 포함하는 A2AP의 에피토프에 결합한다.
A2AP는 아미노산 서열 SRMSLSS (서열식별번호: 1의 아미노산 402 - 408)를 포함하며, 이는 A2AP의 반응성 중심 루프 (서열식별번호: 1의 아미노산 400 - 412)에 위치한다. 특정한 실시양태에서, 본 발명에 따른 상기 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 인간 A2AP에 결합하고 A2AP의 활성을 억제할 수 있으며, 여기서 상기 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열식별번호: 1의 아미노산 402 - 408 (SRMSLSS)을 포함하는 A2AP의 에피토프에 결합하고, 여기서 상기 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 플라스민 활성을 억제하지 않는다.
특정한 실시양태에서, 본 발명에 따른 상기 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 인간 A2AP에 결합하고 A2AP의 활성을 억제할 수 있으며, 여기서 상기 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열식별번호: 1의 아미노산 402 - 408 (SRMSLSS)을 포함하는 A2AP의 에피토프에 결합하고, 여기서 상기 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 시험관내 플라스민 억제 검정에서 1 μM, 2 μM, 5 μM 또는 10 μM의 상기 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 농도까지 플라스민 활성을 억제하지 않는다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 인간 A2AP에 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편에 관한 것이며, 여기서 상기 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 A2AP를 세린 프로테아제 억제제로부터 세린 프로테아제 기질로 전환시키지 않는다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 인간 A2AP에 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편에 관한 것이며, 여기서 상기 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열식별번호: 1의 아미노산 40 - 491의 서열의 인간 A2AP에 ≤100 nM, ≤ 50 nM, ≤ 25 nM, ≤10 nM, ≤1 nM 또는 ≤ 0.5 nM의 해리 상수 (KD)로 결합한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 인간 A2AP에 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편에 관한 것이며, 여기서 상기 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열식별번호: 1의 아미노산 40 - 491의 서열의 인간 A2AP에 ≤ 500 nM, ≤ 250 nM, ≤ 100 nM, ≤ 50 nM, ≤ 25 nM, ≤ 10 nM, ≤ 1 nM, 또는 ≤ 0.5 nM의 EC50으로 결합한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 인간 A2AP에 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편에 관한 것이며, 여기서 상기 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열식별번호: 1의 아미노산 40 - 491의 인간 A2AP의 활성을 시험관내 A2AP 기능 차단 검정에서 ≤ 500 nM, ≤ 250 nM, ≤ 100 nM, ≤ 50 nM, ≤ 25 nM, ≤ 10 nM, ≤ 1 nM, 또는 ≤ 0.5 nM의 EC50으로 억제한다.
시험관내 A2AP 기능 차단 검정은 실시예 4에 기재된 바와 같은 검정일 수 있다. 이러한 검정에서, 시험 항체는 A2AP와 함께 사전-인큐베이션된다. 플라스민, 트립신 또는 키모트립신과 같은 A2AP-기질을 검정에 첨가한 후, A2AP에 의해 차단되지 않은 첨가된 A2AP 기질의 활성은, 예를 들어 A2AP-기질에 대한 표지된 기질의 사용에 의해 분석될 수 있다. 예를 들어, 플라스민 (A2AP 기질)의 경우에 형광원성 기질 I-1275 (바켐; MeOSuc-Ala-Phe-Lys-AMC 트리플루오로아세테이트 염; 카탈로그 번호 I-1275)가 사용될 수 있다.
특정한 실시양태에서, 본 발명에 따른 상기 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은
(i) 서열식별번호: 1의 아미노산 40 - 491의 서열의 인간 A2AP에 ≤100 nM, ≤ 50 nM, ≤ 25 nM, ≤10 nM, ≤1 nM, 또는 ≤ 0.5 nM의 해리 상수 (KD)로 결합하고;
(ii) 서열식별번호: 1의 아미노산 40 - 491의 인간 A2AP의 활성을 시험관내 A2AP 기능 차단 검정에서 ≤ 500 nM, ≤ 250 nM, ≤ 100 nM, ≤ 50 nM, ≤ 25 nM, ≤ 10 nM, ≤ 1 nM, 또는 ≤ 0.5 nM의 EC50으로 억제한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 인간 A2AP에 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편에 관한 것이며, 여기서 상기 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 A2AP의 존재 하에 플라스민 매개된 혈병 용해를 증가시킨다. 특히, 본 발명에 따른 단리된 항체 또는 항원-결합 단편은 시험관내 및/또는 생체내에서 플라스민 매개된 혈병 용해를 증가시킨다. 시험관내에서 플라스민 매개된 혈병 용해를 증가시키는 항체의 능력은 실시예 7에 기재된 바와 같이 평가될 수 있다. 생체내에서 플라스민 매개된 혈병 용해를 증가시키는 항체의 능력은 실시예 8에 기재된 바와 같이 평가될 수 있다.
본 발명에 따른 단리된 항체 또는 항원-결합 단편은 상기 기재된 특징의 임의의 조합을 나타낼 수 있다.
특정한 실시양태에서, 본 발명에 따른 단리된 항체 또는 항원-결합 단편은 A2AP와 플라스민의 상호작용, 특히 인간 A2AP와 인간 플라스민의 상호작용, 특히 서열식별번호: 1의 아미노산 40 - 491의 인간 A2AP와 인간 플라스민, 특히 서열식별번호: 118 (플라스민 중쇄 A) 및 서열식별번호: 119 (플라스민 경쇄 B)를 포함하는 인간 플라스민의 상호작용을 방해한다. 특히, 본 발명에 따른 항체 또는 항원-결합 단편은 A2AP 차단 항체 또는 항원-결합 단편이다.
특정한 실시양태에서, 본 발명에 따른 단리된 항체 또는 항원-결합 단편은 서열식별번호: 32와 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 중쇄 가변 도메인을 포함한다. 특정한 실시양태에서, 본 발명에 따른 단리된 항체 또는 항원-결합 단편은 서열식별번호: 38과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 특정한 실시양태에서, 본 발명에 따른 단리된 항체 또는 항원-결합 단편은 서열식별번호: 32와 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 중쇄 가변 도메인, 및 서열식별번호: 38과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 경쇄 가변 도메인을 포함한다.
특정한 실시양태에서, 본 발명에 따른 단리된 항체 또는 항원-결합 단편은 서열 EX1YDSSGYYHLX2Y (서열식별번호: 4)를 포함하는 H-CDR3을 포함하는 중쇄 항원-결합 영역을 포함하며, 여기서 X1은 Y, D 및 G로 이루어진 군으로부터 선택되고, X2는 D, V, E 및 T로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정한 실시양태에서, X1은 D 및 G로 이루어진 군으로부터 선택되고, X2는 V, E 및 T로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정한 실시양태에서, 본 발명에 따른 단리된 항체 또는 항원-결합 단편은 서열 X1AWDX2SLSGWV (서열식별번호: 5)를 포함하는 L-CDR3을 포함하는 경쇄 항원-결합 영역을 포함하며, 여기서 X1은 A 및 W로 이루어진 군으로부터 선택되고, X2는 D, N, L, W 및 V로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정한 실시양태에서, X1은 W로 이루어진 군으로부터 선택되고, X2는 N, L, W 및 V로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특히, 본 발명에 따른 단리된 항체 또는 항원-결합 단편은 i) 서열 EX1YDSSGYYHLX2Y (서열식별번호: 4)를 포함하며, 여기서 X1은 Y, D 및 G로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서X2는 D, V, E 및 T로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 H-CDR3을 포함하는 중쇄 항원-결합 영역 및 ii) 서열 X1AWDX2SLSGWV (서열식별번호: 5)를 포함하며, 여기서 X1은 A 및 W로 이루어진 군으로부터 선택되고; 여기서 X2는 D, N, L, W 및 V로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 L-CDR3을 포함하는 경쇄 항원-결합 영역을 포함한다.
특정한 실시양태에서, H-CDR3 영역의 5' 단부에 직접 인접한 2개의 프레임워크 잔기 X1X2 (서열식별번호: 32의 참조 VH 도메인의 잔기 96 [X1] 및 97 [X2]에 상응함)는 하기와 같이 선택되며: X1은 A 및 D로 이루어진 군으로부터 선택되고, 특히 X1은 D이고, X2는 R 및 S로 이루어진 군으로부터 선택되고, 특히 X2는 S이다.
특정한 실시양태에서, 본 발명에 따른 단리된 항체 또는 항원-결합 단편은 서열식별번호: 6 또는 서열식별번호: 21을 포함하는 H-CDR1 및 서열식별번호: 7, 서열식별번호: 8 또는 서열식별번호: 22를 포함하는 H-CDR2를 포함하는 중쇄 항원-결합 영역을 포함한다. 특정한 실시양태에서, 본 발명에 따른 단리된 항체 또는 항원-결합 단편은 서열식별번호: 9를 포함하는 L-CDR1 및 서열식별번호: 10을 포함하는 L-CDR2를 포함하는 경쇄 항원-결합 영역을 포함한다.
특정한 실시양태에서, 본 발명에 따른 단리된 항체 또는 항원-결합 단편은 하기를 포함한다:
i) 서열식별번호: 13을 포함하는 H-CDR3을 포함하는 중쇄 항원-결합 영역 및 서열식별번호: 18을 포함하는 L-CDR3을 포함하는 경쇄 항원-결합 영역, 또는
ii) 서열식별번호: 11을 포함하는 H-CDR3을 포함하는 중쇄 항원-결합 영역 및 서열식별번호: 17을 포함하는 L-CDR3을 포함하는 경쇄 항원-결합 영역, 또는
iii) 서열식별번호: 11을 포함하는 H-CDR3을 포함하는 중쇄 항원-결합 영역 및 서열식별번호: 18을 포함하는 L-CDR3을 포함하는 경쇄 항원-결합 영역, 또는
iv) 서열식별번호: 12를 포함하는 H-CDR3을 포함하는 중쇄 항원-결합 영역 및 서열식별번호: 18을 포함하는 L-CDR3을 포함하는 경쇄 항원-결합 영역, 또는
v) 서열식별번호: 13을 포함하는 H-CDR3을 포함하는 중쇄 항원-결합 영역 및 서열식별번호: 19를 포함하는 L-CDR3을 포함하는 경쇄 항원-결합 영역, 또는
vi) 서열식별번호: 13을 포함하는 H-CDR3을 포함하는 중쇄 항원-결합 영역 및 서열식별번호: 18을 포함하는 L-CDR3을 포함하는 경쇄 항원-결합 영역, 또는
vii) 서열식별번호: 14를 포함하는 H-CDR3을 포함하는 중쇄 항원-결합 영역 및 서열식별번호: 18을 포함하는 L-CDR3을 포함하는 경쇄 항원-결합 영역, 또는
viii) 서열식별번호: 14를 포함하는 H-CDR3을 포함하는 중쇄 항원-결합 영역 및 서열식별번호: 20을 포함하는 L-CDR3을 포함하는 경쇄 항원-결합 영역, 또는
ix) 서열식별번호: 15를 포함하는 H-CDR3을 포함하는 중쇄 항원-결합 영역 및 서열식별번호: 18을 포함하는 L-CDR3을 포함하는 경쇄 항원-결합 영역, 또는
x) 서열식별번호: 16을 포함하는 H-CDR3을 포함하는 중쇄 항원-결합 영역 및 서열식별번호: 18을 포함하는 L-CDR3을 포함하는 경쇄 항원-결합 영역.
특정한 실시양태에서, 본 발명에 따른 단리된 항체 또는 항원-결합 단편은 하기를 포함한다:
i) 서열식별번호: 6을 포함하는 H-CDR1, 서열식별번호: 8을 포함하는 H-CDR2, 및 서열식별번호: 13을 포함하는 H-CDR3을 포함하는 중쇄 항원-결합 영역, 및 서열식별번호: 9를 포함하는 L-CDR1, 서열식별번호: 10을 포함하는 L-CDR2, 및 서열식별번호: 18을 포함하는 L-CDR3을 포함하는 경쇄 항원-결합 영역, 또는
ii) 서열식별번호: 6을 포함하는 H-CDR1, 서열식별번호: 7을 포함하는 H-CDR2, 및 서열식별번호: 13을 포함하는 H-CDR3을 포함하는 중쇄 항원-결합 영역, 및 서열식별번호: 9를 포함하는 L-CDR1, 서열식별번호: 10을 포함하는 L-CDR2, 및 서열식별번호: 18을 포함하는 L-CDR3을 포함하는 경쇄 항원-결합 영역, 또는
iii) 서열식별번호: 6을 포함하는 H-CDR1, 서열식별번호: 7을 포함하는 H-CDR2, 및 서열식별번호: 11을 포함하는 H-CDR3을 포함하는 중쇄 항원-결합 영역, 및 서열식별번호: 9를 포함하는 L-CDR1, 서열식별번호: 10을 포함하는 L-CDR2, 및 서열식별번호: 17을 포함하는 L-CDR3을 포함하는 경쇄 항원-결합 영역, 또는
iv) 서열식별번호: 6을 포함하는 H-CDR1, 서열식별번호: 7을 포함하는 H-CDR2, 및 서열식별번호: 11을 포함하는 H-CDR3을 포함하는 중쇄 항원-결합 영역, 및 서열식별번호: 9를 포함하는 L-CDR1, 서열식별번호: 10을 포함하는 L-CDR2, 및 서열식별번호: 18을 포함하는 L-CDR3을 포함하는 경쇄 항원-결합 영역, 또는
v) 서열식별번호: 6을 포함하는 H-CDR1, 서열식별번호: 7을 포함하는 H-CDR2, 및 서열식별번호: 12를 포함하는 H-CDR3을 포함하는 중쇄 항원-결합 영역, 및 서열식별번호: 9를 포함하는 L-CDR1, 서열식별번호: 10을 포함하는 L-CDR2, 및 서열식별번호: 18을 포함하는 L-CDR3을 포함하는 경쇄 항원-결합 영역, 또는
vi) 서열식별번호: 6을 포함하는 H-CDR1, 서열식별번호: 7을 포함하는 H-CDR2, 및 서열식별번호: 13을 포함하는 H-CDR3을 포함하는 중쇄 항원-결합 영역, 및 서열식별번호: 9를 포함하는 L-CDR1, 서열식별번호: 10을 포함하는 L-CDR2, 및 서열식별번호: 19를 포함하는 L-CDR3을 포함하는 경쇄 항원-결합 영역, 또는
vii) 서열식별번호: 6을 포함하는 H-CDR1, 서열식별번호: 7을 포함하는 H-CDR2, 및 서열식별번호: 14를 포함하는 H-CDR3을 포함하는 중쇄 항원-결합 영역, 및 서열식별번호: 9를 포함하는 L-CDR1, 서열식별번호: 10을 포함하는 L-CDR2, 및 서열식별번호: 18을 포함하는 L-CDR3을 포함하는 경쇄 항원-결합 영역, 또는
viii) 서열식별번호: 6을 포함하는 H-CDR1, 서열식별번호: 7을 포함하는 H-CDR2, 및 서열식별번호: 14를 포함하는 H-CDR3을 포함하는 중쇄 항원-결합 영역, 및 서열식별번호: 9를 포함하는 L-CDR1, 서열식별번호: 10을 포함하는 L-CDR2, 및 서열식별번호: 20을 포함하는 L-CDR3을 포함하는 경쇄 항원-결합 영역, 또는
ix) 서열식별번호: 6을 포함하는 H-CDR1, 서열식별번호: 7을 포함하는 H-CDR2, 및 서열식별번호: 15를 포함하는 H-CDR3을 포함하는 중쇄 항원-결합 영역, 및 서열식별번호: 9를 포함하는 L-CDR1, 서열식별번호: 10을 포함하는 L-CDR2, 및 서열식별번호: 18을 포함하는 L-CDR3을 포함하는 경쇄 항원-결합 영역, 또는
x) 서열식별번호: 6을 포함하는 H-CDR1, 서열식별번호: 7을 포함하는 H-CDR2, 및 서열식별번호: 16을 포함하는 H-CDR3을 포함하는 중쇄 항원-결합 영역, 및 서열식별번호: 9를 포함하는 L-CDR1, 서열식별번호: 10을 포함하는 L-CDR2, 및 서열식별번호: 18을 포함하는 L-CDR3을 포함하는 경쇄 항원-결합 영역, 또는
xi) 서열식별번호: 21을 포함하는 H-CDR1, 서열식별번호: 8을 포함하는 H-CDR2, 및 서열식별번호: 13을 포함하는 H-CDR3을 포함하는 중쇄 항원-결합 영역, 및 서열식별번호: 9를 포함하는 L-CDR1, 서열식별번호: 10을 포함하는 L-CDR2, 및 서열식별번호: 18을 포함하는 L-CDR3을 포함하는 경쇄 항원-결합 영역, 또는
xii) 서열식별번호: 6을 포함하는 H-CDR1, 서열식별번호: 22를 포함하는 H-CDR2, 및 서열식별번호: 13을 포함하는 H-CDR3을 포함하는 중쇄 항원-결합 영역, 및 서열식별번호: 9를 포함하는 L-CDR1, 서열식별번호: 10을 포함하는 L-CDR2, 및 서열식별번호: 18을 포함하는 L-CDR3을 포함하는 경쇄 항원-결합 영역.
특정한 실시양태에서, 본 발명에 따른 단리된 항체 또는 항원-결합 단편은 30S, 31S, 53S, 56S, 97K로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1, 적어도 2, 적어도 3 또는 적어도 4 또는 5개의 중쇄 가변 도메인 프레임워크 및 CDR 잔기를 포함한다. 이들 아미노산 위치는 서열식별번호: 32의 참조 중쇄 가변 도메인의 아미노산 위치에 상응하고, 프레임워크 및 H-CDR1 및 H-CDR2 아미노산 잔기를 포함한다.
특정한 실시양태에서, 본 발명에 따른 단리된 항체 또는 항원-결합 단편은 하기를 포함한다:
i) 서열식별번호: 32를 포함하는 가변 중쇄 도메인 및 서열식별번호: 38을 포함하는 가변 경쇄 도메인; 또는
ii) 서열식별번호: 23을 포함하는 가변 중쇄 도메인 및 서열식별번호: 37을 포함하는 가변 경쇄 도메인; 또는
iii) 서열식별번호: 24를 포함하는 가변 중쇄 도메인 및 서열식별번호: 38을 포함하는 가변 경쇄 도메인; 또는
iv) 서열식별번호: 25를 포함하는 가변 중쇄 도메인 및 서열식별번호: 38을 포함하는 가변 경쇄 도메인; 또는
v) 서열식별번호: 26을 포함하는 가변 중쇄 도메인 및 서열식별번호: 38을 포함하는 가변 경쇄 도메인; 또는
vi) 서열식별번호: 27을 포함하는 가변 중쇄 도메인 및 서열식별번호: 39를 포함하는 가변 경쇄 도메인; 또는
vii) 서열식별번호: 27을 포함하는 가변 중쇄 도메인 및 서열식별번호: 38을 포함하는 가변 경쇄 도메인; 또는
viii) 서열식별번호: 28을 포함하는 가변 중쇄 도메인 및 서열식별번호: 38을 포함하는 가변 경쇄 도메인; 또는
ix) 서열식별번호: 28을 포함하는 가변 중쇄 도메인 및 서열식별번호: 40을 포함하는 가변 경쇄 도메인; 또는
x) 서열식별번호: 29를 포함하는 가변 중쇄 도메인 및 서열식별번호: 38을 포함하는 가변 경쇄 도메인; 또는
xi) 서열식별번호: 30을 포함하는 가변 중쇄 도메인 및 서열식별번호: 38을 포함하는 가변 경쇄 도메인; 또는
xii) 서열식별번호: 31을 포함하는 가변 중쇄 도메인 및 서열식별번호: 38을 포함하는 가변 경쇄 도메인; 또는
xiii) 서열식별번호: 33을 포함하는 가변 중쇄 도메인 및 서열식별번호: 38을 포함하는 가변 경쇄 도메인; 또는
xiv) 서열식별번호: 34를 포함하는 가변 중쇄 도메인 및 서열식별번호: 38을 포함하는 가변 경쇄 도메인; 또는
xv) 서열식별번호: 35를 포함하는 가변 중쇄 도메인 및 서열식별번호: 38을 포함하는 가변 경쇄 도메인; 또는
xvi) 서열식별번호: 36을 포함하는 가변 중쇄 도메인 및 서열식별번호: 38을 포함하는 가변 경쇄 도메인.
특정한 실시양태에서, 본 발명에 따른 단리된 항체는 IgG 항체이다. 특정한 이러한 실시양태에서, 본 발명에 따른 단리된 항체는 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 항체이다. 가장 특히, 본 발명에 따른 단리된 항체는 IgG1 또는 IgG4 항체이다.
특정한 실시양태에서, 본 발명에 따른 단리된 항체는 하기를 포함한다:
i) 서열식별번호: 55를 포함하는 중쇄 및 서열식별번호: 57을 포함하는 경쇄; 또는
ii) 서열식별번호: 41을 포함하는 중쇄 및 서열식별번호: 56을 포함하는 경쇄; 또는
iii) 서열식별번호: 42를 포함하는 중쇄 및 서열식별번호: 57을 포함하는 경쇄; 또는
iv) 서열식별번호: 43을 포함하는 중쇄 및 서열식별번호: 57을 포함하는 경쇄; 또는
v) 서열식별번호: 44를 포함하는 중쇄 및 서열식별번호: 57을 포함하는 경쇄; 또는
vi) 서열식별번호: 45를 포함하는 중쇄 및 서열식별번호: 58을 포함하는 경쇄; 또는
vii) 서열식별번호: 45를 포함하는 중쇄 및 서열식별번호: 57을 포함하는 경쇄; 또는
viii) 서열식별번호: 46을 포함하는 중쇄 및 서열식별번호: 57을 포함하는 경쇄; 또는
ix) 서열식별번호: 46을 포함하는 중쇄 및 서열식별번호: 59를 포함하는 경쇄; 또는
x) 서열식별번호: 47을 포함하는 중쇄 및 서열식별번호: 57을 포함하는 경쇄; 또는
xi) 서열식별번호: 48을 포함하는 중쇄 및 서열식별번호: 57을 포함하는 경쇄; 또는
xii) 서열식별번호: 49를 포함하는 중쇄 및 서열식별번호: 57을 포함하는 경쇄; 또는
xiii) 서열식별번호: 50을 포함하는 중쇄 및 서열식별번호: 57을 포함하는 경쇄; 또는
xiv) 서열식별번호: 51을 포함하는 중쇄 및 서열식별번호: 57을 포함하는 경쇄; 또는
xv) 서열식별번호: 52를 포함하는 중쇄 및 서열식별번호: 57을 포함하는 경쇄; 또는
xvi) 서열식별번호: 53을 포함하는 중쇄 및 서열식별번호: 57을 포함하는 경쇄; 또는
xvii) 서열식별번호: 54를 포함하는 중쇄 및 서열식별번호: 57을 포함하는 경쇄.
특정한 실시양태에서, 본 발명에 따른 항원-결합 단편은 scFv, Fab, Fab' 단편 또는 F(ab')2 단편이다.
특정한 실시양태에서, 본 발명에 따른 단리된 항체 또는 항원-결합 단편은 모노클로날 항체 또는 항원-결합 단편이다.
특정한 실시양태에서, 본 발명에 따른 단리된 항체 또는 항원-결합 단편은 인간, 인간화 또는 키메라 항체 또는 항원-결합 단편, 보다 특히 완전 인간 항체 또는 항원-결합 단편이다.
특정한 실시양태에서, 본 발명에 따른 단리된 항체 또는 항원-결합 단편은 단일특이적 항체이다. 특정한 다른 실시양태에서, 본 발명에 따른 단리된 항체 또는 항원-결합 단편은 A2AP 및 적어도 1종의 추가의 항원에 결합하는 다중특이적 항체, 예컨대 이중특이적, 삼중특이적 또는 사중특이적 항체이다.
추가 측면에서, 본 발명은 A2AP에 대한 결합에 대해 본 발명에 따른 단리된 항체 또는 항원-결합 단편과 경쟁하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편에 관한 것이다.
본 발명에 따른 바람직한 항체의 아미노산 서열은 표 1에 열거되어 있다.
표 1: 본 발명에 따른 바람직한 항체의 아미노산 서열
Figure pct00004
본 발명에 따른 바람직한 항체의 핵산 서열은 표 2에 열거되어 있다.
표 2: 본 발명에 따른 바람직한 항체의 핵산 서열
Figure pct00005
펩티드 변이체
본 발명의 항체 또는 항원-결합 단편은 본원에 제공된 특정 펩티드 서열로 제한되지 않는다. 오히려, 본 발명은 또한 이들 폴리펩티드의 변이체를 구현한다. 본 개시내용 및 통상적으로 이용가능한 기술 및 참고문헌을 참조하여, 숙련된 작업자는 본원에 개시된 항체의 기능적 변이체를 제조, 시험 및 이용할 수 있을 것이며, A2AP에 결합하는 능력을 갖는 이들 변이체는 본 발명의 범주 내에 속한다는 것을 인지할 것이다.
변이체는, 예를 들어 본원에 개시된 펩티드 서열과 비교하여 적어도 1개의 변경된 상보성 결정 영역 (CDR) (초가변) 및/또는 프레임워크 (FR) (가변) 도메인/위치를 갖는 항체를 포함할 수 있다.
CDR 또는 FR 영역 내의 1개 이상의 아미노산 잔기를 변경시킴으로써, 숙련된 작업자는 상용적으로 항원에 대해, 예를 들어 새로운 또는 개선된 특성에 대해 스크리닝될 수 있는 돌연변이되거나 다양화된 항체 서열을 생성할 수 있다.
본 발명의 추가의 바람직한 실시양태는 VH 및 VL 서열이 표 1에 제시된 바와 같이 선택된 항체 또는 항원-결합 단편이다. 숙련된 작업자는 표 1의 데이터를 사용하여 본 발명의 범주 내에 있는 펩티드 변이체를 설계할 수 있다. 변이체는 1개 이상의 CDR 영역 내의 아미노산을 변화시키는 것에 의해 구축되는 것이 바람직하고; 변이체는 또한 1개 이상의 변경된 프레임워크 영역을 가질 수 있다. 변경은 또한 프레임워크 영역에서 이루어질 수 있다. 예를 들어, 펩티드 FR 도메인은 배선 서열과 비교하여 잔기에서 편차가 존재하도록 변경될 수 있다.
대안적으로, 숙련된 작업자는 예를 들어 문헌 [Knappik A., et al., JMB 2000, 296:57-86]에 기재된 절차를 사용하여 본원에 개시된 아미노산 서열을 이러한 항체의 동일한 부류의 공지된 서열과 비교함으로써 동일한 분석을 할 수 있다.
또한, 변이체는 추가의 최적화를 위한 출발점으로서 1개의 항체를 사용하여, 항체 내의 1개 이상의 아미노산 잔기, 바람직하게는 1개 이상의 CDR 내의 아미노산 잔기를 다양화하고, 생성된 항체 변이체 집합을 개선된 특성을 갖는 변이체에 대해 스크리닝함으로써 수득될 수 있다. VL 및/또는 VH의 CDR3 내의 1개 이상의 아미노산 잔기의 다양화가 특히 바람직하다. 다양화는 예를 들어 트리뉴클레오티드 돌연변이유발 (TRIM) 기술을 사용하여 DNA 분자의 집합을 합성함으로써 수행될 수 있다 (Virnekaes B. et al., Nucl. Acids Res. 1994, 22: 5600.). 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 예를 들어 변경된 반감기 (예를 들어 Fc 부분의 변형 또는 추가의 분자, 예컨대 PEG의 부착), 변경된 결합 친화도 또는 변경된 ADCC 또는 CDC 활성을 생성하는 변형을 포함하나 이에 제한되지는 않는 변형/변이를 갖는 분자를 포함한다.
보존적 아미노산 변이체
본원에 기재된 항체 펩티드 서열의 전체 분자 구조가 보존된 폴리펩티드 변이체가 제조될 수 있다. 개별 아미노산의 특성을 고려하여, 숙련된 작업자는 일부 합리적인 치환을 인식할 것이다. 아미노산 치환, 즉, "보존적 치환"은, 예를 들어, 수반되는 잔기의 극성, 전하, 용해도, 소수성, 친수성, 및/또는 양친매성 성질에서의 유사성에 기초하여 이루어질 수 있다.
예를 들어, (a) 비극성 (소수성) 아미노산은 알라닌, 류신, 이소류신, 발린, 프롤린, 페닐알라닌, 트립토판 및 메티오닌을 포함하고; (b) 극성 중성 아미노산은 글리신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라긴 및 글루타민을 포함하고; (c) 양으로 하전된 (염기성) 아미노산은 아르기닌, 리신 및 히스티딘을 포함하고; (d) 음으로 하전된 (산성) 아미노산은 아스파르트산 및 글루탐산을 포함한다. 치환은 전형적으로 군 (a)-(d) 내에서 이루어질 수 있다. 또한, 글리신 및 프롤린은 α-나선을 파괴하는 그의 능력에 기초하여 서로 치환될 수 있다. 유사하게, 특정 아미노산, 예컨대 알라닌, 시스테인, 류신, 메티오닌, 글루탐산, 글루타민, 히스티딘 및 리신은 α-나선에서 보다 통상적으로 발견되는 반면, 발린, 이소류신, 페닐알라닌, 티로신, 트립토판 및 트레오닌은 β-병풍 시트에서 보다 통상적으로 발견된다. 글리신, 세린, 아스파르트산, 아스파라긴 및 프롤린은 통상적으로 턴에서 발견된다. 일부 바람직한 치환은 하기 군 사이에서 이루어질 수 있다: (i) S 및 T; (ii) P 및 G; 및 (iii) A, V, L 및 I. 공지된 유전자 코드, 및 재조합 및 합성 DNA 기술을 고려하여, 숙련된 과학자는 보존적 아미노산 변이체를 코딩하는 DNA를 용이하게 구축할 수 있다.
글리코실화 변이체
항체가 Fc 영역을 포함하는 경우, 그에 부착된 탄수화물은 변경될 수 있다. 포유동물 세포에 의해 생산된 천연 항체는 전형적으로 Fc 영역의 CH2 도메인의 카바트 EU 넘버링을 사용하여 Asn297에 N-연결에 의해 일반적으로 부착된 분지형, 이중안테나 올리고사카라이드를 포함하며; 예를 들어, 문헌 [Wright et al., Trends Biotechnol. 15: 26-32 (1997)]을 참조한다.
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 항체가 글리코실화되는 정도를 증가 또는 감소시키도록 변경된다. 항체에 대한 글리코실화 부위의 부가 또는 결실은 1개 이상의 글리코실화 부위가 생성되거나 제거되도록 발현 시스템 (예를 들어 숙주 세포)을 변경시키고/거나 아미노산 서열을 변경시킴으로써 편리하게 달성될 수 있다.
본 발명의 한 실시양태에서, 감소된 이펙터 기능을 갖는 비-글리코실 항체 또는 항체 유도체는 원핵 숙주에서의 발현에 의해 제조된다. 적합한 원핵 숙주는 이. 콜라이(E. coli), 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium) 및 슈도모나스(Pseudomonas), 스트렙토미세스(Streptomyces), 및 스타필로코쿠스(Staphylococcus) 속 내의 다양한 종을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
한 실시양태에서, 상기 항체의 Fc 부분의 CH2 도메인 내의 보존된 N-연결 부위에서의 변형을 특징으로 하는, 감소된 이펙터 기능을 갖는 항체 변이체가 제공된다. 본 발명의 한 실시양태에서, 변형은 중쇄 글리코실화 부위에서의 글리코실화를 방지하기 위한 상기 부위에서의 돌연변이를 포함한다. 따라서, 본 발명의 하나의 바람직한 실시양태에서, 비-글리코실 항체 또는 항체 유도체는 중쇄 글리코실화 부위의 돌연변이, - 즉 카바트 EU 넘버링을 사용한 N297의 돌연변이에 의해 제조되고, 적절한 숙주 세포에서 발현된다.
본 발명의 또 다른 실시양태에서, 비-글리코실 항체 또는 항체 유도체는 감소된 이펙터 기능을 가지며, 여기서 상기 항체 또는 항체 유도체의 Fc 부분의 CH2 도메인 내의 보존된 N-연결 부위에서의 변형은 CH2 도메인 글리칸의 제거, - 즉 탈글리코실화를 포함한다. 이들 비-글리코실 항체는 통상적인 방법에 의해 생성된 다음, 효소적으로 탈글리코실화될 수 있다. 항체의 효소적 탈글리코실화 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Winkelhake & Nicolson (1976), J Biol Chem. 251(4):1074-80] 참조).
본 발명의 또 다른 실시양태에서, 탈글리코실화는 글리코실화 억제제 튜니카마이신을 사용하여 달성될 수 있다 (Nose & Wigzell (1983), Proc Natl Acad Sci USA, 80(21):6632-6). 즉, 변형은 상기 항체의 Fc 부분의 CH2 도메인 내의 보존된 N-연결 부위에서의 글리코실화의 방지이다.
한 실시양태에서, Fc 영역에 (직접적으로 또는 간접적으로) 부착된 푸코스가 결여된 탄수화물 구조를 갖는 항체 변이체가 제공된다. 예를 들어, 이러한 항체에서 푸코스의 양은 1% 내지 80%, 1% 내지 65%, 5% 내지 65% 또는 20% 내지 40%일 수 있다. 푸코스의 양은, 예를 들어 WO 2008/077546에 기재된 바와 같은 MALDI-TOF 질량 분광측정법에 의해 측정된 바와 같이, Asn 297에 부착된 모든 당구조물 (예를 들어, 복합체, 하이브리드 및 높은 만노스 구조물)의 합계 대비 Asn297에서의 당 쇄 내의 푸코스의 평균 양을 계산하는 것에 의해 결정된다. Asn297은 Fc 영역 내의 약 위치 297 (Fc 영역 잔기의 Eu 넘버링)에 위치한 아스파라긴 잔기를 지칭하지만; Asn297은 또한 항체에서의 부차적 서열 변이로 인해 위치 297의 약 ± 3개 아미노산 상류 또는 하류, 즉 위치 294와 300 사이에 위치할 수 있다. 이러한 푸코실화 변이체는 개선된 ADCC 기능을 가질 수 있다.
"탈푸코실화" 또는 "푸코스-결핍" 항체 변이체와 관련된 간행물의 예는 문헌 [Okazaki et al., J Mol. Biol. 336: 1239-1249 (2004); Yamane-Ohnuki et al., Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004)]을 포함한다.
탈푸코실화 항체를 생산할 수 있는 세포주의 예는 단백질 푸코실화가 결핍된 Lec13 CHO 세포 (Ripka et al., Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986); 및 WO 2004/056312), 및 녹아웃 세포주, 예컨대 알파-1,6-푸코실트랜스퍼라제 유전자, FUT8, 녹아웃 CHO 세포 (예를 들어, 문헌 [Yamane-Ohnuki et al., Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004); Kanda, Y. et al., Biotechnol. Bioeng., 94(4):680-688 (2006)] 참조)를 포함한다.
이등분된 올리고사카라이드를 갖는 항체 변이체가 추가로 제공되며, 예를 들어 여기서 항체의 Fc 영역에 부착된 이중안테나 올리고사카라이드는 GlcNAc에 의해 이등분된다. 이러한 항체 변이체는 감소된 푸코실화 및/또는 개선된 ADCC 기능을 가질 수 있다. 이러한 항체 변이체의 예는, 예를 들어 WO 2003/011878; 미국 특허 번호 6,602,684; 및 US 2005/0123546에 기재되어 있다.
Fc 영역에 부착된 올리고사카라이드 내에 적어도 1개의 갈락토스 잔기를 갖는 항체 변이체가 또한 제공된다. 이러한 항체 변이체는 개선된 CDC 기능을 가질 수 있다. 이러한 항체 변이체는, 예를 들어 WO1997/30087; WO1998/58964; 및 WO1999/22764에 기재되어 있다.
Fc 영역 변이체
특정 실시양태에서, 1개 이상의 아미노산 변형 (예를 들어 치환)이 본원에 제공된 항체의 Fc 영역 (예를 들어, 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 Fc 영역) 내로 도입될 수 있고, 그에 의해 Fc 영역 변이체가 생성될 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 모든 이펙터 기능은 아니지만 일부 이펙터 기능을 보유하는 항체 변이체를 고려하며, 이는 생체내 항체의 반감기가 중요하지만 특정 이펙터 기능 (예컨대 보체 및 ADCC)은 불필요하거나 해로운 적용에 대해 바람직한 후보가 되게 한다. 시험관내 및/또는 생체내 세포독성 검정을 수행하여 CDC 및/또는 ADCC 활성의 감소/고갈을 확인할 수 있다. 예를 들어, Fc 수용체 (FcR) 결합 검정을 수행하여, 항체가 FcγR 결합은 결여되어 있지만 (따라서 ADCC 활성이 결여될 가능성이 있음) FcRn 결합 능력은 보유한다는 것을 확실하게 할 수 있다. 일부 실시양태에서, 변경된 (즉, 개선된 또는 감소된) C1q 결합 및/또는 보체 의존성 세포독성 (CDC)을 발생시키는 변경이 Fc 영역에서 이루어진다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 증가된 또는 감소된 반감기를 보유하는 항체 변이체를 고려한다. 증가된 반감기 및 모체 IgG의 태아로의 전달을 담당하는 신생아 Fc 수용체 (FcRn)에 대한 개선된 결합을 갖는 항체 (Guyer et al., J Immunol. 117:587 (1976) 및 Kim et al., J Immunol. 24:249 (1994))가 US2005/0014934 (Hinton et al.)에 기재되어 있다. 이들 항체는 FcRn에 대한 Fc 영역의 결합을 개선시키는 1개 이상의 치환을 갖는 Fc 영역을 포함한다.
추가 측면에서, 본 발명은 본 발명에 따른 단리된 항체 또는 항원 결합 단편을 포함하는 항체 접합체에 관한 것이다.
항체 생성
본 발명의 항체는 다수의 건강한 지원자의 항체로부터 단리된 아미노산 서열에 기초한 재조합 항체 라이브러리로부터, 예를 들어 완전 인간 CDR을 신규한 항체 분자 내로 재조합시키는 n-CoDeR® 기술을 사용하여 유래될 수 있다 (Carlson & Soederlind, Expert Rev Mol Diagn. 2001 May;1(1):102-8). 또는 대안적으로, 예를 들어 문헌 [Hoet RM et al., Nat Biotechnol 2005;23(3):344-8)]에 기재된 완전 인간 항체 파지 디스플레이 라이브러리로서의 항체 라이브러리를 사용하여 A2AP-특이적 항체를 단리할 수 있다. 인간 항체 라이브러리로부터 단리된 항체 또는 항체 단편은 본원에서 인간 항체 또는 인간 항체 단편으로 간주된다.
인간 항체는 추가로, 항원 챌린지에 반응하여 무손상 인간 항체 또는 인간 가변 영역을 갖는 무손상 항체를 생산하도록 변형된 트랜스제닉 동물에게 면역원을 투여하는 것에 의해 제조될 수 있다. 이러한 동물은 전형적으로 내인성 이뮤노글로불린 유전자좌를 대체하거나 또는 염색체외에 존재하거나 동물의 염색체 내로 무작위로 통합된 인간 이뮤노글로불린 유전자좌의 전부 또는 일부를 함유한다. 예를 들어, 유전자 조작된 마우스의 면역화, 특히 hMAb 마우스 (예를 들어, 벨로크이뮨 마우스® 또는 제노마우스(XENOMOUSE)®)의 면역화가 수행될 수 있다.
추가의 항체는 하이브리도마 기술 (예를 들어, 문헌 [Koehler and Milstein Nature. 1975 Aug 7;256(5517):495-7] 참조)을 사용하여 생성될 수 있고, 이는 예를 들어 키메라 또는 인간화 항체로 전환될 수 있는 뮤린, 래트, 또는 토끼 항체를 발생시킬 수 있다. 인간화 항체 및 그의 제조 방법은 예를 들어 문헌 [Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)]에서 검토되고, 추가로 예를 들어 문헌 [Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); Queen et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 86:10029-10033 (1989); 미국 특허 번호 5,821,337, 7,527,791, 6,982,321, 및 7,087,409; Kashmiri et al., Methods 36:25-34 (2005) (특이성 결정 영역 (SDR) 그라프팅을 기재함); Padlan, Mol. Immunol. 28:489-498 (1991) ("재표면화"를 기재함); Dall' Acqua et al., Methods 36:43-60 (2005) ("FR 셔플링"을 기재함); 및 Osboum et al., Methods 36:61-68 (2005) 및 Klimka et al., Br. J. Cancer, 83:252-260 (2000) (FR 셔플링에 대한 "가이드 선택" 접근법을 기재함)]에 기재되어 있다.
재조합 항체 라이브러리를 사용한 항체의 생성에 대한 예가 제공된다.
본 발명에 따른 DNA 분자
본 발명은 또한 본 발명에 따른 항체 또는 항원-결합 단편을 코딩하는 단리된 핵산 서열에 관한 것이다. 본 발명에 따른 항체 또는 항원-결합 단편을 코딩하는 단리된 핵산 서열은 예를 들어 문헌 [Sambrook et al., 1989, 및 Ausubel et al., 1989]에 기재된 기술에 의해, 또는 대안적으로 화학적 합성에 의해 생산될 수 있다. (예를 들어, 문헌 [Oligonucleotide Synthesis (1984, Gait, ed., IRL Press, Oxford)]에 기재된 기술). 발현된 항체에 대해 사용된 DNA 서열이 표 2에 제공된다. 이들 서열은 특정 경우에 포유동물 발현을 위해 최적화된다. 본 발명의 DNA 분자는 본원에 개시된 서열에 제한되지 않고, 또한 그의 변이체를 포함한다. 본 발명 내의 DNA 변이체는 혼성화에서의 그의 물리적 특성을 참조하여 기재될 수 있다. 숙련된 작업자는 핵산 혼성화 기술을 사용하여 DNA가 그의 상보체를 확인하는데 사용될 수 있고, DNA가 이중 가닥이기 때문에 그의 등가물 또는 상동체를 확인하는데 사용될 수 있다는 것을 인식할 것이다. 또한, 혼성화는 100% 미만의 상보성으로 발생할 수 있다는 것이 인식될 것이다. 그러나, 조건을 적절하게 선택하면, 혼성화 기술을 사용하여 DNA 서열을 특정한 프로브에 대한 그의 구조적 관련성에 기초하여 구별할 수 있다. 이러한 조건에 관한 지침에 대해, 문헌 [Sambrook et al., 1989 상기 문헌 및 Ausubel et al., 1995 (Ausubel, F. M., Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D. D., Sedman, J. G., Smith, J. A., & Struhl, K. eds. (1995). Current Protocols in Molecular Biology. New York: John Wiley and Sons)]을 참조한다.
2개의 폴리뉴클레오티드 서열 사이의 구조적 유사성은 2개의 서열이 서로 혼성화할 조건의 "엄격도"의 함수로서 표현될 수 있다. 본원에 사용된 용어 "엄격도"는 조건이 혼성화에 불리한 정도를 지칭한다. 엄격한 조건은 혼성화에 강하게 불리하고, 가장 구조적으로 관련된 분자만이 이러한 조건 하에 서로 혼성화할 것이다. 반대로, 비-엄격한 조건은 보다 낮은 정도의 구조적 관련성을 나타내는 분자의 혼성화에 유리하다. 따라서, 혼성화 엄격도는 2개의 핵산 서열의 구조적 관계와 직접적으로 상관된다.
혼성화 엄격도는 전체 DNA 농도, 이온 강도, 온도, 프로브 크기 및 수소 결합을 파괴하는 작용제의 존재를 비롯한 많은 인자의 함수이다. 혼성화를 촉진하는 인자는 높은 DNA 농도, 높은 이온 강도, 낮은 온도, 보다 긴 프로브 크기 및 수소 결합을 파괴하는 작용제의 부재를 포함한다. 혼성화는 전형적으로 2개의 단계: "결합" 단계 및 "세척" 단계로 수행된다.
기능적으로 등가인 DNA 변이체
본 발명의 범주 내의 또 다른 부류의 DNA 변이체가 이들이 코딩하는 생성물과 관련하여 기재될 수 있다. 이들 기능적으로 등가인 폴리뉴클레오티드는 이들이 유전자 코드의 축중성으로 인해 동일한 펩티드 서열을 코딩한다는 사실을 특징으로 한다.
본원에 제공된 DNA 분자의 변이체는 여러 상이한 방식으로 구축될 수 있는 것으로 인식된다. 예를 들어, 이는 완전 합성 DNA로서 구축될 수 있다. 올리고뉴클레오티드를 효율적으로 합성하는 방법이 널리 이용가능하다. 문헌 [Ausubel et al., section 2.11, Supplement 21 (1993)]을 참조한다. 중첩 올리고뉴클레오티드는 문헌 [Khorana et al., J. Mol. Biol. 72:209-217 (1971)]에 최초로 보고된 방식으로 합성 및 어셈블리될 수 있고; 또한 문헌 [Ausubel et al., 상기 문헌, Section 8.2]을 참조한다. 합성 DNA는 바람직하게는 적절한 벡터 내로의 클로닝을 용이하게 하기 위해 유전자의 5' 및 3' 단부에서 조작된 편리한 제한 부위를 갖도록 설계된다.
나타낸 바와 같이, 변이체를 생성하는 방법은 본원에 개시된 DNA 중 하나로 출발한 다음, 부위-지정 돌연변이유발을 수행하는 것이다. 문헌 [Ausubel et al., 상기 문헌, chapter 8, Supplement 37 (1997)]을 참조한다. 전형적인 방법에서, 표적 DNA는 단일-가닥 DNA 박테리오파지 비히클 내로 클로닝된다. 단일-가닥 DNA가 단리되고, 목적하는 뉴클레오티드 변경(들)을 함유하는 올리고뉴클레오티드와 혼성화된다. 상보적 가닥이 합성되고, 이중 가닥 파지가 숙주 내로 도입된다. 생성된 자손 중 일부는 목적하는 돌연변이체를 함유할 것이며, 이는 DNA 서열분석을 사용하여 확인될 수 있다. 또한, 자손 파지가 목적하는 돌연변이체일 확률을 증가시키는 다양한 방법이 이용가능하다. 이들 방법은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있고, 이러한 돌연변이체를 생성하기 위한 키트가 상업적으로 입수가능하다.
재조합 DNA 구축물 및 발현
본 발명은 본 발명에 따른 뉴클레오티드 서열 중 1개 이상을 포함하는 재조합 DNA 구축물을 추가로 제공한다. 본 발명의 재조합 구축물은 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 그의 변이체를 코딩하는 DNA 분자가 삽입된 벡터, 예컨대 플라스미드, 파지미드, 파지 또는 바이러스 벡터와 관련하여 사용될 수 있다.
따라서, 한 측면에서, 본 발명은 본 발명에 따른 핵산 서열을 포함하는 벡터에 관한 것이다.
본원에 제공된 항체, 그의 항원 결합 부분, 또는 변이체는 숙주 세포에서 경쇄 및 중쇄 또는 그의 부분을 코딩하는 핵산 서열의 재조합 발현에 의해 제조될 수 있다. 항체, 그의 항원 결합 부분, 또는 변이체를 재조합적으로 발현시키기 위해, 경쇄 및 중쇄가 숙주 세포에서 발현되도록 경쇄 및/또는 중쇄 또는 그의 부분을 코딩하는 DNA 단편을 보유하는 1개 이상의 재조합 발현 벡터로 숙주 세포를 형질감염시킬 수 있다. 문헌 [Sambrook, Fritsch and Maniatis (eds.), Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor, N.Y., (1989), Ausubel, F. M. et al., (eds.) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates, (1989)] 및 미국 특허 번호 4,816,397 (Boss et al.)에 기재된 바와 같이, 표준 재조합 DNA 방법론을 사용하여 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 핵산을 제조 및/또는 수득하고, 이들 핵산을 재조합 발현 벡터 내로 혼입시키고, 벡터를 숙주 세포 내로 도입한다.
또한, 중쇄 및/또는 경쇄의 가변 영역을 코딩하는 핵산 서열은, 예를 들어 전장 항체 쇄, Fab 단편을 코딩하는 핵산 서열, 또는 scFv로 전환될 수 있다. VL- 또는 VH-코딩 DNA 단편은 예를 들어 항체 불변 영역 또는 가요성 링커를 코딩하는 또 다른 DNA 단편에 (2개의 DNA 단편에 의해 코딩된 아미노산 서열이 인-프레임이도록) 작동가능하게 연결될 수 있다. 인간 중쇄 및 경쇄 불변 영역의 서열은 관련 기술분야에 공지되어 있고 (예를 들어, 문헌 [Kabat, E. A., et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242] 참조), 이들 영역을 포괄하는 DNA 단편은 표준 PCR 증폭에 의해 수득될 수 있다.
scFv를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 생성하기 위해, VH- 및 VL-코딩 핵산은 가요성 링커를 코딩하는 또 다른 단편에 작동가능하게 연결될 수 있고, 이에 VL 및 VH 영역이 가요성 링커에 의해 연결된, VH 및 VL 서열이 인접한 단일-쇄 단백질로서 발현될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Bird et al., (1988) Science 242:423-426; Huston et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; McCafferty et al., Nature (1990) 348:552-554] 참조).
항체, 그의 항원 결합 단편 또는 그의 변이체를 발현시키기 위해, 표준 재조합 DNA 발현 방법이 사용될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Goeddel; Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990))] 참조). 예를 들어, 목적하는 폴리펩티드를 코딩하는 DNA는 발현 벡터 내로 삽입될 수 있고, 이어서 이는 적합한 숙주 세포 내로 형질감염된다. 적합한 숙주 세포는 원핵 및 진핵 세포이다. 원핵 숙주 세포의 예는 예를 들어 박테리아이고, 진핵 숙주 세포의 예는 효모, 곤충 및 곤충 세포, 식물 및 식물 세포, 트랜스제닉 동물, 또는 포유동물 세포이다. 재조합 구축물의 숙주 세포 내로의 도입은 표준 기술, 예컨대 인산칼슘 형질감염, DEAE 덱스트란 매개 형질감염, 전기천공, 형질도입 또는 파지 감염을 사용하여 수행될 수 있다.
일부 실시양태에서, 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 DNA는 별개의 벡터 내로 삽입된다. 다른 실시양태에서, 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 DNA는 동일한 벡터 내로 삽입된다. 조절 서열의 선택을 비롯한 발현 벡터의 설계는 숙주 세포의 선택, 목적하는 단백질의 발현 수준 및 발현이 구성적인지 또는 유도성인지와 같은 인자에 의해 영향을 받는 것으로 이해된다.
따라서, 추가 측면에서, 본 발명은 본 발명에 따른 항체 또는 항원-결합 단편을 발현하고/거나 본 발명에 따른 핵산 또는 본 발명에 따른 벡터를 포함하는 단리된 세포에 관한 것이다.
단리된 세포는 실질적으로 발현 벡터가 이용가능한 임의의 세포일 수 있다. 단리된 세포는 예를 들어 고등 진핵 숙주 세포, 예컨대 포유동물 세포, 하등 진핵 숙주 세포, 예컨대 효모 세포일 수 있고, 원핵 세포, 예컨대 박테리아 세포일 수 있다.
추가 측면에서, 본 발명은 본 발명에 따른 세포의 배양을 포함하는, 본 발명에 따른 단리된 항체 또는 항원-결합 단편을 생산하는 방법에 관한 것이다. 특정한 실시양태에서, 본 발명에 따른 세포는 항체 발현에 적합한 조건 하에 배양되고, 항체 또는 항원-결합 단편은 회수된다. 특정한 실시양태에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 특히 적어도 95 중량% 균질성으로 정제된다.
박테리아 발현
박테리아 사용에 유용한 발현 벡터는 기능적 프로모터와 작동가능한 판독 상으로 적합한 번역 개시 및 종결 신호와 함께 목적하는 단백질을 코딩하는 DNA 서열을 삽입하는 것에 의해 구축된다. 벡터는 벡터의 유지를 보장하고, 바람직한 경우에 숙주 내에서 증폭을 제공하기 위해 1종 이상의 표현형 선택 마커 및 복제 기점을 포함할 것이다. 형질전환에 적합한 원핵 숙주는 이. 콜라이, 바실루스 서브틸리스, 살모넬라 티피무리움 및 슈도모나스, 스트렙토미세스, 및 스타필로코쿠스 속 내의 다양한 종을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
박테리아 벡터는 예를 들어 박테리오파지-, 플라스미드- 또는 파지미드-기반일 수 있다. 이들 벡터는 널리 공지된 클로닝 벡터 pBR322 (ATCC 37017)의 요소를 전형적으로 함유하는 상업적으로 입수가능한 플라스미드로부터 유래된 선택 마커 및 박테리아 복제 기점을 함유할 수 있다. 적합한 숙주 균주의 형질전환 및 숙주 균주의 적절한 세포 밀도로의 성장 후에, 선택된 프로모터는 적절한 수단 (예를 들어, 온도 이동 또는 화학적 유도)에 의해 탈억제/유도되고, 세포는 추가의 기간 동안 배양된다. 세포는 전형적으로 원심분리에 의해 수거되고, 물리적 또는 화학적 수단에 의해 파괴되고, 생성된 조 추출물은 추가의 정제를 위해 유지된다.
박테리아 시스템에서, 발현되는 단백질에 대해 의도되는 용도에 따라 다수의 발현 벡터가 유리하게 선택될 수 있다. 예를 들어, 항체의 생성을 위해 또는 펩티드 라이브러리를 스크리닝하기 위해 다량의 이러한 단백질이 생산되어야 하는 경우에, 예를 들어 용이하게 정제되는 융합 단백질 생성물의 높은 수준의 발현을 지시하는 벡터가 바람직할 수 있다.
따라서, 본 발명의 실시양태는 본 발명의 신규 항체를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터이다.
본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 그의 변이체는 자연적으로 정제된 생성물, 화학적 합성 절차의 생성물, 및 예를 들어 이. 콜라이, 바실루스 서브틸리스, 살모넬라 티피무리움 및 슈도모나스, 스트렙토미세스 및 스타필로코쿠스 속 내의 다양한 종을 포함한 원핵 숙주, 바람직하게는 이. 콜라이 세포로부터 재조합 기술에 의해 생산된 생성물을 포함한다.
포유동물 발현
포유동물 숙주 세포 발현을 위한 바람직한 조절 서열은 포유동물 세포에서 높은 수준의 단백질 발현을 지시하는 바이러스 요소, 예컨대 시토메갈로바이러스 (CMV) (예컨대 CMV 프로모터/인핸서), 원숭이 바이러스 40 (SV40) (예컨대 SV40 프로모터/인핸서), 아데노바이러스 (예를 들어, 아데노바이러스 주요 후기 프로모터 (AdMLP)) 및 폴리오마로부터 유래된 프로모터 및/또는 인핸서를 포함한다. 항체의 발현은 구성적일 수 있거나 또는 조절될 수 있다 (예를 들어 Tet 시스템과 함께 소분자 유도제, 예컨대 테트라시클린의 첨가 또는 제거에 의해 유도가능함). 바이러스 조절 요소 및 그의 서열의 추가의 설명에 대해서는, 예를 들어 미국 5,168,062 (Stinski), 미국 4,510,245 (Bell et al.) 및 미국 4,968,615 (Schaffner et al.)를 참조한다. 재조합 발현 벡터는 또한 복제 기점 및 선택 마커를 포함할 수 있다 (예를 들어, 미국 4,399,216, 4,634,665 및 미국 5,179,017 참조). 적합한 선택 마커는 벡터가 도입된 숙주 세포에 대해 약물, 예컨대 G418, 퓨로마이신, 히그로마이신, 블라스티시딘, 제오신/블레오마이신 또는 메토트렉세이트에 대한 저항성을 부여하는 유전자 또는 영양요구성을 이용하는 선택 마커, 예컨대 글루타민 신테타제를 포함한다 (Bebbington et al., Biotechnology (N Y). 1992 Feb;10(2):169-75). 예를 들어, 디히드로폴레이트 리덕타제 (DHFR) 유전자는 메토트렉세이트에 대한 저항성을 부여하고, neo 유전자는 G418에 대한 저항성을 부여하고, 아스페르길루스 테레우스(Aspergillus terreus)로부터의 bsd 유전자는 블라스티시딘에 대한 저항성을 부여하고, 퓨로마이신 N-아세틸-트랜스퍼라제는 퓨로마이신에 대한 저항성을 부여하고, Sh ble 유전자 생성물은 제오신에 대한 저항성을 부여하고, 히그로마이신에 대한 저항성은 이. 콜라이 히그로마이신 저항성 유전자 (hyg 또는 hph)에 의해 부여된다. DHFR 또는 글루타민 신테타제와 같은 선택 마커는 또한 MTX 및 MSX와 함께 증폭 기술에 유용하다.
발현 벡터의 숙주 세포 내로의 형질감염은 표준 기술, 예컨대 전기천공, 뉴클레오펙션, 인산칼슘 침전, 리포펙션, 다가양이온-기반 형질감염, 예컨대 폴리에틸렌이민 (PEI)-기반 형질감염 및 DEAE-덱스트란 형질감염을 사용하여 수행될 수 있다.
본원에 제공된 항체, 그의 항원 결합 단편 또는 그의 변이체를 발현시키는데 적합한 포유동물 숙주 세포는 차이니즈 햄스터 난소 (CHO 세포) 예컨대 CHO-K1, CHO-S, CHO-K1SV [예를 들어, 문헌 [R. J. Kaufman and P. A. Sharp (1982) Mol. Biol. 159:601-621]에 기재된 바와 같이 DHFR 선택 마커와 함께 사용되는 문헌 [Urlaub and Chasin, (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220 및 Urlaub et al., Cell. 1983 Jun;33(2):405-12]에 기재된 dhfr- CHO 세포; 및 문헌 [Fan et al., Biotechnol Bioeng. 2012 Apr;109(4):1007-15]에 예시된 다른 녹아웃 세포 포함], NS0 골수종 세포, COS 세포, HEK293 세포, HKB11 세포, BHK21 세포, CAP 세포, EB66 세포, 및 SP2 세포를 포함한다.
발현은 또한 발현 시스템, 예컨대 HEK293, HEK293T, HEK293-EBNA, HEK293E, HEK293-6E, HEK293-프리스타일, HKB11, Expi293F, 293EBNALT75, CHO 프리스타일, CHO-S, CHO-K1, CHO-K1SV, CHOEBNALT85, CHOS-XE, CHO-3E7 또는 CAP-T 세포에서 일시적이거나 절반-안정할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Durocher et al., Nucleic Acids Res. 2002 Jan 15;30(2):E9]).
일부 실시양태에서, 발현 벡터는 발현된 단백질이 숙주 세포가 성장하는 배양 배지 내로 분비되도록 설계된다. 항체, 그의 항원 결합 단편 또는 그의 변이체는 표준 단백질 정제 방법을 사용하여 배양 배지로부터 회수될 수 있다.
정제
본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 그의 변이체는 황산암모늄 또는 에탄올 침전, 산 추출, 단백질 A 크로마토그래피, 단백질 G 크로마토그래피, 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피, 포스포-셀룰로스 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 히드록실아파타이트 크로마토그래피 및 렉틴 크로마토그래피를 포함하나 이에 제한되지는 않는 널리 공지된 방법에 의해 재조합 세포 배양물로부터 회수 및 정제될 수 있다. 고성능 액체 크로마토그래피 ("HPLC")가 또한 정제에 사용될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Colligan, Current Protocols in Immunology, or Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, N.Y., (1997-2001), e.g., Chapters 1, 4, 6, 8, 9, 10]을 참조하고, 각각은 전체적으로 본원에 참조로 포함된다.
본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 그의 변이체는 자연적으로 정제된 생성물, 화학적 합성 절차의 생성물, 및 예를 들어 효모, 고등 식물, 곤충 및 포유동물 세포를 포함한 진핵 숙주로부터 재조합 기술에 의해 생산된 생성물을 포함한다. 재조합 생산 절차에 사용되는 숙주에 따라, 본 발명의 항체는 글리코실화될 수 있거나 또는 비-글리코실화될 수 있다. 이러한 방법은 많은 표준 실험실 매뉴얼, 예컨대 문헌 [Sambrook, 상기 문헌, Sections 17.37-17.42; Ausubel, 상기 문헌, Chapters 10, 12, 13, 16, 18 and 20]에 기재되어 있다.
바람직한 실시양태에서, 항체는 (1) 예를 들어 로우리(Lowry) 방법, UV-Vis 분광분석법 또는 SDS-모세관 겔 전기영동 (예를 들어 캘리퍼 랩칩 GXII, GX 90 또는 바이오라드 바이오애널라이저 장치 상에서)에 의해 결정된 바와 같이 95 중량% 초과의 항체로, 추가의 바람직한 실시양태에서 99 중량% 초과로, (2) N-말단 또는 내부 아미노산 서열의 적어도 15개의 잔기를 수득하기에 충분한 정도로, 또는 (3) 쿠마시 블루 또는 바람직하게는 은 염색을 사용하는 환원 또는 비-환원 조건 하에서의 SDS-PAGE에 의해 균질한 것으로 정제된다. 단리된 자연 발생 항체는 재조합 세포 내의 계내 항체를 포함하며, 이는 항체의 자연 환경의 적어도 1종의 성분이 존재하지 않을 것이기 때문이다. 그러나, 통상적으로, 단리된 항체는 적어도 1개의 정제 단계에 의해 제조될 것이다.
치료 방법
치료 방법은 치료를 필요로 하는 대상체에게 치료 유효량의 본 발명에 의해 고려되는 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 그의 변이체를 투여하는 것을 수반한다. 본원에서 "치료 유효"량은 단독으로 또는 다른 작용제와 조합되어 단일 용량으로서 또는 다중 용량 요법에 따라 대상체에서 플라스민 매개된 혈병 용해를 증가시키기에 충분한 양으로, 이는 유해 상태의 완화를 유도하지만, 그러한 양은 독성학적으로 허용되는 것인 항체 또는 항원-결합 단편의 양으로서 정의된다. 대상체는 인간 또는 비-인간 동물 (예를 들어, 토끼, 래트, 마우스, 개, 원숭이 또는 다른 하등 영장류)일 수 있다.
따라서, 한 측면에서, 본 발명은 질환의 치료 또는 예방에 사용하기 위한, 본 발명에 따른 단리된 항체 또는 항원-결합 단편 또는 본 발명에 따른 단리된 항체 또는 항원-결합 단편을 포함하는 접합체 또는 본 발명에 따른 단리된 항체 또는 항원-결합 단편을 포함하는 제약 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 단리된 항체 또는 항원-결합 단편은 부분 또는 완전 혈관 폐쇄로 인한 허혈성 사건과 연관된 다양한 A2AP 연관 장애 및/또는 질환에서 치료 또는 진단 도구로서 사용될 수 있다.
허혈성 사건은 1개의 혈관의 부분 또는 완전 폐쇄로 인한 것일 수 있지만, 이는 또한 1개 초과의 혈관의 부분 또는 완전 폐쇄의 결과일 수 있으며, 이에 의해 일부 혈관은 부분 폐쇄될 수 있고, 일부 혈관은 완전 폐쇄될 수 있다.
따라서, 추가 측면에서, 본 발명은 부분 또는 완전 혈관 폐쇄로 인한 허혈성 사건과 연관된 장애 또는 질환, 예컨대 허혈성 졸중, 급성 관상동맥 증후군, 말초 동맥 질환, 심근경색, 심부 정맥 혈전증, 폐 색전증, 정맥 혈전증, 또는 단락 혈전증의 치료 또는 예방에 사용하기 위한, 본 발명에 따른 단리된 항체 또는 항원-결합 단편 또는 본 발명에 따른 단리된 항체 또는 항원-결합 단편을 포함하는 접합체 또는 본 발명에 따른 단리된 항체 또는 항원-결합 단편을 포함하는 제약 조성물에 관한 것이다.
추가 측면에서, 본 발명은 질환, 특히 부분 또는 완전 혈관 폐쇄로 인한 허혈성 사건과 연관된 장애 또는 질환, 예컨대 허혈성 졸중, 급성 관상동맥 증후군, 말초 동맥 질환, 심근경색, 심부 정맥 혈전증, 폐 색전증, 정맥 혈전증, 또는 단락 혈전증의 치료 또는 예방을 위한, 본 발명에 따른 단리된 항체 또는 항원-결합 단편 또는 본 발명에 따른 단리된 항체 또는 항원-결합 단편을 포함하는 접합체 또는 본 발명에 따른 단리된 항체 또는 항원-결합 단편을 포함하는 제약 조성물에 관한 것이다.
추가 측면에서, 본 발명은 질환, 특히 부분 또는 완전 혈관 폐쇄로 인한 허혈성 사건과 연관된 장애 또는 질환, 예컨대 허혈성 졸중, 급성 관상동맥 증후군, 말초 동맥 질환, 심근경색, 심부 정맥 혈전증, 폐 색전증, 정맥 혈전증, 또는 단락 혈전증의 치료 또는 예방 방법에서의, 본 발명에 따른 단리된 항체 또는 항원-결합 단편 또는 본 발명에 따른 단리된 항체 또는 항원-결합 단편을 포함하는 접합체 또는 본 발명에 따른 단리된 항체 또는 항원-결합 단편을 포함하는 제약 조성물의 용도에 관한 것이다.
추가 측면에서, 본 발명은 질환, 특히 부분 또는 완전 혈관 폐쇄로 인한 허혈성 사건과 연관된 장애 또는 질환, 예컨대 허혈성 졸중, 급성 관상동맥 증후군, 말초 동맥 질환, 심근경색, 심부 정맥 혈전증, 폐 색전증, 정맥 혈전증, 또는 단락 혈전증의 예방 또는 치료를 위한 제약 조성물, 바람직하게는 의약의 제조를 위한, 본 발명에 따른 단리된 항체 또는 항원-결합 단편 또는 본 발명에 따른 단리된 항체 또는 항원-결합 단편을 포함하는 접합체 또는 본 발명에 따른 단리된 항체 또는 항원-결합 단편을 포함하는 제약 조성물의 용도에 관한 것이다.
추가 측면에서, 본 발명은 본 발명에 따른 단리된 항체 또는 항원-결합 단편 또는 본 발명에 따른 단리된 항체 또는 항원-결합 단편을 포함하는 접합체 또는 본 발명에 따른 단리된 항체 또는 항원-결합 단편을 포함하는 제약 조성물의 유효량을 사용한, 질환, 특히 부분 또는 완전 혈관 폐쇄로 인한 허혈성 사건과 연관된 장애 또는 질환, 예컨대 허혈성 졸중, 급성 관상동맥 증후군, 말초 동맥 질환, 심근경색, 심부 정맥 혈전증, 폐 색전증, 정맥 혈전증, 또는 단락 혈전증의 치료 또는 예방 방법에 관한 것이다. 상기 언급된 장애는 인간에서 잘 특징화되어 있지만, 또한 포유동물을 비롯한 다른 동물에서도 유사한 병인으로 존재하며, 본 발명에 따른 제약 조성물을 투여하는 것에 의해 치료될 수 있다.
본 발명에 따른 항체 또는 항원-결합 단편 또는 그의 변이체는 공지된 의약과 공-투여될 수 있고, 일부 경우에 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 그 자체가 변형될 수 있다. 예를 들어, 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 그의 변이체는 잠재적으로 효능을 추가로 증가시키기 위해 약물 또는 또 다른 펩티드 또는 단백질에 접합될 수 있다.
본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 그의 변이체는 단독 제약 작용제로서, 또는 조합이 허용되지 않는 유해 효과를 유발하지 않는 경우에 1종 이상의 추가의 치료제와 조합되어 투여될 수 있다.
따라서, 추가 측면에서, 본 발명은 1종 이상의 추가의 치료 활성 화합물과 동시, 개별, 또는 순차적 조합으로 사용하기 위한 본 발명에 따른 단리된 항체 또는 항원-결합 단편 또는 본 발명에 따른 접합체 또는 본 발명에 따른 제약 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 항체 또는 항원-결합 단편과 조합되어 사용될 치료 활성 화합물의 비제한적 예는 하기와 같다:
i) 응고 캐스케이드의 억제제, 예컨대 플라스미노겐 활성화제 (혈전용해제/섬유소용해제)뿐만 아니라 혈전용해 및/또는 섬유소용해를 증가시키는 화합물 (예컨대 조직 플라스미노겐 활성화제 (t-PA), 스트렙토키나제, 레테플라제, 및 우로키나제) 또는 플라스미노겐 활성화제 억제제 (PAI) 또는 트롬빈-활성화가능한 섬유소용해 억제제 (TAFI)의 억제제;
ii) 항응고제, 예컨대 미분획 헤파린, 저분자량 헤파린, 헤파리노이드, 히루딘, 비발리루딘 및/또는 아르가트로반; 직접 경구 항응고제 / 비-비타민 K 항응고제, 예컨대 인자 Xa 억제제, 예를 들어 아픽사반, 에독사반, 및 리바록사반, 및 트롬빈 억제제, 예를 들어 다비가트란.
iii) 혈소판 응집 억제제, 예컨대 아스피린, 클로피도그렐, 실로스타졸, 프라수그렐, 티카그렐로르, 칸그렐로르 등.
조합 요법은 본 발명에 따른 항체 또는 항원-결합 단편 또는 그의 변이체 및 1종 이상의 추가의 치료제를 포함하는 단일 제약 투여 제제의 투여, 뿐만 아니라 본 발명에 따른 항체 또는 항원-결합 단편 및 각각의 추가의 치료제의 그 자체의 개별 제약 투여 제제로의 투여를 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 그의 변이체 및 치료제는 환자에게 단일 액체 조성물로 함께 투여될 수 있거나, 또는 각각의 작용제는 개별 투여 제제로 투여될 수 있다.
개별 투여 제제가 사용되는 경우에, 본 발명에 따른 항체 또는 항원-결합 단편 또는 그의 변이체 및 1종 이상의 추가의 치료제는 본질적으로 동시에 (예를 들어, 공동으로) 또는 개별적으로 시차를 둔 시간에 (예를 들어, 순차적으로) 투여될 수 있다.
본 발명에 따른 항체 또는 항원-결합 단편 또는 그의 변이체는 외과적 개입, 예컨대 비제한적으로 기계적 색전절제술, 혈전절제술, 혈병 회수 장치, 뇌 재혈관화와 조합되어 사용될 수 있다.
진단 방법
또한, 본 발명에 따른 항체 또는 항원-결합 단편은 그 자체로 또는 조성물로, 연구 및 진단에서, 또는 분석 참조 표준물 등으로서 이용될 수 있다.
항-A2AP 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 A2AP의 존재를 검출하는데 사용될 수 있다. 따라서, 추가 측면에서, 본 발명은 진단제로서 사용하기 위한 본 발명에 따른 단리된 항체 또는 항원-결합 단편 또는 본 발명에 따른 항체 접합체에 관한 것이다.
제약 조성물 및 투여
추가 측면에서, 본 발명은 본 발명에 따른 단리된 항체 또는 항원-결합 단편 또는 본 발명에 따른 항체 접합체를 포함하는 제약 조성물에 관한 것이다. 상기 장애 중 임의의 것을 치료하기 위해, 본 발명에 따라 사용하기 위한 제약 조성물은 1종 이상의 생리학상 허용되는 담체, 부형제 또는 보조제를 사용하여 임의의 통상적인 방식으로 제제화될 수 있다. 제제화 및 투여 기술에 대한 추가의 세부사항은 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences (Ed. Maack Publishing Co, Easton, Pa.)]의 최신판에서 찾아볼 수 있다.
본 발명에 따른 항체 또는 항원-결합 단편은 임의의 적합한 수단에 의해 투여될 수 있으며, 이는 치료될 장애의 유형에 따라 달라질 수 있다. 가능한 투여 경로는 경구, 비경구 및 국소 투여를 포함한다. 비경구 전달 방법은 동맥내, 근육내, 피하, 수질내, 척수강내, 뇌실내, 정맥내, 복강내 또는 비강내 투여를 포함한다. 또한, 본 발명에 따른 항체 또는 항원-결합 단편은 펄스 주입에 의해, 예를 들어 항체의 감소하는 용량으로 투여될 수 있다. 바람직하게는, 투여는 주사, 가장 바람직하게는 부분적으로 투여가 단기적인지 또는 장기적인지에 따라 정맥내 또는 피하 주사에 의한다. 투여되는 양은 다양한 인자, 예컨대 임상 증상, 개체의 체중, 다른 약물이 투여되는지 여부 등에 좌우될 것이다. 통상의 기술자는 투여 경로가 치료될 장애 또는 상태에 따라 달라질 것임을 인식할 것이다.
본 발명에 따른 제약 조성물은 본 발명에 따른 항체 또는 항원-결합 단편을 단독으로 또는 적어도 1종의 다른 작용제, 예컨대 안정화 화합물과 조합하여 포함한다. 본 발명에 따른 항체 또는 항원-결합 단편은 염수, 완충 염수, 덱스트로스, 및 물을 포함하나 이에 제한되지는 않는 임의의 멸균, 생체적합성 제약 담체 중에서 투여될 수 있다. 특정한 실시양태에서, 본 발명에 따른 제약 조성물은 1종 이상의 추가의 제약 활성 화합물, 특히 A2AP 연관 장애 및/또는 부분 또는 완전 혈관 폐쇄로 인한 허혈성 사건과 연관된 장애를 치료하는데 적합한 1종 이상의 추가의 제약 활성 화합물을 포함할 수 있다. 이들 작용제 중 임의의 것은 부형제(들) 또는 제약상 허용되는 담체와 혼합된 제약 조성물로 환자에게 단독으로, 또는 다른 작용제 또는 약물과 조합되어 투여될 수 있다. 특정한 실시양태에서, 제약상 허용되는 담체는 제약상 불활성이다.
경구 투여를 위한 제약 조성물은 경구 투여에 적합한 투여량으로 관련 기술분야에 널리 공지된 제약상 허용되는 담체를 사용하여 제제화될 수 있다. 이러한 담체는 제약 조성물이 환자에 의한 섭취를 위해 정제, 환제, 당의정, 캡슐, 액체, 겔, 시럽, 슬러리, 현탁액 등으로서 제제화될 수 있게 한다.
경구 사용을 위한 제약 제제는 활성 화합물을 고체 부형제와 조합하고, 임의로 생성된 혼합물을 분쇄하고, 원하는 경우에 적합한 보조제를 첨가한 후 과립의 혼합물을 가공하여 정제 또는 당의정 코어를 수득하는 것을 통해 수득될 수 있다. 적합한 부형제는 탄수화물 또는 단백질 충전제, 예컨대 락토스, 수크로스, 만니톨 또는 소르비톨을 포함한 당; 옥수수, 밀, 벼, 감자 또는 다른 식물로부터의 전분; 셀룰로스, 예컨대 메틸-셀룰로스, 히드록시프로필메틸셀룰로스 또는 소듐 카르복시메틸 셀룰로스; 및 아라비아 및 트라가칸트를 포함한 검; 및 단백질, 예컨대 젤라틴 및 콜라겐이다. 원하는 경우에, 붕해제 또는 가용화제, 예컨대 가교된 폴리비닐 피롤리돈, 한천, 알긴산 또는 그의 염, 예컨대 알긴산나트륨이 첨가될 수 있다.
당의정 코어에는 적합한 코팅, 예컨대 농축 당 용액이 제공될 수 있으며, 이는 또한 아라비아 검, 활석, 폴리비닐 피롤리돈, 카르보폴 겔, 폴리에틸렌 글리콜 및/또는 이산화티타늄, 래커 용액, 및 적합한 유기 용매 또는 용매 혼합물을 함유할 수 있다. 염료 또는 안료는 제품 식별을 위해 또는 활성 화합물의 양, 즉 투여량을 특징화하기 위해 정제 또는 당의정 코팅에 첨가될 수 있다.
경구로 사용될 수 있는 제약 제제는 젤라틴으로 제조된 푸시-피트 캡슐, 뿐만 아니라 젤라틴 및 코팅, 예컨대 글리세롤 또는 소르비톨로 제조된 연질 밀봉 캡슐을 포함한다. 푸시-피트 캡슐은 충전제 또는 결합제, 예컨대 락토스 또는 전분, 윤활제, 예컨대 활석 또는 스테아르산마그네슘, 및 임의로 안정화제와 혼합된 활성 성분을 함유할 수 있다. 연질 캡슐에서, 활성 화합물은 안정화제의 존재 또는 부재 하에 적합한 액체, 예컨대 지방 오일, 액체 파라핀, 또는 액체 폴리에틸렌 글리콜 중에 용해 또는 현탁될 수 있다.
비경구 투여를 위한 제약 제제는 활성 화합물의 수용액을 포함한다. 주사를 위해, 본 발명의 제약 조성물은 수용액 중에, 바람직하게는 생리학상 상용성인 완충제, 예컨대 행크 용액, 링거액 또는 생리학상 완충 염수 중에 제제화될 수 있다. 수성 주사 현탁액은 현탁액의 점도를 증가시키는 물질, 예컨대 소듐 카르복시메틸 셀룰로스, 소르비톨 또는 덱스트란을 함유할 수 있다. 추가적으로, 활성 화합물의 현탁액은 적절한 유성 주사 현탁액으로서 제조될 수 있다. 적합한 친지성 용매 또는 비히클은 지방 오일, 예컨대 참깨 오일, 또는 합성 지방산 에스테르, 예컨대 에틸 올레에이트 또는 트리글리세리드, 또는 리포솜을 포함한다. 임의로, 현탁액은 또한 화합물의 용해도를 증가시켜 고도로 농축된 용액의 제조를 가능하게 하는 적합한 안정화제 또는 작용제를 함유할 수 있다.
국소 또는 비강 투여를 위해, 침투될 특정한 장벽에 적절한 침투제가 제제에 사용된다. 이러한 침투제는 일반적으로 관련 기술분야에 공지되어 있다.
본 발명의 제약 조성물은 관련 기술분야에 공지된 방식으로, 예를 들어 통상적인 혼합, 용해, 과립화, 당의정-제조, 연화, 유화, 캡슐화, 포획 또는 동결건조 공정에 의해 제조될 수 있다.
제약 조성물은 염으로서 제공될 수 있고, 염산, 황산, 아세트산, 락트산, 타르타르산, 말산, 숙신산 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는 산으로 형성될 수 있다. 염은 상응하는 유리 염기 형태인 수성 또는 다른 양성자성 용매에 보다 가용성인 경향이 있다. 다른 경우에, 바람직한 제제는 사용 전 완충제와 조합된 폴리소르베이트와 같은 추가의 물질을 임의로 포함하는, pH 범위 4.5 내지 7.5의 1 mM - 50 mM 히스티딘 또는 포스페이트 또는 트리스, 0.1%-2% 수크로스 및/또는 2%-7% 만니톨 중의 동결건조된 분말일 수 있다.
허용되는 담체 중에 제제화된 본 발명의 화합물을 포함하는 제약 조성물을 제조한 후, 이를 적절한 용기에 넣고, 표시된 상태의 치료에 대해 라벨링할 수 있다. 항-A2AP 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 투여를 위해, 이러한 라벨링은 투여의 양, 빈도 및 방법을 포함할 것이다.
치료 유효 용량
본 발명에 따라 사용하기에 적합한 제약 조성물은 활성 성분이 의도된 목적, 예를 들어 부분 또는 완전 혈관 폐쇄로 인한 허혈성 사건을 특징으로 하는 특정한 질환 상태의 치료를 달성하기 위한 유효량으로 함유된 조성물을 포함한다.
유효 용량의 결정은 충분히 관련 기술분야의 통상의 기술자의 능력 내에 있다. 본 발명의 신규 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 그의 변이체의 치료 유효량을 결정하는 것은 주로 특정한 환자 특징, 투여 경로, 및 치료될 장애의 성질에 좌우될 것이다. 일반적 지침은, 예를 들어 국제 조화 회의 및 문헌 [REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, chapters 27 and 28, pp. 484-528 (18th ed., Alfonso R. Gennaro, Ed., Easton, Pa.: Mack Pub. Co., 1990)]의 간행물에서 찾아볼 수 있다. 보다 구체적으로, 치료 유효량을 결정하는 것은 의약의 독성 및 효능과 같은 인자에 좌우될 것이다. 독성은 관련 기술분야에 널리 공지되고 상기 참고문헌에서 확인되는 방법을 사용하여 결정될 수 있다. 효능은 하기 실시예에 기재된 방법과 함께 동일한 지침을 이용하여 결정될 수 있다.
임의의 화합물에 대해, 치료 유효 용량은 초기에 세포 배양 검정에서 또는 동물 모델, 통상적으로 마우스, 토끼, 개, 돼지 또는 원숭이에서 추정될 수 있다. 동물 모델은 또한 바람직한 농도 범위 및 투여 경로를 달성하기 위해 사용된다. 이어서, 이러한 정보는 인간에서 유용한 용량 및 투여 경로를 결정하는데 사용될 수 있다.
치료 유효 용량은 증상 또는 상태를 호전시키는 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 양을 지칭한다. 이러한 화합물의 치료 효능 및 독성은 세포 배양물 또는 실험 동물에서 표준 제약 절차에 의해, 예를 들어 ED50 (집단의 50%에서 치료상 유효한 용량) 및 LD50 (집단의 50%에 치명적인 용량)으로 결정될 수 있다. 치료 효과와 독성 효과 사이의 용량 비는 치료 지수이고, 이는 ED50/LD50의 비로 표현될 수 있다. 큰 치료 지수를 나타내는 제약 조성물이 바람직하다. 세포 배양 검정 및 동물 연구로부터 수득된 데이터는 인간 사용을 위한 투여량 범위를 공식화하는데 사용된다. 이러한 화합물의 투여량은 바람직하게는 독성이 거의 또는 전혀 없이 ED50을 포함하는 순환 농도의 범위 내에 있다. 투여량은 사용되는 투여 형태, 환자의 감수성, 및 투여 경로에 따라 이러한 범위 내에서 달라진다.
정확한 투여량은 치료될 환자를 고려하여 개별 의사에 의해 선택된다. 투여량 및 투여는 충분한 수준의 활성 모이어티를 제공하거나 또는 목적하는 효과를 유지하도록 조정된다. 고려될 수 있는 추가의 인자는 환자의 질환 상태의 중증도, 연령, 체중 및 성별; 식이, 투여 시간 및 빈도, 약물 조합(들), 반응 감수성, 및 요법에 대한 내성/반응을 포함한다. 장기 작용 제약 조성물은 특정한 제제의 반감기 및 클리어런스율에 따라, 예를 들어 3 내지 4일마다, 매주, 2주마다 1회, 또는 3주마다 1회 투여될 수 있다.
통상의 투여량은 투여 경로에 따라 0.1 내지 100,000 마이크로그램에서 약 10 g의 총 용량까지 달라질 수 있다. 특정한 투여량 및 전달 방법에 관한 지침은 문헌에 제공된다. 미국 특허 번호 4,657,760; 5,206,344; 또는 5,225,212를 참조한다.
키트
추가 측면에서, 본 발명은 본 발명에 따른 단리된 항체 또는 항원-결합 단편 또는 본 발명에 따른 접합체 및 사용에 대한 지침서를 포함하는 키트에 관한 것이다. 특정한 실시양태에서, 키트는 본 발명의 상기 언급된 조성물의 성분 중 1종 이상이 충전된 1개 이상의 용기를 포함한다. 인간 투여를 위한 제품의 제조, 사용 또는 판매에 대한 정부 기관의 승인을 반영하는, 제약 또는 생물학적 제품의 제조, 사용 또는 판매를 규제하는 정부 기관에 의해 규정된 형태의 통지서가 이러한 용기(들)에 회합될 수 있다.
도 1: 교차-종 특이적, 중화 항-알파2-항플라스민 항체를 발견하기 위한 패닝 전략.
비오티닐화된 항원에 대한 선택을 위한 4가지 주요 전략이 도시된다. 표시된 경우에, 각각의 선택 라운드 전에, 관련 또는 비-알파2-항플라스민 비오티닐화된 단백질에 대한 고갈 단계를 포함시켰다.
도 2: 인간 알파2-항플라스민 및 토끼 알파2-항플라스민에 대한 Fab 431A-M080-C01의 결합의 ELISA-기반 분석
ELISA 검정에서 평가된 바와 같은 인간 (흑색 칼럼) 및 토끼 (회색 칼럼) 알파2-항플라스민에 대한 Fab 431A-M080-C01의 특이적 결합이 제시된다. 항원을 마이크로타이터 플레이트에 1 μg/ml의 최종 농도로 코팅하였다. 이를 위해, 형질감염된 세포의 상청액을 포스페이트-완충 염수 (PBS) 중에 1:1.5, 1:4.5, 1:13.5, 1:40.5, 1:121.5, 1:364.5, 1:1093.5의 인자로 희석하였다. 상대 형광 단위 (RFU, 세로좌표)를 희석된 Fab (가로좌표)에 대해 플롯팅한다. 추가의 세부사항은 실시예 3을 참조한다.
도 3: 기능 차단 활성에 대한 Fab 431A-M080-C01의 분석.
플라스민 - 알파2-항플라스민 생화학적 검정에서 측정된 바와 같은 Fab 431A-M080-C01의 기능 차단 활성이 도시된다. 이를 위해, 관심 Fab를 함유하는 포유동물 세포로부터의 상청액을 인간 또는 토끼 알파2-항플라스민과 함께 사전-인큐베이션한 후, 인간 플라스민 및 형광원성 플라스민 기질을 첨가하였다. 플라스민에 의한 기질의 절단으로부터 생성된 상대 형광 단위를 측정하였다. 생성된 데이터는 억제 백분율로서 제시된다. 좌측 담회색 칼럼은 인간 알파2-항플라스민의 중화를 나타내고, 우측 암회색 칼럼은 토끼 알파2-항플라스민의 중화를 나타낸다. 생화학적 검정의 상세한 설명에 대해서는 실시예 4를 참조한다.
도 4: 인간 및 토끼 알파2-항플라스민에 대한 항체 TPP-12387의 결합 활성.
실시예 3에 기재된 방법에 따라, 항체 TPP-12387을 인간 및 토끼 알파2-항플라스민에 결합하는 그의 능력에 대해 용량-의존성 방식으로 시험하였다. 인간 알파2-항플라스민에 대한 결합 활성은 본 도면의 좌측 패널에 제시되고, 토끼 알파2-항플라스민에 대한 결합 활성은 우측 패널에 제시된다. 결합 활성을 EC50으로서 M 값 단위로 계산하였다. 사중으로 수행된 2 내지 3가지 독립적 실험으로부터의 예로서 1개의 용량 반응 곡선이 제시된다: EC50 (인간 A2AP)은 1.2E-07 M이었고; EC50 (토끼 A2AP)은 6.0E-09 M이었다.
도 5: 인간 및 토끼 알파2-항플라스민에 대한 항체 TPP-12387의 중화 활성.
실시예 4에 기재된 방법에 따라, 항체 TPP-12387을 인간 및 토끼 알파2-항플라스민의 활성을 차단하는 그의 능력에 대해 용량-의존성 방식으로 시험하였다. 인간 알파2-항플라스민에 대한 중화 활성은 본 도면의 좌측 패널에 제시되고, 토끼 알파2-항플라스민에 대한 중화 활성은 우측 패널에 제시된다. 기능 차단 활성을 EC50으로서 M 값 단위로 계산하였다. 사중으로 수행된 2 내지 3가지 독립적 실험으로부터의 예로서 1개의 용량 반응 곡선이 제시된다: EC50 (인간 A2AP)은 1.7E-07 M이었고; EC50 (토끼 A2AP)은 1.4E-09 M이었다.
도 6: 시노몰구스 알파2-항플라스민에 대한 항체 TPP-12387의 결합 및 기능 차단 활성
실시예 3 및 실시예 4에 기재된 방법에 따라, 항체 TPP-12387을 시노몰구스 알파2-항플라스민의 활성을 차단하는 그의 능력에 대해 용량-의존성 방식으로 시험하였다. 시노몰구스 알파-2항플라스민에 대한 항체의 결합 활성은 도 6.1에 제시되고, 그의 중화 활성은 도 6.2에 제시된다. 활성을 EC50으로서 M 값 단위로 계산하였다. 사중으로 수행된 2 내지 3가지 독립적 실험으로부터의 예로서 1개의 용량 반응 곡선이 제시된다: EC50 (시노몰구스 A2AP 결합)은 9.9E-08 M이었고; EC50 (시노몰구스 A2AP 활성 차단)은 1.6E-07 M이었다.
도 7: 인간 알파2-항플라스민에 대한 TPP-12387 변이체의 결합 및 기능 차단 활성.
실시예 3 및 실시예 4에 기재된 방법에 따라, 항체 TPP-14323 (7.17, 7.18), TPP-14318 (7.15, 7.16), TPP-14314 (7.13, 7.14), TPP-14313 (7.11, 7.12), TPP-14308 (7.9, 7.10), TPP-14305 (7.7, 7.8), TPP-14303 (7.5, 7.6), TPP-14298 (7.3; 7.4), 및 TPP-14293 (7.1; 7.2)을 인간 알파2-항플라스민에 결합하고 그의 활성을 차단하는 그의 능력에 대해 용량-의존성 방식으로 시험하였다. 인간 알파2-항플라스민에 대한 결합 활성은 7.1, 7.3, 7.5, 7.7, 7.9, 7.11, 7.13, 7.15, 7.17에 제시되고, 중화 활성은 7.2, 7.4, 7.6, 7.8, 7.10, 7.12, 7.14, 7.16, 7.18에 제시된다. 결합 및 기능 차단 활성을 EC50으로서 M 값 단위로 계산하였다 (표 3.3). 각각의 항체에 대해, 사중으로 수행된 2 내지 3가지 독립적 실험으로부터의 예로서 1개의 용량 반응 곡선이 제시된다.
도 8: 인간 알파2-항플라스민에 대한 결합 및 중화에 대한 TPP-14308의 배선 변이체의 시험.
TPP-14308의 배선화 접근법으로부터 생성된 47종의 항체를 인간 알파2-항플라스민에 결합하고 그의 활성을 차단하는 능력에 대해 용량-의존성 방식으로 TPP-14308과 비교하여 시험하였다. TPP-14308의 배선화 접근법으로부터 생성된 6종의 항체 (TPP-17041, TPP-17044, TPP-17045, TPP-17048, TPP-17051, TPP-17053)는 개선된 결합 활성 및/또는 중화 활성을 나타낸다. 인간 알파2-항플라스민에 대한 결합 활성은 8.1, 8.3, 8.5, 8.7, 8.9, 8.11에 제시되고, 중화 활성은 8.2, 8.4, 8.6, 8.8, 8.10, 8.12에 제시된다. 결합 및 기능 차단 활성을 EC50으로서 M 값 단위로 계산하였다 (표 3.5). 각각의 항체에 대해, 사중으로 수행된 2 내지 3가지 독립적 실험으로부터의 예로서 1개의 용량 반응 곡선이 제시된다 (사각형 = TPP 17308, 원형 = TPP-17041, TPP-17044, TPP-17045, TPP-17048, TPP-17051 또는 TPP-17053).
도 9: 상이한 종으로부터의 인간 알파2-항플라스민에 대한 TPP-17044 IgG1 항체의 중화 활성.
인간 (9.1), 시노몰구스 (9.2), 및 토끼 (9.3) 알파2-항플라스민에 대한 실시예 4에 기재된 방법에 따른 기능 차단 활성에 대한 TPP-17044의 시험이 제시된다. 중화 활성을 EC50으로서 M 값 단위로 계산하였다. 이러한 항체에 대해, 사중으로 수행된 2 내지 3가지 독립적 실험으로부터의 예로서 1개의 용량 반응 곡선이 제시된다. 인간 알파2-항플라스민에 대한 TPP-17044의 기능 차단 활성은 4.4E-10 M이었고 (도 9.1에 제시된 바와 같음), 제2 실험의 경우 5.4E-10 M 및 제3 실험의 경우 5.0E-10 M이었다. 시노몰구스 알파2-항플라스민의 억제에 대한 값은 4.6E-10 M (도 9.2)이었고, 제2 실험의 경우 4.9E-10 M 및 제3 실험의 경우 5.1E-10 M이었다. 토끼 알파2-항플라스민은 TPP-17044에 의해 그의 활성이 2.7E-08 M의 IC50 값으로 차단되었고 (도 9.3), 제2 실험의 경우 3.6E-08 M 및 제3 실험의 경우 2.9E-08 M로 차단되었다.
도 10: 상이한 종으로부터의 인간 알파2-항플라스민에 대한 TPP-17928 IgG4 항체의 중화 활성.
인간 (10.1), 시노몰구스 (10.2), 및 토끼 (10.3) 알파2-항플라스민에 대한 실시예 4에 기재된 방법에 따른 기능 차단 활성에 대한 TPP-17928의 시험이 제시된다. 중화 활성을 EC50으로서 M 값 단위로 계산하였다. 이러한 항체에 대해, 사중으로 수행된 2 내지 3가지 독립적 실험으로부터의 예로서 1개의 용량 반응 곡선이 제시된다. 인간 알파2-항플라스민에 대한 TPP-17928의 기능 차단 활성은 1.1E-10 M이었고 (도 10.1에 제시된 바와 같음), 제2 실험의 경우 1.6E-10 M이었다. 시노몰구스 알파2-항플라스민의 억제에 대한 값은 2.6E-10 M (도 10.2)이었고, 제2 실험의 경우 3.4E-10 M 및 제3 실험의 경우 2.9E-10 M이었다. 토끼 알파2-항플라스민은 TPP-17928에 의해 그의 활성이 1.5E-08 M의 IC50 값으로 차단되었고 (도 10.3), 제2 실험의 경우 1.9E-10 M 및 제3 실험의 경우 1.6E-10 M로 차단되었다.
도 11: TPP-17928에 의한 혈병 용해 시간의 감소.
항체 TPP-17928은 각각 인간 (삼각형) 및 토끼 (사각형) 혈장에서 tPA-유도된 혈병 용해 시간을 용량-의존성 방식으로 감소시킨다. 활성을 IC50으로서 M 값 단위로 계산하였다. 곡선은 3가지 독립적 실험으로부터의 평균 (+/- SD)을 나타낸다. 실험 세부사항은 실시예 7을 참조한다. IC50 (인간 혈장)은 2.5E-07 M이었고; EC50 (토끼 혈장)은 2.3E-07 M이었다.
도 12: 혈병 용해에 대한 TPP-17928의 생체내 효과.
동물에게 측정 30분 전에 형광-표지된 혈장 혈병을 제공하였고; 각각의 처리는 시점 0분에 투여하였다. 360분에 걸쳐 혈장 샘플을 채취하고, 혈병 용해의 간접 파라미터로서 혈장 형광의 양을 측정하였다. 혈병 용해에 대한 상이한 농도의 TPP-17928 (도 12.1, 대조군 원형; 3.75 mg/kg 백색 원형; 7.5 mg/kg 백색 사각형; 15 mg/kg 백색 삼각형)의 효과, 및 상이한 농도의 tPA (도 12.2, 대조군 원형, 0.125 mg/kg 삼각형, 0.25 mg/kg 사각형, 1 mg/kg 다이아몬드형) 또는 둘 다의 조합 (도 12.1, 15 mg/kg + 0.125 mg/kg tPA (백색 다이아몬드형))의 효과를 측정하였다. 상대 형광 단위 (rFU, 세로좌표)를 혈장 샘플이 채취된 시점 (가로좌표)에 대해 플롯팅한다. 값은 평균 +/- SD이다. TPP-17928 단독은 혈병 용해에 대해 용량-의존성 효과를 갖는다. 본 발명의 항체의 적용 후에, 활성 최대치는 약 60분에 달성되고, 이는 이어서 전체 실험 시간 (360분)에 걸쳐 지속적인 효과를 생성한다. 또한, tPA-처리는 혈병 용해에 대해 용량-의존성 효과를 나타낸다. tPA는 혈병 용해의 빠르고 급격한 증가 (15분 후 최대)를 갖지만, TPP-17928에 대해 관찰된 바와 같은 더 오래 지속되는 효과는 나타내지 않는다. 저용량 tPA로의 TPP-17928의 공-투여는 단일 화합물의 투여보다 더 빠른 혈병 용해로 이어진다. 세부사항은 실시예 8을 참조한다.
도 13: tPA 및 TPP-17928 유도된 귀 출혈 시간의 결정.
혈장 형광 측정 (도 12에 제시됨)과 동시에, 귀 출혈 시간을 화합물 투여 후 시점 0분에 결정하였다. 각각의 처리군에 대해, 출혈 시간이 초 단위 (sec)로 제시된다. 값은 평균 +/- SEM이다.
칼럼 1: 대조군
칼럼 2: 0.125 mg/kg tPA,
칼럼 3: 0.25 mg/kg tPA
칼럼 4: 1 mg/kg tPA
칼럼 5: 3.75 mg/kg TPP-17928
칼럼 6: 7.5 mg/kg TPP-17928
칼럼 7: 15 mg/kg TPP-17928
칼럼 8: 15 mg/kg TPP-17928 + 0.125 mg/kg tPA
도 14: 플라스민에 대한 77A3 및 본 발명의 항체의 효과
실시예 10에 기재된 바와 같은 A2AP 기능 차단 검정의 결과가 제시된다.
하기 항체 및 항체 농도를 사용하였다:
도 14.1: 6.1E-11 - 3.0E-08 M 77A3 (좌측 다이어그램) 및 6.11E-11 - 1.0E-06 M 77A3 (우측 다이어그램)
도 14.2: 6.11E-11 - 1E-06 M 77A3 (원형) 및 6.1E-11 - 1.0E-06 M TPP-17041 (삼각형)
도 14.3: 6.1E-11 - 1.0E-06 M 77A3 (원형) 및 6.1E-11 - 1.0E-06 M TPP-17044 (사각형)
도 14.4: 6.1E-11 - 1Ee-06 M 77A3 (원형) 및 6.1E-11 - 1.0E-06 M TPP-17045 (삼각형)
도 14.5: 6.1E-11 - 1.0E-06 M 77A3 (원형) 및 6.1E-11 - 1.0E-06 M TPP-17048 (다이아몬드형)
도 14.6: 6.1E-11 - 1.0E-06 M 77A3 (원형) 및 6.1E-11 - 1.0E-06 M TPP-17051 (삼각형).
도 14.7: 6.1E-11 - 1.0E-06 M 77A3 (원형) 및 6.1E-11 - 1.0E-06 M TPP-17053 (사각형).
0.03 μM까지 77A3 농도의 증가는 플라스민에 의한 형광원성 기질 I-1275의 절단으로 인해 형광 신호의 증가를 발생시켰다. 그러나, 77A3 농도의 추가의 증가는 형광 신호의 감소를 발생시켰다. 이는 실시예 4에 기재된 생화학적 검정에서 0.03 μM의 농도까지의 시험 항체 77A3은 알파2-항플라스민의 차단으로 이어지고, 77A3 항체 농도의 추가의 증가는 플라스민 활성의 저하로 이어져, 1 μM의 77A3 농도에서 플라스민 활성의 완전한 억제를 발생시킨다는 것을 나타낸다 (도 14.1). 놀랍게도, 이러한 발견과 비교하여, 본 발명의 시험 항체는 1 μM까지 형광 신호의 감소를 발생시키지 않았고, 이는 본 발명의 시험 항체가 플라스민 활성에 영향을 미치지 않는다는 것을 나타낸다 (도 14.2-14.7).
도 15: 본 발명에 따른 바람직한 항체의 아미노산 서열
본 발명에 따른 바람직한 항체의 VH, H-CDR1, H-CDR2, H-CDR2, H-CDR3, VL, L-CDR1, L-CDR2, L-CDR3, 중쇄 및 경쇄의 아미노산 서열이 도시된다.
도 16: 플라스민의 단백질분해 활성에 대한 77A3 및 본 발명의 항체의 효과
실시예 11에 기재된 바와 같은 사용된 항체 농도에 의존적인 플라스민 활성이 77A3 (사각형) 및 TPP-17928 (원형)에 대해 제시된다. 이중으로 수행된 2 내지 3가지 독립적 실험으로부터의 1개의 용량 반응 곡선이 예로서 제시된다. 77A3은 플라스민 활성에 대한 억제 효과를 농도-의존성 방식으로 나타내는 반면 (IC50 1.7 μM), TPP-17928은 놀랍게도 10 μM의 농도까지 플라스민 활성을 억제하지 않는다 (또한 실시예 11에서 표로 제시된 IC50 값의 개관 참조).
서열 목록
하기 서열을 개시하는 서열 목록이 포함된다:
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실시예
실시예 1: 바이오인벤트(BioInvent) 항체 라이브러리로부터의 항체 TPP-12387의 생성
완전 인간 항체 파지 디스플레이 라이브러리 (바이오인벤트 n-CoDeR Fab 람다 라이브러리)를 사용하여, 인간 및 토끼 기원으로부터의 인간 알파2-항플라스민인 가용성 비오티닐화된 항원에 대한 선택에 의해 인간 모노클로날 항체를 단리하였다.
인간 알파2-항플라스민은 상업적 공급원의 것 (항체 온라인; 카탈로그 번호 ABIN2544306)으로부터 사용한 반면, 토끼 항원은 재조합 발현 및 정제에 의해 사내 생산하였다. 이를 위해, 토끼 알파2-항플라스민으로부터의 cDNA를 표준 발현 벡터 내로 클로닝하고, 이러한 구축물로 293펙틴 형질감염 시약 (인비트로젠, 카탈로그 번호 12347-019)을 제조업체의 지침에 따라 사용하여 HEK293 세포를 일시적으로 형질감염시켰다. 발현된 토끼 알파2-항플라스민을 Ni-IMAC 및 크기 배제 크로마토그래피를 통해 세포 배양 상청액으로부터 정제하였다.
술포-NHS-LC-비오틴 키트 (써모 사이언티픽(Thermo Scientific), 카탈로그 번호 A39257)를 사용하여 항원을 비오티닐화하였다. 유리 비오틴을 적절한 완충제에 대한 투석에 의해 반응물로부터 제거하였다.
패닝 절차를 위해, 하기 프로토콜을 적용하였다: 스트렙타비딘-커플링된 디나비즈 M-280 (인비트로젠, 카탈로그 번호 11205D)을 각각 비오티닐화된 항원 (1개 튜브) 및 비오티닐화된 오프-타겟 (3개 튜브)으로 실온 (RT)에서 1시간 동안 코팅하였다. 디나비즈를 세척하고, 후속적으로 엔드-오버-엔드 회전으로 실온에서 1시간 동안 차단하였다. 오프-타겟 결합제의 고갈을 위해, 차단된 파지 라이브러리를 차단된 오프-타겟 로딩된 디나비즈에 첨가하고, 엔드-오버-엔드 회전으로 실온에서 10분 동안 인큐베이션하였다. 이 고갈 단계를 2회 반복하였다. 고갈된 파지 라이브러리를 차단된 표적 로딩된 디나비즈에 첨가하고, 엔드-오버-엔드 회전으로 실온에서 60분 동안 인큐베이션하였다. 엄격한 세척 (차단 완충제 중 3 x 및 0.05% 트윈-20을 함유하는 PBS (150 mM NaCl; 8 mM Na2HPO4; 1.5 mM KH2PO4; pH = 7.4-7.6으로 조정됨) 중 9 x) 후에, 코팅된 표적에 특이적으로 결합하는 Fab-파지를 갖는 디나비즈를 직접 사용하여 에스케리키아 콜라이 균주 HB101을 감염시켰다. 후속적으로, 파지를 M13KO7 헬퍼 파지 (인비트로젠, 카탈로그 번호 18311019)를 사용하여 에스케리키아 콜라이 균주 HB101에서 증폭시켰다. 다음 선택 라운드에서, 표적 농도를 감소시켜 고친화도 결합제에 대한 선택 압력을 증대시켰다.
이 라이브러리의 패닝 동안, 4가지의 상이한 선택 전략을 수행하였다:
전략 I은 둘 다 N-말단이 결여된 전장 인간 알파2-항플라스민 및 토끼 알파2-항플라스민 각각에 대해 결합 활성을 나타내는 항체를 확인하는 방식으로 설계되었다. 비오티닐화된 비관련 단백질을 사용하는 고갈 단계를 포함시켰다.
전략 II는 알파2-항플라스민의 플라스민 결합 부위를 인식하는 항체를 목표로 하였다. 전략 I에서와 같이, 성공 확률을 증가시키기 위해, 플라스민-결합 부위가 누락된 알파2-항플라스민 변이체를 항원으로서 사용하는 고갈 단계를 포함시켰다.
2가지의 추가의 전략 (전략 III 및 IV)에서, 알파2-항플라스민의 소위 반응성 중심 루프 (RCL)를 나타내는 비오티닐화된 선형 및 비오티닐화된 시클릭 펩티드를 각각 사용하였다. 둘 다의 경우에, 비관련 비오티닐화된 단백질을 고갈 단계에 사용하였다.
패닝 전략의 상세한 개관이 도 1에 제공된다.
실시예 2: 재조합 DNA 구축물 및 Fab 및 전장 항체의 발현, 정제 및 정량화
HEK293-6E 세포에서의 생산
일시적으로 형질감염된 HEK293-6E 세포를 사용하여 포유동물 세포 배양에 의해 Fab뿐만 아니라 전장 항체를 생산하였다. 중쇄 및 경쇄를 적합한 발현 벡터 시스템 내로 클로닝하였다. 세포를 3 - 4일 동안 인큐베이션하였다. 상청액을 수집하고, Fab 및 항체를 기재된 바와 같이 정제하였다.
Fab 및 항체의 정제 및 정량화
항체를 제조업체의 지침에 따라 단백질 A 크로마토그래피 (써모피셔(ThermoFischer), 카탈로그 번호 A26455)에 의해 정제하였다.
항체, 그의 항원 결합 부분, 또는 유도체를 표준 단백질 정제 방법을 사용하여 배양 배지로부터 회수하였다.
Fab를 3-단계 연구 하류 공정을 사용하여 멸균 여과된 포유동물 세포 상청액으로부터 정제하였다. 포획 단계로서, PBS pH 7.4 중에 평형화된 "포획 선택 IgG-CH1" 친화도 칼럼 (써모피셔, 카탈로그 번호 494320005)을 사용하였다. 세척 완충제 (PBS pH 7.4) 중에서 10 칼럼 부피로 세척한 후, 글리신 0.1M pH 3.0 (6 CV)을 사용하여 Fab의 용리를 달성하였다. 트리스 염기로의 중화 시, DPBS pH 7.4로의 완충제 교환 및 응집체 제거에 크기 배제 크로마토그래피 (지이 헬스케어(GE Healthcare), 슈퍼덱스 200, 카탈로그 번호 GE29321905)를 사용하였다. 분석적 크기 배제 크로마토그래피는 생성된 배치에 이량체가 존재하지 않는다는 것을 입증하였다.
전장 항체의 정량화를 위해, 항-인간 IgG Fc 특이적 항체 (시그마(Sigma), 카탈로그 번호 I2136)를 384-웰 마이크로타이터 플레이트 (눈크(Nunc))에 5 μg/ml의 농도로 밤새 4℃에서 코팅하였다. 관심 IgG를 함유하는 용액을 상이한 농도로 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 검출을 위해, 검출 항체 A0170 (시그마) 및 기질로서 암플렉스 레드를 첨가하였다. 스펙트라플루오르플러스 판독기 (테칸(Tecan))를 사용하여 535/590 nm에서 형광을 모니터링하였다.
Fab와 같은 항체 변이체의 정량화를 위해, 인간 카파 ELISA 키트 (압캠(Abcam), 카탈로그 번호 ab157709)를 제조업체의 지침에 따라 사용하였다.
실시예 3: 항-알파2-항플라스민 결합 활성을 시험하기 위한 효소-연결 면역흡착 검정 (ELISA).
표준 ELISA 포맷을 사용하여 각각 인간 및 토끼 알파-2-항플라스민에 대한 본 발명의 Fab의 결합 친화도를 분석하였다. 항원을 흑색 384 웰 맥시소르프 마이크로타이터 플레이트 (눈크; 카탈로그 번호 460518)에 코팅하고, 1X 코팅 완충제 (칸도르 바이오사이언스(Candor Bioscience); 카탈로그 번호 121125) 중에 1 μg/ml의 농도로 희석하였다. 플레이트를 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 밤새 인큐베이션한 후, 플레이트를 PBS + 0.05% 트윈 20을 사용하여 50μl/웰로 2 X 세척하였다. 이후에, 50 μl/웰의 차단 완충제 (스마트 블록(Smart Block); 칸도르 바이오사이언스; 카탈로그 번호 113500)를 첨가하고, 플레이트를 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 그 후, 플레이트를 50μl/웰의 PBS+ 0.05% 트윈 20 완충제를 사용하여 3 X 세척하였다. 본 발명의 Fab를 상이한 농도로 30 μl/웰의 최종 부피로 첨가하였다. 플레이트를 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 이러한 인큐베이션 단계 후에, 플레이트를 50μl/웰의 PBS+ 0.05% 트윈 20 완충제를 사용하여 3 X 세척하였다. 결합된 Fab 및 전장 항체의 검출을 위해, 항-인간 람다 경쇄 (결합 및 유리)-퍼옥시다제 항체 (시그마; 카탈로그 번호 A5175)를 10% 차단 완충제 중에 1:10.000의 인자로 희석하였다. 이러한 희석된 검출 항체 30 μl/웰을 첨가하고, 플레이트를 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 이러한 인큐베이션 단계 후에, 플레이트를 50μl/웰의 PBS+ 0.05% 트윈 20 완충제를 사용하여 3 X 세척하였다. 기질로서, 30 μl/웰의 1:1000 희석된 암플렉스 레드 (인비트로젠; 카탈로그 번호 12222; DMSO 중 원액 10mM) 및 1:10.000의 과산화수소 (머크(Merck); 카탈로그 번호 107209; 30% 원액)의 혼합물을 첨가하고, 플레이트를 암실에서 20분 동안 인큐베이션하였다.
측정을 위해, 인피니트 f500 판독기 (테칸)를 사용하였다. 측정 모드: 형광; 상부 판독; Ex 535 nm; Em 590 nm.
스크리닝된 2 x 1010개의 총수의 Fab 변이체로부터, 각각 인간 및 토끼 알파2-항플라스민에 대한 결합에 대해 시험될 잠재적 후보로서 2944개의 변이체를 선택하였다.
실시예 2에 기재된 바와 같이, HEK293 세포를 일시적으로 형질감염시켰다. 생성된 상청액을 인간 및 토끼 항원에 결합하는 그의 능력을 시험하기 위해 추가의 정제 또는 희석 없이 직접 사용하였다. 이들 2944개의 Fab로부터, 별개의 서열을 나타내는 88개의 후보는 2종의 항원에 대해 요구되는 교차-종 결합 활성을 보여주었다.
입체형태를 위해, 본 발명의 88개의 변이체를 그의 결합 능력에 대해 재시험하였다. 이를 위해, 형질감염된 세포의 상청액을 포스페이트-완충 염수 (PBS) 중에 1:1.5, 1:4.5, 1:13.5, 1:40.5, 1:121.5, 1:364.5, 1:1093.5의 인자로 희석하였다. 이들 희석된 샘플을 인간 및 토끼 알파-2-항플라스민에 대한 결합에 대해 시험하였다.
사중으로 수행된 2 내지 3가지 독립적 실험으로부터의 예로서 1개의 용량 반응 곡선을 도 4에 제시한다. 3가지 독립적 실험에 대해, 인간 알파2-항플라스민에 대한 TPP-12387의 결합 활성에 대한 EC50 값은 하기와 같았다: 각각 1.2E-07 M (도 4에 제시된 바와 같음), 1.0E-07 M, 및 1.3E-07 M. 토끼 알파2-항플라스민에 대한 결합 활성은 각각 6.0E-09 M (도 4에 제시된 바와 같음), 6.07E-09 M 및 6.2E-09 M이었다.
실시예 4: 선택된 후보를 알파2-항플라스민 기능 차단 활성에 대해 시험하기 위한 생화학적 검정.
항-알파2-항플라스민 분자를 기능적 차단 활성에 대해 시험하기 위해, Fab 또는 전장 항체를 50 mM 트리스-HCl (깁코(GIBCO); 카탈로그 번호 15567-027 (50mM)), 100 mM NaCl (시그마; 카탈로그 번호 S7653), 5 mM CaCl2 (시그마; 카탈로그 번호 21115-100ML), 0.1% 알부민 0.1% (시그마; BSA, 카탈로그 번호 A4503-100g), pH 7.4로 이루어진 완충제 중의 1 nM의 인간 알파2-항플라스민 (항체 온라인; 카탈로그 번호 ABIN2544306) 또는 사내 생산된 토끼 알파2-항플라스민 또는 사내 생산된 시노몰구스 알파2-항플라스민과 함께 37℃에서 20분 동안 사전-인큐베이션하였다.
그 후, 400 pM의 최종 농도의 인간 플라스민 (헤마톨로직 테크놀로지스 인크.(Haematologic Technologies INC.); 카탈로그 번호 HCPM0140) 및 50 μm의 최종 농도의 형광원성 기질 I-1275 (바켐; MeOSuc-Ala-Phe-Lys-AMC 트리플루오로아세테이트 염; 카탈로그 번호 I-1275 (스톡: DMSO 중 10mM))를 첨가하고, 반응물을 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 이 반응은 384 웰 마이크로타이터 플레이트 (눈크; 카탈로그 번호 262260)에서 수행하였다. 형광원성 신호를 하기 조건에서 측정하였다: 모두스 형광 최고 판독, Ex 360 nM, Em 465 nm, Ex 대역폭 5 nm, Em 대역폭 5 nm.
Fab 및/또는 전장 항체 기능 차단 활성의 용량 의존성의 결정을 위해, 이들 분자의 농도를 상기 기재된 바와 같이 측정하였다. 규정된 농도에서 출발하여 1:3 또는 1:4 희석 단계가 이어진 상이한 농도의 Fab 및/또는 전장 항체를 각각 1 nM의 인간, 시노몰구스, 또는 토끼 알파2-항플라스민과 함께 사전-인큐베이션하였다.
88개의 Fab 후보를 인간 및 토끼 알파2-항플라스민에 대해 단일-지점 측정에서 기능 차단 활성에 대해 시험하였고, 이는 일시적으로 형질감염된 HEK293 세포로부터 생성된 상청액으로부터 최대 가능한 부피를 활성 검정에 첨가하였음을 의미한다. 이로써, 적어도 약 30%의 알파2-항플라스민 활성의 감소를 나타내는 17개의 Fab가 확인되었다.
다음 단계에서, 이들 17개의 Fab를 전장 IgG1 항체 포맷으로 재포맷하였다. 이들 중 12개는 합리적인 발현율을 나타내었다.
실시예 3에 기재된 방법에 따라, 이들 12개의 항체를 인간 및 토끼 알파2-항플라스민에 결합하는 능력에 대해 용량-의존성 방식으로 시험하였다. 생성된 데이터를 그래프패드프리즘 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. 항체의 결합 활성을 EC50 값으로서 계산하였다. 2 내지 3가지 독립적 실험을 사중으로 수행하였다.
다음 단계에서, 이들 12개의 전장 항체를 인간 및 토끼 알파2-항플라스민에 대한 활성의 차단에 대해 용량-의존적으로 재시험하였다.
인간 및 토끼 알파2-항플라스민 항체에 대한 그의 결합 활성 및 기능 차단 활성에 기초하여 TPP-12387을 추가의 시험 및 최적화를 위해 선택하였다. 도 2는 실시예 3에서 결정된 바와 같은 인간 및 토끼 알파2-항플라스민에 대한 TPP-12387에 상응하는 Fab 단편의 결합 활성을 보여준다. 도 3은 실시예 4에서 결정된 바와 같은 인간 및 토끼 알파2-항플라스민에 대한 TPP-12387에 상응하는 Fab 단편의 기능 차단 활성을 보여준다. 도 4는 실시예 3에 기재된 결합 검정에서 결정된 바와 같은 인간 및 토끼 알파2-항플라스민에 대한 IgG1 항체 TPP-12387의 결합 활성을 보여준다. 도 5는 실시예 4에 기재된 기능 차단 검정에서 결정된 바와 같은 인간 및 토끼 알파2-항플라스민에 대한 IgG1 항체 TPP-12387의 기능 차단 활성을 보여준다. 사중으로 수행된 2 내지 3가지 독립적 실험의 예로서 인간 및 토끼 알파2-항플라스민에 대한 TPP-12387의 중화 활성에 대한 1개의 용량 반응 곡선을 도 5에 제시한다. 3가지 독립적 실험에 대해, 인간 알파2-항플라스민에 대한 TPP-12387의 기능 차단 활성에 대한 IC50 값은 하기와 같았다: 각각 1.7E-07 M (도 5에 제시된 바와 같음), 1.8E-07 M, 및 1.8E-07 M. 토끼 알파2-항플라스민에 대한 결합 활성은 1.4E-08 M (도 4에 제시된 바와 같음), 1.3E-08 M 및 1.5E-08 M이었다.
다음 단계에서, TPP-12387을 시노몰구스 알파2-항플라스민에 대한 그의 결합 활성뿐만 아니라 그의 기능 차단 활성에 대해 시험하였다. 시노몰구스 알파2-항플라스민을 토끼 알파2-항플라스민과 동일한 방식으로 제조하였다. 시노몰구스 알파2-항플라스민에 대한 TPP-12387의 결합 활성뿐만 아니라 그의 기능 차단 활성의 값을 도 6에 제시한다. 사중으로 수행된 2 내지 3가지 독립적 실험의 예로서 시노몰구스 알파2-항플라스민에 대한 항체 TPP-12387의 결합 및 기능 차단 활성에 대한 1개의 용량 반응 곡선을 도 6에 제시한다. 이로써, 시노몰구스 알파2-항플라스민에 대한 TPP-12387의 결합 활성에 대한 EC50 값은 제2의 독립적 실험에서 9.0E-08 M (도 6.1에 제시된 바와 같음) 및 9.0E-08 M이었고, 시노몰구스 알파2-항플라스민의 기능 차단 활성에 대한 IC50은 제2 실험에서 1.6E-07 M (도 6.2에 제시된 바와 같음) 및 1.6E-07 M이었다.
실시예 5: 리드 항체 TPP-12387의 친화도 최적화
항체 TPP-12387을 그의 친화도를 최적화하고 그의 기능적 효율을 증가시키는 것을 목표로 리드 최적화 절차에 적용하였다.
친화도 성숙은 제1 단일 돌연변이 수집 라운드에 이어서 가장 친화도- 및 효력-증가 아미노산 교환의 재조합에 이어서 배선화 및 서열 최적화 캠페인에 의해 수행하였다. 돌연변이 수집을 위해, 하기 개별 아미노산 위치에서의 NNK (N = A 또는 G 또는 C 또는 T, K = G 또는 T) 무작위화를 잔기 AAWDDSLSGWV (잔기 91 내지 101, CDR-L3 포함) 및 AREYYDSSGYYHLDY (잔기 96 내지 110, CDR-H3 잔기 98 - 110 플러스 그의 N-말단 부위에서 CDR에 플랭킹된 2개의 추가의 아미노산 포함)의 NNK 코돈-다양화를 포함하여 합성 올리고뉴클레오티드를 사용한 부위 지정 돌연변이유발에 의해 생성하였다.
생성된 단일 NNK 라이브러리를 서열분석하고, CDR-L3에 대한 TPP-12387의 139개의 아미노산 교환 변이체 및 CDR-H3에 대한 156개를 확인하였다 (표 3.1 및 3.2 참조).
Figure pct00051
표 3.1: TPP-12387의 CDRL3에서의 교환의 목록
Figure pct00052
표 3.2: TPP-12387의 CDRH3 플러스 2개의 N-말단 인접 아미노산에서의 교환의 목록
모든 변이체를 포유동물 세포주 HEK293의 일시적 형질감염에 의해 발현시키고, 생성된 발현 상청액을 인간 알파2-항플라스민에 대한 그의 결합 능력뿐만 아니라 그의 기능 차단 활성에 대해 직접 시험하였다.
항체 TPP-12387보다 더 높은 결합 및 기능 차단 활성을 나타내는 변이체를 HEK293 세포에서 1회 더 발현시키고, 항체를 실시예 2에 기재된 바와 같이 정제 및 정량화하고, 인간 알파2-항플라스민에 대한 그의 결합 능력 및 그의 기능 차단 능력에 대해 모 변이체 TPP-12387과 직접 비교하여 재-시험하였다.
이에 의해, CDR-L3 내에서 5개의 교환 및 CDR-H3 내에서 7개의 교환이 모 항체 TPP-12387과 비교하여 개선된 활성을 갖는 것으로 확인되었다. 개선된 친화도 및 기능적 효율을 갖는 이들 11개의 단일 치환 변이체를 TPP-12387을 기초로 하는 1개의 재조합 라이브러리에서 재조합하였다. 여기서, 선택된 돌연변이 또는 상응하는 야생형 아미노산을 각각의 선택된 위치에 도입하기 위해 올리고뉴클레오티드를 생성하였다. 라이브러리 구축은 순차적 라운드의 중첩 연장 PCR을 사용하여 수행하였다. 최종 PCR 생성물을 포유동물 IgG1 발현 벡터에 라이게이션하고, 변이체를 서열분석하였다.
이러한 재조합 라이브러리에서 생성된 항체는 TPP-14290, TPP-14291, TPP-14292, TPP-14293, TPP-14294, TPP-14295, TPP-14296, TPP-14297, TPP-14298, TPP-14299, TPP-14300, TPP-14301, TPP-14302, TPP-14303, TPP-14304, TPP-14305, TPP-14306, TPP-14307, TPP-14308, TPP-14309, TPP-14310, TPP-14311, TPP-14312, TPP-14313, TPP-14314, TPP-14315, TPP-14316, TPP-14317, TPP-14318, TPP-14319, TPP-14320, TPP-14322, TPP-14323, TPP-14324였다.
실시예 2에 기재된 바와 같이, 항체를 상청액으로부터 정제하고, 그의 농도를 결정하였다. 다음으로, 항체를 인간 알파2-항플라스민에 결합하는 그의 능력 및 인간 알파2-항플라스민을 차단하는 그의 능력에 대해 시험하였다 (실시예 3 및 4에 기재된 바와 같음).
항체 TPP-14293, TPP-14298, TPP-14303, TPP-14305, TPP-14308, TPP-14313, TPP-14314, TPP-14318, TPP-14323은, 인간 알파2-항플라스민에 결합하고 인간 알파2-항플라스민의 활성을 차단하는 관점에서 가장 강력한 것으로 확인된 바와 같이, TPP-12387의 가장 개선된 재조합 돌연변이체를 나타낸다. 이들 항체에 대한 결합 및 활성 데이터를 도 7에 제시한다.
실시예 3 및 실시예 4에 기재된 방법에 따라, 항체 TPP-14323, TPP-14318, TPP-14314, TPP-14313, TPP-14308, TPP-14305, TPP-14303, TPP-14298, 및 TPP-14293을 인간 알파2-항플라스민에 결합하고 그의 활성을 차단하는 그의 능력에 대해 용량-의존성 방식으로 시험하였다. 각각의 항체에 대해, 사중으로 수행된 2 내지 3가지 독립적 실험으로부터의 1개의 용량 반응 곡선을 도 7.1 내지 도 7.18에 예로서 제시한다 (표 3.3 참조).
표 3.3: 3가지 독립적 실험의 결합 활성 EC [M] 및 기능 차단 활성 IC50 [M]
Figure pct00053
*도 7에 제시됨
실시예 6: 서열-기반 면역원성에 대한 위험 감소
서열-기반 면역원성에 대한 위험을 감소시키기 위해, 항체 TPP-14308을 추가의 최적화를 위해 선택하였다. 이를 위해, 가장 가까운 배선 서열과 상이한 아미노산을 교환하고, 상응하는 cDNA를 합성하고, HEK293 세포를 일시적으로 형질감염시키고, 발현된 본 발명의 항체를 정량화하되 정제하지는 않고, 인간 알파2-항플라스민에 결합하고 인간 알파2-항플라스민의 기능을 차단하는 그의 능력에 대해 시험하였다.
이러한 접근법의 결과는 47개의 항체였다.
대부분의 배선 교환은 둘 다의 기능에서 단지 약간의 개선을 나타낸다.
프레임워크 서열 및 CDRH1 및 CDRH2 내의 아미노산만을 교환하였지만, 놀랍게도, 항체 TPP-14308과 비교하여 훨씬 더 높은 결합 활성 및/또는 개선된 기능 차단 활성을 나타내는 6개의 변이체가 확인되었다.
이들 변이체의 결합 및 기능 차단 활성의 용량 반응 곡선을 도 8에 제시한다.
표 3.5: 2 내지 3가지 독립적 실험의 결합 활성 EC [M] 및 기능 차단 활성 IC50 [M]
Figure pct00054
*도 8에 제시됨
다음 단계에서, 가장 활성인 항체 TPP-17044를 더 많은 양으로 발현시켰고, 정제 및 정량화하였다. 정제 및 정량화된 항체를 인간, 시노몰구스, 및 토끼 알파2-항플라스민의 그의 기능 차단 활성에 대해 재시험하였다. 결과를 도 9에 제시한다. 사중으로 수행된 2 내지 3가지 독립적 실험으로부터의 1개의 용량 반응 곡선을 예로서 제시한다. 인간 알파2-항플라스민에 대한 TPP-17044의 기능 차단 활성은 4.4E-10 M이었고 (도 9.1에 제시된 바와 같음), 제2 실험의 경우 5.4E-10 M이었고, 제3 실험의 경우 5E-10 M이었다. 시노몰구스 알파2-항플라스민의 억제에 대한 값은 4.6E-10 M (도 9.2)이었고, 제2 실험의 경우 4.9E-10 M이었고, 제3 실험의 경우 5.1E-10 M이었다. 토끼 알파2-항플라스민은 TPP-17044에 의해 그의 활성이 2.7E-08 M의 IC50 값으로 차단되었고 (도 9.3), 제2 실험의 경우 3.6E-08 M 및 제3 실험의 경우 2.9E-08 M로 차단되었다.
마지막으로, 면역원성 반응의 이론적 위험을 추가로 최소화하기 위해 TPP-17044를 인간 항체의 인간 IgG4 Fc 버전 내로 재클로닝하였다. 생성된 항체 TPP-17928을 인간, 시노몰구스, 및 토끼 알파2-항플라스민에 대한 그의 기능 차단 활성에 대해 다시 시험하였다. 결과를 도 10에 제시한다. 사중으로 수행된 2 내지 3가지 독립적 실험으로부터의 1개의 용량 반응 곡선을 예로서 제시한다. 인간 알파2-항플라스민에 대한 TPP-17928의 기능 차단 활성은 1.1E-10 M이었고 (도 10.1에 제시된 바와 같음), 제2 실험의 경우 1.6E-10 M이었다. 시노몰구스 알파2-항플라스민의 억제에 대한 값은 2.6E-10 M (도 10.2)이었고, 제2 실험의 경우 3.4E-10 M이었고, 제3 실험의 경우 2.9E-10 M이었다. 토끼 알파2-항플라스민은 TPP-17928에 의해 그의 활성이 1.5E-08 M의 IC50 값으로 차단되었고 (도 10.3), 제2 실험의 경우 1.9E-10 M 및 제3 실험의 경우 1.6E-10 M로 차단되었다.
실시예 7: 시험관내 혈병 용해
마지막 10일 동안 의약을 투여받지 않은 건강한 대상체로부터 정맥천자에 의해 인간 혈액을 수집하였다 (절차는 [Ethics Committee "Aerztekammer Nordrhein", #2017029]에 의해 승인됨). 혈액을 1/10 부피의 3.8% 시트르산삼나트륨을 함유하는 플라스틱 튜브 내로 수집하였다. 혈소판-결핍 혈장 (PPP)을 4℃에서 10분 동안 2500 g에서의 즉각적 원심분리에 의해 수득하고, -20℃에서 저장하였다.
모든 실험에 대해, 적어도 n=3의 독립적 공여자로부터의 혈장을 사용하였다. 혈병 용해 검정을 하기와 같이 수행하였다. 동결된 혈장을 해동시키고 (37℃에서 30분 동안), 96-웰 플레이트에서 규정된 농도의 시험 화합물 [0.015 μM - 1 μM로 다양함] 또는 대조군으로서 용매 단독과 혼합하였다. 제2 96-웰 플레이트 상에서, 혈병 유도제로서 CaCl2 (시그마; 카탈로그 번호 21115-100ML) [최종 농도: 12.5 mM] 및 용해 개시제로서 저용량 tPA (액틸라제(Actilyse)®, 베링거 잉겔하임(Boehringer Ingelheim)) [최종 농도 0.3 μg/ml]를 제조하였다. 시험 화합물을 혈장 중에서 짧게 인큐베이션한 후 (37℃에서 5분), 혼합물을 제2 플레이트에 첨가하고, 마이크로플레이트 판독기 (테칸 인피니트(Tecan infinite) 200 프로)로 직접 옮겨 3시간 동안 시간 경과에 따라 (405 nm, 37℃, 1/분에서) 흡광을 측정하였다. 용해 시간 감소의 최종 결정을 위해, tPA-유도된 용해 시간을 100%로 (모든 공여자 혈장에 대해 개별적으로) 설정하고, 용해 시간 감소를 용량-반응 곡선에서 각각의 시험 화합물에 대해 계산하였다.
토끼 혈장의 분석을 위해, 수컷 뉴질랜드 백색 토끼로부터의 전혈을 정맥천자를 통해 수득하고, 인간 혈장에 대해 상기 기재된 바와 같이 제조하고 사용하였다.
도 11에 제시된 바와 같이, 항체 TPP-17928은 각각 인간 및 토끼 혈장에서 tPA-유도된 혈병 용해 시간을 용량-의존성 방식으로 감소시킨다. 인간 혈장에 대해, TPP-17928의 기능 차단 활성에 대한 값은 2.5E-07 M이었고, 토끼 혈장에 대해서는 2.3E-07 M이었다.
실시예 8: 토끼의 급성 폐 색전증에서의 TPP-17928의 생체내 시험
폐 색전증에서의 혈병 용해에 대한 본 발명의 항-항-알파2-항플라스민 항체의 효과를 연구하기 위해, 토끼 생체내 모델을 사용하였다.
수컷 뉴질랜드 백색 토끼를 크실라진/케타민 (5 mg/kg + 40 mg/kg, 시그마, 카탈로그 번호 X1126 및 K2753)의 근육내 주사에 의해 마취시켰다. 귀, 목 및 좌측 뒷다리 (대퇴 삼각 영역)를 면도하였다. 토끼를 마취상태로 유지시키기 위해, 귀 정맥을 통해 크실라진/케타민 (80 ml + 800 ml ad 60 ml NaCl 0.9%)의 5 ml/h로의 주입을 제공하였다. 토끼를 가열 플레이트 상에 놓고, 전체 실험 시간 동안 37℃에서 유지시켰다. 화합물 적용 및 혈액 샘플링을 위해 좌측 대퇴 정맥에 캐뉼라를 삽입하고, 혈병 주사를 위해 우측 경정맥에 캐뉼라를 삽입하였다.
형광 표지된 혈병의 제조를 위해, 토끼 혈소판 결핍 혈장을 알렉사 488 형광-표지된 인간 피브리노겐 (써모 피셔 사이언티픽, 카탈로그 번호 F13191)과 혼합하였다. 2.5 μl 바트록소빈 [20 U/ml] (록소(LOXO), 카탈로그 번호 101-04) 및 2.5 μl CaCl2 [0.1 mM]를 45 μl의 혈장 혼합물에 첨가하는 것에 의해 응고가 개시되었고; 최종 혈병 부피 50 μl는 75 μg의 형광-표지된 피브리노겐을 함유하였다.
혈병 성숙 (37℃에서 30분) 후, 2개의 혈병/kg 체중을 마취된 토끼의 경정맥 내로 주사하여 폐에서 혈병의 색전술을 유발하였다. 색전술 30분 후에, 염수, 항체 TPP-17928, tPA 또는 항체 TPP-17928 및 tPA의 조합물의 볼루스 i.v. 주사에 의해 처리를 시작하였다. 360분의 기간에 걸쳐 토끼의 정맥으로부터 혈액 샘플을 채취하고, 혈병 용해의 간접 파라미터로서 혈장 형광을 분석하였다. 동시에, 처리 개시 직후 및 처리 300분 후에 귀 출혈 시간을 결정하였다. 귀 출혈 시간에 접근하기 위해, 스칼펠 블레이드로 귀의 외부 가장자리 (외부 귀 정맥 근처)와 평행하게 대략 3-5 mm의 절개부를 만들었다. 30초마다 절개부 바로 옆을 작은 필터 팁으로 부드럽게 두드려 절개부에서 여전히 출혈이 있는지 입증하였다.
도 12.1에 제시된 바와 같이, 토끼에서의 폐 색전증의 항체 TPP-17928로의 처리는 증가된 혈병 용해로 이어졌고, 이는 시간 경과에 따라 tPA 처리와 대등한 것으로 간주된다. TPP-17928은 혈병 용해에 대한 간접 측정 파라미터로서 혈장 형광을 용량-의존적으로 증가시킨다 (대조군과 비교하여 AUC의 2.1-배 증가). 15 mg/kg의 TPP-17928과 저농도의 tPA (0.125 mg/kg)의 조합은 혈병 용해를 훨씬 더 빨리 가속화한다. tPA-처리는 또한 혈병 용해에 대해 용량-의존성 효과를 나타낸다 (도 12.2).
추가의 토끼 폐 색전증 실험에서 30 mg/kg TPP-12387 (대조군과 비교하여 AUC의 2.6-배 증가) 및 15 mg/kg TPP-17044 (대조군과 비교하여 AUC의 2.1-배 증가)에 대해 혈병 용해에 대한 파라미터로서 혈장 형광의 증가와 유사한 결과가 관찰되었다.
귀 출혈 시간의 결정
상기 기재된 실험에서, 동시에, 귀 출혈 시간을 결정하였다. 처리 적용 직후에 (0분에) 귀 출혈 시간을 하기와 같이 측정하였다. 귀 출혈 시간에 접근하기 위해, 스칼펠 블레이드로 귀의 외부 가장자리 (외부 귀 정맥 근처)와 평행하게 대략 3-5 mm의 절개부를 만들었다. 30초마다 절개부 바로 옆을 작은 필터 팁으로 부드럽게 두드려 절개부에서 여전히 출혈이 있는지 입증하였다. 귀 출혈 시간은 tPA 처리와 비교하여 항-a2AP-항체 처리에 대해 우수한 안전성 프로파일을 드러낸다. 화합물 투여 직후, 사용된 항체 농도 중 어떠한 것에 대해서도 검출가능한 출혈 시간의 증가가 없는 반면, 특히 1 mg/kg의 최고 농도에서의 tPA 처리는 귀 출혈 시간 연장에 대해 즉시 효과를 나타낸다. 놀랍게도, 또한 저용량의 tPA (0.125 mg/kg)와 조합된 15 mg/kg의 TPP-17928의 조합물은 출혈 시간의 유의한 증가로 이어지지 않는다. 이는 유해 사건, 이 경우에서는 출혈과 관련하여 tPA 처리에 비해 항-a2AP-항체 처리의 우월성을 명백하게 증명한다. 결과를 도 13에 제시한다. tPA [1 mg/kg]에 대해 2.03-배, TPP-17928 [15 mg/kg]에 대해 0.95-배 및 tPA [0.125 mg/kg] + TPP-17928 [15 mg/kg]의 조합물에 대해 1.56-배의 출혈 시간 연장. 추가의 토끼 귀 출혈 실험에서 30 mg/kg TPP-12387 (0.91-배) 및 15 mg/kg TPP-17044 (1.05-배)에 대해, 귀 출혈 시간 연장에 대해 어떠한 영향도 없는, 유사한 결과가 관찰되었다.
실시예 9: 본 발명의 항체의 결합 친화도의 결정.
결합 검정은 단백질 G 센서 칩 및 검정 완충제 HBS-EP+를 사용하여 25℃에서 비아코어 T200 기기 상에서 수행하였다. 항체를 ~150 RU로 포획하고, 분석물을 완전 동역학을 위해 1.56 내지 200 nM의 농도로 사용하였다. 상호작용 파트너로서, 인간, 시노몰구스 및 토끼로부터의 알파2-항플라스민을 사용하였다. 글리신-HCl pH 1.5로 재생을 수행하였다. 실험적 센소그램을 1:1 랭뮤어 결합 모델에 피팅함으로써 동역학적 파라미터를 유도하였다. 결과를 표 4에 제시한다.
표 4: 본 발명의 항체의 친화도 값.
Figure pct00055
실시예 10: 77A3 및 본 발명의 항체의 기능 차단 활성의 직접 비교.
A2AP 활성에 대한 시험 항체 77A3과 본 발명의 시험 항체의 차단 활성을 비교하기 위해, 실시예 4에 상세히 기재된 바와 같은 기능 차단 검정을 사용하였다. 간략하게, 시험 항체를 A2AP와 함께 각각 6.1E-11 - 3.0E-08 M 및 .0E-06 M의 농도에서 사전-인큐베이션하였다. 플라스민 및 I-1275 (플라스민 세린 프로테아제 활성에 대한 형광원성 기질)를 검정에 첨가한 후, 플라스민의 세린 프로테아제 활성에 대한 척도로서 형광 신호를 결정하였다.
0.03 μM까지 77A3 농도의 증가는 플라스민에 의한 형광원성 기질 I-1275의 절단으로 인해 형광 신호의 증가를 발생시켰다. 그러나, 77A3 농도의 추가의 증가는 형광 신호의 감소를 발생시켰다. 이는 실시예 4에 기재된 생화학적 검정에서 0.03 μM의 농도까지의 시험 항체 77A3은 알파2-항플라스민의 차단으로 이어지고, 77A3 항체 농도의 추가의 증가는 플라스민 활성의 저하로 이어져, 1 μM의 77A3 농도에서 플라스민 활성의 완전한 억제를 발생시킨다는 것을 나타낸다 (도 14.1). 본 발명의 항체에 대해, A2AP의 기능 차단 활성에 대해 하기 IC50 값이 생성되었다: TPP-17041 - 6.4 E-10 M, TPP-17044 - 3.9 E-10 M, TPP-17045 - 1.4 E-10 M, TPP-17048 - 1.2 E-09 M, TPP-17051 - 3.3 E-10 M, TPP-17053 - 1.5 E-10 M. 1 μM의 농도까지 시험된 본 발명의 항체 중 어떠한 것도 형광 신호의 감소를 발생시키지 않았고, 이는 본 발명의 시험 항체가 플라스민 활성에 영향을 미치지 않는다는 것을 나타낸다 (도 14.2 - 14.7).
실시예 11: 플라스민의 단백질분해 활성을 억제하는 것에 대해 본 발명의 항체를 시험하기 위한 생화학적 검정
실시예 10에서 항체 77A3에 대해 수득된 놀라운 결과를 추가로 조사하기 위해, 본 발명의 항-알파2-항플라스민 항체뿐만 아니라 항체 77A3을 생화학적 플라스민 검정에서 억제 활성에 대해 시험하였다. 이를 위해, 규정된 농도에서 출발하여 1:2 또는 1:3 희석 단계가 이어진 상이한 농도의 항체를 1시간 동안 37℃에서 400 pM의 헤마톨로직 테크놀로지스 인크.로부터 입수한 인간 플라스민; 카탈로그 번호 HCPM0140) 및 형광원성 기질 I-1275 (바켐; MeOSuc-Ala-Phe-Lys-AMC 트리플루오로아세테이트 염; 카탈로그 번호 I-1275 (스톡: DMSO 중 10mM))와 함께 1 μM의 최종 농도에서 인큐베이션하였다. 이 반응을 384 웰 마이크로타이터 플레이트 (눈크; 카탈로그 번호 262260)에서 수행하였다. 형광원성 신호를 하기 조건에서 측정하였다: 모두스 형광 최고 판독, Ex 360 nM, Em 465 nm, Ex 대역폭 5 nm, Em 대역폭 5 nm.
도 16에 제시된 바와 같이, TPP-17928 (본 발명의 모든 항체에 대해 예시적으로 제시됨)은 생화학적 활성에 영향을 미치지 않은 반면, 77A3은 1.7 μM의 IC50 값으로 플라스민의 단백질분해 활성을 차단한다.
표 5: 77A3 및 본 발명의 시험 항체에 의한 플라스민 단백질분해 활성의 억제.
Figure pct00056
*이중으로 수행된 2 내지 3가지 독립적 실험으로부터의 용량 반응 곡선이 77A3 및 TPP-17928에 대해 도 16에서 예로서 제시됨.
실시예 12: TPP-12387 및 77A3의 에피토프 맵핑
회사 펩페르프린트(PEPperPRINT) (독일 하이델베르크)는 펩페르칩(PEPperCHIP)® 펩티드 마이크로어레이 플랫폼을 사용하여 에피토프 맵핑을 수행하였다.
선형 에피토프 맵핑을 위해, 항원 서열을 14개의 아미노산의 펩티드-펩티드 중첩을 갖는 중첩 선형 15개 아미노산 펩티드로 번역하였다. 생성된 펩티드 마이크로어레이는 이중으로 인쇄된 491개의 상이한 펩티드를 함유하였다.
입체형태적 에피토프 맵핑을 위해, 항원 서열을 6, 9 및 12개의 아미노산의 펩티드-펩티드 중첩을 갖는 중첩 7, 10 및 13개 아미노산 펩티드로 번역하였다. 펩티드 합성 후에, 모든 펩티드를 C-말단 시스테인 측쇄와 적절하게 변형된 N-말단 사이의 티오에테르 연결을 통해 고리화하였다. 생성된 입체형태적 펩티드 마이크로어레이는 이중으로 인쇄된 1,488개의 상이한 시클릭 구속성 펩티드를 함유하였다.
마이크로어레이를 록랜드 차단 완충제 MB-070을 사용하여 차단하고 (제1 검정 30분 전), PBS, pH 7.4와 0.05% (선형 에피토프 맵핑) 또는 0.005% (입체형태적 에피토프 맵핑) 트윈 20과 10% 차단 완충제로 이루어진 인큐베이션 완충제 중에서 항체 인큐베이션을 수행하였다.
인큐베이션 후, PBS, pH 7.4와 0.05% (선형 에피토프 맵핑) 또는 0.005% (입체형태적 에피토프 맵핑) 트윈 20을 사용하여 어레이를 세척하였다. 어레이를 3 x 1분 (선형 에피토프 맵핑) 또는 2 x 10초 (입체형태적 에피토프 맵핑) 세척하였다.
항체를 인큐베이션 완충제 중 1 μg/ml, 10 μg/ml 및 100 μg/ml의 농도로 마이크로어레이 상에서 인큐베이션하였다. 인큐베이션 시간은 4℃에서 16시간이었고, 140 rpm에서 진탕시켰다.
대조군으로서, 마우스 모노클로날 항-HA (12CA5) 다이라이트800을 1:2000의 희석으로 사용하였고; 이 검출 항체를 실온에서 인큐베이션 완충제 중에서 45분 염색으로 마이크로어레이 상에서 인큐베이션하였다.
2차 항체로서, 염소 항-인간 IgG (Fc) 다이라이트680을 1:5000의 희석으로 사용하였다. 이 검출 항체를 실온에서 인큐베이션 완충제 중에서 45분 염색으로 마이크로어레이 상에서 인큐베이션하였다.
스캐닝 오프셋 0.65 mm, 해상도 21 μm, 및 스캐닝 강도 7/7 (적색 = 700nm/녹색 = 800 nm)로 리-코르(LI-COR) 오디세이 이미징 시스템을 사용하여 신호를 검출하였다.
스팟 강도의 정량화 및 펩티드 주석화는 24-비트 채색된 tiff 파일보다 더 높은 동적 범위를 나타내는 7/7의 스캐닝 강도에서의 16-비트 그레이 스케일 tiff 파일에 기초하였다. 마이크로어레이 영상 분석을 펩슬라이드(PepSlide)® 분석기를 사용하여 수행하였다. 소프트웨어 알고리즘을 사용하여 각 스팟의 형광 강도를 미가공, 전경 및 배경 신호로 분해하고, 스팟 중복의 평균 중앙 전경 강도 및 스팟-대-스팟 편차를 계산하였다. 평균 중앙 전경 강도에 기초하여 강도 맵을 생성하였고, 펩티드 맵에서의 상호작용을 강도 색 코드에 의해 높은 스팟 강도에 대해서는 적색 및 낮은 스팟 강도에 대해서는 백색으로 강조표시하였다. 검정의 평균 스팟 강도를 N-에서 C-말단으로의 항원 서열에 대해 항체 샘플로 플롯팅하여 전체 스팟 강도 및 신호-대-잡음 비를 가시화하였다. 강도 플롯을 펩티드 및 강도 맵, 뿐만 아니라 마이크로어레이 스캔의 육안 검사와 상관시켜 시험된 항체의 에피토프를 확인하였다.
2차 염소 항-인간 IgG (Fc) 다이라이트680 항체 (1:5000) 및 대조군 마우스 모노클로날 항-HA (12CA5) 다이라이트800 항체 (1:2000)를 사용한 선형 및 입체형태적 펩티드 마이크로어레이의 사전-염색은 항원의 선형 또는 시클릭 구속성 펩티드와 어떠한 배경 상호작용도 나타내지 않았다. 대조적으로, 관심 항체와의 인큐베이션은 하기 관찰을 생성하였다:
표 6에 제시된 바와 같이, TPP-12387은 A2AP의 반응성 중심 루프 (서열식별번호: 1의 아미노산 400 - 412)에 위치하는 서열식별번호: 1의 아미노산 402 - 408에 상응하는 컨센서스 모티프 SRMSLSS를 갖는 펩티드에 대해 높은 신호-대-잡음 비를 나타내었다.
대조적으로, 항체 77A3의 경우, 서열식별번호: 1의 아미노산 330 - 338에 상응하는, 기본 컨센서스 모티프 RPTKVRLPK를 갖는 펩티드에 대해 매우 약한 신호-대-잡음 비가 확인되었다. A2AP의 이 부분에 대해서는 뚜렷한 것이 기재되어 있지 않다.
표 6: TPP-12387 및 77A3에 대한 A2AP 결합 부위
Figure pct00057
SEQUENCE LISTING <110> Bayer AG <120> NOVEL ANTI-A2AP ANTIBODIES AND USES THEREOF <130> BHC201046 <160> 119 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 491 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Ala Leu Leu Trp Gly Leu Leu Val Leu Ser Trp Ser Cys Leu Gln 1 5 10 15 Gly Pro Cys Ser Val Phe Ser Pro Val Ser Ala Met Glu Pro Leu Gly 20 25 30 Arg Gln Leu Thr Ser Gly Pro Asn Gln Glu Gln Val Ser Pro Leu Thr 35 40 45 Leu Leu Lys Leu Gly Asn Gln Glu Pro Gly Gly Gln Thr Ala Leu Lys 50 55 60 Ser Pro Pro Gly Val Cys Ser Arg Asp Pro Thr Pro Glu Gln Thr His 65 70 75 80 Arg Leu Ala Arg Ala Met Met Ala Phe Thr Ala Asp Leu Phe Ser Leu 85 90 95 Val Ala Gln Thr Ser Thr Cys Pro Asn Leu Ile Leu Ser Pro Leu Ser 100 105 110 Val Ala Leu Ala Leu Ser His Leu Ala Leu Gly Ala Gln Asn His Thr 115 120 125 Leu Gln Arg Leu Gln Gln Val Leu His Ala Gly Ser Gly Pro Cys Leu 130 135 140 Pro His Leu Leu Ser Arg Leu Cys Gln Asp Leu Gly Pro Gly Ala Phe 145 150 155 160 Arg Leu Ala Ala Arg Met Tyr Leu Gln Lys Gly Phe Pro Ile Lys Glu 165 170 175 Asp Phe Leu Glu Gln Ser Glu Gln Leu Phe Gly Ala Lys Pro Val Ser 180 185 190 Leu Thr Gly Lys Gln Glu Asp Asp Leu Ala Asn Ile Asn Gln Trp Val 195 200 205 Lys Glu Ala Thr Glu Gly Lys Ile Gln Glu Phe Leu Ser Gly Leu Pro 210 215 220 Glu Asp Thr Val Leu Leu Leu Leu Asn Ala Ile His Phe Gln Gly Phe 225 230 235 240 Trp Arg Asn Lys Phe Asp Pro Ser Leu Thr Gln Arg Asp Ser Phe His 245 250 255 Leu Asp Glu Gln Phe Thr Val Pro Val Glu Met Met Gln Ala Arg Thr 260 265 270 Tyr Pro Leu Arg Trp Phe Leu Leu Glu Gln Pro Glu Ile Gln Val Ala 275 280 285 His Phe Pro Phe Lys Asn Asn Met Ser Phe Val Val Leu Val Pro Thr 290 295 300 His Phe Glu Trp Asn Val Ser Gln Val Leu Ala Asn Leu Ser Trp Asp 305 310 315 320 Thr Leu His Pro Pro Leu Val Trp Glu Arg Pro Thr Lys Val Arg Leu 325 330 335 Pro Lys Leu Tyr Leu Lys His Gln Met Asp Leu Val Ala Thr Leu Ser 340 345 350 Gln Leu Gly Leu Gln Glu Leu Phe Gln Ala Pro Asp Leu Arg Gly Ile 355 360 365 Ser Glu Gln Ser Leu Val Val Ser Gly Val Gln His Gln Ser Thr Leu 370 375 380 Glu Leu Ser Glu Val Gly Val Glu Ala Ala Ala Ala Thr Ser Ile Ala 385 390 395 400 Met Ser Arg Met Ser Leu Ser Ser Phe Ser Val Asn Arg Pro Phe Leu 405 410 415 Phe Phe Ile Phe Glu Asp Thr Thr Gly Leu Pro Leu Phe Val Gly Ser 420 425 430 Val Arg Asn Pro Asn Pro Ser Ala Pro Arg Glu Leu Lys Glu Gln Gln 435 440 445 Asp Ser Pro Gly Asn Lys Asp Phe Leu Gln Ser Leu Lys Gly Phe Pro 450 455 460 Arg Gly Asp Lys Leu Phe Gly Pro Asp Leu Lys Leu Val Pro Pro Met 465 470 475 480 Glu Glu Asp Tyr Pro Gln Phe Gly Ser Pro Lys 485 490 <210> 2 <211> 491 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 2 Met Val Leu Leu Arg Gly Leu Leu Val Leu Ser Leu Ser Cys Leu Gln 1 5 10 15 Gly Pro Cys Ala Val Leu Pro Pro Val Ser Ala Met Glu Pro Val Gly 20 25 30 Arg Gln Leu Thr Ser Gly Gln Ser Gln Glu Lys Leu Pro Pro Leu Ala 35 40 45 Leu Leu Lys Leu Val Asn Gln Glu Leu His Gly Gln Thr Ala Leu Lys 50 55 60 Lys Ser Pro Gly Asp Cys Arg Glu Thr Pro Thr Pro Glu Gln Thr Arg 65 70 75 80 Arg Leu Ala Gln Ala Met Met Ala Phe Thr Thr Asp Leu Phe Ser Leu 85 90 95 Val Val Gln Ala Ser Thr Ser Pro Asn Leu Val Leu Ser Pro Leu Ser 100 105 110 Val Ala Leu Ala Leu Ser His Leu Ala Leu Gly Ala Gln Asn His Thr 115 120 125 Leu Gln Arg Leu Gln Gln Val Leu His Ala Asp Ser Gly Pro Cys Leu 130 135 140 Pro His Leu Leu Ser His Leu Cys Arg Asn Leu Gly Pro Gly Ala Phe 145 150 155 160 Arg Leu Ala Ala Arg Met Tyr Leu Gln Lys Gly Phe Pro Ile Lys Glu 165 170 175 Asp Phe Leu Lys Leu Ser Glu Gln Leu Phe Gly Ala Lys Pro Val Ser 180 185 190 Leu Thr Gly Arg Gln Glu Glu Asp Leu Val Asn Ile Asn Gln Trp Val 195 200 205 Lys Glu Ala Thr Glu Gly Lys Ile Glu Asp Phe Leu Ser Glu Leu Pro 210 215 220 Asp Ser Thr Val Leu Leu Leu Leu Asn Ala Ile His Phe Gln Gly Phe 225 230 235 240 Trp Arg Ser Lys Phe Asp Pro Ser Leu Thr Gln Arg Asp Ser Phe His 245 250 255 Leu Asp Glu Gln Phe Thr Val Pro Val Asp Met Met Gln Ala His Lys 260 265 270 Tyr Pro Leu Arg Trp Phe Leu Leu Glu Gln Pro Glu Ile Gln Val Ala 275 280 285 Gln Phe Pro Phe Lys Asn Asn Met Ser Phe Val Val Leu Val Pro Thr 290 295 300 Asn Phe Glu Trp Asn Val Ser Gln Val Leu Ser Asn Leu Ser Trp Asp 305 310 315 320 Ile Leu His Gln Pro Ser Leu Arg Glu Arg Pro Thr Lys Val Gln Leu 325 330 335 Pro Lys Leu Leu Leu Lys His Gln Leu Asp Leu Val Thr Thr Leu Ser 340 345 350 Gln Leu Gly Leu Gln Glu Leu Phe Leu Ala Pro Asp Leu Arg Gly Ile 355 360 365 Ser Asp Glu Gly Leu Val Val Ser Ser Val Gln His Gln Ser Thr Leu 370 375 380 Glu Leu Asn Glu Ala Gly Val Glu Ala Ala Ala Ala Thr Ser Thr Ala 385 390 395 400 Met Ser Arg Met Ser Leu Ser Ser Phe Ser Val Asn Arg Pro Phe Leu 405 410 415 Phe Phe Ile Leu Glu Asp Thr Ile Asp Leu Pro Ile Phe Val Gly Ile 420 425 430 Val Arg Asn Pro Asn Pro Ser Ala Gln Pro Glu Arg Lys Glu Gln Gln 435 440 445 Asp Ser Pro Asp His Arg Asp Pro Ser Gln Pro Gln Lys Ser Phe Pro 450 455 460 His Gly Asp Lys Leu Phe Ser Pro Asp Leu Lys Leu Ala Pro Pro Ser 465 470 475 480 Glu Glu Asp Tyr Pro Gln Leu Ser Ser Pro Lys 485 490 <210> 3 <211> 491 <212> PRT <213> Macaca fascicularis <400> 3 Met Ala Leu Phe Trp Gly Leu Leu Val Leu Ser Trp Ser Cys Leu Gln 1 5 10 15 Gly Pro Leu Ser Val Phe Ser Pro Val Ser Ala Met Glu Pro Leu Gly 20 25 30 Trp Gln Leu Thr Ser Gly Pro Asn Gln Glu Lys Val Pro Pro Leu Thr 35 40 45 Leu Leu Lys Leu Gly Asn Gln Glu Pro Gly Gly Gln Thr Ala Leu Lys 50 55 60 Ser Leu Pro Gly Ile Cys Ser Arg Asp Pro Thr Pro Glu Gln Thr Arg 65 70 75 80 Arg Leu Ala Gln Ala Met Met Ala Phe Thr Ala Asp Leu Phe Ser Leu 85 90 95 Val Ala Gln Thr Ser Thr Cys Pro Asn Leu Ile Leu Ser Pro Leu Ser 100 105 110 Val Ala Leu Ala Leu Ser His Leu Ala Leu Gly Ala Gln Asn His Thr 115 120 125 Leu Gln Arg Leu Gln Gln Val Leu His Ala Gly Ser Gly Pro Cys Leu 130 135 140 Pro His Leu Leu Ser Arg Leu Cys Gln Asn Met Gly Pro Gly Ala Phe 145 150 155 160 Arg Leu Ala Ala Arg Met Tyr Leu Gln Lys Gly Phe Pro Ile Lys Glu 165 170 175 Asp Phe Leu Glu Gln Ser Glu Arg Leu Phe Gly Ala Lys Pro Val Ser 180 185 190 Leu Thr Gly Lys Gln Glu Asp Asp Leu Ala Asn Ile Asn Gln Trp Val 195 200 205 Lys Glu Ala Thr Glu Gly Lys 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cagatgaaca gcctgagagc cgaggacacc gccgtgtact attgtgccag agagggctac 300 gacagcagcg gctactacca cctggattat tggggccagg gcaccctggt tacagtgtca 360 tca 363 <210> 94 <211> 333 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antibody sequence <400> 94 cagtctgttc tgacacagcc tcctagcgcc tctggcacac ctggacagag agtgaccatc 60 agctgtaccg gcagcagctc caatatcggc gccacctatg acgtgcactg gtatcagcag 120 ctgcctggca cagcccctaa actgctgatc tacagcaaca accagcggcc tagcggcgtg 180 cccgatagat tttctggcag caagagcggc acaagcgcca gcctggctat ctctggactg 240 agatctgagg acgaggccga ctactattgc gccgcctggg atgattctct gagcggctgg 300 gttttcggcg gaggcacaaa actgacagtg cta 333 <210> 95 <211> 333 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antibody sequence <400> 95 cagtctgttc tgacacagcc tcctagcgcc tctggcacac ctggacagag agtgaccatc 60 agctgtaccg gcagcagctc caatatcggc gccacctatg acgtgcactg gtatcagcag 120 ctgcctggca cagcccctaa actgctgatc tacagcaaca accagcggcc tagcggcgtg 180 cccgatagat tttctggcag caagagcggc acaagcgcca gcctggctat ctctggactg 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<212> PRT <213> Homo sapiens <400> 118 Glu Pro Leu Asp Asp Tyr Val Asn Thr Gln Gly Ala Ser Leu Phe Ser 1 5 10 15 Val Thr Lys Lys Gln Leu Gly Ala Gly Ser Ile Glu Glu Cys Ala Ala 20 25 30 Lys Cys Glu Glu Asp Glu Glu Phe Thr Cys Arg Ala Phe Gln Tyr His 35 40 45 Ser Lys Glu Gln Gln Cys Val Ile Met Ala Glu Asn Arg Lys Ser Ser 50 55 60 Ile Ile Ile Arg Met Arg Asp Val Val Leu Phe Glu Lys Lys Val Tyr 65 70 75 80 Leu Ser Glu Cys Lys Thr Gly Asn Gly Lys Asn Tyr Arg Gly Thr Met 85 90 95 Ser Lys Thr Lys Asn Gly Ile Thr Cys Gln Lys Trp Ser Ser Thr Ser 100 105 110 Pro His Arg Pro Arg Phe Ser Pro Ala Thr His Pro Ser Glu Gly Leu 115 120 125 Glu Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Asn Asp Pro Gln Gly Pro Trp 130 135 140 Cys Tyr Thr Thr Asp Pro Glu Lys Arg Tyr Asp Tyr Cys Asp Ile Leu 145 150 155 160 Glu Cys Glu Glu Glu Cys Met His Cys Ser Gly Glu Asn Tyr Asp Gly 165 170 175 Lys Ile Ser Lys Thr Met Ser Gly Leu Glu Cys Gln Ala Trp Asp Ser 180 185 190 Gln Ser Pro His Ala His Gly Tyr Ile Pro Ser Lys Phe Pro Asn Lys 195 200 205 Asn Leu Lys Lys Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Arg Glu Leu Arg Pro 210 215 220 Trp Cys Phe Thr Thr Asp Pro Asn Lys Arg Trp Glu Leu Cys Asp Ile 225 230 235 240 Pro Arg Cys Thr Thr Pro Pro Pro Ser Ser Gly Pro Thr Tyr Gln Cys 245 250 255 Leu Lys Gly Thr Gly Glu Asn Tyr Arg Gly Asn Val Ala Val Thr Val 260 265 270 Ser Gly His Thr Cys Gln His Trp Ser Ala Gln Thr Pro His Thr His 275 280 285 Asn Arg Thr Pro Glu Asn Phe Pro Cys Lys Asn Leu Asp Glu Asn Tyr 290 295 300 Cys Arg Asn Pro Asp Gly Lys Arg Ala Pro Trp Cys His Thr Thr Asn 305 310 315 320 Ser Gln Val Arg Trp Glu Tyr Cys Lys Ile Pro Ser Cys Asp Ser Ser 325 330 335 Pro Val Ser Thr Glu Gln Leu Ala Pro Thr Ala Pro Pro Glu Leu Thr 340 345 350 Pro Val Val Gln Asp Cys Tyr His Gly Asp Gly Gln Ser Tyr Arg Gly 355 360 365 Thr Ser Ser Thr Thr Thr Thr Gly Lys Lys Cys Gln Ser Trp Ser Ser 370 375 380 Met Thr Pro His Arg His Gln Lys Thr Pro Glu Asn Tyr Pro Asn Ala 385 390 395 400 Gly Leu Thr Met Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Ala Asp Lys Gly Pro 405 410 415 Trp Cys Phe Thr Thr Asp Pro Ser Val Arg Trp Glu Tyr Cys Asn Leu 420 425 430 Lys Lys Cys Ser Gly Thr Glu Ala Ser Val Val Ala Pro Pro Pro Val 435 440 445 Val Leu Leu Pro Asp Val Glu Thr Pro Ser Glu Glu Asp Cys Met Phe 450 455 460 Gly Asn Gly Lys Gly Tyr Arg Gly Lys Arg Ala Thr Thr Val Thr Gly 465 470 475 480 Thr Pro Cys Gln Asp Trp Ala Ala Gln Glu Pro His Arg His Ser Ile 485 490 495 Phe Thr Pro Glu Thr Asn Pro Arg Ala Gly Leu Glu Lys Asn Tyr Cys 500 505 510 Arg Asn Pro Asp Gly Asp Val Gly Gly Pro Trp Cys Tyr Thr Thr Asn 515 520 525 Pro Arg Lys Leu Tyr Asp Tyr Cys Asp Val Pro Gln Cys Ala Ala Pro 530 535 540 Ser Phe Asp Cys Gly Lys Pro Gln Val Glu Pro Lys Lys Cys Pro Gly 545 550 555 560 Arg <210> 119 <211> 230 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 119 Val Val Gly Gly Cys Val Ala His Pro His Ser Trp Pro Trp Gln Val 1 5 10 15 Ser Leu Arg Thr Arg Phe Gly Met His Phe Cys Gly Gly Thr Leu Ile 20 25 30 Ser Pro Glu Trp Val Leu Thr Ala Ala His Cys Leu Glu Lys Ser Pro 35 40 45 Arg Pro Ser Ser Tyr Lys Val Ile Leu Gly Ala His Gln Glu Val Asn 50 55 60 Leu Glu Pro His Val Gln Glu Ile Glu Val Ser Arg Leu Phe Leu Glu 65 70 75 80 Pro Thr Arg Lys Asp Ile Ala Leu Leu Lys Leu Ser Ser Pro Ala Val 85 90 95 Ile Thr Asp Lys Val Ile Pro Ala Cys Leu Pro Ser Pro Asn Tyr Val 100 105 110 Val Ala Asp Arg Thr Glu Cys Phe Ile Thr Gly Trp Gly Glu Thr Gln 115 120 125 Gly Thr Phe Gly Ala Gly Leu Leu Lys Glu Ala Gln Leu Pro Val Ile 130 135 140 Glu Asn Lys Val Cys Asn Arg Tyr Glu Phe Leu Asn Gly Arg Val Gln 145 150 155 160 Ser Thr Glu Leu Cys Ala Gly His Leu Ala Gly Gly Thr Asp Ser Cys 165 170 175 Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Phe Glu Lys Asp Lys Tyr 180 185 190 Ile Leu Gln Gly Val Thr Ser Trp Gly Leu Gly Cys Ala Arg Pro Asn 195 200 205 Lys Pro Gly Val Tyr Val Arg Val Ser Arg Phe Val Thr Trp Ile Glu 210 215 220 Gly Val Met Arg Asn Asn 225 230

Claims (24)

  1. A2AP에 결합하고 A2AP의 활성을 억제할 수 있는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편으로서, 플라스민 활성을 억제하지 않는 상기 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  2. 제1항에 있어서,
    서열식별번호: 1의 아미노산 40 - 491의 서열의 인간 A2AP에 ≤100 nM, ≤ 50 nM, ≤ 25 nM, ≤10 nM, ≤1 nM, 또는 ≤ 0.5 nM의 해리 상수 (KD)로 결합하고;
    서열식별번호: 1의 아미노산 40 - 491의 서열의 인간 A2AP의 활성을 시험관내 A2AP 기능 차단 검정에서 ≤ 500 nM, ≤ 250 nM, ≤ 100 nM, ≤ 50 nM, ≤ 25 nM, ≤ 10 nM, ≤ 1 nM, 또는 ≤ 0.5 nM의 EC50으로 억제하는
    단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 시험관내 플라스민 억제 검정에서 1 μM, 2 μM, 5 μM 또는 10 μM의 상기 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 농도까지 플라스민 활성을 억제하지 않는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 플라스민이 인간 플라스민이고, 특히 상기 플라스민이 서열식별번호: 118 및 서열식별번호: 119를 포함하는 인간 플라스민인 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 하기를 포함하는 단리된 항체 또는 항원-결합 단편:
    i) 서열식별번호: 6을 포함하는 H-CDR1, 서열식별번호: 8을 포함하는 H-CDR2, 및 서열식별번호: 13을 포함하는 H-CDR3을 포함하는 중쇄 항원-결합 영역, 및 서열식별번호: 9를 포함하는 L-CDR1, 서열식별번호: 10을 포함하는 L-CDR2, 및 서열식별번호: 18을 포함하는 L-CDR3을 포함하는 경쇄 항원-결합 영역; 또는
    ii) 서열식별번호: 6을 포함하는 H-CDR1, 서열식별번호: 7을 포함하는 H-CDR2, 및 서열식별번호: 13을 포함하는 H-CDR3을 포함하는 중쇄 항원-결합 영역, 및 서열식별번호: 9를 포함하는 L-CDR1, 서열식별번호: 10을 포함하는 L-CDR2, 및 서열식별번호: 18을 포함하는 L-CDR3을 포함하는 경쇄 항원-결합 영역; 또는
    iii) 서열식별번호: 6을 포함하는 H-CDR1, 서열식별번호: 7을 포함하는 H-CDR2, 및 서열식별번호: 11을 포함하는 H-CDR3을 포함하는 중쇄 항원-결합 영역, 및 서열식별번호: 9를 포함하는 L-CDR1, 서열식별번호: 10을 포함하는 L-CDR2, 및 서열식별번호: 17을 포함하는 L-CDR3을 포함하는 경쇄 항원-결합 영역; 또는
    iv) 서열식별번호: 6을 포함하는 H-CDR1, 서열식별번호: 7을 포함하는 H-CDR2, 및 서열식별번호: 11을 포함하는 H-CDR3을 포함하는 중쇄 항원-결합 영역, 및 서열식별번호: 9를 포함하는 L-CDR1, 서열식별번호: 10을 포함하는 L-CDR2, 및 서열식별번호: 18을 포함하는 L-CDR3을 포함하는 경쇄 항원-결합 영역; 또는
    v) 서열식별번호: 6을 포함하는 H-CDR1, 서열식별번호: 7을 포함하는 H-CDR2, 및 서열식별번호: 12를 포함하는 H-CDR3을 포함하는 중쇄 항원-결합 영역, 및 서열식별번호: 9를 포함하는 L-CDR1, 서열식별번호: 10을 포함하는 L-CDR2, 및 서열식별번호: 18을 포함하는 L-CDR3을 포함하는 경쇄 항원-결합 영역; 또는
    vi) 서열식별번호: 6을 포함하는 H-CDR1, 서열식별번호: 7을 포함하는 H-CDR2, 및 서열식별번호: 13을 포함하는 H-CDR3을 포함하는 중쇄 항원-결합 영역, 및 서열식별번호: 9를 포함하는 L-CDR1, 서열식별번호: 10을 포함하는 L-CDR2, 및 서열식별번호: 19를 포함하는 L-CDR3을 포함하는 경쇄 항원-결합 영역; 또는
    vii) 서열식별번호: 6을 포함하는 H-CDR1, 서열식별번호: 7을 포함하는 H-CDR2, 및 서열식별번호: 14를 포함하는 H-CDR3을 포함하는 중쇄 항원-결합 영역, 및 서열식별번호: 9를 포함하는 L-CDR1, 서열식별번호: 10을 포함하는 L-CDR2, 및 서열식별번호: 18을 포함하는 L-CDR3을 포함하는 경쇄 항원-결합 영역; 또는
    viii) 서열식별번호: 6을 포함하는 H-CDR1, 서열식별번호: 7을 포함하는 H-CDR2, 및 서열식별번호: 14를 포함하는 H-CDR3을 포함하는 중쇄 항원-결합 영역, 및 서열식별번호: 9를 포함하는 L-CDR1, 서열식별번호: 10을 포함하는 L-CDR2, 및 서열식별번호: 20을 포함하는 L-CDR3을 포함하는 경쇄 항원-결합 영역; 또는
    ix) 서열식별번호: 6을 포함하는 H-CDR1, 서열식별번호: 7을 포함하는 H-CDR2, 및 서열식별번호: 15를 포함하는 H-CDR3을 포함하는 중쇄 항원-결합 영역, 및 서열식별번호: 9를 포함하는 L-CDR1, 서열식별번호: 10을 포함하는 L-CDR2, 및 서열식별번호: 18을 포함하는 L-CDR3을 포함하는 경쇄 항원-결합 영역; 또는
    x) 서열식별번호: 6을 포함하는 H-CDR1, 서열식별번호: 7을 포함하는 H-CDR2, 및 서열식별번호: 16을 포함하는 H-CDR3을 포함하는 중쇄 항원-결합 영역, 및 서열식별번호: 9를 포함하는 L-CDR1, 서열식별번호: 10을 포함하는 L-CDR2, 및 서열식별번호: 18을 포함하는 L-CDR3을 포함하는 경쇄 항원-결합 영역; 또는
    xi) 서열식별번호: 21을 포함하는 H-CDR1, 서열식별번호: 8을 포함하는 H-CDR2, 및 서열식별번호: 13을 포함하는 H-CDR3을 포함하는 중쇄 항원-결합 영역, 및 서열식별번호: 9를 포함하는 L-CDR1, 서열식별번호: 10을 포함하는 L-CDR2, 및 서열식별번호: 18을 포함하는 L-CDR3을 포함하는 경쇄 항원-결합 영역; 또는
    xii) 서열식별번호: 6을 포함하는 H-CDR1, 서열식별번호: 22를 포함하는 H-CDR2, 및 서열식별번호: 13을 포함하는 H-CDR3을 포함하는 중쇄 항원-결합 영역, 및 서열식별번호: 9를 포함하는 L-CDR1, 서열식별번호: 10을 포함하는 L-CDR2, 및 서열식별번호: 18을 포함하는 L-CDR3을 포함하는 경쇄 항원-결합 영역.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 하기를 포함하는 단리된 항체 또는 항원-결합 단편:
    xiii) 서열식별번호: 32를 포함하는 가변 중쇄 도메인 및 서열식별번호: 38을 포함하는 가변 경쇄 도메인; 또는
    xiv) 서열식별번호: 23을 포함하는 가변 중쇄 도메인 및 서열식별번호: 37을 포함하는 가변 경쇄 도메인; 또는
    xv) 서열식별번호: 24를 포함하는 가변 중쇄 도메인 및 서열식별번호: 38을 포함하는 가변 경쇄 도메인; 또는
    xvi) 서열식별번호: 25를 포함하는 가변 중쇄 도메인 및 서열식별번호: 38을 포함하는 가변 경쇄 도메인; 또는
    xvii) 서열식별번호: 26을 포함하는 가변 중쇄 도메인 및 서열식별번호: 38을 포함하는 가변 경쇄 도메인; 또는
    xviii) 서열식별번호: 27을 포함하는 가변 중쇄 도메인 및 서열식별번호: 39를 포함하는 가변 경쇄 도메인; 또는
    xix) 서열식별번호: 27을 포함하는 가변 중쇄 도메인 및 서열식별번호: 38을 포함하는 가변 경쇄 도메인; 또는
    xx) 서열식별번호: 28을 포함하는 가변 중쇄 도메인 및 서열식별번호: 38을 포함하는 가변 경쇄 도메인; 또는
    xxi) 서열식별번호: 28을 포함하는 가변 중쇄 도메인 및 서열식별번호: 40을 포함하는 가변 경쇄 도메인; 또는
    xxii) 서열식별번호: 29를 포함하는 가변 중쇄 도메인 및 서열식별번호: 38을 포함하는 가변 경쇄 도메인; 또는
    xxiii) 서열식별번호: 30을 포함하는 가변 중쇄 도메인 및 서열식별번호: 38을 포함하는 가변 경쇄 도메인; 또는
    xxiv) 서열식별번호: 31을 포함하는 가변 중쇄 도메인 및 서열식별번호: 38을 포함하는 가변 경쇄 도메인; 또는
    xxv) 서열식별번호: 33을 포함하는 가변 중쇄 도메인 및 서열식별번호: 38을 포함하는 가변 경쇄 도메인; 또는
    xxvi) 서열식별번호: 34를 포함하는 가변 중쇄 도메인 및 서열식별번호: 38을 포함하는 가변 경쇄 도메인; 또는
    xxvii) 서열식별번호: 35를 포함하는 가변 중쇄 도메인 및 서열식별번호: 38을 포함하는 가변 경쇄 도메인; 또는
    xxviii) 서열식별번호: 36을 포함하는 가변 중쇄 도메인 및 서열식별번호: 38을 포함하는 가변 경쇄 도메인.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, IgG 항체, 특히 IgG1 또는 IgG4 항체인 단리된 항체.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 하기를 포함하는 단리된 항체:
    xxix) 서열식별번호: 55를 포함하는 중쇄 및 서열식별번호: 57을 포함하는 경쇄; 또는
    xxx) 서열식별번호: 41을 포함하는 중쇄 및 서열식별번호: 56을 포함하는 경쇄; 또는
    xxxi) 서열식별번호: 42를 포함하는 중쇄 및 서열식별번호: 57을 포함하는 경쇄; 또는
    xxxii) 서열식별번호: 43을 포함하는 중쇄 및 서열식별번호: 57을 포함하는 경쇄; 또는
    xxxiii) 서열식별번호: 44를 포함하는 중쇄 및 서열식별번호: 57을 포함하는 경쇄; 또는
    xxxiv) 서열식별번호: 45를 포함하는 중쇄 및 서열식별번호: 58을 포함하는 경쇄; 또는
    xxxv) 서열식별번호: 45를 포함하는 중쇄 및 서열식별번호: 57을 포함하는 경쇄; 또는
    xxxvi) 서열식별번호: 46을 포함하는 중쇄 및 서열식별번호: 57을 포함하는 경쇄; 또는
    xxxvii) 서열식별번호: 46을 포함하는 중쇄 및 서열식별번호: 59를 포함하는 경쇄; 또는
    xxxviii) 서열식별번호: 47을 포함하는 중쇄 및 서열식별번호: 57을 포함하는 경쇄; 또는
    xxxix) 서열식별번호: 48을 포함하는 중쇄 및 서열식별번호: 57을 포함하는 경쇄; 또는
    xl) 서열식별번호: 49를 포함하는 중쇄 및 서열식별번호: 57을 포함하는 경쇄; 또는
    xli) 서열식별번호: 50을 포함하는 중쇄 및 서열식별번호: 57을 포함하는 경쇄; 또는
    xlii) 서열식별번호: 51을 포함하는 중쇄 및 서열식별번호: 57을 포함하는 경쇄; 또는
    xliii) 서열식별번호: 52를 포함하는 중쇄 및 서열식별번호: 57을 포함하는 경쇄; 또는
    xliv) 서열식별번호: 53을 포함하는 중쇄 및 서열식별번호: 57을 포함하는 경쇄; 또는
    xlv) 서열식별번호: 54를 포함하는 중쇄 및 서열식별번호: 57을 포함하는 경쇄.
  9. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, scFv, Fab, Fab' 단편 또는 F(ab')2 단편인 항원-결합 단편.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 모노클로날 항체 또는 항원-결합 단편인 단리된 항체 또는 항원-결합 단편.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 인간, 인간화 또는 키메라 항체 또는 항원-결합 단편인 단리된 항체 또는 항원-결합 단편.
  12. A2AP에 대한 결합에 대해 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 단리된 항체 또는 항원-결합 단편과 경쟁하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 단리된 항체 또는 항원 결합 단편을 포함하는 항체 접합체.
  14. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 항원-결합 단편을 코딩하는 단리된 핵산 서열.
  15. 제14항에 따른 핵산 서열을 포함하는 벡터.
  16. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 항원-결합 단편을 발현하고/거나 제14항에 따른 핵산 또는 제15항에 따른 벡터를 포함하는 단리된 세포.
  17. 제16항에 있어서, 상기 세포가 원핵 또는 진핵 세포인 단리된 세포.
  18. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 단리된 항체 또는 항원-결합 단편을 생산하는 방법으로서, 제16항 또는 제17항에 따른 세포의 배양 및 임의로 항체 또는 항원-결합 단편의 정제를 포함하는 방법.
  19. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 단리된 항체 또는 항원-결합 단편 또는 제13항에 따른 항체 접합체 및 임의로 1종 이상의 제약상 허용되는 부형제를 포함하는 제약 조성물.
  20. 제1항 내지 제13항 및 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 질환의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 단리된 항체 또는 항원-결합 단편 또는 접합체 또는 제약 조성물.
  21. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 진단제로서 사용하기 위한 단리된 항체 또는 항원-결합 단편 또는 항체 접합체.
  22. 제1항 내지 제13항 및 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 부분 또는 완전 혈관 폐쇄로 인한 허혈성 사건과 연관된 장애 또는 질환, 예컨대 허혈성 졸중, 급성 관상동맥 증후군, 말초 동맥 질환, 심근경색, 심부 정맥 혈전증, 폐 색전증, 정맥 혈전증, 또는 단락 혈전증의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 단리된 항체 또는 항원-결합 단편 또는 접합체 또는 제약 조성물.
  23. 제1항 내지 제12항, 제16항 및 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 특히 응고 캐스케이드의 억제제, 항응고제 및 혈소판 응집 억제제로부터 선택된 1종 이상의 추가의 치료 활성 화합물과 동시, 개별, 또는 순차적 조합으로 사용하기 위한 단리된 항체 또는 항원-결합 단편 또는 접합체 또는 제약 조성물.
  24. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 단리된 항체 또는 항원-결합 단편 또는 제13항에 따른 접합체 또는 제19항에 따른 제약 조성물 및 사용에 대한 지침서를 포함하는 키트.
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