JP2023541179A - 新規な抗ａ２ａｐ抗体およびその使用 - Google Patents

新規な抗ａ２ａｐ抗体およびその使用 Download PDF

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Abstract

本発明は、ヒトＡ２ＡＰに結合する単離された抗体またはその抗原結合フラグメントに関する。本発明による単離された抗体または抗原結合フラグメントは、ｉ）ウサギおよび／またはカニクイザルＡ２ＡＰと交差反応し、ｉｉ）ヒトプラスミン活性を阻害せず、およびｉｉｉ）Ａ２ＡＰの存在下でプラスミン媒介性血餅溶解を増加させる。

Description

発明の分野
本発明は、ヒトα２アンチプラスミン（Ａ２ＡＰ）に結合する単離された抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。本発明による単離された抗体または抗原結合フラグメントは、ｉ）ウサギおよび／またはカニクイザル（ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ）Ａ２ＡＰと交差反応し、ｉｉ）ヒトプラスミンに結合せず／ヒトプラスミン活性を阻害せず、ｉｉｉ）Ａ２ＡＰをセリンプロテアーゼ阻害剤からセリンプロテアーゼ基質に変換せず、ｉｖ）解離定数（ＫＤ）≦１００ｎＭ、≦５０ｎＭ、≦２５ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、または≦０．５ｎＭで、配列番号１のアミノ酸４０～４９１の配列のヒトＡ２ＡＰに結合し；ｖ）≦５００ｎＭ、≦２５０ｎＭ、≦１００ｎＭ、≦５０ｎＭ、≦２５ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、または≦０．５ｎＭのＥＣ５０で、配列番号１のアミノ酸４０～４９１の配列のヒトＡ２ＡＰに結合し；ｖｉ）≦５００ｎＭ、≦２５０ｎＭ、≦１００ｎＭ、≦５０ｎＭ、≦２５ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、または≦０．５ｎＭのＥＣ５０で、配列番号１のアミノ酸４０～４９１のヒトＡ２ＡＰの活性を阻害し；および／またはＡ２ＡＰの存在下でのプラスミン媒介性血餅溶解を増加させる。
本発明はさらに、前記抗体または抗原結合フラグメントをコードする単離された核酸配列およびそれを含むベクター、前記抗体または抗原結合フラグメントを発現する単離された細胞、前記抗体または抗原結合フラグメントを産生する方法、ならびに前記抗体または抗原結合フラグメントを含む医薬組成物およびキットを提供する。
本発明による抗体は、虚血性脳卒中、急性冠症候群、末梢動脈疾患、心筋梗塞、深部静脈血栓症、肺塞栓症、静脈血栓症、またはシャント血栓症などの部分的または完全な血管閉塞に起因する虚血性事象に関連する疾患の治療に使用することができる。
発明の背景
血管内の血餅形成は、虚血性脳卒中、急性冠症候群、末梢動脈疾患、心筋梗塞、深部静脈血栓症、肺塞栓症、静脈血栓症、またはシャント血栓症などの複数の重篤な疾患を引き起こし得る。血餅の発生および持続性は、フィブリンおよび血小板によるその形成の速度、ならびに溶解系によるその溶解によって影響を受ける。現在の標準的な治療は、血栓症の慢性予防のための抗凝固に焦点を当てており、これは、非ビタミンＫアンタゴニストの経口抗凝固剤（ＮＯＡＣ）による全ての改善にもかかわらず、依然として出血のリスクを伴い、血餅の消散に対して間接的な効果しか有さない。
虚血性または塞栓性事象に罹患している患者の主な治療目標は、血流の適時の回復である。静脈内（ＩＶ）組換え組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）および機械的血栓除去（ＭＴ）などの血管内治療を含む、血栓溶解を使用する再潅流療法は、例えば虚血性脳卒中に罹患している患者のための唯一の承認された治療である。しかしながら、両方の治療選択肢には限界がある。特に、短時間作用型ｔＰＡについては、出血リスクの強い増加、神経毒性作用、および限られた有効性の時間枠のため、その使用は制限される。
対照的に、主要な内因性プラスミン阻害剤α２－アンチプラスミン（ａ２Ａｐ）の阻害は、出血リスクを伴わずに病理学的パラメータを改善することが報告されている。したがって、α２－アンチプラスミンの阻害は、血餅溶解の加速および（二次）血栓性事象の予防のための革新的な治療選択肢であり得る。
α２－アンチプラスミンは、セルピンスーパーファミリーのメンバーである。これは、セリンプロテアーゼプラスミンの主要な生理学的阻害剤である。プラスミンは次に、様々な他のタンパク質の分解および線維素溶解に関与する重要な酵素である（Ｔｏｎｅ Ｍ、Ｋｉｋｕｎｏ Ｒ、Ｋｕｍｅ－Ｉｗａｋｉ Ａ、Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ－Ｇｏｔｏｈ Ｔ、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｈｕｍａｎ ａｌｐｈａ ２－ｐｌａｓｍｉｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｄｅｄｕｃｅｄ ｆｒｏｍ ｃＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅ、Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９８７；１０２（５）：１０３３－１０４１；Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ ＧＡ、Ｂｉｒｄ ＰＩ、Ｃａｒｒｅｌｌ ＲＷら、Ｔｈｅ ｓｅｒｐｉｎｓ ａｒｅ ａｎ ｅｘｐａｎｄｉｎｇ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ ｏｆ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｌｙ ｓｉｍｉｌａｒ ｂｕｔ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｌｙ ｄｉｖｅｒｓｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ，ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ，ｎｏｖｅｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ，ａｎｄ ａ ｒｅｖｉｓｅｄ ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２００１；２７６（３６）：３３２９３－３３２９６）。
α２－アンチプラスミンは、２７アミノ酸のシグナルペプチドを有する４９１アミノ酸の前駆体として合成される。分泌型は、短いプロペプチド（残基２８～３９）および成熟鎖（残基４０～４９１）を示す。肝臓および腎臓は、ａ２Ａｐ産生の主要部位であるが、筋肉、腸、中枢神経系、および胎盤などの他の組織も、そのｍＲＮＡを中程度のレベルで発現する。
α２－アンチプラスミンの血漿中濃度は約１マイクロモル（～７０マイクログラム／ｍｌ）であり、血漿中の半減期は２．６日間で決定されている（Ｃｏｌｌｅｎ Ｄ、Ｗｉｍａｎ Ｂ、Ｔｕｒｎｏｖｅｒ ｏｆ ａｎｔｉｐｌａｓｍｉｎ，ｆａｓｔ－ａｃｔｉｎｇ ｐｌａｓｍｉｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ｐｌａｓｍａ、Ｂｌｏｏｄ、１９７９；５３（２）：３１３－３２４）。
α２－アンチプラスミンの実験的治療的不活化は、微小血管血栓症、虚血性脳損傷、脳腫脹、脳出血および血栓塞栓性脳卒中後の死亡を著しく減少させる（Ｒｅｅｄ ＧＬ、Ｈｏｕｎｇ ＡＫ、Ｗａｎｇ Ｄ、Ｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒ ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ，ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ，ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｉｎｊｕｒｙ，ａｎｄ ｄｅａｔｈ ａｆｔｅｒ ｃｅｒｅｂｒａｌ ｔｈｒｏｍｂｏｅｍｂｏｌｉｓｍ ａｒｅ ａｆｆｅｃｔｅｄ ｂｙ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ α２－ａｎｔｉｐｌａｓｍｉｎ、Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ Ｔｈｒｏｍｂ Ｖａｓｃ Ｂｉｏｌ、２０１４；３４（１２）：２５８６－２５９３）。
Ｍｉｍｕｒｏらは、Ａ２ＡＰ抗体であるＪＰＴＩ－１について記載している。予め形成されたＡ２ＡＰ－プラスミン複合体に対するＪＰＴＩ－１の結合活性は、遊離Ａ２ＡＰに対するよりも低かった。ＪＰＴＩ－１は、Ａ２ＡＰ－プラスミン複合体の形成を妨害することによりＡ２ＡＰ活性を阻害した。しかしながら、Ｍｉｍｕｒｏらは、血餅溶解を増強するためのＪＰＴＩ－１の使用について沈黙している（Ｍｉｍｕｒｏ Ｊら、Ｂｌｏｏｄ、１９８７；６９：４４６－４５３）。
先行技術の最もよく特徴付けられた既知の抗体の１つは、Ｒｅｅｄらによって記載された７７Ａ３であり（Ｒｅｅｄ ＧＬ、Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ ａｌｐｈａ ２－ａｎｔｉｐｌａｓｍｉｎ ｔｈａｔ ａｃｃｅｌｅｒａｔｅ ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ ｉｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ａｎｉｍａｌ ｐｌａｓｍａｓ、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ、１９９７；１６（３）：２８１－２８６；ＷＯ９８／１２３３４、ＷＯ９８／１２３２９）、古典的なマウス免疫アプローチに由来する抗体である。この抗体がマウス由来であるという事実により、少なくともヒト化キャンペーンが行われている。
他の機能遮断抗α２－アンチプラスミン抗体は、非ヒト抗体、例えばヤギ由来のＳｅｒｐｉｎ Ｆ２／α２－アンチプラスミン抗体（Ｒ＆Ｄ、カタログ番号ＡＦ１４８４－ＳＰ）としてのそれらの起源のため、それらの特異性、例えばそれぞれマウス特異的抗体クローン２７Ｃ９、４Ｈ９、およびＣＢＹＹ－Ｉ０９５６（ＭｙＢｉｏＳｏｕｒｃｅ、カタログ番号ＭＢＳ１３５０９５およびＭＢＳ１３５０７６、Ｃｒｅａｔｉｖｅ Ｂｉｏｌａｂｓ、カタログ番号ＣＢＭＡＢ－Ｉ２１２４－ＹＹ）のため、またはこれらの抗体がポリクローナルであるという事実のため（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号ＰＡ５－４７１４２）、治療薬として適していない。
したがって、これまで満たされていない部分的または完全な血管閉塞に起因する虚血事象に関連する疾患の治療に有用な新規の治療用Ａ２ＡＰ抗体が非常に必要とされている。
国際公開第９８／１２３３４号 国際公開第９８／１２３２９号
Ｔｏｎｅ Ｍ、Ｋｉｋｕｎｏ Ｒ、Ｋｕｍｅ－Ｉｗａｋｉ Ａ、Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ－Ｇｏｔｏｈ Ｔ、Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９８７；１０２（５）：１０３３－１０４１ Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ ＧＡ、Ｂｉｒｄ ＰＩ、Ｃａｒｒｅｌｌ ＲＷら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２００１；２７６（３６）：３３２９３－３３２９６ Ｃｏｌｌｅｎ Ｄ、Ｗｉｍａｎ Ｂ、Ｂｌｏｏｄ、１９７９；５３（２）：３１３－３２４ Ｒｅｅｄ ＧＬ、Ｈｏｕｎｇ ＡＫ、Ｗａｎｇ Ｄ、Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ Ｔｈｒｏｍｂ Ｖａｓｃ Ｂｉｏｌ、２０１４；３４（１２）：２５８６－２５９３ Ｍｉｍｕｒｏ Ｊら、Ｂｌｏｏｄ、１９８７；６９：４４６－４５３ Ｒｅｅｄ ＧＬ、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ、１９９７；１６（３）：２８１－２８６
本発明の対象
先行技術に鑑みて、本発明の目的は、先行技術のＡ２ＡＰ抗体の欠点を克服する新規な治療用Ａ２ＡＰ抗体を提供することである。特に、本発明の目的は、ヒトＡ２ＡＰの高親和性結合剤である新規Ａ２ＡＰ抗体を提供することである。望ましいＡ２ＡＰ抗体は、ウサギおよび／またはカニクイザルＡ２ＡＰに対して交差反応性である。それらはヒト治療において非免疫原性であり、すなわち、それらはヒトまたはヒト化抗体である。望ましいＡ２ＡＰ抗体はＡ２ＡＰに対して選択的であり、特に、ヒトプラスミンに結合せず、それを阻害しない。また、それらは、Ａ２ＡＰの存在下でプラスミン媒介性血餅溶解を増加させることができる。
そのような新規なＡ２ＡＰ抗体は、虚血性脳卒中、急性冠症候群、末梢動脈疾患、心筋梗塞、深部静脈血栓症、肺塞栓症、静脈血栓症またはシャント血栓症などの部分的または完全な血管閉塞に起因する虚血性事象に関連する疾患の治療において大きな進歩を提供する。
発明の概要
上述の目的および他の目的は、本発明の教示によって達成される。本発明はα２－アンチプラスミンに対して特異的親和性を有し、被験体に治療的利益を送達することができる新規抗体の発見に基づく。
したがって、第１の態様において、本発明は、ヒトＡ２ＡＰに結合する単離された抗体またはその抗原結合フラグメントに関し、ここで、前記単離された抗体またはその抗原結合フラグメントは、
ｉ）ウサギおよび／またはカニクイザルＡ２ＡＰと交差反応し、
ｉｉ）ヒトプラスミン活性を阻害せず、
ｉｉｉ）Ａ２ＡＰをセリンプロテアーゼ阻害剤からセリンプロテアーゼ基質に変換せず、
ｉｖ）解離定数（ＫＤ）≦１００ｎＭ、≦５０ｎＭ、≦２５ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、または≦０．５ｎＭで、配列番号１のアミノ酸４０～４９１の配列のヒトＡ２ＡＰに結合し；
ｖ）≦５００ｎＭ、≦２５０ｎＭ、≦１００ｎＭ、≦５０ｎＭ、≦２５ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、または≦０．５ｎＭのＥＣ５０で、配列番号１のアミノ酸４０－４９１の配列のヒトＡ２ＡＰに結合し；
ｖｉ）≦５００ｎＭ、≦２５０ｎＭ、≦１００ｎＭ、≦５０ｎＭ、≦２５ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、または≦０．５ｎＭのＥＣ５０で、配列番号１のアミノ酸４０～４９１のヒトＡ２ＡＰの活性を阻害し；および／または
Ａ２ＡＰの存在下でプラスミン媒介性血餅溶解を増加させる。
本発明による単離された抗体または抗原結合フラグメントは、機能遮断抗α２－アンチプラスミン抗体または抗原結合フラグメントであり、これらは、他の血栓溶解促進化合物に典型的であるため、出血のような望ましくない副作用を引き起こすことなく、インビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）およびインビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）で加速された血餅溶解を誘導する。したがって、本発明による単離された抗体または抗原結合フラグメントは、虚血性脳卒中、急性冠症候群、末梢動脈疾患、心筋梗塞、深部静脈血栓症、肺塞栓症、静脈血栓症またはシャント血栓症などの血管部分閉塞または完全閉塞に起因する虚血性事象に関連する疾患の治療に使用することができる。本発明による単離された抗体または抗原結合フラグメントは、Ａ２ＡＰ関連障害の診断においてさらに使用され得る。
さらなる態様において、本発明は、Ａ２ＡＰに結合することができ、Ａ２ＡＰの活性を阻害することができる単離された抗体またはその抗原結合フラグメントに関し、ここで、前記単離された抗体またはその抗原結合フラグメントは、プラスミン活性を阻害しない。
さらなる態様において、本発明は、ヒトＡ２ＡＰに結合し、Ａ２ＡＰの活性を阻害することができる単離された抗体またはその抗原結合フラグメントに関し、
ここで、前記単離された抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号１のアミノ酸４０２～４０８（ＳＲＭＳＬＳＳ）を含むＡ２ＡＰのエピトープに結合する。
さらなる態様において、本発明は、Ａ２ＡＰへの結合について前記単離された抗体または抗原結合フラグメントと競合する、単離された抗体またはその抗原結合フラグメントに関する。
さらなる態様において、本発明は、本発明による単離された抗体または抗原結合フラグメントを含む抗体コンジュゲートに関する。
さらなる態様において、本発明は、本発明による抗体または抗原結合フラグメントをコードする単離された核酸配列に関する。
さらなる態様において、本発明は、本発明による核酸配列を含むベクターに関する。
さらなる態様において、本発明は、本発明による抗体もしくは抗原結合フラグメントを発現する、および／または本発明による核酸もしくは本発明によるベクターを含む単離された細胞に関する。
さらなる態様において、本発明は、本発明による単離された抗体または抗原結合フラグメントを産生する方法であって、本発明による細胞を培養すること、および任意に抗体または抗原結合フラグメントを精製することを含む方法に関する。
さらなる態様において、本発明は、本発明による単離された抗体または抗原結合フラグメントまたは本発明による抗体コンジュゲートを含む医薬組成物に関する。
さらなる態様において、本発明は、疾患の治療または予防に使用するための、本発明による単離された抗体または抗原結合フラグメント、または本発明によるコンジュゲート、または本発明による医薬組成物に関する。
さらなる態様において、本発明は、診断薬としての使用のための、本発明による単離された抗体もしくは抗原結合フラグメントまたは本発明によるコンジュゲートに関する。
さらなる態様において、本発明は、部分的または完全な血管閉塞に起因する虚血事象に関連する障害または疾患、例えば虚血性脳卒中、急性冠症候群、末梢動脈疾患、心筋梗塞、深部静脈血栓症、肺塞栓症、静脈血栓症、またはシャント血栓症の治療または予防に使用するための、本発明による単離された抗体もしくは抗原結合フラグメント、本発明によるコンジュゲートまたは本発明による医薬組成物に関する。
さらなる態様において、本発明は、特に凝固カスケード阻害剤、抗凝固剤、および血小板凝集阻害剤から選択される１種以上のさらなる治療活性化合物と同時に、別々に、または連続して組み合わせて使用するための、本発明による単離された抗体もしくは抗原結合フラグメント、本発明によるコンジュゲートまたは本発明による医薬組成物に関する。
さらなる態様において、本発明は、本発明による単離された抗体もしくは抗原結合フラグメントまたは本発明によるコンジュゲートと、使用説明書とを含むキットに関する。
発明の詳細な説明
本発明は、本発明の以下の詳細な説明およびそこに含まれる実施例を参照することによって、より容易に理解され得る。
定義
別途定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解される意味を有する。しかしながら、以下の参考文献は、本発明が関連する当業者に、本発明で使用される用語の多くの一般的定義を提供することができ、そのような定義が当技術分野で一般的に理解される意味と一致する限り、参考および使用することができる。そのような参考文献には、これらに限定されないが、以下のものが含まれる：Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎら、Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ （第２版、１９９４）；Ｔｈｅ Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｗａｌｋｅｒ編、１９８８）；Ｈａｌｅ ＆ Ｍａｒｈａｍ、Ｔｈｅ Ｈａｒｐｅｒ Ｃｏｌｌｉｎｓ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９１）；およびＬａｃｋｉｅら、Ｔｈｅ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｃｅｌｌ＆Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（第３版、１９９９）；およびＣｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｅｄｓ．Ａｂｂａｓ、Ｌｉｃｈｔｍａｎ ａｎｄ Ｐｏｂｅｒ、第２版、Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ Ｃｏｍｐａｎｙ。当業者に利用可能な、当技術分野で一般的に理解されている意味を有する本明細書で使用される用語の定義を提供する任意の追加の技術的リソースを参考にすることができる。本発明の目的のために、以下の用語をさらに定義する。さらなる用語は、本明細書の他の箇所で定義される。本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」および「ｔｈｅ」は文脈が明らかに別段の指示をしない限り、複数の参照を含む。したがって、例えば、「遺伝子（ａ ｇｅｎｅ）」への言及は１つまたは複数の遺伝子への言及であり、当業者に公知のその等価物などを含む。
本明細書の文脈において、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という語は「含むが、これに限定されない（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ， ｂｕｔ ｎｏｔ ｌｉｍｉｔｅｄ ｔｏ）」を意味する。この用語は、制限のないものを意図しており、記載された特徴、要素、整数、ステップ、または構成要素の存在を特定するが、１つまたは複数の他の特徴、要素、整数、ステップ、構成要素、またはそれらの群の存在または追加を排除しない。したがって、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、より限定的な用語「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」および「から本質的になる（ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」を包含する。一実施形態において、本出願を通して、特に特許請求の範囲内で使用される「含む」という用語は、「からなる」という用語に置き換えることができる。
これに関連して、「約（ａｂｏｕｔ）」または「およそ（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」という用語は、所与の値または範囲の８０％～１２０％、あるいは９０％～１１０％を意味し、９５％～１０５％の範囲内を含む。
用語「ポリペプチド」および「タンパク質」は、アミノ酸残基のポリマーを指すために本明細書において互換的に使用される。この用語は、１つまたは複数のアミノ酸残基が対応する天然アミノ酸の人工化学模倣物であるアミノ酸ポリマー、ならびに天然アミノ酸ポリマーおよび非天然アミノ酸ポリマーに適用される。特に明記しない限り、特定のポリペプチド配列は、その保存的に修飾された変異体も暗黙的に包含する。
本明細書で使用される場合、「Ａ２ＡＰ」は、「ＳｅｒｐｉｎＦ２」（セルピンファミリーＦメンバー２）、ＡＡＰ、ＡＰＩ、ＰＬＩ、またはＡＬＰＨＡ－２－ＰＩとしても知られる「α２－アンチプラスミン」を示す。Ａ２ＡＰは、セルピンスーパーファミリーのメンバーである。これは、セリンプロテアーゼプラスミンの主要な生理学的阻害剤である。Ａ２ＡＰは、２７アミノ酸のシグナルペプチドを有する４９１アミノ酸の前駆体として合成される。分泌型は、短いプロペプチド（残基２８～３９）および成熟鎖（残基４０～４９１）を示す。ヒトＡ２ＡＰの参照配列は、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔデータベースから受託番号Ｐ０８６９７－１（配列番号１）で入手可能であり、シグナルペプチド（１～２７位）、プロペプチド（残基２８～３９）および成熟鎖（残基４０～４９１）を含む（番号付けは１位のメチオニンに従う）。
ヒトＡ２ＡＰ（配列番号１）：
MALLWGLLVLSWSCLQGPCSVFSPVSAMEPLGRQLTSGPNQEQVSPLTLLKLGNQEPGGQTALKSPPGVCSRDPTPEQTHRLARAMMAFTADLFSLVAQTSTCPNLILSPLSVALALSHLALGAQNHTLQRLQQVLHAGSGPCLPHLLSRLCQDLGPGAFRLAARMYLQKGFPIKEDFLEQSEQLFGAKPVSLTGKQEDDLANINQWVKEATEGKIQEFLSGLPEDTVLLLLNAIHFQGFWRNKFDPSLTQRDSFHLDEQFTVPVEMMQARTYPLRWFLLEQPEIQVAHFPFKNNMSFVVLVPTHFEWNVSQVLANLSWDTLHPPLVWERPTKVRLPKLYLKHQMDLVATLSQLGLQELFQAPDLRGISEQSLVVSGVQHQSTLELSEVGVEAAAATSIAMSRMSLSSFSVNRPFLFFIFEDTTGLPLFVGSVRNPNPSAPRELKEQQDSPGNKDFLQSLKGFPRGDKLFGPDLKLVPPMEEDYPQFGSPK
Figure 2023541179000001
本明細書で使用される場合、「プラスミン」は、「プラスミン」を示す。プラスミンは、例えば血餅中のフィブリンを溶解するように作用する。プラスミンは、プラスミノーゲン（ＰＬＧ）と呼ばれるプロ酵素として肝臓から体循環に放出される。プラスミノーゲンの２つの主要なグリコフォームがヒトに存在する－Ｉ型プラスミノーゲンは２つのグリコシル化部分（Ｎ２８９にＮ結合し、Ｔ３４６にＯ結合する）を含有するが、ＩＩ型プラスミノーゲンは単一のＯ結合糖（Ｔ３４６にＯ結合する）のみを含有する。ＩＩ型プラスミノーゲンは、Ｉ型グリコフォームよりも細胞表面に優先的に動員される。逆に、Ｉ型プラスミノーゲンは、血餅により容易に動員されるようである。循環において、プラスミノーゲンは、閉構造、活性化抵抗性の立体構造をとる。血餅または細胞表面に結合すると、プラスミノーゲンは、例えば、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）を含む様々な酵素によって活性プラスミンに変換され得る開構造をとる。フィブリンは、組織プラスミノーゲン活性化因子によるプラスミノーゲン活性化のための補因子である。プラスミノーゲンのプラスミンへの変換は、Ａｒｇ－５６１とＶａｌ－５６２（Ｗｉｋｉｐｅｄｉａ）との間のペプチド結合の切断を含む。
ヒトプラスミンの参照配列は、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔデータベースから受託番号Ｐ００７４７－１（番号付けは１位のメチオニンに従う）で入手可能である。
Figure 2023541179000002
用語「抗Ａ２ＡＰ抗体」または「抗α２－アンチプラスミン抗体」および「α２－アンチプラスミンに結合する抗体」または「Ａ２ＡＰに結合する抗体」は、α２－アンチプラスミンを十分な親和性で結合することができる抗体を指し、その結果、抗体は、α２－アンチプラスミンを標的とする際の診断および／または治療剤として有用である。一実施形態において、非関連、非α２－アンチプラスミンタンパク質への抗α２－アンチプラスミン抗体の結合の程度が例えば、標準的なＥＬＩＳＡ手順によって測定した場合、α２－アンチプラスミンへの抗体の結合の約１０％未満、約５％未満、または約２％未満である。ある態様において、α２－アンチプラスミンに結合する抗体は、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ、または≦０．００１ｎＭ（例えば、１０－８Ｍ以下、例えば、１０－８Ｍ～１０－１３Ｍ、例えば、１０－９Ｍ～１０－１３Ｍ）の結合活性（ＥＣ５０）を有する。特定の実施形態において、抗α２－アンチプラスミン抗体が異なる種由来のα２－アンチプラスミンの間で保存されているα２－アンチプラスミンのエピトープに結合する。
本明細書で使用される「抗体」という用語は、免疫グロブリン分子を指すことが意図される。抗体は、４つのポリペプチド鎖、２つの重（Ｈ）鎖（約５０～７０ｋＤａ）および２つの軽（Ｌ）鎖（約２５ｋＤａ）を含み得、これらは典型的にはジスルフィド結合によって相互連結される。特定の実施形態において、抗体がポリペプチド鎖の２つの同一の対から構成される。各鎖のアミノ末端部分は、抗原認識に主に関与する約１００～１１０またはそれ以上のアミノ酸の「可変」領域を含む。重鎖可変領域は、本明細書においてＶＨと略記され、軽鎖可変領域は、本明細書においてＶＬと略記される。各鎖のカルボキシル末端部分は、主にエフェクター機能を担う定常領域を規定する。重鎖定常領域は例えば、３つのドメインＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３を含むことができる。軽鎖定常領域は、１つのドメイン（ＣＬ）からなる。ＶＨおよびＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる、より保存された領域が散在する、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性の領域にさらに細分することができる。各ＶＨおよびＶＬは、典型的にはアミノ末端からカルボキシ末端に、例えば、以下の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４で配列された、３つのＣＤＲおよび最大４つのＦＲから構成される。
本明細書で使用される場合、用語「相補性決定領域」（ＣＤＲ；例えば、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）は、その存在が抗原結合に必要である抗体可変ドメインのアミノ酸残基を指す。各可変ドメインは、典型的にはＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３として同定される３つのＣＤＲを有する。各相補性決定領域は、Ｋａｂａｔにより定義されているような「相補性決定領域」からのアミノ酸残基（例えば、軽鎖可変ドメイン中の約２３～３６（Ｌ１）、５２～５８（Ｌ２）および９１～１０１（Ｌ３）ならびに重鎖可変ドメイン中の３１～３５（Ｈ１）、５０～６５（Ｈ２）および９８～１１０（Ｈ３）；（Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ（１９９１））および／または「超可変ループ」からのアミノ酸残基（例えば、軽鎖可変ドメイン中の約２６～３２（Ｌ１）、５０～５２（Ｌ２）および９１～９６（Ｌ３）ならびに重鎖可変ドメイン中の２６～３２（Ｈ１）、５３～５５（Ｈ２）および９６～１０１（Ｈ３）（Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ；Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １９６：９０１－９１７（１９８７）））を含み得る。いくつかの例において、相補性決定領域は、Ｋａｂａｔに従って定義されるＣＤＲおよび超可変ループの両方からのアミノ酸を含み得る。
「フレームワーク」またはＦＲ残基は、超可変領域残基以外の可変ドメイン残基である。
語句「定常領域」とは、エフェクター機能を付与する抗体分子の部分を指す。
本明細書において用語「Ｆｃ領域」は、定常領域の少なくとも一部を含む免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。この用語は、天然配列Ｆｃ領域および変異体Ｆｃ領域を含む。一実施形態において、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域がＣｙｓ２２６から、またはＰｒｏ２３０から重鎖のカルボキシル末端まで延びる。しかしながら、Ｆｃ領域のＣ末端リシン（Ｌｙｓ４４７）は、存在しても存在しなくてもよい。本明細書において別段の指定がない限り、Ｆｃ領域または定常領域におけるアミノ酸残基の番号付けは、Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ、１９９１に記載されているように、ＥＵ番号付けシステム（ＥＵインデックスとも呼ばれる）に従う。
免疫グロブリンは、それらの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて異なるクラスに割り当てることができる。重鎖は、ミュー（μ）、デルタ（Δ）、ガンマ（γ）、α（α）、およびエプシロン（ε）として分類され、それぞれＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＥとして抗体のアイソタイプを定義する。特定の実施形態において、本発明による抗体がＩｇＧ抗体である。これらのうちのいくつかは、サブクラスまたはアイソタイプ、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２にさらに分けられ得る。特定の実施形態において、本発明による抗体がＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４抗体、より具体的にはＩｇＧ１またはＩｇＧ４抗体である。異なるアイソタイプは、異なるエフェクター機能を有し得る。ヒト軽鎖は、カッパ（Κ）およびラムダ（λ）軽鎖として分類される。軽鎖および重鎖内で、可変領域および定常領域は、約１２個以上のアミノ酸の「Ｊ」領域によって連結され、重鎖はまた、約１０個以上のアミノ酸の「Ｄ」領域を含む。一般的には、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｃｈ．７（Ｐａｕｌ、Ｗ．編集、第２版、Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ、Ｎ．Ｙ（１９８９））を参照されたい。
抗体／免疫グロブリンの「機能的フラグメント」または「抗原結合抗体フラグメント」は本明細書において、抗原結合領域を保持する抗体／免疫グロブリンのフラグメント（例えば、ＩｇＧの可変領域）として定義される。抗体の「抗原結合領域」は、典型的には抗体の１つまたは複数の超可変領域、例えば、ＣＤＲ１、－２、および／または－３領域に見出される；しかしながら、可変「フレームワーク」領域はまた、ＣＤＲの足場を提供することなどによって、抗原結合において重要な役割を果たすことができる。好ましくは「抗原結合領域」は、少なくとも可変軽（ＶＬ）鎖の４～１０３および可変重（ＶＨ）鎖の５～１０９アミノ酸残基、より好ましくはＶＬの３～１０７およびＶＨの４～１１１アミノ酸残基を含み、特に好ましくは完全なＶＬおよびＶＨ鎖（ＶＬの１～１０９およびＶＨの１～１１３アミノ酸位置；ＷＯ９７／０８３２０による番号付け）である。
「機能的フラグメント」または「抗原結合抗体フラグメント」の非限定的な例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖフラグメント、ドメイン抗体（ｄＡｂ）、相補性決定領域（ＣＤＲ）フラグメント、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）、単鎖抗体フラグメント、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、直鎖抗体（Ｚａｐａｔａら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．、８（１０）：１０５７－１０６２（１９９５））；キレート化組換え抗体、トリボディまたはバイボディ、ナノボディ、小モジュラー免疫製剤（ＳＭＩＰ）、抗原結合ドメイン免疫グロブリン融合タンパク質、ラクダ化抗体、ＶＨＨ含有抗体、またはそのムテインまたは誘導体、および抗体が所望の生物学的活性を保持する限り、ＣＤＲ配列などの、ポリペプチドに特異的抗原結合を付与するのに十分な免疫グロブリンの少なくとも一部を含有するポリペプチド；および抗体フラグメントから形成される二重特異性および三重特異性抗体（Ｃ．Ａ．Ｋ Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ、ｅｄｉｔｏｒ（１９９５）Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（Ｂｒｅａｋｔｈｒｏｕｇｈｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ；Ｒ．Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ＆Ｓ．Ｄｕｅｂｅｌ、ｅｄｉｔｏｒｓ（２００１）Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ）が挙げられる。「二重特異性」または「二機能性」抗体以外の抗体は、その結合部位の各々が同一であると理解される。Ｆ（ａｂ’）２またはＦａｂは、ＣＨ１領域とＣＬ領域との間に生じる分子間ジスルフィド相互作用を最小化または完全に除去するように操作され得る。抗体のパパイン消化は、２つの同じ抗原結合フラグメント（「Ｆａｂ」フラグメントと呼ばれ、これらは各々、１つの抗原結合部位を含む）と、残りの「Ｆｃ」フラグメント（この名前は容易に結晶化する能力を反映する）とを生じる。ペプシン処理により、２つの「Ｆｖ」フラグメントを有するＦ（ａｂ’）２フラグメントが得られる。「Ｆｖ」フラグメントは、完全な抗原認識および結合部位を含む最小抗体フラグメントである。この領域は、１つの重鎖可変ドメインと１つの軽鎖可変ドメインとが硬く非共有的に会合している二量体から構成されている。各可変ドメインの３つのＣＤＲが相互作用して、ＶＨ－ＶＬ二量体の表面上の抗原結合部位を規定するのは、この立体配置である。まとめると、６個のＣＤＲによって、抗体に対する抗原結合特異性が付与される。しかし、単一の可変ドメイン（または抗原に特異的な３つのＣＤＲのみを含むＦｖの半分）でさえ、抗原を認識し、結合する能力を有する。
「単鎖Ｆｖ」または「ｓＦｖ」または「ｓｃＦｖ」抗体フラグメントは、抗体のＶＨおよびＶＬドメインを含み、これらのドメインは、単一のポリペプチド鎖中に存在する。
好ましくは、Ｆｖポリペプチドは、Ｆｖが抗原結合のための所望の構造を形成することを可能にする、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間のポリペプチドリンカーをさらに含む。Ｆｖの総説については、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ ｉｎ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、第１１３巻、Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ ａｎｄ Ｍｏｏｒｅ編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、２６９－３１５頁（１９９４）を参照されたい。
Ｆａｂフラグメントにはまた、軽鎖の定常ドメインと重鎖の第１定常ドメイン（ＣＨ１）とが含まれる。Ｆａｂフラグメントは、抗体ヒンジ領域からの１つまたは複数のシステイン残基を含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシル末端における数個の残基の付加によって、Ｆａｂ’フラグメントとは異なる。Ｆａｂ’－ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基（単数または複数）が遊離のチオール基を有しているＦａｂ’についての本明細書中での名称である。Ｆ（ａｂ’）２抗体フラグメントは、元々、それらの間にヒンジシステイン残基を有するＦａｂ’フラグメントの対として産生された。
用語「ムテイン」または「変異体」は互換的に使用することができ、可変領域または可変領域と等価な部分に少なくとも１つのアミノ酸置換、欠失、または挿入を含む抗体または抗原結合フラグメントを指すが、ただし、ムテインまたは変異体は、所望の結合親和性または生物学的活性を保持する。本発明において企図される抗体または抗原結合抗体フラグメントの変異体は、抗体または抗原結合抗体フラグメントの結合活性が維持される分子である。
「キメラ抗体」またはその抗原結合フラグメントは本明細書において、可変ドメインが非ヒト起源に由来し、いくつかまたはすべての定常ドメインがヒト起源に由来するものとして定義される。
「ヒト化抗体」は例えば、任意の必要なフレームワーク復帰突然変異と共にヒト配列由来Ｖ領域に移植された、マウスなどの非ヒト種に由来するＣＤＲ領域を含む。したがって、ほとんどの場合、ヒト化抗体は、レシピエントの超可変領域由来の残基が、所望の特異性、親和性、および能力を有するマウス、ラット、ウサギ、または非ヒト霊長類などの非ヒト種（ドナー抗体）の超可変領域由来の残基によって置換されているヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。例えば、米国特許第５，２２５，５３９号；同第５，５８５，０８９号；同第５，６９３，７６１号；同第５，６９３，７６２号；同第５，８５９，２０５号（それぞれ参照により本明細書に組み入れられる）を参照されたい。いくつかの例において、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク残基は、対応する非ヒト残基によって置換される（例えば、それぞれ参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，５８５，０８９号；同第５，６９３，７６１号；同第５，６９３，７６２号を参照されたい）。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体またはドナー抗体に見出されない残基を含むことができる。これらの修飾は抗体性能をさらに改良するために（例えば、所望の親和性を得るために）行われる。一般に、ヒト化抗体は、超可変領域のすべてまたは実質的にすべてが非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、フレームワーク領域のすべてまたは実質的にすべてがヒト免疫グロブリン配列のものである、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的にすべてを含む。ヒト化抗体は任意に、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部、典型的にはヒト免疫グロブリンのものも含む。さらなる詳細については、Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ ３３１：５２２－２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３－２７（１９８８）；およびＰｒｅｓｔａ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３－９６（１９９２）（それぞれ参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
「ヒト抗体」または「完全ヒト抗体」は、ヒト由来ＣＤＲ、すなわちヒト起源のＣＤＲを含む。完全ヒト抗体は、ＩＭＧＴデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ）に基づいて決定された最も近いヒト生殖系列基準と比較して、少数の生殖系列逸脱を含み得る。例えば、本発明による完全ヒト抗体は、最も近いヒト生殖系列基準と比較して、ＣＤＲにおける最大１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の生殖系列偏差を含み得る。完全ヒト抗体は、細胞濃縮または不死化工程と組み合わせたクローニング技術によって、ヒト由来Ｂ細胞から開発することができる。しかしながら、完全ヒト抗体の大部分は、ヒトＩｇＧ遺伝子座のトランスジェニック免疫マウス、またはファージディスプレイによる洗練されたコンビナトリアルライブラリーから単離される（Ｂｒｕｅｇｇｅｍａｎｎ Ｍ．、Ｏｓｂｏｒｎ Ｍ．Ｊ．、Ｍａ Ｂ．、Ｈａｙｒｅ Ｊ．、Ａｖｉｓ Ｓ．、Ｌｕｎｄｓｔｒｏｍ Ｂ． ａｎｄ Ｂｕｅｌｏｗ Ｒ．、Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ａｎｉｍａｌｓ、Ａｒｃｈ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｔｈｅｒ Ｅｘｐ（Ｗａｒｓｚ．）６３（２０１５）、１０１－１０８；Ｃａｒｔｅｒ Ｐ．Ｊ．、Ｐｏｔｅｎｔ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ｂｙ ｄｅｓｉｇｎ、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ ６（２００６）、３４３－３５７；Ｆｒｅｎｚｅｌ Ａ．、Ｓｃｈｉｒｒｍａｎｎ Ｔ． ａｎｄ Ｈｕｓｔ Ｍ．、Ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｈｕｍａｎ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｔｈｅｒａｐｙ、ＭＡｂｓ ８（２０１６）、１１７７－１１９４；Ｎｅｌｓｏｎ Ａ．Ｌ．、Ｄｈｉｍｏｌｅａ Ｅ． ａｎｄ Ｒｅｉｃｈｅｒｔ Ｊ．Ｍ．、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｔｒｅｎｄｓ ｆｏｒ ｈｕｍａｎ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ ９（２０１０）、７６７－７７４．））。
完全ヒト抗体を作製するために、いくつかの技術が利用可能である（ＷＯ２００８／１１２６４０Ａ３参照）。Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＣＡＴ）およびＤｙａｘは、免疫化されたヒトから単離された末梢Ｂ細胞から抗体ｃＤＮＡ配列を得て、特定の特異性のヒト可変領域配列の同定のためのファージディスプレイライブラリーを考案した。簡潔に述べると、抗体可変領域配列は、Ｍ１３バクテリオファージの遺伝子ＩＩＩまたは遺伝子ＶＩＩＩ構造のいずれかと融合される。これらの抗体可変領域配列は、それぞれの配列を有するファージの先端でＦａｂまたは単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）構造のいずれかとして発現される。異なるレベルの抗原結合条件（ストリンジェンシー）を使用するパニングプロセスのラウンドを通して、目的の抗原に特異的なＦａｂまたはｓｃＦｖ構造を発現するファージを選択し、単離することができる。次いで、選択されたファージの抗体可変領域ｃＤＮＡ配列を、標準的な配列決定手順を用いて解明することができる。次いで、これらの配列は、確立された抗体工学技術を使用して、所望のアイソタイプを有する完全抗体の再構築のために使用され得る。この方法に従って構築された抗体は、完全ヒト抗体（ＣＤＲを含む）とみなされる。選択された抗体の免疫反応性（抗原結合親和性および特異性）を改善するために、異なる重鎖および軽鎖の組み合わせ会合、重鎖および軽鎖のＣＤＲ３における欠失／付加／突然変異（Ｖ－ＪおよびＶ－Ｄ－Ｊ組換えを模倣するため）、およびランダム突然変異（体細胞超突然変異を模倣するため）を含む、インビトロ成熟プロセスを導入することができる。この方法によって生成される「完全ヒト」抗体の例は、抗腫瘍壊死因子α抗体、Ｈｕｍｉｒａ（アダリムマブ）である。
「Ｈｕｍａｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ（商標）」抗体は、Ｓｔｕｄｎｉｃｋａら、米国特許第５，７６６，８８６号に記載されている方法に従って、親配列を変更することによって生成される。
本発明の抗体は、組換え抗体遺伝子ライブラリーに由来し得る。組換えヒト抗体遺伝子のレパートリーを作製するためのテクノロジーの開発、および糸状バクテリオファージの表面上のコードされた抗体フラグメントのディスプレイは、ヒト化、キメラ、マウス、またはムテイン抗体にも適用することができる、ヒト抗体を直接的に作製および選択するための組換え手段を提供した。ファージ技術によって産生される抗体は、細菌において抗原結合フラグメント（通常はＦｖまたはＦａｂフラグメント）として産生され、したがってエフェクター機能を欠く。エフェクター機能は、次の２つの戦略のうちの１つによって導入することができる：フラグメントが哺乳動物細胞における発現のために完全抗体中に、またはエフェクター機能を誘発することができる第２の結合部位を有する二重特異性抗体フラグメント中に操作することができる。典型的には、抗体のＦｄフラグメント（ＶＨ－ＣＨ１）および軽鎖（ＶＬ－ＣＬ）がＰＣＲによって別々にクローニングされ、コンビナトリアルファージディスプレイライブラリー中で無作為に組み換えられ、その後、特定の抗原への結合について選択され得る。Ｆａｂフラグメントはファージ表面上で発現される、すなわち、それらをコードする遺伝子に物理的に連結される。したがって、抗原結合によるＦａｂの選択は、Ｆａｂをコードする配列を共選択し、その後増幅することができる。数ラウンドの抗原結合および再増幅によって、パンニングと呼ばれる手順によって、抗原に特異的なＦａｂが濃縮され、最終的に単離される。
ファージディスプレイライブラリーに由来するヒト抗体について、様々な手順が記載されている。そのようなライブラリーは、Ｃａｒｌｓｓｏｎ ａｎｄ Ｓｏｅｄｅｒｌｉｎｄ Ｅｘｐ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｄｉａｇｎ．１（１）、１０２－１０８ （２００１）、Ｓｏｅｄｅｒｌｉｎら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１８、８５２－８５６（２０００）および米国特許第６，９８９，２５０号によって記載されるように、多様なインビボで形成された（すなわち、ヒト由来の）ＣＤＲを組み換えることができる単一のマスターフレームワーク上に構築することができる。あるいは、そのような抗体ライブラリーは、インシリコで設計され、合成的に作製される核酸によってコードされるアミノ酸配列に基づき得る。抗体配列のインシリコ設計は例えば、ヒト配列のデータベースを分析し、そこから得られたデータを利用してポリペプチド配列を考案することによって達成される。インシリコで作製された配列を設計および取得するための方法は例えば、Ｋｎａｐｐｉｋら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（２０００）２９６：５７；Ｋｒｅｂｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．（２００１）２５４：６７；および米国特許第６，３００，０６４号に記載されている。ファージディスプレイスクリーニングの概説（例えば、Ｈｏｅｔ ＲＭら、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２００５；２３（３）：３４４－８を参照のこと）については、十分に確立されたハイブリドーマテクノロジー（例えば、Ｋｏｅｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ Ｎａｔｕｒｅ．１９７５ Ａｕｇ ７；２５６（５５１７）：４９５－７を参照のこと）、またはマウスの免疫化、とりわけｈＭＡｂマウスの免疫化（例えば、ＶｅｌｏｃＩｍｍｕｎｅ ｍｏｕｓｅ（登録商標））。
本明細書で使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均質な抗体の集団から得られる抗体を指し、すなわち、その集団を含む個々の抗体は、少量で存在し得る可能な変異、例えば、天然に存在する変異を除いて同一である。したがって、用語「モノクローナル」は、別個の抗体の混合物ではない抗体の特徴を示す。異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を典型的に含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対するものである。それらの特異性に加えて、モノクローナル抗体調製物は、典型的には他の免疫グロブリンによって汚染されないという点で有利である。用語「モノクローナル」は、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とすると解釈されるべきではない。例えば、使用されるモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ、２５６：４９５［１９７５］によって最初に記載されたハイブリドーマ法によって作製され得るか、または組換えＤＮＡ法によって作製され得る（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照されたい）。「モノクローナル抗体」はまた、例えば、組換え、キメラ、ヒト化、ヒト、Ｈｕｍａｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ（商標）、または抗体フラグメントであってもよい。
「単離された」抗体は、それを発現した細胞の成分から同定され、分離されたものである。細胞の汚染成分は、抗体の診断的または治療的使用を妨害する材料であり、酵素、ホルモン、および他のタンパク質性または非タンパク質性溶質を含み得る。
「単離された」核酸は、その自然環境の成分から同定され、分離されたものである。単離された核酸は、核酸分子を通常含む細胞に含まれる核酸分子を含むが、核酸分子は染色体外またはその天然の染色体位置とは異なる染色体位置に存在する。
本明細書中で使用される場合、抗体は、関心対象の抗原、例えばＡ２ＡＰ「に特異的に結合し」、「に特異的であり」、または「を特異的に認識する」ものであり、十分な親和性で抗原に結合するものであり、そのため、抗体は、抗原を発現する細胞または組織を標的とする際に治療薬として有用であり、前述の抗原標的のオルソログおよび変異体（例えば、変異体形態、スプライス変異体、またはタンパク質分解的に切断された形態）以外のタンパク質と有意に交差反応しない。本明細書で使用される特定のポリペプチドまたは特定のポリペプチド標的上のエピトープ「を特異的に認識する」または「に特異的に結合する」または「に特異的である」という用語は、例えば、約１０－４Ｍ未満、あるいは約１０－５Ｍ未満、あるいは約１０－６Ｍ未満、あるいは約１０－７Ｍ未満、あるいは約１０－８Ｍ未満、あるいは約１０－９Ｍ未満、あるいは約１０－１０Ｍ未満、あるいは約１０－１１Ｍ未満、あるいは約１０－１２Ｍ未満、またはそれ未満の抗原に対する一価ＫＤを有する、抗体またはその抗原結合フラグメントによって示すことができる。そのような抗体がそのような抗原と１つまたは複数の参照抗原とを区別することができる場合、抗体は、抗原「に特異的に結合する」、「に特異的である」、または「を特異的に認識する」。その最も一般的な形態において、「特異的結合」、「に特異的に結合する」、「に特異的である」、または「特異的に認識する」は例えば、以下の方法の１つに従って決定されるように、目的の抗原と無関係の抗原とを区別する抗体の能力を指す。そのような方法は限定されるものではないが、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ－、ＲＩＡ－、ＥＣＬ－、ＩＲＭＡ－試験およびペプチドスキャンを含む。例えば、標準的なＥＬＩＳＡアッセイを行うことができる。スコアリングは標準的な発色によって行うことができる（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼとの二次抗体および過酸化水素とのテトラメチルベンジジン）。特定のウェルにおける反応は光学密度、例えば、４５０ｎｍでスコアリングされる。典型的なバックグラウンド（＝陰性反応）は０．１ＯＤであり得；典型的な陽性反応は１ＯＤであり得る。これは、正／負の差異が５倍超、１０倍超、５０倍超、好ましくは１００倍超であることを意味する。典型的には、結合特異性の決定は、単一の参照抗原ではなく、粉乳、ＢＳＡ、トランスフェリンなどの約３～５個の無関係の抗原のセットを使用することによって行われる。
「結合親和性」または「親和性」は、分子の単一の結合部位とその結合パートナーとの間の非共有相互作用の総和の強度を指す。特に明記しない限り、本明細書で使用する場合、「結合親和性」は結合対（例えば、抗体と抗原）のメンバー間の１：１相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。解離定数「ＫＤ」は一般に、分子（抗体など）とその結合相手（抗原など）との間の親和性、すなわち、リガンドが特定の蛋白質にどの程度強く結合するかを記述するために使用される。リガンド－タンパク質親和性は、２つの分子間の非共有結合性分子間相互作用によって影響を受ける。親和性は、本明細書に記載のものを含む、当技術分野で公知の一般的な方法によって測定することができる。一実施形態において、本発明による「ＫＤ」または「ＫＤ値」は、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００機器（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉａｃｏｒｅ、Ｉｎｃ）を使用する表面プラズモン共鳴アッセイを使用して測定される。他の好適なデバイスは、ＢＩＡＣＯＲＥ Ｔ１００、ＢＩＡＣＯＲＥ（Ｒ）－２０００、ＢＩＡＣＯＲｅ ４０００、ＢＩＡＣＯＲＥ（Ｒ）－３０００（ＢＩＡｃｏｒｅ、Ｉｎｃ．、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）、またはＰｒｏｔｅＯｎ ＸＰＲ３６機器（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ．）である。
本明細書で使用される場合、「エピトープ」という用語は、免疫グロブリンまたはＴ細胞受容体に特異的に結合することができる任意のタンパク質決定基を含む。エピトープ決定基は通常、アミノ酸もしくは糖側鎖、またはそれらの組み合わせなどの分子の化学的に活性な表面グルーピングからなり、通常、特定の三次元構造特性、ならびに特定の電荷特性を有する。
参照抗体と「同じエピトープに結合する抗体」または参照抗体と「結合について競合する抗体」とは、競合アッセイにおいて参照抗体のその抗原への結合を１０％、２０％、３０％、４０％、５０％またはそれ以上遮断し、逆に、参照抗体は競合アッセイにおいてその抗原への抗体の結合を１０％、２０％、３０％、４０％、５０％またはそれ以上遮断する抗体を指す。
「成熟抗体」または「成熟抗原結合フラグメント」、例えば成熟Ｆａｂ変異体または「最適化された」変異体という用語は、標的タンパク質の細胞外ドメインなどの所与の抗原に対するより強い結合（すなわち、増加した親和性を有する結合）を示す抗体または抗体フラグメントの誘導体を含む。成熟は、この親和性の増加をもたらす、抗体または抗体フラグメントの６つのＣＤＲ内の少数の突然変異を同定するプロセスである。成熟プロセスは、抗体への突然変異の導入および改善された結合剤を同定するためのスクリーニングのための分子生物学的方法の組み合わせである。
参照ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列に関する「配列同一性パーセント（％）」はそれぞれ、最大の配列同一性パーセントを達成するために、配列をアラインさせ、必要に応じてギャップを導入した後の、参照ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列のそれぞれの中の、核酸またはアミノ酸残基とそれぞれ同一である候補配列中の、核酸またはアミノ酸残基それぞれのパーセンテージとして定義される。保存的置換は、配列同一性の一部とはみなされない。ギャップなしアライメントが好ましい。アミノ酸配列同一性パーセントを決定する目的でのアラインメントは、当業者の範囲内の様々な方法で、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮまたはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの公的に利用可能なコンピュータソフトウェアを使用して達成することができる。当業者は、比較される配列の全長にわたって最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、配列をアラインするための適切なパラメータを決定することができる。
「配列相同性」は、同一であるか、または保存的アミノ酸置換を表すアミノ酸のパーセンテージを示す。
「アンタゴニスト」抗体または「遮断」抗体は、それが結合する抗原の生物学的活性を有意に（部分的にまたは完全に）阻害するものである。特定の実施形態において、本発明による抗体または抗原結合フラグメントは、Ａ２ＡＰ遮断抗体または抗原結合フラグメントである。
「抗体コンジュゲート」という用語は、薬物を含む１つまたは複数の分子にコンジュゲートした抗体を指し、この場合、抗体コンジュゲートは、「抗体－薬物コンジュゲート」（「ＡＤＣ」）と呼ばれ、およびペプチドまたはタンパク質などの高分子量分子にコンジュゲートした抗体を指す。
アミノ酸は、本明細書では、一般に知られている３文字記号またはＩＵＰＡＣ－ＩＵＢ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎによって推奨される１文字記号によって言及され得る。同様に、ヌクレオチドは、それらの一般的に受け入れられている一文字コードによって言及され得る。
「ベクター」という用語は、本明細書で使用される場合、それが連結されている別の核酸を増殖させることができる核酸分子を指す。この用語は、自己複製核酸構造としてのベクター、ならびにそれが導入された宿主細胞のゲノムに組み込まれたベクターを含む。特定のベクターは、それらが作動可能なように連結されている核酸の発現を指令することができる。このようなベクターは、本明細書において「発現ベクター」と称される。
「宿主細胞」、「宿主細胞株」、および「宿主細胞培養物」という用語は、互換的に使用され、少なくとも１つの外因性核酸が導入された細胞を指し、そのような細胞の子孫を含む。宿主細胞は、「形質転換体」および「形質転換細胞」、「形質移入体」および「形質移入細胞」および「形質導入細胞」を含み、継代数に関係なく、初代形質転換／形質移入／形質導入細胞およびそれに由来する子孫を含む。子孫は核酸含量が親細胞と完全に同一ではない場合があるが、突然変異を含み得る。最初に形質転換された細胞においてスクリーニングまたは選択されたものと同じ機能または生物学的活性を有する突然変異子孫が、本明細書に含まれる。
本明細書で使用される場合、「治療有効量」という語句は、所望の治療レジメンに従って投与された場合に、疾患のそのような症状の一部またはすべてを軽減することまたは疾患の素因を低減することを含む、所望の治療または予防効果または応答を誘発するのに適切であろう治療または予防抗体の量を指すことを意味する。
「医薬製剤」／「医薬組成物」という用語は、その中に含有される活性成分の生物学的活性が有効であることを可能にするような形態であり、製剤が投与される被験体に対して許容できないほど毒性である追加の成分を含有しない製剤を指す。
本発明による抗体
一態様において、本発明は、ヒトＡ２ＡＰに結合する単離された抗体またはその抗原結合フラグメントに関し、ここで、前記単離された抗体またはその抗原結合フラグメントはウサギおよび／またはカニクイザルＡ２ＡＰと交差反応する。特定の実施形態において、本発明による単離された抗体または抗原結合フラグメントは、ヒトＡ２ＡＰに対する親和性とは１００倍未満、特に３０倍未満、さらにより具体的には１５倍未満、最も具体的には５倍未満異なるウサギＡ２ＡＰに対する親和性を有する。特にそのような実施形態において、前記親和性は、配列番号１のアミノ酸４０～４９１のヒトＡ２ＡＰおよび配列番号２のアミノ酸２８～４９１のウサギＡ２ＡＰに対するものである。特定の実施形態において、本発明による単離された抗体または抗原結合フラグメントは、ヒトＡ２ＡＰに対する親和性とは１００倍未満、特に３０倍未満、さらにより具体的には１５倍未満、最も具体的には５倍未満異なるカニクイザルＡ２ＡＰに対する親和性を有する。特にそのような実施形態において、前記親和性は、配列番号１のアミノ酸４０～４９１のヒトＡ２ＡＰおよび配列番号３のアミノ酸２８～４９１のカニクイザルＡ２ＡＰに対するものである。
別の態様において、本発明は、ヒトＡ２ＡＰに結合することができ、Ａ２ＡＰの活性を阻害することができる単離された抗体またはその抗原結合フラグメントに関し、ここで、前記単離された抗体またはその抗原結合フラグメントはプラスミン活性を阻害しない。
特定の実施形態において、本発明による前記単離された抗体またはその抗原結合フラグメントは、Ａ２ＡＰのプラスミンへの結合を防止することによってＡ２ＡＰの活性を阻害する。
Ａ２ＡＰの内因性血漿濃度が比較的高い（それぞれ１μＭ；および７０μｇ／ｍｌ）という事実により、Ａ２ＡＰ活性を遮断するために高濃度の中和抗体が必要とされる。したがって、Ａ２ＡＰ抗体が、高濃度の抗体までプラスミン活性を阻害しないのであれば有利である。驚くべきことに、本発明による単離された抗体またはその抗原結合フラグメントは、インビトロプラスミン阻害アッセイにおいて１０μＭの濃度までプラスミン活性を阻害しなかったが、抗体７７Ａ３は同じアッセイにおいて１．７μＭのＩＣ５０でプラスミン活性を阻害した（実施例１１、図１６を参照されたい）。
特定の実施形態において、本発明による前記単離された抗体またはその抗原結合フラグメントは、ヒトプラスミン、特に配列番号１１８（プラスミン重鎖Ａ）および配列番号１１９（プラスミン軽鎖Ｂ）を含むヒトプラスミンの活性を、高マイクロモル濃度で存在する場合であっても阻害しない。
特定の実施形態において、本発明による前記単離された抗体またはその抗原結合フラグメントは、インビトロプラスミン阻害アッセイにおいて、１μＭ、２μＭ、５μＭまたは１０μＭの前記単離された抗体またはその抗原結合フラグメントの濃度（ｃｏｎｃｅｒｔａｔｉｏｎ）までプラスミン活性を阻害しない。
特定の実施形態において、本発明による前記単離された抗体またはその抗原結合フラグメントは、インビトロプラスミン阻害アッセイにおいて、１μＭ、２μＭ、５μＭまたは１０μＭの前記単離された抗体またはその抗原結合フラグメントの濃度（ｃｏｎｃｅｒｔａｔｉｏｎ）までプラスミン活性を阻害せず、ここで、インビトロプラスミン阻害アッセイは、プラスミンのタンパク質分解活性の阻害を決定する。
そのようなインビトロプラスミン阻害アッセイは、実施例１１に記載されるように、プラスミンのタンパク質分解活性の阻害を決定するアッセイであり得る。そのようなアッセイのために、プラスミンおよび蛍光発生基質Ｉ－１２７５（Ｂａｃｈｅｍ；ＭｅＯＳｕｃ－Ａｌａ－Ｐｈｅ－Ｌｙｓ－ＡＭＣトリフルオロアセテート塩；カタログ番号Ｉ－１２７５）のようなプラスミンタンパク質分解活性のための標識基質を使用することができる。
別の態様において、本発明は、ヒトＡ２ＡＰに結合し、Ａ２ＡＰの活性を阻害することができる単離された抗体またはその抗原結合フラグメントに関し、ここで、前記単離された抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号１のアミノ酸４０２～４０８（ＳＲＭＳＬＳＳ）を含むＡ２ＡＰのエピトープに結合する。
Ａ２ＡＰは、Ａ２ＡＰの反応中心ループ（配列番号１のアミノ酸４００～４１２）に位置するアミノ酸配列ＳＲＭＳＬＳＳ（配列番号１のアミノ酸４０２～４０８）を含む。特定の実施形態において、本発明による前記単離された抗体またはその抗原結合フラグメントは、ヒトＡ２ＡＰに結合し、Ａ２ＡＰの活性を阻害することができ、ここで、前記単離された抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号１のアミノ酸４０２～４０８（ＳＲＭＳＬＳＳ）を含むＡ２ＡＰのエピトープに結合し、前記単離された抗体またはその抗原結合フラグメントは、プラスミン活性を阻害しない。
特定の実施形態において、本発明による前記単離された抗体またはその抗原結合フラグメントは、ヒトＡ２ＡＰに結合し、Ａ２ＡＰの活性を阻害することができ、ここで、前記単離された抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号１のアミノ酸４０２～４０８（ＳＲＭＳＬＳＳ）を含むＡ２ＡＰのエピトープに結合し、前記単離された抗体またはその抗原結合フラグメントは、インビトロプラスミン阻害アッセイにおいて、１μＭ、２μＭ、５μＭまたは１０μＭの前記単離された抗体またはその抗原結合フラグメントの濃度（ｃｏｎｃｅｒｔａｔｉｏｎ）まで、プラスミン活性を阻害しない。
別の態様において、本発明がヒトＡ２ＡＰに結合する単離された抗体またはその抗原結合フラグメントに関し、ここで、前記単離された抗体またはその抗原結合フラグメントは、Ａ２ＡＰをセリンプロテアーゼ阻害剤からセリンプロテアーゼ基質に変換しない。
別の態様において、本発明は、ヒトＡ２ＡＰに結合する単離された抗体またはその抗原結合フラグメントに関し、ここで、配列番号１のアミノ酸４０～４９１の配列のヒトＡ２ＡＰに、解離定数（ＫＤ）≦１００ｎＭ、≦５０ｎＭ、≦２５ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、または≦０．５ｎＭで結合する単離された抗体またはその抗原結合フラグメントに関する。
別の態様において、本発明は、ヒトＡ２ＡＰに結合する単離された抗体またはその抗原結合フラグメントに関し、ここで、前記単離された抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号１のアミノ酸４０～４９１の配列のヒトＡ２ＡＰに、≦５００ｎＭ、≦２５０ｎＭ、≦１００ｎＭ、≦５０ｎＭ、≦２５ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、または≦０．５ｎＭのＥＣ５０で結合する。
別の態様において、本発明は、ヒトＡ２ＡＰに結合する単離された抗体またはその抗原結合フラグメントに関し、ここで、前記単離された抗体またはその抗原結合フラグメントは、インビトロＡ２ＡＰ機能遮断アッセイにおいて、配列番号１のアミノ酸４０～４９１のヒトＡ２ＡＰの活性を、≦５００ｎＭ、≦２５０ｎＭ、≦１００ｎＭ、≦５０ｎＭ、≦２５ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、または≦０．５ｎＭのＥＣ５０で阻害する。
インビトロＡ２ＡＰ機能遮断アッセイは、実施例４に記載されるようなアッセイであり得る。このようなアッセイでは、試験抗体をＡ２ＡＰとプレインキュベートする。プラスミン、トリプシンまたはキモトリプシンなどのＡ２ＡＰ基質をアッセイに添加した後、添加したＡ２ＡＰ基質の活性（Ａ２ＡＰによって遮断されない）を、例えば、Ａ２ＡＰ基質のための標識基質の使用によって分析することができる。例えば、プラスミン（Ａ２ＡＰ基質）については、蛍光基質Ｉ－１２７５（Ｂａｃｈｅｍ；ＭｅＯＳｕｃ－Ａｌａ－Ｐｈｅ－Ｌｙｓ－ＡＭＣトリフルオロアセテート塩；カタログ番号Ｉ－１２７５）を使用することができる。
特定の実施形態において、本発明による前記単離された抗体またはその抗原結合フラグメントは、
（ｉ）解離定数（ＫＤ）≦１００ｎＭ、≦５０ｎＭ、≦２５ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、または≦０．５ｎＭで、配列番号１のアミノ酸４０～４９１の配列のヒトＡ２ＡＰに結合し；および
（ｉｉ）インビトロＡ２ＡＰ機能遮断アッセイにおいて、配列番号１のアミノ酸４０～４９１のヒトＡ２ＡＰの活性を、≦５００ｎＭ、≦２５０ｎＭ、≦１００ｎＭ、≦５０ｎＭ、≦２５ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、または≦０．５ｎＭのＥＣ５０で阻害する。
別の態様において、本発明は、ヒトＡ２ＡＰに結合する単離された抗体またはその抗原結合フラグメントに関し、ここで、前記単離された抗体またはその抗原結合フラグメントは、Ａ２ＡＰの存在下でプラスミン媒介性血餅溶解を増加させる。特に、本発明による単離された抗体または抗原結合フラグメントは、インビトロおよび／またはインビボでのプラスミン媒介性血餅溶解を増加させる。インビトロでプラスミン媒介性血餅溶解を増加させる抗体の能力は、実施例７に記載されるように評価され得る。インビボでプラスミン媒介性血餅溶解を増加させる抗体の能力は、実施例８に記載されるように評価され得る。
本発明による単離された抗体または抗原結合フラグメントは、上記の特徴の任意の組み合わせを示し得る。
特定の実施形態において、本発明による単離された抗体または抗原結合フラグメントは、Ａ２ＡＰとプラスミンとの相互作用、特にヒトＡ２ＡＰとヒトプラスミンとの相互作用、特に配列番号１のアミノ酸４０～４９１のヒトＡ２ＡＰとヒトプラスミン、特に配列番号１１８（プラスミン重鎖Ａ）および配列番号１１９（プラスミン軽鎖Ｂ）を含むヒトプラスミンとの相互作用を妨害する。特に、本発明による抗体または抗原結合フラグメントは、Ａ２ＡＰ遮断抗体または抗原結合フラグメントである。
特定の実施形態において、本発明による単離された抗体または抗原結合フラグメントは、配列番号３２と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一である重鎖可変ドメインを含む。特定の実施形態において、本発明による単離された抗体または抗原結合フラグメントは、配列番号３８と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一である軽鎖可変ドメインを含む。特定の実施形態において、本発明による単離された抗体または抗原結合フラグメントは、配列番号３２と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一である重鎖可変ドメインと、配列番号３８と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一である軽鎖可変ドメインとを含む。
特定の実施形態において、本発明による単離された抗体または抗原結合フラグメントは、配列ＥＸ１ＹＤＳＳＧＹＹＨＬＸ２Ｙ（配列番号４）を含むＨ－ＣＤＲ３を含む重鎖抗原結合領域を含み、ここで、Ｘ１は、Ｙ、ＤおよびＧからなる群から選択され、Ｘ２は、Ｄ、Ｖ、ＥおよびＴからなる群から選択される。特定の実施形態において、Ｘ１は、ＤおよびＧからなる群から選択され、Ｘ２は、Ｖ、ＥおよびＴからなる群から選択される。
特定の実施形態において、本発明による単離された抗体または抗原結合フラグメントが配列Ｘ１ＡＷＤＸ２ＳＬＳＧＷＶ（配列番号５）を含むＬ－ＣＤＲ３を含む軽鎖抗原結合領域を含み、ここで、Ｘ１は、ＡおよびＷからなる群から選択され、Ｘ２は、Ｄ、Ｎ、Ｌ、ＷおよびＶからなる群から選択される。特定の実施形態において、Ｘ１は、Ｗからなる群から選択され、Ｘ２は、Ｎ、Ｌ、ＷおよびＶからなる群から選択される。
特に、本発明による単離された抗体または抗原結合フラグメントは、ｉ）配列ＥＸ１ＹＤＳＳＧＹＹＨＬＸ２Ｙ（配列番号４）を含むＨ－ＣＤＲ３を含む重鎖抗原結合領域を含み、ここで、Ｘ１は、Ｙ、ＤおよびＧからなる群から選択され、Ｘ２は、Ｄ、Ｖ、ＥおよびＴからなる群から選択され、およびｉｉ）配列Ｘ１ＡＷＤＸ２ＳＬＳＧＷＶ（配列番号５）を含むＬ－ＣＤＲ３を含む軽鎖抗原結合領域を含み、ここで、Ｘ１は、ＡおよびＷからなる群から選択され、Ｘ２は、Ｄ、Ｎ、Ｌ、ＷおよびＶからなる群から選択される。
特定の実施形態において、Ｈ－ＣＤＲ３領域の５’末端に直接隣接する２つのフレームワーク残基Ｘ１Ｘ２（配列番号３２の参照ＶＨドメインの残基９６［Ｘ１］および９７［Ｘ２］に対応する）は、以下のように選択される：Ｘ１は、ＡおよびＤからなる群から選択され、特にＸ１は、Ｄであり、およびＸ２は、ＲおよびＳからなる群から選択され、特にＸ２は、Ｓである。
特定の実施形態において、本発明による単離された抗体または抗原結合フラグメントは、配列番号６または配列番号２１を含むＨ－ＣＤＲ１および配列番号７、配列番号８または配列番号２２を含むＨ－ＣＤＲ２を含む重鎖抗原結合領域を含む。特定の実施形態において、本発明による単離された抗体または抗原結合フラグメントは、配列番号９を含むＬ－ＣＤＲ１および配列番号１０を含むＬ－ＣＤＲ２を含む軽鎖抗原結合領域を含む。
特定の実施形態において、本発明による単離された抗体または抗原結合フラグメントは、
ｉ）配列番号１３を含むＨ－ＣＤＲ３を含む重鎖抗原結合領域および配列番号１８を含むＬ－ＣＤＲ３を含む軽鎖抗原結合領域、または
ｉｉ）配列番号１１を含むＨ－ＣＤＲ３を含む重鎖抗原結合領域および配列番号１７を含むＬ－ＣＤＲ３を含む軽鎖抗原結合領域、または
ｉｉｉ）配列番号１１を含むＨ－ＣＤＲ３を含む重鎖抗原結合領域および配列番号１８を含むＬ－ＣＤＲ３を含む軽鎖抗原結合領域、または
ｉｖ）配列番号１２を含むＨ－ＣＤＲ３を含む重鎖抗原結合領域および配列番号１８を含むＬ－ＣＤＲ３を含む軽鎖抗原結合領域、または
ｖ）配列番号１３を含むＨ－ＣＤＲ３を含む重鎖抗原結合領域および配列番号１９を含むＬ－ＣＤＲ３を含む軽鎖抗原結合領域、または
ｖｉ）配列番号１３を含むＨ－ＣＤＲ３を含む重鎖抗原結合領域および配列番号１８を含むＬ－ＣＤＲ３を含む軽鎖抗原結合領域、または
ｖｉｉ）配列番号１４を含むＨ－ＣＤＲ３を含む重鎖抗原結合領域および配列番号１８を含むＬ－ＣＤＲ３を含む軽鎖抗原結合領域、または
ｖｉｉｉ）配列番号１４を含むＨ－ＣＤＲ３を含む重鎖抗原結合領域および配列番号２０を含むＬ－ＣＤＲ３を含む軽鎖抗原結合領域、または
ｉｘ）配列番号１５を含むＨ－ＣＤＲ３を含む重鎖抗原結合領域および配列番号１８を含むＬ－ＣＤＲ３を含む軽鎖抗原結合領域、または
ｘ）配列番号１６を含むＨ－ＣＤＲ３を含む重鎖抗原結合領域および配列番号１８を含むＬ－ＣＤＲ３を含む軽鎖抗原結合領域
を含む。
特定の実施形態において、本発明による単離された抗体または抗原結合フラグメントは：
ｉ）配列番号６を含むＨ－ＣＤＲ１、配列番号８を含むＨ－ＣＤＲ２、および配列番号１３を含むＨ－ＣＤＲ３を含む重鎖抗原結合領域、ならびに配列番号９を含むＬ－ＣＤＲ１、配列番号１０を含むＬ－ＣＤＲ２、および配列番号１８を含むＬ－ＣＤＲ３を含む軽鎖抗原結合領域、または
ｉｉ）配列番号６を含むＨ－ＣＤＲ１、配列番号７を含むＨ－ＣＤＲ２、および配列番号１３を含むＨ－ＣＤＲ３を含む重鎖抗原結合領域、ならびに配列番号９を含むＬ－ＣＤＲ１、配列番号１０を含むＬ－ＣＤＲ２、および配列番号１８を含むＬ－ＣＤＲ３を含む軽鎖抗原結合領域、または
ｉｉｉ）配列番号６を含むＨ－ＣＤＲ１、配列番号７を含むＨ－ＣＤＲ２、および配列番号１１を含むＨ－ＣＤＲ３を含む重鎖抗原結合領域、ならびに配列番号９を含むＬ－ＣＤＲ１、配列番号１０を含むＬ－ＣＤＲ２、および配列番号１７を含むＬ－ＣＤＲ３を含む軽鎖抗原結合領域、または
ｉｖ）配列番号６を含むＨ－ＣＤＲ１、配列番号７を含むＨ－ＣＤＲ２、および配列番号１１を含むＨ－ＣＤＲ３を含む重鎖抗原結合領域、ならびに配列番号９を含むＬ－ＣＤＲ１、配列番号１０を含むＬ－ＣＤＲ２、および配列番号１８を含むＬ－ＣＤＲ３を含む軽鎖抗原結合領域、または
ｖ）配列番号６を含むＨ－ＣＤＲ１、配列番号７を含むＨ－ＣＤＲ２、および配列番号１２を含むＨ－ＣＤＲ３を含む重鎖抗原結合領域、ならびに配列番号９を含むＬ－ＣＤＲ１、配列番号１０を含むＬ－ＣＤＲ２、および配列番号１８を含むＬ－ＣＤＲ３を含む軽鎖抗原結合領域、または
ｖｉ）配列番号６を含むＨ－ＣＤＲ１、配列番号７を含むＨ－ＣＤＲ２、および配列番号１３を含むＨ－ＣＤＲ３を含む重鎖抗原結合領域、ならびに配列番号９を含むＬ－ＣＤＲ１、配列番号１０を含むＬ－ＣＤＲ２、および配列番号１９を含むＬ－ＣＤＲ３を含む軽鎖抗原結合領域、または
ｖｉｉ）配列番号６を含むＨ－ＣＤＲ１、配列番号７を含むＨ－ＣＤＲ２、および配列番号１４を含むＨ－ＣＤＲ３を含む重鎖抗原結合領域、ならびに配列番号９を含むＬ－ＣＤＲ１、配列番号１０を含むＬ－ＣＤＲ２、および配列番号１８を含むＬ－ＣＤＲ３を含む軽鎖抗原結合領域、または
ｖｉｉｉ）配列番号６を含むＨ－ＣＤＲ１、配列番号７を含むＨ－ＣＤＲ２、および配列番号１４を含むＨ－ＣＤＲ３を含む重鎖抗原結合領域、ならびに配列番号９を含むＬ－ＣＤＲ１、配列番号１０を含むＬ－ＣＤＲ２、および配列番号２０を含むＬ－ＣＤＲ３を含む軽鎖抗原結合領域、または
ｉｘ）配列番号６を含むＨ－ＣＤＲ１、配列番号７を含むＨ－ＣＤＲ２、および配列番号１５を含むＨ－ＣＤＲ３を含む重鎖抗原結合領域、ならびに配列番号９を含むＬ－ＣＤＲ１、配列番号１０を含むＬ－ＣＤＲ２、および配列番号１８を含むＬ－ＣＤＲ３を含む軽鎖抗原結合領域、または
ｘ）配列番号６を含むＨ－ＣＤＲ１、配列番号７を含むＨ－ＣＤＲ２、および配列番号１６を含むＨ－ＣＤＲ３を含む重鎖抗原結合領域、ならびに配列番号９を含むＬ－ＣＤＲ１、配列番号１０を含むＬ－ＣＤＲ２、および配列番号１８を含むＬ－ＣＤＲ３を含む軽鎖抗原結合領域、または
ｘｉ）配列番号２１を含むＨ－ＣＤＲ１、配列番号８を含むＨ－ＣＤＲ２、および配列番号１３を含むＨ－ＣＤＲ３を含む重鎖抗原結合領域、ならびに配列番号９を含むＬ－ＣＤＲ１、配列番号１０を含むＬ－ＣＤＲ２、および配列番号１８を含むＬ－ＣＤＲ３を含む軽鎖抗原結合領域、または
ｘｉｉ）配列番号６を含むＨ－ＣＤＲ１、配列番号２２を含むＨ－ＣＤＲ２、および配列番号１３を含むＨ－ＣＤＲ３を含む重鎖抗原結合領域、ならびに配列番号９を含むＬ－ＣＤＲ１、配列番号１０を含むＬ－ＣＤＲ２、および配列番号１８を含むＬ－ＣＤＲ３を含む軽鎖抗原結合領域を含む。
特定の実施形態において、本発明による単離された抗体または抗原結合フラグメントは、３０Ｓ、３１Ｓ、５３Ｓ、５６Ｓ、９７Ｋからなる群から選択されるＣＤＲ残基および重鎖可変ドメインフレームワークの少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つまたは少なくとも４つまたは少なくとも５つを含む。これらのアミノ酸位置は、配列番号３２の参照重鎖可変ドメインのアミノ酸位置に対応し、フレームワークならびにＨ－ＣＤＲ１およびＨ－ＣＤＲ２アミノ酸残基を含む。
特定の実施形態において、本発明による単離された抗体または抗原結合フラグメントは：
ｉ）配列番号３２を含む可変重鎖ドメインおよび配列番号３８を含む可変軽鎖ドメイン；または
ｉｉ）配列番号２３を含む可変重鎖ドメインおよび配列番号３７を含む可変軽鎖ドメイン；または
ｉｉｉ）配列番号２４を含む可変重鎖ドメインおよび配列番号３８を含む可変軽鎖ドメイン；または
ｉｖ）配列番号２５を含む可変重鎖ドメインおよび配列番号３８を含む可変軽鎖ドメイン；または
ｖ）配列番号２６を含む可変重鎖ドメインおよび配列番号３８を含む可変軽鎖ドメイン；または
ｖｉ）配列番号２７を含む可変重鎖ドメインおよび配列番号３９を含む可変軽鎖ドメイン；または
ｖｉｉ）配列番号２７を含む可変重鎖ドメインおよび配列番号３８を含む可変軽鎖ドメイン；または
ｖｉｉｉ）配列番号２８を含む可変重鎖ドメインおよび配列番号３８を含む可変軽鎖ドメイン；または
ｉｘ）配列番号２８を含む可変重鎖ドメインおよび配列番号４０を含む可変軽鎖ドメイン；または
ｘ）配列番号２９を含む可変重鎖ドメインおよび配列番号３８を含む可変軽鎖ドメイン；または
ｘｉ）配列番号３０を含む可変重鎖ドメインおよび配列番号３８を含む可変軽鎖ドメイン；または
ｘｉｉ）配列番号３１を含む可変重鎖ドメインおよび配列番号３８を含む可変軽鎖ドメイン；または
ｘｉｉｉ）配列番号３３を含む可変重鎖ドメインおよび配列番号３８を含む可変軽鎖ドメイン；または
ｘｉｖ）配列番号３４を含む可変重鎖ドメインおよび配列番号３８を含む可変軽鎖ドメイン；または
ｘｖ）配列番号３５を含む可変重鎖ドメインおよび配列番号３８を含む可変軽鎖ドメイン；または
ｘｖｉ）配列番号３６を含む可変重鎖ドメインおよび配列番号３８を含む可変軽鎖ドメイン
を含む。
特定の実施形態において、本発明による単離された抗体は、ＩｇＧ抗体である。特にそのような実施形態において、本発明による単離された抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４抗体である。最も具体的には、本発明による単離された抗体は、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４抗体である。
特定の実施形態において、本発明による単離された抗体は：
ｉ）配列番号５５を含む重鎖および配列番号５７を含む軽鎖；または
ｉｉ）配列番号４１を含む重鎖および配列番号５６を含む軽鎖；または
ｉｉｉ）配列番号４２を含む重鎖および配列番号５７を含む軽鎖；または
ｉｖ）配列番号４３を含む重鎖および配列番号５７を含む軽鎖；または
ｖ）配列番号４４を含む重鎖および配列番号５７を含む軽鎖；または
ｖｉ）配列番号４５を含む重鎖および配列番号５８を含む軽鎖；または
ｖｉｉ）配列番号４５を含む重鎖および配列番号５７を含む軽鎖；または
ｖｉｉｉ）配列番号４６を含む重鎖および配列番号５７を含む軽鎖；または
ｉｘ）配列番号４６を含む重鎖および配列番号５９を含む軽鎖；または
ｘ）配列番号４７を含む重鎖および配列番号５７を含む軽鎖；または
ｘｉ）配列番号４８を含む重鎖および配列番号５７を含む軽鎖；または
ｘｉｉ）配列番号４９を含む重鎖および配列番号５７を含む軽鎖；または
ｘｉｉｉ）配列番号５０を含む重鎖および配列番号５７を含む軽鎖；または
ｘｉｖ）配列番号５１を含む重鎖および配列番号５７を含む軽鎖；または
ｘｖ）配列番号５２を含む重鎖および配列番号５７を含む軽鎖；または
ｘｖｉ）配列番号５３を含む重鎖および配列番号５７を含む軽鎖；または
ｘｖｉｉ）配列番号５４を含む重鎖および配列番号５７を含む軽鎖
を含む。
特定の実施形態において、本発明による抗原結合フラグメントは、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’フラグメントまたはＦ（ａｂ’）２フラグメントである。
特定の実施形態において、本発明による単離された抗体または抗原結合フラグメントは、モノクローナル抗体または抗原結合フラグメントである。
特定の実施形態において、本発明による単離された抗体または抗原結合フラグメントは、ヒト、ヒト化またはキメラ抗体または抗原結合フラグメント、より具体的には完全ヒト抗体または抗原結合フラグメントである。
特定の実施形態において、本発明による単離された抗体または抗原結合フラグメントは、単一特異性抗体である。特定の他の実施形態において、本発明による単離された抗体または抗原結合フラグメントは、Ａ２ＡＰおよび少なくとも１つのさらなる抗原に結合する多重特異性抗体、例えば二重特異性、三重特異性または四重特異性抗体である。
さらなる態様において、本発明は、Ａ２ＡＰへの結合について、本発明による単離された抗体または抗原結合フラグメントと競合する、単離された抗体またはその抗原結合フラグメントに関する。
本発明による好ましい抗体のアミノ酸配列を表１に列挙する。
表１：本発明による好ましい抗体のアミノ酸配列
Figure 2023541179000003
Figure 2023541179000004
本発明による好ましい抗体の核酸配列を表２に列挙する。
表２：本発明による好ましい抗体の核酸配列
Figure 2023541179000005
Figure 2023541179000006
ペプチド変異体
本発明の抗体または抗原結合フラグメントは、本明細書に提供される特定のペプチド配列に限定されない。むしろ、本発明は、これらのポリペプチドの変異体も具体化する。本開示および従来利用可能な技術および参考文献を参照すると、当業者は、本明細書に開示される抗体の機能的変異体を調製し、試験し、利用することができ、一方で、Ａ２ＡＰに結合する能力を有するこれらの変異体が本発明の範囲内にあることを認識するであろう。
変異体は例えば、本明細書に開示されるペプチド配列に対して、少なくとも１つの変更された相補性決定領域（ＣＤＲ）（超可変）および／またはフレームワーク（ＦＲ）（可変）ドメイン／位置を有する抗体を含むことができる。
ＣＤＲまたはＦＲ領域中の１つまたは複数のアミノ酸残基を変更することによって、当業者は例えば、突然変異または多様化された抗体配列を日常的に生成することができ、それらは、新規または改善された特性について、抗原に対してスクリーニングすることができる。
本発明のさらに好ましい実施形態は、ＶＨおよびＶＬ配列が表１に示されるように選択される抗体または抗原結合フラグメントである。当業者は、表１のデータを使用して、本発明の範囲内にあるペプチド変異体を設計することができる。変異体は、１つまたは複数のＣＤＲ領域内のアミノ酸を変化させることによって構築されることが好ましく；変異体はまた、１つまたは複数の変更したフレームワーク領域を有し得る。フレームワーク領域に変更を加えてもよい。例えば、ペプチドＦＲドメインは、生殖系列配列と比較して残基に偏差がある場合に変更され得る。
あるいは、当業者は例えば、Ｋｎａｐｐｉｋ Ａ．ら、ＪＭＢ ２０００、２９６：５７－８６に記載されている手順を用いて、本明細書に開示されているアミノ酸配列を、そのような抗体の同じクラスの既知の配列と比較することによって、同じ分析を行うことができる。
さらに、変異体は、さらなる最適化のための出発点として１つの抗体を使用することによって、抗体中の１つ以上のアミノ酸残基、好ましくは１つ以上のＣＤＲ中のアミノ酸残基を多様化することによって、および改善された特性を有する変異体について得られた抗体変異体のコレクションをスクリーニングすることによって得ることができる。特に好ましいのは、ＶＬおよび／またはＶＨのＣＤＲ３中の１つまたは複数のアミノ酸残基の多様化である。多様化は例えば、トリヌクレオチド突然変異誘発（ＴＲＩＭ）技術を用いてＤＮＡ分子のコレクションを合成することによって行うことができる（Ｖｉｒｎｅｋａｅｓ Ｂ．ら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９４、２２：５６００）。抗体またはその抗原結合フラグメントは例えば、変更された半減期（例えば、Ｆｃ部分の修飾またはＰＥＧなどのさらなる分子の結合）、変更された結合親和性または変更されたＡＤＣＣもしくはＣＤＣ活性をもたらす修飾を含むが、これらに限定されない修飾／変異を有する分子を含む。
保存的アミノ酸変異体
本明細書に記載の抗体ペプチド配列の全体的な分子構造を保存するポリペプチド変異体を作製することができる。個々のアミノ酸の特性を考慮すると、いくつかの合理的な置換が当業者に認識されるのであろう。アミノ酸置換、すなわち「保存的置換」は例えば、関与する残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、および／または両親媒性の性質の類似性に基づいて行うことができる。
例えば、（ａ）非極性（疎水性）アミノ酸としてはアラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、およびメチオニンが挙げられ；（ｂ）極性中性アミノ酸としてはグリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、およびグルタミンが挙げられ；（ｃ）正に荷電した（塩基性）アミノ酸としてはアルギニン、リシン、およびヒスチジンが挙げられ；ならびに（ｄ）負に荷電した（酸性）アミノ酸としてはアスパラギン酸およびグルタミン酸が挙げられる。置換は、典型的にはグループ（ａ）～（ｄ）内でなされ得る。さらに、グリシンおよびプロリンは、α－ヘリックスを破壊するそれらの能力に基づいて、互いに置換され得る。同様に、特定のアミノ酸、例えば、アラニン、システイン、ロイシン、メチオニン、グルタミン酸、グルタミン、ヒスチジンおよびリシンは、α－ヘリックスにおいてより一般的に見出され、一方、バリン、イソロイシン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファンおよびトレオニンは、β－プリーツシートにおいてより一般的に見出される。グリシン、セリン、アスパラギン酸、アスパラギン、およびプロリンは一般に、交互に見出される。いくつかの好ましい置換は、以下の群の中でなされ得る：（ｉ）ＳおよびＴ；（ｉｉ）ＰおよびＧ；ならびに（ｉｉｉ）Ａ、Ｖ、ＬおよびＩ。公知の遺伝子コード、ならびに組換えおよび合成ＤＮＡ技術を考慮すると、当業者は、保存的アミノ酸変異体をコードするＤＮＡを容易に構築することができる。
グリコシル化変異体
抗体がＦｃ領域を含む場合、それに結合した炭水化物を変更することができる。哺乳動物細胞によって産生される天然抗体は典型的には、Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインのＫａｂａｔ ＥＵナンバリングを使用して、Ａｓｎ２９７にＮ－結合によって一般的に結合される分岐した、二分岐オリゴ糖を含む；例えば、Ｗｒｉｇｈｔら、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５：２６－３２（１９９７）を参照。
ある特定の実施形態において、本明細書で提供される抗体は、抗体がグリコシル化される程度を増加または減少させるように変更される。抗体へのグリコシル化部位の付加または欠失は、発現系（例えば、宿主細胞）を変更することによって、および／または１つ以上のグリコシル化部位が作製または除去されるようにアミノ酸配列を変更することによって、好都合に達成され得る。
本発明の一実施形態において、低下したエフェクター機能を有するアグリコシル抗体または抗体誘導体は、原核生物宿主における発現によって調製される。好適な原核生物宿主としては大腸菌、枯草菌、ネズミチフス菌、ならびにシュードモナス属、ストレプトマイセス属、およびブドウ球菌属内の様々な種が挙げられるが、これらに限定されない。
一実施形態において、低下したエフェクター機能を有する抗体変異体が提供され、これは前記抗体のＦｃ部分のＣＨ２ドメインにおける保存されたＮ結合部位における修飾を特徴とする。本発明の一実施形態において、修飾が重鎖グリコシル化部位に突然変異を含み、その部位でのグリコシル化を防止する。したがって、本発明の１つの好ましい実施形態において、アグリコシル抗体または抗体誘導体は、重鎖グリコシル化部位の突然変異、すなわち、Ｋａｂａｔ ＥＵナンバリングを用いたＮ２９７の突然変異によって調製され、適切な宿主細胞において発現される。
本発明の別の実施形態において、アグリコシル抗体または抗体誘導体は低下したエフェクター機能を有し、ここで、前記抗体または抗体誘導体のＦｃ部分のＣＨ２ドメインにおける保存されたＮ結合部位における修飾は、ＣＨ２ドメイングリカンの除去、すなわち脱グリコシル化を含む。これらのアグリコシル抗体は、従来の方法によって生成され、次いで酵素的に脱グリコシル化され得る。抗体の酵素的脱グリコシル化のための方法は当技術分野において周知である（例えば、Ｗｉｎｋｅｌｈａｋｅ ＆ Ｎｉｃｏｌｓｏｎ（１９７６）、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２５１（４）：１０７４－８０）。
本発明の別の実施形態において、脱グリコシル化は、グリコシル化阻害剤ツニカマイシン（Ｎｏｓｅ ＆ Ｗｉｇｚｅｌｌ（１９８３）、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、８０（２１）：６６３２－６）を用いて達成され得る。すなわち、修飾は、前記抗体のＦｃ部分のＣＨ２ドメインにおける保存されたＮ結合部位におけるグリコシル化の防止である。
一実施形態において、Ｆｃ領域に（直接的または間接的に）結合したフコースを欠く炭水化物構造を有する抗体変異体が提供される。例えば、このような抗体中のフコースの量は、１％～８０％、１％～６５％、５％～６５％または２０％～４０％であり得る。フコースの量は例えば、ＷＯ２００８／０７７５４６に記載されているように、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析によって測定される、Ａｓｎ２９７に結合した全ての糖構造（例えば、複合体、ハイブリッドおよび高マンノース構造）の合計に対する、Ａｓｎ２９７における糖鎖内のフコースの平均量を計算することによって決定される。Ａｓｎ２９７は、Ｆｃ領域中の約２９７位に位置するアスパラギン残基（Ｆｃ領域残基のＥｕナンバリング）を指す；しかしながら、Ａｓｎ２９７は、抗体のわずかな配列変動のために、２９７位の上流または下流約±３アミノ酸、すなわち２９４位と３００位との間にも位置し得る。そのようなフコシル化変異体は、改善されたＡＤＣＣ機能を有し得る。
「脱フコシル化」または「フコース欠損」抗体変異体に関する刊行物の例としては、Ｏｋａｚａｋｉら、Ｊ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３６：１２３９－１２４９（２００４）；Ｙａｍａｎｅ－Ｏｈｎｕｋｉら、Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．８７：６１４（２００４）が挙げられる。
脱フコシル化抗体を産生することができる細胞株の例には、タンパク質フコシル化を欠損するＬｅｃ１３ＣＨＯ細胞（Ｒｉｐｋａら、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２４９：５３３－５４５（１９８６）；およびＷＯ２００４／０５６３１２）、ならびにアルファ－１，６－フコシルトランスフェラーゼ遺伝子、ＦＵＴ８、ノックアウトＣＨＯ細胞などのノックアウト細胞株（例えば、Ｙａｍａｎｅ－Ｏｈｎｕｋｉら、Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．８７：６１４（２００４）；Ｋａｎｄａ、Ｙ．ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．、９４（４）：６８０－６８８（２００６）を参照のこと）が挙げられる。
抗体変異体には、例えば、抗体のＦｃ領域に結合した二分岐オリゴ糖がＧｌｃＮＡｃによって二分された二分オリゴ糖がさらに提供される。そのような抗体変異体は、フコシル化の減少および／または改善されたＡＤＣＣ機能を有し得る。そのような抗体変異体の例は例えば、ＷＯ２００３／０１１８７８；米国特許第６，６０２，６８４号；およびＵＳ２００５／０１２３５４６に記載されている。
Ｆｃ領域に結合したオリゴ糖中に少なくとも１つのガラクトース残基を有する抗体変異体も提供される。このような抗体変異体は、改善されたＣＤＣ機能を有し得る。このような抗体変異体は、例えばＷＯ１９９７／３００８７；ＷＯ１９９８／５８９６４；およびＷＯ１９９９／２２７６４に記載されている。
ＦＣ領域変異体
特定の実施形態において、１つまたは複数のアミノ酸修飾（例えば、置換）を、本明細書で提供される抗体のＦｃ領域（例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４Ｆｃ領域）に導入し、それによってＦｃ領域変異体を生成することができる。
特定の実施形態において、本発明は、インビボでの抗体の半減期は重要であるが、特定のエフェクター機能（例えば、補体およびＡＤＣＣ）が不必要または有害である用途のための望ましい候補となる、すべてではないがいくつかのエフェクター機能を有する抗体変異体を企図する。ＣＤＣおよび／またはＡＤＣＣ活性の減少／枯渇を確認するために、インビトロおよび／またはインビボ細胞毒性アッセイを実施することができる。例えば、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）結合アッセイは、抗体がＦｃγＲ結合を欠く（したがって、おそらくＡＤＣＣ活性を欠く）がＦｃＲｎ結合能力を保持することを確実にするために行うことができる。いくつかの実施形態において、Ｃ１ｑ結合および／または補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）の変更（すなわち、改善または減少のいずれか）をもたらす変更がＦｃ領域で行われる。
特定の実施形態において、本発明は、増加または減少した半減期を有する抗体変異体を企図する。母体ＩｇＧの胎児への転移に関与する、半減期が増加し、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）への結合が改善された抗体（Ｇｕｙｅｒら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１７：５８７（１９７６）およびＫｉｍら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：２４９（１９９４））は、ＵＳ２００５／００１４９３４（Ｈｉｎｔｏｎら）に記載されている。これらの抗体は、ＦｃＲｎへのＦｃ領域の結合を改善する１つまたは複数の置換を有するＦｃ領域を含む。
さらなる態様において、本発明は、本発明による単離された抗体または抗原結合フラグメントを含む抗体コンジュゲートに関する。
抗体産生
本発明の抗体は、多数の健常ボランティアの抗体から単離されたアミノ酸配列に基づく組換え抗体ライブラリーに由来してもよく、例えば、ｎ－ＣｏＤｅＲ（登録商標）技術を用いて、完全ヒトＣＤＲは新しい抗体分子に組換えられる（Ｃａｒｌｓｏｎ ＆ Ｓｏｅｄｅｒｌｉｎｄ、Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ Ｍｏｌ Ｄｉａｇｎ．２００１ Ｍａｙ；１（１）：１０２－８）。あるいは、例えば、Ｈｏｅｔ ＲＭら、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２００５；２３（３）：３４４－８）に記載されている完全ヒト抗体ファージディスプレイライブラリーとしての抗体ライブラリーを使用して、Ａ２ＡＰ特異的抗体を単離することができる。ヒト抗体ライブラリーから単離された抗体または抗体フラグメントは、本明細書においてヒト抗体またはヒト抗体フラグメントとみなされる。
ヒト抗体は、抗原攻撃に応答して、インタクトなヒト抗体またはヒト可変領域を有するインタクトな抗体を産生するように改変されたトランスジェニック動物に免疫原を投与することによってさらに調製され得る。そのような動物は、典型的には内因性免疫グロブリン遺伝子座を置き換えるか、または染色体外に存在するか、または動物の染色体にランダムに組み込まれた、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の全部または一部を含有する。例えば、遺伝子操作されたマウスの免疫化、とりわけｈＭＡｂマウス（例えば、ＶｅｌｏｃＩｍｍｕｎｅマウス（登録商標）またはＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（登録商標））の免疫化を行うことができる。
さらなる抗体は、ハイブリドーマ技術（例えば、Ｋｏｅｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ Ｎａｔｕｒｅ．１９７５ Ａｕｇ ７；２５６（５５１７）：４９５－７を参照されたい）を用いて生成され得、例えば、キメラ抗体またはヒト化抗体に変換され得るマウス、ラット、またはウサギ抗体をもたらす。ヒト化抗体およびそれらを作製する方法は例えば、Ａｌｍａｇｒｏ ａｎｄ Ｆｒａｎｓｓｏｎ、Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．１３：１６１９－１６３３（２００８）に概説されており、例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３－３２９（１９８８）；Ｑｕｅｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：１００２９－１００３３（１９８９）；米国特許第５，８２１，３３７、７，５２７，７９１、６，９８２，３２１、および７，０８７，４０９号；Ｋａｓｈｍｉｒｉら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６：２５－３４ （２００５）（特異性決定領域（ＳＤＲ）グラフティングを記載）；Ｐａｄｌａｎ、Ｍｏｌ．、Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２８：４８９－４９８（１９９１）（「リサーフェシング」について記載）；Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６：４３－６０（２００５）（「ＦＲシャッフリング」について記載）；およびＯｓｂｏｕｍら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６：６１－６８（２００５）およびＫｌｉｍｋａら、Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、８３：２５２－２６０（２０００）（ＦＲシャッフリングへの「誘導選択」アプローチを記載している）にさらに記載されている。
組換え抗体ライブラリーを用いた抗体の作製のための例が提供される。
本発明によるＤＮＡ分子
本発明はまた、本発明による抗体または抗原結合フラグメントをコードする単離された核酸配列に関する。本発明による抗体または抗原結合フラグメントをコードする単離された核酸配列は例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、およびＡｕｓｕｂｅｌら、１９８９に記載されている技術によって、または代替的に、化学合成によって作製することができる（例えば、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（１９８４、Ｇａｉｔ編集、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ）に記載の技術）。発現された抗体に使用されたＤＮＡ配列を表２に示す。これらの配列は、哺乳動物発現のための特定の場合において最適化される。本発明のＤＮＡ分子は、本明細書に開示される配列に限定されず、その変異体も含む。本発明内のＤＮＡ変異体は、ハイブリダイゼーションにおけるそれらの物理的特性を参照することによって記載され得る。当業者は、ＤＮＡがその相補体を同定するために使用され得ること、およびＤＮＡは二本鎖であるので、核酸ハイブリダイゼーション技術を使用してその等価物または相同体であることを認識するのであろう。ハイブリダイゼーションは、１００％未満の相補性で起こり得ることも認識されるのであろう。しかしながら、条件の適切な選択を考慮すると、ハイブリダイゼーション技術を使用して、特定のプローブに対するそれらの構造的関連性に基づいてＤＮＡ配列を区別することができる。そのような条件に関するガイダンスについては、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９上記の、およびＡｕｓｕｂｅｌら、１９９５（Ａｕｓｕｂｅｌ、Ｆ．Ｍ．、Ｂｒｅｎｔ、Ｒ．、Ｋｉｎｇｓｔｏｎ、Ｒ．Ｅ．、Ｍｏｏｒｅ、Ｄ．Ｄ．、Ｓｅｄｍａｎ、Ｊ．Ｇ．、Ｓｍｉｔｈ、Ｊ．Ａ．、＆ Ｓｔｒｕｈｌ、Ｋ．編集（１９９５）、分子生物学における現在のプロトコル、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ）を参照。
２つのポリヌクレオチド配列間の構造的類似性は、２つの配列が互いにハイブリダイズする条件の「ストリンジェンシー」の関数として表すことができる。本明細書で使用される場合、用語「ストリンジェンシー」は、条件がハイブリダイゼーションに好ましくない程度を指す。ストリンジェントな条件はハイブリダイゼーションに強く不利であり、最も構造的に関連する分子のみが、このような条件下で互いにハイブリダイズする。逆に、非ストリンジェント条件は、より低い程度の構造的関連性を示す分子のハイブリダイゼーションに有利である。したがって、ハイブリダイゼーションストリンジェンシーは、２つの核酸配列の構造的関係と直接相関する。
ハイブリダイゼーションストリンジェンシーは、全体的なＤＮＡ濃度、イオン強度、温度、プローブサイズ、および水素結合を破壊する薬剤の存在を含む多くの因子の関数である。ハイブリダイゼーションを促進する因子には、高いＤＮＡ濃度、高いイオン強度、低い温度、より長いプローブサイズ、および水素結合を破壊する薬剤の不在が含まれる。ハイブリダイゼーションは、典型的には「結合」相および「洗浄」相の２つの相で実施される。
機能的に等価なＤＮＡ変異体
本発明の範囲内のさらに別のクラスのＤＮＡ変異体は、それらがコードする産物を参照して記載され得る。これらの機能的に等価なポリヌクレオチドは、遺伝子コードの縮重のために同じペプチド配列をコードするという事実を特徴とする。
本明細書において提供されるＤＮＡ分子の変異体は、いくつかの異なる方法で構築され得ることが認識される。例えば、それらは完全に合成されたＤＮＡとして構築され得る。オリゴヌクレオチドを効率的に合成する方法は、広く利用可能である。Ａｕｓｕｂｅｌら、ｓｅｃｔｉｏｎ ２．１１、Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ ２１（１９９３）を参照。重複オリゴヌクレオチドは、Ｋｈｏｒａｎａら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、７２：２０９－２１７（１９７１）により最初に報告された様式で合成および組み立てられ得る；Ａｕｓｕｂｅｌら、上記の、Ｓｅｃｔｉｏｎ ８．２も参照のこと。合成ＤＮＡは、好ましくは適切なベクターへのクローニングを容易にするために、遺伝子の５’末端および３’末端で操作された便利な制限部位を用いて設計される。
示されるように、変異体を作製する方法は、本明細書に開示されるＤＮＡのうちの１つから開始し、次いで部位特異的突然変異誘発を行うことである。Ａｕｓｕｂｅｌら、上記の、第８章、Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ ３７（１９９７）を参照されたい。典型的な方法では、標的ＤＮＡを一本鎖ＤＮＡバクテリオファージビヒクルにクローニングする。一本鎖ＤＮＡを単離し、所望のヌクレオチド変更を含むオリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせる。相補鎖が合成され、二本鎖ファージが宿主に導入される。得られた子孫の一部は、ＤＮＡ配列決定を用いて確認することができる所望の変異体を含む。加えて、子孫ファージが所望の変異体である確率を増加させる様々な方法が利用可能である。これらの方法は当業者に周知であり、キットは、このような変異体を生成するために市販されている。
組換えＤＮＡ構築物および発現
本発明はさらに、本発明によるヌクレオチド配列の１つまたは複数を含む組換えＤＮＡ構築物を提供する。本発明の組換え構築物は、本発明の抗体またはその抗原結合フラグメントもしくはその変異体をコードするＤＮＡ分子が挿入されているベクター、例えばプラスミド、ファージミド、ファージまたはウイルスベクターと関連して使用することができる。
したがって、一態様において、本発明は、本発明による核酸配列を含むベクターに関する。
本明細書において提供される抗体、抗原結合部分、またはその変異体は、宿主細胞における軽鎖および重鎖またはその部分をコードする核酸配列の組換え発現によって調製することができる。抗体、抗原結合部分、またはその変異体を組換え的に発現させるために、軽鎖および重鎖が宿主細胞中で発現されるように、軽鎖および／または重鎖またはその部分をコードするＤＮＡフラグメントを保有する１つ以上の組換え発現ベクターで宿主細胞をトランスフェクトすることができる。重鎖および軽鎖をコードする核酸を調製および／または取得し、これらの核酸を組換え発現ベクターに組み込み、該ベクターを宿主細胞に導入するために、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ（編集）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ；Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、（１９８９）、Ａｕｓｕｂｅｌ、Ｆ．Ｍ．ら（編集）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ、（１９８９）およびＢｏｓｓらによる米国特許第４，８１６，３９７号に記載されている方法など、標準的な組換えＤＮＡ方法が使用される。
さらに、重鎖および／または軽鎖の可変領域をコードする核酸配列は例えば、全長抗体鎖、Ｆａｂフラグメントをコードする核酸配列、またはｓｃＦｖに変換することができる。ＶＬまたはＶＨをコードするＤＮＡフラグメントは（２つのＤＮＡフラグメントによってコードされるアミノ酸配列がインフレームであるように）、例えば、抗体定常領域または柔軟なリンカーをコードする別のＤＮＡフラグメントに作動可能なように連結され得る。ヒト重鎖および軽鎖定常領域の配列は、当技術分野で公知であり（例えば、Ｋａｂａｔ、Ｅ．Ａ．ら、（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１－３２４２を参照）、これらの領域を包含するＤＮＡフラグメントは、標準的なＰＣＲ増幅によって取得できる。
ｓｃＦｖをコードするポリヌクレオチド配列を作製するために、ＶＨおよびＶＬをコードする核酸は、ＶＨおよびＶＬ配列が、フレキシブルリンカーによって連結されるＶＬおよびＶＨ領域を備え、連続する一本鎖タンパク質として発現され得るように、フレキシブルリンカーをコードする別のフラグメントに作動可能なように連結され得る（例えば、Ｂｉｒｄら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３－４２６；Ｈｕｓｔｏｎら（１９８８） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７９－５８８３；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、Ｎａｔｕｒｅ（１９９０）３４８：５５２－５５４を参照）。
抗体、その抗原結合フラグメントまたはその変異体を発現させるために、標準的な組換えＤＮＡ発現法を用いることができる（例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ；Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ（１９９０））。例えば、所望のポリペプチドをコードするＤＮＡを発現ベクターに挿入し、次いで、適切な宿主細胞にトランスフェクトすることができる。適切な宿主細胞は、原核細胞および真核細胞である。原核生物宿主細胞の例は例えば細菌であり、真核生物宿主細胞の例は、酵母、昆虫および昆虫細胞、植物および植物細胞、トランスジェニック動物、または哺乳動物細胞である。宿主細胞への組換え構築物の導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥデキストラン媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入またはファージ感染などの標準的な技術を用いて行うことができる。
いくつかの態様において、重鎖および軽鎖をコードするＤＮＡは、別々のベクターに挿入される。他の実施形態において、重鎖および軽鎖をコードするＤＮＡは、同じベクターに挿入される。調節配列の選択を含む発現ベクターの設計は、宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現レベル、および発現が構成的であるか誘導性であるかなどの因子によって影響されることが理解される。
したがって、さらなる態様において、本発明は、本発明による抗体もしくは抗原結合フラグメントを発現する、および／または本発明による核酸もしくは本発明によるベクターを含む単離された細胞に関する。
単離された細胞は、発現ベクターが利用可能な実質的に任意の細胞であり得る。単離された細胞は例えば、哺乳動物細胞などの高等真核宿主細胞、酵母細胞などの下等真核宿主細胞であってもよく、細菌細胞などの原核細胞であってもよい。
さらなる態様において、本発明は、本発明による細胞を培養することを含む、本発明による単離された抗体または抗原結合フラグメントを産生する方法に関する。特定の実施形態において、本発明による細胞が抗体発現に適した条件下で培養され、抗体または抗原結合フラグメントが回収される。特定の実施形態において、抗体または抗原結合フラグメントが特に少なくとも９５重量％の均一性まで精製される。
細菌発現
細菌使用のための有用な発現ベクターは、所望のタンパク質をコードするＤＮＡ配列を、適切な翻訳開始および終止シグナルと共に、機能的プロモーターを有する作動可能な読み取り相に挿入することによって構築される。ベクターは、ベクターの維持を確実にし、所望であれば、宿主内で増幅を提供するために、１つまたは複数の表現型選択マーカーおよび複製起点を含む。形質転換に適した原核生物宿主としては大腸菌、枯草菌、ネズミチフス菌、ならびにシュードモナス属、ストレプトマイセス属、およびブドウ球菌属内の様々な種が挙げられるが、これらに限定されない。
細菌ベクターは例えば、バクテリオファージ、プラスミド、またはファージミドベースであり得る。これらのベクターは、選択マーカーと、周知のクローニングベクターｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ ３７０１７）のエレメントを典型的に含有する市販のプラスミドに由来する細菌複製起点とを含有することができる。適切な宿主株の形質転換および適切な細胞密度への宿主株の増殖に続いて、選択されたプロモーターは、適切な手段（例えば、温度変化または化学的誘導）によって抑制解除／誘導され、細胞は、さらなる時間培養される。細胞は、典型的には、遠心分離により集められ、物理的または化学的手段により破壊され、次いで、得られた粗抽出物をさらなる精製のためにとっておく。
細菌系では、発現されるタンパク質を意図する用途に応じて、多数の発現ベクターを有利に選択することができる。例えば、大量のそのようなタンパク質が産生される場合、抗体の生成のために、またはペプチドライブラリーをスクリーニングするために、例えば、容易に精製される高レベルの融合タンパク質産物の発現を指示するベクターが望ましい場合がある。
したがって、本発明の一実施形態は、本発明の新規抗体をコードする核酸配列を含む発現ベクターである。
本発明の抗体またはその抗原結合フラグメントまたはその変異体は、天然に精製された産物、化学合成手順の産物、および、例えば、大腸菌、枯草菌、ネズミチフス菌、ならびにシュードモナス属、ストレプトミセス、およびブドウ球菌属内の様々な種、好ましくは大腸菌細胞を含む原核生物宿主からの組換え技術によって産生された産物を含む。
哺乳類発現
哺乳動物宿主細胞発現のための好ましい調節配列には、哺乳動物細胞における高レベルのタンパク質発現を指令するウイルスエレメント、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）（ＣＭＶプロモーター／エンハンサーなど）、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）（ＳＶ４０プロモーター／エンハンサーなど）、アデノウイルス（例えば、アデノウイルス主要後期プロモーター（ＡｄＭＬＰ））およびポリオーマに由来するプロモーターおよび／またはエンハンサーが含まれる。抗体の発現は、構成的であってもよく、または調節的であってもよい（例えば、Ｔｅｔ系と併せたテトラサイクリンなどの小分子誘導因子の付加または除去によって誘導可能である）。ウイルス調節エレメントおよびその配列のさらなる説明については、例えば、ＳｔｉｎｓｋｉによるＵ．Ｓ．５，１６８，０６２、ＢｅｌｌらによるＵ．Ｓ．４，５１０，２４５およびＳｃｈａｆｆｎｅｒらによるＵ．Ｓ．４，９６８，６１５を参照されたい。組換え発現ベクターはまた、複製起点および選択マーカーを含むことができる（例えば、Ｕ．Ｓ．４，３９９，２１６、４，６３４，６６５およびＵ．Ｓ．５，１７９，０１７を参照されたい）。適切な選択マーカーには、Ｇ４１８、ピューロマイシン、ハイグロマイシン、ブラストシジン、ゼオシン／ブレオマイシンまたはメトトレキサートなどの薬物に対する耐性を付与する遺伝子またはグルタミンシンテターゼなどの栄養要求性を利用する選択マーカー（Ｂｅｂｂｉｎｇｔｏｎら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｎ Ｙ）１９９２ Ｆｅｂ；１０（２）：１６９－７５）を、ベクターが導入された宿主細胞に含む。例えば、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子はメトトレキサートに対する耐性を付与し、ｎｅｏ遺伝子はＧ４１８に対する耐性を付与し、アスペルギルス・テレウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒｅｕｓ）由来のｂｓｄ遺伝子はブラストサイジンに対する耐性を付与し、ピューロマイシンＮ－アセチルトランスフェラーゼはピューロマイシンに対する耐性を付与し、Ｓｈ ｂｌｅ遺伝子産物はゼオシンに対する耐性を付与し、ハイグロマイシンに対する耐性は、大腸菌ハイグロマイシン耐性遺伝子（ｈｙｇまたはｈｐｈ）によって付与される。ＤＨＦＲまたはグルタミンシンテターゼのような選択可能なマーカーもまた、ＭＴＸおよびＭＳＸと併せて増幅技術に有用である。
宿主細胞への発現ベクターのトランスフェクションは、エレクトロポレーション、ヌクレオフェクション、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクション、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）に基づくトランスフェクションおよびＤＥＡＥ－デキストラントランスフェクションなどのポリカチオンに基づくトランスフェクションなどの標準的な技術を用いて行うことができる。
本明細書で提供される抗体、その抗原結合フラグメントまたはその変異体を発現するための好適な哺乳動物宿主細胞には、ＣＨＯ－Ｋ１、ＣＨＯ－Ｓ、ＣＨＯ－Ｋ１ＳＶなどのチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ細胞）［ＵｒｌａｕｂおよびＣｈａｓｉｎ、（１９８０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：４２１６－４２２０およびＵｒｌａｕｂら、Ｃｅｌｌ．１９８３ Ｊｕｎ；３３（２）：４０５－１２に記載されている、例えば、Ｒ．Ｊ．Ｋａｕｆｍａｎ ａｎｄ Ｐ．Ａ．Ｓｈａｒｐ（１９８２）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５９：６０１－６２１に記載されているＤＨＦＲ選択可能なマーカーと使用される、ｄｈｆｒ－ＣＨＯ細胞；およびＦａｎら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ．２０１２ Ａｐｒ；１０９（４）：１００７－１５に例示される他のノックアウト細胞を含む］、ＮＳ０骨髄腫細胞、ＣＯＳ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＨＫＢ１１細胞、ＢＨＫ２１細胞、ＣＡＰ細胞、ＥＢ６６細胞、およびＳＰ２細胞が挙げられる。
発現はまた、ＨＥＫ２９３、ＨＥＫ２９３Ｔ、ＨＥＫ２９３－ＥＢＮＡ、ＨＥＫ２９３Ｅ、ＨＥＫ２９３－６Ｅ、ＨＥＫ２９３－Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ、ＨＫＢ１１、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ、２９３ＥＢＮＡＬＴ７５、ＣＨＯ Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ、ＣＨＯ－Ｓ、ＣＨＯ－Ｋ１、ＣＨＯ－Ｋ１ＳＶ、ＣＨＯＥＢＮＡＬＴ８５、ＣＨＯＳ－ＸＥ、ＣＨＯ－３Ｅ７またはＣＡＰ－Ｔ細胞（例えば、Ｄｕｒｏｃｈｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２００２ Ｊａｎ １５；３０（２）：Ｅ９）などの発現系において一過性または半安定であり得る。
いくつかの実施形態において、発現ベクターは、発現されたタンパク質が宿主細胞が増殖する培地中に分泌されるように設計される。抗体、その抗原結合フラグメントまたはその変異体は、標準的なタンパク質精製法を用いて培地から回収することができる。
精製
本発明の抗体またはその抗原結合フラグメントまたはその変異体は、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、プロテインＡクロマトグラフィー、プロテインＧクロマトグラフィー、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーを含むがこれらに限定されない周知の方法によって、組換え細胞培養物から回収および精製することができる。高速液体クロマトグラフィー（「ＨＰＬＣ」）も精製に用いることができる。例えば、Ｃｏｌｌｉｇａｎ、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、ｏｒ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、ＮＹ、Ｎ．Ｙ．、（１９９７－２００１）、例えば、Ｃｈａｐｔｅｒｓ１、４、６、８、９、１０を参照されたい、それぞれが参照により完全に本明細書に組み込まれる。
本発明の抗体またはその抗原結合フラグメントまたはその変異体には、天然に精製された産物、化学合成手順の産物、および、例えば、酵母、高等植物、昆虫および哺乳動物細胞を含む、真核宿主からの組換え技術によって産生された産物が含まれる。組換え産生手順において使用される宿主に応じて、本発明の抗体は、グリコシル化され得るか、または非グリコシル化され得る。そのような方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、上記の、Ｓｅｃｔｉｏｎｓ１７．３７～１７．４２；Ａｕｓｕｂｅｌ、上記の、Ｃｈａｐｔｅｒｓ１０、１２、１３、１６、１８および２０などの多くの標準的な実験室マニュアルに記載されている。
好適な実施形態において、抗体は例えば、ローリー法、ＵＶ－Ｖｉｓ分光法、またはＳＤＳ－キャピラリーゲル電気フォレジン（例えば、Ｃａｌｉｐｅｒ ＬａｂＣｈｉｐ ＧＸＩＩ、ＧＸ ９０またはＢｉｏｒａｄ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ装置により）によって決定されるように、抗体の９５重量％以上に、さらに好適な実施形態において９９重量％以上に、（２）Ｎ末端または内部アミノ酸配列の少なくとも１５残基を得るのに十分な程度まで、または（３）クマシーブルーまたは好ましくは銀染色を用いた還元または非還元条件下でＳＤＳ－ＰＡＧＥにより均質になるまで、精製される。抗体の天然環境の少なくとも１つの成分が存在しないので、単離された天然に存在する抗体は、組換え細胞内のインサイチュの（ｉｎ ｓｉｔｕ）抗体を含む。しかし、通常は、単離された抗体が少なくとも１つの精製工程によって調製される。
治療方法
治療方法は、治療を必要とする被験体に、治療上有効である量の本発明によって企図される抗体もしくはその抗原結合フラグメントまたはその変異体を投与することを含む。「治療上有効である」量は、本明細書において、単回用量として、または複数回投与レジメンにより、単独で、または他の薬剤と組み合わせて、被験体におけるプラスミン媒介性血餅溶解を増加させるのに十分な量の抗体または抗原結合フラグメントの量として定義され、それは有害な状態の緩和をもたらすが、毒物学的に許容される量である。被験体は、ヒトまたは非ヒト動物（例えば、ウサギ、ラット、マウス、イヌ、サルまたは他の低次霊長類）であり得る。
したがって、一態様において、本発明は、疾患の治療または予防に使用するための、本発明による単離された抗体もしくは抗原結合フラグメント、または本発明による単離された抗体もしくは抗原結合フラグメントを含むコンジュゲート、または本発明による単離された抗体もしくは抗原結合フラグメントを含む医薬組成物に関する。
本発明による単離された抗体または抗原結合フラグメントは、部分的または完全な血管閉塞に起因する虚血事象に関連する様々なＡ２ＡＰ関連障害および／または疾患における治療または診断ツールとして使用することができる。
虚血事象は１つの血管の部分的または完全な閉塞に起因し得るが、それはまた、いくつかの血管が部分的に閉塞され得、いくつかの血管が完全に閉塞され得る、２つ以上の血管の部分的または完全な閉塞の結果であり得る。
したがって、さらなる態様において、本発明は、虚血性脳卒中、急性冠症候群、末梢動脈疾患、心筋梗塞、深部静脈血栓症、肺塞栓症、静脈血栓症、もしくはシャント血栓症などの、部分的または完全な血管閉塞に起因する虚血事象に関連する障害または疾患の治療または予防に使用するための、本発明による単離された抗体もしくは抗原結合フラグメント、または本発明による単離された抗体もしくは抗原結合フラグメントを含むコンジュゲート、または本発明による単離された抗体もしくは抗原結合フラグメントを含む医薬組成物に関する。
さらなる態様において、本発明は、疾患、特に、虚血性脳卒中、急性冠症候群、末梢動脈疾患、心筋梗塞、深部静脈血栓症、肺塞栓症、静脈血栓症、またはシャント血栓症などの部分的または完全な血管閉塞に起因する虚血事象に関連する障害または疾患の治療または予防のための、本発明による単離された抗体もしくは抗原結合フラグメント、または本発明による単離された抗体もしくは抗原結合フラグメントを含むコンジュゲート、または本発明による単離された抗体もしくは抗原結合フラグメントを含む医薬組成物に関する。
さらなる態様において、本発明は、疾患、特に、虚血性脳卒中、急性冠症候群、末梢動脈疾患、心筋梗塞、深部静脈血栓症、肺塞栓症、静脈血栓症、またはシャント血栓症などの部分的または完全な血管閉塞に起因する虚血事象に関連する障害または疾患の治療または予防の方法における、本発明による単離された抗体もしくは抗原結合フラグメント、または本発明による単離された抗体もしくは抗原結合フラグメントを含むコンジュゲート、または本発明による単離された抗体もしくは抗原結合フラグメントを含む医薬組成物の使用に関する。
さらなる態様において、本発明は、疾患、特に、虚血性脳卒中、急性冠症候群、末梢動脈疾患、心筋梗塞、深部静脈血栓症、肺塞栓症、静脈血栓症、またはシャント血栓症などの部分的または完全な血管閉塞に起因する虚血事象に関連する障害または疾患の予防または治療のための医薬組成物、好ましくは医薬の調製のための、本発明による単離された抗体もしくは抗原結合フラグメント、または本発明による単離された抗体もしくは抗原結合フラグメントを含むコンジュゲート、または本発明による単離された抗体もしくは抗原結合フラグメントを含む医薬組成物の使用に関する。
さらなる態様において、本発明は、本発明による単離された抗体もしくは抗原結合フラグメントまたは本発明による単離された抗体もしくは抗原結合フラグメントを含むコンジュゲートまたは本発明による単離された抗体もしくは抗原結合フラグメントを含む医薬組成物の有効量を使用する、虚血性脳卒中、急性冠症候群、末梢動脈疾患、心筋梗塞、深部静脈血栓症、肺塞栓症、静脈血栓症、またはシャント血栓症などの部分的または完全な血管閉塞に起因する虚血事象に関連する障害または疾患の治療または予防の方法に関する。上述の障害は、ヒトにおいて十分に特徴付けられているが、哺乳動物を含む他の動物においても同様の病因で存在し、本発明による医薬組成物を投与することによって治療することができる。
本発明による抗体もしくは抗原結合フラグメントまたはその変異体は、既知の医薬と同時投与されてもよく、場合によっては抗体またはその抗原結合フラグメント自体が修飾されてもよい。例えば、抗体もしくはその抗原結合フラグメントまたはその変異体は、効力を潜在的にさらに増加させるために、薬物または別のペプチドもしくはタンパク質にコンジュゲートされ得る。
本発明の抗体またはその抗原結合フラグメントもしくはその変異体は、唯一の医薬剤として、または１つもしくは複数のさらなる治療剤と組み合わせて投与され得、ここで、この組み合わせは許容できない有害作用を引き起こさない。
したがって、さらなる態様において、本発明は、１つまたは複数のさらなる治療活性化合物と同時に、別々に、または連続的に組み合わせて使用するための本発明による単離された抗体もしくは抗原結合フラグメント、または本発明によるコンジュゲート、または本発明による薬学的組成物に関する。
本発明による抗体または抗原結合フラグメントと組み合わせて使用される治療活性化合物の非限定的な例は以下のとおりである：
ｉ）プラスミノーゲン活性化因子のような凝固カスケードの阻害剤（血栓溶解剤／線維素溶解剤）、ならびに血栓溶解および／または線維素溶解を増加させる化合物（組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔ－ＰＡ）、ストレプトキナーゼ、レテプラーゼ、およびウロキナーゼのような）、またはプラスミノーゲン活性化因子阻害因子（ＰＡＩ）もしくはトロンビン活性化可能線維素溶解阻害因子（ＴＡＦＩ）の阻害剤；
ｉｉ）非分画ヘパリン、低分子量ヘパリン、ヘパリノイド、ヒルジン、ビバリルジンおよび／またはアルガトロバンのような抗凝固剤；直接経口抗凝固剤／第Ｘａ因子阻害剤などの非ビタミンＫ抗凝固剤、例えばアピキサバン、エドキサバンおよびリバーロキサバン、ならびにトロンビン阻害剤、例えばダビガトラン。
ｉｉｉ）アスピリン、クロピドグレル、シロスタゾール、プラスグレル、チカグレロル、カングレロールなどの血小板凝集阻害剤。
併用療法は、本発明による抗体もしくは抗原結合フラグメントまたはその変異体および１つ以上の追加の治療剤を含む単一の医薬投与製剤の投与、ならびに本発明による抗体もしくは抗原結合フラグメントおよびそれぞれの追加の治療剤の、それ自体の別々の医薬投与製剤における投与を含む。例えば、本発明の抗体またはその抗原結合フラグメントまたはその変異体および治療剤は、単一の液体組成物で患者に一緒に投与されてもよく、または各薬剤は別々の投与製剤で投与されてもよい。
別々の投与製剤が使用される場合、本発明による抗体もしくは抗原結合フラグメントまたはその変異体および１つ以上の追加の治療剤は、本質的に同時に（例えば、同時に（ｃｏｎｃｕｒｒｅｎｔｌｙ））または別々にずらして（例えば、連続して）投与され得る。
本発明による抗体または抗原結合フラグメントまたはその変異体は、機械的塞栓摘出術、血栓摘出術、血栓回収デバイス、脳血行再建術のようなこれらに限定されない外科的介入と組み合わせて使用され得る。
診断方法
さらに、本発明による抗体または抗原結合フラグメントは、それ自体で、または組成物中で、研究および診断において、または分析基準などとして利用され得る。
抗Ａ２ＡＰ抗体またはその抗原結合フラグメントは、Ａ２ＡＰの存在を検出するために使用することができる。したがって、さらなる態様において、本発明は、診断薬として使用するための、本発明による単離された抗体もしくは抗原結合フラグメントまたは本発明による抗体コンジュゲートに関する。
医薬組成物および投与
さらなる態様において、本発明は、本発明による単離された抗体または抗原結合フラグメントまたは本発明による抗体コンジュゲートを含む医薬組成物に関する。前述の障害のいずれかを治療するために、本発明に従って使用するための医薬組成物は、１つ以上の生理学的に許容される担体、賦形剤、または助剤を使用して、任意の従来の様式で製剤化され得る。製剤化および投与のための技術に関するさらなる詳細は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（編集 Ｍａａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐａ．）の最新版に見出すことができる。
本発明による抗体または抗原結合フラグメントは、治療される障害のタイプに応じて変化し得る任意の適切な手段によって投与することができる。可能な投与経路としては、経口、非経口、および局所投与が挙げられる。非経口送達の方法は、動脈内、筋肉内、皮下、髄内、髄腔内、脳室内、静脈内、腹腔内、または鼻腔内投与を含む。さらに、本発明による抗体または抗原結合フラグメントは例えば、抗体の用量を減少させながら、パルス注入によって投与され得る。好ましくは投与は，注射、最も好ましくは静脈内または皮下注射によるものであり、部分的には投与が短時間であるかまたは長期であるかに依存する。投与される量は、臨床症状、個体の体重、他の薬物が投与されるかどうかなどの様々な因子に依存する。当業者は、投与経路が治療される障害または状態に応じて変化することを認識するのであろう。
本発明による医薬組成物は、本発明による抗体または抗原結合フラグメントを、単独で、または安定化化合物などの少なくとも１つの他の薬剤と組み合わせて含む。本発明による抗体または抗原結合フラグメントは，生理食塩水、緩衝生理食塩水、デキストロース、および水を含むが、これらに限定されない、任意の無菌の生体適合性医薬担体中で投与され得る。特定の実施形態において、本発明による医薬組成物は、１つ以上のさらなる薬学的に活性な化合物、特に、Ａ２ＡＰ関連障害および／または部分的または完全な血管閉塞による虚血事象に関連する障害を治療するのに適した１つ以上のさらなる薬学的に活性な化合物を含み得る。これらの薬剤のいずれも、単独で、または他の薬剤もしくは薬物と組み合わせて、賦形剤（複数可）または薬学的に許容される担体と混合される医薬組成物中で、患者に投与することができる。特定の実施形態において、薬学的に許容される担体は薬学的に不活性である。
経口投与のための医薬組成物は、経口投与に適した用量で、当技術分野で周知の薬学的に許容される担体を用いて製剤化することができる。このような担体は、患者による摂取のために、医薬品組成物を錠剤、丸剤、糖衣錠、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液等に製剤化できる。
経口使用のための医薬調製物は、活性化合物と固体賦形剤との組み合わせ、任意に得られた混合物を粉砕すること、および所望であれば、適切な補助剤を添加した後に顆粒の混合物を加工して錠剤または糖衣錠コアを得ることによって得ることができる。好適な賦形剤は、炭水化物またはタンパク質充填剤、例えば、ラクトース、ショ糖、マンニトール、またはソルビトールを含む糖類；トウモロコシ、コムギ、イネ、ジャガイモ、または他の植物由来のデンプン；メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、またはカルボキシメチルセルロースナトリウムなどのセルロース；アラビアゴムおよびトラガントを含むゴム類；ならびにゼラチンおよびコラーゲンなどのタンパク質類である。必要に応じて、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸、またはアルギン酸ナトリウムなどのその塩などの崩壊剤または可溶化剤を添加してもよい。
糖衣錠コアには、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポールゲル、ポリエチレングリコールおよび／または二酸化チタン、ラッカー溶液、ならびに適切な有機溶媒または溶媒混合物を含有する可能性がある濃縮糖溶液などの適切なコーティングを施すことができる。色素または顔料は、製品同定のために、または活性化合物の量、すなわち投薬量を特徴付けるために、錠剤または糖衣錠コーティングに添加され得る。
経口的に使用することができる医薬調製物には、ゼラチン製のプッシュフィットカプセル、ならびにゼラチンおよびグリセロールまたはソルビトールなどのコーティングで作製された軟質の密封カプセルが含まれる。プッシュフィットカプセルは、ラクトースまたはデンプンなどの充填剤または結合剤、タルクまたはステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤、および任意に安定剤と混合された活性成分を含有することができる。柔らかいカプセルでは、活性化合物が、安定剤があるなしにかかわらず、脂肪油、液体パラフィン、液体ポリエチレングリコールのような適切な液体に溶解または懸濁される。
非経口投与のための医薬製剤には、活性化合物の水溶液が含まれる。注射のために、本発明の医薬組成物は、水溶液、好ましくは生理学的に適合性の緩衝液、例えば、ハンクス液、リンゲル液、または生理学的に緩衝された生理食塩水中に製剤化され得る。水性注射懸濁液は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、またはデキストランなどの、懸濁液の粘度を増加させる物質を含有し得る。さらに、活性化合物の懸濁液は、適切な油性注入懸濁液として調製され得る。好適な親脂性溶媒またはビヒクルにはゴマ油のような脂肪油、またはオレイン酸エチルまたはトリグリセリドのような合成脂肪酸エステル、またはリポソームが包含される。任意に、懸濁液はまた、高濃度溶液の調製を可能にするために、化合物の溶解度を増加させる適切な安定剤または薬剤を含有する可能性がある。
局所または経鼻投与のために、浸透されるべき特定のバリアに適切な浸透剤が製剤中で使用される。このような浸透剤は、当該技術分野において一般に知られている。
本発明の医薬組成物は例えば、従来の混合、溶解、造粒、糖衣錠製造、微粒子化（ｌｅｖｉｇａｔｉｎｇ）、乳化、カプセル化、封入または凍結乾燥工程の手段によって、当該技術分野で公知の方法で製造することができる。
医薬組成物は、塩として提供することができ、塩酸、硫酸、酢酸、乳酸、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸などを含むが、これらに限定されない酸で形成することができる。塩は、水性または対応する遊離塩基形態である他のプロトン性溶媒により可溶性である傾向がある。他の場合には、好ましい調製物は、１ｍＭ～５０ｍＭのヒスチジンまたはリン酸もしくはトリス、０．１％～２％のスクロースおよび／または２％～７％のマンニトール中の、ｐＨ４．５～７．５の範囲の凍結乾燥粉末であってもよく、任意に、使用前に緩衝液と混合されるポリソルベートのような追加の物質を含む。
許容される担体中に製剤化された本発明の化合物を含む医薬組成物が調製された後、それらを適切な容器に入れ、指示された状態の治療のためにラベル付けすることができる。抗Ａ２ＡＰ抗体またはその抗原結合フラグメントの投与のために、そのようなラベリングは、投与の量、頻度および方法を含む。
治療上の有効用量
本発明による使用に適した医薬組成物には、意図する目的、例えば、部分的または完全な血管閉塞による虚血事象を特徴とする特定の疾患状態の治療を達成するのに有効な量で活性成分が含有される組成物が含まれる。
有効用量の決定は、十分に当業者の能力の範囲内である。本発明の新規抗体またはその抗原結合フラグメントもしくはその変異体の治療有効量を決定することは、主に、特定の患者の特徴、投与経路、および治療される障害の性質に依存する。一般的なガイダンスは例えば、国際調和会議（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｎ Ｈａｒｍｏｎｉｚａｔｉｏｎ）の刊行物およびＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ、第２７および２８章、４８４－５２８頁（第１８版、Ａｌｆｏｎｓｏ Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ、Ｅｄ．、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐａ．：Ｍａｃｋ Ｐｕｂ．Ｃｏ．、１９９０）に見出すことができる。より具体的には、治療有効量を決定することは、薬剤の毒性および有効性などの因子に依存する。毒性は当技術分野で周知の方法を用いて決定することができ、前述の参考文献に見出される。有効性は、実施例において以下に記載される方法と併せて同じガイダンスを利用して決定され得る。
任意の化合物について、治療有効用量は、細胞培養アッセイにおいて、または動物モデル、通常はマウス、ウサギ、イヌ、ブタまたはサルにおいて、最初に推定することができる。動物モデルはまた、望ましい濃度範囲および投与経路を達成するために使用される。次いで、そのような情報を使用して、ヒトにおける投与のための有用な用量および経路を決定することができる。
治療上有効な用量は、症状または状態を改善する抗体またはその抗原結合フラグメントの量を指す。そのような化合物の治療的有効性および毒性は、細胞培養物または実験動物における通常の薬学的手法、例えば、ＥＤ５０（集団の５０％において治療的に効果的な用量）およびＬＤ５０（集団の５０％に対して致死的な用量）によって決定することができる。治療効果と毒性効果との間の投与量比は治療係数であり、ＥＤ５０／ＬＤ５０の比率として表すことができる。大きな治療係数を示す医薬組成物が好ましい。細胞培養アッセイおよび動物研究から得られたデータは、ヒト使用のための用量の範囲を処方する際に使用される。このような化合物の投与量は、好ましくはほとんどまたは全く有害性を有さないＥＤ５０を含む循環血中濃度の範囲内にある。用量は、使用される投与形態、患者の感受性、および投与経路に応じて、この範囲内で変化する。
正確な用量は、治療されるべき患者を考慮して個々の担当医により選択される。用量および投与は十分なレベルの活性部分を提供するように、または所望の効果を維持するように調整される。考慮され得るさらなる因子は、疾患状態の重症度、患者の年齢、体重および性別；食事、投与の時間および頻度、薬物の組み合わせ、反応感受性、ならびに治療に対する耐性／応答を含む。長時間作用型医薬組成物は、特定の製剤の半減期およびクリアランス速度に応じて、例えば３～４日毎、毎週、２週間に１回、または３週間に１回投与することができる。
通常の用量は、投与経路に応じて、０．１～１００，０００マイクログラム、最大約１０ｇの総用量で変動してもよい。特定の用量および送達方法に関するガイダンスは、文献に提供されている。米国特許第４，６５７，７６０号、５，２０６，３４４号、５，２２５，２１２号を参照。
キット
さらなる態様において、本発明は、本発明による単離された抗体または抗原結合フラグメントまたは本発明によるコンジュゲートと、使用説明書とを含むキットに関する。特定の実施形態において、キットは、本発明の前述の組成物の成分のうちの１つまたは複数が充填された１つまたは複数の容器を含む。そのような容器に関連して、ヒトへの投与のための製品の製造、使用または販売の機関による承認を反映している、医薬品または生物学的製品の製造、使用または販売を規制する政府機関によって規定された形式の通知があることができる。
図面の簡単な説明
図１：種間特異的な中和抗α２－アンチプラスミン抗体を見つけるためのパニング戦略 ビオチン化抗原に対する選択のための４つの主要な戦略が示されている。示される場合、選択の各ラウンドの前に、関連または非α２－アンチプラスミンビオチン化タンパク質の枯渇ステップを含めた。 図２：ヒトα２－アンチプラスミンおよびウサギα２－アンチプラスミンへのＦａｂ ４３１Ａ－Ｍ０８０－Ｃ０１の結合のＥＬＩＳＡに基づく分析 ＥＬＩＳＡアッセイにおいて評価される、ヒト（黒色カラム）およびウサギ（灰色カラム）α２－アンチプラスミンに対するＦａｂ ４３１Ａ－Ｍ０８０－Ｃ０１の特異的結合を示す。抗原を、１μｇ／ｍｌの最終濃度でマイクロタイタープレートにコーティングした。このために、トランスフェクトされた細胞の上清を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で、１：１，５、１：４，５、１：１３，５、１：４０，５、１：１２１，５、１：３６４，５、１：１０９３，５の係数で希釈した。相対蛍光単位（ＲＦＵ、縦座標）を希釈Ｆａｂ（横座標）に対してプロットする。詳細については、実施例３を参照されたい。 図３：Ｆａｂ ４３１Ａ－Ｍ０８０－Ｃ０１の機能遮断活性の分析 プラスミン－α２－アンチプラスミン生化学アッセイにおいて測定されたＦａｂ ４３１Ａ－Ｍ０８０－Ｃ０１の機能遮断活性を示す。このために、目的のＦａｂを含有する哺乳動物細胞からの上清を、ヒトまたはウサギα２－アンチプラスミンとプレインキュベートし、続いてヒトプラスミンおよび蛍光発生プラスミン基質を添加した。プラスミンによる基質の切断から生じる相対蛍光単位を測定した。得られたデータは、阻害のパーセンテージとして示される。左側の明灰色の列は、ヒトα２－アンチプラスミンの中和を表し、右側の暗灰色の列は、ウサギα２－アンチプラスミンの中和を表す。生化学的アッセイの詳細な説明については、実施例４を参照されたい。 図４：ヒトおよびウサギα２－アンチプラスミンに対する抗体ＴＰＰ－１２３８７の結合活性 実施例３に記載の方法に従って、抗体ＴＰＰ－１２３８７を、ヒトおよびウサギα２－アンチプラスミンに用量依存的に結合するその能力について試験した。ヒトα２－アンチプラスミンに対する結合活性を左パネルに示し、ウサギα２－アンチプラスミンに対する結合活性をこの図の右パネルに示す。結合活性を、Ｍ値におけるＥＣ５０として計算した。１つの用量応答曲線は、四重反復で実施された２～３回の独立した実験の例として示される：ＥＣ５０（ヒトＡ２ＡＰ）は、１．２Ｅ－０７Ｍであり；ＥＣ５０（ウサギＡ２ＡＰ）は、６．０Ｅ－０９Ｍであった。 図５：ヒトおよびウサギα２－アンチプラスミンに対する抗体ＴＰＰ－１２３８７の中和活性 実施例４に記載の方法に従って、抗体ＴＰＰ－１２３８７を、ヒトおよびウサギα２－アンチプラスミンの活性を用量依存的に遮断するその能力について試験した。ヒトα２－アンチプラスミンに対する中和活性を左パネルに示し、ウサギα２－アンチプラスミンに対する中和活性をこの図の右パネルに示す。機能遮断活性は、Ｍ値におけるＥＣ５０として計算した。１つの用量応答曲線は、四重反復で実施された２～３回の独立した実験の例として示される：ＥＣ５０（ヒトＡ２ＡＰ）は、１．７Ｅ－０７Ｍであり；ＥＣ５０（ウサギＡ２ＡＰ）は、１．４Ｅ－０９Ｍであった。 図６：カニクイザルα２－アンチプラスミンに対する抗体ＴＰＰ－１２３８７の結合および機能遮断活性 実施例３および実施例４に記載の方法に従って、抗体ＴＰＰ－１２３８７を、用量依存的にカニクイザルα２－アンチプラスミンの活性を遮断するその能力について試験した。カニクイザルα－２アンチプラスミンに対する抗体の結合活性を図６．１に示し、その中和活性を図６．２に示す。活性は、Ｍ値におけるＥＣ５０として計算した。１つの用量応答曲線は、四重反復で実施された２～３回の独立した実験の例として示されている：ＥＣ５０（カニクイザルＡ２ＡＰ結合）は、９．９Ｅ－０８Ｍであり；ＥＣ５０（カニクイザルＡ２ＡＰ活性遮断）は１．６Ｅ－０７Ｍであった。 図７：ヒトα２－アンチプラスミンに対するＴＰＰ－１２３８７変異体の結合および機能遮断活性 実施例３および実施例４に記載の方法に従って、抗体ＴＰＰ－１４３２３（７．１７、７．１８）、ＴＰＰ－１４３１８（７．１５、７．１６）、ＴＰＰ－１４３１４（７．１３、７．１４）、ＴＰＰ－１４３１３（７．１１、７．１２）、ＴＰＰ－１４３０８（７．９、７．１０）、ＴＰＰ－１４３０５（７．７、７．８）、ＴＰＰ－１４３０３（７．５、７．６）、ＴＰＰ－１４２９８（７．３；７．４）およびＴＰＰ－１４２９３（７．１；７．２）を、用量依存的にヒトα２－アンチプラスミンに結合し、その活性を遮断する能力について試験した。ヒトα２－アンチプラスミンに対する結合活性を７．１、７．３、７．５、７．７、７．９、７．１１、７．１３、７．１５、７．１７に示し、中和活性を７．２、７．４、７．６、７．８、７．１０、７．１２、７．１４、７．１６、７．１８に示す。結合および機能遮断活性を、Ｍ値におけるＥＣ５０として計算した（表３．３）。各抗体について、１つの用量応答曲線を、四重反復で実施された２～３回の独立した実験の例として示す。
図８：ヒトアルファ２－アンチプラスミンの結合および中和についてＴＰＰ－１４３０８の生殖細胞系変異体を試験する ＴＰＰ－１４３０８の生殖細胞系アプローチから得られた４７の抗体を、ＴＰＰ－１４３０８と比較して、用量依存的に、ヒトα２－アンチプラスミンに結合し、その活性を遮断する能力について試験した。ＴＰＰ－１４３０８（ＴＰＰ－１７０４１、ＴＰＰ－１７０４４、ＴＰＰ－１７０４５、ＴＰＰ－１７０４８、ＴＰＰ－１７０５１、ＴＰＰ－１７０５３）の生殖細胞系アプローチから生じる６つの抗体は、改善された結合活性および／または中和活性を示す。ヒトα２－アンチプラスミンに対する結合活性を８．１、８．３、８．５、８．７、８．９、８．１１に示し、中和活性を８．２、８．４、８．６、８．８、８．１０、８．１２に示す。結合および機能遮断活性を、Ｍ値におけるＥＣ５０として計算した（表３．５）。各抗体について、１つの用量応答曲線を、四重反復で行った２～３回の独立した実験からの例として示す（四角＝ＴＰＰ１７３０８、丸＝ＴＰＰ－１７０４１、ＴＰＰ－１７０４４、ＴＰＰ－１７０４５、ＴＰＰ－１７０４８、ＴＰＰ－１７０５１またはＴＰＰ－１７０５３）。 図９：異なる種由来のヒトα２－アンチプラスミンに対するＴＰＰ－１７０４４ＩｇＧ１抗体の中和活性 ヒト（９．１）、カニクイザル（９．２）、およびウサギ（９．３）α２－アンチプラスミンに対する、実施例４に記載の方法による機能遮断活性についてのＴＰＰ－１７０４４の試験を示す。中和活性は、Ｍ値におけるＥＣ５０として計算した。この抗体について、１つの用量応答曲線を、四重反復で実施された２～３回の独立した実験の例として示す。ヒトα２－アンチプラスミンに対するＴＰＰ－１７０４４の機能遮断活性は、４．４Ｅ－１０Ｍ（図９．１に示す）であり、２回目の実験では５．４Ｅ－１０Ｍ、３回目の実験では５．０Ｅ－１０Ｍであった。カニクイザルα２－アンチプラスミンの阻害について、値は、４．６Ｅ－１０Ｍ（図９．２）、第２の実験については４．９Ｅ－１０Ｍ、第３の実験については５．１Ｅ－１０Ｍであった。ウサギα２－アンチプラスミンは、ＴＰＰ－１７０４４によってその活性が遮断され、ＩＣ５０値は２．７Ｅ－０８Ｍ（図９．３）、２回目の実験では３．６Ｅ－０８Ｍ、３回目の実験では２．９Ｅ－０８Ｍであった。 図１０：異なる種由来のヒトα２－アンチプラスミンに対するＴＰＰ－１７９２８ＩｇＧ４抗体の中和活性 ヒト（１０．１）、カニクイザル（１０．２）、およびウサギ（１０．３）α２－アンチプラスミンに対する、実施例４に記載の方法による機能遮断活性についてのＴＰＰ－１７９２８の試験を示す。中和活性は、Ｍ値におけるＥＣ５０として計算した。この抗体について、１つの用量応答曲線を、四重反復で実施された２～３回の独立した実験の例として示す。ヒトα２－アンチプラスミンに対するＴＰＰ－１７９２８の機能遮断活性は、１．１Ｅ－１０Ｍ（図１０．１に示す）であり、第２の実験では１．６Ｅ－１０Ｍであった。カニクイザルα２－アンチプラスミンの阻害について、値は、２．６Ｅ－１０Ｍ（図１０．２）、２回目の実験では３．４Ｅ－１０Ｍ、３回目の実験では２．９Ｅ－１０Ｍであった。ウサギα２－アンチプラスミンは、ＴＰＰ－１７９２８によってその活性が遮断され、ＩＣ５０値は、１．５Ｅ－０８Ｍ（図１０．３）、第２の実験では１．９Ｅ－１０Ｍ、第３の実験では１．６Ｅ－１０Ｍであった。 図１１：ＴＰＰ－１７９２８による血餅溶解時間の短縮 抗体ＴＰＰ－１７９２８は、ヒト（三角形）およびウサギ（四角形）血漿において、それぞれ、用量依存的に、ｔＰＡ誘導性の血餅溶解時間を短縮させる。活性は、Ｍ値におけるＩＣ５０として計算した。曲線は、３回の独立した実験からの平均（＋／－ＳＤ）を表す。実験の詳細については、実施例７を参照されたい。ＩＣ５０（ヒト血漿）は２．５Ｅ－０７Ｍであり、ＥＣ５０（ウサギ血漿）は２．３Ｅ－０７Ｍであった。 図１２：血餅溶解に対するＴＰＰ－１７９２８のインビボ効果 動物は測定の３０分前に蛍光標識血漿血餅を受け、それぞれの処理は０分の時点で投与された。３６０分以上の血漿サンプルを採取し、血餅溶解の間接的パラメータとしての血漿蛍光の量を測定した。血餅溶解に対する、異なる濃度のＴＰＰ－１７９２８の効果（図１２．１、対照丸；３．７５ｍｇ／ｋｇ白丸；７．５ｍｇ／ｋｇ白四角；１５ｍｇ／ｋｇ白三角）、および異なる濃度のｔＰＡの効果（図１２．２、対照丸、０．１２５ｍｇ／ｋｇ三角、０．２５ｍｇ／ｋｇ四角、１ｍｇ／ｋｇ菱形）または両方の組み合わせ（図１２．１、１５ｍｇ／ｋｇ＋０．１２５ｍｇ／ｋｇ ｔＰＡ（白菱形））の効果を測定した。相対蛍光単位（ｒＦＵ、縦座標）を、血漿試料が採取された時点（横座標）に対してプロットする。値は、平均＋／－ＳＤである。ＴＰＰ－１７９２８単独では、血餅の溶解に用量依存的な影響を及ぼす。本発明の抗体の適用後、活性最大値は約６０分で達成され、その後、全実験時間（３６０分）にわたって持続効果をもたらす。また、ｔＰＡ処理は、血餅の溶解に用量依存的な効果を示す。ｔＰＡは、血餅の溶解の急激な増加（１５分後に最大）を示すが、ＴＰＰ－１７９２８で観察されるように、より長く持続する効果を示さない。ＴＰＰ－１７９２８の低用量ｔＰＡへの同時投与は、単一化合物の投与よりも速い血餅の溶解をもたらす。詳細は、実施例８を参照されたい。 図１３：ｔＰＡおよびＴＰＰ－１７９２８誘発耳出血時間の測定 血漿蛍光測定（図１２に示す）と同時に、化合物投与後０分の時点で耳出血時間を測定した。各処理群について、出血時間（秒）を示す。値は平均＋／－ＳＥＭである。
カラム１：対照
カラム２：０．１２５ｍｇ／ｋｇのｔＰＡ、
カラム３：０．２５ｍｇ／ｋｇのｔＰＡ
カラム４：１ｍｇ／ｋｇのｔＰＡ
カラム５：３．７５ｍｇ／ｋｇのＴＰＰ－１７９２８
カラム６：７．５ｍｇ／ｋｇのＴＰＰ－１７９２８
カラム７：１５ｍｇ／ｋｇのＴＰＰ－１７９２８
カラム８：１５ｍｇ／ｋｇのＴＰＰ－１７９２８＋０．１２５ｍｇ／ｋｇのｔＰＡ
図１４：プラスミンに対する７７Ａ３および本発明の抗体の効果 実施例１０に記載のＡ２ＡＰ機能遮断アッセイの結果を示す。
以下の抗体および抗体濃度を使用した：
図１４．１：６．１Ｅ－１１～３．０Ｅ－０８Ｍ ７７Ａ３（左図）および６．１１Ｅ－１１～１．０Ｅ－０６Ｍ ７７Ａ３（右図）
図１４．２：６．１１Ｅ－１１～１Ｅ－０６Ｍ ７７Ａ３（丸）および６．１Ｅ－１１～１．０Ｅ－０６Ｍ ＴＰＰ－１７０４１（三角）
図１４．３：６．１Ｅ－１１～１．０Ｅ－０６Ｍ ７７Ａ３（丸）及び６．１Ｅ－１１～１．０Ｅ－０６Ｍ ＴＰＰ－１７０４４（四角）
図１４．４：６．１Ｅ－１１～１Ｅｅ－０６Ｍ ７７Ａ３（丸）および６．１Ｅ－１１～ １．０Ｅ－０６Ｍ ＴＰＰ－１７０４５（三角）
図１４．５：６．１Ｅ－１１～１．０Ｅ－０６Ｍ ７７Ａ３（丸）および６．１Ｅ－１１～１．０Ｅ－０６Ｍ ＴＰＰ－１７０４８（菱形）
図１４．６：６．１Ｅ－１１～１．０Ｅ－０６Ｍ ７７Ａ３（丸）および６．１Ｅ－１１～１．０Ｅ－０６Ｍ ＴＰＰ－１７０５１（三角）．
図１４．７：６．１Ｅ－１１～１．０Ｅ－０６Ｍ ７７Ａ３（丸）および６．１Ｅ－１１～１．０Ｅ－０６Ｍ ＴＰＰ－１７０５３（四角）。
０．０３μＭまでの７７Ａ３の濃度の増加は、プラスミンによる蛍光基質Ｉ－１２７５の切断に起因する蛍光シグナルの増加をもたらした。しかし、７７Ａ３の濃度のさらなる増加は、蛍光シグナルの減少をもたらした。これは、０，０３μＭの濃度までの実施例４に記載の生化学アッセイにおける抗体７７Ａ３の試験が、α２－アンチプラスミンの遮断をもたらし、７７Ａ３抗体濃度のさらなる増加がプラスミン活性の低下をもたらし、１μＭの７７Ａ３の濃度でプラスミン活性の完全な阻害をもたらすことを示す（図１４．１）。驚くべきことに、この発見と比較して、１μＭまでの本発明の試験抗体は、蛍光シグナルの減少をもたらさず、このことは本発明の試験抗体がプラスミン活性に影響を及ぼさないことを示す（図１４．２－１４．７）。
図１５：本発明による好ましい抗体のアミノ酸配列 本発明による好ましい抗体のＶＨ、Ｈ－ＣＤＲ１、Ｈ－ＣＤＲ２、Ｈ－ＣＤＲ２、Ｈ－ＣＤＲ３、ＶＬ、Ｌ－ＣＤＲ１、Ｌ－ＣＤＲ２、Ｌ－ＣＤＲ３、重鎖および軽鎖のアミノ酸配列を示す。 図１６：プラスミンのタンパク質分解活性に対する本発明の７７Ａ３および抗体の効果 ７７Ａ３（四角）およびＴＰＰ－１７９２８（丸）について、実施例１１に記載の使用した抗体濃度に応じたプラスミン活性を示す。二重反復で実施された２～３回の独立した実験からの１つの用量応答曲線が、例として示される。７７Ａ３は、濃度依存的にプラスミン活性に対する阻害作用（ＩＣ５０ １．７μＭ）を示すが、ＴＰＰ－１７９２８は驚くべきことに、１０μＭの濃度までプラスミン活性を阻害しない（実施例１１におけるＩＣ５０値の表による概要も参照されたい）。
配列表
以下の配列を開示する配列表を添付する：
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実施例
実施例１：ＢｉｏＩｎｖｅｎｔ抗体ライブラリーからの抗体ＴＰＰ－１２３８７の生成
完全ヒト抗体ファージディスプレイライブラリー（ＢｉｏＩｎｖｅｎｔ ｎ－ＣｏＤｅＲ Ｆａｂラムダライブラリー）を使用して、ヒト由来およびウサギ由来のヒトα２－アンチプラスミンである可溶性ビオチン化抗原に対する選択によってヒトモノクローナル抗体を単離した。
ヒトα２－アンチプラスミンを商業的供給源（抗体オンライン；カタログ番号ＡＢＩＮ２５４４３０６）から使用したが、ウサギ抗原は組換え発現および精製によって自家生産された。このために、ウサギα２－アンチプラスミンからのｃＤＮＡを標準発現ベクターにクローニングし、ＨＥＫ２９３細胞を、製造説明書に従って２９３ｆｅｃｔｉｎトランスフェクション試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１２３４７－０１９）を用いてこの構築物で一過性にトランスフェクトした。発現したウサギα２－アンチプラスミンを、Ｎｉ－ＩＭＡＣおよびサイズ排除クロマトグラフィーを介して細胞培養上清から精製した。
Ｓｕｌｆｏ－ＮＨＳ－ＬＣ－Ｂｉｏｔｉｎキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号Ａ３９２５７）を用いて抗原をビオチン化した。遊離ビオチンを、適切な緩衝液に対する透析によって反応物から除去した。
パンニング手順のために、以下のプロトコールを適用した：ストレプトアビジン結合Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｍ－２８０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１１２０５Ｄ）を、それぞれビオチン化抗原（１チューブ）およびビオチン化オフターゲット（３チューブ）で室温（ＲＴ）で１時間被覆した。ダイナビーズを洗浄し、その後、エンドオーバーエンド回転を伴いＲＴで１時間ブロックした。オフターゲット結合剤の枯渇のために、ブロッキングされたファージライブラリーを、ブロッキングされたオフターゲットロードダイナビーズに添加し、エンドオーバーエンド回転を伴い室温で１０分間インキュベートした。この枯渇工程を２回繰り返した。枯渇したファージライブラリーを、ブロックされた標的ロードダイナビーズに添加し、エンドオーバーエンド回転を伴いＲＴで６０分間インキュベートした。ストリンジェントな洗浄後（３ｘブロッキング緩衝液中、９ｘ０．０５％ Ｔｗｅｅｎ－２０を伴うＰＢＳ中（１５０ｍＭ ＮａＣｌ；８ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４；１．５ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４；ｐＨ＝７．４～７．６に調整））、コーティングされた標的に特異的に結合するＦａｂ－ファージを有するダイナビーズを直接使用して、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）株ＨＢ１０１を感染させた。続いて、Ｍ１３ＫＯ７ヘルパーファージ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１８３１１０１９）を用いて、ファージを大腸菌株ＨＢ１０１中で増幅する。以下の選択ラウンドにおいて、標的濃度を低下させて、高親和性結合剤の選択圧を増大させた。
このライブラリのパンニング中に、４つの異なる選択戦略が実施された：
戦略Ｉは、両方ともＮ末端を欠く、全長ヒトα２－アンチプラスミンおよびウサギα２－アンチプラスミンに対してそれぞれ結合活性を示す抗体を同定するように設計された。ビオチン化された無関係なタンパク質を使用して、枯渇工程を含めた。
戦略ＩＩは、α２－アンチプラスミンのプラスミン結合部位を認識する抗体を目的とした。戦略Ｉと同様に、成功の確率を高めるために、抗原としてプラスミン結合部位を欠くα２－アンチプラスミン変異体を用いて、枯渇工程を含めた。
２つのさらなる戦略（戦略ＩＩＩおよびＩＶ）において、α２－アンチプラスミンのいわゆる反応中心ループ（ＲＣＬ）を表すビオチン化直鎖およびビオチン化環状ペプチドをそれぞれ使用した。どちらの場合も、無関係なビオチン化タンパク質を枯渇工程に使用した。
パンニング戦略の詳細な概要を図１に示す。
実施例２：組換えＤＮＡ構築物ならびにＦａｂおよび完全長抗体の発現、精製および定量化
ＨＥＫ２９３－６Ｅ細胞における産生
一過的にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３－６Ｅ細胞を使用する哺乳動物細胞培養によって、Ｆａｂならびに全長抗体を産生した。重鎖および軽鎖を適切な発現ベクター系にクローニングした。細胞を３～４日間インキュベートした。上清を回収し、Ｆａｂおよび抗体を記載のように精製した。
Ｆａｂおよび抗体の精製および定量
抗体を、プロテインＡクロマトグラフィー（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｃｈｅｒ、カタログ番号Ａ２６４５５）により、製造業者の説明書に従って精製した。
標準的なタンパク質精製法を使用することによって、抗体、抗原結合部分、またはそれらの誘導体を培地から回収した。
Ｆａｂを、無菌濾過された哺乳動物細胞上清から、３段階の研究下流プロセスを用いて精製した。捕捉工程として、ＰＢＳ ｐＨ７．４中で平衡化した「Ｃａｐｔｕｒｅ Ｓｅｌｅｃｔ ＩｇＧ－ＣＨ１」アフィニティーカラム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、カタログ番号４９４３２０００５）を使用した。洗浄緩衝液（ＰＢＳ ｐＨ７．４）で、１０カラム容量で洗浄した後、グリシン０．１Ｍ ｐＨ３．０（６ＣＶ）を用いてＦａｂの溶出を達成した。Ｔｒｉｓ Ｂａｓｅで中和すると、サイズ排除クロマトグラフィー（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００、カタログ番号ＧＥ２９３２１９０５）を用いて、ＤＰＢＳ ｐＨ７．４への緩衝液交換および凝集物除去を行った。分析用サイズ排除クロマトグラフィーは、得られたバッチ中に二量体が存在しないことを実証した。
完全長抗体の定量のために、抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ特異的抗体（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｉ２１３６）を、４℃で３８４ウェルマイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ）に一晩、５μｇ／ｍｌの濃度でコーティングした。目的のＩｇＧを含有する溶液を、異なる濃度で添加して、室温で１時間インキュベートした。検出のために、検出抗体Ａ０１７０（Ｓｉｇｍａ）および基質としてＡｍｐｌｅｘ Ｒｅｄを添加した。蛍光は、ＳｐｅｃｔｒａＦｌｕｏｒｐｌｕｓリーダー（Ｔｅｃａｎ）を用いて５３５／５９０ｎｍでモニターした。
Ｆａｂのような抗体変異体の定量のために、Ｈｕｍａｎ Ｋａｐｐａ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ（Ａｂｃａｍ、カタログ番号ａｂ１５７７０９）を製造業者の説明書に従って使用した。
実施例３：抗α２－アンチプラスミン結合活性を試験するための酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）
標準ＥＬＩＳＡフォーマットを用いて、ヒトおよびウサギα－２－アンチプラスミンに対する本発明のＦａｂの結合親和性をそれぞれ分析した。抗原を黒色３８４ウェルＭａｘｉｓｏｒｐマイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ；カタログ番号４６０５１８）にコーティングし、１Ｘコーティング緩衝液（Ｃａｎｄｏｒ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ；カタログ番号１２１１２５）中で１μｇ／ｍｌの濃度に希釈した。プレートを４℃で一晩インキュベートした。一晩インキュベートした後、ＰＢＳ＋０，０５％ Ｔｗｅｅｎ２０を用いてプレートを２Ｘ５０μｌ／ウェルで洗浄した。その後、５０μｌ／ウェルのブロッキング緩衝液（Ｓｍａｒｔ Ｂｌｏｃｋ；Ｃａｎｄｏｒ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ；カタログ番号１１３５００）を加え、プレートを室温で１時間インキュベートした。その後、プレートを、５０μｌ／ウェルのＰＢＳ＋０，０５％ Ｔｗｅｅｎ２０緩衝液を用いて３Ｘ洗浄した。本発明のＦａｂを、３０μｌ／ウェルの最終容量で異なる濃度で添加した。プレートを室温で１時間インキュベートした。このインキュベーション工程の後、プレートを、５０μｌ／ウェルのＰＢＳ＋０，０５％ Ｔｗｅｅｎ２０緩衝液を用いて３Ｘ洗浄した。結合したＦａｂおよび完全長抗体の検出のために、抗ヒトラムダ軽鎖（結合および遊離）－ペルオキダーゼ抗体（シグマ；カタログ番号Ａ５１７５）を、１０％ブロッキング緩衝液中で１：１０．０００の係数で希釈した。３０μｌ／ウェルのこの希釈検出抗体を加え、プレートを室温で１時間インキュベートした。このインキュベーション工程の後、プレートを、５０μｌ／ウェルのＰＢＳ＋０，０５％ Ｔｗｅｅｎ２０緩衝液を用いて３Ｘ洗浄した。基質として、３０μｌ／ウェルの１：１０００希釈Ａｍｐｌｅｘレッド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；カタログ番号１２２２２；ＤＭＳＯ中１０ｍＭの原液）および１：１０．０００の過酸化水素（Ｍｅｒｃｋ；カタログ番号１０７２０９；３０％原液）の混合物を加え、プレートを暗所で２０分間インキュベートした。
測定には、Ｉｎｆｉｎｉｔｅ ｆ５００リーダー（Ｔｅｃａｎ）を使用した。測定モード：蛍光；トップリーディング；Ｅｘ ５３５ｎｍ；Ｅｍ ５９０ｎｍ。
スクリーニングされた２×１０１０のＦａｂ変異体の総数から、２９４４の変異体を、それぞれヒトおよびウサギα２－アンチプラスミンの結合について試験される潜在的な候補として選択した。
実施例２に記載されるように、ＨＥＫ２９３細胞を一過性にトランスフェクトした。得られた上清を、ヒトおよびウサギ抗原に結合するそれらの能力を試験するために、さらなる精製または希釈なしで直接使用した。これらの２９４４個のＦａｂから、異なる配列を示す８８個の候補が、２つの抗原に対して要求される種間結合活性を示した。
コンホメーションについて、本発明の８８の変異体を、それらの結合能力について再試験した。このために、トランスフェクトされた細胞の上清を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で、１：１，５、１：４，５、１：１３，５、１：４０，５、１：１２１，５、１：３６４，５、１：１０９３，５の係数で希釈した。これらの希釈試料を、ヒトおよびウサギα－２－アンチプラスミンの結合について試験した。
１つの用量応答曲線を、四重反復で実施された２～３回の独立した実験の例として図４に示す。３つの独立した実験について、ヒトα２－アンチプラスミンに対するＴＰＰ－１２３８７の結合活性についてのＥＣ５０値は、以下の通りであった：それぞれ、１．２Ｅ－０７Ｍ（図４に示す通り）、１．０Ｅ－０７Ｍ、および１．３Ｅ－０７Ｍ。ウサギα２－アンチプラスミンに対する結合活性は、それぞれ、６．０Ｅ－０９Ｍ（図４に示す通り）、６．０７Ｅ－０９Ｍおよび６．２Ｅ－０９Ｍであった。
実施例４：α２－アンチプラスミン機能遮断活性の選択された候補を試験するための生化学アッセイ
抗α２アンチプラスミン分子の機能的遮断活性を試験するために、Ｆａｂｓまたは完全長抗体を、１ｎＭのヒトα２－アンチプラスミン（抗体オンライン；カタログ番号ＡＢＩＮ２５４４３０６）、または自社生産のウサギα２－アンチプラスミンまたは自社生産のカニクイザルα２－アンチプラスミンと、５０ｍＭ ＴＲＩＳ－ＨＣｌ（ＧＩＢＣＯ；カタログ番号１５５６７－０２７（５０ｍＭ））、１００ｍＭ ＮａＣｌ（Ｓｉｇｍａ；カタログ番号Ｓ７６５３）、５ｍＭ ＣａＣｌ２（Ｓｉｇｍａ；カタログ番号２１１１５－１００ＭＬ）、０，１％アルブミン０，１％（Ｓｉｇｍａ；ＢＳＡ、カタログ番号Ａ４５０３－１００ｇ）からなる緩衝液中で、ｐＨ７，４で、３７℃で２０分間予めインキュベートした。
その後、最終濃度４００ｐＭのヒトプラスミン（Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＩＮＣ；カタログ番号ＨＣＰＭ０１４０）および最終濃度５０μｍの蛍光基質Ｉ－１２７５（Ｂａｃｈｅｍ；ＭｅＯＳｕｃ－Ａｌａ－Ｐｈｅ－Ｌｙｓ－ＡＭＣトリフルオロアセテート塩；カタログ番号Ｉ－１２７５（ストック：ＤＭＳＯ中１０ｍＭ））を加え、反応物を３７℃で１時間インキュベートした。この反応を３８４ウェルマイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ；カタログ番号２６２２６０）中で実施した。蛍光発生シグナルを、以下の条件で測定した：モード蛍光トップリーディング、Ｅｘ ３６０ｎＭ、Ｅｍ ４６５ｎｍ、Ｅｘ帯域幅５ｎｍ、Ｅｍ帯域幅５ｎｍ。
Ｆａｂおよび／または完全長抗体機能遮断活性の用量依存性を決定するために、これらの分子の濃度を上記のように測定した。定義された濃度で開始して、続いて１：３または１：４希釈工程が続く異なる濃度のＦａｂおよび／または完全長抗体を、それぞれ１ｎＭのヒト、カニクイザル、またはウサギα２－アンチプラスミンとプレインキュベートした。
８８個のＦａｂ候補を、ヒトおよびウサギα２－アンチプラスミンでの単一点測定における機能遮断活性について試験し、これは、一過的にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞から得られた上清から、最大可能体積を活性アッセイに加えたことを意味する。これにより、約３０％のα２－アンチプラスミン活性の少なくとも低下を示す１７個のＦａｂが同定された。
次の工程において、これらの１７個のＦａｂを完全長ＩｇＧ１抗体フォーマットに再フォーマットした。これらのうち１２種は、妥当な発現率を示した。
実施例３に記載の方法に従って、これらの１２種の抗体を、ヒトおよびウサギα２－アンチプラスミンに用量依存的に結合する能力について試験した。生成されたデータは、ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍソフトウェアを用いて分析した。抗体の結合活性をＥＣ５０値として計算した。四重反復で２～３回の独立した実験を実施した。
次の工程において、これらの１２個の完全長抗体は、ヒトおよびウサギα２－アンチプラスミンに対する活性を遮断することを用量依存的に再試験した。
ヒトおよびウサギα２－アンチプラスミン抗体に対するその結合活性および機能遮断活性に基づいて、ＴＰＰ－１２３８７をさらなる試験および最適化のために選択した。図２は、実施例３において決定された、ヒトおよびウサギα２－アンチプラスミンに対するＴＰＰ－１２３８７に対応するＦａｂフラグメントの結合活性を示す。図３は、実施例４において決定された、ヒトおよびウサギα２－アンチプラスミンに対するＴＰＰ－１２３８７に対応するＦａｂフラグメントの機能遮断活性を示す。図４は、実施例３に記載される結合アッセイにおいて決定される、ヒトおよびウサギα２－アンチプラスミンに対するＩｇＧ１抗体ＴＰＰ－１２３８７の結合活性を示す。図５は、実施例４に記載の機能遮断アッセイにおいて決定された、ヒトおよびウサギα２－アンチプラスミンに対するＩｇＧ１抗体ＴＰＰ－１２３８７の機能遮断活性を示す。ヒトおよびウサギアルファ２－アンチプラスミンに対するＴＰＰ－１２３８７の中和活性についての１つの用量応答曲線を、四重反復で実施した２～３回の独立した実験の例として図５に示す。３つの独立した実験について、ヒトα２－アンチプラスミンに対するＴＰＰ－１２３８７の機能遮断活性のＩＣ５０値は、以下の通りであった：それぞれ、１．７Ｅ－０７Ｍ（図５に示す通り）、１．８Ｅ－０７Ｍ、および１．８Ｅ－０７Ｍ。ウサギα２－アンチプラスミンに対する結合活性は、１．４Ｅ－０８Ｍ（図４に示す）、１．３Ｅ－０８Ｍおよび１．５Ｅ－０８Ｍであった。
次の工程において、ＴＰＰ－１２３８７を、カニクイザルα２－アンチプラスミンに対するその結合活性について、ならびにその機能遮断活性について試験した。カニクイザルα２－アンチプラスミンを、ウサギα２－アンチプラスミンと同じ方法で作製した。カニクイザルα２－アンチプラスミンに対するＴＰＰ－１２３８７の結合活性およびその機能阻止活性の値を図６に示す。カニクイザルα２－アンチプラスミンに対する抗体ＴＰＰ－１２３８７の結合活性および機能遮断活性についての１つの用量応答曲線を、四重反復で実施した２～３回の独立した実験の例として図６に示す。これにより、カニクイザルα２－アンチプラスミンに対するＴＰＰ－１２３８７の結合活性についてのＥＣ５０値は、第２の独立した実験において９．０Ｅ－０８Ｍ（図６．１に示す）および９．０Ｅ－０８Ｍであり、カニクイザルα２－アンチプラスミンの機能遮断活性についてのＩＣ５０は、第２の実験において１．６Ｅ－０７Ｍ（図６．２に示す）および１．６Ｅ－０７Ｍであった。
実施例５：リード抗体ＴＰＰ－１２３８７の親和性最適化
抗体ＴＰＰ－１２３８７を、その親和性を最適化し、その機能効率を高めることを目的とするリード最適化手順に供した。
親和性成熟は、最初の単一突然変異収集ラウンドと、それに続く最も親和性および効力を増加させるアミノ酸交換の組換えと、それに続く生殖細胞系列化および配列最適化キャンペーンによって行った。ＮＮＫ（Ｎ＝ＡまたはＧまたはＣまたはＴ、Ｋ＝ＧまたはＴ）を集める突然変異については、以下の個々のアミノ酸位置でのランダム化を、残基ＡＡＷＤＤＳＬＳＧＷＶ（ＣＤＲ－Ｌ３を含む残基９１～１０１）およびＡＲＥＹＹＤＳＳＧＹＹＨＬＤＹ（ＣＤＲ－Ｈ３残基９８～１１０およびそのＮ末端部位でＣＤＲに隣接する２つの追加のアミノ酸を含む残基９６～１１０）のＮＮＫコドン多様化を含む合成オリゴヌクレオチドを使用する部位特異的突然変異誘発によって生成した。
得られた単一のＮＮＫライブラリーを配列決定し、ＣＤＲ－Ｌ３および１５６ＣＤＲ－Ｈ３に対するＴＰＰ－１２３８７の１３９個のアミノ酸交換変異体を同定した（表３．１および３．２を参照されたい）。
表３．１：ＴＰＰ－１２３８７のＣＤＲＬ３における交換の一覧
Figure 2023541179000057
表３．２：ＣＤＲＨ３とＴＰＰ－１２３８７の２つのＮ末端隣接アミノ酸の交換のリスト
Figure 2023541179000058
全ての変異体を、哺乳動物細胞株ＨＥＫ２９３の一過性トランスフェクションによって発現させ、得られた発現上清を、ヒトα２－アンチプラスミンに対するそれらの結合能力ならびにそれらの機能遮断活性について直接試験した。
抗体ＴＰＰ－１２３８７よりも高い結合および機能遮断活性を示す変異体をＨＥＫ２９３細胞において１回以上発現させ、実施例２に記載のように抗体を精製および定量し、親変異体ＴＰＰ－１２３８７と直接比較して、ヒトα２－アンチプラスミンに対するそれらの結合能力およびそれらの機能遮断能力について再試験した。
これにより、ＣＤＲ－Ｌ３内の５つの交換およびＣＤＲ－Ｈ３内の７つの交換が、親抗体ＴＰＰ－１２３８７と比較して改善された活性で同定された。改善された親和性および機能的効率を有するこれらの１１個の単一置換変異体を、ＴＰＰ－１２３８７に基づく１つの組換えライブラリー中で組換えた。ここで、選択された突然変異または対応する野生型アミノ酸を選択された各位置に導入するためにオリゴヌクレオチドを作製した。重複伸長ＰＣＲの連続ラウンドを用いてライブラリー構築を行った。最終ＰＣＲ産物を哺乳動物ＩｇＧ１発現ベクターに連結し、変異体を配列決定した。
この組換えライブラリーにおいて生成された抗体は、ＴＰＰ－１４２９０、ＴＰＰ－１４２９１、ＴＰＰ－１４２９２、ＴＰＰ－１４２９３、ＴＰＰ－１４２９４、ＴＰＰ－１４２９５、ＴＰＰ－１４２９６、ＴＰＰ－１４２９７、ＴＰＰ－１４２９８、ＴＰＰ－１４２９９、ＴＰＰ－１４３００、ＴＰＰ－１４３０１、ＴＰＰ－１４３０２、ＴＰＰ－１４３０３、ＴＰＰ－１４３０４、ＴＰＰ－１４３０５、ＴＰＰ－１４３０６、ＴＰＰ－１４３０７、ＴＰＰ－１４３０８、ＴＰＰ－１４３０９、ＴＰＰ－１４３１０、ＴＰＰ－１４３１１、ＴＰＰ－１４３１２、ＴＰＰ－１４３１３、ＴＰＰ－１４３１４、ＴＰＰ－１４３１５、ＴＰＰ－１４３１６、ＴＰＰ－１４３１７、ＴＰＰ－１４３１８、ＴＰＰ－１４３１９、ＴＰＰ－１４３２０、ＴＰＰ－１４３２２、ＴＰＰ－１４３２３、ＴＰＰ－１４３２４であった。
実施例２に記載されるように、抗体を上清から精製し、それらの濃度を決定した。次に、抗体を、ヒトα２－アンチプラスミンに結合する能力およびヒトα２－アンチプラスミンを遮断する能力について試験した（実施例３および４に記載）。
抗体ＴＰＰ－１４２９３、ＴＰＰ－１４２９８、ＴＰＰ－１４３０３、ＴＰＰ－１４３０５、ＴＰＰ－１４３０８、ＴＰＰ－１４３１３、ＴＰＰ－１４３１４、ＴＰＰ－１４３１８、ＴＰＰ－１４３２３は、ヒトα２－アンチプラスミンの結合およびヒトα２－アンチプラスミンの活性の遮断に関して最も強力であると同定されたＴＰＰ－１２３８７の最も改善された組換え変異体を表す。これらの抗体の結合および活性データを図７に示す。
実施例３および実施例４に記載の方法によれば、ＴＰＰ－１４３２３、ＴＰＰ－１４３１８、ＴＰＰ－１４３１４、ＴＰＰ－１４３１３、ＴＰＰ－１４３０８、ＴＰＰ－１４３０５、ＴＰＰ－１４３０３、ＴＰＰ－１４２９８、およびＴＰＰ－１４２９３を、用量依存的にヒトα２－アンチプラスミンに結合し、その活性を遮断する能力について試験した。各抗体について、図７．１～図７．１８に例として、四重反復で実施した２～３回の独立した実験から１回の用量反応曲線を示す。（表３．３参照）
表３．３：３つの独立した実験の結合活性ＥＣ［Ｍ］および機能遮断活性ＩＣ５０［Ｍ］
Figure 2023541179000059
 ＊図７に示す
実施例６：配列に基づく免疫原性のリスク低減
配列に基づく免疫原性のリスクを低減するために、さらなる最適化のために抗体ＴＰＰ－１４３０８を選択した。このために、最も近い生殖系列配列とは異なるアミノ酸を交換し、対応するｃＤＮＡを合成し、ＨＥＫ２９３細胞を一過性にトランスフェクトし、本発明の発現抗体を定量したが、精製せず、ヒトα２－アンチプラスミンに結合し、ヒトα２－アンチプラスミンの機能を遮断する能力について試験した。
このアプローチの結果は４７の抗体であった。
ほとんどの生殖系列交換は、両方の機能性においてわずかな改善しか示さない。
フレームワーク配列内ならびにＣＤＲＨ１およびＣＤＲＨ２のアミノ酸のみが交換されているが、驚くべきことに、抗体ＴＰＰ－１４３０８と比較して、さらに高い結合活性および／または改善された機能遮断活性を示す６つの変異体が同定された。
これらの変異体の結合および機能遮断活性の用量反応曲線を図８に示す。
表３．５：２～３回の独立した実験の結合活性ＥＣ［Ｍ］および機能遮断活性ＩＣ５０［Ｍ］
Figure 2023541179000060
 ＊図８に示されている。
次の工程において、最も活性な抗体ＴＰＰ－１７０４４をより多量に発現させ、精製し、定量した。精製され定量化された抗体を、ヒト、カニクイザル、およびウサギα２－アンチプラスミンの機能遮断活性について再試験した。結果を図９に示す。四重反復で実施した２～３回の独立した実験から得られた用量反応曲線を一例として示す。ヒトα２－アンチプラスミンに対するＴＰＰ－１７０４４の機能遮断活性は、４．４Ｅ－１０Ｍ（図９．１に示す）であり、２回目の実験では５．４Ｅ－１０Ｍ、３回目の実験では５Ｅ－１０Ｍであった。カニクイザルα２－アンチプラスミンの阻害について、値は、４．６Ｅ－１０Ｍ（図９．２）、第２の実験については４．９Ｅ－１０Ｍ、第３の実験については５．１Ｅ－１０Ｍであった。ウサギα２－アンチプラスミンは、２．７Ｅ－０８Ｍ、２回目の実験では３．６Ｅ－０８Ｍ、３回目の実験では２．９Ｅ－０８ＭのＩＣ５０値で、ＴＰＰ－１７０４４によってその活性が遮断された（図９．３）。
最後に、免疫原性反応の理論的リスクをさらに最小限にするために、ＴＰＰ－１７０４４をヒトＩｇＧ４Ｆｃバージョンのヒト抗体に再クローニングした。得られた抗体ＴＰＰ－１７９２８を、ヒト、カニクイザル、およびウサギα２－アンチプラスミンに対するその機能遮断活性について再度試験した。結果を図１０に示す。四重反復で実施した２～３回の独立した実験から得られた用量反応曲線を一例として示す。ヒトα２－アンチプラスミンに対するＴＰＰ－１７９２８の機能遮断活性は、１．１Ｅ－１０Ｍ（図１０．１に示す）であり、第２の実験では１．６Ｅ－１０Ｍであった。カニクイザルα２－アンチプラスミンの阻害について、値は、２．６Ｅ－１０Ｍ（図１０．２）、２回目の実験では３．４Ｅ－１０Ｍ、３回目の実験では２．９Ｅ－１０Ｍであった。ウサギα２－アンチプラスミンは、ＴＰＰ－１７９２８によってその活性が１．５Ｅ－０８Ｍ（図１０．３）、第２の実験の１．９Ｅ－１０Ｍ、第３の実験の１．６Ｅ－１０ＭのＩＣ５０値で遮断された。
実施例７：インビトロ凝血溶解
過去１０日間投薬されていない健常被験体から静脈穿刺によりヒト血を採取した（倫理委員会「Ａｅｒｚｔｅｋａｍｍｅｒ Ｎｏｒｄｒｈｅｉｎ」、＃２０１７０２９によって承認された手続き）。血液を、１／１０体積の３．８％クエン酸三ナトリウムを含有するプラスチックチューブに採取した。血小板不良血漿（ＰＰＰ）は、２５００ｇで、１０分間４℃で直ちに遠心分離し、－２０℃で保存した。
全ての実験について、少なくともｎ＝３の独立したドナーからの血漿を使用した。血餅溶解アッセイは以下のように実施した。凍結血漿を解凍し（３７℃で３０分間）、９６ウェルプレート中で規定濃度の試験化合物［０．０１５μＭ～１μＭの間で変化する］または対照としてのみ溶媒と混合した。第２の９６ウェルプレート上で、ＣａＣｌ２（Ｓｉｇｍａ；カタログ番号２１１１５～１００ＭＬ）［最終濃度：１２．５ｍＭ］を凝血塊誘導剤として、低用量ｔＰＡ（Ａｃｔｉｌｙｓｅ（登録商標）、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ）［最終濃度０．３μｇ／ｍｌ］を溶解開始剤として調製した。試験化合物を血漿中で短時間インキュベートした後（３７℃で５分間）、混合物を第２のプレートに加え、マイクロプレートリーダー（Ｔｅｃａｎ ｉｎｆｉｎｉｔｅ ２００ Ｐｒｏ）に直接移して、吸収（４０５ｎｍ、３７℃、１／分）を経時的に３時間測定した。溶解時間短縮の最終決定のために、ｔＰＡ誘導溶解時間を１００％（各ドナー血漿について個別に）に設定し、溶解時間短縮を用量－応答曲線において各試験化合物について計算した。
ウサギ血漿の分析のために、雄のニュージーランド白色ウサギからの全血を静脈穿刺により得て、ヒト血漿について上記のように調製し、使用した。
図１１に示されるように、抗体ＴＰＰ－１７９２８は、ヒト血漿およびウサギ血漿において、それぞれ、用量依存的に、ｔＰＡ誘導性凝血塊溶解時間を減少させる。ヒト血漿については、ＴＰＰ－１７９２８の機能遮断活性の値は、２．５Ｅ－０７Ｍであり、ウサギ血漿については２．３Ｅ－０７Ｍであった。
実施例８：ウサギにおける急性肺塞栓症におけるＴＰＰ－１７９２８のインビボ試験
肺塞栓症における血餅溶解に対する本発明の抗α２－アンチプラスミン抗体の効果を研究するために、ウサギインビボモデルを使用した。
雄ニュージーランド白ウサギにキシラジン／ケタミン（５ｍｇ／ｋｇ＋４０ｍｇ／ｋｇ、Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｘ１１２６およびＫ２７５３）を筋肉内注射して麻酔した。耳、頸部および左後肢（大腿三角の領域）を剃毛した。ウサギを麻酔状態に保つために、キシラジン／ケタミン（８０ｍｌ＋８００ｍｌ、６０ｍｌ ＮａＣｌ ０．９％）を５ｍｌ／ｈで耳静脈から注入した。ウサギを加熱プレート上に置き、全実験時間３７℃に保った。左大腿静脈を化合物投与および採血のためにカニューレ挿入し、右頸静脈を血餅注入のためにカニューレ挿入した。
蛍光標識血餅の調製のために、ウサギ血小板不良血漿を、ＡＬＥＸＡ４８８蛍光標識ヒトフィブリノゲン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号Ｆ１３１９１）と混合した。２．５μｌのバトロキソビン［２０Ｕ／ｍｌ］（ＬＯＸＯ、カタログ番号１０１－０４）および２．５μｌのＣａＣｌ２［０．１ｍＭ］を４５μｌの血漿混合物に添加することによって凝固を開始した；最終血餅容量５０μｌは、７５μｇの蛍光標識フィブリノゲンを含有する。
血餅の成熟（３７℃で３０分）後、２血餅／ｋｇ体重を麻酔ウサギの頸静脈に注射し、肺における血餅の塞栓をもたらした。３０分後に、生理食塩水、抗体ＴＰＰ－１７９２８、ｔＰＡ、または抗体ＴＰＰ－１７９２８とｔＰＡの組み合わせのいずれかのボーラス静脈内注射によって塞栓治療を開始した。３６０分の期間にわたって、ウサギの静脈から血液サンプルを採取し、血漿蛍光を血餅溶解の間接的パラメータとして分析した。同時に、治療開始直後および治療３００分後に、耳出血時間を決定した。耳出血時間にアクセスするために、３－５ｍｍのアプリの切開を、耳の外縁（外耳静脈に近い）に平行にメス刃を用いて作製した。３０秒毎に、切開部のすぐそばに小さなフィルターチップで穏やかに叩くことによって、切開部がまだ出血しているかどうかが証明された。
図１２．１に示すように、抗体ＴＰＰ－１７９２８を用いたウサギにおける肺塞栓症の治療は血餅溶解の増加をもたらし、これは、経時的にｔＰＡ治療に匹敵すると考えられる。ＴＰＰ－１７９２８は、血餅溶解の間接測定パラメータとして、血漿蛍光を用量依存的に増加させる（対照と比較してＡＵＣの２．１倍増加）。１５ｍｇ／ｋｇのＴＰＰ－１７９２８と低濃度のｔＰＡ（０，１２５ｍｇ／ｋｇ）との併用は、血餅の溶解をより速く促進した。ｔＰＡ治療はまた、血餅の溶解に対する用量依存的効果を示す（図１２．２）。
血餅溶解のパラメータとしての血漿蛍光の増加を伴う同様の結果が、さらなるウサギ肺塞栓実験において、３０ｍｇ／ｋｇのＴＰＰ－１２３８７（対照と比較してＡＵＣの２．６倍の増加）および１５ｍｇ／ｋｇのＴＰＰ－１７０４４（対照と比較してＡＵＣの２．１倍の増加）について観察された。
耳出血時間の測定
上記の実験では、同時に耳出血時間を測定した。治療適用の直後（０分）に、耳出血時間を以下のように測定した。耳出血時間にアクセスするために、３－５ｍｍのアプリの切開を、耳の外縁（外耳静脈に近い）に平行にメス刃を用いて作製した。３０秒毎に、切開部のすぐそばに小さなフィルターチップで穏やかに叩くことによって、切開部がまだ出血しているかどうかが証明された。耳出血時間は、ｔＰＡ治療と比較して、抗ａ２ＡＰ抗体治療の優れた安全性プロファイルを明らかにする。化合物投与の直後には使用された抗体濃度のいずれについても検出可能な出血時間の増加はないが、ｔＰＡ治療は、特に１ｍｇ／ｋｇの最高濃度で、耳出血時間の延長に対する即時の効果を示す。驚くべきことに、低用量のｔＰＡ（０．１２５ｍｇ／ｋｇ）と組み合わせた１５ｍｇ／ｋｇのＴＰＰ－１７９２８の組み合わせも、出血時間の有意な増加をもたらさない。このことは、有害事象、この場合は出血に関して、抗ａ２ＡＰ抗体治療がｔＰＡ治療よりも優れていることを明らかに証明している。結果を図１３に示す。出血時間の延長は、ｔＰＡ［１ｍｇ／ｋｇ］２．０３倍、ＴＰＰ－１７９２８［１５ｍｇ／ｋｇ］０．９５倍、ｔＰＡ［０．１２５ｍｇ／ｋｇ］＋ＴＰＰ－１７９２８［１５ｍｇ／ｋｇ］１．５６倍である。さらなるウサギ耳出血実験において、耳出血時間の延長に影響を及ぼさない同様の結果が、３０ｍｇ／ｋｇのＴＰＰ－１２３８７（０．９１倍）および１５ｍｇ／ｋｇのＴＰＰ－１７０４４（１．０５倍）について観察された。
実施例９：本発明の抗体の結合親和性の決定
結合アッセイは、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００装置で、プロテインＧセンサーチップおよびアッセイ緩衝液ＨＢＳ－ＥＰ＋を用いて２５℃で行った。抗体を約１５０ＲＵまで捕捉し、全動力学のために１．５６～２００ｎＭの濃度で分析物を使用した。相互作用パートナーとして、ヒト、カニクイザルおよびウサギ由来のα２－アンチプラスミンを使用した。再生は、ｐＨ１．５のグリシン－ＨＣｌを用いて行った。反応速度パラメータは、実験センサグラムを１：１ラングミュア結合モデルに適合させることによって導出した。結果を表４に示す。
表４：本発明の抗体の親和性値。
Figure 2023541179000061
実施例１０：７７Ａ３および本発明の抗体の機能遮断活性の直接比較
Ａ２ＡＰ活性に対する試験抗体７７Ａ３の遮断活性を、本発明の試験抗体と比較するために、実施例４に詳細に記載される機能遮断アッセイを使用した。簡単に述べると、試験抗体を６．１Ｅ－１１～３．０Ｅ－０８Ｍおよび．０Ｅ－０６Ｍの濃度で、それぞれＡ２ＡＰとプレインキュベートした。プラスミンおよびＩ－１２７５（プラスミンセリンプロテアーゼ活性のための蛍光発生基質）をアッセイに添加した後、プラスミンのセリンプロテアーゼ活性の尺度としての蛍光シグナルを決定した。
０．０３μＭまでの７７Ａ３濃度の増加は、プラスミンによる蛍光基質Ｉ－１２７５の切断に起因する蛍光シグナルの増加をもたらした。しかし、７７Ａ３濃度のさらなる増加は、蛍光シグナルの減少をもたらした。これは、０，０３μＭの濃度までの実施例４に記載の生化学アッセイにおける抗体７７Ａ３の試験が、α２－アンチプラスミンの遮断をもたらし、７７Ａ３抗体濃度のさらなる増加がプラスミン活性の低下をもたらし、１μＭの７７Ａ３濃度でプラスミン活性の完全な阻害をもたらすことを示す（図１４．１）。本発明の抗体について、Ａ２ＡＰの機能遮断活性についての以下のＩＣ５０値を生成した：ＴＰＰ－１７０４１－６．４Ｅ－１０Ｍ、ＴＰＰ－１７０４４－３．９Ｅ－１０Ｍ、ＴＰＰ－１７０４５－１．４Ｅ－１０Ｍ、ＴＰＰ－１７０４８－１．２Ｅ－０９Ｍ、ＴＰＰ－１７０５１－３．３Ｅ－１０Ｍ、ＴＰＰ－１７０５３－１．５Ｅ－１０Ｍ。１μＭの濃度まで試験した本発明の抗体のいずれも、蛍光シグナルの減少をもたらさず、このことは、本発明の試験抗体がプラスミン活性に影響を及ぼさないことを示している（図１４．２－１４．７）。
実施例１１：プラスミンのタンパク質分解活性を阻害することについて本発明の抗体を試験するための生化学的アッセイ
実施例１０において抗体７７Ａ３について得られた驚くべき結果をさらに調査するために、本発明の抗α２－アンチプラスミン抗体ならびに抗体７７Ａ３を、生化学的プラスミンアッセイにおいて阻害活性について試験した。このために、定義された濃度で開始し、続いて１：２または１：３希釈工程を行う異なる濃度の抗体を、Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＩＮＣ．から入手した４００ｐＭのヒトプラスミン；カタログ番号ＨＣＰＭ１４０）および１μＭの最終濃度での蛍光発生基質Ｉ－１２７５（Ｂａｃｈｅｍ；ＭｅＯＳｕｃ－Ａｌａ－Ｐｈｅ－Ｌｙｓ－ＡＭＣトリフルオロアセテート塩；カタログ番号Ｉ－１２７５（ストック：ＤＭＳＯ中１０ｍＭ））と共に、３７℃で１時間インキュベートした。この反応を３８４ウェルマイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ；カタログ番号２６２２６０）中で実施した。蛍光発生シグナルを、以下の条件で測定した：モード蛍光トップリーディング、Ｅｘ ３６０ｎＭ、Ｅｍ ４６５ｎｍ、Ｅｘ帯域幅５ｎｍ、Ｅｍ帯域幅５ｎｍ。
図１６に示されるように、ＴＰＰ－１７９２８（本発明の全ての抗体について例示的に示される）は生化学的活性に影響を及ぼさないが、７７Ａ３は１．７μＭのＩＣ５０値でプラスミンのタンパク質分解活性を遮断する。
表５：７７Ａ３および本発明の試験抗体によるプラスミンタンパク質分解活性の阻害。
Figure 2023541179000062
 ＊７７Ａ３およびＴＰＰ－１７９２８について、二重反復で実施された２～３回の独立した実験からの用量反応曲線を、図１６に例として示す。
実施例１２：ＴＰＰ－１２３８７および７７Ａ３のエピトープマッピング
エピトープマッピングは、ＰＥＰｐｅｒＣＨＩＰ（登録商標）Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙプラットフォームを使用することによって、ＰＥＰｐｅｒＰＲＩＮＴ社（Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によって実施した。
線状エピトープマッピングのために、抗原配列を、１４アミノ酸のペプチド－ペプチド重複を有する重複線状１５アミノ酸ペプチドに翻訳した。得られたペプチドマイクロアレイは、二度繰り返してプリントされた４９１種の異なるペプチドを含んでいた。
立体配座エピトープマッピングのために、抗原配列を、６、９および１２アミノ酸のペプチド－ペプチド重複を有する重複する７、１０および１３アミノ酸ペプチドに翻訳した。ペプチド合成後、全てのペプチドを、Ｃ末端システイン側鎖と適切に修飾されたＮ末端との間のチオエーテル結合を介して環化した。得られた立体配座ペプチドマイクロアレイは、二度繰り返してプリントされた１，４８８種の異なる環状拘束ペプチドを含んでいた。
マイクロアレイを、ロックランドブロッキングバッファーＭＢ－０７０（最初のアッセイの３０分前）を使用することによってブロックし、抗体インキュベーションを、ＰＢＳからなるインキュベーションバッファー中、１０％ブロッキングバッファーを含む０．０５％（線状エピトープマッピング）または０．００５％（立体構造エピトープマッピング）Ｔｗｅｅｎ２０でｐＨ７．４、で行った。
インキュベーション後、アレイを、ＰＢＳ用いて、０．０５％（線状エピトープマッピング）または０．００５％（立体配座エピトープマッピング）Ｔｗｅｅｎ２０でｐＨ７．４、で洗浄した。アレイを３×１分（線状エピトープマッピング）または２×１０秒（立体配座エピトープマッピング）洗浄した。
抗体を、インキュベーション緩衝液中、１μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌおよび１００μｇ／ｍｌの濃度でマイクロアレイ上でインキュベートした。インキュベーション時間は４℃で１６時間、１４０ｒｐｍで振盪した。
対照として、マウスモノクローナル抗ＨＡ（１２ＣＡ５）ＤｙＬｉｇｈｔ８００を１：２０００の希釈で使用した；この検出抗体を室温でインキュベーション緩衝液中で４５分染色してマイクロアレイ上でインキュベートした。
二次抗体として、ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）ＤｙＬｉｇｈｔ６８０を１：５０００の希釈で使用した。この検出抗体を、室温でインキュベーション緩衝液中で４５分染色してマイクロアレイ上でインキュベートした。
ＬＩ－ＣＯＲ Ｏｄｙｓｓｅｙ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍを用いて、走査オフセット０．６５ｍｍ、解像度２１μｍ、走査強度７／７（赤＝７００ｎｍ／緑＝８００ｎｍ）で信号を検出した。
スポット強度およびペプチドアノテーションの定量化は、２４ビットカラー化ｔｉｆｆファイルよりも高いダイナミックレンジを示す７／７の走査強度での１６ビットグレースケールｔｉｆｆファイルに基づいた。マイクロアレイ画像分析は、ＰｅｐＳｌｉｄｅ（登録商標）Ａｎａｌｙｚｅｒで行った。ソフトウェアアルゴリズムを用いて、各スポットの蛍光強度を生信号、前景信号および背景信号に分解し、前景強度の平均中央値およびスポット複製のスポット間偏差を計算した。前景強度の平均中央値に基づいて、強度マップが生成され、ペプチドマップ中の相互作用が、高いスポット強度については赤色、低いスポット強度については白色を有する強度カラーコードによって強調された。アッセイの平均スポット強度を、Ｎ末端からＣ末端までの抗原配列に対する抗体試料でプロットし、全体的なスポット強度およびシグナル対ノイズ比を可視化した。強度プロットは、試験した抗体のエピトープを同定するために、ペプチドおよび強度マップ、ならびにマイクロアレイスキャンの目視検査と関連付けた。
二次ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）ＤｙＬｉｇｈｔ６８０抗体（１：５０００）および対照マウスモノクローナル抗ＨＡ（１２ＣＡ５）ＤｙＬｉｇｈｔ８００抗体（１：２０００）による線状および立体配座ペプチドマイクロアレイの前染色は、抗原の線状または環状拘束ペプチドとのバックグラウンド相互作用を示さなかった。対照的に、目的の抗体とのインキュベーションは、以下の観察をもたらした：
表６に示されるように、ＴＰＰ－１２３８７は、コンセンサスモチーフＳＲＭＳＬＳＳを有するペプチドに対して高いシグナル対ノイズ比を示し、これは、Ａ２ＡＰの反応中心ループ（配列番号１のアミノ酸４００～４１２）に位置する配列番号１のアミノ酸４０２～４０８に対応する。
対照的に、抗体７７Ａ３については、基本コンセンサスモチーフＲＰＴＫＶＲＬＰＫを有するペプチドに対する非常に弱いシグナル対ノイズ比が同定され、これは配列番号１のアミノ酸３３０～３３８に対応する。Ａ２ＡＰのこの部分については、明確な記載はない。
表６：ＴＰＰ－１２３８７および７７Ａ３のＡ２ＡＰ結合部位
Figure 2023541179000063

Claims (24)

  1. Ａ２ＡＰに結合し、Ａ２ＡＰの活性を阻害することができる単離された抗体またはその抗原結合フラグメントであって、前記単離された抗体またはその抗原結合フラグメントがプラスミン活性を阻害しない、前記単離された抗体またはその抗原結合フラグメント。
  2. 請求項１記載の単離された抗体またはその抗原結合フラグメントであって、
    前記単離された抗体またはその抗原結合フラグメントが、解離定数（ＫＤ）≦１００ｎＭ、≦５０ｎＭ、≦２５ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、または≦０．５ｎＭで、配列番号１のアミノ酸４０～４９１の配列のヒトＡ２ＡＰに結合し、および
    前記単離された抗体またはその抗原結合フラグメントが、インビトロＡ２ＡＰ機能遮断アッセイにおいて、≦５００ｎＭ、≦２５０ｎＭ、≦１００ｎＭ、≦５０ｎＭ、≦２５ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、または≦０．５ｎＭのＥＣ５０で、配列番号１のアミノ酸４０～４９１の配列のヒトＡ２ＡＰの活性を阻害する、
    前記単離された抗体またはその抗原結合フラグメント。
  3. 請求項１または２に記載の単離された抗体またはその抗原結合フラグメントであって、
    前記単離された抗体またはその抗原結合フラグメントが、インビトロプラスミン阻害アッセイにおいて、１μＭ、２μＭ、５μＭまたは１０μＭの前記単離された抗体またはその抗原結合フラグメントの濃度までプラスミン活性を阻害しない、
    前記単離された抗体またはその抗原結合フラグメント。
  4. 請求項１、２または３に記載の単離された抗体またはその抗原結合フラグメントであって、
    前記プラスミンが、ヒトプラスミンであり、特に前記プラスミンが、配列番号１１８および配列番号１１９を含むヒトプラスミンである、
    前記単離された抗体またはその抗原結合フラグメント。
  5. 請求項１～４のいずれか一項に記載の単離された抗体または抗原結合フラグメントであって、
    ｉ）配列番号６を含むＨ－ＣＤＲ１、配列番号８を含むＨ－ＣＤＲ２、および配列番号１３を含むＨ－ＣＤＲ３を含む重鎖抗原結合領域、ならびに配列番号９を含むＬ－ＣＤＲ１、配列番号１０を含むＬ－ＣＤＲ２、および配列番号１８を含むＬ－ＣＤＲ３を含む軽鎖抗原結合領域；または
    ｉｉ）配列番号６を含むＨ－ＣＤＲ１、配列番号７を含むＨ－ＣＤＲ２、および配列番号１３を含むＨ－ＣＤＲ３を含む重鎖抗原結合領域、ならびに配列番号９を含むＬ－ＣＤＲ１、配列番号１０を含むＬ－ＣＤＲ２、および配列番号１８を含むＬ－ＣＤＲ３を含む軽鎖抗原結合領域；または
    ｉｉｉ）配列番号６を含むＨ－ＣＤＲ１、配列番号７を含むＨ－ＣＤＲ２、および配列番号１１を含むＨ－ＣＤＲ３を含む重鎖抗原結合領域、ならびに配列番号９を含むＬ－ＣＤＲ１、配列番号１０を含むＬ－ＣＤＲ２、および配列番号１７を含むＬ－ＣＤＲ３を含む軽鎖抗原結合領域；または
    ｉｖ）配列番号６を含むＨ－ＣＤＲ１、配列番号７を含むＨ－ＣＤＲ２、および配列番号１１を含むＨ－ＣＤＲ３を含む重鎖抗原結合領域、ならびに配列番号９を含むＬ－ＣＤＲ１、配列番号１０を含むＬ－ＣＤＲ２、および配列番号１８を含むＬ－ＣＤＲ３を含む軽鎖抗原結合領域；または
    ｖ）配列番号６を含むＨ－ＣＤＲ１、配列番号７を含むＨ－ＣＤＲ２、および配列番号１２を含むＨ－ＣＤＲ３を含む重鎖抗原結合領域、ならびに配列番号９を含むＬ－ＣＤＲ１、配列番号１０を含むＬ－ＣＤＲ２、および配列番号１８を含むＬ－ＣＤＲ３を含む軽鎖抗原結合領域；または
    ｖｉ）配列番号６を含むＨ－ＣＤＲ１、配列番号７を含むＨ－ＣＤＲ２、および配列番号１３を含むＨ－ＣＤＲ３を含む重鎖抗原結合領域、ならびに配列番号９を含むＬ－ＣＤＲ１、配列番号１０を含むＬ－ＣＤＲ２、および配列番号１９を含むＬ－ＣＤＲ３を含む軽鎖抗原結合領域；または
    ｖｉｉ）配列番号６を含むＨ－ＣＤＲ１、配列番号７を含むＨ－ＣＤＲ２、および配列番号１４を含むＨ－ＣＤＲ３を含む重鎖抗原結合領域、ならびに配列番号９を含むＬ－ＣＤＲ１、配列番号１０を含むＬ－ＣＤＲ２、および配列番号１８を含むＬ－ＣＤＲ３を含む軽鎖抗原結合領域；または
    ｖｉｉｉ）配列番号６を含むＨ－ＣＤＲ１、配列番号７を含むＨ－ＣＤＲ２、および配列番号１４を含むＨ－ＣＤＲ３を含む重鎖抗原結合領域、ならびに配列番号９を含むＬ－ＣＤＲ１、配列番号１０を含むＬ－ＣＤＲ２、および配列番号２０を含むＬ－ＣＤＲ３を含む軽鎖抗原結合領域；または
    ｉｘ）配列番号６を含むＨ－ＣＤＲ１、配列番号７を含むＨ－ＣＤＲ２、および配列番号１５を含むＨ－ＣＤＲ３を含む重鎖抗原結合領域、ならびに配列番号９を含むＬ－ＣＤＲ１、配列番号１０を含むＬ－ＣＤＲ２、および配列番号１８を含むＬ－ＣＤＲ３を含む軽鎖抗原結合領域；または
    ｘ）配列番号６を含むＨ－ＣＤＲ１、配列番号７を含むＨ－ＣＤＲ２、および配列番号１６を含むＨ－ＣＤＲ３を含む重鎖抗原結合領域、ならびに配列番号９を含むＬ－ＣＤＲ１、配列番号１０を含むＬ－ＣＤＲ２、および配列番号１８を含むＬ－ＣＤＲ３を含む軽鎖抗原結合領域；または
    ｘｉ）配列番号２１を含むＨ－ＣＤＲ１、配列番号８を含むＨ－ＣＤＲ２、および配列番号１３を含むＨ－ＣＤＲ３を含む重鎖抗原結合領域、ならびに配列番号９を含むＬ－ＣＤＲ１、配列番号１０を含むＬ－ＣＤＲ２、および配列番号１８を含むＬ－ＣＤＲ３を含む軽鎖抗原結合領域；または
    ｘｉｉ）配列番号６を含むＨ－ＣＤＲ１、配列番号２２を含むＨ－ＣＤＲ２、および配列番号１３を含むＨ－ＣＤＲ３を含む重鎖抗原結合領域、ならびに配列番号９を含むＬ－ＣＤＲ１、配列番号１０を含むＬ－ＣＤＲ２、および配列番号１８を含むＬ－ＣＤＲ３を含む軽鎖抗原結合領域
    を含む、前記単離された抗体または抗原結合フラグメント。
  6. 請求項１～５のいずれか一項に記載の単離された抗体または抗原結合フラグメントであって、
    ｘｉｉｉ）配列番号３２を含む可変重鎖ドメインおよび配列番号３８を含む可変軽鎖ドメイン；または
    ｘｉｖ）配列番号２３を含む可変重鎖ドメインおよび配列番号３７を含む可変軽鎖ドメイン；または
    ｘｖ）配列番号２４を含む可変重鎖ドメインおよび配列番号３８を含む可変軽鎖ドメイン；または
    ｘｖｉ）配列番号２５を含む可変重鎖ドメインおよび配列番号３８を含む可変軽鎖ドメイン；または
    ｘｖｉｉ）配列番号２６を含む可変重鎖ドメインおよび配列番号３８を含む可変軽鎖ドメイン；または
    ｘｖｉｉｉ）配列番号２７を含む可変重鎖ドメインおよび配列番号３９を含む可変軽鎖ドメイン；または
    ｘｉｘ）配列番号２７を含む可変重鎖ドメインおよび配列番号３８を含む可変軽鎖ドメイン；または
    ｘｘ）配列番号２８を含む可変重鎖ドメインおよび配列番号３８を含む可変軽鎖ドメイン；または
    ｘｘｉ）配列番号２８を含む可変重鎖ドメインおよび配列番号４０を含む可変軽鎖ドメイン；または
    ｘｘｉｉ）配列番号２９を含む可変重鎖ドメインおよび配列番号３８を含む可変軽鎖ドメイン；または
    ｘｘｉｉｉ）配列番号３０を含む可変重鎖ドメインおよび配列番号３８を含む可変軽鎖ドメイン；または
    ｘｘｉｖ）配列番号３１を含む可変重鎖ドメインおよび配列番号３８を含む可変軽鎖ドメイン；または
    ｘｘｖ）配列番号３３を含む可変重鎖ドメインおよび配列番号３８を含む可変軽鎖ドメイン；または
    ｘｘｖｉ）配列番号３４を含む可変重鎖ドメインおよび配列番号３８を含む可変軽鎖ドメイン；または
    ｘｘｖｉｉ）配列番号３５を含む可変重鎖ドメインおよび配列番号３８を含む可変軽鎖ドメイン；または
    ｘｘｖｉｉｉ）配列番号３６を含む可変重鎖ドメインおよび配列番号３８を含む可変軽鎖ドメイン
    を含む、前記単離された抗体または抗原結合フラグメント。
  7. 請求項１～６のいずれか一項に記載の単離された抗体であって、
    ＩｇＧ抗体、特にＩｇＧ１またはＩｇＧ４抗体である、前記単離された抗体。
  8. 請求項１～７のいずれか一項に記載の単離された抗体であって、
    ｘｘｉｘ）配列番号５５を含む重鎖および配列番号５７を含む軽鎖；または
    ｘｘｘ）配列番号４１を含む重鎖および配列番号５６を含む軽鎖；または
    ｘｘｘｉ）配列番号４２を含む重鎖および配列番号５７を含む軽鎖；または
    ｘｘｘｉｉ）配列番号４３を含む重鎖および配列番号５７を含む軽鎖；または
    ｘｘｘｉｉｉ）配列番号４４を含む重鎖および配列番号５７を含む軽鎖；または
    ｘｘｘｉｖ）配列番号４５を含む重鎖および配列番号５８を含む軽鎖；または
    ｘｘｘｖ）配列番号４５を含む重鎖および配列番号５７を含む軽鎖；または
    ｘｘｘｖｉ）配列番号４６を含む重鎖および配列番号５７を含む軽鎖；または
    ｘｘｘｖｉｉ）配列番号４６を含む重鎖および配列番号５９を含む軽鎖；または
    ｘｘｘｖｉｉｉ）配列番号４７を含む重鎖および配列番号５７を含む軽鎖；または
    ｘｘｘｉｘ）配列番号４８を含む重鎖および配列番号５７を含む軽鎖；または
    ｘｌ）配列番号４９を含む重鎖および配列番号５７を含む軽鎖；または
    ｘｌｉ）配列番号５０を含む重鎖および配列番号５７を含む軽鎖；または
    ｘｌｉｉ）配列番号５１を含む重鎖および配列番号５７を含む軽鎖；または
    ｘｌｉｉｉ）配列番号５２を含む重鎖および配列番号５７を含む軽鎖；または
    ｘｌｉｖ）配列番号５３を含む重鎖および配列番号５７を含む軽鎖；または
    ｘｌｖ）配列番号５４を含む重鎖および配列番号５７を含む軽鎖
    を含む、前記単離された抗体。
  9. 請求項１～６のいずれか一項に記載の抗原結合フラグメントであって、
    ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’フラグメントまたはＦ（ａｂ’）２フラグメントである、前記抗原結合フラグメント。
  10. 請求項１～９のいずれか一項に記載の単離された抗体または抗原結合フラグメントであって、
    モノクローナル抗体または抗原結合フラグメントである、前記単離された抗体または抗原結合フラグメント。
  11. 請求項１～１０のいずれか一項に記載の単離された抗体または抗原結合フラグメントであって、
    ヒト、ヒト化またはキメラ抗体または抗原結合フラグメントである、前記単離された抗体または抗原結合フラグメント。
  12. Ａ２ＡＰへの結合について、請求項１～１１のいずれか一項に記載の単離された抗体または抗原結合フラグメントと競合する、単離された抗体またはその抗原結合フラグメント。
  13. 請求項１～１２のいずれか一項に記載の単離された抗体または抗原結合フラグメントを含む、抗体コンジュゲート。
  14. 請求項１～１２のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合フラグメントをコードする、単離された核酸配列。
  15. 請求項１４に記載の核酸配列を含むベクター。
  16. 請求項１～１２のいずれか一項に記載の抗体もしくは抗原結合フラグメントを発現する、および／または請求項１４に記載の核酸もしくは請求項１５に記載のベクターを含む、単離された細胞。
  17. 請求項１６に記載の単離された細胞であって、前記細胞が、原核細胞または真核細胞である、前記単離された細胞。
  18. 請求項１～１２のいずれか一項に記載の単離された抗体または抗原結合フラグメントを産生する方法であって、請求項１６または１７のいずれか一項に記載の細胞を培養すること、および任意に抗体または抗原結合フラグメントを精製することを含む、前記方法。
  19. 請求項１～１２のいずれか一項に記載の単離された抗体もしくは抗原結合フラグメント、または請求項１３に記載の抗体コンジュゲート、および任意に１つ以上の薬学的に許容される賦形剤を含む、医薬組成物。
  20. 疾患の治療または予防に使用するための、請求項１～１２のいずれか一項に記載の単離された抗体もしくは抗原結合フラグメント、または請求項１３に記載のコンジュゲート、または請求項１９に記載の医薬組成物。
  21. 診断薬としての使用のための、請求項１～１２のいずれか一項に記載の単離された抗体もしくは抗原結合フラグメント、または請求項１３に記載の抗体コンジュゲート。
  22. 虚血性脳卒中、急性冠症候群、末梢動脈疾患、心筋梗塞、深部静脈血栓症、肺塞栓症、静脈血栓症、またはシャント血栓症などの、部分的または完全な血管閉塞に起因する虚血性事象に関連する障害または疾患の治療または予防に使用するための、請求項１～１２のいずれか一項に記載の単離された抗体または抗原結合フラグメント、または請求項１３に記載のコンジュゲート、または請求項１９に記載の医薬組成物。
  23. １つ以上のさらなる治療活性化合物、特に凝固カスケードの阻害剤、抗凝固剤および血小板凝集阻害剤から選択される化合物と同時に、別々に、または連続的に組み合わせて使用するための、請求項１～１２のいずれか一項に記載の単離された抗体もしくは抗原結合フラグメント、または請求項１６に記載のコンジュゲート、または請求項１９に記載の医薬組成物。
  24. 請求項１～１２のいずれか一項に記載の単離された抗体もしくは抗原結合フラグメント、または請求項１３に記載のコンジュゲート、または請求項１９に記載の医薬組成物、および使用説明書を含むキット。
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