KR20230068127A - 대장균을 이용한 메이신의 대량 생산방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 (a) Gentiana triflora의 6-C-글리코실트랜스퍼라제 유전자(GtF6CGT1)가 삽입되어 있는 플라스미드 및 Gentiana triflora의 글루코스 2″-O-람노실트랜스퍼라제 유전자(UGT91L1)가 삽입되어 있는 플라스미드로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 플라스미드로 형질전환된 재조합 대장균을 배지에서 배양하는 단계; (b) 상기 형질전환된 재조합 대장균을 배양 중인 배양액에 루테올린을 첨가하는 단계; 및 (c) 상기 루테올린이 첨가된 배양액에 상기 형질전환된 재조합 대장균을 배양하는 단계를 포함하는 대장균을 이용한 메이신의 대량 생산방법에 관한 것으로, 본 발명에 의하면 대장균을 이용함으로써 옥수수 수염에 소량 포함되어 있는 메이신을 대량으로 생산할 수 있는 장점이 있다.

Description

대장균을 이용한 메이신의 대량 생산방법{Method for mass production of maysin using E. coli}
본 발명은 대장균을 이용한 메이신의 대량 생산방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 옥수수 수염에 포함되어 있는 중요 생리활성 물질인 메이신(maysin)은 극히 적은 양이 포함되어 있기 때문에, 이를 대량 생산하기 위해 메이신 생합성 유전자를 활용하여 대장균 세포공장에서 대량 생산하는 방법에 관한 것이다.
옥수수 수염은 예로부터 우리나라를 비롯한 중국, 남미, 유럽 등지에서 신장염 치료제, 요로 결석 치료제, 이뇨제 및 당뇨병 치료제 등 각종 민간요법 약제로 널리 사용되어 왔다.
옥수수 수염에는 메이신(maysin)을 비롯한 클로로겐산(chlorogenic acid), 네오클로로겐산(neochlorogenic acid), 4-카페오일퀴닉산(4-caffeoylquinic acid), 람노실이소오리엔틴(rhamnosyl isoorientin) 등이 함유되어 있는 것으로 알려져 있다.
메이신(람노실 6-C-(4-케토푸코실)-5, 7, 3', 4' 테트라히드록시플라본)은 6개의 탄소 위치에서 이당류 잔기에 부착된 루테올린(luteolin)인 플라본 C-글리코시드이다. Petrorhagia velutina와 Zea mays에서 천연 제품으로 분리되었으며, 살충 및 신경 보호 활성을 나타낸다.
옥수수의 특정 메이신 생합성 경로는 C-글루코실 플라본이 생성되는 부분에서 발생하고, pl 유전자좌에 의해 조절되는 다른 일반적인 유전 메커니즘에 의해 제어될 수 있다는 점을 제외하고는 알려져 있지 않다.
플로바펜(phlobaphene)은 플로바펜 생합성이 옥수수 p1 유전자에 의해 조절되는 옥수수 계통 식물의 특정 꽃 기관에 축적된 적색 안료이며, 옥수수 실크에서 메이신 합성도 조절하는 플라보노이드 생합성 효소를 암호화하는 유전자의 Myb-동종 전사 활성제를 암호화한다.
옥수수에서 메이신 경로 순서(루테올린 → 이소오리엔틴 → 람노실리이소오리엔틴 → 메이신)의 설명은 McMullen et al.(2004)에 의해 보고되었으며(J. Hered. 95, (2004) 225-233).
메이신의 제조에 관한 종래기술로는 메이신 함량이 높은 옥수수수염 추출물의 제조방법(대한민국 등록특허공보 제10-1201628호), 옥수수수염 유래 메이신을 포함하는 유효물질의 고수율 추출방법(대한만국 공개특허공보 제10-2015-0057084호)이 개시되어 있다.
그러나, 상기와 같은 종래기술은 옥수수 수염에 포함되어 있는 메이신성분은 극히 적은 양이 포함되어 있기 때문에, 이를 대량 생산하기에는 한계가 있기 때문에, 상기 메이신을 대량생산할 수 있는 방법의 개발이 절실히 요구되고 있는 실정이다.
대한민국 등록특허공보 제10-1201628호 대한만국 공개특허공보 제10-2015-0057084호
본 발명자의 목적은 옥수수 수염에 포함되어 있는 중요 생리활성 물질인 메이신은 극히 적은 양이 포함되어 있기 때문에, 이에 대한 대안으로 메이신 생합성 유전자를 활용하여 대장균 세포공장에서 메이신을 대량 생산하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 메이신을 대량 생산할 수 있는 제조합 대장균을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기의 방법에 의해 대량 생산된 메이신을 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) Gentiana triflora의 6-C-글리코실트랜스퍼라제 유전자(GtF6CGT1)가 삽입되어 있는 플라스미드 및 Gentiana triflora의 글루코스 2″-O-람노실트랜스퍼라제 유전자(UGT91L1)가 삽입되어 있는 플라스미드로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 플라스미드로 형질전환된 재조합 대장균을 배지에서 배양하는 단계; (b) 상기 형질전환된 재조합 대장균을 배양 중인 배양액에 루테올린을 첨가하는 단계; 및 (c) 상기 루테올린이 첨가된 배양액에 상기 형질전환된 재조합 대장균을 배양하는 단계를 포함하는 대장균을 이용한 메이신의 대량 생산방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로 상기 6-C-글리코실트랜스퍼라제 유전자(GtF6CGT1)가 삽입되어 있는 플라스미드는 도 2a로 표시되는 pIBR181-GtF6CGT1일 수 있다.
본 발명의 일 구현예로 상기 글루코스 2″-O-람노실트랜스퍼라제 유전자(UGT91L1)가 삽입되어 있는 플라스미드는 도 2b로 표시되는 pET32a-UGT91L1일 수 있다.
본 발명의 일 구현예로 상기 배지는 항생제가 보충된 Luria-Bertani(LB) 한천 브로쓰 배지일 수 있다.
본 발명의 일 구현예로 상기 항생제는 암피실린, 카나마이신 및 클로람페니콜일 수 있다.
본 발명의 일 구현예로 상기 항생제는 암피실린 90~110 μg/mL, 카나마이신 40~60 μg/mL 및 클로람페니콜 90~110 μg/mL이 보충될 수 있다.
본 발명의 일 구현예로 상기 루테올린은 상기 형질전환된 재조합 대장균의 배양 15~25시간 후에 첨가될 수 있다.
본 발명의 일 구현예로 상기 루테올린은 글루코스 및 글리세린으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 탄소원과 함께 첨가될 수 있다.
본 발명의 일 구현예로 상기 글루코스는 4~6%(w/v)이고, 상기 글리세린은 4~6%(w/v)일 수 있다.
본 발명의 일 구현예로 상기 (c) 단계의 배양은 35~40℃에서 24~72시간 동안 수행될 수 있다.
본 발명의 일 구현예로 상기 재조합 대장균은 재조합 대장균 C-41(DE3)일 수 있다.
또한, 상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 Gentiana triflora의 6-C-글리코실트랜스퍼라제 유전자(GtF6CGT1)가 삽입되어 있는 플라스미드로 형질전환된 재조합 대장균을 제공한다.
또한, 상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 Gentiana triflora의 글루코스 2″-O-람노실트랜스퍼라제 유전자(UGT91L1)가 삽입되어 있는 플라스미드로 형질전환된 재조합 대장균을 제공한다.
또한, 상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 Gentiana triflora의 6-C-글리코실트랜스퍼라제 유전자(GtF6CGT1)가 삽입되어 있는 플라스미드 및 Gentiana triflora의 글루코스 2″-O-람노실트랜스퍼라제 유전자(UGT91L1)가 삽입되어 있는 플라스미드로 형질전환된 재조합 대장균을 제공한다.
또한, 상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기의 방법에 의해 대량 생산된 메이신을 제공한다.
본 발명에 의하면 대장균을 이용함으로써 옥수수 수염에 소량 포함되어 있는 메이신을 대량으로 생산할 수 있는 장점이 있다.
도 1a는 메이신 합성 과정, 도 1b는 E. coli에서 메이신이 생산되는 과정을 나타낸 것이다.
도 2a 도 2d는 각 유전자가 삽입된 플라즈미드 유전자 지도를 나타낸 것으로서, 도 2a는 pIBR181-GtF6CGT1 플라스미드 유전자 지도, 도 2b는 pET32a-UGT91L1 플라스미드 유전자 지도, 도 2c는 pACYC-UGT708A6 플라스미드 유전자 지도, 도 2d는 pET28a-RHS1 플라스미드 유전자 지도를 나타낸 것이다.
도 3은 각 발현 벡터 유전자에서 발현된 효소를 나타낸 것으로, 1. RHS1, 2. UGT91L1, 3. GtF6CGT1, 4. UGT708A6이다.
도 4는 루테올린을 piBR181-GtF6CGT1 및 pACYC-UGT708A6을 각각 발현시키는 대징균에 공급한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 루태올린을 piBR181-GtF6CGT1을 발현시키는 대장균에 공급한 결과물에 대한 질량분석 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 루태올린을 piBR181-GtF6CGT1 및 pET32a-UGT91L1을 발현시키는 대장균에 공급한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 P1과 P2에 대한 질량분석 결과를 나타낸 것이다.
도 8a 내지 도 8c는 글루코즈와 글리세린의 첨가에 따른 람노실이소오리엔틴(rhamnosyl-isoorientin)의 생산 결과를 니타낸 것으로서, 도 8a는 단지 0.5 mM의 루태올린 만 공급한 결과, 도 8b는 0.5 mM의 루태올린에 5% 글루코스를 첨가한 결과, 도 8c는 0.5 mM의 루태올린에 5% 글리세린을 첨가한 결과이다.
도 9는 람노실이소오리엔틴에 RHS1 효소 반응 결과물에 대한 질량분석 결과를 나타낸 것이다.
본 발명은 제1 구현예로 (a) Gentiana triflora의 6-C-글리코실트랜스퍼라제 유전자(GtF6CGT1)가 삽입되어 있는 플라스미드 및 Gentiana triflora의 글루코스 2″-O-람노실트랜스퍼라제 유전자(UGT91L1)가 삽입되어 있는 플라스미드로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 플라스미드로 형질전환된 재조합 대장균을 배지에서 배양하는 단계; (b) 상기 형질전환된 재조합 대장균을 배양 중인 배양액에 루테올린을 첨가하는 단계; 및 (c) 상기 루테올린이 첨가된 배양액에 상기 형질전환된 재조합 대장균을 배양하는 단계를 포함하는 대장균을 이용한 메이신의 대량 생산방법을 제공한다.
연어 실크(sm) 유전자좌를 발현하는 Zea maise L.는 포도당 변형 효소를 암호화하는 sm1 영역을 포함하는 반면, 옥수수 염색체에 위치하는 sm2 영역은 옥수수 염색체에 있는 람노실 트랜스퍼라제를 조절한다.
메이신(maysin), 아피메이신(apimaysin) 및 메톡시메이신(methoxymaysin)을 포함하는 모든 유도체는 Lee et al.(2009)에 의해 보고된 공통 경로에서 합성된다(Genome. 52, (2009) 39-48).
옥수수 배아 추출물의 주요 플라본인 메이신은 식약처로부터 피부 보호와 관련된 생리활성 클래스 2 기능성으로 개별 인정을 받았는데, 상기 메이신은 항비만, 당뇨병, 신장 관련 질환, 신경퇴행성 등을 포함한 다양한 생물학적 활성이 이 화합물과 관련되어 있다.
이 화합물의 생합성은 수율 측면에서 매우 제한적이었다. 생합성 경로 유전자의 확인은 미생물 공급원에서도 메이신을 확장하고 합성할 수 있는 가능성을 보여주었다. 미생물 플랫폼은 항상 천연물 생합성 및 외래 유전 물질을 어느 정도 발현하는 바람직한 변형에 활용되는 놀라운 예를 보여 왔다.
대장균(Escherichia coli)과 같은 미생물 세포는 시스템/합성 생물학 도구의 적용을 통해 대사적으로 조작되어 원하는 상품, 의약품, 화장품 성분 등의 생산을 검출 가능한 양에서 심지어 그램 규모까지 증가시킨다. 간단한 생체 변형을 통한 천연물 약물작용발생단 공학(pharmacophore engineering)은 E. coli에서 단일 또는 다중 유전자 발현을 통한 효과적인 도구이었다.
이 연구는 E. coli에서 식물 2차 대사산물인 메이신의 생합성을 강조한다. 이전의 보고서(Plant Cell 28, (2016) 1297-1309)를 기반으로 옥수수에서 3개의 유전자, 즉 이기능성 플라본(bifunctional flavone) C- 및 O-글루코실트랜스퍼라제(UGT708A6), 글루코스 2″-O-람노실트랜스퍼라제(UGT91L1), 및 메이신 생합성을 위하여 E. coli에서 발현될 수 있도록 코돈 최적화 및 뉴클레오티드 서열 합성을 위한 이기능성 UDP-람노스 합성효소/UDP-4-케토-6-데옥시글루코스 합성효소(RHS1)를 선택하였다.
또한, Gentiana triflora의 플라본 6-C-글리코실트랜스퍼라제(flavone 6-C-glycosyltransferase)(GtF6CGT1)를 사용하였다. 이러한 효소는 시험관내 반응을 통해 기능적으로 검증되어 메이신을 합성한다.
또한, 재조합 대장균 균주에 루테올린과 아피게닌을 외인성으로 공급하여 6-C 위치에서 2"-글루코스의 람노실 및 2"-(4-케토푸코스 슈가 모이어티)를 장식하였다. 한편, 슈가 O-메틸트랜스퍼라제는 또한 E. coli에서 메톡시메이신을 생성하기 위하여 공동 발현되었다.
본 발명의 상기 메이신의 대량 생산방법에서, 상기 6-C-글리코실트랜스퍼라제 유전자(GtF6CGT1)가 삽입되어 있는 플라스미드는 도 2a로 표시되는 pIBR181-GtF6CGT1일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 메이신의 대량 생산방법에서, 상기 글루코스 2″-O-람노실트랜스퍼라제 유전자(UGT91L1)가 삽입되어 있는 플라스미드는 도 2b로 표시되는 pET32a-UGT91L1일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 메이신의 대량 생산방법에서, 상기 배지는 항생제가 보충된 Luria-Bertani(LB) 한천 브로쓰 배지일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 메이신의 대량 생산방법에서, 상기 항생제는 암피실린, 카나마이신 및 클로람페니콜일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 메이신의 대량 생산방법에서, 상기 항생제는 암피실린 90~110 μg/mL, 바람직하게는 95~105 μg/mL, 보다 바람직하게는 100 μg/mL, 카나마이신 40~60 μg/mL 바람직하게는 45~55 μg/mL, 보다 바람직하게는 50 μg/mL, 및 클로람페니콜 90~110 μg/mL, 바람직하게는 95~105 μg/mL, 보다 바람직하게는 100 μg/mL일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 메이신의 대량 생산방법에서, 상기 루테올린은 상기 형질전환된 재조합 대장균의 배양 15~25시간, 바람직하게는 18~22시간, 보다 바람직하게는 20시간 후에 첨가될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 메이신의 대량 생산방법에서, 상기 루테올린은 글루코스 및 글리세린으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 탄소원과 함께 첨가될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 메이신의 대량 생산방법에서, 상기 글루코스는 4~6%(w/v), 바람직하게는 4.5~5.5%(w/v)이고, 바람직하게는 5%(w/v)일 수 있고, 상기 글리세린은 4~6%(w/v)), 바람직하게는 4.5~5.5%(w/v)이고, 바람직하게는 5%(w/v)일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 메이신의 대량 생산방법에서, 상기 (c) 단계의 배양은 35~40℃, 바람직하게는 36~38℃, 보다 바람직하게는 38℃에서 24~72시간, 바람직하게는 36~60시간 동안 수행될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 메이신의 대량 생산방법에서, 상기 재조합 대장균은 재조합 대장균 C-41(DE3)일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명은 제2 구현예로 Gentiana triflora의 6-C-글리코실트랜스퍼라제 유전자(GtF6CGT1)가 삽입되어 있는 플라스미드로 형질전환된 재조합 대장균을 제공한다.
본 발명은 제3 구현예로 Gentiana triflora의 글루코스 2″-O-람노실트랜스퍼라제 유전자(UGT91L1)가 삽입되어 있는 플라스미드로 형질전환된 재조합 대장균을 제공한다.
본 발명은 제4 구현예로 Gentiana triflora의 6-C-글리코실트랜스퍼라제 유전자(GtF6CGT1)가 삽입되어 있는 플라스미드 및 Gentiana triflora의 글루코스 2″-O-람노실트랜스퍼라제 유전자(UGT91L1)가 삽입되어 있는 플라스미드로 형질전환된 재조합 대장균을 제공한다.
본 발명은 제5 구현예로 상기의 방법에 의해 대량 생산된 메이신을 제공한다.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이에 제한되는 것은 아니다.
<실시예>
1. 재료 및 방법
(1). 화학물질 및 시약
Luteolin, Apigenin 및 Chrysin은 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다. 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside(IPTG)는 GeneChem Inc.(대전, 한국)에서 구입하였다. 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 등급 아세토니트릴 및 물은 Mallinckrodt Baker(미국 필립스버그)에서 구입하였다.
모든 제한 효소, pGEM-T®-easy vector, Taq polymerase 및 T4 DNA ligase는 Takara Bio(Shiga, Japan) 및 Promega(Madison, WI, USA)에서 구입하였다. 나머지 화학 물질과 시약은 신뢰할 수 있는 상업적 공급처에서 구입한 최고 화학 등급이었다.
(2). 박테리아 균주, 클로닝 및 배양 조건
메이신(maysin) 생합성 경로의 확인 및 특성화된 유전자(Plant Cell 28 (2016) 1297-1309)는 코돈 최적화되었고, 뉴클레오티드는 E. coli에서 기능적으로 발현하기 위하여 상업적으로 합성되었다(General Biosystem Inc. USA).
이기능성 효소(bi-functional enzyme): 플라본 6-C/7-O-글루코실트랜스프라제(UGT708A6: 1428 bp 길이, GeneBank: NP_001132650), 글루코스 2"-O-람노실트랜스퍼라제(Sm2 ie UGT91L1: 1284 bp 길이, GeneBank: DAA40920.1) 및 이기능성 효소: UDP-람노스 신타제 및 UDP-4-케토-6-데옥시 글루코스 신타제(Sm1 즉, RHS1: 2031bp 길이, GeneBank: AFW77498.1)를 합성하여 상이한 발현 벡터로 클로닝하였다.
RHS1은 BamHI 및 XhoI의 제한 부위에 pET28a 벡터로 클로닝되었고, UGT91L1은 NdeI 및 BamHI에서 pET32a 벡터로 클로닝되도록 합성된 반면, UGT708A6은 pACYC-Duet 벡터의 PstI 및 NotI에 클로닝하기 위하여 합성되었다.
pIBR181에서 효소 글루코스 6-C-글리코실트랜스퍼라제(GtF6CGT1)의 발현 및 생산을 위하여, pET28에서 이기능성 UDP-람노오스 합성효소/ UDP-4-케토-6-데옥시글루코오스 합성효소(RHS1) 및 글루코스 2"-O-람노실트랜스퍼라제(UGT91L1) pET32 벡터에서는 Escherichia coli C41(DE3)이 사용되었고, 모든 DNA 조작에는 E. coli XL-1 Blue(MRF' Invitrogen, USA)가 사용되었다.
모든 재조합 균주는 암피실린(100μg/mL), 카나마이신(50μg/mL) 및 클로람페니콜(100μg/mL)이 필요한 곳마다 보충된 Luria-Bertani(LB) 한천 플레이트 및 브로쓰 배지에서 성장하였다.
pIBR181-GtF6CGT1, pET28a-RHS1, pACYC-UGT708A6 및 pET32a-UGT91L1을 각각 포함하는 신선한 재조합 대장균(E. coli)(DE3)을 열충격 형질전환 방법으로 제조하였다. 또 다른 균주는 C-41(DE3) 숙주에서 piBR181-GtF6CGT1 및 pET32a-UGT91L1 플라스미드의 생물학적 형질전환에 의해 구축되었다.
(3). 단백질 발현 및 분석
이들 4개의 균주의 종 배양물(seed culture)을 상응하는 항생제가 보충된 LB 브로쓰 배지에서 제조하고, 200rpm의 진탕 배양기에서 37℃에서 밤새 배양하였다. 그런 다음 500μL의 종 배양물을 500mL 원뿔형 플라스크에 각각의 항생제가 포함된 신선한 100mL LB 배지로 옮겼다.
600 nm에서 광학 밀도(OD)가 0.6에 도달하면, 배양물을 0.4 mM 이소프로필 β-D -1-I티오갈락토피라노사이드(IPTG)로 유도하고, 200 rpm의 진탕 배양기에서 20°C에서 약 20시간 동안 배양하였다. 그런 다음 세포 펠렛을 842xg(3,000rpm)에서 10분 동안 원심분리하여 수확하고, 완충액(50mM Tris-HCl 및 10% 글리세롤(pH 7.5))으로 2회 세척(보텍싱한 후 원심분리)하고 재현탁하였다.
동일한 완충액 1mL로 세포 펠릿을 얼음조에서 Fisher Scientific Sonic Dismembrator Model 500(5-9초 펄스 켜기 및 끄기, 총 360초, 20% 진폭)을 사용하여 용해하고, 12,000rpm에서 고속 원심분리에 의해 투명한 용해물을 수집하였다. (13,475 xg) 4℃에서 30분 동안 수득된 조 단백질을 12% 나트륨 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)에 의해 추가로 분석하였다.
단백질은 -20℃에서 50mM Tris-HCl, pH 7.5 및 10% 글리세롤을 포함하는 완충액에 보관되었다. 조단백질 농도는 소 혈청 알부민을 표준으로 하고 Bradford 방법을 사용하여 결정되었다(Bradford et al. 1976).
(4). 세포 공장 시스템에 의한 이소오리엔틴(isoorientin)의 생합성
우선 UGT708A6과 GtF6CGT1 효소의 활성은 별도의 50mL 플라스크에서 in vivo 반응을 진행하여 확인하였다. UGT708A6 및 GtF6CGT1을 보유하는 E. coli의 종 배양물을 각각의 항생제가 공급된 LB 브로쓰에서 제조하고, 200rpm의 진탕 인큐베이터에서 37℃에서 밤새 인큐베이션하였다.
500 μL의 종균 접종 후, 배양물을 250 ml 코니컬 플라스크에 각각의 항생제가 보충된 2개의 새로운 50 ml LB 배지에 붓고 200 rpm으로 진탕 배양기에서 37°C에서 배양하였다.
곧 600 nm에서의 광학 밀도(OD )가 0.6에 도달하고, 배양은 200 rpm의 진탕 배양기에서 20℃에서 약 20시간 동안 0.4 mM IPTG로 유도되었다. 그런 다음, 루테올린(100μM)을 두 유도 배양물에 첨가하였다.
20시간 후, 배양 샘플을 1 ml 취하여 각각에 1 ml 메탄올과 10분 동안 보텍싱하면서 혼합하고 14,000 rpm에서 원심분리하여 투명한 샘플을 얻었다. 투명한 샘플을 역상 고성능 액체 크로마토그래피(RP-HPLC)-광다이오드 어레이(PDA)로 분석하였다.
(5). 세포 공장 시스템에 의한 람노실이소오리엔틴의 생합성
GtF6CGT1과 UGT708A6의 활성 결과를 HPLC-PDA로 분석한 결과, GtF6CGT1의 기능이 더 효과적인 것으로 나타났다. 따라서, 대장균 C-41(DE3) 숙주에 piBR181-GtF6CGT1 및 pET32a-UGT91L1 플라스미드를 갖는 재조합 균주를 50mL LB 브로쓰에서 배양하였다.
상기 언급한 바와 같이, 50mL 배양물을 준비하고, 200rpm의 진탕 배양기에서 20℃에서 0.4mM IPTG로 유도한 후 20시간 후 100μM 루테올린을 공급하였다.
유사하게, 20시간 후, 1ml의 배양 샘플을 취하고 10분 동안 보텍싱하면서 1ml 메탄올과 혼합하고 14,000rpm에서 30분 동안 원심분리하여 투명한 샘플을 얻었다. 투명한 샘플을 역상 고성능 액체 크로마토그래피(RP-HPLC)-포토다이오드 어레이(PDA)로 분석하였다.
(6). 미생물 세포에서 람노실이소오리엔틴의 대규모 생산
람노실이소오리엔틴(rhamnosyl-isoorientin)의 대규모 생산은 발효기에서 E. coli C-41(DE3)에 piBR181-GtF6CGT1 및 pET32a-UGT91L1 플라스미드를 포함하는 균주를 사용하여 수행하였다.
필요한 항생제를 첨가한 15ml 시험관에 종자 배양물을 준비하고, 37℃의 진탕 배양기에서 약 5시간 동안 배양하였다. 그런 다음 3개의 500mL 개별 플라스크에 500μL 종균(seed)을 100mL LB 브로쓰 배지에 필요한 양의 항생제를 공급한 각 플라스크에 옮기고, 200rpm의 진탕 배양기에서 37°C에서 밤새 배양하였다.
그 후, 300mL의 종균을 공기 및 pH 7.5를 유지하면서 37℃에서 필요한 양의 항생제가 포함된 3L-LB 브로쓰 배지를 갖는 오토클레이브 발효기로 옮겼다. 광학 밀도(OD)가 0.6에 도달하면 0.4mM IPTG를 첨가하고 배양물을 20℃에서 약 20시간 동안 인큐베이션하였다.
그 후, 배양액에 5% 글루코스를 공급하면서 0.5mM 루테올린을 공급하였다. 또한 동일한 조건에서 포도당 대신 5% 글리세린을 공급하여 발효기 반응을 진행하였다. 이후 24시간, 48시간, 72시간에 시료를 채취하여 역상 고성능 액체 크로마토그래피(RP-HPLC)-포토다이오드 어레이(PDA)로 생성물을 분석하였다.
그리고, 2배 부피의 에틸 아세테이트로 배양물을 수확하고, 회전 증발기로 추출된 조 생성물을 건조시켰다.
(7). 시험관내(in vitro) 반응에 의한 메이신의 생합성
이기능성(bifunctional) UDP-람노오스 합성효소/UDP-4-케토-6-데옥시글루코오스 합성효소(RHS1)가 대장균 C-41(DE3)에서 발현되었다. 갓 제조된 이 균주를 위에서 언급한 방법으로 단백질 발현을 위하여 50 ml LB 브로쓰에서 배양하였다.
RHS1의 조효소를 반응에 사용하였다. 반응은 10mM MgCl2·6H2O, 3mM NAD+, 3mM NADH, 49μL 증류수 및 5mM 람노실이소오리엔틴(rhamnosylisoorientin)을 포함하는 100mM Tris-HCl(pH 7.5)을 사용하여 15μL 총 부피에서 수행되었다.
유사하게, 다른 세트의 반응은 동일한 세트의 다른 조건에서 Tris-HCl 대신 인산염 완충액을 변경하고, NAD+ 및 NADH 대신 보조인자 NADP+ 및 NADPH를 변경하여 수행하였다. 반응 혼합물을 37℃에서 20시간 동안 인큐베이션하였다.
(8). 분석 절차 od 메이신
역상 HPLC-PDA 분석은 YMC-PACK ODS-AQ로 패킹된 C18 컬럼을 사용하여 290 nm UV 흡광도에서 수행되었다. 4.6mm 내부 직경, 150mm 길이 및 5μm 입자 크기는 바이너리 조건에서 광다이오드 어레이(PDA)에 연결되어, 25분 프로그램에 대해 1mL/min의 유속으로 유지되는 용매 A(0.05% 트리플루오로아세트산 완충액-TFA) 물과 100% 아세토니트릴(CAN)로 구성된다.
아세토니트릴은 0-20%(0-8분), 40-75%(8-15분), 75-100%(15-20분) 및 100-20%(25분)로 설정되었다. 화합물의 정제는 36분 바이너리 프로그램을 사용하여 UV 검출기에 연결된 C18 컬럼(YMC-PACK ODS-AQ; 150mm 길이, 20mm 내부 직경, 10μm 입자 크기)을 갖는 분취용 HPLC에 의해 수행되었다. 흐름은 0-20분(40%), 20-30분(75%) 및 30-36분(0%) 동안 ACN 흐름으로 프로그램 전반에 걸쳐 10mL/분이었다.
고해상도 4중 비행 전자분무 이온화 질량 분석기(HRQTOF-ESI/MS)는 Synapt G2-S 시스템(Waters)과 결합된 Acquity 질량 분석기(UPLC 포함; Waters, Milford, MA USA)를 사용하여 양이온 모드에서 수행되었다.
정제된 화합물은 TCI CryoProbe(5mm)가 장착된 Avance II 900 Bruker(독일) BioSpin NMR 분광계에 의해 구조적으로 결정되었다. 모든 샘플을 D2O로 교환하고 1H NMR(양성자), 13C NMR(탄소), HMBC(이핵 다중 결합 상관 관계) 및 HSQC(이핵 신호-양자 상관 관계)에 대해 순수한 D2O에 용해시켰다.
2. 살험 결과
(1). 단백질 발현 및 SDS-PAGE 분석
시험관 내 반응을 위한 가용성 재조합 단백질을 생산하기 위하여 4개의 플라스미드 pET28a-RHS1, pET32a-UGT91L1, piBR181-GtF6CGT1 및 pACYC-UGT708A6(도 2)을 E. coli C-41(DE3)로 형질전환시켰다.
각 단백질 RHS1, UGT91L1, GtF6CGT1 및 UGT708A6의 가용성 분획에 대한 SDS-PAGE 분석은 각각 약 (75, 47, 55 및 55) kDa에서 밴드를 나타냈다(도 3). 밴드 크기는 헥사히스티딘 태그가 붙은 융합 단백질이 있는 각 단백질의 계산된 분자량에 해당한다.
이들 단백질의 용해성 용해물을 Ni++-NTA 비드 정제 시스템에 적용하였다. 정제된 단백질을 농축, 정량화하여 시험관내 반응에 사용하였다.
(2). 이소오리엔틴과 람노실이소오리엔틴의 미생물적 생산
UGT708A6 및 GtF6CGT1 균주가 포함된 배양액에 루테올린을 20시간 후 공급하여 제조한 시료의 RP-HPLC-PDA를 분석한 결과, UGT708A6에서는 예상되는 이소오리엔틴 피크가 나타나지 않았지만, GtF6CGT1에서는 뚜렷한 이소오리엔틴 피크가 나타났다(도 4).
또한, GtF6CGT1의 동일한 샘플을 포지티브 모드에서 고해상도 QTOF-ESI/MS 질량에 적용한 결과, [M+H]+ m/z+가 449.1089 Da로 밝혀졌으며, 이는 루테올린에 결합된 글루코스 1개의 질량과 유사하다. 정확한 질량을 갖는 화학식 C21H21O11 +는 449.1078이었다(도 5).
다음으로, E. coli C-41(DE3)에 2개의 플라스미드 piBR181-GtF6CGT1 및 pET32a-UGT91L1을 보유하는 균주에 루테올린을 공급하여 얻은 RP-HPLC-PDA로 또 다른 샘플을 분석하였다.
HPLC-PDA 크로마토그램은 루테올린의 파장에 가까운 파장에서 머무름 시간 8.0 및 8.5분에 두 개의 피크를 나타냈다. 이것은 양성 모드에서 QTOF-ESI/MS에 의해 추가로 확인된 람노실이소오리엔틴 및 이소오리엔틴의 가능한 산물에 대한 단서를 제공할 수 있다. QTOF-ESI/MS 분석에 따르면, 머무름 시간 8.0분의 피크 P1은 화학식이 C27H31O15 +인 루테올린과 결합된 1개의 글루코스 및 1개의 람노스와 유사한 595.1655 Da의 [M+H]+ m/z+를 나타냈다.
595.1657의 정확한 질량과 8.5분의 피크는 449.1089 Da의 [M+H]+ m/z+를 나타내었으며, 이는 화학식이 C21H21O11 +이고, 정확한 질량이 449.1078인 루테올린에 부착된 포도당과 유사하다( 도 6 및 도 7).
(3). 람노실이소오리엔틴 대량 생산
상기 방법 및 재료에서 언급한 바와 같이 대장균 C-41(DE3)에 2개의 플라스미드 piBR181-GtF6CGT1 및 pET32a-UGT91L1을 보유하는 균주를 발효기에서 IPTG로 배양 및 유도하였다. 분석을 위한 샘플은 24시간, 48시간 및 72시간에 발효기에서 채취하였다.
추가 HPLC-PDA 및 고해상도 QTOF-ESI/MS 분석을 수행하였다. 생성물의 HPLC-PDA 피크 면적의 분석에 기초하여, 24시간에 약 45% 기질이 각각 8분 및 8.5분의 체류 시간에서 생성물 P1 및 P2로 전환되었다.
48시간 인큐베이션 시간을 더 늘리면 기질은 점차 감소하지만, 반면에 생성물 P1과 P2는 증가하였다. 같은 방식으로 72시간의 배양 기간을 더 늘리면 기질의 80%가 제품 P1과 P2로 전환되었다(도 8).
마찬가지로 발효기에서 동일한 균주로 탄소원을 글루코스와 글리세린으로 사용하여 대규모 생산을 수행하였다. 24시간, 48시간, 72시간에 채취한 시료의 결과를 분석한 결과, 글리세린의 경우 생성물 P1과 P2의 형성 패턴은 거의 동일한 반면, 포도당의 경우 P1이 P2보다 많았다. 그러나 기질이 제품으로 전환되는 속도는 시간이 지남에 따라 점차 감소하고 있다(도 8a 내지 도 8c).
(4). 생체내 메이신 합성 및 분석
RHS1의 조효소(crude enzyme)를 반응에 사용하였다. 반응은 10mM MgCl2·6H2O, 3mM NAD+, 3mM NADH, 49μL 증류수 및 5mM 람노실이소오리엔틴을 포함하는 100mM Tris-HCl(pH 7.5)을 사용하여 15μL 총 부피에서 수행되었다. 유사하게, 다른 세트의 반응은 동일한 세트의 다른 조건에서 Tris-HCl 대신 인산염 완충액을 변경하고, NAD+ 및 NADH 대신 보조인자 NADP+ 및 NADPH를 변경하여 수행하였다.
반응 혼합물을 37°C에서 20시간 동안 인큐베이션하였다. HPLC-PDA 및 QTOF-ESI/MS의 분석에서, 방법 및 재료에 언급된 바와 같이 라마노실이소오리엔틴 반응을 수행한 결과 미량의 메이신 형성이 검출되었고, 그 질량은 577.1577 Da의 [M+H]+ m/z+로 밝혀졌으며, 이는 메이신 577.1552 Da 및 화학식 C27H29O14 +의 질량과 유사하다.
질량 분석 결과는 버퍼 Tris-HCl과 포스페이트 버퍼를 사용하지만, 소량으로 메이신(maysin)이 형성되는 것으로 나타났다(도 9).
이상으로 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시예일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다.
따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다. 본 발명의 단순한 변형 내지 변경은 이 분야의 통상의 지식을 가진 자에 의하여 용이하게 이용될 수 있으며, 이러한 변형이나 변경은 모두 본 발명의 영역에 포함되는 것으로 볼 수 있다.

Claims (15)

  1. (a) Gentiana triflora의 6-C-글리코실트랜스퍼라제 유전자(GtF6CGT1)가 삽입되어 있는 플라스미드 및 Gentiana triflora의 글루코스 2″-O-람노실트랜스퍼라제 유전자(UGT91L1)가 삽입되어 있는 플라스미드로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 플라스미드로 형질전환된 재조합 대장균을 배지에서 배양하는 단계;
    (b) 상기 형질전환된 재조합 대장균을 배양 중인 배양액에 루테올린을 첨가하는 단계; 및
    (c) 상기 루테올린이 첨가된 배양액에 상기 형질전환된 재조합 대장균을 배양하는 단계를 포함하는 대장균을 이용한 메이신의 대량 생산방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 6-C-글리코실트랜스퍼라제 유전자(GtF6CGT1)가 삽입되어 있는 플라스미드는 도 2a로 표시되는 pIBR181-GtF6CGT1인 것을 특징으로 하는 대장균을 이용한 메이신의 대량 생산방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 글루코스 2″-O-람노실트랜스퍼라제 유전자(UGT91L1)가 삽입되어 있는 플라스미드는 도 2b로 표시되는 pET32a-UGT91L1인 것을 특징으로 하는 대장균을 이용한 메이신의 대량 생산방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 배지는 항생제가 보충된 Luria-Bertani(LB) 한천 브로쓰 배지인 것을 특징으로 하는 대장균을 이용한 메이신의 대량 생산방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 항생제는 암피실린, 카나마이신 및 클로람페니콜
    인 것을 특징으로 하는 대장균을 이용한 메이신의 대량 생산방법.
  6. 제4항에 있어서, 상기 항생제는 암피실린 90~110 μg/mL, 카나마이신 40~60 μg/mL 및 클로람페니콜 90~110 μg/mL이 보충되는 것을 특징으로 하는 대장균을 이용한 메이신의 대량 생산방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 루테올린은 상기 형질전환된 재조합 대장균의 배양 15~25시간 후에 첨가되는 것을 특징으로 하는 대장균을 이용한 메이신의 대량 생산방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 루테올린은 글루코스 및 글리세린으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 탄소원과 함께 첨가되는 것을 특징으로 하는 대장균을 이용한 메이신의 대량 생산방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 글루코스는 4~6%(w/v)이고, 상기 글리세린은 4~6%(w/v)인 것을 특징으로 하는 대장균을 이용한 메이신의 대량 생산방법.
  10. 제1항에 있어서, 상기 (c) 단계의 배양은 35~40℃에서 24~72시간 동안 수행되는 것을 특징으로 하는 대장균을 이용한 메이신의 대량 생산방법.
  11. 제1항에 있어서, 상기 재조합 대장균은 재조합 대장균 C-41(DE3)인 것을 특징으로 하는 대장균을 이용한 메이신의 대량 생산방법.
  12. Gentiana triflora의 6-C-글리코실트랜스퍼라제 유전자(GtF6CGT1)가 삽입되어 있는 플라스미드로 형질전환된 재조합 대장균.
  13. Gentiana triflora의 글루코스 2″-O-람노실트랜스퍼라제 유전자(UGT91L1)가 삽입되어 있는 플라스미드로 형질전환된 재조합 대장균.
  14. Gentiana triflora의 6-C-글리코실트랜스퍼라제 유전자(GtF6CGT1)가 삽입되어 있는 플라스미드 및 Gentiana triflora의 글루코스 2″-O-람노실트랜스퍼라제 유전자(UGT91L1)가 삽입되어 있는 플라스미드로 형질전환된 재조합 대장균.
  15. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 방법에 의해 대량 생산된 메이신.
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