KR20230057397A - 합성 men a 항원을 포함하는, 네이세리아 메닌기티디스에 대한 5가 백신 - Google Patents
합성 men a 항원을 포함하는, 네이세리아 메닌기티디스에 대한 5가 백신 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명자들은 다수의 병원체에 의해 유발된 박테리아성 수막염에 대한 면역화를 위한 조합 백신을 확인하였다.
Description
본원에 인용된 모든 문헌은 그 전문이 참조로 포함된다.
기술 분야
본 발명은 박테리아성 수막염에 대한 면역화, 특히 다수의 병원체에 의해 유발된 박테리아성 수막염에 대한 면역화를 위한 조합 백신에 관한 것이다.
네이세리아 메닌기티디스(Neisseria meningitidis)는 전세계적으로 박테리아성 수막염 및 패혈증의 주요 원인이며, 침습성 질환의 발병 및 유행을 유발할 수 있다. 침습성 수막구균 질환은 전세계적으로 발생한다. 발생률은 세계 여러 지역에서 다양하지만, 유아, 아동 및 청소년이 침습성 질환의 발생에 가장 취약하다. 질환의 증상은 급속하게 진행되고, 종종 파괴적인 결과를 초래한다. 피막 폴리사카라이드에서의 항원 차이에 기초하여, 엔. 메닌기티디스의 12종의 혈청군이 확인되었다. 실질적으로 모든 질환-연관 분리주는 피막화되어 있으며, 혈청군 A, B, C, W, X 및 Y는 전세계적으로 침습성 수막구균 감염의 90% 초과의 원인이 된다. 이들 혈청군의 분포는 지리적으로 및 시간적으로 달라진다.
B군 수막염은 주로 유아 및 청소년에게 영향을 미치는 심각하고 종종 치명적인 질환이다. 이는 쉽게 오진되고, 발병 24시간 이내에 사망할 수도 있으며, 치료 투여에도 불구하고 심각한 평생 장애를 유발할 수 있다.
현재 혈청군 B 수막구균에 대해 면역화되도록 설계된 2종의 허가된 백신이 존재한다: GSK의 벡스세로(BEXSERO) 및 화이자(Pfizer)의 트루멘바(TRUMENBA).
벡스세로 (또한 C4MenB로도 공지됨)는 5종의 수막구균 항원: 네이세리아 헤파린 결합 단백질 A (NHBA), 인자 H 결합 단백질 (fHbp) 변이체 1.1, 네이세리아 부착 단백질 A (NadA) 및 보조 단백질 GNA1030 및 GNA2091과 함께 B군 수막구균 NZ98/254의 유행성 균주로부터의 외막 소포 (OMV)의 제제를 함유한다. 이들 항원 중 4종은 융합 단백질 (NHBA-GNA1030 융합 단백질 및 GNA2091-fHbp 융합 단백질)로서 존재한다. 벡스세로®는 문헌에 기재되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Bai et al. (2011) Expert Opin Biol Ther. 11:969-85, Su & Snape (2011) Expert Rev Vaccines 10:575-88] 참조).
트루멘바®는 인산알루미늄 상에 흡착된 2종의 지질화된 MenB fHbp 항원 (v1.55 및 v3.45)을 함유한다.
fHbp (또한 관련 기술분야에서 게놈-유래 네이세리아 항원 (GNA) 1870, LP2086 및 단백질 '741'로서 상호교환가능하게 공지됨)는 짧은 링커 서열에 의해 연결된 20개의 보체 제어 단백질 (CCP) 모듈로 이루어진 큰 (180 kDa) 다중-도메인 가용성 당단백질인 인간 인자 H (hfH)에 결합한다. hfH는 인간 혈장에서 순환하고, 보체계의 대안적 경로를 조절한다. hfH에 대한 fHbp의 기능적 결합은 우세하게는 hfH의 CCP 모듈 (또는 도메인) 6-7에 의존하고, 보체-매개 사멸에 저항하는 박테리아의 능력을 증진시킨다. 따라서, fHbp의 발현은 생체외 인간 혈액 및 혈청에서 생존을 가능하게 한다.
여러 fHbp 분류 체계가 제안되었으므로, 새로운 하위-변이체의 배정을 위한 통합된 fHbp 명명법을 사용하는 전용 데이터베이스가 이용가능하다: 하이퍼텍스트 전송 프로토콜 (http)://neisseria.org/nm/typing/fhbp (또한 하이퍼텍스트 전송 프로토콜 (https)://pubmlst.org/neisseria/fHbp/).
fHbp는 3종의 (주요) 변이체 1, 2 및 3으로 분류되었고, 이는 하위/변이체 fHbp-1.x, fHbp-2.x 및 fHbp-3.x (여기서 x는 특이적 펩티드 하위/변이체를 나타냄)로 추가로 나뉘었다. 상이한 명명법 체계에서, 하위/변이체는 서열 다양성에 기초하여 서브패밀리 A (변이체 2 및 3에 상응함) 및 서브패밀리 B (변이체 1에 상응함)로 군분류된다.
벡스세로는 전세계적으로 순환하는 MenB 균주에 대해 넓은 적용범위를 제공할 것으로 예측된다 (Medini D et al., Vaccine 2015; 33:2629-2636; Vogel U et al. Lancet Infect Dis 2013;13:416-425; Krizova et al., Epidemiol Mikrobiol Imunol 2014; 63:103-106; Tzanakaki G et al. BMC Microbiol 2014;14:111; Wasko I et al. Vaccine 2016;34:510-515; 6. Simoes MJ et al. PLoS ONE 12(5): e0176177; 및 Parikh SR et al. Lancet Infect Dis 2017; 17:754-62). 추가로, 2015년 9월에 영국 국가 유아 면역화 프로그램 내에 벡스세로를 도입한 후, 10개월에서의 데이터는 2회 용량 후 모든 MenB 균주에 대해 83% 백신 효능을 나타냈다 (Parikh SR et al., Lancet 2016; 388:2775-82).
그러나, 살박테리아 활성은 변이체 특이적이고; 하나의 변이체에 대해 생성된 항체가 다른 변이체에 대해 반드시 교차-보호성인 것은 아니며, 다만 일부 교차-반응성이 fHbp v2와 v3 사이에 기재되어 있다 (Masignani V et al., J Exp Med 2003; 197:789-799). 벡스세로 백신에 포함된 하위/변이체 fHbpv1.1에 대해 생성된 항체는 fHbp v1과 고도로 교차-반응성이고, fHbp v2 및 v3과 약하게 교차-반응성이다 (Brunelli B et al., Vaccine 2011; 29:1072-1081).
따라서, 허가된 혈청군 B 수막구균 백신, 예컨대 벡스세로의 효능에도 불구하고, 예를 들어 벡스세로의 강도를 손상시키지 않으면서 확장된 MenB 균주 적용범위 및 개선된 면역원성을 갖는 백신을 개발할 필요가 남아있다.
WO2020/030782는 면역원성 조성물에 벡스세로 항원과 함께 추가의 fHbp 변이체를 포함시킴으로써 MenB 백신의 균주 적용범위 및 면역원성을 개선시킬 수 있는 방법을 기재한다. 특히, WO2020/030782는 변형된 fHbp v2, v3 및 v1.13 또는 v1.15 폴리펩티드를 포함하는 fHbp 융합 단백질을 포함하는 면역원성 조성물을 개시한다.
혈청군 A, C, W 및 Y에 대한 면역화를 위한 백신 접근법은 네이세리아 메닌기티디스 피막 폴리사카라이드 (CPS)에 초점을 맞추는 경향이 있었다. 일반적으로, CPS는 T-세포 비의존성 항원이며, 이는 이들이 T-세포의 관여 없이 면역 반응을 제공할 수 있다는 것을 의미한다. 이 반응은 T-세포 의존성 면역 반응을 특징화하는 여러 중요한 특성, 예컨대 면역 기억, IgM에서 IgG로의 부류 전환 및 친화도 성숙이 결여되어 있다. 그러나, 폴리사카라이드 부분이 담체 단백질에 연결되는 경우에, 이는 기억 효과를 생성하고, 또한 어린 아동에 보호를 제공하는 세포성 면역 반응을 촉발한다. 담체 단백질에 연결된 이러한 폴리사카라이드는 종종 당접합체로 지칭되고, 백신으로서 특히 가치있다. 이와 관련하여, 특히 효율적인 백신 (당접합체 백신)은 사카라이드를 링커 모이어티 (또는 스페이서)를 통해 담체 단백질에 공유 부착시킴으로써 또는 심지어 사카라이드를 선택된 담체 단백질과 직접 커플링시킴으로써 제조될 수 있다. 임의의 경우에, 당접합체는 또한 어린 아동에서 기억 및 효과를 갖는 T-세포 의존성 면역 반응을 유도할 수 있는 반면, 비-접합된 CPS는 일반적으로 성인에서 기억 효과를 제공하지 못하거나 또는 유아에서 임의의 실질적인 면역원성 효과를 제공하지 못한다.
현행 혈청군 C 백신 (멘주게이트(MENJUGATE) [Costantino et al. (1992) Vaccine 10:691-698, Jones (2001) Curr Opin Investig Drugs 2:47-49], 메닌기텍(MENINGITEC) 및 네이스백-C(NEISVAC-C))은 접합된 사카라이드를 포함한다. 멘주게이트 및 메닌기텍은 CRM197 담체에 접합된 올리고사카라이드 항원을 갖는 반면, 네이스백-C는 파상풍 톡소이드 담체에 접합된 완전 폴리사카라이드 (탈-O-아세틸화)를 사용한다.
상표명 멘베오(MENVEO), 메낙트라(MENACTRA) 및 니멘릭스(NIMENRIX)로 시판되는 백신 제품은 모두 혈청군 Y, W135, C 및 A 각각으로부터의 접합된 피막 사카라이드 항원을 함유한다.
멘베오 (또한 일반적으로 수막구균 (군 A, C, Y 및 W-135) 올리고사카라이드 디프테리아 CRM197 접합체 백신으로도 공지됨)에서, 각각의 A, C, W135 및 Y 항원은 CRM197 담체에 접합된다.
메낙트라 (또한 일반적으로 수막구균 (군 A, C, Y 및 W-135) 폴리사카라이드 디프테리아 톡소이드 접합체 백신으로도 공지됨)에서, 각각의 A, C, W135 및 Y 항원은 디프테리아 톡소이드 담체에 접합된다.
니멘릭스 (또한 일반적으로 수막구균 폴리사카라이드 군 A, C, W-135 및 Y 접합체 백신으로도 공지됨)에서, 각각의 A, C, W135 및 Y 항원은 파상풍 톡소이드 담체에 접합된다.
엔. 메닌기티디스 피막 폴리사카라이드 중에서, 엔. 메닌기티디스 혈청군 A 피막 폴리사카라이드 (MenA CPS)는 물에서 고유한 화학적 불안정성을 겪는 것으로 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Frasch et al. Adv. Biotechnol. Processes, 1990, 12, 123-145] 참조). 이러한 불안정성의 결과로서, 혈청군 A 항원은 고체 동결건조 형태로 제공된다. 따라서, 혈청군 A 항원을 함유하는 백신, 예컨대 멘베오는 현재, 투여 전에 조합 (재구성)되는 2개의 바이알에 공급되어야 한다. 접합체 백신의 MenCYW-135 성분은 액체로서 제공되며, 이는 투여 시점에 MenA 동결건조 접합체 백신 성분을 재구성하여 완전한 백신 제품을 형성하는 데 사용된다. 그러나, 이러한 백신 제품의 제공은 불편하고, 완전 액체 단일 제제가 가장 유리할 것이다.
추가로, 각각의 엔. 메닌기티디스 혈청군 A, B, C, W135 및 Y에 의한 감염에 대해 면역 보호를 제공하는, 완전 액체 5가 백신 조성물을 제공하는 것이 유리할 것이다.
MenA CPS는 (1→6)-연결된 2-아세트아미도-2-데옥시-α-D-만노피라노실 포스페이트 반복 단위로 구성되고, MenA 폴리사카라이드의 가수분해 불안정성은 주로 포스포디에스테르 연결 상의 고리 산소 및 N-아세트아미드 촉진된 가수분해로 인한 것이다. 실제로, 고리 내의 산소 및 N-아세틸 기 (NHAc)는 둘 다 포스포디에스테르 글리코시드 연결을 탈안정화시키고, NHAc의 축방향 위치는 또한 하기 보고된 반응식 A (Berti et al. Vaccine, 2012, 30, 6409-6415)에 나타낸 바와 같이 이 메카니즘에 기여하는 것으로 관찰되었다:
가수분해에 대해 저항성인 MenA 폴리사카라이드 모방체의 이용가능성은 보다 안정한 접합체 백신의 개발에 매우 매력적이다. CPS의 안정화는 상이한 방식으로 달성될 수 있고, 고리-산소가 메틸렌 기에 의해 대체된 MenA CPS 유사체가 선행 기술에서 보고되었다. 특히 이와 관련하여, 고리 내의 산소가 탄소에 의해 대체되는 경우에, 반응식 A에 기재된 탈안정화는 반응식 B에 제공된 바와 같이 방지된다:
문헌 [Toma et al. Org. Biomol. Chem., 2009, 7, 3734-3740]은 단량체 O-(2-아세트아미도-2-데옥시-5a-카르바-알파-D-만노피라노실)포스페이트의 제조를 기재하며, 여기서 메틸렌 기는 MenA CPS의 반복 단위의 피라노스 산소를 대체한다. 상기 간행물은 단량체 자체의 화학적 합성 제조만을 언급한다.
문헌 [Gao et al. (Org. Biomol. Chem. 2012, 10(33), 6673, 및 ACS Chem. Biol. 2013, 8(11), 2561) 및 Ramella D. et al. (Eur J. Org. Chem, 2014, 5915-5924)]은 메틸렌 기가 피라노스 산소 원자를 대체하는 카르바슈가를 사용함으로써 글리코실 1-O-포스페이트의 안정화를 기재한다. 이들은 또한 단백질 담체에 대한 합성 카르바-삼량체의 접합을 보고하지만, 그러나 더 높은 중합도를 갖는 카르바-유사체의 거동을 추가로 조사하지는 않았다. 또한, 특정 수준의 아세틸화 및/또는 특정 아세틸화 패턴을 갖는 카르바-유사체에 대한 언급은 없다. 또한 추가로, 고려되는 삼량체는 항-MenA CPS 항체의 결합을 억제하는 데 불량한 잠재력을 나타냈으며, 이는 기재된 유도체가 비교적 불량한 합성 항원이라는 것을 나타낸다. 천연 MenA 폴리사카라이드의 경우, 권장되는 아세틸화도는 75-90%이고, WHO 가이드라인은 MenA 백신이 적어도 61.5% O-아세틸화를 갖는 것을 권장하는 것으로 시사된다. 그러나, 저자들은 아세틸화가 O-아세틸화된 접합된 폴리사카라이드의 소수성에 유의한 변경을 만든다는 것을 추가로 개시한다. 따라서, 천연 폴리사카라이드와의 구조적 입체형태적 변화 및 입체형태 차이를 고려하여, 카르바-유사체에 대해 최적인 아세틸화의 수준 및 패턴은 예측되기에 명백하지 않다. 이는 또한 올리고머 길이의 증가에 있어서 카르바-유사체와 천연 폴리사카라이드 사이의 입체형태적 차이를 보여준 최근 인 실리코 연구에서 확인된다 (Carbohydrate Research, 486 (2019) 107838).
따라서, 우수한 안정성을 갖고, 우수한 면역원성 프로파일을 나타내며, 신뢰가능하고 편리한 합성 접근법에 따라 수득가능하고, 각각의 엔. 메닌기티디스 혈청군 A, B, C, W135 및 Y에 의한 감염에 대한 면역 보호를 제공하는 완전 액체 5가 백신 조성물에 포함시키기에 적합한 카르바MenA 유사체 폴리사카라이드 유도체를 확인할 필요가 있다.
본 발명의 제1 측면은, 대상체에게 투여된 후, 네이세리아 메닌기티디스의 혈청군 A, B, C, W135 및 Y에 대해 살박테리아성인 면역 반응을 유도할 수 있는 수성 면역원성 조성물을 제공하며, 여기서 조성물은
i. 접합된 혈청군 A 항원;
ii. 접합된 혈청군 C 항원;
iii. 접합된 혈청군 W135 항원;
iv. 접합된 혈청군 Y 항원; 및
v. 혈청군 B로부터의 1종 이상의 폴리펩티드 항원
을 포함하며, 여기서 (ii), (iii) 및 (iv)는 피막 사카라이드 항원이고, 여기서 (i)은 혈청군 A 피막 사카라이드의 합성 유사체이다.
제1 측면의 바람직한 실시양태에서, 접합된 혈청군 A 항원은 올리고머 접합체이고, 화학식 (Ia) 또는 (Ib)의 올리고머를 포함한다:
여기서 올리고머에서
n은 ≥ 6이고;
R은 H 또는 -P(O)(OR")2이고, 여기서 R"는 H 또는 제약상 허용되는 포스페이트 반대이온이고;
R'는 H 또는 제약상 허용되는 포스페이트 반대이온이고;
Rx는 H 또는 -C(O)CH3이고, 각각의 반복 단위에서 동일하거나 상이할 수 있고;
Ry는 H 또는 -C(O)CH3이고, 각각의 반복 단위에서 동일하거나 상이할 수 있고;
여기서 적어도 1개의 반복 단위에서 Rx 또는 Ry 중 적어도 하나는 -C(O)CH3이고;
Az는 -NH(CO)R1, -N(R1)2 및 -N3으로 이루어진 군으로부터 선택된 아자 치환기이고, 여기서 R1은 독립적으로 H, 선형 또는 분지형 C1-C6-알킬 및 선형 또는 분지형 C1-C6-할로알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고;
Z는 (i) 보호기,
(ii) 단백질에의 접합을 위한 관능성 링커,
또는 (iii) 선형 또는 분지형 C1-C6 알킬, 임의로 치환된 페닐, -C(O)Y, 또는 선형 또는 분지형 C1-C6-알킬-X이고,
여기서 Y는 H, 선형 또는 분지형 C1-C6-알킬 또는 보호기이고,
여기서 X는 -NH2, -N3, -C≡CH, -CH=CH2, -SH 또는 -S-C≡N이다.
제1 측면의 바람직한 실시양태에서, 접합된 혈청군 A 항원은 화학식 (IIa) 또는 (IIb)의 올리고머 접합체이다:
여기서 올리고머에서
n은 ≥6이고;
R은 H 또는 -P(O)(OR")2이고, 여기서 R"는 H 또는 제약상 허용되는 포스페이트 반대이온이고;
R'는 H 또는 제약상 허용되는 포스페이트 반대이온이고;
Rx는 H 또는 -C(O)CH3이고, 각각의 반복 단위에서 동일하거나 상이할 수 있고;
Ry는 H 또는 -C(O)CH3이고, 각각의 반복 단위에서 동일하거나 상이할 수 있고;
여기서 적어도 1개의 반복 단위에서 Rx 또는 Ry 중 적어도 하나는 -C(O)CH3이고;
Az는 -NH(CO)R1, -N(R1)2 및 -N3으로 이루어진 군으로부터 선택된 아자 치환기이고, 여기서 R1은 독립적으로 H, 선형 또는 분지형 C1-C6-알킬 및 선형 또는 분지형 C1-C6-할로알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고;
Z는 (i) 관능성 링커 또는 결합이고;
P는 단백질이다.
본 발명의 제2 측면은 제1 측면에 따른 면역원성 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 포유동물에서 면역 반응을 일으키는 방법을 제공한다.
본 발명의 제3 측면은 의약에 사용하기 위한, 제1 측면에 따른 면역원성 조성물을 제공한다.
본 발명의 제4 측면은 백신으로서 사용하기 위한, 제1 측면에 따른 면역원성 조성물을 제공한다.
본 발명의 제5 측면은 포유동물에서 면역 반응을 일으키는 방법에 사용하기 위한, 제1 측면에 따른 면역원성 조성물을 제공한다.
본 발명의 제6 측면은 엔. 메닌기티디스 감염에 대해 포유동물을 면역화시키는 데 사용하기 위한, 제1 측면에 따른 면역원성 조성물을 제공한다.
도 1은 카르바-유사체 DP8, 즉 n = 8인 화학식 (Ia)의 무작위 O-아세틸화 (즉, 올리고머가 1개 이상의 Rx 및/또는 Ry에서 아세틸화된 경우, 다시 말해서 Rx 및/또는 Ry 중 적어도 하나는 -C(O)Me임)를 위한 3개의 반응 단계의 1H-NMR 모니터링이다.
도 2는 아세틸화 % 결정을 위해 적분을 사용한 최종 무작위 O-아세틸화 카르바-유사체 DP8 (즉, n = 8인 화학식 (Ia))의 1H-NMR이다.
도 3은 최종 무작위 O-아세틸화 카르바-유사체 DP8 (화학식 Ia)의 31P NMR 스펙트럼이다. 스펙트럼은 위치 C3+C4에서 44%의 정도로 발생하는 동시 아세틸화 및 C3 또는 C4에서 28%의 정도로 발생하는 아세틸화를 보여준다. 분자의 27%는 아세틸화되지 않았다.
도 4는 본 발명에 따른 올리고머와 CRM197의 접합 반응식 및 조 반응물의 SDS-page 특징화를 도시한다.
도 5는 CPS에 대한 항-MenA 항체의 결합의 억제를 보여준다. 억제제로서 상이한 길이의 비-아세틸화 카르바MenA 올리고머 및 코팅으로서 CPS를 사용한 항-MenA mAb (도 5a), 항-MenA 폴리클로날 혈청 (도 5b)에 의한 경쟁적 ELISA. (도 5c) 항-MenA mAb와 고정화된 비오티닐화 CPS 사이의 결합의 경쟁적 SPR. a 및 b에서 MenA CPS 및 deOAc CPS는 양성 대조군이었고, 베타-글루칸 라미나린은 음성 대조군이었다. c에서 MenA CPS 및 그의 단편을 양성 대조군으로서 사용하였고, 항-MenC mAb를 음성 대조군으로서 칩 상에 유동시켰다.
도 6a, 6b, 6c 및 6d. 신-당접합체에 의해 도출된 면역 반응. 도 6a, 6b 및 6c 패널은 기하 평균으로서 보고된 항체 역가 (수평 막대)와 95%의 CI (수직 막대)를 보여준다. 도 6d 패널은 기하 평균으로서 보고된 rSBA 역가 (수평 막대)와 95%의 CI (수직 막대)를 보여준다. 양측 만-휘트니 검정을 사용하여 순위를 비교하였다; n=10. 면역전(Pre-immune)은 두 유형의 분석에서 음성 대조군이었다. 도 6a) 천연 MenA CPS에 대한 제2 부스트 후 개별 뮤린 혈청에서 추정된 항-MenA IgG 역가. avDP~15 MenA와 카르바DP6/DP8 접합체 사이에 p<0.0001. 도 6b) HSA에 접합된 탈-O-아세틸화 MenA CPS에 대해 결정된 항-deOAc MenA IgG 역가. avDP~15와 카르바DP8 접합체 사이 및 avDP8.5와 카르바DP6 접합체 사이에 p=0.002; avDP8.5와 카르바DP8 접합체 사이에 p=0.003; 및 avDP~15와 카르바DP6 접합체 사이의 비교 p=0.004. 도 6c) 코팅을 위해 MenA CPS를 사용한 제2 부스트 후 개별 혈청에서 추정된 항-MenA IgG 역가. avDP15와 Ac-carbaDP8 접합체 비교 p=0.0011. 도 6d) 각각 풀링된 및 개별 마우스 혈청에 대한 제3 주사 후 측정된 인간 및 토끼 혈청 살박테리아 역가. 순위 비교 시 유의한 차이는 발견되지 않았다. 면역화를 이중으로 수행하였으며, 대표적인 실험으로부터의 데이터가 여기에 제시된다. *풀링된 혈청에 대한 제3 주사 후 측정된 인간 및 토끼 SBA 역가; **반응자 마우스로부터 풀링된 혈청에 대한 제3 주사 후 측정된 인간 및 토끼 SBA 역가. y-축 상에 "항 Men A CPS IgG (GMT 95% CI)"가 나타내어진다.
도 7은 백신의 3회 용량 후 측정된 ELISA 역가를 보여준다: 항-MenA 폴리사카라이드 IgG 항체를 선택적 3-O-아세틸화 카르바MenA DP8의 CRM197 접합체 및 기준으로서의 천연 MenA-CRM197 백신 (즉, 양성 대조군)과 비교하여 무작위 O-아세틸화 카르바MenA 유사체 DP8의 CRM197 접합체로 평가하였다.
도 8a 및 8b는 백신의 2회 및 3회 용량 후 ELISA 역가이다. p 값은 기준 천연 MenA-CRM197과 다른 백신접종 군 사이의 비교를 지칭한다.
도 9는 백신의 3회 용량 후 SBA 역가를 보여준다: 인간 보체 매개된 살박테리아 역가를 선택적 3-O-아세틸화 카르바MenA DP8의 CRM197 접합체 및 기준으로서의 천연 MenA-CRM197 백신 (즉, 양성 대조군)과 비교하여 무작위 O-아세틸화 카르바MenA 유사체 DP8의 CRM197 접합체로 도출된 혈청에 대해 측정하였다.
도 10은 토끼 (rSBA) 및 인간 보체 (hSBA)로 수득된, 본 발명에 따른 백신 (DP8-OAc) 및 또한 본 발명에 따르지 않는 백신 (DP6-OAc)의 2회 및 3회 용량 후 SBA 역가를 보여준다.
도 11은 기준 MenABCWY 및 고체 (동결건조) MenA 성분을 갖는 MenA 제제 대 무작위 아세틸화 카르바MenA 항원을 포함하는 상응하는 완전 액체 제제에 대해 HT-ELISA에 의해 측정된 단일 및 풀링된 혈청에 대한 총 IgG 역가를 보여준다.
도 12는 기준 MenABCWY 및 고체 (동결건조) MenA 성분을 갖는 MenA 제제 대 무작위 아세틸화 카르바MenA 항원을 포함하는 상응하는 완전 액체 제제에 대해 rSBA 및 SBA에 의해 측정된 기능적 항체 반응을 보여준다.
도 13은 카르바MenA DP8 및 DP10 접합체의 SDS-page 및 웨스턴 블롯 특징화를 보여준다.
도 14는 기준으로서의 ABNGCWY 백신 (즉, 양성 대조군)과 비교하여 BNGCWY와 조합된 무작위 O-아세틸화 카르바MenA 유사체 DP10을 사용한 백신의 3회 용량 후에 측정된 ELISA 역가를 보여준다. 도 14a는 항-MenA 폴리사카라이드 IgG 항체를 보여주고, 도 14b는 항-MenC, 항-MenW 및 항-MenY 폴리사카라이드 IgG 항체를 보여주고, 도 14c는 항-NadA, 항-FHbp var.1.1, 항-NHBA, 항-231.13NB 및 항-OMV 단백질 IgG 항체를 보여주며, 여기서 각각의 항원에 대해 기준 ABNGCWY 백신은 좌측 막대에 제시되고, BNGCWY와 조합된 무작위 O-아세틸화 카르바MenA 유사체 DP10은 우측 막대에 제시된다.
도 15는 백신의 3회 용량 후 SBA 역가를 보여준다: 도 15a는 3125 및 F8238 MenA 균주를 사용함으로써 기준으로서의 ABNGCWY 백신 (즉, 양성 대조군)과 비교하여 BNGCWY와 조합된 무작위 O-아세틸화 카르바MenA 유사체 DP10으로 도출된, 혈청에 대해 측정된 인간 보체 매개된 살박테리아 역가를 보여준다. 도 15b는 C11 (MenC의 경우), 240070 (MenW의 경우) 및 860800 (MenY의 경우) 균주를 사용함으로써 기준으로서의 ABNGCWY 백신 (즉, 양성 대조군)과 비교하여 BNGCWY와 조합된 무작위 O-아세틸화 카르바MenA 유사체 DP10으로 도출된, 혈청에 대해 측정된 인간 보체 매개된 살박테리아 역가를 보여준다. 도 15c는 96217 (NadA의 경우), M14459 (fHbp var1.1의 경우), M13530 (NHBA의 경우), M08-240104 (fHbp var2의 경우), M01-240320 (fHbp var3의 경우), M15-240084 및 M08-0240264 (fHbp var1.13의 경우) 및 NZ98/254 균주를 사용함으로써 기준으로서의 ABNGCWY 백신 (즉, 양성 대조군)과 비교하여 BNGCWY와 조합된 무작위 O-아세틸화 카르바MenA 유사체 DP10으로 도출된, 혈청에 대해 측정된 인간 보체 매개된 살박테리아 역가를 보여준다.
도 2는 아세틸화 % 결정을 위해 적분을 사용한 최종 무작위 O-아세틸화 카르바-유사체 DP8 (즉, n = 8인 화학식 (Ia))의 1H-NMR이다.
도 3은 최종 무작위 O-아세틸화 카르바-유사체 DP8 (화학식 Ia)의 31P NMR 스펙트럼이다. 스펙트럼은 위치 C3+C4에서 44%의 정도로 발생하는 동시 아세틸화 및 C3 또는 C4에서 28%의 정도로 발생하는 아세틸화를 보여준다. 분자의 27%는 아세틸화되지 않았다.
도 4는 본 발명에 따른 올리고머와 CRM197의 접합 반응식 및 조 반응물의 SDS-page 특징화를 도시한다.
도 5는 CPS에 대한 항-MenA 항체의 결합의 억제를 보여준다. 억제제로서 상이한 길이의 비-아세틸화 카르바MenA 올리고머 및 코팅으로서 CPS를 사용한 항-MenA mAb (도 5a), 항-MenA 폴리클로날 혈청 (도 5b)에 의한 경쟁적 ELISA. (도 5c) 항-MenA mAb와 고정화된 비오티닐화 CPS 사이의 결합의 경쟁적 SPR. a 및 b에서 MenA CPS 및 deOAc CPS는 양성 대조군이었고, 베타-글루칸 라미나린은 음성 대조군이었다. c에서 MenA CPS 및 그의 단편을 양성 대조군으로서 사용하였고, 항-MenC mAb를 음성 대조군으로서 칩 상에 유동시켰다.
도 6a, 6b, 6c 및 6d. 신-당접합체에 의해 도출된 면역 반응. 도 6a, 6b 및 6c 패널은 기하 평균으로서 보고된 항체 역가 (수평 막대)와 95%의 CI (수직 막대)를 보여준다. 도 6d 패널은 기하 평균으로서 보고된 rSBA 역가 (수평 막대)와 95%의 CI (수직 막대)를 보여준다. 양측 만-휘트니 검정을 사용하여 순위를 비교하였다; n=10. 면역전(Pre-immune)은 두 유형의 분석에서 음성 대조군이었다. 도 6a) 천연 MenA CPS에 대한 제2 부스트 후 개별 뮤린 혈청에서 추정된 항-MenA IgG 역가. avDP~15 MenA와 카르바DP6/DP8 접합체 사이에 p<0.0001. 도 6b) HSA에 접합된 탈-O-아세틸화 MenA CPS에 대해 결정된 항-deOAc MenA IgG 역가. avDP~15와 카르바DP8 접합체 사이 및 avDP8.5와 카르바DP6 접합체 사이에 p=0.002; avDP8.5와 카르바DP8 접합체 사이에 p=0.003; 및 avDP~15와 카르바DP6 접합체 사이의 비교 p=0.004. 도 6c) 코팅을 위해 MenA CPS를 사용한 제2 부스트 후 개별 혈청에서 추정된 항-MenA IgG 역가. avDP15와 Ac-carbaDP8 접합체 비교 p=0.0011. 도 6d) 각각 풀링된 및 개별 마우스 혈청에 대한 제3 주사 후 측정된 인간 및 토끼 혈청 살박테리아 역가. 순위 비교 시 유의한 차이는 발견되지 않았다. 면역화를 이중으로 수행하였으며, 대표적인 실험으로부터의 데이터가 여기에 제시된다. *풀링된 혈청에 대한 제3 주사 후 측정된 인간 및 토끼 SBA 역가; **반응자 마우스로부터 풀링된 혈청에 대한 제3 주사 후 측정된 인간 및 토끼 SBA 역가. y-축 상에 "항 Men A CPS IgG (GMT 95% CI)"가 나타내어진다.
도 7은 백신의 3회 용량 후 측정된 ELISA 역가를 보여준다: 항-MenA 폴리사카라이드 IgG 항체를 선택적 3-O-아세틸화 카르바MenA DP8의 CRM197 접합체 및 기준으로서의 천연 MenA-CRM197 백신 (즉, 양성 대조군)과 비교하여 무작위 O-아세틸화 카르바MenA 유사체 DP8의 CRM197 접합체로 평가하였다.
도 8a 및 8b는 백신의 2회 및 3회 용량 후 ELISA 역가이다. p 값은 기준 천연 MenA-CRM197과 다른 백신접종 군 사이의 비교를 지칭한다.
도 9는 백신의 3회 용량 후 SBA 역가를 보여준다: 인간 보체 매개된 살박테리아 역가를 선택적 3-O-아세틸화 카르바MenA DP8의 CRM197 접합체 및 기준으로서의 천연 MenA-CRM197 백신 (즉, 양성 대조군)과 비교하여 무작위 O-아세틸화 카르바MenA 유사체 DP8의 CRM197 접합체로 도출된 혈청에 대해 측정하였다.
도 10은 토끼 (rSBA) 및 인간 보체 (hSBA)로 수득된, 본 발명에 따른 백신 (DP8-OAc) 및 또한 본 발명에 따르지 않는 백신 (DP6-OAc)의 2회 및 3회 용량 후 SBA 역가를 보여준다.
도 11은 기준 MenABCWY 및 고체 (동결건조) MenA 성분을 갖는 MenA 제제 대 무작위 아세틸화 카르바MenA 항원을 포함하는 상응하는 완전 액체 제제에 대해 HT-ELISA에 의해 측정된 단일 및 풀링된 혈청에 대한 총 IgG 역가를 보여준다.
도 12는 기준 MenABCWY 및 고체 (동결건조) MenA 성분을 갖는 MenA 제제 대 무작위 아세틸화 카르바MenA 항원을 포함하는 상응하는 완전 액체 제제에 대해 rSBA 및 SBA에 의해 측정된 기능적 항체 반응을 보여준다.
도 13은 카르바MenA DP8 및 DP10 접합체의 SDS-page 및 웨스턴 블롯 특징화를 보여준다.
도 14는 기준으로서의 ABNGCWY 백신 (즉, 양성 대조군)과 비교하여 BNGCWY와 조합된 무작위 O-아세틸화 카르바MenA 유사체 DP10을 사용한 백신의 3회 용량 후에 측정된 ELISA 역가를 보여준다. 도 14a는 항-MenA 폴리사카라이드 IgG 항체를 보여주고, 도 14b는 항-MenC, 항-MenW 및 항-MenY 폴리사카라이드 IgG 항체를 보여주고, 도 14c는 항-NadA, 항-FHbp var.1.1, 항-NHBA, 항-231.13NB 및 항-OMV 단백질 IgG 항체를 보여주며, 여기서 각각의 항원에 대해 기준 ABNGCWY 백신은 좌측 막대에 제시되고, BNGCWY와 조합된 무작위 O-아세틸화 카르바MenA 유사체 DP10은 우측 막대에 제시된다.
도 15는 백신의 3회 용량 후 SBA 역가를 보여준다: 도 15a는 3125 및 F8238 MenA 균주를 사용함으로써 기준으로서의 ABNGCWY 백신 (즉, 양성 대조군)과 비교하여 BNGCWY와 조합된 무작위 O-아세틸화 카르바MenA 유사체 DP10으로 도출된, 혈청에 대해 측정된 인간 보체 매개된 살박테리아 역가를 보여준다. 도 15b는 C11 (MenC의 경우), 240070 (MenW의 경우) 및 860800 (MenY의 경우) 균주를 사용함으로써 기준으로서의 ABNGCWY 백신 (즉, 양성 대조군)과 비교하여 BNGCWY와 조합된 무작위 O-아세틸화 카르바MenA 유사체 DP10으로 도출된, 혈청에 대해 측정된 인간 보체 매개된 살박테리아 역가를 보여준다. 도 15c는 96217 (NadA의 경우), M14459 (fHbp var1.1의 경우), M13530 (NHBA의 경우), M08-240104 (fHbp var2의 경우), M01-240320 (fHbp var3의 경우), M15-240084 및 M08-0240264 (fHbp var1.13의 경우) 및 NZ98/254 균주를 사용함으로써 기준으로서의 ABNGCWY 백신 (즉, 양성 대조군)과 비교하여 BNGCWY와 조합된 무작위 O-아세틸화 카르바MenA 유사체 DP10으로 도출된, 혈청에 대해 측정된 인간 보체 매개된 살박테리아 역가를 보여준다.
본 발명은, 대상체에게 투여된 후, 네이세리아 메닌기티디스의 혈청군 A, B, C, W135 및 Y에 대해 살박테리아성인 면역 반응을 유도할 수 있는 수성 면역원성 조성물을 제공한다. 유리하게는, 조성물은 완전 액체 제제로서 제공되며, 이는 각각의 항원 성분이 동결건조 필요 없이 단일 수성 용량으로 안정하게 조합될 수 있다는 것을 의미한다. 면역원성 조성물은
i. 접합된 혈청군 A 항원;
ii. 접합된 혈청군 C 항원;
iii. 접합된 혈청군 W135 항원;
iv. 접합된 혈청군 Y 항원; 및
v. 혈청군 B로부터의 1종 이상의 폴리펩티드 항원
을 포함하며, 여기서 (ii), (iii) 및 (iv)는 피막 사카라이드 항원이고, 여기서 (i)은 혈청군 A 피막 사카라이드의 합성 유사체이다. 바람직하게는, 사카라이드 항원은 올리고사카라이드이다.
접합된 혈청군 A 항원 성분
본 발명의 면역원성 조성물의 혈청군 A 항원 성분은 합성 폴리사카라이드 카르바-유사체 (즉, 만노사민 단위의 고리 산소가 메틸렌으로 대체됨)이다. 바람직한 실시양태에서, 폴리사카라이드 카르바-유사체는 적어도 6의 중합도를 갖고, 바람직하게는 제1 단위의 C-1을 제2 단위의 C-6에 연결하는 1,6 연결을 통해 제1 유사체 단량체가 제2 유사체 단량체에 연결되며, 여기서 1,6-연결은 포스포네이트 모이어티를 포함한다.
주목할 만하게, 이러한 유도체는 MenA 혈청군으로부터의 천연 폴리사카라이드를 모방할 수 있을 뿐만 아니라, 이들은 또한 천연 CPS에 비해 개선된 안정성을 가질 것으로 예상된다.
용어 "올리고사카라이드"는 일반적으로 관련 기술분야에 공지된 바와 같이, 그의 의미로 3 내지 10개의 모노사카라이드 단위를 갖는 폴리사카라이드를 포함한다 (예를 들어 https://en.wikipedia.org/wiki/Oligosaccharide 참조).
용어 "올리고머"는 엔도시클릭 산소가 메틸렌 (-CH2-) 기에 의해 대체되어 시클로헥산 백본을 제공하는 카르바-유사체 폴리사카라이드를 지칭한다.
"중합도" (DP)는 최종 올리고머를 제공하기 위해 함께 연결된 단량체의 수를 나타낸다. 본 발명에서, 달리 제공되지 않는 한, DP는 화학식 (I) 및 (II)에서 "n"에 의해 나타내어진다.
"평균 중합도" (avDP)는 올리고머를 구성하는 반복 단위의 평균 수를 나타낸다.
달리 제공되지 않는 한, 용어 "접합"은 대상 엔티티, 특히 n (즉, DP) ≥6을 갖는 본 발명의 올리고머와 선택된 단백질의 연결 또는 연관을 나타낸다.
본원에 사용된 용어 "알킬"은 포화, 직쇄형 또는 분지형 탄화수소 모이어티를 나타낸다. 용어 "C1-C6-알킬"은 1 내지 6개의 탄소 원자를 함유하는 알킬 모이어티를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "할로알킬"은 수소 원자 중 1개 이상이 할로겐 원자로 대체된 포화, 직쇄형 또는 분지형 탄화수소 모이어티를 나타낸다. 특히, "할로알킬"에 대한 언급은 "플루오로알킬"에 대한 언급이며, 즉 여기서 할로겐은 플루오로이다. 용어 "C1-C6-할로알킬"은 수소 원자 중 1개 이상이 할로겐 원자로 대체된, 1 내지 6개의 탄소 원자를 함유하는 알킬 모이어티를 지칭한다. 예는 -CF3, -CH2F, -CH2CF3 등을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 특히 Z의 정의에 따르면, 페닐은 임의로 치환될 수 있다. 페닐 기는 접합을 가능하게 하는 1개 이상의 반응성 관능기, 예컨대 N3, NH2, SH로 임의로 치환될 수 있다. 다른 적합한 기는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다.
본원에 사용된 용어 "보호기"는 의도된 목적을 위한 임의의 적합한 보호기이다. 이러한 보호기의 선택 및 용법 및 그의 용법의 세부사항은, 예를 들어 문헌 [Greene, T.W. and Wuts, P.G.M., "Protective Groups in Organic Synthesis"]에서 이용가능하다. 적합한 보호기는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다.
본원에 사용된 용어 "제약상 허용되는 포스페이트 반대이온"은 포스페이트 기에 적합한 임의의 반대이온, 즉 타당한 의학적 판단의 범주 내에서, 합리적인 이익/위험 비에 상응하게, 과도한 독성, 자극 또는 다른 문제 또는 합병증 없이 인간 및 동물의 조직과 접촉하여 사용하기에 적합한 금속 양이온이다. 제약상 허용되는 포스페이트 반대이온은 1족 또는 2족 금속일 수 있다. 이러한 제약상 허용되는 포스페이트 반대이온의 특정한 예는 나트륨 (Na+) 및 칼륨 (K+)이다. 예를 들어 본 발명의 올리고머 또는 접합체가 완충제 중에 있는 경우에, 반대이온은 나트륨인 것이 바람직하다.
한 실시양태에서, 본 발명은 올리고머 접합체이고, 화학식 (Ia) 또는 (Ib)의 올리고머를 포함하는 접합된 혈청군 A 항원에 관한 것이다:
여기서 올리고머에서
n은 ≥ 6이고;
R은 H 또는 -P(O)(OR")2이고, 여기서 R"는 H 또는 제약상 허용되는 포스페이트 반대이온이고;
R'는 H 또는 제약상 허용되는 포스페이트 반대이온이고;
Rx는 H 또는 -C(O)CH3이고, 각각의 반복 단위에서 동일하거나 상이할 수 있고;
Ry는 H 또는 -C(O)CH3이고, 각각의 반복 단위에서 동일하거나 상이할 수 있고;
여기서 적어도 1개의 반복 단위에서 Rx 또는 Ry 중 적어도 하나는 -C(O)CH3이고;
Az는 -NH(CO)R1, -N(R1)2 및 -N3으로 이루어진 군으로부터 선택된 아자 치환기이고, 여기서 R1은 독립적으로 H, 선형 또는 분지형 C1-C6-알킬 및 선형 또는 분지형 C1-C6-할로알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고;
Z는 (i) 보호기,
(ii) 단백질에의 접합을 위한 관능성 링커,
또는 (iii) 선형 또는 분지형 C1-C6 알킬, 임의로 치환된 페닐, -C(O)Y, 또는 선형 또는 분지형 C1-C6-알킬-X이고,
여기서 Y는 H, 선형 또는 분지형 C1-C6-알킬 또는 보호기이고,
여기서 X는 -NH2, -N3, -C≡CH, -CH=CH2, -SH 또는 -S-C≡N이다.
또 다른 실시양태에서, 접합된 혈청군 A 항원은 화학식 (IIa) 또는 (IIb)의 올리고머 접합체이다:
여기서 올리고머에서
n은 ≥6이고;
R은 H 또는 -P(O)(OR")2이고, 여기서 R"는 H 또는 제약상 허용되는 포스페이트 반대이온이고;
R'는 H 또는 제약상 허용되는 포스페이트 반대이온이고;
Rx는 H 또는 -C(O)CH3이고, 각각의 반복 단위에서 동일하거나 상이할 수 있고;
Ry는 H 또는 -C(O)CH3이고, 각각의 반복 단위에서 동일하거나 상이할 수 있고;
여기서 적어도 1개의 반복 단위에서 Rx 또는 Ry 중 적어도 하나는 -C(O)CH3이고;
Az는 -NH(CO)R1, -N(R1)2 및 -N3으로 이루어진 군으로부터 선택된 아자 치환기이고, 여기서 R1은 독립적으로 H, 선형 또는 분지형 C1-C6-알킬 및 선형 또는 분지형 C1-C6-할로알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고;
Z는 (i) 관능성 링커 또는 결합이고;
P는 단백질이다.
바람직한 실시양태에서, 올리고머는 화학식 (Ia)에 의해 정의된다.
상기 정의된 바와 같이, n은 ≥ 6, 바람직하게는 ≥ 8이다. 한 실시양태에서, n은 8 내지 30이다. 또 다른 실시양태에서, n은 8 내지 20이다. 특정한 실시양태에서, n은 8 내지 15이다. 특히, n은 8 또는 10이다. 한 실시양태에서, n은 8이다. 한 실시양태에서, n은 10이다.
한 실시양태에서, R은 H 또는 -P(O)(OR")2이고, 여기서 적어도 1개의 R"는 Na+이다. 한 실시양태에서, R은 H이다.
한 실시양태에서, R은 NHC(O)CH3이다.
한 실시양태에서, R'는 Na+이며, 이에 따라 본 발명의 올리고머가 화학식 (Ia') 또는 (Ib'), 바람직하게는 화학식 (Ia')에 따라 정의된다:
따라서, 이에 따라 한 실시양태에서, 본 발명의 올리고머 접합체 항원은 화학식 (IIa') 또는 화학식 (IIb'), 바람직하게는 화학식 (IIa')에 따라 정의된다:
상기 정의된 바와 같이, Rx는 H 또는 -C(O)CH3이고, 각각의 반복 단위에서 동일하거나 상이할 수 있고, Ry는 H 또는 -C(O)CH3이고, 각각의 반복 단위에서 동일하거나 상이할 수 있고, 여기서 적어도 1개의 반복 단위에서 Rx 또는 Ry 중 적어도 하나는 -C(O)CH3이다. 따라서, 화학식 (Ia), (IIa), (Ib) 및 (IIb)에 따른 대괄호 안에 정의된 바와 같은 화학식은 올리고머의 각각의 단위가 이러한 백본을 가진다는 것을 의미하지만, 대괄호에 의해 정의된 각각의 반복 단위에 대해 Rx 및 Ry의 상이한 옵션이 선택될 수 있다는 것을 고려하면, 대괄호에 의해 정의된 단량체 단위가 반드시 동일한 것은 아니라는 것이 이해되어야 한다. 따라서, n 및 Rx 및 Ry에 대한 H 또는 -C(O)CH3의 선택에 따라, 상이한 % 아세틸화가 달성될 수 있는 것으로 인지될 것이다. 예를 들어, 대괄호에 의해 정의된 올리고머의 각각의 반복 단위는 아세틸화 수준에 따라, 즉 각각의 Rx 및 Ry에 대한 H 또는 -C(O)CH3의 선택에 따라 동일하거나 상이할 수 있다.
한 실시양태에서, 올리고머에서 적어도 1개의 반복 단위에서 Rx는 -C(O)CH3이다. 한 실시양태에서, 올리고머에서 적어도 1개의 동일한 반복 단위에서 Rx는 H이고 Ry는 -C(O)CH3이다.
한 실시양태에서, 올리고머에서 적어도 1개의 동일한 반복 단위에서 Rx는 -C(O)CH3이고 Ry는 H이다.
한 실시양태에서, 올리고머에서 적어도 1개의 동일한 반복 단위에서 Rx 및 Ry는 둘 다 -C(O)CH3이다.
한 실시양태에서, 올리고머에서 적어도 1개의 동일한 반복 단위에서 Rx는 H이고 Ry는 -C(O)CH3이고, 적어도 1개의 또 다른 동일한 반복 단위에서 Rx는 -C(O)CH3이고 Ry는 H이다.
한 실시양태에서, 올리고머에서 적어도 4개의 반복 단위에서의 동일한 반복 단위 내에서 Rx는 H이고 Ry는 -C(O)CH3이다. 한 실시양태에서, 올리고머에서 적어도 6개의 반복 단위에서의 동일한 반복 단위 내에서 Rx는 H이고 Ry는 -C(O)CH3이다. 한 실시양태에서, 올리고머에서 적어도 8개의 반복 단위에서의 동일한 반복 단위 내에서 Rx는 H이고 Ry는 -C(O)CH3이다. 한 실시양태에서, 올리고머에서 적어도 10개의 반복 단위에서의 동일한 반복 단위 내에서 Rx는 H이고 Ry는 -C(O)CH3이다.
한 실시양태에서, 올리고머에서 적어도 4개의 반복 단위에서의 동일한 반복 단위 내에서 Rx는 -C(O)CH3이고 Ry는 H이다.
한 실시양태에서, 올리고머에서 4개의 반복 단위에서의 동일한 반복 단위 내에서 Rx는 H이고 Ry는 -C(O)CH3이고, 4개의 반복 단위에서의 동일한 반복 단위 내에서 Rx는 -C(O)CH3이고 Ry는 H이다.
한 실시양태에서, 올리고머는 모든 반복 단위에서 Rx 또는 Ry가 -C(O)CH3일 수 있고, 다시 말해서 각각의 반복 단위 상의 반복 단위 3 또는 4 아세틸화는 선택적 아세틸화 단위이다.
한 실시양태에서, 올리고머에서 적어도 1개의 동일한 반복 단위에서 Rx는 H이고 Ry는 -C(O)CH3이고, 적어도 1개의 동일한 반복 단위에서 Rx는 -C(O)CH3이고 Ry는 H이고, 적어도 1개의 동일한 반복 단위에서 Rx 및 Ry는 둘 다 -C(O)CH3이다.
한 실시양태에서, 올리고머에서 Rx 및 Ry의 합하여 약 50 내지 90%는 -C(O)CH3이다. 다시 말해서, 올리고머의 아세틸화의 총량이 약 50 내지 90%이다. 다시 말해서, 본 발명의 올리고머에서 적어도 Rx 중 하나 및 Ry 중 하나는 동일하거나 상이한 반복 단위에서 -C(O)CH3이고, 3 위치에서의 아세틸화도 (Ry가 -C(O)CH3임) 및 4 위치에서의 아세틸화도 (Rx가 -C(O)CH3임)의 총합은 약 50 내지 90%이다. 의심을 피하기 위해, 상기 언급된 바와 같이, Rx 및 Ry는 올리고머의 각각의 반복 단위에서 동일하거나 상이할 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 올리고머에서 Rx 및 Ry의 합하여 약 60 내지 80%는 -C(O)CH3이다. 다시 말해서, 올리고머의 아세틸화의 총량이 약 60 내지 80%이다. 의심을 피하기 위해, 상기 언급된 바와 같이, Rx 및 Ry는 올리고머의 각각의 반복 단위에서 동일하거나 상이할 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명의 올리고머의 적어도 1개의 동일한 반복 단위에서, 바람직하게는 올리고머의 반복 단위의 약 40 내지 50%에서 Rx 및 Ry는 둘 다 -C(O)CH3이고; 나머지 반복 단위의 약 10 내지 30%에서 Rx 또는 Ry 중 하나는 -C(O)CH3이고, 올리고머에서 반복 단위의 나머지는 Rx = Ry = H일 수 있다.
상기 정의된 바와 같이, Az는 -NH(CO)R1, -N(R1)2 및 -N3으로 이루어진 군으로부터 선택된 아자 치환기이고, 여기서 R1은 독립적으로 H, 선형 또는 분지형 C1-C6-알킬 및 선형 또는 분지형 C1-C6-할로알킬로 이루어진 군으로부터 선택된다. 질소 원자는 카르바-유사체 반복 단위에 직접 부착된다.
이러한 Az 치환기의 예는 -N3, -NH2, -NH-C1-C6 알킬, -N-(C1-C6 알킬)2 및 -NH(CO)-C1-C6 알킬을 포함한다. 한 실시양태에서, -C1-C6 알킬은 -C1-C4 알킬, 특히 -CH3이다. 따라서, 한 실시양태에 따르면, Az는 -NH(CO)-C1-C6 알킬, 특히 -NHAc (여기서 Ac는 아세테이트, 즉 -C(O)CH3을 나타냄)로도 또한 나타내어지는 -NH(CO)-CH3이다.
Z는 본 발명의 올리고머가 단백질에 접합되는지 아닌지의 여부에 따라 상이한 의미를 가질 수 있다.
화학식 (Ia) 또는 (Ib)에 따르면, 본 발명의 올리고머는 단백질에 접합되지 않는다. 따라서, 상기 정의된 바와 같이, 화학식 (Ia) 또는 (Ib)에 따르면, Z는 하기 중 하나이다:
(i) 보호기,
(ii) 선형 또는 분지형 C1-C6 알킬, 임의로 치환된 아릴, -C(O)Y, 또는 선형 또는 분지형 C1-C6-알킬-X, 또는
(iii) 단백질에의 접합을 위한 관능성 링커.
따라서, 한 실시양태에 따르면, Z는 말단 사카라이드 단위를 캡핑하여, 예를 들어 추가의 쇄 신장에 대해 또는 후속 변형에 대해 비반응성 또는 반응성일 수 있도록 하는 수단이다.
Z가 말단 카르바-유사체 단위를 캡핑하기 위한 수단인 것으로 의도되는 경우에, 이는 보호기 또는 캡핑기, 예컨대 선형 또는 분지형 C1-C6 알킬, 임의로 치환된 페닐, -C(O)-Y, 또는 선형 또는 분지형 -C1-C6 알킬-X를 포함할 수 있고, 여기서 X는 -NH2, -N3, -C≡CH, -CH=CH2, -SH 또는 -S-C≡N이고, 여기서 Y는 H, 선형 또는 분지형 C1-C6-알킬 또는 보호기이다.
본원에 정의된 바와 같이, Z는 단백질에의 접합을 위한 관능성 링커일 수 있다. 이러한 경우에, "관능성 링커"는 사카라이드를 단백질에 접합시키는 데 사용되는 것으로 관련 기술분야에 공지된 임의의 링커를 지칭한다.
한 실시양태에서, X는 -NH2이다.
한 실시양태에서, 화학식 (Ia) 또는 (Ib)에 따른 Z는 -(CH2)6-NH2, -(CH2)4-NH2, -(CH2)3-NH2 및 -(CH2)2-NH2로부터 선택되고, 여기서 아미노 기는 적합한 보호기, 예를 들어 -C(O)CH3에 의해 임의로 보호된다 (이러한 보호기의 선택 및 용법 및 그의 용법의 세부사항은, 예를 들어 문헌 [Greene, T.W. and Wuts, P.G.M., "protective groups in organic synthesis"]에서 이용가능함).
본 발명의 올리고머는 폴리사카라이드 카르바-유사체의 제조를 위한 유기 합성 분야에 공지된 합성 접근법에 따라 제조될 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 올리고머의 제조는 적어도 6개의 만노사민 카르바-유사체 빌딩 블록을, 반복 단위 사이에 1,6-알파 연결을 형성함으로써 목적하는 방식으로 연결하여, 적어도 6의 중합도를 갖는 올리고머를 제공함으로써 달성될 수 있다. 화학식 (I)에 나타내어진 바와 같이, 단량체는 알파-(1→6) 포스페이트 연결을 통해 연결되고, 이러한 연결은 표준 중합 기술, 예컨대 특히 문헌 [Gao et al., Org. Biomol. Chem., 2012, 10, 6673]에 기재된 것을 사용하여 수행될 수 있다.
만노사민 카르바-유사체 빌딩 블록은 위치 3에 아세테이트 또는 임의의 합성 단계에서 아세테이트로 대체될 수 있는 보호기를 보유할 수 있다.
대안적으로, 한 실시양태에 따르면, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 화학식 (I)의 올리고머의 제조 방법에 관한 것이다:
a. 포스포디에스테르 연결을 갖는 단량체의 제조;
b. 이와 같이 수득된 단량체의, 예를 들어 포스포르아미다이트를 사용한 신장 반응;
c. 올리고머의 O-아세틸화.
한 실시양태에서, Ry가 C(O)CH3인 경우에, 단계 (b) 및 (c)는 O-아세틸화가 신장 반응 전에 수행되도록 반대일 수 있다.
보다 상세하게, 방법은 반응식 1에 예시된 단계를 포함할 수 있다:
반응식 1: 본 발명의 올리고사카라이드의 제조 방법.
(a) TBAF, THF, 0℃→rt, 92%. (b) MeONa, MeOH, rt, 85%. (c) DMTrCl, Et3N, DCM, rt, 91%. (d) 2-시아노에틸 N,N-디이소프로필-클로로포스포르아미다이트, N,N-디이소프로필에틸아민, DCM, rt, 9 (94%). (e) I. 11, DCI, MeCN, II. CSO, MeCN, III. TCA, DCM, H2O, 94%. (f) I. 9, DCI, MeCN, II. CSO, MeCN, III. TCA, DCM, H2O, 16 (82%), 17 (95%), 18 (90%), 19 (92%), 20 (88%), 21 (86%), 22 (87%). (g) NH4OH, H2O, 디옥산. (h) H2, Pd 블랙, H2O, AcOH, 1 (99%), 2 (76%), 3 (69%), 4 (39%), 5 (88%), 6 (83%), 7 (77%), 8 (44%), (i): (Boc)2O, NaHCO3, rt, 16 h; (l): Ac2O/이미다졸, 40℃, ~9d; (m); TFA, rt, 1 h.
의심을 피하기 위해, Ac는 아세틸 기, 즉 -C(O)CH3을 지칭하는 것으로 의도된다.
특히, 포스포르아미다이트 빌딩 블록의 사용은 포스포디에스테르 연결의 형성에 보다 효과적이다. 본 발명자들은 신장될 1급 알콜 관능기를 일시적으로 차폐하기 위해 디메톡시트리틸 (DMTr) 에테르의 사용을 선택하였다. 각각의 신장 단계는 포스포르아미다이트와 성장하는 쇄 알콜의 커플링, 중간체 포스파이트의 상응하는 포스포디에스테르로의 산화 및 (n+1) 올리고머 상의 1급 히드록실의 탈차폐를 포함하는 3-단계 순서의 반복에 기초한다. 반응식 1에 예시된 바와 같이, 주요 빌딩 블록 9는 중간체 10으로부터 수득되며, 이는 또한 공지된 카르바슈가 12로부터 3 단계로 유도된다 (예를 들어, 문헌 [Q. Gao et al. Org. Biomol. Chem., 2012, 10, 6673-6681] 참조). 후자의 카르바 만노스 빌딩 블록은 선행 기술 방법론에 따라 상업적으로 입수가능한 3,4,6-트리-O-아세틸-D-글루칼로부터 제조될 수 있다. 따라서, 1급 실릴 에테르 및 아세틸 에스테르를 테트라부틸암모늄 플루오라이드 (TBAF) 및 NaOMe의 연속 작용에 의해 화합물 12로부터 제거하여 디올 14를 85% 수율로 수득하였다. 이어서, DMTr 기를 위치선택적으로 도입하여 알콜 10을 91% 수율로 수득하였다. 이 화합물을 2-시아노에틸-N,N-디이소프로필-클로로포스포르아미다이트와의 반응에 의해 신장 블록 포스포르아미다이트 9로 전환시켰다. 빌딩 블록을 사용하여 수동으로 표적 올리고머를 조립하였다. 합성은 공지된 포스포르아미다이트 11을 사용하여 알콜 10 상에 아미노헥산올 스페이서를 설치하여 시작하였다. 포스포르아미다이트의 활성화를 위한 활성화제로서 디시아노이미다졸 (DCI)을 사용하여 2-단계 원 포트 반응으로 빌딩 블록들을 커플링시켰다. (1S)-(+)-(10-캄포르술포닐)-옥사지리딘 (CSO)을 사용하여 계내 형성된 포스파이트의 산화를 수행하였다. DCI (pKa 5.2)가 통상적으로 사용되는 테트라졸 (pKa 4.9)보다 바람직한데, 이는 이것이 덜 산성이고 산 불안정성 DMTr 기와 조합하여 사용하기에 적합하기 때문이다. CSO가 아이오딘 대신에 사용되었는데, 이는 아세토니트릴과 같은 비-수성 용매 중 그의 보다 높은 용해도로 인한 것이다. 조 포스포디에스테르 생성물을 TCA로 처리하여 DMTr 기를 절단하였다. 생성물을 크기-배제 크로마토그래피 (세파덱스 LH-20)에 의해 정제하여 스페이서-장착된 단량체 15를 94% 수율로 수득하였다. 후속 커플링을 모두 상기 기재된 절차에 따라 8 이상의 목적하는 중합도에 도달할 때까지 수행하였다. 보다 긴 올리고머의 신장을 위해, 보다 많은 양의 포스포르아미다이트 9를 사용하고, 커플링 반응 시간을 증가시켜 알콜의 완전한 전환을 보장하였다. 각각의 신장 주기에 대한 수율은 82% 내지 95% 범위로 우수 내지 탁월하였다. 10으로부터 출발하여 옥타머 22를 40% 전체 수율로 수득하였다. 단편 16-22를 2-단계 순서를 사용하여 탈보호하였다. 먼저 시아노에틸 기 (CE)를 수성 암모니아 용액 (33%)을 사용하여 제거하였다. 다음에, 이렇게 형성된 포스포디에스테르 상의 모든 나머지 보호기 (벤질 에테르 및 카르복시벤질 카르바메이트)를 팔라듐 블랙 상에서의 가수소분해에 의해 절단하여 표적 비-아세틸화 올리고머 1-8을 수득하였다.
비-아세틸화 올리고머 1-8은 3- 및/또는 4-위치에서 무작위 방식으로 O-아세틸화될 수 있으며, 즉 올리고머에서 Rx 및 Ry의 합하여 약 50 내지 90%가 -C(O)CH3이다. 이는 (i) 유리 아민 기를 BOC-보호하고; (ii) 예를 들어 Ac2O/이미다졸을 사용하여 O-아세틸화하고; (iii) 탈보호하여 아세틸화 올리고머 1c-8c 또는 1d 내지 8d를 수득함으로써 달성될 수 있다. 이어서 이러한 아세틸화 올리고머를 링커 기, 예컨대 비스-숙신이미딜 아디페이트 (또한 SIDEA로도 공지됨)로 활성화시키고, 단백질, 예컨대 CRM197에 접합시킬 수 있다.
반응식 2. 3-O-아세틸화 단량체 빌딩 블록의 제조로 이어지는 방법.
(a) K2CO3, MeOH; (b) PMBCH(OMe)2, PPTS; (c) BnBr, NaH; (d) DIBAL-H, DCM; (e) DMP, DCM; (f) PPh3CH3I, KHMDS, THF, -78℃; (g) m_디클로로벤젠, t, μ-웨이브; (h) NaBH4, EtOH/THF; (i) TDSCl, Im, DCM; (j) OsO4, TMANO, 3:1 아세톤-H2O; (l) (MeO)3Cme, PTSA, CAN, 이어서 80% AcOH; (m) Tf2O, DCM/py, -20℃에서 rt; 이어서 NaN3, 19:1 DMF-H2O; (n) PPh3, THF, 60℃, H2O; 이어서 Ac2O, MeOH; (o NaOMe/MeOH; (p) TBSOTf, 2,6-루티딘, DCM; (q) DDQ, 이어서 Ac2O, py; (r) HF/피리딘, THF; (s) DMTrCl, 피리딘, DCM.
대안적으로, 3-O-아세틸화 단량체 빌딩 블록 및 4-O-아세틸화 빌딩 블록은 하기 반응식 3에 도시된 방법에 의해 제조될 수 있다:
반응식 3. 3-O-아세틸화 및 4-O-아세틸화 단량체 빌딩 블록의 제조로 이어지는 방법
(a') K2CO3, MeOH; (b') TDSCl, 이미다졸, DMF, -30℃; (c') BnBr, NaH, DMF, 0℃; (d') TBAF, THF; (e') IBX, AcOEt; (f') PPh3CH3I, KHMDS, THF, -78℃에서 rt; (g') 1,3-디클로로벤젠, NaBH4, EtOH/THF, 230℃; (h') TIPSCl, 이미다졸, DMF; (i') TiCl4, DCM/톨루엔 2:8, -70℃; (l') NapBr, NaH, DMF, 0℃; (m') Me3NO 2H2O, 아세톤/H2O 3:1, OsO4; (n') (MeO)3CMe, PTSA, ACN; (o') Tf2O, DCM/Py, -20℃에서 rt; 이어서 NaN3, 19:1 DMF-H2O; (p') NaOMe, MeOH; (q') TBSOTf, -10℃에서 70℃, Pyr, DMAP; (r') Pd/C, H2, AcOH, 이어서 Ac2O, Pyr; (s') HF pyr, Pyr; (t') DMTrCl, Pyr, 0℃; (r") DDQ, DCM, H2O; (s") PPh3, H2O, THF, 이어서 DMTrCl, Pyr.
아세틸화 빌딩 블록 38, 55a, 55b 및 완전 아세틸화 빌딩 블록 (즉, 동일한 단위의 C3 및 C4 위치 둘 다에 O-Ac 기를 가짐)은 화합물 9와 관련하여 상기 기재된 바와 같이 포스포르이미데이트로의 변환 및 후속 커플링에 의해 올리고머 버전으로 전환될 수 있다.
본 발명의 카르바-유사체의 면역원성을 위한 중요한 전제조건은 상응하는 MenA 피막 사카라이드를 모방하는 그의 능력이다. 이를 조사하기 위해, 상이한 중합도를 갖는 카르바-유사체를 사용하여 경쟁적 ELISA를 수행하였다.
본 발명의 올리고머는 포유동물 숙주 및 바람직하게는 인간 숙주를 포함한 숙주에 단독으로 또는 담체 단백질에 연결되어 또는 만노스 카르바-유사체 단위의 단독중합체 또는 이종중합체로서 도입될 수 있다. 특정한 실시양태에서, 본 발명의 올리고머는 단백질 접합체로서 사용된다. 따라서, 추가 측면에서, 본 발명은 화학식 (IIa) 또는 (IIb)에 따른, 단백질에 연결된 화학식 (I)의 본 발명의 올리고머를 포함하는 접합체 유도체를 포함한다:
여기서 n, Az, R, R', Rx 및 Ry는 상기 정의된 바와 같고;
Z는 링커 또는 결합이고;
P는 단백질이다.
화학식 (Ia) 또는 (Ib)의 올리고머는, 바람직하게는 포스페이트 모이어티를 통해 제1 반복 단위의 C-1 탄소에 연결된 Z 모이어티를 통해 단백질에 접합되는 경우에 특히 유용하다. 이와 같이 수득된 화학식 (IIa) 또는 (IIb)의 올리고머-단백질 접합된 유도체는 잠재적으로 유아에서 면역원성 반응을 도출할 수 있고, 또한 가능하게는 백신접종의 유효성을 연장시키는 기억 효과를 제공하는 세포성 반응을 도출할 수 있는 조성물의 제조에 유용하다.
한 실시양태에서, 올리고머 접합체는 바람직하게는 화학식 (IIa)에 의해 정의되며, 즉 여기서 단백질은 카르바-유사체의 6-위치보다는 1-위치에서 접합된다.
단백질 (또는 담체 단백질)은 면역원성 반응에 영향을 미칠 수 있고, 심지어 접합체로서 전달되는 경우에 본 발명의 1종 이상의 화합물을 사용한 포유동물의 치료로부터 생성된 항체의 정확한 성질에 영향을 미칠 수 있다. 적합한 단백질은 Z 모이어티의 말단 부분과 반응할 수 있는 관능기를 가져 본 발명의 접합체 유도체를 형성하는 것이다. 바람직하게는, 상기 관능기는 Z 모이어티에 연결되어 아미드 결합 또는 티오에테르를 형성할 수 있는 -NH2 및 -SH로부터 선택된다. 보다 바람직하게는, 단백질은 Z와 반응하는 경우에 아미드 결합의 형성에 적합한 -NH2 기를 갖는다.
유용한 단백질은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 그러나, 한 실시양태에서, P는 디프테리아 톡소이드 (DT), 파상풍 톡소이드 (TT), CRM197, 이. 콜라이 ST 및 슈도모나스 아에루기노사 외독소 (rEPA)로부터 선택된 불활성화된 박테리아 독소이거나, 또는 P는 폴리아미노산, 예컨대 폴리(리신:글루탐산)이거나, 또는 P는 B형 간염 바이러스 코어 단백질 또는 SPR96-2021 또는 엔. 메닌기티디스 혈청군 B 항원 fHbp-231 (즉, WO 2015/128480 (이는 본원에 참조로 포함됨)에 정의된 바와 같은 인자 H 결합 단백질 (fHbp)의 변이체2, 변이체3 및 변이체1의 융합 단백질)이다.
한 실시양태에서, P는 TT, DT 또는 CRM197이다.
특정한 실시양태에서, P는 CRM197이다.
상기 정의된 바와 같이, 화학식 (IIa) 또는 (IIb)에 따르면, Z는 링커 또는 결합이다. Z가 링커인 경우에, 이는 올리고사카라이드를 단백질에 접합시키는 데 적합한, 관련 기술분야에 공지된 임의의 적합한 링커로부터 유래될 수 있다.
다시 말해서, 미반응 형태의 Z는, 즉 올리고머 및 단백질에 연결되지 않은 경우에, 그것이 본 발명의 올리고머와 단백질 사이의 링커로서 작용할 수 있게 하는 관능기를 가질 수 있어, Z가 관능성 링커 (화학식 (Ia) 및 화학식 (Ib)에 따라 정의된 바와 같음)가 되도록 한다. 바람직하게는, Z는 단백질 담체 상의 상보적 기에 커플링시키기 위한 아민, 카르복실레이트 또는 히드록실 기를 포함하는 화합물로부터 유래되지만, 올리고사카라이드를 단백질에 접합시키는 방식을 제공하는 관련 기술분야에 공지된 다른 기가 또한 고려된다.
본 발명의 올리고머가 단백질에 접합되는 경우에, 화학식 (IIa) 또는 (IIb)에서의 바람직한 Z 모이어티는 임의로 보호된 형태의 아민-치환된 알콕시 기인 링커로부터 유래된다. 이러한 형태일 때, 아민은 이관능성 시약으로 아세틸화 또는 알킬화되며, 이의 다른 말단은 단백질에 유사하게 부착된다.
한 실시양태에서, 화학식 (IIa) 또는 (IIb)에 따르면, Z는 본 발명의 올리고머를 단백질에 연결할 수 있는 동종이관능성 또는 이종이관능성 링커로부터 유래된다. 이와 관련하여, 본 발명의 접합체에 사용하기 적합한 이관능성 링커는 관련 기술분야에 공지된 것들, 예컨대 디-카르복실산, 바람직하게는 말론산, 숙신산, 아디프산 및 수베르산 또는 그의 활성화 형태를 포함한다. 대안적으로, 스쿠아레이트 에스테르가 사용될 수 있다. 이들 유형의 시약은 스페이서 모이어티가 아민을 포함하는 화합물을 단백질에 연결하는 데 특히 편리하다. 바람직하게는, 상기 이관능성 링커는 아디프산 N-히드록시숙신이미드 디에스테르 (SIDEA) 및 BS(PEG)5로부터 유래된다.
일부 실시양태에서, Z는 적어도 2 또는 3개의 원자 길이이다. 링커의 일부 비제한적 예는 -(CH2)m-A, -Ph-A, -(CH2)a-Ph-(CH2)a-A 및 그의 치환된 형태를 포함하며, 여기서 각각의 Ph는 임의로 치환된 페닐 기를 나타내고, 각각의 a 및 m은 독립적으로 1-10의 정수를 나타낸다. "A"는 단백질을 연결할 수 있거나 연결하는 관능기 또는 그의 잔기, 예컨대 -NH2, -OH 또는 -SH, 에스테르, 아미드 또는 다른 카르복실-함유 기, 디엔 또는 친디엔체, 말레이미드, 알킨, 시클로알킨을 나타낸다. Z는 OR', SR' 또는 N(R')2를 포함할 수 있고, 여기서 각각의 R'는 독립적으로 H 또는 C1-C6-알킬, 아실, 아릴, 아릴알킬, 헤테로아실, 헤테로아릴 또는 헤테로아릴알킬 기이고, A를 추가로 포함할 수 있다.
한 실시양태에서, 화학식 (IIa) 또는 (IIb)에서의 Z는 하기 화학식을 갖는 이종이관능성 링커이다:
*-(CH2)p-NH(CO)-(CH2)p-(X-(CH2)p)p-C(O)-*
여기서 *는 부착 지점을 나타내고, 여기서
p는 독립적으로 1 내지 10으로부터 선택되고;
X는 -O-, -S- 및 -NH-로부터 선택된다.
한 실시양태에서, Z는 화학식 *-(CH2)6NHCO(CH2)4CO*를 갖는다.
또 다른 실시양태에서, Z는 하기 화학식을 갖는 링커이다:
*-(CH2)m-NHC(O)-(CH2)m-C(O)-*
여기서 *는 부착 지점을 나타내고, 여기서 m은 독립적으로 1 내지 10으로부터 선택된다.
대안적 실시양태에서, Z는 하기 화학식을 갖는다:
Z 링커는 전형적으로 신장 단량체가 부착되기 전 단백질에 연결될 단량체 내로 도입되고, 임의로 후속 신장 반응에 영향을 미치거나 참여하지 않도록 보호된 형태로 도입된다.
따라서, 한 실시양태에서, Z는 하기 화학식을 갖는 2가 링커이다:
여기서 r은 2 내지 6의 정수이고, (*)는 올리고머에 대한 부착 지점을 나타내고, PG는 수소 또는 바람직하게는 알콕시카르보닐, 메톡시카르보닐, t-부틸옥시 카르보닐 또는 벤질옥시카르보닐로부터 선택된 보호기를 나타낸다. 단백질은 아민을 통해 부착된다.
존재하는 경우에, PG는 적합하게는 제거되어 Z 모이어티와 단백질의 반응을 가능하게 함으로써 그의 접합체를 수득하게 할 수 있다. 대안적으로, PG는 제거될 수 있고, 이와 같이 수득된 유리 아미노 기는, 예를 들어 단백질에의 연결에 적합한 추가의 스페이서 모이어티를 도입함으로써 추가로 관능화될 수 있다.
한 실시양태에서, 하기 화학식에 따른 올리고머 접합체가 제공된다:
여기서 n, Az, R, R', Rx 및 Ry는 상기 정의된 바와 같다.
본 발명의 한 실시양태에서, 하기 화학식에 따른, 즉 R'가 Na+인 올리고머 접합체가 제공된다:
여기서 n, Az, R, Rx 및 Ry는 상기 정의된 바와 같다.
본 발명의 무작위 아세틸화 올리고머 접합체가 백신 조성물 내로 혼입되는 경우에, 이는 천연 MenA 접합체보다 더 높은 안정성의 아세틸화 백분율을 나타내며, 이때 카르바-유사체가 백신 중에 제제화되는 경우 5% 미만의 아세틸화가 상실될 수 있다.
의심을 피하기 위해, 본 발명의 올리고머는 관련 기술분야에 공지된 임의의 적합한 방법에 의해, 예를 들어 문헌 ["The design of semi-synthetic and synthetic glycoconjugate vaccines", P. Constantino et al., Expert Opin. Drug. Discov]에 보고된 방법에 따라 단백질에 접합될 수 있다는 것을 주목해야 한다.
접합 반응은 또한, 예를 들어 WO2004/067030에 기재된, MenA 사카라이드를 담체 단백질에 접합시키는 데 사용된 것과 유사한 접합 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명의 올리고머는, 예를 들어 문헌 [Berti et al., ACS Chem. Biol., 2012, 7, 1420-1428]에 보고된 바와 같이, 디-N-히드록시숙신이미딜 아디페이트 링커를 이용하는 접합 절차를 사용하여 CRM197에 커플링될 수 있다. 트리메틸아민을 함유하는 DMSO 중 선택된 링커로의 처리 후, 수득된 활성화된 올리고머는 아세톤과의 공동-침전에 의해 정제되고, 접합에 사용될 수 있다. 따라서, 목적하는 신-접합체는 CRM197과 함께 100:1 올리고머/단백질 몰비로 밤새 인큐베이션함으로써 수득될 수 있다. 접합은 화학식 (Ia)/(Ib)의 올리고머의 활성화, 이어서 선택된 단백질에의 접합 또는 관심 단백질 관능기의 활성화 및 전형적으로 Z 모이어티를 통한 본 발명의 올리고사카라이드와의 후속 접합을 고려할 수 있다. 따라서, 한 실시양태에 따르면, 본 발명의 올리고머는 먼저 적절한 활성화제로 활성화되고, 이어서 관련 기술분야에 공지된 방법에 따라 선택된 단백질의 -NH2 잔기와 커플링된다.
한 실시양태에서, Z 기는 링커의 제1 말단 부분과의 반응에 의해 활성화되고, 여기서 링커의 다른 말단은 선택된 단백질에 연결될 수 있다. 예를 들어, 한 실시양태에 따르면, 방법은 본 발명의 올리고머를 트리에틸아민의 존재 하에 SIDEA로 활성화시켜 출발 올리고머의 활성화된 에스테르를 수득하는 것을 포함할 수 있다. 이어서, 이러한 활성화된 에스테르를 포스포네이트 완충제의 존재 하에 CRM197과 반응시켜 목적하는 접합체를 수득할 수 있다.
접합 후에, 올리고머-단백질 접합체는 관련 기술분야에 공지된 다양한 기술에 의해 정제될 수 있다. 정제 단계의 한 목적은 올리고머-단백질 접합체로부터 미결합 올리고머를 제거하는 것이다. 전형적으로, 본 발명의 접합체는, 예를 들어 문헌 [Anderson, P.W., et al. J. Immunol. (1986) 137:1181-1186] 및 [Jennings, H.J. et al., J. Immunol. (1981) 127:1011-1018]에 기재된 바와 같이, 특히 크기 배제 크로마토그래피, 밀도 구배 원심분리, 소수성 상호작용 크로마토그래피 또는 황산암모늄 분획화를 포함한 임의의 수의 표준 기술에 의해 미반응 단백질 및 올리고머로부터 정제될 수 있다.
추가의 실시양태에서, Z는 모노사카라이드, 바람직하게는 하기 기재된 바와 같은 만노사민일 수 있다. 따라서, 추가 실시양태에서, 본 발명은 또한 하기 화학식 (III)을 갖는 올리고머에 관한 것이다:
여기서 R, Az 및 n은 상기 정의된 바와 같고;
Z는
P 및 링커는 화학식 (I) 및 (II)에 대한 Z의 정의와 관련하여 상기 정의된 바와 같다.
예를 들어, 이러한 방식으로 정의된 접합체의 예는 하기와 같다:
이러한 실시양태에 따르면, 본 발명의 유도체는 -O-링커 Z 모이어티를 통해 선택된 단백질에 직접 연결될 수 있고, 따라서 말단 단량체의 탄소 원자에 직접 연결된 -O링커--P 모이어티를 갖는 접합체 유도체로 이어진다. 링커에 관한 한, 이는 상기 나타낸 링커 Z에 따른 임의의 적합한 2가 링커일 수 있다. 대안적으로 Z는 케토 또는 알데히드 기를 보유하는 링커로 유도체화된 단백질에의 접합을 위한 아민일 수 있다.
접합된 혈청군 C, W135 및 Y 항원 성분
본 발명의 면역원성 조성물은 각각의 수막구균 혈청군 C, W135 및 Y로부터의 피막 사카라이드 항원을 포함하며, 여기서 항원은 담체 단백질(들)에 접합되고/거나 올리고사카라이드이다. 피막 사카라이드는 올리고사카라이드의 형태로 사용될 수 있다. 이들은 정제된 피막 폴리사카라이드의 단편화에 의해 (예를 들어 가수분해에 의해) 편리하게 형성되고, 통상적으로 목적하는 크기의 단편의 정제가 이어질 것이다.
의심을 피하기 위해, 용어 "피막 폴리사카라이드/사카라이드" (CPS)는 박테리아의 세포 외피 밖에 있는 층에서 발견될 수 있어 박테리아 세포 자체의 외피의 일부인 사카라이드를 나타낸다. CPS는 폭넓은 범위의 박테리아의 최외곽 표면 상에서, 일부 경우에는 심지어 진균에서도 발현된다.
용어 "올리고사카라이드"는 일반적으로 관련 기술분야에 공지된 바와 같이, 그의 의미로 3 내지 10개의 모노사카라이드 단위를 갖는 폴리사카라이드를 포함한다 (예를 들어 https://en.wikipedia.org/wiki/Oligosaccharide 참조).
일반적으로, 접합은 사카라이드를 T-비의존성 항원으로부터 T-의존성 항원으로 전환시켜 면역 기억을 위한 프라이밍을 가능하게 하기 때문에 사카라이드의 면역원성을 증진시킨다. 접합은 소아 백신에 특히 유용하고, 널리 공지된 기술이다.
수막구균으로부터 피막 폴리사카라이드를 제조하는 기술은 다년간 공지되어 왔다 (예를 들어 WO2005/032583 및 WO03/007985 참조).
전형적인 담체 단백질은 박테리아 독소, 예컨대 디프테리아 또는 파상풍 독소 또는 톡소이드 또는 그의 돌연변이체이다. CRM197 디프테리아 독소 돌연변이체 [Research Disclosure, 453077 (Jan 2002)]는 유용하고, 상표명 프레브나르(PREVNAR)™ 하에 판매되는 스트렙토코쿠스 뉴모니아에(Streptococcus pneumoniae) 백신 내의 담체이다. 다른 적합한 담체 단백질은 엔. 메닌기티디스 외막 단백질 복합체 [EP-A-0372501], 합성 펩티드 [EP-A-0378881, EP-A-0427347], 열 쇼크 단백질 [WO93/17712, WO94/03208], 백일해 단백질 [WO98/58668, EP-A-0471177], 시토카인 [WO91/01146], 림포카인 [WO91/01146], 호르몬 [WO91/01146], 성장 인자 [WO91/01146], 다양한 병원체-유래 항원으로부터의 다중 인간 CD4+ T 세포 에피토프를 포함하는 인공 단백질 [Falugi et al. (2001) Eur J Immunol 31:3816-3824], 예컨대 N19 [Baraldo et al. (2004) Infect Immun 72(8):4884-7], 에이치. 인플루엔자에(H. influenzae)로부터의 단백질 D [EP-A-0594610, Ruan et al. (1990) J Immunol 145:3379-3384], 뉴모리신 [Kuo et al. (1995) Infect Immun 63:2706-13] 또는 그의 비-독성 유도체 [Michon et al. (1998) Vaccine. 16:1732-41], 폐렴구균 표면 단백질 PspA [WO02/091998], 철-흡수 단백질 [WO01/72337], 씨. 디피실레(C. difficile)로부터의 독소 A 또는 B [WO00/61761], 재조합 피. 아에루기노사(P. aeruginosa) 외단백질 A (rEPA) [WO00/33882] 등을 포함한다.
임의의 적합한 접합 반응은 필요한 경우에 임의의 적합한 링커와 함께 사용될 수 있다.
사카라이드는 전형적으로 접합 전에 활성화 또는 관능화될 것이다. 활성화는, 예를 들어 시아닐화 시약, 예컨대 CDAP (예를 들어 1-시아노-4-디메틸아미노 피리디늄 테트라플루오로보레이트 [Lees et al. (1996) Vaccine 14:190-198, WO95/08348 등])를 수반할 수 있다. 다른 적합한 기술은 카르보디이미드, 히드라지드, 활성 에스테르, 노르보란, p-니트로벤조산, N-히드록시숙신이미드, S-NHS, EDC, TSTU 등을 사용한다.
링커 기를 통한 연결은 임의의 공지된 절차, 예를 들어 US 4,882,317 및 US 4,695,624에 기재된 절차를 사용하여 이루어질 수 있다. 한 유형의 연결은 폴리사카라이드의 환원성 아미노화, 생성된 아미노 기와 아디프산 링커 기의 한 말단과의 커플링 및 이어서 아디프산 링커 기의 다른 말단에의 단백질 커플링을 수반한다 [Porro et al. (1985) Mol Immunol 22:907-919, EP0208375]. 다른 링커는 B-프로피온아미도 [WO00/10599], 니트로페닐-에틸아민 [Gever et al. Med. Microbiol. Immunol, 165: 171-288 (1979)], 할로아실 할라이드 [US 4,057,685], 글리코시드 연결 [US 4,673,574; US 4,761,283; US 4,808,700], 6-아미노카프로산 [US 4,459,286], ADH [US 4,965,338], C4 내지 C12 모이어티 [US 4,663,160] 등을 포함한다. 링커를 사용하는 것에 대한 대안으로서, 직접 연결이 사용될 수 있다. 단백질에 대한 직접 연결은, 예를 들어 US 4,761,283 및 US 4,356,170에 기재된 바와 같이, 폴리사카라이드의 산화에 이어서 단백질에 의한 환원성 아미노화를 포함할 수 있다.
아미노 기를 사카라이드 내로 도입하고 (예를 들어, 말단 =O 기를 -NH2로 대체함으로써), 이어서 아디프산 디에스테르 (예를 들어, 아디프산 N-히드록시숙신이미도 디에스테르)로 유도체화하고, 담체 단백질과 반응시키는 것을 수반하는 방법이 바람직하다. 또 다른 바람직한 반응은, 예를 들어 MenC의 경우 단백질 D 담체에 의한 CDAP 활성화를 사용한다.
현행 혈청군 C 백신 (멘주게이트™ [Costantino et al. (1992) Vaccine 10:691-698, Jones (2001) Curr Opin Investig Drugs 2:47-49], 메닌기텍™ 및 네이스백-C™)은 접합된 사카라이드를 포함한다. 멘주게이트™ 및 메닌기텍™은 CRM197 담체에 접합된 올리고사카라이드 항원을 갖는 반면, 네이스백-C™은 파상풍 톡소이드 담체에 접합된 완전한 폴리사카라이드 (탈-O-아세틸화)를 사용한다.
상표명 멘베오, 메낙트라 및 니멘릭스로 시판되는 백신 제품은 모두 혈청군 Y, W135, C 및 A 각각으로부터의 접합된 피막 사카라이드 항원을 함유한다.
멘베오 (또한 일반적으로 수막구균 (군 A, C, Y 및 W-135) 올리고사카라이드 디프테리아 CRM197 접합체 백신으로도 공지됨)에서, 각각의 A, C, W135 및 Y 항원은 CRM197 담체에 접합된다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 혈청군 C, W135 및 Y 올리고사카라이드 항원은 각각 CRM197에 접합된다. 바람직하게는, 각각의 접합된 혈청군 C, W135 및 Y 피막 사카라이드 항원은 허가된 멘베오 백신의 CRM197-접합된 혈청군 C, W135 및 Y 항원 성분에 상응한다.
메낙트라 (또한 일반적으로 수막구균 (군 A, C, Y 및 W-135) 폴리사카라이드 디프테리아 톡소이드 접합체 백신으로도 공지됨)에서, 각각의 A, C, W135 및 Y 항원은 디프테리아 톡소이드 담체에 접합된다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 혈청군 C, W135 및 Y 올리고사카라이드 항원은 각각 디프테리아 톡소이드 담체에 접합된다. 바람직하게는, 각각의 접합된 혈청군 C, W135 및 Y 피막 사카라이드 항원은 허가된 메낙트라 백신의 디프테리아 톡소이드 담체-접합된 혈청군 C, W135 및 Y 항원 성분에 상응한다.
니멘릭스 (또한 일반적으로 수막구균 폴리사카라이드 군 A, C, W-135 및 Y 접합체 백신으로도 공지됨)에서, 각각의 A, C, W135 및 Y 항원은 파상풍 톡소이드 담체에 접합된다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 혈청군 C, W135 및 Y 올리고사카라이드 항원은 각각 파상풍 톡소이드 담체에 접합된다. 바람직하게는, 각각의 접합된 혈청군 C, W135 및 Y 피막 사카라이드 항원은 허가된 니멘릭스 백신의 파상풍 톡소이드 담체-접합된 혈청군 C, W135 및 Y 항원 성분에 상응한다.
혈청군 B 항원 성분
벡스세로 백신 제품 (또한 C4MenB로도 공지됨)은 B군 수막구균 NZ98/254, B:4:P1.7b,4의 유행성 균주로부터의 OMV의 제제를 함유한다. 동일한 OMV가 MeNZB™ 백신에서 발견되며, 본원에서 OMVnz로 지칭된다. 추가로, 벡스세로는 5종의 수막구균 항원: NHBA (287; 하위변이체 1.2), fHbp (741; 하위변이체 1.1), NadA (961; 하위변이체 3.1), GNA1030 (953) 및 GNA2091 (936)을 포함한다. 이들 항원 중 4종은 융합 단백질 (NHBA-GNA1030 융합 단백질 (287-953) 및 GNA2091-fHbp (936-741) 융합 단백질)로서 존재한다. 0.5 ml 용량의 벡스세로®는 1.5 mg 수산화알루미늄 아주반트 상에 흡착된 50 μg의 각각의 NHBA, NadA 및 fHbp 및 엔. 메닌기티디스 균주 NZ98/254로부터의 25μg OMV를 포함한다. 벡스세로는 문헌에 기재되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Bai et al. (2011) Expert Opin Biol Ther. 11:969-85, Su & Snape (2011) Expert Rev Vaccines 10:575-88] 참조).
바람직한 실시양태에서, 본 발명의 면역원성 조성물의 혈청군 B 항원 성분은 벡스세로의 단백질 항원 성분 중 1종 이상을 포함한다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명의 면역원성 조성물은 상기 기재된 벡스세로의 모든 수막구균 항원 성분 (단백질 항원 및 OMV)을 포함한다.
추가의 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 면역원성 조성물은 상표명 벡스세로로 시판되는 완전 백신 제품을 포함한다.
추가의 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 면역원성 조성물은 벡스세로의 fHbp v1.1 성분과 상이한 1종 이상의 fHbp 항원을 포함하고, 바람직하게는 추가의 fHbp 항원은 fHbp 231 융합 폴리펩티드의 형태이다. 바람직하게는, 추가의 fHbp 항원은 WO2020/030782에 개시된 항원이다. 이러한 fHbp 항원 성분은 조성물의 유일한 MenB 항원 성분으로서 또는 보다 바람직하게는 벡스세로 항원 중 1종 이상에 추가로 또는 완전 벡스세로 백신 제품에 추가로 본 발명의 면역원성 조성물에 포함될 수 있다.
지단백질인 인자 H 결합 단백질 (fHbp)은 모든 MenB 균주의 표면 상에서 발현된다. fHbp는 인간 보체 조절 단백질인 인자 H (hfH)에 결합하여, 보체-매개 사멸로부터 박테리아를 보호하는 복합체를 형성하고, 인간 혈류에서 엔. 메닌기티디스에 대한 생존 메카니즘을 제공한다. fHbp에 대한 항체는 이중 역할을 갖는다: 이들은 그 자체로 살박테리아성이고, hfH에 대한 결합을 방지함으로써 균주를 박테리아 사멸에 보다 감수성이게 한다. hfH에 결합하는 fHbp의 능력을 감소시키거나 제거하는 것은 fHbp 에피토프를 차폐하고 항체 결합을 방지하는 잠재력을 갖는 fHbp와 hfH 사이의 보호성 복합체의 형성을 방지함으로써 fHbp 항원의 면역원성을 증가시킨다.
fHbp는 3종의 상이한 유전적 및 면역원성 변이체 (v1, v2 및 v3)에 존재하고, 많은 하위변이체를 갖는다. 벡스세로에 의한 적용범위에 들지 않는 대다수의 MenB 균주는 var1.1 (var1.1은 벡스세로에 포함되는 fHbp 항원임)과의 관련성이 먼 v2, v3 또는 v1 하위변이체에서 fHbp를 발현한다.
WO2020/030782는 면역원성이고 개선된 엔. 메닌기티디스 균주 적용범위를 제공하기 위해 기존 수막구균 백신과 조합될 수 있는 돌연변이된 fHbp 변이체 1 (v1) 폴리펩티드를 개시한다. 특히, 이들 v1 폴리펩티드는 벡스세로에 포함된 fHbp v1.1 항원과 비교하여 유전적으로 다양한 fHbp 변이체 1의 하위변이체이다.
추가로, WO2020/030782에 개시된 v1 폴리펩티드는 상응하는 야생형 v1 폴리펩티드와 비교하여 hfH에 대한 결합을 감소시키기 위해 돌연변이된다. 대조적으로, 벡스세로에 포함된 fHbp v1.1 항원 및 트루멘바에 포함된 fHp v1.55 및 v3.45 항원은 hfH에 결합한다.
WO2020/030782에 개시된 v1 폴리펩티드는 단독으로 또는 융합 단백질의 성분으로서, 안정성을 개선시키고 또한 fHbp 결합을 감소시키도록 변형된 fHbp 변이체 2 및 3의 돌연변이체 형태와 함께 제공될 수 있다. 이들 v2 및 v3 항원을 본 발명의 v1 항원과 함께 포함하는 단일 융합 단백질을 제공함으로써, 본 발명자들은 균주 적용범위를 개선시킨다. 명확성을 위해, v2 및 v3 항원 중 어느 것도, 예를 들어 벡스세로에 존재하지 않는다. 본 발명의 융합 단백질 내의 v2 및 v3 항원의 존재는, 예를 들어 벡스세로와 비교하여 균주 적용범위를 개선시킨다.
v1 폴리펩티드 및 융합 단백질은 바람직하게는 수막구균 NHBA 항원, 수막구균 NadA 항원, 수막구균 fHbp 항원 및 수막구균 외막 소포와 조합되어 (예를 들어, 벡스세로 조성물과 조합되어) 사용되어, 벡스세로 단독과 비교하여 증가된 면역원성 (fHbp 변이체의 비-결합 형태의 첨가/포함으로 인함) 및 증가된 엔. 메닌기티디스 혈청형 B 균주 적용범위 (새로운 fHbp 변이체/하위변이체의 첨가로 인함)를 갖는 조합된 면역원성 조성물을 제공한다.
돌연변이체 v1.13 수막구균 fHbp 폴리펩티드
WO2020/030782의 발명자들은 hfH에 대한 결합을 감소시키도록 변형될 수 있는 fHbp v1.13 서열 내의 잔기를 확인하였다. 이러한 돌연변이체는 본원에서 비-결합 (NB) 돌연변이체로 지칭된다. 본 발명자들은 또한 hfH에 대한 결합을 감소시키는 데 특히 유용한 v1.13 서열 내의 돌연변이의 조합을 확인하였다. fHbp v1.13은 또한 fHbp 변이체 B09로서 관련 기술분야에 공지되어 있다.
균주 M982로부터의 성숙 야생형 fHbp v1.13 지단백질 (진뱅크 수탁 번호 AAR84475.1)은 하기 아미노산 서열을 가지며, N-말단 폴리-글리신 신호 서열은 밑줄표시된다:
성숙 v1.13 지단백질은 전장 야생형 서열과 상이하며, 전장 폴리펩티드는 추가의 19개 잔기 N-말단 리더 서열을 갖고, 이는 성숙 폴리펩티드에서 절단되어 있다. 따라서, 전장 야생형 fHbp v1.13은 하기 아미노산 서열을 갖는다 (N-말단 리더 서열은 볼드체로 제시됨):
성숙 v1.13 지단백질의 ΔG 형태는 성숙 폴리펩티드의 N-말단 폴리-글리신 서열이 결여되어 있으며, 즉 서열식별번호: 1의 처음 7개의 아미노산이 결여되어 있고, 서열식별번호: 31의 처음 26개의 아미노산이 결여되어 있다:
따라서, 한 실시양태에서, 본 발명의 면역원성 조성물의 혈청군 B 항원 성분은 서열식별번호: 2에 대해 적어도 k% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 돌연변이체 v1.13 수막구균 fHbp 폴리펩티드를 포함하며, 단 상기 돌연변이체 v1.13 수막구균 fHbp 폴리펩티드의 아미노산 서열은 서열식별번호: 2의 잔기 E211, S216 또는 E232 중 1개 이상에서의 치환 돌연변이를 포함한다.
k의 값은 80, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100으로부터 선택될 수 있다. 이는 바람직하게는 80 (즉, 돌연변이체 fHbp v1.13 아미노산 서열이 서열식별번호: 2에 대해 적어도 80% 동일성을 가짐)이고, 보다 바람직하게는 85, 보다 바람직하게는 90, 보다 바람직하게는 95이다. 가장 바람직하게는, 돌연변이체 fHbp v1.13 아미노산 서열은 서열식별번호: 2에 대해 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일성을 갖는다.
바람직하게는, 아미노산 서열은 치환 E211A, S216R 또는 E232A 중 적어도 1개 이상에 의해 서열식별번호: 2와 상이하다. 보다 바람직하게는, 아미노산 서열은 하기 (i) E211A 및 E232A 또는 (ii) E211A 및 S216R로부터 선택된 다수의 잔기에서의 치환을 포함한다. 보다 바람직하게는, 아미노산 서열은 서열식별번호: 2에 비해 잔기 E211A 및 S216R에서의 치환을 포함한다.
이론에 얽매이는 것을 원하지는 않지만, 서열식별번호: 2의 잔기 211에서의 글루탐산 (E)의 알라닌 (A)으로의 치환은 hfH 동원에 수반되는 음으로 하전된 잔기를 제거하여 fH 결합의 제거에 기여한다. 서열식별번호: 2의 잔기 216에서의 세린 (S)의 아르기닌 (R)으로의 치환은 야생형 아미노산을 hfH에 결합하지 않는 엔. 고노레아에(N. gonorrhoeae)로부터의 상응하는 잔기로 대체한다.
바람직한 실시양태에서, 돌연변이체 v1.13 폴리펩티드는 서열식별번호: 3 (v1.13 ΔG (E211A/E232A)) 또는 서열식별번호: 4 (v1.13 ΔG (E211A/S216R))의 아미노산 서열을 갖는다. 보다 바람직하게는, 돌연변이체 v1.13 폴리펩티드는 서열식별번호: 4의 아미노산 서열을 갖는다.
돌연변이체 v1.13 폴리펩티드는 숙주 동물, 바람직하게는 포유동물, 보다 바람직하게는 인간에게 투여된 후, 서열식별번호: 1의 야생형 수막구균 fHbp 폴리펩티드를 인식할 수 있는 항체를 도출할 수 있다. 이들 항체는 이상적으로는 살박테리아성이다 (하기 참조).
돌연변이체 v1.15 수막구균 fHbp 폴리펩티드
WO2020/030782의 발명자들은 또한 hfH에 대한 결합을 방지하도록 변형될 수 있는 fHbp v1.15 서열 내의 잔기를 확인하였다. 이러한 돌연변이체는 본원에서 비-결합 (NB) 돌연변이체로 지칭된다. 본 발명자들은 hfH에 대한 결합을 방지하는 데 특히 유용한 v1.15 서열 내의 돌연변이의 조합을 확인하였다. fHbp v1.15는 또한 fHbp 변이체 B44로서 관련 기술분야에 공지되어 있다.
균주 NM452로부터의 성숙 야생형 fHbp v1.15 지단백질 (진뱅크 수탁 번호 ABL14232.1)은 하기 아미노산 서열을 가지며, N-말단 폴리-글리신 신호 서열은 밑줄표시된다:
성숙 v1.15 지단백질은 전장 야생형 서열과 상이하며, 전장 폴리펩티드는 추가의 19개 잔기 N-말단 리더 서열을 갖고, 이는 성숙 폴리펩티드에서 절단되어 있다. 따라서, 전장 야생형 fHbp v1.15는 하기 아미노산 서열을 갖는다 (N-말단 리더 서열은 볼드체로 제시됨):
성숙 v1.15 지단백질의 ΔG 형태는 N-말단 폴리-글리신 서열이 결여되어 있으며, 즉 서열식별번호: 5의 처음 12개의 아미노산이 결여되어 있고, 서열식별번호: 32의 처음 31개의 아미노산이 결여되어 있다:
따라서, 한 실시양태에서, 본 발명의 면역원성 조성물의 혈청군 B 항원 성분은 서열식별번호: 6에 대해 적어도 k% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 단 상기 돌연변이체 v1.15 수막구균 fHbp 폴리펩티드의 아미노산 서열은 서열식별번호: 6의 잔기 E214, S219 또는 E235 중 1개 이상에서의 치환 돌연변이를 포함한다.
k의 값은 80, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100으로부터 선택될 수 있다. 이는 바람직하게는 80 (즉, 돌연변이체 fHbp v1.15 아미노산 서열이 서열식별번호: 6에 대해 적어도 80% 동일성을 가짐)이고, 보다 바람직하게는 85, 보다 바람직하게는 90, 보다 바람직하게는 95이다. 가장 바람직하게는, 돌연변이체 fHbp v1.15 아미노산 서열은 서열식별번호: 6에 대해 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일성을 갖는다.
바람직하게는, 아미노산 서열은 치환 E214A, S219R 또는 E235A 중 적어도 1개 이상에 의해 서열식별번호: 6과 상이하다. 보다 바람직하게는, 아미노산 서열은 하기: (i) S219R, (ii) E214A 및 S219R 및 (iii) E214A 및 E235A로부터 선택된 잔기에서의 치환을 포함한다.
바람직한 실시양태에서, 돌연변이체 v1.15 폴리펩티드는 서열식별번호: 7 (v.1.15_S219R), 서열식별번호: 8 (v1.15_E214A/S219R) 또는 서열식별번호: 9 (v1.15_E214A/E235A)의 아미노산 서열을 갖는다.
돌연변이체 v1.15 폴리펩티드는 숙주 동물, 바람직하게는 포유동물, 보다 바람직하게는 인간에게 투여된 후, 서열식별번호: 5의 야생형 수막구균 fHbp 폴리펩티드를 인식할 수 있는 항체를 도출할 수 있다. 이들 항체는 이상적으로는 살박테리아성이다 (하기 참조).
융합 폴리펩티드
WO2020/030782의 개시내용은 또한 v1, v2 및 v3 수막구균 fHbp 폴리펩티드 중 3종 모두를 포함하는 융합 폴리펩티드를 제공하며, 여기서 변이체 fHbp 서열은 N-말단에서 C-말단으로 v2-v3-v1 순서이다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 면역원성 조성물의 혈청군 B 항원 성분은 이러한 fHbp 융합 폴리펩티드를 포함한다.
바람직하게는, fHbp 융합 폴리펩티드는 화학식 NH2-A-[-X-L]3-B-COOH의 아미노산 서열을 가지며, 여기서 각각의 X는 상이한 변이체 fHbp 서열이고, L은 임의적인 링커 아미노산 서열이고, A는 임의적인 N 말단 아미노산 서열이고, B는 임의적인 C 말단 아미노산 서열이다.
융합체의 v1 fHbp 폴리펩티드 성분은 상기 기재된 바와 같은 돌연변이체 v1.13 fHbp 폴리펩티드 또는 돌연변이체 v1.13 fHbp 폴리펩티드이다.
융합체의 v2 및 v3 fHbp 폴리펩티드 성분은 바람직하게는 야생형 v2 및 v3 폴리펩티드와 비교하여 증진된 안정성 및 감소된 hfH 결합 능력을 갖는 돌연변이체 v2 및 v3 폴리펩티드이다. 상기 설명된 바와 같이, hfH에 대한 fHbp 결합을 감소시키는 것이 유리한데, 이것이 fHbp 에피토프를 차폐할 수 있는 fHbp와 hfH 사이의 보호성 복합체의 형성을 방지함으로써 폴리펩티드 항원의 면역원성을 증가시키기 때문이다.
폴리펩티드의 안정성을 증가시키고 또한 hfH에 대한 결합을 감소시키도록 변형될 수 있는 v2 및 v3 서열 내의 잔기가 확인되었고, WO2015/128480에 상세하게 기재되어 있다.
균주 2996으로부터의 전장 야생형 fHbp v2는 하기 아미노산 서열을 갖는다 (리더 서열은 볼드체로 제시되고, 폴리-글리신 서열은 밑줄표시됨):
성숙 지단백질은 서열식별번호: 10의 처음 19개의 아미노산이 결여되어 있다:
서열식별번호: 10의 ΔG 형태는 처음 26개의 아미노산이 결여되어 있다:
바람직한 실시양태에서, 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 12에 대해 적어도 k% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 돌연변이체 v2 fHbp 폴리펩티드를 포함하며, 단 v2 fHbp 아미노산 서열은 서열식별번호: 12의 잔기 S32 및 L123에서의 치환 돌연변이를 포함한다. 바람직하게는 치환은 S32V 및 L123R이다.
k의 값은 80, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100으로부터 선택될 수 있다. 이는 바람직하게는 80 (즉, 돌연변이체 fHbp v2 아미노산 서열이 서열식별번호: 12에 대해 적어도 80% 동일성을 가짐)이고, 보다 바람직하게는 85, 보다 바람직하게는 90, 보다 바람직하게는 95이다.
일부 실시양태에서, 융합 단백질에 포함된 fHbp v2 폴리펩티드는 서열식별번호: 12에 비해 말단절단된다. 야생형 성숙 서열과 비교하여, 서열식별번호: 12는 N-말단에서 이미 폴리-글리신 서열을 포함한 여기까지 말단절단되어 있지만 (서열식별번호: 11 및 12 비교), 서열식별번호: 12는 C-말단에서 말단절단되고/거나 N-말단에서 추가로 말단절단될 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 융합 단백질에 포함된 v2 fHbp 폴리펩티드는 서열식별번호: 16의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진다.
융합 단백질에 포함된 v2 fHbp 폴리펩티드는 동일한 실험 조건 하에, 잔기 S32 및 L123에서의 서열 차이가 없는 것을 제외하고는 동일한 폴리펩티드보다 더 높은 안정성을 가지며, 예를 들어 서열식별번호: 10으로 이루어진 야생형 수막구균 폴리펩티드보다 더 높은 안정성을 갖는다. S32V 돌연변이는 유리한 소수성 상호작용을 도입함으로써 구조를 안정화시킨다. L123R 돌연변이는 fH와의 충돌 및 불리한 전하를 도입함으로써 fH 결합을 제거한다.
안정성 증진은, 예를 들어 문헌 [Johnson (2013) Arch Biochem Biophys 531:100-9 및 Bruylants et al. Current Medicinal Chemistry 2005; 12:2011-20]에 논의된 바와 같이 시차 주사 열량측정법 (DSC)을 사용하여 평가될 수 있다. DSC는 이전에 v2 fHbp의 안정성을 평가하는 데 사용되었다 (Johnson et al. PLoS Pathogen 2012; 8: e1002981). 안정성을 평가하기 위한 DSC에 적합한 조건은 100-200mM NaCl (예를 들어 150mM)을 함유하는 pH 6 내지 8 (예를 들어 7-7.5)인 완충 용액 (예를 들어 25mM 트리스) 중 20μM의 폴리펩티드를 사용할 수 있다.
안정성의 증가는 DSC에 의해 평가하였을 때 야생형과 비교하여 적어도 1개의 피크의 열 전이 중간점 (Tm)의 적어도 5℃, 예를 들어 적어도 10℃, 15℃, 20℃, 25℃, 30℃, 35℃ 또는 그 초과의 증가에 의해 입증된다. 야생형 fHbp는 언폴딩 동안 2개의 DSC 피크 (N-말단 도메인에 대한 것 1개 및 C-말단 도메인에 대한 것 1개)를 나타내고, 본 발명의 융합 단백질에 포함된 v2 폴리펩티드가 이러한 도메인 둘 다를 포함하는 경우에, "안정성의 증가"는 N-말단 도메인의 Tm의 적어도 5℃ 증가를 지칭한다. N-말단 도메인의 Tm은 야생형 v2 서열에서 40℃ 또는 심지어 그 미만에서 발생할 수 있는 반면 (Johnson et al. (2012) PLoS Pathogen 8: e1002981), C-말단 도메인은 80℃ 이상의 Tm을 가질 수 있다. 따라서, 본 발명의 융합 단백질에 포함된 돌연변이체 fHbp v2 아미노산 서열은 바람직하게는 Tm이 적어도 45℃, 예를 들어 ≥50℃, ≥55℃, ≥60℃, ≥65℃, ≥70℃, ≥75℃ 또는 심지어 ≥80℃인 N-말단 도메인을 갖는다.
균주 M1239로부터의 전장 야생형 fHbp v3은 하기 아미노산 서열을 갖는다 (리더 서열은 볼드체로 제시되고, 폴리-글리신 서열은 밑줄표시됨):
성숙 지단백질은 서열식별번호: 13의 처음 19개의 아미노산이 결여되어 있다:
서열식별번호: 13의 ΔG 형태는 처음 31개의 아미노산이 결여되어 있다 (즉, 신호 서열 및 폴리-글리신 서열이 결여되어 있음):
바람직한 실시양태에서, 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 15에 대해 적어도 k% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 돌연변이체 v3 fHbp 폴리펩티드를 포함하며, 단 v3 fHbp 아미노산 서열은 서열식별번호: 15의 잔기 S32 및 L126에서의 치환 돌연변이를 포함한다. 바람직하게는 치환은 S32V 및 L126R이다.
k의 값은 80, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100으로부터 선택될 수 있다. 이는 바람직하게는 80 (즉, 돌연변이체 fHbp v2 아미노산 서열이 서열식별번호: 15에 대해 적어도 80% 동일성을 가짐)이고, 보다 바람직하게는 85, 보다 바람직하게는 90, 보다 바람직하게는 95이다.
일부 실시양태에서, 융합 단백질에 포함된 fHbp v3 폴리펩티드는 서열식별번호: 15에 비해 말단절단된다. 야생형 성숙 서열과 비교하여, 서열식별번호: 15는 N-말단에서 이미 폴리-글리신 서열을 포함한 여기까지 말단절단되어 있지만 (서열식별번호: 14 및 15 비교), 서열식별번호: 15는 C-말단에서 말단절단되고/거나 N-말단에서 추가로 말단절단될 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 융합 단백질에 포함된 v3 fHbp 폴리펩티드는 서열식별번호: 17의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진다.
융합 단백질에 포함된 v3 fHbp 폴리펩티드는 동일한 실험 조건 하에, 잔기 S32 및 L126에서의 서열 차이가 없는 것을 제외하고는 동일한 폴리펩티드보다 더 높은 안정성을 가지며, 예를 들어 서열식별번호: 13으로 이루어진 야생형 수막구균 폴리펩티드보다 더 높은 안정성을 갖는다. S32V 돌연변이는 유리한 소수성 상호작용을 도입함으로써 구조를 안정화시킨다. L126R 돌연변이는 fH와의 충돌 및 불리한 전하를 도입함으로써 fH 결합을 제거한다.
안정성 증진은, 예를 들어 문헌 [Johnson (2013) Arch Biochem Biophys 531:100-9 및 Bruylants et al. (2005) Current Medicinal Chemistry 12:2011-20]에 논의된 바와 같이 시차 주사 열량측정법 (DSC)을 사용하여 평가될 수 있다. DSC는 이전에 v3 fHbp의 안정성을 평가하는 데 사용되었다 (van der Veen et al. (2014) Infect Immun PMID 24379280). 안정성을 평가하기 위한 DSC에 적합한 조건은 100-200mM NaCl (예를 들어 150mM)을 함유하는 pH 6 내지 8 (예를 들어 7-7.5)인 완충 용액 (예를 들어 25mM 트리스) 중 20μM의 폴리펩티드를 사용할 수 있다.
안정성의 증가는 DSC에 의해 평가하였을 때 야생형과 비교하여 적어도 1개의 피크의 열 전이 중간점 (Tm)의 적어도 5℃, 예를 들어 적어도 10℃, 15℃, 20℃, 25℃, 30℃, 35℃ 또는 그 초과의 증가에 의해 입증된다. 야생형 fHbp는 언폴딩 동안 2개의 DSC 피크 (N-말단 도메인에 대한 것 1개 및 C-말단 도메인에 대한 것 1개)를 나타내고, 본 발명의 융합 단백질에 포함된 v3 폴리펩티드가 이러한 도메인 둘 다를 포함하는 경우에, "안정성의 증가"는 N-말단 도메인의 Tm의 적어도 5℃ 증가를 지칭한다. N 말단 도메인의 Tm은 야생형 v3 서열에서 약 60℃ 이하에서 발생할 수 있는 반면 (Johnson et al. (2012) PLoS Pathogen 8:e1002981), C-말단 도메인은 80℃ 이상의 Tm을 가질 수 있다. 따라서, 본 발명의 돌연변이체 fHbp v3 아미노산 서열은 바람직하게는 Tm이 적어도 65℃, 예를 들어 ≥70℃, ≥75℃ 또는 심지어 ≥80℃인 N-말단 도메인을 갖는다.
상기 기재된 바와 같이, 바람직한 실시양태에서, fHbp 융합 폴리펩티드는 화학식 NH2-A-[-X-L]3-B-COOH의 아미노산 서열을 가지며, 여기서 각각의 X는 상이한 변이체 fHbp 서열이고, L은 임의적인 링커 아미노산 서열이다. 바람직한 실시양태에서, 링커 아미노산 서열 "L"은 글리신 중합체 또는 글리신-세린 중합체 링커이다.
예시적인 링커는 "GGSG", "GGSGG", "GSGSG", "GSGGG", "GGGSG", "GSSSG" 및 "GSGGGG"를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 다른 적합한 글리신 또는 글리신-세린 중합체 링커는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 분명할 것이다. 본 발명에 따른 바람직한 융합 폴리펩티드에서, v2와 v3 서열 및 v3과 v1 서열은 글리신-세린 중합체 링커 "GSGGGG"에 의해 연결된다.
바람직한 실시양태에서, 융합 폴리펩티드는 하기 아미노산 서열 중 하나를 포함하거나 또는 그로 이루어진다 (글리신-세린 링커 서열은 밑줄표시되고, 돌연변이된 잔기는 볼드체로 표시됨):
바람직한 실시양태에서, 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 19의 아미노산 서열을 포함한다. 대안적인 바람직한 실시양태에서, 융합 폴리펩티드는 서열식별번호: 18의 아미노산 서열을 포함한다.
융합 폴리펩티드는 숙주 동물, 바람직하게는 포유동물, 보다 바람직하게는 인간에게 투여된 후, 야생형 수막구균 fHbp 폴리펩티드, 특히 서열식별번호: 31, 32, 10 및/또는 13의 폴리펩티드를 인식할 수 있는 항체를 도출할 수 있다. 이들 항체는 이상적으로는 살박테리아성이다 (하기 참조).
상기 기재된 바와 같이, 바람직한 실시양태에서, fHbp 융합 폴리펩티드는 화학식 NH2-A-[-X-L]3-B-COOH의 아미노산 서열을 가지며, 여기서 각각의 X는 상이한 변이체 fHbp 서열이고, A는 임의적인 N 말단 아미노산 서열이다. 바람직한 실시양태에서, 본원에 기재된 융합 단백질은 융합 단백질의 우수한 발현을 가능하게 하는 데 유리한 하기 N-말단 아미노산 서열을 추가로 포함한다:
본원에 개시된 임의의 융합 단백질 (예를 들어, 서열식별번호: 18-22, 29 및 30)은 융합 폴리펩티드의 N-말단에 서열식별번호: 34의 아미노산 서열을 포함하도록 변형될 수 있으며, 즉 서열식별번호: 34의 아미노산 서열은 융합 폴리펩티드의 fHbp v2 성분의 N-말단에 부가된다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명의 면역원성 조성물의 혈청군 B 항원 성분은 상기 정의된 바와 같은 fHbp 융합 폴리펩티드와 함께 완전 벡스세로 백신 제품을 포함한다. 가장 바람직하게는, fHbp 융합 폴리펩티드는 fHbp 23S_1.13_E211A/S216R이다. 바람직하게는, 혈청군 B 항원 성분은 단일 완전 액체 제제로 제공된다.
살박테리아 반응
상기 기재된 바람직한 v1.13, v1.15 및/또는 융합 폴리펩티드는 수막구균에 대해 살박테리아성인 항체 반응을 도출할 수 있다. 살박테리아 항체 반응은 마우스에서 편리하게 측정되고, 백신 효능의 표준 지표이다 (예를 들어, 문헌 [Pizza et al. (2000) Science 287:1816-1820]의 각주 14; 또한 WO2007/028408 참조).
상기 기재된 폴리펩티드는 바람직하게는 v1.13 fHbp 서열을 발현하는 엔. 메닌기티디스 혈청군 B 균주에 대해 살박테리아성인 항체 반응을 도출할 수 있다.
상기 기재된 바람직한 폴리펩티드는 혈청 살박테리아 검정에서 v1.13 fHbp 서열을 발현하는 엔. 메닌기티디스 균주에 대해 살박테리아성인 항체를 마우스에서 도출할 수 있다.
상기 기재된 폴리펩티드는 바람직하게는 v1.15 fHbp 서열을 발현하는 엔. 메닌기티디스 혈청군 B 균주에 대해 살박테리아성인 항체 반응을 도출할 수 있다.
상기 기재된 바람직한 폴리펩티드는 혈청 살박테리아 검정에서 v1.15 fHbp 서열을 발현하는 엔. 메닌기티디스 균주에 대해 살박테리아성인 항체를 마우스에서 도출할 수 있다.
예를 들어, 이들 폴리펩티드를 포함하는 면역원성 조성물은 인간 보체를 사용한 골드슈나이더(Goldschneider) 검정 (문헌 [Goldschneider et al. (1969) J. Exp. Med. 129:1307-26, Santos et al. (2001) Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology 8:616-23, 및 Frasch et al. (2009) Vaccine 27S:B112-6])을 사용하여 ≥1:4의 혈청 살박테리아 역가를 제공할 수 있고/거나 새끼 토끼 보체를 사용하여 ≥1:128의 혈청 살박테리아 역가를 제공할 수 있다.
폴리펩티드
상기 기재된 폴리펩티드는 다양한 수단에 의해, 예를 들어 화학적 합성에 의해 (적어도 부분적으로), 프로테아제를 사용하여 보다 긴 폴리펩티드를 소화시킴으로써, RNA로부터의 번역에 의해, 세포 배양물로부터 (예를 들어 재조합 발현으로부터 또는 엔. 메닌기티디스 배양물로부터)의 정제 등에 의해 제조될 수 있다. 이. 콜라이 숙주에서의 이종 발현이 바람직한 발현 경로이다.
폴리펩티드는 이상적으로는 적어도 100개 아미노산 길이, 예를 들어 150aa, 175aa, 200aa, 225aa 또는 그 초과이다. 이들은 돌연변이체 fHbp v1, v2 및/또는 v3 아미노산 서열을 포함하고, 돌연변이체 fHbp v1, v2 또는 v3 아미노산 서열은 유사하게 적어도 100개 아미노산 길이, 예를 들어 150aa, 175aa, 200aa, 225aa 또는 그 초과이어야 한다.
fHbp는 자연적으로 엔. 메닌기티디스에서의 지단백질이다. 또한, 이는 이. 콜라이에서 그의 천연 리더 서열 또는 이종 리더 서열과 함께 발현될 때 지질화되는 것으로 밝혀졌다. 본 발명의 폴리펩티드는 N-말단 시스테인 잔기를 가질 수 있으며, 이는 예를 들어 팔미토일 기를 포함하여 지질화될 수 있고, 통상적으로 트리팔미토일-S-글리세릴-시스테인을 형성한다. 다른 실시양태에서, 폴리펩티드는 지질화되지 않는다.
폴리펩티드는 바람직하게는 실질적으로 순수한 또는 실질적으로 단리된 형태로 (즉, 다른 네이세리아 또는 숙주 세포 폴리펩티드가 실질적으로 없이) 제조된다. 일반적으로, 폴리펩티드는 비-자연 발생 환경에서 제공되고, 예를 들어 이들은 그의 자연 발생 환경으로부터 분리된다. 특정 실시양태에서, 폴리펩티드는 출발 물질과 비교하여 폴리펩티드가 풍부한 조성물에 존재한다. 따라서, 정제된 폴리펩티드가 제공되며, 여기서 정제된은 폴리펩티드가, 다른 발현된 폴리펩티드가 실질적으로 없는 조성물에 존재한다는 것을 의미하고, 여기서 실질적으로 없는은 조성물 중 총 폴리펩티드의 50% 초과 (예를 들어 ≥75%, ≥80%, ≥90%, ≥95% 또는 ≥99%)가 본 발명의 폴리펩티드라는 것을 의미한다.
폴리펩티드는 다양한 형태 (예를 들어, 천연, 융합, 글리코실화, 비-글리코실화, 지질화, 디술피드 가교 등)를 취할 수 있다.
폴리펩티드가 생물학적 숙주에서 번역에 의해 생산되는 경우에, 개시 코돈이 요구되며, 이는 대부분의 숙주에서 N-말단 메티오닌을 제공할 것이다. 따라서, 폴리펩티드는 적어도 신생 단계에서 상기 서열식별번호 서열의 상류에 메티오닌 잔기를 포함할 것이다.
신생 서열의 절단은 돌연변이체 fHbp v1, v2 또는 v3 아미노산 서열이 그 자체로 폴리펩티드의 N-말단을 제공할 수 있다는 것을 의미한다. 그러나, 다른 실시양태에서, 폴리펩티드는 돌연변이체 fHbp v1, v2 또는 v3 아미노산 서열의 상류에 N-말단 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 N-말단에 단일 메티오닌을 갖고, 바로 이어서 돌연변이체 fHbp v1, v2 또는 v3 아미노산 서열을 가지며; 다른 실시양태에서는 보다 긴 상류 서열이 사용될 수 있다. 이러한 상류 서열은 짧을 수 있다 (예를 들어, 40개 이하의 아미노산, 즉 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1개). 예는 단백질 트래픽킹을 지시하는 리더 서열 또는 클로닝 또는 정제를 용이하게 하는 짧은 펩티드 서열 (예를 들어 히스티딘 태그, 즉 Hisn (여기서 n = 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 초과))을 포함한다. 다른 적합한 N-말단 아미노산 서열은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 분명할 것이다.
폴리펩티드는 또한 돌연변이체 fHbp v1, v2 또는 v3 아미노산 서열의 최종 아미노산의 하류에 아미노산을 포함할 수 있다. 이러한 C-말단 연장부는 짧을 수 있다 (예를 들어, 40개 이하의 아미노산, 즉 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1개). 예는 단백질 트래픽킹을 지시하는 서열, 클로닝 또는 정제를 용이하게 하는 짧은 펩티드 서열 (예를 들어 히스티딘 태그, 즉 Hisn (여기서 n = 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 초과)을 포함함) 또는 폴리펩티드 안정성을 증진시키는 서열을 포함한다. 다른 적합한 C-말단 아미노산 서열은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 분명할 것이다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 C-말단에 히스티딘 태그 (문헌 [Johnson et al. (2012) PLoS Pathogen 8:e1002981, 및 Pajon et al. (2012) Infect Immun 80:2667-77] 참조) 및 특히 헥사히스티딘 태그를 포함하는 폴리펩티드를 배제한다.
용어 "폴리펩티드"는 임의의 길이의 아미노산 중합체를 지칭한다. 중합체는 선형 또는 분지형일 수 있고, 변형된 아미노산을 포함할 수 있으며, 비-아미노산이 개재될 수 있다. 용어는 또한 자연적으로 또는 개입에 의해; 예를 들어, 디술피드 결합 형성, 글리코실화, 지질화, 아세틸화, 인산화 또는 임의의 다른 조작 또는 변형, 예컨대 표지 성분과의 접합에 의해 변형된 아미노산 중합체를 포괄한다. 또한, 예를 들어 아미노산의 1개 이상의 유사체 (예를 들어, 비천연 아미노산 등 포함), 뿐만 아니라 관련 기술분야에 공지된 다른 변형을 함유하는 폴리펩티드가 상기 정의 내에 포함된다. 폴리펩티드는 단일 쇄 또는 회합된 쇄로서 발생할 수 있다.
폴리펩티드는 고체 지지체에 부착되거나 고정화될 수 있다.
폴리펩티드는 검출가능한 표지, 예를 들어 방사성 표지, 형광 표지 또는 비오틴 표지를 포함할 수 있다. 이는 면역검정 기술에 특히 유용하다.
폴리펩티드는 전형적으로 인공 아미노산 서열, 즉 임의의 자연 발생 수막구균에 존재하지 않는 서열로 이루어진다.
인자 H에 대한 친화도는 고정화된 인간 fH를 사용한 표면 플라즈몬 공명 (예를 들어, 문헌 [Schneider et al. (2009) Nature 458:890-5]에 개시된 바와 같음)을 사용하여 정량적으로 평가될 수 있다. (동일한 실험 조건 하에 측정된 경우에 돌연변이가 없는 것을 제외하고는 동일한 폴리펩티드에 비해) 적어도 10배, 이상적으로는 적어도 100배의 친화도 감소 (즉, 해리 상수 KD의 증가)를 제공하는 돌연변이가 바람직하다.
본 발명의 면역원성 조성물
본 발명의 면역원성 조성물은 5종의 상이한 수막구균 혈청형 (A, B, C, W135 및 Y)에 대한 항원 성분을 포함하는 5가 조성물이다. 각각의 이들 성분은 상기 정의된 바와 같다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명의 5가 면역원성 조성물은 하기를 포함한다:
● 상기 정의된 바와 같은 CRM 197에 접합된, 혈청군 A 피막 사카라이드의 합성 유사체인 혈청군 A 항원;
● 상기 정의된 바와 같은 CRM 197에 접합된 혈청군 C 항원;
● 상기 정의된 바와 같은 CRM 197에 접합된 혈청군 W135 항원;
● 상기 정의된 바와 같은 CRM 197에 접합된 혈청군 Y 항원; 및
● 허가된 백신 벡스세로의 항원을 상기 정의된 바와 같은 fHBp 231 융합 단백질과 함께 포함하는 혈청군 B 항원의 조합물.
바람직한 실시양태에서, 본 발명의 5가 면역원성 조성물은 완전 액체 (수성) 제제로서 제공된다. 의심을 피하기 위해, 이는 각각의 성분이 액체 형태이고 면역원성 조성물의 어떠한 성분도 고체 (동결건조) 형태가 아니라는 것을 의미한다.
본 발명의 추가 측면에 따르면, 적어도 1종의 제약상 허용되는 부형제를 포함하는, 상기 기재된 바와 같은 면역원성 조성물이 제공된다.
일반적으로, 제약상 허용되는 부형제는 그 자체가 항체의 생산을 유도하지 않고, 조성물을 받는 환자에게 유해하지 않으며, 과도한 독성 없이 투여될 수 있는 임의의 물질일 수 있다. 제약상 허용되는 담체 및 부형제는 관련 기술분야에서 사용되는 것들이고, 액체, 예컨대 물, 염수, 글리세롤 및 에탄올을 포함할 수 있다. 선행 기술에 따르면, 보조 물질, 예컨대 습윤제 또는 유화제, pH 완충 물질 등이 또한 이러한 비히클 중에 존재할 수 있다.
면역원성 조성물은 아주반트를 추가로 포함할 수 있다. 아주반트는 알루미늄 기재 아주반트, 예컨대 수산화알루미늄 또는 인산알루미늄일 수 있다.
본 발명의 면역원성 조성물은 다른 제약 활성 물질 또는 다른 백신과 조합되어 투여될 수 있다. 투여를 위한 조성물은 다른 유형의 면역원성 화합물, 예컨대 당접합체를 포함할 수 있으며, 예를 들어 다른 엔. 메닌기티디스 병원체에 대한 보호를 제공하는 면역 반응을 도출할 수 있다.
본 발명의 추가 측면에 따르면, 상기 기재된 바와 같은 면역원성 조성물을 포함하는 백신이 제공된다.
상기 면역원성 조성물은 네이세리아 메닌기티디스 감염에 대해 포유동물, 바람직하게는 인간을 면역화시키는 데 유용하다.
본 발명의 면역원성 조성물은 네이세리아 메닌기티디스 혈청군 A, B, C, W125 및/또는 Y에 의해 유발된 감염 및/또는 질환에 대해 포유동물을 면역화시켜, 면역원성 조성물의 수용자가 네이세리아 메닌기티디스 박테리아에 의한 감염 및/또는 그로 인한 질환에 대한 보호를 제공하는 면역 반응을 시작하도록 하는 데 사용된다.
따라서, 본 발명에 따른 면역원성 조성물은 네이세리아 메닌기티디스에 의해 유발된 감염 및/또는 질환에 대해 대상체를 면역화시키는 예방적 방법에 사용된다. 면역원성 조성물은 또한 치료 방법에 (즉, 네이세리아 메닌기티디스 감염을 치료하기 위해) 사용될 수 있다.
본 발명은 또한 포유동물에게 본 발명의 면역원성 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 포유동물에서 네이세리아 메닌기티디스 감염에 대한 생체내 면역 반응을 일으키는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 이러한 방법에 사용하기 위한 본 발명의 폴리펩티드를 제공한다.
면역 반응은 바람직하게는 보호성이고, 바람직하게는 항체 및/또는 세포-매개 면역을 수반한다. 바람직하게는, 면역 반응은 살박테리아 항체 반응이다. 방법은 부스터 반응을 일으킬 수 있다. 생체내 면역 반응을 일으킴으로써, 포유동물은 네이세리아 질환 (특히 수막구균 감염)에 대해 보호될 수 있다.
본 발명은 또한 포유동물에게 본 발명의 면역원성 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 네이세리아 (예를 들어 수막구균) 감염에 대해 포유동물을 보호하는 방법을 제공한다.
본 발명의 면역학적 조성물은 바람직하게는 치료적 (즉, 감염을 치료하기 위한) 또는 예방적 (즉, 감염을 예방하기 위한) 용도에 적합한 백신 제품으로서 제제화된다. 백신은 전형적으로 예방적이다.
포유동물은 바람직하게는 인간이다. 인간은 성인, 청소년 또는 아동 (예를 들어 영아 또는 유아)일 수 있다. 아동용으로 의도된 백신은 또한, 예를 들어 안전성, 투여량, 면역원성 등을 평가하기 위해 성인에게 투여될 수 있다.
용도 및 방법은 수막염 (특히 박테리아, 예컨대 수막구균, 수막염) 및 박테리아혈증을 포함하나 이에 제한되지는 않는 질환을 예방/치료하는 데 특히 유용하다. 예를 들어, 이들은 엔. 메닌기티디스에 의해 유발되는 침습성 수막구균 질환에 대한 (구체적으로 혈청군 A, B, C, W135 및 Y에 대한) 개체의 능동 면역화에 적합하다.
엔. 메닌기티디스에 대한 보호는 역학적으로, 예를 들어 임상 시험에서 측정될 수 있지만, 면역원성 조성물이 수용자에서 혈청 살박테리아 항체 (SBA) 반응을 도출하는지를 확인하는 간접적 측정을 사용하는 것이 편리하다. SBA 검정에서, 조성물의 수용자로부터의 혈청을 보체 (새끼 토끼 보체가 종종 대신 사용되지만, 바람직하게는 인간 보체)의 존재 하에 표적 박테리아 (본 발명에서, 엔. 메닌기티디스)와 함께 인큐베이션하고, 박테리아의 사멸을 다양한 혈청 희석률에서 평가하여 SBA 활성을 결정한다. SBA 검정에서 관찰된 결과는 경쟁적 SBA 검정을 수행하여 관심 항원(들)의 면역원성 활성의 추가의 간접적 증거를 제공함으로써 보강될 수 있다. 경쟁적 SBA 검정에서, 항원(들)을 함유하는 면역원성 조성물의 수용자로부터의 혈청을 상기 항원(들)과 함께 사전-인큐베이션하고, 후속적으로 인간 보체의 존재 하에 표적 박테리아와 함께 인큐베이션한다. 이어서, 박테리아의 사멸을 평가하고, 수용자의 혈청 내의 살박테리아 항체가 사전-인큐베이션 단계 동안 관심 항원에 결합하여 박테리아 상의 표면 항원에 결합하는 데 이용가능하지 않은 경우에, 감소 또는 제거할 것이다.
조성물이 엔. 메닌기티디스의 각각의 및 모든 균주에 대해 보호되어야 하거나 또는 조성물의 각각의 및 모든 수용자가 보호되어야 할 필요는 없다. 이러한 보편적인 보호는 이 분야에서 통상의 표준이 아니다. 오히려, 보호는 통상적으로 종종 국가별로 선택되고 아마도 시간에 따라 달라질 참조 실험실 균주의 패널에 대해 평가되고, 수용자 집단에 걸쳐 측정된다.
본 발명의 바람직한 조성물은 인간 대상체의 허용되는 백분율에 대해 각각의 항원 성분에 대한 혈청보호 기준보다 우수한 항체 역가를 환자에게 부여할 수 있다. 숙주가 항원에 대해 혈청전환된 것으로 간주되는 상기 연관된 항체 역가를 갖는 항원은 널리 공지되어 있고, 이러한 역가는 WHO와 같은 기구에 의해 공개되어 있다. 바람직하게는 대상체의 통계적으로 유의한 샘플의 80% 초과, 보다 바람직하게는 90% 초과, 보다 더 바람직하게는 93% 초과, 가장 바람직하게는 96-100%가 혈청전환된다.
면역원성 조성물은 면역학적 유효량의 면역원, 뿐만 아니라 필요에 따라 임의의 다른 명시된 성분을 포함한다.
'면역학적 유효량'은 단일 용량으로 또는 일련의 용량의 일부로서 개체에게 상기 양을 투여하는 것이 치료 또는 예방에 효과적이라는 것을 의미한다.
용어 "예방"은 질환의 진행이 감소 및/또는 제거되거나 또는 질환의 발병이 제거되는 것을 의미한다. 예를 들어, 대상체의 면역계는 프라이밍되어 (예를 들어 백신접종에 의함) 면역 반응을 촉발하고 감염을 퇴치함으로써 질환의 발병이 제거되도록 할 수 있다. 따라서, 백신접종된 대상체는 감염될 수는 있지만, 대조군 대상체보다 감염을 더 잘 퇴치할 수 있다. 이 양은 치료될 개체의 건강 및 신체 상태, 연령, 치료될 개체의 분류학적 군 (예를 들어 비-인간 영장류, 영장류 등), 항체를 합성하는 개체의 면역계의 능력, 목적하는 보호의 정도, 백신의 제제, 치료하는 의사의 의학적 상황의 평가 및 다른 관련 인자에 따라 달라진다. 양은 상용 시험을 통해 결정될 수 있는 비교적 넓은 범위에 속할 것으로 예상된다. 조성물은 다른 면역조절제와 함께 투여될 수 있다.
백신 효능
본 발명에 사용하기 위한 면역원성 조성물은 바람직하게는 적어도 10%, 예를 들어 ≥20%, ≥30%, ≥40%, ≥50%, ≥60%, ≥70%, ≥80%, ≥85%, ≥90% 또는 그 초과의 적어도 1종의 엔. 메닌기티디스 균주에 대한 백신 효능을 갖는다.
백신 효능은 본 발명에 따른 조성물을 받지 않은 대상체 (예를 들어, 비-면역화된 대상체 또는 위약 또는 음성 대조군을 받은 대상체)와 비교하여 이러한 조성물을 받은 대상체에서 수막구균 질환이 발생할 상대 위험의 감소에 의해 결정된다. 따라서, 본 발명에 따라 면역화된 집단에서의 수막구균 질환의 발생률을 본 발명에 따라 면역화되지 않은 대조군 집단에서의 발생률과 비교하여 상대 위험을 제공하며, 백신 효능은 100%에서 이 숫자를 뺀 것이다.
백신 효능은 개체보다는 집단에 대해 결정된다. 따라서, 이는 유용한 역학적 도구이지만, 개별 보호를 예측하지는 않는다. 예를 들어, 개별 대상체는 감염원의 매우 많은 접종물에 노출될 수 있거나 또는 이들을 감염에 보다 취약하게 만드는 다른 위험 인자를 가질 수 있지만, 이는 효능 척도의 유효성 또는 유용성을 무효화하지는 않는다. 본 발명에 따라 면역화되고 백신 효능이 측정되는 집단의 크기는 이상적으로는 적어도 100명이고, 더 많은 대상체, 예를 들어 적어도 500명의 대상체일 수 있다. 대조군의 크기는 또한 적어도 100명, 예를 들어 적어도 500명이어야 한다.
투여
본 발명의 조성물은 일반적으로 환자에게 직접 투여될 것이다. 직접 전달은 비경구 주사에 의해 (예를 들어, 피하로, 복강내로, 정맥내로, 근육내로 또는 조직의 간질 공간으로) 또는 직장, 경구, 질, 국소, 경피, 비강내, 안구, 귀, 폐 또는 다른 점막 투여에 의해 달성될 수 있다. 주사에 의한 투여가 바람직하다. 대퇴부 또는 상완에의 근육내 투여가 바람직하다. 주사는 바늘 (예를 들어, 피하 바늘)을 통해 이루어질 수 있지만, 무바늘 주사가 대안적으로 사용될 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 조성물은 단일 기밀 용기, 바람직하게는 바이알 또는 시린지에 포장된다.
네이세리아 감염은 신체의 다양한 영역에 영향을 미치고, 따라서 조성물은 다양한 형태로 제조될 수 있다. 예를 들어, 조성물은 액체 용액 또는 현탁액으로서 주사제로서 제조될 수 있다. 주사 전 액체 비히클 중 용액 또는 현탁액에 적합한 고체 형태가 또한 제조될 수 있다. 조성물은 국소 투여를 위해, 예를 들어 연고, 크림 또는 분말로서 제조될 수 있다. 조성물은 경구 투여를 위해, 예를 들어 정제 또는 캡슐로서 또는 시럽 (임의로 향미제 첨가됨)으로서 제조될 수 있다. 조성물은 폐 투여를 위해, 예를 들어 미세 분말 또는 스프레이를 사용하여 흡입기로서 제조될 수 있다. 조성물은 좌제 또는 페사리로서 제조될 수 있다. 조성물은 비강, 귀 또는 안구 투여를 위해, 예를 들어 점적제로서 제조될 수 있다. 비경구 주사에 적합한 조성물이 가장 바람직하다.
가장 바람직하게는, 본 발명의 면역원성 조성물은 완전 액체 제제로서 제공되며, 즉 본 발명의 조성물의 항원 성분은 동결건조 형태로 존재하지 않는다.
본 발명은 전신 및/또는 점막 면역을 도출하는 데 사용될 수 있다.
본원에 사용된 조성물의 '용량'은 단일 면역화로서 대상체에게 투여하기에 적합한 조성물의 부피이다. 인간 백신은 전형적으로 약 0.5 ml의 투여량 부피로 투여되지만, 분할 용량이 (예를 들어, 아동에게) 투여될 수 있다. 용량의 부피는 조성물 중 항원의 농도에 따라 추가로 달라질 수 있다.
조성물은 '다중용량' 키트, 즉 다중 면역화를 위한 충분한 조성물을 함유하는 단일 용기로 제공될 수 있다. 다중용량은 보존제를 포함할 수 있거나 또는 다중용량 용기는 조성물의 개별 용량의 제거를 위한 무균 어댑터를 가질 수 있다.
투여는 단일 용량 스케줄을 수반할 수 있지만, 통상적으로는 다중 용량 스케줄을 수반할 것이다. 바람직하게는, 적어도 3회 용량의 스케줄이 주어진다. 프라이밍 용량 사이의 적합한 간격은, 예를 들어 4-16주, 예컨대 1개월 또는 2개월로 상용적으로 결정될 수 있다. 예를 들어, 벡스세로®는 생후 2, 4 및 6개월에 또는 2, 3 및 4개월에 투여될 수 있고, 제4 임의적 용량은 12개월에 투여될 수 있다.
면역화되는 대상체는 임의의 연령, 예를 들어 생후 0-12개월, 1-5세, 5-18세, 18-55세 또는 55세 초과일 수 있는 인간이다. 바람직하게는, 면역화되는 대상체는 청소년 (예를 들어 12-18세) 또는 성인 (18세 이상)이다.
임의로, 대상체는 소아기에 (예를 들어 12세 전에) 엔. 메닌기티디스에 대해 면역화되었고 본 발명에 따른 면역원성 조성물의 부스터 용량을 받은 청소년 또는 성인이다.
비-항원 성분
본 발명의 면역원성 조성물은 일반적으로 제약상 허용되는 담체를 포함할 것이며, 이는 그 자체가 조성물을 받는 환자에게 유해한 항체의 생산을 유도하지 않는 임의의 물질일 수 있고, 과도한 독성 없이 투여될 수 있다. 제약상 허용되는 담체는 액체, 예컨대 물, 염수, 글리세롤 및 에탄올을 포함할 수 있다. 보조 물질, 예컨대 습윤제 또는 유화제, pH 완충 물질 등이 또한 이러한 비히클 중에 존재할 수 있다. 적합한 담체에 대한 자세한 논의는 문헌 [Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy. 20th edition, ISBN: 0683306472]에서 이용가능하다.
조성물은 바람직하게는 멸균된다. 이는 바람직하게는 발열원-무함유이다. 이는 바람직하게는, 예를 들어 pH 6 내지 pH 8, 일반적으로 약 pH 7에서 완충된다. 조성물이 수산화알루미늄 염을 포함하는 경우에, 히스티딘 완충제를 사용하는 것이 바람직하다 [WO03/009869]. 본 발명의 조성물은 인간에 대해 등장성일 수 있다.
본 발명의 조성물에 사용될 수 있는 아주반트는 불용성 금속 염, 수중유 에멀젼 (예를 들어 MF59 또는 AS03, 둘 다 스쿠알렌을 함유함), 사포닌, LPS의 비-독성 유도체 (예컨대 모노포스포릴 지질 A 또는 3-O-탈아실화 MPL), 면역자극 올리고뉴클레오티드, 해독된 박테리아 ADP-리보실화 독소, 마이크로입자, 리포솜, 이미다조퀴놀론 또는 그의 혼합물을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 면역자극제로서 작용하는 다른 물질은 문헌 [Vaccine Design... (1995) eds. Powell & Newman. ISBN: 030644867X. Plenum]의 챕터 7에 개시되어 있다.
수산화알루미늄 및/또는 인산알루미늄 아주반트의 사용이 특히 바람직하고, 폴리펩티드는 일반적으로 이들 염에 흡착된다. 이들 염은 옥시히드록시드 및 히드록시포스페이트를 포함한다 (예를 들어, 문헌 [Vaccine Design... (1995) eds. Powell & Newman. ISBN: 030644867X. Plenum]의 챕터 8 및 9 참조). 염은 임의의 적합한 형태 (예를 들어 겔, 결정질, 무정형 등)를 취할 수 있다.
일반
본 개시내용 및 청구범위에 사용된 단수 형태는 문맥이 달리 명확하게 지시하지 않는 한 복수 형태를 포함하며; 즉, 단수 형태는 달리 나타내지 않는 한 "1개 이상"을 의미한다.
"A 및/또는 B"와 같은 어구에 사용된 용어 "및/또는"은 "A 및 B", "A 또는 B", "A" 및 "B"를 포함하는 것으로 의도된다. 마찬가지로, "A, B 및/또는 C"와 같은 어구에 사용된 용어 "및/또는"은 각각의 하기 실시양태를 포괄하는 것으로 의도된다: A, B 및 C; A, B 또는 C; A 또는 C; A 또는 B; B 또는 C; A 및 C; A 및 B; B 및 C; A (단독); B (단독); 및 C (단독).
용어 "포함하는"은 "포함한" 뿐만 아니라 "이루어진"을 포괄하며, 예를 들어 X를 "포함하는" 조성물은 X로 독점적으로 이루어질 수 있거나 또는 추가의 어떤 것, 예를 들어 X + Y를 포함할 수 있다. "포함하는" (또는 "포함한다" 등)에 대한 언급은 "이루어진" (또는 "이루어진다" 등)에 대한 언급에 의해 임의로 대체될 수 있다. 용어 "본질적으로 이루어진"은 청구항의 범주를 명시된 물질 또는 단계 및 청구된 발명의 "기본적이고 신규한 특징(들)에 실질적으로 영향을 미치지 않는 것"으로 제한한다.
달리 명시되지 않는 한, 모든 명칭 "A%-B%," "A-B%," "A% 내지 B%," "A 내지 B%," "A%-B", "A% 내지 B"는 그의 상용적이고 통상적인 의미로 주어진다. 일부 실시양태에서, 이들 명칭은 동의어이다.
용어 "실질적으로" 또는 "실질적인"은 기재되거나 청구된 조건이 모든 중요한 측면에서 기재된 표준으로서 기능한다는 것을 의미한다. 따라서, "실질적으로 없는"은, 수치 값이 일부 불순물 또는 물질의 존재를 나타내더라도, 모든 중요한 측면에서 무 조건으로서 기능하는 조건을 포괄하는 것으로 의도된다. "실질적인"은 일반적으로 90% 초과, 바람직하게는 95% 초과, 가장 바람직하게는 99% 초과의 값을 의미한다. 특정한 값이 명세서 및 청구범위에 사용되는 경우에, 달리 언급되지 않는 한, 용어 "실질적으로"는 특정한 값에 대해 허용되는 오차 범위를 갖는 것을 의미한다.
수치 값 x와 관련하여 용어 "약"은 임의적이고, 예를 들어 x±10%를 의미한다.
본 개시내용이 "에피토프"에 관한 것인 경우에, 이 에피토프는 B-세포 에피토프 및/또는 T-세포 에피토프일 수 있지만, 통상적으로는 B-세포 에피토프일 것이다. 이러한 에피토프는 실험적으로 확인될 수 있거나 (예를 들어, PEPSCAN (예를 들어, 문헌 [Geysen et al. (1984) PNAS USA 81:3998-4002 및 Carter (1994) Methods Mol Biol 36:207-23] 참조) 또는 유사한 방법을 사용함) 또는 이들은 예측될 수 있다 (예를 들어, 제임슨-볼프(Jameson-Wolf) 항원 지수 (문헌 [Jameson, BA et al. 1988, CABIOS 4(1):181-186]), 매트릭스-기반 접근법 (문헌 [Raddrizzani & Hammer (2000) Brief Bioinform 1(2):179-89]), MAPITOPE (문헌 [Bublil et al. (2007) Proteins 68(1):294-304]), TEPITOPE (문헌 [De Lalla et al. (1999) J. Immunol. 163:1725-29 및 Kwok et al. (2001) Trends Immunol 22:583-88]), 신경망 (문헌 [Brusic et al. (1998) Bioinformatics 14(2):121-30]), 옵티머(OptiMer) & 에피머(EpiMer) (문헌 [Meister et al. (1995) Vaccine 13(6):581-91 및 Roberts et al. (1996) AIDS Res Hum Retroviruses 12(7):593-610]), ADEPT (문헌 [Maksyutov & Zagrebelnaya (1993) Comput Appl Biosci 9(3):291-7]), Tsites (문헌 [Feller & de la Cruz (1991) Nature 349(6311):720-1]), 친수성 (문헌 [Hopp (1993) Peptide Research 6:183-190]) 또는 항원 지수 (문헌 [Welling et al. (1985) FEBS Lett. 188:215-218])를 사용함). 에피토프는 항체 또는 T-세포 수용체의 항원 결합 부위에 의해 인식되고 이에 결합하는 항원의 부분이고, 이들은 또한 "항원 결정기"로도 지칭될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 질의 아미노산 서열과 대상 아미노산 서열 사이의 "백분율 서열 동일성"에 대한 언급은 쌍별 서열 정렬을 수행하기 위해 관련 기술분야에 공지된 적합한 알고리즘 또는 소프트웨어 프로그램을 사용하여 계산된 동일성 값을 지칭하는 것으로 이해된다.
질의 아미노산 서열은 본원의 1개 이상의 청구항에서 확인된 아미노산 서열에 의해 기재될 수 있다. 질의 서열은 대상 서열과 100% 동일할 수 있거나 또는 대상 서열과 비교하여 특정 정수 개수 이하의 아미노산 변경 (예를 들어, 점 돌연변이, 치환, 결실, 삽입 등)을 포함하여 % 동일성이 100% 미만일 수 있다. 예를 들어, 질의 서열은 대상 서열과 적어도 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 또는 99% 동일하다.
정렬을 수행하고 백분율 (%) 서열 동일성을 계산하는 데 사용되는 바람직한 정렬 도구는 국부 정렬 도구, 예컨대 베이직 로컬 얼라인먼트 서치 툴 (BLAST) 알고리즘이다. BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 국립 생물 정보 센터 (www.ncbi.nlm.nih.gov)를 통해 공개적으로 이용가능하다. 정렬은 갭 개방 페널티 12 및 갭 연장 페널티 2를 사용한 아핀 갭 검색과 BLOSUM 매트릭스 62를 사용하는 스미스-워터맨(Smith-Waterman) 상동성 검색 알고리즘에 의해 결정될 수 있다. 스미스-워터맨 상동성 검색 알고리즘은 문헌 [Smith & Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2: 482-489]에 개시되어 있다. 다른 바람직한 정렬 도구는 워터(Water) (EMBOSS) 및 마처(Marcher) (EMBOSS)이다. 대안적으로, 정렬을 수행하고 백분율 (%) 서열 동일성을 계산하는 데 사용되는 바람직한 정렬 도구는 최적 적합 정렬 도구, 예컨대 GENEPAST이며, 이는 또한 KERR 알고리즘으로도 공지되어 있다.
퍼센트 동일성을 계산하기 위해, 질의 및 대상 서열은 지정된 영역 (예를 들어, 적어도 약 40, 45, 50, 55, 60, 65개 또는 그 초과의 아미노산 길이의 영역이며, 대상 아미노산 서열의 전장까지일 수 있음)에 걸쳐 최대 상응성을 위해 비교 및 정렬될 수 있다. 상기 지정된 영역은 아미노산 서열에서 임의의 명시된 점 돌연변이를 포함하는 질의 서열의 영역을 포함하여야 한다. 대안적으로, 백분율 서열 동일성은 대상 서열의 "전장"에 걸쳐 계산될 수 있다. 질의 서열에 존재할 수 있는 임의의 N-말단 또는 C-말단 아미노산 스트레치, 예컨대 신호 펩티드 또는 리더 펩티드 또는 C-말단 또는 N-말단 태그는 정렬로부터 배제되어야 한다.
폴리펩티드 서열과 관련하여 용어 "단편"은 폴리펩티드가 전장 단백질의 분획이라는 것을 의미한다. 본원에 사용된 돌연변이체 폴리펩티드의 단편은 또한 돌연변이(들)를 포함한다. 단편은 전장 단백질과 공통적인 정성적 생물학적 활성을 보유할 수 있고, 예를 들어 "면역원성 단편"은 전장 서열로 생성되는 것과 동일하거나 유사한 면역 반응이 단편에 대해 생성되도록 하는 1개 이상의 에피토프, 예컨대 면역우성 에피토프를 함유하거나 코딩한다. 폴리펩티드 단편은 일반적으로 천연 단백질과 비교하여 아미노 (N) 말단 부분 및/또는 카르복시 (C) 말단 부분이 결실되지만, 여기서 단편의 나머지 아미노산 서열은 천연 단백질의 아미노산 서열과 동일하다. 폴리펩티드 단편은, 예를 들어 참조 폴리펩티드 서열의 약 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 24, 26, 28, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262개의 인접 아미노산 (그 사이의 모든 정수 개수 포함), 예를 들어 참조 폴리펩티드 서열의 50 내지 260, 50 내지 255, 50 내지 250, 50 내지 200, 50 내지 150개의 인접 아미노산을 함유할 수 있다. 용어 단편은 전장 fHbp 폴리펩티드 및 그의 성숙 지단백질을 명백하게 배제한다.
혈청군 다음에, 수막구균 분류는 혈청형, 혈청하위유형 및 이어서 면역형을 포함하고, 표준 명명법은 혈청군, 혈청형, 혈청하위유형 및 면역형을 열거하며, 각각이 콜론에 의해 분리되어 있다 (예를 들어 B:4:P1.15:L3,7,9). 혈청군 B 내에서, 일부 계통은 종종 질환을 유발하고 (과다침습성), 일부 계통은 다른 것보다 더 중증 형태의 질환을 유발하고 (과다병독성), 다른 것은 거의 질환을 유발하지 않는다. 7종의 과다병독성 계통, 즉 하위군 I, III 및 IV-1, ET-5 복합체, ET-37 복합체, A4 클러스터 및 계통 3이 인식된다. 이들은 다중유전자좌 효소 전기영동 (MLEE)에 의해 정의되었지만, 다중유전자좌 서열 유형결정 (MLST)이 또한 수막구균을 분류하는 데 사용되었다. 4종의 주요 과다병독성 클러스터는 ST32, ST44, ST8 및 ST11 복합체이다.
본원에서 "증진된 안정성" 또는 "보다 높은 안정성" 또는 "증가된 안정성"에 대한 언급은 본원에 개시된 돌연변이체 폴리펩티드가 동일한 실험 조건 하에 비-돌연변이체 (야생형) 폴리펩티드와 비교하여 더 높은 상대 열안정성 (kcal/mol)을 갖는다는 것을 의미한다. 안정성 증진은, 예를 들어 문헌 [Bruylants et al. (Differential Scanning Calorimetry in Life Sciences: Thermodynamics, Stability, Molecular Recognition and Application in Drug Design, 2005 Curr. Med. Chem. 12: 2011-2020) 및 Calorimetry Sciences Corporation's "Characterizing Protein stability by DSC" (Life Sciences Application Note, Doc. No. 20211021306 February 2006)]에 논의된 바와 같은 시차 주사 열량측정법 (DSC) 또는 시차 주사 형광측정법 (DSF)을 사용하여 평가될 수 있다. 안정성의 증가는 DSC 또는 DSF에 의해 평가 시 열 전이 중간점 (Tm)의 적어도 약 5℃ 증가로서 특징화될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Thomas et al., Effect of single-point mutations on the stability and immunogenicity of a recombinant ricin A chain subunit vaccine antigen, 2013 Hum. Vaccin. Immunother. 9(4): 744-752]을 참조한다.
"유효량"은 언급된 효과 또는 결과를 유발하기에 충분한 양을 의미한다. "유효량"은 언급된 목적과 관련하여 공지된 기술을 사용하여 실험적으로 및 상용 방식으로 결정될 수 있다.
"면역학적 유효량" 또는 "치료 유효량"은 단일 용량으로 또는 일련의 용량의 일부로서 개체에게 상기 양을 투여하는 것이 치료 또는 예방에 효과적이라는 것을 의미한다. 이 양은 치료될 개체의 건강 및 신체 상태, 연령, 치료될 개체의 분류학적 군 (예를 들어 비-인간 영장류, 영장류 등), 항체를 합성하는 개체의 면역계의 능력, 목적하는 보호의 정도, 백신의 제제, 치료하는 의사의 의학적 상황의 평가 및 다른 관련 인자에 따라 달라질 수 있다. 양은 상용 시험을 통해 결정될 수 있는 비교적 넓은 범위에 속할 것으로 예상된다.
용어 "치료"는 하기 중 어느 하나 이상을 의미한다: (i) 전통적인 백신에서와 같은 감염 또는 재감염의 예방, (ii) 증상의 중증도의 감소 또는 증상의 제거, (iii) 증상의 재발의 지연 및 (iv) 대상체에서 해당 병원체 또는 장애의 실질적인 또는 완전한 제거. 따라서, 치료는 예방적으로 (감염 전에) 또는 치료적으로 (감염 후에) 수행될 수 있다.
용어 "% w/w"는 나타낸 바와 같은 상이한 화합물에 대한 또는 조성물의 전체 함량에 대한 주어진 화합물의 중량 백분율을 나타낸다.
유사하게, 용어 "% v/v"는 나타낸 바와 같은 상이한 화합물에 대한 또는 조성물의 전체 함량에 대한 주어진 화합물의 부피 백분율을 나타낸다.
본원에 인용된 모든 간행물은 그 전문이 참조로 포함된다.
서열
본 발명의 수행 방식
본 발명은 이제 하기 비제한적 실시예를 참조하여 추가로 정의될 것이다.
실시예
접합된 혈청군 A 항원의 합성 및 특징화
일반적 절차 및 물질.
달리 언급되지 않는 한, 모든 화학물질 (아크로스(Acros), 바이오솔브(Biosolve), 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich) 및 TCI)을 제공받은 대로 사용하였고, 모든 반응을 주위 온도 (22℃)에서 아르곤 분위기 하에 실행하였다. TLC 분석을 위해 알루미늄 시트 (머크(Merck), TLC 실리카 겔 60 F254)를 사용하고, EtOH 중 H2SO4 (20%)의 용액으로 또는 10% 수성 H2SO4 중 (NH4)6Mo7O24·4H2O (25 g/L) 및 (NH4)4Ce(SO4)4·2H2O (10g/L)의 용액으로 또는 H2O 중 KMnO4 (2%) 및 K2CO3 (1%)의 용액으로 분무한 다음, 
140℃에서 가열하였다. 칼럼 크로마토그래피를 위해 40-63 μm 60Å 실리카 겔 (SD 스크리닝 디바이시스(SD Screening Devices))을 사용하였다. NMR 스펙트럼 (1H, 13C 및 31P)을 브루커(Bruker) AV-400liq 또는 브루커 AV-500 또는 브루커 AV-600으로 기록하였다. 고해상도 질량 스펙트럼을 양성 모드의 전기분무 이온 공급원 (공급원 전압 3.5 kV, 시스 기체 유동 10, 모세관 온도 250℃)이 장착된 질량 분광계 (써모 피니간(Thermo Finnigan) LTQ 오비트랩(Orbitrap)) 상에서 m/z 400 (질량 범위 m/z= 150-2000)으로 해상도 R= 60000 및 잠금 질량으로서 디옥틸프탈레이트 (m/z= 391.28428)를 사용하여 직접 주입에 의해 기록하였다.
약어
AcOH = 아세트산
ACN = 아세토니트릴
DCM = 디클로로메탄
DMTrCl = 4,4'-디메톡시트리틸 클로라이드
EtOAc = 에틸 아세테이트
THF = 테트라히드로푸란
TBAF = 테트라부틸암모늄 플루오라이드
실시예 1: 반응식 1에 따른, 본 발명의 화학식 (Ia)의 올리고머의 제조
아세트아미도-3,4-디-O-벤질-2-데옥시-6-O-텍실디메틸실릴-5a-카르바-α-D 만노피라노스 (13)
실릴 에테르 12는 문헌 [Q. Gao et al. Org. Biomol. Chem., 2012, 10, 6673]에 기재된 절차에 따라 제조될 수 있다.
실릴 에테르 12 (1.6 g, 2.7 mmol)를 건조 THF (20 mL) 중에 용해시켰다. 혼합물을 0℃로 냉각시켰다. THF 중 TBAF의 0.1 M 용액 (4.1 mL, 4.1 mmol)을 천천히 첨가하였다. 반응물을 실온으로 가열하고, 3시간 동안 교반하였다. 반응물에 AcOH (0.31 mL)를 첨가하였다. 용액을 DCM으로 3회 추출하고, 염수로 1회 세척하였다. 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 진공 하에 농축시켰다. 조 물질을 플래쉬 크로마토그래피 (EtOAc/헥산)에 의해 정제하여 생성물 13 (1.1 g, 2.52 mmol)을 92% 수율로 수득하였다. 분광학적 데이터는 보고된 데이터와 일치하였다.
2-아세트아미도-3,4-디-O-벤질-2-데옥시-5a-카르바-α-D 만노피라노스 (14)
알콜 13 (1.12 g, 2.5 mmol)을 MeOH (32 mL) 중에 용해시켰다. 혼합물에 NaOMe (0.03 g, 0.5 mmol)를 첨가하였다. 반응물을 실온에서 3시간 동안 교반하였다. 앰버라이트 H+ 수지를 중성 pH에 도달할 때까지 첨가하였다. 현탁액을 여과하고, 진공 하에 농축시켰다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ= 1.70 - 1.85 (m, 2H, H-5a), 1.90 (s, 3H, AcNH), 2.19 - 2.23 (m, 1H, H-5), 3.60 - 3.79 (m, 3H, H-6, H-1), 3.83 - 3.90 (m, 1H, H-2), 3.91 - 3.99 (m, 1H, H-4), 4.14 - 4.23 (m, 1H, H-3), 4.33 - 4.41 (m, 1H, CHH Bn), 4.54 - 4.72 (m, 3H, CH2 Bn, CHH Bn), 5.79 (m, 1H, NHAc), 7.22 - 7.42 (m, 10H, Harom). 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ= 23.5 (CH3 AcNH), 30.6 (CH2 C-5a), 39.5 (CH C-5), 53.5 (CH C-3), 64.1 (CH2 C-6), 67.9 (CH C-4), 72.4 (CH2 Bn), 73.8 (CH2 Bn), 75.5 (CH C-1), 79.0 (CH C-4), 127.3 - 128.9 (CHarom), 171.8 (C=O AcNH). HRMS: [C23H29NO5 + H]+ 요구치 400.21251, 실측치 400.21179.
2-아세트아미도-3,4-디-O-벤질-2-데옥시-6-O-(비스(4-메톡시페닐)(페닐))-5-카르바-α-D-만노피라노스 (10)
디올 14 (0.9 g, 2.25 mmol)를 건조 DCM (30 mL) 중에 용해시켰다. 혼합물에 Et3N (1.9 mL, 13.5 mmol)을 첨가하였다. DMTrCl (1.16 g, 3.38 mmol)을 첨가하였다. 반응물을 2시간 동안 교반하였다. 반응물에 H2O를 첨가하고, 염수로 1회 세척하였다. 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 진공 하에 농축시켰다. 조 물질을 플래쉬 크로마토그래피 (EtOAc/헥산)에 의해 정제하여 생성물 10 (1.6 g, 2.04 mmol)을 91% 수율로 수득하였다. 1H NMR (400 MHz, CD3CN) δ= 1.70 - 1.85 (m, 1H, 5a'-H), 1.91 (s, 3H, AcNH), 2.00 - 2.21 (m, 2H, 5a-H, 5-H), 3.01 - 3.19 (m, 1H, 6'-H), 3.27 - 3.37 (m, 1H, 6-H), 3.51 - 3.67 (m, 1H, H-4), 3.73 (s, 7H, H-3, 2x OMe), 4.06 - 4.20 (m, 1H, H-1), 4.22 - 4.32 (m, 1H, CHH Bn), 4.40 - 4.62 (m, 3H, CH2 Bn, H-2), 4.65 - 4.73 (m, 1H, CHH Bn), 6.35 - 6.44 (m, 1H, NHAc), 6.78 - 7.47 (m, 23H, Harom). 13C NMR (100 MHz, CD3CN) δ= 23.2 (CH3 AcNH), 31.6 (CH2 C-5a), 38.6 (CH C-5), 53.3 (CH C-2), 55.8 (2x CH3 OMe), 64.6 (CH2 C-6), 67.6 (CH C-1), 72.1 (CH2 Bn), 73.8 (CH2 Bn), 77.2 (CH C-4), 79.8 (CH C-3), 86.5 (Cq DMTr), 113.9 (CHarom), 127.3 - 130.7 (CHarom), 137.2 - 159.4 (5x Cq DMTr), 171.1 (C=O AcNH). HRMS: [C44H47NO7 + Na]+ 요구치 724.32501, 실측치 724.32483.
1-O-((N,N-디이소프로필아미노)-O-2-시아노에틸-포스포르아미다이트))-2-아세트아미도-3,4-디-O-벤질-2-데옥시-6-O-(비스(4-메톡시페닐)(페닐)-5a-카르바-α-D-만노피라노스 (9)
알콜 10 (1.5 g, 2.14 mmol)을 ACN과 함께 3회 공증발시키고, 건조 DCM (22 mL) 중에 용해시켰다. 혼합물에 새로 활성화된 MS3Å 및 DIPEA (0.6 mL, 3.2 mmol)를 첨가하였다. 혼합물에 2-시아노에틸 N,N-디이소프로필-클로로포스포르아미다이트 (0.6 mL, 2.6 mmol)를 첨가하였다. 반응물을 2시간 동안 교반하였다. 용액에 H2O를 첨가하고, 염수/NaHCO3의 1:1 용액으로 1회 세척하였다. 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 진공 하에 농축시켰다. 조 물질을 플래쉬 크로마토그래피 (DCM/아세톤/Et3N)에 의해 정제하여 생성물 9 (1.81 g, 2.0 mmol)를 94% 수율 (부분입체이성질체의 혼합물)로 수득하였다. 1H NMR (400 MHz, CD3CN) δ= 1.04 - 1.24 (m, 12H, 4x 이소프로필아미노), 1.70 - 1.85 (m, 1H, 5a'-H), 1.92 (s, 3H, AcNH), 2.00 - 2.21 (m, 2H, 5a-H, 5-H), 2.55 - 2.75 (m, 2H, CH2 시아노에틸), 2.98 - 3.10 (m, 1H, 6'-H), 3.27 - 3.37 (m, 1H, 6-H), 3.47 - 3.70 (m, 3H, 2x CH 이소프로필아미노, H-4), 3.70 - 3.88 (m, 9H, H-3, CH2 시아노에틸, 2x OMe), 4.06 - 4.20 (m, 1H, H-1), 4.22 - 4.32 (m, 1H, CHH Bn), 4.40 - 4.62 (m, 3H, CH2 Bn, H-2), 4.65 - 4.73 (m, 1H, CHH Bn), 6.35 - 6.44 (m, 1H, NHAc), 6.78 - 7.47 (m, 23H, Harom). 13C NMR (100 MHz, CD3CN) δ= 20.7 (CH2 시아노에틸), 22.9 (CH3 AcNH), 24.5 - 24.7 (2x CH3 이소프로필아미노), 30.6 (CH2 C-5a), 38.5 (CH C-5), 43.7 (2x CH 이소프로필아미노), 51.7 (CH C-2), 55.5 (2x CH3 OMe), 59.1 (CH2 시아노에틸), 64.2 (CH2 C-6), 70.5 (CH C-1), 71.5 (CH2 Bn), 74.3 (CH2 Bn), 77.8 (CH C-4), 79.5 (CH C-3), 86.2 (Cq DMTr), 113.6 (CHarom), 127.3 - 130.7 (CHarom), 136.8 - 159.2 (5x Cq DMTr), 170 (C=O AcNH).31P NMR (162 MHz, CD3CN) δ= 146.9, 147.26.
전형적 규모 (0.03 - 0.3 mmol)로의 포스포르아미다이트 커플링, 산화 및 탈트리틸화를 위한 일반적 절차
출발 알콜을 ACN과 함께 3회 공증발시키고, 새로 활성화된 MS3Å 및 DCI (ACN 중 0.25 M 용액, 1.5 당량)을 첨가하였다. 용액을 15분 동안 교반하였다. 혼합물에 포스포르아미다이트 시약 (ACN 중 0.1 - 0.16 M 용액, 1.3 - 3 당량)을 첨가하고, 출발 물질의 총 전환까지 (
2시간) 교반하였다. 후속적으로 CSO (ACN 중 0.5M 용액, 2당량)를 반응 혼합물에 첨가하고, 15분 동안 교반하였다. 혼합물을 EtOAc로 희석하고, 염수/NaHCO3의 1:1 용액으로 세척하였다. 수층을 EtOAc로 2회 추출하였다. 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 진공 하에 농축시켰다. 조 물질을 ACN과 함께 3회 공증발시키고, DCM (5 - 10 mL) 중에 용해시켰다. 용액에 TCA (DCM 중 0.18M 용액)를 첨가하고, 1시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물에 H2O를 첨가하고, 15분 동안 교반하였다. 반응물을 염수/NaHCO3의 1:1 용액으로 세척하였다. 수층을 DCM으로 3회 추출하였다. 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 진공 하에 농축시켰다. 조 물질을 플래쉬 크로마토그래피 (DCM/아세톤) 또는 크기 배제 크로마토그래피 (세파덱스 LH-20, MeOH/DCM 1:1)에 의해 정제하였다.
1-O-((2-아세트아미도-3,4-디-O-벤질-2-데옥시-5a-카르바-α-D-만노피라노실-1-O-포스포릴)2-시아노에틸)-6-헥실-벤질-카르바메이트 (15)
상기 기재된 바와 같은 일반적 절차를 사용하여, 알콜 10 (0.21 g, 0.3 mmol)을 포스포르아미다이트 11 (2.5 mL, ACN 중 0.16M, 0.45 mmol)에 커플링시키고, 산화시키고, 탈트리틸화시켰다. 조 물질을 플래쉬 크로마토그래피 (DCM/아세톤)에 의해 정제하여 생성물 15 (0.216 g, 0.282 mmol)를 94% 수율로 수득하였다. 1H NMR (400 MHz, CD3CN) δ= 1.24 - 1.40 (m, 4H, 2x CH2 헥실스페이서), 1.40 - 1.51 (m, 2H, CH2 헥실스페이서), 1.58 - 1.70 (m, 2H, CH2 헥실스페이서), 1.80 - 1.92 (m, 4H, 5a'-H, AcNH), 1.96 - 2.02 (m, 2H, 5a-H, 5-H), 2.72 - 2.82 (m, 2H, CH2 시아노에틸), 2.96 (bs, 1H, OH), 3.02 - 3.12 (m, 2H, CH2 헥실스페이서), 3.56 - 3.74 (m, 3H, H-6, H-4), 3.76 - 3.84 (m, 1H, H-3), 3.95 - 4.07 (m, 2H, CH2 헥실스페이서), 4.08 - 4.20 (m, 2H, CH2 시아노에틸), 4.44 - 4.63 (m, 5H, H-1, H-2, CH2 Bn, CHH Bn), 4.72 - 4.80 (m, 1H, CHH Bn), 5.03 (s, 2H, CH2 Bn 스페이서), 5.70 (bs, 1H, NH), 6.49 - 6.60 (m, 1H, NHAc), 7.23 - 7.44 (m, 15H, Harom). 13C NMR (100 MHz, CD3CN) δ= 19.9 (CH2 시아노에틸), 22.8 (CH3 AcNH), 25.4 (CH2 헥실스페이서), 26.4 (CH2 헥실스페이서), 30.0 (CH2 C-5a), 30.4 (CH2 헥실스페이서), 30.5 (CH2 헥실스페이서), 40.0 (CH C-5), 41.0 (CH2 헥실스페이서), 51.1 (CH C-2), 62.9 (CH2 C-6), 63.0 (CH2 시아노에틸), 66.3 (CH2 Bn 스페이서), 68.8 (CH2 헥실스페이서), 72.2 (CH2 Bn), 74.0 (CH2 Bn), 75.1 (CH C-1), 76.7 (CH C-4), 79.3 (CH C-3), 128.1 - 129.1 (CHarom), 138.9 - 139.7 (3x Cq Bn), 170.8 (C=O AcNH). 31P NMR (162 MHz, CD3CN) δ= -2.40, -2.36. HRMS: [C40H52N3O10P + H]+ 요구치 766.34707, 실측치 766.34707.
1-O-디-((2-아세트아미도-3,4-디-O-벤질-2-데옥시-5a-카르바-α-D-만노피라노실-1-O-포스포릴)2-시아노에틸)-6-헥실-벤질-카르바메이트 (16)
상기 기재된 바와 같은 일반적 절차를 사용하여, 알콜 15 (0.186 g, 0.24 mmol)를 포스포르아미다이트 9 (2.3 mL, ACN 중 0.16 M, 0.37 mmol)에 커플링시키고, 산화시키고, 탈트리틸화시켰다. 조 물질을 크기 배제 크로마토그래피 (세파덱스 LH-20, DCM/MeOH 1:1)에 의해 정제하여 생성물 16 (0.255 g, 0.199 mmol)을 82% 수율로 수득하였다. 1H NMR (400 MHz, CD3CN) δ= 1.25 - 1.40 (m, 4H, 2x CH2 헥실스페이서), 1.40 - 1.51 (m, 2H, CH2 헥실스페이서), 1.58 - 1.71 (m, 2H, CH2 헥실스페이서), 1.80 - 1.92 (m, 8H, 2x 5a'-H, 2x AcNH), 1.96 - 2.02 (m, 4H, 2x 5a-H, 2x 5-H), 2.70 - 2.81 (m, 4H, 2x CH2 시아노에틸), 2.96 (bs, 1H, OH), 3.01 - 3.12 (m, 2H, CH2 헥실스페이서), 3.56 - 3.87 (m, 6H, 2x H-6, 2x H-4), 3.94 - 4.28 (m, 8H, 2x H-3, CH2 헥실스페이서, 2x CH2 시아노에틸), 4.29 - 4.85 (m, 12H, 2x H-1, 2x H-2, 4x CH2 Bn), 5.03 (s, 2H, CH2 Bn 스페이서), 5.75 (bs, 1H, NH), 6.52 - 6.62 (m, 1H, NHAc), 6.85 - 6.99 (m, 1H, NHAc), 7.21 - 7.41 (m, 25H, Harom). 13C NMR (100 MHz, CD3CN) δ= 19.9 - 20.0 (2x CH2 시아노에틸), 22.9 - 23.0 (2x CH3 AcNH), 25.5 (CH2 헥실스페이서), 26.5 (CH2 헥실스페이서), 29.1 - 29.2 (2x CH2 C-5a), 30.1 (CH2 헥실스페이서), 30.5 (CH2 헥실스페이서), 38.1 - 40.0 (2x CH C-5), 41.1 (CH2 헥실스페이서), 50.9 - 51.4 (2x CH C-2), 62.5 - 62.6 (2x CH2 C-6), 63.0 - 63.2 (2x CH2 시아노에틸), 66.3 (CH2 Bn 스페이서), 68.9 (CH2 헥실스페이서), 72.1 - 72.3 (4x CH2 Bn), 75.0 - 75.4 (2x CH C-1), 75.5 - 76.9 (2x CH C-4), 79.2 - 79.5 (2x CH C-3), 128.2 - 129.1 (CHarom), 138.9 - 139.6 (5x Cq Bn), 170.8 (2x C=O AcNH). 31P NMR (162 MHz, CD3CN) δ= -2.60, -2.58, -2.34, -2.32, -2.22, -2.17. HRMS: [C66H83N5O17P2 + H]+ 요구치 1280.53320, 실측치 1280.53320.
1-O-트리-((2-아세트아미도-3,4-디-O-벤질-2-데옥시-5a-카르바-α-D-만노피라노실-1-O-포스포릴)2-시아노에틸)-6-헥실-벤질-카르바메이트 (17)
상기 기재된 바와 같은 일반적 절차를 사용하여, 알콜 16 (0.215 g, 0.167 mmol)을 포스포르아미다이트 9 (1.6 mL, ACN 중 0.16 M, 0.25 mmol)에 커플링시키고, 산화시키고, 탈트리틸화시켰다. 조 물질을 크기 배제 크로마토그래피 (세파덱스 LH-20, DCM/MeOH 1:1)에 의해 정제하여 생성물 17 (0.285 g, 0.158 mmol)을 95% 수율로 수득하였다. 1H NMR (400 MHz, CD3CN) δ= 1.25 - 1.40 (m, 4H, 2x CH2 헥실스페이서), 1.40 - 1.51 (m, 2H, CH2 헥실스페이서), 1.58 - 1.71 (m, 2H, CH2 헥실스페이서), 1.80 - 1.92 (m, 12H, 3x 5a'-H, 3x AcNH), 1.96 - 2.30 (m, 6H, 3x 5a-H, 3x 5-H), 2.68 - 2.83 (m, 6H, 3x CH2 시아노에틸), 2.93 (bs, 1H, OH), 3.00 - 3.11 (m, 2H, CH2 헥실스페이서), 3.59 - 3.89 (m, 9H, 3x H-6, 3x H-4), 3.96 - 4.22 (m, 11H, 3x H-3, CH2 헥실스페이서, 3x CH2 시아노에틸), 4.31 - 4.86 (m, 18H, 3x H-1, 3x H-2, 6x CH2 Bn), 5.03 (s, 2H, CH2 Bn 스페이서), 5.78 (bs, 1H, NH), 6.55 - 6.65 (m, 1H, NHAc), 6.9 - 7.15 (m, 2H, 2x NHAc), 7.19 - 7.40 (m, 35H, Harom). 13C NMR (100 MHz, CD3CN) δ= 20.0 - 20.1 (3x CH2 시아노에틸), 22.9 - 23.0 (3x CH3 AcNH), 25.5 (CH2 헥실스페이서), 26.5 (CH2 헥실스페이서), 28.9 - 29.2 (3x CH2 C-5a), 30.1 (CH2 헥실스페이서), 30.5 (CH2 헥실스페이서), 38.0 - 40.0 (3x CH C-5), 41.1 (CH2 헥실스페이서), 50.8 - 51.4 (3x CH C-2), 62.5 - 63.0 (3x CH2 C-6), 63.0 - 63.3 (3x CH2 시아노에틸), 66.3 (CH2 Bn 스페이서), 68.4 (CH2 헥실스페이서), 72.1 - 74.1 (6x CH2 Bn), 75.2 - 75.5 (3x CH C-1), 75.5 - 76.1 (3x CH C-4), 79.3 - 79.5 (3x CH C-3), 128.2 - 129.1 (CHarom), 138.9 - 139.7 (7x Cq Bn), 170.9 - 171.2 (3x C=O AcNH). 31P NMR (162 MHz, CD3CN) δ= -2.82, -2.77, -2.62, -2.58, -2.36, -2.33, -2.24, -2.20, -2.16. HRMS: [C92H114N7O24P3 + H]+ 요구치 1795.72333, 실측치 1795.22333.
1-O-테트라-((2-아세트아미도-3,4-디-O-벤질-2-데옥시-5a-카르바-α-D-만노피라노실-1-O-포스포릴)2-시아노에틸)-6-헥실-벤질-카르바메이트 (18)
상기 기재된 바와 같은 일반적 절차를 사용하여, 알콜 17 (0.267 g, 0.148 mmol)을 포스포르아미다이트 9 (1.4 mL, ACN 중 0.16 M, 0.22 mmol)에 커플링시키고, 산화시키고, 탈트리틸화시켰다. 조 물질을 크기 배제 크로마토그래피 (세파덱스 LH-20, DCM/MeOH 1:1)에 의해 정제하여 생성물 18 (0.299 g, 0.129 mmol)을 87% 수율로 수득하였다. 1H NMR (400 MHz, (CD3)2CO) δ= 1.31 - 1.47 (m, 4H, 2x CH2 헥실스페이서), 1.47 - 1.57 (m, 2H, CH2 헥실스페이서), 1.62 - 1.75 (m, 2H, CH2 헥실스페이서), 1.85 - 2.02 (m, 16H, 4x 5a'-H, 4x AcNH), 2.07 - 2.17 (m, 8H, 4x 5a-H, 4x 5-H), 2.82 - 3.00 (m, 8H, 4x CH2 시아노에틸), 3.08 - 3.18 (m, 2H, CH2 헥실스페이서), 3.66 - 4.01 (m, 12H, 4x H-6, 4x H-4), 4.04 - 4.36 (m, 14H, 4x H-3, CH2 헥실스페이서, 4x CH2 시아노에틸), 4.40 - 4.94 (m, 24H, 4x H-1, 4x H-2, 8x CH2 Bn), 5.05 (s, 2H, CH2 Bn 스페이서), 6.39 (bs, 1H, NH), 7.17 - 7.42 (m, 45H, Harom), 7.42 - 7.80 (m, 4H, NHAc). 13C NMR (100 MHz, (CD3)2CO) δ= 20.0 - 20.1 (4x CH2 시아노에틸), 23.1 - 23.2 (4x CH3 AcNH), 25.8 (CH2 헥실스페이서), 26.8 (CH2 헥실스페이서), 29.2 - 29.8 (4x CH2 C-5a), 30.8 (CH2 헥실스페이서), 30.8 (CH2 헥실스페이서), 38.3 - 40.3 (4x CH C-5), 41.4 (CH2 헥실스페이서), 51.2 - 51.5 (4x CH C-2), 62.6 - 63.4 (4x CH2 C-6), 63.4 - 63.6 (4x CH2 시아노에틸), 66.2 (CH2 Bn 스페이서), 68.8 (CH2 헥실스페이서), 72.0 - 75.0 (8x CH2 Bn), 75.6 - 75.8 (4x CH C-1), 76.5 - 77.2 (4x CH C-4), 79.7 - 79.8 (4x CH C-3), 128.1 - 129.1 (CHarom), 139.3 - 140.1 (9x Cq Bn), 170.7 - 171.2 (4x C=O AcNH). 31P NMR (162 MHz, CD3)2CO) δ= -2.84, -2.77, -2.68, -2.47, -2.42, -2.37, -2.30, -1.96, -1.91, -1.89. HRMS: [C118H145N9O31P4 + 2H] ++ 요구치 1155.45892, 실측치 1155.45892.
1-O-펜타-((2-아세트아미도-3,4-디-O-벤질-2-데옥시-5a-카르바-α-D-만노피라노실-1-O-포스포릴)2-시아노에틸)-6-헥실-벤질-카르바메이트 (19)
상기 기재된 바와 같은 일반적 절차를 사용하여, 알콜 18 (0.277 g, 0.120 mmol)을 포스포르아미다이트 9 (1.1 mL, ACN 중 0.16 M, 0.18 mmol)에 커플링시키고, 산화시키고, 탈트리틸화시켰다. 조 물질을 크기 배제 크로마토그래피 (세파덱스 LH-20, DCM/MeOH 1:1)에 의해 정제하여 생성물 19 (0.31 g, 0.110 mmol)를 92% 수율로 수득하였다. 1H NMR (400 MHz, (CD3)2CO) δ= 1.31 - 1.46 (m, 4H, 2x CH2 헥실스페이서), 1.46 - 1.58 (m, 2H, CH2 헥실스페이서), 1.62 - 1.75 (m, 2H, CH2 헥실스페이서), 1.84 - 2.02 (m, 20H, 5x 5a'-H, 5x AcNH), 2.07 - 2.19 (m, 10H, 5x 5a-H, 5x 5-H), 2.82 - 2.97 (m, 10H, 5x CH2 시아노에틸), 3.08 - 3.18 (m, 2H, CH2 헥실스페이서), 3.67 - 4.02 (m, 15H, 5x H-6, 5x H-4), 4.04 - 4.36 (m, 17H, 5x H-3, CH2 헥실스페이서, 5x CH2 시아노에틸), 4.38 - 4.95 (m, 30H, 5x H-1, 5x H-2, 10x CH2 Bn), 5.05 (s, 2H, CH2 Bn 스페이서), 6.43 (bs, 1H, NH), 7.16 - 7.41 (m, 55H, Harom), 7.42 - 7.86 (m, 5H, NHAc). 13C NMR (100 MHz, (CD3)2CO) δ= 19.8 - 20.0 (5x CH2 시아노에틸), 23.0 - 23.1 (5x CH3 AcNH), 25.7 (CH2 헥실스페이서), 26.7 (CH2 헥실스페이서), 29.2 - 30.0 (5x CH2 C-5a), 30.7 (CH2 헥실스페이서), 30.7 (CH2 헥실스페이서), 38.2 - 40.2 (5x CH C-5), 41.2 (CH2 헥실스페이서), 51.0 - 51.4 (5x CH C-2), 62.5 - 63.2 (5x CH2 C-6), 63.3 - 63.5 (5x CH2 시아노에틸), 66.1 (CH2 Bn 스페이서), 68.7 (CH2 헥실스페이서), 72.0 - 75.0 (10x CH2 Bn), 75.6 - 75.8 (5x CH C-1), 76.5 - 77.2 (5x CH C-4), 79.7 - 79.8 (5x CH C-3), 128.0 - 129.0 (CHarom), 139.2 - 140.0 (11x Cq Bn), 170.7 - 171.2 (5x C=O AcNH). 31P NMR (162 MHz, CD3)2CO) δ= -2.84, -2.77, -2.68, -2.47, -2.42, -2.37, -2.30, -1.96, -1.88, -1.89, -1.86, -1.84, -1.79. HRMS: [C144H176N11O38P5 + 2H] ++ 요구치 1412.55219, 실측치 1412.55219.
1-O-헥사-((2-아세트아미도-3,4-디-O-벤질-2-데옥시-5a-카르바-α-D-만노피라노실-1-O-포스포릴)2-시아노에틸)-6-헥실-벤질-카르바메이트 (20)
상기 기재된 바와 같은 일반적 절차를 사용하여, 알콜 19 (0.280 g, 0.099 mmol)를 포스포르아미다이트 9 (1.24 mL, ACN 중 0.16 M, 0.20 mmol)에 커플링시키고, 산화시키고, 탈트리틸화시켰다. 조 물질을 크기 배제 크로마토그래피 (세파덱스 LH-20, DCM/MeOH 1:1)에 의해 정제하여 생성물 20 (0.29 g, 0.087 mmol)을 88% 수율로 수득하였다. 1H NMR (500 MHz, (CD3)2CO) δ= 1.31 - 1.46 (m, 4H, 2x CH2 헥실스페이서), 1.46 - 1.57 (m, 2H, CH2 헥실스페이서), 1.63 - 1.74 (m, 2H, CH2 헥실스페이서), 1.84 - 2.02 (m, 24H, 6x 5a'-H, 6x AcNH), 2.07 - 2.30 (m, 12H, 6x 5a-H, 6x 5-H), 2.82 - 2.97 (m, 12H, 6x CH2 시아노에틸), 3.09 - 3.18 (m, 2H, CH2 헥실스페이서), 3.67 - 4.04 (m, 18H, 6x H-6, 6x H-4), 4.04 - 4.38 (m, 20H, 6x H-3, CH2 헥실스페이서, 6x CH2 시아노에틸), 4.38 - 5.00 (m, 36H, 6x H-1, 6x H-2, 12x CH2 Bn), 5.05 (s, 2H, CH2 Bn 스페이서), 6.42 (bs, 1H, NH), 7.16 - 7.41 (m, 65H, Harom), 7.42 - 7.89 (m, 6H, NHAc). 13C NMR (100 MHz, (CD3)2CO) δ= 19.9 - 20.0 (6x CH2 시아노에틸), 23.0 - 23.1 (6x CH3 AcNH), 25.7 (CH2 헥실스페이서), 26.8 (CH2 헥실스페이서), 29.2 - 30.2 (6x CH2 C-5a), 30.4 (CH2 헥실스페이서), 30.7 (CH2 헥실스페이서), 38.2 - 40.2 (6x CH C-5), 41.3 (CH2 헥실스페이서), 51.0 - 51.4 (6x CH C-2), 62.5 - 63.4 (6x CH2 C-6), 63.4 - 63.5 (6x CH2 시아노에틸), 66.2 (CH2 Bn 스페이서), 68.7 (CH2 헥실스페이서), 72.2 - 75.6 (12x CH2 Bn), 75.6 - 75.8 (6x CH C-1), 76.5 - 77.2 (6x CH C-4), 79.7 - 79.8 (6x CH C-3), 128.1 - 129.1 (CHarom), 139.2 - 140.0 (13x Cq Bn), 170.7 - 171.2 (6x C=O AcNH). 31P NMR (162 MHz, CD3)2CO) δ= -2.84, -2.77, -2.68, -2.45, -2.42, -2.37, -2.31, -1.94, -1.81, -1.78. HRMS: [C170H207N13O45P6 + NH4]+ 요구치 3356.312, 실측치 3357.010.
n = 6인 올리고머를 제조하기 위해, 상기 단계 후에 하기 기재된 일반적 탈보호 절차를 수행할 수 있다.
1-O-엡타-((2-아세트아미도-3,4-디-O-벤질-2-데옥시-5a-카르바-α-D-만노피라노실-1-O-포스포릴)2-시아노에틸)-6-헥실-벤질-카르바메이트 (21)
상기 기재된 바와 같은 일반적 절차를 사용하여, 알콜 20 (0.140 g, 0.042 mmol)을 포스포르아미다이트 9 (0.8 mL, ACN 중 0.1 M, 0.84 mmol)에 커플링시키고, 산화시키고, 탈트리틸화시켰다. 조 물질을 크기 배제 크로마토그래피 (세파덱스 LH-20, DCM/MeOH 1:1)에 의해 정제하여 생성물 21 (0.139 g, 0.036 mmol)을 86% 수율로 수득하였다. 1H NMR (500 MHz, (CD3)2CO) δ= 1.31 - 1.46 (m, 4H, 2x CH2 헥실스페이서), 1.46 - 1.57 (m, 2H, CH2 헥실스페이서), 1.63 - 1.74 (m, 2H, CH2 헥실스페이서), 1.84 - 2.02 (m, 28H, 7x 5a'-H, 7x AcNH), 2.07 - 2.30 (m, 14H, 7x 5a-H, 7x 5-H), 2.82 - 2.97 (m, 14H, 7x CH2 시아노에틸), 3.09 - 3.18 (m, 2H, CH2 헥실스페이서), 3.67 - 4.04 (m, 21H, 7x H-6, 7x H-4), 4.04 - 4.38 (m, 23H, 7x H-3, CH2 헥실스페이서, 7x CH2 시아노에틸), 4.38 - 5.00 (m, 42H, 7x H-1, 7x H-2, 14x CH2 Bn), 5.05 (s, 2H, CH2 Bn 스페이서), 6.42 (bs, 1H, NH), 7.16 - 7.41 (m, 75H, Harom), 7.42 - 7.89 (m, 7H, NHAc). 13C NMR (125 MHz, (CD3)2CO) δ= 19.9 - 20.0 (7x CH2 시아노에틸), 23.0 - 23.1 (7x CH3 AcNH), 25.7 (CH2 헥실스페이서), 26.8 (CH2 헥실스페이서), 29.2 - 30.2 (7x CH2 C-5a), 30.4 (CH2 헥실스페이서), 30.7 (CH2 헥실스페이서), 38.2 - 40.2 (7x CH C-5), 41.3 (CH2 헥실스페이서), 51.0 - 51.4 (7x CH C-2), 62.5 - 63.4 (7x CH2 C-6), 63.4 - 63.5 (7x CH2 시아노에틸), 66.2 (CH2 Bn 스페이서), 68.7 (CH2 헥실스페이서), 72.2 - 75.6 (14x CH2 Bn), 75.6 - 75.8 (7x CH C-1), 76.5 - 77.2 (7x CH C-4), 79.7 - 79.8 (7x CH C-3), 128.1 - 129.1 (CHarom), 139.2 - 140.0 (15x Cq Bn), 170.7 - 171.2 (7x C=O AcNH). 31P NMR (202 MHz, CD3)2CO) δ= -2.84, -2.77, -2.68, -2.45, -2.42, -2.37, -2.31, -1.94, -1.81, -1.78. HRMS: [C196H238N15O52P7 + 2H] ++ 요구치 1926,73908, 실측치 1926,73908.
1-O-옥타-((2-아세트아미도-3,4-디-O-벤질-2-데옥시-5a-카르바-α-D-만노피라노실-1-O-포스포릴)2-시아노에틸)-6-헥실-벤질-카르바메이트 (22) n = 8
상기 기재된 바와 같은 일반적 절차를 사용하여, 알콜 22 (0.105 g, 0.027 mmol)를 포스포르아미다이트 9 (0.7 mL, ACN 중 0.1 M, 0.68 mmol)에 커플링시키고, 산화시키고, 탈트리틸화시켰다. 조 물질을 크기 배제 크로마토그래피 (세파덱스 LH-20, DCM/MeOH 1:1)에 의해 정제하여 생성물 22 (0.103 g, 0.023 mmol)를 87% 수율로 수득하였다. 1H NMR (500 MHz, (CD3)2CO) δ= 1.31 - 1.46 (m, 4H, 2x CH2 헥실스페이서), 1.46 - 1.57 (m, 2H, CH2 헥실스페이서), 1.63 - 1.74 (m, 2H, CH2 헥실스페이서), 1.84 - 2.02 (m, 32H, 8x 5a'-H, 8x AcNH), 2.07 - 2.30 (m, 16H, 8x 5a-H, 8x 5-H), 2.82 - 2.97 (m, 16H, 8x CH2 시아노에틸), 3.09 - 3.18 (m, 2H, CH2 헥실스페이서), 3.67 - 4.04 (m, 24H, 8x H-6, 8x H-4), 4.04 - 4.38 (m, 26H, 8x H-3, CH2 헥실스페이서, 8x CH2 시아노에틸), 4.38 - 5.00 (m, 48H, 8x H-1, 8x H-2, 16x CH2 Bn), 5.05 (s, 2H, CH2 Bn 스페이서), 6.42 (bs, 1H, NH), 7.16 - 7.41 (m, 85H, Harom), 7.42 - 7.89 (m, 8H, NHAc). 13C NMR (125 MHz, (CD3)2CO) δ= 19.9 - 20.0 (8x CH2 시아노에틸), 23.0 - 23.1 (8x CH3 AcNH), 25.7 (CH2 헥실스페이서), 26.8 (CH2 헥실스페이서), 29.2 - 30.2 (8x CH2 C-5a), 30.4 (CH2 헥실스페이서), 30.7 (CH2 헥실스페이서), 38.2 - 40.2 (8x CH C-5), 41.3 (CH2 헥실스페이서), 51.0 - 51.4 (8x CH C-2), 62.5 - 63.4 (8x CH2 C-6), 63.4 - 63.5 (8x CH2 시아노에틸), 66.2 (CH2 Bn 스페이서), 68.7 (CH2 헥실스페이서), 72.2 - 75.6 (16x CH2 Bn), 75.6 - 75.8 (8x CH C-1), 76.5 - 77.2 (8x CH C-4), 79.7 - 79.8 (8x CH C-3), 128.1 - 129.1 (CHarom), 139.2 - 140.0 (17x Cq Bn), 170.7 - 171.2 (8x C=O AcNH). 31P NMR (202 MHz, CD3)2CO) δ= -2.84, -2.77, -2.68, -2.45, -2.42, -2.37, -2.31, -1.94, -1.81, -1.78. HRMS: [C222H269N17O59P8 + 2H]+ + 요구치 2184.33410, 실측치 2184.33410.
전형적 규모 (5-40 μmol)로의 탈보호를 위한 일반적 절차
출발 알콜을 NH3 (수용액 30-33%, 10 μmol당 1 mL) 및 디옥산 중에 용해시켰다 (완전히 용해될 때까지). 반응 혼합물을 2시간 동안 교반하였다. 혼합물을 진공 하에 농축시켰다. 1H NMR 및 31P NMR 분석은 반-보호된 중간체로의 총 전환을 나타냈다. 조 물질을 밀리큐(MilliQ) H2O 중에 용해시키고, 다우엑스(Dowex) Na+ 양이온-교환 수지 (유형: 50WX4-200, H2O 중 0.5 M NaOH 상에 저장함, 사용 전에 밀리큐 H2O 및 MeOH로 플러싱함)를 함유하는 칼럼을 통해 용리시켰다. 조 물질을 밀리큐 H2O (10 μmol당 2 mL) 중에 용해시켰다. 반응 혼합물에 4-5 방울의 빙초산을 첨가하였다. 혼합물을 Ar로 퍼징하였다. 용액에 한 스쿱의 Pd 블랙을 첨가하였다. 반응 혼합물을 H2로 수초 동안 퍼징하고, H2 분위기 하에 3일 동안 교반하였다. 혼합물에 셀라이트를 첨가하였다. 용액을 여과하고, 진공 하에 농축시켰다. 조 물질을 크기-배제 크로마토그래피 (토요펄(Toyopearl) HW-40)에 의해 정제하였다. 순수한 화합물을 밀리큐 H2O 중에 용해시키고, 다우엑스 Na+ 양이온-교환 수지 (유형: 50WX4-200, H2O 중 0.5 M NaOH 상에 저장함, 사용 전에 밀리큐 H2O 및 MeOH로 플러싱함)를 함유하는 칼럼을 통해 용리시키고, 동결건조시켰다.
1-O-옥타-(2-아세트아미도-2-데옥시-5a-카르바-α-D-만노피라노실-1-O-포스포릴)-6-헥실-아민 (8) n = 8
알콜 22 (23.2 μmol)를 상기 기재된 일반적 절차를 사용하여 탈보호하였다. 순수한 올리고머 8을 44% 수율 (25.9 mg, 10.2 μmol)로 수득하였다. 1H NMR (500 MHz, D2O) δ= 1.33 - 1.43 (m, 4H, 2x CH2 헥실스페이서), 1.57 - 1.69 (m, 4H, 2x CH2 헥실스페이서), 1.73 - 2.08 (m, 48H, 8x 5a'-H, 8x 5a-H, 8x 5-H, 8x AcNH), 2.92 - 3.00 (m, 2H, CH2 헥실스페이서), 3.48 - 3.68 (m, 8H, 8x H-4), 3.68 - 3.76 (m, 2H, CH2 헥실스페이서), 3.81 - 4.22 (m, 24H, 8x H-3, 8x H-6), 4.25 - 4.36 (m, 8H, 8x H-1), 4.37 - 4.53 (m, 8H, 8x H-2). 13C NMR (126 MHz, D2O) δ= 21.9 (8x CH3 AcNH), 24.4 (CH2 헥실스페이서), 25.1 (CH2 헥실스페이서), 26.6 (CH2 헥실스페이서), 28.0 (8x CH2 C-5a), 29.5 (CH2 헥실스페이서), 38.6 (8x CH C-5), 39.4 (CH2 헥실스페이서), 53.5 (8x CH C-2), 61.9 (8x CH2 C-6), 66.2 (CH2 헥실스페이서), 70.1 (8x CH C-1), 70.4 (8x CH C-4), 71.9 (8x CH C-3), 174.7 (8x C=O AcNH). 31P NMR (202 MHz, D2O) δ= 0.25, 0.37, 0.41, 0.44, 0.48. HRMS: [C78H145N9O57P8 + H]++ 요구치 1183.83071, 실측치 1183.83071.
본 발명에 따른 무작위 아세틸화 카르바 올리고머의 제조
1. Boc 유도체로서의 아민 보호
건조된 카르바-유사체 DP6 (n=6), DP7 (n=7) 및 DP8 (n=8)을 H2O:디옥산 1:1 v/v 중에 가용화시킨 다음, NaHCO3 (2.95 당량) 및 (Boc)2O (1.13 당량)를 4℃에서 첨가하였다. 이어서, 반응물을 자기 교반 하에 실온에서 밤새 유지한 다음, 생성물을 세파덱스 G10 칼럼 (용리액: H2O)에 의해 정제하고, 화합물을 함유하는 분획을 건조시켰다.
2. 무작위 O-아세틸화
단계 1로부터의 건조된 Boc 보호된 카르바-유사체를 아세토니트릴 중에 재현탁시킨 다음, 아세트산 무수물 (분자 중 각각의 -OH 기에 대해 3.6 당량) 및 이미다졸 (1.8 당량)을 첨가하였다. 반응을 40℃에서 유지하고, 아세틸화 반응 시간을 표적 아세틸화 % (~75%)에 도달할 때까지 연장하였다 (1H-NMR에 의해 모니터링함). 이어서, 조 아세틸화 화합물을 건조시켰다.
의심을 피하기 위해, "무작위 O-아세틸화"는 Rx 및 Ry 중 어느 것이 및 몇개가 -C(O)CH3인지에 대한 궁극적인 제어가 존재하지 않는다는 것을 의미하는 것으로 의도된다. 그러나, NMR 기술을 사용하여, 올리고머에서의 총 % O-아세틸화를 결정하는 것이 가능하다.
올리고머는 또한 본원에서 올리고머의 상응하는 중합도 (DP)를 갖는 Ac-카르바MenA, 예를 들어 Ac-카르바MenA DP8로서 나타내어진다.
3. Boc 탈보호
단계 2로부터의 건조된 조 O-아세틸화 카르바-유사체를 CH2Cl2:TFA 4:1 v/v 중에 가용화시키고, 반응물을 자기 교반 하에 실온에서 1시간 동안 유지하였다. 이어서, 조 반응물을 건조시키고, H2O 중에 재가용화시키고, 세파덱스 G10 칼럼 (용리액: H2O)에 의해 정제하였다.
% 아세틸화 결정을 위한 NMR 프로토콜
샘플을 진공 하에 건조시키고, 0.6 mL D2O 중에 재구성하고, 5 mm NMR 튜브로 옮겼다. 400 MHz 및 25℃에서 표준 1차원 펄스프로그램에 의해 양성자 NMR 스펙트럼을 수집하였다. 탑스핀 브루커(TopSpin Bruker) 소프트웨어에 의해 획득 및 처리를 수행하였다.
카르바-유사체에서의 % O-아세틸화의 결정은 5-5.4 ppm에서의 H3+H4 O-Ac (즉, 아세테이트 기의 H)의 피크 및 ~3 ppm에서의 링커의 NH2 옆의 CH2의 삼중선을 적분함으로써 수행하였으며, 이에 값 2가 주어진다. 도 1을 보면, O-아세틸화가 100%인 경우에, H3+H4 O-Ac의 적분 값이 DP6의 경우 12 (DP7의 경우 14 및 DP8의 경우 16)여야 한다고 가정하여, 하기 비율이 적용될 수 있다:
12: 100 = 9.04: X, 여기서 X = % 아세틸화
최종 생성물을 1H-NMR에 의해 특징화하여 정체 구조를 확인하고 합성 당의 O-아세틸화 %를 결정하였다 (도 2 및 표 1).
도 2는 최종 무작위 아세틸화 카르바-유사체의 1H NMR을, % 아세틸화 결정을 위한 적분값으로 도시하며, 여기서 n = 8이다.
표 1.
n = 8인 화학식 (Ia)의 동일한 무작위 아세틸화 카르바-유사체의 경우, 3 및 4 위치 사이의 아세틸 기의 분포를 31P NMR 분광분석법 (101 MHz, D2O)에 의해 결정하였다. 기록된 스펙트럼은 도 3에 도시되어 있다: 이는 위치 C3 및 C4에서 44%의 정도로 발생하는 동시 아세틸화 (즉, 올리고머의 동일한 반복 단위에서 Rx 및 Ry는 둘 다 -C(O)CH3임) 및 C3 또는 C4에서 28%의 정도로 발생하는 아세틸화 (즉, 동일한 반복 단위에서 Rx는 -C(O)CH3이고 Ry는 H이거나 또는 Rx는 H이고 Ry는 -C(O)CH3임)를 나타내고; 반복 단위의 27%는 비-아세틸화된다.
실시예 2: 반응식 2에 따른 선택적 아세틸화 카르바 단량체 빌딩 블록의 제조 (예를 들어, 여기서 Rx는 H이고 Ry는 -C(O)CH3임)
D-글루칼 (23)
3,4,6-트리-O-아세틸-D-글루칼의 혼합물 (10.0g, 36.7mmol)에 MeOH건조 (150mL) 중 K2CO3 (508mg, 3.67mmol)을 첨가한 다음, 실온에서 N2 하에 교반하였다. 1시간 후, 반응이 완결되었고, 아세트산으로 켄칭하여 pH 7에 도달하였다. 용매를 감압 하에 증발시키고, 투명한 오일인 D-글루칼의 조 생성물을 직접 후속 단계에 사용하였다.
4,6-O-(4-메톡시벤질리덴)-D-글루칼 (24)
건조 DMF (100mL) 중 조 화합물 23에 아니스알데히드 디메틸 아세탈 (9.40mL, 55.1mmol)에 이어서 피리딘 p-톨루엔술포네이트 (922mg, 3.67mmol)를 N2 하에 첨가하였다. 반응을 회전증발기 상에서 진공 (180mbar) 하에 25-30℃에서 2.5-3시간 동안 수행하였다. 이어서, DMF를 감압 하에 증발시키고, 조 생성물을 100 mL의 DCM으로 추출하였다. 유기 층을 50 mL NH4Cl, 50 mL의 증류수 및 50 mL의 염수 용액으로 연속적으로 세척하였다. 최종적으로, 수집된 수성 층을 50 mL DCM에 의해 추출하였다. 이어서, 혼합물을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 감압 하에 증발시켜 4,6-O-(4-메톡시벤질리덴)-D-글루칼을 백색 분말로서 45%의 수율로 수득하였다.
δ 1H (400 MHz; CDCl3)
7.43 (2H, td, J 8.6, J 4.7, 8-H), 6.90 (2H, dt, J 8.8, J 4.9, 9-H), 6.33 (1H, ddd, J 6.1, J 1.6, J 0.4, 1-H), 5.55 (1H, s, 7-H), 4.76 (1H, dd, J 6.1, J 2.0, 2-H), 4.49 (1H, br d, J 7.3, 3-H), 4.35 (1H, dd, J 10.3, J 5.0, 5-H), 3.93-3.87 (1H, m, 6-H), 3.83-3.79 (1H, m, 6-H), 3.80 (3H, s, -OMe), 3.77-3.75 (1H, m, 4-H), 2.47 (1H, s, -OH).
δ 13C (100 MHz; CDCl3)
159.4 (11-C), 143.3 (1-C), 128.6 (8-C), 126.7 (9-C), 112.8 (10-C), 102.7 (2-C), 100.9 (7-C), 79.8 (4-C), 68.9 (5-C), 67.6 (6-C), 65.7 (3-C), 54.4 (OMe).
3-O-벤질옥시-4,6-O-(4-메톡시벤질리덴)-D-글루칼 (25)
0℃에서 DMF (350mL) 중 24 (16.05g, 60.7mmol)의 용액에 미네랄 오일 중 60% 수소화나트륨 (7.29g, 182mmol)을 조금씩 첨가하였다 - NaH는 이전에 건조 n-헥산으로 그의 미네랄 오일을 3회 세척해낼 수 있다. 동일한 온도에서 30분 교반한 후, 빙조를 제거하였다. 벤질 브로마이드 (14.4mL, 121mmol)를 첨가하고, 온도를 실온으로 가온하면서 반응물을 밤새 교반하였다. 이어서, 혼합물을 메탄올 (20mL)로 켄칭하고, DMF를 감압 하에 증발시켰다. 유기 상을 100 mL의 EtOAc로 추출한 다음, 유기 층을 NH4Cl, NaHCO3 및 염수 (각각 50mL)로 세척하였다. 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 용매를 감압 하에 증발시켰다. 잔류물을 실리카 겔 상의 플래쉬 칼럼 크로마토그래피 (EtOAc/헥산=3:7)에 의해 정제하여 3-O-벤질옥시-4,6-O-(4-메톡시벤질리덴)-D-글루칼 (18.43g, 86%)을 백색 분말로서 수득하였다.
δ 1H (400 MHz; CDCl3)
7.42 (2H, dt, J 8.5, J 4.6, 8-H), 7.37-7.23 (7H, m, Harom), 6.90 (2H, dt, J 8.9, J 4.9, 9-H), 6.34 (1H, dd, J 6.2, J 1.4, 1-H), 5.58 (1 H, s, 7-H), 4.81 (1H, dd, J 6.17, J 2.06, 2-H), 4.79 (1H, d, J 12.1, 10-H CH2 Ph), 4.70 (1H, d, J 12.1, 10-H CH2 Ph), 4.36-4.32 (2H, m, 3-H, 6a-H), 4.00 (1H, dd, J 9.8, J 7.4, 6b-H), 3.88 (1H, td, J 10.1, J 4.7, 5-H), 3.81 (1H, t, J 10.1, 4-H), 3.80 (3H, s, -OMe).
δ 13C (100 MHz; CDCl3)
160.2 (11-C), 144.5 (1-C), 138.6 (13-C), 129.9 (8-C), 129.9-127.2 (Carom 9, 14, 15, 16-C), 113.7 (10-C), 102.4 (2-C), 101.3 (7-C), 80.1 (5-C), 73.2 (4-C), 72.1 (6-C), 68.8 (3-C), 68.4 (12-C), 55.4 (-OMe).
3-O-벤질옥시-4-O-(4-메톡시벤질옥시)-D-글루칼 (26)
글루칼 25 (780mg, 2.20mmol)를 DCM (20mL) 중에 용해시키고, 0℃에서 냉각시키고, 실온에서 20분 동안 교반하였다. 이어서, 헥산 중 DIBAL-H 1M (11.0mL, 11.0mmol)을 0℃에서 적가하였다. 혼합물을 0℃에서 2시간 동안 교반하였다. 반응물을 증류수 중 통상적으로 로쉘(Rochelle) 염으로 명명되는 타르타르산나트륨칼륨 4수화물 (7.5mL 물 중 1.5g 타르트레이트)의 용액에 의해 20분 동안 켄칭하였다. 이어서, 혼합물을 DCM (30mL)으로 추출하고, 유기 층을 증류수로 2회 및 염수 (각각 40mL)로 세척하였다. 수성 층을 최종적으로 DCM (20mL)으로 추출하였다. 유기 상을 그룹화하고 Na2SO4 상에서 건조시켰다. 용매를 감압 하에 증발시켰다. 잔류물을 실리카 겔 상의 플래쉬 크로마토그래피 (EtOAc/헥산=1:3)에 의해 정제하여 3-O-벤질옥시-4-O-(4-메톡시벤질옥시)-D-글루칼을 백색 고체로서 84% 수율로 수득하였다.
δ 1H (400 MHz; CDCl3)
7.34-7.20 (7H, m, Harom), 6.83 (2H, dt, J 8.7, J 4.8, 9-H), 6.34 (1H, dd, J 6.1, J 1.2, 1-H), 4.82 (1H, dd, J 6.1, J 2.6, 2-H), 4.75 (1H, d, J 11.1, 10-H CH2 Ph), 4.63 (1H, d, J 11.1, 10-H CH2 Ph), 4.61 (1H, d, J 11.8, 7-H CH2 Ph(4-OMe)), 4.52 (1H, d, J 11.8, 7-H CH2 Ph(4-OMe)), 4.19 (1H, ddd, J 6.3, J 2.4, J 2.3, 3-H), 3.87 (1H, dt, J 8.8, J 4.2, 5-H), 3.81-3.79 (2H, m, 6-H), 3.77 (1H, dd, J 8.7, J 6.3 , 4-H), 3.71 (3 H, s, -OMe), 2.65 (1H, s, -OH).
δ 13C (100 MHz; CDCl3)
159.2 (11-C), 144.4 (1-C), 138.1 (13-C), 130.1 (8-C), 129.7-127.6 (Carom 9, 14, 15, 16-C), 113.7 (10-C), 100.1 (2-C), 77.5 (5-C), 75.6 (3-C), 74.1 (4-C), 73.3 (12-C), 70.4 (7-C), 61.4 (6-C), 55.1 (-OMe).
1,5-안히드로-3-O-벤질옥시-4-O-(4-메톡시벤질옥시)-2,6,7-트리데옥시-D-아라비노-헵트-1,6-디에니톨 (28)
건조 DCM (6.1mL) 중 이전 알콜 26 (650mg, 1.82mmol)의 용액에 DMP (926mg, 2.18mmol)를 첨가하였다. 이어서, 혼합물을 실온 (25℃)에서 1시간 동안 교반하였다.
한편, -78℃에서 건조 THF (12.0mL) 중 새로운 PPh3CH3I (1.48g, 3.65mmol)를 사용하여 일리드를 제조하고, 25분 동안 교반하였다. 이어서, KHMDS (7.3mL, 3.65mmol, 톨루엔 중 0.5M)를 -78℃에서 적가하였다. 혼합물을 -78℃에서 20분 동안, 0℃에서 50분 동안 및 최종적으로 -78℃에서 30분 동안 순차적으로 교반하여 일리드를 형성하였다.
또한, 산화 반응물을 Na2S2O3 (30mL) 및 NaHCO3 (30mL)의 용액에 의해 10분 동안 켄칭하였다. 이어서, 알데히드를 DCM (3*40mL)으로 후처리하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, DCM을 감압 하에 증발시켰다.
이어서, 건조 THF 중 알데히드 (11.0mL)를 -78℃에서 일리드에 적가하였다. 반응물을 밤새 교반하였다. 혼합물을 NH4Cl (20mL) 및 DCM (50mL)으로 후처리하였다. 이어서, 유기 층을 DCM (2*30mL)으로 다시 추출하고, NaCl (80mL)에 의해 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시켰다. 잔류물을 플래쉬 크로마토그래피 (n헥산/EtOAc=7:3)에 의해 정제하여 알켄을 황색 오일로서 2 단계에 걸쳐 83%의 수율로 수득하였다.
δ 1H (400 MHz; CDCl3)
7.37-7.27 (4H, m, Harom), 7.24 (2H, dt, J 8.6, J 5.5, 9-H), 6.86 (2H, td, J 8.7, J 5.5, 10-H), 6.41 (1H, dd, J 6.1, J 1.3, 1-H), 6.04 (1H, ddd, J 17.2, J 10.6, J 6.6, 6-H), 5.43 (1H, dt, J 2.9, J 17.3, 7b-H), 5.31 (1H, dt, J 2.6, J 10.6, 7a-H), 4.88 (1H, dd, J 6.2, J 2.7, 2-H), 4.70 (1H, d, J 10.9, 11-H, CH2 Ph), 4.64 (1H, d, J 11.7, 8-H, CH2 Ph(4-OMe)), 4.62 (1H, d, J 10.9, 11-H CH2 Ph), 4.58 (1H, d, J 11.7, 8-H CH2 Ph(4-OMe)), 4.31 (1H, dd, J 7.1, J 8.0, 5-H), 4.19 (1H, ddd, J 6.2, J 2.5, J 1.5, 3-H), 3.79 (3H, s, -OMe), 3.59 (1H, dd, J 8.6, J 6.2, 4-H).
δ 13C (100 MHz; CDCl3)
159.4 (12-C), 144.6 (1-C), 138.5 (14-C), 134.5 (6-C), 130.3 (9-C), 129.8-127.8 (Carom 10, 15, 16, 17-C), 118.4 (7-C), 113.9 (11-C), 100.5 (2-C), 78.2 (5-C), 78.0 (4-C), 75.5 (3-C), 73.6 (8-C), 70.8 (13-C), 55.4 (-OMe).
(3R,4R,5R)-4-O-벤질옥시-3-O-(4-메톡시벤질옥시)-5-(히드록시메틸)시클로헥센 (29)
알켄 28 (200mg, 0.57mmol)을 실온에서 m-DCB (1.43mL, 0.4M) 중에 용해시켰다. 이어서, 클라이젠 재배열을 마이크로-웨이브 하에 265℃에서 10분 동안 수행하였다. 반응성 알데히드의 황색 용액의 소모 후, 즉시 THF/EtOH (10mL, 4:1) 중 NaBH4 (86mg, 2.27mmol)의 혼합물에 붓고, 실온에서 1시간 동안 교반하였다 (TLC 상의 모노스팟, 오렌지색 용액). 반응물을 증류수 (10mL)로 켄칭하였다. 수성 상을 10 mL의 증류수에 의해 증가시키고, DCM (3*20mL)으로 추출하였다. 최종적으로, 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시켰다. 잔류물을 플래쉬 크로마토그래피 (n헥산/EtOAc=8:2)에 의해 정제하여 알콜 7을 무색 오일로서 2 단계에 걸쳐 78%의 수율로 수득하였다.
δ 1H (400 MHz; CDCl3)
7.28-7.16 (7H, m, Harom), 6.79 (2H, br d, J 8.3, 14-H), 5.67-5.64 (1H, m, 1-H), 5.64-5.59 (1H, m, 2-H), 4.88 (1H, d, J 11.3, 8-H CH2 Ph), 4.64 (1H, d, J 11.3, 8-H CH2 Ph), 4.56 (1H, d, J 11.2, 12-H CH2 Ph(4-OMe)), 4.48 (1H, d, J 11.7, 12-H CH2 Ph(4-OMe)), 4.12 (1H, br d, 4-H), 3.71 (3H, s, -OMe), 3.57-3.47 (3H, m, 3-H, 6-H), 2.35 (1H, s, -OH), 2.07-2.00 (1H, m, 7-H), 1.97-1.88 (1H, m, 5-H), 1.82-1.75 (1H, m, 7-H).δ 13C (100 MHz; CDCl3)
δ 13C (100 MHz; CDCl3)
159.4 (17-C), 138.5 (9-C), 132.1 (14-C), 130.5-128.0 (Carom 10, 11, 12, 15-C), 127.7 (1-C), 126.1 (2-C), 114.0 (16-C), 82.3 (3-C), 80.9 (4-C), 74.4 (8-C), 71.1 (13-C), 65.9 (6-C), 55.4 (-OMe), 40.7 (5-C), 28.1 (7-C).
4-O-벤질-3-O-(4-메톡시벤질옥시)-6-O-텍실디메틸실릴-5-메틸시클로헥센 (30)
알콜 29 (715mg, 2.02mmol)를 실온에서 건조 THF (17mL) 중에 용해시켰다. 이미다졸 (125mg, 1.83mmol)을 첨가하고, 혼합물을 실온에서 5분 동안 교반한 다음, 0℃에서 10분 동안 교반하였다. 이어서, 텍실디메틸실릴클로라이드 (1.19mL, 6.05mmol)를 적가하여 백색 침전물의 형성에 주의를 기울였다. 따라서, 빙조를 최초 침전 시에 제거하고, 남아있는 TDSCl을 혼합물에 천천히 첨가하고, 실온으로 가온되도록 하고, 밤새 교반하였다. 반응을 TLC (Pent/AcOEt 3:1)에 의해 모니터링하였다. 유기 상을 EtOAc로 추출한 다음, 증류수 (5회)로 세척하였다. 잔류물을 플래쉬 크로마토그래피 (nHex/AcOEt 95:5)에 의해 정제하여 화합물 30이 황색 오일로서 정량적 수율로 형성되도록 하였다.
δ 1H (400 MHz; CDCl3)
7.37-7.16 (7H, m, Harom), 6.88-6.84 (2H, m, 14-H), 5.75 (1H, ddq, J 9.0, J 4.3, J 2.4, 1-H), 5.64 (1H, br d, 2-H), 4.91 (1H, d, J 11.0, 8-H CH2 Ph), 4.68 (1H, d, J 11.0, 8-H CH2 Ph), 4.64 (1H, d, J 11.3, 12-H CH2 Ph(4-OMe)), 4.60 (1H, d, J 11.3, 12-H CH2 Ph(4-OMe)), 4.16 (1H, ddq, J 7.1, J 3.6, J 1.8, 3-H), 3.86 (1H, dd, J 9.8, J 4.8, 6-H), 3.79 (3H, s, -OMe), 3.64 (1H, dd, J 10.0, J 6.6, 4-H), 3.63-3.58 (1H, m, 6-H), 2.28-2.16 (1H, m, 7-H), 2.10 (1H, dt, J 18.4, J 5.3, 7-H), 1.91 (1H, ttd, J 10.5, J 5.1, J 2.7, 5-H), 1.64 (1H, hept, J 6.9, 17-H), 0.90 (6H, d, J 6.9, 18-H), 0.87 (6H, s, 16-H), 0.13 (6H, s, 15-H).
δ 13C (100 MHz; CDCl3)
159.3 (14-C), 139.3 (9-C), 133.8 (17-C), 131.0-128.0 (Carom 10, 11, 12, 15-C), 127.6 (1-C), 126.3 (2-C), 113.9 (16-C), 81.5 (3-C), 79.7 (4-C), 74.7 (8-C), 71.5 (13-C), 62.6 (6-C), 55.4 (-OMe), 41.4 (5-C), 34.3 (21-C), 28.7 (7-C), 25.3 (19-C), 20.5-20.3 (20-C), 18.8-18.7 (22-C), -3.27- -3.46 (18-C).
4-O-벤질-3-O-(4-메톡시벤질옥시)-6-O-텍실디메틸실릴-5a-카르바-α-D-글루코피라노스 (31)
화합물 30 (230mg, 0.46mmol)을 아세톤 (1.69mL) 및 물 (562μL)의 혼합물 중에 용해시켰다. OsO4 (4.5mL H2O 및 18mL 아세톤 중 250mg OsO4의 제제에 기초하여 537μL) 및 TMANO (116mg, 1.02mmol)의 용액을 실온에서 첨가하였다. 반응을 25℃에서 48시간 동안 수행하였다. Na2S2O3의 포화 수용액 (2mL)을 첨가하고, 혼합물을 실온에서 교반하여 OsO4를 환원시켰다. 유기 상을 CHCl3 (15mL)로 추출하고, 염수 (10mL)로 세척하고, 최종적으로 Na2SO4 상에서 건조시켰다. 조 생성물을 플래쉬 크로마토그래피 (nHex/AcOEt, 8.2)에 의해 정제하여 디올 31이 무색 오일로서 77%의 수율로 형성되도록 하였다.
δ 1H (400 MHz; CDCl3)
7.37-7.15 (7H, m, Harom), 6.87 (2H, br d, J 8.7, 14-H), 4.90 (1H, d, J 12, 8-H CH2 Ph), 4.88 (1H, d, J 8, 12-H CH2 Ph(4-OMe)), 4.69 (1H, d, J 10.9, 8-H CH2 Ph), 4.61 (1H, d, J 11.1, 12-H CH2 Ph(4-OMe)), 4.05 (1H, br d, J 2.7, 1-H), 3.96 (1H, dd, J 10.0, J 3.3, 6-H), 3.78 (3H, s, -OMe), 3.71 (1H, t, J 9.4, 3-H), 3.48 (2H, t, J 10.0, 6-H, 4-H), 3.43 (1H, dd, J 2.3, J 9.4, 2-H), 2.64 (1H, s, -OH), 2.58 (1H, s, -OH), 2.09-2.03 (1H, m, 5-H), 1.77 (1H, dt, J 14.5, J 3.6, 7-H), 1.62 (1H, hept, J 6.9, 17-H), 1.59-1.52 (1H, m, 7-H), 0.88 (6H, d, J 6.9, 18-H), 0.85 (6H, d, d 1.2, 16-H), 0.07 (6H, s, 15-H).
δ 13C (100 MHz; CDCl3)
159.5 (14-C), 138.9 (9-C), 130.9 (17-C), 129.7-127.7 (Carom 10, 11, 12, 15-C), 114.2 (16-C), 83.4 (3-C), 81.0 (4-C), 75.1 (13-C), 74.9 (8-C), 74.6 (2-C), 68.5 (1-C), 62.1 (6-C), 55.3 (-OMe), 38.9 (5-C), 34.3 (21-C), 30.4 (7-C), 25.2 (19-C), 20.5-20.4 (20-C), 18.8-18.7 (22-C), -3.35- -3.56 (18-C).
1-O-아세틸-4-O-벤질-3-O-(4-메톡시벤질옥시)-6-O-텍실디메틸실릴-5a-카르바-α-D-글루코피라노스 (32)
화합물 31 (155mg, 0.29mmol)을 질소 하에 실온에서 아세토니트릴 (2.9mL) 중에 용해시켰다. 트리메틸 오르토아세테이트 (115μL, 0.88mmol) 및 PTSA (5mg, 0.03mmol)를 혼합물에 연속적으로 첨가한 다음, 이를 질소 하에 실온에서 60분 동안 교반하였다. 반응이 완결된 후, AcOH 80%의 용액 (2.32mL AcOH + 0.58mL H2O)을 첨가하였다. 하기 아세틸화 반응은 60분 내에 완전히 종료되었다. 유기 상을 DCM (5mL)으로 추출한 다음, 물 (5mL) 및 NaHCO3 (5mL)으로 세척하고, 최종적으로 Na2SO4 상에서 건조시켰다. 잔류물을 플래쉬 크로마토그래피 (nHex/AcOEt)에 의해 정제하여 슈도 아노머 위치 상에서 선택적으로 아세틸화된 화합물 32를 무색 오일로서 정량적 수율로 수득하였다.
δ 1H (400 MHz; CDCl3)
7.39-7.13 (7H, m, Harom), 6.87 (2H, dt, J 8.7, J 5.0, 14-H), 5.26 (1H, dd, J 5.7, J 3.0, 1-H), 4.91 (1H, d, J 10.6, 8-H CH2 Ph), 4.90 (1H, d, J 10.9, 12-H CH2 Ph(4-OMe)), 4.70 (1H, d, J 10.0, 8-H CH2 Ph), 4.68 (1H, d, J 10.5, 12-H CH2 Ph(4-OMe)), 3.95 (1H, dd, J 10.0, J 3.5, 6-H), 3.80 (3H, s, -OMe), 3.75 (1H, t, J 9.3, 3-H), 3.58 (1H, br d, J 9.6, 2-H), 3.53 (1H, dd, J 9.1, J 10.1, 4-H), 3.50 (1H, dd, J 9.8, J 2.4, 6-H), 2.28 (1H, s, -OH), 2.08 (3H, s, -OAc), 1.95-1.88 (1H, m, 5-H), 1.85 (1H, dt, J 14.8, J 7.6, 7-H), 1.61 (1H, dt, J 13.8, J 6.9, 7-H), 1.61 (1H, hept, J 6.9, 17-H), 0.88 (6H, d, J 6.8, 18-H), 0.84 (6H, d, J 1.7, 16-H), 0.07 (6H, d, J 4.4, 15-H).
δ 13C (100 MHz; CDCl3)
170.9 (C(O), -OAc), 159.5 (14-C), 138.7 (9-C), 130.8 (17-C), 129.8-127.9 (Carom 10, 11, 12, 15-C), 114.8 (16-C), 84.0 (3-C), 80.5 (4-C), 75.4 (13-C), 75.3 (8-C), 73.4 (2-C), 71.8 (1-C), 61.8 (6-C), 55.4 (-OMe), 39.6 (5-C), 34.3 (21-C), 28.8 (7-C), 25.3 (19-C), 21.4 (CH3, -OAc), 20.5-20.4 (20-C), 18.8-18.7 (22-C), -3.28- -3.53 (18-C).
1-O-아세틸-2-아지도-4-O-벤질옥시-3-O-(4-메톡시벤질옥시)-6-O-텍실디메틸실릴-5a-카르바-α-D-만노피라노스
화합물 32 (220mg, 0.38mmol)를 DCM/피리딘의 혼합물 (5:1, 0.05M) 중에 용해시키고, 질소 하에 -10℃에서 10분 동안 교반하였다. 트리플레이트 무수물 (355μL, 2.11mmol)을 -10℃에서 적가하였다. 혼합물을 순차적으로 0℃에 천천히 도달하도록 30분 동안 교반하고, 0℃에서 추가로 30분 동안 교반하였다. 반응이 완결된 후, 유기 상을 NaHCO3 및 염수로 세척하였다. 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 수득된 조 물질을 톨루엔과의 공증발 (3회) 후에 후속 단계에 직접 사용하였다. 다음에, 건조 조 물질을 40℃에서 DMF/H2O (19:1, 0.2M) 중에 용해시켰다. 아지드화나트륨 (125mg, 1.92mmol) 및 15-크라운-5 (15.2μL, 0.08mmol)를 실온에서 첨가하고, 반응물을 40℃에서 밤새 처리하였다. 트리플레이트 중간체가 완전히 소멸된 후, 용매를 증발시키고, 잔류물을 최종적으로 플래쉬 크로마토그래피 (nHex/EtOAc)에 의해 정제하여 표제 화합물 아지드를 무색 오일로서 82%의 수율로 형성되도록 하였다.
δ 1H (400 MHz; CDCl3)
7.38-7.14 (7H, m, Harom), 6.86 (2H, dt, J 8.6, J 4.9, 14-H), 4.98-4.94 (1H, m, 1-H), 4.88 (1H, d, J 10.7, 8-H CH2 Ph), 4.66 (1H, d, J 19.1, 12-H CH2 Ph(4-OMe)), 4.63 (1H, d, J 19.5, 12-H CH2 Ph(4-OMe)), 4.59 (1H, d, J 10.9, 8-H CH2 Ph), 3.87-3.84 (1H, m, 2-H), 3.84 (1H, dd, J 6.3, J 2.7, 6-H), 3.80 (3H, s, -OMe), 3.82-3.75 (2H, m, 4-H, 3-H), 3.52 (1H, dd, J 9.9, J 2.1, 6-H), 2.00 (3H, s, -OAc), 1.91-1.82 (2H, m, 5-H, 7-H), 1.65-1.57 (2H, m, 7-H, 17-H), 0.89 (6H, d, J 6.9, 18-H), 0.85 (6H, d, J 1.2, 16-H), 0.07 (6H, d, J 4.1, 15-H).
δ 13C (100 MHz; CDCl3)
169.8 (C(O), -OAc), 159.6 (14-C), 138.9 (9-C), 130.2 (17-C), 129.8-127.8 (Carom 10, 11, 12, 15-C), 114.0 (16-C), 81.1 (4-C), 77.0 (3-C), 75.4 (8-C), 72.9 (13-C), 70.6 (1-C), 62.2 (6-C), 61.4 (2-C), 55.4 (-OMe), 39.8 (5-C), 34.4 (21-C), 27.1 (7-C), 25.3 (19-C), 21.2 (CH3, -OAc), 20.6-20.5 (20-C), 18.8-18.7 (22-C), -3.35- -3.52 (18-C).
1-O-아세틸-2-아세트아미드-4-O-벤질옥시-3-O-(4-메톡시벤질옥시)-6-O-텍실디메틸실릴-5a-카르바-α-D-만노피라노스 (33)
제시된 바와 같은 아지드 (334mg, 0.56mmol), PPh3 (366mg, 1.40mmol) 및 촉매량의 피리딘 (13.6μL, 0.17mmol)의 혼합물에 THF/H2O (85:15, 0.14M)를 첨가하고, 60℃에서 24시간 동안 교반하였다. 출발 물질이 소멸된 후, 생성된 아민을 용매 건조시킨 다음, 피리딘 (5.6mL) 중에 용해시켰다. 아세트산 무수물 (1.06mL, 11.2mmol)을 첨가하고, 용액을 다시 24시간 동안 교반하였다. 조 물질을 플래쉬 크로마토그래피 (nHex/AcOEt)에 의해 정제하여 아세트아미드 33을 황색 오일로서 75% 수율로 수득하였다.
δ 1H (400 MHz; CDCl3)
7.39-7.28 (5H, m, Harom), 7.19 (2H, dt, J 9.4, J 4.6, 13-H), 6.86 (2H, dt, J 9.4, J 4.8, 14-H), 5.59 (1H, d, J 8.1, NHAc), 5.12 (1H, td, J 7.2, J 3.9, 1-H), 4.71 (1H, d, J 11.3, 8-H CH2 Ph), 4.56 (1H, d, J 11.3, 8-H CH2 Ph), 4.50 (1H, d, J 11.2, 12-H CH2 Ph(4-OMe)), 4.42 (1H, td, J 7.7, J 4.1, 2-H), 4.36 (1H, d, J 11.2, 12-H CH2 Ph(4-OMe)), 3.84 (1H, dd, J 2.4, J 4.0, 3-H), 3.85-3.82 (1H, m, 6-H), 3.80 (3H, s, -OMe), 3.72 (1H, t, J 6.3, 4-H), 3.60 (1H, dd, J 9.9, J 5.5, 6-H), 2.09-2.02 (1H, m, 5-H), 2.01 (3H, s, -OAc), 1.90 (3H, s, -NHAc), 1.82 (2H, tdd, J 14.2, J 7.4, J 4.6, 7-H), 1.66-1.57 (1H, hept, J 6.9, 17-H), 0.89 (6H, d, J 6.9, 18-H), 0.84 (6H, s, 16-H), 0.08 (6H, d, J 6.2, 15-H).
δ 13C (100 MHz; CDCl3)
170.7 (C(O), -NHAc), 170.1 (C(O), -OAc), 159.6 (14-C), 138.6 (9-C), 130.0 (15-C), 129.9 (17-C), 128.6-127.8 (Carom 10, 11, 12-C), 114.1 (16-C), 78.7 (3-C), 74.4 (4-C), 73.6 (8-C), 71.9 (13-C), 69.6 (1-C), 62.5 (6-C), 55.4 (-OMe), 50.6 (2-C), 39.9 (5-C), 34.4 (21-C), 27.1 (7-C), 25.2 (19-C), 23.5 (CH3, -NHAc) , 21.3 (CH3, -OAc), 20.5 (20-C), 18.8 (22-C), -3.37- -3.48 (18-C).
1-O-tert부틸실릴-2-아세트아미드-4-O-벤질-2-데옥시-3-O-(4-메톡시벤질옥시)-6-O-텍실디메틸실릴-5a-카르바-α-D-만노피라노스 (35)
화합물 33 (582mg, 0.95mmol)을 MeOH (9.5mL) 중에 용해시켰다. 혼합물에 NaOMe (11mg, 0.2mmol)를 첨가하였다. 반응물을 실온에서 3시간 동안 교반하였다. 앰버라이트 H+ 이온 교환 수지를 중성 pH에 도달할 때까지 첨가하였다. 현탁액을 여과하고, 진공 하에 농축시켰다. 조 물질을 톨루엔과 함께 3회 공증발시켰다.
N2 기체의 흐름 하에, 플라스크에 DCM (4 mL) 중 34 (0.95 mmol)의 용액을 충전하였다. 0℃에서, 2,6-루티딘 (2.37 mmol)에 이어서 TBSOTf (437μL, 1.9mmol)를 적가 방식으로 첨가하였다. 혼합물을 교반하여 실온으로 가온되도록 하였다. 그의 완결 후, 반응물을 실온으로 냉각시키고, MeOH로 켄칭하고, 혼합물을 클로로포름으로 희석하였다. 혼합물을 10% 수성 CuSO4 용액 (2x), H2O 및 염수로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 진공 하에 농축시켰다. 칼럼 크로마토그래피 (nHex/EtOAc)에 의해 정제하여 표제 화합물 35를 오렌지색 오일로서 2 단계에 걸쳐 83% 수율로 수득하였다.
문헌 [J. D. C. Codee et al., J. Org. Chem, 2017, 82, 2, 848-868].
δ 1H (400 MHz; CDCl3)
7.41-7.24 (5H, m, Harom), 7.19 (2H, dt, J 9.5, J 4.6, 13-H), 6.86 (2H, dt, J 9.4, J 4.8, 14-H), 5.57 (1H, d, J 5.7, NHAc), 4.93 (1H, d, J 10.6, 8-H CH2 Ph), 4.58 (1H, d, J 10.5, 8-H CH2 Ph), 4.56 (1H, d, J 11.1, 12-H CH2 Ph(4-OMe)), 4.48 (1H, d, J 11.1, 12-H CH2 Ph(4-OMe)), 4.27 (1H, dd, J 5.2, J 2.3, 2-H), 4.25-4.21 (1H, m, 1-H), 4.03 (1H, dd, J 9.6, J 4.5, 3-H), 3.97 (1H, dd, J 9.7, J 3.6, 6-H), 3.81 (3H, s, -OMe), 3.54 (1H, t, J 9.9, 4-H), 3.48 (1H, dd, J 9.7, J 2.2, 6-H), 2.09-2.02 (1H, m, 5-H), 2.01 (3H, s, -NHAc), 1.78-1.69 (1H, m, 7-H), 1.69-1.59 (1H, m, 17-H), 1.52-1.45 (1H, m, 7-H), 0.93 (6H, d, J 6.9, 18-H), 0.87 (6H, s, 16-H), 0.86 (6H, s, 20-H), 0.84 (6H, s, 16-H), 0.12 (6H, d, J 12.0, 19-H), 0.09 (6H, d, J 9.4, 15-H).
δ 13C (100 MHz; CDCl3)
170.7 (C(O), -NHAc), 159.5 (14-C), 139.1 (9-C), 130.2 (17-C), 130.0 (15-C), 128.6-127.7 (Carom 10, 11, 12-C), 114.0 (16-C), 78.5 (3-C), 77.6 (4-C), 75.5 (8-C), 71.4 (13-C), 67.7 (2-C), 62.6 (6-C), 55.4 (-OMe), 53.4 (1-C), 38.6 (5-C), 34.6 (21-C), 30.4 (7-C), 25.9 (25-C) , 25.2 (19-C), 23.6 (CH3 -NHAc), 20.7-20.6 (20-C), 18.9-18.8 (22-C), 18.0 (24-C), -3.37- -3.58 (18-C), -4.82- -4.92 (23-C).
1-O-tert부틸실릴-2-아세트아미드-4-O-벤질옥시-3-O-(4-메톡시벤질옥시)-6-O-텍실디메틸실릴-5a-카르바-α-D-만노피라노스
DCM (3.4mL) 중 14 (71mg, 0.10mmol)의 냉각된 (0℃) 용액에 새로 제조한 포스페이트 완충제 (362μL, pH 7.5, 10mM)를 첨가하였다. 새로 제조한 DDQ (50.0mg, 0.22mmol)를 1시간에 걸쳐 조금씩 첨가하고, 이 후 혼합물을 실온으로 가온되도록 하고, 30분 동안 교반하였다. 혼합물을 NaHCO3으로 희석하고, 수성 층을 DCM으로 2회 추출하였다. 합한 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 진공 하에 농축시켰다. 칼럼 크로마토그래피 (nHex/EtOAc)에 의해 정제하여 화합물 15를 오렌지색 고체로서 72% 수율로 수득하였다.
문헌 [Dan Van Der Es, Thesis, 2016, Universiteit Leiden, pp160].
δ 1H (400 MHz; CDCl3)
7.41-7.27 (5H, m, Harom), 5.52 (1H, d, J 5.4, NHAc), 4.73 (2H, s, 8-H CH2 Ph), 4.26 (1H, br d, J 2.7, 1-H), 4.16 (1H, dt, J 9.0, J 3.8, 3-H), 4.06 (1H, dd, J 9.0, J 4.5, 2-H), 3.94 (1H, dd, J 9.9, J 3.7, 6-H), 3.53 (1H, dd, J 10.0, J 2.1, 6-H), 3.46 (1H, t, J 9.5, 4-H), 2.73 (1H, s, -OH), 2.10-2.03 (1H, m, 5-H), 2.00 (3H, s, -NHAc), 1.81-1.69 (1H, m, 7-H), 1.69-1.59 (1H, m, 14-H), 1.51 (1H, dt, J 13.7, J 3.2, 7-H), 0.93 (6H, d, J 6.9, 15-H), 0.88 (6H, s, 17-H), 0.87 (6H, s, 13-H), 0.14-0.04 (12H, m, 16-H, 12-H).
δ 13C (100 MHz; CDCl3)
170.1 (C(O), -NHAc), 138.8 (9-C), 128.7-127.7 (Carom 10, 11, 12-C), 79.6 (4-C), 74.8 (8-C), 70.7 (3-C), 67.6 (1-C), 62.9 (6-C), 56.5 (2-C), 38.5 (5-C), 34.6 (16-C), 31.2 (7-C), 25.9 (20-C), 25.3 (14-C), 23.6 (CH3, -NHAc), 20.7-20.6 (15-C), 18.9-18.8 (17-C), 18.0 (19-C), -3.37- -3.53 (13-C), -4.80- -4.90 (18-C).
1-O-tert부틸실릴-2-아세트아미드-4-O-벤질옥시-6-O-텍실디메틸실릴-5a-카르바-α-D-만노피라노스 (36)
제시된 바와 같은 알콜 (180mg, 0.32mmol)을 질소 하에 실온에서 건조 DCM (3.2mL) 중에 용해시켰다. 피리딘 (257μL, 3.18mmol), 아세트산 무수물 (601μL, 6.36mmol) 및 촉매량의 DMAP (7.8mg, 0.06mmol)를 연속적으로 첨가하고, 혼합물을 반응이 끝날 때까지 교반하였다. 용액을 MeOH로 켄칭한 다음, 감압 하에 농축시켰다. 플래쉬 크로마토그래피 (nHex/EtOAc)에 의해 정제하여 화합물 36이 황색 오일로서 정량적 수율로 형성되도록 하였다.
δ 1H (400 MHz; CDCl3)
7.37-7.13 (5H, m, Harom), 5.44 (1H, dd, J 10.3, J 4.5, 3-H), 5.27 (1H, d, J 7.4, NHAc), 4.70 (2H, d, J 10.9, 8-H CH2 Ph), 4.61 (1H, d, J 10.9, 8-H CH2 Ph), 4.31 (1H, dt, J 7.3, J 3.8, 2-H), 4.10 (1H, br d, J 2.7, 1-H), 3.97 (1H, dd, J 9.8, J 3.2, 6-H), 3.61 (1H, t, J 10.3, 4-H), 3.46 (1H, dd, J 9.8, J 2.0, 6-H), 2.18-2.11 (1H, m, 5-H), 2.00 (3H, s, -NHAc), 1.98 (3H, s, -OAc), 1.79-1.70 (1H, m, 7-H), 1.70-1.61 (1H, m, 14-H), 1.52 (1H, dt, J 14.3, J 2.8, 7-H), 0.95 (6H, d, J 6.9, 15-H), 0.90 (6H, s, 17-H), 0.88 (6H, s, 13-H), 0.13 (6H, d, J 15.1, 16-H), 0.09 (6H, d, J 14.8, 12-H).
δ 13C (100 MHz; CDCl3)
170.0 (C(O), -NHAc), 169.8 (C(O), -OAc), 138.7 (9-C), 128.6-127.6 (Carom 10, 11, 12-C), 76.2 (4-C), 75.1 (8-C), 73.2 (3-C), 68.1 (1-C), 62.3 (6-C), 54.0 (2-C), 38.7 (5-C), 34.6 (16-C), 30.6 (7-C), 25.8 (20-C), 25.3 (14-C), 23.6 (CH3, -NHAc), 21.2 (CH3, -OAc), 20.7-20.6 (15-C), 19.0-18.9 (17-C), 18.1 (19-C), -3.41- -3.62 (13-C), -4.90- -4.99 (18-C).
2-아세트아미드-4-O-벤질옥시-5a-카르바-α-D-만노피라노스 (37)
화합물 36 (120mg, 0.20mmol)을 0℃에서 건조 THF (2.0mL) 중에 용해시켰다. HF/Py 30%의 용액 (420 μL)을 적가하고, 반응물을 밤새 교반하고, 0℃에서 실온으로 천천히 가온하였다. 이어서, 혼합물을 NaHCO3 (3 mL)으로 켄칭하였다. 유기 층을 EtOAc로 2회 추출하고, 염수로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시켰다. 수득한 조 화합물 37을 실리카 상에서 여과하여 백색 고체를 60% 수율로 수득하였다.
δ 1H (400 MHz; CD3OD)
7.37-7.26 (5H, m, Harom), 5.33 (1H, dd, J 8.4, J 4.4, 3-H), 4.72 (2H, d, J 11.4, 8-H CH2 Ph), 4.66 (1H, d, J 11.4, 8-H CH2 Ph), 4.45 (1H, t, J 4.8, 2-H), 4.10 (1H, br d, J 2.7, 1-H), 3.87 (1H, q, J 4.5, 1-H), 3.78-3.73 (2H, m, 4-H, 6-H), 3.68 (1H, dd, J 10.6, J 4.2, 6-H), 2.17-2.09 (1H, m, 5-H), 2.04 (1H, s, -OH), 2.03 (1H, s -OH), 2.02 (3H, s, -NHAc), 1.98 (3H, s, -OAc), 1.83 (2H, dd, J 7.8, J 3.8, 7-H).
δ 13C (100 MHz; CDCl3)
173.6 (C(O), -NHAc), 172.0 (C(O), -OAc), 140.0 (9-C), 129.3-128.6 (Carom 10, 11, 12-C), 77.2 (4-C), 74.9 (8-C), 74.7 (3-C), 68.2 (1-C), 63.1 (6-C), 54.0 (2-C), 40.7 (5-C), 30.9 (7-C), 22.5 (CH3, -NHAc), 21.1 (CH3, -OAc).
2-아세트아미드-4-O-벤질옥시-6-O-디메톡시트리틸-5a-카르바-α-D-만노피라노스 (38)
화합물 37 (15mg, 42.7μmol)을 질소 하에 실온에서 건조 DCM 중에 용해시켰다. 건조 피리딘 (5.2μL, 64.0μmol) 및 DMTrCl (217mg, 64.0μmol)을 연속적으로 첨가한 다음, 혼합물을 실온에서 3시간 동안 교반하였다. 이어서, 반응물에 H2O를 첨가하였다. 유기 층을 염수로 1회 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 진공 하에 농축시켰다. 플래쉬 크로마토그래피 (nHex/AcOEt, 0.1% TEA)에 의해 정제하여 화합물 38을 백색 고체로서 74% 수율로 수득하였다.
δ 1H (400 MHz; CD3OD)
7.40-7.05 (14H, m, Harom), 6.79 (4H, dd, J 8.9, J 1.7, 13-H), 5.24 (1H, dd, J 7.9, J 4.3, 3-H), 4.53 (1H, d, J 11.3, 8-H CH2 Ph), 4.38 (1H, t, J 4.8, 2-H), 4.31 (1H, d, J 11.3, 8-H CH2 Ph), 3.79 (1H, q, J 5.2, 1-H), 3.72 (3H, s, -OMe), 3.72 (3H, s, -OMe), 3.61 (1H, t, J 8.1, 4-H), 3.34-3.26 (1H, m, 6-H), 3.05 (1H, t, J 8.3, 6-H), 2.34-2.24 (1H, m, 5-H), 2.08-1.98 (1H, m, 7-H), 1.95 (3H, s, -NHAc), 1.86 (3H, s, -OAc), 1.85-1.79 (1H, m, 7-H).
δ 13C (100 MHz; CD3OD)
173.6 (C(O), -NHAc), 172.0 (C(O), -OAc), 160.0 (17-C), 146.7 (9-C), 137.6 (14-C), 137.5 (14-C), 137.3 (9-C), 131.4 (18-C), 129.9-126.3 (Carom 10, 11, 12, 15, 19, 20, 21-C), 114.0 (16-C), 87.2 (13-C), 77.3 (4-C), 74.5 (3-C), 74.4 (8-C), 68.0 (1-C), 65.0 (6-C), 55.7 (-OMe), 54.1 (2-C), 39.2 (5-C), 31.9 (7-C), 22.5 (CH3, -NHAc), 21.1 (CH3, -OAc).
실시예 3 (참조 실시예): 아세틸화가 없는 올리고머 접합체 - CRM-MenA DP6 (OAC 부재) 및 CRM-MenA DP8 (OAc 부재)의 제조
출발 올리고머 (DP6 및 DP8)를 진공 건조시키고, 1:9 H2O:DMSO 용액 중에 40 mmol/mL의 최종 아미노 기 농도로 가용화시키고, 아미노 기와 비교하여 5배 몰 과량의 트리에틸아민의 존재 하에 12배 몰 과량의 디-N-히드록시숙신이미딜 아디페이트 링커 (SIDEA)와 반응시켰다. 반응물을 완만한 교반 하에 실온에서 3시간 동안 유지하였다. 활성화된 올리고사카라이드를 4 부피의 에틸 아세테이트로 침전시키고, 이어서 펠릿을 1 mL의 동일한 용매로 10회 세척하여 정제하였다. 최종적으로, 펠릿을 진공 하에 건조시키고, 도입된 N-히드록시숙신이미드 에스테르 기의 함량을 결정하였다.
접합체를 40:1의 활성 에스테르 (AE):단백질 몰비를 사용하여 50 mM NaH2PO4 pH 7 중에서 제조하고, 완만한 교반 하에 실온에서 밤새 수행하였다. 접합체를 30 kDa의 컷-오프를 사용하고 완충제로서 PBS pH 7.2를 사용하는 접선 흐름 여과 (비바스핀(Vivaspin))에 의해 정제하였다. 접합체를 SDS-page에 의해, 총 단백질 함량에 대해 마이크로 BCA (Smith, P.K., et al. (1985) Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal Biochem 150:76-85)에 의해 및 총 사카라이드 함량에 대해 MALDI 분석에 의해 특징화하였다. 하기 표 2에 제시된 바와 같이, 각각 카르바 DP6 및 DP8로부터의 2종의 접합체에 대해 MALDI TOF MS에 의해 16.9 및 10.4의 사카라이드/단백질 몰비를 결정하였다.
표 2
소듐 도데실 술페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (SDS-Page). SDS-Page를 사전-캐스팅된 3-8% 폴리아크릴아미드 겔 (NuPAGE® 인비트로젠(Invitrogen)) 상에서 수행하였다. 약 40분 동안 150V의 전압을 갖는 전기영동 챔버를 사용하여, 각각의 샘플에 대해 5 μg의 단백질을 로딩하는 트리스-아세테이트 SDS 구동 완충제 (NuPAGE® 인비트로젠) 중에서 전기영동 실행을 수행하였다. 3 μl의 NuPAGE® LDS 샘플 완충제를 첨가하여 샘플을 제조하였다. 전기영동 실행 후, 겔을 H2O 중에서 3회 세척한 다음, 쿠마시로 염색하였다.
실시예 4: 화학식 (IIa)에 따른 본 발명의 올리고머 접합체의 제조
무작위 O-아세틸화 카르바-유사체를 디-N-히드록시숙신이미딜 아디페이트 링커 (SIDEA)로 활성화시켰으며, 올리고사카라이드에 대해 수득된 활성화의 %는 DP6OAc에 대해 56%, DP7OAc에 대해 79% 및 DP8OAc에 대해 84%인 것으로 추정되었다.
활성화된 올리고사카라이드 (즉, 활성화된 O-아세틸화 카르바-유사체)를 동결건조시켜 접합 단계를 위해 준비하였다. 도 4에 보고된 화학을 적용함으로써 접합체를 수득하였고, 동일한 도면에서 SDS-page 특징화가 제시되며, 여기서 접합체의 도말표본이 관찰될 수 있다.
정제된 당접합체 (즉, O-아세틸화 카르바-유사체를 포함하는 것)를 표 3에 제시된 바와 같이 단백질 함량의 측면에서 마이크로BCA (Smith, P.K., et al. (1985) Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal Biochem 150:76-85)에 의해 및 사카라이드 함량의 측면에서 HPAEC-PAD에 의해 특징화하였다.
표 3
실시예 5: 올리고머 길이의 시험관내 선택
카르바-유사체의 면역원성을 위한 중요한 전제조건은 천연 MenA CPS를 모방하는 그의 능력이다. 이러한 특성을 시험관내 조사하기 위해, CPS 및 avDP ~15를 갖는 중간 길이 올리고머와 비교하여 상이한 길이를 갖는 올리고머의 살박테리아 항-MenA mAb (JW-A1)에 대한 결합을 문헌 [Giuntini, S. et al., PLoS One, 2012, 7, e34272; Tsang, R. S. et al., Clin. Diagn. Lab. Immunol., 2005, 12, 152-156; 및 Reyes, F. et al., Biologicals, 2013, 41, 275-278]에 기재된 바와 같이 시험하였다.
두드러지게, 도 5a에 제시된 바와 같이, 4 내지 7의 DP가 mAb를 인식하지 않았지만, 천연 CPS와 비교하여, 4 자릿수 더 높은 IC50이긴 하지만, DP8에 의한 결합이 관찰되었다. MenA CPS의 탈-O-아세틸화는 감소된 인식으로 이어졌으며, 이는 아세틸화 에피토프에 대한 mAb의 특이성을 의미한다.
억제제를 MenA-CRM197 접합체로의 마우스의 면역화에 의해 생성된 항-MenA 폴리클로날 혈청으로 검정하였을 때 (도 5b), 카르바 DP8이 deOAc CPS와 대등하게 억제제로서 수행한 경우에 유사한 거동이 관찰되었다.
이는 항-MenA 항체 결합에 대한 카르바 DP8의 경향을 확증하였다. 이어서, 상이한 단편을 항-deOAc MenA 혈청에 대해 시험하였다. 이러한 경우에, deOAc CPS (IC50 = 1.86 x 10-6)는 Ac 대응물과 유사하게 억제되었고, 이는 아세틸화 패턴과 독립적으로 CPS 백본에 대한 혈청의 특이성을 나타낸다. 가장 중요하게, 모든 카르바 DP4-8 유사체에 대한 인식이 관찰되었으며, 이는 이들이 모두 탈아세틸화 MenA CPS 부분과 유사하다는 것을 입증한다.
주목할 만하게, 카르바 DP8의 결합 친화도 (IC50 = 1.59 x 10-2 mM)가 DP7보다 한 자릿수 더 높았다 (IC50 =1.84 x 10-1 mM). 이들 결과에 기초하여, 담체 단백질에의 접합을 위해 DP8 및 DP6을 선택하여 마우스에서 항체를 도출하는 2종의 올리고머의 능력을 비교하였으며, 첫번째 것은 항-MenA 항체에 명확하게 결합하였고, 두번째 것은 인식을 나타내지 않았다.
실시예 6: CRM197에의 카르바MenA DP6 및 DP8의 접합.
디-N-히드록시숙신이미딜 아디페이트 링커를 이용하여, 문헌 [Adamo et al., (ACS Chem. Biol., 2012, 7, 1420-1428) 및 Adamo et al.,(J. Carbohydr. Chem., 2011, 30, 249-280)]에 의해 이전에 보고된 접합 절차를 사용하여, 카르바MenA DP6 및 DP8 화합물을 CRM197에 커플링시켰다. 이러한 방법에 의해 생산된 접합체는 항-링커 항체를 도출하지 않는 것으로 공지되어 있다 (Adamo et al., Chem. Sci., 2014, 5, 4302-4311). 트리에틸아민을 함유하는 DMSO 중에서 DP6 및 DP8 화합물의 아민을 스페이서로 처리한 후, 수득된 활성화된 올리고머를 아세톤과의 공동-침전에 의해 정제하고, 접합에 사용하였다. 완충된 pH 7.2 용액 중 (NHS 정량화에 의해 결정 시, ~40-50 활성 에스테르 : 단백질에 상응하는) 100:1 글리칸/단백질 몰비로 CRM197과 함께 밤새 인큐베이션하여, SDS page 겔 전기영동에 의해 평가 시 목적하는 신-당접합체를 수득하였으며, 이를 30 kDa MW 컷오프 막에 대한 투석에 의해 정제하였다. 각각 카르바 DP6 및 DP8로부터의 2종의 접합체에 대해 MALDI TOF MS에 의해 16.9 및 10.4의 사카라이드/단백질 몰비를 결정하였다.
카르바MenA CRM197 접합체의 면역원성.
접합된 카르바MenA DP6 및 DP8의 면역원성을 시험하기 위해, 8마리의 BALB/c 암컷 마우스의 군을 하기에 보다 상세하게 기재된 방법론에 따라 신당접합체로 면역화시켰다. avDP8.5 및 ~15를 갖는 크기조정된 MenA 폴리사카라이드로부터 이전에 기재된 바와 같이 제조된 접합체를 대조군으로서 사용하였다.
마우스는 2주 간격으로 3회 피하 (s.c.) 용량 (사카라이드 기준으로 2 μg)을 받았다. 신-당접합체는 ELISA 플레이트 상에 코팅된 동일한 생성물에 대해 접합체에 의해 도출된 혈청을 검정함으로써 관찰된 바와 같이, 제3주에 면역 반응을 유도하였다. 시험된 혈청 희석률에서, 항-CRM197 항체는 검출가능하지 않았다. 각각의 접합체는 접합된 항원을 인식하는 항체를 제공하였고, 이 인식의 특이성을 경쟁적 ELISA에 의해 확인하였다. 항-카르바MenA DP8 혈청의 결합은 항원의 다가 노출로 인해 접합된 형태보다 비접합된 옥타머에 의해 더 큰 정도로 억제되었다. 추가로, 이러한 결합은 deOAc CPS에 의해 ~25% 억제되었고, 천연 아세틸화 대응물에 의해 거의 동등하게 억제되었으며, 이는 피막 구조를 인식하는 데 있어서 생성된 항체의 잠재력을 예상한다.
아세틸 치환기가 결핍된 백본 CPS 구조와 교차-반응하는 도출된 항체의 능력을 결정하기 위해, 혈청을 인간 혈청 알부민 (HSA)에 접합된 비-아세틸화 CPS에 대해 검정하였다. 카르바MenA 접합체는 명확하게 항-deOAc CPS 면역 반응을 나타냈지만, IgG 역가는 대조군으로서 사용된 접합된 avDP8.5 및 ~15에 의해 도출된 것보다 열등하였다 (p ≤ 0.003, 도 6b). 2종의 카르바-유사체 접합체의 반응은 통계적으로 상이하지 않았지만, DP8 접합체에 대한 반응자 마우스의 수는 DP6 접합체에 대한 것보다 더 높았다.
코팅 시약으로서 아세틸화 CPS를 사용하여 ELISA를 수행하였을 때, 카르바MenA DP6 및 DP8 신당접합체에 의해 도출된 항-천연 MenA IgG 역가와 대조군 사이의 차이는 훨씬 더 명백하였다 (p < 0.0001, 도 6a).
이어서, 문헌 [Gao, Q et al., CS Chem. Biol., 2013, 8, 2561-2567; 및 Adamo, R. et al., Glycoconj. J., 2014, 31, 637-647]에 보고된 바와 같이, 풀링된 혈청에 대해 아세틸화 CPS를 발현하는 박테리아의 보체 매개된 용해를 측정함으로써 도출된 항체의 기능성을 평가하였다. 이 검정은 인간에서 수막구균 백신에 대한 보호를 예측하는 것으로 간주된다.
이는 카르바MenA DP6 및 DP8 접합체를 사용하여 생성된 반응자 마우스로부터의 풀링된 혈청에 대해 불량한 살박테리아 활성을 밝혀내었다 (각각 1024 vs 512). 인간 보체를 사용하여 혈청 살박테리아 활성 (SBA)을 측정하였을 때, 카르바 DP8-CRM197은 천연 MenA CPS avDP~15에 기초한 기준 백신에 의해 생성된 혈청의 SBA보다 유의하게 더 낮은 128의 역가를 나타냈다. 이들 결과 (도 6a에 나타냄)는 deOAc MenA CPS의 접합체에 의해 도출된 항체가 거의 기능적이지 않다는 문헌에 보고된 관찰과 일치한다 (Berry, D. S et al., Infect. Immun., 2002, 70, 3707-3713).
종합하면, 이 데이터는 카르바MenA DP8이 항-MenA CPS 항체에 결합할 수 있는 MenA CPS의 효과적이고 안정한 모방체라는 것을 밝혀내었다. 카르바MenA DP8 접합체는 인간 보체 침착을 활성화시킬 수 있는 항체를 유도한 반면, 카르바MenA DP6은 그렇지 않았으며, 이는 DP8 분자를 리드 항원으로서 강조한다. 그러나, 카르바MenA DP8 신당접합체 백신은 단지 낮은 수준의 살박테리아 항-MenA 항체를 도출하였다. MenA CPS가 위치 3 및 4에서 가변적으로 O-아세틸화된다는 것을 고려하여, 본 발명자들은 따라서 천연 폴리사카라이드와의 유사성을 추가로 증가시키고, 카르바MenA DP8 리드 분자를 무작위로 O-아세틸화함으로써 보호성 항체의 생성을 증가시키는 것을 추구하였다.
실시예 7: 당모방체 백신 후보의 최적화
카르바MenA DP8 상에 아세틸 에스테르를 도입하기 위해, 본 발명자들은 먼저 링커의 아민 기 상에 일시적 Boc 보호기를 설치하였다. 이어서, 생성된 화합물을 Ac2O/이미다졸로의 처리에 의해 조심스럽게 아세틸화하여 천연 CPS와 유사하게 75%의 아세틸화 수준에 도달하였다. 이어서, Boc-탈보호는 접합-준비된 Ac-카르바MenA DP8을 제공하였다. NMR 분석은 아세틸이 C-3 또는 C-4 위치에 존재하며, 또한 C-3/4에서 44% 정도까지의 동시 아세틸화를 갖는다는 것을 밝혀내었다. 이 화합물을 잠재적 항원으로서 시험하기 위해, 본 발명자들은 먼저 경쟁적 표면 플라즈몬 공명 (SPR) 실험에서 항-MenA CPS mAb와의 결합을 평가하였다. 이 SPR을 이전에 수행된 표준 ELISA와 비교하여 검정의 감도를 증가시키도록 최적화하였다.
디-N-히드록시숙신이미딜 아디페이트 스페이서와의 반응 및 CRM197과의 인큐베이션을 포함하는, 비-아세틸화 올리고머에 사용된 2-단계 절차를 통해, Ac-카르바MenA DP8을 CRM197에 접합시켰다. 정제된 신-당접합체를 비교자로서 avDP~15 CRM197 접합체를 사용하여 10마리의 BALB/c 암컷 마우스에 의한 면역화 연구에 사용하였다. 3회 s.c. 주사 (사카라이드 기준으로 2 μg) 후, 혈청을 수집하고, 살박테리아 IgG의 함량에 대해 분석하였다. 도 6c에 제시된 바와 같이, Ac-카르바DP8-CRM197은 그의 비-아세틸화 대응물인 카르바DP8-CRM197 (도 6a에 제시됨)과 비교하여 억제제로서 4-로그 더 높은 능력을 나타냈고, mAb에 대한 결합은 천연 avDP8 및 avDP~15 올리고머와 거의 대등하였다.
현저하게, Ac-카르바MenA DP8-CRM197 접합체는 대조군과 비교하여 더 높은 수준의 항-MenA CPS 항체를 유도하였다. 개별 마우스에서 분석된 SBA 역가는 또한 합성 항원이 MenA 박테리아의 토끼 보체 매개된 살박테리아 사멸을 기준 백신보다 통계적으로 비-열등하게 유도할 수 있었다는 것을 나타냈다 (도 6d). 풀링된 혈청에서의 분석은 인간 보체 매개된 살박테리아 활성이 또한 Ac-카르바MenA DP8과 천연 avDP~15 사이에 대등하였다는 것을 확인시켜 주었으며, 이는 안정화된 신당접합체 백신의 생성에 사용될 수 있는 MenA CPS의 진정하고 강력한 모방체로서 Ac-카르바MenA DP8을 밝혀내었다.
실시예 8: 무작위 O-아세틸화 카르바MenA DP6 및 DP8 유사체의 면역학적 평가
무작위 아세틸화를 갖는 및 갖지 않는 접합된 카르바 DP6 및 DP8 유사체의 면역원성을 시험하기 위해, 8마리의 BALB/c 암컷 마우스의 군을 신당접합체로 면역화시켰다. 접합된 크기조정된 MenA 폴리사카라이드를 대조군으로서 사용하였다. 마우스를 2주 간격으로 3회 피하 (s.c.) 용량 (사카라이드 기준으로 2 μg)으로 면역화시켰다. 항-MenA CPS 반응을 평가하였고, 데이터는 당 쇄 길이 6 (n = 6) 및 8 (n = 8) 둘 다에서, O-아세틸화 없이 카르바MenA 당 항원으로 수득된 접합체에 대한 반응 부재를 나타냈다. 반대로, 올리고머의 무작위 O-아세틸화 후에 수득된 카르바MenA 접합체는 비-아세틸화 백신과 비교하여 천연 MenA CPS에 대해 유의하게 더 높은 반응을 유도하였다 (표 4). 비교하면, O-아세틸화 백신에 의해 유도된 반응은 기준 MenA-CRM197 접합체보다 더 낮았지만, DP8에 대해서는 단지 2배만 더 낮았으며, 이는 시험된 것들 사이에 보다 우수한 반응을 제공하였다.
카르바 MenA 접합체에 사용된 백신 제제는 하기와 같았다:
324.96 μl의 AlPO4 (2 mg/ml NaCl을 함유하는 4.43 mg/ml)를 관심 접합체에 첨가하였다. 부피를 1.2 mg/ml의 AlPO4의 농도에서 pH 7.2의 PBS 완충제의 첨가에 의해 1.2 ml로 만들었다. 용액을 최종적으로 0.6 mg/ml의 AlPO4의 최종 농도에서 PBS에 의해 2.4 ml의 부피로 1:1 v/v 희석하였다. 200 μl/마우스의 제제를 주사하였다. 이 절차를 또한 원액으로부터의 MenA-CRM197의 제제화에 사용하였다.
2회 및 3회 용량 후의 ELISA 반응이 표 4에 보고된다. 볼 수 있는 바와 같이, 군 2 및 3이 본 발명에 따른 것들이다. 군 2의 경우, 상기 기재된 바와 같은 n = 6 및 무작위 아세틸화를 갖는 올리고머 접합체를 사용하였다. 군 3의 경우, 상기 기재된 바와 같은 n = 8 및 무작위 아세틸화를 갖는 올리고머 접합체를 사용하였다. 군 2 및 3 접합체의 아세틸화 수준은 약 75%였다.
표 4
도 8a 및 도 8b는 2회 및 3회 용량 후 ELISA 역가를 제공한다. p 값은 기준 천연 MenA-CRM197과 다른 군 사이의 비교를 지칭한다.
상기 언급된 본 발명의 무작위 O-아세틸화 카르바MenA DP8 유사체를 위치 3에서만 선택적으로 O-아세틸화된 카르바MenA DP8 (O-아세틸화의 백분율은 약 70%임) 및 양성 대조군으로서의 MenA 백신 (모두 CRM197에 접합됨)과 비교함으로써 하기에 기재된 바와 같이 제2 면역학적 연구를 수행하였다.
10마리의 Balb/C 마우스의 3개의 군을 상기 언급된 접합체로 면역화시켰다. 마우스를 2주 간격으로 3회 피하 (s.c.) 용량 (사카라이드 기준으로 2 μg; 200 μl/마우스의 제제)으로 면역화시켰다. 카르바 MenA 접합체에 대해 사용된 백신 제제는 제1 면역학적 연구에 대해 상기 보고된 바와 동일하였다. 항-MenA CPS 반응을 평가하였으며, 데이터 (표 5에 요약됨)는 제3 면역화 후에 기준 MenA 백신보다 3 O-아세틸화 카르바MenA DP8에 대해 약 10배 더 낮은 총 IgG 반응을 나타냈다. 반대로, 본 발명의 무작위 O-아세틸화 카르바MenA DP8 접합체는 3 O-아세틸화 접합체와 비교하여 천연 MenA CPS에 대해 유의하게 더 높은 반응을 유도하였고, 기준 MenA 백신의 것과 실질적으로 동등하였다 (도 7 참조).
표 5
도 9는 3회 용량 후, 본 발명의 선택적 3-O-아세틸화 카르바MenA DP8 및 무작위 아세틸화 카르바MenA DP8의 CRM197-접합체에 의해 도출된 인간 보체 매개된 혈청 살박테리아 역가를 보여준다. MenA-CRM197 백신은 양성 대조군이었다.
무작위 O-아세틸화 카르바MenA-CRM197 접합체에 의해 유도된 SBA 역가는 3회 용량 후에 기준 MenA 백신과 통계적으로 대등한 반면, 3 O-아세틸화 카르바MenA-CRM197 접합체는 새끼 토끼 보체 및 인간 보체 둘 다로 측정 시, 기준 백신과 비교하여 혈청에서 훨씬 더 낮은 SBA 역가를 유도하였다.
도 10 및 표 6에 보고된 결과는 항-MenA 항체가 MenA 균주에 대해 살박테리아성인 능력을 보여준다. 특히, 천연 MenA-CRM197 백신 및 2종의 O-아세틸화 합성 카르바-유사체 (군 2 (DP6) 및 군 3 (DP8))를 사용하여 수득된 백신은 또한 인간 보체를 사용하여 시험한 경우에 유의한 살박테리아 활성을 유지할 수 있었다. 본 발명에 따른 DP8 O-아세틸화 합성 카르바-유사체 (군 3)는 DP6 O-아세틸화 합성 카르바-유사체 (군 2)보다 우수한 살박테리아 활성을 나타낸다. 도 10은 토끼 (rSBA) 및 인간 (hSBA) 보체를 사용하여 수득된 2회 및 3회 용량 후 SBA 역가를 도시한다.
표 6
결론
수득된 데이터에 기초하여, 본 발명의 카르바 MenA 올리고머는 보다 안정한 버전의 MenA 백신의 개발에 사용될 수 있고, 올리고머 길이와 조합된 OAc 모이어티는 MenA 균주에 대한 기능적 면역 반응을 도출하는 데 주요한 것으로 결론지을 수 있다.
방법
신당접합체의 제조: 아미노-올리고사카라이드를 진공 건조시키고, 1:9 H2O: DMSO 용액 중에 40 mmol mL-1의 최종 아미노 기 농도로 가용화시키고, 아미노 기와 비교하여 5배 몰 과량의 트리에틸아민의 존재 하에 12배 몰 과량의 디-N-히드록시숙신이미딜 아디페이트 링커 (SIDEA)와 반응시켰다. 반응물을 완만한 교반 하에 실온에서 3시간 동안 유지하였다. 활성화된 올리고사카라이드를 4 부피의 에틸 아세테이트로 침전시키고, 이어서 펠릿을 1 mL의 동일한 용매로 10회 세척하여 정제하였다. 최종적으로, 펠릿을 진공 하에 건조시키고, 도입된 N-히드록시숙신이미드 에스테르 기의 함량을 결정하였다.
접합체를 40:1의 활성 에스테르 (AE):단백질 몰비를 사용하여 50 mM NaH2PO4 pH 7 중에서 제조하고, 완만한 교반 하에 실온에서 밤새 수행하였다. 접합체를 30 kDa의 컷오프를 사용하고 완충제로서 PBS pH 7.2를 사용하는 접선 흐름 여과 (비바스핀)에 의해 정제하였다. 접합체를 총 단백질 함량에 대해 마이크로 BCA (Smith, P.K., et al. (1985) Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal Biochem 150:76-85)에 의해 및 총 사카라이드 함량에 대해 MALDI 분석에 의해 특징화하였다.
마우스 면역화 및 ELISA 분석:
모든 마우스를 특정 병원체-무함유 조건 하에 수용하였다. 항원 제제를 멸균 조건 하에 제조하였다. 10마리의 BALB/c 마우스의 군을 제1일, 제14일 및 제28일에 면역화시키고; 제0일 (면역전), 제27일 (2회 후) 및 제42일 (3회 후)에 채혈을 수행하였다. 백신을 사카라이드 용량으로 및 사카라이드의 관점에서 용량당 2 μg/마우스의 투여량으로 투여하였다. 아주반트 AlPO4를 0.12 mg의 Al3+의 용량으로 사용하였다. 당접합체에 의해 유도된 항체 반응을 ELISA에 의해 측정하였다. 면역전 혈청을 이 분석에서 음성 대조군으로서 사용하였다. pH 8.2의 PBS 완충제 중 5 μg mL-1 폴리사카라이드 용액 100 μL/웰을 첨가하고, 이어서 4℃에서 밤새 인큐베이션함으로써 플레이트를 HSA-deOAc 또는 MenA CPS로 코팅하였다46. HSA-deOAc MenA CPS, CRM197 접합체 및 CRM197를 pH 7.2 PBS 완충제 중 2 μg mL-1의 단백질 농도로 코팅하였다. 0.05%의 트윈 20 (시그마)을 함유하는 PBS 완충제 (TPBS)로 3회 세척함으로써 플레이트로부터 코팅 용액을 제거하였다. 이어서, TPBS 중 3%의 BSA 용액 100 μl/웰을 첨가하고, 플레이트를 37℃에서 1시간 인큐베이션함으로써 차단 단계를 수행하였다. TPBS로 3회 세척함으로써 플레이트로부터 차단 용액을 제거하였다. 200 μL/웰의 사전-희석된 혈청 (면역전 음성 대조군의 경우 1:25, 참조 혈청의 경우 1:200/1:500 및 시험 혈청의 경우 1:25/1:200)을 플레이트의 각각의 칼럼의 제1 웰에 첨가하였고, 다른 웰 상에 100 μl의 TPBS를 분배하였다. 이어서, 웰에서 웰로 100 μL의 혈청 용액을 옮김으로써 각각의 칼럼을 따라 8회의 2배 연속 희석을 수행하였다. 1차 항체 희석 후에, 플레이트를 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서, TPBS로 3회 세척하고, 100 μL/웰의 2차 항체 알칼리성 포스페이트 접합체 (항 마우스 IgG 1:10000, 시그마-알드리치)의 TPBS 용액을 첨가하고, 플레이트를 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. TPBS로 3회 더 세척한 후, 0.5 M 디-에탄올아민 완충제 pH 9.6 중 1 mg mL-1의 p-NPP (시그마) 100 μL/웰을 첨가하였다. 최종적으로, 플레이트를 실온에서 30분 동안 인큐베이션하고, 플레이트 판독기 스펙트라맥스 190을 사용하여 405 nm에서 판독하였다. 혈청 역가를 컷-오프 OD = 1에 상응하는 혈청 희석률의 역수로서 표현하였다.
각각의 면역화 군을 단일 마우스 역가의 기하 평균 (GMT)과 95% CI로 나타냈다. 그래프패드 프리즘(GraphPad Prism) 7 소프트웨어에 의해 통계 및 그래프 분석을 수행하였다.
시험관내 살박테리아 검정:
시험관내 살박테리아 검정으로 엔. 메닌기티디스의 보체-매개 용해를 측정함으로써 백신 면역화에 의해 유도된 기능적 항체를 분석하였다 (Jackson, L. A et al., Clin. Infect. Dis., 2009, 49, e1-10). 새끼 토끼 보체의 상업적 로트 (필 프리즈 바이올로지칼(Peel Freeze Biological), cod. 31061)를 rSBA에 대한 활성 보체의 공급원으로서 사용하고, 한편 혈장을 hSBA의 보체 공급원으로서 사용하였다.
엔. 메닌기티디스 균주를 초콜릿 한천 플레이트 상에서 5% CO2 하에 37℃에서 밤새 성장시켰다. 콜로니를 0.25% 글루코스를 함유하는 뮐러-힌톤(Mueller-Hinton) 브로쓰에 접종하여 OD600 0.05-0.08에 도달하도록 하고, 진탕시키면서 37℃에서 인큐베이션하였다. 박테리아 현탁액이 OD600 0.25-0.27에 도달하였을 때, 박테리아를 검정 완충제 (1% BSA 및 0.1% 글루코스를 함유하는 DPBS) 중에 작업 희석률 (약 104 CFU mL-1)로 희석하였다. 각각의 웰 내의 총 부피는 25 μL의 시험 혈청의 연속 2배 희석물, 12.5 μL의 작업 희석물에서의 박테리아 및 12.5 μL의 보체 공급원을 함유한 50 μL였다. 시험된 혈청을 풀링하고, 56℃에서 30분 동안 열-불활성화시켰다. 음성 대조군은 시험 혈청 없이 보체 혈청과 함께 및 시험 혈청과 열-불활성화된 보체와 함께 개별적으로 인큐베이션된 박테리아를 포함하였다. 새끼 토끼 보체의 첨가 직후에, 음성 대조군을 기울기(tilt) 방법을 사용하여 뮐러-힌톤 한천 플레이트 상에 플레이팅하였다 (시간 0). 마이크로타이터 플레이트를 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션한 다음, 각각의 샘플을 뮐러-힌톤 한천 플레이트 상에 이중으로 스폿팅하면서 대조군을 기울기 방법을 사용하여 플레이팅하였다 (시간 1). 한천 플레이트를 37℃에서 밤새 인큐베이션하고, 시간 0 및 시간 1에 상응하는 콜로니 (생존 박테리아)를 카운팅하였다. 혈청 살박테리아 역가를 시간 0에서의 mL당 대조군 콜로니 형성 단위 (CFU)와 비교하여, 반응 혼합물에서의 박테리아의 60분 인큐베이션 후 mL당 CFU의 50% 감소를 유발하는 혈청 희석률로 정의하였다. 전형적으로, 시험 풀링 또는 개별 뮤린 혈청 없이 보체의 존재 하에 인큐베이션된 박테리아 (음성 대조군)는 60분 인큐베이션 시간 동안 CFU mL-1의 150 내지 200% 증가를 나타냈다. 수막구균 혈청형 A에 대한 참조 균주는 F8238이었다 (Mak, P. A., Santos, G. F., Masterman, K. A., Janes, J., Wacknov, B., Vienken, K., Giuliani, M., Herman, A. E., Cooke, M., Mbow, M. L., Donnelly, J., Clin. Vacc. Immunol., 2011, 18, 1252-1260.).
통계적 방법
ELISA로부터 수득된 데이터에 대해 비-파라미터 t 검정을 수행하였고, 그래프패드 소프트웨어를 적용하여 2개의 관심 군 (즉, CRM197-MenA avDP15 및 CRM197-MenA DP6OAc 또는 DP8OAc) 사이의 순위를 비교하는 만-휘트니 검정을 수행하였다. ELISA 데이터를 기하 평균과 95%의 CI로서 보고하였다. 추가로, 고정 효과로서 군 (4 및 5를 제외한 이들 모두), 시간 및 군과 시간 상호작용을 포함한 분산 분석 (ANOVA) 모델을 log10 항체 역가 상에 피팅하였다. 군들 사이에 동일한 분산을 가정하지 않았기 때문에 이질적 분산 모델을 사용하였다. 각각의 종점에 대해, 이 모델을 사용하여 군 기하 평균과 그의 95% CI, 뿐만 아니라 기하 평균 비 (O-아세틸화 제제 대 기준) 및 95% CI를 추정하였다. 상이하게, SBA 데이터에 대해, 각각의 시점 (혈청의 풀)에서 각각의 군에 대한 단일 관찰이 존재하기 때문에, 단지 그래프 분석만을 수행하였다.
최종 접합체에서 가수분해된 MenA 및 카르바MenA 올리고머의 정량화를 위한 프로토콜
HPAEC-PAD를 사용하여 본 발명의 MenA 및 카르바MenA 접합체로부터 시간 경과에 따라 방출된 단량체의 양을 정량화하였다. 샘플을 건조 오븐에서 110℃에서 2시간 동안 최종 농도 6M의 HCl로 가수분해함으로써 보고된 역가를 수득하였다. 인큐베이션 후, 샘플을 스피드백 시스템에서 건조시킨 다음, 물로 재용해시키고, 0.45μm로 여과하였다. 카르바MenA DP7을 사용하여 0.5-5.0 μg/mL 범위에서 구축된 표준 곡선을 사용하여 정량화를 수행하고, NMR에 의해 정량화하고, 샘플로서 처리하였다. 가드가 있는 카르보팩 PA1 칼럼이 장착된 ICS5000 시스템 (디오넥스-테모 피셔(Dionex-Themo Fisher)) 상에서 분석을 수행하였다. 1.0 mL/분으로 100mM 수산화나트륨의 존재 하에 아세트산나트륨의 구배로 용리를 수행하고, 펄스 적분 전류측정법으로 탄수화물에 대해 사중파 형태를 사용함으로써 피크를 검출하였다. 결과를 크로멜레온(Chromeleon)™ 7.2 크로마토그래피 데이터 시스템 (CDS) 소프트웨어로 정교화하였다.
실시예 9: ABCWY 콤보 백신 대 카르바MenA-BCWY 콤보 백신의 비교
MenBCWY 항원과 조합된 MenA카르바 (무작위 OAc) 반응을 연구하기 위해, Balb/C 마우스의 4개의 군을 하기 표 7에 나타낸 백신 제제로 면역화시켰다. 마우스를 2주 간격으로 (제1일, 제14일 및 제28일) 3회 피하 (s.c.) 용량 (사카라이드 기준으로 2 μg; 200 μl/마우스의 제제)으로 면역화시키고, 제0일, 제27일 및 제42일에 혈액을 채취하였다.
카르바 MenA 접합체에 대해 사용된 백신 제제는 제1 면역학적 연구에 대해 상기 보고된 바와 동일하였다.
*BNG는 조성물의 Men B 항원 성분이 서열식별번호: 35로서 상기 확인된 231.13 융합 단백질에 상응하는 추가의 fHbp 융합 단백질과 함께 벡스세로 백신 항원으로 구성되었다는 것을 나타낸다.
표 7
군 1 및 2에 고체 (동결건조) MenA 성분을 포함하는 백신 제제를 투여하였다. 군 3 및 4에 완전 액체 제제를 투여하였다. 명확성을 위해, MenA카르바는 카르바MenA에 상응한다.
3회 후 단일 및 풀링된 혈청에 대해 및 2회 후 풀링된 혈청에 대해 HT-ELISA에 의해 총 IgG를 측정하였다. 도 11에 제시된 바와 같이, 카르바MenA에 의해 유도된 IgG 역가는 BCWY 항원과 조합된 MenA와 대등하다.
중요하게, 도 11의 제1 칼럼에 제시된 데이터 (MenABNGCWY)는 액체 BCWY 성분과 혼합된 동결건조 Men A 성분에 관한 것인 반면, MenA카르바 (무작위OAc) + MenBNGCWY에 대한 데이터는 완전 액체 제제 (동결건조 MenA 성분 부재)이다.
기능적 항체 반응을 rSBA 및 hSBA 둘 다에 의해 측정하였으며, 도 12에 제시된 바와 같이, BNGCWY와 조합된 카르바MenA에 의해 유도된 항체 기능성은 기준 조합 ABNGCWY와 대등하다.
따라서, 본 발명에 따른 면역원성 조성물은 투여 전에 BCWY 성분과의 재구성을 요구하는 동결건조 MenA 성분이 혼입된 기준 5가 조성물의 면역학적 효능을 포함하지 않으면서 완전 액체 제제에서 효과적이라는 이점을 갖는다.
실시예 10: 래트에서의 ABCWY 콤보 백신 대 카르바MenA-BCWY 콤보 백신의 비교
방법
신당접합체의 제조
카르바MenA DP8 및 DP10 상에 아세틸 에스테르를 도입하기 위해, 본 발명자들은 먼저 링커의 아민 기 상에 일시적 Boc 보호기를 설치하였다. 이어서, 생성된 화합물을 Ac2O/이미다졸로의 처리에 의해 조심스럽게 아세틸화하여 천연 CPS와 유사하게 75%의 아세틸화 수준에 도달하였다. 이어서, Boc-탈보호는 접합-준비된 Ac-카르바MenA DP10 및 Ac-카르바MenA DP10을 제공하였다.
아미노-올리고사카라이드를 진공 건조시키고, 1:9 H2O: DMSO 용액 중에 40 mmol mL-1의 최종 아미노 기 농도로 가용화시키고, 아미노 기와 비교하여 5배 몰 과량의 트리에틸아민의 존재 하에 12배 몰 과량의 디-N-히드록시숙신이미딜 아디페이트 링커 (SIDEA)와 반응시켰다. 반응물을 완만한 교반 하에 실온에서 3시간 동안 유지하였다. 활성화된 올리고사카라이드를 4 부피의 에틸 아세테이트로 침전시키고, 이어서 펠릿을 1 mL의 동일한 용매로 10회 세척하여 정제하였다. 최종적으로, 펠릿을 진공 하에 건조시키고, 도입된 N-히드록시숙신이미드 에스테르 기의 함량을 결정하였다.
접합체를 하기 표에 보고된 활성 에스테르 (AE):단백질 몰비를 사용하여 100 mM NaH2PO4 pH 7에서 제조하였다 (표 8):
표 8
반응을 완만한 교반 하에 실온에서 밤새 수행하였다. 접합체를 30 kDa의 컷오프를 사용하고 완충제로서 10 mM NaH2PO4 pH 7.2를 사용하는 접선 흐름 여과 (비바스핀)에 의해 정제하였다. 접합체를 총 단백질 함량에 대해 마이크로 BCA (Smith, P.K., et al. (1985). Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal Biochem 150:76-85)에 의해, 총 사카라이드 함량에 대해 HPAEC-PAD 분석 (표 9)에 의해, SDS-Page 및 웨스턴 블롯 (도 13)에 의해 특징화하였다.
표 9
래트 면역화:
모든 래트를 특정 병원체-무함유 조건 하에 수용하였다. 항원 제제를 멸균 조건 하에 제조하였다. CD(SD) 스프라그-돌리 10마리의 래트의 군을 제1일, 제22일 및 제36일에 면역화하고; 제0일 (면역전) 및 제49일 (3회 후)에 채혈을 수행하였다. 백신을 ACWY-7B 인간 용량의 1/5, 즉 1:5 희석 (1:5 dil)의 투여량 (1/5 HD)으로 근육내로 (IM) 투여하였다. 아주반트 AlOH를 3 mg/ml의 용량으로 사용하였다.
표 10
MenACWY 래트 ELISA (통상적인 HT-ELISA):
플레이트를 PBS 1x pH 8.2 중 5μg/ml의 각각의 폴리사카라이드 (A, C, W135, Y)의 용액으로 코팅하고, +2-8℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 세척 (PBS1x 트윈20) 후, 플레이트를 200 μl의 스마트블록 (칸도르 바이오사이언스(Candor Bioscience))의 첨가에 의해 차단하고, 실온에서 2시간 인큐베이션하였다. 세척한 후, 플레이트를 액체 플레이트 실러 (칸도르 바이오사이언스)로 밀봉하고, 실온에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 최종적으로 흡인하고, 2-8℃에서 냉장고에 저장하였다.
샘플을 PBS 1x BSA 1% pH 7.4의 용액 중에 출발 희석률 1:100 (MenA 및 MenY), 1:500 (MenC) 및 1:200 MenW135로부터 이어서 추가로 5회의 2배 연속 희석으로 희석하였다.
이어서, 플레이트를 30℃에서 90분 동안 인큐베이션한 다음, 상기 기재된 바와 같이 세척하고, 100μl의 2차 항체 (항-래트 총 IgG 알칼리성 포스파타제 접합체)의 용액을 첨가하였다. 이어서, 플레이트를 30℃에서 60분 동안 인큐베이션하였다.
세척한 후, 플레이트에 100μl의 기질 (파라-니트로페닐 포스페이트)을 첨가하고, 30℃에서 30' 인큐베이션 후 405nm에서 판독하였다.
벡스세로+NG 래트 ELISA (통상적인 HT-ELISA):
플레이트를 PBS 1x 중 0.15μM의 재조합 단백질 (287-953, 936-741, 961c, 741-231.16) 및 OMV-NZ에 대해 트리스 100mM pH 9.0 중 2μg/ml의 용액으로 코팅하고, +2-8℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 세척 (PBS1x 트윈20) 후, 플레이트를 200 μl의 스마트블록 (칸도르 바이오사이언스)의 첨가에 의해 차단하고, 실온에서 2시간 인큐베이션하였다. 세척한 후, 플레이트를 액체 플레이트 실러 (칸도르 바이오사이언스)로 밀봉하고, 실온에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 최종적으로 흡인하고, 2-8℃에서 냉장고에 저장하였다.
샘플을 PBS 1x BSA 1% pH 7.4의 용액 중에 출발 희석률 1:1000 (936-741), 1:500 (287-953, 961c 및 OMV-NZ) 및 1:1000 (741-231.13)으로부터 이어서 추가로 5회의 2배 연속 희석으로 희석하였다.
이어서, 플레이트를 37℃에서 90분 동안 인큐베이션한 다음, 상기 기재된 바와 같이 세척하고, 100μl의 2차 항체 (항-래트 총 IgG 알칼리성 포스파타제 접합체)의 용액을 첨가하였다. 이어서, 플레이트를 37℃에서 60분 동안 인큐베이션하였다.
세척한 후, 플레이트에 100μl의 기질 (파라-니트로페닐 포스페이트)을 첨가하고, 37℃에서 25-30' 인큐베이션 후 405nm에서 판독하였다.
3회 후 단일 혈청에 대해 HT-ELISA에 의해 총 IgG를 측정하였다. 도 14a에 제시된 바와 같이, Men A PS에 대한 IgG 역가는 ABNGCWY로 또는 BNGCWY와 조합된 카르바MenA로 면역화된 래트 혈청에서 대등하고, MenA-CRM으로 면역화된 래트에서보다 카르바MenA로 면역화된 래트에서 더 높다.
도 14b에서는, ABNGCWY로 또는 BNGCWY와 조합된 카르바MenA로 면역화된 래트 혈청에서 측정 시 Men CWY PS에 대해 대등한 IgG 역가가 수득된 것으로 제시된다.
도 14c에서는, ABNGCWY로 또는 BNGCWY와 조합된 카르바MenA로 면역화된 래트 혈청에서 측정 시 벡스세로 항원 및 231.13_NB 융합 단백질에 대해 대등한 IgG 역가가 수득된 것으로 제시된다.
카르바-MenA 제제는 MenA-CRM 군보다 우수한 항-PS MenA IgG 역가를 유도하였다. MenCWY_7B-카르바 MenA와 표준 5가 제제의 비교에서 유의한 결과는 나타나지 않았다.
시험관내 살박테리아 검정:
제1일에, 수막구균 박테리아를 모 배양물로부터의 단리를 위해 초콜릿 한천 폴리비텍스 플레이트 (비오메리유(BIOMERIEUX) 43101) 상에 스트리킹하고, 5% CO2 하에 37℃에서 16 (±2)시간 동안 인큐베이션하였다. 제2일에, 박테리아를 한천 플레이트로부터 수집하고, 뮐러 힌톤 배지 중에 광학 밀도 (OD600) 0.05로 재현탁시키고, 검정에 사용하기 전 OD 0.25 (109 CFU/ml에 상응함)까지 135 rpm에서 진탕하면서 5% CO2 하에 37%에서 성장시켰다.
이어서, 박테리아를 5U/mL 헤파린, 10 mM MgCl2 및 1.5 mM CaCl2를 함유하는 반응 완충제 (둘베코 염수 포스페이트 완충제, 0.1% 글루코스 및 1% 소 혈청 알부민) 중에 105 CFU/ml로 희석하였다.
SBA를 96 웰 마이크로플레이트에서 20μl의 작업 완충제 중에 2배 연속 희석된 시험 혈청, 10μl의 박테리아 (3/5 x 104 CFU/ml) 및 10μl의 활성 혈장 보체 (혈장을 -80℃에서 비축하고, 사용 직전에 해동함)을 혼합함으로써 웰당 40μl의 최종 부피로 실행시켰다. 사전 동의 하에 지원자 공여자로부터 수득된 인간 혈장을, 단지 50%의 농도로 검정에 첨가되었을 때 특정한 수막구균 균주의 콜로니-형성 단위의 수를 유의하게 감소시키지 않는 경우에만 그 균주를 갖는 보체 공급원으로서 사용하기 위해 선택하였다.
살박테리아 검정은 2개의 내부 대조군을 함유한다:
1) 항체의 부재 하에 보체 단독에 의한 박테리아 사멸을 평가하기 위한 보체 의존성 대조군; 이들 반응은 박테리아 및 활성 보체만을 포함한다.
2) 열 불활성화된 보체의 존재 하에 혈청 단독에 의한 사멸을 평가하기 위한 보체 비의존성 대조군; 이들 반응은 박테리아, 혈청 샘플 및 열 불활성화된 보체를 함유한다.
반응 혼합물을 5% CO2 하에 37℃에서 60분 동안 (T60) 인큐베이션하였다.
T60에서, 100 μl의 용융된 TSB/0.7% 한천 배지를 각각의 웰에 첨가하고, 10분 동안 고체화되도록 하였다. 50 μl의 용융된 한천 배지의 제2 층을 각각의 웰에 첨가하고, 추가로 10분 동안 고체화되도록 하였다. 이어서, 플레이트를 커버로 덮어 37℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 5% CO2 하에 37℃에서 밤새 후, 마이크로플레이트를 악시오랩(AxioLab) 시스템 (마이크로테크닉스(MicroTechniX) BVBA) 내로 로딩하고, 각각의 웰의 영상을 획득하고, 미가공 및 분석된 사진의 파일셰어에 자동으로 저장하였다. 영상 분석을 악시오비전(AxioVision) Rel. 4.8 4.8.2에 의해 수행하고, 콜로니 카운팅을 자동으로 수득하였다. 살박테리아 역가 (hSBA 역가)를 혈청이 없는 대조군 반응물에 존재하는 콜로니 형성 단위 (CFU)의 수에 비해 CFU의 적어도 50% 감소를 유발하는 혈청 희석률의 역수로서 결정하였다. 통계적 분석을 위해 내삽된 SBA 역가를 사용하였다.
기능적 항체 반응을 hSBA에 의해 측정하였으며, 도 15a, 도 15b, 도 15c에 제시된 바와 같이, BNGCWY와 조합된 카르바MenA에 의해 유도된 항체 기능성은 기준 조합 ABNGCWY와 대등하고, 추가로 대등한 hSBA 역가가 또한 다른 CWY 항원 및 벡스세로에 의한 단백질에 의해 유도되었다 (도 15b 및 도 15c).
카르바-MenA 제제는 MenA-CRM과 비교하였을 때 MenA 3125 균주에 대해 열등한 hSBA 역가를 나타냈다. MenACWY_7B fHbp 1X와 MenCWY_7B-카르바MenA 제제 사이에는 어떠한 차이도 검출되지 않았다.
MenACWY-7B fHbp 1X 제제는 MenCWY_7B-카르바MenA 제제와 비교하였을 때 MenA F8238 균주에 대해 우수한 hSBA 역가를 나타냈다. MenA-CRM과 카르바 MenA 제제 사이에는 어떠한 차이도 주목되지 않았다.
본 발명의 실시양태는 후속 넘버링된 단락에서 추가로 기재된다:
1. 대상체에게 투여된 후, 네이세리아 메닌기티디스(Neisseria meningitidis)의 혈청군 A, B, C, W135 및 Y에 대해 살박테리아성인 면역 반응을 유도할 수 있는 수성 면역원성 조성물로서, 여기서 조성물은
i. 접합된 혈청군 A 항원;
ii. 접합된 혈청군 C 항원;
iii. 접합된 혈청군 W135 항원;
iv. 접합된 혈청군 Y 항원; 및
v. 혈청군 B로부터의 1종 이상의 폴리펩티드 항원
을 포함하며, 여기서 (ii), (iii) 및 (iv)는 피막 사카라이드 항원이고, 여기서 (i)은 혈청군 A 피막 사카라이드의 합성 유사체인
수성 면역원성 조성물.
2. 제1 단락에 있어서, 접합된 혈청군 A 항원이 올리고머 접합체이고, 화학식 (Ia) 또는 (Ib)의 올리고머를 포함하며:
여기서
n은 ≥ 6이고;
R은 H 또는 -P(O)(OR")2이고, 여기서 R"는 H 또는 제약상 허용되는 포스페이트 반대이온이고;
R'는 H 또는 제약상 허용되는 포스페이트 반대이온이고;
Rx는 H 또는 -C(O)CH3이고, 각각의 반복 단위에서 동일하거나 상이할 수 있고;
Ry는 H 또는 -C(O)CH3이고, 각각의 반복 단위에서 동일하거나 상이할 수 있고;
여기서 적어도 1개의 반복 단위에서 Rx 또는 Ry 중 적어도 하나는 -C(O)CH3이고;
Az는 -NH(CO)R1, -N(R1)2 및 -N3으로 이루어진 군으로부터 선택된 아자 치환기이고, 여기서 R1은 독립적으로 H, 선형 또는 분지형 C1-C6-알킬 및 선형 또는 분지형 C1-C6-할로알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고;
Z는 (i) 보호기,
(ii) 단백질에의 접합을 위한 관능성 링커,
또는 (iii) 선형 또는 분지형 C1-C6 알킬, 임의로 치환된 페닐, -C(O)Y, 또는 선형 또는 분지형 C1-C6-알킬-X이고,
여기서 Y는 H, 선형 또는 분지형 C1-C6-알킬 또는 보호기이고,
여기서 X는 -NH2, -N3, -C≡CH, -CH=CH2, -SH 또는 -S-C≡N인
조성물.
3. 제1 단락 또는 제2 단락에 있어서, 접합된 혈청군 A 항원이 화학식 (IIa) 또는 (IIb), 바람직하게는 화학식 (IIa)의 접합체이며:
여기서 올리고머에서
n은 ≥6이고;
R은 H 또는 -P(O)(OR")2이고, 여기서 R"는 H 또는 제약상 허용되는 포스페이트 반대이온이고;
R'는 H 또는 제약상 허용되는 포스페이트 반대이온이고;
Rx는 H 또는 -C(O)CH3이고, 각각의 반복 단위에서 동일하거나 상이할 수 있고;
Ry는 H 또는 -C(O)CH3이고, 각각의 반복 단위에서 동일하거나 상이할 수 있고;
여기서 적어도 1개의 반복 단위에서 Rx 또는 Ry 중 적어도 하나는 -C(O)CH3이고;
Az는 -NH(CO)R1, -N(R1)2 및 -N3으로 이루어진 군으로부터 선택된 아자 치환기이고, 여기서 R1은 독립적으로 H, 선형 또는 분지형 C1-C6-알킬 및 선형 또는 분지형 C1-C6-할로알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고;
Z는 (i) 관능성 링커 또는 결합이고;
P는 단백질인
조성물.
4. 제2 단락 또는 제3 단락에 있어서, 올리고머에서 적어도 1개의 반복 단위에서 Rx가 -C(O)CH3인 조성물.
5. 제2 단락 내지 제4 단락 중 어느 한 단락에 있어서, 올리고머에서 n이 6 내지 30인 조성물.
6. 제2 단락 내지 제4 단락 중 어느 한 단락에 있어서, 올리고머에서 n이 8 내지 20인 조성물.
7. 제2 단락 내지 제4 단락 중 어느 한 단락에 있어서, 올리고머에서 n이 8 내지 15인 조성물.
8. 제2 단락 내지 제4 단락 중 어느 한 단락에 있어서, 올리고머에서 n이 8 또는 10인 조성물.
9. 제2 단락 내지 제8 단락 중 어느 한 단락에 있어서, 올리고머에서 Az가 -NHC(O)CH3인 조성물.
10. 제2 단락 내지 제9 단락 중 어느 한 단락에 있어서, 올리고머에서 적어도 1개의 동일한 반복 단위에서 Rx 및 Ry가 둘 다 -C(O)CH3인 조성물.
11. 제2 단락 내지 제10 단락 중 어느 한 단락에 있어서, 올리고머에서 적어도 1개의 동일한 반복 단위에서 Rx가 H이고 Ry가 -C(O)CH3인 조성물.
12. 제2 단락 내지 제11 단락 중 어느 한 단락에 있어서, 올리고머에서 적어도 1개의 동일한 반복 단위에서 Rx가 -C(O)CH3이고 Ry가 H인 조성물.
13. 제2 단락 내지 제12 단락 중 어느 한 단락에 있어서, 올리고머에서 적어도 1개의 동일한 반복 단위에서 Rx 및 Ry가 둘 다 -C(O)CH3인 조성물.
14. 제2 단락 내지 제13 단락 중 어느 한 단락에 있어서, 올리고머에서 적어도 1개의 동일한 반복 단위에서 Rx가 H이고 Ry가 -C(O)CH3이고, 적어도 1개의 동일한 반복 단위에서 Rx가 -C(O)CH3이고 Ry가 H인 조성물.
15. 제2 단락 내지 제14 단락 중 어느 한 단락에 있어서, 올리고머에서 적어도 1개의 동일한 반복 단위에서 Rx가 H이고 Ry가 -C(O)CH3이고, 적어도 1개의 동일한 반복 단위에서 Rx가 -C(O)CH3이고 Ry가 H이고, 적어도 1개의 동일한 반복 단위에서 Rx 및 Ry가 둘 다 -C(O)CH3인 조성물.
16. 제2 단락 내지 제15 단락 중 어느 한 단락에 있어서, 올리고머의 반복 단위의 40 내지 50%에서 Rx 및 Ry가 둘 다 -C(O)CH3인 조성물.
17. 제16 단락에 있어서, 올리고머의 나머지 반복 단위의 10 내지 20%에서 Rx 또는 Ry 중 하나가 -C(O)CH3이고, 올리고머에서 반복 단위의 나머지는 Rx = Ry = H인 조성물.
18. 제2 단락 내지 제17 단락 중 어느 한 단락에 있어서, 올리고머에서 Rx 및 Ry의 약 50 내지 90%가 -C(O)CH3인 조성물.
19. 제2 단락 내지 제18 단락 중 어느 한 단락에 있어서, 각각의 반복 단위에서 Rx가 H이고, 올리고머에서 Ry의 적어도 80%가 -C(O)CH3인 조성물.
20. 제2 단락 내지 제19 단락 중 어느 한 단락에 있어서, P가 디프테리아 톡소이드 (DT), 파상풍 톡소이드 (TT), CRM197, 이. 콜라이 ST 및 슈도모나스 아에루기노사 외독소 (rEPA)로부터 선택된 불활성화된 박테리아 독소이거나, 또는 P가 폴리아미노산, 예컨대 폴리(리신:글루탐산)이거나, 또는 P가 B형 간염 바이러스 코어 단백질 또는 SPR96-2021인 조성물.
21. 제2 단락 내지 제20 단락 중 어느 한 단락에 있어서, P가 CRM197인 조성물.
22. 제2 단락 내지 제21 단락 중 어느 한 단락에 있어서, Z가 하기 화학식을 갖는 링커이며:
*-(CH2)p-NH(CO)-(CH2)p-(X-(CH2)p)p-C(O)-*
여기서 *는 부착 지점을 나타내고, 여기서
p는 독립적으로 1 내지 10으로부터 선택되고;
X는 -O-, -S- 및 -NH-로부터 선택된 것인
조성물.
23. 제2 단락 내지 제21 단락 중 어느 한 단락에 있어서, Z가 하기 화학식을 갖는 링커이며:
*-(CH2)m-NHC(O)-(CH2)m-C(O)-*
여기서 m은 독립적으로 1 내지 10으로부터 선택된 것인
조성물.
24. 제2 단락 내지 제23 단락 중 어느 한 단락에 있어서, 올리고머 접합체가 하기 구조를 가지며:
여기서 n, Az, R, Rx 및 Ry는 제2 단락 내지 제19 단락 중 어느 한 단락에 정의된 바와 같은 것인
조성물.
25. 상기 단락 중 어느 한 단락에 있어서, 접합된 혈청군 C, W135 및 Y 항원이 디프테리아 톡소이드, 파상풍 톡소이드, 에이치. 인플루엔자에 단백질 D 및 CRM197로부터 선택된 담체 단백질에 접합된 것인 조성물.
26. 제25 단락에 있어서, 혈청군 C, W135 및 Y 항원이 CRM197에 접합된 것인 조성물.
27. 상기 단락 중 어느 한 단락에 있어서, 혈청군 B로부터의 1종 이상의 폴리펩티드 항원이 수막구균 NHBA 항원, 수막구균 NadA 항원, 수막구균 fHbp 항원 및 수막구균 외막 소포 (OMV) 중 1종 이상을 포함하는 것인 조성물.
28. 제27 단락에 있어서, 서열식별번호: 2에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 돌연변이체 v1.13 수막구균 fHbp 폴리펩티드를 포함하며, 여기서 아미노산 서열은 서열식별번호: 2의 잔기 S216, E211 또는 E232 중 적어도 1개에서의 치환 돌연변이를 포함하는 것인 조성물.
29. 제28 단락에 있어서, 아미노산 서열이 치환 S216R, E211A 및 E232A 중 적어도 1개 이상에 의해 서열식별번호: 2와 상이한 것인 조성물.
30. 제29 단락에 있어서, 아미노산 서열이 하기:
(i) E211A 및 S216R, 및
(ii) E211A 및 E232A
로부터 선택된 다수의 잔기에서의 치환을 포함하는 것인 조성물.
31. 제28 단락 내지 제30 단락 중 어느 한 단락에 있어서, v1.13 수막구균 fHbp 폴리펩티드가 서열식별번호: 3 또는 서열식별번호: 4의 아미노산 서열을 갖는 것인 조성물.
32. 제27 단락에 있어서, v1, v2 및 v3 수막구균 fHbp 폴리펩티드를 N-말단에서 C-말단으로 v2-v3-v1 순서로 포함하는 융합 폴리펩티드를 포함하며, 여기서 v1 fHbp 폴리펩티드는 제28 단락 내지 제31 단락 중 어느 한 단락에 정의된 바와 같은 돌연변이체 v1.13 fHbp 폴리펩티드인 조성물.
33. 제32 단락에 있어서,
(a) v2 fHbp 폴리펩티드가 서열식별번호: 12에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 돌연변이체 v2 fHbp 폴리펩티드이며, 여기서 v2 fHbp 아미노산 서열은 서열식별번호: 12의 잔기 S32 및 L123에서의 치환 돌연변이를 포함하고, 여기서 치환은 S32V 및 L123R이고;
(b) v3 fHbp 폴리펩티드가 서열식별번호: 15에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 돌연변이체 v3 fHbp 폴리펩티드이며, 여기서 v3 fHbp 아미노산 서열은 서열식별번호: 15의 잔기 S32 및 L126에서의 치환 돌연변이를 포함하고, 여기서 치환은 S32V 및 L126R인
조성물.
34. 제33 단락에 있어서,
(a) v2 fHbp 폴리펩티드가 서열식별번호: 16의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어지고/거나;
(b) v3 fHbp 폴리펩티드가 서열식별번호: 17의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진 것인
조성물.
35. 제32 단락 내지 제34 단락 중 어느 한 단락에 있어서, v2와 v3 fHbp 아미노산 서열 및 v3과 v1 fHbp 아미노산 서열이 글리신-세린 링커에 의해 연결되고, 바람직하게는 여기서 v2 서열이 서열식별번호: 18에 상응하는 N-말단 리더 서열을 갖는 것인 조성물.
36. 제32 단락 내지 제35 단락 중 어느 한 단락에 있어서, fHbp 융합 폴리펩티드가 서열식별번호: 19-23 중 어느 것의 아미노산 서열을 포함하는 것인 조성물.
37. 제36 단락에 있어서, fHbp 융합 폴리펩티드가 서열식별번호: 34의 임의적인 N-말단 아미노산 서열을 추가적으로 포함하는 것인 조성물.
38. 제36 단락에 있어서, fHbp 융합 폴리펩티드가 서열식별번호: 35의 서열을 갖는 것인 조성물.
39. 제28 단락 내지 제36 단락 중 어느 한 단락에 있어서, 수막구균 NHBA 항원, 수막구균 NadA 항원, 수막구균 fHbp 항원 및 수막구균 외막 소포 (OMV)를 추가로 포함하는 조성물.
40. 상기 단락 중 어느 한 단락에 있어서, 아주반트를 추가로 포함하는 조성물.
41. 제40 단락에 있어서, 아주반트가 수산화알루미늄인 조성물.
42. 상기 단락 중 어느 한 단락에 있어서, 벡스세로(BEXSERO)를 포함하는 조성물.
43. 상기 단락 중 어느 한 단락에 있어서, 단일 기밀 용기, 바람직하게는 바이알 또는 시린지에 포장된 조성물.
44. 제1 단락 내지 제43 단락 중 어느 한 단락에 따른 면역원성 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 포유동물에서 면역 반응을 일으키는 방법으로서, 임의로 여기서 포유동물은 인간인, 포유동물에서 면역 반응을 일으키는 방법.
45. 엔. 메닌기티디스에 의해 유발된 감염 및/또는 질환의 치료 또는 예방을 필요로 하는 포유동물에게 면역학적 유효량의 제1 단락 내지 제43 단락 중 어느 한 단락에 따른 조성물을 투여하는 것을 포함하며, 임의로 여기서 포유동물은 인간인, 상기 포유동물에서 엔. 메닌기티디스에 의해 유발된 감염 및/또는 질환을 치료 또는 예방하는 방법.
46. 제1 단락 내지 제43 단락 중 어느 한 단락에 있어서, 의약에 사용하기 위한 면역원성 조성물.
47. 제1 단락 내지 제43 단락 중 어느 한 단락에 있어서, 백신으로서 사용하기 위한 면역원성 조성물.
48. 제1 단락 내지 제43 단락 중 어느 한 단락에 있어서, 포유동물에서 면역 반응을 일으키는 방법에 사용하기 위한 것이며, 임의로 여기서 포유동물은 인간인 면역원성 조성물.
49. 제1 단락 내지 제43 단락 중 어느 한 단락에 있어서, 엔. 메닌기티디스 감염에 대해 포유동물을 면역화시키는 데 사용하기 위한 것이며, 임의로 여기서 포유동물은 인간인 조성물.
50. 엔. 메닌기티디스에 의해 유발된 감염 및/또는 질환의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 의약의 제조에 있어서의 제1 단락 내지 제43 단락 중 어느 한 단락에 정의된 바와 같은 조성물의 용도.
SEQUENCE LISTING
<110> GlaxoSmithKline Biologicals SA
<120> Vaccine Composition
<130> VB66961 WO
<150> GB 2013262.7
<151> 2020-08-25
<160> 35
<170> PatentIn version 3.5
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<211> 255
<212> PRT
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Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Gly Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro
1 5 10 15
Leu Asp His Lys Asp Lys Ser Leu Gln Ser Leu Thr Leu Asp Gln Val
20 25 30
Val Arg Lys Asn Glu Lys Leu Lys Leu Ala Ala Gln Gly Ala Glu Lys
35 40 45
Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser Leu Asn Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp
50 55 60
Lys Val Ser Phe Asp Phe Ile Arg Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu
65 70 75 80
Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe Gln Ile Tyr Lys Gln Asp His Ser
85 90 95
Ala Val Val Ala Leu Gln Ile Glu Lys Ile Asn Asn Pro Asp Lys Ile
100 105 110
Asp Ser Leu Ile Asn Gln Arg Ser Phe Arg Val Ser Gly Leu Gly Gly
115 120 125
Glu His Thr Ala Phe Asn Gln Leu Pro Asp Gly Lys Ala Glu Tyr His
130 135 140
Gly Lys Ala Phe Ser Ser Asp Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr
145 150 155 160
Ile Asp Phe Ala Ala Lys Gln Gly His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys
165 170 175
Thr Pro Glu Gln Asn Val Glu Leu Ala Ala Ala Glu Leu Lys Ala Asp
180 185 190
Glu Lys Ser His Ala Val Ile Leu Gly Asp Thr Arg Tyr Gly Ser Glu
195 200 205
Glu Lys Gly Thr Tyr His Leu Ala Leu Phe Gly Asp Arg Ala Gln Glu
210 215 220
Ile Ala Gly Ser Ala Thr Val Lys Ile Gly Glu Lys Val His Glu Ile
225 230 235 240
Gly Ile Ala Gly Lys Gln Gly Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp
245 250 255
Ile Gly Thr Gly Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys
260 265 270
Asp Lys Gly Leu Lys Ser Leu Thr Leu Glu Asp Val Ile Pro Gln Asn
275 280 285
Gly Thr Leu Thr Leu Ser Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Phe Lys Ala
290 295 300
Gly Asp Lys Asp Asn Ser Leu Asn Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys
305 310 315 320
Ile Ser Arg Phe Asp Phe Val Gln Lys Ile Glu Val Asp Gly Gln Thr
325 330 335
Ile Thr Leu Ala Ser Gly Glu Phe Gln Ile Tyr Lys Gln Asn His Ser
340 345 350
Ala Val Val Ala Leu Gln Ile Glu Lys Ile Asn Asn Pro Asp Lys Thr
355 360 365
Asp Ser Leu Ile Asn Gln Arg Ser Phe Arg Val Ser Gly Leu Gly Gly
370 375 380
Glu His Thr Ala Phe Asn Gln Leu Pro Gly Gly Lys Ala Glu Tyr His
385 390 395 400
Gly Lys Ala Phe Ser Ser Asp Asp Pro Asn Gly Arg Leu His Tyr Ser
405 410 415
Ile Asp Phe Thr Lys Lys Gln Gly Tyr Gly Arg Ile Glu His Leu Lys
420 425 430
Thr Leu Glu Gln Asn Val Glu Leu Ala Ala Ala Glu Leu Lys Ala Asp
435 440 445
Glu Lys Ser His Ala Val Ile Leu Gly Asp Thr Arg Tyr Gly Ser Glu
450 455 460
Glu Lys Gly Thr Tyr His Leu Ala Leu Phe Gly Asp Arg Ala Gln Glu
465 470 475 480
Ile Ala Gly Ser Ala Thr Val Lys Ile Gly Glu Lys Val His Glu Ile
485 490 495
Gly Ile Ala Gly Lys Gln Gly Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp
500 505 510
Ile Gly Ala Gly Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys
515 520 525
Asp Lys Gly Leu Gln Ser Leu Thr Leu Asp Gln Ser Val Ser Lys Asn
530 535 540
Glu Lys Leu Lys Leu Ala Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn
545 550 555 560
Gly Ser Leu Asn Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe
565 570 575
Asp Phe Ile Arg Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu Ile Thr Leu Glu
580 585 590
Ser Gly Glu Phe Gln Val Tyr Lys Gln Ser His Ser Ala Leu Thr Ala
595 600 605
Phe Gln Thr Glu Gln Ile Gln Asp Ser Glu His Ser Gly Lys Met Val
610 615 620
Ala Lys Arg Gln Phe Arg Ile Gly Asp Ile Ala Gly Glu His Thr Ser
625 630 635 640
Phe Asp Lys Leu Pro Glu Gly Gly Arg Ala Thr Tyr Arg Gly Thr Ala
645 650 655
Phe Gly Ser Asp Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe
660 665 670
Ala Ala Lys Gln Gly Asn Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Ser Pro Glu
675 680 685
Leu Asn Val Asp Leu Ala Ala Ala Ile Lys Pro Asp Gly Lys Arg His
690 695 700
Ala Val Ile Ser Gly Ser Val Leu Tyr Asn Gln Ala Glu Lys Gly Ser
705 710 715 720
Tyr Ser Leu Gly Ile Phe Gly Lys Ala Gln Glu Val Ala Gly Ser Ala
725 730 735
Glu Val Lys Thr Val Asn Gly Ile Arg His Ile Gly Leu Ala Ala Lys
740 745 750
Gln
<210> 31
<211> 274
<212> PRT
<213> Neisseria meningitidis
<400> 31
Met Asn Arg Thr Ala Phe Cys Cys Phe Ser Leu Thr Ala Ala Leu Ile
1 5 10 15
Leu Thr Ala Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly
20 25 30
Ala Gly Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys
35 40 45
Gly Leu Gln Ser Leu Thr Leu Asp Gln Ser Val Arg Lys Asn Glu Lys
50 55 60
Leu Lys Leu Ala Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly Asp
65 70 75 80
Ser Leu Asn Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe Asp
85 90 95
Phe Ile Arg Gln Ile Glu Val Asp Gly Lys Leu Ile Thr Leu Glu Ser
100 105 110
Gly Glu Phe Gln Val Tyr Lys Gln Ser His Ser Ala Leu Thr Ala Leu
115 120 125
Gln Thr Glu Gln Val Gln Asp Ser Glu Asp Ser Gly Lys Met Val Ala
130 135 140
Lys Arg Gln Phe Arg Ile Gly Asp Ile Ala Gly Glu His Thr Ser Phe
145 150 155 160
Asp Lys Leu Pro Lys Gly Gly Ser Ala Thr Tyr Arg Gly Thr Ala Phe
165 170 175
Gly Ser Asp Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe Ala
180 185 190
Ala Lys Gln Gly His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Ser Pro Glu Leu
195 200 205
Asn Val Glu Leu Ala Thr Ala Tyr Ile Lys Pro Asp Glu Lys Arg His
210 215 220
Ala Val Ile Ser Gly Ser Val Leu Tyr Asn Gln Asp Glu Lys Gly Ser
225 230 235 240
Tyr Ser Leu Gly Ile Phe Gly Gly Gln Ala Gln Glu Val Ala Gly Ser
245 250 255
Ala Glu Val Glu Thr Ala Asn Gly Ile His His Ile Gly Leu Ala Ala
260 265 270
Lys Gln
<210> 32
<211> 282
<212> PRT
<213> Neisseria meningitidis
<400> 32
Met Asn Arg Thr Thr Phe Cys Cys Leu Ser Leu Thr Ala Ala Leu Ile
1 5 10 15
Leu Thr Ala Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Val
20 25 30
Ala Ala Asp Ile Gly Ala Gly Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu
35 40 45
Asp His Lys Asp Lys Gly Leu Lys Ser Leu Thr Leu Glu Asp Ser Ile
50 55 60
Ser Gln Asn Gly Thr Leu Thr Leu Ser Ala Gln Gly Ala Glu Arg Thr
65 70 75 80
Phe Lys Ala Gly Asp Lys Asp Asn Ser Leu Asn Thr Gly Lys Leu Lys
85 90 95
Asn Asp Lys Ile Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg Gln Ile Glu Val Asp
100 105 110
Gly Gln Leu Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe Gln Val Tyr Lys Gln
115 120 125
Ser His Ser Ala Leu Thr Ala Leu Gln Thr Glu Gln Val Gln Asp Ser
130 135 140
Glu His Ser Gly Lys Met Val Ala Lys Arg Gln Phe Arg Ile Gly Asp
145 150 155 160
Ile Val Gly Glu His Thr Ser Phe Gly Lys Leu Pro Lys Asp Val Met
165 170 175
Ala Thr Tyr Arg Gly Thr Ala Phe Gly Ser Asp Asp Ala Gly Gly Lys
180 185 190
Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe Ala Ala Lys Gln Gly His Gly Lys Ile
195 200 205
Glu His Leu Lys Ser Pro Glu Leu Asn Val Asp Leu Ala Ala Ala Asp
210 215 220
Ile Lys Pro Asp Glu Lys His His Ala Val Ile Ser Gly Ser Val Leu
225 230 235 240
Tyr Asn Gln Ala Glu Lys Gly Ser Tyr Ser Leu Gly Ile Phe Gly Gly
245 250 255
Gln Ala Gln Glu Val Ala Gly Ser Ala Glu Val Glu Thr Ala Asn Gly
260 265 270
Ile Arg His Ile Gly Leu Ala Ala Lys Gln
275 280
<210> 33
<211> 254
<212> PRT
<213> Neisseria meningitidis
<400> 33
Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Gly Leu
1 5 10 15
Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys Gly Leu Gln
20 25 30
Ser Leu Thr Leu Asp Gln Ser Val Arg Lys Asn Glu Lys Leu Lys Leu
35 40 45
Ala Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser Leu Asn
50 55 60
Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe Asp Phe Ile Gln
65 70 75 80
Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe Gln
85 90 95
Val Tyr Lys Gln Ser His Ser Ala Leu Thr Ala Phe Gln Thr Glu Gln
100 105 110
Ile Gln Asp Ser Glu His Ser Gly Lys Met Val Ala Lys Arg Gln Phe
115 120 125
Arg Ile Gly Asp Ile Ala Gly Glu His Thr Ser Phe Asp Lys Leu Pro
130 135 140
Glu Gly Gly Arg Ala Thr Tyr Arg Gly Thr Ala Phe Gly Ser Asp Asp
145 150 155 160
Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe Ala Ala Lys Gln Gly
165 170 175
Asn Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Ser Pro Glu Leu Asn Val Asp Leu
180 185 190
Ala Ala Ala Asp Ile Lys Pro Asp Gly Lys Arg His Ala Val Ile Ser
195 200 205
Gly Ser Val Leu Tyr Asn Gln Ala Glu Lys Gly Ser Tyr Ser Leu Gly
210 215 220
Ile Phe Gly Gly Lys Ala Gln Glu Val Ala Gly Ser Ala Glu Val Lys
225 230 235 240
Thr Val Asn Gly Ile Arg His Ile Gly Leu Ala Ala Lys Gln
245 250
<210> 34
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> N-terminal sequence
<400> 34
Met Gly Pro Asp Ser Asp Arg Leu Gln Gln Arg Arg
1 5 10
<210> 35
<211> 769
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MUTATED fhbp POLYPETIDE
<400> 35
Met Gly Pro Asp Ser Asp Arg Leu Gln Gln Arg Arg Val Ala Ala Asp
1 5 10 15
Ile Gly Ala Gly Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys
20 25 30
Asp Lys Ser Leu Gln Ser Leu Thr Leu Asp Gln Val Val Arg Lys Asn
35 40 45
Glu Lys Leu Lys Leu Ala Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn
50 55 60
Gly Asp Ser Leu Asn Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg
65 70 75 80
Phe Asp Phe Ile Arg Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu Ile Thr Leu
85 90 95
Glu Ser Gly Glu Phe Gln Ile Tyr Lys Gln Asp His Ser Ala Val Val
100 105 110
Ala Leu Gln Ile Glu Lys Ile Asn Asn Pro Asp Lys Ile Asp Ser Leu
115 120 125
Ile Asn Gln Arg Ser Phe Arg Val Ser Gly Leu Gly Gly Glu His Thr
130 135 140
Ala Phe Asn Gln Leu Pro Asp Gly Lys Ala Glu Tyr His Gly Lys Ala
145 150 155 160
Phe Ser Ser Asp Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe
165 170 175
Ala Ala Lys Gln Gly His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Thr Pro Glu
180 185 190
Gln Asn Val Glu Leu Ala Ala Ala Glu Leu Lys Ala Asp Glu Lys Ser
195 200 205
His Ala Val Ile Leu Gly Asp Thr Arg Tyr Gly Ser Glu Glu Lys Gly
210 215 220
Thr Tyr His Leu Ala Leu Phe Gly Asp Arg Ala Gln Glu Ile Ala Gly
225 230 235 240
Ser Ala Thr Val Lys Ile Gly Glu Lys Val His Glu Ile Gly Ile Ala
245 250 255
Gly Lys Gln Gly Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Thr
260 265 270
Gly Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys Gly
275 280 285
Leu Lys Ser Leu Thr Leu Glu Asp Val Ile Pro Gln Asn Gly Thr Leu
290 295 300
Thr Leu Ser Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Phe Lys Ala Gly Asp Lys
305 310 315 320
Asp Asn Ser Leu Asn Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Ile Ser Arg
325 330 335
Phe Asp Phe Val Gln Lys Ile Glu Val Asp Gly Gln Thr Ile Thr Leu
340 345 350
Ala Ser Gly Glu Phe Gln Ile Tyr Lys Gln Asn His Ser Ala Val Val
355 360 365
Ala Leu Gln Ile Glu Lys Ile Asn Asn Pro Asp Lys Thr Asp Ser Leu
370 375 380
Ile Asn Gln Arg Ser Phe Arg Val Ser Gly Leu Gly Gly Glu His Thr
385 390 395 400
Ala Phe Asn Gln Leu Pro Gly Gly Lys Ala Glu Tyr His Gly Lys Ala
405 410 415
Phe Ser Ser Asp Asp Pro Asn Gly Arg Leu His Tyr Ser Ile Asp Phe
420 425 430
Thr Lys Lys Gln Gly Tyr Gly Arg Ile Glu His Leu Lys Thr Leu Glu
435 440 445
Gln Asn Val Glu Leu Ala Ala Ala Glu Leu Lys Ala Asp Glu Lys Ser
450 455 460
His Ala Val Ile Leu Gly Asp Thr Arg Tyr Gly Ser Glu Glu Lys Gly
465 470 475 480
Thr Tyr His Leu Ala Leu Phe Gly Asp Arg Ala Gln Glu Ile Ala Gly
485 490 495
Ser Ala Thr Val Lys Ile Gly Glu Lys Val His Glu Ile Gly Ile Ala
500 505 510
Gly Lys Gln Gly Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala
515 520 525
Gly Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys Gly
530 535 540
Leu Gln Ser Leu Thr Leu Asp Gln Ser Val Arg Lys Asn Glu Lys Leu
545 550 555 560
Lys Leu Ala Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser
565 570 575
Leu Asn Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe Asp Phe
580 585 590
Ile Arg Gln Ile Glu Val Asp Gly Lys Leu Ile Thr Leu Glu Ser Gly
595 600 605
Glu Phe Gln Val Tyr Lys Gln Ser His Ser Ala Leu Thr Ala Leu Gln
610 615 620
Thr Glu Gln Val Gln Asp Ser Glu Asp Ser Gly Lys Met Val Ala Lys
625 630 635 640
Arg Gln Phe Arg Ile Gly Asp Ile Ala Gly Glu His Thr Ser Phe Asp
645 650 655
Lys Leu Pro Lys Gly Gly Ser Ala Thr Tyr Arg Gly Thr Ala Phe Gly
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Ser Asp Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe Ala Ala
675 680 685
Lys Gln Gly His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Ser Pro Glu Leu Asn
690 695 700
Val Glu Leu Ala Thr Ala Tyr Ile Lys Pro Asp Glu Lys Arg His Ala
705 710 715 720
Val Ile Ser Gly Ser Val Leu Tyr Asn Gln Asp Ala Lys Gly Ser Tyr
725 730 735
Arg Leu Gly Ile Phe Gly Gly Gln Ala Gln Glu Val Ala Gly Ser Ala
740 745 750
Glu Val Glu Thr Ala Asn Gly Ile His His Ile Gly Leu Ala Ala Lys
755 760 765
Gln
Claims (50)
- 대상체에게 투여된 후, 네이세리아 메닌기티디스(Neisseria meningitidis)의 혈청군 A, B, C, W135 및 Y에 대해 살박테리아성인 면역 반응을 유도할 수 있는 수성 면역원성 조성물로서, 여기서 조성물은
vi. 접합된 혈청군 A 항원;
vii. 접합된 혈청군 C 항원;
viii. 접합된 혈청군 W135 항원;
ix. 접합된 혈청군 Y 항원; 및
x. 혈청군 B로부터의 1종 이상의 폴리펩티드 항원
을 포함하며, 여기서 (ii), (iii) 및 (iv)는 피막 사카라이드 항원이고, 여기서 (i)은 혈청군 A 피막 사카라이드의 합성 유사체인
수성 면역원성 조성물. - 제1항에 있어서, 접합된 혈청군 A 항원이 올리고머 접합체이고, 화학식 (Ia) 또는 (Ib)의 올리고머를 포함하며:
여기서
n은 ≥ 6이고;
R은 H 또는 -P(O)(OR")2이고, 여기서 R"는 H 또는 제약상 허용되는 포스페이트 반대이온이고;
R'는 H 또는 제약상 허용되는 포스페이트 반대이온이고;
Rx는 H 또는 -C(O)CH3이고, 각각의 반복 단위에서 동일하거나 상이할 수 있고;
Ry는 H 또는 -C(O)CH3이고, 각각의 반복 단위에서 동일하거나 상이할 수 있고;
여기서 적어도 1개의 반복 단위에서 Rx 또는 Ry 중 적어도 하나는 -C(O)CH3이고;
Az는 -NH(CO)R1, -N(R1)2 및 -N3으로 이루어진 군으로부터 선택된 아자 치환기이고, 여기서 R1은 독립적으로 H, 선형 또는 분지형 C1-C6-알킬 및 선형 또는 분지형 C1-C6-할로알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고;
Z는 (i) 보호기,
(ii) 단백질에의 접합을 위한 관능성 링커,
또는 (iii) 선형 또는 분지형 C1-C6 알킬, 임의로 치환된 페닐, -C(O)Y, 또는 선형 또는 분지형 C1-C6-알킬-X이고,
여기서 Y는 H, 선형 또는 분지형 C1-C6-알킬 또는 보호기이고,
여기서 X는 -NH2, -N3, -C≡CH, -CH=CH2, -SH 또는 -S-C≡N인
조성물. - 제1항 또는 제2항에 있어서, 접합된 혈청군 A 항원이 화학식 (IIa) 또는 (IIb), 바람직하게는 화학식 (IIa)의 접합체이며:
여기서 올리고머에서
n은 ≥6이고;
R은 H 또는 -P(O)(OR")2이고, 여기서 R"는 H 또는 제약상 허용되는 포스페이트 반대이온이고;
R'는 H 또는 제약상 허용되는 포스페이트 반대이온이고;
Rx는 H 또는 -C(O)CH3이고, 각각의 반복 단위에서 동일하거나 상이할 수 있고;
Ry는 H 또는 -C(O)CH3이고, 각각의 반복 단위에서 동일하거나 상이할 수 있고;
여기서 적어도 1개의 반복 단위에서 Rx 또는 Ry 중 적어도 하나는 -C(O)CH3이고;
Az는 -NH(CO)R1, -N(R1)2 및 -N3으로 이루어진 군으로부터 선택된 아자 치환기이고, 여기서 R1은 독립적으로 H, 선형 또는 분지형 C1-C6-알킬 및 선형 또는 분지형 C1-C6-할로알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고;
Z는 (i) 관능성 링커 또는 결합이고;
P는 단백질인
조성물. - 제2항 또는 제3항에 있어서, 올리고머에서 적어도 1개의 반복 단위에서 Rx가 -C(O)CH3인 조성물.
- 제2항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고머에서 n이 6 내지 30인 조성물.
- 제2항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고머에서 n이 8 내지 20인 조성물.
- 제2항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고머에서 n이 8 내지 15인 조성물.
- 제2항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고머에서 n이 8 또는 10인 조성물.
- 제2항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고머에서 Az가 -NHC(O)CH3인 조성물.
- 제2항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고머에서 적어도 1개의 동일한 반복 단위에서 Rx 및 Ry가 둘 다 -C(O)CH3인 조성물.
- 제2항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고머에서 적어도 1개의 동일한 반복 단위에서 Rx가 H이고 Ry가 -C(O)CH3인 조성물.
- 제2항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고머에서 적어도 1개의 동일한 반복 단위에서 Rx가 -C(O)CH3이고 Ry가 H인 조성물.
- 제2항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고머에서 적어도 1개의 동일한 반복 단위에서 Rx 및 Ry가 둘 다 -C(O)CH3인 조성물.
- 제2항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고머에서 적어도 1개의 동일한 반복 단위에서 Rx가 H이고 Ry가 -C(O)CH3이고, 적어도 1개의 동일한 반복 단위에서 Rx가 -C(O)CH3이고 Ry가 H인 조성물.
- 제2항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고머에서 적어도 1개의 동일한 반복 단위에서 Rx가 H이고 Ry가 -C(O)CH3이고, 적어도 1개의 동일한 반복 단위에서 Rx가 -C(O)CH3이고 Ry가 H이고, 적어도 1개의 동일한 반복 단위에서 Rx 및 Ry가 둘 다 -C(O)CH3인 조성물.
- 제2항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고머의 반복 단위의 40 내지 50%에서 Rx 및 Ry가 둘 다 -C(O)CH3인 조성물.
- 제16항에 있어서, 올리고머의 나머지 반복 단위의 10 내지 20%에서 Rx 또는 Ry 중 하나가 -C(O)CH3이고, 올리고머에서 반복 단위의 나머지는 Rx = Ry = H인 조성물.
- 제2항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고머에서 Rx 및 Ry의 약 50 내지 90%가 -C(O)CH3인 조성물.
- 제2항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 반복 단위에서 Rx가 H이고, 올리고머에서 Ry의 적어도 80%가 -C(O)CH3인 조성물.
- 제2항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, P가 디프테리아 톡소이드 (DT), 파상풍 톡소이드 (TT), CRM197, 이. 콜라이 ST 및 슈도모나스 아에루기노사 외독소 (rEPA)로부터 선택된 불활성화된 박테리아 독소이거나, 또는 P가 폴리아미노산, 예컨대 폴리(리신:글루탐산)이거나, 또는 P가 B형 간염 바이러스 코어 단백질 또는 SPR96-2021인 조성물.
- 제2항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, P가 CRM197인 조성물.
- 제2항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, Z가 하기 화학식을 갖는 링커이며:
*-(CH2)p-NH(CO)-(CH2)p-(X-(CH2)p)p-C(O)-*
여기서 *는 부착 지점을 나타내고, 여기서
p는 독립적으로 1 내지 10으로부터 선택되고;
X는 -O-, -S- 및 -NH-로부터 선택된 것인
조성물. - 제2항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, Z가 하기 화학식을 갖는 링커이며:
*-(CH2)m-NHC(O)-(CH2)m-C(O)-*
여기서 m은 독립적으로 1 내지 10으로부터 선택된 것인
조성물. - 제2항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고머 접합체가 하기 구조를 가지며:
여기서 n, Az, R, Rx 및 Ry는 제2항 내지 제19항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 것인
조성물. - 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 접합된 혈청군 C, W135 및 Y 항원이 디프테리아 톡소이드, 파상풍 톡소이드, 에이치. 인플루엔자에 단백질 D 및 CRM197로부터 선택된 담체 단백질에 접합된 것인 조성물.
- 제25항에 있어서, 혈청군 C, W135 및 Y 항원이 CRM197에 접합된 것인 조성물.
- 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 혈청군 B로부터의 1종 이상의 폴리펩티드 항원이 수막구균 NHBA 항원, 수막구균 NadA 항원, 수막구균 fHbp 항원 및 수막구균 외막 소포 (OMV) 중 1종 이상을 포함하는 것인 조성물.
- 제27항에 있어서, 서열식별번호: 2에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 돌연변이체 v1.13 수막구균 fHbp 폴리펩티드를 포함하며, 여기서 아미노산 서열은 서열식별번호: 2의 잔기 S216, E211 또는 E232 중 1개 이상에서의 치환 돌연변이를 포함하는 것인 조성물.
- 제28항에 있어서, 아미노산 서열이 치환 S216R, E211A 및 E232A 중 적어도 1개 이상에 의해 서열식별번호: 2와 상이한 것인 조성물.
- 제29항에 있어서, 아미노산 서열이 하기:
(iii) E211A 및 S216R, 및
(iv) E211A 및 E232A
로부터 선택된 다수의 잔기에서의 치환을 포함하는 것인 조성물. - 제28항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, v1.13 수막구균 fHbp 폴리펩티드가 서열식별번호: 3 또는 서열식별번호: 4의 아미노산 서열을 갖는 것인 조성물.
- 제27항에 있어서, v1, v2 및 v3 수막구균 fHbp 폴리펩티드를 N-말단에서 C-말단으로 v2-v3-v1 순서로 포함하는 융합 폴리펩티드를 포함하며, 여기서 v1 fHbp 폴리펩티드는 제28항 내지 제31항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 돌연변이체 v1.13 fHbp 폴리펩티드인 조성물.
- 제32항에 있어서,
(c) v2 fHbp 폴리펩티드가 서열식별번호: 12에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 돌연변이체 v2 fHbp 폴리펩티드이며, 여기서 v2 fHbp 아미노산 서열은 서열식별번호: 12의 잔기 S32 및 L123에서의 치환 돌연변이를 포함하고, 여기서 치환은 S32V 및 L123R이고;
(d) v3 fHbp 폴리펩티드가 서열식별번호: 15에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 돌연변이체 v3 fHbp 폴리펩티드이며, 여기서 v3 fHbp 아미노산 서열은 서열식별번호: 15의 잔기 S32 및 L126에서의 치환 돌연변이를 포함하고, 여기서 치환은 S32V 및 L126R인
조성물. - 제33항에 있어서,
(c) v2 fHbp 폴리펩티드가 서열식별번호: 16의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어지고/거나;
(d) v3 fHbp 폴리펩티드가 서열식별번호: 17의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진 것인
조성물. - 제32항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, v2와 v3 fHbp 아미노산 서열 및 v3과 v1 fHbp 아미노산 서열이 글리신-세린 링커에 의해 연결되고, 바람직하게는 여기서 v2 서열이 서열식별번호: 18에 상응하는 N-말단 리더 서열을 갖는 것인 조성물.
- 제32항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, fHbp 융합 폴리펩티드가 서열식별번호: 19-23 중 어느 것의 아미노산 서열을 포함하는 것인 조성물.
- 제36항에 있어서, fHbp 융합 폴리펩티드가 서열식별번호: 34의 임의적인 N-말단 아미노산 서열을 추가적으로 포함하는 것인 조성물.
- 제36항에 있어서, fHbp 융합 폴리펩티드가 서열식별번호: 35의 서열을 갖는 것인 조성물.
- 제28항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 수막구균 NHBA 항원, 수막구균 NadA 항원, 수막구균 fHbp 항원 및 수막구균 외막 소포 (OMV)를 추가로 포함하는 조성물.
- 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 아주반트를 추가로 포함하는 조성물.
- 제40항에 있어서, 아주반트가 수산화알루미늄인 조성물.
- 제1항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 벡스세로(BEXSERO)를 포함하는 조성물.
- 제1항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 단일 기밀 용기, 바람직하게는 바이알 또는 시린지에 포장된 조성물.
- 제1항 내지 제43항 중 어느 한 항에 따른 면역원성 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 포유동물에서 면역 반응을 일으키는 방법으로서, 임의로 여기서 포유동물은 인간인, 포유동물에서 면역 반응을 일으키는 방법.
- 엔. 메닌기티디스에 의해 유발된 감염 및/또는 질환의 치료 또는 예방을 필요로 하는 포유동물에게 면역학적 유효량의 제1항 내지 제43항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 투여하는 것을 포함하며, 임의로 여기서 포유동물은 인간인, 상기 포유동물에서 엔. 메닌기티디스에 의해 유발된 감염 및/또는 질환을 치료 또는 예방하는 방법.
- 제1항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 의약에 사용하기 위한 면역원성 조성물.
- 제1항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 백신으로서 사용하기 위한 면역원성 조성물.
- 제1항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 포유동물에서 면역 반응을 일으키는 방법에 사용하기 위한 것이며, 임의로 여기서 포유동물은 인간인 면역원성 조성물.
- 제1항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 엔. 메닌기티디스 감염에 대해 포유동물을 면역화시키는 데 사용하기 위한 것이며, 임의로 여기서 포유동물은 인간인 조성물.
- 엔. 메닌기티디스에 의해 유발된 감염 및/또는 질환의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 의약의 제조에 있어서의 제1항 내지 제43항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 조성물의 용도.
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