KR20230056983A

KR20230056983A - 신규한 락토바실러스 루테리 psc102 균주 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20230056983A
Application number: KR1020210140879A
Authority: KR
Inventors: 박승춘; 이언비; 임숙경; 문동찬; 윤순식
Original assignee: 경북대학교 산학협력단; 대한민국(농림축산식품부 농림축산검역본부장)
Priority date: 2021-10-21
Filing date: 2021-10-21
Publication date: 2023-04-28

Abstract

본 발명은 대장균(Escherichia coli) 또는 장독소성대장균(ETEC, Enterotoxigenic Escherichia coli)에 항균효과를 보이고, 면역증진효과를 발휘하는 락토바실러스 루테리 PSC102(Lactobacillus reuteri PSC102; 수탁번호: KCCM12927P) 균주 또는 이의 파라프로바이오틱스 및 이의 용도에 관한 것이다.

Description

신규한 락토바실러스 루테리 PSC102 균주 및 이의 용도 {Novel Lactobacillus reuteri PSC102 strain and use thereof}

본 발명은 신규한 락토바실러스 루테리 PSC102(Lactobacillus reuteri PSC102) 균주 및 이의 용도에 관한 것이다.

돼지 세균성 설사병은 일부 병원성 세균들이 외부로부터 유입되거나, 동물에 가해지는 스트레스가 요인이 되어 장 또는 체내에 존재하던 병원성 세균이 일시에 다량 증식하여 발생한다. 세균성 설사병에는 대장균증, 살모넬라 감염증 등이 있다. 특히 대장균증은 분만직후부터 포유기 및 이유직후에 다발하며, 주요 증상으로는 패혈증에 의한 폐사, 성장 저하, 면역력 감소, 탈수, 부종병, 신경증상 등 자돈 육성상 경제적으로 큰 손실이 발생할 수 있다. 병원성 대장균(Escherichia coli)과 장독소성대장균(ETEC, Enterotoxigenic Escherichia coli)이 돼지에서 설사를 유발하는 주요 원인체로 알려져 있다.

돼지 세균성 설사병을 예방 또는 치료하기 위해 항생제를 주로 사용함에 따라 항생제 오남용과 항생제 내성 또한 문제가 되고 있다. 항생제의 내성균 출현에 의해 항생제의 효용이 감소할 우려가 있으며, 이를 극복하기 위한 프로바이오틱스, 프리바이오틱스, 식물화합물, 허브, 항산화제, 생체활성 펩타이드 등 대체제 개발에 대한 연구가 지속적으로 보고되고 있다.

한편, 생균제(probiotics)는 여러 종류의 정상 장내 세균총에서 병원성균에 대해 증식을 억제하는 항균력이 있는 것으로 알려져 있으며, 장내 세균총의 균형을 유지하는데 중요한 역할을 담당한다고 알려져 있다. 생균제는 내산성, 내담즙성, 항생제에 대한 적절한 내성을 가져야 하며, 안전성이 확보되어야 한다.

제10-1851297호

본 발명은 신규한 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri) 균주를 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri)를 포함하는 조성물로서 항균효과 또는 면역증진효과가 있는 조성물을 제공하고자 한다.

본 발명은 락토바실러스 루테리 PSC102(Lactobacillus reuteri PSC102; 수탁번호: KCCM12927P) 균주를 제공한다.

또한, 본 발명은 락토바실러스 루테리 PSC102(Lactobacillus reuteri PSC102; 수탁번호: KCCM12927P) 균주 또는 이의 파라프로바이오틱스를 포함하는 것을 특징으로 하는 건강기능식품용 조성물을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 조성물은, 바람직하게는 장내 유해균을 감소시키는 것이 좋다.

본 발명에 있어서, 상기 장내 유해균은, 더욱 바람직하게는 대장균(Escherichia coli) 또는 장독소성대장균(ETEC, Enterotoxigenic Escherichia coli)일 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 조성물은, 바람직하게는 사이토카인 분비 증진에 따른 면역증진효과를 가지는 것이 좋다.

또한, 본 발명은 락토바실러스 루테리 PSC102(Lactobacillus reuteri PSC102; 수탁번호: KCCM12927P) 또는 이의 파라프로바이오틱스를 포함하는 것을 특징으로 하는 사료용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 락토바실러스 루테리 PSC102(Lactobacillus reuteri PSC102; 수탁번호: KCCM12927P) 또는 이의 파라프로바이오틱스를 포함하는 것을 특징으로 하는 사료 첨가제용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 락토바실러스 루테리 PSC102(Lactobacillus reuteri PSC102; 수탁번호: KCCM12927P) 또는 이의 파라프로바이오틱스를 포함하는 것을 특징으로 하는 어류 양식용 사료 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 락토바실러스 루테리 PSC102(Lactobacillus reuteri PSC102; 수탁번호: KCCM12927P) 또는 이의 파라프로바이오틱스를 포함하는 것을 특징으로 하는 어류 양식용 사료 첨가제 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 사료용 조성물 또는 사료 첨가제용 조성물을 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계를 포함하는 면역증진방법을 제공한다.

본 발명은 신규 균주인 락토바실러스 루테리 PSC102(Lactobacillus reuteri PSC102; 수탁번호: KCCM12927P) 균주 또는 이의 파라프로바이오틱스를 제공한다.

본 발명은 락토바실러스 루테리 PSC102(Lactobacillus reuteri PSC102; 수탁번호: KCCM12927P) 균주 또는 이의 파라프로바이오틱스를 포함하는 조성물을 제공한다.

본 발명의 조성물은 대장균(Escherichia coli) 또는 장독소성대장균(ETEC, Enterotoxigenic Escherichia coli)에 항균효과를 보이고, 면역증진효과를 발휘할 수 있으며, 이는 건강기능식품 조성물, 사료 조성물, 사료 첨가제용 조성물로 사용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 Lactobacillus reuteri PSC102 균주를 전자현미경(SEM)으로 관찰한 도이다.
도 2는 본 발명의 Lactobacillus reuteri PSC102 균주의 계통수를 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명의 Lactobacillus reuteri PSC102 균주의 배양조건에 따른 균수, pH, OD, Brix를 나타낸 도이다.
도 4는 본 발명의 Lactobacillus reuteri PSC102 균주에 NaOH를 농도별로 처리하여 파라프로바이오틱스를 제조한 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 본 발명의 Lactobacillus reuteri PSC102 균주를 온도에 따라 열처리하여 파라프로바이오틱스를 제조한 결과를 나타낸 도이다.
도 6은 본 발명의 Lactobacillus reuteri PSC102 균주의 파라프로바이오틱스를 전자현미경으로 관찰한 도이다.
도 7은 본 발명의 Lactobacillus reuteri PSC102 균주의 파라프로바이오틱스 처리에 따른 면역 증진 효과를 나타낸 도이다.
도 8은 CTX로 면역억제를 유도한 랫트에 Lactobacillus reuteri PSC102 균주 또는 이의 파라프로바이오틱스 처리에 따른 체중 변화를 나타낸 도이다.
도 9는 CTX로 면역억제를 유도한 랫트에 Lactobacillus reuteri PSC102 균주 또는 이의 파라프로바이오틱스 처리에 따른 비장조직을 전자현미경으로 관찰한 도이다.
도 10은 CTX로 면역억제를 유도한 랫트에 Lactobacillus reuteri PSC102 균주 또는 이의 파라프로바이오틱스 처리에 따른 혈액분석결과를 나타낸 도이다.
도 11은 CTX로 면역억제를 유도한 랫트에 Lactobacillus reuteri PSC102 균주 또는 이의 파라프로바이오틱스 처리에 따른 호중구 수(A), 호중구의 이동(B), 호중구의 식균작용(C)을 나타낸 도이다.
도 12는 CTX로 면역억제를 유도한 랫트에 Lactobacillus reuteri PSC102 균주 또는 이의 파라프로바이오틱스 처리에 따른 비장세포 수(A) 및 비장 림프구의 증식(B)을 나타낸 도이다.
도 13의 A는 CTX로 면역억제를 유도한 랫트의 흉선 조직에서 Lactobacillus reuteri PSC102 균주 또는 이의 파라프로바이오틱스 처리에 따른 CD4+ 및 CD8+ T 림프구 발현을 나타낸 도이고, B는 CD3+, C는 CD4+/CD8-(R1 영역), D는 CD4+/CD8+(R2 영역), E는 CD4-/CD8+(R3 영역) 및 F는 CD4-/CD8-(R4 영역)을 나타낸 도이다.
도 14의 A는 CTX로 면역억제를 유도한 랫트의 혈액단핵세포(PBMC)에서 Lactobacillus reuteri PSC102 균주 또는 이의 파라프로바이오틱스 처리에 따른 CD4+ 및 CD8+ T 림프구 발현을 나타낸 도이고, B는 CD3+, C는 CD4+/CD8-(R1 영역), D는 CD4+/CD8+(R2 영역), E는 CD4-/CD8+(R3 영역) 및 F는 CD4-/CD8-(R4 영역)을 나타낸 도이다.
도 15는 CTX로 면역억제를 유도한 랫트의 혈액단핵세포(PBMC)에서 Lactobacillus reuteri PSC102 균주 또는 이의 파라프로바이오틱스 처리에 따른 CD4+의 CD45RA+ 및 CD28+로의 발현을 나타낸 도이다.
도 16은 CTX로 면역억제를 유도한 랫트의 혈액단핵세포(PBMC)에서 Lactobacillus reuteri PSC102 균주 또는 이의 파라프로바이오틱스 처리에 따른 CD8+의 CD45RA+ 및 CD28+로의 발현을 나타낸 도이다.
도 17의 A는 CTX로 면역억제를 유도한 랫트의 비장에서 Lactobacillus reuteri PSC102 균주 또는 이의 파라프로바이오틱스 처리에 따른 CD4+ 및 CD8+ T 림프구 발현을 나타낸 도이고, B는 CD3+, C는 CD4+/CD8-(R1 영역), D는 CD4+/CD8+(R2 영역), E는 CD4-/CD8+(R3 영역) 및 F는 CD4-/CD8-(R4 영역)을 나타낸 도이다.
도 18은 CTX로 면역억제를 유도한 랫트의 비장에서 Lactobacillus reuteri PSC102 균주 또는 이의 파라프로바이오틱스 처리에 따른 CD4+의 CD45RA+ 및 CD28+로의 발현을 나타낸 도이다.
도 19는 CTX로 면역억제를 유도한 랫트의 비장에서 Lactobacillus reuteri PSC102 균주 또는 이의 파라프로바이오틱스 처리에 따른 CD8+의 CD45RA+ 및 CD28+로의 발현을 나타낸 도이다.
도 20은 CTX로 면역억제를 유도한 랫트의 혈청에서 Lactobacillus reuteri PSC102 균주 또는 이의 파라프로바이오틱스 처리에 따른 사이토카인 발현을 나타낸 도이다.

본 발명은 락토바실러스 루테리 PSC102(Lactobacillus reuteri PSC102; 수탁번호: KCCM12927P) 균주를 제공한다. 본 발명의 락토바실러스 루테리 PSC102(Lactobacillus reuteri PSC102) 균주는 2021년 01월 12일에 한국미생물보존센터에 기탁하여 수탁번호 KCCM12927P를 부여받았다.

본 발명은 이유자돈의 분변으로부터 락토바실러스 루테리 PSC102(Lactobacillus reuteri PSC102; 수탁번호: KCCM12927P) 균주를 분리하였다. 본 발명의 락토바실러스 루테리 PSC102(Lactobacillus reuteri PSC102; 수탁번호: KCCM12927P) 균주는 그람 양성균이며, 통성혐기성이고, 막대(rod)형태이며, 포자를 형성하지 않는다. 카탈라아제(catalase) 생성 시험결과는 음성이며, 유산(lactic acid) 및 유기산을 생산하는 특성을 가지는바, 전형적인 락토바실러스가 가지는 형태 및 배양학적 특징을 나타내었다.

본 발명의 락토바실러스 루테리 PSC102(Lactobacillus reuteri PSC102; 수탁번호: KCCM12927P) 균주는 당 분해 효능이 탁월하며, 장독소성대장균(ETEC, Enterotoxigenic Escherichia coli)과 대장균(E. coli)에 대한 항균효과가 우수하다. 또한 pH 2 및 3에서도 생존 능력이 뛰어나 내산성을 보이며, 내담즙성도 우수하여 프로바이오틱스로서 기능할 수 있는 것으로 나타났다. 또한, 본 발명의 락토바실러스 루테리 PSC102(Lactobacillus reuteri PSC102; 수탁번호: KCCM12927P) 균주는 대부분의 항생제(표 13 참조)에 내성을 나타내므로 항생제가 포함된 사료, 사료 첨가제 등의 조성물에 병용하여 프로바이오틱스로서의 효과를 보일 수 있다. 또한, 본 발명의 본 발명의 락토바실러스 루테리 PSC102(Lactobacillus reuteri PSC102; 수탁번호: KCCM12927P) 균주는는 독성이 없으며 GRAS(Generally Recognized As Safe)에 속하는 것으로 판단하였다. 한편, 본 발명의 락토바실러스 루테리 PSC102(Lactobacillus reuteri PSC102; 수탁번호: KCCM12927P) 균주는 정체배양의 경우 성장에 유리한 것으로 나타났다.

본 발명의 락토바실러스 루테리 PSC102(Lactobacillus reuteri PSC102; 수탁번호: KCCM12927P) 균주의 파라프로바이오틱스(paraprobiotics)는 당 업계에 널리 알려진 방법에 의해 제조할 수 있으나, 바람직하게는 NaOH를 이용하여 유도하거나 열처리에 의해 제조할 수 있다. 본 발명 락토바실러스 루테리 PSC102(Lactobacillus reuteri PSC102; 수탁번호: KCCM12927P) 또는 이의 파라바이오틱스는 사이토카인 발현을 촉진함에 따라 면역 증진 효과를 발휘할 수 있다.

비장, 흉선 등으로 구성된 면역 시스템은 미생물 및 외부 항원에 대한 방어 메커니즘으로 알려져 있으며, 림프구 분비 사이토카인 및 항체는 세포 매개 및 체액성 면역과 관련있다고 알려져 있다. 면역억제성 질환을 개선, 예방 또는 치료하는 방법으로는 장내 미생물 균형 유지, 병원체에 대한 보호, 면역조절효과가 있는 프로바이오틱스 등이 있는데, 프로바이오틱스는 투여 시 살아있는 미생물을 투여하므로 감염, 알레르기 반응, 항생제 내성 운반체로의 작용 등의 부작용이 우려될 수 있다. 이에 따라 안전상의 이유로 프로바이오틱스는 비감염성 또는 항생제 비내성화를 하여 사용한다.

이에 본 발명은 안전성이 확보된 락토바실러스 루테리 PSC102(Lactobacillus reuteri PSC102; 수탁번호: KCCM12927P) 또는 이의 파라바이오틱스를 이용하여 항균효과, 면역증진효과가 우수한 조성물을 제공하고자 한다.

일 측면에서, 본 발명은 락토바실러스 루테리 PSC102(Lactobacillus reuteri PSC102; 수탁번호: KCCM12927P) 균주 또는 이의 파라프로바이오틱스를 포함하는 것을 특징으로 하는 건강기능식품용 조성물을 제공한다.

본 발명의 건강기능식품용 조성물은 대장균(Escherichia coli) 또는 장독소성대장균(ETEC, Enterotoxigenic Escherichia coli) 등의 장내 유해균을 감소시키며, 사이토카인 분비 증진에 따른 면역증진효과를 발휘한다.

본 발명의 건강기능식품 조성물은 유효성분인 추출물을 함유하는 것 외에 통상의 식품 조성물과 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.

상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 향미제는 천연 향미제(타우마틴), 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 본 발명의 식품 조성물은 하기 약학적 조성물과 동일한 방식으로 제제화 되어 기능성 식품으로 이용하거나, 각종 식품에 첨가할 수 있다. 본 발명의 조성물을 첨가할 수 있는 식품으로는 예를 들어, 음료류, 육류, 초코렛, 식품류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 사탕류, 아이스크림류, 알콜 음료류, 비타민 복합제 및 건강보조식품류 등이 있다.

또한, 상기 식품 조성물은 유효성분인 추출물 외에 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 식품 조성물은 천연 과일 주스 및 과일 주스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다.

본 발명의 건강기능식품 조성물은, 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상, 환 등의 형태로 제조 및 가공될 수 있다. 본 발명에서 '건강기능식품 조성물'이라 함은 건강기능식품에 관한 법률 제6727호에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 말하며, 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다. 본 발명의 건강 기능성 식품은 통상의 식품 첨가물을 포함할 수 있으며, 식품 첨가물로서의 적합 여부는 다른 규정이 없는 한, 식품의약품안전처에 승인된 식품 첨가물 공전의 총칙 및 일반시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하여 판정한다. 상기 '식품 첨가물 공전'에 수재된 품목으로는 예를 들어, 케톤류, 글리신, 구연산칼슘, 니코틴산, 계피산 등의 화학적 합성물; 감색소, 감초추출물, 결정셀룰로오스, 고량색소, 구아검 등의 천연첨가물; L-글루타민산나트륨 제제, 면류첨가알칼리제, 보존료 제제, 타르색소제제 등의 혼합제제류 등을 들 수 있다. 예를 들어, 정제 형태의 건강 기능성 식품은 본 발명의 유효성분을 부형제, 결합제, 붕해제 및 다른 첨가제와 혼합한 혼합물을 통상의 방법으로 과립화한 다음, 활택제 등을 넣어 압축성형하거나, 상기 혼합물을 직접 압축 성형할 수 있다. 또한 상기 정제 형태의 건강 기능성 식품은 필요에 따라 교미제 등을 함유할 수도 있다. 캅셀 형태의 건강 기능성 식품 중 경질 캅셀제는 통상의 경질 캅셀에 본 발명의 유효성분을 부형제 등의 첨가제와 혼합한 혼합물을 충진하여 제조할 수 있으며, 연질 캅셀제는 본 발명의 유효성분을 부형제 등의 첨가제와 혼합한 혼합물을 젤라틴과 같은 캅셀 기제에 충진하여 제조할 수 있다. 상기 연질 캅셀제는 필요에 따라 글리세린 또는 소르비톨 등의 가소제, 착색제, 보존제 등을 함유할 수 있다. 환 형태의 건강 기능성 식품은 본 발명의 유효성분과 부형제, 결합제, 붕해제 등을 혼합한 혼합물을 기존에 공지된 방법으로 성형하여 조제할 수 있으며, 필요에 따라 백당이나 다른 제피제로 제피할 수 있으며, 또는 전분, 탈크와 같은 물질로 표면을 코팅할 수도 있다. 과립 형태의 건강 기능성 식품은 본 발명의 유효성분의 부형제, 결합제, 붕해제 등을 혼합한 혼합물을 기존에 공지된 방법으로 입상으로 제조할 수 있으며, 필요에 따라 착향제, 교미제 등을 함유할 수 있다.

또한, 일 측면에서, 본 발명은 락토바실러스 루테리 PSC102(Lactobacillus reuteri PSC102; 수탁번호: KCCM12927P) 또는 이의 파라프로바이오틱스를 포함하는 것을 특징으로 하는 사료용 조성물을 제공한다.

또한, 일 측면에서, 본 발명은 락토바실러스 루테리 PSC102(Lactobacillus reuteri PSC102; 수탁번호: KCCM12927P) 또는 이의 파라프로바이오틱스를 포함하는 것을 특징으로 하는 사료 첨가제용 조성물을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 사료 또는 사료 첨가제용 조성물은 가축 사육을 목적으로 하는 개체에 급여하는 것으로, 상기 가축은 돼지, 소, 양, 염소, 낙타, 순록, 말, 당나귀, 개, 고양이, 토끼 등의 포유류; 닭, 칠면조, 꿩, 타조, 거위, 오리, 메추라기 등의 조류; 관상어, 해상어, 육상어 등의 어류; 굼벵이, 지렁이, 지네, 전갈, 거미, 등에, 꽃무지, 풍뎅이, 거저리, 귀뚜라미, 누에 등의 곤충류;로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 용어 “사료 첨가제” 란 영양소 보충 및 체중감소 예방, 사료 내 섬유소의 소화 이용성 증진, 유질개선, 번식장애 예방 및 수태율 향상, 하절기 고온 스트레스 예방 등 다양한 효과를 목적으로 사료에 첨가하는 물질을 말한다.

또한, 상기 사료 첨가제는 원형 그대로 사용하거나 또는 추가적으로 가축에 허용되는 곡류 및 그 부산물 등의 공지된 담체, 안정제 등을 가할 수 있으며, 필요에 따라 구연산, 후말산, 아디픽산, 젖산, 사과산 등의 유기산이나 인산나트륨, 인산칼륨, 산성 피로인산염, 폴리인산염(중합인산염) 등의 인산염이나, 폴리페놀, 카테킨, 알파-토코페롤, 로즈마리 추출물, 비타민 C, 녹차 추출물, 감초 추출물, 키토산, 탄닌산, 피틴산 등의 천연 항산화제, 탄산수소나트륨(중조), 벤토나이트(bentonite), 산화마그네슘, 복합광물질 등의 광물질제제, 아연, 구리, 코발트, 셀레늄 등의 미량 광물질인 미네랄제제, 케로틴, 비타민 E, 비타민 A, D, E, 니코틴산, 비타민 B 복합체 등의 비타민제, 메티오닌, 리이산 등의 보호아미노산제, 지방산 칼슘염 등의 보호지방산제, 생균제(유산균제), 효모배양물, 곰팡이 발효물 등의 생균, 효모제, 항생물질, 항균제 및 기타의 첨가제 등을 가할 수도 있으며, 그 형상으로서는 분체, 과립, 펠릿, 현탁액 등 의 적당한 상태일 수 있으며, 상기 사료첨가제를 공급하는 경우는 가축 등에 대하여 단독으로 또는 사료에 혼합하여 공급할 수 있다.

또한, 상기 가축용 사료 첨가제는 배합사료의 총 중량 대비 5 내지 50 중량%, 바람직하게는 5 내지 15 중량%, 더욱 바람직하게는 10 중량%로 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 배합사료는 통상적으로 시판중이고 가축에게 사료로 급여 가능한 일반 사료와, 본 발명의 사료 첨가제를 혼합한 것을 의미하고, 때때로 조사료, 농후사료, 특수사료 등을 포함할 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 사료 첨가제를 포함하는 사료는 당업계에서 공지된 다양한 형태의 사료로 제조 가능하며, 바람직하게는 농후사료, 조사료 또는 특수사료가 포함될 수 있다.

또한, 상기 농후사료에는 밀, 귀리, 옥수수 등의 곡류를 포함하는 종자 열매류, 곡물을 정제하고 남은 부산물로서 쌀겨, 밀기울, 보릿겨 등을 포함하는 겨류, 콩, 유체, 깨, 아마인, 코코야자 등을 채유하고 얻은 부산물인 깻묵류와 고구마, 감자 등에서 녹말을 뺀 나머지인 녹말찌꺼기의 주성분인 잔존녹말질류 등의 찌꺼기류, 어분, 물고기 찌꺼기, 어류에서 얻은 신선한 액상물(液狀物)을 농축시킨 것인 피시솔루블(fish soluble), 육분(肉粉), 혈분, 우모분, 탈지분유, 우유에서 치즈, 탈지유에서 카제인을 제조할 때의 잔액인 훼이(whey)를 건조한 건조훼이 등의 동물질사료, 효모, 클로렐라, 해조류 등이 있다.

또한, 상기 조사료에는 야초, 목초, 풋베기 등의 생초(生草)사료, 사료용 순무, 사료용 비트, 순무의 일종인 루터베어거 등의 뿌리채소류, 생초, 풋베기작물, 곡실(穀實) 등을 사일로에 채워 놓고 젖산 발효시킨 저장사료인 사일리지(silage), 야초, 목초를 베어 건조시킨 건초, 종축용(種畜用) 작물의 짚, 콩과 식물의 나뭇잎 등이 있다.

또한, 특수사료에는 패각, 암염 등의 미네랄 사료, 요소나 그 유도체인 디우레이드이소부탄 등의 요소사료, 천연사료 원료만을 배합했을 때 부족하기 쉬운 성분을 보충하거나, 사료의 저장성을 높이기 위해서 일반 사료에 미량으로 첨가하는 물질인 사료첨가물, 식이보조제 등이 있다.

또한, 본 발명은 상기 사료 조성물 또는 사료 첨가제용 조성물을 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계를 포함하는 면역증진방법을 제공한다.

본 명세서에서 사용되는 용어(terminology)들은 본 발명의 바람직한 실시 예를 적절히 표현하기 위해 사용된 용어들로서, 이는 사용자, 운용자의 의도 또는 본 발명이 속하는 분야의 관례 등에 따라 달라질 수 있다. 따라서 본 용어들에 대한 정의는 본 명세서 전반에 걸친 내용을 토대로 내려져야 할 것이다. 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.

본 명세서 전체에 걸쳐, 특정 물질의 농도를 나타내기 위하여 사용되는 "%"는 별도의 언급이 없는 경우, 고체/고체는(w/w) %, 고체/액체는(w/v) %, 그리고 액체/액체는(v/v) %이다.

이하, 실시예 및 실험예를 통하여 본 발명을 보다 자세히 설명한다. 다만, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명에 대한 예시로 제시되는 것으로, 당업자에게 주지 저명한 기술 또는 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략할 수 있고, 이에 의해 본 발명이 제한되지는 않는다. 본 발명은 후술하는 특허청구범위의 기재 및 그로부터 해석되는 균등 범주 내에서 다양한 변형 및 응용이 가능하다.

<실시예 1> Lactobacillus reuteri PSC102 균주 분리

유산균을 투여 받지 않은 건강한 이유자돈(10±3 kg)의 분변을 수집하여 각 1 g의 분변을 99 ml의 혐기성 용액에 균질화시켰다. 각 균질액 1 ml를 pH 2.0으로 조절된 9 ml의 Lactobacillus selective MRS broth에 혼합하여 37 ℃에서 2시간 진탕시켰다. 진탕액 1 ml를 0.1 % bacto agar가 포함된 식염수로 10배 희석하였다. 각 희석액을 0.15 % bile salt(oxgall, Difco)가 포함된 MRS agar에서 48 시간 혐기적으로 배양하여 위산과 담즙에 저항하는 154개의 후보균주(L0001-L0154)와 Lactobacillus reuteri PSC102 균주를 분리하였다.

154개의 후보균주(L0001-L0154)와 Lactobacillus reuteri PSC102 균주를 5 ml MRS broth에 37 ℃에서 18시간 진탕배양한 후 5분간 12,000 rpm으로 원심분리 하였다. 상층액을 ×1, ×3으로 각각 농축시킨 후 대장균(E. coli) 또는 ETEC(Enterotoxigenic Escherichia coli)으로 도말된 LB 배지에서 paper disc에 ×1 60 ㎕와 ×3 60 ㎕를 흡착시켰다. 4℃ 냉장고에 30분 방치한 뒤 37 ℃ 배양기에서 18시간 배양 후 직경환을 측정하였다.

또한 154개의 후보균주(L0001-L0154)와 Lactobacillus reuteri PSC102 균주 중에서 아밀레이스(amylase), 라이페이스(lipase), 파이테이즈(phytase), 프로테이스(protease)를 생산하는 효소 생성 균주를 선발하기 위해 각 효소선발 배지에 균주를 도말한 뒤 24시간 배양하여 관찰하였다. 표 1에 각 효소선발 배지를, 표 2 내지 6에 균주의 항균효과와 효소 생성능을 실험 결과를 나타내었다.

Enzyme selective media	Ingredient	Treatment
Amylase	polypeptone (0.5%), beef extract (0.5%), yeast extract (0.2%), NaCl (0.2%), corn starch (2%), agar (1.5%)	48 hours at 37˚C aerobically, 0.2% Congo red reagent for 30 min
Lipase	tryptone (0.1%), yeast extract (0.5%), NaCl (0.05%), and tricaprylin (0.1%), agar (1.5%)	48 hours at 37˚C aerobically
Phytase	D-glucose (1.5%), calcium phytate (0.5%), NH₄NO₃ (0.5%), MgSO₄·7H₂O (0.05%), MnSO₄.7H₂O (0.01%), KCl (0.05%), FeSO₄.7H₂O (0.001%), and MnSO₄·4H₂0 (0.01%), agar (1.5%)	48 hours at 37˚C aerobically
Protease	1.5% agar medium also containing beef extract (1%), polypeptide (0.5%), milk casein, agar (1.5%), NaCl (0.5%), pH 8.0	48 hours at 37˚C aerobically

	E. coli		ETEC			Protease	Lipase	Amylase	Phytase
	x1	x3	x1	x3	pH7, x3	Protease	Lipase	Amylase	Phytase
Enrofloxacin	18	18	18	18	18
PSC102	11	14	12	14	15	+++	+	+++	+++
L0001	9	9	9	9	9	++	+	+	+
L0002	10	13	10	13	10	++	+	+	+
L0003	9	9	9	9	9	+++	-	+	+
L0004	9	9	9	9	9	+++	+	+++	+++
L0005	9	9	9	9	9	+++	+	+	++
L0006	11	12	11	12	10	+++	-	+	++
L0007	9	9	9	9	9	++	-	+	++
L0008	9	9	9	9	9	++	+	+	++
L0009	9	9	9	9	9	++	+	++	+
L0010	10	12	9	9	10	++	-	++	+
L0011	9	9	9	9	9	++	-	++	++
L0012	9	9	9	9	9	++	-	+	+
L0013	10	12	9	9	10	++	-	+	+
L0014	10	12	9	9	10	+++	-	+	+
L0015	9	9	9	9	9	+++	-	+++	+
L0016	9	11	9	9	9	+++	+	+++	+
L0017	10	12	9	9	11	+++	+	+++	++
L0018	10	12	9	9	12	+++	+	+++	++
L0019	9	9	9	9	9	++	+	+++	++
L0020	9	10	9	9	9	++	+	+	++
L0021	10	10	9	10	9	++	-	+	+
L0022	9	9	9	9	9	++	+	+	+
L0023	9	9	9	9	9	++	+	+	+
L0024	9	9	9	9	9	++	+	+	+
L0025	9	10	9	9	9	++	+	+	+
L0026	9	9	9	11	11	++	+	+	+
L0027	9	9	9	9	9	++	+	+	++
L0028	9	10	9	11	11	++	+	+	++
L0029	9	9	9	11	11	++	+	+	++
L0030	9	9	9	11	11	++	-	+	+

	E. coli		ETEC			Protease	Lipase	Amylase	Phytase
	x1	x3	x1	x3	pH7, x3	Protease	Lipase	Amylase	Phytase
L0031	9	9	9	9	9	++	-	+	+
L0032	9	9	9	9	9	++	-	+	+
L0033	9	9	9	9	9	++	+	+	+
L0034	9	9	9	10	11	++	+	+	+
L0035	9	10	9	9	9	++	+	+	+
L0036	9	9	9	9	9	++	-	+	+
L0037	9	9	9	11	9	++	-	+	+
L0038	9	11	9	9	9	++	-	+	+
L0039	9	9	9	9	9	++	-	+	+
L0040	9	9	9	10	11	++	-	+	+
L0041	9	9	9	9	9	++	-	+	+
L0042	9	11	9	9	9	++	-	+	++
L0043	9	9	9	9	9	++	-	+	++
L0044	10	10	9	12	12	++	-	+	+
L0045	10	11	11	13	12	++	-	+	+
L0046	9	9	9	9	9	++	-	+	+
L0047	9	9	9	9	9	++	-	+	+
L0048	9	9	9	12	9	++	-	+	+
L0049	9	9	9	12	9	++	-	+	++
L0050	9	9	9	12	9	++	-	+	++
L0051	9	9	9	9	9	++	-	+	+
L0052	9	9	9	9	9	++	-	+	+
L0053	9	9	9	9	9	++	-	+	+
L0054	9	9	9	9	9	++	-	+	++
L0055	9	9	9	9	9	++	-	+	++
L0056	9	11	9	9	9	++	-	+	+
L0057	9	11	9	9	9	++	-	+	+
L0058	9	9	9	9	9	++	-	+	+
L0059	9	11	9	9	9	++	-	+	+
L0060	9	11	9	9	9	++	-	+	+

	E. coli		ETEC			Protease	Lipase	Amylase	Phytase
	x1	x3	x1	x3	pH7, x3	Protease	Lipase	Amylase	Phytase
L0061	9	9	9	9	9	++	-	+	+
L0062	9	9	9	9	9	++	-	+	+
L0063	9	11	9	9	9	++	-	+	+
L0064	9	11	9	9	9	++	-	+	+
L0065	9	11	9	9	9	++	-	+	+
L0066	9	11	9	9	9	++	-	+	+
L0067	9	9	9	9	9	++	-	+	+
L0068	9	9	9	9	9	++	-	+	+
L0069	9	11	9	9	9	++	-	+	+
L0070	9	9	9	9	9	++	-	+	+
L0071	9	9	9	9	9	++	-	+	+
L0072	9	9	9	9	9	++	-	+	+
L0073	9	11	9	9	9	++	-	+	+
L0074	9	9	9	9	9	++	-	+	+
L0075	9	9	9	9	9	++	-	+	+
L0076	9	9	9	9	9	++	-	+	+
L0077	9	11	9	9	9	++	-	+	+
L0078	9	9	9	9	9	++	-	+	+
L0079	9	9	9	9	9	++	+	+	+
L0080	9	9	9	9	9	++	+	+	+
L0081	9	9	9	9	9	++	-	+	+
L0082	9	9	9	9	9	++	+	+	+
L0083	9	9	9	9	9	++	+	+	++
L0084	9	9	9	9	9	+++	-	+	+
L0085	9	9	9	9	9	+++	+	+	+
L0086	9	9	9	9	9	+++	+	+	++
L0087	9	9	9	9	9	++	-	+	++
L0088	9	9	9	9	9	++	+	+	+
L0089	9	9	9	9	9	++	+	+	+
L0090	9	9	9	9	9	++	-	+	++

	E. coli		ETEC			Protease	Lipase	Amylase	Phytase
	x1	x3	x1	x3	pH7, x3	Protease	Lipase	Amylase	Phytase
L0091	9	9	9	9	9	++	++	+++	++
L0092	9	9	9	9	9	++		+++	+
L0093	9	9	9	9	9	++	+	+++	+
L0094	9	9	9	9	9	+++	+	+++	+
L0095	9	9	9	9	9	++	+	+	+
L0096	9	9	9	9	9	++	-	+	+
L0097	9	9	9	9	9	++	-	+	++
L0098	9	9	9	9	9	++	-	+	++
L0099	9	9	9	9	9	++	-	+	++
L0100	9	9	9	9	9	++	+	+	+
L0101	9	9	9	9	9	+++	+	+	+
L0102	9	9	9	9	9	+++	+	+	+
L0103	9	9	9	9	9	++	-	+	++
L0104	9	9	9	9	9	++	+	+	+
L0105	9	9	9	9	9	++	+	+	+
L0106	9	9	9	9	9	+++	+	+	+
L0107	9	9	9	9	9	+++	-	+	+
L0108	9	11	9	11	9	+++	+	+	++
L0109	9	11	9	11	9	++	+	+	++
L0110	9	9	9	9	9	++	-	+	+
L0111	9	9	9	9	9	++	+	+	+
L0112	9	11	9	11	10	++	+	+	+
L0113	9	9	9	9	9	++	+	++	++
L0114	9	11	9	9	9	++	+	++	+
L0115	9	9	9	9	9	++	-	++	+
L0116	9	11	9	11	9	++	+	++	+
L0117	9	12	9	11	10	++	-	++	+
L0118	9	12	9	11	9	++	-	++	+
L0119	9	10	9	9	9	++	-	++	++
L0120	9	10	9	9	9	++	-	++	+

	E. coli		ETEC			Protease	Lipase	Amylase	Phytase
	x1	x3	x1	x3	pH7, x3	Protease	Lipase	Amylase	Phytase
L0121	9	10	9	9	9	++	+	++	+
L0122	9	10	9	11	9	++	+	+	++
L0123	9	11	9	11	9	++	+	+	++
L0124	9	12	9	11	10	++	+	+	+
L0125	9	12	9	11	9	++	+	+	+
L0126	9	9	9	9	9	++	-	+	+
L0127	9	14	9	9	9	++	-	+	++
L0128	9	12	9	12	9	++	-	+	++
L0129	9	13	9	12	9	++	-	+	+
L0130	9	9	9	9	9	++	-	+	+
L0131	9	9	9	9	9	++	+	+	+
L0132	9	9	9	9	9	++	+	+	+
L0133	9	12	9	11	10	++	+	+	+
L0134	9	9	9	9	9	++	-	+	++
L0135	9	12	9	11	9	++	-	+	++
L0136	9	11	9	11	9	++	+	+	+
L0137	9	11	9	11	10	++	+	+	+
L0138	9	9	9	9	9	++	-	+	+
L0139	9	11	9	11	9	++	+	+	+
L0140	9	9	9	9	9	++	+	+	+
L0141	9	9	9	9	9	++	+	+	++
L0142	9	9	9	9	9	++	+	+	++
L0143	9	9	9	9	9	++	+	+	++
L0144	9	9	9	9	9	++	+	+	+
L0145	9	9	9	9	9	++	+	+	+
L0146	9	11	9	11	10	++	+	+	+
L0147	9	9	9	9	9	++	-	+	+
L0148	9	11	9	11	10	++	-	+	+
L0149	9	11	9	11	10	++	-	+	+
L0150	9	11	9	11	10	++	+	+	++
L0151	9	11	9	11	10	++	+	+	+
L0152	10	11	9	11	10	++	+	+	+
L0153	10	12	9	12	11	++	+	+	+
L0154	9	9	9	9	9	++	+	+	++

표 2내지 6의 결과를 종합하여 대장균(E. coli)과 장독소성대장균(ETEC)에 항균효과를 보이며, pH 7로 중화시킨 후 장독소성대장균(ETEC)에 항균효과를 보이고, 아밀레이스(amylase), 라이페이스(lipase), 파이테이즈(phytase), 프로테이스(protease)를 생산하는 균주로 Lactobacillus reuteri PSC102 균주를 최종 후보로 선정하였다.

<실시예 2> Lactobacillus reuteri PSC102 균주 동정

16S rRNA 유전자 염기서열을 분석함으로써, 균주를 최종적으로 동정하였다. Genomic DNA extraction kit(Qiagen)을 이용하여 분리 균주로부터 genomic DNA를 추출한 다음, eubacterial 16S rDNA 클로닝을 위하여 forward primer(5'-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3')와 reverse primer(5'-AAG GAG GTG ATC CAG CC-3') 세트를 사용하여 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)을 수행하였다. 50 pmole 프라이머, 50 ng 템플레이트 DNA, 10×Tay DNA 중합효소 버퍼(polymerase buffer) 5㎕, Taq DNA 중합효소(Takara, Japen) 1U가 포함된 PCR 혼합물을 95 ℃에서 5분간 변성시킨 후에 95 ℃에서 1분, 55～60 ℃에서 1분, 72 ℃에서 1분간 30 cycle을 반복함으로써 PCR을 수행하였다. PCR 산물을 pSTBlue-1(Novagen, USA)에 클로닝 한 다음, BigDyeTM-terminator sequencing Kit과 ABI PRISM377 sequencer(Perkin-Elmer, USA)로 염기서열을 분석하였다.

최종 분리된 균주는 락토바실러스 루테리 PSC102(Lactobacillus reuteri PSC102; 수탁번호: KCCM12927P)이다. 도 1에 Lactobacillus reuteri PSC102 균주의 전자현미경(SEM) 사진을, 도 2에 Lactobacillus reuteri PSC102 균주의 계통수를 나타내었다. 표 7에 본 발명의 락토바실러스 루테리 PSC102(Lactobacillus reuteri PSC102; 수탁번호: KCCM12927P) 균주의 서열목록을 나타내었다.

서열번호

염기서열

1

ctggctcagg atgaacgccg gcggtgtgcc taatacatgc aagtcgtacg cactggccca actgattgat ggtgcttgca cctgattgac gatggatcac cagtgagtgg cggacgggtg agtaacacgt aggtaacctg ccccggagcg ggggataaca tttggaaaca gatgctaata ccgcataaca acaaaagccg catggctttt gtttgaaaga tggctttggc tatcactctg ggatggacct gcggtgcatt agctagttgg taaggtaacg gcttaccaag gcgatgatgc atagccgagt tgagagactg atcggccaca atggaactga gacacggtcc atactcctac gggaggcagc agtagggaat cttccacaat gggcgcaagc ctgatggagc aacaccgcgt gagtgaagaa gggtttcggc tcgtaaagct ctgttgttgg agaagaacgt gcgtgagagt aactgttcac gcagtgacgg tatccaacca gaaagtcacg gctaactacg tgccagcagc cgcggtaata cgtaggtggc aagcgttatc cggatttatt gggcgtaaag cgagcgcagg cggttgctta ggtctgatgt gaaagccttc ggcttaaccg aagaagtgca tcggaaaccg ggcgacttga gtgcagaaga ggacagtgga actccatgtg tagcggtgga atgcgtagat atatggaaga acaccagtgg cgaaggcggc tgtctggtct gcaactgacg ctgaggctcg aaagcatggg tagcgaacag gattagatac cctggtagtc catgccgtaa acgatgagtg ctaggtgttg gagggtttcc gcccttcagt gccggagcta acgcattaag cactccgcct ggggagtacg accgcaaggt tgaaactcaa aggaattgac gggggcccgc acaagcggtg gagcatgtgg tttaattgga agctacgcga agaaccttac caggtcttga catcttgcgc taaccttaga gataaggcgt tcccttcggg gacgcaatga caggtggtgc atggtggtcg tcagctcgtg tcgtgagatg ttgggttaag tcccgcaacg agcgcaaccc ttgttactag ttgccagcat taagttgggc actctagtga gactgccggt gacaaaccgg aggaaggtgg ggacgacgtc agatcatcat gccccttatg acctgggcta cacacgtgct acaatggacg gtacaacgag tcgcaaactc gcgagagtaa gctaatttct taaagccgtt ctcagttcgg actgtaggct gcaactcgcc tacacgaagt cggaatcgct ggtaatcgcg gatcagcatg ccgcggtgaa tacgttcccg ggccttgtac acaccgcccg tcacaccatg ggagtttgta acgcccaaag tcggtggcct aacctttatg gagga

본 발명의 Lactobacillus reuteri PSC102 균주를 MRS agar에서 배양하여 그람염색을 실시한 결과, 그람 양성균으로 밝혀졌다. 이 균주는 통성혐기성(facultative anaerobes)이고, 도 1과 같이 막대(rod)형태이며, 포자를 형성하지 않는다. 이 균주에 대한 카탈라아제(catalase) 생성 시험결과는 음성이고, 유산(lactic acid) 및 유기산을 생산하는 특성을 가지는바, 전형적인 락토바실러스가 가지는 형태 및 배양학적 특징을 나타내었다.

<실험예 1> Lactobacillus reuteri PSC102 균주의 당 분해능

API 50 CHL kit에 의한 49종의 탄수화물 이용성을 확인하였다. API 50CHL medium에 현탁하여 strip에 분주한 후 37°C에서 48시간 동안 배양하였고, 실험에 의한 strip의 판독은 각 tube의 색변화로 negative(-), positive (+) 등으로 판정하였으며, API 50 CHL database를 이용하여 동정하였다. 그 결과를 아래 표 8에 나타내었다.

No	Characteristics	Result	No	Characteristics	Result	No	Characteristics	Result
0	Control	-	16	Inositol	-	32	Inulin	+
1	Glycerol	+	17	Mannitol	+	33	Melezitose	-
2	Erythritol	-	18	Sorbitol	+	34	Raffinose	+
3	D-arabinose	-	19	α-Methyl-D-mannoside	+	35	Starch	+
4	Ribose D-ribose	+	20	α-Methyl-D-glucoside	-	36	Glycogen	+
5	D-xylose	+	21	N-Acethyl-glucosamine	-	37	Xylitol	-
6	L-xylose	+	22	Amygdalin	+	38	Gentiobiose	-
7	D-adonitol	-	23	Arbutin	+	39	D-Turanose	+
8	Methy-BD-xylopyranosicle	-	24	Esculin	+	40	D-Lyxose	-
9	D-galactose	+	25	Salicin	+	41	D-TAGatose	-
10	D-glucose	+	26	Celiobiose	+	42	D-fucose	+
11	D-fructose	+	27	Maltose	+	43	L-fucose	-
12	D-mannose	+	28	Lactose	+	44	D-arabitol	-
13	L-sorbose	+	29	Melibiose	+	45	L-arabitol	-
14	Rhamnose	-	30	Sucrose	+	46	GlucoNaTe	-
15	Dulcitol	-	31	Trehalose	+	47	2-keto-Gluconate	+

본 발명의 락토바실러스 루테리 PSC102(Lactobacillus reuteri PSC102; 수탁번호: KCCM12927P) 균주는 당분해 특성에서 lactose와 raffinose에 양성 반응을 보여 우유 또는 두유 요구르트 제조용 스타터로서 활용이 가능한 것으로 나타났다. 당분해능이 다양하게 나타나, 향후 산업용배지 혹은 산업현장에서 활용이 우수한 균주임을 확인하였다.

또한, Lactobacillus reuteri PSC102, Lactobacillus reuteri KCTC3594, Lactobacillus acidophillus의 효소 활성을 비교하였다. 최종 균주의 효소 활성은 API ZYM kit(Biomerieux, Marcy-I’Etoile, France)를 이용하여 측정하였다. MRS (Difco™) 액체 배지에 선별 균주를 접종하고 37°C에서 24시간 배양한 후 균체를 회수하여 멸균수로 3회 세척하고 멸균수에 현탁하여 시료를 준비하였다. 5 mL suspension medium(Biomerieux, Marcy-I’Etoile, France)에 탁도 5-6 Mcfarland(Biomerieux, Marcy-I’Etoile, France)로 조정하고, 현탁액을 ZYM kit의 각 큐플에 접종하여 37°C에서 4시간 배양한 후 표현 활성 증가와 용해를 도와주는 ZYM A, B 시약을 각각 큐플에 떨어뜨려 5분간 반응시킨 후 색의 변화를 관찰하여 효소 활성 정도를 측정하였다. 그 결과를 표 9에 나타내었다.

		Lactobacillus reuteri PSC102	Lactobacillus reuteri KCTC3594	Lactobacillus acidophillus
1	Control	0	0	0
2	Alkaline Phosphatase	0	0	0
3	Esterase	3	2	2
4	Esterase lipase	1	1	1
5	Lipase	0	0	0
6	Leucine aryamidase	5	5	4
7	Valine aryamidase	1	3	1
8	Cystine arylamidase	1	0	0
9	Trypsin	0	0	0
10	α-Chymotrypsin	0	0	0
11	Acid phosphatase	4	2	2
12	Naphthol-AS-BI-phosphohydrolase	4	2	2
13	α-Galactosidase	4	4	1
14	β-Galactosidase	1	5	4
15	β-glucoronidase	0	0	0
16	α-Glucosidase	5	2	1
17	β-Glucosidase	0	0	0
18	N-acyl-glucosaminidase	0	0	0
19	α-Mannosidase	0	0	0
20	α-Fructosidase	0	0	0

상기 표 9에서 보듯이, 본 발명의 락토바실러스 루테리 PSC102(Lactobacillus reuteri PSC102; 수탁번호: KCCM12927P) 균주의 당 분해 효능이 가장 우수한 것으로 나타났다. Lactobacillus reuteri PSC102는 지질에 대한 가수분해 효소인 esterase 및 esterase lipase에 대한 활성을 갖고 있었으나 protease 계열의 효소에도 활성을 갖는 것으로 나타났다. 한편, Raffinose나 stachyose 등을 분해하는 것으로 알려진 α-galactosidase에 대한 활성을 갖고 있었으며, β-galactosidase에 대해서도 약한 활성이 나타났다. 특히 acid phophatase는 보조사료 첨가제로 사용할 경우 사료 내에 인의 흡수를 증가시킬 수 있어 무기인의 사용을 감소시킬 수 있는데, 본 발명의 락토바실러스 루테리 PSC102(Lactobacillus reuteri PSC102; 수탁번호: KCCM12927P) 균주는 acid phophatase에 활성이 나타나는 점을 확인하였다.

<실험예 2> Lactobacillus reuteri PSC102 균주의 병원성 대장균 항균효과

이유자돈 세균성 설사병의 원인으로 알려진 장독소성대장균(ETEC)과, 설사병 분변에서 분리한 야외균주(E. coli)를 대상으로 Lactobacillus reuteri PSC102 균주의 항균효과를 확인하였다. Lactobacillus reuteri PSC102 균주의 배양액 원액(pH 3.5)과 중화 배양액(pH 7.0)을 각각 상층액(100%, 50%, 25%, 12.5%, 6%, 3%, 1.5%)로 TSB 배지에 혼합하고, 시험균주를 10⁵ CFU/ml의 농도로 50㎕ 접종한 뒤, 37 ℃에서 24시간 배양한 후 TSA 고체배지에서 균수를 측정하였다. 실험결과를 표 10에 나타내었다.

병원성균주	상층액의 농도(%), pH3.5
병원성균주	100	50	25	12.5	6.2	3.1	1.5	0.7
ETEC-1	N	1	2	4	3	4	4	4
ETEC-2	N	N	--	2	2	4	4	4
E. coli-1	N	N	--	2	4	4	4	4
E. coli-2	1	1	1	3	4	4	4	4
E. coli-3	N	1	1	3	4	4	4	4
E. coli-4	N	1	1	2	4	4	4	4
E. coli-5	1	1	1	2	4	4	4	4
병원성균주	상층액의 농도(%), pH 7.0
병원성균주	100	50	25	12.5	6.2	3.1	1.5	0.7
ETEC-1	1	1	2	3	3	3	4	4
ETEC-2	1	1	2	2	2	4	4	4
E. coli-1	N	1	2	2	3	4	4	4
E. coli-2	1	2	3	3	4	4	4	4
E. coli-3	1	1	2	3	3	4	4	4
E. coli-4	N	1	2	2	3	4	4	4
E. coli-5	1	1	1	2	3	4	4	4
N : No growth, 1 :<10²CFU/ml, 2: <10³CFU/ml, 3: <10⁵CFU/ml, 4: <10⁷CFU/ml

상기 표 10에서 보듯이, 본 발명의 Lactobacillus reuteri PSC102 균주는 장독소성대장균(ETEC)과 대장균(E. coli)에 대해 항균효과를 나타내며, 이에 따라 장독소성대장균(ETEC)과 대장균(E. coli)에 의해 유발되는 증상, 질환 등의 개선, 치료 효과가 있는 것으로 판단하였다.

<실험예 3> Lactobacillus reuteri PSC102 균주의 내산성

생균제로서 기능을 발휘하기 위해서는 pH 3 이하의 조건인 위를 통과하여야 한다. Lactobacillus reuteri PSC102 균주가 내산성 프로바이오틱스로서 적합한 균주인지 확인하기 위해 5 ml의 MRS 배지에 1N HCl을 첨가하여 pH 2, 3, 4, 5, 대조군(pH 7.0)으로 pH를 조절한 후, 10⁵ CFU/ml 이상인 Lactobacillus reuteri PSC102 균주와 Lactobacillus reuteri KCCM 40717 균주 0.1%를 넣고 0시, 1시, 6시, 12시 간격으로 성장을 확인하였다. 1N HCl로 pH 2, 3, 4, 5, 대조군(pH 7.0)으로 각각 조정한 MRS 액체배지에 Lactobacillus reuteri PSC102 균주를 접종한 뒤, 37℃에서 배양하면서 배양시간별 생균수의 변화를 관찰하였다. 관찰 결과를 표 11에 나타내었다.

Lactobacillus ruteri PSC102	0시 (log cfu/ml)	1시간 (log cfu/ml)	6시간 (log cfu/ml)	12시간 (log cfu/ml)
pH 2	5.6532125	3.748188	3.53147892	0
pH 3	5.6532125	4.812913	3.74818803	0
pH 5	5.6532125	4.973128	4.53147892	7.653212514
pH 7	5.6532125	5.986772	6.53147892	10.74818803
Lactobacillus ruteri KCTC3594	0시 (log cfu/ml)	1시간 (log cfu/ml)	6시간 (log cfu/ml)	12시간 (log cfu/ml)
pH 2	5.1931246	0	0	0
pH 3	5.1931246	4.361728	0	0
pH 5	5.1931246	4.973128	5.10037055	5.170261715
pH 7	5.1931246	5.986772	6.53147892	9.161368002

상기 표 11에서 보듯이, 본 발명의 Lactobacillus reuteri PSC102 균주는 강산성인 pH 2 및 3에서도 6시간 이상 생존하는 것을 확인하였으며, 표준균주인 Lactobacillus reuteri KCTC3594 균주보다 내산성이 뛰어난 것으로 나타났다.

<실험예 4> Lactobacillus reuteri PSC102 균주의 내담즙성

담즙염(bile salt) 0%, 0.1%, 0.3%, 1%를 MRS 액체배지 5ml에 넣고, 본 발명의 Lactobacillus reuteri PSC102 균주와 Lactobacillus reuteri KCCM 40717 균주를 각각 10⁵ CFU/ml으로 희석한 희석물 0.1%를 넣고 0시, 1시, 6시, 12시 간격으로 균수를 측정하여 성장을 확인하였다. 실험 결과를 표 12에 나타내었다.

Lactobacillus ruteri PSC102	0시 (log cfu/ml)	1시간 (log cfu/ml)	6시간 (log cfu/ml)	12시간 (log cfu/ml)
Bile 0.1%	5.2253093	5.274158	5.40483372	7.278753601
Bile 0.3%	5.2253093	5.25042	5.36921586	6.826074803
Bile 1%	5.2253093	5.173186	5.32221929	6.531478917
Bile 0%	5.2253093	5.361728	6.65321251	9.193124598
Lactobacillus ruteri KCCM 40717	0시 (log cfu/ml)	1시간 (log cfu/ml)	6시간 (log cfu/ml)	12시간 (log cfu/ml)
Bile 0.1%	5.1931246	5.222716	5.53147892	7.278753601
Bile 0.3%	5.1931246	5.25042	5.36921586	6.276461804
Bile 1%	5.1931246	5.173186	5.2764618	5.193124598
Bile 0%	5.1931246	5.748188	6.53147892	9.093421685

상기 표 12에서 보듯이, 담즙염 1%에서도 본 발명의 Lactobacillus reuteri PSC102 균주가 생존하는 것으로 나타났으며, 이에 따라 본 발명의 Lactobacillus reuteri PSC102 균주는 내담즙성이 우수한 것으로 나타났다.

<실험예 5> Lactobacillus reuteri PSC102 균주의 항생제 내성

Lactobacillus reuteri PSC102 균주를 10⁶ CFU/ml로 배양하여 100 ㎕를 96-well 플레이트에 넣고, 희석된 항생제를 100 ㎕ 첨가한 뒤, 37 ℃의 인큐베이터에 넣고 24시간 후 균의 생육을 조사하여 최소발육억제농도(MIC)와 최저살균농도(MBC)를 측정하였다.

항생제	Lactobacillus ruteri PSC102		Lactobacillus ruteri KCCM 40717		Staphylococcus aureus ATCC25922		Enterotoxigenic E. coli
항생제	MIC (㎍/ml)	MBC (㎍/ml)	MIC (㎍/ml)	MBC (㎍/ml)	MIC (㎍/ml)	MBC (㎍/ml)	MIC (㎍/ml)	MBC (㎍/ml)
Cephalexin	>256	>256	>256	>256	2	4	32	64
Colistin sulfate	>64	>128	>64	>128	>64	>128	0.05	1
Enrofloxacin	8	16	4	8	0.05	1	0.025	1
Cefalonium	32	64	64	32	2	4	16	32
Amoxicillin trihydrate	4	2	1	1	0.5	2	1	2
Penicillin G procaine	32	64	16	64	0.05	1	32	64
Norfloxacin	>256	>256	>256	>256	0.5	4	0.5	1
Spectinomycin	64	128	8	128	8	64	2	4
Tylosin base	4	8	2	4	1	8	32	64
Cefuroxine sodium	2	32	1	8	0.05	2	1	2
Florfenicol	2	16	2	16	2	8	4	16
Penicillin G Benzathine	4	8	2	4	0.05	2	16	32
Gentamicin sulfate	64	128	32	128	4	16	1	2
Streptomycin sulfate	64	128	32	128	4	16	1	2
D.H.S.M	64	256	32	256	4	16	1	2

본 발명의 Lactobacillus reuteri PSC102 균주는 대부분의 항생제에 내성이 있는 것으로 나타났으며, Lactobacillus ruteri KCCM 40717, Staphylococcus aureus ATCC25922, Enterotoxigenic Escherichia coli의 항생제 내성에 비해 현저하게 높은 것으로 나타났다. 즉, 본 발명의 Lactobacillus reuteri PSC102 균주를 항생제가 포함된 사료, 사료 첨가제 등에 병용하여 프로바이오틱스로서의 효과를 가질 수 있다.

<실험예 6> Lactobacillus reuteri PSC102 균주의 단회독성시험

Lactobacillus reuteri PSC102 균주의 안전성을 평가하기 위해 단회경구독성시험을 실시하였다. 시험군은 대조군(control, 0.85% NaCl), 저용량군(10⁷ CFU/ml), 중용량군(10⁹ CFU/ml) 그리고 고용량군(10¹¹ CFU/ml)으로 구성하였으며, 하루 절식시킨 7주령 Sprague-Dawley 계통의 특정병원균 부재(Specific pathogen free, SPF) 랫트에 1회 경구 투여하고 14일 동안 관찰하였다. 실험 결과를 표 14에 나타내었다.

Sex	Dose	Days after administration														Final	LD₅₀
Sex	(mg/kg)	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12	13	14	mortality (%)	LD₅₀
Male (total n=20 with n=5 at each group)	1.2×10¹¹ (High)	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	>10¹¹
	1.6×10⁹ (Middle)	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	CFU/㎖
	2.1×10⁷ (Low)	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0
	Control (saline)	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0
Female (total n=20 with n=5 at each group)	1.2×10¹¹ (High)	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	>10¹¹
	1.6×10⁹ (Middle)	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	CFU/㎖
	2.1×10⁷ (Low)	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0
	Control (saline)	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0

모든 암수 시험군에서 Lactobacillus reuteri PSC102 균주에 기인한 사망은 관찰되지 않았다. 또한, Lactobacillus reuteri PSC102 균주에 의한 독성증상과 특이할 만한 임상증상도 나타나지 않았다. 따라서 Lactobacillus reuteri PSC102 균주는 암수 모두에서 LD⁵⁰이 10¹¹ CFU/ml 이상으로 추정되며, GRAS에 속하는 것으로 판단하였다.

<실험예 7> Lactobacillus reuteri PSC102 균주의 배양조건 설정

MRS 액체 배지에 1% Lactobacillus reuteri PSC102 균주를 접종하고 37 ℃에서 48시간 정체배양과 진탕배양을 실시하였다. 도 3에 배양 중 5ml의 시료에 대한 균수(LogCFU/ml), pH 변화, OD 그리고 Brix(%)를 나타내었다. OD 값은 진탕배양보다 정치배양에서 높지만 Brix(%)는 진탕배양보다 낮으므로 Lactobacillus reuteri PSC102 균주는 진탕배양보다 정체배양에서 성장이 유리한 것으로 나타났다.

<실시예 3> Lactobacillus reuteri PSC102 균주 파라프로바이오틱스 제조

Lactobacillus reuteri PSC102 균주의 NaOH에 대한 MIC 농도(1.9 mg/ml)와 MBC 농도(3.8 mg/ml)를 기준으로 1/3 MIC, MIC, 1/3 MBC, MBC 농도로 NaOH를 처리하여 파라프로바이오틱스를 제조하였다. 또한, Lactobacillus reuteri PSC102 균주를 100 ℃에서 열처리하여 파라프로바이오틱스를 제조하였다.

도 4에 NaOH 처리한 경우, 도 5에 열처리한 경우의 Lactobacillus reuteri PSC102 균주의 파라프로바이오틱스를 나타내었다. 도 4에서 보듯이, MBC 농도로 30분 처리할 경우 파라프로바이오틱스를 제조할 수 있었으며, 도 5에서 보듯이, 80~100 ℃에서 15분 이상 열처리 할 경우 파라프로바이오틱스를 제조할 수 있었다.

도 6에 Lactobacillus reuteri PSC102 균주의 파라프로바이오틱스를 전자현미경(SEM)로 관찰한 결과를 나타내었다. 80 ℃에서 30분 열처리한 경우와 NaOH MBC 농도에서 30분 이상 처리한 경우를 비교하면, NaOH를 처리한 경우 세포벽에 더 많은 구멍이 형성되는 점을 확인하였다. 80 ℃에서 30분 열처리한 경우에는 세균의 세포벽이 노출되었다. 또한, NaOH 처리 시에는 세균의 세포벽은 보존되지만 세균 내부 물질이 모두 유출되어 bacterial ghoust가 되는 것을 확인하였다.

<실험예 8> Lactobacillus reuteri PSC102 균주의 면역증강효과

본 실험에서는 Lactobacillus reuteri PSC102 균주의 면역증강효과를 확인하였다. 역전사(RT) PCR에 의한 사이토카인 mRNA의 정량 분석을 위해 RAW 264.7 세포를 1×10⁵ cells/ml로 3cm culture dishes, 24 well plate에 분주하고 12시간 배양한 뒤 PBS(1×) LPS(100 ng/ml), Lactobacillus reuteri PSC102 균주(LR), NaOH로 유도한 파라프로바이오틱스(LGR), 열처리하여 제조한 파라프로바이오틱스(hLR)를 각각 1.0×10⁸CFU/ML로 처리하였다. TRIzol® reagent (Invitrogen)를 사용하여 총 RNA를 추출하였다. cDNA는 RNA 펠렛을 DEPC 처리된 물로 재부유한 뒤 -70 ℃에 cDNA Bionner Premix를 사용하여 동결하였다. 각 시로에서 추출된 총 RNA(5 ㎍)는 cDNA로 역전사하였다.

Real time-PCR(CFX96, Bio-Rad 실험실, 영국 Hempstead)을 수행하기 위해 1 ㎕의 cDNA를 10 ㎕의 10 pM 커스터마이징 프라이머를 포함하는 10 ㎕의 2 X iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad, CA, USA)로 증폭하고 반응 범위를 Bio-Rad 실시간 열 순환기에서 정량화하였다. 초기변성을 위해 95 ℃에서 5분간 반응시킨 후 전체 40 사이클을 증폭시켰다. 각 사이클은 95 ℃에서 10초, 60 ℃(iNOS, IL-1β), 56 ℃(TNF-α, IL-6) 및 55 ℃(Cox-2)에서 어닐링 및 72 ℃에서 20초 증폭하였다. 2^-ΔΔCt 방법을 사용하여 유전자 발현의 상대적 변화를 계산하였다. β-액틴은 표준 대조군으로 사용되었다. 유전자 발현은 자극되지 않은 샘플의 정규화된 발현에 대한 배수 변화로 표현되었다. PCR 증폭에 사용되는 프라이머는 표 15에 나타내었다.

Genes	Oligonucleotide sequence (5'-3')
iNOS	F: TGTGGCTACCACATTGAAGAA R: TCATGATAACGTTTCTGGCTCTT
IL-1β	F: TGAGCACCTTCTTTTCCTTCA R: TTGTCTAATGGGAACGTCACAC
TNF-α	F :CTGTAGCCCACGTCGTAGC R: GGTTGTCTTTGAGATCCATGC
IL-6	F: CTAATTCATATCTTCAACCAAGAGG R :TGGTCCTTAGCCACTCCTTC
Cox-2	F: CACTACATCCTGACCCACTT R: ATGCTCCTGCTTGAGTATGT
β -actin	F: GTCATCACTATTGGCAACGAG R: TTGGCATAGAGGTCTTTACGG

도 7에서 보듯이, 사이토카인은 모두 PBS 처리된 대조군과 비교하여 유의하게 발현되었(P < 0.05)으나, 열처리에 따른 파라프리바이오틱스(hLR)를 처리한 경우 가장 많은 발현이 나타났다. 모든 사이토카인 발현이 촉진됨에 따라 면역저하상태를 개선할 수 있으며 이에 따른 면역 증진 효과가 발휘될 수 있다. 한편, Cox-2, iNOS도 함께 증가하여 염증 반응도 함께 증가되는 것으로 나타났는데, 일정한 수준에서 염증 반응 활성화는 면역 증진 효과와 밀접한 관계가 있다. 통상적으로 유산균체 혹은 생균제는 면역 조절제로 작용한다. 염증 반응이 일정 수준의 이상이 되면 억제 반응이 나타나며, 면역 반응이 저하되면 염증 반응과 함께 면역 반응이 증진된다.

<실험예 9> Lactobacillus reuteri PSC102 균주 열처리에 의한 파라프로바이오틱스의 면역증진효과

본 실험에서는 상기 실험예 8에서 가장 많은 사이토카인을 발현시킨 열처리에 의한 파라프로바이오틱스(hLR)의 면역증진효과를 확인하였다.

동물실험은 경북대학교 실험동물 관리 및 사용 위원회(KNU-2021-50)의 승인을 받았다. 4주령의 특정 병원체가 없는 Sprague Dawley 랫트를 Orient Bio Inc.(경기도, 대한민국)에서 구입하였다. 랫트는 실온, 22~26 ℃; 상대 습도, 55~70 %; 24시간 동일한 명암 주기에서 일주일 동안 적응시켰으며, 여과된 수돗물과 표준 펠릿 식이는 자유롭게 공급하였다. 랫트는 임의로 하기 표 16과 같이 8개 그룹으로 분류하였다. 대조군으로는 열처리하지 않은 Lactobacillus reuteri PSC102 균주(LR)를 사용하였다.

Groups	Description
Group I	Normal control group - received only water and normal diet.
Group Ⅱ	Levamisole group - received known immunostimulant (Levamisole, 3 mg/kg/day)
Group Ⅲ	CTX group - received known immunosuppresant (Cyclophopshamide, 5 mg/kg/day)
Group Ⅳ	CTX group - received a known immunostimulant (levamisole, 3 mg/kg/day)
Group V	Treatment group - received low dose (10⁶ CFU/kg/day) heat-killed hLR (LhLR)
Group Ⅵ	Treatment group - received medium dose (10⁹ CFU/kg/day) heat-killed hLR (MhLR)
Group Ⅶ	Treatment group - received high dose (10¹¹CFU/kg/day) heat-killed hLR (HhLR)
Group Ⅷ	Treatment group - received (1011 CFU/kg/day) Lactobacillus reuteri PSC102 (LR)

정상 대조군(Group I)과 레바미솔(Levamisole) 그룹(Group Ⅱ)을 제외하고 6개 그룹은 3일간 사이클로포스파미드(Cyclophopshamide, CTX)를 복강 내 주사하여 면역 억제를 유도하였다. 렛트에게 레바미솔, LhLR, MhLR, HhLR 및 LR을 21일간 매일 1ml씩 경구투여하였다. 투여량 조절을 위해 3일 간격으로 체중을 측정하였다. 21일 후, 렛트를 희생시키고 혈액과 장기를 수집하였다. 혈액은 혈청 분리기 튜브에 수집하고 10분간 6,000 rpm에서 원심분리하였다. 분리된 혈청은 효소 결합 면역 흡착 분석법(ELISA)에 사용할 때까지 -70℃에 보관하였으며, 장기는 칭량 후 무균처리 하였다.

9-1. 렛트의 체중 변화

도 8에서 보듯이, CTX의 복강내 주사 후 면역 억제된 랫트 그룹 Ⅲ은 모두 체중이 감소하는 것으로 나타났다. 한편, CTX 처리군과 비교하여 hLR(L, M, H)과 레바미솔 그룹은 체중이 꾸준히 증가하는 것으로 나타났다.

9-2. 면역 기관 지수

표 17에서 보듯이, 면역기관지수는 CTX 처리군에서 유의하게 감소하였으며, LR 또는 hLR 투여 후 유의하게 증가하는 것을 확인하였다.

Groups	Thymus index (mg/g)	Spleen index (mg/g)
Normal control	1.87±0.09^a	2.03±0.09^a
Levamisole	1.98±0.04^a	2.16±0.04^a
CTX	1.45±0.06^b	1.17±0.06^b
Levamisole+CTX	1.94±0.17^a	2.04±0.17^a
LhLR	1.86±0.16^a	2.10±0.16^a
MhLR	1.94±0.08^a	2.43±0.08^a
HhLR	2.20±0.12^c	2.89±0.12^c
LR	1.91±0.15^a	2.09±0.15^a

9-3. 비장의 조직학적 관찰

면역기관인 비장의 조직 형태를 조사하기 위해 희생된 랫트의 비장은 10% buffered formalin solution에 고정하고 hematoxylin 및 eosin (HE) 염색하였다. 도 9에 비장 조직의 전자현미경 관찰 결과를 나타내었다. 도 9에서 보듯이, 정상그룹의 비장은 병변이 없고 비장세포가 조밀하게 배열되었으나, CTX 처리에 따라 비장세포가 괴사하면서 불규칙한 배열을 보이는 것으로 나타났다. hLR 처리그룹에서는 비장세포의 미세구조가 조밀하게 배열되었으며, 병변이 없고 세포간 공간이 적어 정상 그룹과 유사한 양상을 보였다. LR 처리그룹도 CTX 처리그룹에 비해 비교적 조밀한 배열을 보였다. 이에 따라 LR 또는 hLR은 CTX에 의해 유도된 랫트의 비장 손상을 개선, 예방 또는 치료할 수 있음을 확인하였다.

9-4. 혈액분석

혈액면역세포에 대한 Lactobacillus reuteri PSC102 균주의 영향을 평가하기 위해 혈액분석을 수행하였다. 희생된 랫트로부터 수집한 전혈을 이용하여 CBC 분석을 수행하였다. 백혈구(WBC), 림프구(lymphocyte), 과립구(granulocyte) 및 일반적으로 호염기구, 호산구 및 단핵구를 포함하는 중간범위 절대계수(MID)의 수는 URIT-300 Vet Plus(URIT Medical Electronic Co., Ltd., Guangxi)를 사용하였다.

도 10에 혈액면역세포 수를 나타내었다. CTX 처리에 따라 감소한 혈액면역세포수는 hLR 처리에 따라 증가하는 것으로 나타났다.

9-5. 호중구 이동 및 식균 작용 분석

호중구는 감염 또는 염증 부위로 이동하여 사이토카인을 방출하고, 다른 면역세포를 감염 또는 염증 부위로 유인하여 면역작용을 증폭시키는 기능이 있다고 알려져 있다. Histopaque®(Sigma-Aldrich, USA)를 사용하여 전혈에서 호중구를 분리하였다. 동일한 부피의 전혈과 Histopque-1077을 15 ml 원뿔형 튜브에 첨가하고 실온에서 30분 동안 400 ×g에서 원심분리하였다. 불투명한 경계면의 0.5 cm 이내까지 상층을 조심스럽게 흡인하였다. 수집된 계면을 10 ml의 등장성 PBS로 세척하고 10분 동안 250 ×g에서 원심분리하였다. 수집된 펠릿을 10 % FBS가 보충된 DMEM에 재현탁하고, 혈구계에 의해 트리판 블루를 사용하여 세포를 계수하였다.

호중구의 이동은 CytoselectTM 24웰 이동 분석 키트(3 ㎛, 형광 측정 형식)(Cell Biolabs, INC. CA, USA)를 사용하여 제조업체의 프로토콜에 따라 수행하였다. 분리된 호중구는 무혈청 DMEM 배지에서 100 ㎕의 5 x 10⁶ cells/ml를 삽입물 내부에 첨가한 다음 10 % FBS를 포함하는 배지 500 ㎕를 하부 웰에 첨가하였다. 이동성 세포를 24시간 동안 인큐베이션하고 배지를 내부 삽입물로부터 흡인하였다. 인큐베이션은 200 ㎕의 세포 분리 용액이 들어 있는 깨끗한 웰에 삽입물을 옮긴 후 37 ℃에서 30분 동안 실행하였다. 삽입물을 분리 용액으로 부드럽게 기울여 세포를 막의 밑면에서 완전히 제거하였다. 이동성 세포를 포함하는 400 ㎕의 배지를 분리 용액으로 옮겼다. 180 ㎕의 혼합물과 60 μL의 4X 용해 완충액/CyQuant® 염료 용액(Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA, USA)을 96-well 플레이트로 옮기고 실온에서 20분 동안 인큐베이션하였다. 마지막으로 200μL의 혼합물을 96웰 플레이트에 옮겨 480nm에서 형광을 판독하고 상대 형광 단위(RFU)로 표시하였다.

호중구의 식균작용은 Zymosan을 이용하였으며, CytoselectTM 96-well 식균작용 분석(Cells biolabs, INC. CA, USA)의 제조업체 프로토콜에 따라 수행하였다. 호중구를 수확하고 100μL의 106개 세포/ml를 96-well 플레이트에 접종한 다음 각 웰에 10μL 자이모산을 첨가하였다. 혼합물을 37℃ 및 5% CO₂에서 2시간 동안 배양하였다. 원심분리 후 배양액을 흡인하여 제거하고 차가운 PBS로 세척하였다. 100 μL의 고정 용액을 각 웰에 첨가하고 실온에서 5분 동안 인큐베이션하였다. 고정 용액을 원심분리 및 부드러운 흡인으로 제거한 다음 PBS로 두 번 세척하였다. 미리 희석된 차단 용액 100μL를 첨가하고 오비탈 쉐이커에서 실온에서 60분 동안 배양하였다. 후속적인 원심분리 및 2회 세척 후, 미리 희석된 투과성 용액 100 ㎕를 첨가하고 실온에서 5분 동안 배양하였다. 다시 원심분리 및 세척 후, 100 ㎕의 검출 항체를 첨가하였다. PBS로 세척한 후 각 웰에 50 ㎕의 검출 완충액을 첨가하고 오비탈 쉐이커 상에서 실온에서 10분 동안 배양하였다. 반응은 100 ㎕의 기질을 추가하고 37℃에서 20분 동안 배양하였다. 마지막으로 50 ㎕의 정지 시약을 첨가하고 마이크로플레이트 리더(BioTek Instruments, Inc. Winooski, USA)로 405 nm에서 흡광도를 판독하였다.

도 11에 총 호중구(A), 호중구의 이동(B), 호중구의 식균작용(C)을 나타내었다. CTX 처리그룹은 호중구 수를 감소시키고 호중구의 이동 및 식균작용을 감소시켰다. hLR은 호중구 수를 증가시키고, 호중구의 이동 및 식균작용을 증가시키는 것으로 나타났다(p < 0.05).

9-6. 비장세포 증식

랫트의 비장 세포는 무균상태를 유지하며 얼음 위의 Hank's Balanced Salt Solution(HBSS)(Gibco Life Technologies, New York, NY, USA)이 들어 있는 소독된 튜브에 보관하였다. 3 ml 주사기의 플런저를 사용하여 균질화시키고 70 ㎛ 미세 나일론 세포 여과기(BD Bioscience, CA, USA)로 여과하였다. 수집된 세포를 1,800 rpm에서 5분 동안 원심분리하였다. 세포를 RBC 용해 완충액에 재현탁하고 2% FBS가 보충된 PBS를 함유하는 FACS 완충액으로 용해된 RBC를 제거하기 위해 1,800 rpm에서 5분 동안 원심분리하였다. 상층액을 버리고 PBS로 3회 세척하였다. 펠렛을 Roswell Park Memorial Institute(RPMI)-1640(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)에 재현탁하고 세포수를 혈구계와 함께 트리판 블루 염료 배제법으로 측정하였다.

비장세포의 증식 분석은 Con A와 LPS를 사용하여 수행하였다. FBS(10%) 및 페니실린/스트렙토마이신(1%)을 함유하는 RPMI-1640 배지에서 96-well 플레이트의 각 웰에 대조군 및 처리군으로부터 200 ㎕의 4 × 10⁶ 세포/ml를 접종하였다. 세포를 37℃에서 72시간 동안 배양하였다. 5 mg/ml의 MTT 시약(10 ㎕)을 각 웰에 첨가한 다음 디메틸 설폭사이드(200 ㎕/well)를 첨가하고, 흡광도를 570 nm에서 측정하였다. 증식 지수는 처리된 세포의 광학 밀도(OD) / 대조 세포의 광학 밀도(OD)로 계산하였다.

면역세포의 증식은 면역 활성화의 특징이기 때문에 세포 매개 면역은 비장세포의 증식에 따라 평가할 수 있다. 도 12의 A에서 보듯이, CTX 처리에 따라 비장세포수가 감소하였으나, LR 또는 hLR 처리에 따라 비장 세포 수가 증가하는 것으로 나타났다. 또한 도 12의 B에서 보듯이, CTX 처리에 따라 Con A 또는 LPS 자극에 의해 비장 림프구의 증식이 억제되었으나, LR 또는 hLR의 처리에 따라 비장 림프구의 증식이 유의하게 증가하는 것으로 나타났다.

9-7. 흉선 T세포 발현

랫트의 흉선 세포는 상기 9-6과 동일하게 처리하였다. 흉선 T 림프구 표현형은 FACS 튜브로 수확하여 1 × 10⁶ cells/ml의 농도에서 수행하였다. T 세포는 항-래트 항체로 염색되었다(항-CD3+(APC-접합), 항-CD4+(PE-Cy7-접합), 항-CD8+(FITC-접합), 항-CD45RA+(PE-접합) 및 항-CD28+(BV711-접합)). 10⁶ cells/ml의 10 ㎕를 첨가하고 진탕한 다음 배양하고 4 ℃에서 30분 동안 암실에서 측정하였다. 결합되지 않은 항체를 FACS 완충액으로 세척하여 제거한 뒤, 현탁된 세포를 300 ×g에서 5분 동안 원심분리하였다. 그런 다음 유세포 분석을 위해 400 ㎕의 FACS 완충액에 재현탁하였다. CD3 나이브 T 세포, CD4 Th, CD8 CTL, CD45RA 및 CD28 조절 T 세포(Treg)를 확인하였다. BD FACSAriaTM III(BD Biosciences, San Diego, CA, USA)의 FACSDiva 버전 6.1.3 소프트웨어가 포함된 다색 FACS를 사용하여 데이터를 수집 및 분석하였다.

도 13에서 보듯이, 흉선에서 CD3의 발현은 CTX의 처리에 따라 억제되었으며, LR 또는 hLR 처리시 CD3의 억제를 회복하였다. 또한 흉선에서 대부분의 림프구는 성숙되었으며, CD4 및 CD8을 발현하였다. CD4+/CD8+의 백분율은 CTX 처리군과 비교하여 LR 또는 hLR 처리군에서 높게 나타났다. 도 13의 A는 흉선 조직에서 CD4+ 및 CD8+ T 림프구 발현을 나타낸 것이고, B는 CD3+, C는 CD4+/CD8-(R1 영역), D는 CD4+/CD8+(R2 영역), E는 CD4-/CD8+(R3 영역) 및 F는 CD4-/CD8-(R4 영역)을 나타낸 것이다.

9-8. PBMC T 세포 발현

혈액단핵세포(PBMC)의 T 림프구 표현형은 상기 9-7과 동일하게 분석하였다. 도 14에서 보듯이, CD3의 발현은 CTX 처리에 따라 유의하게 억제되었으며, LR 또는 hLR의 처리에 따라 억제가 회복되는 것을 확인하였다. 분화된(CD4+ 또는 CD8+ 단일 염색) 림프구의 차이는 그룹 간에 통계적으로 유의하지 않았으며, 모든 그룹의 CD4+ 및 CD8+ 수준은 각각 70~80% 및 20~30%인 랫트 PBMC의 CD4+ 및 CD8+ 림프구의 정상 수준으로 나타났다.

도 14의 D에서 보듯이, CD4+/CD8+의 발현은 고용량의 hLR(HhLR) 및 LR 처리에 따라 유의하게 역전되었으며, 도 15 및 도 16에서 보듯이, CD4+ 및 CD8+의 CD45RA+ 및 CD28+로의 발현에서, CD4+CD45RA+CD28-(HhLR 및 LR)과 CD8+CD45RA+CD28-(HhLR 및 LR)이 회복되었으며, CD8+CD45RA-CD28+의 경우 CTX 그룹에 비해 LhLR 처리에 따라 증가하는 것으로 나타났다.

9-9. 비장 T 세포 발현

비장의 T 림프구 표현형은 상기 9-7과 동일하게 분석하였다. 도 17에서 보듯이, 비장의 CD3 세포 수준은 CTX 처리에 의해 억제되었으며, LR 또는 hLR 처리에 따라 증가하는 것으로 나타났다. 비장세포 hLR 처리군에서 CD4+ 단일 염색의 백분율은 CTX 처리군보다 유의하게 더 높았다. CD8+ 단일 염색 비장세포의 비율은 그룹 간에 유의한 차이가 없었다. hLR 처리는 CD8+ 세포독성 T 세포(12 - 15%)와 비교하여 림프구를 CD4+ 도우미 T 세포(75% 이상)로 분화하는 데 유리한 것으로 나타났다. 도 18 및 도 19에 의하면, CD4+ 및 CD8+의 CD45RA+ 및 CD28+로의 발현에서, LR 또는 hLR 처리에 따라 CD4+CD45RA+CD28-의 유의미한 감소를 나타내었지만 CD4+CD45RA-CD28+의 발현은 통계적으로 유의하지 않았다. 또한, CD8+CD45RA+CD28-는 LR 또는 hLR 처리에 의해 증가하였으며, CD8+CD45RA-CD28는 통계적으로 유의하지 않았다.

9-10. 사이토카인 발현

혈청에서 IL-2, IL-4, IL-6, IFN-γ, TNF-α, IL-10 및 IL-12A의 수준을 조사하였다. 사이토카인 농도는 제조업체의 프로토콜(ELK Biotechnology, 무한, 중국)에 따라 ELISA에 의해 결정하였다. 100 ㎕의 시료와 표준물질을 각 웰에 첨가한 뒤 37 ℃에서 2시간 배양하였다. 세척 완충액으로 3회 세척한 후 희석된 비오틴화 항체 칵테일 100 ㎕를 각 웰에 첨가하고 37 ℃에서 1시간 동안 배양하였다. 웰을 세척 완충액으로 다시 3회 세척하고 희석된 스트렙타비딘-HRP 100 ㎕를 각 웰에 첨가하고 37 ℃에서 1시간 동안 배양하였다. 세 번 세척한 후 TMB 기질 90 ㎕를 각 웰에 첨가하고 37 ℃에서 20분 배양하였다. 마지막으로 50 ㎕의 정지 시약을 첨가하고 마이크로플레이트 리더(BioTek, Winooski, VT, USA)에서 450 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 표준 곡선을 생성하여 단백질의 농도를 결정하였고, 그 결과를 pg/ml로 표시하였다.

도 20에서 보듯이, CTX 처리에 따라 사이토카인의 농도가 감소하였으며, LR 또는 hLR 처리에 따라 사이토카인 농도가 증가하는 것으로 나타났다. 구체적으로 hLR 처리에서 IL-4, IL-6, IFN-γ 및 TNF-α는 중간 및 고용량 수준(M, H)에서 양성 대조군에 비해 유의한 증가(p<0.05)를 보인 반면, IL-2, IL-10 및 IL-12A는 고용량(H) 그룹에서 hLR 처리에 따라 양성 대조군에 비해 현저히 향상되었다(p < 0.05). 따라서, LR 또는 hLR은 CTX에 의해 유도된 사이토카인 발현 감소를 역전시킬 수 있으며, hLR은 특히 면역자극효과가 우수한 것으로 나타났다.

한국미생물보존센터(국외)

KCCM12927P

20210112

<110> Kyungpook National University Industry-Academic Cooperation Foundation REPUBLIC OF KOREA(Animal and Plant Quarantine Agency) <120> Novel Lactobacillus reuteri PSC102 strain and use thereof <130> 2021-0468-KR <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1475 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lactobacillus reuteri PSC102 <400> 1 ctggctcagg atgaacgccg gcggtgtgcc taatacatgc aagtcgtacg cactggccca 60 actgattgat ggtgcttgca cctgattgac gatggatcac cagtgagtgg cggacgggtg 120 agtaacacgt aggtaacctg ccccggagcg ggggataaca tttggaaaca gatgctaata 180 ccgcataaca acaaaagccg catggctttt gtttgaaaga tggctttggc tatcactctg 240 ggatggacct gcggtgcatt agctagttgg taaggtaacg gcttaccaag gcgatgatgc 300 atagccgagt tgagagactg atcggccaca atggaactga gacacggtcc atactcctac 360 gggaggcagc agtagggaat cttccacaat gggcgcaagc ctgatggagc aacaccgcgt 420 gagtgaagaa gggtttcggc tcgtaaagct ctgttgttgg agaagaacgt gcgtgagagt 480 aactgttcac gcagtgacgg tatccaacca gaaagtcacg gctaactacg tgccagcagc 540 cgcggtaata cgtaggtggc aagcgttatc cggatttatt gggcgtaaag cgagcgcagg 600 cggttgctta ggtctgatgt gaaagccttc ggcttaaccg aagaagtgca tcggaaaccg 660 ggcgacttga gtgcagaaga ggacagtgga actccatgtg tagcggtgga atgcgtagat 720 atatggaaga acaccagtgg cgaaggcggc tgtctggtct gcaactgacg ctgaggctcg 780 aaagcatggg tagcgaacag gattagatac cctggtagtc catgccgtaa acgatgagtg 840 ctaggtgttg gagggtttcc gcccttcagt gccggagcta acgcattaag cactccgcct 900 ggggagtacg accgcaaggt tgaaactcaa aggaattgac gggggcccgc acaagcggtg 960 gagcatgtgg tttaattgga agctacgcga agaaccttac caggtcttga catcttgcgc 1020 taaccttaga gataaggcgt tcccttcggg gacgcaatga caggtggtgc atggtggtcg 1080 tcagctcgtg tcgtgagatg ttgggttaag tcccgcaacg agcgcaaccc ttgttactag 1140 ttgccagcat taagttgggc actctagtga gactgccggt gacaaaccgg aggaaggtgg 1200 ggacgacgtc agatcatcat gccccttatg acctgggcta cacacgtgct acaatggacg 1260 gtacaacgag tcgcaaactc gcgagagtaa gctaatttct taaagccgtt ctcagttcgg 1320 actgtaggct gcaactcgcc tacacgaagt cggaatcgct ggtaatcgcg gatcagcatg 1380 ccgcggtgaa tacgttcccg ggccttgtac acaccgcccg tcacaccatg ggagtttgta 1440 acgcccaaag tcggtggcct aacctttatg gagga 1475

Claims

락토바실러스 루테리 PSC102(Lactobacillus reuteri PSC102; 수탁번호: KCCM12927P) 균주.
락토바실러스 루테리 PSC102(Lactobacillus reuteri PSC102; 수탁번호: KCCM12927P) 균주 또는 이의 파라프로바이오틱스를 포함하는 것을 특징으로 하는 건강기능식품용 조성물.
제2항에 있어서,
상기 조성물은,
장내 유해균을 감소시키는 것을 특징으로 하는 건강기능식품용 조성물.
제3항에 있어서,
상기 장내 유해균은,
대장균(Escherichia coli) 또는 장독소성대장균(ETEC, Enterotoxigenic Escherichia coli)인 것을 특징으로 하는 건강기능식품용 조성물.
제2항에 있어서,
상기 조성물은,
사이토카인 분비 증진에 따른 면역증진효과를 가지는 것을 특징으로 하는 건강기능식품용 조성물.
락토바실러스 루테리 PSC102(Lactobacillus reuteri PSC102; 수탁번호: KCCM12927P) 또는 이의 파라프로바이오틱스를 포함하는 것을 특징으로 하는 사료용 조성물.
락토바실러스 루테리 PSC102(Lactobacillus reuteri PSC102; 수탁번호: KCCM12927P) 또는 이의 파라프로바이오틱스를 포함하는 것을 특징으로 하는 사료 첨가제용 조성물.
락토바실러스 루테리 PSC102(Lactobacillus reuteri PSC102; 수탁번호: KCCM12927P) 또는 이의 파라프로바이오틱스를 포함하는 것을 특징으로 하는 어류 양식용 사료 조성물.
락토바실러스 루테리 PSC102(Lactobacillus reuteri PSC102; 수탁번호: KCCM12927P) 또는 이의 파라프로바이오틱스를 포함하는 것을 특징으로 하는 어류 양식용 사료 첨가제 조성물.
제6항 내지 제9항 중 선택되는 어느 한 항의 조성물을 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계를 포함하는 면역증진방법.