KR20230053596A - 조직 공학용 셀룰로오스 결합 도메인(cbd) 세포 이펙터 단백질(cep) 키메라. - Google Patents

조직 공학용 셀룰로오스 결합 도메인(cbd) 세포 이펙터 단백질(cep) 키메라. Download PDF

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오데드 쇼세요브
아미트 야아리
츠비 즈비린
시리 바란 엘메드비
에프라트 아비가드 라론
요나탄 에란
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바이오베터 엘티디.
이슘 리서치 디벨롭먼트 컴퍼니 오브 더 히브루 유니버시티 오브 예루살렘 엘티디.
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Abstract

시험관 내 조직 공학에 사용하기 위한 키메라 폴리펩티드뿐만 아니라 이를 이용하는 시스템 및 방법이 개시되며, 상기 폴리펩티드는 셀룰로오스 결합 도메인(CBD), 세포 이펙터 단백질(CEP) 및 CBD를 CEP에 연결하는 링커를 포함한다.

Description

조직 공학용 셀룰로오스 결합 도메인(CBD) 세포 이펙터 단백질(CEP) 키메라.
본 개시내용은 일반적으로 섬유질 및 기타 비-등방성 조직, 특히 배양육의 생산을 위한 신규한 성장 유도/조작 스캐폴드에 대한 것이다. 구체적으로, 발명은 셀룰로오스 섬유 스캐폴드에 결합된 CEP인 세포 이펙터 단백질(CEP)에 융합된 재조합 셀룰로오스 결합 도메인(CBD)에 관한 것이다.
세포외 거대분자, 소분자, 이펙터 단백질 및 미네랄로 구성된 3-차원 네트워크인 세포외 기질(ECM)은 세포 성장, 증식 및 분화의 중요한 조절자이다. 부가하여, 그것은 잘-기능하는 조직이 생성되는 것을 보장하는 조직 순서와 방향에 기여한다. 그러나, 이 단계에서는 시험관 내에서 ECM 환경과 조직 생성을 비용-효율적으로 모방할 수 있는 이용가능한 기술이 없다. 조직 공학의 분야에서 최근 기술 중 스캐폴드의 사용은 핵심 구성요소이다. 그러나, 기존 기술은 ECM-유사 환경을 제공하는 능력이 부족하다. 다공성, 섬유질, 하이드로겔, 마이크로스피어 및 무세포 스캐폴드를 포함하는 많은 유형의 스캐폴드가 있으며, 이는 지지 구조로 기능하는 동안 세포의 방향성 분포를 가능하게 하지 않으며; 각 유형의 세포에 대해 복잡한 조작을 요하고; 감소된 세포 생존력과 연관되어 있고; 때때로 산성 부산물을 생성한다.
성장 인자는 세포의 운명을 지시하고 조직의 형성을 허용함에 의해 조직 공학에서 중요한 역할을 한다. 그러나, 성장 인자는 자연적으로 발생하는 변화로 인해 그 생체활성을 잃는 경향이 있다. 하이드로겔(예를 들어 젤라틴, 알기네이트) 및 소수성 중합체(예를 들어 폴리카프로락톤) 같은 특정 물질의 사용을 포함하여 이 단점을 극복하기 위한 몇 가지 전략이 개발되었지만; 짧은 반감기와 불안정성은 효율적인 조직 공학의 주요 장애물로 남아 있다.
따라서, 진정으로 자연에 의한 조직 생성을 모방하는, 잘-정렬되고 기능적인 조직의 효율적인 생성을 가능하게 하는 조직 공학 스캐폴드에 대한 필요성이 남아 있다.
다음 실시형태 및 그의 양태는 범주를 제한하지 않고 예이고 예시적인 것을 의미하는 조성물 및 방법과 조합하여 기술되고 예시된다. 다양한 실시형태에서, 상술한 문제 중 하나 이상이 감소되거나 제거되었으며, 반면 다른 실시형태는 다른 이점 또는 개선에 대한 것이다.
일부 실시형태에 따르면, 시험관 내 조직 공학을 위한 키메라 폴리펩티드 뿐만 아니라 이를 이용하는 시스템 및 방법이 제공된다.
본원에 개시된 키메라 폴리펩티드는 탄수화물-결합 모듈(CBM), 바람직하게는 셀룰로오스 결합 도메인(CBD), 세포 이펙터 단백질(CEP); 및 CBD를 CEP에 연결하는 링커를 포함한다. 본원에 개시된 폴리펩티드는 원하는 조직을 생성하는데 필요한 요구되는 특이성, 순서, 방향 및 기능성을 제공하는 맞춤형 환경을 제공하도록 유리하게 구성된다.
일부 실시형태에 따르면, 링커는 폴리펩티드가 프로테아제에 노출될 때 CBD로부터 CEP의 지속된 방출이 얻어지도록 소정의 절단 효율로 부위-특이적 프로테아제에 의한 절단을 가능하게 하는 것을 특징으로 하는 절단 부위를 포함할 수 있다. 이는 유리하게 CEP의 반감기를 증가시키고, 이에 의해 조직 공학 시스템의 효율을 증가시킨다.
일부 실시형태에 따르면, 키메라 단백질은 조직 성장을 위한 스캐폴드 역할을 하는 섬유 또는 셀룰로오스 섬유의 층에 결합되거나 결합할 수 있다. 유리하게는, 하나 초과의 스캐폴드가 이용될 수 있고, 이에 의해 복합 조직(즉, 지방 조직 및 근육 조직 둘 모두를 포함하는 조직과 같으나 이에 제한되지 않는 하나 초과 유형의 세포로 이루어진 조직)의 생성을 가능하게 할 수 있다.
일부 실시형태에 따르면, 시험관 내 조직 공학에 사용하기 위한 키메라 폴리펩티드가 제공되며, 상기 폴리펩티드는 탄수화물-결합 모듈(CBM); 세포 이펙터 단백질(CEP); 및 CBM을 CEP에 연결하는 링커를 포함하며, 여기서 링커는 폴리펩티드가 프로테아제에 노출될 때 CBM으로부터 CEP의 지속된 방출이 얻어지도록 소정의 절단 효율로 부위-특이적 프로테아제에 의한 절단을 가능하게 하는 것을 특징으로 하는 절단 부위를 포함한다.
일부 실시형태에 따르면, CBM은 셀룰로오스 결합 도메인(CBD)이다. 일부 실시형태에 따르면, CBD는 서열번호: 1(ELQLNLKVEFYNSQPSDTTNSINPQFKVTNTGSSAIDLSKLTLRYYYTVDGQKDQTFWCDHAAIIGSQGSYNGITSNVKGTFVKMSSSTNNADTYLEISFTGGTLEPGAHVQIQGRFAKNDWSQYTQSNDYSFKSASQFVEWDQVTAYLNGVLVWGKEPGGSVVPSTQPVTTPPATTKPPATTIPPS)에 제시된 아미노산 서열에 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 서열 상동성을 갖는다. 각 가능성은 별도의 실시형태이다.
일부 실시형태에 따르면, 링커는 5-50개 아미노산, 5-25개 아미노산, 5-20개 아미노산, 10-25개 아미노산 또는 5-50개 아미노산의 범위 내의 임의의 다른 적합한 길이의 길이를 갖는다. 각 가능성은 별도의 실시형태이다.
일부 실시형태에 따르면, 링커는 서열번호: 2: (GAGGGSGGGSGGGSAGGG)에 제시된 아미노산 서열에 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 서열 상동성을 갖는다. 각 가능성은 별도의 실시형태이다.
일부 실시형태에 따르면, 절단 부위는 서열번호: 3(ENLYFQG) 또는 서열번호: 4(ENLYFSG)에 제시된 아미노산 서열을 가질 수 있다.
일부 실시형태에 따르면, 절단 부위는 CEP의 N' 말단의 약 5개의 아미노산 또는 미만 업스트림 또는 CEP의 C' 말단의 약 5개의 아미노산 또는 미만 다운스트림에 위치한다. 일부 실시형태에 따르면 절단 부위는 링커에 인접할 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 링커-절단-부위-펩티드를 인코딩하는 아미노산은 서열번호: 5: (GAGGGSGGGSGGGSAGGGENLYFXG)에 제시된 아미노산 서열에 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 서열 상동성을 가질 수 있다. 각 가능성은 별도의 실시형태이다.
일부 실시형태에 따르면, 링커-절단-부위-CBD-펩티드를 인코딩하는 아미노산은 서열번호: 6: (ELQLNLKVEFYNSQPSDTTNSINPQFKVTNTGSSAIDLSKLTLRYYYTVDGQKDQTFWCDHAAIIGSQGSYNGITSNVKGTFVKMSSSTNNADTYLEISFTGGTLEPGAHVQIQGRFAKNDWSQYTQSNDYSFKSASQFVEWDQVTAYLNGVLVWGKEPGGSVVPSTQPVTTPPATTKPPATTIPPSGAGGGSGGGSGGGSAGGGENLYFXG)에 제시된 아미노산 서열에 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 서열 상동성을 가질 수 있으며, 여기서 X= Q 또는 S이다. 각 가능성은 별도의 실시형태이다.
일부 실시형태에 따르면, CEP는 성장 인자, 호르몬, 향-세포자멸사 인자, 항-세포자멸사 인자, 혈관 성장 인자, 세포 분화 인자, 골 성장 인자, 트랜스페린 같은 세포 생존력에 필요한 기타 단백질, 또는 이들의 조합으로부터 선택된다. 각 가능성은 별도의 실시형태이다. 일부 실시형태에 따르면, CEP는 세포 분화 인자, 성장 인자 또는 성장 호르몬이다. 각 가능성은 별도의 실시형태이다.
일부 실시형태에 따르면, CEP는 사이토카인 또는 FGF2, IGF1, TGFβ1, EGF, LIF, 액티빈 A, NRG1, PDGF, IL6, IL13 또는 이들의 임의의 조합으로부터 선택되는 성장 인자일 수 있다. 각 가능성은 별도의 실시형태이다.
일부 실시형태에 따르면, CEP는 서열번호: 7: (PSLPEDGGSGAFPPGHFKDPKRLYCKNGGFFLRIHPDGRVDGVREKSDPHIKLQLQAEERGVVSIKGVCANRYLAMKEDGRLLASKCVTDECFFFERLESNNYNTYRSRKYSSWYVALKRTGQYKLGPKTGPGQKAILFLPMSAKS)에 제시된 아미노산 서열에 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 서열 상동성을 갖는 소 FGF2의 이소형일 수 있다. 각 가능성은 별도의 실시형태이다.
일부 실시형태에 따르면, 키메라 폴리펩티드는 ER 보유 신호를 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 보유 신호는 서열번호: 8(KDEL)에 제시된 아미노산 서열을 가질 수 있다.
일부 실시형태에 따르면, 키메라 폴리펩티드는 서열번호: 9: (ELQLNLKVEFYNSQPSDTTNSINPQFKVTNTGSSAIDLSKLTLRYYYTVDGQKDQTFWCDHAAIIGSQGSYNGITSNVKGTFVKMSSSTNNADTYLEISFTGGTLEPGAHVQIQGRFAKNDWSQYTQSNDYSFKSASQFVEWDQVTAYLNGVLVWGKEPGGSVVPSTQPVTTPPATTKPPATTIPPSGAGGGSGGGSGGGSAGGGENLYFXGPSLPEDGGSGAFPPGHFKDPKRLYCKNGGFFLRIHPDGRVDGVREKSDPHIKLQLQAEERGVVSIKGVCANRYLAMKEDGRLLASKCVTDECFFFERLESNNYNTYRSRKYSSWYVALKRTGQYKLGPKTGPGQKAILFLPMSAKSKDEL)에 제시된 아미노산 서열에 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 서열 상동성을 갖는 서열을 포함할 수 있으며, 여기서 X= Q 또는 S이다. 각 가능성은 별도의 실시형태이다.
일부 실시형태에 따르면, 절단 시 CEP는 C-말단 글리신(절단 부위의 잔여물) 및 ER 보유 신호를 포함할 수 있다.
비-제한적인 예로서, 절단 후 키메라 폴리펩티드는 서열번호: 10 (GPSLPEDGGSGAFPPGHFKDPKRLYCKNGGFFLRIHPDGRVDGVREKSDPHIKLQLQAEERGVVSIKGVCANRYLAMKEDGRLLASKCVTDECFFFERLESNNYNTYRSRKYSSWYVALKRTGQYKLGPKTGPGQKAILFLPMSAKSKDEL)에 제시된 아미노산 서열에 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 서열 상동성을 갖는 서열을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에 따르면, 절단 부위는 절단 부위의 변형되지 않은 버전과 비교하여 더 낮은 절단 효율을 제공하도록 변형된다. 일부 실시형태에 따르면, 변형은 하나 이상의 아미노산의 결실, 하나 이상의 아미노산의 첨가, 또는 하나 이상의 아미노산의 치환을 포함한다. 각 가능성은 별도의 실시형태이다. 일부 실시형태에 따르면, 변형은 하나 이상의 아미노산의 화학적 변형을 포함한다. 비-제한적인 예로서, TEV 프로테아제 인식 부위의 P'1 위치(C 말단)에서 글리신 측쇄는 단백질분해 효율에 거의 영향을 미치지 않으면서 변경될 수 있다 DOI: 10.1016/S0006-291X(02)00574-0.
일부 실시형태에 따르면, 절단 부위는 정상 포유류 세포 성장 조건에서 1.5*103 m-1s-1 미만, 1*103 m-1s-1 미만, 0.5*103 m-1s-1 미만, 1.5*103 m-1s-1 미만 또는 15*10 m-1s-1 미만의 촉매 효율(kcat/KM)을 갖는 프로테아스(proteas)의 절단 부위이다. 각 가능성은 별도의 실시형태이다.
일부 실시형태에 따르면, 절단 부위는 CEP가 CBD로부터 방출될 때 생물학적으로 활성이 되도록 위치한다. 일부 실시형태에 따르면, 절단 부위는 CEP가 CBD로부터 방출될 때에만 생물학적으로 활성이 되도록 위치한다. 일부 실시형태에 따르면, CEP는 절단의 결과로서 CBD로부터 방출될 때에만 생물학적으로 활성이다. 일부 실시형태에 따르면, CEP의 반감기는 이의 유리 형태에 비해 CBD 및/또는 링커에 결합될 때 더 높다. 일부 실시형태에 따르면, 링커는 CBD의 반감기를 증가시킨다.
일부 실시형태에 따르면, 본원에 개시된 폴리펩티드 및 적어도 하나의 셀룰로오스의 층 및/또는 섬유를 포함하는 시험관 내 조직 공학 시스템이 제공된다.
일부 실시형태에 따르면, 시스템은 적어도 2개의 셀룰로오스의 층 및/또는 섬유를 포함한다. 일부 실시형태에 따르면, 적어도 2개의 층 및/또는 섬유 각각은 상이한 CEP를 포함하는 키메라 펩티드와 회합된다.
일부 실시형태에 따르면, 적어도 하나의 층은 각각 상이한 CEP를 포함하는 적어도 2가지 유형의 키메라 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시형태에 따르면, 2가지 유형의 키메라 폴리펩티드 중 제1은 분화 인자를 포함하고, 2가지 유형의 키메라 폴리펩티드 중 제2는 분화와 연관된 성장 인자를 포함한다.
일부 실시형태에 따르면, 2가지 유형의 키메라 폴리펩티드 중 제1 링커는 제1 소정의 절단 효율로 부위-특이적 프로테아제에 의한 절단을 가능하게 하는 것을 특징으로 하는 제1 절단 부위를 포함하고 2가지 유형의 키메라 폴리펩티드 중 제2는 제2 소정의 절단 효율로 부위-특이적 프로테아제에 의한 절단을 가능하게 하는 것을 특징으로 하는 제2 절단 부위를 포함하는 링커를 포함하고, 제2 절단 효율은 제1 절단 효율보다 낮다.
일부 실시형태에 따르면, 본원에 개시된 키메라 폴리펩티드를 포함하는 벡터가 제공된다. 일부 실시형태에 따르면, 도 3에 도시된 바와 같은 (pCAMBIA 벡터)이다.
일부 실시형태에 따르면, 시험관 내 조직 공학에 대한 방법이 제공되며, 상기 방법은 다음을 포함한다:
a. 적어도 하나의 셀룰로오스의 층 및/또는 섬유를 포함하는 세포 성장 배지를 증명하는 단계로서; 적어도 하나의 셀룰로오스의 층은 셀룰로오스 결합 도메인(CBD), 세포 이펙터 단백질(CEP); 및 CBD를 CEP에 연결하는 링커를 포함하는 키메라 폴리펩티드를 포함하며, 여기서 링커는 부위-특이적 프로테아제에 의한 절단을 가능하게 하는 것을 특징으로 하는 절단 부위를 포함하는, 단계;
b. 적어도 하나의 셀룰로오스의 층에 포유류 세포를 시딩하는(seeding) 단계;
c. CEP가 세포 성장 배지 안으로 지속적으로 방출되도록 적어도 하나의 셀룰로오스의 층을 부위-특이적 프로테아제에 노출시키는 단계
d. 조직화된 조직이 얻어질 때까지 세포를 성장시키는 단계;
e. 조직을 수확하는 단계.
일부 실시형태에 따르면, 시험관 내 조직 공학에 대한 방법이 제공되며, 상기 방법은 다음을 포함한다:
a. 적어도 하나의 셀룰로오스의 층 및/또는 섬유를 포함하는 세포 성장 배지를 증명하는 단계로서; 적어도 하나의 셀룰로오스의 층은 셀룰로오스 결합 도메인(CBD), 세포 이펙터 단백질(CEP); 및 CBD를 CEP에 연결하는 링커를 포함하는 키메라 폴리펩티드를 포함하는, 단계,
b. 적어도 하나의 셀룰로오스의 층에 포유류 세포를 시딩하는 단계;
c. 조직화된 조직이 얻어질 때까지 세포를 성장시키는 단계;
d. 조직을 수확하는 단계.
일부 실시형태에 따르면, 적어도 하나의 층 및/또는 섬유는 제1 CEP를 포함하는 제1 키메라 폴리펩티드를 갖는 제1 층 및 제1 CEP를 포함하는 제2 키메라 폴리펩티드를 포함하는 제2 층을 포함한다.
일부 실시형태에 따르면, 포유류 세포를 시딩하는 것은 제1 층에 제1 세포 유형을 시딩하고 제2 층에 제2 세포 유형을 시딩하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에 따르면, 제1 세포 유형은 근육 세포를 포함하고 제2 세포 유형은 지방 세포를 포함하고 여기서 조직화된 조직은 육류이다. 일부 실시형태에 따르면, 제1 CEP는 근육 특이적 성장 인자이고 제2 CEP는 지방 특이적 성장 인자이다.
일부 실시형태에 따르면, 포유류 세포는 다능성 또는 만능성 세포이고 여기서 제1 및 제2 인자는 상이한 세포 유형으로 세포의 분화를 야기한다. 일부 실시형태에 따르면, 제1 CEP는 다능성 또는 만능성 세포의 근육 세포로의 분화를 야기하고, 제2 CEP는 다능성 또는 만능성 세포의 지방 세포로의 분화를 야기한다.
본 개시내용의 특정 실시형태는 상기 이점 중 일부, 전부를 포함하거나 전혀 포함하지 않을 수 있다. 하나 이상의 기술적 이점은 본 명세서에 포함된 도면, 설명 및 청구범위로부터 당업자에게 쉽게 명백할 수 있다. 더욱이, 특정한 이점들이 상기에서 열거되었지만, 다양한 실시형태들은 열거된 이점들의 모두, 일부를 포함하거나 또는 전혀 포함하지 않을 수 있다.
상술한 예시적인 양태 및 실시형태에 부가하여, 도면을 참조하고 다음의 상세한 설명을 연구함에 의해 추가 양태 및 실시형태가 명백해질 것이다.
이제 발명은 다음의 예시적인 도면을 참조하여 특정 실시예 및 실시형태와 관련하여 기술될 것이다.
도 1a는 링커에 의해 CBD에 융합된 CEP(예를 들어, GF, 호르몬 등 - 파란색 별표 원)를 포함하는 본원에 개시된 키메라 폴리펩티드의 개략도이다.
도 1b는 링커 키메라 폴리펩티드에 의해 CBD에 융합된 CEP(예를 들어, GF, 호르몬 등 - 파란색 별표 원), 조직 성장을 위한 스캐폴드로 작용하는 셀룰로오스(회색 은색)에 결합된 CBD를 포함하는 본원에 개시된 키메라 폴리펩티드의 개략도이다.
도 2a는 원하는 다층 스캐폴드를 제공하기 위해 배치된 셀룰로오스의 층을 포함하는 다층의 셀룰로오스 스캐폴드의 개략도이다. 각 층은 상이한 유형의 세포의 분화 및/또는 성장에 적합한 인자를 제공하는 상이한 키메라 폴리펩티드를 함유할 수 있다.
도 2b는 상이한 세포에 대한 스캐폴드로 작용하는 상이한 셀룰로오스의 층을 갖는 다층의 셀룰로오스 스캐폴드의 개략도이다. 예를 들어, 각각 근육과 지방 조직의 생성을 위한 근육 및 지방 세포.
도 2c는 스캐폴드 층에 부착된 CEP에 따른 세포의 분화 및/또는 확장에 의해 수득된 배양육과 같으나 이에 제한되지 않는, 원하는 특성(예를 들어, 형태, 질감 등)을 갖는 조직의 개략도이다.
도 3은 이원 플라스미드 pCAMBIA 내부의 CBD-FGF2146aa 카세트의 맵이다.
도 4는 상이한 성장 조건(10% FCS가 보충된 배지, FCS 없는 배지 또는 상업적 FGF2 표준/146aa 소 FGF2 이소형/CBD-FGF2가 보충된 FCS 없는 배지 하에서 72시간 동안 성장된 MCF7 세포에 대해 수행된 레자주린 검정에 의해 측정된 세포 생존력의 수준을 도시한다. 결과는 상대 형광 단위(RFU)로 도시된다. * = < 0.05의 p-값 및 ** = < 0.005의 p-값.
다음 설명에서, 개시내용의 다양한 양태가 기술될 것이다. 설명의 목적을 위해, 개시내용의 상이한 양태의 완전한 이해를 제공하기 위해 특정 구성 및 세부사항이 제시된다. 그러나, 본원에 제시된 특정 세부사항 없이 개시내용이 실시될 수 있다는 것도 당업자에게 명백할 것이다. 더욱이, 개시내용을 모호하게 하지 않기 위해 잘-알려진 특징은 생략되거나 간략화될 수 있다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 기술자가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖다.
용어 "a" 및 "an"은 관사의 문법적 대상 중 하나 또는 하나 초과(즉, 적어도 하나)를 지칭한다. 예를 들어, "요소"는 하나의 요소 또는 하나 초과의 요소를 의미한다.
양, 시간적 기간 등과 같은 측정가능한 값을 언급할 때 용어 "약"은 명시된 값으로부터 ±20% 또는 일부 경우에 10%, 또는 일부 경우에 ±5%, 또는 일부 경우에 ±1%, 또는 일부 경우에 ±0.1%의 변동을 포괄하는 것으로 의도되며, 이러한 변동은 개시된 방법을 수행하는 데 적절하기 때문이다.
본원에서 사용된 용어 "폴리펩티드", "펩티드" 및 "단백질"은 상호교환적으로 사용될 수 있고 아미노산 잔기의 중합체를 지칭한다. 이 용어는 하나 이상의 아미노산 잔기가 상응하는 자연적으로 발생하는 아미노산의 인공 화학적 유사체인 아미노산 중합체뿐만 아니라 자연적으로 발생하는 아미노산 중합체에 적용된다. 발명의 폴리펩티드는 표준 분자 생물학 기술 또는 인공 합성 및 방법에 의해 생성될 수 있다.
발명의 특정 폴리펩티드(즉, 참조 폴리뉴클레오티드)의 변이체는 퍼센트 서열 동일성의 비교에 의해 평가될 수 있다 따라서, 예를 들어, 서열번호: 1의 폴리펩티드에 대해 주어진 퍼센트 서열 상동성을 갖는 폴리펩티드가 개시된다. 임의의 2개의 폴리펩티드 사이의 퍼센트 서열 동일성은 서열 정렬 프로그램 및 본원의 다른 곳에 기재된 매개변수를 사용하여 계산될 수 있다. 예를 들어, 본원에 개시된 CBD를 인코딩하는 폴리펩티드는 서열번호:1의 전체에 걸쳐 적어도 약 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 초과의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 가질 수 있다.
탄수화물-결합 모듈(CBM)은 다양한 상이한 유기체에서 발견된다. 셀룰로오스 결합 도메인(CBD)은 CBM의 한 예이다. CBD는 박테리아 클로스트리디움 셀룰로보란스 또는 임의의 기타 적합한 유전적 공급원(http://www.cazy.org/)에서 단리된 단백질 도메인이다. 그것은 셀룰로오스에 강력하게 결합하고, 안정적이지만 전단력과 pH(pH 4 내지 10) 및 염도(10mM에서 포화 NaCl)에서의 가벼운 변화를 견딜 수 있는 가역적 연결을 형성한다. CBD를 성장 인자(GF) 또는 호르몬과 같으나 이에 제한되지 않는 세포 이펙터 단백질에 연결하는 것은 CEP에 대한 안정성을 증가시킨다. 부가하여, 본원에 개시된 키메라 폴리펩티드의 크기로 인해, CEP의 내재화 속도가 더 느리고 그 반감기가 증가하고 따라서 요구된 작동 농도가 더 낮아진다. 부가하여, CBD의 존재는 조직 성장을 위한 스캐폴드로 작용하고 예를 들어 섬유 근육 또는 다-방향성 조직과 같은 조직의 비-등방성 성장 및 발달을 촉진하는, 셀룰로오스계 스캐폴드에 CEP를 연결하여 다른 실시예에서 원하는 3D 구조를 제공한다.
일부 실시형태에 따르면, 키메라 폴리펩티드는 적합한 프로테아제의 절단 부위를 함유하는 링커를 포함한다. 유리하게는, 링커 자체는 CEP의 입체형태 및 단백질분해 안정성에 기여하도록 구성된다. 일부 실시형태에 따르면, 프로테아제는 부위-특이적 프로테아제, 내인성 식물 프로테아제(세린 프로테아제, 시스테인 프로테아제 또는 기타), 펩티다아제 등일 수 있다. 각 가능성은 별도의 실시형태이다.
일부 실시형태에 따르면, 프로테아제 절단 부위는 성장 조직의 특정 발달 단계에 특이적일 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, CEP의 절단-의존적 방출은 유리하게는 배양 배지 안으로의 CEP의 제어된 방출을 보장하고, 이에 의해 반감기를 연장하고 따라서 더 낮은 작동 농도를 필요로 한다.
일부 실시형태에 따르면, 프로테아제는 TEV 프로테아제(EC 3.4.22.44, Tobacco Etch Virus nuclear-inclusion-a endopeptidase)일 수 있다. 유리하게는, TEV 프로테아제는 토바코 에칭 바이러스(TEV)로부터의 고도로 서열-특이적인 시스테인 프로테아제이다. 일부 실시형태에 따르면, 프로테아제는 Arg-X-X-Arg의 최소 절단 부위를 갖는 퓨린 프로테아제일 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 프로테아제는 전체 SUMO 도메인의 3차 서열을 특이적으로 인식하고 인식 부위의 그 C-말단에서 이중-글리신(GG) 모티프를 절단하는 SUMO 프로테아제일 수 있다. 이 과정은 표적 단백질에 여분의 잔류물을 남기지 않는다. 더욱이, SUMO 프로테아제는 SUMO 도메인을 인식하기 때문에, 그것은 다른 프로테아제보다 더 고도로 특이성이다. 본원에서 사용된 용어 "세포 이펙터 단백질(CEP)"은 세포의 성장 배지에 존재할 때 세포 성장 및/또는 분화에 영향을 미치는 임의의 인자를 지칭할 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, CEP는 성장 인자(예를 들어, TGF 베타, FGF2), 호르몬(예를 들어, 인슐린), 조직의 혈관화에 영향을 미치는 인자 또는 세포자멸사를 유도하는 인자 등일 수 있다. 각각의 가능성은 별도의 실시형태이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 폴리펩티드를 지칭하는 용어 "키메라"는 원래 별개의 단백질을 인코딩하는 아미노-산을 연결하는 펩티드를 지칭한다. 이 키메라 펩티드의 번역은 각각의 원래 단백질에서 유래된 기능적 특성을 갖는 단일 폴리펩티드를 초래한다.
유리하게는 본원에 개시된 키메라 폴리펩티드, 및 이를 이용하는 시험관 내 조직 공학 시스템은 다목적이며, 즉 다양한 조직이 CEP(들)의 조성, CEP(들)의 농도, 상이한 CEP를 포함하는 상이한 키메라 분자 간의 비율 및 셀룰로오스 스캐폴드 상의 이들의 분포에 기반하여 조작될 수 있다.
일부 실시형태에 따르면, 키메라 폴리펩티드는 키메라 폴리펩티드를 발현하도록 유전적으로 변형된 담배 식물과 같으나 이에 제한되지 않는 식물에서 발현될 수 있다. 담배 식물에서 단백질 발현은 다른 발현 시스템에 비해 큰 이점을 수반한다. 이들 이점 중에는 낮은 생산 비용, 대규모 재배 가능성, 및 인간 병원균이 식물에서 복제할 수 없음을 반영하는 고유한 안전성이 있다. 다른 실시형태에 따르면, 키메라 폴리펩티드는 예를 들어 대두 및 옥수수와 같은 다른 식물에서 발현될 수 있다. 다른 실시형태에 따르면, 키메라 폴리펩티드는 예를 들어 개구리밥, 효모, 박테리아, 진균 또는 조류와 같은 다른 유기체에서 발현될 수 있다. 각 가능성은 별도의 실시형태이다.
다음 실시예는 발명의 일부 실시형태를 보다 완전하게 예시하기 위해 제시된다. 그러나, 이들은 발명의 넓은 범주를 제한하는 것으로 결코 해석되어서는 안된다. 당업자는 발명의 범주를 벗어나지 않고 본원에 개시된 원리의 많은 변경 및 변형을 용이하게 고안할 수 있다.
이제 부위-특이적 프로테아제의 절단 부위를 함유하는, 링커(130)에 의해 CBD(120)에 융합된 CEP(110)(예를 들어, GF, 호르몬 등)를 포함하는 본원에 개시된 키메라 폴리펩티드(100)의 개략도인 도 1a을 참조한다. 도 1b에서 볼 수 있는 바와 같이, 키메라 폴리펩티드(100)의 CBD(120)는 조직 성장을 위한 스캐폴드로 작용하는 셀룰로오스(140)에 결합하거나 결합할 수 있다.
이제 다층의 셀룰로오스 스캐폴드의 개략도인 도 2a-도 2c를 참조한다. 스캐폴드는 도 2a에 도시된 바와 같이 원하는 다층의 스캐폴드를 제공하도록 배치된 셀룰로오스의 층을 포함할 수 있다. 각각의 층은 도 2b에 도시된 바와 같이 상이한 유형의 세포(예를 들어, 각각 지방세포 및 근육세포)의 분화 및/또는 성장을 각각 허용하는 상이한 CEP(예를 들어, 지방세포 성장 인자 및 근세포 성장 인자)를 갖는 키메라 폴리펩티드를 함유할 수 있다. 결과적으로 세포는 제공된 CEP에 따라 분화 및/또는 확장할 수 있으며, 이에 의해 배양육의 것과 같으나 이에 제한되지 않는 원하는 특성(예를 들어, 형태, 질감 등)을 가진 조직을 생성할 수 있다(도 2c 참조).
다음 실시예는 발명의 일부 실시형태를 보다 완전하게 예시하기 위해 제시된다. 그러나, 그것은 발명의 넓은 범주를 제한하는 것으로 결코 해석되어서는 안된다. 당업자는 발명의 범주를 벗어나지 않고 본원에 개시된 원리의 많은 변경 및 변형을 용이하게 고안할 수 있다.
실시예
실시예 1 - 본원에 개시된 폴리펩티드의 존재에서 기아 배지에서 성장한 세포의 생존력.
CBD-결합 성장 인자의 활성을 평가하기 위해, 기아 배지에서 성장하고 본원에 개시된 키메라 폴리펩티드만으로 보충된 세포의 생존.
요컨대, MCF-7 세포를 10% 태아 크래프트 혈청(FCS)이 보충된 EMEM 배지(양성 대조군), FCS 없는 EMEM(완전한 기아 - 음성 대조군) 또는 증가하는 농도의 상업적 재조합 인간 FGF2 표준 (rhFGF2, Peprotech, USA #100-18b) FGF2, 146 aa 소 FGF2 이소형(서열번호: 6) 또는 CBD에 TEV 절단-함유 링커를 통해 연결된 146aa 소 FGF2 이소형(CBD-FGF2 - 서열번호: 10에 제시됨)이 보충된 기아 배지에서 96-웰 플레이트(웰당 10K 세포)에서 3일 동안 성장시켰다.
72시간 기아 동안 MCF-7 세포의 생존력을 유지하는 식물-유래된 재조합 소 FGF2의 능력을 평가하기 위해, 레자주린 검정을 수행하였다. 오래된 배지를 폐기하고 레자주린(카탈로그 # ab129732, ABCAM, USA)을 함유하는 투명한 DMEM 배지(높은 글루코스, 페놀 레드 없음)로 교체하였다. 세포를 37℃ 및 5% CO2에서 4시간 동안 인큐베이션하고, 그 동안 형광 강도(여기: 535nm, 방출 파장: 590nm)를 4시간 후에 측정하였다.
도 4에 나타낸 바와 같이, 양성 대조군(10% FCS)에 비해 3-일 기아의 결과로 세포 생존력이 급격히 떨어진 반면, 세포에 FGF2(표준 또는 146aa 소 이소형)를 공급한 경우 유의한 레스큐(rescue)가 관찰되었다. 중요하기로는, 세포에 CBD-결합 FGF2가 공급되었을 때 유사한 레스큐가 얻어졌는데 이는 CBD 결합 FGF2가 성장 인자로 작용할 수 있고 CBD가 생존에 부정적으로 영향을 미치지 않는다는 것을 나타낸다.
실시예 2 - 식물에서 키메라 폴리펩티드의 생산
담배 식물을 본원에 개시된 키메라 폴리펩티드를 발현하도록 형질전환시키고 식물을 성장시킨다.
식물의 충분한 바이오매스가 생산되면, 식물의 잎을 수집하고 잘게 자르고 짜서 잎에서 키메라 폴리펩티드를 추출한다. 추출 후 균질액은 0.2μm 필터에서 여과한다.
이 시점에서 3가지 상이한 옵션이 이용가능하다.
1. 제1 옵션은 셀룰로오스 섬유를 생산하는 것이다; 각 섬유는 그 다음 CBD를 통해 키메라 폴리펩티드에 연결된다. 이렇게 하면 원하는 CEP를 함유하는 맞춤형 스캐폴드가 만들어진다. 후속적으로, 세포는 스캐폴드에 시딩되어 원하는 순서와 방향으로 조직 형성(예를 들어, 육류)을 시작한다.
2. 제2 옵션은 원하는 셀룰로오스-키메라 폴리펩티드 복합체를 사전-프린트하는 것이다. 이 경우에, 키메라 폴리펩티드 키메라가 카트리지(장입 물질)로 사용된다. 다시, 이 적용은 배양된 조직 순서와 방향을 제어하는 것을 허용한다.
3. 마지막으로, 셀룰로오스계 스캐폴드를 함유하는 세포 배양 배지에 키메라 폴리펩티드를 첨가한다.
발명의 특정 실시형태가 예시되고 기술되었지만, 발명이 본원에 기술된 실시형태에 제한되지 않는다는 것이 명백할 것이다. 다수의 변형, 변화, 변경, 대체 및 등가물이 이어지는 특허청구범위에 기술된 바와 같은 본 발명의 사상 및 범주를 벗어나지 않으면서 당업자에게 명백할 것이다.
실시예 3 - 셀룰로오스-결합된 FGF2의 생물학적 활성 시험:
이 실험의 목적은 셀룰로오스-결합 성장 인자를 함유한 기아 배지에서 인간 상피 세포주인, MCF-7의 부착 및 성장을 유도함에 의해 셀룰로오스-결합 성장 인자, 즉 소 FGF2의 생물학적 활성을 입증하는 것이다.
요컨대 96-웰 폴리-L-라이신 플레이트는 나중에 세포 생존력에 대해 레자주린 검정에 의해 평가되는 세포 부착 및 성장의 기초로서 크리스탈 나노 셀룰로오스(CNC)로 코팅된다. CNC 코팅은 CBD-셀룰로오스 상호작용을 통해 셀룰로오스-결합 도메인(CBD)에 융합된 표적 단백질의 플레이트 바닥에 대한 강력한 부착을 허용한다. CNC 코팅된 플레이트를 제조하기 위해 CNC를 부가하고 25℃에서 10분 동안 인큐베이션한다. 사전-희석된 표준 곡선과 CBD 융합된-단백질/들의 샘플을 웰 안으로 첨가하고 4℃에서 2시간 동안 인큐베이션하여 임의의 CBD-단백질 융합 단백질이 CNC에 결합할 수 있도록 한다. 이 실시예에서 CBD는 소 FGF2의 155개 아미노산 이소형에 연결된다.
인큐베이션 후 플레이트를 세정 완충액으로 세정하고(임의의 비-반응성 성분을 제거하기 위함) 세포를 다양한 조건: (a) 혈청-풍부 배지, (b) 혈청 없는 배지("기아 조건") 및 (c) CBD-FGF2가 공급된 혈청 없는 배지 하에서 부착 및 성장을 위해 즉시 플레이트에 첨가한다. 세포의 대사 활성을 검출하고 정량화하는 레자주린 세포 생존력 형광 검정은 세포 부착, 성장 및 생존력에 대한 CBD-FGF2의 효과를 결정하기 위해 24, 48, 72 및 96시간 후에 수행된다. 이 검정에서, 청색 비-형광 레자주린 시약은 대사적으로 활성인 세포에서 탈수소효소 효소에 의해 고도로 형광성 레조루핀으로 환원된다. 이 변환은 생존가능한 세포에서만 발생하므로 생산된 레조루핀의 양은 샘플에서 생존가능한 세포 수에 비례한다. 검정에서 형성된 레조루핀은 형광계(Ex=530-570nm, Em=590-620nm)를 사용하여 상대 형광 단위(RFU)를 측정함에 의해 정량화될 수 있다.
SEQUENCE LISTING <110> BIOBETTER LTD. YISSUM RESEARCH DEVELOPMENT COMPANY OF THE HEBREW UNIVERSITY OF JERUSALEM LTD. <120> CELLULOSE BINDING DOMAIN (CBD) CELL EFFECTOR PROTEIN (CEP) CHIMERA, FOR THE TISSUE ENGINEERING <130> BBTR/002 PCT <150> USP 63/069,080 <151> 2020-08-23 <160> 10 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 187 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 1 Glu Leu Gln Leu Asn Leu Lys Val Glu Phe Tyr Asn Ser Gln Pro Ser 1 5 10 15 Asp Thr Thr Asn Ser Ile Asn Pro Gln Phe Lys Val Thr Asn Thr Gly 20 25 30 Ser Ser Ala Ile Asp Leu Ser Lys Leu Thr Leu Arg Tyr Tyr Tyr Thr 35 40 45 Val Asp Gly Gln Lys Asp Gln Thr Phe Trp Cys Asp His Ala Ala Ile 50 55 60 Ile Gly Ser Gln Gly Ser Tyr Asn Gly Ile Thr Ser Asn Val Lys Gly 65 70 75 80 Thr Phe Val Lys Met Ser Ser Ser Thr Asn Asn Ala Asp Thr Tyr Leu 85 90 95 Glu Ile Ser Phe Thr Gly Gly Thr Leu Glu Pro Gly Ala His Val Gln 100 105 110 Ile Gln Gly Arg Phe Ala Lys Asn Asp Trp Ser Gln Tyr Thr Gln Ser 115 120 125 Asn Asp Tyr Ser Phe Lys Ser Ala Ser Gln 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Claims (43)

  1. 폴리펩티드 및 적어도 하나의 셀룰로오스의 층 및/또는 섬유를 포함하는 시험관 내 조직 공학 시스템으로서, 폴리펩티드는 셀룰로오스 결합 도메인(CBD), 세포 이펙터 단백질(CEP); 및 CBD를 CEP에 연결하는 링커를 포함하는, 시험관 내 조직 공학 시스템.
  2. 제1항에 있어서, CBD는 서열번호: 1에 제시된 아미노산 서열에 적어도 70% 상동성을 갖는, 조직 공학 시스템.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 링커는 10-25개 아미노산의 길이를 갖는, 조직 공학 시스템.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, CEP는 성장 인자, 호르몬, 사이토카인, 향-세포자멸사 인자, 항-세포자멸사 인자, 혈관 성장 인자, 세포 분화 인자, 골 성장 인자, 트랜스페린 같은 세포 생존력에 필요한 기타 단백질, 또는 이들의 조합으로부터 선택되는, 조직 공학 시스템.
  5. 제4항에 있어서, CEP는 세포 분화 인자, 성장 인자, 사이토카인 또는 성장 호르몬인, 조직 공학 시스템.
  6. 제4항에 있어서, CEP는 FGF2, IGF1, TGFβ1, EGF, LIF, 액티빈 A, NRG1, PDGF, IL6, IL13 또는 이들의 임의의 조합으로부터 선택되는, 조직 공학 시스템.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 링커는 폴리펩티드가 프로테아제에 노출될 때, CBD로부터 CEP의 지속된 방출이 얻어지도록 소정의 절단 효율로 부위-특이적 프로테아제에 의한 절단을 가능하게 하는 것을 특징으로 하는 절단 부위를 포함하는, 조직 공학 시스템.
  8. 제7항에 있어서, 절단 부위는 CEP의 N' 말단의 5개의 아미노산 또는 미만 업스트림 또는 CEP의 C' 말단의 5개의 아미노산 또는 미만 다운스트림에 위치하는, 조직 공학 시스템.
  9. 제7항 또는 제8항에 있어서, 절단 부위는 TEV-프로테아스(proteas) 절단 부위인, 조직 공학 시스템.
  10. 제7항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 절단 부위는 절단 부위의 변형되지 않은 버전과 비교하여 더 낮은 절단 효율을 제공하도록 변형된, 조직 공학 시스템.
  11. 제10항에 있어서, 변형은 하나 이상의 아미노산의 결실, 하나 이상의 아미노산의 첨가, 또는 하나 이상의 아미노산의 치환을 포함하는, 조직 공학 시스템.
  12. 제11항에 있어서, 변형은 하나 이상의 아미노산의 화학적 변형을 포함하는, 조직 공학 시스템.
  13. 제7항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 절단 부위는 정상 포유류 세포 성장 조건에서 1.5*103 m-1s-1 미만의 촉매 효율(kcat/KM)을 갖는 프로테아제의 절단 부위인, 조직 공학 시스템.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, CEP의 반감기는 이의 유리 형태에 비해 CBD 및/또는 링커에 결합될 때 더 높은, 조직 공학 시스템.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 링커는 CBD의 반감기를 증가시키는, 조직 공학 시스템.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 2개의 셀룰로오스의 층 및/또는 섬유를 포함하는, 조직 공학 시스템.
  17. 제16항에 있어서, 적어도 2개의 층 및/또는 섬유 각각이 상이한 CEP를 포함하는 키메라 펩티드와 회합되는, 조직 공학 시스템.
  18. 제16항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 층이 각각 상이한 CEP를 포함하는 적어도 2가지 유형의 키메라 폴리펩티드를 포함하는, 조직 공학 시스템.
  19. 제18항에 있어서, 2가지 유형의 키메라 폴리펩티드 중 제1은 분화 인자를 포함하고, 2가지 유형의 키메라 폴리펩티드 중 제2는 분화와 연관된 성장 인자를 포함하는, 조직 공학 시스템.
  20. 제19항에 있어서, 2가지 유형의 키메라 폴리펩티드 중 제1의 링커는 제1 소정의 절단 효율로 부위-특이적 프로테아제에 의한 절단을 가능하게 하는 것을 특징으로 하는 제1 절단 부위를 포함하는 링커를 포함하고 2가지 유형의 키메라 폴리펩티드 중 제2는 제2 소정의 절단 효율로 부위-특이적 프로테아제에 의한 절단을 가능하게 하는 것을 특징으로 하는 제2 절단 부위를 포함하는 링커를 포함하고, 제2 절단 효율은 제1 절단 효율보다 낮은, 조직 공학 시스템.
  21. 시험관 내 조직 공학에 사용하기 위한 키메라 폴리펩티드로서, 폴리펩티드는:
    a. 셀룰로오스 결합 도메인(CBD);
    b. 세포 이펙터 단백질(CEP); 및
    c. CBD를 CEP에 연결하는 링커
    를 포함하는, 키메라 폴리펩티드.
  22. 제21항에 있어서, CBD는 서열번호: 1에 제시된 아미노산 서열에 적어도 70% 상동성을 갖는, 키메라 폴리펩티드.
  23. 제21항 또는 제22항에 있어서, 링커는 10-25개 아미노산의 길이를 갖는, 키메라 폴리펩티드.
  24. 제21항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, CEP는 성장 인자, 호르몬, 사이토카인, 향-세포자멸사 인자, 항-세포자멸사 인자, 혈관 성장 인자, 세포 분화 인자, 골 성장 인자, 트랜스페린 같은 세포 생존력에 필요한 기타 단백질, 또는 이들의 조합으로부터 선택되는, 키메라 폴리펩티드.
  25. 제24항에 있어서, CEP는 세포 분화 인자, 성장 인자, 사이토카인 또는 성장 호르몬인, 키메라 폴리펩티드.
  26. 제24항에 있어서, CEP는 FGF2, IGF1, TGFβ1, EGF, LIF, 액티빈 A, NRG1, PDGF, IL6, IL13 또는 이들의 임의의 조합으로부터 선택되는, 키메라 폴리펩티드.
  27. 제21항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 링커는 폴리펩티드가 프로테아제에 노출될 때, CBD로부터 CEP의 지속된 방출이 얻어지도록 소정의 절단 효율로 부위-특이적 프로테아제에 의한 절단을 가능하게 하는 것을 특징으로 하는 절단 부위를 포함하는, 키메라 폴리펩티드.
  28. 제27항에 있어서, 절단 부위는 CEP의 N' 말단의 5개의 아미노산 또는 미만 업스트림 또는 CEP의 C' 말단의 5개의 아미노산 또는 미만 다운스트림에 위치하는, 키메라 폴리펩티드.
  29. 제26항 또는 제27항에 있어서, 절단 부위는 TEV-프로테아스 절단 부위인, 키메라 폴리펩티드.
  30. 제26항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 절단 부위는 절단 부위의 변형되지 않은 버전과 비교하여 더 낮은 절단 효율을 제공하도록 변형된, 키메라 폴리펩티드.
  31. 제29항에 있어서, 변형은 하나 이상의 아미노산의 결실, 하나 이상의 아미노산의 첨가, 또는 하나 이상의 아미노산의 치환을 포함하는, 키메라 폴리펩티드.
  32. 제30항에 있어서, 변형은 하나 이상의 아미노산의 화학적 변형을 포함하는, 키메라 폴리펩티드.
  33. 제26항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 절단 부위는 정상 포유류 세포 성장 조건에서 1.5*103 m-1s-1 미만의 촉매 효율(kcat/KM)을 갖는 프로테아제의 절단 부위인, 키메라 폴리펩티드.
  34. 제21항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, CEP의 반감기는 이의 유리 형태에 비해 CBD 및/또는 링커에 결합될 때 더 높은, 키메라 폴리펩티드.
  35. 제21항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 링커는 CBD의 반감기를 증가시키는, 키메라 폴리펩티드.
  36. 시험관 내 조직 공학을 위한 방법으로서, 상기 방법은 다음을 포함하는, 방법:
    a. 적어도 하나의 셀룰로오스의 층 및/또는 섬유를 포함하는 세포 성장 배지를 제공하는 단계로서; 적어도 하나의 셀룰로오스의 층은 셀룰로오스 결합 도메인(CBD), 세포 이펙터 단백질(CEP); 및 CBD를 CEP에 연결하는 링커를 포함하는 키메라 폴리펩티드를 포함하는, 단계,
    b. 적어도 하나의 셀룰로오스의 층에 포유류 세포를 시딩하는(seeding) 단계;
    c. 조직화된 조직이 얻어질 때까지 세포를 성장시키는 단계;
    d. 조직을 수확하는 단계.
  37. 제36항에 있어서, 적어도 하나의 층 및/또는 섬유는 제1 CEP를 포함하는 제1 키메라 폴리펩티드를 갖는 제1 층 및 제2 CEP를 포함하는 제2 키메라 폴리펩티드를 포함하는 제2 층을 포함하는, 방법.
  38. 제37항에 있어서, 포유류 세포를 시딩하는 단계는 제1 층 상에 제1 세포 유형 및 제2 층 상에 제2 세포 유형을 시딩하는 단계를 포함하는, 방법.
  39. 제38항에 있어서, 제1 세포 유형은 근육 세포를 포함하고 제2 세포 유형은 지방 세포를 포함하고 여기서 조직화된 조직은 육류인, 방법.
  40. 제39항에 있어서, 제1 CEP는 근육 특이적 성장 인자이고 제2 CEP는 지방 특이적 성장 인자인, 방법.
  41. 제36항에 있어서, 포유류 세포는 다능성 또는 만능성 세포이고, 여기서 제1 및 제2 인자는 상이한 세포 유형으로 세포의 분화를 야기하는, 방법.
  42. 제41항에 있어서, 제1 CEP는 근육 세포로 다능성 또는 만능성 세포의 분화를 야기하고 제2 CEP는 지방 세포로 다능성 또는 만능성 세포의 분화를 야기하는, 방법.
  43. 제36항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 링커는 부위-특이적 프로테아제에 의한 절단을 가능하게 하는 것을 특징으로 하는 절단 부위를 포함하고, 여기서 방법은 CEP가 세포 성장 배지 안으로 지속적으로 방출되도록 적어도 하나의 셀룰로오스의 층을 부위-특이적 프로테아제에 노출시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
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