KR20230049750A - 세균성 감염 및 바이러스성 감염의 진단 방법 - Google Patents

세균성 감염 및 바이러스성 감염의 진단 방법 Download PDF

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펄베쉬 카트리
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Abstract

세균성 감염 및 바이러스성 감염의 진단 방법이 개시되어 있다. 특히, 본 발명은 급성 염증 환자가 세균성 감염인지 또는 바이러스성 감염인지를 결정할 수 있는 바이오마커의 사용에 관한 것이다.

Description

세균성 감염 및 바이러스성 감염의 진단 방법{Methods For Diagnosis of Bacterial and Viral Infection}
상호 참조
본 출원은 2016년 6월 7일자로 출원된 미국 가출원 번호 제62/346,962호의 이익을 주장하며, 그 출원 내용이 본원에 참조로서 포함된다.
연방 후원 연구 또는 개발에 관한 진술
본 발명은 국립 보건원(National Institutes of Health)에 의해 수여된 AI109662 및 AI057229 계약 하에 정부 지원으로 이루어졌다. 정부는 본 발명에 대해 특정 권리를 가진다.
기술 분야
본 발명은 일반적으로 세균성 감염 및 바이러스성 감염의 진단 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 급성 염증 환자가 세균성 감염인지 또는 바이러스성 감염인지를 구별할 수 있는 바이오마커의 용도에 관한 것이다.
감염을 조기에 정확하게 진단하는 것은 환자의 결과를 개선하고 항생제 내성을 감소시키는 데 중요하다. 세균성 패혈증의 사망률은 항생제가 지연되는 매시간마다 8% 증가한다1, 그러나 세균성 감염이 없는 환자에게 항생제를 투여하면 이환율과 항생제 내성이 증가한다. 병원 환경에서 부적절한 항생제 처방률은 30-50%로 추정되며 이는 진단이 개선됨으로써 완화될 것이다2,3. 놀랍게도, 장티푸스(enteric fever)로 의심되는 환자에 항생제를 투여한 경우 95% 가까이가 음성 배양을 보인다4. 현재 감염 여부 및 유형을 광범위하게 결정할 수 있는 최적 표준(gold-standard) 현장 진단은 없다. 따라서, 백악관은 "세균성 감염과 바이러스성 감염을 빠르게 구별하는 필요 시점 진단"을 요구하는 항생제 내성균 퇴치를 위한 국가 행동 계획을 수립했다.5
새로운 PCR 기반 분자 진단은 혈액 배양으로부터 직접 병원균을 프로파일링할 수 있지만6, 이러한 방법은 혈액 내의 적절한 수의 병원균의 존재에 의존한다. 또한, 병원균의 별개의 범위를 탐지하는 것으로 제한된다. 결과적으로, 숙주 유전자 반응을 프로파일링하는 분자 진단에 대한 관심이 증가하고 있다. 이는 무엇보다도 우리의 11-유전자 '패혈증 메타스코어(패혈증 메타스코어(Sepsis MetaScore, SMS))'7(다수의 코호트에 걸쳐 검증됨8)와 같이, 염증이 있지만 비감염인 환자와 비교하여 감염 여부를 구별할 수 있는 진단을 포함한다9,10. 다른 그룹은 세균성 감염 대 바이러스성 감염과 같은 감염 유형을 구별할 수 있는 유전자 세트에 초점을 맞추고 있다11-13. Tsalik 등은 모든 세 가지 부류(즉, 비감염 환자와 세균성 또는 바이러스성 질환을 가진 환자)를 구별하는 모델을 기술했지만, 이 모델은 122개의 프로브 측정을 요구하였다14. 우리는 또한 바이러스성 감염에 대한 일반적인 반응을 기술하는 'Meta-Virus Signature'를 이전에 기술했지만, 이는 임상 응용하기에는 너무 많은 유전자(396개)를 포함시켰다15. 전반적으로, 이 분야에서 큰 가능성을 보였지만 숙주 유전자 발현 감염 진단은 임상 실습을 아직 하지 못했다.
패혈증 및 급성 감염에 대한 이러한 바이오마커 연구 및 수십가지의 기타 게놈 범위의 발현 연구에 관한 데이터는 NIH Gene Expression Omnibus(GEO) 및 EBI ArrayExpress와 같은 공공 데이터베이스에 추가 연구를 위해 게재되고 기탁되었다. 이들 데이터는 바이오마커 발견 및 검증에 모두 사용될 수 있는 대부분 아직 개발되지 않은 자원이다. 이전에 유전자 발현에 대한 우리의 통합된 다중-코호트 분석이 패혈증7, 바이러스성 감염의 특정 유형15과 활동성 결핵16에 대한 강력한 진단 도구를 생산한다는 것을 보였다. 또한, 이들 데이터는 새로운 호스트 유전자 발현 진단에 대한 벤치마킹 및 검증 도구로도 유용하다17. 그러나 공공 데이터에서 이러한 검증은 이전에 적어도 두 가지 관심 부류를 포함하는 (즉, 부류간의 직접 비교가 가능한) 코호트에만 국한되어 왔는데, 이는 연구간 기술 차이로 인해 코호트간의 진단 점수의 직접 비교가 불가능하기 때문이다.
세균성 감염과 바이러스성 감염을 구별할 수 있는 민감하고 특이적인 진단 검사에 대한 필요성이 있다.
본 발명은 급성 염증 환자가 세균성 감염인지 또는 바이러스성 감염인지를 결정할 수 있는 바이오마커의 용도에 관한 것이다. 이들 바이오마커는 예후, 진단 또는 감염 치료의 모니터링에서 단독으로 사용될 수 있거나 또는 하나 이상의 추가 바이오마커 또는 관련 임상 파라미터와 함께 사용될 수 있다.
하나의 구현예에서, 본 발명은 환자의 감염을 진단하는데 사용되는 분류를 개발하는 방법에 관한 것으로, 방법은 (a) 환자의 생물학적 샘플에서 적어도 2개의 바이오마커의 발현 수준을 측정하는 단계(적어도 2개의 바이오마커는 보다 높은 수준의 발현이 세균성 감염을 나타내는 제1 세트의 바이오마커 및 보다 높은 수준의 발현이 바이러스성 감염을 나타내는 제2 세트의 바이오마커 중 하나 또는 둘 다로부터 선택되며, 제1 세트의 바이오마커는 TSPO, EMR1, NINJ2, ACPP, TBXAS1, PGD, S100A12, SORT1, TNIP1, RAB31, SLC12A9, PLP2, IMPA2, GPAA1, LTA4H, RTN3, CETP, TALD01, HK3, ACAA1, CAT, DOK3, SORL1, PYGL, DYSF, TWF2, TKT, CTSB, FLII, PROS1, NRD1, STAT5B, CYBRD1, PTAFR, 및 LAPTM5 중 적어도 하나를 포함하고, 제2 세트의 바이오마커는 OAS1, IFIT1, SAMD9, ISG15, HERC5, DDX60, HESX1, IFI6, MX1, OASL, LAX1, IFIT5, IFIT3, KCTD14, OAS2, RTP4, PARP12, LY6E, ADA, IFI44L, IFI27, RSAD2, IFI44, OAS3, IFIH1, SIGLEC1, JUP, STAT1, CUL1, DNMT1, IFIT2, CHST12, ISG20, DHX58, EIF2AK2, XAF1, 및 GZMB 중 적어도 하나를 포함함); (b) 환자에게서 세균성 또는 바이러스성 감염의 존재 또는 확률을 결정할 수 있는 분류 또는 생성 알고리즘을 개발하기 위해 바이오마커의 발현 수준을 사용하는 단계; 및 (c) 환자에게 세균성 또는 바이러스성 감염이 있거나 또는 있을 가능성이 있는 것으로 진단하기 위한 알고리즘을 적용하는 단계를 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 발명은 환자의 감염을 진단하기 위한 방법에 관한 것으로, 본 방법은 바이러스성 또는 세균성 감염을 예측하는 적어도 2개의 유전자의 발현 수준을 분석하는 단계(적어도 2개의 유전자의 발현 수준은 바이러스성 또는 세균성 감염을 예측하기 위해 적어도 0.80의 곡선 아래 면적을 제공함); 및 환자가 세균성 또는 바이러스성 감염이 있는 것으로 진단하는 단계를 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 발명은 환자의 감염을 진단 및 치료하는 방법에 관한 것으로, 방법은 (a) 환자로부터 생물학적 샘플을 얻는 단계; (b) 생물학적 샘플에서 IFI27, JUP, LAX1, HK3, TNIP1, GPAA1, 및 CTSB 바이오마커의 발현 수준을 측정하는 단계; (c) 바이오마커에 대한 각각의 기준값 범위와 함께 각각의 바이오마커의 발현 수준을 분석하는 단계(대조 대상의 바이오마커에 대한 기준값 범위와 비교하여 IFI27, JUP, LAX1 바이오마커의 증가된 발현 수준은 환자가 바이러스성 감염인 것을 나타내고, 대조 대상의 바이오마커에 대한 기준값 범위와 비교하여 HK3, TNIP1, GPAA1, CTSB 바이오마커의 증가된 발현 수준은 환자가 세균성 감염인 것을 나타냄); 및 (d) 환자가 바이러스성 감염으로 진단된 경우, 환자에게 항바이러스제의 유효량을 투여하거나 환자가 세균성 감염으로 진단된 경우, 환자에게 항생제의 유효량을 투여하는 단계를 포함한다.
임의의 구현예에서, 생물학적 샘플은 전혈 또는 말초 혈액 단핵 세포(PBMCS)를 포함할 수 있다.
임의의 구현예에서, 바이오마커의 수준은 감염 또는 비감염 대상에 대한 시간-일치 기준값과 비교될 수 있다.
임의의 구현예에서, 방법은 바이오마커의 수준에 기초하여 환자에 대한 세균/바이러스 메타스코어를 계산하는 단계를 포함할 수 있되, 환자에 대한 양성 세균/바이러스 메타스코어는 환자가 바이러스성 감염인 것을 나타내고, 환자에 대한 음성 세균/바이러스 메타스코어는 환자가 세균성 감염인 것을 나타낸다.
임의의 구현예에서, 방법은 코코넛(COCONUT) 정규화를 사용하여 데이터를 정규화하는 단계를 포함할 수 있다.
임의의 구현예에서, 환자는 인간일 수 있다.
임의의 구현예에서, 복수의 바이오마커의 수준을 측정하는 단계는 마이크로어레이 분석, 중합 효소 연쇄 반응(PCR), 역전사 중합 효소 연쇄 반응(RT-PCR), 노던 블롯 또는 유전자 발현 연속 분석법(SAGE)을 포함할 수 있다.
하나의 구현예에서, 본 발명은 염증을 갖는 환자를 진단 및 치료하는 방법에 관한 것으로, 방법은 (a) 환자로부터 생물학적 샘플을 얻는 단계; (b) 생물학적 샘플에서 IFI27, JUP, LAX1, HK3, TNIP1, GPAA1, CTSB, CEACAM1, ZDHHC19, C9orf95, GNA15, BATF, C3AR1, KIAA1370, TGFBI, MTCH1, RPGRIP1, 및 HLA-DPB1 바이오마커의 발현 수준을 측정하는 단계; (c) 바이오마커에 대한 각각의 기준값 범위와 함께 각각의 바이오마커의 발현 수준을 우선 분석하는 단계(비감염 대조 대상의 바이오마커에 대한 기준값 범위와 비교하여 CEACAM1, ZDHHC19, C9orf95, GNA15, BATF 및 C3AR1 바이오마커의 증가된 발현 수준과 KIAA1370, TGFBI, MTCH1, RPGRIP1 및 HLA-DPB1 바이오마커의 감소된 발현 수준은 환자가 감염된 것을 나타내고, 비감염 대조 대상의 바이오마커에 대한 기준값 범위와 비교하여 CEACAM1, ZDHHC19, C9orf95, GNA15, BATF, C3AR1, KIAA1370, TGFBI, MTCH1, RPGRIP1, 및 HLA-DPB1 바이오마커의 차등 발현의 부재는 환자가 감염되지 않은 것을 나타냄); (d) 환자가 감염된 것으로 진단된 경우, IFI27, JUP, LAX1, HK3, TNIP1, GPAA1 및 CTSB 바이오마커의 발현 수준을 추가로 분석하는 단계(대조 대상의 바이오마커에 대한 기준값 범위와 비교하여 IFI27, JUP, LAX1 바이오마커의 증가된 발현 수준은 환자가 바이러스성 감염인 것을 나타내고, 대조 대상의 바이오마커에 대한 기준값 범위와 비교하여 HK3, TNIP1, GPAA1, CTSB 바이오마커의 증가된 발현 수준은 환자가 세균성 감염인 것을 나타냄); 및 (e) 환자가 바이러스성 감염으로 진단된 경우 항바이러스제의 유효량을 환자에게 투여하거나 환자가 세균성 감염으로 진단된 경우 항생제의 유효량을 환자에게 투여하는 단계를 포함한다.
임의의 구현예에서, 방법은 환자에 대한 패혈증 메타스코어를 계산하는 단계를 포함할 수 있되, 비감염 대조 대상에 대한 기준값 범위보다 높은 패혈증 메타스코어는 환자가 감염된 것을 나타내고, 비감염 대조 대상에 대한 기준값 범위 내의 패혈증 메타스코어는 환자가 비감염성 염증 질환임을 나타낸다.
임의의 구현예에서, 본 방법은 환자가 감염된 것으로 진단된 경우 환자에 대한 세균/바이러스 메타스코어를 계산하는 단계를 포함할 수 있되, 환자에 대한 양성 세균/바이러스 메타스코어는 환자가 바이러스성 감염인 것을 나타내고, 환자에 대한 음성 세균/바이러스 메타스코어는 환자가 세균성 감염인 것을 나타낸다.
임의의 구현예에서, 바이오마커의 수준은 감염 또는 비감염 대상에 대한 시간-일치 기준값과 비교될 수 있다.
임의의 구현예에서, 비감염성 염증 질환은 전신성 염증 반응 증후군(SIRS), 자가 면역 장애, 외상성 손상 및 수술의 군으로부터 선택될 수 있다.
임의의 구현예에서, 환자는 인간일 수 있다.
임의의 구현예에서, 바이오마커의 수준을 측정하는 단계는 마이크로어레이 분석, 중합 효소 연쇄 반응(PCR), 역전사 중합 효소 연쇄 반응(RT-PCR), 노던 블롯 또는 유전자 발현 연속 분석법(SAGE)을 포함할 수 있다.
하나의 구현예에서, 본 발명은 IFI27, JUP, LAX1, HK3, TNIP1, GPAA1 및 CTSB 바이오마커의 수준을 측정하기 위한 제제를 포함하는 키트에 관한 것이다.
임의의 구현예에서, 키트는 CEACAM1, ZDHHC19, C9orf95, GNA15, BATF, C3AR1, KIAA1370, TGFBI, MTCH1, RPGRIP1, 및 HLA-DPB1 바이오마커의 수준을 측정하기 위한 제제를 포함할 수 있다.
임의의 구현예에서, 키트는 마이크로어레이를 포함할 수 있다.
임의의 구현예에서, 마이크로어레이는 IFI27 폴리뉴클레오타이드에 혼성화하는 올리고뉴클레오타이드, JUP 폴리뉴클레오타이드에 혼성화하는 올리고뉴클레오타이드, LAX1 폴리뉴클레오타이드에 혼성화하는 올리고뉴클레오타이드, HK3 폴리뉴클레오타이드에 혼성화하는 올리고뉴클레오타이드, TNIP1 폴리뉴클레오타이드에 혼성화하는 올리고뉴클레오타이드, GPAA1 폴리뉴클레오타이드에 혼성화하는 올리고뉴클레오타이드, 및 CTSB 폴리뉴클레오타이드에 혼성화하는 올리고뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.
임의의 구현예에서, 마이크로어레이는 CEACAM1 폴리뉴클레오타이드에 혼성화하는 올리고뉴클레오타이드, ZDHHC19 폴리뉴클레오타이드에 혼성화하는 올리고뉴클레오타이드, C9orf95 폴리뉴클레오타이드에 혼성화하는 올리고뉴클레오타이드, GNA15 폴리뉴클레오타이드에 혼성화하는 올리고뉴클레오타이드, BATF 폴리뉴클레오타이드에 혼성화하는 올리고뉴클레오타이드, C3AR1 폴리뉴클레오타이드에 혼성화하는 올리고뉴클레오타이드, KIAA1370 폴리뉴클레오타이드에 혼성화하는 올리고뉴클레오타이드, TGFBI 폴리뉴클레오타이드에 혼성화하는 올리고뉴클레오타이드, MTCH1 폴리뉴클레오타이드에 혼성화하는 올리고뉴클레오타이드, RPGRIP1 폴리뉴클레오타이드에 혼성화하는 올리고뉴클레오타이드, 및 HLA-DPB1 폴리뉴클레오타이드에 혼성화하는 올리고뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.
임의의 구현예에서, 키트는 각각의 바이오마커의 검출된 수준을 패혈증과 관련시키기 위한 지침이 있는 전자적 형태나 종이 형태의 정보를 포함할 수 있다.
하나의 구현예에서, 방법은 감염이 의심되는 환자를 진단하기 위한 컴퓨터 구현 방법에 관한 것으로, 컴퓨터는 (a) 환자의 생물학적 샘플에서 IFI27, JUP, LAX1, HK3, TNIP1, GPAA1, 및 CTSB 바이오마커 수준에 대한 값을 포함하는 입력된 환자 데이터를 수신하는 단계; b) 각각의 바이오마커의 레벨을 분석하여 바이오마커에 대한 각각의 기준값 범위와 비교하는 단계; c) 바이오마커의 수준에 기초하여 환자에 대한 세균/바이러스 메타스코어를 계산하는 단계(환자에 대한 양성 세균/바이러스 메타스코어는 환자가 바이러스성 감염인 것을 나타내고 환자에 대한 음성 세균/바이러스 메타스코어는 환자가 세균성 감염인 것을 나타냄); 및 (d) 환자의 진단에 관한 정보를 표시하는 단계를 수행한다.
임의의 구현예에서, 생물학적 샘플은 전혈 또는 말초 혈액 단핵 세포(PBMCS)를 포함할 수 있다.
하나의 구현예에서, 본 발명은 컴퓨터 구현 방법을 수행하기 위한 진단 시스템에 관한 것으로, 진단 시스템은 a) 내부에 저장된 환자의 진단을 결정하기 위한 명령어를 가지며, 데이터를 저장하기 위한 저장부; b) 데이터를 처리하기 위한 컴퓨터 프로세서(컴퓨터 프로세서는 저장부에 연결되고, 환자 데이터를 수신하고 하나 이상의 알고리즘에 따라 환자 데이터를 분석하기 위해 저장부에 저장된 명령을 실행하도록 구성됨); 및 (c) 환자의 진단에 관한 정보를 표시하기 위한 디스플레이부를 포함한다.
임의의 구현예에서, 저장부는 세균/바이러스 메타스코어를 계산하기 위한 명령어를 포함할 수 있다.
하나의 구현예에서, 본 발명은 염증을 갖는 환자를 진단하기 위한 컴퓨터 구현 방법에 관한 것으로, 컴퓨터는 a) 환자로부터의 생물학적 샘플에서 IFI27, JUP, LAX1, HK3, TNIP1, GPAA1, CTSB, CEACAM1, ZDHHC19, C9orf95, GNA15, BATF, C3AR1, KIAA1370, TGFBI, MTCH1, RPGRIP1, 및 HLA-DPB1 바이오마커의 수준에 대한 값을 포함하는 입력된 환자 데이터를 수신하는 단계; b) 각각의 바이오마커의 수준을 분석하여 바이오마커에 대한 각각의 기준값 범위와 비교하는 단계; c) 환자에 대한 패혈증 메타스코어를 계산하는 단계(비감염 대조 대상에 대한 기준값 범위보다 높은 패혈증 메타스코어는 환자가 감염된 것을 나타내고, 비감염 대조 대상에 대한 기준값 범위 내의 패혈증 메타스코어는 환자가 비감염성 염증 질환인 것을 나타냄); d) 패혈증 점수가 환자가 감염된 것을 나타내는 경우 환자에 대한 세균/바이러스 메타스코어를 계산하는 단계(환자에 대한 양성 세균/바이러스 메타스코어는 환자가 바이러스성 감염인 것을 나타내고, 환자에 대한 음성 세균/바이러스 메타스코어는 환자가 세균성 감염인 것을 나타냄); 및 e) 환자의 진단에 관한 정보를 표시하는 단계를 수행한다.
임의의 구현예에서, 생물학적 샘플은 전혈 또는 말초 혈액 단핵 세포(PBMCS)를 포함할 수 있다.
하나의 구현예에서, 본 발명은 컴퓨터 구현 방법을 수행하기 위한 진단 시스템에 관한 것으로, 진단 시스템은 a) 데이터를 저장하기 위한 저장부(상기 저장부는 그 안에 저장된 환자의 진단을 결정하기 위한 명령어를 가짐); b) 데이터를 처리하기 위한 컴퓨터 프로세서(컴퓨터 프로세서는 저장부에 연결되고, 환자 데이터를 수신하고 하나 이상의 알고리즘에 따라 환자 데이터를 분석하기 위해 저장부에 저장된 명령어를 실행하도록 구성됨); 및 c) 환자의 진단에 관한 정보를 표시하기 위한 디스플레이부를 포함한다.
임의의 구현예에서, 저장부는 패혈증 메타스코어 및 세균/바이러스 메타스코어를 계산하기 위한 명령어를 포함할 수 있다.
하나의 구현예에서, 본 발명은 환자의 감염을 진단 및 치료하기 위한 방법에 관한 것으로, 방법은 a) 환자로부터 생물학적 샘플을 얻는 단계; b) 생물학적 샘플에서 바이러스 반응 유전자 세트 및 세균 반응 유전자 세트의 발현 수준을 측정하는 단계(바이러스 반응 유전자 세트는 OAS2, CUL1, ISG15, CHST12, IFIT1, SIGLEC1, ADA, MX1, RSAD2, IFI44L, GZMB, KCTD14, LY6E, IFI44, HESX1, OASL, OAS1, OAS3, EIF2AK2, DDX60, DNMT1, HERC5, IFIH1, SAMD9, IFI6, IFIT3, IFIT5, XAF1, ISG20, PARP12, IFIT2, DHX58, STAT1의 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자를 포함하고, 세균 반응 유전자 세트는 SLC12A9, ACPP, STAT5B, EMR1, FLII, PTAFR, NRD1, PLP2, DYSF, TWF2, SORT1, TSPO, TBXAS1, ACAA1, S100A12, PGD, LAPTM5, NINJ2, DOK3, SORL1, RAB31, IMPA2, LTA4H, TALDO1, TKT, PYGL, CETP, PROS1, RTN3, CAT, CYBRD1의 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자를 포함함); 및 c) 비감염 대조 대상에 대한 각각의 기준값 범위와 함께 각각의 바이오마커의 발현 수준을 분석하는 단계를 포함하며, 바이러스 반응 유전자의 차등 발현은 기준값과 비교된다.
임의의 구현예에서, 바이러스 반응 유전자 세트 및 세균 반응 유전자 세트는 a) OAS2 및 CUL1을 포함하는 바이러스 반응 유전자 세트 및 SLC12A9, ACPP, STAT5B를 포함하는 세균 반응 유전자 세트; b) ISG15 및 CHST12를 포함하는 바이러스 반응 유전자 세트 및 EMR1 및 FLII를 포함하는 세균 반응 유전자 세트; c) IFIT1, SIGLEC1 및 ADA를 포함하는 바이러스 반응 유전자 세트 및 PTAFR, NRD1, PLP2를 포함하는 세균 반응 유전자 세트; d) MX1을 포함하는 바이러스 반응 유전자 세트 및 DYSF, TWF2를 포함하는 세균 반응 유전자 세트; e) RSAD2를 포함하는 바이러스 반응 유전자 세트 및 SORT1 및 TSPO를 포함하는 세균 반응 유전자 세트; f) IFI44L, GZMB 및 KCTD14를 포함하는 바이러스 반응 유전자 세트 및 TBXAS1, ACAA1 및 S100A12를 포함하는 세균 반응 유전자 세트; g) LY6E를 포함하는 바이러스 반응 유전자 세트 및 PGD 및 LAPTM5를 포함하는 세균 반응 유전자 세트; h) IFI44, HESX1 및 OASL을 포함하는 바이러스 반응 유전자 세트 및 NINJ2, DOK3, SORL1 및 RAB31을 포함하는 세균 반응 유전자 세트; 및 i) OAS1을 포함하는 바이러스 반응 유전자 세트 및 IMPA2 및 LTA4H를 포함하는 세균 반응 유전자 세트의 군으로부터 선택될 수 있다.
임의의 구현예에서, 생물학적 샘플은 전혈 또는 말초 혈액 단핵 세포(PBMCS)를 포함할 수 있다.
임의의 구현예에서, 바이오마커의 수준은 감염 또는 비감염 대상에 대한 시간-일치 기준값과 비교될 수 있다.
임의의 구현예에서, 방법은 바이오마커의 수준에 기초하여 환자에 대한 세균/바이러스 메타스코어를 계산하는 단계를 포함할 수 있되, 환자에 대한 양성 세균/바이러스 메타스코어는 환자가 바이러스성 감염인 것을 나타내고, 환자에 대한 음성 세균/바이러스 메타스코어는 환자가 세균성 감염인 것을 나타낸다.
임의의 구현예에서, 방법은 생물학적 샘플에서 IFI27, JUP, LAX1, HK3, TNIP1, GPAA1, CTSB, CEACAM1, ZDHHC19, C9orf95, GNA15, BATF, C3AR1, KIAA1370, TGFBI, MTCH1, RPGRIP1, 및 HLA-DPB1 바이오마커의 발현 수준을 측정하는 단계; 바이오마커의 각각의 기준값 범위와 함께 각각의 바이오마커의 발현 수준을 분석하는 단계를 포함할 수 있되, 비감염 대조 대상에 대한 바이오마커의 기준값 범위와 비교하여 CEACAM1, ZDHHC19, C9orf95, GNA15, BATF, 및 C3AR1 바이오마커의 증가된 발현 수준과 KIAA1370, TGFBI, MTCH1, RPGRIP1, 및 HLA-DPB1 바이오마커의 감소된 발현 수준은 환자가 감염된 것을 나타내고, 대조 대상과 비교하여 CEACAM1, ZDHHC19, C9orf95, GNA15, BATF, C3AR1, KIAA1370, TGFBI, MTCH1, RPGRIP1, 및 HLA-DPB1 바이오마커는 환자가 감염되지 않은 것을 나타낸다.
하나의 구현예에서, 본 발명은 (a) OAS2 및 CUL1을 포함하는 바이러스 반응 유전자 세트 및 SLC12A9, ACPP, STAT5B를 포함하는 세균 반응 유전자 세트; (b) ISG15 및 CHST12를 포함하는 바이러스 반응 유전자 세트 및 EMR1 및 FLII를 포함하는 세균 반응 유전자 세트; b) IFIT1, SIGLEC1, 및 ADA를 포함하는 바이러스 반응 유전자 세트 및 PTAFR, NRD1, PLP2를 포함하는 세균 반응 유전자 세트; c) MX1을 포함하는 바이러스 반응 유전자 세트 및 DYSF, TWF2를 포함하는 세균 반응 유전자 세트; d) RSAD2를 포함하는 바이러스 반응 유전자 세트 및 SORT1 및 TSPO를 포함하는 세균 반응 유전자 세트; e) IFI44L, GZMB 및 KCTD14를 포함하는 바이러스 반응 유전자 세트 및 TBXAS1, ACAA1 및 S100A12를 포함하는 세균 반응 유전자 세트; f) LY6E를 포함하는 바이러스 반응 유전자 세트 및 PGD 및 LAPTM5를 포함하는 세균 반응 유전자 세트; g) IFI44, HESX1 및 OASL을 포함하는 바이러스 반응 유전자 세트 및 NINJ2, DOK3, SORL1 및 RAB31을 포함하는 세균 반응 유전자 세트; 및 h) OAS1을 포함하는 바이러스 반응 유전자 세트 및 IMPA2 및 LTA4H를 포함하는 세균 반응 유전자 세트의 군으로부터 선택되는 바이러스 반응 유전자 세트 및 세균 반응 유전자 세트의 발현 수준을 측정하기 위한 제제를 포함하는 키트에 관한 것이다.
임의의 구현예에서, 키트는 마이크로어레이를 포함할 수 있다.
하나의 구현예에서, 본 발명은 감염이 의심되는 환자를 진단하기 위한 컴퓨터 구현 방법에 관한 것으로, 컴퓨터는 a) 생물학적 샘플에서 바이러스 반응 유전자 세트 및 세균 반응 유전자 세트의 생물학적 샘플에서의 발현 수준에 대한 값을 포함하는 입력된 환자 데이터를 수신하는 단계(바이러스 반응 유전자 세트는 OAS2, CUL1, ISG15, CHST12, IFIT1, SIGLEC1, ADA, MX1, RSAD2, IFI44L, GZMB, KCTD14, LY6E, IFI44, HESX1, OASL, OAS1, OAS3, EIF2AK2, DDX60, DNMT1, HERC5, IFIH1, SAMD9, IFI6, IFIT3, IFIT5, XAF1, ISG20, PARP12, IFIT2, DHX58, STAT1의 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자를 포함하고, 세균 반응 유전자 세트는 SLC12A9, ACPP, STAT5B, EMR1, FLII, PTAFR, NRD1, PLP2, DYSF, TWF2, SORT1, TSPO, TBXAS1, ACAA1, S100A12, PGD, LAPTM5, NINJ2, DOK3, SORL1, RAB31, IMPA2, LTA4H, TALDO1, TKT, PYGL, CETP, PROS1, RTN3, CAT, CYBRD1의 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자를 포함함); b) 바이러스 반응 유전자 세트 및 세균 반응 유전자 세트의 발현 수준을 분석하여 비감염 대조 대상에 대한 각각의 기준값 범위와 비교하는 단계; c) 바이러스 반응 유전자 세트 및 세균 반응 유전자 세트의 발현 수준에 기초하여 환자에 대한 세균/바이러스 메타스코어를 계산하는 단계; 및 (d) 환자의 진단에 관한 정보를 표시하는 단계를 수행한다.
하나의 구현예에서, 본 발명은 컴퓨터 구현 방법을 수행하기 위한 진단 시스템에 관한 것으로, 진단 시스템은 a) 데이터를 저장하기 위한 저장부(상기 저장부는 그 안에 저장된 환자의 진단을 결정하기 위한 명령어를 가짐); b) 데이터를 처리하기 위한 컴퓨터 프로세서(컴퓨터 프로세서는 저장부에 연결되고, 환자 데이터를 수신하고 하나 이상의 알고리즘에 따라 환자 데이터를 분석하기 위해 저장부에 저장된 명령어를 실행하도록 구성됨); 및 c) 환자의 진단에 관한 정보를 표시하기 위한 디스플레이부를 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 발명은 (a) 환자의 생물학적 샘플에서 적어도 2개의 바이오마커의 발현 수준을 측정하는 단계(적어도 2개의 바이오마커는 보다 높은 수준의 발현이 세균성 감염을 나타내는 제1 세트의 바이오마커 및 보다 높은 수준의 발현이 바이러스성 감염을 나타내는 제2 세트의 바이오마커 중 하나 또는 둘 다로부터 선택되며, 제1 세트의 바이오마커는 TSPO, EMR1, NINJ2, ACPP, TBXAS1, PGD, S100A12, SORT1, TNIP1, RAB31, SLC12A9, PLP2, IMPA2, GPAA1, LTA4H, RTN3, CETP, TALD01, HK3, ACAA1, CAT, DOK3, SORL1, PYGL, DYSF, TWF2, TKT, CTSB, FLII, PROS1, NRD1, STAT5B, CYBRD1, PTAFR, 및 LAPTM5 중 ㅈ거어도 하나를 포함하고, 제2 세트의 바이오마커는 OAS1, IFIT1, SAMD9, ISG15, HERC5, DDX60, HESX1, IFI6, MX1, OASL, LAX1, IFIT5, IFIT3, KCTD14, OAS2, RTP4, PARP12, LY6E, ADA, IFI44L, IFI27, RSAD2, IFI44, OAS3, IFIH1, SIGLEC1, JUP, STAT1, CUL1, DNMT1, IFIT2, CHST12, ISG20, DHX58, EIF2AK2, XAF1, 및 GZMB 중 적어도 하나를 포함함); 및 (b) 바이러스성 또는 세균성 감염을 결정하기 위해 바이오마커에 대한 각각의 기준값 범위와 함께 각각의 바이오마커의 발현 수준을 분석하는 단계를 포함하여, 환자의 감염을 진단하기 위한 방법을 포함한다.
임의의 구현예에서, 본 방법은 환자가 바이러스성 감염으로 진단된 경우, 환자에게 항바이러스제의 유효량을 투여하거나 환자가 세균성 감염으로 진단된 경우, 환자에게 항생제의 유효량을 투여하는 단계를 포함할 수 있다.
임의의 구현예에서, 적어도 2개의 바이오마커의 발현 수준은 적어도 0.80의 곡선 아래 면적을 제공할 수 있다.
임의의 구현예에서, 제1 세트의 바이오마커는 HK3, TNIP1, GPAA1 및 CTSB 중 적어도 하나를 포함할 수 있고, 제2 세트의 바이오마커는 IFI27, JUP, 및 LAX1 중 적어도 하나를 포함할 수 있다.
임의의 구현예에서, 생물학적 샘플은 전혈 또는 말초 혈액 단핵 세포(PBMCS)를 포함할 수 있다.
임의의 구현예에서, 바이오마커의 수준은 감염 또는 비감염 대상에 대한 시간-일치 기준값과 비교될 수 있다.
임의의 구현예에서, 방법은 바이오마커의 수준에 기초하여 환자에 대한 세균/바이러스 메타스코어를 계산하는 단계를 포함할 수 있되, 환자에 대한 양성 세균/바이러스 메타스코어는 환자가 바이러스성 감염인 것을 나타내고, 환자에 대한 음성 세균/바이러스 메타스코어는 환자가 세균성 감염인 것을 나타낸다.
임의의 구현예에서, 상기 방법은 코코넛 정규화를 사용하여 데이터를 정규화하는 단계; 코코넛 정규화는 (a) 다수의 코호트로부터 데이터를 건강 및 질병 성분으로 분리하는 단계; (b) 공변량 없이 ComBat 공정규화(co-normalization)를 사용하여 건강 성분을 공정규화하는 단계; (c) 건강 성분에 대한 각각의 데이터세트에 대해 ComBat 추정 파라미터를 얻는 단계; 및 (d) ComBat 추정 파라미터를 질병 성분에 적용하는 단계를 포함한다.
임의의 구현예에서, 환자는 인간일 수 있다.
임의의 구현예에서, 복수의 바이오마커의 수준을 측정하는 단계는 마이크로어레이 분석, 중합 효소 연쇄 반응(PCR), 역전사 중합 효소 연쇄 반응(RT-PCR), 노던 블롯 또는 유전자 발현 연속 분석법(SAGE)을 포함할 수 있다.
하나의 구현예에서, 본 발명은 염증이 있는 환자를 진단 및 치료하는 방법을 포함할 수 있되, 방법은 (a) 환자의 생물학적 샘플에서 IFI27, JUP, LAX1, HK3, TNIP1, GPAA1, CTSB, CEACAM1, ZDHHC19, C9orf95, GNA15, BATF, C3AR1, KIAA1370, TGFBI, MTCH1, RPGRIP1, 및 HLA-DPB1 바이오마커의 발현 수준을 측정하는 단계; (b) 바이오마커에 대한 각각의 기준값과 함께 각각의 바이오마커의 발현 수준을 우선 분석하는 단계(비감염 대조 대상의 바이오마커에 대한 각각의 기준값 범위와 비교하여 CEACAM1, ZDHHC19, C9orf95, GNA15, BATF 및 C3AR1 바이오마커의 증가된 발현 수준 및 KIAA1370, TGFBI, MTCH1, RPGRIP1, 및 HLA-DPB1 바이오마커의 감소된 발현 수준은 환자가 감염된 것을 나타내고, 비감염 대조 대상과 비교하여 CEACAM1, ZDHHC19, C9orf95, GNA15, BATF, C3AR1, KIAA1370, TGFBI, MTCH1, RPGRIP1, 및 HLA-DPB1 바이오마커의 차등 발현의 부재는 환자가 감염되지 않은 것은 나타냄); 및 (c) 환자의 생물학적 샘플에서 적어도 2개의 바이오마커의 발현 수준을 더 분석하는 단계를 포함하되, 적어도 2개의 바이오마커는 보다 높은 수준의 발현이 세균성 감염을 나타내는 제1 세트의 바이오마커 및 보다 높은 수준의 발현이 바이러스성 감염을 나타내는 제2 세트의 바이오마커 중 하나 또는 둘 다로부터 선택되며, 세균성 또는 바이러스성 감염을 결정하기 위하여, 제1 세트의 바이오마커는 TSPO, EMR1, NINJ2, ACPP, TBXAS1, PGD, S100A12, SORT1, TNIP1, RAB31, SLC12A9, PLP2, IMPA2, GPAA1, LTA4H, RTN3, CETP, TALD01, HK3, ACAA1, CAT, DOK3, SORL1, PYGL, DYSF, TWF2, TKT, CTSB, FLII, PROS1, NRD1, STAT5B, CYBRD1, PTAFR, 및 LAPTM5 중 적어도 하나를 포함하고, 제2 세트의 바이오마커는 OAS1, IFIT1, SAMD9, ISG15, HERC5, DDX60, HESX1, IFI6, MX1, OASL, LAX1, IFIT5, IFIT3, KCTD14, OAS2, RTP4, PARP12, LY6E, ADA, IFI44L, IFI27, RSAD2, IFI44, OAS3, IFIH1, SIGLEC1, JUP, STAT1, CUL1, DNMT1, IFIT2, CHST12, ISG20, DHX58, EIF2AK2, XAF1, 및 GZMB 중 적어도 하나를 포함한다.
임의의 구현예에서, 방법은 환자에 대한 패혈증 메타스코어를 계산하는 단계를 포함할 수 있되, 비감염 대조 대상에 대한 기준값 범위보다 높은 패혈증 메타스코어는 환자가 감염된 것을 나타내고, 비감염 대조 대상에 대한 기준값 범위 내의 패혈증 메타스코어는 환자가 비감염성 염증 질환임을 나타낸다.
임의의 구현예에서, 본 방법은 환자가 감염된 것으로 진단된 경우 환자에 대한 세균/바이러스 메타스코어를 계산하는 단계를 포함할 수 있되, 환자에 대한 양성 세균/바이러스 메타스코어는 환자가 바이러스성 감염인 것을 나타내고, 환자에 대한 음성 세균/바이러스 메타스코어는 환자가 세균성 감염인 것을 나타낸다.
임의의 구현예에서, 바이오마커의 수준은 감염 또는 비감염 대상에 대한 시간-일치 기준값과 비교될 수 있다.
임의의 구현예에서, 비감염성 염증 질환은 전신성 염증 반응 증후군(SIRS), 자가 면역 장애, 외상성 손상 및 수술의 군으로부터 선택될 수 있다.
임의의 구현예에서, 환자는 인간일 수 있다.
임의의 구현예에서, 바이오마커의 수준을 측정하는 단계는 마이크로어레이 분석, 중합 효소 연쇄 반응(PCR), 역전사 중합 효소 연쇄 반응(RT-PCR), 노던 블롯 또는 유전자 발현 연속 분석법(SAGE)을 포함할 수 있다.
하나의 구현예에서, 방법은 키트에 관한 것으로, 키트는 환자의 생물학적 샘플에서 적어도 2개의 바이오마커의 수준을 측정하기 위한 제제를 포함하되, 적어도 2개의 바이오마커는 보다 높은 수준의 발현이 세균성 감염을 나타내는 제1 세트의 바이오마커 및 보다 높은 수준의 발현이 바이러스성 감염을 나타내는 제2 세트의 바이오마커 중 하나 또는 둘 다로부터 선택되며, 제1 세트의 바이오마커는 TSPO, EMR1, NINJ2, ACPP, TBXAS1, PGD, S100A12, SORT1, TNIP1, RAB31, SLC12A9, PLP2, IMPA2, GPAA1, LTA4H, RTN3, CETP, TALD01, HK3, ACAA1, CAT, DOK3, SORL1, PYGL, DYSF, TWF2, TKT, CTSB, FLII, PROS1, NRD1, STAT5B, CYBRD1, PTAFR, 및 LAPTM5 중 적어도 하나를 포함하고, 제2 세트의 바이오마커는 OAS1, IFIT1, SAMD9, ISG15, HERC5, DDX60, HESX1, IFI6, MX1, OASL, LAX1, IFIT5, IFIT3, KCTD14, OAS2, RTP4, PARP12, LY6E, ADA, IFI44L, IFI27, RSAD2, IFI44, OAS3, IFIH1, SIGLEC1, JUP, STAT1, CUL1, DNMT1, IFIT2, CHST12, ISG20, DHX58, EIF2AK2, XAF1, 및 GZMB 중 적어도 하나를 포함한다.
임의의 구현예에서, 키트는 CEACAM1, ZDHHC19, C9orf95, GNA15, BATF, C3AR1, KIAA1370, TGFBI, MTCH1, RPGRIP1, 및 HLA-DPB1 바이오마커의 수준을 측정하기 위한 제제를 포함할 수 있다.
임의의 구현예에서, 키트는 마이크로어레이를 포함할 수 있다.
임의의 구현예에서, 마이크로어레이는 IFI27 폴리뉴클레오타이드에 혼성화하는 올리고뉴클레오타이드, JUP 폴리뉴클레오타이드에 혼성화하는 올리고뉴클레오타이드, LAX1 폴리뉴클레오타이드에 혼성화하는 올리고뉴클레오타이드, HK3 폴리뉴클레오타이드에 혼성화하는 올리고뉴클레오타이드, TNIP1 폴리뉴클레오타이드에 혼성화하는 올리고뉴클레오타이드, GPAA1 폴리뉴클레오타이드에 혼성화하는 올리고뉴클레오타이드, 및 CTSB 폴리뉴클레오타이드에 혼성화하는 올리고뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.
임의의 구현예에서, 마이크로어레이는 CEACAM1 폴리뉴클레오타이드에 혼성화하는 올리고뉴클레오타이드, ZDHHC19 폴리뉴클레오타이드에 혼성화하는 올리고뉴클레오타이드, C9orf95 폴리뉴클레오타이드에 혼성화하는 올리고뉴클레오타이드, GNA15 폴리뉴클레오타이드에 혼성화하는 올리고뉴클레오타이드, BATF 폴리뉴클레오타이드에 혼성화하는 올리고뉴클레오타이드, C3AR1 폴리뉴클레오타이드에 혼성화하는 올리고뉴클레오타이드, KIAA1370 폴리뉴클레오타이드에 혼성화하는 올리고뉴클레오타이드, TGFBI 폴리뉴클레오타이드에 혼성화하는 올리고뉴클레오타이드, MTCH1 폴리뉴클레오타이드에 혼성화하는 올리고뉴클레오타이드, RPGRIP1 폴리뉴클레오타이드에 혼성화하는 올리고뉴클레오타이드, HLA-DPB1 폴리뉴클레오타이드에 혼성화하는 올리고뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.
임의의 구현예에서, 키트는 각각의 바이오마커의 검출된 수준을 패혈증과 관련시키기 위한 지침을 갖는 전자적 형태나 종이 형태의 정보를 포함할 수 있다.
하나의 구현예에서, 본 발명은 감염이 의심되는 환자를 진단하기 위한 컴퓨터 구현 방법에 관한 것으로, 컴퓨터는 (a) 환자의 생물학적 샘플에서 적어도 2개의 바이오마커의 수준에 대한 값을 포함하는 입력된 환자 데이터를 수신하는 단계(적어도 2개의 바이오마커는 보다 높은 수준의 발현이 세균성 감염을 나타내는 제1 세트의 바이오마커 및 보다 높은 수준의 발현이 바이러스성 감염을 나타내는 제2 세트의 바이오마커 중 하나 또는 둘 다로부터 선택되며, 제1 세트의 바이오마커는 TSPO, EMR1, NINJ2, ACPP, TBXAS1, PGD, S100A12, SORT1, TNIP1, RAB31, SLC12A9, PLP2, IMPA2, GPAA1, LTA4H, RTN3, CETP, TALD01, HK3, ACAA1, CAT, DOK3, SORL1, PYGL, DYSF, TWF2, TKT, CTSB, FLII, PROS1, NRD1, STAT5B, CYBRD1, PTAFR, 및 LAPTM5 중 적어도 하나를 포함하고, 제2 세트의 바이오마커는 OAS1, IFIT1, SAMD9, ISG15, HERC5, DDX60, HESX1, IFI6, MX1, OASL, LAX1, IFIT5, IFIT3, KCTD14, OAS2, RTP4, PARP12, LY6E, ADA, IFI44L, IFI27, RSAD2, IFI44, OAS3, IFIH1, SIGLEC1, JUP, STAT1, CUL1, DNMT1, IFIT2, CHST12, ISG20, DHX58, EIF2AK2, XAF1, 및 GZMB 바이오마커 중 적어도 하나를 포함함); (b) 각각의 바이오마커의 수준을 분석하여 바이오마커에 대한 각각의 기준값 범위와 비교하는 단계; (c) 바이오마커의 수준에 기초하여 환자에 대한 세균/바이러스 메타스코어를 계산하는 단계(환자에 대한 양성 세균/바이러스 메타스코어는 환자가 바이러스성 감염인 것을 나타내고, 환자에 대한 음성 세균/바이러스 메타스코어는 환자가 세균성 감염인 것을 나타냄); 및 (d) 환자의 진단에 관한 정보를 표시하는 단계를 수행한다.
임의의 구현예에서, 생물학적 샘플은 전혈 또는 말초 혈액 단핵 세포(PBMCS)를 포함할 수 있다.
하나의 구현예에서, 본 발명은 컴퓨터 구현 방법을 수행하는 진단 시스템에 관한 것으로, (a) 내부에 저장된 환자의 진단을 결정하기 위한 명령어를 가지며, 데이터를 저장하기 위한 저장부; (b) 환자 데이터를 수신하고 하나 이상의 알고리즘에 따라 환자 데이터를 분석하기 위해 저장부에 연결되고 저장부에 저장된 명령어를 실행하도록 구성된, 데이터 처리용 컴퓨터 프로세서; 및 (c) 환자의 진단에 관한 정보를 표시하기 위한 디스플레이부를 포함한다.
임의의 구현예에서, 저장부는 세균/바이러스 메타스코어를 계산하기 위한 명령어를 포함할 수 있다.
하나의 구현예에서, 본 발명은 염증을 갖는 환자를 진단하기 위한 컴퓨터 구현 방법에 관한 것으로, 컴퓨터는 (a) 환자의 생물학적 샘플에서IFI27, JUP, LAX1, HK3, TNIP1, GPAA1, CTSB, CEACAM1, ZDHHC19, C9orf95, GNA15, BATF, C3AR1, KIAA1370, TGFBI, MTCH1, RPGRIP1, 및 HLA-DPB1 바이오마커의 수준에 대한 값을 갖는 입력된 환자 데이터를 수신하는 단계; (b) 각각의 바이오마커의 수준을 분석하여 바이오마커에 대한 각각의 기준값 범위와 비교하는 단계; (c) 환자에 대한 패혈증 메타스코어를 계산하는 단계(비감염 대조 대상에 대한 기준치 범위보다 높은 패혈증 메타스코어는 환자가 감염된 것을 나타내며, 비감염 대조 대상에 대한 기준값 범위 내의 패혈증 메타스코어는 환자가 비감염성 염증 질환임을 나타냄); (d) 패혈증 점수가 환자가 감염된 것을 나타내는 경우 환자에 대한 세균/바이러스 메타스코어를 계산하는 단계(환자에 대한 양성 세균/바이러스 메타스코어는 환자가 바이러스성 감염인 것을 나타내고, 환자에 대한 음성 세균/바이러스 메타스코어는 환자가 세균성 감염인 것을 나타냄); 및 (e) 환자의 진단에 관한 정보를 표시하는 단계를 수행한다.
임의의 구현예에서, 생물학적 샘플은 전혈 또는 말초 혈액 단핵 세포(PBMCS)를 포함할 수 있다.
하나의 구현예에서, 본 발명은 컴퓨터 구현 방법을 수행하는 진단 시스템에 관한 것으로, (a) 내부에 저장된 환자의 진단을 결정하기 위한 명령어를 가지며, 데이터를 저장하기 위한 저장부; (b) 환자 데이터를 수신하고 하나 이상의 알고리즘에 따라 환자 데이터를 분석하기 위해 저장부에 연결되고 저장부에 저장된 명령어를 실행하도록 구성된, 데이터 처리용 컴퓨터 프로세서; 및 (c) 환자의 진단에 관한 정보를 표시하기 위한 디스플레이부를 포함한다.
임의의 구현예에서, 저장부는 패혈증 메타스코어 및 세균/바이러스 메타스코어를 계산하기 위한 명령어를 포함할 수 있다.
하나의 구현예에서, 본 발명은 환자의 감염을 진단 및 치료하는 방법에 관한 것으로, 방법은 (a) 환자로부터 생물학적 샘플을 얻는 단계; (b) 환자의 생물학적 샘플에서 적어도 2개의 바이오마커의 임의의 세트의 발현 수준을 측정하는 단계(적어도 2개의 바이오마커는 보다 높은 수준의 발현이 세균성 감염을 나타내는 제1 세트의 바이오마커 및 보다 높은 수준의 발현이 바이러스성 감염을 나타내는 제2 세트의 바이오마커 중 하나 또는 둘 다로부터 선택되며, 제1 세트의 바이오마커는 TSPO, EMR1, NINJ2, ACPP, TBXAS1, PGD, S100A12, SORT1, TNIP1, RAB31, SLC12A9, PLP2, IMPA2, GPAA1, LTA4H, RTN3, CETP, TALD01, HK3, ACAA1, CAT, DOK3, SORL1, PYGL, DYSF, TWF2, TKT, CTSB, FLII, PROS1, NRD1, STAT5B, CYBRD1, PTAFR, 및 LAPTM5 중 적어도 하나를 포함하고, 제2 세트의 바이오마커는OAS1, IFIT1, SAMD9, ISG15, HERC5, DDX60, HESX1, IFI6, MX1, OASL, LAX1, IFIT5, IFIT3, KCTD14, OAS2, RTP4, PARP12, LY6E, ADA, IFI44L, IFI27, RSAD2, IFI44, OAS3, IFIH1, SIGLEC1, JUP, STAT1, CUL1, DNMT1, IFIT2, CHST12, ISG20, DHX58, EIF2AK2, XAF1, 및 GZMB 중 적어도 하나를 포함함); 및 (c) 비감염 대조 대상에 대한 각각의 기준값 범위와 함께 각각의 바이오마커의 발현 수준을 분석하는 단계를 포함하되, 비감염 대조 대상에 대한 기준값 범위와 비교하여 바이러스 반응 유전자의 차등 발현은 환자가 바이러스성 감염인 것을 나타내고, 비감염 대조 대상에 대한 기준값 범위와 비교하여 세균 반응 유전자의 차등 발현은 환자가 세균성 감염인 것을 나타낸다.
임의의 구현예에서, 바이러스 및 세균 반응 유전자 세트는 (a) OAS2 및 CUL1을 포함하는 바이러스 반응 유전자 세트 및 SLC12A9, ACPP, STAT5B를 포함하는 세균 반응 유전자 세트; (b) ISG15 및 CHST12를 포함하는 바이러스 반응 유전자 세트 및 EMR1 및 FLII를 포함하는 세균 반응 유전자 세트; (c) IFIT1, SIGLEC1 및 ADA를 포함하는 바이러스 반응 유전자 세트 및 PTAFR, NRD1, PLP2를 포함하는 세균 반응 유전자 세트; (d) MX1을 포함하는 바이러스 반응 유전자 세트 및 DYSF, TWF2를 포함하는 세균 반응 유전자 세트; (e) RSAD2를 포함하는 바이러스 반응 유전자 세트 및 SORT1 및 TSPO를 포함하는 세균 반응 유전자 세트; (f) IFI44L, GZMB 및 KCTD14를 포함하는 바이러스 반응 유전자 세트 및 TBXAS1, ACAA1 및 S100A12를 포함하는 세균 반응 유전자 세트; (g) LY6E를 포함하는 바이러스 반응 유전자 세트 및 PGD 및 LAPTM5를 포함하는 세균 반응 유전자 세트; (h) IFI44, HESX1 및 OASL을 포함하는 바이러스 반응 유전자 세트 및 NINJ2, DOK3, SORL1 및 RAB31을 포함하는 세균 반응 유전자 세트; 및 (i) OAS1을 포함하는 바이러스 반응 유전자 세트 및 IMPA2 및 LTA4H를 포함하는 세균 반응 유전자 세트의 군으로부터 선택될 수 있다.
임의의 구현예에서, 생물학적 샘플은 전혈 또는 말초 혈액 단핵 세포(PBMCS)를 포함할 수 있다.
임의의 구현예에서, 바이오마커의 수준은 감염 또는 비감염 대상에 대한 시간-일치 기준값과 비교될 수 있다.
임의의 구현예에서, 방법은 바이오마커의 수준에 기초하여 환자에 대한 세균/바이러스 메타스코어를 계산하는 단계를 포함할 수 있되, 환자에 대한 양성 세균/바이러스 메타스코어는 환자가 바이러스성 감염인 것을 나타내고, 환자에 대한 음성 세균/바이러스 메타스코어는 환자가 세균성 감염인 것을 나타낸다.
임의의 구현예에서, 방법은 생물학적 샘플에서 IFI27, JUP, LAX1, HK3, TNIP1, GPAA1, CTSB, CEACAM1, ZDHHC19, C9orf95, GNA15, BATF, C3AR1, KIAA1370, TGFBI, MTCH1, RPGRIP1, 및 HLA-DPB1 바이오마커의 발현 수준을 측정하는 단계; 바이오마커의 각각의 기준값 범위와 함께 각각의 바이오마커의 발현 수준을 분석하는 단계를 포함할 수 있되, 비감염 대조 대상에 대한 바이오마커의 기준값 범위와 비교하여 CEACAM1, ZDHHC19, C9orf95, GNA15, BATF, 및 C3AR1 바이오마커의 증가된 발현 수준과 KIAA1370, TGFBI, MTCH1, RPGRIP1, 및 HLA-DPB1 바이오마커의 감소된 발현 수준은 환자가 감염된 것을 나타내고, 대조 대상과 비교하여 CEACAM1, ZDHHC19, C9orf95, GNA15, BATF, C3AR1, KIAA1370, TGFBI, MTCH1, RPGRIP1, 및 HLA-DPB1 바이오마커는 환자가 감염되지 않은 것을 나타낸다.
하나의 구현예에서, 방법은 (a) OAS2 및 CUL1을 포함하는 바이러스 반응 유전자 세트 및 SLC12A9, ACPP, STAT5B를 포함하는 세균 반응 유전자 세트; (b) ISG15 및 CHST12를 포함하는 바이러스 반응 유전자 세트 및 EMR1 및 FLII를 포함하는 세균 반응 유전자 세트; (c) IFIT1, SIGLEC1 및 ADA를 포함하는 바이러스 반응 유전자 세트 및 PTAFR, NRD1, PLP2를 포함하는 세균 반응 유전자 세트; (d) MX1을 포함하는 바이러스 반응 유전자 세트 및 DYSF, TWF2를 포함하는 세균 반응 유전자 세트; (e) RSAD2를 포함하는 바이러스 반응 유전자 세트 및 SORT1 및 TSPO를 포함하는 세균 반응 유전자 세트; (f) IFI44L, GZMB 및 KCTD14를 포함하는 바이러스 반응 유전자 세트 및 TBXAS1, ACAA1 및 S100A12를 포함하는 세균 반응 유전자 세트; (h) IFI44, HESX1 및 OASL을 포함하는 바이러스 반응 유전자 세트 및 NINJ2, DOK3, SORL1 및 RAB31을 포함하는 세균 반응 유전자 세트; (i) OAS1을 포함하는 바이러스 반응 유전자 세트 및 IMPA2 및 LTA4H를 포함하는 세균 반응 유전자 세트로부터 선택되는 바이러스 반응 유전자 세트 및 세균 반응 유전자 세트의 발현 수준을 측정하기 위한 제제를 포함하는 키트에 관한 것이다.
임의의 구현예에서, 키트는 마이크로어레이를 포함할 수 있다.
하나의 구현예에서, 본 발명은 감염이 의심되는 환자를 진단하기 위한 컴퓨터 구현 방법에 관한 것으로, 컴퓨터는 (a) 환자의 생물학적 샘플에서 적어도 2개의 바이오마커의 수준에 대한 값을 포함하는 입력된 환자 데이터를 수신하는 단계(적어도 2개의 바이오마커는 보다 높은 수준의 발현이 세균성 감염을 나타내는 제1 세트의 바이오마커 및 보다 높은 수준의 발현이 바이러스성 감염을 나타내는 제2 세트의 바이오마커 중 하나 또는 둘 다로부터 선택되며, 바이러스 반응 유전자 세트는, OAS2, CUL1, ISG15, CHST12, IFIT1, SIGLEC1, ADA, MX1, RSAD2, IFI44L, GZMB, KCTD14, LY6E, IFI44, HESX1, OASL, OAS1, OAS3, EIF2AK2, DDX60, DNMT1, HERC5, IFIH1, SAMD9, IFI6, IFIT3, IFIT5, XAF1, ISG20, PARP12, IFIT2, DHX58, STAT1의 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자를 포함하고, 세균 반응 유전자 세트는 SLC12A9, ACPP, STAT5B, EMR1, FLII, PTAFR, NRD1, PLP2, DYSF, TWF2, SORT1, TSPO, TBXAS1, ACAA1, S100A12, PGD, LAPTM5, NINJ2, DOK3, SORL1, RAB31, IMPA2, LTA4H, TALDO1, TKT, PYGL, CETP, PROS1, RTN3, CAT, CYBRD1의 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자를 포함함); (b) 바이러스 반응 유전자 세트 및 세균 반응 유전자 세트의 발현 수준을 분석하여 비감염 대조 대상에 대한 각각의 기준값 범위와 비교하는 단계; (c) 바이러스 반응 유전자 세트 및 세균 반응 유전자 세트의 발현 수준에 기초하여 환자에 대한 세균/바이러스 메타스코어를 계산하는 단계; 및 (d) 환자의 진단에 관한 정보를 표시하는 단계를 수행한다.
하나의 구현예에서, 본 발명은 컴퓨터 구현 방법을 수행하는 진단 시스템에 관한 것으로, 진단 시스템은 (a) 내부에 저장된 환자의 진단을 결정하기 위한 명령을 가지며, 데이터를 저장하기 위한 저장부; (b) 환자 데이터를 수신하고 하나 이상의 알고리즘에 따라 환자 데이터를 분석하기 위해 저장부에 연결되고 저장부에 저장된 명령어를 실행하도록 구성된, 데이터 처리용 컴퓨터 프로세서; 및 (c) 환자의 진단에 관한 정보를 표시하기 위한 디스플레이부를 포함한다.
본 발명의 이들 구현예 및 다른 구현예는 본원의 개시로 인해 당업자에게 용이하게 생각날 것이다.
도 1a 및 도 1b는 세균/바이러스 메타스코어에 대한 (도 1a) 발견 및 (도 1b) 직접 검증 데이터 세트에 대한 요약 수신자 조작 특성(Receiver Operating Characteristic, ROC) 곡선을 도시한다. 요약 ROC 곡선이 검은 색으로 표시되고 95% 신뢰 구간이 어두운 회색으로 표시된다.
도 2는 코코넛 공정규화 전혈 발견 데이터 세트에 대한 세균/바이러스 점수를 나타낸다. PBMC 데이터 세트는 전혈과 유전자 수준이 다를 것으로 예상되므로 PBMC 데이터 세트는 도 2에서 제외된다. 모든 전혈 발견 데이터 세트에서 전체 AUC는 0.92이다. 데이터 세트(어두운 회색 = 세균성, 밝은 회색 = 바이러스성), 개별 유전자 수준, 및 하우스키핑(housekeeping) 유전자(회색조)에 의한 점수 분포가 도시된다. 점선은 가능한 전체 임계값을 나타낸다. 각각의 바이올린의 너비는 주어진 데이터 세트 내의 점수 분포에 해당한다. 각각의 바이올린 내의 수직 이동 막대는 25번째-75번째 백분위수에 걸쳐 있고, 중간 백색 대시는 평균 점수를 나타낸다. 하우스키핑 유전자(POLG, ATP6V1B1 및 PEG10)는 코코넛-정규화 이후의 데이터 세트 전체에서 예상되는 불변량을 나타낸다.
도 3a-3c는 포함 기준에 부합하는 코코넛-공정규화된 공개 유전자 발현 데이터 전체에서 통합된 항생제 결정 모델(IADM)을 도시한다. 도 3a는 IADM 개략도를 도시한다. 도 3b는 코코넛-공정규화된 데이터에서의 IADM에 대한 점수 및 컷오프(cutoff)의 분포를 도시한다. 도 3c는 진단을 위한 오차 행렬을 도시한다. 세균성 감염 민감도: 94.0%; 세균성 감염 특이도: 59.8%; 바이러스성 감염 민감도: 53.0%; 바이러스성 감염 특이도: 90.6%.
도 4a-4e는 마이크로어레이(총 N=96, SIRS=36, 세균성 패혈증=49, 바이러스성 패혈증=11)로 시험하지 않은 GPSSSI 코호트의 SIRS/패혈증이 있는 아동으로부터 표적 나노스트링(NanoString) 유전자 발현 데이터를 나타낸다. 도 4a는 감염된 환자의 생물 유형별 명세를 나타낸다. 도 4b 및 4c는 SMS 및 세균/바이러스 메타스코어에 대한 ROC 곡선을 도시한다. 도 4d는 IADM에 대한 점수와 컷오프의 분포를 도시한다. 도 4e는 IADM에 대한 오차 행렬을 도시한다; 세균성 감염 민감도: 89.7%; 세균성 감염 특이도: 70.0%; 바이러스성 감염 민감도: 54.5%; 바이러스성 감염 특이도: 96.5%.
도 5a 및 5b는 패혈증 메타스코어(SMS) 단독으로 병원균 유형을 결정할 수 없음을 보여준다. (도 5a의) 다이어그램은 의사 결정 모델을 구축하는 방법을 나타낸다. 도 5b는 세균성 감염 대 바이러스성 감염 환자에서의 SMS 분포를 나타낸다. 11개의 데이터 세트 중 3개만이 세균성 감염과 바이러스성 감염 사이에 유의미한 차이를 나타냈다.
도 6은 다중-코호트 분석 및 세균-바이러스성 메타시그니처(metasignature) 발견을 위한 작업 흐름 개략도를 도시한다.
도 7은 발견 데이터 세트 전체에 걸쳐 세균/바이러스 메타스코어의 유전자 숲그림(forest plot)을 도시한다. x축은 세균성 감염과 바이러스성 감염 샘플 간의 표준화된 평균차를 나타내고, log2 스케일에서 헤지스 g(Hedges' g)로 계산된다. 검정 직사각형의 크기는 연구에서 평균의 표준 오차에 반비례한다. 수염(whisker)은 95% 신뢰 구간을 나타낸다. 밝은 회색의 마름모는 주어진 유전자에 대한 전체 결합 평균차를 나타낸다. 마름모의 너비는 전체 결합 평균차의 95% 신뢰 구간을 나타낸다.
도 8은 발견 데이터 세트에 대한 요약 ROC 파라미터 알파 및 베타의 무작위 효과 메타 분석의 숲그림을 도시한다. 알파는 일치 선과의 거리를 대략적으로 제어하며(높은 알파 = 높은 AUC) 베타는 실제 ROC 곡선의 비틀림(skew)을 제어한다(베타 = 0은 비틀림이 없음을 의미).
도 9는 검증 데이터 세트에 대한 요약 ROC 파라미터 알파 및 베타의 무작위 효과 메타 분석의 숲그림을 도시한다. 알파는 일치 선과의 거리를 대략적으로 제어하며(높은 알파 = 높은 AUC) 베타는 실제 ROC 곡선의 비틀림(skew)을 제어한다(베타 = 0은 비틀림이 없음을 의미).
도 10은 시험관 내에서 LPS 또는 인플루엔자 바이러스로 자극된 단핵구-유도 수지상 세포인 GSE53166에서 총 N = 75(39 LPS, 36 인플루엔자 바이러스)의 세균/바이러스 메타스코어 ROC를 나타낸다.
도 11은 코코넛 공정규화의 개략도를 도시한다. 밝은 회색은 건강('H'), 중간 회색은 바이러스성('V'), 어두운 회색은 세균성(B)을 의미한다. 상이한 교차 해칭은 상이한 배치 효과(batch effect)를 나타내기 위한 것이다. 수학적 표현의 세부 사항에 대해서는 방법 항목 참조.
도 12a 및 도 12b는 전혈 발견 데이터 세트의 데이터를 나타낸다. PBMC 데이터 세트는 전혈과 유전자 수준이 다를 것으로 예상되므로 PBMC 데이터 세트는 도 12a 및 도 12b에서 제외된다. 도 12a는 미가공 데이터를 도시하고, 도 12b는 코코넛 공정규화 데이터를 나타낸다. 코코넛 공정규화는 각각의 유전자가 대조 환자에게 동일한 위치 및 규모로 재설정되도록 한다. 데이터 세트 내의 유전자의 분포는 변하지 않는다(모든 유전자와 모든 데이터 세트에서 데이터 세트 내의 건강 대 질병에 대한 T-통계량의 중앙값 차이는 0, 범위(-1e-13, 1e-13)임). 하우스키핑 유전자 ATP6V1B1은 질병과 관련하여 예상되는 불변성을 보여주며, 정규화 후에 데이터 세트 전체에 걸쳐 변하지 않는다. 질병에 의해 유도될 것으로 예상되는 유전자, 예컨대, CEACAM1은 건강한 대조군 전체에 걸쳐 불변성을 나타내지만, 데이터 세트 간 질병 상태는 다양할 수 있다. 상단 색상 막대는 데이터 세트를 나타내고, 하단 색상 막대는 질병 부류를 나타낸다.
도 13은 전혈 검증 데이터 세트의 코코넛 공정규화의 전체 ROC에서의 세균/바이러스 점수를 나타낸다. 모든 전혈 검증 데이터 세트에서 전체 AUC는 0.93이다. 데이터 세트(어두운 회색 바이올린 = 세균성, 밝은 회색 바이올린 = 바이러스성) 및 하우스키핑 유전자(회색조)에 의한 점수 분포가 도시된다. 각각의 바이올린의 너비는 주어진 데이터 세트 내의 점수 분포에 해당한다. 각각의 바이올린 내의 수직 이동 막대는 25번째-75번째 백분위수에 걸쳐 있고, 중간 백색 대시는 평균 점수를 나타낸다. 점선은 가능한 전체 임계값을 나타낸다. 하우스키핑 유전자(POLG, ATP6V1B1 및 PEG10)는 코코넛-정규화 이후의 데이터 세트 전체에서 예상되는 불변량을 나타낸다.
도 14는 비-공정규화 전혈 발견 데이터 세트의 전체 ROC에서 세균/바이러스 점수를 나타낸다. PBMC 데이터 세트는 전혈과 유전자 수준이 다를 것으로 예상되므로 PBMC 데이터 세트는 도 14에서 제외된다. 모든 전혈 발견 데이터 세트에서 전체 AUC는 0.93이다. 데이터 세트(어두운 회색 바이올린 = 세균성, 밝은 회색 바이올린 = 바이러스성) 및 하우스키핑 유전자(회색조)에 의한 점수 분포가 도시된다. 각각의 바이올린의 너비는 주어진 데이터 세트 내의 점수 분포에 해당한다. 각각의 바이올린 내의 수직 이동 막대는 25번째-75번째 백분위수에 걸쳐 있고, 중간 백색 대시는 평균 점수를 나타낸다. 하우스키핑 유전자인 POLG, ATP6V1B1 및 PEG10의 위치와 규모가 매우 다양하다는 것을 유의해야 한다.
도 15는 비-공정규화 전혈 검증 데이터 세트의 전체 ROC에서의 세균/바이러스 점수를 나타낸다. PBMC 데이터 세트는 전혈과 유전자 수준이 다를 것으로 예상되므로 PBMC 데이터 세트는 도 15에서 제외된다. 데이터 세트(어두운 회색 바이올린 = 세균성, 밝은 회색 바이올린 = 바이러스성) 및 하우스키핑 유전자(회색조)에 의한 점수 분포가 도시된다. 각각의 바이올린의 너비는 주어진 데이터 세트 내의 점수 분포에 해당한다. 각각의 바이올린 내의 수직 이동 막대는 25번째-75번째 백분위수에 걸쳐 있고, 중간 백색 대시는 평균 점수를 나타낸다. 하우스키핑 유전자인 POLG, ATP6V1B1 및 PEG10의 위치와 규모가 매우 다양하다는 것을 유의해야 한다.
도 16은 PBMC 검증 데이터 세트의 코코넛 공정규화의 전체 ROC에서의 세균/바이러스 점수를 나타낸다. PBMC 데이터 세트는 전혈과 유전자 수준이 다를 것으로 예상되므로 PBMC 데이터 세트는 별도로 검사한다. 모든 PBMC 검증 데이터 세트에서 전체 AUC는 0.92이다. 데이터 세트(어두운 회색 바이올린 = 세균성, 밝은 회색 바이올린 = 바이러스성) 및 하우스키핑 유전자(회색조)에 의한 점수 분포가 도시된다. 점선은 가능한 전체 임계값을 나타낸다. 각각의 바이올린의 너비는 주어진 데이터 세트 내의 점수 분포에 해당한다. 각각의 바이올린 내의 수직 이동 막대는 25번째-75번째 백분위수에 걸쳐 있고, 중간 백색 대시는 평균 점수를 나타낸다. 하우스키핑 유전자(POLG, ATP6V1B1)는 코코넛-정규화 이후의 데이터 세트에서 예상되는 불변량을 나타낸다.
도 17은 비-공정규화 PBMC 검증 데이터 세트의 전체 ROC에서의 세균/바이러스 점수를 나타낸다. PBMC 데이터 세트는 전혈과 유전자 수준이 다를 것으로 예상되므로 PBMC 데이터 세트는 별도로 검사한다. 데이터 세트(어두운 회색 바이올린 = 세균성, 밝은 회색 바이올린 = 바이러스성), 개별 유전자 수준, 하우스키핑 유전자(회색조)에 의한 점수 분포가 도시된다. 각각의 바이올린의 너비는 주어진 데이터 세트 내의 점수 분포에 해당한다. 각각의 바이올린 내의 수직 이동 막대는 25번째-75번째 백분위수에 걸쳐 있고, 중간 백색 대시는 평균 점수를 나타낸다. 하우스키핑 유전자인 POLG와 ATP6V1B1의 위치와 크기가 매우 다양함에 유의해야 한다.
도 18은 10,000개의 무작위로 선택된 2-유전자 쌍에 대한 모든 발견 데이터 세트에 걸친 평균 AUC의 분포를 나타낸다.
도 19a-19d는 코코넛 공정규화 데이터에서의 패혈증 메타스코어에 대한 연령의 영향을 나타낸다. 도 19a는 병원균 유형이 SMS에서 연령 차이를 유발하는지 여부를 평가하기 위해 병원균 유형별 연령 대 SMS를 나타낸다. 도 19b는 극단적인 연령대에서 SMS는 상이한 도달 가능한 최대치를 가질 수 있음을 나타내는, 병원균 유형별 log10(연령) 대 SMS를 나타낸다. 도 19c는 연령과 SMS 간의 관계가 데이터 세트 독립적임을 입증하는, 데이터 세트별 log10(연령) 대 SMS를 나타낸다. 도 19a-19c는 감염 환자 샘플만 포함하고, 도 19d는 건강 및 비감염성 SIRS 샘플 모두를 나타낼 뿐 아니라 전체 연령에 걸친 기준선을 나타낸다. 모든 경우에, GSE25504 연령 데이터는 데이터 밀도를 나타내기 위해, 대략 2주 +/- 1주의 원고에서 주어진 평균 연령에 따라 무작위로 배분된다. 모든 연령=0은 연령=1/365로 재설정되었다.
도 20a 및 도 20b는 코코넛 공정규화 후(도 20a) 및 전(도 20b)에 모든 전혈 데이터(발견 및 검증 둘 다)에 걸쳐 패혈증 메타스코어를 나타낸다. 코코넛 공정규화 후 전체 AUC는 0.86(95% CI 0.84-0.89)이다. 데이터 세트(밝은 회색 바이올린 = 비감염 염증, 어두운 회색 바이올린 = 감염/패혈증) 및 하우스키핑 유전자(회색조)에 의한 점수 분포가 도시된다. 점선은 가능한 전체 임계값을 나타낸다. 각각의 바이올린의 너비는 주어진 데이터 세트 내의 점수 분포에 해당한다. 각각의 바이올린 내의 수직 이동 막대는 25번째-75번째 백분위수에 걸쳐 있고, 중간 백색 대시는 평균 점수를 나타낸다. 도 20b에서 정규화 이전에 하우스키핑 유전자의 위치 및 규모가 매우 다양하지만, 코코넛-정규화 이후의 도 20a의 데이터 세트 전체에서 하우스키핑 유전자인 POLG, ATP6V1B1 및 PEG10의 불변성을 유의해야 한다.
도 21a 및 도 21b는 건강한 대조군을 포함하는 코코넛-공정규화 공개 유전자 발현 데이터 전체에서 IADM을 나타낸다. 포함된 데이터 세트(및 사용된 점수 컷오프)는 도 3a-3c의 것들과 동일하다. 도 21a는 코코넛-공정규화 데이터에서 IADM에 대한 점수 분포를 도시한다. 도 21b는 진단용 오차 행렬을 나타낸다. 세균성 감염 민감도: 94.2%; 세균성 감염 특이도: 68.5%; 바이러스성 감염 민감도: 53.0%; 바이러스성 감염 특이도: 94.1%. 'SIRS'는 비감염성 염증을 의미한다.
도 22는 94.0% 민감도 및 59.8% 특이도를 갖는 진단 테스트에 대한 NPV 및 PPV 대 유병률을 나타낸다. 적색선은 실제 증례-감염률의 대략적인 추정치로서 유병률 15%에서 NPV가 98.3%임을 나타낸다.
도 23a-23d는 GSE63990 데이터 세트(급성 호흡기 감염인 성인)에 대한 결과를 나타낸다. 도 23a 및 도 23b는 패혈증 메타스코어 및 세균/바이러스 메타스코어에 대한 ROC 곡선을 도시한다. 도 23c는 IADM에 대한 점수 및 컷오프의 분포를 도시한다. 도 23d는 IADM에 대한 오차 행렬을 도시한다; 세균성 감염 민감도: 94.3%; 세균성 감염 특이도: 52.2%; 바이러스성 감염 민감도: 52.2%; 바이러스성 감염 특이도: 94.3%.
달리 명시하지 않는 한, 본 발명의 실시는 당업계의 약학, 화학, 생화학, 재조합 DNA 기법 및 면역학의 통상적인 방법을 이용할 것이다. 이러한 기술은 문헌에서 충분히 설명된다. 예컨대, J.E. Bennett, R. Dolin, and M.J. Blaser Mandell, Douglas, and Bennett's Principles and Practice of Infectious Diseases (Saunders, 8th edition, 2014); J.R. Brown Sepsis: Symptoms, Diagnosis and Treatment (Public Health in the 21st Century Series, Nova Science Publishers, Inc., 2013); Sepsis and Non-infectious Systemic Inflammation: From Biology to Critical Care (J. Cavaillon, C. Adrie eds., Wiley-Blackwell, 2008); Sepsis: Diagnosis, Management and Health Outcomes (Allergies and Infectious Diseases, N. Khardori ed., Nova Science Pub Inc., 2014); Handbook of Experimental Immunology, Vols. I-IV (D.M. Weir and C.C. Blackwell eds., Blackwell Scientific Publications); A.L. Lehninger, Biochemistry (Worth Publishers, Inc., current addition); Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd Edition, 2001); Methods In Enzymology (S. Colowick and N. Kaplan eds., Academic Press, Inc.) 참조.
본원에 인용된 모든 간행물, 특허 및 특허 출원은 상기 또는 하기 여부에 관계없이 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.
I. 정의
본 발명을 설명하는 데 다음의 용어를 사용하고, 아래에 명시한 바와 같이 정의하고자 한다.
본 명세서 및 첨부된 청구범위에서 사용되는 단수 형태 "하나의(a, an)" 및 "상기(the)"는 문맥상 명백하게 달리 지시하지 않는 한 복수의 지시 대상을 포함하는 것을 유의해야 한다. 따라서, 예를 들어, "바이오마커"라는 언급은 두 개 이상의 바이오마커의 혼합물 등을 포함한다.
용어 "약"은 특히 주어진 양에 관하여 플러스 또는 마이너스 5%의 편차를 포함하기 위한 것이다.
본원에서 사용되는 곡선 아래 면적(Area Under the Curve, AUC)이라는 용어는 수신자 조작 특성 곡선(ROC 곡선) 아래의 면적을 지칭하는 것으로 이해될 것이다.
본 발명의 문맥에서 "바이오마커"는 대조 대상(예컨대, 음성 진단, 정상 또는 건강한 대상, 또는 비감염 대상)으로부터 채취한 비교 샘플과 비교하여 감염이 있는 환자로부터 채취한 샘플에서 차등 발현되는 폴리뉴클레오타이드와 같은 생물학적 화합물을 지칭한다. 바이오마커는 핵산, 핵산의 단편, 폴리뉴클레오타이드 또는 검출 및/또는 정량화될 수 있는 올리고뉴클레오타이드일 수 있다. 바이오마커는 이에 제한되지 않지만, IFI27, JUP, LAX1, OAS2, CUL1, ISG15, CHST12, IFIT1, SIGLEC1, ADA, MX1, RSAD2, IFI44L, GZMB, KCTD14, LY6E, IFI44, HESX1, OASL, OAS1, OAS3, EIF2AK2, DDX60, DNMT1, HERC5, IFIH1, SAMD9, IFI6, IFIT3, IFIT5, XAF1, ISG20, PARP12, IFIT2, DHX58, STAT1, HK3, TNIP1, GPAA1, CTSB, SLC12A9, ACPP, STAT5B, EMR1, FLII, PTAFR, NRD1, PLP2, DYSF, TWF2, SORT1, TSPO, TBXAS1, ACAA1, S100A12, PGD, LAPTM5, NINJ2, DOK3, SORL1, RAB31, IMPA2, LTA4H, TALDO1, TKT, PYGL, CETP, PROS1, RTN3, CAT, CYBRD1, CEACAM1, ZDHHC19, C9orf95, GNA15, BATF, C3AR1, KIAA1370, TGFBI, MTCH1, RPGRIP1, 및 HLA-DPB1을 포함하여 유전자 또는 유전자의 RNA 전사물로부터 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다.
"바이러스 반응 유전자"는 대조 대상(예컨대, 음성 진단, 정상 또는 건강한 대상, 또는 비감염 대상인 사람)으로부터 채취한 비교 샘플과 비교하여 바이러스성 감염이 있는 환자로부터 채취한 샘플에서 차등 발현되는 유전자를 지칭한다. 바이러스 반응 유전자는 이에 제한되지 않지만, IFI27, JUP, LAX1, OAS2, CUL1, ISG15, CHST12, IFIT1, SIGLEC1, ADA, MX1, RSAD2, IFI44L, GZMB, KCTD14, LY6E, IFI44, HESX1, OASL, OAS1, OAS3, EIF2AK2, DDX60, DNMT1, HERC5, IFIH1, SAMD9, IFI6, IFIT3, IFIT5, XAF1, ISG20, PARP12, IFIT2, DHX58, 및 STAT1을 포함한다.
"세균 반응 유전자"는 대조 대상(예컨대, 음성 진단, 정상 또는 건강한 대상, 또는 비감염 대상인 사람)으로부터 채취한 비교 샘플과 비교하여 세균성 감염이 있는 환자로부터 채취한 샘플에서 차등 발현되는 유전자를 지칭한다. 세균 반응 유전자는 이에 제한되지 않지만, HK3, TNIP1, GPAA1, CTSB, SLC12A9, ACPP, STAT5B, EMR1, FLII, PTAFR, NRD1, PLP2, DYSF, TWF2, SORT1, TSPO, TBXAS1, ACAA1, S100A12, PGD, LAPTM5, NINJ2, DOK3, SORL1, RAB31, IMPA2, LTA4H, TALDO1, TKT, PYGL, CETP, PROS1, RTN3, CAT, 및 CYBRD1을 포함한다.
"패혈증 반응 유전자"는 대조 대상(예컨대, 음성 진단, 정상 또는 건강한 대상, 또는 비감염 대상인 사람)으로부터 채취한 비교 샘플과 비교하여 패혈증 또는 감염이 있는 환자로부터 채취한 샘플에서 차등 발현되는 유전자를 지칭한다. 패혈증 반응 유전자는 이에 제한되지 않지만, CEACAM1, ZDHHC19, C9orf95, GNA15, BATF, C3AR1, KIAA1370, TGFBI, MTCH1, RPGRIP1, 및 HLA-DPB1을 포함한다.
용어 "폴리펩타이드" 및 "단백질"은 아미노산 잔기의 중합체를 지칭하지만, 최소 길이에 제한되지 않는다. 따라서, 펩타이드, 올리고펩타이드, 이량체, 다량체 등이 본 정의 내에 포함된다. 전장 단백질과 그 단편은 모두 본 정의에 포함된다. 이 용어는 또한 폴리펩타이드의 발현후 변형, 예를 들어, 당화, 아세틸화, 인산화, 수산화, 산화 등을 포함한다.
용어 "폴리뉴클레오타이드", "올리고뉴클레오타이드", "핵산" 및 "핵산 분자"는 임의의 길이의 리보뉴클레오타이드 또는 데옥시리보뉴클레오타이드 중 하나의 뉴클레오타이드의 중합체 형태를 포함하여 본원에서 사용된다. 이 용어는 분자의 1차 구조만을 나타낸다. 따라서 이 용어는 삼중 가닥, 이중 가닥 및 단일 가닥 RNA뿐만 아니라 삼중 가닥, 이중 가닥 및 단일 가닥 DNA를 포함한다. 또한, 메틸화 및/또는 캡핑(capping) 및 폴리뉴클레오타이드의 변형되지 않은 형태에 의한 변형을 포함한다. 보다 구체적으로, 용어 "폴리뉴클레오타이드", "올리고뉴클레오타이드", "핵산", 및 "핵산 분자"는 (2-데옥시-D-리보스를 함유하는) 폴리데옥시리보뉴클레오타이드, (D-리보스를 함유하는) 폴리리보뉴클레오타이드, 및 퓨린 또는 피리미딘 염기의 N-글리코사이드 또는 C-글리코사이드인 임의의 다른 유형의 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 용어 "폴리뉴클레오타이드", "올리고뉴클레오타이드", "핵산", 및 "핵산 분자" 사이에서 길이의 차이는 의도되지 않았고, 이들 용어는 상호교환적으로 사용된다.
"차등 발현되는"이라는 문구는 대조 대상 또는 비감염 대상과 비교하여 예를 들어 감염(예컨대, 바이러스성 감염 또는 세균성 감염)이 있는 환자로부터 채취한 샘플에 존재하는 바이오마커의 양 및/또는 빈도의 차이를 지칭한다. 예를 들어, 바이오마커는 대조 대상의 샘플과 비교하여 감염(예컨대, 바이러스성 감염 또는 세균성 감염)이 있는 환자의 샘플에서 증가된 수준 또는 감소된 수준으로 존재하는 폴리뉴클레오타이드일 수 있다. 대안으로, 바이오마커는 대조 대상의 샘플과 비교하여 감염(예컨대, 바이러스성 감염 또는 세균성 감염)이 있는 환자의 샘플에서 보다 높은 빈도 또는 낮은 빈도로 검출되는 폴리뉴클레오타이드일 수 있다. 바이오마커는 양, 빈도, 또는 둘 모두의 관점에서 구별되게 존재할 수 있다.
하나의 샘플 내의 폴리뉴클레오타이드의 양이 다른 샘플에서의 폴리뉴클레오타이드의 양과 통계적으로 유의하게 상이한 경우, 폴리뉴클레오타이드는 2개의 샘플 사이에서 차등 발현된다. 예를 들어, 폴리뉴클레오타이드가 다른 샘플에 적어도 약 120%, 적어도 약 130%, 적어도 약 150%, 적어도 약 180%, 적어도 약 200%, 적어도 약 300%, 적어도 약 500%, 적어도 약 700%, 적어도 약 900%, 또는 적어도 약 1000% 더 많이 존재하는 경우, 또는 하나의 샘플에서 검출 가능하고 다른 샘플에서 검출 불가능한 경우에 폴리뉴클레오타이드는 2개의 샘플에서 차등 발현된다.
대안으로 또는 추가로, 패혈증을 앓는 환자의 샘플에서 폴리뉴클레오타이드를 검출하는 빈도가 대조 샘플보다 통계적으로 유의하게 높거나 낮은 경우, 폴리뉴클레오타이드는 두 세트의 샘플에서 차등 발현된다. 예를 들어, 폴리뉴클레오타이드가 한 세트의 샘플에서 다른 세트의 샘플보다 적어도 약 120%, 적어도 약 130%, 적어도 약 150%, 적어도 약 180%, 적어도 약 200%, 적어도 약 300%, 적어도 약 500%, 적어도 약 700%, 적어도 약 900%, 또는 적어도 약 1000% 더 비번하게 또는 덜 빈번하게 관찰되는 것이 검출되는 경우, 폴리뉴클레오타이드는 두 세트의 샘플에서 차등 발현된다.
"유사도 값"은 비교되는 두 개 사이의 유사도의 정도를 나타내는 수치이다. 예를 들어, 유사도 값은 특정 표현형 관련 바이오마커를 사용하는 환자의 발현 프로파일과 하나 이상의 대조 샘플에서의 바이오마커에 대한 기준값 범위 또는 기준 발현 프로파일 사이의 전체 유사도를 나타내는 수치일 수 있다(예컨대, "바이러스성 감염" 발현 프로파일 또는 "세균성 감염" 발현 프로파일에 대한 유사도). 유사도 값은 상관 계수와 같은 유사도 메트릭으로 표현되거나, 환자 샘플 및 대조군 샘플 또는 기준 발현 프로파일에서 바이오마커 수준 사이의 발현 수준 차이 또는 발현 수준 차이의 집합으로서 간단히 표현될 수 있다.
"대상", "개인", 및 "환자"라는 용어는 본원에서 상호교환되게 사용되며 진단, 예후, 치료 또는 치료가 필요한 포유 동물 대상, 특히 사람을 지칭한다. 기타 대상으로 소, 개, 고양이, 기니피그, 토끼, 래트, 마우스, 말 등을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 본 발명의 방법은, 예를 들어 이에 제한되지 않지만, 마우스, 래트 및 햄스터를 포함하는 설치류 등의 동물 실험, 수의학적 적용 및 질병에 대한 동물 모델의 개발에 사용된다.
본원에 사용된 "생물학적 샘플"은 이에 제한되지 않지만, 예를 들어 혈액, 연막, 혈장, 혈청, 혈액 세포(예컨대, 말초 혈액 단핵 세포(PBMCS)), 대변, 소변, 골수, 담즙, 척수액, 림프액, 피부 샘플, 피부의 외부 분비물, 호흡기, 장, 및 비뇨생식관, 눈물, 타액, 젖, 기관, 생검, 및 배양 배지 (예컨대, 재조합 세포 및 세포 성분)에서 세포 및 조직의 성장으로 인한 조건부 매질을 포함하지만 이에 제한되지 않는 시험관내 세포 배양 성분의 샘플을 또한 포함하여, 대상으로부터 단리된 조직, 세포, 또는 체액의 샘플을 지칭한다.
바이오마커의 "검사량"은 검사되는 샘플에 존재하는 바이오마커의 양을 지칭한다. 검사량은 절대량(예컨대, μg/ml) 또는 상대량(예컨대, 신호의 상대 강도) 중 어느 하나일 수 있다.
바이오마커의 "진단량"은 감염(예컨대, 바이러스성 감염 또는 세균성 감염)의 진단과 일치하는 대상의 샘플에서의 바이오마커의 양을 지칭한다. 진단량은 절대량(예컨대, μg/ml) 또는 상대량(예컨대, 신호의 상대 강도) 중 어느 하나일 수 있다.
바이오마커의 "대조량"은 바이오마커의 검사량과 비교되는 임의의 양 또는 범위일 수 있다. 예를 들어, 바이오마커의 대조량은 감염(예컨대, 바이러스성 감염 또는 세균성 감염)이 없는 사람의 바이오마커의 양일 수 있다. 제어량은 절대량(예컨대, μg/ml) 또는 상대량(예컨대, 신호의 상대 강도) 중 어느 하나일 수 있다.
용어 "항체"는 다클론 및 단일클론 항체 제제뿐 아니라 잡종항체, 변형 항체, 키메라 항체, 및 인간화 항체뿐 아니라 잡종(키메라)항체(예를 들어, Winter et al. (1991) Nature 349:293-299; 및 미국 특허 번호 제4,816,567호 참조); F(ab')2 및 F(ab) 단편; Fv 분자(비공유 이질이량체, 예를 들어, Inbar et al. (1972) Proc Natl Acad Sci USA 69:2659-2662; 및 Ehrlich et al. (1980) Biochem 19:4091-4096 참조); 단쇄 Fv 분자(sFv)(예컨대, Huston et al. (1988) Proc Natl Acad Sci USA 85:5879-5883 참조); 이량체 및 삼량체 항체 단편 구조; 미니바디(minibody)(예컨대, Pack et al. (1992) Biochem 31:1579-1584; Cumber et al. (1992) J Immunology 149B:120-126 참조); 인간화 항체 분자(예컨대, Riechmann et al. (1988) Nature 332:323-327; Verhoeyan et al. (1988) Science 239:1534-1536; 및 영국 특허 공보 번호 제GB 2,276,169호, 1994년 9월 21일 공개 참조); 및 모항체 분자의 특이적 결합 특성을 보유하는, 이러한 분자로부터 수득된 임의의 작용성 단편을 포함하는 제제를 포괄한다.
본 발명에 사용하기 위해 고려되는 "검출 가능한 모이어티" 또는 "검출 가능한 표지"는 이에 제한되지 않지만, 방사성 동위 원소, 형광 염료 예를 들어 플루오레세인, 피코에리트린(phycoerythrin), Cy-3, Cy-5, 알로피코야닌(allophycoyanin), DAPI, 텍사스 레드, 로다민, 오레곤 그린, 루시퍼 옐로우 등, 녹색 형광 단백질(GFP), 적색 형광 단백질(DsRed), 시안 형광 단백질(CFP), 황색 형광 단백질(YFP), 실꽃말미잘(Cerianthus) 오렌지 형광 단백질(cOFP), 알칼리 인산분해효소(AP), 베타 락타마아제, 클로람페니콜아세틸전달효소(CAT), 아데노신 탈아미노효소(ADA), 아미노글리코사이드 인산기 전달효소(neor, G418r) 다이하이드로엽산 환원효소(DHFR), 하이그로마이신-B-인산기 전달효소(HPH), 티미딘 인산화효소(TK), (β-갈락토시다아제를 암호화하는) lacZ, 및 크산틴 구아닌 포스포리보실트랜스퍼레이스(XGPRT), 베타-글루쿠론산분해효소(gus), 태반 알칼리 인산분해효소(PLAP), 배아 분비 알칼리 인산분해효소(SEAP) 또는 반딧불이 또는 박테리아 발광효소(LUC)를 포함한다. 효소 태그는 동족 기질과 함께 사용된다. 이 용어는 또한 알려진 형광 강도의 컬러 코딩된 마이크로스피어(예컨대, Luminex(Austin, TX)에서 제조한 xMAP 기술이 적용된 마이크로스피어 참조); 예를 들어, 양자점 색의 상이한 비율 및 조합을 함유하는 양자점 나노 결정(예컨대, Life Technologies(Carlsbad, CA)에서 제조한 Qdot 나노 결정)을 함유하는 마이크로스피어; 유리 코팅 금속 나노 입자(예컨대, Nanoplex Technologies, Inc.(Mountain View, CA)에서 제조한 SERS 나노 태그 참조); 바코드 재료(예컨대, Nanoplex Technologies, Inc.에서 제조한 Nanobarcodes와 같은 서브미크론 크기의 줄무늬 금속 막대 참조), 컬러 바코드로 인코딩된 미세입자(예컨대, Vitra Bioscience에서 제조한 CellCard, vitrabio.com 참조), 및 디지털 홀로그램 코드 이미지를 가진 유리 미세입자(예컨대, Illumina(San Diego, CA)에서 제조한 CyVera 마이크로비드 참조)를 포함한다. 본 발명의 실시와 관련된 다수의 표준 절차에서와 같이, 당업자는 사용될 수 있는 부가적인 표지를 인식할 것이다.
"분류자(classifier)를 개발하는 것"은 둘 이상의 상태 사이를 구별할 수 있는 알고리즘 또는 분류자를 생성하기 위해 입력 변수를 사용하는 것을 의미한다.
본원에서 사용된 "진단"은 일반적으로 대상이 주어진 질병, 장애 또는 기능 장애에 의해 영향 받을 가능성이 있는지에 관한 결정을 포함한다. 당업자는 종종 하나 이상의 진단 지표, 즉 질병, 장애 또는 기능 장애의 존재 또는 부재를 나타내는 바이오마커의 존재, 부재 또는 양에 기초하여 진단한다.
본원에서 사용되는 "예후"는 일반적으로 임상 질환 또는 질병의 예상되는 경과 및 결과의 예측을 지칭한다. 환자의 예후는 보통 질병의 유리한 또는 불리한 경과 또는 결과를 나타내는 질병의 인자 또는 증상을 평가함으로써 이루어진다. "예후"라는 용어는 질환의 경과 또는 결과를 반드시 100% 정확도로 예견하는 능력을 의미하는 것은 아님으로 이해된다. 대신, 당업자는 "예후"라는 용어가 특정 경과 또는 결과가 발생할 확률이 증가한다는 것, 즉 경과 또는 결과는 질환을 나타내지 않는 개인과 비교할 때 질환을 보이는 환자에서 발생할 가능성이 더 높은 것을 의미함을 이해할 것이다.
"실질적으로 정제된"은 자연 환경으로부터 제거되어 단리되거나 분리된 핵산 분자 또는 단백질을 지칭하며, 자연적으로 결합된 다른 성분으로부터 적어도 약 60% 유리된, 바람직하게는 적어도 약 75% 유리된, 가장 바람직하게는 적어도 약 90% 유리된 핵산 분자 또는 단백질을 지칭한다.
II. 발명을 수행하는 모드
본 발명을 상세하게 설명하기 전에, 본 발명은 특정 제형 또는 공정 파라미터에 제한되지 않으며, 물론 다양할 수 있음을 이해해야 한다. 또한, 본원에서 사용된 용어는 단지 특정 구현예를 기술하기 위한 것이며, 제한하려는 것이 아님으로 이해해야 한다.
본원에 기술된 것과 유사한 또는 동등한 다수의 방법 및 물질이 본 발명의 실시에 사용될 수 있지만, 바람직한 물질 및 방법이 본원에 기술된다.
본 발명은 감염의 진단에 사용될 수 있는 바이오마커의 발견에 기초한다(실시예 1 참조). 특히, 본 발명은 급성 염증 환자가 항생제 또는 항바이러스제로 치료함으로써 유익을 얻을 수 있는 세균성 또는 바이러스성 감염 여부를 결정하는 데 사용될 수 있는 바이오마커의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 이해를 증진하기 위해, 확인된 바이오마커 및 감염의 진단 및 치료에 이들을 사용하는 방법에 대해 보다 상세한 논의가 하기에 제공된다.
A. 바이오마커
본 발명의 실시에 사용될 수 있는 바이오마커는 대조 대상(예컨대, 바이러스성 감염이 없는 음성 진단, 정상 또는 건강한 대상, 또는 비감염 대상인 사람)과 비교하여 바이러스성 감염인 환자에서 차등 발현되는, 이에 제한되지 않지만 IFI27, JUP, LAX1, OAS2, CUL1, ISG15, CHST12, IFIT1, SIGLEC1, ADA, MX1, RSAD2, IFI44L, GZMB, KCTD14, LY6E, IFI44, HESX1, OASL, OAS1, OAS3, EIF2AK2, DDX60, DNMT1, HERC5, IFIH1, SAMD9, IFI6, IFIT3, IFIT5, XAF1, ISG20, PARP12, IFIT2, DHX58, 및 STAT1과 같은 "바이러스 반응 유전자"; 대조 대상(예컨대, 세균성 감염이 없는 음성 진단, 정상 또는 건강한 대상, 또는 비감염 대상인 사람)과 비교하여 세균성 감염인 환자에서 차등 발현되는, 이에 제한되지 않지만 HK3, TNIP1, GPAA1, CTSB, SLC12A9, ACPP, STAT5B, EMR1, FLII, PTAFR, NRD1, PLP2, DYSF, TWF2, SORT1, TSPO, TBXAS1, ACAA1, S100A12, PGD, LAPTM5, NINJ2, DOK3, SORL1, RAB31, IMPA2, LTA4H, TALDO1, TKT, PYGL, CETP, PROS1, RTN3, CAT, 및 CYBRD1과 같은 "세균 반응 유전자"; 대조 대상(예컨대, 패혈증이 없는 음성 진단, 정상 또는 건강한 대상, 또는 비감염 대상인 사람)과 비교하여 패혈증인 환자에서 차등 발현되는, 이에 제한되지 않지만 CEACAM1, ZDHHC19, C9orf95, GNA15, BATF, C3AR1, KIAA1370, TGFBI, MTCH1, RPGRIP1, 및 HLA-DPB1과 같은 "패혈증 반응 유전자"를 포함하는, 유전자 또는 유전자의 RNA 전사물로부터의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다.
하나의 양태에서, 본 발명은 환자의 감염을 진단하는 방법을 포함한다. 방법은 a) 환자로부터 생물학적 샘플을 얻는 단계; b) 생물학적 샘플에서 바이러스성 감염과 연관된 차등 발현을 보이는 바이러스 반응 유전자 세트 및 세균성 감염과 연관된 차등 발현을 보이는 세균 반응 유전자 세트의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 c) 각각의 기준값 범위와 함께 바이러스 반응 유전자 및 세균 반응 유전자의 발현 수준을 분석하는 단계를 포함한다.
생물학적 샘플에서 바이오마커의 수준을 분석할 때, 기준값 범위는 감염이 없는 하나 이상의 대상(예컨대, 건강한 대상 또는 비감염 대상)의 하나 이상의 샘플에서 발견되는 하나 이상의 바이오마커의 수준을 나타낼 수 있다. 대안으로, 기준값은 바이러스성 감염 또는 세균성 감염을 갖는 하나 이상의 대상의 하나 이상의 샘플에서 발견되는 하나 이상의 바이오마커의 수준을 나타낼 수 있다. 특정 구현예에서, 바이오마커의 수준은 비감염 또는 감염 대상에 대한 시간-일치 기준값 범위와 비교된다.
특정 구현예에서, 바이러스 반응 유전자 세트 및 세균 반응 유전자 세트는 a) IFI27, JUP 및 LAX1을 포함하는 바이러스 반응 유전자 세트 및 HK3, TNIP1, GPAA1 및 CTSB를 포함하는 세균 반응 유전자 세트; b) OAS2 및 CUL1을 포함하는 바이러스 반응 유전자 세트 및 SLC12A9, ACPP, STAT5B를 포함하는 세균 반응 유전자 세트; c) ISG15 및 CHST12를 포함하는 바이러스 반응 유전자 세트 및 EMR1, FLII를 포함하는 세균 반응 유전자 세트; d) IFIT1, SIGLEC1, 및 ADA를 포함하는 바이러스 유전자 반응 세트 및 PTAFR, NRD1, PLP2를 포함하는 세균 반응 유전자 세트; e) MX1을 포함하는 바이러스 반응 유전자 세트 및 DYSF, TWF2를 포함하는 세균 반응 유전자 세트; f) RSAD2를 포함하는 바이러스 유전자 반응 세트 및 SORT1 및 TSPO를 포함하는 세균 반응 유전자 세트; g) IFI44L, GZMB, 및 KCTD14를 포함하는 바이러스 유전자 반응 세트 및 TBXAS1, ACAA1 및 S100A12를 포함하는 세균 반응 유전자 세트; h) LY6E를 포함하는 바이러스 유전자 반응 세트 및 PGD 및 LAPTM5를 포함하는 세균 반응 유전자 세트; i) IFI44, HESX1, 및 OASL을 포함하는 바이러스 유전자 반응 세트 및 NINJ2, DOK3, SORL1 및 RAB31을 포함하는 세균 반응 유전자 세트; 및 j) OAS1을 포함하는 바이러스 유전자 반응 세트 및 IMPA2 및 LTA4H를 포함하는 세균 반응 유전자 세트로 이루어진 군으로부터 선택된다.
진단 받을 환자로부터 얻은 생물학적 샘플은 일반적으로 전혈 또는 혈액 세포(예컨대, PBMC)이지만, 발현 바이오마커를 함유하는 체액, 조직 또는 세포로부터 얻은 임의의 샘플일 수 있다.본원에서 사용된 "대조" 샘플은 질병이 없는 체액, 조직 또는 세포와 같은 생물학적 샘플을 의미한다. 즉, 정상 또는 비감염 대상(예컨대, 바이러스성 감염, 세균성 감염, 패혈증 또는 염증이 없는 것으로 알려진 개체)으로부터 대조 샘플을 얻는다.　생물학적 샘플은 통상적인 기술에 의해 환자로부터 얻을 수 있다. 예를 들어, 혈액은 정맥 체혈에 의해 얻을 수 있고, 고형 조직 샘플은 당업계에 공지된 방법에 따라 수술 기법에 의해 얻을 수 있다.
특정 구현예에서, 바이오마커 패널은 감염 진단용으로 사용된다. 임의의 크기의 바이오마커 패널이 본 발명의 실시에 사용될 수 있다. 감염 진단용 바이오마커 패널은 전형적으로 예를 들어, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개, 또는 30개의 바이오마커 사이에서 임의의 숫자의 바이오마커를 포함하여, 적어도 3개에서 최대 30개까지의 바이오마커를 포함한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 적어도 3개, 또는 적어도 4개, 또는 적어도 5개, 또는 적어도 6개, 또는 적어도 7개, 또는 적어도 8개, 또는 적어도 9개, 또는 적어도 10개, 또는 적어도 11개 이상의 바이오마커를 포함하는 바이오마커 패널을 포함한다. 작은 바이오마커의 패널은 일반적으로 보다 경제적이지만, 더 큰 바이오마커 패널(즉, 30개 이상의 바이오마커)은 보다 상세한 정보를 제공하는 장점을 가지고 있으며, 또한 본 발명의 실시에 사용될 수 있다.
특정 구현예에서, 본 발명은 IFI27, JUP, LAX1, HK3, TNIP1, GPAA1, 및 CTSB로 이루어진 군으로부터 선택되는 유전자 또는 유전자의 RNA 전사물로부터의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 감염 진단용 바이오마커 패널을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 바이오마커 패널은 CEACAM1, ZDHHC19, C9orf95, GNA15, BATF, C3AR1, KIAA1370, TGFBI, MTCH1, RPGRIP1, 및 HLA-DPB1로 이루어진 군으로부터 선택되는유전자 또는 유전자의 RNA 전사물로부터의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 더 포함한다.
특정 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같이, 바이러스성 감염 및 세균성 감염을 구별하기 위한 바이오마커는 대상에서의 염증이 감염성 염증원으로 인해 야기되는지 또는 비감염성 염증원(예컨대, 외상성 손상, 수술, 자가 면역 질환, 혈전증 또는 전신성 염증 반응 증후군(SIRS))으로 인해 야기되는지를 구별할 수 있는 추가 바이오마커와 조합된다. 첫 번째 진단 검사는 급성 염증이 감염성 또는 비감염성 원인에 의해 유발되는지 여부를 결정하는 데 사용되며, 염증원이 감염인 경우 두 번째 진단 검사를 사용하여 감염이 바이러스성 감염인지 또는 세균성 감염인지 결정하여 각각 항바이러스제나 항생제 중 하나로 치료하여 유익을 얻을 것이다.
하나의 구현예에서, 본 발명은 염증이 있는 환자의 진단 및 치료 방법을 포함하며, 방법은 a) 환자로부터 생물학적 샘플을 얻는 단계; b) 생물학적 샘플에서IFI27, JUP, LAX1, HK3, TNIP1, GPAA1, CTSB, CEACAM1, ZDHHC19, C9orf95, GNA15, BATF, C3AR1, KIAA1370, TGFBI, MTCH1, RPGRIP1, 및 HLA-DPB1 바이오마커의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 c) 바이오마커에 대한 각각의 기준값 범위와 함께 각각의 바이오마커의 발현 수준을 1차 분석하는 단계(비감염 대조 대상의 바이오마커에 대한 각각의 기준값 범위와 비교하여 CEACAM1, ZDHHC19, C9orf95, GNA15, BATF, C3AR1 바이오마커의 증가된 발현 수준 및 KIAA1370, TGFBI, MTCH1, RPGRIP1 및 HLA-DPB1 바이오마커의 감소된 발현 수준은 환자가 감염된 것을 나타내고, 비감염 대조 대상과 비교하여 CEACAM1, ZDHHC19, C9orf95, GNA15, BATF, C3AR1, KIAA1370, TGFBI, MTCH1, RPGRIP1, 및 HLA-DPB1 바이오마커의 차등 발현의 부재는 환자가 감염되지 않은 것을 나타냄); d) 환자가 감염된 것으로 진단된 경우, IFI27, JUP, LAX1, HK3, TNIP1, GPAA1 및 CTSB 바이오마커의 발현 수준을 2차 분석하는 단계(대조 대상의 바이오마커에 대한 각각의 기준값 범위와 비교하여 IFI27, JUP, LAX1 바이오마커의 증가된 발현 수준은 환자가 바이러스성 감염인 것을 나타내고, 대조 대상의 바이오마커에 대한 각각의 기준값 범위와 비교하여 HK3, TNIP1, GPAA1, CTSB 바이오마커의 증가된 발현 수준은 환자가 세균성 감염인 것을 나타냄); 및 e) 환자가 바이러스성 감염으로 진단된 경우, 환자에게 항바이러스제의 유효량을 투여하거나 환자가 세균성 감염으로 진단된 경우, 환자에게 항생제의 유효량을 투여하는 단계를 포함한다.
또 다른 구현예에서, 방법은 환자에 대한 패혈증 메타스코어를 계산하는 단계를 더 포함하되, 비감염 대조 대상에 대한 기준값 범위보다 높은 패혈증 메타스코어는 환자가 감염된 것을 나타내고, 비감염 대조 대상에 대한 기준값 범위 내에 패혈증 메타스코어는 환자가 비감염성 염증 질환임을 나타낸다.
또 다른 구현예에서, 방법은 환자가 감염으로 진단된 경우, 환자에 대한 세균/바이러스 메타스코어를 계산하는 단계를 더 포함하되, 환자에 대한 양성 세균/바이러스 메타스코어는 환자가 바이러스성 감염인 것을 나타내고, 환자에 대한 음성 세균/바이러스 메타스코어는 환자가 세균성 감염인 것을 나타낸다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 감염이 의심되는 환자를 치료하는 방법을 포함하되 방법은 a) 본원에 기재된 방법에 따라 환자의 진단에 관한 정보를 수신하는 단계; 및 b) 환자가 바이러스성 감염으로 진단된 경우 항바이러스제의 치료 유효량을 투여하거나 환자가 세균성 감염으로 진단된 경우 항생제의 유효량을 투여하는 단계를 포함한다.
특정 구현예에서, 본원에 기재된 방법에 의해 바이러스성 감염으로 진단된 환자는 광범위 스펙트럼 항바이러스제, 항바이러스 백신, 뉴라민 가수분해 효소 억제제(예컨대, 자나미비르(Relenza) 및 오셀타미비르(Tamiflu)), 뉴클레오사이드 유사체(예컨대, 아시클로비르, 지도부딘(AZT), 및 라미부딘), 안티센스 항바이러스제(예컨대, 포스포로티오에이트 안티센스 항바이러스제(예컨대, 사이토메갈로바이러스 망막염 치료제 포미비르센(Vitravene)), 모르폴리노 안티센스 항바이러스제), 바이러스 탈피(uncoating) 억제제(예컨대, 인플루엔자용 아만타딘 및 리만타딘, 라이노바이러스용 플레코나릴), 바이러스 유입 억제제(예컨대, HIV용 푸제온(Fuzeon)), 바이러스 조립 억제제(예컨대, 리팜피신) 또는 면역계를 자극하는 항바이러스제(예컨대, 인터페론)와 같은 치료 유효량의 항바이러스제가 투여된다. 예시적인 항바이러스제는 Abacavir, Aciclovir, Acyclovir, Adefovir, Amantadine, Amprenavir, Ampligen, Arbidol, Atazanavir, Atripla(fixed dose drug), Balavir, Cidofovir, Combivir(fixed dose drug), Dolutegravir, Darunavir, Delavirdine, Didanosine, Docosanol, Edoxudine, Efavirenz, Emtricitabine, Enfuvirtide, Entecavir, Ecoliever, Famciclovir, Fixed dose combination(antiretroviral), Fomivirsen, Fosamprenavir, Foscarnet, Fosfonet, Fusion inhibitor, Ganciclovir, Ibacitabine, Imunovir, Idoxuridine, Imiquimod, Indinavir, Inosine, Integrase inhibitor, Interferon type III, Interferon type II, Interferon type I, Interferon, Lamivudine, Lopinavir, Loviride, Maraviroc, Moroxydine, Methisazone, Nelfinavir, Nevirapine, Nexavir, Nitazoxanide, Nucleoside analogues, Novir, Oseltamivir(Tamiflu), Peginterferon alfa-2a, Penciclovir, Peramivir, Pleconaril, Podophyllotoxin, Protease inhibitor, Raltegravir, Reverse transcriptase inhibitor, Ribavirin, Rimantadine, Ritonavir, Pyramidine, Saquinavir, Sofosbuvir, Stavudine, Synergistic enhancer(antiretroviral), Telaprevir, Tenofovir, Tenofovir disoproxil, Tipranavir, Trifluridine, Trizivir, Tromantadine, Truvada, Valaciclovir(Valtrex), Valganciclovir, Vicriviroc, Vidarabine, Viramidine, Zalcitabine, Zanamivir(Relenza), 및 Zidovudine을 포함한다.
특정 구현예에서, 본원에 기술된 방법에 의해 세균성 감염으로 진단된 환자는 치료 유효량의 항생제가 투여된다. 항생제는 광범위 스펙트럼, 살균 또는 제균 항생제가 포함할 수 있다. 예시적 항생제는 Amikacin, Amikin, Gentamicin, Garamycin, Kanamycin, Kantrex, Neomycin, Neo-Fradin, Netilmicin, Netromycin, Tobramycin, Nebcin, Paromomycin, Humatin, Streptomycin, Spectinomycin(Bs), 및 Trobicin과 같은 아미노글리코사이드; Geldanamycin, Herbimycin, Rifaximin, 및 Xifaxan과 같은 안사마이신; Loracarbef 및 Lorabid와 같은 카르바세펨(carbacephem); Ertapenem, Invanz, Doripenem, Doribax, Imipenem/Cilastatin, Primaxin, Meropenem, 및 Merrem과 같은 카르바페넴(carbapenem); Cefadroxil, Duricef, Cefazolin, Ancef, Cefalotin or Cefalothin, Keflin, Cefalexin, Keflex, Cefaclor, Distaclor, Cefamandole, Mandol, Cefoxitin, Mefoxin, Cefprozil, Cefzil, Cefuroxime, Ceftin, Zinnat, Cefixime, Cefdinir, Cefditoren, Cefoperazone, Cefotaxime, Cefpodoxime, Ceftazidime, Ceftibuten, Ceftizoxime, Ceftriaxone, Cefepime, Maxipime, Ceftaroline fosamil, Teflaro, Ceftobiprole, 및 Zeftera와 같은 세팔로스포린(cephalosporin); Teicoplanin, Targocid, Vancomycin, Vancocin, Telavancin, Vibativ, Dalbavancin, Dalvance, Oritavancin, 및 Orbactiv와 같은 당펩타이드; Clindamycin, Cleocin, Lincomycin, 및 Lincocin과 같은 린코사마이드(lincosamide); Daptomycin 및 Cubicin과 같은 지질펩타이드; Azithromycin, Zithromax, Sumamed, Xithrone, Clarithromycin, Biaxin, Dirithromycin, Dynabac, Erythromycin, Erythocin, Erythroped, Roxithromycin, Troleandomycin, Tao, Telithromycin, Ketek, Spiramycin, 및 Rovamycine과 같은 마크로라이드(macrolide); Aztreonam 및 Azactam과 같은 모노박탐(monobactam); Furazolidone, Furoxone, Nitrofurantoin, Macrodantin, 및 Macrobid와 같은 나이트로퓨란; Linezolid, Zyvox, VRSA, Posizolid, Radezolid, 및 Torezolid와 같은 옥사졸리디논(oxazolidinone); Penicillin V, Veetids (Pen-Vee-K), Piperacillin, Pipracil, Penicillin G, Pfizerpen, Temocillin, Negaban, Ticarcillin, 및 Ticar와 같은 페니실린; Amoxicillin/clavulanate, Augmentin, Ampicillin/sulbactam, Unasyn, Piperacillin/tazobactam, Zosyn, Ticarcillin/clavulanate, 및 Timentin과 같은 페니실린 조합물; Bacitracin, Colistin, Coly-Mycin-S, 및 Polymyxin B와 같은 폴리펩타이드; Ciprofloxacin, Cipro, Ciproxin, Ciprobay, Enoxacin, Penetrex, Gatifloxacin, Tequin, Gemifloxacin, Factive, Levofloxacin, Levaquin, Lomefloxacin, Maxaquin, Moxifloxacin, Avelox, Nalidixic acid, NegGram, Norfloxacin, Noroxin, Ofloxacin, Floxin, Ocuflox Trovafloxacin, Trovan, Grepafloxacin, Raxar, Sparfloxacin, Zagam, Temafloxacin, 및 Omniflox와 같은 퀴놀론/플루오로퀴놀론(quinolone/fluoroquinolone); Amoxicillin, Novamox, Amoxil, Ampicillin, Principen, Azlocillin, Carbenicillin, Geocillin, Cloxacillin, Tegopen, Dicloxacillin, Dynapen, Flucloxacillin, Floxapen, Mezlocillin, Mezlin, Methicillin, Staphcillin, Nafcillin, Unipen, Oxacillin, Prostaphlin, Penicillin G, Pentids, Mafenide, Sulfamylon, Sulfacetamide, Sulamyd, Bleph-10, Sulfadiazine, Micro-Sulfon, Silver sulfadiazine, Silvadene, Sulfadimethoxine Di-Methox, Albon, Sulfamethizole, Thiosulfil Forte, Sulfamethoxazole, Gantanol, Sulfanilimide, Sulfasalazine, Azulfidine, Sulfisoxazole, Gantrisin, Trimethoprim-Sulfamethoxazole (Co-trimoxazole) (TMP-SMX), Bactrim, Septra, Sulfonamidochrysoidine, 및 Prontosil과 같은 설폰아마이드; Demeclocycline, Declomycin, Doxycycline, Vibramycin, Minocycline, Minocin, Oxytetracycline, Terramycin, Tetracycline 및 Sumycin, Achromycin V, 및 Steclin과 같은 테트라사이클린; Clofazimine, Lamprene, Dapsone, Avlosulfon, Capreomycin, Capastat, Cycloserine, Seromycin, Ethambutol, Myambutol, Ethionamide, Trecator, Isoniazid, I.N.H., Pyrazinamide, Aldinamide, Rifampicin, Rifadin, Rimactane, Rifabutin, Mycobutin, Rifapentine, Priftin, 및 Streptomycin과 같은 마이코박테리아 대항 약물; Arsphenamine, Salvarsan, Chloramphenicol, Chloromycetin, Fosfomycin, Monurol, Monuril, Fusidic acid, Fucidin, Metronidazole, Flagyl, Mupirocin, Bactroban, Platensimycin, Quinupristin/Dalfopristin, Synercid, Thiamphenicol, Tigecycline, Tigacyl, Tinidazole, Tindamax Fasigyn, Trimethoprim, Proloprim, 및 Trimpex와 같은 기타 항생제를 포함한다.
B. 바이오마커 검출 및 측정
샘플 중의 바이오마커는 당업계에 공지된 임의의 적합한 방법으로 측정 될 수 있는 것으로 이해된다. 바이오마커의 발현 수준의 측정은 직접적 또는 간접적일 수 있다. 예를 들어, RNA 또는 단백질의 함유 수준은 직접 정량화될 수 있다. 대안으로, 바이오마커의 양은 cDNA, 증폭된 RNA 또는 DNA의 함유 수준을 측정하거나, 또는 RNA, 단백질, 또는 다른 분자(예컨대, 대사물질)의 양 또는 활성을 측정함으로써 간접적으로 결정될 수 있다. 샘플에서 바이오마커를 측정하는 방법은 많은 응용이 있다. 예를 들어, 감염의 진단을 돕거나, 대상에 대한 적절한 치료를 결정하거나, 치료할 대상에서의 반응을 모니터하거나, 생체내 또는 시험관내에서 바이오마커의 발현을 조절하는 치료 화합물을 동정하기 위해 하나 이상의 바이오마커를 측정할 수 있다.
바이오마커 폴리뉴클레오타이드 검출
하나의 구현예에서, 바이오마커의 발현 수준은 바이오마커의 폴리뉴클레오타이드 수준을 측정함으로써 결정된다. 특정 바이오마커 유전자의 전사물의 수준은 생물학적 샘플에 존재하는 mRNA 또는 이로부터 유래된 폴리뉴클레오타이드의 양으로부터 결정할 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 이에 제한되지 않지만, 마이크로어레이 분석, 중합 효소 연쇄 반응(PCR), 역전사 중합 효소 연쇄 반응(RT-PCR), 노던 블롯, 유전자 발현 연속 분석법(SAGE), RNA 스위치, 및 고체 상태 나노 기공 검출법을 포함한 다양한 방법으로 검출하고 정량할 수 있다. 예컨대, Draghici Data Analysis Tools for DNA Microarrays, Chapman and Hall/CRC, 2003; Simon et al. Design and Analysis of DNA Microarray Investigations, Springer, 2004; Real-Time PCR: Current Technology and Applications, Logan, Edwards, and Saunders eds., Caister Academic Press, 2009; Bustin A-Z of Quantitative PCR (IUL Biotechnology, No. 5), International University Line, 2004; Velculescu et al. (1995) Science 270: 484-487; Matsumura et al. (2005) Cell. Microbiol. 7: 11-18; Serial Analysis of Gene Expression (SAGE): Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology), Humana Press, 2008을 참조하고, 그 전체 내용이 참조로서 본원에 포함된다.
하나의 구현예에서, 바이오마커의 수준을 측정하기 위해 마이크로어레이가 사용된다. 마이크로어레이 분석의 이점은 각각의 바이오마커의 발현이 동시에 측정될 수 있고, 마이크로어레이가 특정 질병 또는 질환(예컨대, 패혈증)에 대한 진단 발현 프로파일을 제공하도록 특별히 설계될 수 있다는 점이다.
마이크로어레이는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 프로브를 선택한 후, 이러한 프로브를 고형 지지체 또는 표면에 고정시킴으로써 제조된다. 예를 들어, 프로브는 DNA 서열, RNA 서열, 또는 DNA 및 RNA의 공중합체 서열을 포함할 수 있다. 프로브의 폴리뉴클레오타이드 서열은 또한 DNA 및/또는 RNA 유사체, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 예를 들어, 프로브의 폴리뉴클레오타이드 서열은 게놈 DNA의 전체 또는 부분 단편일 수 있다. 프로브의 폴리뉴클레오타이드 서열은 또한 합성 올리고뉴클레오타이드 서열과 같은 합성 뉴클레오타이드 서열일 수 있다. 프로브 서열은 생체내에서 효소적으로, 시험관내에서 효소적으로(예컨대, PCR에 의해) 또는 시험관내에서 비효소적으로 합성될 수 있다.
본 발명의 방법에 사용되는 프로브는 다공성 또는 비다공성일 수 있는 고형 지지체에 고정되는 것이 바람직하다. 예를 들어, 프로브는 폴리뉴클레오타이드의 3' 말단 또는 5' 말단 중 하나에서 나이트로셀룰로스 또는 나일론 막 또는 필터에 공유 결합된 폴리뉴클레오타이드 서열일 수 있다. 이러한 혼성화 프로브는 당업계에 공지되어 있다(예컨대, Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd Edition, 2001) 참조). 대안으로, 고형 지지체 또는 표면은 유리, 실리콘, 또는 플라스틱 표면일 수 있다. 하나의 구현예에서, 혼성화 수준은 DNA 또는 DNA 모방체(mimics)의 집단, 또는 대안으로 RNA 또는 RNA 모방체의 집단과 같은 폴리뉴클레오타이드의 집단이 고정된 표면상의 고상으로 이루어진 프로브의 마이크로어레이로 측정된다. 고상은 비다공성 또는 선택적으로, 겔과 같은 비다공성 재료, 또는 TipChip(Axela, Ontario, Canada)과 같은 다공성 웨이퍼일 수 있다.
하나의 구현예에서, 마이크로어레이는 본원에 기재된 바이오마커 중 하나를 나타내는 결합(예컨대, 혼성화) 부위 또는 "프로브"의 정렬된 어레이를 갖는 지지체 또는 표면을 포함한다. 바람직하게는, 마이크로어레이는 어드레싱 가능한 어레이이고, 보다 바람직하게는 위치상 어드레싱 가능한 어레이이다. 보다 구체적으로, 어레이의 각각의 프로브는 바람직하게는 고형 지지체상의 공지된 미리 결정된 위치에 위치하게 되어, 각 프로브의 정체성(즉, 서열)이 어레이 내의(즉, 지지체 또는 표면 상의) 그것의 위치로부터 결정될 수 있다. 각각의 프로브는 단일 부위에서 고형 지지체에 공유 결합되는 것이 바람직하다.
마이크로어레이는 여러 가지 방법으로 만들 수 있으며 그 중 몇 가지를 하기에 기술한다. 마이크로어레이가 어떻게 제조되어도, 특정한 특성을 공유한다. 어레이는 복사할 수 있으므로 주어진 어레이의 다수의 복사본을 생성하고 서로 쉽게 비교될 수 있다. 바람직하게는, 마이크로어레이는 결합(예컨대, 핵산 혼성화) 조건 하에서 안정한 물질로 제조된다. 마이크로어레이는 일반적으로 작지만, 예컨대, 0.1 cm2 내지 25 cm2이고, 더 큰 어레이는 예를 들어, 스크리닝 어레이에서 또한 사용될 수 있다. 바람직하게는, 주어진 결합 부위 또는 마이크로어레이 내의 독특한 결합 부위 세트는 세포 내의 단일 유전자의 생성물(예컨대, 특정 mRNA, 또는 그로부터 유도된 특정 cDNA)에 특이적으로 결합한다(예컨대, 혼성화한다). 그러나, 일반적으로 다른 관련 서열 또는 유사한 서열은 주어진 결합 부위와 교차 혼성화할 것이다.
상기한 바와 같이, 특정 폴리뉴클레오타이드 분자가 특이적으로 혼성화되는 "프로브"는 상보적 폴리뉴클레오타이드 서열을 함유한다. 마이크로어레이의 프로브는 전형적으로 1,000개 이하의 뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진다. 일부 구현예에서, 어레이의 프로브는 10개 내지 1,000개의 뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진다. 하나의 구현예에서, 프로브의 뉴클레오타이드 서열은 길이가 10개 내지 200개의 뉴클레오타이드 범위이고, 하나의 생물 종의 게놈 서열이어서, 복수의 상이한 프로브가 상보적인 서열로 존재하므로 그러한 생물 종의 게놈에 혼성화되며, 게놈의 전부 또는 일부에 걸쳐 순차적으로 타일링(tile)된다. 다른 구현예에서, 프로브는 길이가 10개 내지 30개의 뉴클레오타이드 범위, 길이가 10개 내지 40개의 뉴클레오타이드 범위, 길이가 20개 내지 50개의 뉴클레오타이드 범위, 길이가 40개 내지 80개의 뉴클레오타이드 범위, 길이가 50개 내지 150개의 뉴클레오타이드 범위, 길이가 80개 내지 120개의 뉴클레오타이드 범위이거나 길이가 60개의 뉴클레오타이드이다.
프로브는 생물체 게놈의 일부에 해당하는 DNA 또는 DNA "모방체"(예컨대, 유도체 및 유사체)를 포함할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 마이크로어레이의 프로브는 상보적 RNA 또는 RNA 모방체이다. DNA 모방체는 DNA와의 특이적, 왓슨-크릭(Watson-Crick)형 혼성화 또는 RNA와의 특이 적 혼성화가 가능한 서브유닛으로 구성된 중합체이다. 핵산은 염기 모이어티, 당 모이어티 또는 인산염 골격(예컨대, 포스포로티오에이트)에서 변형될 수 있다.
DNA는 예를 들어, 게놈 DNA 또는 복제 서열의 중합 효소 연쇄 반응(PCR) 증폭에 의해 수득될 수 있다. PCR 프라이머는 바람직하게는 게놈 DNA의 특이적 단편을 증폭시킬 게놈의 공지된 서열에 기초하여 선택된다. Oligo 버전 5.0(National Biosciences)과 같이 당업계에 공지된 컴퓨터 프로그램이 요구되는 특이도 및 최적 증폭 특성을 갖는 프라이머의 설계에 유용하다. 전형적으로, 마이크로어레이상의 각각의 프로브는 10 염기 내지 50,000 염기, 통상적으로 20 염기 내지 200 염기 길이일 것이다. PCR 방법은 당해 기술 분야에 잘 알려져 있고, 예를 들어, Innis et al., eds., PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications, Academic Press Inc., San Diego, Calif. (1990)에 기술되어 있으며, 그 전체 내용이 본원에 참조로서 포함된다. 제어 로봇 시스템은 핵산을 단리하고 증폭하는 데 유용하다는 것이 당업자에게 명백할 것이다.
폴리뉴클레오타이드 프로브를 생성하기 위한 대안적인 바람직한 수단은 예를 들어 N-포스포네이트 또는 포스포아미다이트 화학법을 사용하는 합성 폴리뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드의 합성에 의한 것이다(Froehler et al., Nucleic Acid Res. 14:5399-5407 (1986); McBride et al., Tetrahedron Lett. 24:246-248 (1983)). 합성 서열은 전형적으로 약 10 내지 약 500 염기 길이, 더욱 전형적으로는 약 20 내지 약 100 염기, 가장 바람직하게는 약 40 내지 약 70 염기 길이이다. 일부 구현예에서, 합성 핵산은 비-천연 염기, 이를테면 이에 제한되지 않지만, 이노신(inosine)을 포함한다. 전술한 바와 같이, 핵산 유사체는 혼성화를 위한 결합 부위로서 사용될 수 있다. 적합한 핵산 유사체의 예는 펩타이드 핵산이다(예컨대, Egholm et al., Nature 363:566-568 (1993); 미국 특허 번호 제5,539,083호 참조).
프로브는 바람직하게는 결합 에너지, 염기 조성, 서열 복잡성, 교차-혼성화 결합 에너지 및 2차 구조를 고려한 알고리즘을 사용하여 선택된다. Friend et al., 국제 특허 공개 제WO 01/05935호, 2001년 1월 25일 공개; Hughes et al., Nat. Biotech. 19:342-7 (2001) 참조.
당업자는 또한 양성 대조 프로브, 예컨대 표적 폴리뉴클레오타이드 분자의 서열에 상보적이고 혼성화 가능한 것으로 알려진 프로브 및 음성 대조 프로브, 예컨대 표적 폴리뉴클레오타이드 분자의 서열에 상보적이지 않고 혼성화되지 않는 것으로 알려진 프로브를 인식할 것이고 이는 어레이에 포함되어야 한다. 하나의 구현예에서, 양성 대조는 어레이의 둘레를 따라 합성된다. 다른 구현예에서, 양성 대조는 어레이를 가로 질러 대각선 줄무늬로 합성된다. 또 다른 구현예에서, 각각의 프로브에 대한 역 상보체는 음성 대조로서 작용하는 프로브의 위치 옆에서 합성된다. 또 다른 구현예에서, 생물의 다른 종으로부터의 서열은 음성 대조 또는 "스파이크-인(spike-in)" 대조로 사용된다.
프로브는 유리, 플라스틱(예컨대, 폴리프로필렌, 나일론), 폴리아크릴아마이드, 나이트로셀룰로스, 겔, 실리콘, 또는 기타 다공성 또는 비다공성 재료로 만들어진 고형 지지체 또는 표면에 부착된다. 핵산을 표면에 부착시키기 위한 한 방법은 일반적으로 문헌[Schena et al, Science 270:467-470 (1995)]에 기술된 바와 같이 유리판상에 인쇄하는 것이다. 이 방법은 cDNA의 마이크로어레이를 제조하는 데 특히 유용하다(또한 문헌[DeRisi et al, Nature Genetics 14:457-460 (1996); Shalon et al., Genome Res. 6:639-645 (1996); 및 Schena et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93:10539-11286 (1995)]을 참조하고, 그 전체가 참조로서 본원에 포함된다).
마이크로어레이를 제조하는 두 번째 방법은 고밀도 올리고뉴클레오타이드 어레이를 생성한다. 제자리(in situ) 합성을 위한 포토리소그래피 기술(Fodor et al., 1991, Science 251:767-773; Pease et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91:5022-5026; Lockhart et al., 1996, Nature Biotechnology 14:1675; 미국 특허 번호 제5,578,832호; 제5,556,752호; 및 제5,510,270호를 참조하고, 이 전체가 참조로서 본원에 포함됨) 또는 정의된 올리고뉴클레오타이드의 신속한 합성 및 부착을위한 다른 방법(Blanchard et al., Biosensors & Bioelectronics 11:687-690; 그 전체가 참조로서 본원에 포함됨)을 사용하여 표면 상의 한정된 위치에서 한정된 서열에 상보적인 수천 개의 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 어레이를 생성하는 기술이 공지되어 있다. 이들 방법을 사용할 때, 공지된 서열의 올리고뉴클레오타이드(예컨대, 60-mer)를 유도된 유리 슬라이드와 같은 표면상에 직접 합성한다. 일반적으로 RNA 당 몇 개의 올리고뉴클레오타이드 분자를 사용하여 생산된 어레이는 과다하다.
예를 들어 마스킹(masking)에 의한 마이크로어레이 제작을 위한 다른 방법(Maskos and Southern, 1992, Nuc. Acids. Res. 20:1679-1684; 그 전체가 참조로서 본원에 포함됨)을 사용할 수도 있다. 원론적으로, 어레이의 임의의 유형, 예를 들어, 나일론 혼성화 막상에 점 블롯(문헌[Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Edition, 2001]을 참조)이 사용될 수 있다. 그러나, 당업자에게 인식되는 바와 같이, 혼성화 부피가 더 작기 때문에 매우 작은 어레이가 자주 선호될 것이다.
마이크로어레이는, 예컨대 미국 특허 번호 제6,028,189호; Blanchard et al., 1996, Biosensors and Bioelectronics 11:687-690; Blanchard, 1998, in Synthetic DNA Arrays in Genetic Engineering, Vol. 20, J. K. Setlow, Ed., Plenum Press, New York at pages 111-123(그 전체가 본원에 참조로서 포함됨)에서 Blanchard에 의해 기술된 방법 및 시스템을 사용하는 올리고뉴클레오타이드 합성을 위한 잉크 젯 인쇄 장치에 의해 제조될 수도 있다. 구체적으로, 이러한 마이크로어레이에서의 올리고뉴클레오타이드 프로브는 프로필렌 카보네이트와 같은 높은 표면 장력 용매의 "미세 방울"에 개별 뉴클레오타이드 염기를 연속적으로 증착시킴으로써, 예컨대 유리 슬라이드상에서 어레이로 합성된다. 미세 방울은 작은 부피(예컨대, 100 pL 이하, 보다 바람직하게는 50 pL 이하)를 가지고 어레이 요소(즉, 상이한 프로브)의 위치를 정의하는 원형 표면 장력 웰(well)을 형성하기 위해 마이크로어레이상에서 (예컨대, 소수성 도메인에 의해) 서로 분리된다. 이 잉크젯 방법에 의해 제조된 마이크로어레이는 전형적으로 고밀도이고, 바람직하게는 1cm2 당 약 2,500개의 상이한 프로브의 밀도를 갖는다. 폴리뉴클레오타이드 프로브는 폴리뉴클레오타이드의 3' 말단 또는 5' 말단에서 공유 결합으로 지지체에 부착된다.
마이크로어레이 분석에 의해 측정될 수 있는 바이오마커 폴리뉴클레오타이드는 자연 발생 핵산 분자뿐만 아니라 합성 핵산 분자를 포함하는 발현된 RNA 또는 이로부터 유래된 핵산(예컨대, cDNA 또는 RNA 중합 효소 프로모터를 포함하는 cDNA로부터 유래된 증폭 RNA)일 수 있다. 하나의 구현예에서, 표적 폴리뉴클레오타이드 분자는 이에 제한되지 않지만, 총 세포 RNA, 폴리(A)+ 메신저 RNA(mRNA), 또는 그의 분획물, 세포질 mRNA, 또는 cDNA로부터 전사된 RNA(즉, cRNA; 예컨대, Linsley & Schelter, 1999년 10월 4일자로 출원된 미국 특허 출원 일련 번호 제09/411,074호, 또는 미국 특허 번호 제5,545,522호, 제5,891,636호, 또는 제5,716,785호 참조)를 포함하여 RNA를 포함한다. 총 폴리(A)+ RNA를 제조하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 일반적으로 예컨대 Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual(3rd Edition, 2001)에 기술된다. RNA는 구아니딘 티오시아네이트 용해 후 CsCl 원심 분리(Chirgwin et al., 1979, Biochemistry 18:5294-5299), 실리카 겔-기반 컬럼(예컨대, RNeasy(Qiagen, Valencia, Calif.), 또는 StrataPrep(Stratagene, La Jolla, CA))을 사용하거나, 또는 (Ausubel et al., eds., 1989, Current Protocols In Molecular Biology, Vol. III, Green Publishing Associates, Inc., John Wiley & Sons, Inc., New York, at pp. 13.12.1-13.12.5에 기술된 바와 같이) 페놀 및 클로로폼을 사용하여 목적 세포로부터 추출될 수 있다. 폴리(A)+ RNA는 예컨대 올리고-dT 셀룰로스를 사용한 선택에 의해, 또는 대안으로 총 세포 RNA의 올리고-dT 프라이밍 역전사에 의해 선택될 수 있다. RNA는 RNA 단편을 생성하기 위해 당업계에 공지된 방법, 예컨대 ZnCl2 배양에 의해 단편화될 수 있다.
하나의 구현예에서, 전체 RNA, mRNA 또는 이로부터 유래된 핵산은 감염 또는 염증을 갖는 환자로부터 채취한 샘플에서 단리된다. 특정 세포에서 잘 발현되지 않는 바이오마커 폴리뉴클레오타이드는 정규화 기술을 사용하여 농축될 수 있다(Bonaldo et al., 1996, Genome Res. 6:791-806).
전술한 바와 같이, 바이오마커 폴리뉴클레오타이드는 하나 이상의 뉴클레오타이드에서 검출 가능하게 표지될 수 있다. 표적 폴리뉴클레오타이드를 표지하는 데 당업계에 공지된 임의의 방법이 사용될 수 있다. 바람직하게는,이 표지하기는 RNA의 길이를 따라 균일하게 표지를 포함하고, 더욱 바람직하게 표지하기는 고도의 효율로 수행된다. 예를 들어, 폴리뉴클레오타이드는 올리고-dT 프라이밍 역전사에 의해 표지될 수 있다. 무작위 프라이머(예컨대, 9-mer)는 폴리뉴클레오타이드의 전장에 걸쳐 표지된 뉴클레오타이드를 균일하게 포함하기 위해 역전사에서 사용될 수 있다. 대안으로, 무작위 프라이머는 폴리뉴클레오타이드를 증폭하기 위해 PCR 방법 또는 T7 프로모터-기반 시험관내 전사 방법과 함께 사용될 수 있다.
검출 가능한 표지는 발광 표지일 수 있다. 예를 들어, 형광 표지, 생물 발광 표지, 화학 발광 표지, 및 비색 표지가 본 발명의 실시에 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 형광 표지는 이에 제한되지 않지만, 플루오레세인, 인광 물질, 로다민 또는 폴리메틴 염료 유도체를 포함한다. 사용될 수 있는 화학 발광 표지는 이에 제한되지 않지만, 루미놀(luminol)을 포함한다. 또한, 이에 제한되지 않지만 FluorePrime(Amersham Pharmacia, Piscataway, NJ), Fluoredite(Miilipore, Bedford, MA), FAM(ABI, Foster City, CA) 및 Cy3 또는 Cy5(Amersham Pharmacia, Piscataway, NJ)와 같은 형광 포스포아미다이트를 포함하는 시판 중인 형광 표지가 사용될 수 있다. 대안으로, 검출 가능한 표지는 방사성 표지된 뉴클레오타이드일 수 있다.
하나의 구현예에서, 환자 샘플로부터의 바이오마커 폴리뉴클레오타이드 분자는 기준 샘플의 상응하는 폴리뉴클레오타이드 분자와 다르게 표지된다. 기준은 정상적인 생물학적 샘플(즉, 대조 샘플, 예컨대, 감염 또는 염증을 가지지 않는 대상으로부터의 혈액 또는 PBMC) 또는 기준 생물학적 샘플(예컨대, 바이러스성 감염 또는 세균성 감염인 대상으로부터의 혈액 또는 PBMC)로부터의 폴리뉴클레오타이드 분자를 포함할 수 있다.
표적 폴리뉴클레오타이드 분자가 어레이의 상보적 폴리뉴클레오타이드 서열, 바람직하게는 상보적 DNA가 위치한 특정 어레이 부위에 특이적으로 결합하거나 특이적으로 혼성화되도록 핵산 혼성화 및 세척 조건이 선택된다. 어레이상에 위치된 이중 가닥 프로브 DNA를 함유하는 어레이는 표적 폴리뉴클레오타이드 분자와 접촉하기 전에 DNA를 단일 가닥이 되게 하는 변성 조건에 바람직하게 적용된다. 단일 가닥의 프로브 DNA(예컨대, 합성 올리고데옥시리보 핵산)를 함유하는 어레이는 표적 폴리뉴클레오타이드 분자와 접촉하기 전에 변성될 필요가 있고, 예컨대 자기-상보성 서열로 인해 생성되는 헤어핀 또는 이량체를 제거할 수 있다.
최적의 혼성화 조건은 프로브 및 표적 핵산의 길이(예컨대, 올리고머 대 200 염기 초과의 폴리뉴클레오타이드) 및 유형(예컨대, RNA 또는 DNA)에 따라 다르다. 당업자는 올리고뉴클레오타이드가 더 짧아질수록 만족할 만한 혼성화 결과를 얻기 위해 비교적 균일한 용융 온도를 달성하기 위해 길이를 조절할 필요가 있을 수 있음을 이해할 것이다. 핵산에 대한 특정(즉, 엄격한) 혼성화 조건의 일반 파라미터는 문헌[Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd Edition, 2001), 및 Ausubel et al., Current Protocols In Molecular Biology, vol. 2, Current Protocols Publishing, New York (1994)]에 기술된다. Schena et al.의 cDNA 마이크로어레이에 대한 전형적인 혼성화 조건은 65°C에서 4시간 동안 5배 SSC와 0.2% SDS에서 혼성화한 후, 25°C에서 저엄중성 세척 완충액(low stringency wash buffer)(1 Х SSC/0.2% SDS)에서 세척한 후, 25°C에서 10분간 고엄중성 세척 완충액(0.1 Х SSC/0.2% SDS)에서 세척한다(Schena et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93:10614 (1993)). 예컨대, 문헌[Tijessen, 1993, Hybridization With Nucleic Acid Probes, Elsevier Science Publishers B.V.; and Kricka, 1992, Nonisotopic Dna Probe Techniques, Academic Press, San Diego, Calif]에 유용한 혼성화 조건 또한 제공된다. 특히 바람직한 혼성화 조건은 프로브의 평균 용융 온도에서 또는 근처 온도에서(예컨대, 51℃ 내, 더욱 바람직하게는 21℃ 내), 1M NaCl, 50mM MES 완충액(pH 6.5), 0.5% 소듐 사르코신 및 30% 폼아마이드에서의 혼성화를 포함한다.
형광 표지된 유전자 생성물이 사용될 때, 마이크로어레이의 각 부위에서의 형광 방출은 바람직하게는 주사 공초점 레이저 현미경(scanning confocal laser microscopy)으로 검출될 수 있다. 하나의 구현예에서, 적절한 여기선(excitation line)을 사용하는 별도의 스캔이 사용된 두 개의 형광체 각각에 대해 수행된다. 대안으로, 두 개의 형광체에 특이적인 파장에서 동시에 표본 조명을 가능하게 하는 레이저가 사용될 수 있으며, 두 개의 형광체로부터의 방출이 동시에 분석될 수 있다(문헌[Shalon et al., 1996, "A DNA microarray system for analyzing complex DNA samples using two-color fluorescent probe hybridization," Genome Research 6:639-645]을 참조하되, 이는 모든 목적을 위해 그 전체 내용이 참조로서 포함됨). 어레이는 컴퓨터로 제어되는 X-Y 스테이지와 현미경 대물 렌즈가 있는 레이저 형광 스캐너로 스캔할 수 있다. 두 개의 형광체의 순차적인 여기는 멀티 라인, 혼합 가스 레이저로 달성되며 방출된 빛은 파장별로 분리되어 두 개의 광전 증폭관으로 검출된다. 형광 레이저 스캐닝 장치는 문헌 [Schena et al., Genome Res. 6:639-645 (1996)] 및 본원에 인용된 다른 참고 문헌에 기재되어 있다. 대안으로, 문헌 [Ferguson et al., Nature Biotech. 14:1681-1684 (1996)]에 기재된 광섬유 다발은 다수의 부위에서 동시에 mRNA 함유 수준을 모니터하는 데 사용될 수 있다. 대안으로, 감소하는 신호 강도를 측정함으로써 증폭이 추적되도록 프로브는 형광체 및 소광체(quencher)로 측정된 표적으로 표지될 수 있다.
특정 구현예에서, 본 발명은 바이러스 반응 유전자 세트 및 세균 반응 유전자 세트 및/또는 패혈증 반응 유전자 세트의 유전자 발현을 검출하기 위한 복수의 프로브를 포함하는 마이크로어레이를 포함한다.
하나의 구현예에서, 마이크로어레이는 IFI27 폴리뉴클레오타이드에 혼성화하는 올리고뉴클레오타이드, JUP 폴리뉴클레오타이드에 혼성화하는 올리고뉴클레오타이드, LAX1 폴리뉴클레오타이드에 혼성화하는 올리고뉴클레오타이드, HK3 폴리뉴클레오타이드에 혼성화하는 올리고뉴클레오타이드, TNIP1 폴리뉴클레오타이드에 혼성화하는 올리고뉴클레오타이드, GPAA1 폴리뉴클레오타이드에 혼성화하는 올리고뉴클레오타이드, 및 CTSB 폴리뉴클레오타이드에 혼성화하는 올리고뉴클레오타이드를 포함한다.
다른 구현예에서, 마이크로어레이는 CEACAM1 폴리뉴클레오타이드에 혼성화하는 올리고뉴클레오타이드, ZDHHC19 폴리뉴클레오타이드에 혼성화하는 올리고뉴클레오타이드, C9orf95 폴리뉴클레오타이드에 혼성화하는 올리고뉴클레오타이드, GNA15 폴리뉴클레오타이드에 혼성화하는 올리고뉴클레오타이드, BATF 폴리뉴클레오타이드에 혼성화하는 올리고뉴클레오타이드, C3AR1 폴리뉴클레오타이드에 혼성화하는 올리고뉴클레오타이드, KIAA1370 폴리뉴클레오타이드에 혼성화하는 올리고뉴클레오타이드, TGFBI 폴리뉴클레오타이드에 혼성화하는 올리고뉴클레오타이드, MTCH1 폴리뉴클레오타이드에 혼성화하는 올리고뉴클레오타이드, RPGRIP1 폴리뉴클레오타이드에 혼성화하는 올리고뉴클레오타이드, 및 HLA-DPB1 폴리뉴클레오타이드에 혼성화하는 올리고뉴클레오타이드를 더 포함한다.
폴리뉴클레오타이드는 이에 제한되지 않지만, 노던 블롯팅, 뉴클레아제 보호 분석(nuclease protection assays), RNA 핑거 프린팅, 중합 효소 연쇄 반응, 리가제 연쇄 반응, Q베타 복제 효소, 등온 증폭법, 가닥 변위 증폭, 전사 기반 증폭 시스템, 뉴클레아제 보호(S1 뉴클레아제 또는 RNAse 보호 분석), SAGE뿐만 아니라, 국제 공개 번호 제WO 88/10315호 및 제WO 89/06700호, 및 국제 출원 번호 제PCT/US87/00880호 및 제PCT/US89/01025에 개시된 방법을 포함하는 다른 방법들에 의해서도 분석될 수 있다.
당업자에게 공지된 통상적인 노던 혼성화 기술에 따라, 표준 노던 블롯 분석을 사용하여 샘플에서 RNA 전사물 크기를 확인하고, 선택적으로 스플라이싱된 RNA 전사물을 동정하며, mRNA의 상대적인 양을 확인할 수 있다. 노던 블롯에서, RNA 샘플은 먼저 변성 조건 하에서 아가로스 겔에서 전기 영동에 의해 크기별로 분리된다. 그런 다음 RNA를 멤브레인으로 옮겨서 가교 결합시키고 표지된 프로브와 혼성화시킨다. 무작위 프라이밍(random-primed), 틈번역(nick-translated), 또는 PCR-생성 DNA 프로브, 시험관내 전사 RNA 프로브 및 올리고뉴클레오타이드를 포함하여, 비동위원소 또는 고특이적 활성 방사성 표지 프로브를 사용할 수 있다. 또한, 오직 부분 상동(예컨대, 다른 종의 cDNA, 또는 엑손을 포함할 수 있는 게놈 DNA 단편)이 있는 서열을 프로브로서 사용할 수 있다. 전장, 단일 가닥 DNA 또는 DNA 서열의 단편을 함유하는 표지된 프로브, 예를 들어 방사성 표지된 cDNA는 길이가 적어도 20개, 적어도 30개, 적어도 50개 또는 적어도 100개의 연속 뉴클레오타이드일 수 있다. 프로브는 당업자에게 공지된 많은 다른 방법 중 임의의 방법으로 표지될 수 있다. 이 연구에 가장 일반적으로 사용되는 표지는 방사성 원소, 효소, 자외선에 노출되었을 때 형광을 내는 화학 물질 등이다. 다수의 형광 물질이 알려져 있으며 표지로서 이용할 수 있다. 이에 제한되지 않지만, 플루오레세인, 로다민, 아우라민, 텍사스 레드, AMCA 블루, 및 루시퍼 옐로우를 포함한다. 특정 검출 물질은 염소(goat)에서 제조되고 아이소티오시아네이트를 통해 플루오레세인과 접합된 항-토끼 항체이다. 단백질은 또한 방사성 원소 또는 효소로 표지될 수 있다. 방사성 표지는 임의의 현재 이용 가능한 계수 절차에 의해 검출될 수 있다. 사용 가능한 동위 원소는 이에 제한되지 않지만, 3H, 14C, 32P, 35S, 36Cl, 35Cr, 57Co, 58Co, 59Fe, 90Y, 125I, 131I 및 186Re를 포함한다. 효소 표지도 마찬가지로 유용하며, 현재 이용되는 비색 분석, 분광 광도법, 형광 분광 광도법, 전류 측정법 또는 가스 측정법에 의해 검출될 수 있다. 효소는 카보디이미드, 다이아이소시아네이트, 글루타르알데하이드 등과 같은 가교 분자와의 반응에 의해 선택된 입자에 접합된다. 당업자에게 공지된 임의의 효소가 사용될 수 있다. 이러한 효소의 예는 이에 제한되지 않지만, 과산화효소, 베타-D-갈락토시다아제, 우레아제, 글루코스 산화효소에 더해 과산화효소, 및 알칼리 인산분해효소를 포함한다. 미국 특허 번호 제3,654,090호, 제3,850,752호 및 제4,016,043호는 대체 표지 재료 및 방법의 개시를 위해 예로서 언급된다.
(리보뉴클레아제 보호 분석과 S1 뉴클레아제 분석을 모두 포함하는) 뉴클레아제 보호 분석은 특정 mRNA를 검출하고 정량하는 데 사용될 수 있다. 뉴클레아제 보호 분석에서, 안티센스 프로브(예컨대, 방사성 표지 또는 비동위원소로 표지)는 용액에서 RNA 샘플에 혼성화된다. 혼성화 후, 단일 가닥, 비혼성화 프로브 및 RNA는 뉴클레아제에 의해 분해된다. 아크릴아마이드 겔을 사용하여 나머지 보호된 단편을 분리한다. 일반적으로, 용액 혼성화는 멤브레인-기반 혼성화보다 더 효율적이며, 블롯 혼성화의 최대치인 20-30 μg에 비해 샘플 RNA의 100 μg까지 수용할 수 있다.
뉴클레아제 보호 분석의 가장 일반적인 유형인 리보뉴클레아제 보호 분석은 RNA 프로브의 사용이 필요하다. 올리고뉴클레오타이드 및 기타 단일-가닥 DNA 프로브는 S1 뉴클레아제를 함유하는 분석에서만 사용할 수 있다. 단일-가닥 안티센스 프로브는 일반적으로 뉴클레아제에 의한 프로브:표적 혼성체의 절단을 방지하기 위해, 표적 RNA와 완전히 상동이어야 한다.
연속 분석 유전자 발현(SAGE)은 또한 세포 샘플에서 RNA 농도를 결정하는 데 사용될 수 있다. 예컨대, 문헌[Velculescu et al., 1995, Science 270:484-7; Carulli, 등, 1998, Journal of Cellular Biochemistry Supplements 30/31:286-96]을 참조하되 그 전체 내용이 본원에 참조로서 포함된다. SAGE 분석은 검출을 위한 특별한 장치를 필요로 하지 않으며, 많은 수의 전사 생성물의 발현을 동시에 검출하기 위한 바람직한 분석 방법 중 하나이다. 먼저, 폴리 A+ RNA가 세포로부터 추출된다. 이어서, RNA를 바이오틴일화 올리고(dT) 프라이머를 사용하여 cDNA로 전환시키고, 4 염기 인식 제한 효소(고정 효소(Anchoring Enzyme): AE)로 처리하여 3' 말단에 바이오틴기를 함유하는 AE-처리 단편을 얻는다. 다음으로, AE-처리 단편을 스트렙타비딘과 결합시켜 배양한다. 결합된 cDNA는 2개의 분획으로 나누어지고, 각각의 분획은 상이한 이중-가닥 올리고뉴클레오타이드 아답터(링커) A 또는 B에 연결된다. 이들 링커는 (1) 고정 효소의 작용에 의해 형성된 돌출부의 서열에 상보적인 서열을 갖는 돌출 단일 가닥 부분, (2) 태깅 효소(TE)로서 기능하는 IIS형 제한 효소의 5' 뉴클레오타이드 인식 서열(인식 부위로부터 20 bp 이하의 소정 위치에서 절단됨), 및 (3) PCR 특이적 프라이머를 제조하기 위한 충분한 길이의 추가 서열로 구성된다. 링커-연결 cDNA는 태깅 효소를 사용하여 절단되고, 짧은 가닥 서열 태그의 형태로 존재하는 링커-연결 cDNA 서열 부분만 남는다. 다음으로, 두 가지 상이한 유형의 링커로부터의 짧은 가닥 서열 태그의 풀(pool)을 서로 연결한 후, 링커 A 및 B에 특이적인 프라이머를 사용하여 PCR 증폭시킨다. 결과적으로, 증폭 생성물은 링커 A 및 B에 결합된 2개의 인접한 서열 태그(다이태그)의 무수한 서열을 포함하는 혼합물로서 수득된다. 증폭 생성물은 고정 효소로 처리되고, 자유 다이태그 부분은 표준 결합 반응에서 가닥으로 연결된다. 그런 다음, 증폭 생성물을 클로닝한다. 클론의 뉴클레오타이드 서열의 결정은 일정한 길이의 연속 다이태그의 판독 값을 얻는 데 사용될 수 있다. 이어서, 각각의 태그에 상응하는 mRNA의 존재는 클론의 뉴클레오타이드 서열 및 서열 태그상의 정보로부터 동정될 수 있다.
정량적 역전사 효소 PCR(qRT-PCR)은 또한 바이오마커의 발현 프로파일을 결정하는 데 사용될 수 있다(예컨대, 미국 특허 출원 공개 번호 제2005/0048542A1호를 참조하되, 그 전체 내용이 본원에 참조로서 포함된다). RT-PCR에 의한 유전자 발현 프로파일링(profiling)의 제1 단계는 RNA 주형을 cDNA로 역전사한 후, PCR 반응에서 지수적으로 증폭시키는 것이다. 가장 일반적으로 사용되는 두 가지 역전사 효소는 AMV-RT(avilo myeloblastosis virus reverse transcriptase)와 MLV-RT(Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase)이다. 역전사 단계는 전형적으로 상황 및 발현 프로파일링의 목표에 따라 특정 프라이머, 무작위 육량체 또는 올리고-dT 프라이머를 사용하여 프라이밍된다. 예를 들어, 추출된 RNA는 GeneAmp RNA PCR 키트(Perkin Elmer, CA, USA)를 사용하여 제조사의 지침에 따라 역전사될 수 있다. 유도된 cDNA는 다음 PCR 반응의 주형으로 사용될 수 있다.
PCR 단계는 다양한 열 안정성 DNA 의존성 DNA 중합 효소를 사용할 수 있지만, 일반적으로 5'-3' 뉴클레아제 활성을 지니지만 3'-5' 교정 엔도뉴클레아제 활성이 없는 Taq DNA 중합 효소를 이용한다. 따라서, TAQMAN PCR은 전형적으로 Taq 또는 Tth 중합 효소의 5'-뉴클레아제 활성을 이용하여 표적 증폭물(amplicon)에 결합된 혼성화 프로브를 가수 분해하지만, 동등한 5'뉴클레아제 활성을 갖는 임의의 효소가 사용될 수 있다. 2개의 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 사용하여 PCR 반응의 전형적인 증폭물을 생성한다. 제3 올리고뉴클레오타이드, 또는 프로브는 2개의 PCR 프라이머 사이에 위치하는 뉴클레오타이드 서열을 검출하도록 설계된다. 프로브는 Taq DNA 중합 효소에 의해 확장되지 않으며 리포터 형광 염료(reporter fluorescent dye) 및 소광 형광 염료로 표지된다. 리포터 염료의 레이저 유도 방출은 두 염료가 프로브상에 있기 때문에 함께 가까이 위치하는 경우 소광 염료에 의해 소광된다. 증폭 반응하는 동안, Taq DNA 중합 효소는 주형 의존적 방식으로 프로브를 절단한다. 생성된 프로브 단편은 용액 내에서 해리되고, 방출된 리포터 염료로부터의 신호는 제2 형광체의 소광 효과가 없다. 리포터 염료의 한 분자는 합성된 각각의 새로운 분자에 대해 유리되며, 비소광 리포터 염료의 검출은 데이터의 정량적 해석을 위한 기초를 제공한다.
TAQMAN RT-PCR은, 예를 들어 ABI PRISM 7700 서열 검출 시스템(Perkin-Elmer-Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) 또는 Lightcycler(Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Germany)와 같은 시판 중인 장비를 사용하여 수행될 수 있다. 다른 대안으로는 이에 제한되지 않지만, cobas Liat(Roche Molecular Diagnostics, Pleasanton, Calif., USA) 또는 GeneXpert 시스템(Cepheid, Sunnyvale, CA, USA)과 같은 요구시점 응답-샘플(sample-to-answer point-of-need) 장치를 포함한다. 당업자는 본 발명이 열거된 장치들에 한정되지 않으며 다른 장치들이 TAQMAN-PCR을 위해 사용될 수 있음을 이해할 것이다. 바람직한 구현예에서, 5' 뉴클레아제 절차는 ABI PRISM 7700 서열 검출 시스템과 같은 실시간 정량적 PCR 장치상에서 실행된다. 이 시스템은 열순환기(thermocycler), 레이저, 전하 결합 소자(charge-coupled device: CCD), 카메라 및 컴퓨터로 이루어진다. 이 시스템은 계측기를 실행하고 데이터를 분석하기 위한 소프트웨어를 포함한다. 5'-뉴클레아제 분석 데이터는 초기에 Ct, 즉 역치 주기(threshold cycle)로 표현된다. 형광 값은 매 주기 동안 기록되며 증폭 반응에서 그 지점까지 증폭된 생성물의 양을 나타낸다. 형광 신호가 통계적으로 유의미한 것으로 처음 기록되는 시점이 역치 주기(Ct)이다. 표준 열 순환에 대한 대안은 이에 제한되지 않지만, 연속 열 구배에 의한 증폭 또는 종점 검출 및 기타 당업계에 공지된 장치를 이용한 등온 증폭을 포함한다. 오차 및 샘플간 편차의 영향을 최소화하기 위해 RT-PCR은 대개 내부 표준을 사용하여 수행된다. 이상적인 내부 표준은 다른 조직 중에 일정한 수준으로 표현되며 실험 처리에 의해 영향 받지 않는다. 유전자 발현의 패턴을 정규화하기 위해 가장 자주 사용되는 RNA는 하우스키핑 유전자 인 GAPDH(glyceraldehyde-3-phosphate-dehydrogenase)와 베타-액틴에 대한 mRNA이다.
RT-PCR 기술의 가장 최근의 변형은 실시간 정량 PCR이며 이중-표지 형광성 프로브(즉, TAQMAN 프로브)를 통해 PCR 생성물 축적을 측정한다. 실시간 PCR은 각각의 표적 서열에 대한 내부 경쟁자가 정규화에 사용되는 정량 경쟁 PCR 및 샘플 내에 함유된 정규화 유전자 또는 RT-PCR을 위한 하우스키핑 유전자를 사용하여 정량 비교 PCR 모두와 함께 사용할 수 있다. 보다 상세한 내용을 위해 예컨대, 문헌 [Held et al., Genome Research 6:986-994 (1996)]을 참조한다.
대안은 디지털 계수 방법을 사용하여 PCR 생성물을 검출하는 것이다. 이에 제한되지 않지만, 디지털 미세방울 PCR 및 PCR 생성물의 고체 상태 나노 기공 검출법을 포함한다. 이들 방법에서 목적 생성물의 계수는 하우스키핑 유전자의 계수로 정규화될 수 있다. 당업자에게 공지된 다른 PCR 검출 방법이 사용될 수 있으며, 본 발명은 열거된 방법에 제한되지 않는다.
바이오마커 데이터 분석
바이오마커 데이터는 바이오마커를 동정하고, 환자가 외상성 손상, 수술, 자가 면역 질환, 혈전증 또는 전신성 염증 반응 증후군(SIRS)과 같은 비감염원에서 발생하는 염증을 앓고 있는지 또는 감염에서 발생하는 염증을 앓고 있는지 여부를 평가하기 위해 검사 및 기준 발현 프로파일 사이의 관찰된 바이오마커 수준의 차이에 대한 통계적 유의성을 결정하며, 환자가 감염된 것으로 진단된 경우, 환자가 바이러스성 감염인지 세균성 감염인지 결정하는 것을 포함하여 감염 유형을 진단하기 위한 다양한 방법에 의해 분석 될 수 있다. 특정 구현예에서, 환자 데이터는 이에 제한되지 않지만, 다변량 선형 판별 분석(LDA), 수신자 조작 특성(ROC) 분석, 주성분 분석(PCA), 앙상블 데이터 마이닝 기법, 마이크로어레이의 중요도 분석(SAM), 마이크로어레이의 세포 특이적 중요도 분석(csSAM), 밀도 정규화 이벤트의 스패닝-트리 진행 분석(spanning-tree progression analysis of density-normalized events: SPADE) 및 다차원 단백질 식별 기술(MUDPIT) 분석을 포함하는 하나 이상의 방법에 의해 분석된다. (예컨대, Hilbe (2009) Logistic Regression Models, Chapman & Hall/CRC Press; McLachlan (2004) Discriminant Analysis and Statistical Pattern Recognition. Wiley Interscience; Zweig et al. (1993) Clin. Chem. 39:561-577; Pepe (2003) The statistical evaluation of medical tests for classification and prediction, New York, NY: Oxford; Sing et al. (2005) Bioinformatics 21:3940-3941; Tusher et al. (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98:5116-5121; Oza (2006) Ensemble data mining, NASA Ames Research Center, Moffett Field, CA, USA; English et al. (2009) J. Biomed. Inform. 42(2):287-295; Zhang (2007) Bioinformatics 8: 230; Shen-Orr et al. (2010) Journal of Immunology 184:144-130; Qiu et al. (2011) Nat. Biotechnol. 29(10):886-891; Ru et al. (2006) J. Chromatogr. A. 1111(2):166-174, Jolliffe Principal Component Analysis (Springer Series in Statistics, 2nd edition, Springer, NY, 2002), Koren et al. (2004) IEEE Trans Vis Comput Graph 10:459-470 참조; 이들 전체 내용이 본원에 참조로서 포함됨)
C. 키트
또 다른 양태에서, 본 발명은 대상에서 감염 진단용 키트를 제공하되, 본 키트는 본 발명의 바이오마커를 검출하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 키트는 바이러스성 또는 세균성 감염이 있는 환자 및 건강한 또는 비감염 대상의 샘플에서 차등 발현되는, 본원에 기재된 임의의 하나 이상의 바이오마커를 검출하는 데 사용될 수 있다. 키트는 바이러스 반응 유전자 세트 및 세균 반응 유전자 세트의 발현 수준을 측정하기 위한 하나 이상의 제제, 감염이 의심되는 인간 대상으로부터 단리된 생물학적 샘플을 보유하기 위한 용기; 및 생물학적 샘플에서 바이러스 반응 유전자 세트 및 세균 반응 유전자 세트의 발현 수준을 측정하기 위해 생물학적 샘플 또는 생물학적 샘플의 일부와 제제를 반응시키기 위한 인쇄된 지침서를 포함한다. 제제는 별도의 용기에 포장될 수 있다. 키트는 면역 분석, PCR, 또는 마이크로어레이 분석을 수행하기 위한 하나 이상의 대조 기준 샘플 및 시약을 더 포함할 수 있다.
하나의 구현예에서, 키트는 세균성 감염과 바이러스성 감염을 구별하기 위한 IFI27, JUP, LAX1, HK3, TNIP1, GPAA1 및 CTSB 바이오마커의 수준을 측정하기 위한 제제를 포함한다.
또 다른 구현예에서, 키트는 염증이 감염원 또는 비감염원으로 인한 것인지 여부를 구별하기 위한 CEACAM1, ZDHHC19, C9orf95, GNA15, BATF, C3AR1, KIAA1370, TGFBI, MTCH1, RPGRIP1 및 HLA-DPB1 바이오마커의 수준을 측정하기 위한 제제를 더 포함한다.
특정 구현예에서, 키트는 복수의 바이오마커 폴리뉴클레오타이드의 분석을 위한 마이크로어레이를 포함한다. 하나의 구현예에서, 마이크로어레이는 IFI27 폴리뉴클레오타이드에 혼성화하는 올리고뉴클레오타이드, JUP 폴리뉴클레오타이드에 혼성화하는 올리고뉴클레오타이드, LAX1 폴리뉴클레오타이드에 혼성화하는 올리고뉴클레오타이드, HK3 폴리뉴클레오타이드에 혼성화하는 올리고뉴클레오타이드, TNIP1 폴리뉴클레오타이드에 혼성화하는 올리고뉴클레오타이드, GPAA1 폴리뉴클레오타이드에 혼성화하는 올리고뉴클레오타이드, 및 CTSB 폴리뉴클레오타이드에 혼성화하는 올리고뉴클레오타이드를 포함한다.
다른 구현예에서, 키트는 CEACAM1 폴리뉴클레오타이드에 혼성화하는 올리고뉴클레오타이드, ZDHHC19 폴리뉴클레오타이드에 혼성화하는 올리고뉴클레오타이드, C9orf95 폴리뉴클레오타이드에 혼성화하는 올리고뉴클레오타이드, GNA15 폴리뉴클레오타이드에 혼성화하는 올리고뉴클레오타이드, BATF 폴리뉴클레오타이드에 혼성화하는 올리고뉴클레오타이드, C3AR1 폴리뉴클레오타이드에 혼성화하는 올리고뉴클레오타이드, KIAA1370 폴리뉴클레오타이드에 혼성화하는 올리고뉴클레오타이드, TGFBI 폴리뉴클레오타이드에 혼성화하는 올리고뉴클레오타이드, MTCH1 폴리뉴클레오타이드에 혼성화하는 올리고뉴클레오타이드, RPGRIP1 폴리뉴클레오타이드에 혼성화하는 올리고뉴클레오타이드, 및 HLA-DPB1 폴리뉴클레오타이드에 혼성화하는 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 마이크로어레이를 포함한다.
키트는 키트에 함유된 조성물용 중 하나 이상의 용기를 포함할 수 있다. 조성물은 액체 형태일 수 있거나 동결 건조될 수 있다. 조성물에 적합한 용기는 예를 들어, 병, 바이알, 주사기 및 시험관을 포함한다. 용기는 유리 또는 플라스틱을 포함하는 다양한 재료로 형성될 수 있다. 키트는 감염 진단 방법에 대한 서면 지침이 들어있는 패키지 삽입물도 포함할 수 있다.
본 발명의 키트는 다양하게 적용된다. 예를 들어, 본 키트는 대상이 감염이 있거나 외상성 손상, 수술, 자가 면역 질환, 혈전증, 또는 전신성 염증 반응 증후군(SIRS)과 같은 비감염원에서 발생하는 기타 염증성 증상이 있는지를 결정하는 데 사용될 수 있다. 환자가 감염된 것으로 진단되면 키트를 사용하여 감염 유형(예컨대, 바이러스성 감염 또는 세균성 감염)을 더 결정할 수 있다. 다른 예에서, 키트는 예를 들어, 광범위 항생제 또는 항바이러스제를 사용하여 급성 염증 환자를 치료해야 하는지 여부를 결정하는 데 사용될 수 있다. 다른 예에서, 키트는 감염이있는 환자의 치료 효과를 모니터하는 데 사용될 수 있다. 추가 예에서, 키트는 치료 효과를 결정하기 위한 시험관내 또는 생체내 동물 모델에서 하나 이상의 바이오마커의 발현을 조절하는 화합물을 동정하는 데 사용될 수 있다.
D. 감염 진단을 위한 진단 시스템 및 컴퓨터화된 방법
추가 양태에서, 본 발명은 감염이 의심되는 환자를 진단하는 컴퓨터 구현 방법을 포함한다. 컴퓨터는 환자의 생물학적 샘플에서 바이러스 반응 유전자 세트 및 세균 반응 유전자 세트 중 하나 또는 둘 모두의 발현 수준에 대한 값을 포함하는 입력된 환자 데이터를 수신하는 단계; 유전자 세트의 발현 수준을 분석하는 단계; 유전자 세트의 발현 수준에 기초하여 세균/바이러스 메타스코어를 계산하는 단계(세균/바이러스 메타스코어 값이 환자가 바이러스성 감염 또는 세균성 감염인지를 나타냄); 및 환자의 진단에 관한 정보를 표시하는 단계를 포함하는 단계를 수행한다.
특정 구현예에서, 입력된 환자 데이터는 a) IFI27, JUP, 및 LAX1을 포함하는 바이러스 반응 유전자 세트 및 HK3, TNIP1, GPAA1 및 CTSB를 포함하는 세균 반응 유전자 세트; b) OAS2 및 CUL1을 포함하는 바이러스 반응 유전자 세트 및 SLC12A9, ACPP, STAT5B를 포함하는 세균 반응 유전자 세트; c) ISG15 및 CHST12를 포함하는 바이러스 반응 유전자 세트 및 EMR1 및 FLII를 포함하는 세균 반응 유전자 세트; d) IFIT1, SIGLEC1, 및 ADA를 포함하는 바이러스 반응 유전자 세트 및 PTAFR, NRD1, PLP2를 포함하는 세균 반응 유전자 세트; e) MX1을 포함하는 바이러스 반응 유전자 세트 및 DYSF, TWF2를 포함하는 세균 반응 유전자 세트; f) RSAD2를 포함하는 바이러스 반응 유전자 세트 및 SORT1 및 TSPO를 포함하는 세균 반응 유전자 세트; g) IFI44L, GZMB, 및 KCTD14를 포함하는 바이러스 반응 유전자 세트 및 TBXAS1, ACAA1 및 S100A12를 포함하는 세균 반응 유전자 세트; h) LY6E를 포함하는 바이러스 반응 유전자 세트 및 PGD 및 LAPTM5를 포함하는 세균 반응 유전자 세트; i) IFI44, HESX1, 및 OASL을 포함하는 바이러스 반응 유전자 세트 및 NINJ2, DOK3, SORL1 및 RAB31를 포함하는 세균 반응 유전자 세트; j) OAS1을 포함하는 바이러스 반응 유전자 세트 및 IMPA2 및 LTA4H를 포함하는 세균 반응 유전자 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 바이러스 반응 유전자 세트 및 세균 반응 유전자 세트의 발현 수준에 대한 값을 포함한다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 감염이 의심되는 환자를 진단하는 컴퓨터 구현 방법을 포함하되, 컴퓨터는 a) 환자로부터의 생물학적 샘플에서 IFI27, JUP, LAX1, HK3, TNIP1, GPAA1, 및 CTSB 바이오마커의 수준에 대한 값을 포함하는 입력된 환자 데이터를 수신하는 단계; b) 각각의 바이오마커의 수준을 분석하여 바이오마커에 대한 각각의 기준값 범위와 비교하는 단계; c) 바이오마커의 발현 수준에 기초하여 환자에 대한 세균/바이러스 메타스코어를 계산하는 단계(환자에 대한 양성 세균/바이러스 메타스코어는 환자가 바이러스성 감염인 것을 나타내고, 환자에 대한 음성 세균/바이러스 메타스코어는 환자가 세균성 감염인 것을 나타냄); 및 d) 환자의 진단에 관한 정보를 표시하는 단계를 포함하는 단계를 수행한다.
특정 구현예에서, 입력된 환자 데이터는 CEACAM1, ZDHHC19, C9orf95, GNA15, BATF, C3AR1, KIAA1370, TGFBI, MTCH1, RPGRIP1, 및 HLA-DPB1를 포함하는 패혈증 반응 유전자 세트의 발현 수준에 대한 값을 더 포함하되, 컴퓨터 구현 방법은 환자에 대한 패혈증 메타스코어를 계산하는 단계를 포함하며, 여기서 비감염 대조 대상에 대한 기준값 범위보다 높은 패혈증 메타스코어는 환자가 감염된 것을 나타내고, 비감염 대조 대상에 대한 기준값 범위 내의 패혈증 메타스코어는 환자가 비감염성 염증 질환임을 나타낸다.
다른 구현예에서, 본 발명은 염증이 있는 환자를 진단하는 컴퓨터 구현 방법을 포함하되, 컴퓨터는 a) 환자로부터의 생물학적 샘플에서 IFI27, JUP, LAX1, HK3, TNIP1, GPAA1, CTSB, CEACAM1, ZDHHC19, C9orf95, GNA15, BATF, C3AR1, KIAA1370, TGFBI, MTCH1, RPGRIP1, 및 HLA-DPB1 바이오마커의 수준에 대한 값을 포함하는 입력된 환자 데이터를 수신하는 단계; b) 각각의 바이오마커의 수준을 분석하여 바이오마커에 대한 각각의 기준값 범위와 비교하는 단계; c) 환자에 대한 패혈증 메타스코어를 계산하는 단계(비감염 대조 대상에 대한 기준값 범위보다 높은 패혈증 메타스코어는 환자가 감염된 것을 나타내고, 비감염 대조 대상에 대한 기준값 범위 내의 패혈증 메타스코어는 환자가 비감염성 염증 질환인 것을 나타냄); d) 패혈증 점수가 환자가 감염된 것을 나타내는 경우 환자에 대한 세균/바이러스 메타스코어를 계산하는 단계(환자에 대한 양성 세균/바이러스 메타스코어는 환자가 바이러스성 감염인 것을 나타내고, 환자에 대한 음성 세균/바이러스 메타스코어는 환자가 세균성 감염인 것을 나타냄); 및 환자의 진단에 관한 정보를 표시하는 단계를 포함하는 단계를 수행한다.
추가 양태에서, 본 발명은 기술된 바와 같이 컴퓨터 구현 방법을 수행하기 위한 진단 시스템을 포함한다. 진단 시스템은 프로세서, 저장부(즉, 메모리), 디스플레이부 및 일반적으로 범용 컴퓨터에 있는 기타 구성 요소를 포함하는 컴퓨터를 포함한다. 저장부는 프로세서에 의해 실행될 수 있는 명령어 및 프로세서에 의해 검색, 조작 또는 저장될 수 있는 데이터를 포함하여 프로세서에 의해 액세스 가능한 정보를 저장한다.
저장부는 환자의 진단을 결정하기 위한 명령어를 포함한다. 예를 들어, 저장부는 본원에 기술된 바와 같이, 세균/바이러스 메타스코어 및/또는 패혈증 메타스코어를 계산하기 위한 명령어를 포함한다(실시예 1 참조). 또한, 저장부는 다변량 선형 판별 분석(LDA), 수신자 조작 특성(ROC) 분석, 주성분 분석(PCA), 앙상블 데이터 마이닝 기법, 마이크로어레이의 중요도 분석(SAM), 마이크로어레이의 세포 특이적 중요도 분석(csSAM), 또는 다차원 단백질 식별 기술(MUDPIT) 분석을 수행하기 위한 명령어를 더 포함할 수 있다. 컴퓨터 프로세서는 저장부에 연결되고, 환자 데이터를 수신하고 하나 이상의 알고리즘에 따라 환자 데이터를 분석하기 위해 저장부에 저장된 명령어를 실행하도록 구성된다. 디스플레이부는 환자의 진단에 관한 정보를 표시한다.
저장부는 하드 드라이브, 메모리 카드, ROM, RAM, DVD, CD-ROM, USB 플래시 드라이브, 쓰기-가능 및 읽기 전용 메모리와 같은 프로세서가 액세스할 수 있는 정보를 저장할 수 있는 임의의 유형일 수 있다. 프로세서는 Intel Corporation의 프로세서와 같이 공지된 임의의 프로세서일 수 있다. 대안으로 프로세서는 ASIC과 같은 전용 제어기일 수 있다.
명령어는 프로세서에 의해 (기계 코드와 같이) 직접적으로 또는 (스크립트와 같이)간접적으로 실행할 수 있는 임의의 명령어 세트일 수 있다. 이와 관련하여, "명령", "단계" 및 "프로그램"이라는 용어는 본원에서 서로 바꿔 사용할 수 있다. 명령어는 프로세서에 의한 직접 처리를 위한 목적 코드 형태로 저장될 수 있으며, 요구에 따라 해석되거나 사전에 컴파일되는 독립 소스 코드 모듈의 스크립트 또는 컬렉션을 포함하는 임의의 다른 컴퓨터 언어로 저장될 수 있다.
데이터는 명령에 따라 프로세서에 의해 검색, 저장 또는 수정될 수 있다. 예를 들어, 진단 시스템이 임의의 특정 데이터 구조에 의해 제한되지 않지만, 데이터는 컴퓨터 레지스터, 관계형 데이터베이스에서 복수의 상이한 필드 및 레코드, XML 문서 또는 플랫 파일을 갖는 테이블로서 저장될 수 있다. 데이터는 이에 제한되지 않지만, 이진값, ASCII 또는 유니 코드와 같은 컴퓨터 판독 가능한 형식으로 포맷될 수 있다. 또한, 데이터는 숫자, 설명 텍스트, 소유 코드, 포인터, (다른 네트워크 위치를 포함하여) 다른 메모리에 저장된 데이터에 대한 참조 또는 관련 데이터를 계산하는 함수에 의해 사용되는 정보와 같은 관련 정보를 식별하기에 충분한 임의의 정보를 포함할 수 있다.
특정 구현예에서, 프로세서 및 저장부는 동일한 물리적 하우징 내에 저장될 수 있거나 저장될 수없는 다중 프로세서 및 저장부를 포함할 수 있다. 예를 들어, 명령어 및 데이터의 일부는 착탈식 CD-ROM 및 읽기 전용 컴퓨터 칩 내의 다른 것들에 저장될 수 있다. 명령어 및 데이터의 일부 또는 전부는 물리적으로 프로세서로부터 멀리 떨어져 있지만, 여전히 액세스 가능한 위치에 저장될 수 있다. 유사하게, 프로세서는 실제로 병렬로 동작할 수 있거나 동작하지 않을 수 있는 프로세서들의 집합을 포함할 수 있다.
하나의 양태에서, 컴퓨터는 하나 이상의 클라이언트 컴퓨터와 통신하는 서버이다. 각각의 클라이언트 컴퓨터는 프로세서, 저장부 및 명령어를 가지고, 서버와 유사하게 구성될 수 있다. 각각의 클라이언트 컴퓨터는 사람이 사용하도록 의도된 개인용 컴퓨터일 수 있고, 중앙 처리 장치(CPU), 디스플레이(예를 들어, 프로세서에 의해 처리된 정보를 표시하는 모니터), CD-ROM, 하드 드라이브, 사용자 입력 장치(예컨대, 마우스, 키보드, 터치 스크린 또는 마이크), 스피커, 모뎀 및/또는 네트워크 인터페이스 장치(전화, 케이블 또는 기타)와 같이 개인용 컴퓨터에서 보통 발견되는 내부 구성요소와 이들 요소를 서로 연결하고 서로(직접적으로 또는 간접적으로) 통신할 수 있도록 하는 데 사용되는 모든 구성 요소를 갖는다. 또한, 본원에 기술된 시스템 및 방법에 따른 컴퓨터는 명령을 처리할 수 있고 인간 및 로컬 저장 능력이 결여된 네트워크 컴퓨터를 포함하는 다른 컴퓨터로 데이터를 전송할 수 있는 임의의 장치를 포함할 수 있다.
클라이언트 컴퓨터가 풀 사이즈 개인용 컴퓨터를 포함할 수 있지만, 시스템 및 방법의 많은 양태는 인터넷과 같은 네트워크를 통해 서버와 무선으로 데이터를 교환할 수 있는 모바일 장치와 연결하여 사용될 때 특히 이점이 있다. 예를 들어, 클라이언트 컴퓨터는 블랙베리(Blackberry) 전화, 애플 아이폰(Apple iPhone), 안드로이드(Android), 또는 기타 인터넷 가능 휴대 전화와 같은 무선 접속이 가능한 PDA일 수 있다. 이와 관련하여, 사용자는 작은 키보드, 키패드, 터치 스크린, 또는 임의의 다른 사용자 입력 수단을 사용하여 정보를 입력할 수 있다. 컴퓨터는 무선 신호를 수신하기 위한 안테나를 가질 수 있다.
서버와 클라이언트 컴퓨터는 네트워크를 통하는 것과 같이, 직접 및 간접 통신이 가능하다. 단지 몇 대의 컴퓨터가 사용될 수도 있지만, 전형적인 시스템은 다수의 연결된 컴퓨터를 포함할 수 있고, 각각의 다른 컴퓨터는 네트워크의 상이한 노드에 위치할 수 있음을 이해해야 한다. 네트워크 및 개재 노드는 인터넷, 월드 와이드 웹(World Wide Web), 인트라넷, 가상 사설 네트워크, 광역 네트워크, 로컬 네트워크, 휴대 전화 네트워크, 하나 이상의 회사에 소유된 통신 프로토콜을 사용하는 사설 네트워크, 이더넷(Ethernet), WiFi 및 HTTP 등을 포함하는 장치 및 통신 프로토콜의 다양한 조합을 포함할 수 있다. 이러한 통신은 모뎀(예컨대, 전화 접속 또는 케이블), 네트워크 및 무선 인터페이스와 같은 다른 컴퓨터에서 데이터를 전송할 수 있는 모든 장치에 의해 용이하게 할 수 있다. 서버는 웹 서버일 수 있다.
전술한 바와 같이, 정보가 송신 또는 수신될 때 소정의 이점을 가지지만, 시스템 및 방법의 다른 양태는 특정 정보 전달 방식으로 제한되지 않는다. 예를 들어, 몇몇 양태에서, 정보는 디스크, 테이프, 플래시 드라이브, DVD 또는 CD-ROM과 같은 매체를 통해 전송될 수 있다. 다른 양태들에서, 정보는 비전자 포맷으로 전송될 수 있고 수동으로 시스템에 입력될 수 있다. 또한, 일부 기능들이 서버상에서 발생하고 다른 기능들은 클라이언트상에서 발생하는 것으로 표시되지만, 시스템 및 방법의 다양한 양태는 단일 프로세서를 갖는 단일 컴퓨터에 의해 구현 될 수 있다.
III. 실험예
하기는 본 발명을 수행하기 위한 특정 양태의 실시예이다. 실시예는 단지 예시적인 목적으로 제공되며, 본 발명의 범위를 어떤 식으로든 제한하려는 것이 아니다.
사용된 수치(예컨대, 양, 온도 등)와 관련하여 정확성을 기하기 위해 노력했지만, 일부 실험 오차 및 편차는 감안해야 한다.
실시예 1
통합된 숙주 유전자 발현 진단을 통한 세균성 감염 및 바이러스성 감염의 확고한 분류
서문
여기서, 세균성 감염과 바이러스성 감염을 구별할 수 있는 능력을 추가하여 패혈증 메타스코어(SMS)의 진단력을 향상시키고자 했다. 따라서 감염 유형을 구별하기 위한 새로운 바이오마커를 도출하기 위해, 세균성 감염 및 바이러스성 감염에 대한 숙주 반응을 비교하는 임상 마이크로어레이 코호트에 다중-코호트 분석 프레임워크를 적용했다. 다수의 코호트 중에서 유전자 발현 데이터를 공정규화하는 새로운 방법을 개발하여 다수의 코호트 중에서 진단 점수를 직접 비교할 수 있게 했다. 마지막으로, 임의의 출처의 급성 염증 환자가 기본 세균성 감염인지 여부를 결정할 수 있는 통합된 항생제 결정 모델(IADM)에 패혈증 메타스코어와 새로운 세균/바이러스 진단을 결합하였다.
결과
7-유전자 세균/바이러스 메타스코어의 유도
이전에 공개한 11-유전자 SMS는 세균성 감염과 바이러스성 감염을 확실하게 구별 할 수 없으며 세균성 감염과 바이러스성 감염이 있는 환자 사이의 점수 분포에 주로 유의미하지 않은 차이를 나타낸다(도 5a 및 5b). 이전에 바이러스성 감염에 대한 보존성 숙주 유전자 반응이 있음을 보였고15, 세균성 감염 대 바이러스성 감염에 대한 분류자가 개선된 진단 모델을 가능하게 할 것이라는 가설을 세웠다. 바이러스성 및/또는 세균성 감염 환자를 연구한 유전자 발현 마이크로어레이 코호트를 체계적으로 검색했다. 바이러스성 감염과 세균성 감염 모두가 있는 환자 수가 5명을 초과하여(N > 5) 포함하는 8개의 코호트11,18-26(전혈 및 PBMC 모두)를 확인하였다(표 1A). 8개의 코호트는 다수의 감염 부위를 갖는 소아 및 성인, 의료 및 수술 환자를 포함하여 426개의 환자 샘플(142개의 바이러스성 감염 및 284개의 세균성 감염)로 구성된다. 전술한 바와 같이(도 6) 7,15,16,27, 8개의 코호트에 다중-코호트 분석을 수행하였다. 리브-원-데이터 세트-아웃 라운드 로빈 분석(leave-one-dataset-out round-robin analysis)에서 2배 초과의 효과 크기 및 1% 미만의 FDR의 중요도 임계값을 설정했다. 그러나 조직 유형이 바이어스 결과가 아닌지 확인하기 위해, PBMC와 전혈 코호트 모두의 개별 분석에서 또한 1.5배 초과의 효과 크기를 가진 유전자만을 더 선택했다. 이 과정으로 72개의 유의미한 발현 유전자가 나타났다(보충 표 1). 이어서 진단을 위해 최적화된 유전자 세트를 찾기 위해 그리디 포워드 검색(greedy forward search)7을 사용하였고 7개의 유전자를 찾았다(바이러스성 감염에서 더 높은 유전자: IFI27, JUP, LAX1, 세균성 감염에서 더 높은 유전자: HK3, TNIP1, GPAA1, CTSB; 도 7). 예상한 대로, 이들 7개의 유전자에 기초한 '세균/바이러스 메타스코어어'는 발견 코호트 8개 모두에서 바이러스성 감염과 세균성 감염을 확고하게 구별하였다(요약 ROC AUC=0.97, 95% CI=0.89-0.99, 도 1a, 도 8).
다음으로 6개의 나머지 독립적 임상 코호트에서 7개의 유전자 세트를 시험하여13,14,28-30 세균성 감염 및 바이러스성 감염(총 341개 샘플, 세균성 138개 및 바이러스성 203개)을 직접 비교하였고, 요약 ROC AUC는 0.91(95% CI=0.82-0.96)임을 환인하였다(표 1B, 도 1b, 도 9). 시그니처 일반화 가능성의 시험으로서, LPS 또는 인플루엔자 바이러스로 시험관내에서 자극된 세포가 세균/바이러스 메타스코어(GSE5316631, N= 75 AUC=0.99)로 구분될 수 있는지를 시험하였다(도 10).
코코넛 공정규화를 통한 전체 검증
세균성 감염 또는 바이러스성 감염 중 하나를 연구한 공개 도메인에는 수십 개의 마이크로어레이 코호트가 있지만, 둘 다는 아니므로 세균성 및 바이러스성 질병을 구별하기 위한 진단력의 직접적인(데이터 세트 내) 추정은 배제된다. 이들 코호트에 걸쳐서 유전자 점수를 적용하고 비교하기 위해서는 병에 걸린 환자의 진단에 영향을 받지 않으면서 데이터 세트간 배치 효과를 제거할 수 있는 새로운 방법이 필요했다. 여기서 우리는 질병 샘플의 바이어스없는 보정을 얻기 위해 건강한 대조군에 대한 ComBat32 경험적 베이즈(Bayes) 정규화 방법을 사용하는 새로운 유형의 어레이 정규화를 설계하고 구현했다(COmbat CO-Normalization Using conTrols, 즉 '코코넛(COCONUT)'이라 부른 방법, 하기 방법 섹션, 및 도 11). 중요하게도 하우스키핑 유전자는 코코넛 공정규화 후에 질병 및 코호트 모두에 걸쳐서 불변하는 한편, 각각의 유전자는 여전히 각각의 데이터 세트 내의 질병군 및 대조군 사이에서 동일한 분포를 유지 한다(도 12a 및 12b). 본 방법은 모든 건강한 샘플이 동일한 분포에서 유래되었다고 가정하고, 상이한 면역 세포 유형마다 기준 유전자 발현 분포가 크게 다르기 때문에, 전혈과 PBMC 샘플을 나눈다. 코코넛 공정규화를 사용하여, 세균/바이러스 메타스코어가 발견 코호트에서 0.92(95% CI 0.89-0.96)의 전체 AUC를 갖는다는 것을 나타낼 수 있었다(도 2, 도 14의 사전-정규화 데이터). 그런 다음, 이 방법을 적용하여 포함 기준에 부합하고 전혈을 사용하는 모든 공개-도메인 마이크로어레이 코호트에서 (세균성 감염 또는 바이러스성 감염 중 하나(둘 다는 아님33-49)를 측정한 20개의 코호트와 대조 환자를 포함한 4개의 직접 검증 코호트를 포함, N=143+897=1,040) 세균/바이러스 메타스코어를 검사하였고, 이들 데이터 전체(표 2, 도 13, 도 15의 사전-정규화 데이터)에 걸쳐 전체 ROC AUC = 0.93(95% CI 0.91-0.94)을 보였다. 특히 주목할 것은 감염(그람 양성, 그람 음성, 비정형 세균, 일반 호흡기 바이러스, 및 뎅기열) 및 중증도(경미한 감염 내지 패혈증성 쇼크)의 광범위한 유형을 포함하는 다양한 범위의 임상 데이터이다. 따라서 모든 코호트(수평 점선으로 표시)에 걸쳐서 단일 컷오프를 설정할 수 있었다. 마지막으로, 이용 가능한 PBMC 검증 코호트(6개의 코호트50-54, N=259, 전체 AUC = 0.92 (95% CI 0.87-0.97, 도 16, 도 17의 사전-정규화 데이터)상에서 동일 과정을 별도로 수행하였다. 놀랍게도 코코넛 공정규화를 사용하는 모든 세 가지 전체 ROC AUC(발견 전혈 = 0.92, 검증 전혈 = 0.93, 검증 PBMC = 0.92)는 직접 검증 코호트(0.91)의 요약 AUC는 대략 일치하여 이 수준의 진단력에서 높은 신뢰도를 보였다.
보충 표 4는 발견 데이터 세트에서 그리디 포워드 알고리즘을 반복함으로써 얻어진 71개 유전자 세트로부터 선택된 2개의 유전자의 모든 조합에 대한 세균/바이러스 메타스코어를 나타낸다. 71개 유전자 세트의 모든 2-유전자 조합은 0.80 이상(≥0.80)의 획득 평균 AUC를 나타낸다. 비교하면 도 18은 무작위로 선택된 2-유전자 쌍 만(10,000) 개에 대한 발견 데이터 세트에서 평균 AUC의 분포를 나타내며, 우연만으로는 0.80 이상의 AUC를 달성할 수 없음을 나타낸다. 도 18에 도시된 바와 같이, 무작위로 선택된 2-유전자 쌍은 0.2 초과(> 0.20) 및 0.80 미만(<0.80)의 경계를 갖는 평균 AUC를 정규 분포시킨다. AUC가 0.80 이상(=0.80)인 보충 표 4에서 제공된 2-유전자 조합은 감염이 바이러스성인지 또는 세균성인지 여부를 임상적으로 유용하게 결정한다.
통합 항생제 결정 모델
주요 임상적 필요는 항생제의 신속하고 식별력 있는 투여가 환자 결과를 개선하는 데 중요하기 때문에 염증 징후와 증상이 있는 환자가 기본 세균성 감염인지 여부를 진단하는 것이다. SMS나 세균/바이러스 메타스코어만으로는 (1) 비감염성 염증, (2) 세균성 질병 및 (3) 바이러스성 질병의 세 가지 부류 모두를 확고하게 구별할 수 없다. 따라서 임상 관련성을 높이기 위해, 앞서 설명한 SMS7를 먼저 적용하여 감염의 존재에 대해 검사한 후, 감염에 대해 양성 반응을 나타내는 샘플을 세균/바이러스 메타스코어로 검사하는 "통합 항생제 결정 모델"(IADM)을 검사하였다(도 3A). 위와 같이, 전체 코호트에서 IADM의 검사 특성을 동시에 설정하는 유일한 방법은 코코넛 공정규화를 사용하는 것이다. 그러나 코코넛 공정규화 데이터에서의 SMS는 건강한 환자 또는 감염 환자 사이의 차이 또는 둘 모두의 차이로 인해 연령에 크게 영향을 받는다는 것을 발견했다(도 19a 및 19b). 따라서, IADM에서 영아(1세 미만의 소아)에 초점을 맞춘 코호트를 제외시켰으며 결과적으로 총 20개의 코호트(N=1,057)가 되었다. 이용 가능한 데이터에 걸쳐 SMS에 대해 생성된 전체 AUC는 0.86(95% CI 0.84-0.89)이었다(보충 표 2, 도 20a 및 20b). 95%의 감염에 대한 SMS 민감도와 95%의 세균성 감염에 대한 세균/바이러스 메타스코어 민감도에 대해 전체 임계값을 설정했다. 이는 세균성 감염에 대해 각각 94.0% 및 59.8%, 그리고 바이러스성 감염에 대해 각각 53.0% 및 90.6%의 전체 민감도 및 특이도를 나타냈다(도 3a-도 3c). 건강한 환자가 비감염 부류에 포함된다면 이는 대체로 변하지 않았다(도 21a 및 도 21b). 따라서, IADM에서 세균성 감염에 대한 전체 양성 및 음성 우도비(likelihood ratio)는 2.34(LR+) 및 0.10(LR-)이고, 프로칼시토닌(procalcitonin)의 새로운 메타-분석은 0.29의 음성 LR(95%CI 0.22-0.38)55을 보였다. NPV와 PPV 대 이들 검사 특성에 대한 유병률을 도시했고, 유병률 15%에서 세균성 감염에 대한 NPV와 PPV는 각각 98.3%와 29.2%이다(도 22).
비감염성 SIRS 환자와 세균성 질환 및 바이러스성 질환이 모두 있는 환자를 포함하나 건강한 대조군은 포함하지 않은 전체 진단에 추가되지 않는 단 하나의 데이터 세트 (GSE6399014)가 있었다. 따라서 국소적으로 유도된 검사 임계값으로 IADM을 검사했다. 전체 세균성 감염의 민감도와 특이도가 각각 94.3% 및 52.2%임을 발견했다(도 21a 및 도 21b).
나노스트링 검증
마지막으로, 소아 SIRS 및 패혈성 쇼크 조사의 유전체학(Genomics of Pediatric SIRS and Septic Shock Investigators: GPSSSI) 코호트(총 N=96이고, 36명의 SIRS, 49명의 세균성 패혈증, 및 11명의 바이러스성 패혈증 환자, 도 4a-도 4e)로부터 패혈증이 있는 소아로부터 독립적인 전혈 샘플에서 이러한 결과를 검증하기 위해 표적 나노스트링 n카운터(nCounter)56 유전자 발현 분석을 사용하였다. GPSSSI 코호트는 GSE66099 데이터 세트에서도 활용되었지만, 본원에서 프로파일된 소아는 마이크로어레이를 통해 프로파일되지 않았으므로 발견 데이터 세트의 일부가 아니다. 나노스트링 검증 코호트에서, SMS AUC는 0.81(GSE66099에서 AUC 0.80)이었다. 유사하게, 세균/바이러스 메타스코어 AUC는 0.84(GSE66099에서 AUC 0.83)이었다. 따라서, 마이크로어레이 AUC는 신규 환자에서 표적 유전자 발현 분석으로 검사했을 때 보존된다. 동일한 IADM을 적용했을 때 세균성 감염에 대한 민감도와 특이도는 각각 89.7%와 70.0%였고, 바이러스성 감염의 경우 각각 54.5%와 96.5%였다.
논의
입원 환자와 외래 환자 모두에서 급성 감염에 대한 더 나은 진단이 필요하다. 낮은 응급도(low-acuity)의 외래 환자 환경에서, 세균성 감염과 바이러스성 감염을 구별할 수 있는 간단한 진단은 적절한 항생제 용법을 돕기에 충분할 수 있다. 높은 응급도 환경에서는 비감염성 염증의 원인이 배제되는 것이 중요하므로 항생제 처방을 위한 의사 결정 모델에는 비감염(건강하지 않은) 사례가 포함되어야 한다. 따라서, 신뢰할 수 있는 진단은 세 가지 사례(비감염성 염증, 세균성 감염 및 바이러스성 감염)를 구별할 필요가 있다. 여기에 8개 코호트의 426개 샘플을 사용하여 독립적인 코호트(1,299명의 환자로 구성된 총 30개 코호트)의 광범위한 임상 조건에 걸쳐서 세균성 감염과 바이러스성 감염을 정확하게 구별할 수 있는 단지 7개 유전자의 세트를 얻었다. (감염 유무를 구분하기 위한) 이전의 패혈증 메타스코어와 (감염 유형을 결정하기 위한) 새로운 세균/바이러스 메타스코어를 통합된 단일 항생제 결정 모델에 결합시킴으로써 어떤 환자에게 항생제가 이로울 지를 높은 정확도로 결정할 수 있음을 더 입증하였다. 마지막으로, 표적 나노스트링 분석을 사용하여 독립적인 샘플에서 7-유전자 세트와 IADM 둘 다의 진단력을 확인하여 마이크로어레이에 의존하지 않을 때 시그니처가 진단력을 유지한다는 것을 보여 주었다.
IADM은 낮은 음성 우도비(0.10)와 높은 NPV 추정치를 가지며, 이는 배제 검사로 잠재적으로 효과적일 수 있음을 의미한다. 특히, 30개의 연구에서 3,244명의 환자를 포함하는 프로칼시토닌의 메타-분석은 전체 추정 음성 우도비가 0.29(95% CI 0.22-0.38)55를 보였다. 따라서, IADM 음성 우도비는 프로칼시토닌 추정치보다 현저히 낮다. 또한 이들 검사 특성은 환자에 대한 지식이 없는 것으로 가정한 것이므로 그러한 검사의 현실 세계 임상 유용성에 대한 추정치일 뿐이다. 병력 및 건강 진단, 생명 징후, 및 실험값은 모두 진단을 도울 것이다. 심지어 이들 기준을 고려하여, 병원내 감염에 대한 ICU 환자를 선별하는 최근의 경제적 의사 결정 모델은 세균성 감염과 바이러스성 감염을 정확하게 진단할 수 있는 IADM과 같은 검사는 비용 효과적일 수 있다고 제안했다57. 궁극적으로, 중재적 임상 시험만이 새로운 진단의 비용 효율성과 임상 유용성을 확립할 수 있을 것이다.
나노스트링 분석을 사용하여 GPSSSI 코호트에서 소아 패혈증 환자에 대한 진단을 검증했다. 나노스트링은 매우 정확하며 한 번에 다수의 유전자 발현 수준을 측정하는 데 유용한 도구이지만, 임상 적용에는 너무 느릴 수도 있다(분석 당 4-6시간). 따라서, 분석을 통해 우리의 유전자 세트가 표적화된 측정에서 확고하다는 것을 확인했지만, 처리 시간을 개선하기 위해서는 추가 작업이 필요할 것이다. 신속한 다중 qPCR을 기반으로 한 최종 상용 제품에는 여러 가능성이 있다. 그러나, 이 기술적 장애물은 임상적 관련성을 얻기 위해 모든 유전자 발현 감염 진단이 극복해야 하는 것이다.
몇몇 그룹은 숙주 유전자 발현에 기초하여 감염을 진단하기 위한 모델을 발표했지만, 아직 임상 실습을 하지 못했다. 대부분의 선행 분류기는 여러 독립적인 코호트에서 시험되지 않았거나, 유용한 진단을 위해 필요한 신속한 프로파일링을 허용하는 유전자가 너무 많았거나 둘 다에 해당하였다. 예를 들어, Suarez 등은 10-유전자 K-가장 가까운-이웃 분류자를 만들었지만, 공개 데이터 세트(GSE60244) 외부에서는 검사하지 않았다13. Tsalik 등은 다중 회귀 모델에 기초하여 122-프로브(120개 유전자) 분류자를 만들었지만, 외부 GEO 코호트에서 검사 시, 그들 각각의 새로운 데이터 세트에서 그들의 회귀 계수를 재훈련하였다14. 이러한 모델 재훈련은 (최종 모델이 국소적으로 재훈련되지 않는다고 가정할 때) 이들 검증 숫자에 강한 상향 편향을 초래하거나, 각각의 새로운 임상 현장이 구현 이전 모델을 훈련시키기 위한 대규모의 예상 코호트를 수집해야 한다고 제안한다. 다른 그룹은 패혈증에 대한 유전자 발현 분류자를 만들었지만, 바이러스성 감염을 식별하기 위한 모델을 포함하지 않았다7,9,10. 새로운 IADM은 광범위한 질병 유형 및 중증도에 걸쳐 확고하지만 바이러스성 감염에 대한 민감도는 상대적으로 낮다. 비유전자 발현 바이오마커는 감염 진단에도 사용되어 왔다. 프로칼시토닌이 패혈증 진단의 설정에서 광범위하게 연구되어 왔지만, 비감염 개인과 바이러스성 감염을 가진 개인을 구별할 수 없다58. 단백질-패널 분석은 바이러스성 감염과 세균성 감염을 식별하는 것으로 나타났지만, 비감염성 염증 환자를 식별할 수 없다59,60. 따라서 이러한 모든 분류자는 추가적인 예비 검사와 직접 비교를 통해 더욱 명확해지는 특정한 강점과 약점이 있다.
이 연구에서의 목표는 새로운 바이오마커를 확인하는 것이지 반드시 새로운 생물학을 확인하는 것은 아니었지만, 바이오마커 세트가 생물학적 타당성을 갖는 것은 여전히 중요하다. 세균/바이러스 메타스코어에서 7개 유전자 중 6개는 이전에 감염 또는 백혈구 활성화와 연관되어 있었다. IFI27 및 JUP 모두 단일 코호트 게놈 전체의 발현 연구에서 바이러스성 감염에 반응하여 유도되는 것으로 나타났지만52,61, TNIP1 및 CTSB는 세균성 감염에 대한 괴사 반응 및 NF-kB를 조절하는 데 중요한 것으로 나타났다62,63. 마지막으로, (바이러스성 감염에서 상향 조절된) LAX1은 T-세포와 B-세포의 활성화에 관여하지만64, HK3은 호중구의 분화 경로에서 중요한 역할을 한다65. 따라서, 감염 유형에 대한 바이오마커로서의 이들 전사체의 역할은 신규한 것이지만, 전례가 없는 것은 아니다.
여기서 우리는 새로운 진단 방법을 벤치마킹하기 위해 사용할 수없는 막대한 한 부류의 코호트 풀에서 모델을 직접 비교하는 새로운 방법인 코코넛에 의존했다. 코코넛은 모든 대조군 동일한 분포에서 온 것으로 가정한다, 즉 각각의 대조군에 속한 유전자는 유전자군으로부터 경험적으로 배운 묶음 파라미터로 동일한 평균 및 분산을 갖도록 재설정된다. 이 방법은 코호트 간의 마이크로어레이 및 일괄 처리 차이점을 보정하므로 단일 임계값으로 전체 ROC 곡선을 생성할 수 있다. 이 방법은, 하나의 컷오프가 상이한 코호트에서 동일한 검사 특성에 이를 수 없으므로, 여러 검증 ROC 곡선을 단순히 보고하는 것보다 진단력에 대한 보다 '현실 세계(real-world)' 측정이다16. 코코넛 공정규화 데이터의 가장 중요한 결론은 코호트 내에서의 직접 비교에서 요약 AUC와 유사한 전체 AUC가 있으면서, 세균/바이러스 메타스코어와 IADM 모두 매우 광범위한 감염 유형과 중증도에 걸쳐 진단력을 유지한다는 것이다.
전체적으로 보아, 입증된 다중-코호트 분석 파이프라인을 활용하여 감염 진단을 개선하기 위한 매우 확고한 모델을 도출했다. 새로운 방법을 사용하여 수십 개의 독립 마이크로어레이 코호트에서 이를 검증할 수 있었다. 또한 소아 패혈증 환자에서 표적 나노스트링 분석을 사용하여 검증했다. IADM은 앞으로의 중재적 임상 시험뿐만 아니라 신속한 처리를 위한 최적화를 계속 해야 하지만, 호스트 게놈의 분자 프로파일링이 향후 임상 도구의 일부가 될 것은 확실해 보인다.
당업자는 세균/바이러스 메타스코어에 대한 대체 방법이 세균성 감염 및 바이러스성 감염을 구별할 수 있는 분류자를 개발하는 데 사용될 수 있음을 이해할 것이다. 당업계에 공지된 임의의 기계 학습 방법이 분류자를 개발하는 데 사용될 수 있다. 분류자를 개발하는 방법은 로지스틱 회귀(logistic regression), 서포트 벡터 머신(support vector machines), 랜덤 포레스트(random forest) 및 그래디언트 부스팅 결정 트리(gradient boosted decision trees)와 같은 의사 결정 트리와 같은 다수의 알고리즘으로 구성된 앙상블 알고리즘을 포함할 수 있다. 분류는 계층으로 배열된 다수의 노드를 포함하는 신경망을 사용하여 개발될 수 있는데, 여기서 첫 번째 계층의 노드로부터의 출력은 다음 계층의 노드에 대한 입력으로 사용된다. 대안으로, 분류는 공간에서의 점으로서의 예시를 나타내는 서포트 벡터 머신 모델을 사용하여 개발될 수 있고, 개별 카테고리의 예시가 가능한 넓은 간격으로 명확하게 구분되도록 맵핑될 수 있다. 그런 다음, 새로운 예시가 동일한 공간에 맵핑되고 새로운 예시가 해당되는 갭(gap)의 측면에 기초하여 카테고리에 속하는 것으로 예측된다. 당업자는 임의의 수의 기계 학습 알고리즘이 세균성 감염 및 바이러스성 감염을 구별할 수 있는 분류를 개발하는 데 사용될 수 있음을 이해할 것이다.
방법
체계적인 검색 및 다중-코호트 분석
NIH GEO와 EBI ArrayExpress에서 bact[와일드 카드], vir[와일드 카드], 감염, 패혈증, SIRS, ICU, 병원내 감염, 발열, 폐렴이라는 검색 용어를 사용하여 공개된 인간 마이크로어레이 전체 게놈 발현 연구를 수행했다. (1) 비임상, (2) 전혈 또는 PBMC 이외의 조직을 사용하여 수행된 연구, 또는 (3) 임상 시간 동안 일치하지 않은 환자를 비교하는 모든 연구를 제거하기 위해 초록을 선별했다.
모든 마이크로어레이 데이터는 표준화된 방법을 사용하여 원 데이터(이용 가능한 경우)로부터 재정규화되었다. Affymetrix 어레이는 (완전 일치 프로브가 있는 어레이상에서) gcRMA 또는 RMA를 사용하여 재정규화되었다. Illumina, Agilent, GE 및 기타 상업용 어레이는 정상-기하 급수적 백그라운드 보정 후 변위치(quantile) 정규화를 통해 재정규화되었다. 맞춤 어레이는 재정규화되지 않았다. 데이터를 log2로 변환하고 고정 효과 모델을 사용하여 각 연구 내에서 유전자에 대한 프로브를 요약했다. 각 연구 내에서, 상이한 마이크로어레이 유형으로 분석된 코호트는 독립적으로 취급되었다.
이전에 기술된 바와 같이, 다중-코호트 메타 분석을 수행하였다7,15,16,27. 간단히 말하면, 헤지스 g를 사용하여 유전자를 요약하고, DerSimonian-Laird 무작위 효과 모델을 메타 분석에 사용한 후, Benjamini-Hochberg 다중 가설 보정을 사용했다66. 세균성 감염 환자는 연구에서 바이러스성 감염 환자와 비교한 결과, 양성 효과 크기는 바이러스에 감염된 환자에서 유전자가 더 많이 발현되었음을 나타내고 음성 효과 크기는 세균에 감염된 환자에서 유전자가 더 많이 발현되었음을 나타낸다.
세균성 감염과 바이러스성 감염 사이의 차등 발현에서 고도로 보존된 유전자 세트를 찾기 위해, 세균성 감염 및 바이러스성 감염이 있는 환자를 직접 비교한 모든 코호트를 선택했다. 문서화된 공동 감염이(즉, 세균성 및 바이러스성 둘 모두) 있는 환자는 제외되었다. 코호트는 메타 분석에 포함될 각 군당 5명 초과의 환자를 요구했다. PBMC와 전혈 코호트가 모두 포함되었다. 유의미한 유전자는 리브-원-데이터 세트-아웃 라운드 로빈 분석에서 효과 크기가 2배 초과이고 FDR이 1% 미만인 유전자였다. 그러나, 두 가지 조직 유형 모두 최종 유전자 세트에 표현되도록 하기 위해 PBMC와 전혈 코호트에 대한 별도의 메타 분석을 수행하였고 각 조직 유형에서 별도로 효과 크기가 1.5배 미만인 모든 유전자를 제거했다. 나머지 유전자는 유의미한 것으로 간주되었다.
7-유전자 세트의 유도
전술한 바와 같이, 고도의 진단 유전자 세트를 찾기 위해 메타 분석에서 유의미한 유전자를 그리디 포워드 검색을 통해 실행하였다7. 간단히 말해서, 새로운 유전자가 발견 AUC를 일부 임계값을 초과하여 더 향상시킬 수 없을 때 까지, 이 알고리즘은 0개 유전자로 시작하여 매 주기마다 발견 코호트에서 진단을 위한 AUC를 가장 잘 향상시키는 유전자 하나를 추가한다. 생성 유전자는 '바이러스' 반응 유전자의 기하 평균에서 '세균' 반응 유전자의 기하 평균을 뺀 것과 각각의 세트에서 유전자 수의 비율의 곱으로 계산된 단일 '세균/바이러스 메타스코어'를 계산하는 데 사용된다. 그런 다음, 생성 연속 점수를 ROC 곡선을 사용하여 진단력에 대해 검사할 수 있다.
추가 유전자 세트의 유도
추가 진단 유전자 세트를 확인하기 위해, 알고리즘의 결론에서, 생성 진단 유전자 세트가 가능한 중요한 유전자 세트에서 제거되고 알고리즘이 다시 실행되는 반복적인 그리디 포워드 검색을 구현했다. 첫 번째 유전자 세트는 추가 검증을 위해 취해졌지만, 다른 유전자 세트는 발견 코호트에서 유사하게 수행되는 것으로 나타났다(보충 표 3).
7-유전자 세트의 직접 검증
생성 유전자 세트를 세균성 감염과 바이러스성 감염을 직접 비교했지만 너무 작아서 메타 분석에는 사용할 수 없는 나머지 공개 유전자 발현 코호트에서 우선 검증하였다. 두 개의 코호트(GSE6024413 및 GSE6399014)는 메타 분석이 완료된 후 공개되었으며 검증을 위해 사용되었다. 일반화 가능성을 보이기 위해, 단핵구-유래 수지상 세포에서 LPS와 인플루엔자 노출을 비교한 대형 시험관내 데이터 세트를 조사했으나, 이는 임상 연구와 동일한 분포에서 온 것으로 기대하지 않기 때문에 요약 AUC에는 포함시키지 않았다.
요약 ROC 곡선
발견 및 검증 코호트 모두에서, 요약 ROC 곡선은 Kester 및 Buntinx67의 방법에 따라 생성하였고, 전술하였다16. 간단히 말하면, 선형-지수 모델은 각각의 ROC 곡선으로 만들어지며, 이러한 개별 곡선의 파라미터는 전체 요약 ROC 곡선 파라미터를 추정하기 위해 무작위 효과 모델을 사용하여 요약된다. 알파 파라미터는 AUC(특히 일치 선으로부터의 거리)를 제어하며 베타 파라미터는 ROC 곡선의 비틀림을 제어한다. 요약 AUC 신뢰 구간은 메타 분석에서 알파와 베타의 표준 오차로부터 추정된다.
코코넛 공정규화
세균성 감염 또는 바이러스성 감염 중 하나에 걸렸지만 둘 다 걸린 것은 아닌 환자를 프로파일링하는 수십 개의 공개 마이크로어레이 코호트가 있다. 이들 코호트에 걸쳐서 유전자 점수를 비교할 수 있는 것이 유리할 지도 모르지만, 각각의 상이한 마이크로어레이가 각각의 유전자에 대해 서로 다른 백그라운드 측정 값을 가지기 때문에 가능하지 않았으며 동일한 유형의 마이크로어레이를 사용하는 연구에서 큰 배치 효과가 있기 때문에 가능하지 않았다. 이들 데이터를 사용하기 위해서, 다음과 같은 방식으로 이들 코호트를 공정규화할 필요가 있었다: (1) 최종 분류에 영향을 미칠 수 있는 편견이 개입되지 않도록(즉, 정규화 프로토콜이 진단에 맹목적이어야 함), (2) 연구 내에서 유전자 분포에 변화가 없어야 하며, (3) 유전자는 정규화 후에 연구 간에 동일한 분포를 보여야 한다. 이러한 특성을 가진 방법은 우리의 유전자 점수가 다수의 연구에 걸쳐서 계산되고 비교될 수 있게 함으로써 이의 일반화 가능성을 광범위하게 검사할 수 있게 한다.
ComBat 경험적 베이즈 정규화 방법32은 크로스-플랫폼 정규화로 인기가 있지만, 질병의 상태에 걸쳐 동일한 분포를 가정하기 때문에 결정적으로 원하는 기준에 못 미친다. 상이한 코호트의 대조 샘플을 동일한 코호트의 질병 샘플과 직접 비교할 수 있도록 대조 샘플을 공정규화하는 ComBat 방법의 변형 버전을 개발했다. 우리는 이 방법을 COmbat CO-Normalization Using conTrols, 즉 '코코넛(COCONUT)'이라고 부른다. 코코넛은 한 가지 강력한 가정을 하는데, 이는 상이한 코호트의 대조/건강한 환자가 동일한 분포를 나타내도록 강제한다는 것이다. 간단히 말해서, 모든 코호트는 건강한 성분과 질병 성분으로 나뉘어져 있다. 건강한 성분은 공변량없이 ComBat의 공정규화를 받는다. ComBat 추정 파라미터인
Figure pat00001
,
Figure pat00002
,
Figure pat00003
,
Figure pat00004
, 및
Figure pat00005
가 건강한 성분에 대한 각각의 데이터 세트에 대해 얻어진 다음 질병 구성 요소에 적용된다(도 10). 이는 모든 코호트의 질병 성분이 동일한 백그라운드 분포에서 나오지만 건강한 성분과의 상대적 거리가 유지되게 한다(데이터 세트 내의 T-통계량은 부동 소수점 계산으로 인해 코코넛후에만 다름). 중요한 것은 질병 분류(즉, 세균성 감염 또는 바이러스성 감염)에 대한 어떤 선험적(priori) 지식도 요구하지 않기 때문에 사전 지정된 기준을 충족시키는 것이다. 이 방법은 다른 사용 가능한 데이터와 함께 풀이 되기 위해 건강한/대조 환자가 데이터 세트에 존재해야 한다는 중요한 요구 사항을 가지고 있다. 또한, 건강한/대조 환자는 동일한 분포로 설정되기 때문에, 그러한 가정이 합리적일 때만 사용해야한다(즉, 동일한 조직 유형 내에서, 동일한 종 중에서 등).
ComBat 모델과 코코넛 방법
Johnson 등이 기술한 바와 같이, ComBat 모델은 먼저 유전자 발현을 위한 보통 최소 제곱 모델(ordinary least squares model)을 먼저 푼 후, 경험적 베이즈 추정량(empiric Bayes estimator)을 사용하여 생성 파라미터를 축소하여 반복적으로 풀어냄으로써 각각의 유전자의 위치와 크기를 보정한다32. 공식으로 나타내면, 각각의 유전자 발현 수준 Yijg(i번째 묶음에서 샘플 j에 대한 유전자 g)는 전체 유전자 발현
Figure pat00006
, 회귀 계수
Figure pat00007
, 첨가 및 배가 배치 효과(multiplicative batch effect)
Figure pat00008
및
Figure pat00009
을 갖는 샘플 조건 X의 설계 행렬, 및 오차항
Figure pat00010
으로 구성되는 것을 가정한다:
Figure pat00011
보통 최소 제곱 회귀를 사용하여 파라미터를 추정하면 Yijg를 새로운 항 Zijg(여기서,
Figure pat00012
는
Figure pat00013
의 표준 편차)로 표준화한다.
Figure pat00014
이하 표준화 데이터는 다음에 따라 분포된다.
Figure pat00015
역 감마는 사전에 표준 정보가 없는 것으로 간주된다. 나머지 하이퍼파라미터(hyperparameter)는 경험적으로 추정되며 유도 및 해는 원래의 참조에서 발견된다32. 그런 다음 추정된 배치 효과
Figure pat00016
및
Figure pat00017
가 표준화된 데이터를 경험적-베이즈 일괄-조정 최종 출력
Figure pat00018
에 따라 조정하는 데 사용될 수 있다:
Figure pat00019
이 방법(코코넛)의 수정된 버전에서, 위의 모든 사항은 수정 없이 원래의 방법에 따라 수행된다. 그러나 이것은 각 데이터 세트에서 건강한/대조 환자에게만 적용된다(즉, Y는 건강한 환자 샘플의 행렬임). 추정된 파라미터
Figure pat00020
,
Figure pat00021
,
Figure pat00022
,
Figure pat00023
및
Figure pat00024
는 모두 취해져서 (Y와 동일한 방식으로 정렬되어야 하는) 질병인 환자 샘플로만 구성된 행렬 D에 직접 적용된다.
Figure pat00025
Figure pat00026
따라서 건강한 대조군 사이의 차이를 보정하는 질병 샘플 D*의 일괄-보정 버전을 얻을 수 있지만, 각 Yi에 대하여 각각의 부분 행렬 Di를 변경하지 않는다.
전체 ROC
코코넛 공정규화를 사용하여 (1) 모든 발견 코호트와 (2) 모든 검증 코호트, 심지어 오직 세균성 질병 또는 오직 바이러스성 질병만 포함하는 집단을 검사했다. 위에서 설명한 이유로 PBMC와 전혈 데이터에 대해 이 작업을 별도로 수행했다. 공정규화 후, 개별 코호트의 분포를 직접 비교할 수 있도록 함께 도시했다. 각각의 플롯에 대해 (1) 각 데이터 세트의 점수 분포, (2) 진단 검사에서 각각의 유전자에 대한 정규화된 유전자 발현 수준, (3) 메타 분석에 기초한 분류 간의 차이를 보이지 않을 것으로 예상되는 하우스키핑 유전자를 나타낸다. 건강한 환자는 이 플롯에서 제외되었다. 그러나, 코코넛 공정규화 후에 코호트 내의 건강한 환자와 질병이 있는 환자 간의 유전자 분포가 변하지 않는다는 것을 보여주기 위해, 표적 유전자 및 하우스키핑 유전자 모두가 있는 환자 유형 모두를 플롯에 도시하였다(도 11). 메타 분석에서 최소 효과 크기와 최소 분산을 가진 유전자를 하우스키핑 유전자로 선택했다.
각각의 비교에 있어서, 단일 전체 ROC AUC가 계산되고 검사의 현실 세계 진단 성능을 추정할 수 있도록 단일 임계값이 설정된다. 세균성 감염 대 바이러스성 감염에 대한 컷오프의 임계값은 세균성 감염 거짓 음성(즉, 항생제가 필요할 때 항생제를 주지 않는 것을 추천)이 파괴적일 수 있기 때문에 세균성 감염에 대한 민감도를 대략 90%로 설정했다.
통합 항생제 결정 모델
SMS는 중증 급성 감염 환자를 다른 원인의 염증 환자와 구별 할 수 있지만, 감염 유형을 구별할 수는 없다(도 5a 및 도 5b). 따라서 11-유전자 SMS가 적용된 통합 항생제 결정 모델(IADM)을 검사한 후, 7-유전자 세균/바이러스 메타스코어를 검사했다. 따라서 이 모델은 (1) 환자가 감염된 것인지 여부와 (2) 그렇다면 어떤 유형의 감염(세균성 또는 바이러스성)인지를 확인한다. 건강한 대조군을 포함하는 비감염성 염증 환자와 충분한 검증 코호트를 식별할 수 없었기 때문에, 발견 및 검증 코호트 모두를 사용하여 전체 ROC를 구축했다. 코코넛 공정규화를 사용하여, 포함된 모든 코호트에 걸쳐서 전체 임계값을 설정하고 이를 각각의 개별 데이터 세트에 적용하여 IADM이 비감염성 염증, 세균성 감염 및 바이러스성 감염 환자를 정확하게 구별할 수 있는지 검사했다. 건강한 환자는 공정규화 과정에서 사용되었기 때문에 진단 부류로 포함되지 않았다. IADM은 또한 건강한 대조군이 없는 모든 코호트에 개별적으로 적용되었지만 (1) 비감염성 SIRS 환자와 (2) 세균성 감염 및 바이러스성 감염 환자 모두를 포함했다.
양성 예측도(PPV)와 음성 예측도(NPV)는 유병률에 따라 달라지며 본원에 사용된 데이터의 유병률은 병원 환경에서의 감염 유병률과 일치하지 않기 때문에 통합 항생제 결정 모델로 얻은 세균성 감염에 대한 민감도와 특이도를 기초로 하여 PPV 및 NPV 곡선을 계산했다. 공식으로 나타내면, NPV = 특이도 x (1-유병률) / ((1-민감도) x 유병률 + 특이도 x (1-유병률)); PPV = 민감도 x 유병률 / (민감도 x 유병률 + (1-특이도) x (1-유병률)).
나노스트링 검증
마지막으로, 나노스트링56 디지털 다중 유전자 정량 분석을 사용하여, 소아 SIRS 및 패혈성 쇼크 조사의 유전체학18-22으로부터 독립적인 환자의 96개 샘플(즉, 마이크로어레이를 통해 프로파일되지 않은 것)을 검사하였다. 18개의 유전자는 어떤 하우스키핑 유전자에 대해서도 재정규화되지 않았다. SMS와 세균/바이러스 메타스코어 유전자는 모두 분석되었고, IADM의 진단 성능이 계산되었다.
모든 분석은 R 통계 계산 언어(버전 3.1.1)에서 수행되었다. 다중-코호트 메타 분석을 재작성하기 위한 코드는 이전에 기탁되었으며 khatrilab.stanford.edu/sepsis에서 입수할 수 있다.
표 1 세균/바이러스 메타스코어의 발견 및 직접 검증에 사용되는 데이터 세트. CAP: 지역 사회 획득성 폐렴. PICU: 소아과 중환자실. RSV: 호흡기 세포융합 바이러스. CMV: 거대 세포 바이러스. MPV: 메타뉴모바이러스.
Figure pat00027
표 2 포함 기준에 부합하고 알려진 단일 병원균 유형(바이러스성 또는 세균성)을 갖는 검증 데이터 세트. PICU: 소아과 중환자실. RSV: 호흡기 세포융합 바이러스. LRTI: 하기도 감염. DHF: 뎅기 출혈열. DSS: 뎅기열 쇼크 증후군.
Figure pat00028
Figure pat00029
보충 표 1. 다중 코호트 분석에서 유의미한 (q<0.01, PBMC와 전혈 모두에서 별도로 ES>전체 2배 및 ES>1.5배) 것으로 발견된 모든 유전자의 목록.
Figure pat00030
Figure pat00031
Figure pat00032
보충 표 2. IADM을 검사하기 위해 사용된 비감염성 염증 질환이 있는 데이터 세트. 다른 데이터 세트는 표 1 & 2에 나열되어 있다. ICU: 중환자실. CAP: 지역 사회 획득성 폐렴. SLE: 전신성 홍반성 루푸스.
Figure pat00033
보충 표 3. 반복적인 그리디 포워드 검색 알고리즘을 사용하여 확인된 진단 유전자 세트.
Figure pat00034
보충표 4. 2-유전자 조합에 대한 곡선 아래 평균 면적(AUC). 각각의 2-유전자 세트는 반복적인 그리디 포워드 검색(71개 유전자 풀)에 의해 발견된 유전자 세트에서 추출되었다. AUC는 발견 데이터 세트의 평균 AUC이다. 평균 AUC가 0.80 이상인 두 가지 유전자 조합만 표시된다.
Figure pat00035
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본 발명의 바람직한 구현예가 도시되고 설명되었지만, 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않으면서 그 안에서 다양한 변경이 가능하다는 것이 이해될 것이다.

Claims (41)

  1. 환자의 감염을 진단하는 방법으로서,
    a) 환자의 생물학적 샘플에서 적어도 2개의 바이오마커의 발현 수준을 측정하는 단계(상기 적어도 2개의 바이오마커는 보다 높은 수준의 발현이 세균성 감염을 나타내는 제1 세트의 바이오마커 및 보다 높은 수준의 발현이 바이러스성 감염을 나타내는 제2 세트의 바이오마커 중 하나 또는 둘 다로부터 선택되며, 상기 제1 세트의 바이오마커는 TSPO, EMR1, NINJ2, ACPP, TBXAS1, PGD, S100A12, SORT1, TNIP1, RAB31, SLC12A9, PLP2, IMPA2, GPAA1, LTA4H, RTN3, CETP, TALD01, HK3, ACAA1, CAT, DOK3, SORL1, PYGL, DYSF, TWF2, TKT, CTSB, FLII, PROS1, NRD1, STAT5B, CYBRD1, PTAFR, 및 LAPTM5 중 적어도 하나를 포함하고, 상기 제2 세트의 바이오마커는 OAS1, IFIT1, SAMD9, ISG15, HERC5, DDX60, HESX1, IFI6, MX1, OASL, LAX1, IFIT5, IFIT3, KCTD14, OAS2, RTP4, PARP12, LY6E, ADA, IFI44L, IFI27, RSAD2, IFI44, OAS3, IFIH1, SIGLEC1, JUP, STAT1, CUL1, DNMT1, IFIT2, CHST12, ISG20, DHX58, EIF2AK2, XAF1, 및 GZMB 중 적어도 하나를 포함함); 및
    b) 바이러스성 또는 세균성 감염을 알아내기 위해 상기 바이오마커에 대한 각각의 기준값 범위와 함께 각각의 바이오마커의 발현 수준을 분석하는 단계를 포함하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 적어도 2개의 바이오마커는 SIGLEC1 및 SLC12A9를 포함하는 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 적어도 2개의 바이오마커의 발현 수준은 적어도 0.80의 수신자 조작 특성(receiver operating characteristic) 곡선 아래 면적을 제공하는 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 세트의 바이오마커는 HK3, TNIP1, GPAA1 및 CTSB 중 적어도 하나를 포함하고; 상기 제2 세트의 바이오마커는 IFI27, JUP 및 LAX1 중 적어도 하나를 포함하는 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생물학적 샘플은 전혈 또는 말초 혈액 단핵 세포(PBMCS)를 포함하는 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바이오마커의 수준은 감염 또는 비감염 대상에 대한 시간-일치 기준값과 비교되는 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바이오마커의 수준에 기초하여 상기 환자에 대한 세균/바이러스 메타스코어(metascore)를 계산하는 단계를 더 포함하되, 상기 환자에 대한 양성 세균/바이러스 메타스코어는 상기 환자가 바이러스성 감염인 것을 나타내고, 상기 환자에 대한 음성 세균/바이러스 메타스코어는 상기 환자가 세균성 감염인 것을 나타내는 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 코코넛(COCONUT) 정규화를 사용하여 데이터를 정규화하는 단계를 더 포함하되, 코코넛 정규화는 하기 a)-d) 단계를 포함하는 방법.
    a) 다수의 코호트로부터의 데이터를 건강 및 질병 성분으로 분리하는 단계;
    b) 공변량 없이 ComBat 공정규화를 사용하여 건강 성분을 공정규화하는 단계;
    c) 상기 건강 성분에 대한 각각의 데이터세트에 대해 ComBat 추정 파라미터를 얻는 단계; 및
    d) 상기 ComBat 추정 파라미터를 상기 질병 성분에 적용하는 단계.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 환자는 인간인 방법.　
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바이오마커의 수준을 측정하는 단계는 형광, 화학 발광, 또는 전기 신호 검출을 통한 마이크로어레이 분석법, 중합 효소 연쇄 반응(PCR), 역전사 중합 효소 연쇄 반응(RT-PCR), 디지털 미세방울 PCR(ddPCR), 고체 상태 나노 기공 검출법, RNA 스위치 활성화, 노던 블롯 또는 유전자 발현 연속 분석법(SAGE) 등을 포함하여 하나 이상의 방법을 수행하는 단계를 포함하는 방법.　
  11. 염증을 갖는 환자를 진단하고 치료하는 방법으로서,
    a) 상기 환자의 생물학적 샘플에서 IFI27, JUP, LAX1, HK3, TNIP1, GPAA1, CTSB, CEACAM1, ZDHHC19, C9orf95, GNA15, BATF, C3AR1, KIAA1370, TGFBI, MTCH1, RPGRIP1 및 HLA-DPB1 바이오마커의 발현 수준을 측정하는 단계;
    b) 상기 바이오마커에 대한 각각의 기준값과 함께 각각의 바이오마커의 발현 수준을 우선 분석하는 단계(비감염 대조 대상의 상기 바이오마커에 대한 상기 기준값 범위와 비교하여 CEACAM1, ZDHHC19, C9orf95, GNA15, BATF, 및 C3AR1 바이오마커의 증가된 발현 수준과 KIAA1370, TGFBI, MTCH1, RPGRIP1, 및 HLA-DPB1 바이오마커의 감소된 발현 수준이 상기 환자가 감염된 것을 나타내고, 비감염 대조대상과 비교하여 상기 CEACAM1, ZDHHC19, C9orf95, GNA15, BATF, C3AR1, KIAA1370, TGFBI, MTCH1, RPGRIP1, 및 HLA-DPB1 바이오마커의 차등 발현의 부재는 상기 환자가 감염되지 않은 것을 나타냄); 및
    c) 환자의 생물학적 샘플에서 적어도 2개의 바이오마커의 발현 수준을 더 분석하는 단계를 포함하되, 상기 적어도 2개의 바이오마커는 보다 높은 수준의 발현이 세균성 감염을 나타내는 제1 세트의 바이오마커 및 보다 높은 수준의 발현이 바이러스성 감염을 나타내는 제2 세트의 바이오마커 중 하나 또는 둘 다로부터 선택되며, 세균성 또는 바이러스성 감염을 결정하기 위하여, 상기 제1 세트의 바이오마커는 TSPO, EMR1, NINJ2, ACPP, TBXAS1, PGD, S100A12, SORT1, TNIP1, RAB31, SLC12A9, PLP2, IMPA2, GPAA1, LTA4H, RTN3, CETP, TALD01, HK3, ACAA1, CAT, DOK3, SORL1, PYGL, DYSF, TWF2, TKT, CTSB, FLII, PROS1, NRD1, STAT5B, CYBRD1, PTAFR, 및 LAPTM5 중 적어도 하나를 포함하고, 상기 제2 세트의 바이오마커는 OAS1, IFIT1, SAMD9, ISG15, HERC5, DDX60, HESX1, IFI6, MX1, OASL, LAX1, IFIT5, IFIT3, KCTD14, OAS2, RTP4, PARP12, LY6E, ADA, IFI44L, IFI27, RSAD2, IFI44, OAS3, IFIH1, SIGLEC1, JUP, STAT1, CUL1, DNMT1, IFIT2, CHST12, ISG20, DHX58, EIF2AK2, XAF1, 및 GZMB 중 적어도 하나를 포함하는 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 환자에 대한 패혈증 메타스코어를 계산하는 단계를 더 포함하되, 비감염 대조 대상에 대한 상기 기준값 범위보다 더 높은 패혈증 메타스코어는 상기 환자가 감염된 것을 나타내고, 비감염 대조 대상의 상기 기준값 범위 내의 패혈증 메타스코어는 상기 환자가 비감염성 염증 질환임을 나타내는 방법.
  13. 제11항 또는 제12항에 있어서, 상기 환자가 감염인 것으로 진단되는 경우, 상기 환자에 대한 세균/바이러스 메타스코어를 계산하는 단계를 더 포함하되, 상기 환자에 대한 양성 세균/바이러스 메타스코어는 상기 환자가 바이러스성 감염인 것을 나타내고, 상기 환자에 대한 음성 세균/바이러스 메타스코어는 상기 환자가 세균성 감염인 것을 나타내는 방법.
  14. 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바이오마커의 수준은 감염 또는 비감염 대상에 대한 시간-일치 기준값과 비교되는 방법.
  15. 제11항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 비감염성 염증 질환은 전신성 염증 반응 증후군(SIRS), 자가 면역 질환, 외상성 손상, 및 수술로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  16. 제11항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 환자는 인간인 방법.　
  17. 제11항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바이오마커의 수준을 측정하는 단계는 형형광, 화학 발광, 또는 전기 신호 검출을 통한 마이크로어레이 분석법, 중합 효소 연쇄 반응(PCR), 역전사 중합 효소 연쇄 반응(RT-PCR), 디지털 미세방울 PCR(ddPCR), 고체 상태 나노 기공 검출법, RNA 스위치 활성화, 노던 블롯 또는 유전자 발현 연속 분석법(SAGE) 등을 포함하여 하나 이상의 방법을 수행하는 단계를 포함하는 방법.
  18. 환자의 생물학적 샘플에서 적어도 2개의 바이오마커의 수준을 측정하기 위한 제제를 포함하는 키트로서, 상기 적어도 2개의 바이오마커는 보다 높은 수준의 발현이 세균성 감염을 나타내는 제1 세트의 바이오마커 및 보다 높은 수준의 발현이 바이러스성 감염을 나타내는 제2 세트의 바이오마커 중 하나 또는 둘 모두로부터 선택되며, 상기 제1세트 바이오마커는 TSPO, EMR1, NINJ2, ACPP, TBXAS1, PGD, S100A12, SORT1, TNIP1, RAB31, SLC12A9, PLP2, IMPA2, GPAA1, LTA4H, RTN3, CETP, TALD01, HK3, ACAA1, CAT, DOK3, SORL1, PYGL, DYSF, TWF2, TKT, CTSB, FLII, PROS1, NRD1, STAT5B, CYBRD1, PTAFR, 및 LAPTM5 중 적어도 하나를 포함하고, 상기 제2 세트의 바이오마커는 OAS1, IFIT1, SAMD9, ISG15, HERC5, DDX60, HESX1, IFI6, MX1, OASL, LAX1, IFIT5, IFIT3, KCTD14, OAS2, RTP4, PARP12, LY6E, ADA, IFI44L, IFI27, RSAD2, IFI44, OAS3, IFIH1, SIGLEC1, JUP, STAT1, CUL1, DNMT1, IFIT2, CHST12, ISG20, DHX58, EIF2AK2, XAF1, 및 GZMB 중 적어도 하나를 포함하는 키트.　
  19. 제18항에 있어서, CEACAM1, ZDHHC19, C9orf95, GNA15, BATF, C3AR1, KIAA1370, TGFBI, MTCH1, RPGRIP1, 및 HLA-DPB1 바이오마커의 수준을 측정하기 위한 제제를 추가로 포함하는 키트.
  20. 제18항 또는 제19항에 있어서, 마이크로어레이를 더 포함하는 키트.
  21. 제20항에 있어서, 상기 마이크로어레이는 IFI27 폴리뉴클레오타이드에 혼성화하는 올리고뉴클레오타이드, JUP 폴리뉴클레오타이드에 혼성화하는 올리고뉴클레오타이드, LAX1 폴리뉴클레오타이드에 혼성화하는 올리고뉴클레오타이드, HK3 폴리뉴클레오타이드에 혼성화하는 올리고뉴클레오타이드, TNIP1 폴리뉴클레오타이드에 혼성화하는 올리고뉴클레오타이드, GPAA1의 폴리뉴클레오타이드에 혼성화하는 올리고뉴클레오타이드, 및 CTSB 폴리뉴클레오타이드에 혼성화하는 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 키트.
  22. 제20항에 있어서, 상기 마이크로어레이는 CEACAM1 폴리뉴클레오타이드에 혼성화하는 올리고뉴클레오타이드, ZDHHC19 폴리뉴클레오타이드에 혼성화하는 올리고뉴클레오타이드, C9orf95 폴리뉴클레오타이드에 혼성화하는 올리고뉴클레오타이드, GNA15 폴리뉴클레오타이드에 혼성화하는 올리고뉴클레오타이드, BATF 폴리뉴클레오타이드에 혼성화하는 올리고뉴클레오타이드, C3AR1 폴리뉴클레오타이드에 혼성화하는 올리고뉴클레오타이드, KIAA1370 폴리뉴클레오타이드에 혼성화하는 올리고뉴클레오타이드, TGFBI 폴리뉴클레오타이드에 혼성화하는 올리고뉴클레오타이드, MTCH1 폴리뉴클레오타이드에 혼성화하는 올리고뉴클레오타이드, RPGRIP1 폴리뉴클레오타이드에 혼성화하는 올리고뉴클레오타이드, 및 HLA-DPB1 폴리뉴클레오타이드에 혼성화하는 올리고뉴클레오타이드를 더 포함하는 키트.
  23. 제18항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 바이오마커의 검출된 수준을 패혈증과 관련시키는 지침을 포함하는 전자적 형태나 종이 형태의 정보를 더 포함하는 키트.
  24. 감염이 의심되는 환자를 진단하기 위한 컴퓨터 구현 방법에 있어서, 상기 컴퓨터는,
    a) 환자의 생물학적 샘플에서 적어도 2개의 바이오마커의 수준에 대한 값을 포함하는 입력된 환자 데이터를 수신하는 단계(상기 적어도 2개의 바이오마커는 보다 높은 수준의 발현이 세균성 감염을 나타내는 제1 세트의 바이오마커 및 보다 높은 수준의 발현이 바이러스성 감염을 나타내는 제2 세트의 바이오마커 중 하나 또는 둘 모두로부터 선택되며, 상기 환자의 상기 생물학적 샘플로부터 제1 세트의 바이오마커는 TSPO, EMR1, NINJ2, ACPP, TBXAS1, PGD, S100A12, SORT1, TNIP1, RAB31, SLC12A9, PLP2, IMPA2, GPAA1, LTA4H, RTN3, CETP, TALD01, HK3, ACAA1, CAT, DOK3, SORL1, PYGL, DYSF, TWF2, TKT, CTSB, FLII, PROS1, NRD1, STAT5B, CYBRD1, PTAFR, 및 LAPTM5 중 적어도 하나를 포함하고, 제2 세트의 바이오마커는 OAS1, IFIT1, SAMD9, ISG15, HERC5, DDX60, HESX1, IFI6, MX1, OASL, LAX1, IFIT5, IFIT3, KCTD14, OAS2, RTP4, PARP12, LY6E, ADA, IFI44L, IFI27, RSAD2, IFI44, OAS3, IFIH1, SIGLEC1, JUP, STAT1, CUL1, DNMT1, IFIT2, CHST12, ISG20, DHX58, EIF2AK2, XAF1, 및 GZMB 바이오마커 중 적어도 하나를 포함함);
    b) 상기 바이오마커들의 각각의 수준을 분석하여 상기 바이오마커에 대한 각각의 기준값 범위와 비교하는 단계;
    c) 상기 바이오마커의 수준에 기초하여 상기 환자에 대한 세균/바이러스 메타스코어를 계산하는 단계(상기 환자의 양성 세균/바이러스 메타스코어는 상기 환자가 바이러스성 감염인 것을 나타내고, 상기 환자의 음성 세균/바이러스 메타스코어는 상기 환자가 세균성 감염인 것을 나타냄); 및
    d) 상기 환자의 상기 진단에 관한 정보를 표시하는 단계를 포함하는 단계를 수행하는 방법.
  25. 제24항에 있어서, 상기 생물학적 샘플은 전혈 또는 말초 혈액 단핵 세포(PBMCS)를 포함하는 방법.
  26. 제24항의 방법을 수행하기 위한 진단 시스템에 있어서,
    a) 내부에 저장된 상기 환자의 진단을 결정하기 위한 명령어를 가지며, 데이터를 저장하기 위한 저장부;
    b) 환자 데이터를 수신하고 하나 이상의 알고리즘에 따라 환자 데이터를 분석하기 위해 상기 저장부에 연결되고 상기 저장부에 저장된 명령어를 실행하도록 구성된, 데이터 처리용 컴퓨터 프로세서; 및
    c) 상기 환자의 상기 진단에 관한 정보를 표시하기 위한 디스플레이부를 포함하는 진단 시스템.
  27. 제26항에 있어서, 상기 저장부는 상기 세균/바이러스 메타스코어를 계산하기 위한 명령어를 포함하는 진단 시스템.
  28. 염증을 갖는 환자를 진단하기 위한 컴퓨터 구현 방법에 있어서, 상기 컴퓨터는,
    a) 상기 환자의 생물학적 샘플에서 IFI27, JUP, LAX1, HK3, TNIP1, GPAA1, CTSB, CEACAM1, ZDHHC19, C9orf95, GNA15, BATF, C3AR1, KIAA1370, TGFBI, MTCH1, RPGRIP1, 및 HLA-DPB1 바이오마커의 수준에 대한 값을 포함하는 입력된 환자 데이터를 수신하는 단계;
    b) 상기 바이오마커의 각각의 수준을 분석하고 상기 바이오마커에 대한 각각의 기준값 범위와 비교하는 단계;
    c) 상기 환자에 대한 패혈증 메타스코어를 계산하는 단계(비감염 대조 대상에 대한 상기 기준값 범위보다 더 높은 패혈증 메타스코어는 상기 환자가 감염된 것을 나타내고, 비감염 대조 대상의 상기 기준값 범위 내의 패혈증 메타스코어는 상기 환자가 비감염성 염증 질환임을 나타냄);
    d) 상기 패혈증 메타스코어가 상기 환자가 감염이 있음을 나타내는 경우, 상기 환자에 대한 세균/바이러스 메타스코어를 계산하는 단계(상기 환자에 대한 양성 세균/바이러스 메타스코어는 상기 환자가 바이러스성 감염인 것을 나타내고, 상기 환자에 대한 음성 세균/바이러스 메타스코어는 상기 환자가 세균성 감염인 것을 나타냄); 및
    e) 상기 환자의 상기 진단에 관한 정보를 표시하는 단계를 포함하는 단계를 수행하는 방법.
  29. 제28항에 있어서, 상기 생물학적 샘플이 전혈 또는 말초 혈액 단핵 세포(PBMCS)를 포함하는 방법.
  30. 제28항의 방법을 수행하기 위한 진단 시스템에 있어서,
    a) 내부에 저장된 상기 환자의 진단을 결정하기 위한 명령어를 가지며, 데이터를 저장하기 위한 저장부;
    b) 환자 데이터를 수신하고 하나 이상의 알고리즘에 따라 환자 데이터를 분석하기 위해 상기 저장부에 연결되고 상기 저장부에 저장된 명령어를 실행하도록 구성된, 데이터 처리용 컴퓨터 프로세서; 및
    c) 상기 환자의 상기 진단에 관한 정보를 표시하기 위한 디스플레이부를 포함하는 진단 시스템.
  31. 제30항에 있어서, 상기 저장부는 상기 패혈증 메타스코어 및 상기 세균/바이러스 메타스코어를 계산하기 위한 명령어를 포함하는 진단 시스템.
  32. 환자의 감염을 진단하고 치료하는 방법으로서,
    a) 상기 환자로부터 생물학적 샘플을 얻는 단계;
    b) 환자의 생물학적 샘플에서 적어도 2개의 바이오마커의 임의의 세트의 발현 수준을 측정하는 단계(상기 적어도 2개의 바이오마커는 보다 높은 수준의 발현이 세균성 감염을 나타내는 제1 세트의 바이오마커 및 보다 높은 수준의 발현이 바이러스성 감염을 나타내는 제2 세트의 바이오마커 중 하나 또는 둘 다로부터 선택되며, 상기 제1 세트의 바이오마커는 TSPO, EMR1, NINJ2, ACPP, TBXAS1, PGD, S100A12, SORT1, TNIP1, RAB31, SLC12A9, PLP2, IMPA2, GPAA1, LTA4H, RTN3, CETP, TALD01, HK3, ACAA1, CAT, DOK3, SORL1, PYGL, DYSF, TWF2, TKT, CTSB, FLII, PROS1, NRD1, STAT5B, CYBRD1, PTAFR, 및 LAPTM5 중 적어도 하나를 포함하고, 상기 제2 세트의 바이오마커는 OAS1, IFIT1, SAMD9, ISG15, HERC5, DDX60, HESX1, IFI6, MX1, OASL, LAX1, IFIT5, IFIT3, KCTD14, OAS2, RTP4, PARP12, LY6E, ADA, IFI44L, IFI27, RSAD2, IFI44, OAS3, IFIH1, SIGLEC1, JUP, STAT1, CUL1, DNMT1, IFIT2, CHST12, ISG20, DHX58, EIF2AK2, XAF1, 및 GZMB 중 적어도 하나를 포함함); 및
    c) 비감염 대조 대상에 대한 각각의 기준값 범위와 함께 각각의 바이오마커의 발현 수준을 분석하는 단계를 포함하되, 비감염 대조 대상에 대한 기준값 범위와 비교하여 바이러스 반응 유전자의 차등 발현은 상기 환자가 바이러스성 감염인 것을 나타내고, 비감염 대조 대상에 대한 기준값 범위와 비교하여 세균성 반응 유전자의 차등 발현은 상기 환자가 세균성 감염인 것을 나타내는 방법.
  33. 제32항에 있어서, 바이러스 및 세균 반응 유전자 세트가 하기 a)-i)로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
    a) OAS2 및 CUL1을 포함하는 바이러스 반응 유전자 세트 및 SLC12A9, ACPP, STAT5B를 포함하는 세균 반응 유전자 세트;
    b) ISG15 및 CHST12를 포함하는 바이러스 반응 유전자 세트 및 EMR1 및 FLII를 포함하는 세균 반응 유전자 세트;
    c) IFIT1, SIGLEC1, 및 ADA를 포함하는 바이러스 반응 유전자 세트 및 PTAFR, NRD1, PLP2를 포함하는 세균 반응 유전자 세트;
    d) MX1을 포함하는 바이러스 반응 유전자 세트 및 DYSF, TWF2를 포함하는 세균 반응 유전자 세트;
    e) RSAD2를 포함하는 바이러스 반응 유전자 세트 및 SORT1과 TSPO를 포함하는 세균 반응 유전자 세트;
    f) IFI44L, GZMB 및 KCTD14를 포함하는 바이러스 반응 유전자 세트 및 TBXAS1, ACAA1 및 S100A12를 포함하는 세균 반응 유전자 세트;
    g) LY6E를 포함하는 바이러스 반응 유전자 세트 및 PGD와 LAPTM5를 포함하는 세균 반응 유전자 세트;
    h) IFI44, HESX1 및 OASL을 포함하는 바이러스 반응 유전자 세트 및 NINJ2, DOK3, SORL1 및 RAB31을 포함하는 세균 반응 유전자 세트;
    i) OAS1을 포함하는 바이러스 반응 유전자 세트 및 IMPA2와 LTA4H를 포함하는 세균 반응 유전자 세트.
  34. 제32항 또는 제33항에 있어서, 상기 생물학적 샘플은 전혈 또는 말초 혈액 단핵 세포(PBMCS)를 포함하는 방법.
  35. 제32항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바이오마커의 수준은 감염 또는 비감염 대상에 대한 시간-일치 기준값과 비교되는 방법.
  36. 제32항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바이오마커의 수준에 기초하여 상기 환자의 세균/바이러스 메타스코어를 계산하는 단계를 더 포함하되, 상기 환자에 대한 양성 세균/바이러스 메타스코어는 상기 환자가 바이러스성 감염인 것을 나타내고, 상기 환자에 대한 음성 세균/바이러스 메타스코어는 상기 환자가 세균성 감염인 것을 나타내는 방법.
  37. 제32항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생물학적 샘플에서 IFI27, JUP, LAX1, HK3, TNIP1, GPAA1, CTSB, CEACAM1, ZDHHC19, C9orf95, GNA15, BATF, C3AR1, KIAA1370, TGFBI, MTCH1, RPGRIP1, 및 HLA-DPB1 바이오마커의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 상기 바이오마커에 대한 각각의 기준값 범위와 함께 각각의 바이오마커의 발현 수준을 분석하는 단계를 포함하되, 비감염 대조 대상의 상기 바이오마커에 대한 상기 기준값 범위와 비교하여 상기 CEACAM1, ZDHHC19, C9orf95, GNA15, BATF 및 C3AR1 바이오마커의 증가된 발현 수준과 상기 KIAA1370, TGFBI, MTCH1, RPGRIP1, and HLA-DPB1의 감소된 발현 수준이 상기 환자가 감염된 것을 나타내고, 비감염 대조 대상과 비교하여 상기 CEACAM1, ZDHHC19, C9orf95, GNA15, BATF, C3AR1, KIAA1370, TGFBI, MTCH1, RPGRIP1, 및 HLA-DPB1 바이오마커의 차등 발현의 부재는 상기 환자가 감염되지 않은 것을 나타내는 방법.
  38. 하기 a)-i)로 이루어진 군으로부터 선택되는 바이러스 반응 유전자 세트 및 세균 반응 유전자 세트의 발현 수준을 측정하기 위한 제제를 포함하는 키트.
    a) OAS2 및 CUL1을 포함하는 바이러스 반응 유전자 세트 및 SLC12A9, ACPP, STAT5B를 포함하는 세균 반응 유전자 세트;
    b) ISG15 및 CHST12를 포함하는 바이러스 반응 유전자 세트 및 EMR1 및 FLII를 포함하는 세균 반응 유전자 세트;
    c) IFIT1, SIGLEC1, 및 ADA를 포함하는 바이러스 반응 유전자 세트 및 PTAFR, NRD1, PLP2를 포함하는 세균 반응 유전자 세트;
    d) MX1을 포함하는 바이러스 반응 유전자 세트 및 DYSF, TWF2를 포함하는 세균 반응 유전자 세트;
    e) RSAD2를 포함하는 바이러스 반응 유전자 세트 및 SORT1과 TSPO를 포함하는 세균 반응 유전자 세트;
    f) IFI44L, GZMB 및 KCTD14를 포함하는 바이러스 반응 유전자 세트 및 TBXAS1, ACAA1 및 S100A12를 포함하는 세균 반응 유전자 세트;
    g) LY6E를 포함하는 바이러스 반응 유전자 세트 및 PGD와 LAPTM5를 포함하는 세균 반응 유전자 세트;
    h) IFI44, HESX1 및 OASL을 포함하는 바이러스 반응 유전자 세트 및 NINJ2, DOK3, SORL1 및 RAB31을 포함하는 세균 반응 유전자 세트; 및
    i) OAS1을 포함하는 바이러스 반응 유전자 세트 및 IMPA2와 LTA4H를 포함하는 세균 반응 유전자 세트.
  39. 제38항에 있어서, 마이크로어레이를 더 포함하는 키트.
  40. 감염이 의심되는 환자를 진단하기 위한 컴퓨터 구현 방법에 있어서, 상기 컴퓨터는,
    a) 환자의 생물학적 샘플에서 적어도 2개의 바이오마커의 발현 수준에 대한 값을 포함하는 입력된 환자 데이터를 수신하는 단계(상기 적어도 2개의 바이오마커는 보다 높은 수준의 발현이 세균성 감염을 나타내는 제1 세트의 바이오마커 및 보다 높은 수준의 발현이 바이러스성 감염을 나타내는 제2 세트의 바이오마커 중 하나 또는 둘 모두로부터 선택되며, 상기 바이러스 반응 유전자 세트는 OAS2, CUL1, ISG15, CHST12, IFIT1, SIGLEC1, ADA, MX1, RSAD2, IFI44L, GZMB, KCTD14, LY6E, IFI44, HESX1, OASL, OAS1, OAS3, EIF2AK2, DDX60, DNMT1, HERC5, IFIH1, SAMD9, IFI6, IFIT3, IFIT5, XAF1, ISG20, PARP12, IFIT2, DHX58, STAT1로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자를 포함하고, 상기 세균 반응 유전자 세트는 SLC12A9, ACPP, STAT5B, EMR1, FLII, PTAFR, NRD1, PLP2, DYSF, TWF2, SORT1, TSPO, TBXAS1, ACAA1, S100A12, PGD, LAPTM5, NINJ2, DOK3, SORL1, RAB31, IMPA2, LTA4H, TALDO1, TKT, PYGL, CETP, PROS1, RTN3, CAT, CYBRD1로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자를 포함함);
    b) 상기 바이러스 반응 유전자 세트 및 상기 세균 반응 유전자 세트의 상기 발현 수준을 분석하고 비감염 대조 대상에 대한 각각의 기준값 범위와 비교하는 단계;
    c) 상기 바이러스 반응 유전자 세트 및 상기 세균 반응 유전자 세트의 상기 발현 수준에 기초하여 상기 환자에 대한 세균/바이러스 메타스코어를 계산하는 단계; 및
    d) 상기 환자의 상기 진단에 관한 정보를 표시하는 단계를 포함하는 단계를 수행하는 방법.
  41. 제40항의 방법을 수행하기 위한 진단 시스템에 있어서,
    a) 내부에 저장된 상기 환자의 진단을 결정하기 위한 명령어를 가지며, 데이터를 저장하기 위한 저장부;
    b) 환자 데이터를 수신하고 하나 이상의 알고리즘에 따라 환자 데이터를 분석하기 위해 상기 저장부에 연결되고 상기 저장부에 저장된 명령어를 실행하도록 구성된, 데이터 처리용 컴퓨터 프로세서; 및
    c) 상기 환자의 상기 진단에 관한 정보를 표시하기 위한 디스플레이부를 포함하는 진단 시스템.
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