JP6995622B2

JP6995622B2 - 敗血症の診断法

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Publication number: JP6995622B2
Application number: JP2017546801A
Authority: JP
Inventors: ピューベシュカトリ，; ティモシー，イー．スウィーニー，
Original assignee: Leland Stanford Junior University
Current assignee: Leland Stanford Junior University
Priority date: 2015-03-12
Filing date: 2016-03-12
Publication date: 2022-01-14
Anticipated expiration: 2036-03-12
Also published as: CN107532214B; AU2016228508A1; JP2023138990A; US10533224B2; JP2018514189A; WO2016145426A1; AU2022203348A1; EP3268499B1; US20180291449A1; CN107532214A; IL286853B2; IL254229B; CA2977422A1; EP3268499A1; IL286853B; JP2022058359A; EP3268499A4; WO2016145426A8; IL286853A; US20230227911A1

Description

連邦政府支援の研究または開発に関する陳述
本発明は、国立衛生研究所により授与された規約ＡＩ０５７２２９、ＡＩ１０９６６２、及びＬＭ００７０３３下で政府支援を受けてなされたものである。政府は、本発明においてある権利を有する。

本発明は、概して、敗血症を診断するための方法に関する。具体的には、本発明は、敗血症の診断、予後、及び治療を支援するためのバイオマーカーの使用、より具体的には、敗血症を、例えば、外傷性損傷、手術、自己免疫疾患、血栓症、または全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）によって引き起こされる非感染性炎症源と区別するために使用され得るバイオマーカーに関する。

感染に応答した全身性炎症症候群である敗血症は、米国で毎年およそ７５０，０００人の命を奪う（Ａｎｇｕｓｅｔａｌ．（２００１）ＣｒｉｔＣａｒｅＭｅｄ２９：１３０３－１３１０）。これは、米国で治療される唯一の最も費用のかかる疾患でもあり、医療制度に毎年２４０億ドルを超える費用を要する（Ｌａｇｕｅｔａｌ．（２０１２）ＣｒｉｔＣａｒｅＭｅｄ４０：７５４－７６１）；ＴｏｒｉｏａｎｄＡｎｄｒｅｗｓ（２０１３）ＮａｔｉｏｎａｌＩｎｐａｔｉｅｎｔＨｏｓｐｉｔａｌＣｏｓｔｓ：ＴｈｅＭｏｓｔＥｘｐｅｎｓｉｖｅＣｏｎｄｉｔｉｏｎｓｂｙＰａｙｅｒ，２０１１（ＳｔａｔｉｓｔｉｃａｌＢｒｉｅｆ＃１６０，ＡｇｅｎｃｙｆｏｒＨｅａｌｔｈｃａｒｅＲｅｓｅａｒｃｈａｎｄＱｕａｌｉｔｙ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ，Ａｕｇｕｓｔ２０１３）。敗血症の迅速な診断及び治療が死亡率の低下に不可欠であり、１時間の遅延毎に死亡リスクが増加する（Ｇａｉｅｓｋｉｅｔａｌ．（２０１０）ＣｒｉｔＣａｒｅＭｅｄ３８：１０４５－１０５３、Ｆｅｒｒｅｒｅｔａｌ．（２０１４）ＣｒｉｔＣａｒｅＭｅｄ４２：１７４９－１７５５）。敗血症は、既知のまたは疑わしい感染源に加えて、全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）の存在を特徴とする（Ｄｅｌｌｉｎｇｅｒｅｔａｌ．（２０１３）ＩｎｔｅｎｓｉｖｅＣａｒｅＭｅｄ３９：１６５－２２８）。しかしながら、無菌性炎症が外傷、手術、血栓症、及び他の非感染性傷害に対する非特異的応答として生じ得るため、ＳＩＲＳは、敗血症に特異的ではない。したがって、敗血症は、組織外傷等の非感染性源によって引き起こされる全身性炎症と臨床的に区別するのが困難であり得る（Ｃｏｂｕｒｎｅｔａｌ．ＪＡＭＡ（２０１２）３０８：５０２－５１１）。結果が標準微生物培養から入手可能になる前に、診断時に感染を有する患者を区別する「究極の判断基準となる」血液検査は存在しない。感染の最も一般的なバイオマーカーのうちの１つであるプロカルシトニンは、０．７８（０．６６～０．９０の範囲）の要約受信者動作特性曲線下面積（ＡＵＣ）を有する（Ｔａｎｇｅｔａｌ．（２００７）ＬａｎｃｅｔＩｎｆｅｃｔＤｉｓ７：２１０－２１７、Ｕｚｚａｎｅｔａｌ．（２００６）ＣｒｉｔＣａｒｅＭｅｄ３４：１９９６－２００３、Ｃｈｅｖａｌｅｔａｌ．（２０００）ＩｎｔｅｎｓｉｖｅＣａｒｅＭｅｄ２６Ｓｕｐｐｌ２：Ｓ１５３－１５８、Ｕｇａｒｔｅｅｔａｌ．（１９９９）ＣｒｉｔＣａｒｅＭｅｄ２７：４９８－５０４）。いくつかの団体が、サイトカインまたは遺伝子発現アレイが敗血症を正確に診断することができるかを評価しているが、宿主応答及びヒト遺伝学が極めて可変性であるため、ロバストな診断シグネチャは見つけられていない（Ｃｏｂｂｅｔａｌ．（２００９）ＡｎｎＳｕｒｇ２５０：５３１－５３９、Ｘｉａｏｅｔａｌ．（２０１１）ＪＥｘｐＭｅｄ２０８：２５８１－２５９０、Ｐａｎｋｌａｅｔａｌ．（２００９）ＧｅｎｏｍｅＢｉｏｌ１０：Ｒ１２７、Ｔａｎｇｅｔａｌ．（２００９）ＣｒｉｔＣａｒｅＭｅｄ３７：８８２－８８８、Ｗｏｎｇ（２０１２）ＣｒｉｔＣａｒｅ１６：２０４、Ｊｏｈｎｓｏｎｅｔａｌ．（２００７）ＡｎｎＳｕｒｇ２４５：６１１－６２１）。実際には、「「完璧な」敗血症マーカーの発見は、現代医学において、最も捉えどころのない夢のうちの１つとなっている」（Ｖｅｇａｅｔａｌ．（２００９）ＣｒｉｔＣａｒｅＭｅｄ３７：１８０６－１８０７）。

感染も組織外傷もいずれも、Ｔｏｌｌ様受容体及びＮＯＤ様受容体等の同じ先天性免疫受容体ファミリーのうちの多くを活性化し、その結果として、大部分が重複した転写経路を活性化する。したがって、感染のみに起因する保存下流効果の区別は、非常に困難になっている。最近の研究では、ｃ型レクチン、ＣＥＡＣＡＭ、及びｓｉｇｌｅｃ受容体ファミリー等の病原体応答に特異的である可能性のあるパターン認識受容体が存在することが示されている（Ｇｅｉｊｔｅｎｂｅｅｋｅｔａｌ．（２００９）ＮａｔＲｅｖＩｍｍｕｎｏｌ９：４６５－４７９、Ｃｒｏｃｋｅｒ（２００７）ＮａｔＲｅｖＩｍｍｕｎｏｌ７：２５５－２６６、Ｋｕｅｓｐｅｒｔｅｔａｌ．（２００６）ＣｕｒｒＯｐｉｎＣｅｌｌＢｉｏｌ１８：５６５－５７１）。それ故に、感染特異的免疫応答を無菌性炎症と区別することができる可能性があり得る。

新たな敗血症療法ならびに新たな予後及び診断バイオマーカーの継続的な捜索により、過去１０年間で数十のマイクロアレイベースのゲノム規模での発現研究が生み出されており、これらの研究は、診断、予後、病原体応答、及び基礎敗血症病態生理学に様々に焦点を当てたものである（Ｊｏｈｎｓｏｎｅｔａｌ．（上記参照）、Ｍａｓｌｏｖｅｅｔａｌ．（２０１４）ＴｒｅｎｄｓＭｏｌＭｅｄ．２０（４）：２０４－２１３）。敗血症における遺伝子発現の多大な理解にもかかわらず、わずかな識見しか臨床診療での改善に実現されていない。重要なことには、これらの研究のうちの多くがＮＩＨＧｅｎｅＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＯｍｎｉｂｕｓ（ＧＥＯ）及びＡｒｒａｙＥｘｐｒｅｓｓ等の公的リポジトリに預け入れられており、それ故に、敗血症に関する公的に入手可能なデータが豊富に存在する。具体的には、敗血症を有する患者を、大手術後、外傷性損傷後、または非敗血症関連ＩＣＵ入院時（血栓症、呼吸不全等）に発症する非感染性炎症（ＳＩＲＳ等）を有する患者と比較する研究がいくつか存在する。

具体的には、１つのデータセットであるＩｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎａｎｄＨｏｓｔＲｅｓｐｏｎｓｅｔｏＩｎｊｕｒｙＰｒｏｇｒａｍ（ＧｌｕｅＧｒａｎｔ）（Ｃｏｂｂｅｔａｌ．（２００５）ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ１０２：４８０１－４８０６）は、外傷後及び敗血症における遺伝子発現に対する時間の影響についてのいくつかの重要な所見をもたらしている。ＧｌｕｅＧｒａｎｔの一部は、重度の外傷性損傷後の患者における遺伝子発現を長期的に試験した。いくつかの団体は、これらのデータを時間に関して試験しており、注目すべき所見は、（１）発現遺伝子の８０％超が外傷性損傷後に差次的発現を示すこと（Ｘｉａｏｅｔａｌ．（上記参照））、（２）異なる遺伝子クラスターが顕著に異なる時間にわたって回復すること（Ｓｅｏｋｅｔａｌ．（２０１３）ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ１１０：３５０７－３５１２）、（３）外傷、熱傷、及び内毒素中毒症等の異なる炎症シナリオが同様の遺伝子発現変化を呈すること（Ｓｅｏｋｅｔａｌ．（上記参照））、ならびに（４）健常患者と異なる外傷後遺伝子発現プロファイルの程度、及び長期にわたるそれらの遺伝子発現回復の程度が臨床転帰と相関していること（Ｄｅｓａｉｅｔａｌ．（２０１１）ＰＬｏＳＭｅｄ８：ｅ１００１０９３、Ｗａｒｒｅｎｅｔａｌ．（２００９）ＭｏｌＭｅｄ１５：２２０－２２７）である。したがって、外傷からの回復の基礎となる変化の重要性、及び特定の臨床転帰に対するそれらの影響の理解が高まっている。

敗血症を、例えば、外傷性損傷及びＳＩＲＳによって引き起こされる非感染性炎症源と区別することができる敗血症の高感度で特異的な診断試験が依然として必要とされている。

本発明は、敗血症を診断するためのバイオマーカーの使用に関する。具体的には、本発明者らは、敗血症を診断し、かつ敗血症を、例えば、外傷性損傷、手術、自己免疫疾患、血栓症、または全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）によって引き起こされる非感染性全身性炎症源と区別するために使用され得るバイオマーカーを見出した。これらのバイオマーカーは、敗血症の予後、診断、もしくはその治療の監視において、単独で、または１つ以上の追加のバイオマーカーもしくは関連臨床的パラメータとの組み合わせで使用され得る。

本発明の実施に際して使用され得るバイオマーカーとしては、ＣＥＡＣＡＭ１、ＺＤＨＨＣ１９、Ｃ９ｏｒｆ９５、ＧＮＡ１５、ＢＡＴＦ、Ｃ３ＡＲ１、ＫＩＡＡ１３７０、ＴＧＦＢＩ、ＭＴＣＨ１、ＲＰＧＲＩＰ１、及びＨＬＡ－ＤＰＢ１を含むが、これらに限定されない、遺伝子または遺伝子のＲＮＡ転写物由来のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドが挙げられる。

ある特定の実施形態では、バイオマーカーパネルが敗血症の診断に使用される。任意のサイズのバイオマーカーパネルが本発明の実施に際して使用され得る。敗血症を診断するためのバイオマーカーパネルは、典型的には、少なくとも３個のバイオマーカー～最大３０個のバイオマーカー、例えば、それらの間の任意の数のバイオマーカー、例えば、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、または３０個のバイオマーカーを含む。ある特定の実施形態では、本発明は、少なくとも３個、少なくとも４個、または少なくとも５個、または少なくとも６個、または少なくとも７個、または少なくとも８個、または少なくとも９個、または少なくとも１０個、または少なくとも１１個、またはそれ以上のバイオマーカーを含むバイオマーカーパネルを含む。通常、より小さいバイオマーカーパネルがより経済的であるが、より大きいバイオマーカーパネル（すなわち、３０個を超えるバイオマーカー）がより詳細な情報の提供に有利であり、本発明の実施に際しても使用され得る。

一実施形態では、バイオマーカーパネルは、敗血症を診断するための複数のバイオマーカーを含み、複数のバイオマーカーとしては、ＣＥＡＣＡＭ１、ＺＤＨＨＣ１９、Ｃ９ｏｒｆ９５、ＧＮＡ１５、ＢＡＴＦ、Ｃ３ＡＲ１、ＫＩＡＡ１３７０、ＴＧＦＢＩ、ＭＴＣＨ１、ＲＰＧＲＩＰ１、及びＨＬＡ－ＤＰＢ１からなる群から選択される、遺伝子または遺伝子のＲＮＡ転写物由来のヌクレオチド配列を含む１つ以上のポリヌクレオチドが挙げられる。ある特定の実施形態では、バイオマーカーパネルは、少なくとも１１個のバイオマーカーを含む。一実施形態では、バイオマーカーパネルは、ＣＥＡＣＡＭ１ポリヌクレオチド、ＺＤＨＨＣ１９ポリヌクレオチド、Ｃ９ｏｒｆ９５ポリヌクレオチド、ＧＮＡ１５ポリヌクレオチド、ＢＡＴＦポリヌクレオチド、Ｃ３ＡＲ１ポリヌクレオチド、ＫＩＡＡ１３７０ポリヌクレオチド、ＴＧＦＢＩポリヌクレオチド、ＭＴＣＨ１ポリヌクレオチド、ＲＰＧＲＩＰ１ポリヌクレオチド、及びＨＬＡ－ＤＰＢ１ポリヌクレオチドを含む。

一態様では、本発明は、対象における敗血症を診断するための方法を含む。本方法は、ａ）対象由来の生体試料中の複数のバイオマーカーのレベルを測定することと、ｂ）複数のバイオマーカーのそれぞれの基準値範囲に関連してバイオマーカーのレベルを分析することと、を含み、非感染対照対象のバイオマーカーの基準値範囲と比較した生体試料中の１つ以上のバイオマーカーの差次的発現が、対象が敗血症を有することを示す。基準値範囲は、敗血症を有しない１名以上の対象（例えば、健常対象または非感染対象）の１つ以上の試料中に見られる１つ以上のバイオマーカーのレベルを表し得る。あるいは、基準値は、敗血症を有する１名以上の対象の１つ以上の試料中に見られる１つ以上のバイオマーカーのレベルを表し得る。ある特定の実施形態では、バイオマーカーのレベルは、非感染または感染／敗血症対象の時間一致基準値範囲と比較される。

ある特定の実施形態では、本発明は、本明細書に記載のバイオマーカーパネルを使用して対象における敗血症を診断するための方法を含む。本方法は、
ａ）対象から生体試料を採取することと、ｂ）生体試料中のバイオマーカーパネルの各バイオマーカーを測定することと、ｃ）各バイオマーカーの測定された値をバイオマーカーのそれぞれの基準値範囲と比較することと、を含み、対照対象のバイオマーカーの基準値と比較した生体試料中のバイオマーカーパネルのバイオマーカーの差次的発現が、対象が敗血症を有することを示す。

一実施形態では、本発明は、対象における敗血症を診断するための方法を含み、本方法は、ａ）対象から生体試料を採取することと、ｂ）生体試料中のバイオマーカーＣＥＡＣＡＭ１、ＺＤＨＨＣ１９、Ｃ９ｏｒｆ９５、ＧＮＡ１５、ＢＡＴＦ、Ｃ３ＡＲ１、ＫＩＡＡ１３７０、ＴＧＦＢＩ、ＭＴＣＨ１、ＲＰＧＲＩＰ１、及びＨＬＡ－ＤＰＢ１の発現レベルを測定することと、ｃ）バイオマーカーのそれぞれの基準値範囲に関連して各バイオマーカーの発現レベルを分析することと、を含み、非感染対照対象のバイオマーカーの基準値範囲と比較して増加したバイオマーカーＣＥＡＣＡＭ１、ＺＤＨＨＣ１９、Ｃ９ｏｒｆ９５、ＧＮＡ１５、ＢＡＴＦ、及びＣ３ＡＲ１の発現レベル、ならびに低下したバイオマーカーＫＩＡＡ１３７０、ＴＧＦＢＩ、ＭＴＣＨ１、ＲＰＧＲＩＰ１、及びＨＬＡ－ＤＰＢ１の発現レベルが、対象が敗血症を有することを示す。

別の実施形態では、本発明は、対象における敗血症を診断するための方法を含み、本方法は、以下の式に従ってバイオマーカーのレベルに基づいて対象の敗血症スコアを決定することを含み、

非感染対照対象の基準値範囲と比較してより高い対象の敗血症スコアが、対象が敗血症を有することを示す。

本明細書に記載の本発明の方法を使用して、対象の敗血症の診断を、例えば、外傷性損傷、手術、自己免疫疾患、血栓症、または全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）によって引き起こされる非感染性炎症源と区別することができる。

生体試料は、例えば、全血、バフィーコート、血漿、血清、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、帯状核細胞、好中球、単球、またはＴ細胞を含み得る。

バイオマーカーポリヌクレオチド（例えば、コード転写物）は、例えば、マイクロアレイ分析、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）、ノーザンブロット、または遺伝子発現連続分析（ＳＡＧＥ）によって検出され得る。

別の態様では、本発明は、敗血症を有する疑いのある対象の感染Ｚ－スコアを決定する方法を含み、本方法は、ａ）対象から生体試料を採取することと、ｂ）生体試料中の複数の敗血症バイオマーカーのレベルを測定することと、ｃ）バイオマーカーの対照基準値と比較して過剰発現している全てのバイオマーカーの発現レベルの幾何平均から、バイオマーカーの対照基準値と比較して過小発現している全てのバイオマーカーの発現レベルの幾何平均を差し引き、その差に、バイオマーカーの対照基準値と比較して過剰発現しているバイオマーカーの数と過小発現しているバイオマーカーの数との比率を乗じることによって、バイオマーカーの感染Ｚ－スコアを決定することと、を含む。

ある特定の実施形態では、感染Ｚ－スコアは、ＣＥＡＣＡＭ１、ＺＤＨＨＣ１９、Ｃ９ｏｒｆ９５、ＧＮＡ１５、ＢＡＴＦ、Ｃ３ＡＲ１、ＫＩＡＡ１３７０、ＴＧＦＢＩ、ＭＴＣＨ１、ＲＰＧＲＩＰ１、及びＨＬＡ－ＤＰＢ１からなる群から選択される、遺伝子または遺伝子のＲＮＡ転写物由来のヌクレオチド配列を含む１つ以上のポリヌクレオチドを含む複数のバイオマーカーの発現レベルから計算される。一実施形態では、複数のバイオマーカーとしては、ＣＥＡＣＡＭ１ポリヌクレオチド、ＺＤＨＨＣ１９ポリヌクレオチド、Ｃ９ｏｒｆ９５ポリヌクレオチド、ＧＮＡ１５ポリヌクレオチド、ＢＡＴＦポリヌクレオチド、Ｃ３ＡＲ１ポリヌクレオチド、ＫＩＡＡ１３７０ポリヌクレオチド、ＴＧＦＢＩポリヌクレオチド、ＭＴＣＨ１ポリヌクレオチド、ＲＰＧＲＩＰ１ポリヌクレオチド、及びＨＬＡ－ＤＰＢ１ポリヌクレオチドが挙げられる。

別の態様では、本発明は、敗血症を有する対象を治療する方法を含み、本方法は、ａ）本明細書に記載の方法に従って敗血症を有する対象を診断することと、ｂ）対象が敗血症の陽性診断を受けた場合、対象に治療有効量の広域抗生物質を投与することと、を含む。

別の態様では、本発明は、敗血症を有する疑いのある対象を治療する方法を含み、本方法は、ａ）本明細書に記載の方法に従う対象の診断に関する情報を受け取ることと、ｂ）患者が敗血症の陽性診断を受けた場合、対象に治療有効量の広域抗生物質を投与すること、を含む。

ある特定の実施形態では、対象データは、多変量線形判別分析（ＬＤＡ）、受信者動作特性（ＲＯＣ）分析、主成分分析（ＰＣＡ）、アンサンブルデータマイニング法、マイクロアレイ細胞特異的有意性分析（ｃｓＳＡＭ）、及び多次元タンパク質同定技術（ＭＵＤＰＩＴ）分析を含むが、これらに限定されない１つ以上の方法によって分析される。

別の実施形態では、本発明は、本明細書に記載のバイオマーカーパネルを使用して対象における敗血症を治療するための薬剤の効果を評価するための方法を含み、本方法は、各バイオマーカーのそれぞれの基準値範囲に関連して、対象がその薬剤で治療される前及び治療された後の対象由来の試料中のバイオマーカーパネルの各バイオマーカーの測定された値を分析することを含む。

別の実施形態では、本発明は、本明細書に記載のバイオマーカーパネルを使用して対象における敗血症を治療するための療法の有効性を監視するための方法を含み、本方法は、各バイオマーカーのそれぞれの基準値範囲に関連して、対象が前記療法を受ける前及び受けた後の対象由来の試料中のバイオマーカーパネルの各バイオマーカーの測定された値を分析することを含む。

別の実施形態では、本発明は、対象における敗血症を治療するための療法の有効性を監視するための方法を含み、本方法は、対象が療法を受ける前の対象由来の第１の試料中及び対象が療法を受けた後の対象由来の第２の試料中のバイオマーカーＣＥＡＣＡＭ１、ＺＤＨＨＣ１９、Ｃ９ｏｒｆ９５、ＧＮＡ１５、ＢＡＴＦ、Ｃ３ＡＲ１、ＫＩＡＡ１３７０、ＴＧＦＢＩ、ＭＴＣＨ１、ＲＰＧＲＩＰ１、及びＨＬＡ－ＤＰＢ１の発現レベルを測定することを含み、第１の試料中のバイオマーカーの発現レベルと比較して、第２の試料中の増加したバイオマーカーＣＥＡＣＡＭ１、ＺＤＨＨＣ１９、Ｃ９ｏｒｆ９５、ＧＮＡ１５、ＢＡＴＦ、及びＣ３ＡＲ１の発現レベル、ならびに低下したバイオマーカーＫＩＡＡ１３７０、ＴＧＦＢＩ、ＭＴＣＨ１、ＲＰＧＲＩＰ１、及びＨＬＡ－ＤＰＢ１の発現レベルが、対象が悪化していることを示し、第１の試料中のバイオマーカーの発現レベルと比較して、低下した第２の試料中のバイオマーカーＣＥＡＣＡＭ１、ＺＤＨＨＣ１９、Ｃ９ｏｒｆ９５、ＧＮＡ１５、ＢＡＴＦ、及びＣ３ＡＲ１の発現レベル、ならびに増加したバイオマーカーＫＩＡＡ１３７０、ＴＧＦＢＩ、ＭＴＣＨ１、ＲＰＧＲＩＰ１、及びＨＬＡ－ＤＰＢ１の発現レベルが、対象が改善していることを示す。

別の態様では、本発明は、対象における敗血症を診断するためのキットを含む。本キットは、敗血症を有する疑いのあるヒト対象から単離された生体試料を保持するための容器と、敗血症バイオマーカーを特異的に検出する少なくとも１つの薬剤と、その薬剤を生体試料または生体試料の一部と接触させて、生体試料中の少なくとも１つの敗血症バイオマーカーの存在または量を検出する印刷された指示と、を含み得る。薬剤は、別個の容器内にパッケージされ得る。本キットは、本明細書に記載のバイオマーカーの検出のためのＰＣＲまたはマイクロアレイ分析を行うための１つ以上の対照基準試料及び試薬をさらに含み得る。

ある特定の実施形態では、本キットは、敗血症を診断するための複数のバイオマーカーを含むバイオマーカーパネルのポリヌクレオチドを検出するための薬剤を含み、１つ以上のバイオマーカーは、ＣＥＡＣＡＭ１ポリヌクレオチド、ＺＤＨＨＣ１９ポリヌクレオチド、Ｃ９ｏｒｆ９５ポリヌクレオチド、ＧＮＡ１５ポリヌクレオチド、ＢＡＴＦポリヌクレオチド、Ｃ３ＡＲ１ポリヌクレオチド、ＫＩＡＡ１３７０ポリヌクレオチド、ＴＧＦＢＩポリヌクレオチド、ＭＴＣＨ１ポリヌクレオチド、ＲＰＧＲＩＰ１ポリヌクレオチド、及びＨＬＡ－ＤＰＢ１ポリヌクレオチドからなる群から選択される。一実施形態では、本キットは、ＣＥＡＣＡＭ１ポリヌクレオチド、ＺＤＨＨＣ１９ポリヌクレオチド、Ｃ９ｏｒｆ９５ポリヌクレオチド、ＧＮＡ１５ポリヌクレオチド、ＢＡＴＦポリヌクレオチド、Ｃ３ＡＲ１ポリヌクレオチド、ＫＩＡＡ１３７０ポリヌクレオチド、ＴＧＦＢＩポリヌクレオチド、ＭＴＣＨ１ポリヌクレオチド、ＲＰＧＲＩＰ１ポリヌクレオチド、及びＨＬＡ－ＤＰＢ１ポリヌクレオチドを含むバイオマーカーパネルのバイオマーカーを検出するための薬剤を含む。さらに、本キットは、単独で、または任意の組み合わせで一緒に、かつ／または敗血症の診断のための臨床的パラメータとの組み合わせで使用され得る２つまたは３つのバイオマーカーパネル等の２つ以上のバイオマーカーパネルを検出するための薬剤を含み得る。

ある特定の実施形態では、本キットは、複数のバイオマーカーポリヌクレオチドの分析のためのマイクロアレイを含む。一実施形態では、本キットは、ＣＥＡＣＡＭ１ポリヌクレオチドにハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、ＺＤＨＨＣ１９ポリヌクレオチドにハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、Ｃ９ｏｒｆ９５ポリヌクレオチドにハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、ＧＮＡ１５ポリヌクレオチドにハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、ＢＡＴＦポリヌクレオチドにハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、Ｃ３ＡＲ１ポリヌクレオチドにハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、ＫＩＡＡ１３７０ポリヌクレオチドにハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、ＴＧＦＢＩポリヌクレオチドにハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、ＭＴＣＨ１ポリヌクレオチドにハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、ＲＰＧＲＩＰ１ポリヌクレオチドにハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、及びＨＬＡ－ＤＰＢ１ポリヌクレオチドにハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含むマイクロアレイを含む。

別の態様では、本発明は、ａ）敗血症を有する疑いのある対象から採取された生体試料中の少なくとも１つのバイオマーカーを測定することと、ｂ）生体試料中の少なくとも１つのバイオマーカーの測定された値を対照対象のバイオマーカーの基準値と比較することと、を含むアッセイを含み、基準値と比較した生体試料中の少なくとも１つのバイオマーカーの差次的発現が、対象が敗血症を有することを示す。生体試料は、例えば、全血、バフィーコート、血漿、血清、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、帯状核細胞、好中球、単球、またはＴ細胞を含み得る。一実施形態では、本アッセイは、対象の感染Ｚ－スコアを決定することをさらに含む。

一実施形態では、本発明は、ａ）敗血症を有する疑いのある対象から採取された生体試料中の本明細書に記載のバイオマーカーパネルの各バイオマーカーを測定することと、ｂ）生体試料中のバイオマーカーパネルの各バイオマーカーの測定された値を対照対象の各バイオマーカーの基準値と比較することと、を含むアッセイを含み、基準値と比較した生体試料中のバイオマーカーの差次的発現が、対象が敗血症を有することを示す。生体試料は、例えば、全血、バフィーコート、血漿、血清、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、帯状核細胞、好中球、単球、またはＴ細胞を含み得る。本アッセイは、対象の感染Ｚ－スコアを決定することをさらに含み得る。

他の実施形態では、少なくとも１つのバイオマーカーの測定は、マイクロアレイ分析、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）、ノーザンブロット、または遺伝子発現連続分析（ＳＡＧＥ）を行うことを含む。一実施形態では、マイクロアレイ分析は、ＣＥＡＣＡＭ１ポリヌクレオチドにハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、ＺＤＨＨＣ１９ポリヌクレオチドにハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、Ｃ９ｏｒｆ９５ポリヌクレオチドにハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、ＧＮＡ１５ポリヌクレオチドにハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、ＢＡＴＦポリヌクレオチドにハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、Ｃ３ＡＲ１ポリヌクレオチドにハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、ＫＩＡＡ１３７０ポリヌクレオチドにハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、ＴＧＦＢＩポリヌクレオチドにハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、ＭＴＣＨ１ポリヌクレオチドにハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、ＲＰＧＲＩＰ１ポリヌクレオチドにハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、及びＨＬＡ－ＤＰＢ１ポリヌクレオチドにハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含むマイクロアレイを用いて行われる。

別の態様では、本発明は、データを記憶するためのストレージコンポーネント（すなわち、メモリ）であって、対象の診断を決定する指示が内部に記憶させている、ストレージコンポーネントと、データを処理するためのコンピュータプロセッサであって、ストレージコンポーネントに連結されており、ストレージコンポーネントに記憶された指示を実行して、患者データを受け取り、かつアルゴリズムに従って患者データを分析するように構成されている、コンピュータプロセッサと、患者の診断に関する情報を表示するためのディスプレイコンポーネントと、を備える診断システムを含む。ストレージコンポーネントは、本明細書に記載されるように感染Ｚ－スコアまたは敗血症スコアを計算する指示を含み得る（実施例１及び２を参照のこと）。加えて、ストレージコンポーネントは、多変量線形判別分析（ＬＤＡ）、受信者動作特性（ＲＯＣ）分析、主成分分析（ＰＣＡ）、アンサンブルデータマイニング法、マイクロアレイ細胞特異的有意性分析（ｃｓＳＡＭ）、または多次元タンパク質同定技術（ＭＵＤＰＩＴ）分析を行う指示をさらに含み得る。

ある特定の実施形態では、本発明は、敗血症を有する疑いのある患者を診断するためのコンピュータ実施方法を含み、コンピュータは、ａ）患者由来の生体試料の複数の敗血症バイオマーカーのレベルの値を含む入力された患者データを受け取るステップと、ｂ）複数の敗血症バイオマーカーのレベルを分析し、敗血症バイオマーカーのそれぞれの基準値範囲と比較するステップと、ｃ）敗血症バイオマーカーのレベルに基づいて患者の感染Ｚ－スコアまたは敗血症スコアを計算するステップと、ｄ）感染Ｚ－スコアの値に基づいて患者が敗血症を有する可能性を計算するステップと、ｅ）患者の診断に関する情報を表示するステップと、を含むステップを行う。

ある特定の実施形態では、入力された患者データは、患者由来の生体試料中の少なくとも１１個の敗血症バイオマーカーのレベルの値を含む。例えば、入力された患者データは、ＣＥＡＣＡＭ１ポリヌクレオチド、ＺＤＨＨＣ１９ポリヌクレオチド、Ｃ９ｏｒｆ９５ポリヌクレオチド、ＧＮＡ１５ポリヌクレオチド、ＢＡＴＦポリヌクレオチド、Ｃ３ＡＲ１ポリヌクレオチド、ＫＩＡＡ１３７０ポリヌクレオチド、ＴＧＦＢＩポリヌクレオチド、ＭＴＣＨ１ポリヌクレオチド、ＲＰＧＲＩＰ１ポリヌクレオチド、及びＨＬＡ－ＤＰＢ１ポリヌクレオチドのレベルの値を含み得る。

別の実施形態では、本発明は、敗血症を有する疑いのある患者を診断するためのコンピュータ実施方法を含み、コンピュータは、ａ）患者由来の生体試料中のバイオマーカーＣＥＡＣＡＭ１、ＺＤＨＨＣ１９、Ｃ９ｏｒｆ９５、ＧＮＡ１５、ＢＡＴＦ、Ｃ３ＡＲ１、ＫＩＡＡ１３７０、ＴＧＦＢＩ、ＭＴＣＨ１、ＲＰＧＲＩＰ１、及びＨＬＡ－ＤＰＢ１の発現レベルの値を含む入力された患者データを受け取るステップと、ｂ）各バイオマーカーのレベルを分析し、各バイオマーカーのそれぞれの基準値範囲と比較するステップと、ｃ）以下の式に従ってバイオマーカーの発現レベルに基づいて患者の敗血症スコアを計算するステップと、

ｄ）敗血症スコアの値に基づいて患者が敗血症を有する可能性を計算するステップであって、非感染対照対象の基準値範囲と比較してより高い患者の敗血症スコアが、患者が敗血症を有することを示す、計算するステップと、ｅ）患者の診断に関する情報を表示するステップと、を含むステップを行う。

当業者であれば、本明細書の開示に照らして、本発明のこれら及び他の実施形態を容易に思いつくであろう。

無菌性ＳＩＲＳ／外傷患者と敗血症患者とを比較したラベル付け主成分分析（ＰＣＡ）を示す。図１Ａは、無菌性ＳＩＲＳ／外傷患者及び敗血症患者がトランスクリプトーム空間で大いに分類可能であるように見えることを示し、分類不能な組はほとんど存在しない。図１Ｂは、非感染性ＳＩＲＳ／外傷からの回復期にある患者、及び院内感染敗血症を有する患者を反映するように更新されたラベルでラベル付けされた同じＰＣＡを示し、「後期」群（入院後４８時間超）の分類がはるかにより困難である。Ｎ＝１０９４（１５の研究の組み合わせ）。無菌性ＳＩＲＳ／外傷患者と敗血症患者とを比較したラベル付け主成分分析（ＰＣＡ）を示す。図１Ａは、無菌性ＳＩＲＳ／外傷患者及び敗血症患者がトランスクリプトーム空間で大いに分類可能であるように見えることを示し、分類不能な組はほとんど存在しない。図１Ｂは、非感染性ＳＩＲＳ／外傷からの回復期にある患者、及び院内感染敗血症を有する患者を反映するように更新されたラベルでラベル付けされた同じＰＣＡを示し、「後期」群（入院後４８時間超）の分類がはるかにより困難である。Ｎ＝１０９４（１５の研究の組み合わせ）。１１遺伝子セットの効果量を示す。発見コホートの各々における、ＳＩＲＳ／外傷／ＩＣＵと感染／敗血症患者とを比較した、陽性遺伝子の効果量の変量効果モデル推定値のフォレストプロットが示されている。１１遺伝子セットの効果量を示す。発見コホートの各々における、ＳＩＲＳ／外傷／ＩＣＵと感染／敗血症患者とを比較した、陽性遺伝子の効果量の変量効果モデル推定値のフォレストプロットが示されている。１１遺伝子セットの効果量を示す。発見コホートの各々における、ＳＩＲＳ／外傷／ＩＣＵと感染／敗血症患者とを比較した、陽性遺伝子の効果量の変量効果モデル推定値のフォレストプロットが示されている。１１遺伝子セットの効果量を示す。発見コホートの各々における、ＳＩＲＳ／外傷／ＩＣＵと感染／敗血症患者とを比較した、陽性遺伝子の効果量の変量効果モデル推定値のフォレストプロットが示されている。発見データセット及び好中球検証データセットにおける１１遺伝子セットの結果を示す。図３Ａは、発見データセットにおける、無菌性ＳＩＲＳ／ＩＣＵ／外傷患者を、敗血症を有する患者と分類するＲＯＣ曲線を示す。図３Ｂは、ＧｌｕｅＧｒａｎｔ好中球検証データセットにおける、感染を有する外傷患者を、感染を有しない時間一致外傷患者と分類するＲＯＣ曲線を示す。損傷以降１日超後のＧｌｕｅＧｒａｎｔ（図３Ｃ）バフィーコート発見試料及び（図３Ｄ）好中球検証試料は、非感染患者と診断から±２４時間以内の患者とを対比した平均感染Ｚ－スコアを示す。いずれの場合でも、時間及び感染状態の両方に起因する有意な効果がある。（図３Ｅ）バフィーコート発見試料及び（図３Ｆ）好中球検証試料の損傷後経過時間による感染Ｚ－スコアのボックスプロットが示されており、以前に感染していない患者を、感染の５日超前、感染の５～１日前、診断（症例）から±１日、及び感染診断から２～５日後の患者と比較する。ＪＴ傾向検定は、入院後の各時点の以前に感染していない患者から感染の±１日の患者までの傾向の増加について有意（ｐ＜０．０１）であった。発見データセット及び好中球検証データセットにおける１１遺伝子セットの結果を示す。図３Ａは、発見データセットにおける、無菌性ＳＩＲＳ／ＩＣＵ／外傷患者を、敗血症を有する患者と分類するＲＯＣ曲線を示す。図３Ｂは、ＧｌｕｅＧｒａｎｔ好中球検証データセットにおける、感染を有する外傷患者を、感染を有しない時間一致外傷患者と分類するＲＯＣ曲線を示す。損傷以降１日超後のＧｌｕｅＧｒａｎｔ（図３Ｃ）バフィーコート発見試料及び（図３Ｄ）好中球検証試料は、非感染患者と診断から±２４時間以内の患者とを対比した平均感染Ｚ－スコアを示す。いずれの場合でも、時間及び感染状態の両方に起因する有意な効果がある。（図３Ｅ）バフィーコート発見試料及び（図３Ｆ）好中球検証試料の損傷後経過時間による感染Ｚ－スコアのボックスプロットが示されており、以前に感染していない患者を、感染の５日超前、感染の５～１日前、診断（症例）から±１日、及び感染診断から２～５日後の患者と比較する。ＪＴ傾向検定は、入院後の各時点の以前に感染していない患者から感染の±１日の患者までの傾向の増加について有意（ｐ＜０．０１）であった。発見データセット及び好中球検証データセットにおける１１遺伝子セットの結果を示す。図３Ａは、発見データセットにおける、無菌性ＳＩＲＳ／ＩＣＵ／外傷患者を、敗血症を有する患者と分類するＲＯＣ曲線を示す。図３Ｂは、ＧｌｕｅＧｒａｎｔ好中球検証データセットにおける、感染を有する外傷患者を、感染を有しない時間一致外傷患者と分類するＲＯＣ曲線を示す。損傷以降１日超後のＧｌｕｅＧｒａｎｔ（図３Ｃ）バフィーコート発見試料及び（図３Ｄ）好中球検証試料は、非感染患者と診断から±２４時間以内の患者とを対比した平均感染Ｚ－スコアを示す。いずれの場合でも、時間及び感染状態の両方に起因する有意な効果がある。（図３Ｅ）バフィーコート発見試料及び（図３Ｆ）好中球検証試料の損傷後経過時間による感染Ｚ－スコアのボックスプロットが示されており、以前に感染していない患者を、感染の５日超前、感染の５～１日前、診断（症例）から±１日、及び感染診断から２～５日後の患者と比較する。ＪＴ傾向検定は、入院後の各時点の以前に感染していない患者から感染の±１日の患者までの傾向の増加について有意（ｐ＜０．０１）であった。発見データセット及び好中球検証データセットにおける１１遺伝子セットの結果を示す。図３Ａは、発見データセットにおける、無菌性ＳＩＲＳ／ＩＣＵ／外傷患者を、敗血症を有する患者と分類するＲＯＣ曲線を示す。図３Ｂは、ＧｌｕｅＧｒａｎｔ好中球検証データセットにおける、感染を有する外傷患者を、感染を有しない時間一致外傷患者と分類するＲＯＣ曲線を示す。損傷以降１日超後のＧｌｕｅＧｒａｎｔ（図３Ｃ）バフィーコート発見試料及び（図３Ｄ）好中球検証試料は、非感染患者と診断から±２４時間以内の患者とを対比した平均感染Ｚ－スコアを示す。いずれの場合でも、時間及び感染状態の両方に起因する有意な効果がある。（図３Ｅ）バフィーコート発見試料及び（図３Ｆ）好中球検証試料の損傷後経過時間による感染Ｚ－スコアのボックスプロットが示されており、以前に感染していない患者を、感染の５日超前、感染の５～１日前、診断（症例）から±１日、及び感染診断から２～５日後の患者と比較する。ＪＴ傾向検定は、入院後の各時点の以前に感染していない患者から感染の±１日の患者までの傾向の増加について有意（ｐ＜０．０１）であった。発見データセット及び好中球検証データセットにおける１１遺伝子セットの結果を示す。図３Ａは、発見データセットにおける、無菌性ＳＩＲＳ／ＩＣＵ／外傷患者を、敗血症を有する患者と分類するＲＯＣ曲線を示す。図３Ｂは、ＧｌｕｅＧｒａｎｔ好中球検証データセットにおける、感染を有する外傷患者を、感染を有しない時間一致外傷患者と分類するＲＯＣ曲線を示す。損傷以降１日超後のＧｌｕｅＧｒａｎｔ（図３Ｃ）バフィーコート発見試料及び（図３Ｄ）好中球検証試料は、非感染患者と診断から±２４時間以内の患者とを対比した平均感染Ｚ－スコアを示す。いずれの場合でも、時間及び感染状態の両方に起因する有意な効果がある。（図３Ｅ）バフィーコート発見試料及び（図３Ｆ）好中球検証試料の損傷後経過時間による感染Ｚ－スコアのボックスプロットが示されており、以前に感染していない患者を、感染の５日超前、感染の５～１日前、診断（症例）から±１日、及び感染診断から２～５日後の患者と比較する。ＪＴ傾向検定は、入院後の各時点の以前に感染していない患者から感染の±１日の患者までの傾向の増加について有意（ｐ＜０．０１）であった。発見データセット及び好中球検証データセットにおける１１遺伝子セットの結果を示す。図３Ａは、発見データセットにおける、無菌性ＳＩＲＳ／ＩＣＵ／外傷患者を、敗血症を有する患者と分類するＲＯＣ曲線を示す。図３Ｂは、ＧｌｕｅＧｒａｎｔ好中球検証データセットにおける、感染を有する外傷患者を、感染を有しない時間一致外傷患者と分類するＲＯＣ曲線を示す。損傷以降１日超後のＧｌｕｅＧｒａｎｔ（図３Ｃ）バフィーコート発見試料及び（図３Ｄ）好中球検証試料は、非感染患者と診断から±２４時間以内の患者とを対比した平均感染Ｚ－スコアを示す。いずれの場合でも、時間及び感染状態の両方に起因する有意な効果がある。（図３Ｅ）バフィーコート発見試料及び（図３Ｆ）好中球検証試料の損傷後経過時間による感染Ｚ－スコアのボックスプロットが示されており、以前に感染していない患者を、感染の５日超前、感染の５～１日前、診断（症例）から±１日、及び感染診断から２～５日後の患者と比較する。ＪＴ傾向検定は、入院後の各時点の以前に感染していない患者から感染の±１日の患者までの傾向の増加について有意（ｐ＜０．０１）であった。ＶＡＰを発症する外傷／ＩＣＵ患者の非対照データセットを示す。これらのデータセットは非感染患者を含まず、それ故に、それらの患者は、経験的ベイズ時間一致共正規化ＧｌｕｅＧｒａｎｔ患者であった。灰色の線は、（図４Ａ）ＥＭＥＸＰ３００１、（図４Ｂ）ＧＳＥ６３７７、及び（図４Ｃ）ＧＳＥ１２８３８好中球試料及び全血試料のＧｌｕｅＧｒａｎｔレス（ｌｏｅｓｓ）曲線を示す。あらゆる場合において、入院以降の最初の８日間のみが示されており、患者を感染診断から１日超後に検閲する。図４Ｄは、診断から±１日以内の患者（図４Ａ～４Ｃの濃い灰色の点）と時間一致非感染ＧｌｕｅＧｒａｎｔ患者とを比較したＲＯＣ曲線を示す。さらなるデータセットの詳細については、表５を参照されたい。ＶＡＰを発症する外傷／ＩＣＵ患者の非対照データセットを示す。これらのデータセットは非感染患者を含まず、それ故に、それらの患者は、経験的ベイズ時間一致共正規化ＧｌｕｅＧｒａｎｔ患者であった。灰色の線は、（図４Ａ）ＥＭＥＸＰ３００１、（図４Ｂ）ＧＳＥ６３７７、及び（図４Ｃ）ＧＳＥ１２８３８好中球試料及び全血試料のＧｌｕｅＧｒａｎｔレス（ｌｏｅｓｓ）曲線を示す。あらゆる場合において、入院以降の最初の８日間のみが示されており、患者を感染診断から１日超後に検閲する。図４Ｄは、診断から±１日以内の患者（図４Ａ～４Ｃの濃い灰色の点）と時間一致非感染ＧｌｕｅＧｒａｎｔ患者とを比較したＲＯＣ曲線を示す。さらなるデータセットの詳細については、表５を参照されたい。ＶＡＰを発症する外傷／ＩＣＵ患者の非対照データセットを示す。これらのデータセットは非感染患者を含まず、それ故に、それらの患者は、経験的ベイズ時間一致共正規化ＧｌｕｅＧｒａｎｔ患者であった。灰色の線は、（図４Ａ）ＥＭＥＸＰ３００１、（図４Ｂ）ＧＳＥ６３７７、及び（図４Ｃ）ＧＳＥ１２８３８好中球試料及び全血試料のＧｌｕｅＧｒａｎｔレス（ｌｏｅｓｓ）曲線を示す。あらゆる場合において、入院以降の最初の８日間のみが示されており、患者を感染診断から１日超後に検閲する。図４Ｄは、診断から±１日以内の患者（図４Ａ～４Ｃの濃い灰色の点）と時間一致非感染ＧｌｕｅＧｒａｎｔ患者とを比較したＲＯＣ曲線を示す。さらなるデータセットの詳細については、表５を参照されたい。ＶＡＰを発症する外傷／ＩＣＵ患者の非対照データセットを示す。これらのデータセットは非感染患者を含まず、それ故に、それらの患者は、経験的ベイズ時間一致共正規化ＧｌｕｅＧｒａｎｔ患者であった。灰色の線は、（図４Ａ）ＥＭＥＸＰ３００１、（図４Ｂ）ＧＳＥ６３７７、及び（図４Ｃ）ＧＳＥ１２８３８好中球試料及び全血試料のＧｌｕｅＧｒａｎｔレス（ｌｏｅｓｓ）曲線を示す。あらゆる場合において、入院以降の最初の８日間のみが示されており、患者を感染診断から１日超後に検閲する。図４Ｄは、診断から±１日以内の患者（図４Ａ～４Ｃの濃い灰色の点）と時間一致非感染ＧｌｕｅＧｒａｎｔ患者とを比較したＲＯＣ曲線を示す。さらなるデータセットの詳細については、表５を参照されたい。健常患者と敗血症患者との判別を示す。試験対象患者基準を満たした８個の独立検証データセット（敗血症診断から４８時間以内に試料採取された末梢全血または好中球）を感染Ｚ－スコアとともに試験した。図５Ａは、単一バイオリンプロット内で組み合わせられた全てのｎ＝４４６患者の感染Ｚ－スコアを示し、エラーバーは、中間四分位数を示す。ｐ値をＷｉｌｃｏｘｏｎ順位和検定で計算した。図５Ｂは、敗血症患者を健常対照と判別する８個のデータセットの各々の別個のＲＯＣ曲線を示す。平均値ＲＯＣＡＵＣは、０．９８である。さらなるデータセットの詳細については、表６を参照されたい。健常患者と敗血症患者との判別を示す。試験対象患者基準を満たした８個の独立検証データセット（敗血症診断から４８時間以内に試料採取された末梢全血または好中球）を感染Ｚ－スコアとともに試験した。図５Ａは、単一バイオリンプロット内で組み合わせられた全てのｎ＝４４６患者の感染Ｚ－スコアを示し、エラーバーは、中間四分位数を示す。ｐ値をＷｉｌｃｏｘｏｎ順位和検定で計算した。図５Ｂは、敗血症患者を健常対照と判別する８個のデータセットの各々の別個のＲＯＣ曲線を示す。平均値ＲＯＣＡＵＣは、０．９８である。さらなるデータセットの詳細については、表６を参照されたい。細胞型エンリッチメント分析を示す。（図６Ａ）マルチコホート分析において有意であることが見出された８２個の遺伝子の全セット及び（図６Ｂ）順方向検索後に見つけられた１１遺伝子セット（８２個の遺伝子のサブセット）の両方のヒト免疫細胞型の標準化エンリッチメントスコア（Ｚ－スコア、黒色の点）が示されている。図６Ｂは、Ｚ－スコアの分布のボックスプロットも示す。細胞型エンリッチメント分析を示す。（図６Ａ）マルチコホート分析において有意であることが見出された８２個の遺伝子の全セット及び（図６Ｂ）順方向検索後に見つけられた１１遺伝子セット（８２個の遺伝子のサブセット）の両方のヒト免疫細胞型の標準化エンリッチメントスコア（Ｚ－スコア、黒色の点）が示されている。図６Ｂは、Ｚ－スコアの分布のボックスプロットも示す。健常患者とＳＩＲＳ／外傷患者と敗血症患者とを比較したラベル付けＰＣＡを示す。図７Ａは、健常患者、ＳＩＲＳ／外傷患者、及び敗血症患者がトランスクリプトーム空間で大いに分類可能であるように見えることを示し、分類不能な組はほとんど存在しない。図７Ｂは、非感染性ＳＩＲＳ／外傷からの回復期にある患者、及び院内感染敗血症を有する患者を反映するように更新されたラベルでラベル付けされた同じＰＣＡを示し、「後期」群（入院後４８時間超）の分類がはるかにより困難である。Ｎ＝１３１６（１５の研究の組み合わせ）。健常患者とＳＩＲＳ／外傷患者と敗血症患者とを比較したラベル付けＰＣＡを示す。図７Ａは、健常患者、ＳＩＲＳ／外傷患者、及び敗血症患者がトランスクリプトーム空間で大いに分類可能であるように見えることを示し、分類不能な組はほとんど存在しない。図７Ｂは、非感染性ＳＩＲＳ／外傷からの回復期にある患者、及び院内感染敗血症を有する患者を反映するように更新されたラベルでラベル付けされた同じＰＣＡを示し、「後期」群（入院後４８時間超）の分類がはるかにより困難である。Ｎ＝１３１６（１５の研究の組み合わせ）。完全血球数及びマイクロアレイデータの両方を用いたＧｌｕｅＧｒａｎｔ患者の好中球割合を示す。中央値好中球割合は、全ての時点で７５～８５％である。それらの入院中に感染した患者を入院中に感染しなかった患者と比較する。ＧＰＳＳＳＩ固有（図９Ａ）、ＧＳＥ２８７５０（図９Ｂ）、ＧＳＥ３２７０７（図９Ｃ）、及びＧＳＥ４００１２（図９Ｄ）を含む、発見マルチコホート分析に含まれたデータセットのバイオリンプロットを示す。入院時のＳＩＲＳ／ＩＣＵ／外傷患者と敗血症患者とを比較したデータセットが示されている。エラーバーは、中間四分位数を示す。ｐ値を、Ｗｉｌｃｏｘｏｎ順位和検定を使用して算定する。図９Ｅ～９Ｉは、［１，３）（図９Ｅ）、［３，６）（図９Ｆ）、［６，１０）（図９Ｇ）、［１０，１８）（図９Ｈ）、及び［１８，２４）（図９Ｉ）を含む、非感染外傷患者と敗血症患者とを一致時点で比較したＧｌｕｅＧｒａｎｔバフィーコートコホートの発見マルチコホート分析に含まれるデータセットのバイオリンプロットを示す。エラーバーは、中間四分位数を示す。Ｐ値を、Ｗｉｌｃｏｘｏｎ順位和検定を使用して算定する。ＧＰＳＳＳＩ固有（図９Ａ）、ＧＳＥ２８７５０（図９Ｂ）、ＧＳＥ３２７０７（図９Ｃ）、及びＧＳＥ４００１２（図９Ｄ）を含む、発見マルチコホート分析に含まれたデータセットのバイオリンプロットを示す。入院時のＳＩＲＳ／ＩＣＵ／外傷患者と敗血症患者とを比較したデータセットが示されている。エラーバーは、中間四分位数を示す。ｐ値を、Ｗｉｌｃｏｘｏｎ順位和検定を使用して算定する。図９Ｅ～９Ｉは、［１，３）（図９Ｅ）、［３，６）（図９Ｆ）、［６，１０）（図９Ｇ）、［１０，１８）（図９Ｈ）、及び［１８，２４）（図９Ｉ）を含む、非感染外傷患者と敗血症患者とを一致時点で比較したＧｌｕｅＧｒａｎｔバフィーコートコホートの発見マルチコホート分析に含まれるデータセットのバイオリンプロットを示す。エラーバーは、中間四分位数を示す。Ｐ値を、Ｗｉｌｃｏｘｏｎ順位和検定を使用して算定する。ＧＰＳＳＳＩ固有（図９Ａ）、ＧＳＥ２８７５０（図９Ｂ）、ＧＳＥ３２７０７（図９Ｃ）、及びＧＳＥ４００１２（図９Ｄ）を含む、発見マルチコホート分析に含まれたデータセットのバイオリンプロットを示す。入院時のＳＩＲＳ／ＩＣＵ／外傷患者と敗血症患者とを比較したデータセットが示されている。エラーバーは、中間四分位数を示す。ｐ値を、Ｗｉｌｃｏｘｏｎ順位和検定を使用して算定する。図９Ｅ～９Ｉは、［１，３）（図９Ｅ）、［３，６）（図９Ｆ）、［６，１０）（図９Ｇ）、［１０，１８）（図９Ｈ）、及び［１８，２４）（図９Ｉ）を含む、非感染外傷患者と敗血症患者とを一致時点で比較したＧｌｕｅＧｒａｎｔバフィーコートコホートの発見マルチコホート分析に含まれるデータセットのバイオリンプロットを示す。エラーバーは、中間四分位数を示す。Ｐ値を、Ｗｉｌｃｏｘｏｎ順位和検定を使用して算定する。ＧＰＳＳＳＩ固有（図９Ａ）、ＧＳＥ２８７５０（図９Ｂ）、ＧＳＥ３２７０７（図９Ｃ）、及びＧＳＥ４００１２（図９Ｄ）を含む、発見マルチコホート分析に含まれたデータセットのバイオリンプロットを示す。入院時のＳＩＲＳ／ＩＣＵ／外傷患者と敗血症患者とを比較したデータセットが示されている。エラーバーは、中間四分位数を示す。ｐ値を、Ｗｉｌｃｏｘｏｎ順位和検定を使用して算定する。図９Ｅ～９Ｉは、［１，３）（図９Ｅ）、［３，６）（図９Ｆ）、［６，１０）（図９Ｇ）、［１０，１８）（図９Ｈ）、及び［１８，２４）（図９Ｉ）を含む、非感染外傷患者と敗血症患者とを一致時点で比較したＧｌｕｅＧｒａｎｔバフィーコートコホートの発見マルチコホート分析に含まれるデータセットのバイオリンプロットを示す。エラーバーは、中間四分位数を示す。Ｐ値を、Ｗｉｌｃｏｘｏｎ順位和検定を使用して算定する。ＧＰＳＳＳＩ固有（図９Ａ）、ＧＳＥ２８７５０（図９Ｂ）、ＧＳＥ３２７０７（図９Ｃ）、及びＧＳＥ４００１２（図９Ｄ）を含む、発見マルチコホート分析に含まれたデータセットのバイオリンプロットを示す。入院時のＳＩＲＳ／ＩＣＵ／外傷患者と敗血症患者とを比較したデータセットが示されている。エラーバーは、中間四分位数を示す。ｐ値を、Ｗｉｌｃｏｘｏｎ順位和検定を使用して算定する。図９Ｅ～９Ｉは、［１，３）（図９Ｅ）、［３，６）（図９Ｆ）、［６，１０）（図９Ｇ）、［１０，１８）（図９Ｈ）、及び［１８，２４）（図９Ｉ）を含む、非感染外傷患者と敗血症患者とを一致時点で比較したＧｌｕｅＧｒａｎｔバフィーコートコホートの発見マルチコホート分析に含まれるデータセットのバイオリンプロットを示す。エラーバーは、中間四分位数を示す。Ｐ値を、Ｗｉｌｃｏｘｏｎ順位和検定を使用して算定する。ＧＰＳＳＳＩ固有（図９Ａ）、ＧＳＥ２８７５０（図９Ｂ）、ＧＳＥ３２７０７（図９Ｃ）、及びＧＳＥ４００１２（図９Ｄ）を含む、発見マルチコホート分析に含まれたデータセットのバイオリンプロットを示す。入院時のＳＩＲＳ／ＩＣＵ／外傷患者と敗血症患者とを比較したデータセットが示されている。エラーバーは、中間四分位数を示す。ｐ値を、Ｗｉｌｃｏｘｏｎ順位和検定を使用して算定する。図９Ｅ～９Ｉは、［１，３）（図９Ｅ）、［３，６）（図９Ｆ）、［６，１０）（図９Ｇ）、［１０，１８）（図９Ｈ）、及び［１８，２４）（図９Ｉ）を含む、非感染外傷患者と敗血症患者とを一致時点で比較したＧｌｕｅＧｒａｎｔバフィーコートコホートの発見マルチコホート分析に含まれるデータセットのバイオリンプロットを示す。エラーバーは、中間四分位数を示す。Ｐ値を、Ｗｉｌｃｏｘｏｎ順位和検定を使用して算定する。ＧＰＳＳＳＩ固有（図９Ａ）、ＧＳＥ２８７５０（図９Ｂ）、ＧＳＥ３２７０７（図９Ｃ）、及びＧＳＥ４００１２（図９Ｄ）を含む、発見マルチコホート分析に含まれたデータセットのバイオリンプロットを示す。入院時のＳＩＲＳ／ＩＣＵ／外傷患者と敗血症患者とを比較したデータセットが示されている。エラーバーは、中間四分位数を示す。ｐ値を、Ｗｉｌｃｏｘｏｎ順位和検定を使用して算定する。図９Ｅ～９Ｉは、［１，３）（図９Ｅ）、［３，６）（図９Ｆ）、［６，１０）（図９Ｇ）、［１０，１８）（図９Ｈ）、及び［１８，２４）（図９Ｉ）を含む、非感染外傷患者と敗血症患者とを一致時点で比較したＧｌｕｅＧｒａｎｔバフィーコートコホートの発見マルチコホート分析に含まれるデータセットのバイオリンプロットを示す。エラーバーは、中間四分位数を示す。Ｐ値を、Ｗｉｌｃｏｘｏｎ順位和検定を使用して算定する。ＧＰＳＳＳＩ固有（図９Ａ）、ＧＳＥ２８７５０（図９Ｂ）、ＧＳＥ３２７０７（図９Ｃ）、及びＧＳＥ４００１２（図９Ｄ）を含む、発見マルチコホート分析に含まれたデータセットのバイオリンプロットを示す。入院時のＳＩＲＳ／ＩＣＵ／外傷患者と敗血症患者とを比較したデータセットが示されている。エラーバーは、中間四分位数を示す。ｐ値を、Ｗｉｌｃｏｘｏｎ順位和検定を使用して算定する。図９Ｅ～９Ｉは、［１，３）（図９Ｅ）、［３，６）（図９Ｆ）、［６，１０）（図９Ｇ）、［１０，１８）（図９Ｈ）、及び［１８，２４）（図９Ｉ）を含む、非感染外傷患者と敗血症患者とを一致時点で比較したＧｌｕｅＧｒａｎｔバフィーコートコホートの発見マルチコホート分析に含まれるデータセットのバイオリンプロットを示す。エラーバーは、中間四分位数を示す。Ｐ値を、Ｗｉｌｃｏｘｏｎ順位和検定を使用して算定する。ＧＰＳＳＳＩ固有（図９Ａ）、ＧＳＥ２８７５０（図９Ｂ）、ＧＳＥ３２７０７（図９Ｃ）、及びＧＳＥ４００１２（図９Ｄ）を含む、発見マルチコホート分析に含まれたデータセットのバイオリンプロットを示す。入院時のＳＩＲＳ／ＩＣＵ／外傷患者と敗血症患者とを比較したデータセットが示されている。エラーバーは、中間四分位数を示す。ｐ値を、Ｗｉｌｃｏｘｏｎ順位和検定を使用して算定する。図９Ｅ～９Ｉは、［１，３）（図９Ｅ）、［３，６）（図９Ｆ）、［６，１０）（図９Ｇ）、［１０，１８）（図９Ｈ）、及び［１８，２４）（図９Ｉ）を含む、非感染外傷患者と敗血症患者とを一致時点で比較したＧｌｕｅＧｒａｎｔバフィーコートコホートの発見マルチコホート分析に含まれるデータセットのバイオリンプロットを示す。エラーバーは、中間四分位数を示す。Ｐ値を、Ｗｉｌｃｏｘｏｎ順位和検定を使用して算定する。ＧｌｕｅＧｒａｎｔコホート由来の選別された単球における感染Ｚ－スコアの性能を示す。これらは、図３Ｂ、３Ｄ、及び３Ｆの好中球検証コホートと同じ患者である。図１０Ａは、４つの試料採取時間ビンの各々のＲＯＣ曲線を示す。図１０Ｂは、損傷後経過時間による感染Ｚ－スコアのボックスプロットを示す。以前に感染していない患者を、感染の５日超前、感染の５～１日前、診断（症例）から±１日以内、及び感染から２～５日後の患者と比較する。ＧｌｕｅＧｒａｎｔコホート由来の選別された単球における感染Ｚ－スコアの性能を示す。これらは、図３Ｂ、３Ｄ、及び３Ｆの好中球検証コホートと同じ患者である。図１０Ａは、４つの試料採取時間ビンの各々のＲＯＣ曲線を示す。図１０Ｂは、損傷後経過時間による感染Ｚ－スコアのボックスプロットを示す。以前に感染していない患者を、感染の５日超前、感染の５～１日前、診断（症例）から±１日以内、及び感染から２～５日後の患者と比較する。ＧｌｕｅＧｒａｎｔコホート由来の選別されたＴ細胞における感染Ｚ－スコアの性能を示す。これらは、図３Ｂ、３Ｄ、及び３Ｆの好中球検証コホートと同じ患者である。図１１Ａは、４つの試料採取時間ビンの各々のＲＯＣ曲線を示す。図１１Ｂは、損傷後経過時間による感染Ｚ－スコアのボックスプロットを示す。以前に感染していない患者を、感染の５日超前、感染の５～１日前、診断（症例）から±１日以内、及び感染から２～５日後の患者と比較する。ＧｌｕｅＧｒａｎｔコホート由来の選別されたＴ細胞における感染Ｚ－スコアの性能を示す。これらは、図３Ｂ、３Ｄ、及び３Ｆの好中球検証コホートと同じ患者である。図１１Ａは、４つの試料採取時間ビンの各々のＲＯＣ曲線を示す。図１１Ｂは、損傷後経過時間による感染Ｚ－スコアのボックスプロットを示す。以前に感染していない患者を、感染の５日超前、感染の５～１日前、診断（症例）から±１日以内、及び感染から２～５日後の患者と比較する。ＳＩＲＳ基準及び感染Ｚ－スコアの線形モデルを示す。図１２Ａは、ＧｌｕｅＧｒａｎｔ患者のロジスティック回帰モデルを示し、ＳＩＲＳデータもマイクロアレイデータもいずれも入手可能である。ＳＩＲＳ基準を２値変数として表す。第１のモデルは、組み合わせでのＳＩＲＳ基準を示し、第２のモデルは、感染Ｚ－スコアを追加する。有意コード：ｐ＜０．００１「＊＊＊」、０．０１「＊＊」、０．０５「＊」。図１２Ｂは、図１２Ａのロジスティック回帰モデルによる出力としての患者の感染の予測対数確率のボックスプロットを示す。ＳＩＲＳ基準及び感染Ｚ－スコアの線形モデルを示す。図１２Ａは、ＧｌｕｅＧｒａｎｔ患者のロジスティック回帰モデルを示し、ＳＩＲＳデータもマイクロアレイデータもいずれも入手可能である。ＳＩＲＳ基準を２値変数として表す。第１のモデルは、組み合わせでのＳＩＲＳ基準を示し、第２のモデルは、感染Ｚ－スコアを追加する。有意コード：ｐ＜０．００１「＊＊＊」、０．０１「＊＊」、０．０５「＊」。図１２Ｂは、図１２Ａのロジスティック回帰モデルによる出力としての患者の感染の予測対数確率のボックスプロットを示す。非時間一致データセットにおける感染Ｚ－スコアを示す。４つのデータセットは、ＳＩＲＳ／ＩＣＵ／外傷患者と敗血症患者とを非一致時点で比較した。これらのデータセットは、好中球（ＧＳＥ５７７２、Ｎ＝９３）、全血（ＥＭＴＡＢ１５４８、Ｎ＝７３）、及びＰＢＭＣ（ＧＳＥ９９６０、Ｎ＝３０、ＥＭＥＸＰ３６２１、Ｎ＝１０）を試験した。さらなるデータセットの詳細については、表７を参照されたい。図１３Ｂ～１３Ｅは、非時間一致データセットにおける感染Ｚ－スコアを示す。ＧＳＥ５７７２（図１３Ｂ）、ＧＳＥ９９６０（図１３Ｃ）、ＥＭＴＡＢ１５４８（図１３Ｄ）、及びＥＭＥＸＰ３６２１（図１３Ｅ）を含む非一致時点データセットのバイオリンプロットが示されている。エラーバーは、中間四分位数を示す。Ｗｉｌｃｏｘｏｎ順位和検定で試験した。非時間一致データセットにおける感染Ｚ－スコアを示す。４つのデータセットは、ＳＩＲＳ／ＩＣＵ／外傷患者と敗血症患者とを非一致時点で比較した。これらのデータセットは、好中球（ＧＳＥ５７７２、Ｎ＝９３）、全血（ＥＭＴＡＢ１５４８、Ｎ＝７３）、及びＰＢＭＣ（ＧＳＥ９９６０、Ｎ＝３０、ＥＭＥＸＰ３６２１、Ｎ＝１０）を試験した。さらなるデータセットの詳細については、表７を参照されたい。図１３Ｂ～１３Ｅは、非時間一致データセットにおける感染Ｚ－スコアを示す。ＧＳＥ５７７２（図１３Ｂ）、ＧＳＥ９９６０（図１３Ｃ）、ＥＭＴＡＢ１５４８（図１３Ｄ）、及びＥＭＥＸＰ３６２１（図１３Ｅ）を含む非一致時点データセットのバイオリンプロットが示されている。エラーバーは、中間四分位数を示す。Ｗｉｌｃｏｘｏｎ順位和検定で試験した。非時間一致データセットにおける感染Ｚ－スコアを示す。４つのデータセットは、ＳＩＲＳ／ＩＣＵ／外傷患者と敗血症患者とを非一致時点で比較した。これらのデータセットは、好中球（ＧＳＥ５７７２、Ｎ＝９３）、全血（ＥＭＴＡＢ１５４８、Ｎ＝７３）、及びＰＢＭＣ（ＧＳＥ９９６０、Ｎ＝３０、ＥＭＥＸＰ３６２１、Ｎ＝１０）を試験した。さらなるデータセットの詳細については、表７を参照されたい。図１３Ｂ～１３Ｅは、非時間一致データセットにおける感染Ｚ－スコアを示す。ＧＳＥ５７７２（図１３Ｂ）、ＧＳＥ９９６０（図１３Ｃ）、ＥＭＴＡＢ１５４８（図１３Ｄ）、及びＥＭＥＸＰ３６２１（図１３Ｅ）を含む非一致時点データセットのバイオリンプロットが示されている。エラーバーは、中間四分位数を示す。Ｗｉｌｃｏｘｏｎ順位和検定で試験した。非時間一致データセットにおける感染Ｚ－スコアを示す。４つのデータセットは、ＳＩＲＳ／ＩＣＵ／外傷患者と敗血症患者とを非一致時点で比較した。これらのデータセットは、好中球（ＧＳＥ５７７２、Ｎ＝９３）、全血（ＥＭＴＡＢ１５４８、Ｎ＝７３）、及びＰＢＭＣ（ＧＳＥ９９６０、Ｎ＝３０、ＥＭＥＸＰ３６２１、Ｎ＝１０）を試験した。さらなるデータセットの詳細については、表７を参照されたい。図１３Ｂ～１３Ｅは、非時間一致データセットにおける感染Ｚ－スコアを示す。ＧＳＥ５７７２（図１３Ｂ）、ＧＳＥ９９６０（図１３Ｃ）、ＥＭＴＡＢ１５４８（図１３Ｄ）、及びＥＭＥＸＰ３６２１（図１３Ｅ）を含む非一致時点データセットのバイオリンプロットが示されている。エラーバーは、中間四分位数を示す。Ｗｉｌｃｏｘｏｎ順位和検定で試験した。非時間一致データセットにおける感染Ｚ－スコアを示す。４つのデータセットは、ＳＩＲＳ／ＩＣＵ／外傷患者と敗血症患者とを非一致時点で比較した。これらのデータセットは、好中球（ＧＳＥ５７７２、Ｎ＝９３）、全血（ＥＭＴＡＢ１５４８、Ｎ＝７３）、及びＰＢＭＣ（ＧＳＥ９９６０、Ｎ＝３０、ＥＭＥＸＰ３６２１、Ｎ＝１０）を試験した。さらなるデータセットの詳細については、表７を参照されたい。図１３Ｂ～１３Ｅは、非時間一致データセットにおける感染Ｚ－スコアを示す。ＧＳＥ５７７２（図１３Ｂ）、ＧＳＥ９９６０（図１３Ｃ）、ＥＭＴＡＢ１５４８（図１３Ｄ）、及びＥＭＥＸＰ３６２１（図１３Ｅ）を含む非一致時点データセットのバイオリンプロットが示されている。エラーバーは、中間四分位数を示す。Ｗｉｌｃｏｘｏｎ順位和検定で試験した。急性感染症を有する患者における感染Ｚ－スコアと健常対照及び自己免疫疾患を有する患者における感染Ｚ－スコアとの比較を示す。ＧＳＥ２２０９８は、健常対照と急性自己免疫炎症または急性感染を有する患者とを比較する。感染Ｚ－スコアは、健常患者及び自己免疫炎症を有する患者の両方からの良好な感染判別を示す。図１４Ａは、バイオリンプロットを示し、エラーバーは、中間四分位数を示す。自己免疫炎症を有する患者と敗血症を有する患者をＷｉｌｃｏｘｏｎ順位和検定で試験した。図１４Ｂは、自己免疫患者または健常対照に対する敗血症患者のＲＯＣプロットを示す。急性感染症を有する患者における感染Ｚ－スコアと健常対照及び自己免疫疾患を有する患者における感染Ｚ－スコアとの比較を示す。ＧＳＥ２２０９８は、健常対照と急性自己免疫炎症または急性感染を有する患者とを比較する。感染Ｚ－スコアは、健常患者及び自己免疫炎症を有する患者の両方からの良好な感染判別を示す。図１４Ａは、バイオリンプロットを示し、エラーバーは、中間四分位数を示す。自己免疫炎症を有する患者と敗血症を有する患者をＷｉｌｃｏｘｏｎ順位和検定で試験した。図１４Ｂは、自己免疫患者または健常対照に対する敗血症患者のＲＯＣプロットを示す。全総合マルチコホート分析の概略図を示す。診断システムの概略図を示す。系統的検索の模式図及び臨床敗血症データセットの選択を示す。入院時の非感染性炎症を有する患者との敗血症／急性感染症のＲＯＣプロット判別を示す。図１８Ａは、１１遺伝子スコアを示す。図１８Ｂは、ＦＡＩＭ３：ＰＬＡＣ８比を示す。図１８Ｃは、ＳｅｐｔｉｃｙｔｅＬａｂを示す。入院時の非感染性炎症を有する患者との敗血症／急性感染症のＲＯＣプロット判別を示す。図１８Ａは、１１遺伝子スコアを示す。図１８Ｂは、ＦＡＩＭ３：ＰＬＡＣ８比を示す。図１８Ｃは、ＳｅｐｔｉｃｙｔｅＬａｂを示す。入院時の非感染性炎症を有する患者との敗血症／急性感染症のＲＯＣプロット判別を示す。図１８Ａは、１１遺伝子スコアを示す。図１８Ｂは、ＦＡＩＭ３：ＰＬＡＣ８比を示す。図１８Ｃは、ＳｅｐｔｉｃｙｔｅＬａｂを示す。以前に感染していない時間一致外傷患者との敗血症／急性感染症を有する外傷患者のＲＯＣプロット判別を示す。図１９Ａは、１１遺伝子スコアを示す。図１９Ｂは、ＦＡＩＭ３：ＰＬＡＣ８比を示す。図１９Ｃは、ＳｅｐｔｉｃｙｔｅＬａｂを示す。以前に感染していない時間一致外傷患者との敗血症／急性感染症を有する外傷患者のＲＯＣプロット判別を示す。図１９Ａは、１１遺伝子スコアを示す。図１９Ｂは、ＦＡＩＭ３：ＰＬＡＣ８比を示す。図１９Ｃは、ＳｅｐｔｉｃｙｔｅＬａｂを示す。以前に感染していない時間一致外傷患者との敗血症／急性感染症を有する外傷患者のＲＯＣプロット判別を示す。図１９Ａは、１１遺伝子スコアを示す。図１９Ｂは、ＦＡＩＭ３：ＰＬＡＣ８比を示す。図１９Ｃは、ＳｅｐｔｉｃｙｔｅＬａｂを示す。

本発明の実施は、別途指示されない限り、当該技術分野の技術の範囲内の従来の薬理学、化学、生化学、組換えＤＮＡ技法及び免疫学方法を用いる。かかる技法は、文献で十分に説明されている。例えば、Ｊ．Ｒ．ＢｒｏｗｎＳｅｐｓｉｓ：Ｓｙｍｐｔｏｍｓ，ＤｉａｇｎｏｓｉｓａｎｄＴｒｅａｔｍｅｎｔ（ＰｕｂｌｉｃＨｅａｌｔｈｉｎｔｈｅ２１ｓｔＣｅｎｔｕｒｙＳｅｒｉｅｓ，ＮｏｖａＳｃｉｅｎｃｅＰｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．，２０１３）、ＳｅｐｓｉｓａｎｄＮｏｎ－ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓＳｙｓｔｅｍｉｃＩｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ：ＦｒｏｍＢｉｏｌｏｇｙｔｏＣｒｉｔｉｃａｌＣａｒｅ（Ｊ．Ｃａｖａｉｌｌｏｎ，Ｃ．Ａｄｒｉｅｅｄｓ．，Ｗｉｌｅｙ－Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，２００８）、Ｓｅｐｓｉｓ：Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ，ＭａｎａｇｅｍｅｎｔａｎｄＨｅａｌｔｈＯｕｔｃｏｍｅｓ（ＡｌｌｅｒｇｉｅｓａｎｄＩｎｆｅｃｔｉｏｕｓＤｉｓｅａｓｅｓ，Ｎ．Ｋｈａｒｄｏｒｉｅｄ．，ＮｏｖａＳｃｉｅｎｃｅＰｕｂＩｎｃ．，２０１４）、ＨａｎｄｂｏｏｋｏｆＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｓ．Ｉ－ＩＶ（Ｄ．Ｍ．ＷｅｉｒａｎｄＣ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌｅｄｓ．，ＢｌａｃｋｗｅｌｌＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＰｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ）、Ａ．Ｌ．Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（ＷｏｒｔｈＰｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．，ｃｕｒｒｅｎｔａｄｄｉｔｉｏｎ）、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔａｌ．，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ（３ｒｄＥｄｉｔｉｏｎ，２００１）、ＭｅｔｈｏｄｓＩｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ｓ．ＣｏｌｏｗｉｃｋａｎｄＮ．Ｋａｐｌａｎｅｄｓ．，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）を参照されたい。

本明細書で引用される全ての出版物、特許、及び特許出願は、上記または以下のものにかかわらず、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。

Ｉ．定義
本発明を説明する際に、以下の用語が用いられ、以下に示されるように定義されるよう意図されている。

本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用されるとき、文脈が別途明確に指示しない限り、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」が複数の指示対象を含むことに留意されたい。したがって、例えば、「１つのバイオマーカー（ａｂｉｏｍａｒｋｅｒ）」への言及は、２つ以上のバイオマーカーの混合物を含むといった具合である。

「約」という用語は、特に所与の量に関して、±５パーセントの偏差を包含するよう意図されている。

本発明との関連での「バイオマーカー」は、対照対象（例えば、陰性と診断されたヒト、正常もしくは健常対象、または非感染対象）から採取された同等の試料と比較して、敗血症を有する患者から採取された試料で差次的に発現されるポリヌクレオチド等の生体化合物を指す。バイオマーカーは、検出及び／または定量され得る核酸、核酸断片、ポリヌクレオチド、またはオリゴヌクレオチドであり得る。敗血症バイオマーカーとしては、ＣＥＡＣＡＭ１、ＺＤＨＨＣ１９、Ｃ９ｏｒｆ９５、ＧＮＡ１５、ＢＡＴＦ、Ｃ３ＡＲ１、ＫＩＡＡ１３７０、ＴＧＦＢＩ、ＭＴＣＨ１、ＲＰＧＲＩＰ１、及びＨＬＡ－ＤＰＢ１を含むが、これらに限定されない、遺伝子または遺伝子のＲＮＡ転写物由来のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドが挙げられる。

「ポリペプチド」及び「タンパク質」という用語は、アミノ酸残基のポリマーを指し、最小長に限定されない。したがって、ペプチド、オリゴペプチド、二量体、多量体等は、この定義内に含まれる。全長タンパク質もその断片もいずれも、この定義によって包含される。これらの用語は、ポリペプチドの発現後修飾、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、水酸化、酸化等も含む。

「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、「核酸」、及び「核酸分子」という用語は、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドのいずれかの任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を含むように本明細書で使用される。この用語は、分子の一次構造のみを指す。したがって、この用語は、三本鎖、二本鎖、及び一本鎖ＤＮＡ、ならびに三本鎖、二本鎖、及び一本鎖ＲＮＡを含む。これは、メチル化及び／またはキャッピング等の修飾、ならびにポリヌクレオチドの非修飾形態も含む。より具体的には、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、「核酸」、及び「核酸分子」という用語は、ポリデオキシリボヌクレオチド（２－デオキシ－Ｄ－リボース含有）、ポリリボヌクレオチド（Ｄ－リボース含有）、及びプリンまたはピリミジン塩基のＮ－またはＣ－グリコシドである任意の他の種類のポリヌクレオチドを含む。「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、「核酸」、及び「核酸分子」という用語間の長さの意図された区別はなく、これらの用語は、同義に使用される。

「差次的に発現される」という語句は、対照対象または非感染対象と比較した、例えば敗血症を有する患者から採取された試料中に存在するバイオマーカーの量及び／または頻度の差を指す。例えば、バイオマーカーは、対照対象の試料と比較して、上昇したレベルまたは低下したレベルで敗血症を有する患者の試料中に存在するポリヌクレオチドであり得る。あるいは、バイオマーカーは、対照対象の試料と比較してより高い頻度またはより低い頻度で敗血症を有する患者の試料中で検出されるポリヌクレオチドであり得る。バイオマーカーは、量、頻度、またはこれらの両方の点で差次的に存在し得る。

ポリヌクレオチドは、一方の試料中のポリヌクレオチドの量が他方の試料中のポリヌクレオチドの量とは統計的に有意に異なる場合、２つの試料間で差次的に発現される。例えば、ポリヌクレオチドは、一方が他方の試料中に存在するポリヌクレオチドを少なくとも約１２０％、少なくとも約１３０％、少なくとも約１５０％、少なくとも約１８０％、少なくとも約２００％、少なくとも約３００％、少なくとも約５００％、少なくとも約７００％、少なくとも約９００％、または少なくとも約１０００％上回る場合、またはそれが一方の試料で検出可能であるが、他方では検出不可能である場合、２つの試料で差次的に発現される。

あるいは、または加えて、ポリヌクレオチドは、敗血症に罹患した患者の試料中のポリヌクレオチドを検出する頻度が対照試料よりも統計的に有意に高いまたは低い場合、二組の試料で差次的に発現される。例えば、ポリヌクレオチドは、一方の組の試料中のポリヌクレオチドが他方の組の試料で観察される頻度よりも少なくとも約１２０％、少なくとも約１３０％、少なくとも約１５０％、少なくとも約１８０％、少なくとも約２００％、少なくとも約３００％、少なくとも約５００％、少なくとも約７００％、少なくとも約９００％、または少なくとも約１０００％高い頻度または低い頻度で検出される場合、二組の試料で差次的に発現される。

「類似値」とは、比較される２つのもの間の類似性の程度を表す数である。例えば、類似値は、特異的表現型関連バイオマーカーを使用した患者の発現プロファイルと、１つ以上の対照試料または基準発現プロファイル中のバイオマーカーの基準値範囲との間の全類似性（例えば、「敗血症」発現プロファイルまたは「無菌性炎症」発現プロファイルとの類似性）を示す数であり得る。類似値は、相関係数等の類似性測定基準として表され得るか、または単に発現レベル差として、または患者試料中のバイオマーカーレベルと対照試料もしくは基準発現プロファイル中のバイオマーカーレベルとの間の発現レベル差の総計として表され得る。

「対象」、「個体」、及び「患者」という用語は、本明細書で同義に使用され、診断、予後、治療、または療法が所望される任意の哺乳類対象、特に、ヒトを指す。他の対象としては、ウシ、イヌ、ネコ、テンジクネズミ、ウサギ、ラット、マウス、ウマ等が挙げられ得る。いくつかの場合では、本発明の方法は、実験動物、獣医学的適用、及び疾患動物モデル（マウス、ラット、及びハムスターを含む齧歯類、ならびに霊長類を含むが、これらに限定されない）の開発における使用を見出す。

本明細書で使用されるとき、「生体試料」とは、例えば、血液、バフィーコート、血漿、血清、血球（例えば、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、帯状核細胞、好中球、単球、またはＴ細胞）、糞便、尿、骨髄、胆汁、髄液、リンパ液、皮膚試料、皮膚、呼吸器、腸管、及び尿生殖路の外分泌物、涙液、唾液、乳液、臓器、生検を含むが、これらに限定されない、対象から単離された組織、細胞、または体液の試料を指し、培養培地での細胞及び組織の成長由来の馴化培地、例えば、組換え細胞、及び細胞成分を含むが、これらに限定されない、インビトロ細胞培養成分の試料も指す。

バイオマーカーの「試験量」とは、試験される試料中に存在するバイオマーカーの量を指す。試験量は、絶対量（例えば、μｇ／ｍＬ）または相対量（例えば、シグナルの相対強度）のいずれかであり得る。

バイオマーカーの「診断量」とは、敗血症の診断と一致した対象の試料中のバイオマーカーの量を指す。診断量は、絶対量（例えば、μｇ／ｍＬ）または相対量（例えば、シグナルの相対強度）のいずれかであり得る。

バイオマーカーの「対照量」は、バイオマーカーの試験量に対して比較される任意の量または量の範囲であり得る。例えば、バイオマーカーの対照量は、敗血症を有しないヒト中のバイオマーカーの量であり得る。対照量は、絶対量（例えば、μｇ／ｍＬ）または相対量（例えば、シグナルの相対強度）のいずれかであり得る。

「抗体」という用語は、ポリクローナル及びモノクローナル抗体調製物、ならびにハイブリッド抗体、改変抗体、キメラ抗体、及びヒト化抗体を含む調製物、ならびにハイブリッド（キメラ）抗体分子（例えば、Ｗｉｎｔｅｒｅｔａｌ．（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ３４９：２９３－２９９、及び米国特許第４，８１６，５６７号を参照のこと）、Ｆ（ａｂ′）_２及びＦ（ａｂ）断片、Ｆ_ｖ分子（非共有結合ヘテロ二量体、例えば、Ｉｎｂａｒｅｔａｌ．（１９７２）ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ６９：２６５９－２６６２、及びＥｈｒｌｉｃｈｅｔａｌ．（１９８０）Ｂｉｏｃｈｅｍ１９：４０９１－４０９６を参照のこと）、一本鎖Ｆｖ分子（ｓＦｖ）（例えば、Ｈｕｓｔｏｎｅｔａｌ．（１９８８）ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ８５：５８７９－５８８３を参照のこと）、二量体及び三量体抗体断片構築体、ミニボディ（例えば、Ｐａｃｋｅｔａｌ．（１９９２）Ｂｉｏｃｈｅｍ３１：１５７９－１５８４、Ｃｕｍｂｅｒｅｔａｌ．（１９９２）ＪＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ１４９Ｂ：１２０－１２６を参照のこと）、ヒト化抗体分子（例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎｅｔａｌ．（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ３３２：３２３－３２７、Ｖｅｒｈｏｅｙａｎｅｔａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ２３９：１５３４－１５３６、及び英国特許公開第ＧＢ２，２７６，１６９号（１９９４年９月２１日公開）を参照のこと）、ならびにかかる分子から得られた任意の機能的断片（かかる断片は、親抗体分子の特異的結合特性を保持する）を包含する。

本発明での使用に企図される「検出可能な部分」または「検出可能な標識」としては、放射性同位体、蛍光色素、例えば、フルオレセイン、フィコエリトリン、Ｃｙ－３、Ｃｙ－５、アロフィコシアニン、ＤＡＰＩ、ＴｅｘａｓＲｅｄ、ローダミン、Ｏｒｅｇｏｎｇｒｅｅｎ、Ｌｕｃｉｆｅｒｙｅｌｌｏｗ等、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＤｓＲｅｄ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、Ｃｅｒｉａｎｔｈｕｓ橙色蛍光タンパク質（ｃＯＦＰ）、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、ベータ－ラクタマーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏ^ｒ、Ｇ４１８^ｒ）ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、ハイグロマイシン－Ｂ－ホスホトランスフェラーゼ（ＨＰＨ）、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、ｌａｃＺ（β－ガラクトシダーゼをコードする）、及びキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＸＧＰＲＴ）、ベータ－グルクロニダーゼ（ｇｕｓ）、胎盤アルカリホスファターゼ（ＰＬＡＰ）、分泌胚アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）、または蛍もしくは細菌ルシフェラーゼ（ＬＵＣ）が挙げられるが、これらに限定されない。酵素タグは、それらの同族基質と使用される。これらの用語は、既知の蛍光強度の色分けされたミクロスフェア（例えば、Ｌｕｍｉｎｅｘ（Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）製のｘＭＡＰ技術ミクロスフェアを参照のこと）、量子ドットナノ結晶を含有するミクロスフェア、例えば、異なる比率及び組み合わせの量子ドット色を含有するミクロスフェア（例えば、ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）製のＱｄｏｔナノ結晶）、ガラス被覆金属ナノ粒子（例えば、ＮａｎｏｐｌｅｘＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（ＭｏｕｎｔａｉｎＶｉｅｗ，ＣＡ）製のＳＥＲＳナノタグを参照のこと）、バーコード材料（例えば、サブミクロンサイズの縞模様の金属棒、例えば、ＮａｎｏｐｌｅｘＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．製のナノバーコードを参照のこと）、着色バーコードでコードされた微粒子（例えば、ＶｉｔｒａＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（ｖｉｔｒａｂｉｏ．ｃｏｍ）製のＣｅｌｌＣａｒｄを参照のこと）、及びデジタルホログラフィックコード画像を有するガラス微粒子（例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ）製のＣｙＶｅｒａマイクロビーズを参照のこと）を含む。本発明の実施に関連した多くの標準手法と同様に、当業者であれば、使用され得るさらなる標識を認識しているであろう。

本明細書で使用されるとき、「診断」は、概して、対象が所与の疾患、障害、もしくは機能不全に罹患している可能性があるかの決定を含む。当業者は、多くの場合、１つ以上の診断指標、すなわち、疾患、障害、もしくは機能不全の存在もしくは不在を示すバイオマーカー、存在、不在、または量に基づいて診断を行う。

本明細書で使用されるとき、「予後」は、概して、臨床状態または疾患の可能性のある経過及び転帰の予測を指す。患者の予後は、通常、好ましいまたは好ましくない疾患経過または転帰を示す疾患の要因または症状を評価することによって行われる。「予後」という用語が、必ずしも状態の経過または転帰を１００％の精度で予測する能力を指すわけではないことが理解される。代わりに、当業者であれば、「予後」という用語が、ある特定の経過または転帰が起こる可能性の高まりを指し、すなわち、所与の状態を呈する個体と比較して、経過または転帰がその状態を呈する患者に起こる可能性がより高いことを理解する。

「実質的に精製された」とは、それらの天然環境から取り除かれ、単離または分離され、かつ天然に会合する他の成分を少なくとも約６０％含まない、好ましくは約７５％含まない、最も好ましくは約９０％含まない核酸分子またはタンパク質を指す。

ＩＩ．本発明の実行様式
本発明を詳細に説明する前に、本発明が、言うまでもなく異なり得る特定の処方またはプロセスパラメータに限定されないことを理解されたい。本明細書で使用される専門用語が本発明の特定の実施形態を説明することのみを目的とし、限定するようには意図されていないことも理解されたい。

本明細書に記載の方法及び材料と同様または同等のいくつかの方法及び材料が本発明の実施に際して使用され得るが、好ましい材料及び方法が本明細書に記載されている。

本発明は、単独で、または敗血症の診断のための臨床的パラメータとの組み合わせでのいずれかでのバイオマーカーの使用に関する。具体的には、本発明者らは、発現プロファイルが、敗血症を診断し、かつ敗血症を、例えば、外傷性損傷、手術、自己免疫疾患、血栓症、または全身性炎症反応症候群によって引き起こされる非感染性全身性炎症源と区別するために使用され得るバイオマーカーパネルを見出した（実施例１を参照のこと）。

Ａ．バイオマーカー
本発明の実施に際して使用され得るバイオマーカーとしては、ＣＥＡＣＡＭ１、ＺＤＨＨＣ１９、Ｃ９ｏｒｆ９５、ＧＮＡ１５、ＢＡＴＦ、Ｃ３ＡＲ１、ＫＩＡＡ１３７０、ＴＧＦＢＩ、ＭＴＣＨ１、ＲＰＧＲＩＰ１、及びＨＬＡ－ＤＰＢ１を含むが、これらに限定されない、遺伝子または遺伝子のＲＮＡ転写物由来のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドが挙げられる。これらのバイオマーカーの差次的発現は、敗血症と関連しており、それ故に、これらのバイオマーカーの発現プロファイルは、敗血症を診断し、かつ敗血症を、例えば、外傷性損傷、手術、自己免疫疾患、血栓症、または全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）によって引き起こされる非感染性炎症状態と区別するのに有用である。

したがって、一態様では、本発明は、対象における敗血症を診断するための方法を提供し、本方法は、敗血症を有する疑いのある対象由来の生体試料中の複数のバイオマーカーのレベルを測定することと、バイオマーカーのレベルを分析することと、バイオマーカーのそれぞれの基準値範囲と比較することとを含み、対照試料中の１つ以上のバイオマーカーと比較した生体試料中の１つ以上のバイオマーカーの差次的発現は、対象が敗血症を有することを示す。生体試料中のバイオマーカーのレベルを分析する場合、比較のために使用される基準値範囲は、敗血症を有しない１名以上の対象（すなわち、正常または非感染対照試料）の１つ以上の試料中に見られる１つ以上のバイオマーカーのレベルを表し得る。あるいは、基準値は、敗血症を有する１つ以上の対象の１つ以上の試料中に見られる１つ以上のバイオマーカーのレベルを表し得る。ある特定の実施形態では、バイオマーカーのレベルは、非感染または感染／敗血症対象の時間一致基準値と比較される。

診断される対象から得られる生体試料は、典型的には、全血、バフィーコート、血漿、血清、または血球（例えば、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、帯状核細胞、好中球、単球、またはＴ細胞）であるが、発現されたバイオマーカーを含む体液、組織、または細胞由来の任意の試料であり得る。本明細書で使用されるとき、「対照」試料とは、罹患していない体液、組織、または細胞等の生体試料を指す。すなわち、対照試料は、正常または非感染対象（例えば、敗血症を有しないことが確認されている個体）から得ることができる。生体試料は、従来の技法により対象から得ることができる。例えば、血液は、静脈穿刺により得ることができ、固体組織試料は、当該技術分野で周知の方法に従って手術技法により得ることができる。

ある特定の実施形態では、バイオマーカーパネルが敗血症の診断に使用される。任意のサイズのバイオマーカーパネルが本発明の実施に際して使用され得る。敗血症を診断するためのバイオマーカーパネルは、典型的には、少なくとも３個のバイオマーカー～最大３０個のバイオマーカー、例えば、それらの間の任意の数のバイオマーカー、例えば、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、または３０個のバイオマーカーを含む。ある特定の実施形態では、本発明は、少なくとも３個、または少なくとも４個、または少なくとも５個、または少なくとも６個、または少なくとも７個、または少なくとも８個、または少なくとも９個、または少なくとも１０個、または少なくとも１１個、またはそれ以上のバイオマーカーを含むバイオマーカーパネルを含む。通常、より小さいバイオマーカーパネルがより経済的であるが、より大きいバイオマーカーパネル（すなわち、３０個を超えるバイオマーカー）がより詳細な情報の提供に有利であり、本発明の実施に際しても使用され得る。

ある特定の実施形態では、本発明は、ＣＥＡＣＡＭ１、ＺＤＨＨＣ１９、Ｃ９ｏｒｆ９５、ＧＮＡ１５、ＢＡＴＦ、Ｃ３ＡＲ１、ＫＩＡＡ１３７０、ＴＧＦＢＩ、ＭＴＣＨ１、ＲＰＧＲＩＰ１、及びＨＬＡ－ＤＰＢ１からなる群から選択される、遺伝子または遺伝子のＲＮＡ転写物由来のヌクレオチド配列を含む１つ以上のポリヌクレオチドを含む敗血症を診断するためのバイオマーカーパネルを含む。一実施形態では、バイオマーカーパネルとしては、ＣＥＡＣＡＭ１ポリヌクレオチド、ＺＤＨＨＣ１９ポリヌクレオチド、Ｃ９ｏｒｆ９５ポリヌクレオチド、ＧＮＡ１５ポリヌクレオチド、ＢＡＴＦポリヌクレオチド、Ｃ３ＡＲ１ポリヌクレオチド、ＫＩＡＡ１３７０ポリヌクレオチド、ＴＧＦＢＩポリヌクレオチド、ＭＴＣＨ１ポリヌクレオチド、ＲＰＧＲＩＰ１ポリヌクレオチド、及びＨＬＡ－ＤＰＢ１ポリヌクレオチドが挙げられる。

ある特定の実施形態では、感染Ｚ－スコアが敗血症の診断に使用される。感染Ｚ－スコアは、バイオマーカーの対照基準値と比較して過剰発現している全ての測定されたバイオマーカーの発現レベルの幾何平均から、バイオマーカーの対照基準値と比較して過小発現している全ての測定されたバイオマーカーの発現レベルの幾何平均を差し引き、その差に、バイオマーカーの対照基準値と比較して過剰発現しているバイオマーカーの数と過小発現しているバイオマーカーの数との比率を乗じることによって計算される。非感染対照対象の基準値範囲と比較してより高い対象の感染Ｚ－スコアは、対象が敗血症を有することを示す（実施例１を参照のこと）。

他の実施形態では、敗血症スコアが敗血症の診断に使用される。患者の敗血症スコアは、以下の式に従ってバイオマーカーＣＥＡＣＡＭ１、ＺＤＨＨＣ１９、Ｃ９ｏｒｆ９５、ＧＮＡ１５、ＢＡＴＦ、Ｃ３ＡＲ１、ＫＩＡＡ１３７０、ＴＧＦＢＩ、ＭＴＣＨ１、ＲＰＧＲＩＰ１、及びＨＬＡ－ＤＰＢ１の発現レベルに基づいて計算され得る。

非感染対照対象の基準値範囲と比較してより高い対象の敗血症スコアは、対象が敗血症を有することを示す（実施例２を参照のこと）。

別の態様では、本発明は、ａ）敗血症を有する疑いのある対象から採取された生体試料中の本明細書に記載のバイオマーカーパネルの各バイオマーカーを測定することと、ｂ）生体試料中のバイオマーカーパネルの各バイオマーカーの測定された値を対照対象の各バイオマーカーの基準値と比較することと、を含むアッセイを含み、基準値と比較した生体試料中のバイオマーカーの差次的発現が、対象が敗血症を有することを示す。ある特定の実施形態では、本アッセイは、本明細書に記載の感染Ｚ－スコアを決定することをさらに含む。

本明細書に記載の方法を使用して、全身性炎症を有する患者が敗血症の治療を受けるべきかを決定することができる。例えば、患者は、患者が本明細書に記載のバイオマーカー発現プロファイルまたは感染Ｚ－スコアまたは敗血症スコアに基づいて敗血症の陽性診断を受けた場合、敗血症の治療のために選択される。

一実施形態では、本発明は、敗血症を有する対象を治療する方法を含み、本方法は、ａ）本明細書に記載の方法に従って敗血症を有する対象を診断することと、ｂ）対象が敗血症の陽性診断を受けた場合、対象に治療有効量の広域抗生物質を投与することと、を含む。

別の実施形態では、本発明は、敗血症を有する疑いのある対象を治療する方法を含み、本方法は、ａ）本明細書に記載の方法に従う対象の診断に関する情報を受け取ることと、ｂ）患者が敗血症の陽性診断を受けた場合、対象に治療有効量の広域抗生物質を投与することと、を含む。

別の実施形態では、本発明は、対象における敗血症を治療するための療法の有効性を監視するための方法を含み、本方法は、対象が療法を受ける前の対象由来の第１の試料中及び対象が療法を受けた後の対象由来の第２の試料中のバイオマーカーＣＥＡＣＡＭ１、ＺＤＨＨＣ１９、Ｃ９ｏｒｆ９５、ＧＮＡ１５、ＢＡＴＦ、Ｃ３ＡＲ１、ＫＩＡＡ１３７０、ＴＧＦＢＩ、ＭＴＣＨ１、ＲＰＧＲＩＰ１、及びＨＬＡ－ＤＰＢ１の発現レベルを測定することを含み、第１の試料中のバイオマーカーの発現レベルと比較して、第２の試料中の増加したバイオマーカーＣＥＡＣＡＭ１、ＺＤＨＨＣ１９、Ｃ９ｏｒｆ９５、ＧＮＡ１５、ＢＡＴＦ、及びＣ３ＡＲ１の発現レベル、ならびに低下したバイオマーカーＫＩＡＡ１３７０、ＴＧＦＢＩ、ＭＴＣＨ１、ＲＰＧＲＩＰ１、及びＨＬＡ－ＤＰＢ１の発現レベルが、対象が悪化していることを示し、第１の試料中のバイオマーカーの発現レベルと比較して、低下した第２の試料中のバイオマーカーＣＥＡＣＡＭ１、ＺＤＨＨＣ１９、Ｃ９ｏｒｆ９５、ＧＮＡ１５、ＢＡＴＦ、及びＣ３ＡＲ１の発現レベル、ならびに増加したバイオマーカーＫＩＡＡ１３７０、ＴＧＦＢＩ、ＭＴＣＨ１、ＲＰＧＲＩＰ１、及びＨＬＡ－ＤＰＢ１の発現レベルが、対象が改善していることを示す。本方法は、対象の敗血症スコアを計算することをさらに含み得、第１の試料の敗血症スコアと比較してより高い第２の試料の敗血症スコアが、対象が悪化していることを示し、第１の試料の敗血症スコアと比較してより低い第２の試料の敗血症スコアが、対象が改善していることを示す。

Ｂ．バイオマーカーの検出及び測定
試料中のバイオマーカーが当該技術分野で既知の任意の好適な方法によって測定され得ることが理解される。バイオマーカーの発現レベルの測定は、直接または間接であり得る。例えば、ＲＮＡまたはタンパク質の存在レベルは、直接定量され得る。あるいは、バイオマーカーの量は、ｃＤＮＡ、増幅ＲＮＡ、もしくはＤＮＡの存在レベルを測定することによって、またはバイオマーカーの発現レベルを示すＲＮＡ、タンパク質、もしくは他の分子（例えば、代謝物）の量もしくは活性を測定することによって間接的に決定され得る。試料中のバイオマーカーを測定するための方法が広く応用されている。例えば、１つ以上のバイオマーカーを測定して、敗血症の診断を支援するか、対象に適切な治療を決定するか、治療への対象の応答を監視するか、またはインビボもしくはインビトロでバイオマーカーの発現を調節する治療化合物を特定することができる。

バイオマーカーポリヌクレオチドの検出
一実施形態では、バイオマーカーの発現レベルは、バイオマーカーのポリヌクレオチドレベルを測定することによって決定される。特異的バイオマーカー遺伝子の転写物のレベルは、生体試料中に存在するｍＲＮＡまたはそれ由来のポリヌクレオチドの量から決定され得る。ポリヌクレオチドは、マイクロアレイ分析、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）、ノーザンブロット、及び遺伝子発現連続分析（ＳＡＧＥ）を含むが、これらに限定されない様々な方法によって検出及び定量され得る。例えば、参照により全体が本明細書に組み込まれる、ＤｒａｇｈｉｃｉＤａｔａＡｎａｌｙｓｉｓＴｏｏｌｓｆｏｒＤＮＡＭｉｃｒｏａｒｒａｙｓ，ＣｈａｐｍａｎａｎｄＨａｌｌ／ＣＲＣ，２００３、Ｓｉｍｏｎｅｔａｌ．ＤｅｓｉｇｎａｎｄＡｎａｌｙｓｉｓｏｆＤＮＡＭｉｃｒｏａｒｒａｙＩｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，２００４、Ｒｅａｌ－ＴｉｍｅＰＣＲ：ＣｕｒｒｅｎｔＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙａｎｄＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｌｏｇａｎ，Ｅｄｗａｒｄｓ，ａｎｄＳａｕｎｄｅｒｓｅｄｓ．，ＣａｉｓｔｅｒＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，２００９、ＢｕｓｔｉｎＡ－ＺｏｆＱｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅＰＣＲ（ＩＵＬＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｎｏ．５），ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＬｉｎｅ，２００４、Ｖｅｌｃｕｌｅｓｃｕｅｔａｌ．（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ２７０：４８４－４８７、Ｍａｔｓｕｍｕｒａｅｔａｌ．（２００５）Ｃｅｌｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７：１１－１８、ＳｅｒｉａｌＡｎａｌｙｓｉｓｏｆＧｅｎｅＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（ＳＡＧＥ）：ＭｅｔｈｏｄｓａｎｄＰｒｏｔｏｃｏｌｓ（ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ），ＨｕｍａｎａＰｒｅｓｓ，２００８を参照されたい。

一実施形態では、マイクロアレイを使用して、バイオマーカーのレベルを測定する。マイクロアレイ分析の利点は、バイオマーカーの各々の発現が同時に測定され得ることであり、マイクロアレイは、特定の疾患または状態（例えば、敗血症）の診断発現プロファイルを提供するように特異的に設計され得る。

マイクロアレイは、ポリヌクレオチド配列を含むプローブを選択し、その後、かかるプローブを固体支持体または表面に固定することによって調製される。例えば、プローブは、ＤＮＡ配列、ＲＮＡ配列、またはＤＮＡ及びＲＮＡのコポリマー配列を含み得る。プローブのポリヌクレオチド配列は、ＤＮＡ及び／もしくはＲＮＡ類似体、またはそれらの組み合わせも含み得る。例えば、プローブのポリヌクレオチド配列は、ゲノムＤＮＡの完全または部分断片であり得る。プローブのポリヌクレオチド配列は、合成されたヌクレオチド配列、例えば、合成オリゴヌクレオチド配列でもあり得る。プローブ配列は、インビボで酵素的に、インビトロで酵素的に（例えば、ＰＣＲにより）、またはインビトロで非酵素的にいずれかで合成され得る。

本発明の方法で使用されるプローブは、好ましくは、多孔性または非多孔性のいずれかであり得る固体支持体に固定される。例えば、プローブは、ポリヌクレオチドの３’末端または５’末端のいずれかでニトロセルロースまたはナイロン膜またはフィルターに共有結合しているポリヌクレオチド配列であり得る。かかるハイブリダイゼーションプローブは、当該技術分野で周知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔａｌ．，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ（３ｒｄＥｄｉｔｉｏｎ，２００１）を参照のこと）。あるいは、固体支持体または表面は、ガラスまたはプラスチック表面であり得る。一実施形態では、ハイブリダイゼーションレベルは、ポリヌクレオチドの集団、例えば、ＤＮＡまたはＤＮＡ模倣物の集団、またはあるいは、ＲＮＡまたはＲＮＡ模倣物の集団に固定された表面上の固相からなるプローブのマイクロアレイに対して測定される。固相は、非多孔性材料、または任意に多孔性材料、例えば、ゲルであり得る。

一実施形態では、マイクロアレイは、各々が本明細書に記載のバイオマーカーのうちの１つを表す、結合（例えば、ハイブリダイゼーション）部位または「プローブ」の規則正しいアレイを有する支持体または表面を含む。好ましくは、マイクロアレイは、アドレス可能なアレイであり、より好ましくは、位置的にアドレス可能なアレイである。より具体的には、アレイの各プローブは、各プローブの正体（すなわち、配列）がアレイにおける（すなわち、支持体または表面上の）その位置から決定され得るように、好ましくは、固体支持体上の既知の所定の位置に位置する。各プローブは、好ましくは、単一部位で固体支持体に共有結合している。

マイクロアレイは、いくつかの方法で作製することができ、それらの方法のいくつかが以下に記載されている。それらがどのように産生されようと、マイクロアレイは、ある特定の特性を共有する。アレイは再現可能であり、所与のアレイの複数のコピーが産生され、互いに容易に比較されることを可能にする。好ましくは、マイクロアレイは、結合（例えば、核酸ハイブリダイゼーション）条件下で安定している材料から作製される。マイクロアレイは、一般に、小さく、例えば、１ｃｍ^２～２５ｃｍ^２であるが、例えば、スクリーニングアレイでより大きいアレイを使用することもできる。好ましくは、マイクロアレイにおける所与の結合部位または固有の組の結合部位は、細胞中の単一遺伝子の産物（例えば、特異的ｍＲＮＡ、またはそれ由来の特異的ｃＤＮＡ）に特異的に結合（例えば、ハイブリダイズ）する。しかしながら、一般に、他の関連または同様の配列が所与の結合部位に交差ハイブリダイズする。

上述のように、特定のポリヌクレオチド分子が特異的にハイブリダイズする「プローブ」は、相補的ポリヌクレオチド配列を含む。マイクロアレイのプローブは、典型的には、１，０００個以下のヌクレオチドのヌクレオチド配列からなる。いくつかの実施形態では、アレイのプローブは、１０～１，０００個のヌクレオチドのヌクレオチド配列からなる。一実施形態では、プローブのヌクレオチド配列は、１０～２００ヌクレオチド長の範囲であり、１つの種の生物のゲノム配列であり、これにより複数の異なるプローブが存在するようになり、配列が相補的であり、それ故に、ゲノムの全てまたは一部にわたって連続してタイルされたかかる種の生物のゲノムにハイブリダイズすることができる。他の実施形態では、プローブは、１０～３０ヌクレオチド長の範囲、１０～４０ヌクレオチド長の範囲、２０～５０ヌクレオチド長の範囲、４０～８０ヌクレオチド長の範囲、５０～１５０ヌクレオチド長の範囲、８０～１２０ヌクレオチド長の範囲、または６０ヌクレオチド長である。

プローブは、生物のゲノムの一部に対応するＤＮＡまたはＤＮＡ「模倣物」（例えば、誘導体及び類似体）を含み得る。別の実施形態では、マイクロアレイのプローブは、相補的ＲＮＡまたはＲＮＡ模倣物である。ＤＮＡ模倣物は、ＤＮＡとの特異的Ｗａｔｓｏｎ－Ｃｒｉｃｋ様ハイブリダイゼーションまたはＲＮＡとの特異的ハイブリダイゼーションの能力を有するサブユニットから成るポリマーである。核酸は、塩基部分、糖部分、またはリン酸骨格（例えば、ホスホロチオエート）で修飾され得る。

ＤＮＡは、例えば、ゲノムＤＮＡまたはクローン化配列のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅によって得ることができる。ＰＣＲプライマーは、好ましくは、ゲノムＤＮＡの特定の断片の増幅をもたらすゲノムの既知の配列に基づいて選択される。Ｏｌｉｇｏバージョン５．０（ＮａｔｉｏｎａｌＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）等の当該技術分野で周知のコンピュータプログラムが、必須の特異性及び最適な増幅特性を有するプライマーの設計に有用である。典型的には、マイクロアレイの各プローブは、１０塩基長～５０，０００塩基長であり、通常、３００塩基長～１，０００塩基長である。ＰＣＲ法が当該技術分野で周知であり、例えば、参照により全体が本明細書に組み込まれる、Ｉｎｎｉｓｅｔａｌ．，ｅｄｓ．，ＰＣＲＰｒｏｔｏｃｏｌｓ：ＡＧｕｉｄｅＴｏＭｅｔｈｏｄｓＡｎｄＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓＩｎｃ．，ＳａｎＤｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）に記載されている。制御ロボットシステムが核酸の単離及び増幅に有用であることが当業者に明らかであろう。

ポリヌクレオチドプローブを生成するための代替の好ましい手段は、合成ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの合成（例えば、Ｎ－ホスホネートまたはホスホロアミダイト化学反応を使用）（Ｆｒｏｅｈｌｅｒｅｔａｌ．，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＲｅｓ．１４：５３９９－５４０７（１９８６）、ＭｃＢｒｉｄｅｅｔａｌ．，ＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔ．２４：２４６－２４８（１９８３））である。合成配列は、典型的には約１０～約５００塩基長、より典型的には、約２０～約１００塩基長、最も好ましくは約４０～約７０塩基長である。いくつかの実施形態では、合成核酸は、イノシンを含むが、これに限定されない非天然塩基を含む。上述のように、核酸類似体は、ハイブリダイゼーションの結合部位として使用され得る。好適な核酸類似体の一例は、ペプチド核酸である（例えば、Ｅｇｈｏｌｍｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ３６３：５６６－５６８（１９９３）、米国特許第５，５３９，０８３号を参照のこと）。

プローブは、好ましくは、結合エネルギー、塩基組成、配列複雑性、交差ハイブリダイゼーション結合エネルギー、及び二次構造を考慮するアルゴリズムを使用して選択される。Ｆｒｉｅｎｄｅｔａｌ．，国際特許公開第ＷＯ０１／０５９３５号（２００１年１月２５日公開）、Ｈｕｇｈｅｓｅｔａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１９：３４２－７（２００１）を参照されたい。

当業者であれば、陽性対照プローブ、例えば、標的ポリヌクレオチド分子の配列に対して相補的であり、ハイブリダイズ可能でもあることで知られているプローブ、及び陰性対照プローブ、例えば、標的ポリヌクレオチド分子の配列に対して相補的ではなく、ハイブリダイズ可能でもないことで知られているプローブがアレイに含まれるべきであることも理解するであろう。一実施形態では、陽性対照は、アレイの周囲長に沿って合成される。別の実施形態では、陽性対照は、アレイにわたる対角ストライプで合成される。さらに別の実施形態では、各プローブの逆補体は、プローブの位置の隣に合成されて、陰性対照としての役目を果たす。なお別の実施形態では、他の種の生物由来の配列が、陰性対照または「スパイクイン」対照として使用される。

プローブは、例えば、ガラス、プラスチック（例えば、ポリプロピレン、ナイロン）、ポリアクリルアミド、ニトロセルロース、ゲル、または他の多孔性もしくは非多孔性材料から作製され得る固体支持体または表面に結合する。核酸を表面に結合するための方法の１つは、Ｓｃｈｅｎａｅｔａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ２７０：４６７－４７０（１９９５）によって概説されるように、ガラスプレート上に印刷することによる方法である。この方法は、ｃＤＮＡのマイクロアレイの調製に特に有用である（参照により全体が本明細書に組み込まれる、ＤｅＲｉｓｉｅｔａｌ，ＮａｔｕｒｅＧｅｎｅｔｉｃｓ１４：４５７－４６０（１９９６）、Ｓｈａｌｏｎｅｔａｌ．，ＧｅｎｏｍｅＲｅｓ．６：６３９－６４５（１９９６）、及びＳｃｈｅｎａｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９３：１０５３９－１１２８６（１９９５）も参照のこと）。

マイクロアレイを作製するための第２の方法により、高密度オリゴヌクレオチドアレイが産生される。規定の配列に相補的な何千ものオリゴヌクレオチドを含むアレイをインサイツ合成のためのフォトリソグラフィー技法を使用して表面上の規定の位置に産生する技法（参照により全体が本明細書に組み込まれる、Ｆｏｄｏｒｅｔａｌ．，１９９１，Ｓｃｉｅｎｃｅ２５１：７６７－７７３、Ｐｅａｓｅｅｔａｌ．，１９９４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９１：５０２２－５０２６、Ｌｏｃｋｈａｒｔｅｔａｌ．，１９９６，ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１４：１６７５、米国特許第５，５７８，８３２号、同第５，５５６，７５２号、及び同第５，５１０，２７０号を参照のこと）、または規定のオリゴヌクレオチドを迅速に合成及び沈着させるための他の方法（参照により全体が本明細書に組み込まれる、Ｂｌａｎｃｈａｒｄｅｔａｌ．，Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ＆Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ１１：６８７－６９０）が既知である。これらの方法が使用される場合、既知の配列のオリゴヌクレオチド（例えば、６０ｍｅｒ）が、誘導体化ガラススライド等の表面上で直接合成される。通常、産生されるアレイは、冗長であり、１つのＲＮＡ当たりいくつかのオリゴヌクレオチド分子を有する。

マイクロアレイを作製するための他の方法（例えば、マスキングによる）（参照により全体が本明細書に組み込まれる、ＭａｓｋｏｓａｎｄＳｏｕｔｈｅｒｎ，１９９２，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．２０：１６７９－１６８４）も使用され得る。原則として、任意の種類のアレイ、例えば、ナイロンハイブリダイゼーション膜上のドットブロット（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔａｌ．，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，３ｒｄＥｄｉｔｉｏｎ，２００１を参照のこと）が使用され得る。しかしながら、当業者であれば認識するであろうように、ハイブリダイゼーション体積がより小さいため、多くの場合、非常に小さいアレイが好ましい。

マイクロアレイは、例えば、参照により全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第６，０２８，１８９号（Ｂｌａｎｃｈａｒｄ）、Ｂｌａｎｃｈａｒｄｅｔａｌ．，１９９６，ＢｉｏｓｅｎｓｏｒｓａｎｄＢｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ１１：６８７－６９０、Ｂｌａｎｃｈａｒｄ，１９９８，ＳｙｎｔｈｅｔｉｃＤＮＡＡｒｒａｙｓｉｎＧｅｎｅｔｉｃＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｖｏｌ．２０，Ｊ．Ｋ．Ｓｅｔｌｏｗ，Ｅｄ．，ＰｌｅｎｕｍＰｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ（１１１～１２３貢）によって記載される方法及びシステムを使用したオリゴヌクレオチド合成のためのインクジェット印刷デバイスを用いることによっても製造され得る。具体的には、かかるマイクロアレイのオリゴヌクレオチドプローブは、個々のヌクレオチド塩基をプロピレンカーボネート等の高表面張力溶媒の「微液滴」中に連続して沈着させることによって、アレイで、例えば、ガラススライド上で合成される。微液滴は、小さい体積（例えば、１００ｐＬ以下、より好ましくは５０ｐＬ以下）を有し、（例えば、疎水性ドメインによって）マイクロアレイ上で互いに分離されて、アレイ要素（すなわち、異なるプローブ）の位置を規定する円形の表面張力ウェルを形成する。このインクジェット法によって製造されるマイクロアレイは、典型的には、高密度のものであり、好ましくは、１ｃｍ^２当たり少なくとも約２，５００個の異なるプローブの密度を有する。ポリヌクレオチドプローブは、ポリヌクレオチドの３’末端または５’末端のいずれかで支持体に共有結合している。

マイクロアレイ分析によって測定され得るバイオマーカーポリヌクレオチドは、ＲＮＡまたはそれ由来の核酸（例えば、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを組み込むｃＤＮＡまたはｃＤＮＡ由来の増幅ＲＮＡ）、例えば、天然に存在する核酸分子、ならびに合成核酸分子を発現させることができる。一実施形態では、標的ポリヌクレオチド分子は、全細胞ＲＮＡ、ポリ（Ａ）^＋メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）もしくはその画分、細胞質性ｍＲＮＡ、またはｃＤＮＡから転写されたＲＮＡ（すなわち、ｃＲＮＡ、例えば、Ｌｉｎｓｌｅｙ＆Ｓｃｈｅｌｔｅｒの米国特許出願第０９／４１１，０７４号（１９９９年１０月４日出願）、または米国特許第５，５４５，５２２号、同第５，８９１，６３６号、もしくは同第５，７１６，７８５号を参照のこと）を含むが、決してこれらに限定されないＲＮＡを含む。全及びポリ（Ａ）^＋ＲＮＡを調製するための方法は、当該技術分野で周知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔａｌ．，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ（３ｒｄＥｄｉｔｉｏｎ，２００１）に概説されている。ＲＮＡは、チオシアン酸グアニジン溶解後のＣｓＣｌ遠心分離（Ｃｈｉｒｇｗｉｎｅｔａｌ．，１９７９，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ１８：５２９４－５２９９）を使用して、シリカゲルベースのカラム（例えば、ＲＮｅａｓｙ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ，Ｃａｌｉｆ．）もしくはＳｔｒａｔａＰｒｅｐ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ＬａＪｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆ．））を使用して、またはＡｕｓｕｂｅｌｅｔａｌ．，ｅｄｓ．，１９８９，ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓＩｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．ＩＩＩ，ＧｒｅｅｎＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＡｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ＮｅｗＹｏｒｋ，ａｔｐｐ．１３．１２．１－１３．１２．５）に記載されるようにフェノール及びクロロホルムを使用して、目的とする細胞から抽出され得る。ポリ（Ａ）^＋ＲＮＡは、例えば、オリゴ－ｄＴセルロースでの選択によって、またはあるいは、全細胞ＲＮＡのオリゴ－ｄＴ刺激逆転写によって選択され得る。ＲＮＡは、当該技術分野で既知の方法によって、例えば、ＺｎＣｌ_２とインキュベートしてＲＮＡの断片を生成することによって断片化され得る。

一実施形態では、全ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、またはそれ由来の核酸は、敗血症患者から採取された試料から単離される。特定の細胞であまり良好に発現されないバイオマーカーポリヌクレオチドは、正規化技法（Ｂｏｎａｌｄｏｅｔａｌ．，１９９６，ＧｅｎｏｍｅＲｅｓ．６：７９１－８０６）を使用してエンリッチされ得る。

上述のように、バイオマーカーポリヌクレオチドは、１つ以上のヌクレオチドで検出可能に標識され得る。当該技術分野で既知の任意の方法を使用して、標的ポリヌクレオチドを標識することができる。好ましくは、この標識は、標識をＲＮＡの長さに沿って均一に組み込み、より好ましくは、標識は、高度の効率で行われる。例えば、ポリヌクレオチドは、オリゴ－ｄＴ刺激逆転写によって標識され得る。ランダムプライマー（例えば、９ｍｅｒ）を逆転写に使用して、標識されたヌクレオチドをポリヌクレオチドの全長にわたって均一に組み込むことができる。あるいは、ランダムプライマーをＰＣＲ法またはＴ７プロモーターベースのインビトロ転写法と併せて使用して、ポリヌクレオチドを増幅することができる。

検出可能な標識は、発光標識であり得る。例えば、蛍光標識、生物発光標識、化学発光標識、及び比色標識が、本発明の実施に際して使用され得る。使用され得る蛍光標識としては、フルオレセイン、リン、ローダミン、またはポリメチン色素誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。加えて、ＦｌｕｏｒｅＰｒｉｍｅ（ＡｍｅｒｓｈａｍＰｈａｒｍａｃｉａ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）、Ｆｌｕｏｒｅｄｉｔｅ（Ｍｉｉｌｉｐｏｒｅ、Ｂｅｄｆｏｒｄ，Ｍａｓｓ．）、ＦＡＭ（ＡＢＩ、ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ，Ｃａｌｉｆ．）、及びＣｙ３またはＣｙ５（ＡｍｅｒｓｈａｍＰｈａｒｍａｃｉａ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）等の蛍光ホスホロアミダイトを含むが、これらに限定されない市販の蛍光標識が使用され得る。あるいは、検出可能な標識は、放射性標識ヌクレオチドであり得る。

一実施形態では、患者試料由来のバイオマーカーポリヌクレオチド分子は、基準試料の対応するポリヌクレオチド分子とは異なって標識される。基準は、正常生体試料（すなわち、対照試料、例えば、敗血症を有しない対象由来の血液）または敗血症基準生体試料、（例えば、敗血症を有する対象由来の血液）由来のポリヌクレオチド分子を含む。

核酸ハイブリダイゼーション及び洗浄条件は、標的ポリヌクレオチド分子がアレイの相補的ポリヌクレオチド配列に、好ましくは、その相補的ＤＮＡが位置する特定のアレイ部位に特異的に結合または特異的にハイブリダイズするように選択される。上に位置する二本鎖プローブＤＮＡを含むアレイが、好ましくは、変性条件に供されて、標的ポリヌクレオチド分子との接触前にＤＮＡを一本鎖にする。一本鎖プローブＤＮＡ（例えば、合成オリゴデオキシリボ核酸）を含むアレイが、標的ポリヌクレオチド分子との接触前に変性される必要があり、例えば、自己相補的配列により生じるヘアピンまたは二量体を除去することができる。

最適なハイブリダイゼーション条件は、プローブ及び標的核酸の長さ（例えば、２００塩基を超えるオリゴマー対ポリヌクレオチド）及び種類（例えば、ＲＮＡまたはＤＮＡ）に依存する。当業者であれば、オリゴヌクレオチドがより短くなると、満足できるハイブリダイゼーション結果のためにそれらの長さを調整して比較的均一の溶融温度を達成しなければならない場合があることを理解する。核酸の特異的な（すなわち、ストリンジェントな）ハイブリダイゼーション条件のための一般的パラメータについては、ＳａｍｂｒｏｏｋらのＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ（３ｒｄＥｄｉｔｉｏｎ，２００１），ａｎｄｉｎＡｕｓｕｂｅｌｅｔａｌ．，ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓＩｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．２，ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，ＮｅｗＹｏｒｋ（１９９４）に記載されている。ＳｃｈｅｎａらのｃＤＮＡマイクロアレイの典型的なハイブリダイゼーション条件は、５倍ＳＳＣ＋０．２％ＳＤＳ中での６５℃で４時間のハイブリダイゼーション、その後、２５℃の低ストリンジェンシー洗浄緩衝液中での洗浄（１倍ＳＳＣ＋０．２％ＳＤＳ）、その後、２５℃の高ストリンジェンシー洗浄緩衝液中での１０分間洗浄（０．１倍ＳＳＣ＋０．２％ＳＤＳ）である（Ｓｃｈｅｎａｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９３：１０６１４（１９９３））。有用なハイブリダイゼーション条件は、例えば、Ｔｉｊｅｓｓｅｎ，１９９３，ＨｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎＷｉｔｈＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＰｒｏｂｅｓ，ＥｌｓｅｖｉｅｒＳｃｉｅｎｃｅＰｕｂｌｉｓｈｅｒｓＢ．Ｖ．、及びＫｒｉｃｋａ，１９９２，ＮｏｎｉｓｏｔｏｐｉｃＤｎａＰｒｏｂｅＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆにも提供されている。特に好ましいハイブリダイゼーション条件は、１ＭＮａＣｌ、５０ｍＭＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．５）、０．５％サルコシンナトリウム、及び３０％ホルムアミド中でのプローブの平均溶融温度またはそれに近い温度（例えば、５１℃以内、より好ましくは２１℃以内）でのハイブリダイゼーションを含む。

蛍光標識された遺伝子産物が使用される場合、マイクロアレイの各部位での蛍光発光は、好ましくは、走査型共焦点レーザー顕微鏡法によって検出され得る。一実施形態では、適切な励起線を使用した別個の走査が、使用される２つのフルオロフォアの各々に行われる。あるいは、２つのフルオロフォアに特異的な波長での同時標本照射を可能にするレーザーが使用されてもよく、２つのフルオロフォアからの発光が同時に分析され得る（全ての目的のために参照により全体が組み込まれる、Ｓｈａｌｏｎｅｔａｌ．，１９９６，“ＡＤＮＡｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓｙｓｔｅｍｆｏｒａｎａｌｙｚｉｎｇｃｏｍｐｌｅｘＤＮＡｓａｍｐｌｅｓｕｓｉｎｇｔｗｏ－ｃｏｌｏｒｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｐｒｏｂｅｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，”ＧｅｎｏｍｅＲｅｓｅａｒｃｈ６：６３９－６４５を参照のこと）。アレイは、コンピュータ制御Ｘ－Ｙステージ及び顕微鏡対物を有するレーザー蛍光スキャナで走査され得る。２つのフルオロフォアの連続励起が多線混合ガスレーザーで達成され、発光された光が波長によって分光され、２つの光電子増倍管で検出される。蛍光レーザー走査デバイスについては、Ｓｃｈｅｎａｅｔａｌ．，ＧｅｎｏｍｅＲｅｓ．６：６３９－６４５（１９９６）、及び本明細書に引用される他の参考文献に記載されている。あるいは、Ｆｅｒｇｕｓｏｎｅｔａｌ．，ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈ．１４：１６８１－１６８４（１９９６）により説明されている光ファイバー束を使用して、ｍＲＮＡの存在レベルを多数の部位で同時に監視することができる。

一実施形態では、本発明は、ＣＥＡＣＡＭ１ポリヌクレオチドにハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、ＺＤＨＨＣ１９ポリヌクレオチドにハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、Ｃ９ｏｒｆ９５ポリヌクレオチドにハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、ＧＮＡ１５ポリヌクレオチドにハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、ＢＡＴＦポリヌクレオチドにハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、Ｃ３ＡＲ１ポリヌクレオチドにハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、ＫＩＡＡ１３７０ポリヌクレオチドにハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、ＴＧＦＢＩポリヌクレオチドにハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、ＭＴＣＨ１ポリヌクレオチドにハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、ＲＰＧＲＩＰ１ポリヌクレオチドにハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、及びＨＬＡ－ＤＰＢ１ポリヌクレオチドにハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含むマイクロアレイを含む。

ポリヌクレオチドは、ノーザンブロット法、ヌクレアーゼ保護アッセイ、ＲＮＡフィンガープリント法、ポリメラーゼ連鎖反応、リガーゼ連鎖反応、Ｑベータレプリカーゼ、等温増幅法、鎖置換増幅、転写ベースの増幅系、ヌクレアーゼ保護（Ｓ１ヌクレアーゼまたはリボヌクレアーゼ保護アッセイ）、ＳＡＧＥ、ならびに参照により全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第ＷＯ８８／１０３１５号及び同第ＷＯ８９／０６７００号、ならびに国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ８７／００８８０号及び同第ＰＣＴ／ＵＳ８９／０１０２５号に開示の方法を含むが、これらに限定されない他の方法によっても分析され得る。

標準のノーザンブロットアッセイを使用して、当業者に既知の従来のノーザンハイブリダイゼーション技法に従って、ＲＮＡ転写物の大きさを解明し、選択的にスプライスされたＲＮＡ転写物及び試料中のｍＲＮＡの相対量を特定することができる。ノーザンブロットでは、ＲＮＡ試料が、変性条件下でアガロースゲル中での電気泳動によって最初にサイズ分離される。その後、ＲＮＡが膜に移され、交差結合され、標識プローブとハイブリダイズされる。ランダム刺激、ニック翻訳、またはＰＣＲ生成ＤＮＡプローブ、インビトロ転写ＲＮＡプローブ、及びオリゴヌクレオチドを含む非同位体または高比活性放射性標識プローブが使用され得る。加えて、部分的相同性のみを有する配列（例えば、異なる種またはエクソンを含み得るゲノムＤＮＡ断片由来のｃＤＮＡ）がプローブとして使用され得る。全長一本鎖ＤＮＡまたはそのＤＮＡ配列の断片のいずれかを含む標識プローブ、例えば、放射性標識ｃＤＮＡは、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも５０、または少なくとも１００連続ヌクレオチド長であり得る。プローブは、当業者に既知の多くの異なる方法のうちのいずれかによって標識され得る。これらの研究に最も一般的に用いられる標識は、放射性元素、酵素、紫外線光に曝されると蛍光を発する化学物質等である。いくつかの蛍光材料が既知であり、標識として利用され得る。これらとしては、フルオレセイン、ローダミン、オーラミン、ＴｅｘａｓＲｅｄ、ＡＭＣＡｂｌｕｅ、及びＬｕｃｉｆｅｒＹｅｌｌｏｗが挙げられるが、これらに限定されない。特定の検出材料は、ヤギで調製され、かつイソチオシアネートを介してフルオレセインとコンジュゲートした抗ウサギ抗体である。タンパク質も、放射性元素または酵素で標識され得る。放射性標識は、現在利用可能な計数手技のうちのいずれかによって検出され得る。使用され得る同位体としては、^３Ｈ、^１４Ｃ、^３２Ｐ、^３５Ｓ、^３６Ｃｌ、^３５Ｃｒ、^５７Ｃｏ、^５８Ｃｏ、^５９Ｆｅ、^９０Ｙ、^１２５Ｉ、^１３１Ｉ、及び^１８６Ｒｅが挙げられるが、これらに限定されない。酵素標識も同様に有用であり、現在利用されている比色、分光測光、蛍光分光測光、電流測定、またはガス測定技法のうちのいずれかによって検出され得る。酵素は、カルボジイミド、ジイソシアネート、グルタルアルデヒド等の架橋分子との反応によって選択された粒子にコンジュゲートする。当業者に既知の任意の酵素が利用され得る。かかる酵素の例としては、ペルオキシダーゼ、ベータ－Ｄ－ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、グルコースオキシダーゼ＋ペルオキシダーゼ、及びアルカリホスファターゼが挙げられるが、これらに限定されない。米国特許第３，６５４，０９０号、同第３，８５０，７５２号、及び同第４，０１６，０４３号が、一例として、代替標識材料及び方法のそれらの開示について参照される。

ヌクレアーゼ保護アッセイ（リボヌクレアーゼ保護アッセイ及びＳ１ヌクレアーゼアッセイの両方を含む）を使用して、特異的ｍＲＮＡを検出及び定量することができる。ヌクレアーゼ保護アッセイでは、アンチセンスプローブ（例えば、放射性標識または非同位体で標識されたもの）が、溶液中でＲＮＡ試料にハイブリダイズする。ハイブリダイゼーション後、一本鎖のハイブリダイズされていないプローブ及びＲＮＡがヌクレアーゼによって分解される。アクリルアミドゲルを使用して、残りの保護された断片を分離する。典型的には、溶液ハイブリダイゼーションが膜ベースのハイブリダイゼーションよりも効率的であり、最大２０～３０μｇのブロットハイブリダイゼーションと比較して最大１００μｇの試料ＲＮＡを収容することができる。

最も一般的な種類のヌクレアーゼ保護アッセイであるリボヌクレアーゼ保護アッセイは、ＲＮＡプローブの使用を必要とする。オリゴヌクレオチド及び他の一本鎖ＤＮＡプローブは、Ｓ１ヌクレアーゼを含むアッセイでのみ使用され得る。一本鎖アンチセンスプローブは、典型的には、ヌクレアーゼによるプローブ：標的ハイブリッドの切断を阻止するために標的ＲＮＡと完全に相同でなければならない。

連続分析遺伝子発現（ＳＡＧＥ）を使用して、細胞試料中のＲＮＡ存在量を決定することもできる。例えば、参照により全体が本明細書に組み込まれる、Ｖｅｌｃｕｌｅｓｃｕｅｔａｌ．，１９９５，Ｓｃｉｅｎｃｅ２７０：４８４－７、Ｃａｒｕｌｌｉ，ｅｔａｌ．，１９９８，ＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｅｌｌｕｌａｒＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙＳｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ３０／３１：２８６－９６を参照されたい。ＳＡＧＥ分析は、検出に特別なデバイスを必要とせず、多数の転写産物の発現を同時に検出するための好ましい分析方法のうちの１つである。最初に、ポリＡ^＋ＲＮＡが細胞から抽出される。次に、ＲＮＡがビオチン化オリゴ（ｄＴ）プライマーを使用してｃＤＮＡに変換され、４塩基認識制限酵素（繋留酵素：ＡＥ）で処理され、それらの３’末端にビオチン基を含むＡＥ処理断片をもたらす。次に、ＡＥ処理断片が結合のためにストレプトアビジンとインキュベートされる。結合されたｃＤＮＡが２つの画分に分割され、その後、各画分が異なる二本鎖オリゴヌクレオチドアダプター（リンカー）ＡまたはＢに連結する。これらのリンカーは、（１）繋留酵素の作用によって形成される突起部分の配列と相補的な配列を有する一本鎖突起部分、（２）タグ付け酵素（ＴＥ）としての役目を果たす（認識部位から２０ｂｐ以下離れた所与の位置で切断する）ＩＩＳ型制限酵素の５’ヌクレオチド認識配列、及び（３）ＰＣＲ特異的プライマーを構築するための十分な長さの追加の配列から成る。リンカー連結ｃＤＮＡは、タグ付け酵素を使用して切断され、リンカー連結ｃＤＮＡ配列部分のみが残り、短鎖配列タグの形態で存在する。次に、２つの異なる種類のリンカー由来の短鎖配列タグのプールが互いに連結し、リンカーＡ及びＢに特異的なプライマーを使用してＰＣＲ増幅する。結果として、リンカーＡ及びＢに結合した２つの隣接する配列タグ（ジタグ）の無数の配列を含む混合物として増幅産物が得られる。増幅産物が繋留酵素で処理され、標準の連結反応で遊離ジタグ部分が連結して鎖になる。その後、増幅産物がクローン化される。そのクローンのヌクレオチド配列の決定を使用して、一定の長さの連続したジタグの読取値を得ることができる。その後、各タグに対応するｍＲＮＡの存在が、クローンのヌクレオチド配列及び配列タグに関する情報から特定され得る。

定量的逆転写酵素ＰＣＲ（ｑＲＴ－ＰＣＲ）を使用して、バイオマーカーの発現プロファイルを決定することもできる（例えば、参照により全体が本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２００５／００４８５４２Ａ１号を参照のこと）。ＲＴ－ＰＣＲによる遺伝子発現プロファイリングの第１のステップは、ＲＮＡ鋳型のｃＤＮＡへの逆転写、続いて、ＰＣＲ反応におけるその指数関数的増幅である。２つの最も一般的に使用される逆転写酵素は、トリ骨髄芽球症ウイルス逆転写酵素（ＡＭＶ－ＲＴ）及びモロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素（ＭＬＶ－ＲＴ）である。逆転写ステップは、典型的には、発現プロファイリングの状況及び目標に応じて、特異的プライマー、ランダム六量体、またはオリゴ－ｄＴプライマーを使用して刺激される。例えば、抽出されたＲＮＡは、製造業者の指示に従ってＧｅｎｅＡｍｐＲＮＡＰＣＲキット（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、Ｃａｌｉｆ．，ＵＳＡ）を使用して逆転写され得る。その後、得られたｃＤＮＡは、その後のＰＣＲ反応において鋳型として使用され得る。

ＰＣＲステップが様々な熱安定性ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを使用するが、典型的には、５’－３’ヌクレアーゼ活性を有するが、３’－５’プルーフリーディングエンドヌクレアーゼ活性を欠くＴａｑＤＮＡポリメラーゼを用いる。したがって、ＴＡＱＭＡＮＰＣＲは、典型的には、ＴａｑまたはＴｔｈポリメラーゼの５’－ヌクレアーゼ活性を利用して、その標的アンプリコンに結合したハイブリダイゼーションプローブを加水分解するが、同等の５’ヌクレアーゼ活性を有する任意の酵素が使用され得る。２つのオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、ＰＣＲ反応を典型とするアンプリコンを生成する。第３のオリゴヌクレオチドまたはプローブは、これらの２つのＰＣＲプライマー間に位置するヌクレオチド配列を検出するように設計される。プローブは、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ酵素によって伸長不可能であり、レポーター蛍光色素及びクエンチャー蛍光色素で標識される。レポーター色素からの任意のレーザー誘起発光は、これらの２つの色素がプローブ上にあるときにすぐ近くに位置する場合、消光色素によって消光される。増幅反応中、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ酵素は、プローブを鋳型依存様式で切断する。結果として生じるプローブ断片が溶液中で解離し、放出されたレポーター色素からのシグナルは、第２のフルオロフォアの消光効果を含まない。新たな分子が合成されるたびにレポーター色素の１つの分子が遊離され、消光されていないレポーター色素の検出により、データの定量的解釈の基礎が提供される。

ＴＡＱＭＡＮＲＴ－ＰＣＲは、例えば、ＡＢＩＰＲＩＳＭ７７００配列検出システム（Ｐｅｒｋｉｎ－Ｅｌｍｅｒ－ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ，Ｃａｌｉｆ．，ＵＳＡ）、またはＬｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ（ＲｏｃｈｅＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）等の市販の機器を使用して行われ得る。好ましい実施形態では、５’ヌクレアーゼ手技が、ＡＢＩＰＲＩＳＭ７７００配列検出システム等のリアルタイム定量ＰＣＲデバイスで行われる。このシステムは、熱サイクラー、レーザー、電荷結合素子（ＣＣＤ）、カメラ、及びコンピュータからなる。このシステムは、器具を起動し、かつデータを分析するためのソフトウェアを含む。５’－ヌクレアーゼアッセイデータは、最初に、Ｃｔ、すなわち、閾値サイクルとして表される。蛍光値は、あらゆるサイクル中に記録され、増幅反応においてその時点まで増幅された産物の量を表す。蛍光シグナルが統計的に有意であるとして最初に記録された時点が、閾値サイクル（Ｃｔ）である。

試料間変動の誤差及び影響を最小限に抑えるために、通常、ＲＴ－ＰＣＲが内部標準を使用して行われる。理想的な内部標準は、異なる組織間で一定のレベルで発現され、実験的治療には影響されない。遺伝子発現のパターンを正規化するために最も高い頻度で使用されるＲＮＡは、ハウスキーピング遺伝子であるグリセルアルデヒド－３－ホスフェート－デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）及びベータ－アクチンのｍＲＮＡである。

ＲＴ－ＰＣＲ技法のより最近の変形は、二重標識蛍光性プローブ（すなわち、ＴＡＱＭＡＮプローブ）によりＰＣＲ産物蓄積を測定するリアルタイム定量ＰＣＲである。リアルタイムＰＣＲは、正規化のために各標的配列に対する内部競合配列が使用される定量競合ＰＣＲとも、試料中に含まれる正規化遺伝子またはＲＴ－ＰＣＲ用のハウスキーピング遺伝子を使用した定量比較ＰＣＲとも適合する。さらなる詳細については、例えば、Ｈｅｌｄｅｔａｌ．，ＧｅｎｏｍｅＲｅｓｅａｒｃｈ６：９８６－９９４（１９９６）を参照されたい。

バイオマーカーデータの分析
バイオマーカーデータは、患者が敗血症を有するか、または非感染性源に起因する全身性炎症、例えば、外傷性損傷、手術、自己免疫疾患、血栓症、または全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）を有するかを評価するために、バイオマーカーを特定し、かつ試験発現プロファイルと基準発現プロファイルとの間の観察されたバイオマーカーレベルの差の統計的有意性を決定するための様々な方法によって分析され得る。ある特定の実施形態では、患者データは、多変量線形判別分析（ＬＤＡ）、受信者動作特性（ＲＯＣ）分析、主成分分析（ＰＣＡ）、アンサンブルデータマイニング法、マイクロアレイ有意分析（ＳＡＭ）、マイクロアレイ細胞特異的有意性分析（ｃｓＳＡＭ）、密度正規化イベントスパニングツリー進行分析（ＳＰＡＤＥ）、及び多次元タンパク質同定技術（ＭＵＤＰＩＴ）分析を含むが、これらに限定されない１つ以上の方法によって分析される（例えば、参照により全体が本明細書に組み込まれる、Ｈｉｌｂｅ（２００９）ＬｏｇｉｓｔｉｃＲｅｇｒｅｓｓｉｏｎＭｏｄｅｌｓ，Ｃｈａｐｍａｎ＆Ｈａｌｌ／ＣＲＣＰｒｅｓｓ、ＭｃＬａｃｈｌａｎ（２００４）ＤｉｓｃｒｉｍｉｎａｎｔＡｎａｌｙｓｉｓａｎｄＳｔａｔｉｓｔｉｃａｌＰａｔｔｅｒｎＲｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ．ＷｉｌｅｙＩｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｚｗｅｉｇｅｔａｌ．（１９９３）Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．３９：５６１－５７７、Ｐｅｐｅ（２００３）Ｔｈｅｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌｅｖａｌｕａｔｉｏｎｏｆｍｅｄｉｃａｌｔｅｓｔｓｆｏｒｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ，ＮｅｗＹｏｒｋ，ＮＹ：Ｏｘｆｏｒｄ、Ｓｉｎｇｅｔａｌ．（２００５）Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ２１：３９４０－３９４１、Ｔｕｓｈｅｒｅｔａｌ．（２００１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９８：５１１６－５１２１，Ｏｚａ（２００６）Ｅｎｓｅｍｂｌｅｄａｔａｍｉｎｉｎｇ，ＮＡＳＡＡｍｅｓＲｅｓｅａｒｃｈＣｅｎｔｅｒ，ＭｏｆｆｅｔｔＦｉｅｌｄ，ＣＡ，ＵＳＡ、Ｅｎｇｌｉｓｈｅｔａｌ．（２００９）Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｉｎｆｏｒｍ．４２（２）：２８７－２９５、Ｚｈａｎｇ（２００７）Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ８：２３０、Ｓｈｅｎ－Ｏｒｒｅｔａｌ．（２０１０）ＪｏｕｒｎａｌｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ１８４：１４４－１３０、Ｑｉｕｅｔａｌ．（２０１１）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２９（１０）：８８６－８９１、Ｒｕｅｔａｌ．（２００６）Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ａ．１１１１（２）：１６６－１７４，ＪｏｌｌｉｆｆｅＰｒｉｎｃｉｐａｌＣｏｍｐｏｎｅｎｔＡｎａｌｙｓｉｓ（ＳｐｒｉｎｇｅｒＳｅｒｉｅｓｉｎＳｔａｔｉｓｔｉｃｓ，２^ｎｄｅｄｉｔｉｏｎ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，ＮＹ，２００２）、Ｋｏｒｅｎｅｔａｌ．（２００４）ＩＥＥＥＴｒａｎｓＶｉｓＣｏｍｐｕｔＧｒａｐｈ１０：４５９－４７０を参照されたい）。

Ｃ．キット
なお別の態様では、本発明は、敗血症を診断するためのキットを提供し、本キットを使用して、本発明のバイオマーカーを検出することができる。例えば、本キットを使用して、敗血症患者及び健常または非感染対象の試料中で差次的に発現される本明細書に記載のバイオマーカーのうちのいずれか１つ以上を検出することができる。本キットは、バイオマーカーを検出するための１つ以上の薬剤と、敗血症を有する疑いのあるヒト対象から単離された生体試料を保持する容器と、薬剤を生体試料または生体試料の一部と反応させて、生体試料中の少なくとも１つの敗血症バイオマーカーの存在または量を検出する印刷された指示とを含み得る。薬剤は、別個の容器内にパッケージされ得る。本キットは、免疫アッセイまたはマイクロアレイ分析を行うための１つ以上の対照基準試料及び試薬をさらに含み得る。

ある特定の実施形態では、本キットは、目的とする少なくとも１１個のバイオマーカーのレベルを測定するための薬剤を含む。例えば、本キットは、ＣＥＡＣＡＭ１ポリヌクレオチド、ＺＤＨＨＣ１９ポリヌクレオチド、Ｃ９ｏｒｆ９５ポリヌクレオチド、ＧＮＡ１５ポリヌクレオチド、ＢＡＴＦポリヌクレオチド、Ｃ３ＡＲ１ポリヌクレオチド、ＫＩＡＡ１３７０ポリヌクレオチド、ＴＧＦＢＩポリヌクレオチド、ＭＴＣＨ１ポリヌクレオチド、ＲＰＧＲＩＰ１ポリヌクレオチド、及びＨＬＡ－ＤＰＢ１ポリヌクレオチドを含むパネルのバイオマーカーを検出するための薬剤を含み得る。加えて、本キットは、単独で、または任意の組み合わせで一緒に、かつ／または敗血症の診断のための臨床的パラメータとの組み合わせで使用され得る２つまたは３つのバイオマーカーパネル等の２つ以上のバイオマーカーパネルを検出するための薬剤を含み得る。

ある特定の実施形態では、本キットは、複数のバイオマーカーポリヌクレオチドの分析のためのマイクロアレイを含む。本キットに含まれる例示のマイクロアレイは、ＣＥＡＣＡＭ１ポリヌクレオチドにハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、ＺＤＨＨＣ１９ポリヌクレオチドにハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、Ｃ９ｏｒｆ９５ポリヌクレオチドにハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、ＧＮＡ１５ポリヌクレオチドにハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、ＢＡＴＦポリヌクレオチドにハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、Ｃ３ＡＲ１ポリヌクレオチドにハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、ＫＩＡＡ１３７０ポリヌクレオチドにハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、ＴＧＦＢＩポリヌクレオチドにハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、ＭＴＣＨ１ポリヌクレオチドにハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、ＲＰＧＲＩＰ１ポリヌクレオチドにハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、及びＨＬＡ－ＤＰＢ１ポリヌクレオチドにハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含む。

本キットは、本キットに含まれる組成物用の１つ以上の容器も含む。組成物は、液体形態であり得るか、または凍結乾燥され得る。組成物用の好適な容器としては、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ、及び試験管が挙げられる。容器は、ガラスまたはプラスチックを含む様々な材料から形成され得る。本キットは、敗血症を診断する方法の書面による指示を含む添付文書も含み得る。

本発明のキットは、いくつかの用途を有する。例えば、本キットを使用して、対象が敗血症を有するか、または非感染性源に起因する他の何らかの炎症状態、例えば、外傷性損傷、手術、自己免疫疾患、血栓症、または全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）を有するかを決定することができる。別の例では、本キットを使用して、患者が広域抗生物質等での敗血症の治療を受けるべきかを決定することができる。別の例では、本キットを使用して、敗血症を有する患者の治療の有効性を監視することができる。さらなる一例では、本キットを使用して、インビトロまたはインビボ動物モデルにおけるバイオマーカーのうちの１つ以上の発現を調節する化合物を特定して、治療の効果を決定することができる。

Ｄ．敗血症を診断するための診断システム及びコンピュータによる方法
さらなる一態様では、本発明は、敗血症を有する疑いのある患者を診断するためのコンピュータ実施方法を含む。コンピュータは、患者由来の生体試料中の１つ以上の敗血症バイオマーカーのレベルの値を含む入力された患者データを受け取るステップと、１つ以上の敗血症バイオマーカーのレベルを分析し、敗血症バイオマーカーのそれぞれの基準値範囲と比較するステップと、患者の感染Ｚ－スコアまたは敗血症スコアを計算するステップと、患者が敗血症を有する可能性を計算するステップと、患者の診断に関する情報を表示するステップと、を含むステップを行う。ある特定の実施形態では、入力された患者データは、患者由来の生体試料中の複数の敗血症バイオマーカーのレベルの値を含む。一実施形態では、入力された患者データは、ＣＥＡＣＡＭ１、ＺＤＨＨＣ１９、Ｃ９ｏｒｆ９５、ＧＮＡ１５、ＢＡＴＦ、Ｃ３ＡＲ１、ＫＩＡＡ１３７０、ＴＧＦＢＩ、ＭＴＣＨ１、ＲＰＧＲＩＰ１、及びＨＬＡ－ＤＰＢ１ポリヌクレオチドのレベルの値を含む。

さらなる一態様では、本発明は、上述のコンピュータ実施方法を行うための診断システムを含む。図１６に示されるように、診断システム１００は、プロセッサ１３０を収容するコンピュータ１１０、ストレージコンポーネント（すなわち、メモリ）１２０、ディスプレイコンポーネント１５０、及び典型的には汎用コンピュータに存在する他のコンポーネントを含む。ストレージコンポーネント１２０は、プロセッサ１３０によって実行され得る指示を含むプロセッサ１３０によってアクセス可能な情報、及びプロセッサによって読み出されるか、操作されるか、または記憶され得るデータを記憶する。

ストレージコンポーネントは、対象の診断を決定する指示を含む。例えば、ストレージコンポーネントは、本明細書に記載のバイオマーカー発現レベルに基づいて対象の感染Ｚ－スコアまたは敗血症スコアを計算する指示を含む（実施例１及び２を参照のこと）。加えて、ストレージコンポーネントは、多変量線形判別分析（ＬＤＡ）、受信者動作特性（ＲＯＣ）分析、主成分分析（ＰＣＡ）、アンサンブルデータマイニング法、マイクロアレイ細胞特異的有意性分析（ｃｓＳＡＭ）、または多次元タンパク質同定技術（ＭＵＤＰＩＴ）分析を行う指示をさらに含み得る。コンピュータプロセッサ１３０は、ストレージコンポーネント１２０に連結されており、ストレージコンポーネントに記憶された指示を実行して、患者データを受け取り、かつ１つ以上のアルゴリズムに従って患者データを分析するように構成されている。ディスプレイコンポーネント１５０は、患者の診断に関する情報を表示する。

ストレージコンポーネント１２０は、ハードドライブ、メモリカード、ＲＯＭ、ＲＡＭ、ＤＶＤ、ＣＤ－ＲＯＭ、ＵＳＢフラッシュドライブ、書き込み可能、及び読み取り専用メモリ等のプロセッサによってアクセス可能な情報を記憶することができる任意の種類のものであり得る。プロセッサ１３０は、ＩｎｔｅｌＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製のプロセッサ等の任意の周知のプロセッサであり得る。あるいは、プロセッサは、ＡＳＩＣ等の専用コントローラであり得る。

指示は、プロセッサにより直接（機械コード等）または間接的に（スクリプト等）実行される任意の組の指示であり得る。その点において、「指示」、「ステップ」、及び「プログラム」という用語は、本明細書で同義に使用され得る。指示は、プロセッサによる直接処理のためにオブジェクトコード形態で記憶され得るか、あるいはオンデマンドで解釈されるか、または事前にコンパイルされる独立ソースコードモジュールのスクリプトもしくはコレクションを含む任意の他のコンピュータ言語で記憶され得る。

データは、指示に従ってプロセッサ１３０により読み出されるか、記憶されるか、または修正され得る。例えば、診断システムが任意の特定のデータ構造によって制限されないが、データは、コンピュータレジスタ、複数の異なるフィールド及びレコードを有する表としてリレーショナルデータベース、ＸＭＬ文書、またはフラットファイルに記憶され得る。データは、２進値、ＡＳＣＩＩ、またはユニコード等であるが、これらに限定されない任意のコンピュータ可読形式でも形式化され得る。さらに、データは、数字、記述文、プロプライエタリコード、ポインタ、他のメモリ（他のネットワーク位置を含む）に記憶されたデータへの参照、または関連データを計算するための関数によって使用される情報等の関連情報を特定するのに十分な任意の情報を含み得る。

ある特定の実施形態では、プロセッサ及びストレージコンポーネントは、同じ物理的筺体内に保管されてもされなくてもよい複数のプロセッサ及びストレージコンポーネントを含み得る。例えば、指示及びデータのうちのいくつかは、取り外し可能なＣＤ－ＲＯＭに記憶され得、他のものは、読み取り専用コンピュータチップに記憶され得る。指示及びデータのうちのいくつかまたは全てが、プロセッサから物理的に遠隔しているが、依然としてプロセッサによりアクセス可能な位置に記憶され得る。同様に、プロセッサは、実際には、並列に動作してもしなくてもよい一群のプロセッサを含み得る。

一態様では、コンピュータ１１０は、１つ以上のクライアントコンピュータ１４０、１７０と通信しているサーバである。各クライアントコンピュータは、サーバ１１０と同様に、プロセッサ、ストレージコンポーネント、及び指示とともに構成され得る。各クライアントコンピュータ１４０、１７０は、通常パーソナルコンピュータに見られる全ての内部コンポーネント、例えば、中央処理装置（ＣＰＵ）、ディスプレイ１５０（例えば、プロセッサによって処理された情報を表示するモニタ）、ＣＤ－ＲＯＭ、ハードドライブ、ユーザ入力デバイス（例えば、マウス、キーボード、タッチスクリーン、またはマイクロホン）１６０、スピーカ、モデム、及び／またはネットワークインターフェースデバイス（電話機、ケーブルまたは別様のもの）、ならびにこれらの要素を互いに接続し、かつそれらが互いに（直接または間接的に）通信することを許容するために使用される全てのコンポーネントを有する、人１９０～１９１による使用を目的としたパーソナルコンピュータであり得る。さらに、本明細書に記載のシステム及び方法によるコンピュータは、指示を処理し、かつデータを人及び局部記憶能力を欠くネットワークコンピュータ等の他のコンピュータに／から送信することができる任意のデバイスを含み得る。

クライアントコンピュータ１４０及び１７０がフルサイズのパーソナルコンピュータを含み得るが、本システム及び本方法の多くの態様は、インターネット等のネットワーク上でデータをサーバと無線交換することができるモバイルデバイスとともに使用される際に特に有利であり得る。例えば、クライアントコンピュータ１７０は、無線機器対応ＰＤＡ、例えば、Ｂｌａｃｋｂｅｒｒｙｐｈｏｎｅ、ＡｐｐｌｅｉＰｈｏｎｅ、または他のインターネットに接続できる携帯電話であり得る。かかる点において、ユーザは、小型キーボード、キーパッド、タッチスクリーン、または任意の他のユーザ入力手段を使用して情報を入力することができる。コンピュータは、無線信号を受信するためのアンテナ１８０を有し得る。

サーバ１１０及びクライアントコンピュータ１４０、１７０は、例えば、ネットワーク２００上で、直接及び間接的に通信することができる。ほんの数個のコンピュータのみが図１６に描写されているが、典型的なシステムが多数の接続されたコンピュータを含んでもよく、各異なるコンピュータがネットワーク２００の異なるノードであることを理解されたい。ネットワーク、及び介在するノードは、デバイス及び通信プロトコル、例えば、インターネット、ワールドワイドウェブ、イントラネット、仮想プライベートネットワーク、広域ネットワーク、ローカルネットワーク、携帯電話ネットワーク、１つ以上の企業専有の通信プロトコルを使用するプライベートネットワーク、イーサネット、ＷｉＦｉ、及びＨＴＴＰの様々な組み合わせを含み得る。かかる通信は、データを他のコンピュータに／から送信することができる任意のデバイス、例えば、モデム（例えば、ダイヤルアップまたはケーブル）、ネットワーク、及び無線インターフェースによって促進され得る。サーバ１１０は、ウェブサーバであり得る。

上述のように情報が送信または受信された場合にある特定の利点が得られるが、本システム及び本方法の他の態様は、任意の特定の情報送信様式に限定されない。例えば、いくつかの態様では、情報は、ディスク、テープ、フラッシュドライブ、ＤＶＤ、またはＣＤ－ＲＯＭ等の媒体を介して送られ得る。他の態様では、情報は、非電子形式で送信され、本システムに手動で入力され得る。なおさらに、いくつかの機能がサーバで行われ、他の機能がクライアントで行われると示されているが、本システム及び本方法の様々な態様は、単一のプロセッサを有する単一のコンピュータにより実施され得る。

ＩＩＩ．実験
以下は、本発明を行うための特定の実施形態の実施例である。これらの実施例は、例証目的のためのみに提供されており、本発明の範囲を決して限定するようには意図されていない。

使用される数字（例えば、量、温度等）に関して正確さを確保するための努力がなされているが、言うまでもなく、いくつかの実験誤差及び偏差が認められるべきである。

実施例１
敗血症及び無菌性炎症の包括的時間経過ベースのマルチコホート分析が、ロバストな診断用遺伝子セットを明らかにする。
序文
我々は、同じ臨床時点でＳＩＲＳ／外傷を敗血症と比較するもの等の時間一致比較のみが敗血症をロバストに診断する遺伝子をもたらすであろうと仮説を立てた。我々は、敗血症における公的に入手可能な遺伝子発現データの包括的時間経過ベースのマルチコホート分析を行って、敗血症において見られる非感染性炎症（ＳＩＲＳ、外傷、及びＩＣＵ入院等）を急性感染による炎症とロバストに区別することができる保存１１遺伝子セットを特定した。この１１遺伝子セットは、発見コホートにおいて優れた診断力を有し、これを１５個の独立コホートで検証した。

結果
包括的検索及びラベル付け主成分分析（ＰＣＡ）可視化
我々は、ＧＥＯ及びＡｒｒａｙＥｘｐｒｅｓｓにおける我々の基準を満たした２７個の独立遺伝子発現データセットを特定し、それから合計２，９０３個のマイクロアレイを含めた（参照により全体が本明細書に組み込まれる、Ｐａｎｋｌａｅｔａｌ．（２００９）ＧｅｎｏｍｅＢｉｏｌ１０：Ｒ１２７、Ｔａｎｇｅｔａｌ．（２００９）ＣｒｉｔＣａｒｅＭｅｄ３７：８８２－８８８、Ｃｖｉｊａｎｏｖｉｃｈｅｔａｌ．（２００８）ＰｈｙｓｉｏｌＧｅｎｏｍｉｃｓ３４：１２７－１３４、Ｓｈａｎｌｅｙｅｔａｌ．（２００７）ＭｏｌＭｅｄ１３：４９５－５０８、Ｗｏｎｇｅｔａｌ．（２００７）ＰｈｙｓｉｏｌＧｅｎｏｍｉｃｓ３０：１４６－１５５、Ｗｏｎｇｅｔａｌ．（２００９）ＣｒｉｔＣａｒｅＭｅｄ３７：１５５８－１５６６、Ｗｏｎｇｅｔａｌ．（２０１０）ＰｅｄｉａｔｒＣｒｉｔＣａｒｅＭｅｄ１１：３４９－３５５、Ｗｏｎｇｅｔａｌ．（２０１１）ＣｒｉｔＣａｒｅＭｅｄ３９：２５１１－２５１７、Ａｌｍａｎｓａｅｔａｌ．（２０１４）ＪＣｒｉｔＣａｒｅ２９：３０７－３０９、Ｂｅｒｍｅｊｏ－Ｍａｒｔｉｎｅｔａｌ．（２０１０）ＣｒｉｔＣａｒｅ１４：Ｒ１６７、Ｍａｒｔｉｎ－Ｌｏｅｃｈｅｓｅｔａｌ．（２０１２）ＭｅｄＩｎｔｅｎｓｉｖａ３６：２５７－２６３、Ｔａｍａｙｏｅｔａｌ．（２０１２）ＪＣｒｉｔＣａｒｅ２７：６１６－６２２、Ｈｕｅｔａｌ．（２０１３）ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ１１０：１２７９２－１２７９７、Ｐａｒｎｅｌｌｅｔａｌ．（２０１２）ＣｒｉｔＣａｒｅ１６：Ｒ１５７、Ｓｕｔｈｅｒｌａｎｄｅｔａｌ．（２０１１）ＣｒｉｔＣａｒｅ１５：Ｒ１４９、Ｔａｎｇｅｔａｌ．（２００６）ＪＣｅｒｅｂＢｌｏｏｄＦｌｏｗＭｅｔａｂ２６：１０８９－１１０２、Ｔａｎｇｅｔａｌ．（２００７）ＡｍＪＲｅｓｐｉｒＣｒｉｔＣａｒｅＭｅｄ１７６：６７６－６８４、Ａｈｎｅｔａｌ．（２０１３）ＰＬｏＳＯｎｅ８：ｅ４８９７９、Ｄｏｌｉｎａｙｅｔａｌ．（２０１２）ＡｍＪＲｅｓｐｉｒＣｒｉｔＣａｒｅＭｅｄ１８５：１２２５－１２３４、Ｂｅｒｄａｌｅｔａｌ．（２０１１）ＪＩｎｆｅｃｔ６３：３０８－３１６、Ｂｅｒｒｙｅｔａｌ．（２０１０）Ｎａｔｕｒｅ４６６：９７３－９７７、Ｆｒｅｄｒｉｋｓｓｏｎｅｔａｌ．（２００８）ＰＬｏＳＯｎｅ３：ｅ３６８６、ＭｃＤｕｎｎｅｔａｌ．（２００８）ＰＬｏＳＯｎｅ３：ｅ１５６４、Ｃｈｕｎｇｅｔａｌ．（２００６）ＪＡｍＣｏｌｌＳｕｒｇ２０３：５８５－５９８、Ｐａｒｎｅｌｌｅｔａｌ．（２０１１）ＰＬｏＳＯｎｅ６：ｅ１７１８６、及びＥｍｏｎｔｓ，Ｐｈ．Ｄ．ｔｈｅｓｉｓ，ＥｒａｓｍｕｓＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＲｏｔｔｅｒｄａｍ，（２００８））。ＧｅｎｏｍｉｃｓｏｆＰｅｄｉａｔｒｉｃＳＩＲＳ／ＳｅｐｔｉｃＳｈｏｃｋＩｎｖｅｓｔｉｇａｔｏｒｓ（ＧＰＳＳＳＩ）からの６個のデータセットをＳＩＲＳまたは敗血症を有する２１９名の患者を含む単一のコホート内に組み合わせたため、これらの２７個のデータセットは２２個の独立コホートのみを含んだ（Ｃｖｉｊａｎｏｖｉｃｈｅｔａｌ．（上記参照）、Ｓｈａｎｌｅｙｅｔａｌ．（上記参照）、Ｗｏｎｇｅｔａｌ．（２００７）（上記参照）、Ｗｏｎｇｅｔａｌ．（２００９）（上記参照）、Ｗｏｎｇｅｔａｌ．（２０１０）（上記参照）、Ｗｏｎｇｅｔａｌ．（２０１１）（上記参照））。使用した試料のうちの多くは、外傷性損傷後最大８つの時点（ここでは１３０１個の試料を使用）で試料採取された合計３３３名の患者を有するＧｌｕｅＧｒａｎｔ外傷データセットからのものであった。これらの２７個のデータセットは、全血、好中球、及びＰＢＭＣから試料採取された、地域感染性及び院内感染性敗血症を混合した小児及び成人コホート、男性及び女性コホートを含む。

最初に、我々は、非感染ＳＩＲＳ／外傷患者及び敗血症／感染患者を遺伝子発現によって分類することができるかを確かめるために可能な限り単純な方法を使用するよう努めた。したがって、我々は、単一行列でＳＩＲＳ／外傷を敗血症／感染と比較する全ての利用可能なデータセットを共正規化した。ラベル付けＰＣＡ（１０倍相互検証ラッソペナルティ付きロジスティック回帰によって特定された１６８個の遺伝子を使用）は、ＳＩＲＳ／外傷患者を適度の重複で敗血症患者と分類することができることを示した（図１Ａ）。次に、我々は、各試料を「早期」（入院後４８時間以内）または「後期」（入院後４８時間超）とラベル付けした。分類不能な試料の大半は、「後期」試料であった（図１Ｂ）。この所見は、健常患者を別個のクラスとして含んだ場合でさえも当てはまった（図７）。以前の研究は、外傷、熱傷、または内毒素血症後の遺伝子発現が経時的に非線形的に変化することを示している（Ｃｏｂｂｅｔａｌ．（上記参照）、Ｘｉａｏｅｔａｌ．（上記参照）、Ｓｅｏｋｅｔａｌ．（上記参照）、Ｄｅｓａｉｅｔａｌ．（上記参照）、及びＭｃＤｕｎｎｅｔａｌ．（上記参照））。初期傷害後のこの連続的な発現変化は、全ての時点を平等に扱った場合に非感染ＳＩＲＳ／外傷を敗血症と区別することができないという説明になり得る。

したがって、我々は、損傷後の入院中の遺伝子発現が異なるコホート間で同様であるかの質的意味を得ようと努めた。我々は、入院後の遺伝子発現を非敗血症イベントについて経時的に長期にわたって試験した全ての末梢血データセットを含んだ。我々は、ＣＵＲ行列分解を使用して互いに最も直交であった１００個の遺伝子を特定し、これらを使用して損傷後の日数によって決定されたクラスでラベル付けされたＰＣＡを行った。頼もしくは、各時点での遺伝子発現群は、それが境界された時点に最も近かった（例えば、［１，２）日目群の先に［０，１）日目があり、［１，２）日目群の後に［２，３）日目が続く）。さらに、経時的な発現の変化は、最初の３つのラベル付けされた主成分の各々で変化する異なる日数群によって証明されるように、データセットのほとんどの変動を説明した。要約すれば、我々の分析は、外傷／ＩＣＵ入院後の遺伝子発現の変化が、（１）非線形様式で経時的に継続し、かつ（２）データセットにわたって同様の変化を経時的に示すことを示した。

時間一致マルチコホート分析
外傷のための入院後の遺伝子発現の変化がデータセットの多大な変動を説明するため、かつこれらの変化が非線形的に継続するため、入院時の患者と感染から数日後の同じ患者との直接比較は、誘発イベントからの回復による発現の「正常な」変化、ならびに院内感染による任意の「異常な」変化により交絡されるであろう。不可能ではないにしろ、これらの変化を解き放すのは非常に困難であろう。その結果として、臨床時間を考慮しない比較は、感染患者を非感染患者とロバストに判別することができるバイオマーカーを産出しない（図１）。したがって、我々は、（直接時間一致比較を可能にするために）時間一致非感染コホートも含んだ感染データセットにのみ焦点を当てた。それ故に、我々は、データセットを２つの群：（１）外傷、手術、または重病のための入院時の患者と、敗血症のための入院時の患者とを比較するデータセット（ＧＳＥ２８７５０（Ｓｕｔｈｅｒｌａｎｄｅｔａｌ．（上記参照））、ＧＳＥ３２７０７（Ｄｏｌｉｎａｙｅｔａｌ．（上記参照））、ＧＳＥ４００１２（Ｐａｒｎｅｌｌｅｔａｌ．（上記参照））、及びＧＰＳＳＳＩ固有統合データセット（ｎ＝４０８個の試料）（Ｃｖｉｊａｎｏｖｉｃｈｅｔａｌ．（上記参照）、Ｓｈａｎｌｅｙｅｔａｌ．（上記参照）、Ｗｏｎｇｅｔａｌ．（２００７）（上記参照）、Ｗｏｎｇｅｔａｌ．（２００９）（上記参照）、Ｗｏｎｇｅｔａｌ．（２０１０）（上記参照）、及びＷｏｎｇｅｔａｌ．（２０１１）（上記参照））、ならびに（２）院内感染を有する患者及び日数一致非感染患者を含むＧｌｕｅＧｒａｎｔデータセットに分類し、我々は、これらからバフィーコート試料コホート内の患者のみを使用した（表１）。ＧｌｕｅＧｒａｎｔ外傷コホートを、損傷以降およそ０．５日目、１、４日目、７日目、１４日目、２１日目、及び２８日目に試料採取し、これらのコホートをそれらの試料採取時間ビンに分類し、所与の時間ビン内の感染と診断された患者を同じ時間ビン内の非感染患者と比較することができる下位群を作成する。バフィーコート試料について、５つの時間ビンに少なくとも１０名の患者が存在し、これらをさらなる研究に用いた。したがって、我々は、６６３個の試料（３２６個のＳＩＲＳ／外傷対照及び３３７個の敗血症／感染症例を含む、時間一致ＳＩＲＳ／外傷を敗血症／感染と比較する合計９個のコホートを使用し、表２は、マルチコホート分析におけるコホートを示す。

その後、我々は、データセット一個抜き様式（ｌｅａｖｅ－ｏｎｅ－ｄａｔａｓｅｔ－ｏｕｔｆａｓｈｉｏｎ）で９個全てのコホートを含む我々の前述（参照により全体が本明細書に組み込まれるＫｈａｔｒｉｅｔａｌ．（２０１３）ＪＥｘｐＭｅｄ２１０：２２０５－２２２１）のマルチコホート遺伝子発現分析フレームワークを適用して、ＳＩＲＳ／外傷を敗血症／感染と比較した。この分析からの出力は、３ステップ閾値化プロセスを受け（偽発見率（ＦＤＲ）１％未満（プールされた効果量及びフィッシャー法の両方）、データセット間不均一性ｐ＞０．０１、及び絶対要約効果量倍率変化１．５超）、全ての時点にわたってＳＩＲＳ／外傷と敗血症患者との間で差次的に発現した８２個の遺伝子をもたらした（全ての８２個全ての遺伝子の要約統計を表８に示す）。クラス間で最も良好に判別する最も簡潔な組の有意な遺伝子を得るために、我々は、貪欲順方向検索を行って、８２個の遺伝子のどの組み合わせが全ての発見データセットにわたってＡＵＣの最も良好な改善をもたらしたかを特定した。ここで、判別は、遺伝子発現レベル（陽性遺伝子と陰性遺伝子との間の幾何平均の差を使用する）を組み合わせて各データセット内の各試料の標準化スコアに入れる「感染Ｚ－スコア」に基づく。これにより、最終的に１１個の遺伝子セット（敗血症において過剰発現６個及び過小発現５個、表３及び図２）を得た。９個の発見コホートにおけるこの１１遺伝子セットの平均ＲＯＣＡＵＣは、０．８７であった（範囲０．７０～０．９８、図３Ａ及び図９）。

ＧｌｕｅＧｒａｎｔ選別細胞コホート検証
ＧｌｕｅＧｒａｎｔ外傷コホートは、２つの独立した下位コホートを有し、一方は、バフィーコートコホート（２００４～２００６年にＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘアレイＧＰＬ５７０上で処理された試料）であり、他方は、好中球、単球、及びＴ細胞を含む選別細胞コホート（２００８－２０１１年に特注ＧｌｕｅＧｒａｎｔ－Ｈｕｍａｎ（ＧＧＨ）アレイ上で処理された試料）である。これらのコホートは、別個の患者であり、時間で分類され、異なる技術を使用してプロファイリングされる。試験対象患者基準及び登録場所が大いに同じである一方で、それらは、他の点では独立している。したがって、我々は、選別細胞ＧｌｕｅＧｒａｎｔコホートにおいて我々の１１遺伝子シグネチャを検証した。ここで、我々は、選別細胞コホートを発見バフィーコートコホートと同じ時間ビンに分け、各時間ビンを別々に処理した。

好中球が感染患者及び非感染患者の両方において外傷後に全白血球プールの７５～８５％を構成する（ひいては遺伝子発現の大半が末梢血に存在する）ため、選別細胞下位コホートから、我々は、好中球が全血試料と最も同様に機能すると予想した（図８）。実際には、１１遺伝子セットは、非常に良好に機能して、時間一致非感染外傷患者を敗血症外傷患者と分類した（４個のコホート、２１８個の試料、平均ＡＵＣ０．８３、範囲０．７３～０．８９）（図３Ｂ）。驚くべきことに、１１遺伝子セットは、これらの同じ患者との単球及びＴ細胞の判別力も示した（単球ＡＵＣ範囲０．７１～０．９７、Ｔ細胞ＡＵＣ範囲０．６９～０．９）（図１０Ａ、１１Ａ）。任意の選別細胞データセットをマルチコホート分析から除外したため、我々は、これらの細胞型における診断能力を予想しなかった。興味深いことに、選別細胞コホートにおいて、ＡＵＣは、初期外傷後経過時間の増加とともに増加し、これは、「ゲノムストーム」外傷性損傷が回復し始めたときに感染による炎症の判別がより容易であることを示唆し得る。

ＧｌｕｅＧｒａｎｔコホートにおける１１遺伝子セットの試験
予想通り、ＧｌｕｅＧｒａｎｔバフィーコートコホートにおいて、感染と診断された±２４時間以内の患者は、感染を有しない時間一致患者と比較して全ての時点で有意により高い感染Ｚ－スコアを有し、これは、好中球コホートにおいて検証された（反復測定ＡＮＯＶＡｐ＜０．０００１、図３Ｃ～３Ｄ、表９Ａ）。バフィーコートコホートにおける損傷後経過時間による感染Ｚ－スコアの比較が、経時的に有意な低下（経時的な反復測定ＡＮＯＶＡ変化ｐ＜０．０００１）を示すが、好中球検証コホートにおける効果がより低い（が、依然として有意である）（経時的な反復測定ＡＮＯＶＡ変化ｐ＜０．０５）ようであった（図３Ｃ～３Ｄ、表９Ａ）。群と損傷後経過時間との相互作用は、発見コホートまたは検証コホートのいずれでも有意ではなく、両群の経時的な感染Ｚ－スコアの低下は、恐らく、炎症の軽減をもたらす外傷性損傷からの回復によることを示唆する（表９Ａ）。

次に、我々は、感染診断前及び感染診断後の感染患者（１１遺伝子セットを特定する際に含まなかった試料）の感染Ｚ－スコアがどのように変化したかを分析した。我々は、同じ入院中にこれまでに感染と診断された患者由来の試料を感染診断からの時間に従って４つの群に群分けした（感染の５日超前、感染の５～１日前、感染診断から±１日以内、または感染診断から２～５日後のいずれか、感染診断から±１日以内の群以外の群を、１１遺伝子セットの発見のためのマルチコホート分析に含まなかった）。我々は、これらの群を損傷後経過日数に従ってさらにビンに分けた。各時間ビン内で、診断群の感染Ｚ－スコアは、発見バフィーコートコホート及び検証好中球コホートの両方においてそれらが感染に進行したときに有意に増加した（ヨンクヒール傾向（ＪＴ）検定ｐ＜０．０１、図３Ｅ～３Ｆ）。さらに、全てのコホートにおいて、恐らく抗生物質による治療に起因して患者が感染から回復し始めると、感染診断から２～５日後の群の感染Ｚ－スコアが低下した。これは、初期損傷後経過時間の増加に伴う診断力の増加を説明することもできる。我々は、５日超前のコホートも、１～５日前のコホートも、２～５日後のコホートもマルチコホート分析に含めなかったため、感染診断前後の感染Ｚ－スコアにおける結果として生じた「ピーク」が感染Ｚ－スコアと臨床感染との関連性を検証することを重視するが、発見バフィーコートコホート及び検証好中球コホートの両方における仮説的傾向も依然として示す。同様の結果が単球及びＴ細胞試料で見られた（好中球検証コホートと同じ患者、図１０Ｂ、１１Ｂ）。

興味深いことに、後の入院中に感染した患者の感染Ｚ－スコアは、入院時のバフィーコート試料において、入院中に感染しなかった患者よりも有意に高かった（ｐ＜０．０１、好中球検証群ｐ＝０．０５、図３Ｅ～３Ｆ）。１つの可能性として、損傷重症度のベースライン差が存在し、これが感染Ｚ－スコアに影響を及ぼし得ることが挙げられる。重度に損傷した患者が感染にかかりやすいことが知られている（Ｏｓｂｏｒｎｅｔａｌ．（２００４）ＣｒｉｔＣａｒｅＭｅｄ３２：２２３４－２２４０）。この仮説を試験するために、我々は、結果として起こる院内感染状態の線形回帰、損傷重症度スコア、及びそれらの相互作用を使用して、感染Ｚ－スコアを独立変数として予測した（表９Ｂ）。結果として起こる院内感染状態も損傷重症度スコアもいずれも、入院時の感染Ｚ－スコアを予測する際に独立して有意であり、損傷重症度が単独でこれらの効果の説明にはならないことを示す。相互作用期間は、発見バフィーコートコホート及び検証好中球コホート試料の両方において有意かつ陰性であり、恐らく、入院時のより高い感染Ｚ－スコアが、後の感染によりかかりやすいことを示し得ることを示唆する。さらなる研究がこの観察結果を試験するのに必要である。

ＧｌｕｅＧｒａｎｔにおける臨床的有用性
感染Ｚ－スコアが感染の臨床的判断を助長するかを試験するために、我々は、ＳＩＲＳ基準のみを使用したロジスティック回帰と、ＳＩＲＳ基準＋感染しているか感染していないＧｌｕｅＧｒａｎｔ外傷患者（バフィーコート及び好中球コホートの両方）を判別する我々の感染Ｚ－スコアを使用したロジスティック回帰を比較した。ＳＩＲＳ基準のみを使用したロジスティック回帰モデルが０．６４のＡＵＣを有した一方で、ＳＩＲＳ基準＋感染Ｚ－スコアは、０．８１の全体ＡＵＣを有した（全ての時点での単一感染係数を使用）（図１２）。連続正味再分類指数（ＮＲＩ）は、疾患マーカーを改善することにより何名の患者が正しく再分類されるかの尺度であり、ここで、感染Ｚ－スコアをＳＩＲＳのみに加える連続ＮＲＩは、０．９０（９５％ＣＩ０．６２～１．１７）であり、０．６を超える連続ＮＲＩは、予測時の「強力な」改善と関連している（Ｐｅｎｃｉｎａｅｔａｌ．（２０１２）ＳｔａｔＭｅｄ３１：１０１－１１３）。

感染Ｚ－スコアの独立検証
次に、我々は、最終的に感染を獲得した外傷またはＩＣＵ患者のみを含んだ３つの独立長期的コホート：ＧＳＥ６３７７（ＭｃＤｕｎｎｅｔａｌ．（上記参照））、ＧＳＥ１２８３８、及びＥＭＥＸＰ３００１（Ｍａｒｔｉｎ－Ｌｏｅｃｈｅｓｅｔａｌ．（上記参照））（表４）における我々のスコアを検証した。３つ全てのコホートは、入院日から少なくとも感染診断日を通じて患者を追跡した（主に、人工呼吸器関連肺炎（ＶＡＰ））。これらの３つの各々のコホート内の全ての患者が感染を獲得したため、それらは時間一致非感染対照を有しなかった。検証コホート感染症例を非感染外傷患者と比較するために、我々は、ＧｌｕｅＧｒａｎｔバフィーコート非感染対照を使用した。我々は、ハウスキーピング遺伝子を使用して各コホートを内部正規化し、その後、経験的ベイズ一括補正を使用してＧｌｕｅＧｒａｎｔバフィーコート患者と共正規化した。その後、我々は、検証コホートとＧｌｕｅＧｒａｎｔ非感染患者とを可変基準として一致時点で比較した。我々の先の所見（図３Ｃ～３Ｆ）が非感染患者における経時的な感染Ｚ－スコアの変化を示したため（表９Ａ）、外傷／ＩＣＵ患者と時間一致ベースラインとの比較が必要である。これらの３つの独立長期的外傷／ＩＣＵコホートは、感染±１日以内の患者が、概して、０．６８～０．８４の範囲のＲＯＣＡＵＣで、時間一致非感染ＧｌｕｅＧｒａｎｔ患者と分類可能であることを示す（図４）。

我々は、全血試料を使用して健常患者を入院時の細菌性またはウイルス性敗血症を有する患者と比較した８個の追加の独立データセットにおいて１１遺伝子セットをさらに検証した（合計Ｎ＝４４６：ＧＳＥ１１７５５（Ｅｍｏｎｔｓｅｔａｌ．（上記参照））、ＧＳＥ１３０１５（Ｐａｎｋｌａｅｔａｌ．（上記参照））、ＧＳＥ２０３４６（Ｐａｒｎｅｌｌｅｔａｌ．（上記参照））、ＧＳＥ２１８０２（Ｂｅｒｍｅｊｏ－Ｍａｒｔｉｎｅｔａｌ．（上記参照））、ＧＳＥ２５５０４（Ｓｍｉｔｈｅｔａｌ．（２０１４）ＮａｔＣｏｍｍｕｎ５：４６４９）、ＧＳＥ２７１３１（Ｂｅｒｄａｌｅｔａｌ．（上記参照））、ＧＳＥ３３３４１（Ａｈｎｅｔａｌ．（上記参照））、及びＧＳＥ４０３９６（Ｈｕｅｔａｌ．（上記参照））、表５）。全ての８つのデータセットの感染Ｚ－スコアを単一バイオリンプロットに合わせ、優れた分類を示した（Ｗｉｌｃｏｘｏｎｐ＜１ｅ－６３、図５Ａ）。健常患者と敗血症患者を分類する平均ＲＯＣは、０．９８であった（範囲０．９４～１．０、図５Ｂ）。

我々の結果は、全血、バフィーコート、好中球、及び単球における感染Ｚ－スコアが入院／損傷以降に経時的に低下するという有力な証拠を提供する。我々は、非時間一致比較が、特にＳＩＲＳ／外傷患者における後期獲得感染において、感染の不正確な分類をもたらすことも示した。したがって、入院時のＳＩＲＳ／外傷患者の感染Ｚ－スコアと後期獲得敗血症／感染患者の感染Ｚ－スコアとの比較は、診断力の不正確な尺度であろう。しかしながら、経時的な感染Ｚ－スコアの減少の影響が比較的単調であるため、入院ＳＩＲＳ／外傷／手術患者と後期獲得敗血症／感染との比較は、感染Ｚ－スコアの検出ＲＯＣＡＵＣに対する下限を提供するであろう。言い換えれば、感染Ｚ－スコアが経時的に減少するため、入院時に試験した非感染患者が後に試料採取された場合（敗血症患者との一致時点で）、それらの感染Ｚ－スコアは、その後の時点でより低いであろう（それ故に、敗血症患者におけるより高い感染Ｚ－スコアとより容易に分類可能であろう）。この推論を用いて、我々は、ＳＩＲＳ／外傷／手術患者を、敗血症の発病時の入院後期の同じ患者、または地域感染及び院内感染敗血症を有する患者の混合コホートのいずれかと比較した４つの独立データセットを試験した。これらのデータセットは、全血（ＥＭＴＡＢ１５４８（Ａｌｍａｎｓａｅｔａｌ．（上記参照）））、好中球（ＧＳＥ５７７２（Ｔａｎｇｅｔａｌ．（２００７）（上記参照）））、及びＰＢＭＣ（ＧＳＥ９９６０（Ｔａｎｇｅｔａｌ．（２００９）（上記参照）））、ＥＭＥＸＰ３６２１（Ｖａｓｓｉｌｉｏｕｅｔａｌ．（２０１３）ＣｒｉｔＣａｒｅ１７：Ｒ１９９））を研究した（表６）。これらの４つのデータセットの各々において、感染Ｚ－スコアは、後期獲得感染を入院ＳＩＲＳまたは外傷と分類し、ＲＯＣＡＵＣは、ＰＢＭＣの場合０．４８～０．７６の範囲であり、全血の場合０．８６の範囲であった（図１３）。我々は、これらのＡＵＣが、それらの時間不一致比較のため、より低いことが予想され、本質的には、適切に時間一致された感染Ｚ－スコアがこれらの細胞コンパートメントの各々においてどのようなものであろうかの下限値であることを重視する。

最後に、我々は、健常患者または自己免疫炎症を有する患者を診断確定後の急性細菌性感染と比較する１つのデータセットにおいて我々の１１遺伝子セットを試験した（ＧＳＥ２２０９８、ｎ＝２７４）（Ｂｅｒｒｙｅｔａｌ．（上記参照）、Ａｌｌａｎｔａｚｅｔａｌ．（２００７）ＪＥｘｐＭｅｄ２０４：２１３１－２１４４）。正確な試料採取時間は入手不可能であるが、典型的には、感染確定までに２４～７２時間かかるため、これらの感染試料が診断時よりも低いＺ－スコアを示すことが予想される。依然として、感染Ｚ－スコアは、健常患者及び自己免疫炎症患者を、急性感染を有する患者と判別することができる（ＲＯＣＡＵＣ０．７２、図１４）。自己免疫炎症を研究するコホートが我々の発見に含まれていないことを考慮して、これは、感染性炎症についての感染Ｚ－スコアの特異度の検証を提供する。

感染Ｚ－スコアに対する感染型の影響
感染Ｚ－スコアに任意の感染型特異的差が存在するかを試験するために、我々は、グラム陽性細菌に感染した患者とグラム陰性細菌に感染した患者、ならびにウイルス感染に感染した患者と細菌感染を有する患者を比較した。各下位コホート内の時間一致感染患者が少なすぎたため、ＧｌｕｅＧｒａｎｔ患者は分析しなかった。４つのデータセットは、グラム陽性感染対グラム陰性感染に関する情報を有し、４つのデータセットは、細菌感染対ウイルス感染に関するデータを有し、いずれの場合にも、感染サブタイプに基づく感染Ｚ－スコアの差の明らかな傾向は存在しなかった（表１０）。

遺伝子セット経路評価及び転写因子分析
１１遺伝子セットを検証した後、我々は、いずれの機構が、これらの遺伝子が何故協働するかを説明することができるかを試験した。我々は、１１遺伝子セットをＩｎｇｅｎｕｉｔｙＰａｔｈｗａｙ分析で分析し、これらの遺伝子のうちのいくつかがＩＬ－６及びＪＵＮの制御下にあることを示した（図１６）。マルチコホート分析によって特定された１１個の遺伝子を全てＥｎｃｏｄｅＱＴ及びＰＡＳＴＡＡ（実験的結果とコンピュータ内での転写因子予測の混合で選択されたもの）の両方に装填した。ＥｎｃｏｄｅＱＴは、６個の陽性遺伝子間で有意な転写因子を１つしか発見せず（Ｍａｘ）、陰性遺伝子では１つも発見しなかった（ＥｎｃｏｄｅＱＴＱ－値０．０１以下、表１０Ａ）。ＰＡＳＴＡＡは、周知の炎症促進性転写因子、例えば、Ｎｆ－ＫＢメンバーｃ－Ｒｅｌ、Ｓｔａｔ５、ならびにインターフェロン応答因子（ＩＲＦ）１及び１０のエンリッチメントを示した（表１０Ｂ）。しかしながら、転写因子分析のためのこれらの２つの方法がエンリッチされた組の因子について合意しなかったため、明白な結論を導き出すことができない。

明らかなネットワークドライバーが見つからなかったため、次に、我々は、それらの敗血症との関係を説明し得る、これらの遺伝子がある特定の免疫細胞型においてエンリッチされるかを研究した。我々は、ヒト免疫細胞型特異的遺伝子発現プロファイルについてＧＥＯを検索し、我々の基準と一致する２７７個の試料を１８データセットから見つけた。我々は、これらを集めて、平均遺伝子発現スコアを使用して広範な免疫細胞型シグネチャにした。その後、我々は、感染Ｚ－スコアと同じ方法を使用して標準化エンリッチメントスコアを計算した（陽性遺伝子と陰性遺伝子との間の幾何平均の差）。我々は、これを、マルチコホート分析において有意にエンリッチされていることが見出された最初の組の８２個の遺伝子と、順方向検索後に見出された１１遺伝子セット（感染Ｚ－スコアを構成する遺伝子）との両方に行った（図６）。この組の全ての８２個の有意な遺伝子が帯状核細胞のみにおいて高度にエンリッチされることが見出された（平均を超える４超の標準偏差、ｐ＜１ｅ－６）。興味深いことに、１１遺伝子セットは、帯状核細胞において帯状核細胞について有意にエンリッチされた（平均を超える２超の標準偏差、ｐ＝０．０１５）が、制御性Ｔ細胞における上方制御及び樹状細胞における下方制御も示した。これは、無菌性ＳＩＲＳと敗血症との間の差次的遺伝子発現の駆動力の１つが帯状核細胞の存在であることを示唆するが、診断に最良の組の遺伝子は、複数の細胞型移行を一度に組み込む可能性のある情報を含む。

考察
外傷後及び敗血症中の遺伝子発現の変化は、「ゲノムストーム」と説明されている（Ｘｉａｏｅｔａｌ．（２０１１）ＪＥｘｐＭｅｄ２０８：２５８１－２５９０）。ここで我々が試験した数十もの研究は、ＳＩＲＳ、外傷、手術、及び敗血症に応答して生じる遺伝子発現の変化に関する有益な識見を報告したが、先行単一研究分析のうちのいずれも依然として敗血症に関連する罹患率及び死亡率を低下させるための共用診断ツールを産出していない。我々は、遺伝子発現の時間依存性変化の高まる理解に基づいて、統合マルチコホート分析を使用して、ＳＩＲＳ／外傷における遺伝子発現を敗血症における遺伝子発現と区別した。これから、我々は、診断能力のために最適化された１１遺伝子セットを見出し、我々は、これを１５個の独立コホートにおいて検証した。さらなる前向き臨床検証により、この１１遺伝子セットは、臨床敗血症診断を支援することができ、これは、次いで、患者ケアに大きな影響を与えることができた。

感染性炎症も非感染性炎症もいずれも同じ先天性免疫経路（ＴＬＲ、ＲＬＲ、ＮＬＲ等）の活性化によりＳＩＲＳに至り得るため、「典型的な」炎症促進性遺伝子及びサイトカイン（ＴＮＦ及びインターロイキン等）は、一般に、無菌性炎症及び感染性炎症の両方で発現される（Ｎｅｗｔｏｎｅｔａｌ．（２０１２）ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂＰｅｒｓｐｅｃｔＢｉｏｌ４）。例えば、最近の研究の１つは、無菌性炎症（ＧｌｕｅＧｒａｎｔ熱傷コホート）と４つの独立敗血症データセットとの間の遺伝子発現の高い相関を示し、９３％もの遺伝子がこれらの２つの状態において同じ方向に変化した（Ｓｅｏｋｅｔａｌ．（２０１３）ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ１１０：３５０７－３５１２）。したがって、敗血症で発現することで知られているサイトカイン及びケモカインの「標準」スイートが主に無菌性ＳＩＲＳでも活性化される場合、無菌性ＳＩＲＳと敗血症との間で特異的かつ差次的に発現されるバイオマーカーを探し求める標準の仮説駆動型アプローチが成功する可能性は低い。しかしながら、レクチン及びＣＥＡＣＡＭ等のいくつかのタンパク質ファミリーが病原体関連分子パターンのみに特異性を有することが示されており、それ故に、感染特異的先天性免疫シグナル伝達経路の可能性を生み出す（Ｇｅｉｊｔｅｎｂｅｅｋｅｔａｌ．（２００９）ＮａｔＲｅｖＩｍｍｕｎｏｌ９：４６５－４７９、Ｃｒｏｃｋｅｒｅｔａｌ．（２００７）ＮａｔＲｅｖＩｍｍｕｎｏｌ７：２５５－２６６、Ｋｕｅｓｐｅｒｔｅｔａｌ．（２００６）ＣｕｒｒＯｐｉｎＣｅｌｌＢｉｏｌ１８：５６５－５７１）。したがって、我々は、特に複数のコホートにわたって無菌性ＳＩＲＳ／外傷患者及び敗血症患者との間で均一に統計的に差次的に発現される遺伝子を探し求めるデータ駆動型不偏アプローチをとった。

我々は、ＳＩＲＳ、外傷、重病、急性感染、及び敗血症における全ての公的に入手可能なマイクロアレイベースのゲノム規模での発現研究を系統的に特定し、全てのデータセットを選別して、非感染ＳＩＲＳ、ＩＣＵ、または外傷患者を、急性感染または敗血症を有する患者と比較したものを特定した。損傷後の時間が外傷後の遺伝子発現において重要な因子であることが知られている（Ｘｉａｏｅｔａｌ．（上記参照）、Ｓｅｏｋｅｔａｌ．（上記参照）、Ｄｅｓａｉｅｔａｌ．（上記参照）、ＭｃＤｕｎｎｅｔａｌ．（上記参照））。複数の独立コホートにわたって、我々は、経時的な遺伝子発現の変化が非線形であるが、同様の軌道をたどったことを示した。さらに、外傷からの正常な回復が、経時的な遺伝子発現の大きな変化を促した。したがって、同じ患者における損傷時またはそれに近い時点での遺伝子発現と後の時点（感染診断時等）での遺伝子発現との比較は、回復過程のみにより多数の差次的に発現された遺伝子をもたらした。それ故に、回復によって引き起こされる大きい変化から感染による遺伝子発現の比較的小さい変化を特定するのは非常に困難である。したがって、我々は、我々の発見コホートを、ＳＩＲＳ／外傷患者と敗血症／感染患者とを一致時点で比較した研究のみに制限した。しかしながら、外傷または手術とは異なり、感染が現れるのに時間がかかるため、敗血症の「開始」は容易に定義されない。したがって、我々は、症例として、敗血症のための入院の４８時間以内または感染診断から±２４時間以内の患者を使用し、これらが感染兆候及び症状が存在する時点であり、臨床診断が必要であるためである。我々は、マルチコホート分析アプローチ（Ｋｈａｔｒｉｅｔａｌ．（２０１３）ＪＥｘｐＭｅｄ２１０：２２０５－２２２１、Ｃｈｅｎｅｔａｌ．（２０１４）ＣａｎｃｅｒＲｅｓ７４：２８９２－２９０２）を使用して、９個の患者コホート由来の６６３個の試料を含む、ＳＩＲＳ／外傷患者と敗血症／感染患者とを時間一致様式で比較した。その後、我々は、試料サイズ加重ＲＯＣＡＵＣを最適化する順方向検索を使用して、判別力のために最適化された簡潔な組の統計的に有意な遺伝子を選択した（ＦＤＲ１％未満、絶対要約効果量１．５倍超）。１１遺伝子セットの幾何平均と定義した感染Ｚ－スコアは、ＳＩＲＳ／外傷患者を敗血症／感染患者と区別するための発見コホートにおいて０．８７の平均ＲＯＣＡＵＣを有した。

我々は、ＧｌｕｅＧｒａｎｔから独立した患者群においてこの遺伝子セットを検証した。敗血症を非感染性炎症と区別するための平均ＡＵＣは、好中球検証コホートにおいて０．８３であり、初期損傷後経過時間が長くなるほどより良好な診断力への明らかな傾向が見られた。我々は、全血転写プロファイルが主に好中球によって駆動されると予想するが、選別された細胞におけるシグナルは、全血とは確実に異なるであろう。したがって、全血の代わりに選別された細胞を診断に使用することにより、より低い判別力がもたらされることが予想される。この制限にもかかわらず、感染Ｚ－スコアは、初期外傷性炎症が減弱し、かつ院内感染が現れる特に初期損傷以降の３日目以上の時点で検証コホートにおいて同程度に機能した（Ｈｉｅｔｂｒｉｎｋｅｔａｌ．（２０１３）Ｓｈｏｃｋ４０：２１－２７）。

ＧｌｕｅＧｒａｎｔにおける患者に利用可能な広範囲に及ぶ臨床表現型データを使用して、我々は、感染Ｚ－スコアの適用に関するいくつかの重要な点を例証した。第１に、感染Ｚ－スコアは、損傷以降に経時的な低下を示し、これは、感染患者及び非感染患者の両方において同様であった。我々は、ＧｌｕｅＧｒａｎｔにおける時間変動非感染ベースラインを基準閾値として使用することにより、０．６８～０．８４の範囲のＲＯＣＡＵＣを有する３つの独立長期的コホートにおける敗血症患者を非感染外傷患者と判別することが可能になることも示した。したがって、最大判別力について、感染Ｚ－スコアが長期的な研究において前向きに試験される場合、診断閾値が初期損傷後経過時間の関数である必要があろう。第２に、感染Ｚ－スコアは、感染前の数日にわたって増加し、感染診断時前後の±１日以内にピークに達し、その後、低下した（恐らく、感染の治療により）。この観察結果は、敗血症を発症する危険性のある患者の早期診断または層別化が１１遺伝子セットを使用して可能であり得るという可能性を高めるが、さらなる研究が必要である。具体的には、我々は、感染の臨床診断に先行する感染Ｚ－スコアの早期上昇が偽陽性ではなく、「早期陽性」結果であることに留意する。最後に、より高い損傷重症度スコア（ＩＳＳ）を有する患者における感染Ｚ－スコアが入院時により高く、したがって、初期感染Ｚ－スコアは、ＩＳＳ及び臨床感染までの相対時間の両方に依存する。しかしながら、入院後２４時間以内の外傷患者は、通常、明らかではない感染（開放創、腹膜汚染等以外）を有する疑いがないため、我々は、感染Ｚ－スコアがいずれにせよこの群において臨床的有用性があるとは予想しない。

ＧｌｕｅＧｒａｎｔバフィーコートコホートにおいて、全ての４つのＳＩＲＳマーカーが利用可能な患者について、ＳＩＲＳ２進パラメータは、感染時の患者を非感染患者と判別する際にあまり良好に機能しなかった（ＲＯＣＡＵＣ０．６４）。ＳＩＲＳ基準＋全体的カットオフを有する感染Ｚ－スコア（すなわち、別個の時間ビンに分けられていない）は判別力を増加させ（ＲＯＣＡＵＣ０．８１）、連続ＮＲＩでは０．９であった。しかしながら、ＳＩＲＳは、敗血症を診断するためのいくつかの基準のうちの１つにすぎない。プロカルシトニンは、敗血症をＳＩＲＳと区別するための十分に研究されたバイオマーカーであり、プロカルシトニンの２つのメタ分析はいずれも０．７８の要約ＲＯＣＡＵＣ（範囲０．６６～０．９０）を示した（Ｔａｎｇｅｔａｌ．（２００７）ＬａｎｃｅｔＩｎｆｅｃｔＤｉｓ７：２１０－２１７、Ｕｚｚａｎｅｔａｌ．（２００６）ＣｒｉｔＣａｒｅＭｅｄ３４：１９９６－２００３、Ｃｈｅｖａｌｅｔａｌ．（２０００）ＩｎｔｅｎｓｉｖｅＣａｒｅＭｅｄ２６Ｓｕｐｐｌ２：Ｓ１５３－１５８、Ｕｇａｒｔｅｅｔａｌ．（１９９９）ＣｒｉｔＣａｒｅＭｅｄ２７：４９８－５０４）。我々の発見コホートにおける平均ＡＵＣは、０．８７であり、時間一致好中球検証コホートは、０．８３の平均ＡＵＣを有し、それ故に、これらはいずれもプロカルシトニンに少なくとも匹敵する。しかしながら、我々は、これらのマーカーの各々が独立して使用されなくてもよいことを重視する。公的に入手可能なデータセットのうちのいずれも、敗血症の診断時のプロカルシトニンレベルを含まなかった。したがって、バイオマーカーの組み合わせを使用したより良好な診断性能及び一対一の比較の両方を試験するために、感染Ｚ－スコアの任意の前向き研究が、従来のバイオマーカー及び新たなバイオマーカーの両方を含むべきである。

我々は、ＶＡＰ／ＶＡＴを発症したＩＣＵ／外傷患者の長期的コホートを３つ、細菌性またはウイルス性敗血症と比較した健常患者のコホートを８つ、全血、好中球、ＰＢＭＣを使用した混合時点または後の時点での患者と比較した入院ＳＩＲＳ／外傷患者のコホートを４つ、急性感染を有する患者と比較した自己免疫炎症を有する患者のコホートを１つ含んだいくつかの追加の外部データセットにおける感染Ｚ－スコアを検証した。感染Ｚ－スコアは、我々の試験対象患者基準と一致した全ての公的に入手可能なデータセットにおいて判別力を有した。さらに、感染Ｚ－スコアは、感染型情報が入手可能なデータセットにわたって感染型（グラム陽性対グラム陰性及び細菌性対ウイルス性）に関して系統的傾向を有しない。我々は、ベースライン感染Ｚ－スコアがＧｌｕｅＧｒａｎｔデータにおいて損傷以降に経時的に低下したという所見に基づいて、これらのコンパートメントのうちのいずれかにおける入院ＳＩＲＳ／外傷と後の時点との比較が時間一致研究よりも不良な診断力を有することを重視する。したがって、４つの独立非時間一致コホートにおける感染Ｚ－スコアの判別力は、それぞれの血液コンパートメントにおける真の判別力の下限であり得る。

ＣＥＡＣＡＭ１、Ｃ３ＡＲ１、ＧＮＡ１５、及びＨＬＡ－ＤＰＢ１等の敗血症特異的１１遺伝子セットにおける遺伝子のうちのいくつかが敗血症または感染と以前に関連付けられている（Ｍａｄｓｅｎ－Ｂｏｕｔｅｒｓｅｅｔａｌ．（２０１０）ＡｍＪＲｅｐｒｏｄＩｍｍｕｎｏｌ６３：７３－９２、Ｗｏｎｇｅｔａｌ．（２０１２）ＣｒｉｔＣａｒｅ１６：Ｒ２１３、Ｋｗａｎｅｔａｌ．（２０１３）ＰＬｏＳＯｎｅ８：ｅ６０５０１）。これらの遺伝子の調節管理が、コンピュータ内での分析に基づいて、ＩＬ－６、ＪＵＮ、ｃ－Ｒｅｌ、Ｓｔａｔ５、及びＩＲＦ１／１０等の炎症促進性因子についてエンリッチされ得るが、いずれの共通因子もネットワークについて説明しなかった。ここで見出された遺伝子セットは、細胞型エンリッチメント分析によってより良好に説明され得る。我々は、帯状核細胞及び脊髄細胞株が、無菌性ＳＩＲＳと敗血症との間で有意に差次的に発現されることが見出された全組の８２個の遺伝子について高度にエンリッチされることを示す。バンドが無菌性ＳＩＲＳと敗血症との区別に役立つことが以前に示されたため、帯状核細胞におけるエンリッチメントの所見は特に興味深いものである（Ｃａｖａｌｌａｚｚｉｅｔａｌ．（２０１０）ＪＩｎｔｅｎｓｉｖｅＣａｒｅＭｅｄ２５：３５３－３５７、Ｄｒｉｆｔｅｅｔａｌ．（２０１３）ＣｒｉｔＣａｒｅＭｅｄ４１：８２０－８３２）。さらに、自動血球計数器及び手動の両方によるバンド計数に非常に高い変動性が存在し（Ｃｏｒｎｂｌｅｅｔｅｔａｌ．（２００２）ＣｌｉｎＬａｂＭｅｄ２２：１０１－１３６、ｖａｎｄｅｒＭｅｅｒｅｔａｌ．（２００６）ＥｕｒＪＨａｅｍａｔｏｌ７６：２５１－２５４）、良好な血清マーカーは存在しない。しかしながら、１１遺伝子セットは、敗血症と無菌性ＳＩＲＳとの区別に少なくとも部分的により良好であり得、これは、１１遺伝子セットが制御性Ｔ細胞の増加及び樹状細胞の減少に関する情報も含むためであり、これらはいずれも以前に敗血症に関与した（Ｓａｉｔｏｅｔａｌ．（２００８）ＴｏｈｏｋｕＪＥｘｐＭｅｄ２１６：６１－６８、Ｖｅｎｅｔｅｔａｌ．（２００８）ＪＬｅｕｋｏｃＢｉｏｌ８３：５２３－５３５、Ｇｒｉｍａｌｄｉｅｔａｌ．（２０１１）ＩｎｔｅｎｓｉｖｅＣａｒｅＭｅｄ３７：１４３８－１４４６）。１１遺伝子セットと異なる免疫細胞型との間の関連性は、いくらかの敗血症生物学の説明に役立ち得るが、これらの１１個の遺伝子のさらなる研究が確実に必要である。

現在の研究の臨床的使用への変換の可能性は、２つの要因に依存する。第１に、１１遺伝子セットもこれらの遺伝子のタンパク質産物もいずれも、時間一致様式で前向きに試験されなければならない。現在、タンパク質アッセイは、ＰＣＲよりも速い応答時間を有するが、ＰＣＲ技術におけるいくつかの進歩が、結果までの時間を臨床的適用性の範囲内に引き下げている（Ｐａｒｋｅｔａｌ．（２０１１）ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌＡｄｖ２９：８３０－８３９、Ｐｏｒｉｔｚｅｔａｌ．（２０１１）ＰＬｏＳＯｎｅ６、ｅ２６０４７）。第２に、我々の結果は、外傷性イベント（損傷または手術等）からの正常な回復による遺伝子発現の変化が、急性疾病の任意の遺伝子発現研究において時間が適切に計上されなければならないことを意味することを示した。我々の検索は、ＳＩＲＳ／外傷後の時間経過を試験するいくつかの研究（ＧＳＥ６３７７、ＧＳＥ１２８３８、ＧＳＥ４００１２、ＥＭＥＸＰ３００１）及び敗血症／感染発症以降の時間経過を試験するいくつかの研究（ＧＳＥ２０３４６、ＧＳＥ２７１３、ＧＳＥ４００１２、ＥＭＥＸＰ３８５０）を見出した。しかしながら、我々は、患者コホートのうちのいくつかが感染を発症し、患者コホートのうちのいくつかが感染を発症しない患者コホートを経時的に試験した公的に入手可能なマイクロアレイ研究（ＧｌｕｅＧｒａｎｔ）を１つしか見つけることができなかった。したがって、我々の結果に基づいて、我々は、適切な時間一致比較を可能にするために、敗血症診断法の今後の研究が感染を有するコホート及び感染を有しないコホートの両方の長期的コホートで設計されるべきであることを推奨する（Ｊｏｈｎｓｏｎｅｔａｌ．（２００７）ＡｎｎＳｕｒｇ２４５：６１１－６２１、Ｍａｓｌｏｖｅｅｔａｌ．（２０１４）ＴｒｅｎｄｓＭｏｌＭｅｄ．２０（４）：２０４－２１３）。

全体的に、ＳＩＲＳ／外傷及び敗血症における公的に入手可能な遺伝子発現データの我々の包括的な分析は、発見コホート及び１５個の独立コホートの両方において優れた判別力を有する簡潔な１１遺伝子セットを産出した。この遺伝子セットのために臨床アッセイを最適化して、臨床的関連性のウィンドウ内で結果を得ることは、実現可能であるはずである。我々の臨床所見を前向き様式で確認するためにも、これらの遺伝子の上流の分子経路を調査するためにも、さらなる研究が必要である。

方法
研究設計
本研究の目的は、統合マルチコホートメタ分析フレームワークを使用して複数の遺伝子発現データセットを分析して、無菌性炎症を有する患者を、感染性炎症を有する患者と分類することができる遺伝子セットを特定することであった。このフレームワークについては、以前に説明されている（Ｋｈａｔｒｉｅｔａｌ．（２０１３）ＪＥｘｐＭｅｄ２１０：２２０５－２２２１、Ｃｈｅｎｅｔａｌ．（２０１４）ＣａｎｃｅｒＲｅｓ７４：２８９２－２９０２）。

検索
２つの公的遺伝子発現マイクロアレイリポジトリ（ＮＩＨＧＥＯ、ＡｒｒａｙＥｘｐｒｅｓｓ）を、以下の検索用語：敗血症、ＳＩＲＳ、外傷、ショック、手術、感染、肺炎、重篤、ＩＣＵ、炎症性、院内のうちのいずれかと一致した全てのヒトデータセットについて検索した。健常対照または非感染性炎症（ＳＩＲＳ、外傷、手術、自己免疫）を有する患者のいずれかと、急性感染及び／もしくは敗血症を有する患者とを比較したデータセットをさらなる研究のために保存した。ＳＩＲＳまたは敗血症モデルとして内毒素注入を利用したデータセットは含めなかった。

マルチコホート分析
非感染ＳＩＲＳ／外傷患者における遺伝子発現と感染または敗血症を有する患者における遺伝子発現とを比較するマルチコホートメタ分析を完了した。ＳＩＲＳ／外傷患者と敗血症／感染患者とを同じ時点で比較した全てのデータセットをマルチコホート分析に含めるために選択し、したがって、入院時の患者と後の時点で敗血症を有する患者との比較を除外した（「結果」の項におけるこのモデルの正当化を参照のこと）。入院データセットを、入院後４８時間以内の患者由来の試料に限定した。ＧｌｕｅＧｒａｎｔ外傷データセットを損傷後経過日数の時間ビンに分け、入院後最初の２４時間を除いた（「補足方法」の項を参照のこと）。これらの時間ビンの各々を、以前に感染していない時間一致患者を感染診断後±２４時間以内の患者と比較するマルチコホート分析において別個のデータセットとして扱った（感染については上で定義された通りである）。したがって、感染診断後２４時間経過した患者をこの比較において検閲する。本方法は、外傷からの回復による経時的な遺伝子発現の「標準の」変化からの感染による偏差の検出を可能にする。

入力データセットを選択した後、我々は、２つのメタ分析法を適用し、一方は、ヘッジのｇを使用して効果量を合わせ、他方は、ｐ値を合わせるフィッシャーの対数和法を使用した（図１５の概略図を参照のこと）。ｎ個のデータセットと仮定して、この方法を、データセット一個抜き様式でｎ回適用する。偽発見率（ＦＤＲ）閾値を０．０１に設定し、一個抜き分析の全てのラウンドで効果量及びフィッシャーの対数和法の両方においてＦＤＲ閾値未満のｑ値を有する遺伝子を選択した。その後、これらの遺伝子をデータセット不均一性検定に供し、全ての入力データセットにわたる不均一性検定において０．０１を超えるｐ値が各遺伝子に必要になり、これにより、異なるデータセットにわたって有意に異なる効果を示す遺伝子を取り除く。次に、１．５倍未満の要約効果量を有する全ての遺伝子を処分した。最後に、上述の基準（表８）の３つ全てに従ってマルチコホート分析において統計的に有意であることが見出された全ての遺伝子を、最も有意な遺伝子から開始して、残り全ての遺伝子を遺伝子スコアに１つずつ加え、判別能力の増加が最も高い遺伝子を最終遺伝子リストに加える貪欲順方向検索モデルに供した。

補足方法
データセットの詳細
６個の公的に入手可能な全血データセットは、ＧｅｎｏｍｉｃｓｏｆＰｅｄｉａｔｒｉｃＳＩＲＳ／ＳｅｐｔｉｃＳｈｏｃｋＩｎｖｅｓｔｉｇａｔｏｒｓ（ＧＰＳＳＳＩ）からのものであった（Ｃｖｉｊａｎｏｖｉｃｈｅｔａｌ．（２００８）ＰｈｙｓｉｏｌＧｅｎｏｍｉｃｓ３４：１２７－１３４、Ｓｈａｎｌｅｙｅｔａｌ．（２００７）ＭｏｌＭｅｄ１３：４９５－５０８、Ｗｏｎｇｅｔａｌ．（２００７）ＰｈｙｓｉｏｌＧｅｎｏｍｉｃｓ３０：１４６－１５５、Ｗｏｎｇｅｔａｌ．（２００９）ＣｒｉｔＣａｒｅＭｅｄ３７：１５５８－１５６６、Ｗｏｎｇｅｔａｌ．（２０１０）ＰｅｄｉａｔｒＣｒｉｔＣａｒｅＭｅｄ１１：３４９－３５５、Ｗｏｎｇｅｔａｌ．（２０１１）ＣｒｉｔＣａｒｅＭｅｄ３９：２５１１－２５１７）。これらのデータセットは、重複試料を含み、それについて、ＨｅｃｔｏｒＷｏｎｇが固有の患者の手掛かりを提供した。その後、それらの固有の患者を一緒にｇｃＲＭＡ正規化し、単一データセットとして扱った（ＧＰＳＳＳＩ固有）。

公的に入手可能なデータセットに加えて、我々は、ＩｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎａｎｄＨｏｓｔＲｅｓｐｏｎｓｅｔｏＩｎｊｕｒｙＰｒｏｇｒａｍ（ＧｌｕｅＧｒａｎｔ）外傷データセット（Ｃｏｂｂｅｔａｌ．（上記参照））を使用した。ＧｌｕｅＧｒａｎｔデータセットは、全バフィーコートまたは選別された細胞（好中球、単球、Ｔ細胞）のいずれかの試料採取された別個の外傷患者コホートからなる。試験対象患者基準は、他の箇所で説明されている（Ｄｅｓａｉｅｔａｌ．（上記参照））。患者を入院後０．５日目、１日目、４日目、７日目、１４日目、２１日目、２８日目に試料採取した。ＧｌｕｅＧｒａｎｔ外傷コホート患者を、患者が院内感染（肺炎、尿路感染、カテーテル関連血流感染等）を有したか、外科感染（表在性創傷感染を除く）を有したか、または内臓穿孔手術を受けた場合、「感染している」と分類した。感染の定義は、ｇｌｕｅｇｒａｎｔ．ｏｒｇ／ｃｏｍｍｏｎｌｙｒｅｆｅｒｅｎｃｅｄｐｕｂｓ．ｈｔｍで見つけることができる。メタ分析について、感染診断日から±２４時間以内に採取された試料を感染症例として含めた。２０名未満の患者の時点をマルチコホート分析に含めなかった。ＧｌｕｅＧｒａｎｔは熱傷患者も含むが、臨床的に関連する感染とコロニー形成熱傷創傷との区別が困難であるため、これらの患者を含めなかった。ＧｌｕｅＧｒａｎｔの使用は、ＧｌｕｅＧｒａｎｔＣｏｎｓｏｒｔｉｕｍ及びＳｔａｎｆｏｒｄＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＩＲＢの両方に承認された（プロトコル２９７９８）。

遺伝子発現の正規化
全てのＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘデータセットをＣＥＬファイルでダウンロードし、ｇｃＲＭＡ（Ｒパッケージａｆｆｙ）を使用して再正規化した。Ａｇｉｌｅｎｔチップ及びＧｅｎｅＰｉｘスキャナで分析された特注アレイからの出力をバックグラウンド補正し、アレイ内レス正規化し、その後、アレイ間分位正規化した（Ｒパッケージｌｉｍｍａ）（Ｇ．Ｓｍｙｔｈ，ｉｎＢｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓａｎｄＣｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌＢｉｏｌｏｇｙＳｏｌｕｔｉｏｎｓＵｓｉｎｇＲａｎｄＢｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ，Ｃ．Ｖ．ＧｅｎｔｌｅｍａｎＲ，ＤｕｄｏｉｔＳ，ＩｒｉｚａｒｒｙＲａｎｄＨｕｂｅｒＷ（ｅｄｓ．），Ｅｄ．（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，ＮｅｗＹｏｒｋ，２００５），ｐｐ．ｐｐ．３９７－４２０）。Ｉｌｌｕｍｉｎａデータセットを分位正規化した。ＧｌｕｅＧｒａｎｔ選別細胞データセットを、特注アレイ（ＧＧＨ－１、ＧＧＨ－２）を使用して分析し、これらを上述のように正規化し、それらの後処理状態で使用した（Ｘｕｅｔａｌ．（２０１１）ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ１０８：３７０７－３７１２）。全ての遺伝子分析について、共通遺伝子のプローブの平均を遺伝子発現レベルとして設定した。全てのプローブ－遺伝子マッピングを、ＧＥＯの２０１４年１２月１４日の最新のＳＯＦＴファイルからダウンロードした。

ラベル付けＰＣＡ法
ラベル付け主成分分析（ＰＣＡ）法は、ＫｏｒｅｎａｎｄＣａｒｍｅｌ（ＩＥＥＥＴｒａｎｓＶｉｓＣｏｍｐｕｔＧｒａｐｈ（２００４）１０：４５９－４７０）の項４．１の等式６及び７に記載の制約最適化の実施である。この最適化は、データの異なるラベル付けクラスの点間の対距離を最大化するデータの線形変換を算定する一方で、変換されたデータが互いに直交するという制約を維持する。この直交制約は、変換されたデータ自体ではなく変換された基礎が相互に直交することを要求する、ＰＣＡが用いる制約とはわずかに異なる。ＰＣＡが投影スキームである一方で、ラベル付けＰＣＡは、この制約の差による線形変換の一般形態である。

Ｘを元のデータセットと呼び、ｍ個の行（データ点）及びｎ個の列（各データ点がｎ個の要素を有する）を有する。Ｙは、各クラスの異なるリストを有する１行列によるｍである。言い換えれば、Ｙ（ｉ）は、要素ｉ及びｊが同じラベル付けクラスの一部である場合、かつその場合に限り、Ｙ（ｊ）と等しい。Ｌは、Ｙ（ｉ）がＹ（ｊ）と等しい場合を除いて、（ｉ，ｊ）入力が－１であるｍ行列による対称的ｍである。後者の場合、入力は、０である。最後に、行ｉが合計０になるように、全ての対角入力（ｉがｊと等しい）を満たす。ＫｏｒｅｎａｎｄＣａｒｍｅｌは、見出し３．２において、固有ベクトルの転置（Ｘ）＊Ｌ＊Ｘがデータの異なるラベル付けクラスにおける点間の対距離を最大化するマッピングを提供することを証明している。しかしながら、この変換は投影スキームのままであり、これは、これらの固有ベクトルが互いに直交することを意味する。後者の結果は変換データの有用性を限定するが、より一般化可能である。この論文で使用される一般的な線形投影は、代わりに、式中、Ａが転置（Ｘ）＊Ｌ＊Ｘであり、Ｂが転置（Ｘ）＊Ｘである、等式Ａｖ＝λＢｖを解くベクトルｖを見出す。より表現的であるが、この方法は、ラベル付けＰＣＡ投影スキームほどロバストではないが、この一般化形態の解決策が、Ｂが単数形ではないことを要求するためである。Ｂが恒等行列ではないため、投影に使用した古い直交制約は有効でなくてもよい。代わりに、この形態の解決策は、基礎が元のデータの共分散基礎に対して相互直交することを要求する。

ラベル付けＰＣＡの適用
ラベル付けＰＣＡ法は、「補足方法」の項で説明されている。非感染性ＳＩＲＳ、ＩＣＵ、または外傷患者と敗血症患者との比較を含む全てのデータセットをプローブから遺伝子に変換し、その後、単一の大型行列にまとめ、分位正規化した。全てのデータセットに存在しない遺伝子を処分した。任意の時点（入院時または院内感染のいずれか）の敗血症を有する患者を単一クラスに群分けし、ラッソペナルティ付き回帰を適用して、無菌性ＳＩＲＳ患者を敗血症患者と分類した（Ｒパッケージｇｌｍｎｅｔ）。ラベル付けＰＣＡを、ペナルティ付き回帰によって選択された遺伝子を使用して、無菌性ＳＩＲＳクラス対敗血症クラスで行った。その後、同じグラフを再ラベル付けして、どの試料が院内感染（もしくは後期）無菌性ＳＩＲＳ患者または敗血症患者由来であるかを示した。その後、ペナルティ付き回帰由来の同じ組の遺伝子をラベル付けＰＣＡに使用して、健常患者、無菌性ＳＩＲＳ患者、敗血症患者を比較した。その後、この同じグラフを再ラベル付けして、どの試料が院内感染もしくは後期無菌性ＳＩＲＳ患者または敗血症患者由来であるかを示した。

ＳＩＲＳ／外傷及び感染における遺伝子発現に対する時間の影響を試験するために、経時的な連続測定結果を含む全てのデータセットを選択した。他方のデータセットからのシグナルを圧倒しないように、ＧｌｕｅＧｒａｎｔデータセットからバフィーコートアレイのみを含んだ。選択されたデータセットをプローブから遺伝子に変換し、その後、単一の大型行列にまとめ、分位正規化した。全てのデータセットに存在しない遺伝子を処分した。遺伝子セットを不偏様式で低減するために、ＣＵＲ行列分解を用いて、合わせたデータセットにおいて最も高い直交性を有する上位１００個の遺伝子を選択した（ＲパッケージｒＣＵＲ）（Ｂｏｄｏｒｅｔａｌ．（２０１２）ＢＭＣＢｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ１３：１０３）。その後、各時点を（１日目、２日目、３日目、４日目、５日目、６日目、１０日目、２０日目、及び４０日目に分けた）異なるクラスとして使用して、ラベル付けＰＣＡを行った。結果として得られたＰＣＡを三次元でグラフ化し、時点毎に色付けし、Ｒパッケージｒｇｌを使用して三次元空間の回転の短いビデオを捉えた。

感染Ｚ－スコア
マルチコホート分析後に有意であることが見出された遺伝子を、それらの効果が陽性または陰性であるかに従って分類した（ここで、「陽性」とは、ＳＩＲＳ／外傷と比較した敗血症における陽性効果量を意味し、「陰性」とは、ＳＩＲＳ／外傷と比較した敗血症における陰性効果量を意味する）。その後、単一遺伝子スコアを使用してこれらの遺伝子セットのクラス判別力を試験した。使用した遺伝子スコアは、全ての陽性遺伝子の遺伝子発現レベルの幾何平均から全ての陰性遺伝子の遺伝子発現レベルの幾何平均を差し引き、陰性遺伝子計数に対する陽性遺伝子計数の比率を乗じたものである。これをあるデータセットにおける各試料について計算し、その後、各データセットのスコアを標準化して、Ｚ－スコア（「感染Ｚ－スコア」）を得た。全データセットに存在しない遺伝子を除外し、個々の試料を欠いている遺伝子を１に設定した。陰性遺伝子発現値（２チャネルアレイ）を有するデータセットの感染Ｚ－スコアを得るために、全データセットをデータセットに存在する最小値によってスケールして、全ての値が陽性であることを確実にした（幾何平均が陰性入力の虚数値をもたらすため）。

各試験データセットにおける目的とするクラスの感染Ｚ－スコアを比較するクラス判別力を試験した。バイオリンプロットを用いて感染Ｚ－スコア範囲を試験し、それらが正規分布を有すると想定することができないため、２５％～７５％の四分位範囲で示し、Ｗｉｌｃｏｘｏｎ順位和検定を使用して比較した。目的とするクラス（敗血症と比較した無菌性ＳＩＲＳ等）を比較する感染Ｚ－スコアのＲＯＣ曲線を構築し、全ＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＣ）を９５％の信頼区間とともに示す。

順方向検索
ＳＩＲＳ／外傷患者を敗血症／感染患者と判別する簡潔な遺伝子セットを得るために、マルチコホート分析において統計的に有意であることが見出された全ての遺伝子を、データセットにおいて最も有意な遺伝子から開始し、残り全ての遺伝子を遺伝子スコアに１つずつ加え、判別能力の増加が最も高い遺伝子を最終遺伝子リストに加える貪欲順方向検索モデルに供した。ここで、判別能力を、感染Ｚ－スコアを各発見データセットにおいて試験し、結果として得られたＡＵＣにデータセットにおける試料の総数を乗じる加重ＲＯＣＡＵＣと定義した。その後、この関数が、各ステップの全ての発見データセットにわたって加重ＡＵＣの和を最大化する。この方法で、小さいデータセットにおける優れたクラス判別は、非常に大きいデータセットにおけるクラス判別の適度の利得を上回らない。この関数は、任意に定義された閾値で停止し、我々は、停止閾値１を使用した（この関数が、現在の感染Ｚ－スコアの全発見重量ＡＵＣを、１を超えて増加させる遺伝子を見つけることができない場合、それが終了するようになる）。したがって、この結果として得られた最終遺伝子セットを発見コホートにおける判別力のために最大化するが、全体的最大として最適化しない。順方向検索後に残った遺伝子のプローブレベルデータを表８に示す。

発見コホート試験
最終遺伝子スコアを使用して、各発見データセットにおける感染Ｚ－スコアを算定した。入院データセットを別個に分析し、別個のＲＯＣプロットをプロットした。院内感染（ＧｌｕｅＧｒａｎｔ）データセットについて、同じ患者の経時的な変化を示すために異なる時間ビンを別個に正規化するのとは対照的に全コホートの感染スコアを一度標準化（Ｚ－スコアに変換）した。その後、反復測定分散分析を使用して感染Ｚ－スコアを有意性について分析した。ＲＯＣ曲線を、マルチコホート分析において別個のデータセットとして扱われる個々の時間ビンについてプロットした。

ＧｌｕｅＧｒａｎｔデータセットについて、感染Ｚ－スコアの２つの時間経過ベース分析をバフィーコート及び好中球データセットの両方に行った。最初に、感染から±２４時間以内の患者及び非感染患者の線形回帰を使用して、平均感染Ｚ－スコアを経時的に比較した。反復測定分散分析を使用して、感染群及び非感染群を互いに比較し、経時的な変化の有意性について試験した。次に、各時間窓のボックスプロットを構築し、その時間窓における以前に感染していない患者の感染Ｚ－スコアを、感染診断の５日超前、診断の５～１日前、または診断から±２４時間の患者と比較した。各時点（０～１日窓を除く）について、ヨンクヒール傾向（ＪＴ）検定で異なる群にわたる感染Ｚ－スコアの傾向を試験した。入院時点（［０，１）の感染Ｚ－スコアを複数の線形回帰における結果変数として試験し、損傷重症度スコア及び感染までの時間の両方の寄与効果を試験した。

検証
最終遺伝子セットを、発見コホートとは完全に別個のいくつかの検証コホートにおいて試験した。ＧｌｕｅＧｒａｎｔの選別細胞コホートを時間ビンに分け、ＡＵＣを時間ビン毎に別個に計算した。診断から±１日の感染がこのコホートにおいて損傷から１８日後に捕捉されなかったため、［１８，２４）日ビンを示さないことに留意されたい。

検証コホートは、外傷患者を経時的に試験した３つのデータセットを含み（ＧＳＥ６３７７、ＧＳＥ１２８３８、及びＥＭＥＸＰ３００１）、これらは全て感染を発症した（主に、人工呼吸器関連肺炎（ＶＡＰ））。これらのデータセットは対照を含まないため、それらをベースラインとしてＧｌｕｅＧｒａｎｔ非感染患者と比較した。これらの３つの検証データセット及びＧｌｕｅＧｒａｎｔバフィーコート非感染試料を、最初に４つのハウスキーピング遺伝子（ＧＡＰＤＨ、ＡＣＴＮ１、ＲＰＬ９、ＫＡＲＳ）の幾何平均の因子によって線形的にスケールした（Ｖａｎｄｅｓｏｍｐｅｌｅｅｔａｌ．（２００２）ＧｅｎｏｍｅＢｉｏｌ３：ＲＥＳＥＡＲＣＨ００３４）。その後、これらのデータセットを重複遺伝子に加え、ＣｏｍＢａｔ経験的ベイズ一括補正ツールを使用してデータセット間で一括補正し、パラメトリック事前分布した（Ｒパッケージｓｖａ）（Ｌｅｅｋｅｔａｌ．（２０１２）Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ２８：８８２－８８３）。ＣｏｍＢａｔ補正を損傷翌日にわたって制御した（これにより、日数間の相対差が比較的異なったままになる）。その後、感染Ｚ－スコアを加えたデータセットについて計算し、検証データセットを非感染ＧｌｕｅＧｒａｎｔコホートのレス曲線に対してプロットした。その後、検証データセットにおける感染診断から±２４時間以内の患者を、日数一致ＣｏｍＢａｔ共正規化非感染ＧｌｕｅＧｒａｎｔバフィーコート患者と比較し、ＲＯＣ曲線を構築した。

健常患者またはＳＩＲＳ／外傷患者と敗血症患者との間の比較を可能にする初期の検索で見出された全ての他のデータセットを単純なクラス判別検証に使用した。全血または好中球で行われた全てのデータセットを示す。ＰＢＭＣで行われた研究を、ＳＩＲＳ／外傷及び敗血症患者を試験したもののみのために選択した。無菌性ＳＩＲＳ群及び敗血症群の両方を含まなかったＰＢＭＣ試料を使用したデータセットを除外した。全ての末梢血健常患者対敗血症患者データセットを単一バイオリンプロットに群分けし、それら全てを使用して同じ比較を行ったため、分類について合同で試験した（Ｗｉｌｃｏｘｏｎ順位和）。ＲＯＣ曲線を各個々のデータセットで別個に行い各データセットにおける感染Ｚ－スコアの判別能力を示した。

ＧｌｕｅＧｒａｎｔＳＩＲＳ評価
ＳＩＲＳの有効性をＧｌｕｅＧｒａｎｔコホートにおける感染のスクリーニング基準として評価するために、全ての患者を非感染または感染から±２４時間以内のいずれかとして分類し、感染とは、上で定義された通りである。患者を感染診断から２４時間超後に検閲した。ＳＩＲＳ基準を標準国際指針に従って定義した（体温３６℃未満または３８℃超、呼吸速度２０超または動脈血二酸化炭素分圧３２未満、総白血球数４，０００未満または１２，０００超、及び心拍数９０超）。いずれの基準にも満たない患者を除外した。各基準を日毎の各患者の２値変数として記憶した。ロジスティック回帰を、Ｚ－スコアを含むデータ及びＺ－スコアを含まないデータの両方で行い、両モデルのＲＯＣＡＵＣを計算した。その後、連続正味再分類指数（ＲパッケージＰｒｅｄｉｃｔＡＢＥＬ）を使用してこれらの２つのモデルを比較した。

遺伝子セット評価
２つのオンラインツール、ＥｎｃｏｄｅＱＴ（Ａｕｅｒｂａｃｈｅｔａｌ．（２０１３）Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ２９：１９２２－１９２４）及びＰＡＳＴＡＡ（Ｒｏｉｄｅｒｅｔａｌ．（２００９）Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ２５：４３５－４４２）を使用して、最終遺伝子セットを転写因子結合部位について評価した。陽性遺伝子及び陰性遺伝子が別個の調節管理下にあるという仮説のため、それらを別個に評価した。ＥｎｃｏｄｅＱＴツールを転写開始部位から５０００上流及び５０００下流塩基対で使用した。同様の分析をＰＡＳＴＡＡで行い、転写開始部位から－２００塩基対の領域を試験し、マウス及びヒトの両方に保存された因子のみを試験した。上位１０個の有意な転写因子を両分析のために記録した。

細胞型エンリッチメント試験
ＧＥＯを関連免疫細胞型の臨床試料の遺伝子発現プロファイルについて検索した。この検索をＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘプラットフォームで実行された試料のみに限定し、プラットフォーム効果均一性を確実にした。使用した全てのデータセットをＲＡＷ形式でダウンロードし、別個にｇｃＲＭＡ正規化した。各試料について、同じ遺伝子に対する複数のプローブマッピングの平均を遺伝子値と見なした。全ての試料に存在しない遺伝子を処分した。全て同じ細胞型に対応する複数の試料について、試料の平均を最終値と見なし、それ故に各細胞型の単一ベクターを作成した。各細胞型ベクターにおける遺伝子セットのＺ－スコアを得るために、「陽性」遺伝子発現の幾何平均を得て、それから「陰性」遺伝子発現の幾何平均を差し引き、陽性遺伝子に対する陰性遺伝子の比率を乗じる（感染Ｚ－スコアと同じ手順）。その後、これらのスコアが群平均からの標準偏差の数を表すように、スコアを全ての細胞型にわたって標準化する。したがって、これは、他の試験細胞型と比較して所与の遺伝子セットが所与の細胞型においてどの程度エンリッチされるかを表す。

基準と一致した合計１８個のＧＥＯデータセットを使用した：ＧＳＥ３９８２（Ｊｅｆｆｒｅｙｅｔａｌ．（２００６）ＮａｔＩｍｍｕｎｏｌ７：２７４－２８３）、ＧＳＥ５０９９（Ｍａｒｔｉｎｅｚｅｔａｌ．（２００６）ＪＩｍｍｕｎｏｌ１７７：７３０３－７３１１）、ＧＳＥ８６６８（Ｒａｄｏｍ－Ａｉｚｉｋｅｔａｌ．（２００８）ＪＡｐｐｌＰｈｙｓｉｏｌ１０４：２３６－２４３）、ＧＳＥ１１２９２（Ｈｅｅｔａｌ．（２０１２）ＭｏｌＳｙｓｔＢｉｏｌ８：６２４）、ＧＳＥ１２４５３（Ｇｉｅｆｉｎｇｅｔａｌ．（２０１３）ＰＬｏＳＯｎｅ８：ｅ８４９２８）、ＧＳＥ１３９８７（Ｍｅｙｅｒｓｅｔａｌ．（２００９）ＪＩｍｍｕｎｏｌ１８２：５４００－５４１１）、ＧＳＥ１４８７９（Ｅｃｋｅｒｌｅｅｔａｌ．（２００９）Ｌｅｕｋｅｍｉａ２３：２１２９－２１３８）、ＧＳＥ１５７４３（Ｓｔｅｇｍａｎｎｅｔａｌ．（２０１０）Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ１３８：１８８５－１８９７）、ＧＳＥ１６０２０（Ｖｉｎｈｅｔａｌ．（２０１０）Ｂｌｏｏｄ１１５：１５１９－１５２９）、ＧＳＥ１６８３６（Ａｎｃｕｔａｅｔａｌ．（２００９）ＢＭＣＧｅｎｏｍｉｃｓ１０：４０３）、ＧＳＥ２４７５９（Ｎｏｖｅｒｓｈｔｅｒｎｅｔａｌ．（２０１１）Ｃｅｌｌ１４４：２９６－３０９）、ＧＳＥ２８４９０（Ａｌｌａｎｔａｚｅｔａｌ．（２０１２）ＰＬｏＳＯｎｅ７：ｅ２９９７９）、ＧＳＥ２８４９１（Ａｌｌａｎｔａｚｅｔａｌ．（上記参照））、ＧＳＥ３１７７３（Ｔｓｉｔｓｉｏｕｅｔａｌ．（２０１２）ＪＡｌｌｅｒｇｙＣｌｉｎＩｍｍｕｎｏｌ１２９：９５－１０３）、ＧＳＥ３４５１５（Ｆｒａｎｋｅｎｂｅｒｇｅｒｅｔａｌ．（２０１２）ＥｕｒＪＩｍｍｕｎｏｌ４２：９５７－９７４）、ＧＳＥ３８０４３（Ｈｕｅｎｅｔａｌ．（２０１３）ＩｎｔＪＣａｎｃｅｒ１３３：３７３－３８２）、ＧＳＥ３９８８９（Ｍａｌｃｏｌｍｅｔａｌ．（２０１３）ＰＬｏＳＯｎｅ８：ｅ５７４０２）、ＧＳＥ４２５１９（Ｒａｐｉｎｅｔａｌ．（２０１４）Ｂｌｏｏｄ１２３：８９４－９０４）、ＧＳＥ４９９１０（Ｍａｂｂｏｔｔｅｔａｌ．（２０１３）ＢＭＣＧｅｎｏｍｉｃｓ１４：６３２）。

２つの遺伝子セットをこの様式で試験し、これらはいずれも、初期マルチコホート分析後に全遺伝子セットが有意であることが見出され、順方向検索後に遺伝子のサブセットが最も診断に適していることが見出された。それらの対応する図は、各細胞亜型におけるＺ－スコア（所与の遺伝子セットについてのエンリッチメント）（黒色の点）、ならびにＺ－スコアの全体分布のボックスプロット（任意の外れ値を白丸として示す）を示す。

統計量及びＲ
全ての算定及び計算を統計学的算定のためにＲ言語で行った（バージョン３．０．２）。ｐ値の有意性レベルを０．０５と設定し、分析は、別途特定されない限り、両側分析であった。

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実施例２
公的データを使用したベンチマーク敗血症遺伝子発現診断法
全身性炎症を有する患者が潜在する感染を有するかを決定することができる急速に利用可能なゴールドスタンダード分子試験は存在しない。敗血症の見逃された診断が遅すぎる治療及び死亡率の増加に至る一方で、不適切な抗生物質は、抗生物質耐性を増加させ、合併症をもたらし得る（Ｆｅｒｒｅｒｅｔａｌ．（２０１４）ＣｒｉｔＣａｒｅＭｅｄ４２（８）：１７４９－１７５５、ＭｃＦａｒｌａｎｄ（２００８）ＦｕｔｕｒｅＭｉｃｒｏｂｉｏｌ３（５）：５６３－５７８、Ｇａｉｅｓｋｉｅｔａｌ．（２０１０）ＣｒｉｔＣａｒｅＭｅｄ３８（４）：１０４５－１０５３）。したがって、非感染性炎症を有する患者を、敗血症を有する患者と分類することができる新たな診断法の差し迫った満たされていない必要性が存在する（Ｃｏｈｅｎｅｔａｌ．（２０１５）ＬａｎｃｅｔＩｎｆｅｃｔＤｉｓ１５（５）：５８１－６１４）。

感染に応答して活性化される細胞経路の多くが組織外傷及び非感染性炎症にも応答して活性化されるため、敗血症を非感染性炎症と区別することができる新たな診断法を導き出すのは困難である。したがって、マイクロアレイによる遺伝子発現プロファイリング等のハイスループット「オミクス」技術が、何万個もの遺伝子の同時試験を可能にするため、敗血症を研究するのに良好な方法である。ひいては、統計的技法を使用して、診断のために最適化された新たな分類子を導き出すことができる。しかしながら、ハイスループットデータセットは、常に試料よりも多くの変数を有するため、再現不可能な過剰適合結果をもたらす傾向がある（Ｓｈｉｅｔａｌ．（２００８）ＢＭＣＢｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ９Ｓｕｐｐｌ９：Ｓ１０、Ｉｏａｎｎｉｄｉｓｅｔａｌ．（２００１）ＮａｔＧｅｎｅｔ２９（３）：３０６－３０９）。さらに、統計力を増加させるために、各バイオマーカーデータセットは、臨床的に均一のコホートにおいて行われ、多くの場合、単一の種類のみのマイクロアレイを使用して行われる。この設計は、研究される群間の差の検出力を増大させるが、結果は、異なる研究室技法を使用して異なる臨床コホートにおいて正しいままである可能性はあまり高くない。結果として、独立検証が、ハイスループット研究から導き出される任意の新たな分類子の一般化可能性を正しく判断するのに不可欠である。

我々の知る限りでは、敗血症を有する患者を、非感染性炎症を有する患者と明確に分類するためのマイクロアレイデータを使用して開発された遺伝子発現診断法が３つ存在する。これらは、以下で、「ＳｅｐｓｉｓＭｅｔａＳｃｏｒｅ」（ＳＭＳ）（Ｓｗｅｅｎｅｙｅｔａｌ．（２０１５）ＳｃｉＴｒａｎｓｌＭｅｄ７（２８７）：２８７ｒａ２７１）、ＦＡＩＭ３：ＰＬＡＣ８比（Ｓｃｉｃｌｕｎａｅｔａｌ．（２０１５）ＡｍＪＲｅｓｐｉｒＣｒｉｔＣａｒｅＭｅｄ．１９２（７）：８２６－８３５）、及びＳｅｐｔｉｃｙｔｅＬａｂ（ＭｃＨｕｇｈｅｔａｌ．（２０１５）ＰＬｏＳＭｅｄ１２（１２）：ｅ１００１９１６）と称される１１遺伝子セットである。加えて、現在、敗血症または急性感染を有する患者を試験する数十もの公的に入手可能なデータセットが存在する。それらは、異なる年齢群、感染型、併存状態、及び対照（非感染性）条件を含む、非常に広範囲の臨床状態に及ぶ。したがって、この比較的未開拓の公的資源を使用して、膨大な数の患者試料にわたって異なる診断法の相対的長所及び短所を推定することができる。ここで、我々は、全ての入手可能な公的遺伝子発現データを使用して、これらの３つの敗血症遺伝子発現診断法の診断力を研究し、直接比較した

方法
我々は、以下の用語：敗血症、ＳＩＲＳ、肺炎、外傷、ＩＣＵ、感染、急性、ショック、及び手術を使用した２つの公的遺伝子発現リポジトリ（ＮＩＨＧＥＯ及びＥＢＩＡｒｒａｙＥｘｐｒｅｓｓ）の系統的検索を２０１５年１２月１０日に終了した。我々は、非マイクロアレイ、非ヒトデータを自動的に除外した。その後、スクリーニングのための対応する原稿の要約を使用して、我々は、（１）非臨床データセット、（２）非時間一致データセット、及び（３）非全血データセットを排除した。その後、残りのデータセットを、基準群（敗血症と比較した）が健常対照または非感染ＳＩＲＳ患者であるかに従って選別した。概略図を図１７に示す。系統的検索からのデータに加えて、我々は、上述のように、ＩｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎａｎｄＨｏｓｔＲｅｓｐｏｎｓｅｔｏＩｎｊｕｒｙ（ＧｌｕｅＧｒａｎｔ）コホートから２つの長期的外傷コホートを含めた（Ｓｗｅｅｎｅｙｅｔａｌ．（２０１５）ＳｃｉＴｒａｎｓｌＭｅｄ７（２８７）：２８７ｒａ２７１７）。異なるマイクロアレイで実行した同じ研究からのコホートを独立コホートとして扱った。

可能な場合、生データが入手可能である全てのデータセットを再正規化した。ｇｃＲＭＡ（利用可能な完全一致プローブを有するアレイ上で）またはＲＭＡを使用してＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘアレイを再正規化した。Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ａｇｉｌｅｎｔ、ＧＥ、及び他の商業的アレイを正規指数バックグラウンド補正により再正規化し、その後、分位正規化した。特注アレイは再正規化しなかった。全てのデータをｌｏｇ２変換状態で使用した。固定効果モデルを使用してプローブをデータセット内の遺伝子に要約した（Ｒａｍａｓａｍｙｅｔａｌ．（２００８）ＰＬｏＳＭｅｄ５（９）：ｅ１８４）。

文献再考を行って、非感染患者と比較した敗血症の診断のために特異的に最適化された遺伝子発現シグネチャを検索した。その後、結果として得られたモデルを、受信者動作特性曲線下面積（ＡＵＣ）によって測定される敗血症の診断力について試験した。敗血症スコアのうちのいずれも計算することができなかったデータセット（全ての上方制御された遺伝子または全ての下方制御された遺伝子のいずれかを欠いているもの）を最終結果から除外した。所与の比較（例えば、非感染性ＳＩＲＳと入院時の敗血症）について、発見データセットが独立検証データセットと比較して過大評価された診断力を示すと予想されるため、その型の全てのデータセット、ならびに非発見データセットのみの両方の平均値を計算した。最後に、我々は、対応のあるｔ検定を用いて重複検証セットを各診断スコアについて比較した（例えば、１１遺伝子セット及びＦＡＩＭ３：ＰＬＡＣ８比を、ＧＳＥ７４２２７、Ｅ－ＭＥＸＰ－３５８９、及びＧｌｕｅＧｒａｎｔ好中球において敗血症を診断するそれらの能力について比較し、これらが両データセットについて検証された唯一のコホートであった）。

ＧＳＥ２８７５０（１１）における患者試料（Ｎ＝２１）を後のデータセットＧＳＥ７４２２４にも使用した（ＭｃＨｕｇｈｅｔａｌ．（２０１５）ＰＬｏＳＭｅｄ１２（１２）：ｅ１００１９１６）（Ｎ＝１０５）が、これらの２つのデータセットを、異なるマイクロアレイ型を使用して実行した（ＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘＨＧ２．０対ＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘＥｘｏｎ１．０ＳＴ）。結果として、ＧＳＥ２８７５０をＳｅｐｔｉｃｙｔｅＬａｂ（ＧＳＥ７４２２４において発見されたもの）の検証計算に含めないが、ＳｅｐｓｉｓＭｅｔａＳｃｏｒｅの検証平均を算定する際に、ＧＳＥ７４２２４におけるＡＵＣをペナルティ付けして、発見においてＧＳＥ７４２２４患者の２０％が存在したという事実を説明した（（ペナルティ付きＡＵＣ×０．８＋ＧＳＥ２８７５０における実際のＡＵＣ×０．２）＝実際のＡＵＣ）。

感染型による交絡を試験するために、各データセットを、（１）グラム陽性感染及びグラム陰性感染の両方、または（２）細菌感染及びウイルス感染の両方のいずれかの存在についてスクリーニングした。このデータの原作者によって説明される微生物学決定が正しいと想定した。共感染の症例を交絡比較に含めなかった。交絡を試験するために、目的とする両クラスを含んだデータセットの各遺伝子発現スコアを計算し、クラス間の結果として得られたスコアをＷｉｌｃｏｘｏｎ順位和検定によりデータセット内で比較した。

メタ分析を上述のように行った。手短に、非感染性ＳＩＲＳ患者と敗血症患者との間の差次的遺伝子発現を、ヘッジのｇを使用してデータセット内で要約し、その後、ダーサイモニアン－レアード変量効果モデルを使用してデータセット間で比較し、続いて、ベンジャミン－ホッホバーグ補正した。個々の遺伝子のフォレストプロットは、各データセット内の個々の効果、ならびにｌｏｇ２空間内の要約された「メタ効果」を示す。Ｒ統計学的算定言語を使用して全ての分析を行った。有意性検定は常に両側検定であった。試験した遺伝子セットの入院非感染性ＳＩＲＳと敗血症との比較を再現するためのコード及びデータは、ｈｔｔｐ：／／ｋｈａｔｒｉｌａｂ．ｓｔａｎｆｏｒｄ．ｅｄｕ／ｓｅｐｓｉｓから入手可能である。ここで使用したアップロードしたデータは、再正規化形態である。ＧｌｕｅＧｒａｎｔデータは、ＧｌｕｅＧｒａｎｔ共同事業体に承認された研究者が利用可能であり、使用説明は、我々のウェブサイトに掲載されている。結果を原稿に使用する場合、著者は、本論文及び元のデータセットについて説明する論文の両方の引用を要請する

結果
我々は、公的遺伝子発現データベースの系統的検索を行い（図１７）、上述のように、以前に感染していない患者及び敗血症の診断後±２４時間以内の患者の時間一致ビンに分けた２つの独立ＧｌｕｅＧｒａｎｔ外傷コホートも使用した（Ｓｗｅｅｎｅｙｅｔａｌ．（２０１５）ＳｃｉＴｒａｎｓｌＭｅｄ７（２８７）：２８７ｒａ２７１）。これにより、３２４１個の患者試料から成る基準と一致した合計３９個のデータセットを得た（Ｓｃｉｃｌｕｎａｅｔａｌ．（上記参照）、ＭｃＨｕｇｈｅｔａｌ．（上記参照）、Ｄｏｌｉｎａｙｅｔａｌ．（２０１２）ＡｍＪＲｅｓｐｉｒＣｒｉｔＣａｒｅＭｅｄ１８５（１１）：１２２５－１２３４、Ｐａｒｎｅｌｌｅｔａｌ．（２０１２）ＣｒｉｔＣａｒｅ１６（４）：Ｒ１５７、Ｗｏｎｇｅｔａｌ．（２００７）ＰｈｙｓｉｏｌＧｅｎｏｍｉｃｓ３０（２）：１４６－１５５、Ｗｙｎｎｅｔａｌ．（２０１１）ＭｏｌＭｅｄ１７（１１－１２）：１１４６－１１５６、Ｗｏｎｇｅｔａｌ．（２００９）ＣｒｉｔＣａｒｅＭｅｄ３７（５）：１５５８－１５６６、Ｓｈａｎｌｅｙｅｔａｌ．（２００７）ＭｏｌＭｅｄ１３（９－１０）：４９５－５０８、Ｃｖｉｊａｎｏｖｉｃｈｅｔａｌ．（２００８）ＰｈｙｓｉｏｌＧｅｎｏｍｉｃｓ３４（１）：１２７－１３４、Ａｌｍａｎｓａｅｔａｌ．（２０１２）ＢＭＣＲｅｓＮｏｔｅｓ５：４０１、Ｉｒｗｉｎｅｔａｌ．（２０１２）ＢＭＣＭｅｄＧｅｎｏｍｉｃｓ５：１３、ｖａｎｄｅＷｅｇｅｔａｌ．（２０１５）ＰＬｏＳＮｅｇｌＴｒｏｐＤｉｓ９（３）：ｅ０００３５２２、ＥｍｏｎｔｓＭ．ＰｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓｉｎＩｍｍｕｎｅＲｅｓｐｏｎｓｅＧｅｎｅｓｉｎＩｎｆｅｃｔｉｏｕｓＤｉｓｅａｓｅｓａｎｄＡｕｔｏｉｍｍｕｎｅＤｉｓｅａｓｅｓ［Ｐｈ．Ｄ．ｔｈｅｓｉｓ］：ＥｒａｓｍｕｓＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＲｏｔｔｅｒｄａｍ；２００８、Ｐａｎｋｌａｅｔａｌ．（２００９）ＧｅｎｏｍｅＢｉｏｌ１０（１１）：Ｒ１２７、Ｚａａｓｅｔａｌ．（２００９）ＣｅｌｌＨｏｓｔＭｉｃｒｏｂｅ６（３）：２０７－２１７、Ｐａｒｎｅｌｌｅｔａｌ．（２０１１）ＰＬｏＳＯｎｅ６（３）：ｅ１７１８６、Ｂｅｒｍｅｊｏ－Ｍａｒｔｉｎｅｔａｌ．（２０１０）ＣｒｉｔＣａｒｅ１４（５）：Ｒ１６７、Ｂｅｒｒｙｅｔａｌ．（２０１０）Ｎａｔｕｒｅ４６６（７３０９）：９７３－９７７、Ｓｍｉｔｈｅｔａｌ．（２０１４）ＮａｔＣｏｍｍｕｎ５：４６４９、Ｂｅｒｄａｌｅｔａｌ．（２０１１）ＪＩｎｆｅｃｔ６３（４）：３０８－３１６、Ａｈｎｅｔａｌ．（２０１３）ＰＬｏＳＯｎｅ８（１）：ｅ４８９７９、Ｍｅｊｉａｓｅｔａｌ．（２０１３）ＰＬｏＳＭｅｄ１０（１１）：ｅ１００１５４９、Ｈｕｅｔａｌ．（２０１３）ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ１１０（３１）：１２７９２－１２７９７、Ｈｅｒｂｅｒｇｅｔａｌ．（２０１３）ＪＩｎｆｅｃｔＤｉｓ２０８（１０）：１６６４－１６６８、Ｋｗｉｓｓａｅｔａｌ．（２０１４）ＣｅｌｌＨｏｓｔＭｉｃｒｏｂｅ１６（１）：１１５－１２７、Ｃａｚａｌｉｓｅｔａｌ．（２０１４）ＩｎｔｅｎｓｉｖｅＣａｒｅＭｅｄＥｘｐ２（１）：２０、Ｓｕａｒｅｚｅｔａｌ．（２０１５）ＪＩｎｆｅｃｔＤｉｓ．２１２（２）：２１３－２２２、Ｚｈａｉｅｔａｌ．（２０１５）ＰＬｏＳＰａｔｈｏｇ１１（６）：ｅ１００４８６９、Ｃｏｎｅｊｅｒｏｅｔａｌ．（２０１５）ＪＩｍｍｕｎｏｌ１９５（７）：３２４８－３２６１、Ｘｉａｏｅｔａｌ．（２０１１）ＪＥｘｐＭｅｄ２０８（１３）：２５８１－２５９０、及びＷａｒｒｅｎｅｔａｌ．（２００９）ＭｏｌＭｅｄ１５（７－８）：２２０－２２７）。

我々の文献再考により、全血試料において非感染性ＳＩＲＳを敗血症と区別するように特異的に最適化された３つの遺伝子発現分類子が明らかになった。これらは、我々が先に公開した１１遺伝子セット（ＳＭＳ）（Ｓｗｅｅｎｅｙｅｔａｌ．，ＳｃｉＴｒａｎｓｌＭｅｄ２０１５）、ＦＡＩＭ３：ＰＬＡＣ８比（Ｓｃｉｃｌｕｎａｅｔａｌ．，ＡＪＲＣＣＭ２０１５）、及びＳｅｐｔｉｃｙｔｅＬａｂ（ＭｃＨｕｇｈｅｔａｌ．，ＰＬｏＳＭｅｄｉｃｉｎｅ，２０１５）であった。各試料について、１１遺伝子スコアを以下の式に従って計算する。

ＦＡＩＭ３：ＰＬＡＣ８比を、ＰＬＡＣ８／ＦＡＩＭ３として計算する。ＳｅｐｔｉｃｙｔｅＬａｂを、（ＰＬＡＣ８＋ＬＡＭＰ１）－（ＰＬＡ２Ｇ７＋ＣＥＡＣＡＭ４）として計算する。全ての場合において、計算をｌｏｇ２変換データで行う。

これらの３つの敗血症スコアの各々のロバスト性及び再現性は、それらの構成遺伝子の各々の発現のロバストで再現可能な変化に依存する。したがって、我々は、これらの３つの検定の各々における個々の遺伝子が、非感染ＳＩＲＳ／外傷患者と敗血症患者とを比較する１２個の全血コホートにわたってどの程度一貫して変化したかを調査した。これらのデータセットの我々のメタ分析により、３つの遺伝子スコア（ＣＥＡＣＡＭ４を除く）のうちのいずれかに含まれた１６個の遺伝子の各々が所望の方向に変化したことが明らかになった（ＦＤＲ＜５％）。留意すべきことに、ＳｅｐｔｉｃｙｔｅＬａｂにおける遺伝子のうちの１つであるＣＥＡＣＡＭ４は、その対応する発見コホートのみにおいて有意に下方制御された。

次に、我々は、データセットを２つの広範な種類の比較、非感染性ＳＩＲＳまたは外傷を有する患者と敗血症または急性感染を有する患者との比較（表１）、及び健常対照と敗血症または急性感染を有する患者との比較（表２）に分けた。これらの両方の種類の比較について、我々は、全体平均ＡＵＣ及び独立検証データセットのみを含んだときのＡＵＣの両方を計算し、３つのシグネチャの各々について、我々は、それらの対応する発見データセットを除外した。

非感染性ＳＩＲＳ／外傷データセットと敗血症データセット（１６個のコホート、１１４８個の試料、表１）との対比において、重複検証データセットを比較するこれらの３つの遺伝子発現診断スコアのＡＵＣ間に対応のあるｔ検定における有意差はなかった（全てｐ＞０．１、図１８及び１９）。１６個全てのコホート（すなわち、発見コホートを含む）のＡＵＣを比較すると、ＳｅｐｓｉｓＭｅｔａＳｃｏｒｅＡＵＣは、他方の２つの遺伝子スコアよりも有意に高く（両方ともにｐ＜０．０５）、ＦＡＩＭ３：ＰＬＡＣ８比とＳｅｐｔｉｃｙｔｅＬａｂとの間に有意差はなかった。しかしながら、ＳｅｐｓｉｓＭｅｔａＳｃｏｒｅがこれらの発見コホートのうちの９個を使用したため、これらの結果は、必ずしもＳｅｐｓｉｓＭｅｔａＳｃｏｒｅのより良好な全体的性能を指摘しない。ＦＡＩＭ３：ＰＬＡＣ８比は、ＧＳＥ３２７０７及びＧＳＥ４００１２における性能の低下を示したが、上述のように、これは、ＣＡＰの存在を試験するために特異的に設計されたものであり、非感染性炎症の他の形態に一般化可能でない場合がある（４１、４２）。最後に、ＳｅｐｔｉｃｙｔｅＬａｂは、小児ＳＩＲＳ／敗血症患者の分類及び感染を有するか有しない入院ＣＯＰＤ患者の分類の両方の性能が有意に低下した（ＡＵＣ＜０．５）。ＳｅｐｔｉｃｙｔｅＬａｂのＡＵＣのこの低下が、ＳｅｐｔｉｃｙｔｅＬａｂの初期発見コホートと比較した臨床状況またはマイクロアレイ型の差に起因する可能性がある。

次に、我々は、健常対照と敗血症または急性感染を有する患者とを比較したデータセットを試験した（２６個のデータセット、２４１７個の試料、表２）。これらの患者の全てではないが大半が敗血症を有したが、敗血症診断試験が大半の感染を健常対照と区別することができるはずであると予想することは理にかなっている。ここで、ＳｅｐｓｉｓＭｅｔａＳｃｏｒｅもＦＡＩＭ３：ＰＬＡＣ８比もいずれも予想通りに機能し、平均検証ＡＵＣは、０．９６±０．０５及び０．９４±０．０９であった（表２）。しかしながら、ＳｅｐｔｉｃｙｔｅＬａｂは、１５６２個の試料（全試料の６４％）から成る１２データセット（全データセットの４３％）においてＡＵＣ＜０．７を有し、平均検証ＡＵＣが０．７１±０．２０となり（表２）、ＳｅｐｓｉｓＭｅｔａＳｃｏｒｅ及びＦＡＩＭ３：ＰＬＡＣ８比の両方（両方ともにｐ＜１ｅ－５）よりも有意に低かった。この場合も同様に、この性能の低下は、ＳｅｐｔｉｃｙｔｅＬａｂが、メタ分析において有意ではないことが見出されたＣＥＡＣＡＭ４を含んだことに起因し得る。健常対照を、敗血症を有する者と分類するための診断の臨床的必要性がないと議論することができるが、これらの２つの群の区別の不良な性能がさらなる偏りを示し得、一般化不可能性の危険性を増加させ得る。

理想的な敗血症診断は、存在する感染型に応じて変動する性能を示さない。診断法のうちのいずれかが特定の感染型に偏っているかを研究するために、我々は、含めたデータセット全てを検索して、細菌感染を有する患者及びウイルス感染を有する患者を比較するもの、ならびにグラム陽性感染及びグラム陰性感染を比較するものを見出した。その後、我々は、これらの感染型の検出における診断力（健常対照と比較して）及びスコア分布の比較における診断力の両方を比較した。より高いスコアが感染のより高い可能性を示すため、１つの感染型において一貫して低いスコアは、健常対照と比較したときに診断性能の変化が検出されない場合であっても、その型の診断性能の低下を示し得る。

患者が細菌感染またはウイルス感染を有するかについての情報を提供したデータセットが８個存在した。一般に、３つのスコアのうちのいずれかについての細菌感染及びウイルス感染のＡＵＣ間の差はわずかである（表３）が、これは、少数であること、かつＡＵＣがこれらの感染と健常対照との比較において比較的高いことに起因し得る。しかしながら、これらの警告にもかかわらず、ＳｅｐｓｉｓＭｅｔａＳｃｏｒｅもＦＡＩＭ３：ＰＬＡＣ８比もいずれも、試験した８個のデータセットのうちの７個において、ウイルス感染を有する患者と比較して細菌感染を有する患者においてより高い平均スコアを示し、これらは両方ともに８個のデータセットのうちの２個において有意に達した（表５）。対照的に、ＳｅｐｔｉｃｙｔｅＬａｂは、細菌感染とウイルス感染との比較において強い傾向を示さず、１個のデータセットにおいて、細菌感染よりもウイルス感染において有意により高い平均を示した。

患者がグラム陽性感染及びグラム陰性感染を有したかの情報を提供したデータセットが８個存在した。グラム陽性感染とグラム陰性感染との比較により、ＳｅｐｓｉｓＭｅｔａＳｃｏｒｅまたはＦＡＩＭ３：ＰＬＡＣ８比のいずれにおいてもＡＵＣの差は明らかにならなかったが、ＳｅｐｔｉｃｙｔｅＬａｂは、いくらかの変動性を示したが、これは、グラム陽性感染とグラム陰性感染との間の大きな差ではなく、健常対照に対する診断性能の高い変動性に起因し得る（表４）。ＳｅｐｓｉｓＭｅｔａＳｃｏｒｅ、ＦＡＩＭ３：ＰＬＡＣ８比、及びＳｅｐｔｉｃｙｔｅｌａｂは、それぞれ、２個、１個、及び１個のデータセットを示し、スコアは、グラム陽性患者よりもグラム陰性患者において有意に高かった（表６）。

考察
ここで、我々は、全ての利用可能な時間一致全血臨床敗血症データセットにおいて、３つの敗血症遺伝子発現診断法（ＳｅｐｓｉｓＭｅｔａＳｃｏｒｅ、ＦＡＩＭ３：ＰＬＡＣ８比、及びＳｅｐｔｉｃｙｔｅＬａｂ）を比較した。全ての検証非感染性ＳＩＲＳ／外傷及び敗血症データセットを比較するＡＵＣ分布間に有意差はなかった。しかしながら、ＦＡＩＭ３：ＰＬＡＣ８比及びＳｅｐｔｉｃｙｔｅＬａｂがＡＵＣ＜０．７を示したいくつかの個々のデータセットが存在した。留意すべきことに、ＳｅｐｔｉｃｙｔｅＬａｂは、健常対照と敗血症または急性感染を有する患者とを比較したときに、検証コホートにおいて有意に低下した性能も有し、Ｓｅｐｔｉｃｙｔｅｌａｂは、全てのデータセットの４３％においてＡＵＣ＜０．７を示した。ＳｅｐｔｉｃｙｔｅＬａｂを、標的ｑＰＣＲを使用してＭＡＲＳ共同事業体からの大型独立患者コホートにおいて最初に検証し、０．８８の全体検証ＡＵＣを示し（ＭｃＨｕｇｈｅｔａｌ．（２０１５）ＰＬｏＳＭｅｄ１２（１２）：ｅ１００１９１６）、それ故に、我々の分析における性能の低下は、臨床状態の変化、技術の変化、またはこれらの両方のいずれかを示し得る。フォレストプロットは、ＧＳＥ７４２２４（ＳｅｐｔｉｃｙｔｅＬａｂの発見コホート）におけるＣＥＡＣＡＭ４の効果量が外れ値であり得ることを示し、これは、比較的不良な一般化可能性に寄与しているかもしれない。

ＳｅｐｓｉｓＭｅｔａＳｃｏｒｅ及びＦＡＩＭ３：ＰＬＡＣ８比について、ウイルス感染とは対照的に細菌感染におけるスコアがより高い傾向があるという証拠がいくつか存在する一方で、ＳｅｐｔｉｃｙｔｅＬａｂは、ウイルス感染におけるスコアがより高いといういくつかの証拠を示した。３つ全てのスコアについてグラム陽性感染とは対照的にグラム陰性感染におけるスコアがより高いという統計的に有意ではない傾向が存在した。しかしながら、異なる病原体型が、それらの個々のデータセットにおける疾病重症度、年齢、性別、または他の臨床交絡因子について一致せず、それ故に、これらの傾向は、慎重に解釈されるべきである。例えば、細菌感染が一般にウイルス感染よりも重度である場合、かつグラム陰性が一般にグラム陽性よりも重度である場合、それらのスコアは、重症度による交絡を指摘し得る。したがって、ここで比較する全ての試験の全てのコホートにわたって交絡因子に対するさらなる試験が必要である。

以前にＳｅｐｓｉｓＭｅｔａＳｃｏｒｅがＧｌｕｅＧｒａｎｔ好中球コホート及び健常コホート対感染コホートのサブセットで検証された（Ｓｗｅｅｎｅｙｅｔａｌ．（２０１５）ＳｃｉＴｒａｎｓｌＭｅｄ７（２８７）：２８７ｒａ２７１）。ここで試験した追加のコホートにおいて、ＳｅｐｓｉｓＭｅｔａＳｃｏｒｅは、先行検証と同様の結果を示し続けている。ＦＡＩＭ３：ＰＬＡＣ８比が続報出版物におけるこれらのデータのうちのいくつかにおいて検証された（Ｓｗｅｅｎｅｙｅｔａｌ．（２０１５）ＡｍＪＲｅｓｐｉｒＣｒｉｔＣａｒｅＭｅｄ１９２（１０）：１２６０－１２６１）が、著者は、それらの遺伝子セットが当初はＣＡＰを有する疑いのあるＩＣＵで治療を受けた患者におけるＣＡＰの存在を決定する非常に限定的な疑問のために設計されたことを指摘した（Ｓｃｉｃｌｕｎａｅｔａｌ．（２０１５）ＡｍＪＲｅｓｐｉｒＣｒｉｔＣａｒｅＭｅｄ１９２（１０）：１２６１－１２６２）。ＳｅｐｔｉｃｙｔｅＬａｂをコホートＥ－ＴＡＢＭ－１５４８（ＭｃＨｕｇｈｅｔａｌ．（上記参照））において試験したが、我々は、手術からの回復に起因するベースライン遺伝子発現プロファイルの予想された変化のため、敗血症診断の試験に使用することが適切ではないことを先に示した（Ｓｗｅｅｎｅｙｅｔａｌ．（２０１５）（上記参照））。

公的データが新たな診断法の検証のために使用されないという事実は、これらのデータを評価及び使用する際に一部の研究者が直面する困難及び知識曲面を反映し得る。公的データを容易に使用可能な形態に成し遂げることが困難であることを考慮して、我々は、目的とする分類子をデータセットに容易に適用するＲスクリプトに加えて、これらのデータの手動でキュレートされた統合リポジトリを提供した（ｋｈａｔｒｉｌａｂ．ｓｔａｎｆｏｒｄ．ｅｄｕ／ｓｅｐｓｉｓ）。我々は、敗血症との任意の新たな遺伝子発現分類子をこれらのデータにおいて試験して分類子間の容易なベンチマーク及び比較を可能にすべきであるという案を推奨する。我々は、ＡＵＣの簡易測定が臨床的有用性の全ての潜在的測定を説明するものではないことを認識している。加えて、単一の臨床分野において繰り返しうまく機能するスコアが、たとえ異なる臨床分野で機能しなくとも依然として高い臨床的有用性を有する場合があり、慎重に適用される必要があろう。それにもかかわらず、資源を最も有望な分野におけるさらなる臨床試験に集中させる助けとなるように、任意の新たな敗血症診断法の長所及び短所を解明することが重要である。

ここで試験した診断遺伝子セットの各々は、長所も短所もいずれも有する。一般に、臨床的に有用になる任意の敗血症診断の場合、それは、広範囲の患者設定においてその最終形態で良好な診断力を保持しなければならない。ここで使用したマイクロアレイコホートは、異なる遺伝子発現診断法の一対一の比較を可能にしたが、標的アッセイを使用したときに（すなわち、複数のマイクロアレイプラットフォームにわたって技術的変化なしで）任意の試験の診断性能の過小評価を示し得る。したがって、任意の遺伝子セットのさらなる前向き検証が、それらを公表して臨床的に実施する前に必要である。依然として、本技法の精度の増大を考慮して、宿主応答の分子プロファイリングが、敗血症を診断し、治療し、潜在的には予防する際に、臨床的ツールセットの有益な一部となる可能性があるように思われる。

本発明の好ましい実施形態が図解及び記載されているが、本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなくそれらに様々な変化が加えられ得ることが理解されよう。

Claims

対象における敗血症の診断を補助するための方法であって、
ａ）前記対象由来の生体試料中のバイオマーカーＣＥＡＣＡＭ１、ＺＤＨＨＣ１９、Ｃ９ｏｒｆ９５、ＧＮＡ１５、ＢＡＴＦ、Ｃ３ＡＲ１、ＫＩＡＡ１３７０、ＴＧＦＢＩ、ＭＴＣＨ１、ＲＰＧＲＩＰ１、及びＨＬＡ－ＤＰＢ１の発現レベルを測定することであって、前記生体試料が、全血、バフィーコート、または好中球である、ことと、
ｂ）前記バイオマーカーのそれぞれの基準値範囲に関連して各バイオマーカーの発現レベルを分析することとであって、非感染性炎症を有する時間一致対照対象の前記バイオマーカーの前記基準値範囲と比較して、増加した前記バイオマーカーＣＥＡＣＡＭ１、ＺＤＨＨＣ１９、Ｃ９ｏｒｆ９５、ＧＮＡ１５、ＢＡＴＦ、及びＣ３ＡＲ１の発現レベル、ならびに低下した前記バイオマーカーＫＩＡＡ１３７０、ＴＧＦＢＩ、ＭＴＣＨ１、ＲＰＧＲＩＰ１、及びＨＬＡ－ＤＰＢ１の発現レベルが、前記対象が敗血症を有する可能性が高いことを示すこと
を含む、前記方法。
前記バイオマーカーの発現レベルが、感染対象または非感染対象の時間一致基準値範囲と比較される、請求項１に記載の方法。
前記バイオマーカーの発現レベルに基づいて前記対象の敗血症スコアを計算することをさらに含み、非感染性炎症を有する時間一致対照対象の基準値範囲と比較してより高い前記対象の敗血症スコアが、前記対象が敗血症を有する可能性が高いことを示す、請求項１に記載の方法。
敗血症の診断を非感染性炎症状態と区別することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
前記非感染性炎症状態が、全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）、自己免疫疾患、外傷性損傷、及び手術からなる群から選択される、請求項４に記載の方法。
前記対象がヒトである、請求項１に記載の方法。
前記バイオマーカーの発現レベルの測定が、マイクロアレイ分析、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）、ノーザンブロット、または遺伝子発現連続分析（ＳＡＧＥ）を行うことを含む、請求項１に記載の方法。
対象における敗血症の診断を補助するための方法であって、全血、バフィーコート、または好中球におけるＣＥＡＣＡＭ１、ＺＤＨＨＣ１９、Ｃ９ｏｒｆ９５、ＧＮＡ１５、ＢＡＴＦ、Ｃ３ＡＲ１、ＫＩＡＡ１３７０、ＴＧＦＢＩ、ＭＴＣＨ１、ＲＰＧＲＩＰ１、及びＨＬＡ－ＤＰＢ１の発現レベルに基づいて前記対象の敗血症スコアを決定することを含み、
非感染性炎症を有する時間一致対照対象の基準値範囲と比較してより高い前記対象の敗血症スコアが、前記対象が敗血症を有する可能性が高いことを示す、前記方法。
対象における敗血症を治療するための療法の有効性を監視するための方法であって、前記対象が前記療法を受ける前の前記対象由来の第１の試料中及び前記対象が前記療法を受けた後の前記対象由来の第２の試料中のバイオマーカーＣＥＡＣＡＭ１、ＺＤＨＨＣ１９、Ｃ９ｏｒｆ９５、ＧＮＡ１５、ＢＡＴＦ、Ｃ３ＡＲ１、ＫＩＡＡ１３７０、ＴＧＦＢＩ、ＭＴＣＨ１、ＲＰＧＲＩＰ１、及びＨＬＡ－ＤＰＢ１の発現レベルを測定することを含み、前記第１の試料中の前記バイオマーカーの発現レベルと比較して、前記第２の試料中の増加した前記バイオマーカーＣＥＡＣＡＭ１、ＺＤＨＨＣ１９、Ｃ９ｏｒｆ９５、ＧＮＡ１５、ＢＡＴＦ、及びＣ３ＡＲ１の発現レベル、ならびに低下した前記バイオマーカーＫＩＡＡ１３７０、ＴＧＦＢＩ、ＭＴＣＨ１、ＲＰＧＲＩＰ１、及びＨＬＡ－ＤＰＢ１の発現レベルが、前記対象が悪化している可能性が高いことを示し、前記第１の試料中の前記バイオマーカーの発現レベルと比較して、前記第２の試料中の低下した前記バイオマーカーＣＥＡＣＡＭ１、ＺＤＨＨＣ１９、Ｃ９ｏｒｆ９５、ＧＮＡ１５、ＢＡＴＦ、及びＣ３ＡＲ１の発現レベル、ならびに増加した前記バイオマーカーＫＩＡＡ１３７０、ＴＧＦＢＩ、ＭＴＣＨ１、ＲＰＧＲＩＰ１、及びＨＬＡ－ＤＰＢ１の発現レベルが、前記対象が改善している可能性が高いことを示し、前記第１の試料及び前記第２の試料が、全血、バフィーコート、または好中球である、前記方法。
ＣＥＡＣＡＭ１、ＺＤＨＨＣ１９、Ｃ９ｏｒｆ９５、ＧＮＡ１５、ＢＡＴＦ、Ｃ３ＡＲ１、ＫＩＡＡ１３７０、ＴＧＦＢＩ、ＭＴＣＨ１、ＲＰＧＲＩＰ１、及びＨＬＡ－ＤＰＢ１の発現レベルに基づいて前記対象の敗血症スコアを計算することをさらに含み、前記第１の試料の前記敗血症スコアと比較してより高い前記第２の試料の敗血症スコアが、前記対象が悪化している可能性が高いことを示し、前記第１の試料の前記敗血症スコアと比較してより低い前記第２の試料の敗血症スコアが、前記対象が改善している可能性が高いことを示す、請求項９に記載の方法。
最大３０個のバイオマーカーの発現レベルを測定するためのオリゴヌクレオチドを含む、キットであって、前記最大３０個のバイオマーカーがＣＥＡＣＡＭ１、ＺＤＨＨＣ１９、Ｃ９ｏｒｆ９５、ＧＮＡ１５、ＢＡＴＦ、Ｃ３ＡＲ１、ＫＩＡＡ１３７０、ＴＧＦＢＩ、ＭＴＣＨ１、ＲＰＧＲＩＰ１、及びＨＬＡ－ＤＰＢ１を含み、前記キットが、ＣＥＡＣＡＭ１ポリヌクレオチドにハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、ＺＤＨＨＣ１９ポリヌクレオチドにハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、Ｃ９ｏｒｆ９５ポリヌクレオチドにハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、ＧＮＡ１５ポリヌクレオチドにハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、ＢＡＴＦポリヌクレオチドにハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、Ｃ３ＡＲ１ポリヌクレオチドにハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、ＫＩＡＡ１３７０ポリヌクレオチドにハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、ＴＧＦＢＩポリヌクレオチドにハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、ＭＴＣＨ１ポリヌクレオチドにハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、ＲＰＧＲＩＰ１ポリヌクレオチドにハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、及びＨＬＡ－ＤＰＢ１ポリヌクレオチドにハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含む、キット。
マイクロアレイをさらに含む、請求項１１に記載のキット。
電子形態または紙形態で、各バイオマーカーの検出されたレベルを敗血症と相関させる指示を含む情報をさらに含む、請求項１１に記載のキット。
敗血症を有する疑いのある患者の診断を補助するためのコンピュータ実施方法であって、前記コンピュータが、
ａ）前記患者由来の生体試料中のバイオマーカーＣＥＡＣＡＭ１、ＺＤＨＨＣ１９、Ｃ９ｏｒｆ９５、ＧＮＡ１５、ＢＡＴＦ、Ｃ３ＡＲ１、ＫＩＡＡ１３７０、ＴＧＦＢＩ、ＭＴＣＨ１、ＲＰＧＲＩＰ１、及びＨＬＡ－ＤＰＢ１の発現レベルの値を含む入力された患者データを受け取るステップであって、前記生体試料が、全血、バフィーコート、または好中球である、ステップと、
ｂ）各バイオマーカーの前記レベルを分析し、各バイオマーカーのそれぞれの基準値範囲と比較するステップと、
ｃ）前記バイオマーカーの発現レベルに基づいて前記患者の敗血症スコアを計算するステップと、
ｄ）前記敗血症スコアの値に基づいて前記患者が敗血症を有する可能性を計算するステップであって、非感染性炎症を有する時間一致対照対象の基準値範囲と比較してより高い前記患者の敗血症スコアが、前記患者が敗血症を有する可能性が高いことを示す、計算するステップと、
ｅ）前記患者の診断に関する情報を表示するステップと、を含むステップを行う、前記方法。
複数のインビトロ複合体を含む組成物であって、前記複数のインビトロ複合体が、バイオマーカーＣＥＡＣＡＭ１、ＺＤＨＨＣ１９、Ｃ９ｏｒｆ９５、ＧＮＡ１５、ＢＡＴＦ、Ｃ３ＡＲ１、ＫＩＡＡ１３７０、ＴＧＦＢＩ、ＭＴＣＨ１、ＲＰＧＲＩＰ１、及びＨＬＡ－ＤＰＢ１遺伝子配列を含む核酸にハイブリダイズされた最大３０個の標識プローブ、前記バイオマーカー遺伝子配列にハイブリダイズされた前記標識プローブ、またはそれらの相補的ポリヌクレオチド配列を含み、前記核酸が、敗血症を有する患者から抽出されるか、または敗血症を有する前記患者から抽出された前記核酸の増幅産物である、前記組成物。
前記インビトロ複合体が検出デバイス内にある、請求項１５に記載の組成物。
前記標識プローブが、蛍光標識、生物発光標識、化学発光標識、比色標識、または同位体標識を含む、請求項１５に記載の組成物。
患者における敗血症の診断を補助するための方法であって、
ａ）前記患者由来の生体試料由来の前記バイオマーカーＣＥＡＣＡＭ１、ＺＤＨＨＣ１９、Ｃ９ｏｒｆ９５、ＧＮＡ１５、ＢＡＴＦ、Ｃ３ＡＲ１、ＫＩＡＡ１３７０、ＴＧＦＢＩ、ＭＴＣＨ１、ＲＰＧＲＩＰ１、及びＨＬＡ－ＤＰＢ１核酸、または前記バイオマーカー核酸の増幅産物を、前記バイオマーカーＣＥＡＣＡＭ１、ＺＤＨＨＣ１９、Ｃ９ｏｒｆ９５、ＧＮＡ１５、ＢＡＴＦ、Ｃ３ＡＲ１、ＫＩＡＡ１３７０、ＴＧＦＢＩ、ＭＴＣＨ１、ＲＰＧＲＩＰ１、及びＨＬＡ－ＤＰＢ１遺伝子配列を検出することができる標識プローブ、前記バイオマーカーＣＥＡＣＡＭ１、ＺＤＨＨＣ１９、Ｃ９ｏｒｆ９５、ＧＮＡ１５、ＢＡＴＦ、Ｃ３ＡＲ１、ＫＩＡＡ１３７０、ＴＧＦＢＩ、ＭＴＣＨ１、ＲＰＧＲＩＰ１、及びＨＬＡ－ＤＰＢ１遺伝子配列にハイブリダイズすることができる前記標識プローブ、またはそれらの相補的ポリヌクレオチド配列と接触させて、請求項１５に記載の組成物を産生することであって、前記生体試料が、全血、バフィーコート、または好中球である、ことと、
ｂ）前記インビトロ複合体の量を測定して、前記生体試料中の前記バイオマーカー核酸の発現レベルを決定することと、
ｃ）前記バイオマーカー核酸のそれぞれの基準値範囲に関連して前記バイオマーカー核酸の発現レベルを分析することと、を含み、非感染性炎症を有する時間一致対照対象の前記バイオマーカー核酸の基準値範囲と比較して、増加した前記バイオマーカーＣＥＡＣＡＭ１、ＺＤＨＨＣ１９、Ｃ９ｏｒｆ９５、ＧＮＡ１５、ＢＡＴＦ、またはＣ３ＡＲ１核酸の発現レベルが、前記患者が敗血症を有する可能性が高いことを示すか、または非感染性炎症を有する時間一致対照対象の前記バイオマーカー核酸の基準値範囲と比較して、低下した前記バイオマーカーＫＩＡＡ１３７０、ＴＧＦＢＩ、ＭＴＣＨ１、ＲＰＧＲＩＰ１、またはＨＬＡ－ＤＰＢ１核酸の発現レベルが、前記患者が敗血症を有する可能性が高いことを示す、前記方法。
前記バイオマーカー核酸の発現レベルに基づいて前記患者の敗血症スコアを計算することをさらに含み、前記非感染性炎症を有する時間一致対照対象の前記基準値範囲と比較してより高い前記患者の敗血症スコアが、前記患者が敗血症を有する可能性が高いことを示す、請求項１８に記載の方法。