KR20230048144A - 다중-파라토프 항-pd-1 항체 및 그의 용도 - Google Patents

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네이선 히긴슨-스코트
케빈 루이스 오티포비
조앤 엘. 비니
살바토레 알리오토
린제이 제이. 에드워즈
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팬디온 오퍼레이션스, 인코포레이티드
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Abstract

예를 들어 PD-1의 활성을 조정하기 위해 사용될 수 있는 다중-파라토프 폴리펩티드.

Description

다중-파라토프 항-PD-1 항체 및 그의 용도
관련 출원에 대한 상호-참조
본 출원은 2020년 8월 19일에 출원된 미국 가출원 번호 63/067,674, 2021년 4월 16일에 출원된 미국 가출원 번호 63/175,760, 2021년 2월 23일에 출원된 미국 가출원 번호 63/152,691을 우선권 주장하며, 이들 각각은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
본 출원은 또한 2020년 8월 19일에 출원된 미국 출원 번호 16/997,238에 관한 것이며, 이는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
분야
본원에 제공된 실시양태는, 예를 들어 PD-1에 결합할 수 있는, 예를 들어 파라토프 항체에 관한 것이다.
예를 들어, 이식된 조직의 거부 또는 자가면역 장애에서와 같은 원치않는 면역 반응의 사례는 전세계적으로 수백만명의 사람들에 대해 주요 건강 문제를 구성한다. 기관 이식에 대한 장기간 결과는 빈번하게 만성 거부 및 이식된 기관의 궁극적 실패를 특징으로 한다. 본질적으로 모든 신체 기관에 영향을 미치고, 북아메리카에서만 5천만명이 넘는 사람들에게 영향을 미친, 20종 초과의 자가면역 장애가 공지되어 있다. 둘 다의 시나리오에서 병원성 면역 반응을 방지하는 데 사용되는 광범위하게 활성인 면역억제 의약은 심각한 부작용을 갖는다. 따라서, 이러한 상태를 치료하기 위한 치료제 및 폴리펩티드가 필요하다. 본원에 제공된 실시양태는 이들 필요 뿐만 아니라 다른 필요를 충족시킨다.
예를 들어 면역 반응을 조정하는 데 사용될 수 있는 폴리펩티드가 본원에 개시된다. 일부 실시양태에서, 면역 반응은 감소되며, 이를 사용하여, 예를 들어 자가면역 상태 또는 면역 반응을 감소시키는 것이 필요하거나 도움이 되는 다른 면역계 장애를 치료할 수 있다. 이러한 면역 장애의 비제한적 예는 본원에 제공된다.
본원에 개시된 실시양태는 이 섹션에 참조로 포함된다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 폴리펩티드는 억제 분자, 예를 들어 억제 면역 체크포인트 분자에 결합하고 효능작용하거나, 또는 달리 면역 세포, 예를 들어 세포독성 T 세포, 헬퍼 T 세포, 조절 T 세포 (Treg), B 세포, NK 세포, 수지상 세포, 예를 들어 형질세포양 수지상 세포, 선천성 림프성 세포, 예를 들어 ILC2, 또는 골수 세포, 예를 들어 호중구 또는 대식세포의 활성을 억제하거나 감소시킨다.
일부 실시양태에서, 면역 세포의 하향 조절 수준은 치료 화합물이 그의 표적에 결합되지 않은 경우보다 치료 화합물이 그의 표적에 결합된 경우에 더 크다. 실시양태에서, 표적 결합된 치료 화합물에 의한 하향 조절 수준은 그것이 표적에 결합되지 않은 경우에 관찰되는 것과 동일하거나 또는 1.5배, 2배, 4배, 8배 또는 10배 더 크다. 실시양태에서, 치료 화합물은 그것이 표적에 결합되지 않은 경우에 면역 세포를 하향 조절하지 않거나 또는 유의하게 하향 조절하지 않는다. 따라서, 억제 수용체, 예를 들어 PD-1의 무차별적 또는 원치않는 효능작용이 최소화되거나 제거된다. 예를 들어, 치료 화합물이 면역 세포에 결합되지만, 표적화 모이어티에는 결합되지 않는 경우에, 치료 화합물에 의한 억제 면역 체크포인트 분자의 결속은 하향 조절을 유발하지 않거나 또는 실질적인 하향 조절을 유발하지 않으며, 예를 들어 치료 화합물이 결합된 면역 세포 상의 억제 수용체는 클러스터링되지 않거나 또는 면역 세포의 하향 조절 또는 실질적인 억제를 제공하는 데 충분한 억제 신호를 유발하기에 충분히 클러스터링되지 않는다.
실시양태에서, 치료 화합물은, 면역 세포 상의 세포 표면 억제 수용체, 예를 들어 PD-1과 결속되는 경우에, 내인성 리간드에 결합하는 세포 표면 억제 수용체의 능력을 억제하지 않거나 또는 실질적으로 억제하지 않는다. 일부 실시양태에서, 치료 화합물은 PD-1 상의 PD-L1/2 결합 부위에 결합할 수 있다. 따라서, 억제 수용체, 예를 들어 PD-1의 무차별적 또는 원치않는 길항작용이 최소화되거나 제거된다. 실시양태에서, 면역 세포 상의 억제 수용체, 예를 들어 PD-1에 대한 치료 화합물의 결합은 천연 리간드, 예를 들어 PD-L1에 결합하는 억제 수용체의 능력을 방해하지 않거나 또는 실질적으로 방해하지 않는다. 실시양태에서, 면역 세포 상의 억제 수용체, 예를 들어 PD-1에 대한 치료 화합물의 결합은 천연 리간드, 예를 들어 PD-L1의 결합을 치료 화합물의 부재 하에 관찰되는 것의 50, 40, 30, 20, 10 또는 5% 미만만큼 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 모이어티는 PD-1에 결합하는 항체이다. 일부 실시양태에서, 항체는 PD-1 효능제이다. 일부 실시양태에서, 항체는 가용성 PD-1 길항제 검정에서 PD-1 길항제가 아니다.
일부 실시양태에서, 치료 화합물은 본원에 제공된 바와 같이 제공된다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 폴리펩티드는 PD-1에 결합하는 제1 및 제2 결합 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 및 제2 결합 도메인은 PD-1 항체 표 4에 제시된 바와 같은 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 및 제2 결합 도메인은 PD-1 항체 표 5에 제시된 바와 같은 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 및 제2 결합 도메인은 PD-1 항체 표 4 및 PD-1 항체 표 5에 제시된 바와 같은 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 폴리펩티드는 PD-1에 결합하는 제1, 제2, 제3 및 제4 결합 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 결합 도메인은 독립적으로 PD-1 항체 표 4에 제시된 바와 같은 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 도메인은 독립적으로 PD-1 항체 표 5에 제시된 바와 같은 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 결합 도메인은 독립적으로 PD-1 항체 표 4 및 PD-1 항체 표 5에 제시된 바와 같은 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 동일한 표적, 예컨대 PD-1에 결합하는 복수의 별개의 결합 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 표적에 결합하는 2 또는 4개의 별개의 결합 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 표적에 결합하는 4개의 결합 도메인을 포함한다. 폴리펩티드가 항체 또는 항체 유사 서열을 포함하는 경우에, 결합 도메인은 또한 항원 인식 도메인 또는 항원 결합 도메인으로도 지칭될 수 있다. 일부 실시양태에서, 결합 도메인 각각은 표적 상의 동일한 에피토프에 결합한다. 일부 실시양태에서, 결합 도메인 중 2개는 표적 상의 동일한 에피토프에 결합한다. 일부 실시양태에서, 예컨대 4개의 결합 도메인이 존재하는 경우에, 2개의 결합 도메인은 동일한 에피토프에 결합하고, 나머지 2개의 결합 도메인은 표적 상의 상이한 에피토프에 결합한다. 일부 실시양태에서, 표적 결합 도메인 중 2개는 동일한 또는 거의 동일한 표적 결합 도메인 (예를 들어 CDR)을 갖는다. 일부 실시양태에서, 각각의 도메인은 동일한 또는 거의 동일한 표적 결합 도메인을 갖는다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 폴리펩티드에 존재하는 또 다른 결합 도메인과 상이한 적어도 1개의 결합 도메인을 포함한다. 이는 또한 표적 결합 도메인의 이종 세트를 갖는 폴리펩티드로도 지칭될 수 있다. 모든 동일한 표적 결합 도메인을 갖는 폴리펩티드는 표적 결합 도메인의 동종 세트를 갖는 것으로 언급될 수 있다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드가 표적 결합 도메인과 관련하여 이종인 경우에, 폴리펩티드는 이중특이적인 것으로 지칭될 수 있다. 이중특이성은 표적 결합 도메인이 결합하는, 즉 상이한 에피토프에 관한 것일 수 있다. 이는 또한 파라토프 또는 다중-파라토프로 지칭될 수 있다.
일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 N-말단에서 C-말단으로 하기 화학식을 포함한다:
(R1-Fc-R2)2,
여기서 R1은 제1 결합 도메인이고,
여기서 R2는 제2 결합 도메인이고,
여기서 R1 및 R2 중 하나는 Fab 항체이고, 다른 것은 scFv 항체이고,
여기서 R1 및 R2는 링커에 의해 연결되고,
여기서 상기 링커는 Fc 이뮤노글로불린 불변 영역, 예컨대 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4를 포함하고,
여기서 상기 링커는 G/S 또는 G/A 링커를 추가로 포함하고,
여기서 G/S 또는 G/A 링커는 (GGGGS)n (서열식별번호: 303) 또는 (GGGGA)n (서열식별번호: 304)의 서열 또는 그의 조합을 포함하며, 여기서 각각의 n은 독립적으로 1-4이다.
일부 실시양태에서, 테트라드 항체는 N-말단에서 C-말단으로 하기 화학식을 갖는다:
(R2-Fc-R1)2,
여기서 R1은 제1 결합 도메인이고,
여기서 R2는 제2 결합 도메인이고,
여기서 R1 및 R2 중 하나는 Fab 항체이고, 다른 것은 scFv 항체이고,
여기서 R1 및 R2는 링커에 의해 연결되고,
여기서 상기 링커는 Fc 이뮤노글로불린 불변 영역, 예컨대 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4를 포함하고,
여기서 상기 링커는 G/S 또는 G/A 링커를 추가로 포함하고,
여기서 G/S 또는 G/A 링커는 (GGGGS)n (서열식별번호: 303) 또는 (GGGGA)n (서열식별번호: 304)의 서열 또는 그의 조합을 포함하며, 여기서 각각의 n은 독립적으로 1-4이다.
일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 제1 폴리펩티드 쇄 및 제2 폴리펩티드 쇄를 포함하며, 여기서
제1 폴리펩티드 쇄는 N-말단에서 C-말단으로 하기 화학식을 갖고:
[VH-A]-[CH1]-[CH2]-[CH3]-[링커 1]-[VH-B]-[링커 2]-[VK-B]; 또는
[VH-A]-[CH1]-[CH2]-[CH3]-[링커 1]-[VK-B]-[링커 2]-[VH-B];
제2 폴리펩티드 쇄는 N-말단에서 C-말단으로 하기 화학식을 가지며:
[VK-A]-[CK],
여기서
VH-A = 본원에 제공된 바와 같은 PD1 항체의 가변 중쇄 도메인;
VK-A = 본원에 제공된 바와 같은 PD1 항체의 가변 경쇄 도메인
VH-B = 본원에 제공된 바와 같은 PD1 항체의 가변 중쇄 도메인;
VK-B = 본원에 제공된 바와 같은 PD1 항체의 가변 경쇄 도메인
CH1 = 인간 IgG1의 불변 중쇄 도메인 1
CH2 = 인간 IgG1의 불변 중쇄 도메인 2
CH3 = 인간 IgG1의 불변 중쇄 도메인 3
CK = 카파 경쇄의 불변 도메인
링커 1은 글리신/세린 또는 글리신/알라닌 링커이고,
링커 2는 글리신/세린 또는 글리신/알라닌 링커이고,
여기서 VH-A, VK-A, VH-B 및 VK-B는 동일한 항체로부터의 것이거나 또는 상이할 수 있다.
일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 제1 폴리펩티드 쇄 및 제2 폴리펩티드 쇄를 포함하며, 여기서
제1 폴리펩티드 쇄는 N-말단에서 C-말단으로 하기 화학식을 갖고:
[VH-B]-[CH1]-[CH2]-[CH3]-[링커 1]-[VH-A]-[링커 2]-[VK-A]; 또는
[VH-B]-[CH1]-[CH2]-[CH3]-[링커 1]-[VK-A]-[링커 2]-[VH-A];
제2 폴리펩티드 쇄는 N-말단에서 C-말단으로 하기 화학식을 가지며:
[VK-B]-[CK],
여기서
VH-A = 본원에 제공된 바와 같은 PD1 항체의 가변 중쇄 도메인;
VK-A = 본원에 제공된 바와 같은 PD1 항체의 가변 경쇄 도메인;
VH-B = 본원에 제공된 바와 같은 PD1 항체의 가변 중쇄 도메인;
VK-B = 본원에 제공된 바와 같은 PD1 항체의 가변 경쇄 도메인;
CH1 = 본원에 제공된 바와 같은 인간 IgG1의 불변 중쇄 도메인 1;
CH2 = 본원에 제공된 바와 같은 인간 IgG1의 불변 중쇄 도메인 2;
CH3 = 본원에 제공된 바와 같은 인간 IgG1의 불변 중쇄 도메인 3;
CK = 본원에 제공된 바와 같은 카파 경쇄의 불변 도메인;
링커 1은 글리신/세린 또는 글리신/알라닌 링커이고,
링커 2는 글리신/세린 또는 글리신/알라닌 링커이고,
여기서 VH-A, VK-A, VH-B 및 VK-B는 동일한 항체로부터의 것이거나 또는 상이할 수 있다.
일부 실시양태에서, PD-1 항체는 PD-1 항체 표 4에 제시된 바와 같은 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, PD-1 항체는 PD-1 항체 표 5에 제시된 바와 같은 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, PD-1 항체는 PD-1 항체 표 4 및 PD-1 항체 표 5에 제시된 바와 같은 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 2개의 제1 폴리펩티드 쇄 및 2개의 제2 폴리펩티드 쇄를 포함한다. 비제한적 예는 본원에 제공된다.
일부 실시양태에서, PD-1에 결합하는 제1 및 제2 결합 도메인을 포함하는 폴리펩티드가 제공되며, 제1 및 제2 결합 도메인은 PD-1 항체 표 4 또는 PD-1 항체 표 5에 제시된 바와 같은 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 PD-1에 결합하는 제3 및 제4 결합 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제3 결합 도메인은 제1 결합 도메인과 동일하다. 일부 실시양태에서, 제4 결합 도메인은 제2 결합 도메인과 동일하다.
일부 실시양태에서, FAb 포맷인 PD-1 항체는 scFv 포맷인 PD-1 항체와 비교하여 PD-1에 대해 더 낮은 친화도를 갖는다. 일부 실시양태에서, FAb 포맷인 PD-1 항체는 scFv 포맷인 PD-1 항체와 비교하여 PD-1에 대해 더 높은 친화도를 갖는다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 치료 화합물 또는 폴리펩티드 중 하나 이상을 투여하는 것을 포함하는, 자가면역 질환 또는 상태를 치료하는 방법이 본원에 제공된다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 치료 화합물 또는 폴리펩티드 중 하나 이상을 투여하는 것을 포함하는, 본원에 기재된 질환 또는 상태를 치료하는 방법이 본원에 제공된다.
일부 실시양태에서, 염증성 장 질환을 갖는 대상체에게 본원에 제공된 치료 화합물 또는 폴리펩티드를 투여하여 염증성 장 질환을 치료하는 것을 포함하는, 염증성 장 질환을 갖는 대상체를 치료하는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 대상체는 크론병 또는 궤양성 결장염을 갖는다.
일부 실시양태에서, 자가면역 간염을 갖는 대상체에게 본원에 제공된 바와 같은 치료 화합물 또는 폴리펩티드를 투여하여 자가면역 간염을 치료하는 것을 포함하는, 자가면역 간염을 갖는 대상체를 치료하는 방법이 제공된다.
일부 실시양태에서, 대상체에게 본원에 제공된 바와 같은 치료 화합물 또는 폴리펩티드를 투여하여 원발성 경화성 담관염을 치료하는 것을 포함하는, 원발성 경화성 담관염을 치료하는 방법이 제공된다.
일부 실시양태에서, 대상체에게 본원에 제공된 바와 같은 치료 화합물 또는 폴리펩티드를 투여하여 장에서의 염증을 치료하는 것을 포함하는, 장에서의 염증을 치료하는 (예를 들어, 감소시키는) 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 염증은 소장에 존재한다. 일부 실시양태에서, 염증은 대장에 존재한다. 일부 실시양태에서, 염증은 장 또는 결장에 존재한다.
일부 실시양태에서, 대상체에게 본원에 제공된 바와 같은 치료 화합물 또는 폴리펩티드를 투여하여 췌장에서의 염증을 치료하는 것을 포함하는, 췌장에서의 염증을 치료하는 (예를 들어, 감소시키는) 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 방법은 췌장염을 치료한다.
일부 실시양태에서, 대상체에게 본원에 제공된 바와 같은 치료 화합물 또는 폴리펩티드를 투여하여 제1형 당뇨병을 치료하는 것을 포함하는, 제1형 당뇨병을 치료하는 방법이 제공된다.
일부 실시양태에서, 이식 대상체에게 치료 유효량의 본원에 제공된 바와 같은 치료 화합물 또는 폴리펩티드를 투여하여 이식 (수용자) 대상체를 치료하는 것을 포함하는, 이식 대상체를 치료하는 방법이 제공된다.
일부 실시양태에서, 이식된 공여자 조직을 갖는 대상체에게 치료 유효량의 본원에 제공된 바와 같은 치료 화합물 또는 폴리펩티드를 투여하는 것을 포함하는, 이식된 공여자 조직을 갖는 대상체에서 이식편 대 숙주 질환 (GVHD)을 치료하는 방법이 제공된다.
일부 실시양태에서, 치료 유효량의 본원에 제공된 바와 같은 치료 화합물 또는 폴리펩티드를 투여하여 자가면역 장애를 갖거나 또는 가질 위험이 있거나 또는 가질 위험이 상승된 대상체를 치료하는 것을 포함하는, 자가면역 장애를 갖거나 또는 가질 위험이 있거나 또는 가질 위험이 상승된 대상체를 치료하는 방법이 제공된다.
도 1은 본원에 제공된 폴리펩티드의 비제한적 예시를 도시한다.
도 2는 본원에 제공된 폴리펩티드의 비제한적 예시를 도시한다.
도 3은 본원에 제공된 폴리펩티드의 비제한적 예시를 도시한다.
달리 나타내지 않는 한, 본원에 사용된 용어 "약"은 그것이 수식하는 값의 ± 10%를 의미하는 것으로 의도된다. 따라서, 약 100은 95 내지 105를 의미한다.
본원 및 첨부된 청구범위에 사용된 단수 형태는 문맥이 달리 명확하게 지시하지 않는 한 복수 지시대상을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "동물"은 인간 및 비-인간 척추동물, 예컨대 야생동물, 가축 및 농장 동물을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
본원에 사용된 용어 "접촉시키는"은 시험관내 시스템 또는 생체내 시스템에서 2개의 요소를 함께 모으는 것을 의미한다. 예를 들어, 치료 화합물을 개체 또는 환자 또는 세포와 "접촉시키는" 것은 화합물을 개체 또는 환자, 예컨대 인간에게 투여하는 것 뿐만 아니라, 예를 들어 표적을 함유하는 세포 또는 정제된 제제를 함유하는 샘플 내로 화합물을 도입하는 것을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "포함하는" (및 포함하는의 임의의 형태, 예컨대 "포함하다", "포함한다" 및 "구성된"), "갖는" (및 갖는의 임의의 형태, 예컨대 "갖다" 및 "갖는다"), "포함한" (및 포함한의 임의의 형태, 예컨대 "포함한다" 및 "포함하다") 또는 "함유하는" (및 함유하는의 임의의 형태, 예컨대 "함유한다" 및 "함유하다")은 포괄적 또는 개방형이고, 추가의 언급되지 않은 요소 또는 방법 단계를 배제하지 않는다. 용어 "포함하는"을 언급하는 임의의 조성물 또는 방법은 또한 언급된 성분 또는 요소로 이루어지거나, 그로 이루어지거나 또는 그로 본질적으로 이루어진 이러한 조성물을 또한 기재하는 것으로 이해되어야 한다.
본원에 사용된 용어 "융합된" 또는 "연결된"은 상이한 도메인 또는 이종 서열을 갖는 단백질에 관하여 사용되는 경우에, 단백질 도메인이 펩티드 결합 또는 다른 공유 결합으로 서로 연결된 동일한 펩티드 쇄의 일부라는 것을 의미한다. 도메인 또는 섹션은 서로 직접 연결 또는 융합될 수 있거나, 또는 또 다른 도메인 또는 펩티드 서열이 2개의 도메인 또는 서열 사이에 존재할 수 있고, 이러한 서열은 여전히 서로 융합 또는 연결된 것으로 간주될 것이다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 다양한 도메인 또는 단백질은 서로에 직접 연결 또는 융합되거나, 또는 링커 서열, 예컨대 2개의 도메인을 함께 연결하는 본원에 기재된 글리신/세린 서열에 연결 또는 융합된다.
본원에 사용된 용어 "개체", "대상체" 또는 "환자"는 상호교환가능하게 사용되며, 포유동물, 예컨대 마우스, 래트, 다른 설치류, 토끼, 개, 고양이, 돼지, 소, 양, 말 또는 영장류, 예컨대 인간을 포함한 임의의 동물을 의미한다.
본원에 사용된 용어 "억제하다"는 결과, 증상 또는 활성을 억제하는 화합물의 부재 하의 활성 또는 결과와 비교하여 결과, 증상 또는 활성이 감소되는 것을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 결과, 증상 또는 활성은 약 또는 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99%만큼 억제된다. 결과, 증상 또는 활성은 또한 그것이 완전히 제거되거나 소멸되는 경우 억제될 수 있다.
본원에 사용된 어구 "그를 필요로 하는"은 대상체가 특정한 방법 또는 치료에 대한 필요를 갖는 것으로 확인된 것을 의미한다. 일부 실시양태에서, 확인은 임의의 진단 수단에 의한 것일 수 있다. 본원에 기재된 임의의 방법 및 치료에서, 대상체는 그를 필요로 할 수 있다. 일부 실시양태에서, 대상체는 특정한 질환, 장애 또는 상태가 만연한 환경에 있거나 또는 이러한 환경으로 이동할 것이다.
본원에 사용된 어구 "X 내지 Y의 정수"는 종점을 포함하는 임의의 정수를 의미한다. 예를 들어, 어구 "X 내지 Y의 정수"는 1, 2, 3, 4 또는 5를 의미한다.
본원에 사용된 용어 "포유동물"은 설치류 (즉, 마우스, 래트 또는 기니 피그), 원숭이, 고양이, 개, 소, 말, 돼지 또는 인간을 의미한다. 일부 실시양태에서, 포유동물은 인간이다.
일부 실시양태에서, 폴리펩티드가 본원에 제공된다. 폴리펩티드는 또한 화합물로도 지칭될 수 있다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 치료 화합물이다. 일부 실시양태에서, 치료 화합물은 서로 상호작용하는 다중 쇄를 갖는 단백질 또는 폴리펩티드이다. 폴리펩티드는 비-공유 상호작용 또는 공유 상호작용을 통해, 예컨대 디술피드 결합 또는 다른 공유 결합을 통해 서로 상호작용할 수 있다. 따라서, 한 실시양태가 치료 화합물을 지칭하는 경우에, 이는 또한 본원에 제공된 바와 같은 단백질 또는 폴리펩티드를 지칭하는 것으로 언급될 수 있고, 문맥이 지시하는 바와 같이 그 반대의 경우도 마찬가지이다.
본원에 사용된 어구 "안과용으로 허용되는"은 치료되는 눈 또는 그의 기능에 대해 또는 치료되는 대상체의 전반적 건강에 대해 지속적인 유해 효과를 갖지 않는 것을 의미한다. 그러나, 일시적 효과, 예컨대 경미한 자극 또는 "찌르는" 느낌은 약물의 국소 안과 투여에서 통상적이고, 이러한 일시적 효과의 존재는 본원에 정의된 바와 같은 "안과용으로 허용되는" 해당 조성물, 제제 또는 성분 (예를 들어, 부형제)과 일치하지 않는 것으로 인식될 것이다. 일부 실시양태에서, 제약 조성물은 안과용으로 허용되거나 또는 안과 투여에 적합할 수 있다.
특정한 항원, 표적 또는 에피토프"에 특이적인 결합" 또는 "에 특이적으로 결합하다" 또는 "에 특이적인"은 비-특이적 상호작용과 측정가능하게 상이한 결합을 의미한다. 특이적 결합은, 예를 들어 일반적으로 결합 활성을 갖지 않는 유사한 구조의 분자인 대조군 분자의 결합과 비교하여 분자의 결합을 결정함으로써 측정될 수 있다. 예를 들어, 특이적 결합은 표적과 유사한 대조군 분자와의 경쟁에 의해 결정될 수 있다.
특정한 항원, 표적 또는 에피토프에 대한 특이적 결합은, 예를 들어 항원 또는 에피토프에 대한 KD가 적어도 약 10-4M, 적어도 약 10-5M, 적어도 약 10-6 M, 적어도 약 10-7M, 적어도 약 10-8M, 적어도 약 10-9M, 대안적으로 적어도 약 10-10 M, 적어도 약 10-11M, 적어도 약 10-12M 또는 그 초과인 항체에 의해 나타내어질 수 있으며, 여기서 KD는 특정한 항체-표적 상호작용의 해리율을 지칭한다. 전형적으로, 항원 또는 표적에 특이적으로 결합하는 항체는 항원 또는 에피토프에 비해 대조군 분자에 대해 적어도 2배, 4배, 5배, 10배, 20배, 50배, 100배, 500배, 1000배, 5,000배, 10,000배 또는 그 초과 더 큰 KD를 가질 것이다.
일부 실시양태에서, 특정한 항원, 표적 또는 에피토프에 대한 특이적 결합은, 예를 들어 표적, 항원 또는 에피토프에 대한 KA 또는 Ka가 대조군에 비해 표적, 항원 또는 에피토프에 대해 적어도 2배, 4배, 5배, 20배, 50배, 100배, 500배, 1000배, 5,000배, 10,000배 또는 그 초과 더 큰 항체에 의해 나타내어질 수 있으며, 여기서 KA 또는 Ka는 특정한 항체-항원 상호작용의 회합률을 지칭한다.
본 개시내용은, 예를 들어 PD-1 효능제로서 작용할 수 있는 분자를 제공한다. 일부 실시양태에서, 효능제는 PD-1에 결합하는 복수의 항원 결합 도메인을 포함하는 항체 또는 폴리펩티드이다. 어떠한 특정한 이론에 얽매이지는 않지만, PD-1의 효능작용은 T 세포 활성화/신호전달을 억제하고, 상이한 메카니즘에 의해 달성될 수 있다. 예를 들어, 가교는 효능작용으로 이어질 수 있으며, 비드-결합된 기능적 PD-1 효능제가 기재되었다 (문헌 [Akkaya. Ph.D. Thesis: Modulation of the PD-1 pathway by inhibitory antibody superagonists. Christ Church College, Oxford, UK, 2012], 이는 본원에 참조로 포함됨). PD-1과 비-중첩 에피토프에 결합하는 2개의 mAb와의 가교는 PD-1 신호전달을 유도한다 (문헌 [Davis, US 2011/0171220], 이는 본원에 참조로 포함됨). 또 다른 예는 가용성인 경우에 효능제로서 작용하는 (문헌 [Said et al., 2010, Nat Med], 이는 본원에 참조로 포함됨) 염소 항-PD-1 항혈청 (예를 들어 AF1086, 알앤디 시스템즈(R&D Systems), 이는 본원에 참조로 포함됨)의 사용을 통해 예시된다. 본 발명의 실시양태에서 사용될 수 있는 PD-1 효능제의 비제한적 예는 UCB 클론 19 또는 클론 10, PD1AB-1, PD1AB-2, PD1AB-3, PD1AB-4 및 PD1AB-5, PD1AB-6 (아납티스(Anaptys)/셀진(Celgene)), PD1-17, PD1-28, PD1-33 및 PD1-35 (문헌 [Collins et al., US 2008/0311117 A1, antibodies against PD-1 and uses therefor], 이는 본원에 참조로 포함됨)를 포함하나 이에 제한되지는 않거나, 또는 이중특이적 1가 항-PD-1/항-CD3 (Ono) 등일 수 있다. 일부 실시양태에서, PD-1 효능제 항체는 PD-1에 대한 PD-L1의 결합을 차단하는 항체일 수 있다. 일부 실시양태에서, PD-1 효능제 항체는 PD-1에 대한 PD-L1의 결합을 차단하지 않는 항체일 수 있다. 일부 실시양태에서, 항체는 PD-1의 길항제로서 작용하지 않는다. 일부 실시양태에서, 효능제는 본원에 제공된 바와 같은 항체이다.
PD-1 효능작용은 임의의 방법, 예컨대 실시예에 기재된 방법에 의해 측정될 수 있다. 예를 들어, 베타-갈락토시다제 "효소 공여자"에 융합된 인간 PD-1 폴리펩티드 및 2) 베타-갈락토시다제 "효소 수용자"에 융합된 SHP-2 폴리펩티드를 포함하는 구축물을 발현하는 (안정하게 발현하는 것 포함) 세포가 구축될 수 있다. 어떠한 이론에 얽매이지는 않지만, PD-1이 결속되는 경우에, SHP-2는 PD-1로 동원된다. 효소 수용자 및 효소 공여자는 검정될 수 있는 완전 활성 베타-갈락토시다제 효소를 형성한다. 비록 검정이 PD-1 효능작용을 직접 나타내지는 않지만, PD-1 신호전달의 활성화를 나타낸다. PD-1 효능작용은 또한, 어떠한 이론에 얽매이지는 않지만, PD-1 효능작용이 항-CD3-유도된 T 세포 활성화를 억제하기 때문에, T 세포 활성화의 억제를 측정함으로써 측정될 수 있다. 예를 들어, PD-1 효능작용은 T 세포를 PHA (인간 T 세포의 경우) 또는 ConA (마우스 T 세포의 경우)로 사전활성화시켜 이들이 PD-1을 발현하도록 함으로써 측정될 수 있다. 이어서, 세포를 PD-1 효능작용 검정을 위해 항-PD-1 (또는 PD-L1)의 존재 하에 항-CD3으로 재활성화시킬 수 있다. 항-CD3의 존재 하에 PD-1 효능제 신호를 받은 T 세포는 항-CD3 자극 단독에 비해 감소된 활성화를 나타낼 것이다. 활성화는 증식 또는 시토카인 생산 (IL-2, IFNγ, IL-17) 또는 다른 마커, 예컨대 CD69 활성화 마커에 의해 판독될 수 있다. 따라서, PD-1 효능작용은 시토카인 생산 또는 세포 증식에 의해 측정될 수 있다. 다른 방법이 또한 PD-1 효능작용을 측정하는 데 사용될 수 있다.
PD-1은 활성화된 T 세포 및 다른 면역 세포 상에서 발현되는 Ig 슈퍼패밀리 구성원이다. PD-1에 대한 천연 리간드는 PD-L1 및 PD-L2인 것으로 보인다. 어떠한 특정한 이론에 얽매이지는 않지만, PD-L1 또는 PD-L2가 활성화된 T 세포 상의 PD-1에 결합하는 경우에, 억제 신호전달 캐스케이드가 개시되어, 활성화된 T 이펙터 세포 기능의 약화를 유발한다. 따라서, T 세포 상의 PD-1과 또 다른 세포 (예를 들어, 종양 세포) 상의 PD-L1/2 사이의 상호작용을 PD-1 길항제로 차단하는 것은 체크포인트 억제로서 공지되어 있고, T 세포를 억제로부터 해방시킨다. 대조적으로, PD-1 효능제 항체는 PD-1에 결합하고, 억제 신호를 보내고, T 세포의 기능을 약화시킬 수 있다. 따라서, PD-1 효능제 항체는 본원에 기재된 다양한 실시양태에 포함될 수 있다.
일부 실시양태에서, PD-1에 결합할 수 있는 분자의 부분은, 예를 들어 폴리펩티드 내의 동일한 단백질 분자의 구성원으로서, 물리적으로 서로 공유적으로 또는 비-공유적으로 직접 또는 링커 엔티티를 통해 테더링될 수 있다. 일부 실시양태에서, 이는 상이한 결합 모이어티가 화학적 또는 펩티드 링커를 통해 함께 융합되도록 하는 융합 단백질로 지칭될 수 있다. 이러한 링커의 비제한적 예는 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, PD-1에 결합할 수 있는 이펙터 모이어티 (또한 이펙터 결합/조정 모이어티로도 지칭될 수 있음)는 폴리펩티드, 예를 들어, 예컨대 비제한적으로 융합 단백질, 예컨대 개별 도메인에 제공된다. 일부 실시양태에서, 이펙터 결합/조정 모이어티는 각각 단일-쇄 단편 가변 (scFv) 또는 Fab 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 치료 단백질 분자 또는 치료 단백질 분자를 코딩하는 핵산, 예를 들어 mRNA 또는 DNA가 대상체에게 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 복수의 이펙터 분자 결합/조정 모이어티는 제3 엔티티, 예를 들어 담체, 예를 들어 중합체 담체, 덴드리머 또는 입자, 예를 들어 나노입자에 연결된다.
본원에 개시된 치료 화합물을 사용하여 공여자 면역 세포, 예를 들어 공여자 T 세포가 수용자 조직의 면역 공격을 매개하는 능력을 최소화함으로써 GVHD를 억제하는 방법이 본원에 제공된다.
또한, 본원에 개시된 치료 화합물의 투여에 의해 대상체에서 자가면역 장애 또는 반응을 치료, 예를 들어 치료적으로 치료 또는 예방적으로 치료 (또는 예방)하여, 예를 들어 면역계의 조정을 제공하는 방법이 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, 조정은 전신이다. 일부 실시양태에서, 방법은 대상체 조직에 대한 내성, 그의 거부의 최소화, 그에 대한 면역 이펙터 세포 매개 손상의 최소화 또는 그의 기능의 연장을 제공한다. 비제한적 예시적인 조직은 췌장, 미엘린, 타액선, 활막세포, 장, 피부, 신장, 폐 및 근세포를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
본원에 사용된 바와 같이, 치유적 치료와 관련하여 용어 "치료하다", "치료된" 또는 "치료하는"은 그 목적이 바람직하지 않은 생리학적 상태, 장애 또는 질환을 둔화 (경감)시키거나 또는 유익한 또는 목적하는 임상 결과를 수득하는 것이다. 예를 들어, 유익한 또는 목적하는 임상 결과는 증상의 완화; 상태, 장애 또는 질환의 정도의 감소; 상태, 장애 또는 질환의 안정화된 (즉, 악화되지 않는) 상태; 상태, 장애 또는 질환 진행의 발병 지연 또는 둔화; 검출가능하든 검출가능하지 않든, 상태, 장애 또는 질환 상태의 호전 또는 완화 (부분적이든 총체적이든); 환자에 의해 반드시 식별가능하지는 않은, 적어도 1종의 측정가능한 물리적 파라미터의 호전; 또는 상태, 장애 또는 질환의 증진 또는 개선을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 치료는 과도한 수준의 부작용 없이 임상적으로 유의한 반응을 도출하는 것을 포함한다. 치료는 또한 치료를 받지 않은 경우에 예상되는 생존과 비교하여 생존을 연장시키는 것을 포함한다. 따라서, "자가면역 질환/장애의 치료"는 자가면역 질환/장애 또는 본원에 기재된 다른 상태와 연관된 임의의 원발성 현상 또는 속발성 증상을 완화시키거나 호전시키는 활동을 의미한다. 다양한 질환 또는 상태가 본원에 제공된다. 치유적 치료는 또한 발병 전에 질환 또는 상태를 예방하거나 감소시키기 위해 예방적으로 투여될 수 있다.
일부 실시양태에서, 치료 화합물의 투여는 장애가 분명해진 후에 시작된다. 일부 실시양태에서, 치료 화합물의 투여는 장애의 발병 또는 완전한 발병 전에 시작된다. 일부 실시양태에서, 치료 화합물의 투여는, 예를 들어 장애를 갖는 대상체, 고위험 대상체, 장애의 위험 또는 존재에 대한 바이오마커를 갖는 대상체, 장애의 가족력 또는 장애의 위험 또는 무증상 존재의 다른 지표를 갖는 대상체에서 장애의 발병 또는 완전한 발병 전에 시작된다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 도세포 손상을 갖지만 아직 당뇨병은 아닌 대상체가 치료된다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 과학 용어는 이들 실시양태가 속하는 기술분야의 통상의 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기재된 것과 유사하거나 동등한 방법 및 물질이 본 발명의 실시양태의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 적합한 방법 및 물질이 하기에 기재된다. 본원에 언급된 모든 공개물, 특허 출원, 특허 및 다른 참고문헌은 그 전문이 참조로 포함된다. 추가로, 물질, 방법 및 예는 단지 예시적이며, 제한적인 것으로 의도되지 않는다. 표제, 하위-표제 또는 번호매김되거나 문자매김된 요소, 예를 들어 (a), (b), (i) 등은 단지 읽기 쉽게 하기 위해 제시된다. 본 명세서에서 표제 또는 번호매김되거나 문자매김된 요소의 사용은 단계 또는 요소가 알파벳 순서로 수행되거나 또는 단계 또는 요소가 반드시 서로 별개일 것을 요구하지 않는다. 실시양태의 다른 특색, 목적 및 이점은 설명 및 도면 및 청구범위로부터 분명할 것이다.
추가의 정의
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 과학 용어는 실시양태가 속하는 기술분야의 통상의 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본 발명의 실시양태를 기재하고 청구하는 데 있어서, 하기 용어 및 본 출원 전반에 걸쳐 달리 언급된 용어는 정의가 제공되는 경우에 정의된 방법에 따라 사용될 것이다.
또한, 본원에 사용된 용어는 단지 특정한 실시양태를 기재할 목적을 위한 것이며, 제한적인 것으로 의도되지 않는다는 것이 이해되어야 한다.
항체는, 이 용어가 본원에 사용된 경우, 적어도 1개의 기능적 이뮤노글로불린 가변 도메인 서열을 포함하는 폴리펩티드, 예를 들어 이뮤노글로불린 쇄 또는 그의 단편을 지칭한다. 항체 분자는 항체 (예를 들어, 전장 항체) 및 항체 단편을 포괄한다. 일부 실시양태에서, 항체 분자는 전장 항체의 항원 결합 또는 기능적 단편 또는 전장 이뮤노글로불린 쇄를 포함한다. 예를 들어, 전장 항체는 자연 발생이거나 또는 정상 이뮤노글로불린 유전자 단편 재조합 과정에 의해 형성된 이뮤노글로불린 (Ig) 분자 (예를 들어, IgG 항체)이다. 실시양태에서, 항체 분자는 이뮤노글로불린 분자의 면역학적으로 활성인 항원 결합 부분, 예컨대 항체 단편을 지칭한다. 항체 단편, 예를 들어 기능적 단편은 항체의 부분, 예를 들어 Fab, Fab', F(ab')2, F(ab)2, 가변 단편 (Fv), 도메인 항체 (dAb) 또는 단일 쇄 가변 단편 (scFv)을 포함한다. 기능적 항체 단편은 무손상 (예를 들어, 전장) 항체에 의해 인식되는 것과 동일한 항원에 결합한다. 용어 "항체 단편" 또는 "기능적 단편"은 또한 가변 영역으로 이루어진 단리된 단편, 예컨대 중쇄 및 경쇄의 가변 영역으로 이루어진 "Fv" 단편 또는 경쇄 및 중쇄 가변 영역이 펩티드 링커에 의해 연결된 재조합 단일 쇄 폴리펩티드 분자 ("scFv 단백질")를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체 단편은 항원 결합 활성이 없는 항체의 부분, 예컨대 Fc 단편 또는 단일 아미노산 잔기를 포함하지 않는다. 예시적인 항체 분자는 전장 항체 및 항체 단편, 예를 들어 dAb (도메인 항체), 단일 쇄, Fab, Fab' 및 F(ab')2 단편 및 단일 쇄 가변 단편 (scFv)을 포함한다.
용어 "항체"는 또한 "sdAb" 또는 "VHH"로도 지칭될 수 있는 도메인 또는 단일 도메인 항체의 전체 또는 항원 결합 단편을 또한 포괄한다. 도메인 항체는 독립형 항체 단편으로서 작용할 수 있는 VH 또는 VL을 포함한다. 추가적으로, 도메인 항체는 중쇄-단독 항체 (HCAb)를 포함한다. 도메인 항체는 또한 CDR 루프가 그라프팅된 염기 스캐폴드로서 IgG의 CH2 도메인을 포함한다. 이는 또한 일반적으로 3개의 상보성 결정 영역이 개재된 4개의 프레임워크 영역으로 구성된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 또는 단백질로서 정의될 수 있다. 이는 FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4로서 나타내어진다. sdAb는 라마와 같은 낙타류에서 생산될 수 있지만, 관련 기술분야에 널리 공지된 기술을 사용하여 합성적으로 생성될 수도 있다. sdAb 또는 폴리펩티드의 아미노산 잔기의 넘버링은 카바트(Kabat) 등 (문헌 ["Sequence of proteins of immunological interest," US Public Health Services, NIH Bethesda, MD, Publication No. 91], 이는 본원에 참조로 포함됨)에 의해 제공된 VH 도메인에 대한 일반적 넘버링에 따른다. 이러한 넘버링에 따르면, sdAb의 FR1은 위치 1-30의 아미노산 잔기를 포함하고, sdAb의 CDR1은 위치 31-36의 아미노산 잔기를 포함하고, sdAb의 FR2는 위치 36-49의 아미노산 잔기를 포함하고, sdAb의 CDR2는 위치 50-65의 아미노산 잔기를 포함하고, sdAb의 FR3은 위치 66-94의 아미노산 잔기를 포함하고, sdAb의 CDR3은 위치 95-102의 아미노산 잔기를 포함하고, sdAb의 FR4는 위치 103-113의 아미노산 잔기를 포함한다. 도메인 항체는 또한 WO2004041862 및 WO2016065323에 기재되어 있으며, 이들 각각은 본원에 참조로 포함된다.
항체 또는 항체 분자는 단일특이적 (예를 들어, 1가 또는 2가), 이중특이적 (예를 들어, 2가, 3가, 4가, 5가 또는 6가), 삼중특이적 (예를 들어, 3가, 4가, 5가 또는 6가) 또는 더 높은 정도의 특이성 (예를 들어, 사중특이적) 및/또는 6가보다 더 높은 정도의 결합가를 가질 수 있다. 항체 분자는 경쇄 가변 영역의 기능적 단편 및 중쇄 가변 영역의 기능적 단편을 포함할 수 있거나 또는 중쇄 및 경쇄는 단일 폴리펩티드로 함께 융합될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "테트라드"는 본원에 기재된 바와 같은 폴리펩티드 또는 항체를 지칭하는 경우에, 2개 세트의 이펙터 모이어티를 포함하고, 상기 2개 세트의 이펙터 모이어티는 각각 개별적으로 2개의 결합 도메인을 포함하여, 폴리펩티드에 총 4개의 결합 도메인을 제공한다.
본원에 사용된 용어 "단일파라토프"는 본원에 기재된 바와 같은 치료 화합물, 분자 또는 항체로서, 동일한 에피토프에 결합하도록 동일한 결합 도메인을 포함하는 본원에 기재된 치료 화합물, 분자 또는 항체를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 폴리펩티드는 단일파라토프가 아니다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 상이한 에피토프에 결합하는 적어도 2개의 상이한 결합 도메인을 포함한다. 따라서, 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 "이중파라토프"로 지칭될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "이중파라토프"는 본원에 기재된 바와 같은 치료 화합물, 분자 또는 항체로서, 서로 중첩되지 않는 에피토프를 포함한 상이한 에피토프에 결합하는 상이한 결합 도메인을 포함하는 본원에 기재된 치료 화합물, 분자 또는 항체를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 단지 2개의 상이한 에피토프에 결합한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 3 또는 4개의 상이한 에피토프에 결합한다.
본원에 사용된 "단일파라토프 테트라드" 또는 "이중파라토프 테트라드"는 본원에 기재된 바와 같은 치료 화합물, 분자 또는 항체로서, 표적에 결합하는 결합 도메인을 포함하는 제1 및 제2 이펙터 모이어티의 2개 세트를 포함하는 본원에 기재된 치료 화합물, 분자 또는 항체를 지칭한다. 이러한 분자의 비제한적 예는 도 1, 도 2 및 도 3에 제시된다.
예를 들어, 도 1은 본원에 기재된 바와 같은 단일파라토프 테트라드 분자의 비제한적 구성을 예시한다. 도 1을 참조하면, 이는 2개의 scFv 부분 (50) 및 (55)을 포함하는 제2 이펙터 모이어티 (40)에 펩티드 또는 화학적 링커 (60) 및 (65)를 통해 연결된 본원에 기재된 바와 같은 Fc 분자 (30) 및 (35)에 연결된 2개의 Fab 부분 (도메인) (20) 및 (25)을 포함하는 제1 이펙터 모이어티 (10)를 도시한다. 일부 실시양태에서, 각각의 Fab 부분 (20) 및 (25) 및 각각의 scFV 분자 (50) 및 (55)는 동일한 분자 및 동일한 에피토프에 결합한다. 본원에 제공된 바와 같이, 이들은 PD-1에 결합할 수 있다. 일부 실시양태에서, FAb 및 scFV는 PD1AB4, PD1AB25, PD1AB30, PD1AB53, PD1AB37의 CDR 또는 본원에 제공된 바와 같은 임의의 다른 CDR 세트를 포함한다.
도 2는 본원에 제공된 바와 같은 이중파라토프 테트라드 분자의 비제한적 구성을 예시한다. 예를 들어, 도 2를 참조하면, 이는 2개의 scFv 분자 (50) 및 (55)를 포함하는 제2 이펙터 모이어티 (40)에 펩티드 또는 화학적 링커 (60) 및 (65)를 통해 연결된 본원에 기재된 바와 같은 Fc 분자 (30) 및 (35)에 연결된 2개의 Fab 분자 (20) 및 (25)를 포함하는 제1 이펙터 모이어티 (10)를 도시한다. 일부 실시양태에서, 각각의 Fab 부분 (도메인) (20) 및 (25) 및 각각의 scFV 부분 (50) 및 (55)은 동일한 분자에 결합하지만 상이한 에피토프에 결합한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, FAb (20) 및 FAb (25)는 표적 분자 상의 제1 에피토프에 결합하고, scFV (50) 및 (55)는 동일한 표적 분자 상의 제2 에피토프에 결합한다. 일부 실시양태에서, 에피토프는 비-중첩된다. 일부 실시양태에서, FAb (25) 및 scFv (55)는 제1 에피토프에 결합하고, FAb (20) 및 scFv (50)는 동일한 표적 분자 상의 제2 에피토프에 결합한다. 일부 실시양태에서, 각각의 FAb (20), Fab (25), scFv (50) 및 scFv (55)는 동일한 표적 분자 상의 상이한 에피토프에 결합한다. 일부 실시양태에서, FAb (20), Fab (25), scFv (50) 및 scFv (55) 중 2개는 표적 분자 상의 제1 에피토프에 결합하고, FAb (20), Fab (25), scFv (50) 및 scFv (55) 중 나머지 2개는 표적 분자 상의 제2 에피토프에 결합한다. 일부 실시양태에서, 표적 분자는 동일한 표적 분자이다. 일부 실시양태에서, 표적 분자는 상이하다. 본 개시내용 전반에 걸쳐 상이한 에피토프가 언급되는 경우에, 에피토프는 비-중첩될 수 있거나 (즉, 임의의 동일한 잔기를 공유하지 않음) 또는 이들은 중첩될 수 있다 (즉, 이들은 동일한 잔기의 일부를 공유하지만, 정확히 동일한 세트의 잔기에 결합하지는 않음). 본원에 제공된 바와 같이, 일부 실시양태에서, 상이한 에피토프는 비-중첩된다. 본원에 제공된 바와 같이, 본원에 언급된 FAb 및 scFV는 PD-1에 결합할 수 있다. 일부 실시양태에서, FAb 및 scFV는 PD1AB4, PD1AB25, PD1AB30, PD1AB53, PD1AB37의 CDR 또는 본원에 제공된 바와 같은 임의의 다른 CDR 세트를 포함한다.
도 3을 참조하면, 일부 실시양태에서, 분자의 scFv 부분 내의 가변 쇄는 디술피드 결합 (70) 및 (75)에 의해 연결된다 (예를 들어, 안정화됨). 어떠한 특정한 이론에 얽매이지는 않지만, 디술피드 결합은 scFv 포맷의 결합 도메인을 안정화시키는 것을 도울 수 있다. 일부 실시양태에서, 분자는 scFv 포맷의 도메인을 연결하는 디술피드 결합 중 1개 이상을 포함하지 않는다.
추가적으로, 도 1, 도 2 및 도 3을 참조하면, FAb 도메인은 쇄 1의 폴리펩티드의 힌지 영역에서, 예를 들어 CH1 및 CH2 도메인 사이에서 디술피드 결합에 의해 연결될 수 있다.
이펙터는, 이 용어가 본원에 사용된 경우, 면역 반응을 매개하는 엔티티, 예를 들어 세포 또는 분자, 예를 들어 가용성 또는 세포 표면 분자를 지칭한다.
본원에 사용된 이펙터 리간드 결합 분자는 이펙터 결합/조정 분자로서의 역할을 할 수 있는 충분한 특이성으로 이펙터에 결합할 수 있는, 이펙터의 자연 발생 반대 리간드로부터의 충분한 서열을 갖는 폴리펩티드를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 이는 자연 발생 반대 리간드의 친화도의 적어도 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 또는 95%로 이펙터에 결합한다. 일부 실시양태에서, 이는 이펙터에 대한 자연 발생 반대 리간드와의 적어도 60, 70, 80, 90, 95, 99 또는 100% 서열 동일성 또는 실질적인 서열 동일성을 갖는다.
본원에 사용된 상승된 위험은 장애 또는 장애의 증상의 의료 병력, 장애 또는 장애의 증상과 연관된 바이오마커, 또는 장애 또는 장애의 증상의 가족력 중 하나 이상을 갖는 대상체에서의 장애의 위험을 지칭한다.
서열 동일성, 백분율 동일성 및 관련 용어는, 이들 용어가 본원에 사용된 경우, 2개의 서열, 예를 들어 2개의 핵산 서열 또는 2개의 아미노산 또는 폴리펩티드 서열의 관련성을 지칭한다. 아미노산 서열과 관련하여, 용어 "실질적으로 동일한"은 제1 및 제2 아미노산 서열이 공통 구조적 도메인 및/또는 공통 기능적 활성을 가질 수 있도록 제1 아미노산이 제2 아미노산 서열 내의 정렬된 아미노산 잔기와 i) 동일한 또는 ii) 그의 보존적 치환인 충분한 개수 또는 최소 개수의 아미노산 잔기를 함유하는 것을 지칭하는 것으로 본원에 사용된다. 예를 들어, 아미노산 서열은 참조 서열, 예를 들어 본원에 제공된 서열에 대해 적어도 약 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 공통 구조적 도메인을 함유한다.
뉴클레오티드 서열과 관련하여, 용어 "실질적으로 동일한"은 제1 및 제2 뉴클레오티드 서열이 공통 기능적 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하거나 또는 공통 구조적 폴리펩티드 도메인 또는 공통 기능적 폴리펩티드 활성을 코딩하도록 제1 핵산 서열이 제2 핵산 서열 내의 정렬된 뉴클레오티드와 동일한 충분한 개수 또는 최소 개수의 뉴클레오티드를 함유하는 것을 지칭하는 것으로 본원에 사용된다. 예를 들어, 뉴클레오티드 서열은 참조 서열, 예를 들어 본원에 제공된 서열에 대해 적어도 약 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는다.
용어 "기능적 변이체"는 자연 발생 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖거나 또는 실질적으로 동일한 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되고 자연 발생 서열의 하나 이상의 활성을 가질 수 있는 폴리펩티드를 지칭한다.
서열들 사이의 상동성 또는 서열 동일성 (이 용어는 본원에서 상호교환가능하게 사용됨)의 계산은 하기와 같이 수행된다.
2개의 아미노산 서열 또는 2개의 핵산 서열의 퍼센트 동일성을 결정하기 위해, 서열을 최적 비교 목적을 위해 정렬한다 (예를 들어, 최적 정렬을 위해 제1 및 제2 아미노산 또는 핵산 서열 중 하나 또는 둘 다에 갭을 도입할 수 있고, 비교 목적을 위해 비-상동 서열을 무시할 수 있음). 바람직한 실시양태에서, 비교 목적을 위해 정렬된 참조 서열의 길이는 참조 서열의 길이의 적어도 30%, 바람직하게는 적어도 40%, 보다 바람직하게는 적어도 50%, 60%, 보다 더 바람직하게는 적어도 70%, 80%, 90%, 100%이다. 이어서, 상응하는 아미노산 위치 또는 뉴클레오티드 위치에서의 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드를 비교한다. 제1 서열 내의 위치가 제2 서열 내의 상응하는 위치와 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드에 의해 점유되는 경우에, 이때 분자는 그 위치에서 동일하다 (본원에 사용된 아미노산 또는 핵산 "동일성"은 아미노산 또는 핵산 "상동성"과 등가임).
2개의 서열 사이의 퍼센트 동일성은 2개의 서열의 최적 정렬을 위해 도입될 필요가 있는 갭의 수 및 각각의 갭의 길이를 고려한, 서열에 의해 공유되는 동일한 위치의 수의 함수이다.
2개의 서열 사이의 서열의 비교 및 퍼센트 동일성의 결정은 수학적 알고리즘을 사용하여 달성될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 2개의 아미노산 서열 사이의 퍼센트 동일성은 블로섬 62 매트릭스 또는 PAM250 매트릭스 및 갭 가중치 16, 14, 12, 10, 8, 6 또는 4 및 길이 가중치 1, 2, 3, 4, 5 또는 6을 사용하는 GCG 소프트웨어 패키지 (www.gcg.com에서 이용가능함) 내의 GAP 프로그램 내로 혼입된 문헌 [Needleman and Wunsch ((1970) J. Mol. Biol. 48:444-453)] 알고리즘을 사용하여 결정된다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 2개의 뉴클레오티드 서열 사이의 퍼센트 동일성은 NWSgapdna.CMP 매트릭스 및 갭 가중치 40, 50, 60, 70 또는 80 및 길이 가중치 1, 2, 3, 4, 5 또는 6을 사용하는 GCG 소프트웨어 패키지 (www.gcg.com에서 이용가능함) 내의 GAP 프로그램을 사용하여 결정된다. 특히 바람직한 파라미터 세트 (및 달리 명시되지 않는 한 사용되어야 하는 것)는 갭 페널티 12, 갭 연장 페널티 4 및 프레임시프트 갭 페널티 5를 사용하는 블로섬 62 점수화 매트릭스이다.
2개의 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열 사이의 퍼센트 동일성은 PAM120 가중치 잔기 표, 갭 길이 페널티 12 및 갭 페널티 4를 사용하는 ALIGN 프로그램 (버전 2.0) 내로 혼입된 문헌 [E. Meyers and W. Miller ((1989) CABIOS, 4:11-17)]의 알고리즘을 사용하여 결정될 수 있다.
본원에 기재된 핵산 및 단백질 서열은, 예를 들어 다른 패밀리 구성원 또는 관련 서열을 확인하기 위해 공중 데이터베이스에 대한 검색을 수행하기 위한 "질의 서열"로 사용될 수 있다. 이러한 검색은 문헌 [Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10]의 NBLAST 및 XBLAST 프로그램 (버전 2.0)을 사용하여 수행될 수 있다. BLAST 뉴클레오티드 검색을 NBLAST 프로그램, 점수 = 100, 워드길이 = 12로 수행하여, 예를 들어 본원에 제공된 임의의 핵산 서열과 상동인 뉴클레오티드 서열을 수득할 수 있다. BLAST 단백질 검색을 XBLAST 프로그램, 점수 = 50, 워드길이 = 3으로 수행하여 본원에 제공된 단백질 분자와 상동인 아미노산 서열을 수득할 수 있다. 비교 목적을 위한 갭이 있는 정렬을 수득하기 위해, 갭드 BLAST를 문헌 [Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402]에 기재된 바와 같이 이용할 수 있다. BLAST 및 갭드 BLAST 프로그램을 이용하는 경우에, 각각의 프로그램 (예를 들어, XBLAST 및 NBLAST)의 디폴트 파라미터를 사용할 수 있다. www.ncbi.nlm.nih.gov를 참조한다.
본원에 사용된 용어 "낮은 엄격도, 중간 엄격도, 높은 엄격도 또는 매우 높은 엄격도 조건 하에 혼성화한다"는 혼성화 및 세척을 위한 조건을 기재한다. 혼성화 반응을 수행하기 위한 지침은 문헌 [Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6]에서 찾아볼 수 있으며, 이는 참조로 포함된다. 수성 및 비수성 방법은 상기 참고문헌에 기재되어 있고, 어느 하나가 사용될 수 있다. 본원에서 언급되는 특정 혼성화 조건은 하기와 같다: 1) 낮은 엄격도 혼성화 조건: 약 45℃에서 6X 염화나트륨/시트르산나트륨 (SSC) 중, 이어서 적어도 50℃에서 0.2X SSC, 0.1% SDS 중 2회 세척 (세척 온도는 낮은 엄격도 조건의 경우 55℃로 증가될 수 있음); 2) 중간 엄격도 혼성화 조건: 약 45℃에서 6X SSC 중, 이어서 60℃에서 0.2X SSC, 0.1% SDS 중 1회 이상의 세척; 3) 높은 엄격도 혼성화 조건: 약 45℃에서 6X SSC 중, 이어서 65℃에서 0.2X SSC, 0.1% SDS 중 1회 이상의 세척; 및 바람직하게는 4) 매우 높은 엄격도 혼성화 조건: 65℃에서 0.5M 인산나트륨, 7% SDS 중, 이어서 65℃에서 0.2X SSC, 1% SDS 중 1회 이상의 세척. 매우 높은 엄격도 조건 (4)이 바람직한 조건 및 달리 명시되지 않는 한 사용되어야 하는 조건이다.
본 발명의 실시양태의 분자 및 화합물은 그의 기능에 대해 실질적인 효과를 갖지 않는 추가의 보존적 또는 비-필수 아미노산 치환을 가질 수 있는 것으로 이해된다.
용어 "아미노산"은 천연이든 합성이든 간에 아미노 관능기 및 산 관능기 둘 다를 포함하고 자연 발생 아미노산의 중합체에 포함될 수 있는 모든 분자를 포괄하는 것으로 의도된다. 예시적인 아미노산은 자연 발생 아미노산; 그의 유사체, 유도체 및 동종체; 변이체 측쇄를 갖는 아미노산 유사체; 및 상기 중 임의의 것의 모든 입체이성질체를 포함한다. 본원에 사용된 용어 "아미노산"은 D- 또는 L- 광학 이성질체 둘 다 및 펩티드모방체를 포함한다.
"보존적 아미노산 치환"은 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 대체된 것이다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 패밀리는 관련 기술분야에 정의되었다. 이들 패밀리는 염기성 측쇄 (예를 들어, 리신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄 (예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산), 비하전된 극성 측쇄 (예를 들어, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인), 비극성 측쇄 (예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), 베타-분지형 측쇄 (예를 들어, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄 (예를 들어, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)를 갖는 아미노산을 포함한다.
대상체는, 이 용어가 본원에 사용된 경우, 포유동물 대상체, 예를 들어 인간 대상체를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 대상체는 비-인간 포유동물, 예를 들어 말, 개, 고양이, 소, 염소 또는 돼지이다.
특이적 항-PD-1 항체가 본원에 제공되지만, 다른 항-PD-1 항체가 사용될 수 있다. 놀랍게도, 본원에 제공된 테트라드 포맷은 예측되지 않은 수준의 PD-1 효능제이고 PD-1 효능작용을 제공하는 예상밖의 능력을 제공하는 것으로 밝혀졌다. 어떠한 특정한 이론에 얽매이지는 않지만, 테트라드 이중-파라토프 포맷은 단량체 항체 또는 테트라드 단일-파라토프가 제공할 수 있는 것보다 더 큰 효능제 능력을 제공하는 것으로 생각되며, 이는 놀라운 결과였다.
PD-L1/PD-1 경로
프로그램화된 세포 사멸 단백질 1 (종종 PD-1로 지칭됨)은 이뮤노글로불린 슈퍼패밀리에 속하는 세포 표면 수용체이다. PD-1은 T 세포 및 B 세포, 골수 세포, 수지상 세포, 단핵구, T 조절 세포, iNK T 세포를 포함하나 이에 제한되지는 않는 다른 세포 유형 상에서 발현된다. PD-1은 2종의 리간드인 PD-L1 및 PD-L2에 결합하고, 억제 면역 체크포인트 분자이다. 항원 로딩된 MHC와 T 세포 상의 T 세포 수용체의 결속과 관련하여 동족 리간드인 PD-L1 또는 PD-L2와의 결속은 T 세포의 활성화 및 기능을 최소화하거나 방지한다. PD-1의 억제 효과는 림프절에서 항원 특이적 T 세포에서의 아폽토시스 (프로그램화된 세포 사멸)의 촉진 및 조절 T 세포 (억제 T 세포)에서의 아폽토시스의 감소 둘 다를 포함할 수 있다.
자가면역 장애
본원에 제공된 폴리펩티드 및 그의 사용 방법은 원치않는 자가면역 반응, 예를 들어 제1형 당뇨병, 다발성 경화증, 심근염, 백반증, 탈모증, 염증성 장 질환 (IBD, 예를 들어 크론병 또는 궤양성 결장염), 쇼그렌 증후군, 초점성 분절성 사구체 경화증 (FSGS), 경피증/전신 경화증 (SSc) 또는 류마티스 관절염에서의 자가면역 반응을 갖거나 또는 가질 위험이 있는 대상체를 치료하는 데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 치료는 자가면역 공격을 받고 있거나 그의 위험이 있는 대상체 조직의 거부를 최소화하거나, 그에 대한 면역 이펙터 세포 매개 손상을 최소화하거나, 그의 생존을 연장시킨다. 일부 실시양태에서, 장애는 전신 홍반성 루푸스 (SLE)이다.
본원에 기재된 화합물로 치료될 수 있는 자가면역 장애 및 질환의 다른 예는 심근염, 심근경색후 증후군, 심막절개술후 증후군, 아급성 박테리아 심내막염, 항-사구체 기저막 신염, 간질성 방광염, 루푸스 신염, 막성 사구체신병증, 만성 신장 질환 ("CKD"), 자가면역 간염, 원발성 담즙성 간경변증, 원발성 경화성 담관염, 항신테타제 증후군, 원형 탈모증, 자가면역 혈관부종, 자가면역 프로게스테론 피부염, 자가면역 두드러기, 수포성 유천포창, 반흔성 유천포창, 포진성 피부염, 원판상 홍반성 루푸스, 후천성 수포성 표피박리증, 결절성 홍반, 임신성 유천포창, 화농성 한선염, 편평 태선, 경화성 태선, 선상 IgA 질환 (lad), 반상경피증, 심상성 천포창, 급성 두창양 태선양 비강진, 뮈샤-하버만병, 건선, 전신 경피증, 백반증, 애디슨병, 제1형 자가면역 다발내분비 증후군 (APS), 제2형 자가면역 다발내분비 증후군 (APS), 제3형 자가면역 다발내분비 증후군 (APS), 자가면역 췌장염 (AIP), 제1형 당뇨병, 자가면역 갑상선염, 오드 갑상선염, 그레이브스병, 자가면역 난소염, 자궁내막증, 자가면역 고환염, 쇼그렌 증후군, 자가면역 장병증, 복강 질환, 크론병, 현미경적 결장염, 궤양성 결장염, 혈소판감소증, 동통성 지방증, 성인-발병 스틸병, 강직성 척추염, CREST 증후군, 약물-유발 루푸스, 골부착부염-관련 관절염, 호산구성 근막염, 펠티 증후군, IgG4-관련 질환, 소아 관절염, 라임병 (만성), 혼합 결합 조직 질환 (MCTD), 회귀성 류마티즘, 패리 롬버그 증후군, 파소네지-터너 증후군, 건선성 관절염, 반응성 관절염, 재발성 다발연골염, 복막후 섬유증, 류마티스성 열, 류마티스 관절염, 사르코이드증, 슈니츨러 증후군, 전신 홍반성 루푸스 (SLE), 미분화 결합 조직 질환 (UCTD), 피부근염, 섬유근육통, 봉입체 근염, 근염, 중증 근무력증, 신경근긴장증, 부신생물성 소뇌 변성, 다발근염, 급성 파종성 뇌척수염 (ADEM), 급성 운동 축삭 신경병증, 항-N-메틸-D-아스파르테이트 (항-NMDA) 수용체 뇌염, 발로 동심성 경화증, 비커스타프 뇌염, 만성 염증성 탈수초성 다발신경병증, 길랑-바레 증후군, 하시모토 뇌병증, 특발성 염증성 탈수초성 질환, 램버트-이튼 근무력 증후군, 다발성 경화증, 오스토란 증후군, 스트렙토코쿠스와 연관된 소아 자가면역 신경정신 장애 (PANDAS), 진행성 염증성 신경병증, 하지 불안 증후군, 강직 인간 증후군, 시데남 무도병, 횡단성 척수염, 자가면역 망막병증, 자가면역 포도막염, 코간 증후군, 그레이브스 안병증, 중간 포도막염, 목질 결막염, 무렌 궤양, 시신경척수염, 안진전 근간대성경련 증후군, 시신경염, 공막염, 수삭 증후군, 교감신경성 안염, 톨로사-헌트 증후군, 자가면역 내이 질환 (AIED), 메니에르병, 베체트병, 다발혈관염을 동반한 호산구성 육아종증 (EGPA), 거대 세포 동맥염, 다발혈관염을 동반한 육아종증 (GPA), IgA 혈관염 (IgAV), 가와사키병, 백혈구파괴성 혈관염, 루푸스 혈관염, 류마티스 혈관염, 현미경적 다발혈관염 (MPA), 결절성 다발동맥염 (PAN), 류마티스성 다발근육통, 혈관염, 원발성 면역 결핍 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
본원에 기재된 화합물로 치료될 수 있는 잠재적 자가면역 장애 및 질환 뿐만 아니라 자가면역 동반이환의 다른 예는 만성 피로 증후군, 복합 부위 통증 증후군, 호산구성 식도염, 위염, 간질성 폐 질환, POEMS 증후군, 레이노 현상, 원발성 면역결핍, 괴저성 농피증, 무감마글로불린혈증, 아밀로이드증, 근위축성 측삭 경화증, 항-세관 기저막 신염, 아토피성 알레르기, 아토피성 피부염, 자가면역 말초 신경병증, 블라우 증후군, 캐슬만병, 샤가스병, 만성 폐쇄성 폐 질환, 만성 재발성 다초점성 골수염, 보체 성분 2 결핍, 접촉성 피부염, 쿠싱 증후군, 피부 백혈구파괴성 혈관염, 데고스병, 습진, 호산구성 위장염, 호산구성 폐렴, 태아 적모구증, 진행성 골화성 섬유이형성증, 위장 유천포창, 저감마글로불린혈증, 특발성 거대 세포 심근염, 특발성 폐 섬유증, IgA 신병증, 면역조절 지단백질, IPEX 증후군, 목질 결막염, 마지드 증후군, 기면증, 라스무센 뇌염, 정신분열증, 혈청병, 척추관절병증, 스위트 증후군, 다카야스 동맥염, 뒤시엔느 근육 이영양증, 베커 근육 이영양증, 선천성 근육 이영양증, 근긴장성 이영양증, 안면견갑상완 (FHSD) 근육 이영양증, 지대 근육 이영양증, 안인두 근육 이영양증 (OPMD), 원위 근육 이영양증, 에머리-드레이푸스 근육 이영양증, 폐동맥 고혈압, 천식, 만성 비부비동염, 과민성 폐장염, 비-특이적 간질성 폐렴, 전자간증, 유산, 재발성 유산, 재생불량성 빈혈, 자가면역 호중구감소증, 자가면역 용혈성 빈혈, 암 면역요법-연관 자가면역 질환 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
일부 실시양태에서, 자가면역 장애는 심상성 천포창, 천포창을 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, 자가면역 장애는 낙엽상 천포창을 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, 자가면역 장애는 수포성 유천포창을 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, 자가면역 장애는 굿패스쳐병을 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, 자가면역 장애는 건선을 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, 자가면역 장애는 피부 장애를 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, 장애는 신생물성 장애, 예를 들어 암을 포함하지 않는다.
추가적으로, 본원에 제공된 바와 같이, TLR9 활성화는 형질세포양 수지상 세포에서의 PD-1 발현의 증가로 이어지는 것으로 밝혀졌다. CpGA에 의한 TLR9 활성화는 또한 인터페론의 생산을 증가시키는 것으로 밝혀졌다. 어떠한 특정한 이론에 얽매이는 것을 원하지는 않지만, 본원에 제공된 PD-1 효능제를 이용하는 것은 인터페론 생산의 감소로 이어졌다. 따라서, 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 화합물 및 조성물은 인터페론병증을 치료하는 데 사용될 수 있으며, 이는 PD-1이 형질세포양 수지상 세포의 표면 상에서 발현될 수 있다는 것을 밝혀낸 이전에 공지되지 않았던 놀라운 예상밖의 결과이다. 따라서, 본원에 제공된 PD-1-결합 이중파라토프 분자는 TLR9 매개 면역 반응을 조정하는 데 사용될 수 있다. 톨-유사 수용체 (TLR)는 여러 상이한 항원을 인식하고 면역학적/염증 반응, 예컨대 시토카인 생산 및 수지상 세포 및 대식세포 활성화를 개시하기 때문에 선천성 면역 반응에 필수적이다. 특히, TLR2, TLR3, TLR4, TLR7, TLR8 및 TLR9는 바이러스 또는 박테리아 리간드, 예컨대 당단백질, 단일- 또는 이중-가닥 RNA 및 비메틸화 5'-CG-3' 서열을 함유하는 폴리뉴클레오티드를 인식한다. 추가적으로, 면역자극 핵산 분자는 포유동물 TLR9 수용체와의 상호작용 및 그를 통한 신호전달을 통해 면역 반응을 자극한다 (Hemmi et al. (2002) Nat. Immunol. 3:196-200). 수지상 세포 (DC)의 별개의 하위세트인 형질세포양 수지상 세포 (PDC)는 엔도솜 TLR 활성화를 통해 바이러스 감염에 반응하여 다량의 제I형 인터페론 (IFN)을 신속하게 분비할 수 있다. 어떠한 특정한 이론에 얽매이지는 않지만, 자기-핵산에 의한 PDC 및 B 세포에서의 TLR7 및 TLR9의 촉발은 전신 홍반성 루푸스 (SLE)의 발병기전에서 핵심적이다. 이는 PDC로부터의 제I형 IFN의 생산으로 이어질 수 있으며, 이는 환자의 혈액에서 IFN-조절된 유전자 (IFN-시그너쳐) 및 죽어가는 세포로부터의 DNA 또는 RNA와 면역 복합체 (IC)를 형성하는 B 세포로부터의 항-DNA 및 항-RNP 항체의 상향조절에 의해 검출될 수 있다 (Barrat and Coffman, 2008; Marshak-Rothstein, 2006). 일단 활성화되면, PDC는 혈액으로부터 피부 및 신장을 포함한 염증발생 조직 내로 이동한다. IFN 및 PDC는 또한 IFN 시그너쳐를 특징으로 하는 다른 자가면역 질환의 발병기전에 기여하는 것으로 제안되었다. 실제로, 제I형 IFN-생산 PDC는 각각 당뇨병, 피부근염 및 쇼그렌 증후군에 의해 이환된 사람의 췌장, 근육 및 타액선에 축적되며, 이는 조절이상 PDC 활성화가 자가면역 질환의 보다 일반적인 특색일 수 있다는 것을 강하게 시사한다 (Barrat and Coffman, 2008; Guiducci et al., 2009; Ueno et al., 2007).
특정한 이론에 얽매이는 것을 원하지는 않지만, 본 개시내용은 TLR9 활성화가 또한 PDC 상의 PD-1 발현의 유도로 이어질 수 있다는 것을 발견하였다. PD-1 효능작용은 TLR9-매개 활성화의 억제 및 PDC의 이펙터 기능으로 이어질 수 있다. 일부 실시양태에서, PD-1 효능작용은 PDC에서의 IFN 생산의 감소 또는 부재로 이어질 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 분자는 PD-1 효능제이다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 PD-1 효능제는 PDC에서 TLR-9 활성을 억제할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 PD-1 효능제의 사용에 의해 매개되는 TLR-9 활성의 억제는 PDC에서의 IFN 생산의 감소 또는 결여로 이어질 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 PD-1 효능제는 인터페론병증을 치료하는 데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 인터페론병증은 제I형 인터페론병증이다. 일부 실시양태에서 제I형 인터페론병증은 에카르디-구티에레스 증후군, 양측 선조체 괴사, 지방이영양증 및 승온을 동반한 만성 비정형 호중구성 피부병 (CANDLE), 완전 비-침투, 유전성 대칭성 색각장애증, 가족성 동창 루푸스, 지방이영양증을 동반한 일본 자가염증성 증후군 (JASL), 관절 구축, 근육 위축, 소구성 빈혈, 지방층염 및 지방이영양증 (JMP), 미코박테리아 질환에 대한 멘델 감수성 (MSMD), 나카조-니시무라 증후군, 뇌 백질이영양증을 동반한 망막 혈관병증 (RVCL), 경직성 하반신부전마비, 영아기에 발병하는 STING-연관 혈관병증 (SAVI), 싱글톤-메르텐 증후군, 또는 척추연골종증 (SPENCD)이다. 본원에 사용된 용어 인터페론병증은 하기 유형의 IFN 시스템 장애: 결핍; IFN 시스템의 마비; 바이러스, 박테리아 및 돌연변이된 종양 세포에 대한 부적절한 반응; 및 제I형 IFN의 과다생산를 포함하는 선천성 또는 후천성 인터페론 시스템의 일반적 병리상태를 지칭하는 것으로 의도된다. 일부 실시양태에서, 인터페론병증은 자가면역 질환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 자가면역 질환은 전신 홍반성 루푸스 (SLE)이다.
일부 실시양태에서, 인터페론병증에 대해 치료되는 대상체는 이러한 치료를 필요로 하는 대상체이다. 즉, 대상체는 이러한 인터페론병증을 치료할 의도로 본원에 제공된 조성물 및 분자로 치료되고 있다.
일부 실시양태에서, 인터페론병증을 치료하는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 방법은 그를 필요로 하는 대상체를 포함한 대상체에게 본원에 제공된 바와 같은 분자 또는 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 형질세포양 수지상 세포로부터 인터페론의 생산을 억제하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 인터페론 생산은 본원에 제공된 파라토프 PD-1 효능제의 부재 하에 생산된 인터페론의 양과 비교하여 약 또는 적어도 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 또는 95%만큼 감소된다.
일부 실시양태에서, 인터페론의 생산을 감소시키는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 방법은 그를 필요로 하는 대상체를 포함한 대상체에게 본원에 제공된 바와 같은 분자 또는 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 일부 실시양태에서, 인터페론 생산은 본원에 제공된 파라토프 PD-1 효능제의 부재 하에 생산된 인터페론의 양과 비교하여 약 또는 적어도 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 또는 95%만큼 감소된다.
일부 실시양태에서, 대상체에서 인터페론의 TLR9 매개 생산을 억제하는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 방법은 그를 필요로 하는 대상체를 포함한 대상체에게 본원에 제공된 바와 같은 분자 또는 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 일부 실시양태에서, 인터페론 생산은 본원에 제공된 파라토프 PD-1 효능제의 부재 하에 생산된 인터페론의 양과 비교하여 약 또는 적어도 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 또는 95%만큼 감소된다.
일부 실시양태에서, TLR9 매개 장애를 치료하는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 방법은 그를 필요로 하는 대상체를 포함한 대상체에게 본원에 제공된 바와 같은 분자 또는 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, TLR9 매개 장애는 제I형 인터페론병증이다. 제I형 인터페론병증의 비제한적 예는 본원에 제공된다.
일부 실시양태에서, 환자의 혈액에서 IFN-조절된 유전자 (IFN-시그너쳐)의 상향조절을 억제하는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 일부 실시양태에서, 방법은 그를 필요로 하는 대상체를 포함한 대상체에게 본원에 제공된 바와 같은 분자 또는 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 억제되는 유전자는 OAS1, IFIT3, MX1 및/또는 IFN-β1이다.
일부 실시양태에서, 세포 또는 대상체에서 OAS1, IFIT3, MX1 및 IFN-β1의 발현을 억제하는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 방법은 대상체에게 본원에 제공된 바와 같은 폴리펩티드, 단백질 또는 항체를 투여하거나 또는 이와 세포를 접촉시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, OAS1, IFIT3, MX1 및 IFN-β1의 발현은 유전자 발현이다. 일부 실시양태에서, 세포는 형질세포양 수지상 세포이다. 일부 실시양태에서, 형질세포양 수지상 세포는 활성화된 형질세포양 수지상 세포이다. 일부 실시양태에서, 유전자의 mRNA 수준에 의해 측정 시 유전자 발현은 본원에 제공된 바와 같은 폴리펩티드, 단백질 또는 항체를 투여하지 않거나 또는 이와 접촉시키지 않은 동일한 세포 또는 대상체와 비교하여 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95%만큼 억제된다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 PD-1 효능제는 IgG4 관련 질환을 치료하는 데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, IgG4 관련 질환은 만성 염증이다. 일부 실시양태에서, IgG4 관련 질환은 복합 섬유화염증성 장애의 스펙트럼이다. 본원에 제공된 폴리펩티드는, 예를 들어 복수의 이펙터 결합/조정 모이어티를 포함할 수 있다. 임의의 적합한 링커 또는 플랫폼이 복수의 모이어티를 제시하는 데 사용될 수 있다. 링커는 전형적으로 1개 이상의 이펙터 결합/조정 모이어티에 커플링 또는 융합될 수 있다.
링커 영역
다른 곳에서 논의된 바와 같이, 이펙터 결합/조정 모이어티는 링커 영역에 의해 연결될 수 있다. 링커는 펩티드 링커 또는 화학적 링커 (예를 들어 소분자)일 수 있다. 본원에 기재된 임의의 링커 영역이 링커로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 링커는 Fc 영역을 포함할 수 있다. 이는 도 1 및 도 2에 부분적으로 예시되어 있다. 일부 실시양태에서, 치료 화합물은 자기-회합할 수 있는 링커를 포함한다. 일부 실시양태에서, 치료 화합물은 자기-회합을 최소화하는 모이어티를 갖는 링커를 포함한다. 링커는 또한 글리신/세린 링커를 포함한다. 일부 실시양태에서, 링커는 글리신/글루탐산/세린 링커이다. 일부 실시양태에서, 링커는 알라닌/글루탐산/리신 링커이다. 일부 실시양태에서, 링커는 글리신/알라닌 링커이다. 일부 실시양태에서, 링커는 GGGGS (서열식별번호: 4)의 1개 이상의 반복부를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 링커는 서열식별번호: 4 또는 서열식별번호: 8의 1, 2, 3 또는 4개의 반복부를 포함한다. 일부 실시양태에서, 링커는 GGGGS (서열식별번호: 4), GGGGSGGGGS (서열식별번호: 5), GGGGSGGGGSGGGGS (서열식별번호: 6), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (서열식별번호: 7), GGGGA (서열식별번호: 8), GGGGAGGGGA (서열식별번호: 9), GGGGAGGGGAGGGGA (서열식별번호: 10) 또는 GGGGAGGGGAGGGGAGGGGA (서열식별번호: 11)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 링커는 GGGSEGGGSEGGGSE (서열식별번호: 1)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 링커는 GGGSKGGGSKGGGSK (서열식별번호: 258)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 링커는 AEEEKAEEEKAEEEK (서열식별번호: 260)를 포함한다. 이들 링커는 본원에 제공된 임의의 치료 화합물, 폴리펩티드 또는 조성물에 사용될 수 있다.
링커 영역은 이종이량체를 생산하도록 변형된 (예를 들어, 돌연변이된) Fc 영역을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, Fc 영역의 CH3 도메인은 돌연변이될 수 있다. 이러한 Fc 영역의 예는, 예를 들어 미국 특허 번호 9,574,010에서 찾아볼 수 있으며, 이는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 본원에 정의된 바와 같은 Fc 영역은 CH3 도메인 또는 그의 단편을 포함하고, 힌지, CH1 또는 CH2를 포함한 1개 이상의 추가의 불변 영역 도메인 또는 그의 단편을 추가적으로 포함할 수 있다. Fc 아미노산 잔기의 넘버링은 문헌 [Kabat et al. 1991, NIH Publication 91-3242, National Technical Information Service, Springfield, Va]에서와 같은 EU 인덱스의 넘버링인 것으로 이해될 것이다. "카바트에 제시된 바와 같은 EU 인덱스"는 인간 IgG1 카바트 항체의 EU 인덱스 넘버링을 지칭한다. 편의상, 미국 특허 번호 9,574,010의 표 B는 인간 IgG1로부터의 CH2 및 CH3 도메인의 카바트에 제시된 바와 같은 EU 인덱스에 따라 넘버링된 아미노산을 제공하며, 이는 본원에 참조로 포함된다. 미국 특허 번호 9,574,010의 표 1.1은 링커 영역으로서 사용될 수 있는 변이체 Fc 이종이량체의 돌연변이를 제공한다. 미국 특허 번호 9,574,010의 표 1.1은 본원에 참조로 포함된다.
일부 실시양태에서, 링커는 제1 CH3 도메인 폴리펩티드 및/또는 제2 CH3 도메인 폴리펩티드를 포함하고, 제1 및 제2 CH3 도메인 폴리펩티드는 독립적으로 야생형 CH3 도메인 폴리펩티드와 비교하여 아미노산 변형을 포함하고, 여기서 제1 CH3 도메인 폴리펩티드는 위치 T350, L351, F405 및 Y407에서의 아미노산 변형을 포함하고, 제2 CH3 도메인 폴리펩티드는 위치 T350, T366, K392 및 T394에서의 아미노산 변형을 포함하고, 여기서 위치 T350에서의 아미노산 변형은 T350V, T3501, T350L 또는 T350M이고; 위치 L351에서의 아미노산 변형은 L351Y이고; 위치 F405에서의 아미노산 변형은 F405A, F405V, F405T 또는 F405S이고; 위치 Y407에서의 아미노산 변형은 Y407V, Y407A 또는 Y407I이고; 위치 T366에서의 아미노산 변형은 T366L, T366I, T366V 또는 T366M이고; 위치 K392에서의 아미노산 변형은 K392F, K392L 또는 K392M이고; 위치 T394에서의 아미노산 변형은 T394W이고, 여기서 아미노산 잔기의 넘버링은 카바트에 제시된 바와 같은 EU 인덱스에 따른다.
일부 실시양태에서, 위치 K392에서의 아미노산 변형은 K392M 또는 K392L이다. 일부 실시양태에서, 위치 T350에서의 아미노산 변형은 T350V이다. 일부 실시양태에서, 제1 CH3 도메인 폴리펩티드는 Q347R 및 S400R 또는 S400E 중 하나로부터 선택된 1개 이상의 아미노산 변형을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 CH3 도메인 폴리펩티드는 L351Y, K360E 및 N390R, N390D 또는 N390E 중 하나로부터 선택된 1개 이상의 아미노산 변형을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 CH3 도메인 폴리펩티드는 Q347R 및 S400R 또는 S400E 중 하나로부터 선택된 1개 이상의 아미노산 변형을 추가로 포함하고, 제2 CH3 도메인 폴리펩티드는 L351Y, K360E 및 N390R, N390D 또는 N390E 중 하나로부터 선택된 1개 이상의 아미노산 변형을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 위치 T350에서의 아미노산 변형은 T350V이다. 일부 실시양태에서, 위치 F405에서의 아미노산 변형은 F405A이다. 일부 실시양태에서, 위치 Y407에서의 아미노산 변형은 Y407V이다. 일부 실시양태에서, 위치 T366에서의 아미노산 변형은 T366L 또는 T366I이다. 일부 실시양태에서, 위치 F405에서의 아미노산 변형은 F405A이고, 위치 Y407에서의 아미노산 변형은 Y407V이고, 위치 T366에서의 아미노산 변형은 T366L 또는 T366I이고, 위치 K392에서의 아미노산 변형은 K392M 또는 K392L이다. 일부 실시양태에서, 제1 CH3 도메인 폴리펩티드는 아미노산 변형 T350V, L351Y, S400E, F405V 및 Y407V를 포함하고, 제2 CH3 도메인 폴리펩티드는 아미노산 변형 T350V, T366L, N390R, K392M 및 T394W를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 CH3 도메인 폴리펩티드는 아미노산 변형 T350V, L351Y, S400E, F405T 및 Y407V를 포함하고, 제2 CH3 도메인 폴리펩티드는 아미노산 변형 T350V, T366L, N390R, K392M 및 T394W를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 CH3 도메인 폴리펩티드는 아미노산 변형 T350V, L351Y, S400E, F405S 및 Y407V를 포함하고, 제2 CH3 도메인 폴리펩티드는 아미노산 변형 T350V, T366L, N390R, K392M 및 T394W를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 CH3 도메인 폴리펩티드는 아미노산 변형 T350V, L351Y, S400E, F405A 및 Y407V를 포함하고, 제2 CH3 도메인 폴리펩티드는 아미노산 변형 T350V, L351Y, T366L, N390R, K392M 및 T394W를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 CH3 도메인 폴리펩티드는 아미노산 변형 Q347R, T350V, L351Y, S400E, F405A 및 Y407V를 포함하고, 제2 CH3 도메인 폴리펩티드는 아미노산 변형 T350V, K360E, T366L, N390R, K392M 및 T394W를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 CH3 도메인 폴리펩티드는 아미노산 변형 T350V, L351Y, S400R, F405A 및 Y407V를 포함하고, 제2 CH3 도메인 폴리펩티드는 아미노산 변형 T350V, T366L, N390D, K392M 및 T394W를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 CH3 도메인 폴리펩티드는 아미노산 변형 T350V, L351Y, S400R, F405A 및 Y407V를 포함하고, 제2 CH3 도메인 폴리펩티드는 아미노산 변형 T350V, T366L, N390E, K392M 및 T394W를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 CH3 도메인 폴리펩티드는 아미노산 변형 T350V, L351Y, S400E, F405A 및 Y407V를 포함하고, 제2 CH3 도메인 폴리펩티드는 아미노산 변형 T350V, T366L, N390R, K392L 및 T394W를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 CH3 도메인 폴리펩티드는 아미노산 변형 T350V, L351Y, S400E, F405A 및 Y407V를 포함하고, 제2 CH3 도메인 폴리펩티드는 아미노산 변형 T350V, T366L, N390R, K392F 및 T394W를 포함한다.
일부 실시양태에서, 단리된 이종다량체는 제1 CH3 도메인 폴리펩티드 및 제2 CH3 도메인 폴리펩티드를 포함하는 이종이량체 CH3 도메인을 포함하고, 제1 CH3 도메인 폴리펩티드는 위치 F405 및 Y407에서의 아미노산 변형을 포함하고, 제2 CH3 도메인 폴리펩티드는 위치 T366 및 T394에서의 아미노산 변형을 포함하고, 여기서 (i) 제1 CH3 도메인 폴리펩티드는 위치 L351에서의 아미노산 변형을 추가로 포함하고, (ii) 제2 CH3 도메인 폴리펩티드는 위치 K392에서의 아미노산 변형을 추가로 포함하고, 여기서 위치 F405에서의 아미노산 변형은 F405A, F405T, F405S 또는 F405V이고; 위치 Y407에서의 아미노산 변형은 Y407V, Y407A, Y407L 또는 Y407I이고; 위치 T394에서의 아미노산 변형은 T394W이고; 위치 L351에서의 아미노산 변형은 L351Y이고; 위치 K392에서의 아미노산 변형은 K392L, K392M, K392V 또는 K392F이고, 위치 T366에서의 아미노산 변형은 T366I, T366L, T366M 또는 T366V이고, 여기서 이종이량체 CH3 도메인은 약 70℃ 이상의 용융 온도 (Tm) 및 약 90% 초과의 순도를 갖고, 여기서 아미노산 잔기의 넘버링은 카바트에 제시된 바와 같은 EU 인덱스에 따른다.
일부 실시양태에서, 링커는 제1 CH3 도메인 폴리펩티드 및/또는 제2 CH3 도메인 폴리펩티드를 포함하고, 여기서 제1 CH3 도메인 폴리펩티드는 위치 F405 및 Y407에서의 아미노산 변형을 포함하고, 제2 CH3 도메인 폴리펩티드는 위치 T366 및 T394에서의 아미노산 변형을 포함하고, 여기서 (i) 제1 CH3 도메인 폴리펩티드는 위치 L351에서의 아미노산 변형을 추가로 포함하고, (ii) 제2 CH3 도메인 폴리펩티드는 위치 K392에서의 아미노산 변형을 추가로 포함하고, 여기서 위치 F405에서의 아미노산 변형은 F405A, F405T, F405S 또는 F405V이고; 위치 Y407에서의 아미노산 변형은 Y407V, Y407A, Y407L 또는 Y407I이고; 위치 T394에서의 아미노산 변형은 T394W이고; 위치 L351에서의 아미노산 변형은 L351Y이고; 위치 K392에서의 아미노산 변형은 K392L, K392M, K392V 또는 K392F이고, 위치 T366에서의 아미노산 변형은 T366I, T366L, T366M 또는 T366V이고, 여기서 이종이량체 CH3 도메인은 약 70℃ 이상의 용융 온도 (Tm) 및 약 90% 초과의 순도를 갖고, 여기서 아미노산 잔기의 넘버링은 카바트에 제시된 바와 같은 EU 인덱스에 따른다. 일부 실시양태에서, 위치 F405에서의 아미노산 변형은 F405A이다. 일부 실시양태에서, 위치 T366에서의 아미노산 변형은 T366I 또는 T366L이다. 일부 실시양태에서, 위치 Y407에서의 아미노산 변형은 Y407V이다. 일부 실시양태에서, 위치 F405에서의 아미노산 변형은 F405A이고, 위치 Y407에서의 아미노산 변형은 Y407V이고, 위치 T366에서의 아미노산 변형은 T366I 또는 T366L이고, 위치 K392에서의 아미노산 변형은 K392L 또는 K392M이다. 일부 실시양태에서, 위치 F405에서의 아미노산 변형은 F405A이고, 위치 Y407에서의 아미노산 변형은 Y407V이고, 위치 T366에서의 아미노산 변형은 T366L이고, 위치 K392에서의 아미노산 변형은 K392M이다. 일부 실시양태에서, 위치 F405에서의 아미노산 변형은 F405A이고, 위치 Y407에서의 아미노산 변형은 Y407V이고, 위치 T366에서의 아미노산 변형은 T366L이고, 위치 K392에서의 아미노산 변형은 K392L이다. 일부 실시양태에서, 위치 F405에서의 아미노산 변형은 F405A이고, 위치 Y407에서의 아미노산 변형은 Y407V이고, 위치 T366에서의 아미노산 변형은 T366I이고, 위치 K392에서의 아미노산 변형은 K392M이다. 일부 실시양태에서, 위치 F405에서의 아미노산 변형은 F405A이고, 위치 Y407에서의 아미노산 변형은 Y407V이고, 위치 T366에서의 아미노산 변형은 T366I이고, 위치 K392에서의 아미노산 변형은 K392L이다. 일부 실시양태에서, 제1 CH3 도메인 폴리펩티드는 위치 S400D 및 S400E로부터 선택된 S400에서의 아미노산 변형을 추가로 포함하고, 제2 CH3 도메인 폴리펩티드는 아미노산 변형 N390R을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 위치 F405에서의 아미노산 변형은 F405A이고, 위치 Y407에서의 아미노산 변형은 Y405V이고, 위치 S400에서의 아미노산 변형은 S400E이고, 위치 T366에서의 아미노산 변형은 T366L이고, 위치 K392에서의 아미노산 변형은 K392M이다.
일부 실시양태에서, 변형된 제1 및 제2 CH3 도메인은 유형 G 이뮤노글로불린 (IgG)에 기초한 Fc 구축물에 포함된다. IgG는, 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4일 수 있다.
변이체 CH3 도메인을 포함하는 다른 링커는 미국 특허 번호 9,499,634 및 9,562,109에 기재되어 있으며, 이들 각각은 그 전문이 참조로 포함된다.
일부 실시양태에서, 링커는 단백질, 예를 들어 자연 발생 단백질, 예컨대 인간 혈청 알부민의 상보적 단편일 수 있다. 일부 실시양태에서, 절편화 부위는 높은 용매 접근가능한 표면적 (SASA) 및 알부민 구조의 나머지와의 제한된 접촉을 갖는 알부민 폴리펩티드의 루프 상에 존재한다. 일부 실시양태에서, 절편화는 수송체 폴리펩티드 사이에 상보적 계면을 생성한다. 이들 절편화 부위는, 예를 들어 미국 특허 번호 9,388,231에 기재되어 있으며, 이는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
일부 실시양태에서, 제1 폴리펩티드는 본원에 기재된 돌연변이 중 1개 이상을 갖는 알부민 폴리펩티드의 잔기 1-337 또는 잔기 1-293을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 폴리펩티드는 본원에 기재된 돌연변이 중 1개 이상을 갖는 알부민 폴리펩티드의 342-585 또는 304-585의 잔기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 폴리펩티드는 알부민 단백질의 잔기 1-339, 1-300, 1-364, 1-441, 1-83, 1-171, 1-281, 1-293, 1-114, 1-337 또는 1-336을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 폴리펩티드는 알부민 단백질의 잔기 301-585, 365-585, 442-585, 85-585, 172-585, 282-585 또는 115-585, 304-585, 340-585 또는 342-585를 포함한다.
일부 실시양태에서, 제1 및 제2 폴리펩티드는 하기 표에 제시된 바와 같은 알부민 단백질의 잔기를 포함한다. 알부민 단백질의 서열은 하기에 기재되어 있다.
Figure pct00001
일부 실시양태에서, 제1 및 제2 폴리펩티드는 서로 공유 결합, 예컨대 디술피드 결합을 형성할 수 있는 링커를 포함한다. 링커의 비제한적 예는 펩티드 링커이다. 일부 실시양태에서, 펩티드 링커는 GGGGS (서열식별번호: 4)를 포함한다. 링커는 제1 폴리펩티드의 C-말단 및 제2 폴리펩티드의 N-말단에 융합될 수 있다. 링커는 또한 디술피드 결합을 형성하는 링커의 능력을 제거하지 않으면서 본원에 기재된 모이어티들을 부착시키는 데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 제1 및 제2 폴리펩티드는 공유 결합을 형성할 수 있는 링커를 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, 제1 및 제2 폴리펩티드는 하기 치환을 갖는다.
Figure pct00002
알부민 폴리펩티드의 서열은 N-말단 신호전달 잔기 (MKWVTFISLLFLFSSAYSRGVFRR) (서열식별번호: 3)가 제거된 단백질-후 형태의 제시된 바와 같은 인간 알부민의 서열일 수 있다.
Figure pct00003
일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 IgG Fc 백본의 C-말단 상의 scFv와 융합된 IgG1 Fc 백본 상의 F(ab')2로 구성된 항체를 N-말단에 포함한다. 일부 실시양태에서, IgG Fc 백본은 IgG1 Fc 백본이다. 일부 실시양태에서, IgG1 백본은 IgG4 백본, IgG2 백본 또는 다른 유사한 IgG 백본으로 대체된다. 본 단락에 기재된 IgG 백본은 본 출원 전반에 걸쳐 사용될 수 있으며, 여기서 Fc 영역은 치료 화합물의 일부로서 지칭된다. 따라서, 일부 실시양태에서, IgG1 Fc 백본 상의 F(ab')2로 구성된 항체는 IgG1 Fc 또는 본원에 제공된 임의의 다른 이펙터 결합/조정 모이어티 상의 항-PD-1 항체일 수 있다. 일부 실시양태에서, N-말단 영역이 항-PD-1 항체인 경우, C-말단에 융합된 scFv 절편은 항-PD-1 항체일 수 있다. 이러한 비제한적 예에서, N-말단은 이펙터 결합/조정 모이어티, 예컨대 본원에 제공된 것 중 어느 하나일 수 있고, C-말단은 또 다른 이펙터 결합/조정 모이어티, 예컨대 본원에 제공된 것 중 어느 하나일 수 있다. 일부 실시양태에서, 이펙터 결합/조정 모이어티는 또 다른 이펙터 결합/조정 모이어티와 동일하다. 일부 실시양태에서, 이펙터 결합/조정 모이어티는 또 다른 이펙터 결합/조정 모이어티와 상이하다.
일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 N-말단에서 C-말단으로 하기 화학식을 포함한다:
(R1-Fc-R2)2,
여기서 R1은 제1 결합 도메인이고,
여기서 R2는 제2 결합 도메인이고,
여기서 R1 및 R2 중 하나는 Fab 항체이고, 다른 것은 scFv 항체이고,
여기서 R1 및 R2는 링커에 의해 연결되고,
여기서 상기 링커는 Fc 이뮤노글로불린 불변 영역, 예컨대 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4를 포함하고,
여기서 상기 링커는 G/S 또는 G/A 링커를 추가로 포함하고,
여기서 G/S 또는 G/A 링커는 (GGGGS)n (서열식별번호: 303) 또는 (GGGGA)n (서열식별번호: 304)의 서열 또는 그의 조합을 포함하며, 여기서 각각의 n은 독립적으로 1-4이다.
일부 실시양태에서, 테트라드 항체는 N-말단에서 C-말단으로 하기 화학식을 갖는다:
(R2-Fc-R1)2,
여기서 R1은 제1 결합 도메인이고,
여기서 R2는 제2 결합 도메인이고,
여기서 R1 및 R2 중 하나는 Fab 항체이고, 다른 것은 scFv 항체이고,
여기서 R1 및 R2는 링커에 의해 연결되고,
여기서 상기 링커는 Fc 이뮤노글로불린 불변 영역, 예컨대 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4를 포함하고,
여기서 상기 링커는 G/S 또는 G/A 링커를 추가로 포함하고,
여기서 G/S 또는 G/A 링커는 (GGGGS)n (서열식별번호: 303) 또는 (GGGGA)n (서열식별번호: 304)의 서열 또는 그의 조합을 포함하며, 여기서 각각의 n은 독립적으로 1-4이다.
일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 제1 링커에 의해 scFv 항체에 연결된 Fab 중쇄 도메인을 포함하는 제1 폴리펩티드 쇄 및 Fab 경쇄 (카파) 도메인을 포함하는 제2 폴리펩티드 쇄를 포함하며, 여기서 Fab 중쇄 및 경쇄는 PD-1에 결합하고, scFv 항체는 동일하거나 상이한 에피토프에서 PD-1에 결합한다. 일부 실시양태에서, 제1 링커는 Fc 이뮤노글로불린 불변 영역, 예컨대 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4를 포함하고, (GGGGS)n (서열식별번호: 303) 또는 (GGGGA)n (서열식별번호: 304)의 서열 또는 그의 조합을 추가로 포함하며, 여기서 각각의 n은 독립적으로 1-4이다. 일부 실시양태에서, scFv는 scFv 링커로 경쇄 가변 도메인에 연결된 중쇄 가변 도메인을 포함하며, 여기서 상기 scFv 링커는 (GGGGS)n (서열식별번호: 303), (GGGGA)n (서열식별번호: 304), (GGGSE)n (서열식별번호: 305), (GGGSK)n (서열식별번호: 306) 또는 (AEEEK)n (서열식별번호: 307)의 서열 또는 그의 조합을 포함하며, 여기서 각각의 n은 독립적으로 1-4이다.
서로 독립적인 제1 링커 및 scFv 링커의 서열은 동일하거나 상이할 수 있고, 본 출원 전반에 걸쳐 달리 기재된 바와 같다. 따라서, 일부 실시양태에서, 제1 링커는 GGGGS (서열식별번호: 4), GGGGSGGGGS (서열식별번호: 5), GGGGSGGGGSGGGGS (서열식별번호: 6), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (서열식별번호: 7), GGGGA (서열식별번호: 8), GGGGAGGGGA (서열식별번호: 9), GGGGAGGGGAGGGGA (서열식별번호: 10) 또는 GGGGAGGGGAGGGGAGGGGA (서열식별번호: 11)를 포함한다. 일부 실시양태에서, scFv 링커는 GGGGS (서열식별번호: 4), GGGGSGGGGS (서열식별번호: 5), GGGGSGGGGSGGGGS (서열식별번호: 6), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (서열식별번호: 7), GGGGA (서열식별번호: 8), GGGGAGGGGA (서열식별번호: 9), GGGGAGGGGAGGGGA (서열식별번호: 10) 또는 GGGGAGGGGAGGGGAGGGGA (서열식별번호: 11) 또는 GGGSEGGGSEGGGSE (서열식별번호: 1)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 링커는 GGGSKGGGSKGGGSK (서열식별번호: 258)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 링커는 AEEEKAEEEKAEEEK (서열식별번호: 260)를 포함한다.
일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 제1 폴리펩티드 쇄 및 제2 폴리펩티드 쇄를 포함하며, 여기서
제1 폴리펩티드 쇄는 N-말단에서 C-말단으로 하기 화학식을 갖고:
[VH-A]-[CH1]-[CH2]-[CH3]-[링커 1]-[VH-B]-[링커 2]-[VK-B]; 또는
[VH-A]-[CH1]-[CH2]-[CH3]-[링커 1]-[VK-B]-[링커 2]-[VH-B];
제2 폴리펩티드 쇄는 N-말단에서 C-말단으로 하기 화학식을 가지며:
[VK-A]-[CK],
여기서
VH-A = 본원에 제공된 바와 같은 PD1 항체의 가변 중쇄 도메인;
VK-A = 본원에 제공된 바와 같은 PD1 항체의 가변 경쇄 도메인;
VH-B = 본원에 제공된 바와 같은 PD1 항체의 가변 중쇄 도메인;
VK-B = 본원에 제공된 바와 같은 PD1 항체의 가변 경쇄 도메인;
CH1 = 인간 IgG1의 불변 중쇄 도메인 1
CH2 = 인간 IgG1의 불변 중쇄 도메인 2
CH3 = 인간 IgG1의 불변 중쇄 도메인 3
CK = 카파 경쇄의 불변 도메인
링커 1은 글리신/세린 또는 글리신/알라닌 링커이고,
링커 2는 글리신/세린 또는 글리신/알라닌 링커이고,
여기서 VH-A, VK-A, VH-B 및 VK-B는 동일한 항체로부터의 것이거나 또는 상이할 수 있다.
일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 제1 폴리펩티드 쇄 및 제2 폴리펩티드 쇄를 포함하며, 여기서
제1 폴리펩티드 쇄는 N-말단에서 C-말단으로 하기 화학식을 갖고:
[VH-B]-[CH1]-[CH2]-[CH3]-[링커 1]-[VH-A]-[링커 2]-[VK-A]; 또는
[VH-B]-[CH1]-[CH2]-[CH3]-[링커 1]-[VK-A]-[링커 2]-[VH-A];
제2 폴리펩티드 쇄는 N-말단에서 C-말단으로 하기 화학식을 가지며:
[VK-B]-[CK],
여기서
VH-A = 본원에 제공된 바와 같은 PD1 항체의 가변 중쇄 도메인;
VK-A = 본원에 제공된 바와 같은 PD1 항체의 가변 경쇄 도메인;
VH-B = 본원에 제공된 바와 같은 PD1 항체의 가변 중쇄 도메인;
VK-B = 본원에 제공된 바와 같은 PD1 항체의 가변 경쇄 도메인;
CH1 = 본원에 제공된 바와 같은 인간 IgG1의 불변 중쇄 도메인 1;
CH2 = 본원에 제공된 바와 같은 인간 IgG1의 불변 중쇄 도메인 2;
CH3 = 본원에 제공된 바와 같은 인간 IgG1의 불변 중쇄 도메인 3;
CK = 본원에 제공된 바와 같은 카파 경쇄의 불변 도메인;
링커 1은 글리신/세린, 글리신/글루탐산/세린, 알라닌/글루탐산/리신 또는 글리신/알라닌 링커 또는 본원에 제공된 바와 같은 다른 링커이고;
링커 2는 글리신/세린, 글리신/글루탐산/세린, 알라닌/글루탐산/리신 또는 글리신/알라닌 링커 또는 본원에 제공된 바와 같은 다른 링커이고;
여기서 VH-A, VK-A, VH-B 및 VK-B는 동일한 항체로부터의 것이거나 또는 상이할 수 있다.
일부 실시양태에서, CH1, CH2 및 CH3은 IgG Fc 영역으로부터의 도메인이다. CH1-CH2-CH3의 서열은, 예를 들어 하기와 같을 수 있다:
Figure pct00004
일부 실시양태에서, 링커 1은 1, 2, 3 또는 4개의 GGGGS (서열식별번호: 4) 및/또는 GGGGA (서열식별번호: 8) 및/또는 GGGSE (서열식별번호: 300) 반복부를 포함한다. 일부 실시양태에서, 링커 2는 1, 2, 3 또는 4개의 GGGGS (서열식별번호: 4), GGGSE (서열식별번호: 300) 및/또는 GGGGA (서열식별번호: 8) 반복부를 포함한다. 의심을 피하기 위해, 본 출원 전반에 걸쳐 사용되는 링커 1 및 링커 2의 서열은 서로 독립적이다. 따라서, 일부 실시양태에서, 링커 1 및 링커 2는 동일하거나 상이할 수 있다. 일부 실시양태에서, 링커 1은 GGGGS (서열식별번호: 4), GGGGSGGGGS (서열식별번호: 5), GGGGSGGGGSGGGGS (서열식별번호: 6), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (서열식별번호: 7), GGGGA (서열식별번호: 8), GGGGAGGGGA (서열식별번호: 9), GGGGAGGGGAGGGGA (서열식별번호: 10) 또는 GGGGAGGGGAGGGGAGGGGA (서열식별번호: 11)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 링커 2는 GGGGS (서열식별번호: 4), GGGGSGGGGS (서열식별번호: 5), GGGGSGGGGSGGGGS (서열식별번호: 6), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (서열식별번호: 7), GGGGA (서열식별번호: 8), GGGGAGGGGA (서열식별번호: 9), GGGGAGGGGAGGGGA (서열식별번호: 10), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGA (서열식별번호: 11), GGGSE (서열식별번호: 300), GGGSEGGGSE (서열식별번호: 301), GGGSEGGGSEGGGSE (서열식별번호: 1) 또는 GGGSEGGGSEGGGSEGGGSE (서열식별번호: 302)를 포함한다.
일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 경쇄 및 중쇄를 포함한다. 일부 실시양태에서, 경쇄 및 중쇄는 N-말단에서 제1 이펙터 모이어티의 VH 도메인으로 시작한 후, 인간 IgG1의 CH1 도메인이 이어지고, 이는 인간 IgG1의 Fc 영역 (예를 들어, CH2-CH3)에 융합된다. 일부 실시양태에서, Fc 영역의 C-말단은 본원에 제공된 바와 같은 링커, 예컨대 비제한적으로 GGGGS (서열식별번호: 4), GGGGSGGGGS (서열식별번호: 5), GGGGSGGGGSGGGGS (서열식별번호: 6), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (서열식별번호: 7), GGGGA (서열식별번호: 8), GGGGAGGGGA (서열식별번호: 9), GGGGAGGGGAGGGGA (서열식별번호: 10) 또는 GGGGAGGGGAGGGGAGGGGA (서열식별번호: 11), GGGSE (서열식별번호: 300), GGGSEGGGSE (서열식별번호: 301), GGGSEGGGSEGGGSE (서열식별번호: 1) 또는 GGGSEGGGSEGGGSEGGGSE (서열식별번호: 302)에 융합된다. 이어서, 링커는 제2 이펙터 모이어티, 예컨대 scFv 항체에 융합될 수 있다. 일부 실시양태에서, 제1 및 제2 이펙터 모이어티는 PD-1 항체이다. 일부 실시양태에서, PD-1 항체는 PD-1 항체 표 4로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, PD-1 항체는 PD-1 항체 표 5로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, PD-1 항체는 PD-1 항체 표 4 및 PD-1 항체 표 5로부터 선택된다. 폴리펩티드는 중쇄 동종이량체화를 통해 동종이량체화될 수 있으며, 이는 2개의 이펙터 모이어티 세트, 예컨대 2개의 항-PD-1 항체 세트를 갖는 치료 화합물을 생성한다.
일부 실시양태에서, 하기 화학식을 갖는 폴리펩티드가 제공된다:
쇄 1: FAbVH-[CH1]-[CH2]-[CH3]-[링커 1]-[scFv VK]-[링커 2]-[scFv VH]; 및/또는
쇄 2: FAbVL-CK, 여기서
FAbVH = 본원에 제공된 바와 같은 PD1 항체의 가변 중쇄 도메인;
scFv VK = 본원에 제공된 바와 같은 PD1 항체의 가변 경쇄 도메인;
scFv VH = 본원에 제공된 바와 같은 PD1 항체의 가변 중쇄 도메인;
FAbVL = 본원에 제공된 바와 같은 PD1 항체의 가변 경쇄 도메인;
CH1 = 예를 들어 본원에 제공된 바와 같은 인간 이뮤노글로불린, 예컨대 IgG1의 불변 중쇄 도메인 1;
CH2 = 예를 들어 본원에 제공된 바와 같은 인간 이뮤노글로불린, 예컨대 IgG1의 불변 중쇄 도메인 2;
CH3 = 예를 들어 본원에 제공된 바와 같은 인간 이뮤노글로불린, 예컨대 IgG1의 불변 중쇄 도메인 3;
CK = 본원에 제공된 바와 같은 카파 경쇄의 불변 도메인 또는 카파 경쇄의 불변 도메인 대신 치환될 수 있는 경쇄의 다른 불변 도메인;
링커 1은 글리신/세린, 글리신/글루탐산/세린, 알라닌/글루탐산/리신 또는 글리신/알라닌 링커 또는 본원에 제공된 바와 같은 다른 링커 (예를 들어 (GGGSE)n, 여기서 n은 1-4임)이고;
링커 2는 글리신/세린, 글리신/글루탐산/세린, 알라닌/글루탐산/리신 또는 글리신/알라닌 링커 또는 본원에 제공된 바와 같은 다른 링커 (예를 들어 (GGGSE)n, 여기서 n은 1-4임)이다.
일부 실시양태에서, 쇄 1은 하기 화학식을 갖는다: FAbVH-[CH1]-[CH2]-[CH3]-[링커 1]-[scFv VH]-[링커 2]-[scFv VK], 여기서
AbVH = 본원에 제공된 바와 같은 PD1 항체의 가변 중쇄 도메인;
scFv VK = 본원에 제공된 바와 같은 PD1 항체의 가변 경쇄 도메인;
scFv VH = 본원에 제공된 바와 같은 PD1 항체의 가변 중쇄 도메인;
FAbVL = 본원에 제공된 바와 같은 PD1 항체의 가변 경쇄 도메인;
CH1 = 예를 들어 본원에 제공된 바와 같은 인간 이뮤노글로불린, 예컨대 IgG1의 불변 중쇄 도메인 1;
CH2 = 예를 들어 본원에 제공된 바와 같은 인간 이뮤노글로불린, 예컨대 IgG1의 불변 중쇄 도메인 2;
CH3 = 예를 들어 본원에 제공된 바와 같은 인간 이뮤노글로불린, 예컨대 IgG1의 불변 중쇄 도메인 3;
CK = 본원에 제공된 바와 같은 카파 경쇄의 불변 도메인 또는 카파 경쇄의 불변 도메인 대신 치환될 수 있는 경쇄의 다른 불변 도메인;
링커 1은 글리신/세린, 글리신/글루탐산/세린, 알라닌/글루탐산/리신 또는 글리신/알라닌 링커 또는 본원에 제공된 바와 같은 다른 링커 (예를 들어 (GGGSE)n, 여기서 n은 1-4임)이고;
링커 2는 글리신/세린, 글리신/글루탐산/세린, 알라닌/글루탐산/리신 또는 글리신/알라닌 링커 또는 본원에 제공된 바와 같은 다른 링커 (예를 들어 (GGGSE)n, 여기서 n은 1-4임)이다.
일부 실시양태에서, 하기 화학식을 갖는 폴리펩티드가 제공된다:
쇄 1: [scFv VK]-[링커 2]-[scFv VH]-[링커 1]-[FAbVH]-[CH1]-[CH2]-[CH3] 및/또는
쇄 2: FAbVL-CK, 여기서
FAbVH = 본원에 제공된 바와 같은 PD1 항체의 가변 중쇄 도메인;
scFv VK = 본원에 제공된 바와 같은 PD1 항체의 가변 경쇄 도메인;
scFv VH = 본원에 제공된 바와 같은 PD1 항체의 가변 중쇄 도메인;
FAbVL = 본원에 제공된 바와 같은 PD1 항체의 가변 경쇄 도메인;
CH1 = 예를 들어 본원에 제공된 바와 같은 인간 이뮤노글로불린, 예컨대 IgG1의 불변 중쇄 도메인 1;
CH2 = 예를 들어 본원에 제공된 바와 같은 인간 이뮤노글로불린, 예컨대 IgG1의 불변 중쇄 도메인 2;
CH3 = 예를 들어 본원에 제공된 바와 같은 인간 이뮤노글로불린, 예컨대 IgG1의 불변 중쇄 도메인 3;
CK = 본원에 제공된 바와 같은 카파 경쇄의 불변 도메인 또는 카파 경쇄의 불변 도메인 대신 치환될 수 있는 경쇄의 다른 불변 도메인;
링커 1은 글리신/세린, 글리신/글루탐산/세린, 알라닌/글루탐산/리신 또는 글리신/알라닌 링커 또는 본원에 제공된 바와 같은 다른 링커 (예를 들어 (GGGSE)n, 여기서 n은 1-4임)이고;
링커 2는 글리신/세린, 글리신/글루탐산/세린, 알라닌/글루탐산/리신 또는 글리신/알라닌 링커 또는 본원에 제공된 바와 같은 다른 링커 (예를 들어 (GGGSE)n, 여기서 n은 1-4임)이다.
일부 실시양태에서, 하기 화학식을 갖는 폴리펩티드가 제공된다:
쇄 1: [scFv VH]-[링커 2]-[scFv VK]-[링커 1]-[FAbVH]-[CH1]-[CH2]-[CH3] 및/또는
쇄 2: FAbVL-CK, 여기서
FAbVH = 본원에 제공된 바와 같은 PD1 항체의 가변 중쇄 도메인;
scFv VK = 본원에 제공된 바와 같은 PD1 항체의 가변 경쇄 도메인;
scFv VH = 본원에 제공된 바와 같은 PD1 항체의 가변 중쇄 도메인;
FAbVL = 본원에 제공된 바와 같은 PD1 항체의 가변 경쇄 도메인;
CH1 = 예를 들어 본원에 제공된 바와 같은 인간 이뮤노글로불린, 예컨대 IgG1의 불변 중쇄 도메인 1;
CH2 = 예를 들어 본원에 제공된 바와 같은 인간 이뮤노글로불린, 예컨대 IgG1의 불변 중쇄 도메인 2;
CH3 = 예를 들어 본원에 제공된 바와 같은 인간 이뮤노글로불린, 예컨대 IgG1의 불변 중쇄 도메인 3;
CK = 본원에 제공된 바와 같은 카파 경쇄의 불변 도메인 또는 카파 경쇄의 불변 도메인 대신 치환될 수 있는 경쇄의 다른 불변 도메인;
링커 1은 글리신/세린, 글리신/글루탐산/세린, 알라닌/글루탐산/리신 또는 글리신/알라닌 링커 또는 본원에 제공된 바와 같은 다른 링커 (예를 들어 (GGGSE)n, 여기서 n은 1-4임)이고;
링커 2는 글리신/세린, 글리신/글루탐산/세린, 알라닌/글루탐산/리신 또는 글리신/알라닌 링커 또는 본원에 제공된 바와 같은 다른 링커 (예를 들어 (GGGSE)n, 여기서 n은 1-4임)이다.
일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 복수의 쇄 1 및 복수의 쇄 2를 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 쇄 1의 2개의 폴리펩티드 및 쇄 2의 2개의 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 쇄 1의 복수의 (예를 들어, 2개의) 폴리펩티드는 서로 연결된다. 일부 실시양태에서, 쇄 1의 복수의 (예를 들어, 2개의) 폴리펩티드는 디술피드 결합을 통해 서로 연결된다. 일부 실시양태에서, 복수의 쇄 1 폴리펩티드를 서로 연결하는 디술피드 결합은 폴리펩티드의 [CH1]-[CH2]-[CH3] 도메인을 통해 이루어진다. 일부 실시양태에서, 복수의 쇄 1 폴리펩티드를 서로 연결하는 디술피드 결합은 폴리펩티드의 [CH1]-[CH2] 도메인 사이에 존재하는 힌지 영역을 통해 이루어진다.
따라서, 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 4개의 폴리펩티드 쇄에 제공되는 4개의 결합 도메인을 포함할 수 있으며, 여기서 제1 결합 도메인은 제1 쇄 1 및 제1 쇄 2의 FAbVH 및 FAbVL에 의해 형성되고, 제2 결합 도메인은 제2 쇄 1 및 제2 쇄 2의 FAbVH 및 FAbVL에 의해 형성되고, 제3 결합 도메인은 제1 쇄 1의 [scFv VH/VK]-[링커 2]-[scFv VK/VH]에 의해 형성되고, 제4 결합 도메인은 제2 쇄 1의 [scFv VH/VK]-[링커 2]-[scFv VK/VH]에 의해 형성되어, PD-1에 결합하는 4개의 (4) 결합 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 생성한다. 일부 실시양태에서, 각각의 결합 도메인은 PD-1 효능제로서 작용한다. 일부 실시양태에서, 4개의 폴리펩티드 결합 도메인은 본원에 제공된 바와 같은 서열 또는 항체 서열을 포함한다. scFV 및 FAb 서열 (예를 들어 도메인)은, 예를 들어 본원에 제공된 바와 같다.
일부 실시양태에서, FAbVH, FAbVL, scFv VH 및 scFv VH는 본원에 제공된 바와 같은 중쇄 또는 경쇄 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, FAbVH, FAbVL, scFv VH 및 scFv VK는 본원에 제공된 바와 같은 CDR1, CDR2, CDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함한다.
일부 실시양태에서, FAbVH 및 FAbVL에 의해 형성된 결합 도메인은 scFv VK 및 scFv VH에 의해 형성된 결합 도메인과 비교하여 PD-1 상의 상이한 에피토프에 결합한다.
일부 실시양태에서, FAbVH 및 FAbVL에 의해 형성된 결합 도메인은 scFv VK 및 scFv VH에 의해 형성된 결합 도메인과 비교하여 더 높은 친화도로 PD-1에 결합한다.
일부 실시양태에서, FAbVH 및 FAbVL에 의해 형성된 결합 도메인은 scFv VK 및 scFv VH에 의해 형성된 결합 도메인과 비교하여 더 높은 친화도로 PD-1에 결합한다.
일부 실시양태에서, scFv VK 및 scFv VH는 디술피드 결합에 의해 연결된다. 이러한 실시양태의 비제한적 예는, 예를 들어 도 3 (70) 및 (75)에 예시되어 있다.
일부 실시양태에서, PD-1 항체는 하기 표로부터 선택된다:
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008
Figure pct00009
Figure pct00010
Figure pct00011
Figure pct00012
Figure pct00013
Figure pct00014
Figure pct00015
Figure pct00016
Figure pct00017
일부 실시양태에서, 항체는 PD-1 항체 표 4에 제시된 바와 같은 CDR 세트를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체는 PD-1 항체 표 4의 클론 ID: PD1AB4 또는 PD1AB30의 CDR을 포함한다.
일부 실시양태에서, FAbVH, FAbVL, scFv VH 및 scFv VH는 본원에 언급된 표에 제시된 바와 같은 CDR 세트를 포함한다.
PD-1 항체 표 4가 Fab 포맷으로 간주될 수 있는 중쇄 및 경쇄를 예시하지만, 중쇄 및 경쇄는 단일 쇄 포맷으로 중쇄 및 경쇄를 연결하기 위해 펩티드 또는 다른 유형의 링커를 사용하여 scFV 포맷으로 연결될 수 있다.
일부 실시양태에서, FAb 포맷인 PD-1 항체는 scFv 포맷인 PD-1 항체와 비교하여 PD-1에 대해 더 낮은 친화도를 갖는다. 일부 실시양태에서, FAb 포맷인 PD-1 항체는 scFv 포맷인 PD-1 항체와 비교하여 PD-1에 대해 더 높은 친화도를 갖는다. 일부 실시양태에서, 친화도는 본원에 제공된 바와 같이 약 또는 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400% 또는 500% 더 높거나 더 낮다.
일부 실시양태에서, CDR을 특징화하는 데 사용될 수 있는 상이한 포맷에 기초한 하기 클론의 CDR이 제공된다.
Figure pct00018
Figure pct00019
Figure pct00020
따라서, 일부 실시양태에서, 상기 표에 제공된 바와 같은 LCDR 세트 또는 HCDR 세트를 포함하는, PD-1에 결합하는 항체가 제공된다.
일부 실시양태에서, CDR을 특징화하는 데 사용될 수 있는 상이한 포맷에 기초한 하기 클론의 Fab CDR이 제공된다.
Figure pct00021
Figure pct00022
Figure pct00023
따라서, 일부 실시양태에서, 본원의 표에 제공된 바와 같은 Fab LCDR 세트 또는 Fab HCDR 세트를 포함하는, PD-1에 결합하는 항체가 제공된다.
일부 실시양태에서, CDR을 특징화하는 데 사용될 수 있는 상이한 포맷에 기초한 하기 클론의 scFv CDR이 제공된다.
Figure pct00024
Figure pct00025
Figure pct00026
따라서, 일부 실시양태에서, 본원의 표에 제공된 바와 같은 scFv LCDR 세트 또는 scFv HCDR 세트를 포함하는, PD-1에 결합하는 항체가 제공된다. 일부 실시양태에서, 상기 PD-1 항체 Fab 표 6 및 PD-1 항체 scFv 표 7에 제공된 바와 같은 Fab LCDR 및 Fab HCDR 세트 또는 scFv LCDR 및 scFv HCDR 세트를 포함하는, PD-1에 결합하는 항체가 제공된다.
일부 실시양태에서, PD-1 항체는 하기 표로부터 선택된 폴리펩티드를 포함한다:
Figure pct00027
Figure pct00028
Figure pct00029
Figure pct00030
Figure pct00031
Figure pct00032
Figure pct00033
Figure pct00034
Figure pct00035
일부 실시양태에서, PD-1 항체는 PD-1 항체 표 8로부터 선택된 폴리펩티드를 포함한다.
일부 실시양태에서, PD-1 항체는 하기 표로부터 선택된 폴리펩티드를 포함한다:
Figure pct00036
Figure pct00037
Figure pct00038
Figure pct00039
Figure pct00040
Figure pct00041
Figure pct00042
Figure pct00043
Figure pct00044
Figure pct00045
Figure pct00046
Figure pct00047
Figure pct00048
Figure pct00049
Figure pct00050
일부 실시양태에서, PD-1 항체는 PD-1 항체 표 9로부터 선택된 폴리펩티드를 포함한다.
일부 실시양태에서, PD-1 항체는 하기 표로부터 선택된 폴리펩티드를 포함한다:
Figure pct00051
일부 실시양태에서, PD-1 항체는 PD-1 항체 표 10으로부터 선택된 폴리펩티드를 포함한다.
일부 실시양태에서, PD-1 항체는 하기 표로부터 선택된 폴리펩티드를 포함한다:
Figure pct00052
Figure pct00053
일부 실시양태에서, PD-1 항체는 PD-1 항체 표 11로부터 선택된 폴리펩티드를 포함한다.
본원에 제공된 바와 같이, 항체 또는 폴리펩티드는 파라토프 분자를 제조하기 위해 본원의 표에 제공된 바와 같은 복수의 폴리펩티드 쇄, 예컨대 쇄 1 중 2개 및 쇄 2 중 2개를 가질 수 있다. 이들은 비제한적 예이다.
일부 실시양태에서, PD-1에 결합하는 복수의 항체를 포함하는 폴리펩티드가 제공된다. 복수의 항체는 동일하거나 상이한 CDR 영역을 갖는 1종 초과의 항체를 포함한다.
일부 실시양태에서, PD-1 항체는 PD-1 항체 표 4에 제시된 바와 같은 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체는 PD-1 항체 표 4에 예시된 바와 같은 scFV 포맷이다. 일부 실시양태에서, 항체는 PD-1 항체 표 4의 클론 중 어느 하나로부터의 CDR1, PD-1 항체 표 4의 클론 중 어느 하나로부터의 CDR2 및 PD-1 항체 표 4의 클론 중 어느 하나로부터의 CDR3을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체는 PD-1 항체 표 4의 클론 중 어느 하나로부터의 LCDR1, PD-1 항체 표 4의 클론 중 어느 하나로부터의 LCDR2 및 PD-1 항체 표 4의 클론 중 어느 하나로부터의 LCDR3을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 제시된 CDR의 아미노산 잔기는 돌연변이를 함유한다. 일부 실시양태에서, CDR은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 치환 또는 돌연변이를 함유한다. 일부 실시양태에서, 치환은 보존적 치환이다.
일부 실시양태에서, PD-1 항체는 PD-1 항체 표 4의 클론 중 어느 하나로부터 선택된 VH 영역 및 PD-1 항체 표 4에 제시된 바와 같은 클론 중 어느 하나로부터 선택된 VL 영역을 갖는다.
일부 실시양태에서, 분자는 PD-1에 결합하는 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체는 (i) 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하며, 여기서 중쇄 CDR1 서열은 PD-1 항체 표 4에 제시된 CDR1 서열 중 임의의 것의 아미노산 서열을 갖고; 중쇄 CDR2는 PD-1 항체 표 4에 제시된 CDR2 서열 중 임의의 것의 아미노산 서열을 갖고; 중쇄 CDR3은 PD-1 항체 표 4에 제시된 CDR3 서열 중 임의의 것의 아미노산 서열을 갖거나; 또는 상기 중 임의의 것의 변이체를 갖는 것인 중쇄 가변 영역; 및 (ii) 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하며, 여기서 경쇄 CDR1 서열은 PD-1 항체 표 4에 제시된 LCDR1 서열 중 임의의 것의 아미노산 서열을 갖고; 경쇄 LCDR2는 PD-1 항체 표 4에 제시된 LCDR2 서열 중 임의의 것의 아미노산 서열을 갖고; 경쇄 CDR3은 PD-1 항체 표 4에 제시된 LCDR3 서열 중 임의의 것의 아미노산 서열을 갖거나; 또는 상기 중 임의의 것의 변이체를 갖는 것인 경쇄 가변 영역을 포함한다.
일부 실시양태에서, 항체는 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하며, 여기서 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열은 PD-1 항체 표 4의 PD1AB4에 제시된 바와 같은 아미노산 서열 또는 상기 중 임의의 것의 변이체를 갖는 것인 중쇄 가변 영역; 및 (ii) 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하며, 여기서 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열은 PD-1 항체 표 4의 PD1AB4에 제시된 바와 같은 서열에 제시된 바와 같은 아미노산 서열 또는 상기 중 임의의 것의 변이체를 갖는 것인 경쇄 가변 영역을 포함한다.
일부 실시양태에서, 항체는 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하며, 여기서 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열은 PD-1 항체 표 4의 PD1AB30에 제시된 바와 같은 아미노산 서열 또는 상기 중 임의의 것의 변이체를 갖는 것인 중쇄 가변 영역; 및 (ii) 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하며, 여기서 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열은 PD-1 항체 표 4의 PD1AB30에 제시된 바와 같은 서열에 제시된 바와 같은 아미노산 서열 또는 상기 중 임의의 것의 변이체를 갖는 것인 경쇄 가변 영역을 포함한다.
이들은 비제한적 예시적인 예이고, 항체는 본원에 제공된 표에 제시된 바와 같은 CDR을 가질 수 있으며, 각각의 CDR 세트에 대한 이전 단락을 작성하지 않고도 명백하게 참조된다.
일부 실시양태에서, PD-1 항체는 본원에 제공된 바와 같은 VH 및 VL(VK) 쇄, 예컨대 PD-1 항체 표 4에 열거된 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, PD-1 항체는 PD-1 항체 Fab 표 6 및 PD-1 항체 scFv 표 7에 제시된 바와 같은 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체는 PD-1 항체 Fab 표 6에 예시된 바와 같은 Fab 포맷이다. 일부 실시양태에서, 항체는 PD-1 항체 scFv 표 7에 예시된 바와 같은 scFv 포맷이다. 일부 실시양태에서, 항체는 PD-1 항체 Fab 표 6 및 PD-1 항체 scFv 표 7의 클론 중 어느 하나로부터의 CDR1, PD-1 항체 Fab 표 6 및 PD-1 항체 scFv 표 7의 클론 중 어느 하나로부터의 CDR2 및 PD-1 항체 Fab 표 6 및 PD-1 항체 scFv 표 7의 클론 중 어느 하나로부터의 CDR3을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체는 PD-1 항체 Fab 표 6 및 PD-1 항체 scFv 표 7의 클론 중 어느 하나로부터의 LCDR1, PD-1 항체 Fab 표 6 및 PD-1 항체 scFv 표 7의 클론 중 어느 하나로부터의 LCDR2 및 PD-1 항체 Fab 표 6 및 PD-1 항체 scFv 표 7의 클론 중 어느 하나로부터의 LCDR3을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 제시된 CDR의 아미노산 잔기는 돌연변이를 함유한다. 일부 실시양태에서, CDR은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 치환 또는 돌연변이를 함유한다. 일부 실시양태에서, 치환은 보존적 치환이다.
일부 실시양태에서, PD-1 항체는 PD-1 항체 표 8 및 PD-1 항체 표 9의 클론 중 어느 하나로부터 선택된 VH 영역 및 PD-1 항체 표 8 및 PD-1 항체 표 9에 제시된 바와 같은 클론 중 어느 하나로부터 선택된 VL 영역을 갖는다.
일부 실시양태에서, 분자는 PD-1에 결합하는 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체는 (i) 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하며, 여기서 중쇄 CDR1 서열은 PD-1 항체 Fab 표 6 및 PD-1 항체 scFv 표 7에 제시된 CDR1 서열 중 임의의 것의 아미노산 서열을 갖고; 중쇄 CDR2는 PD-1 항체 Fab 표 6 및 PD-1 항체 scFv 표 7에 제시된 CDR2 서열 중 임의의 것의 아미노산 서열을 갖고; 중쇄 CDR3은 PD-1 항체 Fab 표 6 및 PD-1 항체 scFv 표 7에 제시된 CDR3 서열 중 임의의 것의 아미노산 서열을 갖거나; 또는 상기 중 임의의 것의 변이체를 갖는 것인 중쇄 가변 영역; 및 (ii) 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하며, 여기서 경쇄 CDR1 서열은 PD-1 항체 Fab 표 6 및 PD-1 항체 scFv 표 7에 제시된 LCDR1 서열 중 임의의 것의 아미노산 서열을 갖고; 경쇄 LCDR2는 PD-1 항체 Fab 표 6 및 PD-1 항체 scFv 표 7에 제시된 LCDR2 서열 중 임의의 것의 아미노산 서열을 갖고; 경쇄 CDR3은 PD-1 항체 Fab 표 6 및 PD-1 항체 scFv 표 7에 제시된 LCDR3 서열 중 임의의 것의 아미노산 서열을 갖거나; 또는 상기 중 임의의 것의 변이체를 갖는 것인 경쇄 가변 영역을 포함한다.
일부 실시양태에서, 항체는 Fab 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하며, 여기서 Fab 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열은 PD-1 항체 Fab 표 6의 PD1AB37에 제시된 바와 같은 아미노산 서열 또는 상기 중 임의의 것의 변이체를 갖는 것인 Fab 중쇄 가변 영역; 및 (ii) 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하며, 여기서 Fab 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열은 PD-1 항체 Fab 표 6의 PD1AB37에 제시된 바와 같은 서열에 제시된 바와 같은 아미노산 서열 또는 상기 중 임의의 것의 변이체를 갖는 것인 Fab 경쇄 가변 영역을 포함한다.
일부 실시양태에서, 항체는 scFv 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하며, 여기서 scFv 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열은 PD-1 항체 scFv 표 7의 PD1AB37에 제시된 바와 같은 아미노산 서열 또는 상기 중 임의의 것의 변이체를 갖는 것인 scFv 중쇄 가변 영역; 및 (ii) scFv 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하며, 여기서 scFv 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열은 PD-1 항체 scFv 표 7의 PD1AB37에 제시된 바와 같은 서열에 제시된 바와 같은 아미노산 서열 또는 상기 중 임의의 것의 변이체를 갖는 것인 scFv 경쇄 가변 영역을 포함한다.
일부 실시양태에서, 항체는 Fab 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하며, 여기서 Fab 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열은 PD-1 항체 Fab 표 6의 PD1AB53에 제시된 바와 같은 아미노산 서열 또는 상기 중 임의의 것의 변이체를 갖는 것인 Fab 중쇄 가변 영역; 및 (ii) 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하며, 여기서 Fab 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열은 PD-1 항체 Fab 표 6의 PD1AB53에 제시된 바와 같은 서열에 제시된 바와 같은 아미노산 서열 또는 상기 중 임의의 것의 변이체를 갖는 것인 Fab 경쇄 가변 영역을 포함한다.
일부 실시양태에서, 항체는 scFv 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하며, 여기서 scFv 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열은 PD-1 항체 scFv 표 7의 PD1AB53에 제시된 바와 같은 아미노산 서열 또는 상기 중 임의의 것의 변이체를 갖는 것인 scFv 중쇄 가변 영역; 및 (ii) scFv 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하며, 여기서 scFv 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열은 PD-1 항체 scFv 표 7의 PD1AB53에 제시된 바와 같은 서열에 제시된 바와 같은 아미노산 서열 또는 상기 중 임의의 것의 변이체를 갖는 것인 scFv 경쇄 가변 영역을 포함한다.
이들은 비제한적 예시적인 예이고, 항체는 본원에 제공된 표에 제시된 바와 같은 CDR을 가질 수 있으며, 각각의 CDR 세트에 대한 이전 단락을 작성하지 않고도 명백하게 참조된다.
일부 실시양태에서, PD-1 항체는 본원에 제공된 바와 같은 Fab VH 및 VL(VK) 쇄, 예컨대 PD-1 항체 표 8 및 PD-1 항체 표 9에 열거된 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, Fab VH 펩티드는 서열식별번호: 256 또는 260의 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, Fab VK 쇄는 서열식별번호: 259 또는 263의 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체는 서열식별번호: 256의 Fab VH 및 서열식별번호: 259의 Fab VK를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체는 서열식별번호: 260의 Fab VH 및 서열식별번호: 263의 Fab VK를 포함한다. 일부 실시양태에서, PD-1 항체는 본원에 제공된 바와 같은 scFv VH 및 VL(VK) 쇄, 예컨대 PD-1 항체 표 8 및 PD-1 항체 표 9에 열거된 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, scFv VH 펩티드는 서열식별번호: 257 또는 261의 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, scFv VK 쇄는 서열식별번호: 258 또는 262의 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체는 서열식별번호: 257의 scFv VH 및 서열식별번호: 258의 scFv VK를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체는 서열식별번호: 261의 scFv VH 및 서열식별번호: 262의 scFv VK를 포함한다.
일부 실시양태에서, PD-1 항체는 본원에 제공된 바와 같은 Fab VH 및 VL(VK) 및 scFv VH 및 VL(VK) 쇄, 예컨대 PD-1 항체 표 8 및 PD-1 항체 표 9에 열거된 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, Fab VH 펩티드는 서열식별번호: 256 또는 260의 서열을 포함하고, scFv VH 펩티드는 서열식별번호: 257 또는 261의 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, Fab VK 쇄는 서열식별번호: 259 또는 263의 서열을 포함하고, scFv VK 쇄는 서열식별번호: 258 또는 262의 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체는 서열식별번호: 256의 Fab VH 및 서열식별번호: 259의 Fab VK 및 서열식별번호: 257의 scFv VH 및 서열식별번호: 258의 scFv VK를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체는 서열식별번호: 260의 Fab VH 및 서열식별번호: 263의 Fab VK 및 서열식별번호: 261의 scFv VH 및 서열식별번호: 262의 scFv VK를 포함한다.
일부 실시양태에서, scFv는 N-말단에서 C-말단으로 VH 및 VL을 포함한다. 일부 실시양태에서, N-말단에서 C-말단으로 VH는 링커를 통해 VL에 연결된다. 일부 실시양태에서, 링커는 본원에 제공된 임의의 링커이다. 일부 실시양태에서, scFv는 N-말단에서 C-말단으로 VL 및 VH를 포함한다. 일부 실시양태에서, N-말단에서 C-말단으로 VL은 링커를 통해 VH에 연결된다. 일부 실시양태에서, 링커는 본원에 제공된 임의의 링커이다.
일부 실시양태에서, PD-1 항체는 PD-1 항체 표 4에 제시된 바와 같은 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체는 scFV 포맷이다. 일부 실시양태에서, 항체는 PD-1 항체 표 4의 클론 중 어느 하나로부터의 VH 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체는 PD-1 항체 표 4의 클론 중 어느 하나로부터의 VK 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 제시된 VH 또는 VK의 아미노산 잔기는 돌연변이를 함유한다. 일부 실시양태에서, VH 또는 VK는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 치환 또는 돌연변이를 함유한다. 일부 실시양태에서, 치환은 보존적 치환이다.
일부 실시양태에서, 치료 화합물이 Fc 부분을 포함하는 경우에, Fc 도메인 (부분)은 Fc 영역을 FcR에 결합할 수 없는 "무이펙터"로 만드는 돌연변이를 보유한다. Fc 영역을 무이펙터로 만드는 돌연변이는 공지되어 있다. 일부 실시양태에서, 공지된 넘버링 시스템에 따른 Fc 영역 내의 돌연변이는 K322A, L234A, L235A, G237A, L234F, L235E, N297, P331S 또는 그의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, Fc 돌연변이는 L234 및/또는 L235 및/또는 G237에서의 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, Fc 돌연변이는 L234A 및/또는 L235A 돌연변이를 포함하며, 이는 LALA 돌연변이로 지칭될 수 있다. 일부 실시양태에서, Fc 돌연변이는 L234A, L235A 및 G237A 돌연변이를 포함한다.
링커 폴리펩티드, 치료 펩티드 및 폴리펩티드 (예를 들어, 치료 화합물)를 코딩하는 핵산, 핵산 서열을 포함하는 벡터 및 핵산 또는 벡터를 포함하는 세포가 본원에 개시된다.
도 1 및 도 2에 예시된 바와 같은 FAb (20) 및 (25) 및 scFV (50) 및 (55) 도메인은 임의의 중쇄 및 경쇄 또는 CDR 서열을 단독으로 또는 표에 제시된 바와 같이 및 본원 및 상기 기재된 바와 같이 제공된 대로 포함할 수 있다.
제약 조성물 및 키트
실시양태에서, 본 발명의 실시양태는 제약상 허용되는 담체와 함께 제제화된, 본원에 제공된 치료 화합물 또는 폴리펩티드를 포함하는 조성물, 예를 들어 제약상 허용되는 조성물을 제공한다. 본원에 사용된 "제약상 허용되는 담체"는 생리학상 상용성인 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 등장화제 및 흡수 지연제 등을 포함한다.
담체는 정맥내, 근육내, 피하, 비경구, 직장, 국부, 안과, 국소, 척수 또는 표피 투여 (예를 들어, 주사 또는 주입에 의함)에 적합할 수 있다. 본원에 사용된 용어 "담체"는 화합물과 함께 투여되는 희석제, 아주반트 또는 부형제를 의미한다. 일부 실시양태에서, 제약 담체는 또한 액체, 예컨대 물 및 오일, 예컨대 석유, 동물, 식물 또는 합성 기원의 것, 예컨대 땅콩 오일, 대두 오일, 미네랄 오일, 참깨 오일 등일 수 있다. 제약 담체는 또한 염수, 아카시아 검, 젤라틴, 전분 페이스트, 활석, 케라틴, 콜로이드성 실리카, 우레아 등일 수 있다. 추가로, 보조제, 안정화제, 증점제, 윤활제 및 착색제가 사용될 수 있다. 담체는 본원에 제공된 치료 화합물을 포함하는 제약 조성물에 사용될 수 있다.
본원에 제공된 실시양태의 조성물 및 화합물은 다양한 형태일 수 있다. 이들은, 예를 들어 액체, 반고체 및 고체 투여 형태, 예컨대 액체 용액 (예를 들어, 주사가능한 및 주입가능한 용액), 분산액 또는 현탁액, 리포솜 및 좌제를 포함한다. 바람직한 형태는 의도된 투여 방식 및 치료 용도에 좌우된다. 전형적인 조성물은 주사가능한 또는 주입가능한 용액의 형태이다. 일부 실시양태에서, 투여 방식은 비경구 (예를 들어, 정맥내, 피하, 복강내, 근육내)이다. 일부 실시양태에서, 치료 분자는 정맥내 주입 또는 주사에 의해 투여된다. 또 다른 실시양태에서, 치료 분자는 근육내 또는 피하 주사에 의해 투여된다. 또 다른 실시양태에서, 치료 분자는 표적 부위에 국부로, 예를 들어 주사 또는 국소 적용에 의해 투여된다.
본원에 사용된 어구 "비경구 투여" 및 "비경구로 투여된"은 경장 및 국소 투여 이외의 다른, 통상적으로 주사에 의한 투여 방식을 의미하고, 비제한적으로 정맥내, 근육내, 동맥내, 척수강내, 피막내, 안와내, 심장내, 피내, 복강내, 경기관, 피하, 각피하, 관절내, 피막하, 지주막하, 척수내, 경막외 및 흉골내 주사 및 주입을 포함한다.
제약 조성물은 전형적으로 멸균되어야 하고, 일부 실시양태에서, 제조 및 저장 조건 하에 안정해야 한다. 조성물은 용액, 마이크로에멀젼, 분산액, 리포솜 또는 높은 치료 분자 농도에 적합한 다른 정렬된 구조로서 제제화될 수 있다. 멸균 주사가능한 용액은 요구되는 양의 활성 화합물 (즉, 치료 분자)을 필요에 따라 상기 열거된 성분 중 하나 또는 그의 조합과 함께 적절한 용매 중에 혼입시키고, 이어서 여과 멸균함으로써 제조될 수 있다. 일반적으로, 분산액은 활성 화합물을 염기성 분산 매질 및 상기 열거된 것으로부터의 필요한 다른 성분을 함유하는 멸균 비히클 내로 혼입시킴으로써 제조된다. 멸균 주사가능한 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우에, 바람직한 제조 방법은 활성 성분 플러스 그의 이전에 멸균-여과된 용액으로부터의 임의의 추가의 목적하는 성분의 분말을 생성하는 진공 건조 및 동결-건조이다. 용액의 적절한 유동성은, 예를 들어 코팅, 예컨대 레시틴의 사용에 의해, 분산액의 경우 요구되는 입자 크기의 유지에 의해 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 주사가능한 조성물의 지속 흡수는 흡수를 지연시키는 작용제, 예를 들어 모노스테아레이트 염 및 젤라틴을 조성물에 포함시킴으로써 달성될 수 있다.
통상의 기술자에 의해 인지되는 바와 같이, 투여 경로 및/또는 방식은 목적하는 결과에 따라 달라질 것이다. 특정 실시양태에서, 활성 화합물은 급속 방출에 대해 화합물을 보호할 담체와 함께, 예컨대 임플란트, 경피 패치 및 마이크로캡슐화 전달 시스템을 포함한 제어 방출 제제로 제조될 수 있다. 생분해성, 생체적합성 중합체, 예컨대 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리무수물, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르 및 폴리락트산이 사용될 수 있다. 이러한 제제의 제조를 위한 많은 방법이 특허를 받았거나 또는 일반적으로 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978]을 참조한다.
특정 실시양태에서, 치료 화합물은, 예를 들어 불활성 희석제 또는 동화성 식용 담체와 함께 경구로 투여될 수 있다. 화합물 (및 원하는 경우에, 다른 성분)은 또한 경질 또는 연질 쉘 젤라틴 캡슐에 봉입되거나, 정제로 압축되거나 또는 대상체의 식이에 직접 혼입될 수 있다. 경구 치료적 투여를 위해, 화합물은 부형제와 함께 혼입될 수 있고, 섭취가능한 정제, 협측 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭시르, 현탁액, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 사용될 수 있다. 화합물을 비경구 투여 이외의 다른 것에 의해 투여하기 위해, 화합물을 그의 불활성화를 방지하는 물질로 코팅하거나 또는 화합물을 그와 공-투여하는 것이 필요할 수 있다. 치료 조성물은 또한 관련 기술분야에 공지된 의료 장치로 투여될 수 있다.
투여 요법은 최적의 목적하는 반응 (예를 들어, 치료 반응)을 제공하도록 조정된다. 예를 들어, 단일 볼루스가 투여될 수 있거나, 여러 분할 용량이 시간에 걸쳐 투여될 수 있거나, 또는 용량이 치료 상황의 위급성에 의해 나타나는 바와 같이 비례적으로 감소 또는 증가될 수 있다. 투여의 용이성 및 투여량의 균일성을 위해 비경구 조성물을 투여 단위 형태로 제제화하는 것이 특히 유리하다. 본원에 사용된 투여 단위 형태는 치료될 대상체에 대한 단일 투여량으로서 적합한 물리적 이산 단위를 지칭하고; 각각의 단위는 요구되는 제약 담체와 함께 목적하는 치료 효과를 생성하도록 계산된 미리 결정된 양의 활성 화합물을 함유한다. 투여 단위 형태에 대한 규격은 (a) 활성 화합물의 독특한 특징 및 달성하고자 하는 특정한 치료 효과 및 (b) 개체에서의 감수성의 치료를 위해 이러한 활성 화합물을 배합하는 분야에 고유한 제한사항에 의해 지시되고, 이에 직접적으로 의존한다.
치료 화합물의 치료 또는 예방 유효량에 대한 예시적인 비제한적 범위는 0.1-30 mg/kg, 보다 바람직하게는 1-25 mg/kg이다. 치료 화합물의 투여량 및 치료 요법은 통상의 기술자에 의해 결정될 수 있다. 특정 실시양태에서, 치료 화합물은 약 1 내지 40 mg/kg, 예를 들어 1 내지 30 mg/kg, 예를 들어 약 5 내지 25 mg/kg, 약 10 내지 20 mg/kg, 약 1 내지 5 mg/kg, 1 내지 10 mg/kg, 5 내지 15 mg/kg, 10 내지 20 mg/kg, 15 내지 25 mg/kg 또는 약 3 mg/kg의 용량으로 주사에 의해 (예를 들어, 피하로 또는 정맥내로) 투여된다. 투여 스케줄은, 예를 들어 1주 1회 내지 2, 3 또는 4주마다 1회로 달라질 수 있다. 한 실시양태에서, 치료 화합물은 격주로 약 10 내지 20 mg/kg의 용량으로 투여된다. 치료 화합물은 약 35 내지 440 mg/m2, 전형적으로 약 70 내지 310 mg/m2, 보다 전형적으로 약 110 내지 130 mg/m2의 용량에 도달하도록 20 mg/분 초과, 예를 들어 20-40 mg/분 및 전형적으로 40 mg/분 이상의 비율로 정맥내 주입에 의해 투여될 수 있다. 실시양태에서, 약 110 내지 130 mg/m2의 주입 비율이 약 3 mg/kg의 수준을 달성한다. 다른 실시양태에서, 치료 화합물은 약 1 내지 100 mg/m2, 예를 들어 약 5 내지 50 mg/m2, 약 7 내지 25 mg/m2 또는 약 10 mg/m2의 용량에 도달하도록 10 mg/분 미만, 예를 들어 5 mg/분 이하의 비율로 정맥내 주입에 의해 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 치료 화합물은 약 30분의 기간에 걸쳐 주입된다. 투여량 값은 완화될 상태의 유형 및 중증도에 따라 달라질 수 있다는 것을 주목하여야 한다. 임의의 특정한 대상체에 대해, 구체적 투여 요법은 개별 필요성 및 조성물을 투여하거나 그의 투여를 감독하는 사람의 전문적인 판단에 따라 시간 경과에 따라 조정되어야 하고, 본원에 제시된 투여량 범위는 단지 예시적이며 청구된 조성물의 범주 또는 실시를 제한하는 것으로 의도되지 않는다는 것이 추가로 이해되어야 한다.
제약 조성물은 "치료 유효량" 또는 "예방 유효량"의 폴리펩티드를 포함할 수 있다. "치료 유효량"은 필요한 투여량에서 필요한 기간 동안 목적하는 치료 결과를 달성하는 데 효과적인 양을 지칭한다. 폴리펩티드의 치료 유효량은 개체의 질환 상태, 연령, 성별 및 체중 및 개체에서 목적하는 반응을 도출하는 치료 화합물의 능력과 같은 인자에 따라 달라질 수 있다. 치료 유효량은 또한 치료상 유익한 효과가 치료 분자의 임의의 독성 또는 유해 효과를 능가하는 양이다. "치료 유효 투여량"은 바람직하게는 측정가능한 파라미터, 예를 들어 면역 공격을 비치료 대상체에 비해 적어도 약 20%, 보다 바람직하게는 적어도 약 40%, 보다 더 바람직하게는 적어도 약 60%, 보다 더 바람직하게는 적어도 약 80% 억제한다. 측정가능한 파라미터, 예를 들어 면역 공격을 억제하는 화합물의 능력은 이식 거부 또는 자가면역 장애에서의 효능을 예측하는 동물 모델 시스템에서 평가될 수 있다. 대안적으로, 조성물의 이러한 특성은 숙련된 진료의에게 공지된 검정에 의해 시험관내에서 이러한 억제를 억제하는 화합물의 능력을 검사함으로써 평가될 수 있다.
"예방 유효량"은 필요한 투여량에서 필요한 기간 동안 목적하는 예방 결과를 달성하는 데 효과적인 양을 지칭한다. 전형적으로, 예방 용량은 질환 전에 또는 질환의 초기에 대상체에서 사용되기 때문에, 예방 유효량은 치료 유효량 미만일 것이다.
또한, 본원에 기재된 치료 화합물을 포함하는 키트가 실시양태의 범주 내에 있다. 키트는 사용에 대한 지침서; 다른 시약, 예를 들어 표지, 치료제 또는 치료 분자를 표지 또는 다른 치료제에 킬레이트화하거나 또는 달리 커플링시키는 데 유용한 작용제 또는 방사선보호 조성물; 투여를 위한 치료 분자를 제조하기 위한 장치 또는 다른 물질; 제약상 허용되는 담체; 및 대상체에게 투여하기 위한 장치 또는 다른 물질을 포함한 1종 이상의 다른 요소를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 실시양태는 또한 하기를 포함하나 이에 제한되지는 않는다:
1. PD-1에 결합하는 제1, 제2, 제3 및 제4 결합 도메인을 포함하는 폴리펩티드로서, 여기서 제1 및 제2 결합 도메인은 PD-1 상의 제1 에피토프에 결합하고, 제3 및 제4 결합 도메인은 PD-1 상의 제2 에피토프에 결합하고, 여기서 제1 및 제2 에피토프는 동일하지 않은 것인 폴리펩티드.
2. 실시양태 1에 있어서, PD-1 효능제인 폴리펩티드.
3. 실시양태 1에 있어서, 제1 및 제2 결합 도메인이 PD-1에 결합하는 제3 및 제4 결합 도메인과 비교하여 PD-1에 대해 더 낮은 친화도를 갖는 것인 폴리펩티드.
4. 실시양태 1에 있어서, 제1 및 제2 결합 도메인이 PD-1에 결합하는 제3 및 제4 결합과 비교하여 PD-1에 대해 더 높은 친화도를 갖는 것인 폴리펩티드.
5. 실시양태 1-4 중 어느 하나에 있어서, 제1, 제2, 제3 및 제4 결합 도메인이 PD-1에 결합하는 항체 또는 항체 단편인 폴리펩티드.
6. 실시양태 5에 있어서, 제1 및 제2 결합 도메인 항체가 Fab 포맷이고, 제3 및 제4 결합 도메인이 scFv 포맷인 폴리펩티드.
7. 실시양태 6에 있어서, Fab 포맷의 항체가 scFv 포맷의 항체와 비교하여 PD-1에 대해 더 높은 친화도를 갖는 것인 폴리펩티드.
8. 실시양태 6에 있어서, Fab 포맷의 항체가 scFv 포맷의 항체와 비교하여 PD-1에 대해 더 낮은 친화도를 갖는 것인 폴리펩티드.
9. 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 본원에 제공된 바와 같은 서열 또는 항체, 예컨대 PD1AB4, PD1AB25, PD1AB30, PD1AB53 또는 PD1AB37의 폴리펩티드 쇄 또는 단편을 포함하는 폴리펩티드.
10. PD-1에 결합하는 제1 및 제2 결합 도메인을 포함하는 폴리펩티드로서, 여기서 제1 및 제2 결합 도메인은 본원에 제시된 바와 같은 서열, 예컨대 본원에 제공된 바와 같은 PD-1 항체 표 4, PD-1 항체 표 5, PD-1 항체 표 8, PD-1 항체 표 9, PD-1 항체 표 10 또는 PD-1 항체 표 11에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 것인 폴리펩티드.
11. 실시양태 1에 있어서, PD-1에 결합하는 제3 및 제4 결합 도메인을 포함하며, 여기서 제3 결합 도메인은 제1 결합 도메인과 동일한 에피토프에 결합하고, 제4 결합 도메인은 제2 결합 도메인과 동일한 에피토프에 결합하는 것인 폴리펩티드.
12. 실시양태 11에 있어서, 제1 및 제3 결합 도메인이 동일한 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함하는 것인 폴리펩티드.
13. 실시양태 11 및 12에 있어서, 제2 및 제4 결합 도메인이 동일한 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함하는 것인 폴리펩티드.
14. 실시양태 11-13 중 어느 하나에 있어서, 제1 및 제2 결합 도메인이 상이한 폴리펩티드 서열을 포함하는 것인 폴리펩티드.
15. 실시양태 10에 있어서, 제1 및 제2 결합 도메인이 PD-1에 결합하는 항체인 폴리펩티드.
16. 실시양태 10에 있어서, 제1 및 제2 결합 도메인이 동일한 서열을 갖는 것인 폴리펩티드.
17. 실시양태 10 및 15에 있어서, 제1 및 제2 결합 도메인이 상이한 서열을 갖는 것인 폴리펩티드.
18. 실시양태 15-16에 있어서, 제1 및 제2 결합 도메인이 동일한 에피토프에 결합하는 것인 폴리펩티드.
19. 실시양태 15-16에 있어서, 제1 및 제2 결합 도메인이 상이한 에피토프에 결합하는 것인 폴리펩티드.
20. 실시양태 15-16 중 어느 하나에 있어서, 제1 결합 도메인 및 제2 결합 도메인 중 하나가 Fab 항체이고, 다른 것은 scFv 항체인 폴리펩티드.
21. 실시양태 15-20 중 어느 하나에 있어서, 제1 및 제2 결합 도메인이 링커에 의해 연결되는 것인 폴리펩티드.
22. 실시양태 21에 있어서, 링커가 이뮤노글로불린 불변 영역, 예컨대 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 불변 영역을 포함하는 것인 폴리펩티드.
23. 실시양태 21에 있어서, 링커가 IgG1의 이뮤노글로불린 불변 영역을 포함하는 것인 폴리펩티드.
24. 실시양태 21-23에 있어서, 링커가 글리신/세린, 글리신/알라닌 링커, 글리신/글루탐산/세린 또는 알라닌/글루탐산/리신을 추가로 포함하는 것인 폴리펩티드.
25. 실시양태 24에 있어서, 글리신/세린 링커가 (GGGGS)n (서열식별번호: 303), (GGGSE)n (서열식별번호: 305) 또는 (GGGGA)n (서열식별번호: 304)의 서열 또는 그의 조합을 포함하며, 여기서 각각의 n은 독립적으로 1-4인 폴리펩티드.
26. 실시양태 1 및 10에 있어서, scFv 항체에 연결된 Fab 중쇄 도메인을 포함하는 제1 폴리펩티드 쇄 및 Fab 경쇄 (카파) 도메인을 포함하는 제2 폴리펩티드 쇄를 포함하며, 여기서 Fab 중쇄 및 경쇄는 PD-1에 결합하고, scFv 항체는 동일하거나 상이한 에피토프에서 PD-1에 결합하는 것인 폴리펩티드.
27. 실시양태 26에 있어서, scFv가 scFv 링커로 경쇄 가변 도메인에 연결된 중쇄 가변 도메인을 포함하는 것인 폴리펩티드.
28. 실시양태 27에 있어서, scFV 링커가 (GGGGS)n (서열식별번호: 303), (GGGSE)n (서열식별번호: 305) 또는 (GGGGA)n (서열식별번호: 304)의 서열 또는 그의 조합을 포함하며, 여기서 각각의 n은 독립적으로 1-4인 폴리펩티드.
29. 실시양태 1-22 중 어느 하나에 있어서, 제1 결합 도메인이 PD-1 항체 표 4, PD-1 항체 표 5, PD-1 항체 표 8, PD-1 항체 표 9, PD-1 항체 표 10 또는 PD-1 항체 표 11에 제공된 바와 같은 서열을 포함하고, 제2 결합 도메인이 PD-1 항체 표 4, PD-1 항체 표 5, PD-1 항체 표 8, PD-1 항체 표 9, PD-1 항체 표 10 또는 PD-1 항체 표 11에 제공된 바와 같은 서열을 포함하는 것인 폴리펩티드.
30. 실시양태 1-28 중 어느 하나의 실시양태에 있어서, 제1 결합 도메인 및 제2 결합 도메인이 독립적으로 선택된, 본원에 제공된 바와 같은 항체 또는 그의 항원 결합 단편인 폴리펩티드.
31. 실시양태 30에 있어서, 제1 결합 도메인 및 제2 결합 도메인이 독립적으로 선택된, 하기를 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편인 폴리펩티드:
(i) 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하며, 여기서 중쇄 CDR1 서열은 PD-1 항체 표 4, PD-1 항체 표 5, PD-1 항체 Fab 표 6 또는 PD-1 항체 scFv 표 7에 제시된 CDR1 서열 중 임의의 것의 아미노산 서열을 갖고; 중쇄 CDR2는 PD-1 항체 표 4, PD-1 항체 표 5, PD-1 항체 Fab 표 6 또는 PD-1 항체 scFv 표 7에 제시된 CDR2 서열 중 임의의 것의 아미노산 서열을 갖고; 중쇄 CDR3은 PD-1 항체 표 4, PD-1 항체 표 5, PD-1 항체 Fab 표 6 또는 PD-1 항체 scFv 표 7에 제시된 CDR3 서열 중 임의의 것의 아미노산 서열을 갖거나; 또는 상기 중 임의의 것의 변이체를 갖는 것인 중쇄 가변 영역; 및
(ii) 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하며, 여기서 경쇄 CDR1 서열은 PD-1 항체 표 4, PD-1 항체 표 5, PD-1 항체 Fab 표 6 또는 PD-1 항체 scFv 표 7에 제시된 LCDR1 서열 중 임의의 것의 아미노산 서열을 갖고; 경쇄 LCDR2는 PD-1 항체 표 4, PD-1 항체 표 5, PD-1 항체 Fab 표 6 또는 PD-1 항체 scFv 표 7에 제시된 LCDR2 서열 중 임의의 것의 아미노산 서열을 갖고; 경쇄 CDR3은 PD-1 항체 표 4, PD-1 항체 표 5, PD-1 항체 Fab 표 6 또는 PD-1 항체 scFv 표 7에 제시된 LCDR3 서열 중 임의의 것의 아미노산 서열을 갖거나; 또는 상기 중 임의의 것의 변이체를 갖는 것인 경쇄 가변 영역.
32. 실시양태 30에 있어서, 제1 결합 도메인 및 제2 결합 도메인이 독립적으로 선택된 항체 또는 그의 항원 결합 단편이며, 여기서 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 PD-1 항체 표 4, PD-1 항체 표 8, PD-1 항체 표 9, PD-1 항체 표 10 또는 PD-1 항체 표 11에 제시된 바와 같은 VK 서열을 포함하는 것인 폴리펩티드.
33. 실시양태 30에 있어서, 제1 결합 도메인 및 제2 결합 도메인이 독립적으로 선택된 항체 또는 그의 항원 결합 단편이며, 여기서 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 PD-1 항체 표 4, PD-1 항체 표 8, PD-1 항체 표 9, PD-1 항체 표 10 또는 PD-1 항체 표 11에 제시된 바와 같은 VH 서열을 포함하는 것인 폴리펩티드.
34. 실시양태 30에 있어서, 제1 결합 도메인 및 제2 결합 도메인이 독립적으로 선택된 항체 또는 그의 항원 결합 단편이며, 여기서 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 본원에 제공된 PD-1 항체 표에 제시된 바와 같은 VK 서열 및 본원에 제공된 PD-1 항체 표에 제시된 바와 같은 VH 서열을 포함하는 것인 폴리펩티드.
35. 실시양태 30에 있어서, 제1 결합 도메인 및 제2 결합 도메인이 독립적으로 선택된 항체 또는 그의 항원 결합 단편이며, 여기서 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 독립적으로 PD-1 항체 표 4의 클론 ID: PD1AB4 (서열식별번호: 35), PD1AB30 (서열식별번호: 185), PD1AB17 (서열식별번호: 113), PD1AB18 (서열식별번호: 120), PD1AB20 (서열식별번호: 135), PD1AB25 (서열식별번호: 169); PD-1 항체 표 8의 PD1AB37 Fab (서열식별번호: 256), PD1AB37 scFv (서열식별번호: 257); 및 PD-1 항체 표 9의 PD1AB53 Fab (서열식별번호: 260), PD1AB53 scFv (서열식별번호: 261)의 중쇄 가변 영역을 포함하는 것인 폴리펩티드.
36. 실시양태 30에 있어서, 제1 결합 도메인 및 제2 결합 도메인이 독립적으로 선택된 항체 또는 그의 항원 결합 단편이며, 여기서 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 독립적으로 PD-1 항체 표 4의 PD1AB4, PD1AB30, PD1AB17, PD1AB18, PD1AB20, PD1AB25; PD-1 항체 Fab 표 6의 PD1AB37 또는 PD1AB53 및 PD-1 항체 scFv 표 7의 중쇄 도메인의 CDR을 포함하는 것인 폴리펩티드.
37. 실시양태 30에 있어서, 제1 결합 도메인 및 제2 결합 도메인이 독립적으로 선택된 항체 또는 그의 항원 결합 단편이며, 여기서 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 독립적으로 서열식별번호: 37, 171, 115, 122, 137, 171, 267, 238, 279의 제1 CDR; 서열식별번호: 38, 172, 116, 123, 138, 172, 229, 239의 제2 CDR; 및 서열식별번호: 39, 173, 117, 124, 139, 173, 230, 240의 제3 CDR을 포함하는 중쇄를 포함하는 것인 폴리펩티드.
38. 실시양태 30에 있어서, 제1 결합 도메인 및 제2 결합 도메인이 독립적으로 선택된 항체 또는 그의 항원 결합 단편이며, 여기서 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 독립적으로 하기를 포함하는 중쇄를 포함하는 것인 폴리펩티드:
서열식별번호: 37의 제1 CDR, 서열식별번호: 38의 제2 CDR 및 서열식별번호: 39의 제3 CDR;
서열식별번호: 171의 제1 CDR, 서열식별번호: 172의 제2 CDR 및 서열식별번호: 173의 제3 CDR;
서열식별번호: 115의 제1 CDR, 서열식별번호: 116의 제2 CDR 및 서열식별번호: 117의 제3 CDR;
서열식별번호: 122의 제1 CDR, 서열식별번호: 123의 제2 CDR 및 서열식별번호: 124의 제3 CDR;
서열식별번호: 137의 제1 CDR, 서열식별번호: 138의 제2 CDR 및 서열식별번호: 139의 제3 CDR;
서열식별번호: 267의 제1 CDR, 서열식별번호: 229의 제2 CDR 및 서열식별번호: 230의 제3 CDR;
서열식별번호: 238의 제1 CDR, 서열식별번호: 239의 제2 CDR 및 서열식별번호: 240의 제3 CDR;
서열식별번호: 279의 제1 CDR, 서열식별번호: 239의 제2 CDR 및 서열식별번호: 240의 제3 CDR; 또는
서열식별번호: 267의 제1 CDR, 서열식별번호: 229의 제2 CDR 및 서열식별번호: 230의 제3 CDR.
39. 실시양태 30 및 35-38에 있어서, 제1 결합 도메인 및 제2 결합 도메인이 독립적으로 선택된 항체 또는 그의 항원 결합 단편이며, 여기서 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 독립적으로 PD-1 항체 표 4의 클론 ID: PD1AB4 (서열식별번호: 36), PD1AB30 (서열식별번호: 170), PD1AB17 (서열식별번호: 114), PD1AB18 (서열식별번호: 121), PD1AB20 (서열식별번호: 136), PD1AB25 (서열식별번호: 170); PD-1 항체 표 8의 PD1AB37 Fab (서열식별번호: 259), PD1AB37 scFv (서열식별번호: 258); 및 PD-1 항체 표 9의 PD1AB53 Fab (서열식별번호: 263), PD1AB53 scFv (서열식별번호: 262)의 경쇄 가변 영역을 포함하는 것인 폴리펩티드.
40. 실시양태 30 및 35-38에 있어서, 제1 결합 도메인 및 제2 결합 도메인이 독립적으로 선택된 항체 또는 그의 항원 결합 단편이며, 여기서 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 독립적으로 PD-1 항체 표 4의 PD1AB4, PD1AB30, PD1AB17, PD1AB18, PD1AB20 또는 PD1AB25; PD-1 항체 Fab 표 6의 PD1AB37 또는 PD1AB53 및 PD-1 항체 scFv 표 7의 경쇄 도메인의 CDR을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 것인 폴리펩티드.
41. 실시양태 30 및 35-38에 있어서, 제1 결합 도메인 및 제2 결합 도메인이 독립적으로 선택된 항체 또는 그의 항원 결합 단편이며, 여기서 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 독립적으로 서열식별번호: 40, 118, 125, 140, 174, 276의 제1 CDR; 서열식별번호: 19, 126, 47, 175, 227, 237의 제2 CDR 및 서열식별번호: 41, 119, 127, 141, 176의 제3 CDR을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 것인 폴리펩티드.
42. 실시양태 30 및 35-38에 있어서, 제1 결합 도메인 및 제2 결합 도메인이 독립적으로 선택된 항체 또는 그의 항원 결합 단편이며, 여기서 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 독립적으로 하기를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 것인 폴리펩티드:
서열식별번호: 40의 제1 CDR, 서열식별번호: 19의 제2 CDR 및 서열식별번호: 41의 제3 CDR;
서열식별번호: 118의 제1 CDR, 서열식별번호: 19의 제2 CDR 및 서열식별번호: 119의 제3 CDR;
서열식별번호: 125의 제1 CDR, 서열식별번호: 126의 제2 CDR 및 서열식별번호: 127의 제3 CDR;
서열식별번호: 140의 제1 CDR, 서열식별번호: 47의 제2 CDR 및 서열식별번호: 141의 제3 CDR;
서열식별번호: 174의 제1 CDR, 서열식별번호: 175의 제2 CDR 및 서열식별번호: 176의 제3 CDR;
서열식별번호: 174의 제1 CDR, 서열식별번호: 227의 제2 CDR 및 서열식별번호: 176의 제3 CDR;
서열식별번호: 40의 제1 CDR, 서열식별번호: 237의 제2 CDR 및 서열식별번호: 41의 제3 CDR;
서열식별번호: 276의 제1 CDR, 서열식별번호: 237의 제2 CDR 및 서열식별번호: 41의 제3 CDR; 또는
서열식별번호: 174의 제1 CDR, 서열식별번호: 227의 제2 CDR 및 서열식별번호: 176의 제3 CDR.
43. 실시양태 30 및 35-38에 있어서, 제1 결합 도메인 및 제2 결합 도메인이 독립적으로 선택된 항체 또는 그의 항원 결합 단편이며, 여기서 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 독립적으로 하기를 포함하는 것인 폴리펩티드:
서열식별번호: 37의 제1 CDR, 서열식별번호: 38의 제2 CDR 및 서열식별번호: 39의 제3 CDR을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열식별번호: 40의 제1 CDR, 서열식별번호: 19의 제2 CDR 및 서열식별번호: 41의 제3 CDR을 포함하는 경쇄 가변 영역;
서열식별번호: 171의 제1 CDR, 서열식별번호: 172의 제2 CDR 및 서열식별번호: 173의 제3 CDR을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열식별번호: 174의 제1 CDR, 서열식별번호: 175의 제2 CDR 및 서열식별번호: 176의 제3 CDR을 포함하는 경쇄 가변 영역;
서열식별번호: 115의 제1 CDR, 서열식별번호: 116의 제2 CDR 및 서열식별번호: 117의 제3 CDR을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열식별번호: 118의 제1 CDR, 서열식별번호: 19의 제2 CDR 및 서열식별번호: 119의 제3 CDR을 포함하는 경쇄 가변 영역;
서열식별번호: 122의 제1 CDR, 서열식별번호: 123의 제2 CDR 및 서열식별번호: 124의 제3 CDR을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열식별번호: 125의 제1 CDR, 서열식별번호: 126의 제2 CDR 및 서열식별번호: 127의 제3 CDR을 포함하는 경쇄 가변 영역;
서열식별번호: 137의 제1 CDR, 서열식별번호: 138의 제2 CDR 및 서열식별번호: 139의 제3 CDR을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열식별번호: 140의 제1 CDR, 서열식별번호: 47의 제2 CDR 및 서열식별번호: 141의 제3 CDR을 포함하는 경쇄 가변 영역;
서열식별번호: 171의 제1 CDR, 서열식별번호: 172의 제2 CDR 및 서열식별번호: 173의 제3 CDR을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열식별번호: 174의 제1 CDR, 서열식별번호: 175의 제2 CDR 및 서열식별번호: 176의 제3 CDR을 포함하는 경쇄 가변 영역;
서열식별번호: 267의 제1 CDR, 서열식별번호: 229의 제2 CDR 및 서열식별번호: 230의 제3 CDR을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열식별번호: 174의 제1 CDR, 서열식별번호: 227의 제2 CDR 및 서열식별번호: 176의 제3 CDR을 포함하는 경쇄 가변 영역;
서열식별번호: 238의 제1 CDR, 서열식별번호: 239의 제2 CDR 및 서열식별번호: 240의 제3 CDR을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열식별번호: 40의 제1 CDR, 서열식별번호: 237의 제2 CDR 및 서열식별번호: 41의 제3 CDR을 포함하는 경쇄 가변 영역;
서열식별번호: 279의 제1 CDR, 서열식별번호: 239의 제2 CDR 및 서열식별번호: 240의 제3 CDR을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열식별번호: 276의 제1 CDR, 서열식별번호: 237의 제2 CDR 및 서열식별번호: 41의 제3 CDR을 포함하는 경쇄 가변 영역; 또는
서열식별번호: 267의 제1 CDR, 서열식별번호: 229의 제2 CDR 및 서열식별번호: 230의 제3 CDR을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열식별번호: 174의 제1 CDR, 서열식별번호: 227의 제2 CDR 및 서열식별번호: 176의 제3 CDR을 포함하는 경쇄 가변 영역.
44. 실시양태 30 및 35-38에 있어서, 제1 결합 도메인 및 제2 결합 도메인이 독립적으로 선택된 항체 또는 그의 항원 결합 단편이며, 여기서 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 독립적으로 서열식별번호: 35, 서열식별번호: 185, 서열식별번호: 113, 서열식별번호: 120, 서열식별번호: 135, 서열식별번호: 169, 서열식별번호: 256, 서열식별번호: 257, 서열식별번호: 260 또는 서열식별번호: 261의 서열을 포함하는 중쇄 및 서열식별번호: 36, 서열식별번호: 170, 서열식별번호: 114, 서열식별번호: 121, 서열식별번호: 136, 서열식별번호: 170, 서열식별번호: 259, 서열식별번호: 258, 서열식별번호: 263 또는 서열식별번호: 262의 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 것인 폴리펩티드.
45. 실시양태 30 및 35-38에 있어서, 제1 결합 도메인 및 제2 결합 도메인이 독립적으로 선택된 항체 또는 그의 항원 결합 단편이며, 여기서 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 독립적으로 하기를 포함하는 것인 폴리펩티드:
서열식별번호: 35의 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열식별번호: 36의 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
서열식별번호: 113의 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열식별번호: 114의 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
서열식별번호: 120의 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열식별번호: 121의 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
서열식별번호: 135의 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열식별번호: 136의 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
서열식별번호: 169의 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열식별번호: 170의 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역,
서열식별번호: 185의 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열식별번호: 170의 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역,
서열식별번호: 256의 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열식별번호: 259의 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
서열식별번호: 257의 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열식별번호: 258의 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
서열식별번호: 260의 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열식별번호: 263의 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 또는
서열식별번호: 261의 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열식별번호: 262의 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역.
46. 실시양태 1 및 10에 있어서, 제1 폴리펩티드 쇄 및 제2 폴리펩티드 쇄를 포함하며, 여기서 하기인 폴리펩티드:
제1 폴리펩티드 쇄는 N-말단에서 C-말단으로 하기 화학식을 갖고:
[VH-A]-[CH1]-[CH2]-[CH3]-[링커 1]-[VH-B]-[링커 2]-[VK-B]; 또는
[VH-A]-[CH1]-[CH2]-[CH3]-[링커 1]-[VK-B]-[링커 2]-[VH-B];
제2 폴리펩티드 쇄는 N-말단에서 C-말단으로 하기 화학식을 가지며:
[VK-A]-[CK],
여기서
VH-A = 본원에 제공된 바와 같은 PD1 항체의 가변 중쇄 도메인;
VK-A = 본원에 제공된 바와 같은 PD1 항체의 가변 경쇄 도메인;
VH-B = 본원에 제공된 바와 같은 PD1 항체의 가변 중쇄 도메인;
VK-B = 본원에 제공된 바와 같은 PD1 항체의 가변 경쇄 도메인;
CH1 = 인간 IgG1의 불변 중쇄 도메인 1
CH2 = 인간 IgG1의 불변 중쇄 도메인 2
CH3 = 인간 IgG1의 불변 중쇄 도메인 3
CK = 카파 경쇄의 불변 도메인
링커 1은 글리신/세린, 글리신/알라닌, 글리신/글루탐산/세린 또는 알라닌/글루탐산/리신 링커이고,
링커 2는 글리신/세린, 글리신/알라닌, 글리신/글루탐산/세린 또는 알라닌/글루탐산/리신 링커이고,
여기서 VH-A, VK-A, VH-B 및 VK-B는 동일한 항체로부터의 것이거나 또는 상이할 수 있다.
47. 실시양태 1 및 10에 있어서, 제1 폴리펩티드 쇄 및 제2 폴리펩티드 쇄를 포함하며, 여기서 하기인 폴리펩티드:
제1 폴리펩티드 쇄는 N-말단에서 C-말단으로 하기 화학식을 갖고:
[VH-B]-[CH1]-[CH2]-[CH3]-[링커 1]-[VH-A]-[링커 2]-[VK-A]; 또는
[VH-B]-[CH1]-[CH2]-[CH3]-[링커 1]-[VK-A]-[링커 2]-[VH-A];
제2 폴리펩티드 쇄는 N-말단에서 C-말단으로 하기 화학식을 가지며:
[VK-B]-[CK],
여기서
VH-A = 본원에 제공된 바와 같은 PD1 항체의 가변 중쇄 도메인;
VK-A = 본원에 제공된 바와 같은 PD1 항체의 가변 경쇄 도메인;
VH-B = 본원에 제공된 바와 같은 PD1 항체의 가변 중쇄 도메인;
VK-B = 본원에 제공된 바와 같은 PD1 항체의 가변 경쇄 도메인;
CH1 = 본원에 제공된 바와 같은 인간 IgG1의 불변 중쇄 도메인 1;
CH2 = 본원에 제공된 바와 같은 인간 IgG1의 불변 중쇄 도메인 2;
CH3 = 본원에 제공된 바와 같은 인간 IgG1의 불변 중쇄 도메인 3;
CK = 본원에 제공된 바와 같은 카파 경쇄의 불변 도메인;
링커 1은 글리신/세린, 글리신/알라닌, 글리신/글루탐산/세린 또는 알라닌/글루탐산/리신 링커이고;
링커 2는 글리신/세린, 글리신/알라닌, 글리신/글루탐산/세린 또는 알라닌/글루탐산/리신 링커이고;
여기서 VH-A, VK-A, VH-B 및 VK-B는 동일한 항체로부터의 것이거나 또는 상이할 수 있다.
48. 실시양태 46 또는 47에 있어서, VH-A 및 VH-B가 독립적으로 하기를 포함하는 것인 폴리펩티드:
(i) 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하며, 여기서 중쇄 CDR1 서열은 PD-1 항체 표 4, PD-1 항체 표 5, PD-1 항체 Fab 표 6 또는 PD-1 항체 scFv 표 7에 제시된 CDR1 서열 중 임의의 것의 아미노산 서열을 갖고; 중쇄 CDR2는 PD-1 항체 표 4, PD-1 항체 표 5, PD-1 항체 Fab 표 6 또는 PD-1 항체 scFv 표 7에 제시된 CDR2 서열 중 임의의 것의 아미노산 서열을 갖고; 중쇄 CDR3은 PD-1 항체 표 4, PD-1 항체 표 5, PD-1 항체 Fab 표 6 또는 PD-1 항체 scFv 표 7에 제시된 CDR3 서열 중 임의의 것의 아미노산 서열을 갖거나; 또는 상기 중 임의의 것의 변이체를 갖는 것인 중쇄 가변 영역.
49. 실시양태 48에 있어서, VH-A 및 VH-B가 상이한 것인 폴리펩티드.
50. 실시양태 46-49 중 어느 하나에 있어서, VH-A가 서열식별번호: 37의 제1 CDR, 서열식별번호: 38의 제2 CDR 및 서열식별번호: 39의 제3 CDR을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 것인 폴리펩티드.
51. 실시양태 46-49 중 어느 하나에 있어서, VH-B가 서열식별번호: 37의 제1 CDR, 서열식별번호: 38의 제2 CDR 및 서열식별번호: 39의 제3 CDR을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 것인 폴리펩티드.
52. 제46항에 있어서, VH-A가 서열식별번호: 37의 제1 CDR, 서열식별번호: 38의 제2 CDR 및 서열식별번호: 39의 제3 CDR을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하고, VH-B가 서열식별번호: 37의 제1 CDR, 서열식별번호: 38의 제2 CDR 및 서열식별번호: 39의 제3 CDR을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 것인 폴리펩티드.
53. 실시양태 46-49 중 어느 하나에 있어서, VH-A가 서열식별번호: 171의 제1 CDR, 서열식별번호: 172의 제2 CDR 및 서열식별번호: 173의 제3 CDR을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 것인 폴리펩티드.
54. 실시양태 46-49 중 어느 하나에 있어서, VH-B가 서열식별번호: 171의 제1 CDR, 서열식별번호: 172의 제2 CDR 및 서열식별번호: 173의 제3 CDR을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 것인 폴리펩티드.
55. 실시양태 46-49 중 어느 하나에 있어서, VH-A가 서열식별번호: 267의 제1 CDR, 서열식별번호: 229의 제2 CDR 및 서열식별번호: 230의 제3 CDR을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 것인 폴리펩티드.
56. 실시양태 46-49 중 어느 하나에 있어서, VH-B가 서열식별번호: 267의 제1 CDR, 서열식별번호: 229의 제2 CDR 및 서열식별번호: 230의 제3 CDR을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 것인 폴리펩티드.
57. 실시양태 46-49 중 어느 하나에 있어서, VH-A가 서열식별번호: 238의 제1 CDR, 서열식별번호: 239의 제2 CDR 및 서열식별번호: 240의 제3 CDR을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 것인 폴리펩티드.
58. 실시양태 46-49 중 어느 하나에 있어서, VH-B가 서열식별번호: 238의 제1 CDR, 서열식별번호: 239의 제2 CDR 및 서열식별번호: 240의 제3 CDR을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 것인 폴리펩티드.
59. 실시양태 46-49 중 어느 하나에 있어서, VH-A가 서열식별번호: 279의 제1 CDR, 서열식별번호: 239의 제2 CDR 및 서열식별번호: 240의 제3 CDR을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 것인 폴리펩티드.
60. 실시양태 46-49 중 어느 하나에 있어서, VH-B가 서열식별번호: 279의 제1 CDR, 서열식별번호: 239의 제2 CDR 및 서열식별번호: 240의 제3 CDR을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 것인 폴리펩티드.
61. 실시양태 46-49 중 어느 하나에 있어서, VH-A가 서열식별번호: 267의 제1 CDR, 서열식별번호: 229의 제2 CDR 및 서열식별번호: 230의 제3 CDR을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 것인 폴리펩티드.
62. 실시양태 46-49 중 어느 하나에 있어서, VH-B가 서열식별번호: 267의 제1 CDR, 서열식별번호: 229의 제2 CDR 및 서열식별번호: 230의 제3 CDR을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 것인 폴리펩티드.
63. 46-49에 있어서, VH-A가 서열식별번호: 279의 제1 CDR, 서열식별번호: 239의 제2 CDR 및 서열식별번호: 240의 제3 CDR을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하고, VH-B가 서열식별번호: 267의 제1 CDR, 서열식별번호: 229의 제2 CDR 및 서열식별번호: 230의 제3 CDR을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 것인 폴리펩티드.
64. 46-49에 있어서, VH-A가 서열식별번호: 267의 제1 CDR, 서열식별번호: 229의 제2 CDR 및 서열식별번호: 230의 제3 CDR을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하고, VH-B가 서열식별번호: 238의 제1 CDR, 서열식별번호: 239의 제2 CDR 및 서열식별번호: 240의 제3 CDR을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 것인 폴리펩티드.
65. 실시양태 46-63 중 어느 하나에 있어서, VK-A 및 VK-B가 각각 독립적으로 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하며, 여기서 경쇄 CDR1 서열은 PD-1 항체 표 4, PD-1 항체 표 5, PD-1 항체 Fab 표 6 또는 PD-1 항체 scFv 표 7에 제시된 LCDR1 서열 중 임의의 것의 아미노산 서열을 갖고; 경쇄 LCDR2는 PD-1 항체 표 4, PD-1 항체 표 5, PD-1 항체 Fab 표 6 또는 PD-1 항체 scFv 표 7에 제시된 LCDR2 서열 중 임의의 것의 아미노산 서열을 갖고; 경쇄 CDR3은 PD-1 항체 표 4, PD-1 항체 표 5, PD-1 항체 Fab 표 6 또는 PD-1 항체 scFv 표 7에 제시된 LCDR3 서열 중 임의의 것의 아미노산 서열을 갖거나; 또는 상기 중 임의의 것의 변이체를 갖는 것인 폴리펩티드.
66. 실시양태 46-65 중 어느 하나에 있어서, VK-A 또는 VK-B가 서열식별번호: 40의 제1 CDR, 서열식별번호: 19의 제2 CDR 및 서열식별번호: 41의 제3 CDR을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 것인 폴리펩티드.
67. 실시양태 46-65 중 어느 하나에 있어서, VK-A 또는 VK-B가 서열식별번호: 174의 제1 CDR, 서열식별번호: 175의 제2 CDR 및 서열식별번호: 176의 제3 CDR을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 것인 폴리펩티드.
68. 실시양태 46-65 중 어느 하나에 있어서, VK-A 또는 VK-B가 서열식별번호: 174의 제1 CDR, 서열식별번호: 227의 제2 CDR 및 서열식별번호: 176의 제3 CDR을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 것인 폴리펩티드.
69. 실시양태 46-65 중 어느 하나에 있어서, VK-A 또는 VK-B가 서열식별번호: 40의 제1 CDR, 서열식별번호: 237의 제2 CDR 및 서열식별번호: 41의 제3 CDR을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 것인 폴리펩티드.
70. 실시양태 46-65 중 어느 하나에 있어서, VK-A 또는 VK-B가 서열식별번호: 276의 제1 CDR, 서열식별번호: 237의 제2 CDR 및 서열식별번호: 41의 제3 CDR을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 것인 폴리펩티드.
71. 실시양태 46-65 중 어느 하나에 있어서, VK-A 또는 VK-B가 서열식별번호: 174의 제1 CDR, 서열식별번호: 227의 제2 CDR 및 서열식별번호: 176의 제3 CDR을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 것인 폴리펩티드.
72. 실시양태 46 또는 47에 있어서, 하기인 폴리펩티드:
VH-A는 서열식별번호: 37의 제1 CDR, 서열식별번호: 38의 제2 CDR 및 서열식별번호: 39의 제3 CDR을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하고;
VH-B는 서열식별번호: 171의 제1 CDR, 서열식별번호: 172의 제2 CDR 및 서열식별번호: 173의 제3 CDR을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하거나;
VK-A는 서열식별번호: 40의 제1 CDR, 서열식별번호: 19의 제2 CDR 및 서열식별번호: 41의 제3 CDR을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고;
VK-B는 서열식별번호: 174의 제1 CDR, 서열식별번호: 175의 제2 CDR 및 서열식별번호: 176의 제3 CDR을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하거나;
VK-A는 서열식별번호: 276의 제1 CDR, 서열식별번호: 237의 제2 CDR 및 서열식별번호: 41의 제3 CDR을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고;
VK-B는 서열식별번호: 174의 제1 CDR, 서열식별번호: 227의 제2 CDR 및 서열식별번호: 176의 제3 CDR을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하거나; 또는
VK-A는 서열식별번호: 174의 제1 CDR, 서열식별번호: 227의 제2 CDR 및 서열식별번호: 176의 제3 CDR을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고;
VK-B는 서열식별번호: 40의 제1 CDR, 서열식별번호: 237의 제2 CDR 및 서열식별번호: 41의 제3 CDR을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
73. 실시양태 46-72 중 어느 하나에 있어서, 링커 1이 (GGGGS)n (서열식별번호: 303)이며, 여기서 n은 1-4인 폴리펩티드.
74. 실시양태 46-72 중 어느 하나에 있어서, 링커 2가 (GGGGS)n (서열식별번호: 303)이며, 여기서 n은 1-4인 폴리펩티드.
75. 제1, 제2, 제3 및 제4 결합 도메인을 포함하는 이중파라토프 폴리펩티드로서, 여기서 제1, 제2, 제3 및 제4 결합 도메인 중 2개는 PD-1 상의 제1 에피토프에 결합하고, 제1, 제2, 제3 및 제4 결합 도메인 중 다른 2개는 PD-1 상의 제2 에피토프에 결합하고, 여기서 제1 및 제2 에피토프는 상이한 것인 이중파라토프 폴리펩티드.
76. 실시양태 75에 있어서, 제1 및 제2 에피토프가 비-중첩되는 것인 이중파라토프 폴리펩티드.
77. 실시양태 75 또는 76에 있어서, 제1, 제2, 제3 및 제4 결합 도메인이 본원에 제공된 것과 같은 PD-1 항체를 포함하는 것인 이중파라토프 폴리펩티드.
78. 실시양태 75-77 중 어느 하나에 있어서, 제1, 제2, 제3 및 제4 결합 도메인 중 2개가 PD1AB4, PD1AB30, PD1AB17, PD1AB18, PD1AB20, PD1AB25, PD1AB37 또는 PD1AB53 중 하나로부터의 CDR을 포함하고, 다른 2개가 PD1AB4, PD1AB30, PD1AB17, PD1AB18, PD1AB20, PD1AB25, PD1AB37 또는 PD1AB53 중 하나로부터의 CDR을 포함하며, 여기서 모든 결합 도메인이 동일한 것은 아닌 이중파라토프 폴리펩티드.
79. 실시양태 1-78 중 어느 하나의 폴리펩티드, 단백질 또는 항체를 포함하는 제약 조성물.
80. 대상체에게 실시양태 1-65 중 어느 하나의 폴리펩티드 또는 실시양태 66의 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 전신 홍반성 루푸스 (SLE), 에카르디-구티에레스 증후군, 양측 선조체 괴사, 지방이영양증 및 승온을 동반한 만성 비정형 호중구성 피부병 (CANDLE), 완전 비-침투, 유전성 대칭성 색각장애증, 가족성 동창 루푸스, 지방이영양증을 동반한 일본 자가염증성 증후군 (JASL), 관절 구축, 근육 위축, 소구성 빈혈, 지방층염 및 지방이영양증 (JMP), 미코박테리아 질환에 대한 멘델 감수성 (MSMD), 나카조-니시무라 증후군, 뇌 백질이영양증을 동반한 망막 혈관병증 (RVCL), 경직성 하반신부전마비, 영아기에 발병하는 STING-연관 혈관병증 (SAVI), 싱글톤-메르텐 증후군, 또는 척추연골종증 (SPENCD)을 치료하는 방법.
81. 염증성 장 질환을 갖는 대상체에게 실시양태 1-65 중 어느 하나의 폴리펩티드, 단백질 또는 항체 또는 실시양태 79의 제약 조성물을 투여하여 염증성 장 질환을 치료하는 것을 포함하는, 염증성 장 질환을 갖는 대상체를 치료하는 방법.
82. 실시양태 81에 있어서, 염증성 장 질환을 갖는 대상체가 크론병을 갖는 것인 방법.
83. 실시양태 81에 있어서, 염증성 장 질환을 갖는 대상체가 궤양성 결장염을 갖는 것인 방법.
84. 자가면역 간염을 갖는 대상체에게 실시양태 1-78 중 어느 하나의 폴리펩티드, 단백질 또는 항체 또는 실시양태 79의 제약 조성물을 투여하여 자가면역 간염을 치료하는 것을 포함하는, 자가면역 간염을 갖는 대상체를 치료하는 방법.
85. 대상체에게 실시양태 1-78 중 어느 하나의 폴리펩티드, 단백질 또는 항체 또는 실시양태 79의 제약 조성물을 투여하여 원발성 경화성 담관염을 치료하는 것을 포함하는, 원발성 경화성 담관염을 치료하는 방법.
86. 대상체에게 실시양태 1-78 중 어느 하나의 폴리펩티드, 단백질 또는 항체 또는 실시양태 79의 제약 조성물을 투여하여 제1형 당뇨병을 치료하는 것을 포함하는, 제1형 당뇨병을 치료하는 방법.
87. 이식 대상체에게 치료 유효량의 실시양태 1-78 중 어느 하나의 폴리펩티드, 단백질 또는 항체 또는 실시양태 79의 제약 조성물을 투여하여 이식 (수용자) 대상체를 치료하는 것을 포함하는, 이식 대상체를 치료하는 방법.
88. 이식된 공여자 조직을 갖는 대상체에게 치료 유효량의 실시양태 1-78 중 어느 하나의 폴리펩티드, 단백질 또는 항체 또는 실시양태 79의 제약 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 이식된 공여자 조직을 갖는 대상체에서 GVHD를 치료하는 방법.
89. 치료 유효량의 실시양태 1-78 중 어느 하나의 폴리펩티드, 단백질 또는 항체 또는 실시양태 79의 제약 조성물을 투여하여 자가면역 장애를 갖거나 또는 가질 위험이 있거나 또는 가질 위험이 상승된 대상체를 치료하는 것을 포함하는, 자가면역 장애를 갖거나 또는 가질 위험이 있거나 또는 가질 위험이 상승된 대상체를 치료하는 방법.
90. 치료 유효량의 실시양태 1-78 중 어느 하나의 폴리펩티드, 단백질 또는 항체 또는 실시양태 79의 제약 조성물을 투여하여 대상체를 치료하는 것을 포함하는, 대상체에서 PD-1의 활성에 대해 효능작용하는 방법.
91. 대상체에게 실시양태 1-78 중 어느 하나의 폴리펩티드, 단백질 또는 항체 또는 실시양태 79의 제약 조성물을 투여하여 대상체를 치료하는 것을 포함하는, 대상체에서 인터페론병증을 치료하는 방법.
92. 실시양태 91에 있어서, 인터페론병증이 제I형 인터페론병증인 방법.
93. 실시양태 91 또는 92에 있어서, 대상체가 그를 필요로 하는 대상체인 방법.
94. 실시양태 91 - 93 중 어느 하나에 있어서, 제I형 인터페론병증이 전신 홍반성 루푸스 (SLE), 에카르디-구티에레스 증후군, 양측 선조체 괴사, 지방이영양증 및 승온을 동반한 만성 비정형 호중구성 피부병 (CANDLE), 완전 비-침투, 유전성 대칭성 색각장애증, 가족성 동창 루푸스, 지방이영양증을 동반한 일본 자가염증성 증후군 (JASL), 관절 구축, 근육 위축, 소구성 빈혈, 지방층염 및 지방이영양증 (JMP), 미코박테리아 질환에 대한 멘델 감수성 (MSMD), 나카조-니시무라 증후군, 뇌 백질이영양증을 동반한 망막 혈관병증 (RVCL), 경직성 하반신부전마비, 영아기에 발병하는 STING-연관 혈관병증 (SAVI), 싱글톤-메르텐 증후군, 또는 척추연골종증 (SPENCD)인 방법.
95. 대상체에게 실시양태 1-78 중 어느 하나의 폴리펩티드, 단백질 또는 항체 또는 실시양태 79의 제약 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 형질세포양 수지상 세포로부터 인터페론의 생산을 억제하는 방법.
96. 실시양태 95에 있어서, 형질세포양 수지상 세포가 활성화된 형질세포양 수지상 세포인 방법.
97. 실시양태 95 또는 96에 있어서, 활성화된 형질세포양 수지상 세포가 TLR9 매개 활성화된 것인 방법.
98. 실시양태 95-97 중 어느 하나에 있어서, 인터페론의 생산이 실시양태 1-78 중 어느 하나의 폴리펩티드, 단백질 또는 항체 또는 실시양태 79의 제약 조성물의 부재 하에 생산된 인터페론의 양과 비교하여 약 또는 적어도 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 또는 95%만큼 감소되는 것인 방법.
99. 대상체에게 실시양태 1-77 중 어느 하나의 폴리펩티드, 단백질 또는 항체 또는 실시양태 78의 제약 조성물을 투여하는 것을 포함하는, TLR9 매개 장애를 치료하는 방법.
100. 실시양태 99에 있어서, TLR9 매개 장애가 전신 홍반성 루푸스 (SLE), 에카르디-구티에레스 증후군, 양측 선조체 괴사, 지방이영양증 및 승온을 동반한 만성 비정형 호중구성 피부병 (CANDLE), 완전 비-침투, 유전성 대칭성 색각장애증, 가족성 동창 루푸스, 지방이영양증을 동반한 일본 자가염증성 증후군 (JASL), 관절 구축, 근육 위축, 소구성 빈혈, 지방층염 및 지방이영양증 (JMP), 미코박테리아 질환에 대한 멘델 감수성 (MSMD), 나카조-니시무라 증후군, 뇌 백질이영양증을 동반한 망막 혈관병증 (RVCL), 경직성 하반신부전마비, 영아기에 발병하는 STING-연관 혈관병증 (SAVI), 싱글톤-메르텐 증후군, 또는 척추연골종증 (SPENCD)인 방법.
101. 대상체에게 실시양태 1-78 중 어느 하나의 폴리펩티드, 단백질 또는 항체 또는 실시양태 79의 제약 조성물을 투여하거나 또는 이와 세포를 접촉시키는 것을 포함하는, 세포 또는 대상체에서 OAS1, IFIT3, MX1 및 IFN-β1의 발현을 억제하는 방법.
102. 실시양태 101에 있어서, OAS1, IFIT3, MX1 및 IFN-β1의 발현이 유전자 발현인 방법.
103. 실시양태 101 또는 102에 있어서, 세포가 형질세포양 수지상 세포인 방법.
104. 실시양태 101-103에 있어서, 형질세포양 수지상 세포가 활성화된 형질세포양 수지상 세포인 방법.
105. 실시양태 1-78 중 어느 하나의 폴리펩티드, 단백질 또는 항체를 코딩하는 핵산.
106. 실시양태 105의 핵산을 포함하는 벡터.
107. 실시양태 105의 핵산 또는 실시양태 106의 벡터를 포함하는 세포.
108. 실시양태 107의 세포를 배양하여 실시양태 1-78 중 어느 하나의 폴리펩티드, 단백질 또는 항체를 제조하는 것을 포함하는, 실시양태 1-78 중 어느 하나의 폴리펩티드, 단백질 또는 항체의 제조 방법.
109. 실시양태 1-78 중 어느 하나의 폴리펩티드, 단백질 또는 항체를 코딩하는 핵산 서열의 제조 방법으로서,
a) 표적화 모이어티를 코딩하는 서열을 포함하는 벡터를 제공하고, 이펙터 결합/조정 모이어티를 코딩하는 서열을 벡터 내로 삽입하여, 치료 화합물을 코딩하는 서열을 형성하거나; 또는
b) 이펙터 결합/조정 모이어티를 코딩하는 서열을 포함하는 벡터를 제공하고, 표적화 모이어티를 코딩하는 서열을 벡터 내로 삽입하여, 치료 화합물을 코딩하는 서열을 형성하여,
이에 의해 실시양태 1-78 중 어느 하나의 폴리펩티드, 단백질 또는 항체를 코딩하는 서열을 제조하는 것을 포함하는 방법.
실시예
실시예 1. 이중파라토프 PD-1 효능제는 강한 가용성 PD-1 효능작용을 나타낸다.
PD1AB4, PD1AB30, PD1AB17, PD1AB18, PD1AB20 또는 PD1AB25 중 2개의 CDR을 포함하는 이중파라토프 폴리펩티드를 생산하고, PD-1 활성에 대해 효능작용하는 그의 능력에 대해 시험한다. 만들어진 포맷은 도 2에 예시되어 있다. 이중파라토프 분자는 이중파라토프가 아닌 분자와 비교하여 PD-1에 대해 효능작용하는 놀라운 예상밖의 우수한 능력을 갖는 것으로 밝혀졌다.
실시예 2. 이중파라토프 분자는 바이오센서 검정에 의해 인간 또는 마우스 PD-1에 결합한다.
항-인간 IgG Fc (AHC) 바이오센서를 검정 완충제 중에서 20분 동안 평형화시켰다. 시험 물품을 검정 완충제 (1x PBS, 1% BSA, 0.05% 트윈20) 중에 10 μg/mL로 희석하였다. 인간 PD-1의 7-포인트 연속 희석물을 검정 완충제 중에서, 1000 nM에서 시작하여 15.625 nM까지 (인간 PD-1) 또는 2000 nM에서 시작하여 31.25 nM까지 (마우스 PD-1) 제조하였다. 시험 물품을 팁 상에 180초 동안 로딩하고, 이어서 PD-1과의 180초 회합 단계 및 검정 완충제 중 180초 해리 단계를 수행하였다. PD1AB43은 인간 PD-1에 1.87E-08의 Kd (M), 3.21E-10의 KD 오차, 6.38E+04의 Kon (1/ms), 3.74E+02의 Kon 오차, 1.20E-03의 Kdis (1/s), 1.93E-05의 Kdis 오차 및 0.1549의 반응으로 결합하였고; PD1AB53은 6.29E-10의 Kd, 1.64E-10의 KD 오차, 6.76E+04의 Kon, 2.42E+02의 Kon 오차, 4.26E+02의 Kdis, 1.11E-05의 Kdis 오차 및 0.2273의 반응을 나타냈다. PD1AB43은 마우스 PD-1에 1.43E-06의 Kd (M), 5.88E-08의 KD 오차, 2.82E+04의 Kon (1/ms), 9.91E+04의 Kon 오차, 4.04E-02의 Kdis (1/s), 8.53E-04의 Kdis 오차 및 0.0546의 반응으로 결합하였고; PD1AB53은 3.84E-06의 Kd, 4.27E-07의 KD 오차, 5.94E+03의 Kon, 6.33E+02의 Kon 오차, 2.28E-02의 Kdis, 7.00E-04의 Kdis 오차 및 0.0367의 반응을 나타냈다. 이중파라토프 분자는 인간 및 마우스 PD-1에 대한 결합을 나타냈다.
실시예 3. 이중파라토프 분자는 ELISA에 의해 측정 시 인간, 시노 또는 마우스 PD-1에 결합한다.
플레이트를 1x PBS 중 2 μg/mL huPD-1로 4℃에서 밤새 코팅하였다. 1% BSA를 함유하는 1x PBS로 플레이트를 차단하였다. 항체를 50 nM에서 0.05 nM까지의 3배 연속 희석물을 사용한 결합에 대해 이중으로 시험하였다. 항체 결합을 항-카파-HRP 항체에 의해 검출하였으며, 2차 항체만으로 코팅된 웰에 대해 신호를 배경 차감한다. PD1AB43, PD1AB86, PD1AB87, PD1AB88, PD1AB53, PD1AB69, PD1AB64 및 PD1AB76은 인간, 시노 또는 마우스 PD-1에 결합하였다. 이중파라토프 분자는 인간, 시노 및 마우스 PD-1에 대한 결합을 나타냈다.
실시예 4. 이중파라토프 분자는 바이오센서 검정에 의해 인간, 시노 또는 마우스 PD-1에 결합한다.
항-인간 IgG Fc (AHC) 바이오센서를 검정 완충제 중에서 20분 동안 평형화시켰다. 시험 물품을 검정 완충제 (1x PBS, 1% BSA, 0.05% 트윈20) 중에 10 μg/mL로 희석하였다. 인간 PD-1의 7-포인트 연속 희석물을 검정 완충제 중에서, 1000 nM에서 시작하여 15.625 nM까지 (인간 및 시노 PD-1) 또는 2000 nM에서 시작하여 31.25 nM까지 (마우스 PD-1) 제조하였다. 시험 물품을 팁 상에 180초 동안 로딩하고, 이어서 PD-1과의 180초 회합 단계 및 검정 완충제 중 180초 해리 단계를 수행하였다. PD1AB53은 인간 PD-1에 3.30E-08의 Kd (M), 4.13E+04의 Kon (1/ms) 및 1.36E-03의 Kdis (1/s)로 결합하였고; PD1AB64는 2.13E-08의 Kd, 3.95E+04의 Kon 및 8.41E-04의 Kdis를 나타냈고; PD1AB37은 1.83E-08의 Kd, 4.50E+04의 Kon 및 8.24E-04의 Kdis를 나타냈고; PD1AB38은 5.07E-08의 Kd, 5.64E+04의 Kon 및 2.86E-03의 Kdis를 나타냈다. PD1AB53은 시노몰구스 PD-1에 1.35E-08의 Kd (M), 3.94E+04의 Kon (1/ms) 및 5.31E-04의 Kdis (1/s)로 결합하였고; PD1AB64는 1.66E-08의 Kd, 3.87E+04의 Kon 및 6.41E-04의 Kdis를 나타냈고; PD1AB37은 1.54E-08의 Kd, 3.68E+04의 Kon 및 5.66E-04의 Kdis를 나타냈고; PD1AB38은 2.83E-08의 Kd, 3.79E+04의 Kon 및 1.08E-03의 Kdis를 나타냈다. PD1AB53은 마우스 PD-1에 2.46E-05의 Kd (M), 2.67E+03의 Kon (1/ms) 및 6.57E-02의 Kdis (1/s)로 결합하였고; PD1AB64는 약하게 결합하였고; PD1AB37은 4.86E-06의 Kd, 5.05E+03의 Kon 및 2.45E-02의 Kdis를 나타냈고; PD1AB38은 9.79E-07의 Kd, 2.34E+04의 Kon 및 2.29E-02의 Kdis를 나타냈다. 이중파라토프 분자는 인간, 시노 및 마우스 PD-1에 대한 결합을 나타냈다.
실시예 5. 이중파라토프 분자는 바이오센서 검정에 의해 종에 걸쳐 일관된 친화도로 인간, 시노 또는 마우스 PD-1에 결합한다.
항-인간 IgG Fc (AHC) 또는 스트렙타비딘 (SA) 바이오센서를 검정 완충제 중에서 20분 동안 평형화시켰다. Fc-태그부착된 마우스 및 시노몰구스 PD-1을 5 μg/mL로 희석하고, 비오티닐화 huPD-1 물품을 검정 완충제 (1x PBS, 1% BSA, 0.05% 트윈20) 중에 0.5 μg/mL로 희석하였다. 시험 물품 Fab 및 scFv 단편의 7-포인트 연속 희석물을 검정 완충제 중에서 PD1AB53 Fab (500 nM), PD1AB37 및 PD1AB38 Fab (1000 nM); scFv 단편 (2000 nM)으로 제조하였다. PD-1을 팁 상에 180초 동안 로딩하고, 이어서 PD-1과의 180초 회합 단계 및 검정 완충제 중 180초 해리 단계를 수행하였다. PD1AB37의 Fab 모이어티는 인간 PD-1에 330nM의 Kd로 결합한 반면 scFv 모이어티는 89.9nM의 Kd로 결합하였고; PD1AB38의 Fab 모이어티는 인간 PD-1에 140nM의 Kd로 결합한 반면 scFv 모이어티는 89.9nM의 Kd로 결합하였고; PD1AB53의 Fab 모이어티는 인간 PD-1에 32.6nM의 Kd로 결합한 반면 scFv 모이어티는 1.35uM의 Kd로 결합하였다. PD1AB37의 Fab 모이어티는 시노 PD-1에 497nM의 Kd로 결합한 반면 scFv 모이어티는 58.6nM의 Kd로 결합하였고; PD1AB38의 Fab 모이어티는 시노 PD-1에 172nM의 Kd로 결합한 반면 scFv 모이어티는 58.6nM의 Kd로 결합하였고; PD1AB53의 Fab 모이어티는 시노 PD-1에 30.3nM의 Kd로 결합한 반면 scFv 모이어티는 1.17uM의 Kd로 결합하였다. PD1AB37의 Fab 모이어티는 마우스 PD-1에 1.35uM의 Kd로 결합한 반면 scFv 모이어티는 결합을 나타내지 않았고; PD1AB38의 Fab 모이어티는 마우스 PD-1에 176nM의 Kd로 결합한 반면 scFv 모이어티는 결합을 나타내지 않았고; PD1AB53의 Fab 모이어티는 마우스 PD-1에 결합하지 않은 반면 scFv 모이어티는 1.06uM의 Kd로 결합하였다.
실시예 6. 이중파라토프 분자는 SEC-MALS에 의해 예상된 분자량을 나타낸다.
SEC-MALS를 표준 프로토콜에 따라 사용하여 PD1AB53, PD1AB37 및 PD1AB38의 분자량을 평가하였다. 간략하게, 20 μL의 시험 물품을 제닉스(Zenix) SEC-300 칼럼 상에 주입하고, 0.35 mL/분으로 10분 동안 용리시켰다. PD1AB53은 198.4kDa의 크기를 갖는 것으로 예측되었고, 3.4% 오차 및 0.025kDa 글리칸을 포함하는 205.7kDa의 실제 분자량을 나타냈다. PD1AB37은 197.7kDa의 크기를 갖는 것으로 예측되었고, 4.3% 오차 및 0.028kDa 글리칸을 포함하는 188.9kDa의 실제 분자량을 나타냈다. PD1AB38은 197.9kDa의 크기를 갖는 것으로 예측되었고, 3.1% 오차 및 0.049kDa 글리칸을 포함하는 195.4kDa의 실제 분자량을 나타냈다. 이중파라토프 분자는 그의 예상된 크기를 면밀히 반영하고, 예상밖의 글리코실화를 나타내지 않는다.
실시예 7. 이중파라토프 분자인 PD1AB53은 유리한 저장 안정성 프로파일을 갖는다.
시험 물품을 대략 30 mg/mL로 농축시키고, 4℃ 및 37℃에서 0, 3, 14, 21 및 28일 동안 인큐베이션하였다. 대략 15 μg의 시험 물품을 어드밴스바이오(AdvanceBio) SEC-300Å 칼럼 상에 주입하고, 0.35 mL/분으로 10분 동안 용리시켰다. PD1AB53을 a) 25 mM 아세트산나트륨, 100 mM 염화나트륨, pH 6.0; b) 25 mM 아세트산나트륨, 100 mM 염화나트륨, 200 mM 수크로스, pH 6.0; 및 c) 25 mM 인산나트륨, 250 mM 염화나트륨, pH 7.0 중에서 제제화하였다. 안정성은 % POI로서 계산되었고, 제0일에 a)에서 99.2% 및 b)에서 99.3%; 제3일에 a)에서 99.1%, b)에서 99.3% 및 c)에서 99.1%; 제14일에 a)에서 98.9%, b)에서 99.2% 및 c)에서 99.0%; 제21일에 a)에서 98.9%, b)에서 99.0% 및 c)에서 98.7%; 및 제28일에 a)에서 98.9%, b)에서 99.0% 및 c)에서 93.6%를 나타냈다. PD1AB53은 아세트산나트륨 완충제 중 대략 23mg/ml로 4℃에서 최대 28일까지 우수한 안정성을 가지며, 37℃에서 시간 경과에 따라 응집을 나타냈다.
실시예 8. 이중파라토프 분자인 PD1AB37은 유리한 저장 안정성 프로파일을 갖는다.
시험 물품을 대략 30 mg/mL로 농축시키고, 4℃ 및 37℃에서 0, 3, 14, 21 및 28일 동안 인큐베이션하였다. 대략 15 μg의 시험 물품을 어드밴스바이오(AdvanceBio) SEC-300Å 칼럼 상에 주입하고, 0.35 mL/분으로 10분 동안 용리시켰다. PD1AB37을 a) 25 mM 인산나트륨, 250 mM 염화나트륨, pH 7.0; b) 25 mM 인산나트륨, 250 mM 염화나트륨, 200 mM 수크로스, pH 7.0; 및 c) 25 mM 인산나트륨, 250 mM 염화나트륨, 200 mM 글루타메이트, pH 7.0 중에서 제제화하였다. 안정성은 % POI로서 계산되었고, 제0일에 a)에서 61.9%, b)에서 63.7% 및 c)에서 62.6%; 제3일에 a)에서 60.1%, b)에서 61.6% 및 c)에서 62.2%; 제14일에 a)에서 57.2%, b)에서 64.9% 및 c)에서 62.2%; 제21일에 a)에서 60.5%, b)에서 65.1% 및 c)에서 62.3%; 및 제28일에 a)에서 59.1%, b)에서 65.2% 및 c)에서 60.8%를 나타냈다. PD1AB37은 아세트산나트륨 완충제 중 대략 15mg/ml로 4℃에서 최대 28일까지 안정하였고, 농축의 결과로서 응집을 나타냈다. 시간 경과에 따른 응집 및 약간의 분해는 37℃에서의 가속 저장 조건에서 명백하였다.
실시예 9. 이중파라토프 분자인 PD1AB38은 유리한 저장 안정성 프로파일을 갖는다.
시험 물품을 대략 30 mg/mL로 농축시키고, 4℃ 및 37℃에서 0, 3, 14, 21 및 28일 동안 인큐베이션하였다. 대략 15 μg의 시험 물품을 어드밴스바이오 SEC-300Å 칼럼 상에 주입하고, 0.35 mL/분으로 10분 동안 용리시켰다. PD1AB37을 a) 25 mM 인산나트륨, 250 mM 염화나트륨, pH 7.0; b) 25 mM 인산나트륨, 250 mM 염화나트륨, 200 mM 수크로스, pH 7.0 중에서 제제화하였다. 안정성은 % POI로서 계산되었고, 제0일에 a)에서 72.8% 및 b)에서 78.0%; 제3일에 a)에서 70.3% 및 b)에서 77.1%; 제14일에 a)에서 67.6% 및 b)에서 77.1%; 제21일에 a)에서 66.6% 및 b)에서 77.2%; 및 제28일에 a)에서 71.9% 및 b)에서 76.9%를 나타냈다. PD1AB38은 아세트산나트륨 완충제 중 대략 15mg/ml로 4℃에서 최대 28일까지 안정하였고, 농축의 결과로서 응집을 나타냈다. 시간 경과에 따른 응집 및 약간의 분해는 37℃에서의 가속 저장 조건에서 명백하였다.
실시예 10. 이중파라토프 분자는 낮은 다반응성을 갖는다.
다반응성 결합은 인간에서의 불량한 PK 결과와 상관관계가 있을 수 있다. 간략하게, 플레이트를 1x PBS 중 1 μg/mL dsDNA로 4℃에서 밤새 코팅하였다. 1% BSA를 함유하는 1x PBS로 플레이트를 차단하였다. 항체를 100 nM에서의 결합에 대해 삼중으로 시험하였다. 항체 결합을 항-카파-HRP 항체에 의해 검출하였으며, 2차 항체만으로 코팅된 웰에 대해 신호를 배경 차감한다. 시험 물품은 각각 100nM, 1-nM 또는 1nM의 PD1AB53, PD1AB37, PD1AB38, 음성 및 양성 대조군을 포함하였다. PD1AB53, PD1AB37 및 PD1AB38은 모든 농도에서 낮은 다반응성을 나타냈고, PD1AB53은 모든 시험 물품 중에서 최저 다반응성을 나타냈다. PD1AB37은 PD1AB38보다 더 낮은 다반응성을 나타냈다. 이중파라토프 분자는 낮은 다반응성을 나타냈다.
실시예 11. 이중파라토프 분자는 자기-상호작용을 나타내지 않는다.
항체 자기-상호작용은 제제에서 불량한 PK 또는 고점도의 잠재적 위험을 나타낼 수 있다. 간략하게, 항-인간 Ig 포획 항체로 코팅된 금 나노입자를 100 nM 시험 물품, 대조군 항체 또는 완충제와 함께 2시간 동안 인큐베이션하였다. 흡광도를 510-570 nm에서 측정하여 각각의 항체에 대한 최대 흡광도의 파장을 결정하였다 (플라즈몬 파장). Δ피크 흡광도 파장을 완충제 대조군과 비교하여 계산한다. 이중특이적 분자는 AC-SINS에 의해 측정 시 자기-상호작용을 거의 나타내지 않았으며, 이는 최대 흡광도의 파장의 이동에 의해 나타났다. 따라서, 이중파라토프 분자는 낮은 자기-상호작용을 나타낸다.
실시예 12. 이중파라토프 분자는 유리한 열 안정성을 나타낸다.
시험 물품 형광을 1℃/분 증가로 25℃에서 95℃까지 측정하였다. Tm을 1차 미분 방정식의 국부 최대치로부터 계산하고, Tagg를 266 및 473 nm에서의 흡광도에 의해 측정하였다. 일반적으로, Tagg266은 초기 작은 응집체 형성의 온도를 나타내는 반면 Tagg473은 초기 큰 응집체 형성의 온도를 나타낸다. PD1AB53은 68℃의 Tm1을 나타냈고, Tm2 및 3은 둘 다 80℃를 약간 초과하였다. PD1AB37 및 PD1AB38은 67℃의 Tm1 및 73℃의 Tm2 및 75℃의 Tm3으로 유사한 측정치를 나타냈다. PD1AB53은 80℃ 바로 미만의 Tagg266 및 80℃ 약간 초과의 Tagg473을 나타냈다. PD1AB37은 70℃ 약간 미만의 Tagg266 및 70℃ 약간 초과의 Tagg473을 나타냈다. PD1AB38은 70℃ 약간 미만의 Tagg266 및 70℃ 약간 초과의 Tagg473을 나타냈다. 따라서, 이중파라토프 분자는 열 안정성을 나타낸다.
실시예 13. 이중파라토프 분자는 낮은 전하 이종성을 나타낸다.
샘플을 메틸 셀룰로스, 4 M 우레아, 3-10 파마라이트(Pharmalyte)® 양성전해질 (4%), 5 mM 아르기닌 및 pI 마커 (하기 나타냄)의 매트릭스 중에 희석하였다. 혼합물을 iCE3 IEF 분석기 (프로테인심플(ProteinSimple))에 적용하고, 1,500 V에서 사전-집속시킨 후, 3,000 V에서 집속시켰다. 각각의 피크의 등전점을 괄호 안의 pI 마커로부터 계산하였다. PD1AB53 및 PD1AB38은 8.0 초과의 pI 값을 나타냈다. PD1AB53 및 PD1AB38은 제제화 및 정제 공정 개발에 유리한 pI 프로파일을 갖는다.
실시예 14. PD1AB53은 질량 분광측정법에 의해 정확한 질량을 갖는다.
샘플을 구아니딘 및 DTT에 의해 변성 및/또는 환원시킨 다음, PNGase F (MEDNA Bio M3104)에 의해 탈글리코실화시켰다. 샘플을 액퀴티 UPLC 단백질 BEH SEC 칼럼을 사용하여 제보 G2-XS QTOF 질량 분광계에 커플링된 워터스 액퀴티 UPLC에 의해 분석하였다. 글리코실화 조건은 G0F의 글리코실화 중량 (1445Da)을 가정한다. 비환원 조건은 디술피드 (22)당 -2 Da의 디술피드-결합 중량을 가정한다. 비-환원 글리코실화 상태의 PD1AB53의 실험적으로 결정된 분자 질량은 201295Da이었고, 예상된 분자 질량은 201296Da이었다. 비-환원 탈글리코실화 상태의 PD1AB53의 실험적으로 결정된 분자 질량은 198406Da이었고, 예상된 분자 질량은 198412Da이었다. 환원된 글리코실화 상태의 PD1AB53의 실험적으로 결정된 분자 질량은 76416Da 및 24255Da이었고, 예상된 분자 질량은 각각 76415Da 및 24258Da이었다. 환원된 탈글리코실화 상태의 PD1AB53의 실험적으로 결정된 분자 질량은 74970Da 및 24253Da이었고, 예상된 분자 질량은 각각 74970Da 및 24258Da이었다. 실험적으로 결정된 질량을 6 Da 내의 각각의 조건에 대해 계산된 질량과 정렬하였다.
실시예 15. PD1AB37은 질량 분광측정법에 의해 정확한 질량을 갖는다.
샘플을 구아니딘 및 DTT에 의해 변성 및/또는 환원시킨 다음, PNGase F (MEDNA Bio M3104)에 의해 탈글리코실화시켰다. 샘플을 액퀴티 UPLC 단백질 BEH SEC 칼럼을 사용하여 제보 G2-XS QTOF 질량 분광계에 커플링된 워터스 액퀴티 UPLC에 의해 분석하였다. 글리코실화 조건은 G0F의 글리코실화 중량 (1445Da)을 가정한다. 비환원 조건은 디술피드 (22)당 -2 Da의 디술피드-결합 중량을 가정한다. 비-환원 글리코실화 상태의 PD1AB37의 실험적으로 결정된 분자 질량은 200545Da이었고, 예상된 분자 질량은 200545Da이었다. 비-환원 탈글리코실화 상태의 PD1AB37의 실험적으로 결정된 분자 질량은 197655Da이었고, 예상된 분자 질량은 197658Da이었다. 환원된 글리코실화 상태의 PD1AB37의 실험적으로 결정된 분자 질량은 77122Da 및 23174Da이었고, 예상된 분자 질량은 각각 77121Da 및 23175Da이었다. 환원된 탈글리코실화 상태의 PD1AB37의 실험적으로 결정된 분자 질량은 75676Da 및 23174Da이었고, 예상된 분자 질량은 각각 65675Da 및 23175Da이었다. 실험적으로 결정된 질량을 2 Da 내의 각각의 조건에 대해 계산된 질량과 정렬하였다.
실시예 16. PD1AB38은 질량 분광측정법에 의해 정확한 질량을 갖는다.
샘플을 구아니딘 및 DTT에 의해 변성 및/또는 환원시킨 다음, PNGase F (MEDNA Bio M3104)에 의해 탈글리코실화시켰다. 샘플을 액퀴티 UPLC 단백질 BEH SEC 칼럼을 사용하여 제보 G2-XS QTOF 질량 분광계에 커플링된 워터스 액퀴티 UPLC에 의해 분석하였다. 글리코실화 조건은 G0F의 글리코실화 중량 (1445Da)을 가정한다. 비환원 조건은 디술피드 (22)당 -2 Da의 디술피드-결합 중량을 가정한다. 비-환원 글리코실화 상태의 PD1AB38의 실험적으로 결정된 분자 질량은 200765Da이었고, 예상된 분자 질량은 200767Da이었다. 비-환원 탈글리코실화 상태의 PD1AB38의 실험적으로 결정된 분자 질량은 197877Da이었고, 예상된 분자 질량은 197880Da이었다. 환원된 글리코실화 상태의 PD1AB38의 실험적으로 결정된 분자 질량은 77134Da 및 23266Da이었고, 예상된 분자 질량은 각각 77134Da 및 23271Da이었다. 환원된 탈글리코실화 상태의 PD1AB38의 실험적으로 결정된 분자 질량은 75690Da 및 23264Da이었고, 예상된 분자 질량은 각각 75689Da 및 23271Da이었다. 실험적으로 결정된 질량을 7 Da 내의 각각의 조건에 대해 계산된 질량과 정렬하였다.
실시예 17. PD1AB38, PD1AB37 및 PD1AB53은 가변 도메인 CDR에서 최소 번역후 변형을 나타낸다.
샘플을 DTT 및 IAM으로 처리하고, 이어서 트립신/Lys-C 소화시켰다. 이어서, 소화된 샘플을 단백질 BEH C18 칼럼을 사용하여 제보 G2-XS QTOF 질량 분광계에 커플링된 워터스 액퀴티 UPLC에 의해 분석하였다. 데이터는 PD1AB38, PD1AB37 및 PD1AB53의 가변 도메인 CDR에서 최소 변형을 나타냈지만, 주요 산화 또는 탈아미노화는 나타내지 않았다. PD1AB38, PD1AB37 및 PD1AB53은 제조에 유리한 특성을 나타낸다.
실시예 18. PD1AB53, PD1AB37 및 PD1AB38은 유사한 글리코실화 패턴을 나타낸다.
샘플을 워터스 글리코웍스 라피플루오르-MS N-글리칸 키트로 처리하였다. 샘플을 액퀴티 UPLC 글리칸 BEH 아미드 칼럼을 사용하여 제보 G2-XS QTOF 질량 분광계에 커플링된 워터스 액퀴티 UPLC에 의해 분석하였다. 글리칸 종을 총 %로서 계산하였다. PD1AB53은 0.98%의 G0-GN; 8.6% G0F-GN; 0.67% G0; 77.37% G0F; 7.9% Man5; 1.78% G0F+GN; 2.31% G1F; 및 0.39% Man6을 포함하였다. PD1AB37은 1.11% G0-GN; 9.57% G0F-GN; 0.68% G0; 77.02% G0F; 7.96% Man5; 2.02% G0F+GN; 0.99% G1F; 0.29% Man6; 및 0.37% 미지 (1368.6)를 포함하였다. PD1AB38은 1.28% G0-GN; 10.5% G0F-GN; 0.76% G0; 73.29% G0F; 9.44% Man5; 2.26% G0F+GN; 1.31% G1F; 0.28% Man6; 0.29% 미지 (1725.73); 및 0.59% 미지 (1368.6)를 포함하였다. 따라서, 시험된 이중파라토프 분자에 걸쳐 우세한 종은 G0F, G0F-GN 및 만노스 5를 포함하였다.
실시예 19. 에피토프 맵핑은 PD-1에 대한 독특한 결합을 시사한다.
펩티드 가교 질량 분광측정법 접근법에 이어서 다양한 에피토프의 % 중첩을 검증하기 위한 컴퓨터 분자 모델링을 사용하여 표준 프로토콜에 따라 에피토프 맵핑을 수행하였다. 결과는 다른 분자와의 하기 % 중첩을 나타냈다:
Figure pct00054
따라서, 에피토프 맵핑은 PD-1 효능제 및 길항제 사이에 위치하는 결합의 다양성을 밝혀내었다.
실시예 20. 이중파라토프 분자는 PD-1 길항제 활성을 갖지 않는다.
PD-1 리포터 Jurkat 세포를 나타낸 농도의 시험 물품과 함께 1시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서, PD-L1 발현 세포를 첨가하고, SHP-2 동원을 2시간 후에 평가하였다. PD1AB43, PD1AB38, PD1AB37 및 PD1AB53, LY3462817 음성 대조군 및 TTJ2 음성 대조군은 펨브롤리주맙 양성 대조군과 비교하여 길항제 활성을 나타내지 않았다. 따라서, 이중파라토프 분자 PD1AB43, PD1AB38, PD1AB37 및 PD1AB53은 길항제 활성을 나타내지 않는다.
실시예 21. 이중파라토프 분자는 PD-1 효능제 활성을 갖는다.
PD-1 리포터 Jurkat 세포를 0.001 내지 100nM 범위의 농도의 가용성 시험 물품과 함께 인큐베이션하였다. SHP-2 동원을 2시간 후에 평가하였다. PD1AB43은 0.5736의 EC50(nM)을 나타냈고; PD1AB38은 0.3022의 EC50을 나타냈고; PD1AB37은 0.3700의 EC50을 나타냈고; PD1AB53은 1.210의 EC50을 나타냈다.
또 다른 실험에서, 플레이트를 항-인간 IgG로 코팅하고, 차단하고, Ig-테더링된 시험 물품을 0.001 내지 100nM 범위의 농도로 1시간 동안 첨가하였다. 플레이트를 세척하고, PD-1 리포터 Jurkat 세포를 첨가하였다. SHP-2 동원을 2시간 후에 평가하였다. PD1AB43은 8.507의 EC50(nM)을 나타냈고; PD1AB38은 20.85의 EC50을 나타냈고; PD1AB37은 24.48의 EC50을 나타냈고; PD1AB53은 4.835의 EC50을 나타냈고; LY3462817은 5.686의 EC50을 나타냈다. 따라서, 가용성 및 Ig-테더링된 이중파라토프 분자는 효능제 활성을 나타낸다.
실시예 22. 이중파라토프 분자는 시험관내에서 T 세포 증식을 억제한다.
100 nM 대조군 시험 물품, LY3462817, PD1AB38, PD1AB37 또는 PD1AB53의 부재 또는 존재 하에 스타필로코쿠스 장독소 B (SEB) 또는 CMV, EBV 및 인플루엔자로부터의 에피토프를 함유하는 펩티드 풀로 인간 PBMC를 자극하였다. 자극 3 내지 6일 후에 Ki67에 대한 세포내 염색에 의해 증식을 평가하였다. 퍼센트 Ki67 양성 사건을 시험 물품 부재 조건에 대해 정규화하였다. 데이터는 SEB- 또는 CEF 펩티드 풀-자극된 T 세포 증식의 억제를 보여주었다. 따라서, 이중파라토프 분자는 인간 T 세포의 증식을 억제한다.
실시예 23. 이중파라토프 분자는 시험관내에서 T 세포 증식을 억제한다.
인간 PBMC를 37℃에서 2시간 동안 비히클 또는 200nM PD1AB53으로 전처리한 다음, PD-L1 및 PD-L2를 차단하는 항체 (각각 2 μg/ml)의 존재 하에 파상풍 톡소이드 (5 μg/ml)로 자극하였다. 4일의 자극 후 MSD ELISA에 의해 인터페론 감마 (IFN-γ), IL-2 및 종양 괴사 인자 (TNF-α)의 수준을 측정하고, 이를 사용하여 % 억제를 계산하였다. 데이터는 IFN-γ, IL-2 및 TNF-α의 감소를 보여주었다. PD1AB53은 PBMC에서 파상풍 톡소이드-유도된 시토카인 생산을 감소시켰다.
실시예 24. 이중파라토프 분자는 시험관내 형질세포양 수지상 세포에서 CpGA-유도된 제I형 인터페론 반응을 억제한다.
특정한 이론에 얽매이는 것을 원하지는 않지만, TLR9 활성화는 형질세포양 수지상 세포 상에서 PD-1 발현을 유도할 수 있다. 정제된 인간 형질세포양 수지상 세포를 CpGA로 6 또는 24시간 동안 자극하고, 이어서 PD-1, IFN-β1, MX1, MX2 및 IFIT3의 qRT-PCR 측정을 위한 세포 수집 및 RNA 추출, 뿐만 아니라 MSD에 의한 시토카인 분석을 위한 상청액 수집을 수행하였다. 유전자 발현 데이터는 자극되지 않은 세포와 비교하여 자극 후 6시간에만 PD-1, IFN-β, MX1, MX2 및 IFIT3의 발현을 보여주었다. 상청액의 분석은 자극되지 않은 세포로부터의 상청액과 비교하여 자극 후 6 및 24시간에 IFN-β1, TNFα 및 IL-13의 분비를 보여주었다.
다음으로, 정제된 인간 형질세포양 수지상 세포를 PD1AB38, PD1AB37 또는 PD1AB53의 존재 또는 부재 하에 CpGA로 24시간 동안 자극하였다. CpGA 자극은 세포 표면 상에서 PD-1 발현을 유도하였고, 제I형 IFN 반응 유전자 OAS1, IFIT3, MX1 및 IFN-β1을 유도하였다. 이들 유전자의 CpGA-유도된 발현은 PD1AB38, PD1AB37 및 PD1AB53의 존재 하에 억제되었다. 따라서, 이중파라토프 PD-1 효능제는 CpGA-유도된 제I형 IFN 반응 유전자를 억제한다.
실시예 25. PD1AB43은 xGVHD에서 생존을 연장시키고 피부 표현형을 개선시킨다.
인간 PBMC의 면역결핍 마우스 내로의 전달에 의해 이종 이식편 대 숙주 질환을 유도하였다. 세포 전달 10일 후에 시작하여, 마우스를 비히클 또는 PD1AB43으로 매주 피하로 처리하였다. 피부 염증을 하기와 같이 점수화하였다: 0: 건강함, 1: 탈모 < 1 cm x 1 cm, 2: 탈모 > 1 cm x 1 cm, 그러나 총 탈모는 아님, 3: 총 탈모, 플러스 염증발생 꼬리, 귀, 발에 대해 각각 추가의 0.3. PD1AB43은 피부 표현형을 개선시켰고, 중앙 생존 기간을 비히클에 대한 53일과 비교하여 70.5일로 연장시켰다.
실시예 26. PD1AB53은 xGVHD에서 피부 염증의 중증도를 감소시킨다.
인간 PBMC의 면역결핍 마우스 내로의 전달에 의해 이종 이식편 대 숙주 질환을 유도하였다. 세포 전달 10일 후에 시작하여, 마우스를 비히클 또는 PD1AB53으로 2주마다 피하로 처리하였다. 피부 염증을 하기와 같이 점수화하였다: 0: 건강함, 1: 탈모 < 1 cm x 1 cm, 2: 탈모 > 1 cm x 1 cm, 그러나 총 탈모는 아님, 3: 총 탈모, 플러스 염증발생 꼬리, 귀, 발에 대해 각각 추가의 0.3. PD1AB53은 비히클과 비교하여 개선된 피부 점수를 나타냈다.
실시예 27. PD1AB43은 xGVHD에서 피부 및 결장의 T 세포 침윤을 감소시킨다.
인간 PBMC의 면역결핍 마우스 내로의 전달에 의해 이종 이식편 대 숙주 질환을 유도하였다. 세포 전달 10일 후에 시작하여, 마우스를 비히클 또는 PD1AB43으로 매주 피하로 처리하였다. 생착-후 >100일에 피부 또는 결장을 수거하였다. 샘플을 포르말린 고정 및 파라핀 포매시키거나 또는 소화시켜 침윤 세포를 단리하였다. 침윤 CD4+ 및 CD8+ T 세포를 IHC 샘플의 자동화 영상 분석 또는 소화된 조직의 유동 세포측정법에 의해 정량화하였다. 군에 대해 맹검인 병리학자가 피부 조직병리학을 점수화하였다. PD1AB43 처리된 마우스는 IHC 또는 유동 세포측정법에 의해 측정 시, 피부 및 결장에서 보다 낮은 수준의 CD4+ 및 CD8+ 세포를 나타냈다. PD1AB43 처리된 마우스는 또한 혈액 중 CD4+ 세포의 보다 낮은 수준 및 감소된 조직병리학 점수를 나타냈으며, 이는 개선된 피부 표현형을 나타낸다. PD1AB43은 xGVHD에서 피부 및 결장의 T 세포 침윤을 효과적으로 감소시키고, 피부 표현형을 개선시킨다.
실시예 28. 이중파라토프 분자는 인간 PD-1 녹-인 마우스에서 조절 T 세포 공동-발현 활성화 마커를 증가시킨다.
8주령 인간 PD-1 녹-인 마우스에게 PD1AB43, PD1AB38, PD1AB37, PD1AB53, PD1AB64, LY3462817 또는 비히클을 등덜미에 피하로 투여하였다. 제4일, 제7일 또는 제10일에 마우스를 안락사시키고, 비장을 절개하고, 비장세포를 면역표현형 T 세포 하위세트에 대한 표면 및 세포내 마커에 대한 항체로 염색하고, 활성화 마커 LAG3 및 CTLA4의 발현을 측정하였다. 데이터는 주사 후 제4일, 제7일 및 제10일에 LAG3 및 CTLA4를 공동-발현하는 비장 Treg의 빈도 및 수의 증가를 보여주었다. PD1AB43, PD1AB38, PD1AB37, PD1AB53 및 PD1AB64 이중파라토프 분자는 인간 PD-1 녹-인 마우스에서 조절 T 세포 활성화 마커의 발현을 증가시킨다.
실시예 29. 이중파라토프 분자는 조절 T 세포 공동-발현 활성화 마커를 용량-의존성 방식으로 증가시킨다.
8주령 인간 PD-1 녹-인 마우스에게 저용량, 중간 용량 및 고용량의 PD1AB53, PD1AB37, PD1AB38, D1.3, LY3462817 또는 비히클을 등덜미에 피하로 투여하였다. 7일 후에 마우스를 안락사시키고, 비장을 절개하고, 비장세포를 면역표현형 T 세포 하위세트에 대한 표면 및 세포내 마커에 대한 항체로 염색하고, 활성화 마커 LAG3 및 CTLA4의 발현을 측정하였다. 데이터는 LAG3 및 CTLA4를 공동-발현하는 비장 Treg의 빈도 및 수의 용량-의존성 증가를 보여준다. PD1AB38, PD1AB37 및 PD1AB53 이중파라토프 분자는 조절 T 세포 활성화 마커의 발현을 용량-의존성 방식으로 증가시킨다.
실시예 30. 이중파라토프 분자는 인간 CD34+ 생착된 NSG 마우스에서 조절 T 세포 공동-발현 활성화 마커를 증가시킨다.
인간 CD34-양성 조혈 줄기 세포-생착된 NSG 마우스에게 PD1AB38, PD1AB37, PD1AB53, D1.3, LY3462817 또는 비히클을 등덜미에 피하로 투여하였다. 7일 후에 마우스를 안락사시키고, 비장을 절개하고, 비장세포를 면역표현형 인간 T 세포 하위세트에 대한 표면 및 세포내 마커에 대한 항체로 염색하고, 활성화 마커 LAG3 및 CTLA4의 발현을 측정하였다. 데이터는 LAG3 및 CTLA4를 공동-발현하는 비장 인간 Treg의 빈도 및 수의 증가를 보여주었다. PD1AB38, PD1AB37 및 PD1AB53 이중파라토프 분자는 인간 CD34+ 생착된 NSG 마우스에서 조절 T 세포 활성화 마커의 발현을 증가시킨다.
이들 데이터는 PD-1 항체가, 각각의 결합 도메인이 동일한 에피토프에 결합하는 단일파라토프 포맷과 비교하여 이중파라토프 포맷, 예컨대 도 2에 예시된 포맷에서 더 큰 유효성으로 기능하고 효능제로서 작용할 수 있다는 것을 입증한다.
본원에 인용된 각각의 및 모든 특허, 특허 출원 및 공개물의 개시내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 다양한 실시양태가 구체적 측면을 참조하여 개시되었지만, 실시양태의 진정한 취지 및 범주로부터 벗어나지 않으면서 이들 실시양태의 다른 측면 및 변형이 관련 기술분야의 다른 통상의 기술자에 의해 고안될 수 있다는 것이 분명하다. 첨부된 청구범위는 모든 이러한 측면 및 등가의 변형을 포함하는 것으로 해석되는 것으로 의도된다.
SEQUENCE LISTING <110> PANDION OPERATIONS, INC. <120> MULTI-PARATOPIC ANTI-PD-1 ANTIBODIES AND USES THEREOF <130> 145256.001212 <150> 63067674 <151> 2020-08-19 <150> 63152691 <151> 2021-02-23 <150> 63175760 <151> 2021-04-16 <160> 307 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 1 Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu 1 5 10 15 <210> 2 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 2 Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala 1 5 10 15 Tyr Ser Arg Gly Val Phe Arg Arg 20 <210> 3 <211> 585 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 3 Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu 1 5 10 15 Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln 20 25 30 Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu 35 40 45 Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys 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Lys Pro Gly Ser Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys 100 105 <210> 284 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 284 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Asn Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys 100 105 <210> 285 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 285 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Arg Asp Ile Lys Asn Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Asn Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys 100 105 <210> 286 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 286 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Arg Asp Ile Leu Asn Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys 100 105 <210> 287 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 287 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys 100 105 <210> 288 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 288 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Arg Asp Ile Lys Asn Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ala Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys 100 105 <210> 289 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 289 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Thr Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Arg Asp Ile Lys Asn Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys 100 105 <210> 290 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 290 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys 100 105 <210> 291 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 291 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Thr Tyr 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Cys Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Asn Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ser Gly Trp Val Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 100 105 110 Ser <210> 292 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 292 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Arg Asp Ile Asn Asn Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys 100 105 <210> 293 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 293 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Cys Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Asn Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ser Gly Trp Val Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 100 105 110 Ser <210> 294 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 294 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Leu Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys 100 105 <210> 295 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 295 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Asn Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys 100 105 <210> 296 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 296 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Cys Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ser Gly Trp Val Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 100 105 110 Ser <210> 297 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 297 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Thr Tyr 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Cys Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ser Gly Trp Val Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 100 105 110 Ser <210> 298 <211> 197 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 298 Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu 1 5 10 15 Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln 20 25 30 Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu 35 40 45 Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys 50 55 60 Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu 65 70 75 80 Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro 85 90 95 Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu 100 105 110 Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His 115 120 125 Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg 130 135 140 Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg 145 150 155 160 Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala 165 170 175 Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser 180 185 190 Ser Ala Lys Gln Arg 195 <210> 299 <211> 221 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 299 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Thr Tyr 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ser Gly Trp Val Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 100 105 110 Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser 115 120 125 Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp 130 135 140 Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr 145 150 155 160 Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr 165 170 175 Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln 180 185 190 Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp 195 200 205 Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr 210 215 220 <210> 300 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 300 Gly Gly Gly Ser Glu 1 5 <210> 301 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 301 Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu 1 5 10 <210> 302 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 302 Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly 1 5 10 15 Gly Gly Ser Glu 20 <210> 303 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(5) <223> n is 1, 2, 3, 4 <400> 303 Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 304 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(5) <223> n is 1, 2, 3, 4 <400> 304 Gly Gly Gly Gly Ala 1 5 <210> 305 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(5) <223> n is 1, 2, 3, 4 <400> 305 Gly Gly Gly Ser Glu 1 5 <210> 306 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(5) <223> n is 1, 2, 3, 4 <400> 306 Gly Gly Gly Ser Lys 1 5 <210> 307 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(5) <223> n is 1, 2, 3, 4 <400> 307 Ala Glu Glu Glu Lys 1 5

Claims (50)

  1. PD-1에 결합하는 제1, 제2, 제3 및 제4 결합 도메인을 포함하는 폴리펩티드로서, 여기서 제1 및 제2 결합 도메인은 PD-1 상의 제1 에피토프에 결합하고, 제3 및 제4 결합 도메인은 PD-1 상의 제2 에피토프에 결합하고, 여기서 제1 및 제2 에피토프는 동일하지 않은 것인 폴리펩티드.
  2. 제1항에 있어서, 폴리펩티드가 PD-1 효능제인 폴리펩티드.
  3. 제1항에 있어서, 제1, 제2, 제3 및 제4 결합 도메인이 PD-1에 대해 동일하거나 유사한 친화도를 갖는 것인 폴리펩티드.
  4. 제1항에 있어서,
    제1 및 제2 결합 도메인이 PD-1에 결합하는 제3 및 제4 결합 도메인과 비교하여 PD-1에 대해 더 낮은 친화도를 갖거나; 또는
    제1 및 제2 결합 도메인이 PD-1에 결합하는 제3 및 제4 결합 도메인과 비교하여 PD-1에 대해 더 높은 친화도를 갖는 것인
    폴리펩티드.
  5. 제1항에 있어서, 제1, 제2, 제3 및 제4 결합 도메인이 PD-1에 결합하는 항체 또는 항체 단편인 폴리펩티드.
  6. 제5항에 있어서, 제1 및 제2 결합 도메인 항체가 Fab 포맷이고, 제3 및 제4 결합 도메인 항체가 scFv 포맷인 폴리펩티드.
  7. 제6항에 있어서,
    Fab 포맷의 제1 및 제2 결합 도메인 항체가 scFv 포맷의 제3 및 제4 결합 도메인 항체와 비교하여 PD-1에 대해 더 높은 친화도를 갖거나; 또는
    Fab 포맷의 제1 및 제2 결합 도메인 항체가 scFv 포맷의 제3 및 제4 결합 도메인 항체와 비교하여 PD-1에 대해 더 낮은 친화도를 갖는 것인
    폴리펩티드.
  8. PD-1에 결합하는 제1 및 제2 결합 도메인을 포함하는 폴리펩티드로서, 여기서 제1 및 제2 결합 도메인은 본원에 제시된 바와 같은 서열, 예컨대 본원에 제공된 바와 같은 PD-1 항체 표 4, PD-1 항체 표 5, PD-1 항체 표 8, PD-1 항체 표 9, PD-1 항체 표 10 또는 PD-1 항체 표 11에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 것인 폴리펩티드.
  9. 제8항에 있어서, PD-1에 결합하는 제3 및 제4 결합 도메인을 포함하며, 여기서 제3 결합 도메인은 제1 결합 도메인과 동일한 에피토프에 결합하고, 제4 결합 도메인은 제2 결합 도메인과 동일한 에피토프에 결합하는 것인 폴리펩티드.
  10. 제9항에 있어서,
    제1 및 제3 결합 도메인이 동일한 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함하고;
    제2 및 제4 결합 도메인이 동일한 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함하고;
    제1 및 제2 결합 도메인이 상이한 폴리펩티드 서열을 포함하고;
    제3 및 제4 결합 도메인이 상이한 폴리펩티드 서열을 포함하는 것인
    폴리펩티드.
  11. 제9항에 있어서,
    제1 및 제3 결합 도메인이 동일한 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함하고;
    제2 및 제4 결합 도메인이 동일한 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함하고;
    제1 및 제2 결합 도메인이 동일한 폴리펩티드 서열을 포함하고;
    제3 및 제4 결합 도메인이 동일한 폴리펩티드 서열을 포함하는 것인
    폴리펩티드.
  12. 제9항에 있어서, 제1 및 제2 결합 도메인이 PD-1에 결합하는 항체인 폴리펩티드.
  13. 제9항에 있어서, 제1 및 제2 결합 도메인이 동일한 에피토프 또는 상이한 에피토프에 결합하는 것인 폴리펩티드.
  14. 제8항에 있어서, 제1 결합 도메인 및 제2 결합 도메인 중 하나가 Fab 항체이고, 다른 것은 scFv 항체인 폴리펩티드.
  15. 제8항에 있어서, 제1 및 제2 결합 도메인이 이뮤노글로불린 불변 영역, 예컨대 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 불변 영역을 포함하는 글리신/세린, 글리신/알라닌 링커, 글리신/글루탐산/세린 또는 알라닌/글루탐산/리신 링커에 의해 연결된 것인 폴리펩티드.
  16. 제1항에 있어서, scFv 항체에 연결된 Fab 중쇄 도메인을 포함하는 제1 폴리펩티드 쇄 및 Fab 경쇄 (예를 들어, 카파) 도메인을 포함하는 제2 폴리펩티드 쇄를 포함하며, 여기서 Fab 중쇄 및 경쇄는 PD-1에 결합하고, scFv 항체는 동일하거나 상이한 에피토프에서 PD-1에 결합하고; 여기서 scFv는 (GGGGS)n (서열식별번호: 303), (GGGSE)n (서열식별번호: 305) 또는 (GGGGA)n (서열식별번호: 304)의 서열 또는 그의 조합을 포함하는 scFv 링커로 경쇄 가변 도메인에 연결된 중쇄 가변 도메인을 포함하고, 여기서 각각의 n은 독립적으로 1-4인 폴리펩티드.
  17. 제1항에 있어서, 제1 결합 도메인이 PD-1 항체 표 4, PD-1 항체 표 5, PD-1 항체 표 8, PD-1 항체 표 9, PD-1 항체 표 10 또는 PD-1 항체 표 11에 제공된 바와 같은 서열을 포함하고, 제2 결합 도메인이 PD-1 항체 표 4, PD-1 항체 표 5, PD-1 항체 표 8, PD-1 항체 표 9, PD-1 항체 표 10 또는 PD-1 항체 표 11에 제공된 바와 같은 서열을 포함하는 것인 폴리펩티드.
  18. 제1항에 있어서, 제1 결합 도메인 및 제2 결합 도메인이 독립적으로 선택된, 본원에 제공된 바와 같은 항체 또는 그의 항원 결합 단편인 폴리펩티드.
  19. 제1항에 있어서, 제1 결합 도메인 및 제2 결합 도메인이 독립적으로 선택된,
    (i) 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하며, 여기서 중쇄 CDR1 서열은 PD-1 항체 표 4, PD-1 항체 표 5, PD-1 항체 Fab 표 6 또는 PD-1 항체 scFv 표 7에 제시된 CDR1 서열 중 임의의 것의 아미노산 서열을 갖고; 중쇄 CDR2는 PD-1 항체 표 4, PD-1 항체 표 5, PD-1 항체 Fab 표 6 또는 PD-1 항체 scFv 표 7에 제시된 CDR2 서열 중 임의의 것의 아미노산 서열을 갖고; 중쇄 CDR3은 PD-1 항체 표 4, PD-1 항체 표 5, PD-1 항체 Fab 표 6 또는 PD-1 항체 scFv 표 7에 제시된 CDR3 서열 중 임의의 것의 아미노산 서열을 갖거나; 또는 상기 중 임의의 것의 변이체를 갖는 것인 중쇄 가변 영역; 및
    (ii) 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하며, 여기서 경쇄 CDR1 서열은 PD-1 항체 표 4, PD-1 항체 표 5, PD-1 항체 Fab 표 6 또는 PD-1 항체 scFv 표 7에 제시된 LCDR1 서열 중 임의의 것의 아미노산 서열을 갖고; 경쇄 LCDR2는 PD-1 항체 표 4, PD-1 항체 표 5, PD-1 항체 Fab 표 6 또는 PD-1 항체 scFv 표 7에 제시된 LCDR2 서열 중 임의의 것의 아미노산 서열을 갖고; 경쇄 CDR3은 PD-1 항체 표 4, PD-1 항체 표 5, PD-1 항체 Fab 표 6 또는 PD-1 항체 scFv 표 7에 제시된 LCDR3 서열 중 임의의 것의 아미노산 서열을 갖거나; 또는 상기 중 임의의 것의 변이체를 갖는 것인 경쇄 가변 영역
    을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편인 폴리펩티드.
  20. 제1항에 있어서, 제1 결합 도메인 및 제2 결합 도메인이 독립적으로 선택된 항체 또는 그의 항원 결합 단편이며, 여기서 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 독립적으로
    서열식별번호: 37, 115, 122, 137, 171, 267, 238, 279의 제1 CDR; 서열식별번호: 38, 116, 123, 138, 172, 229, 239의 제2 CDR; 및 서열식별번호: 39, 117, 124, 139, 173, 230, 240의 제3 CDR을 포함하는 중쇄; 및
    서열식별번호: 40, 118, 125, 140, 174, 276의 제1 CDR; 서열식별번호: 19, 126, 47, 175, 227, 237의 제2 CDR 및 서열식별번호: 41, 119, 127, 141, 176의 제3 CDR을 포함하는 경쇄 가변 영역
    을 포함하는 것인 폴리펩티드.
  21. 제1항에 있어서, 제1 결합 도메인 및 제2 결합 도메인이 독립적으로 선택된 항체 또는 그의 항원 결합 단편이며, 여기서 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 독립적으로 서열식별번호: 35, 서열식별번호: 113, 서열식별번호: 120, 서열식별번호: 135, 서열식별번호: 169, 서열식별번호: 185, 서열식별번호: 202, 서열식별번호: 256, 서열식별번호: 257, 서열식별번호: 260 또는 서열식별번호: 262 또는 서열식별번호: 275의 서열을 포함하는 중쇄 및 서열식별번호: 36, 서열식별번호: 114, 서열식별번호: 121, 서열식별번호: 136, 서열식별번호: 170, 서열식별번호: 258, 서열식별번호: 259, 서열식별번호: 261 또는 서열식별번호: 263의 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 것인 폴리펩티드.
  22. 제1항에 있어서, 제1 폴리펩티드 쇄 및 제2 폴리펩티드 쇄를 포함하며, 여기서
    제1 폴리펩티드 쇄는 N-말단에서 C-말단으로 하기 화학식을 갖고:
    [VH-A]-[CH1]-[CH2]-[CH3]-[링커 1]-[VH-B]-[링커 2]-[VK-B]; 또는
    [VH-A]-[CH1]-[CH2]-[CH3]-[링커 1]-[VK-B]-[링커 2]-[VH-B];
    제2 폴리펩티드 쇄는 N-말단에서 C-말단으로 하기 화학식을 갖거나:
    [VK-A]-[CK]; 또는
    제1 폴리펩티드 쇄는 N-말단에서 C-말단으로 하기 화학식을 갖고:
    [VH-B]-[CH1]-[CH2]-[CH3]-[링커 1]-[VH-A]-[링커 2]-[VK-A]; 또는
    [VH-B]-[CH1]-[CH2]-[CH3]-[링커 1]-[VK-A]-[링커 2]-[VH-A];
    제2 폴리펩티드 쇄는 N-말단에서 C-말단으로 하기 화학식을 가지며:
    [VK-B]-[CK],
    여기서
    VH-A = 본원에 제공된 바와 같은 PD1 항체의 가변 중쇄 도메인;
    VK-A = 본원에 제공된 바와 같은 PD1 항체의 가변 경쇄 도메인;
    VH-B = 본원에 제공된 바와 같은 PD1 항체의 가변 중쇄 도메인;
    VK-B = 본원에 제공된 바와 같은 PD1 항체의 가변 경쇄 도메인;
    CH1 = 본원에 제공된 바와 같은 인간 IgG1의 불변 중쇄 도메인 1;
    CH2 = 본원에 제공된 바와 같은 인간 IgG1의 불변 중쇄 도메인 2;
    CH3 = 본원에 제공된 바와 같은 인간 IgG1의 불변 중쇄 도메인 3;
    CK = 본원에 제공된 바와 같은 카파 경쇄의 불변 도메인;
    링커 1은 글리신/세린, 글리신/알라닌, 글리신/글루탐산/세린 또는 알라닌/글루탐산/리신 링커이고;
    링커 2는 글리신/세린, 글리신/알라닌, 글리신/글루탐산/세린 또는 알라닌/글루탐산/리신 링커이고;
    여기서 VH-A, VK-A, VH-B 및 VK-B는 동일한 항체로부터의 것이거나 또는 상이할 수 있는 것인
    폴리펩티드.
  23. 제22항에 있어서, VH-A 및 VH-B가 독립적으로
    (i) 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하며, 여기서 중쇄 CDR1 서열은 PD-1 항체 표 4, PD-1 항체 표 5, PD-1 항체 Fab 표 6 또는 PD-1 항체 scFv 표 7에 제시된 CDR1 서열 중 임의의 것의 아미노산 서열을 갖고; 중쇄 CDR2는 PD-1 항체 표 4, PD-1 항체 표 5, PD-1 항체 Fab 표 6 또는 PD-1 항체 scFv 표 7에 제시된 CDR2 서열 중 임의의 것의 아미노산 서열을 갖고; 중쇄 CDR3은 PD-1 항체 표 4, PD-1 항체 표 5, PD-1 항체 Fab 표 6 또는 PD-1 항체 scFv 표 7에 제시된 CDR3 서열 중 임의의 것의 아미노산 서열을 갖거나; 또는 상기 중 임의의 것의 변이체를 갖는 것인 중쇄 가변 영역; 및
    (ii) 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하며, 여기서 경쇄 CDR1 서열은 PD-1 항체 표 4, PD-1 항체 표 5, PD-1 항체 Fab 표 6 또는 PD-1 항체 scFv 표 7에 제시된 LCDR1 서열 중 임의의 것의 아미노산 서열을 갖고; 경쇄 LCDR2는 PD-1 항체 표 4, PD-1 항체 표 5, PD-1 항체 Fab 표 6 또는 PD-1 항체 scFv 표 7에 제시된 LCDR2 서열 중 임의의 것의 아미노산 서열을 갖고; 경쇄 CDR3은 PD-1 항체 표 4, PD-1 항체 표 5, PD-1 항체 Fab 표 6 또는 PD-1 항체 scFv 표 7에 제시된 LCDR3 서열 중 임의의 것의 아미노산 서열을 갖거나; 또는 상기 중 임의의 것의 변이체를 갖는 것인 경쇄 가변 영역
    을 포함하는 것인 폴리펩티드.
  24. 제22항에 있어서, VH-A가
    서열식별번호: 37의 제1 CDR, 서열식별번호: 38의 제2 CDR 및 서열식별번호: 39의 제3 CDR을 포함하는 중쇄 가변 영역;
    서열식별번호: 171의 제1 CDR, 서열식별번호: 172의 제2 CDR 및 서열식별번호: 173의 제3 CDR을 포함하는 중쇄 가변 영역;
    서열식별번호: 238의 제1 CDR, 서열식별번호: 239의 제2 CDR 및 서열식별번호: 240의 제3 CDR을 포함하는 중쇄 가변 영역;
    서열식별번호: 279의 제1 CDR, 서열식별번호: 239의 제2 CDR 및 서열식별번호: 240의 제3 CDR을 포함하는 중쇄 가변 영역; 또는
    서열식별번호: 267의 제1 CDR, 서열식별번호: 229의 제2 CDR 및 서열식별번호: 230의 제3 CDR을 포함하는 중쇄 가변 영역
    을 포함하는 것인 폴리펩티드.
  25. 제22항에 있어서, VH-B가
    서열식별번호: 37의 제1 CDR, 서열식별번호: 38의 제2 CDR 및 서열식별번호: 39의 제3 CDR을 포함하는 중쇄 가변 영역;
    서열식별번호: 171의 제1 CDR, 서열식별번호: 172의 제2 CDR 및 서열식별번호: 173의 제3 CDR을 포함하는 중쇄 가변 영역;
    서열식별번호: 238의 제1 CDR, 서열식별번호: 239의 제2 CDR 및 서열식별번호: 240의 제3 CDR을 포함하는 중쇄 가변 영역;
    서열식별번호: 279의 제1 CDR, 서열식별번호: 239의 제2 CDR 및 서열식별번호: 240의 제3 CDR을 포함하는 중쇄 가변 영역; 또는
    서열식별번호: 267의 제1 CDR, 서열식별번호: 229의 제2 CDR 및 서열식별번호: 230의 제3 CDR을 포함하는 중쇄 가변 영역
    을 포함하는 것인 폴리펩티드.
  26. 제22항에 있어서, VK-A 또는 VK-B가
    서열식별번호: 40의 제1 CDR, 서열식별번호: 19의 제2 CDR 및 서열식별번호: 41의 제3 CDR을 포함하는 경쇄 가변 영역;
    서열식별번호: 174의 제1 CDR, 서열식별번호: 175의 제2 CDR 및 서열식별번호: 176의 제3 CDR을 포함하는 경쇄 가변 영역;
    서열식별번호: 174의 제1 CDR, 서열식별번호: 227의 제2 CDR 및 서열식별번호: 176의 제3 CDR을 포함하는 경쇄 가변 영역;
    서열식별번호: 40의 제1 CDR, 서열식별번호: 237의 제2 CDR 및 서열식별번호: 41의 제3 CDR을 포함하는 경쇄 가변 영역; 또는
    서열식별번호: 276의 제1 CDR, 서열식별번호: 237의 제2 CDR 및 서열식별번호: 41의 제3 CDR을 포함하는 경쇄 가변 영역
    을 포함하는 것인 폴리펩티드.
  27. 제22항에 있어서,
    VH-A가 서열식별번호: 37의 제1 CDR, 서열식별번호: 38의 제2 CDR 및 서열식별번호: 39의 제3 CDR을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하고;
    VH-B가 서열식별번호: 171의 제1 CDR, 서열식별번호: 172의 제2 CDR 및 서열식별번호: 173의 제3 CDR을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하거나;
    VK-A가 서열식별번호: 40의 제1 CDR, 서열식별번호: 19의 제2 CDR 및 서열식별번호: 41의 제3 CDR을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고;
    VK-B가 서열식별번호: 174의 제1 CDR, 서열식별번호: 175의 제2 CDR 및 서열식별번호: 176의 제3 CDR을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하거나;
    VK-A가 서열식별번호: 276의 제1 CDR, 서열식별번호: 237의 제2 CDR 및 서열식별번호: 41의 제3 CDR을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고;
    VK-B가 서열식별번호: 174의 제1 CDR, 서열식별번호: 227의 제2 CDR 및 서열식별번호: 176의 제3 CDR을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하거나; 또는
    VK-A가 서열식별번호: 174의 제1 CDR, 서열식별번호: 227의 제2 CDR 및 서열식별번호: 176의 제3 CDR을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고;
    VK-B가 서열식별번호: 40의 제1 CDR, 서열식별번호: 237의 제2 CDR 및 서열식별번호: 41의 제3 CDR을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 것인
    폴리펩티드.
  28. 제22항에 있어서, 링커 1이 (GGGGS)n (서열식별번호: 303)이며, 여기서 n은 1-4이고; 링커 2가 (GGGGS)n (서열식별번호: 303)이며, 여기서 n은 1-4인 폴리펩티드.
  29. 제1, 제2, 제3 및 제4 결합 도메인을 포함하는 이중파라토프 폴리펩티드로서, 여기서 제1, 제2, 제3 및 제4 결합 도메인 중 2개는 PD-1 상의 제1 에피토프에 결합하고, 제1, 제2, 제3 및 제4 결합 도메인 중 다른 2개는 PD-1 상의 제2 에피토프에 결합하고, 여기서 제1 및 제2 에피토프는 상이하고; 여기서 제1, 제2, 제3 및 제4 결합 도메인은 본원에 제공된 것과 같은 PD-1 항체를 포함하는 것인 이중파라토프 폴리펩티드.
  30. 제29항에 있어서, 제1 및 제2 에피토프가 비-중첩되는 것인 이중파라토프 폴리펩티드.
  31. 제29항에 있어서, 제1, 제2, 제3 및 제4 결합 도메인 중 2개가 서열식별번호: 35, 서열식별번호: 113, 서열식별번호: 120, 서열식별번호: 135, 서열식별번호: 169, 서열식별번호: 185, 서열식별번호: 202, 서열식별번호: 256, 서열식별번호: 257, 서열식별번호: 260 또는 서열식별번호: 262 또는 서열식별번호: 275의 서열을 포함하는 중쇄 및 서열식별번호: 36, 서열식별번호: 114, 서열식별번호: 121, 서열식별번호: 136, 서열식별번호: 170, 서열식별번호: 258, 서열식별번호: 259, 서열식별번호: 261 또는 서열식별번호: 263의 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 것인 이중파라토프 폴리펩티드.
  32. 제29항에 있어서, 제1, 제2, 제3 및 제4 결합 도메인 중 2개가
    서열식별번호: 37, 115, 122, 137, 171, 267, 238, 279의 제1 CDR; 서열식별번호: 38, 116, 123, 138, 172, 229, 239의 제2 CDR; 및 서열식별번호: 39, 117, 124, 139, 173, 230, 240의 제3 CDR을 포함하는 중쇄; 및
    서열식별번호: 40, 118, 125, 140, 174, 276의 제1 CDR; 서열식별번호: 19, 126, 47, 175, 227, 237의 제2 CDR 및 서열식별번호: 41, 119, 127, 141, 176의 제3 CDR을 포함하는 경쇄 가변 영역
    을 포함하며, 여기서 모든 결합 도메인이 동일한 것은 아닌
    이중파라토프 폴리펩티드.
  33. 제1항의 폴리펩티드를 포함하는 제약 조성물.
  34. 제31항의 이중파라토프 폴리펩티드를 포함하는 제약 조성물.
  35. 대상체에게 제1항의 폴리펩티드를 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 전신 홍반성 루푸스 (SLE), 에카르디-구티에레스 증후군, 양측 선조체 괴사, 지방이영양증 및 승온을 동반한 만성 비정형 호중구성 피부병 (CANDLE), 완전 비-침투, 유전성 대칭성 색각장애증, 가족성 동창 루푸스, 지방이영양증을 동반한 일본 자가염증성 증후군 (JASL), 관절 구축, 근육 위축, 소구성 빈혈, 지방층염 및 지방이영양증 (JMP), 미코박테리아 질환에 대한 멘델 감수성 (MSMD), 나카조-니시무라 증후군, 뇌 백질이영양증을 동반한 망막 혈관병증 (RVCL), 경직성 하반신부전마비, 영아기에 발병하는 STING-연관 혈관병증 (SAVI), 싱글톤-메르텐 증후군, 또는 척추연골종증 (SPENCD)을 치료하는 방법.
  36. 염증성 장 질환, 자가면역 간염, 원발성 경화성 담관염, 제1형 당뇨병, 이식, GVHD를 갖거나 또는 자가면역 장애를 갖거나 또는 가질 위험이 있거나 또는 가질 위험이 상승된 대상체에게 제1항의 폴리펩티드를 투여하여 염증성 장 질환, 자가면역 간염, 원발성 경화성 담관염, 제1형 당뇨병, 이식, GVHD 또는 자가면역 장애 또는 그의 위험 또는 상승된 위험을 치료하는 것을 포함하는, 염증성 장 질환, 자가면역 간염, 원발성 경화성 담관염, 제1형 당뇨병, 이식, GVHD를 갖거나 또는 자가면역 장애를 갖거나 또는 가질 위험이 있거나 또는 가질 위험이 상승된 대상체를 치료하는 방법.
  37. 제36항에 있어서, 염증성 장 질환을 갖는 대상체가 크론병 또는 궤양성 결장염을 갖는 것인 방법.
  38. 치료 유효량의 제1항의 폴리펩티드를 투여하여 대상체를 치료하는 것을 포함하는, 대상체에서 PD-1의 활성에 대해 효능작용하는 방법.
  39. 인터페론병증의 치료를 필요로 하는 대상체에게 제1항의 폴리펩티드를 투여하여 대상체를 치료하는 것을 포함하는, 인터페론병증의 치료를 필요로 하는 대상체에서 인터페론병증을 치료하는 방법.
  40. 제39항에 있어서, 인터페론병증이 제I형 인터페론병증, 예컨대 전신 홍반성 루푸스 (SLE), 에카르디-구티에레스 증후군, 양측 선조체 괴사, 지방이영양증 및 승온을 동반한 만성 비정형 호중구성 피부병 (CANDLE), 완전 비-침투, 유전성 대칭성 색각장애증, 가족성 동창 루푸스, 지방이영양증을 동반한 일본 자가염증성 증후군 (JASL), 관절 구축, 근육 위축, 소구성 빈혈, 지방층염 및 지방이영양증 (JMP), 미코박테리아 질환에 대한 멘델 감수성 (MSMD), 나카조-니시무라 증후군, 뇌 백질이영양증을 동반한 망막 혈관병증 (RVCL), 경직성 하반신부전마비, 영아기에 발병하는 STING-연관 혈관병증 (SAVI), 싱글톤-메르텐 증후군, 또는 척추연골종증 (SPENCD)인 방법.
  41. 대상체에게 제1항의 폴리펩티드를 투여하는 것을 포함하는, 형질세포양 수지상 세포로부터 인터페론의 생산을 억제하는 방법.
  42. 제42항에 있어서, 형질세포양 수지상 세포가 활성화된 형질세포양 수지상 세포인 방법.
  43. 제42항에 있어서, 인터페론의 생산이 제1항의 폴리펩티드의 부재 하에 생산된 인터페론의 양과 비교하여 약 또는 적어도 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 또는 95%만큼 감소되는 것인 방법.
  44. 대상체에게 제1항의 폴리펩티드를 투여하여 TLR9 매개 장애, 예컨대 전신 홍반성 루푸스 (SLE), 에카르디-구티에레스 증후군, 양측 선조체 괴사, 지방이영양증 및 승온을 동반한 만성 비정형 호중구성 피부병 (CANDLE), 완전 비-침투, 유전성 대칭성 색각장애증, 가족성 동창 루푸스, 지방이영양증을 동반한 일본 자가염증성 증후군 (JASL), 관절 구축, 근육 위축, 소구성 빈혈, 지방층염 및 지방이영양증 (JMP), 미코박테리아 질환에 대한 멘델 감수성 (MSMD), 나카조-니시무라 증후군, 뇌 백질이영양증을 동반한 망막 혈관병증 (RVCL), 경직성 하반신부전마비, 영아기에 발병하는 STING-연관 혈관병증 (SAVI), 싱글톤-메르텐 증후군, 또는 척추연골종증 (SPENCD)을 치료하는 것을 포함하는, TLR9 매개 장애를 치료하는 방법.
  45. 대상체에게 제1항의 폴리펩티드를 투여하거나 또는 이와 세포를 접촉시키는 것을 포함하는, 세포 또는 대상체에서 OAS1, IFIT3, MX1 및 IFN-β1의 발현을 억제하는 방법.
  46. 제1항의 폴리펩티드, 단백질 또는 항체를 코딩하는 핵산.
  47. 제46항의 핵산을 포함하는 벡터.
  48. 제46항의 핵산 또는 제47항의 벡터를 포함하는 세포.
  49. 제48항의 세포를 배양하여 제1항의 폴리펩티드를 제조하는 것을 포함하는, 제1항의 폴리펩티드의 제조 방법.
  50. 제1항의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열의 제조 방법으로서,
    a) 표적화 모이어티를 코딩하는 서열을 포함하는 벡터를 제공하고, 이펙터 결합/조정 모이어티를 코딩하는 서열을 백터 내로 삽입하여, 치료 화합물을 코딩하는 서열을 형성하거나; 또는
    b) 이펙터 결합/조정 모이어티를 코딩하는 서열을 포함하는 벡터를 제공하고, 표적화 모이어티를 코딩하는 서열을 백터 내로 삽입하여, 치료 화합물을 코딩하는 서열을 형성하여,
    이에 의해 제1항의 폴리펩티드를 코딩하는 서열을 제조하는 것을 포함하는 방법.
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