KR20230047259A - 마이크로 캐리어, 세포 복합체 및 이를 포함하는 의료용 조성물, 미용 조성물, 의료 용품 및 미용 용품 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 생체 적합성 고분자를 포함하는 고분자 매트릭스; 및 상기 고분자 매트릭스에 분산되고, 반응성 작용기의 함량이 1 mol/103g 이하인 폴리펩타이드;를 포함하는 고분자 마이크로 입자; 및 상기 고분자 마이크로 입자의 표면 상에 형성된 세포 부착 유도층;을 포함하는, 마이크로 캐리어, 이를 포함하는 세포 복합체, 의료용 조성물, 미용 조성물, 의료 용품 및 미용 용품에 관한 것이다.

Description

마이크로 캐리어, 세포 복합체 및 이를 포함하는 의료용 조성물, 미용 조성물, 의료 용품 및 미용 용품{MICRO CARRIER, CELL COMPOSITE, AND MEDICAL COMPOSITION, COSMETIC COMPOSITION, MEDICAL ARTICLES AND COSMETIC ARTICLES USING THE SAME}
본 발명은 높은 가교 효율 및 생산 수율과 동시에, 안정성을 구현할 수 있을 뿐만 아니라, 단백질 또는 펩타이드 약학 유효물질의 화학적 변형 없이 약물 방출 특성을 확인할 수 있고, 세포탈착공정없이 3차원 배양후 바로 체내 주입이 가능하며, 부착성 세포에 안정적인 환경을 제공하여 세포 생존율이 높아지면서 높은 체내 이식율에 기여할 수 있는 마이크로 캐리어, 및 이를 포함하는 세포 복합체, 의료용 조성물, 미용 조성물, 의료 용품 및 미용 용품에 관한 것이다.
약물 전달 시스템은 약물의 활성을 유지하면서 표적 위치로 약물의 전달 및 방출이 가능하도록 하는 일련의 기술을 의미한다. 고령화 시대에 진입함에 따라 건강 관리 및 약물 치료의 니즈가 증가하고 있으며, 이에 대응하기 위한 약물 전달 기술 개발이 활발히 이루어지고 있다.
약물 전달 시스템은 전달 경로에 따라 경구 투여형, 경피 투여형, 주사형, 폐흡입형, 점막 투여형으로 분류할 수 있다. 경구 투여형은 경구로 투여하는 가장 일반적인 약물 전달 방식으로 시장에서도 가장 높은 비중을 차지하고 있다. 경피 투여형은 피부를 통해 약물을 전달하는 방식으로 장시간 연속 투여가 가능하고 혈중 농도 조절이 쉽다. 주사형은 정맥, 근육, 피하 주사 등으로 나뉘며, 폐흡입형과 점막투여형은 흡수가 빠르고 통증을 회피할 수 있는 장점이 있다. 이러한 약물 전달 시스템 분야에서 이용하는 캐리어는 생체 적합성이 확보되어야 하며, 따라서 천연 고분자를 활용하는 시도들이 계속 이루어지고 있다. 또한 사용하는 약물은 기존의 저분자량 합성 약물에서 고분자량의 단백질이나 펩타이드 의약품으로 확장되고 있다. 약물 전달 시스템의 약물 방출 모델은 시스템 파라미터를 기반으로 시간에 따른 약물 방출 현상을 관찰하기 위한 모델이다. 수식을 기반으로 한 약물 방출 모델은 약물 전달 시스템 내 각 파라미터들이 방출 거동에 어떻게 영향을 주는지 판단 및 예측할 수 있는 도구가 될 수 있으며, 이를 통해 신규 약물 전달 시스템을 설계할 수 있기 때문에 매우 중요하다. 이 과정에서 각 모델에서 시간에 따른 약물의 방출도를 정확하게 측정하고 분석하는 과정이 필요하다.
생체 적합성 고분자인 히알루론산 및 젤라틴은 약물 전달 시스템 캐리어의 고분자 소재로 사용되고 있다. 생체 적합성 물질로 주로 이용되는 히알루론산은 N-아세틸-D-글루코사민과 D-글루쿠론산으로 구성되어 있고 상기 반복단위가 선형으로 연결되어 있는 생체고분자 물질이다. 안구의 유리액, 관절의 활액 및 닭벼슬 등에 많이 존재한다. 히알루론산은 우수한 생체적합성과 점탄성으로 인해 생체 주입형 물질로 흔히 사용되나, 그 자체만으로는 생체 내(in vivo) 또는 산, 알칼리 등의 조건에서 쉽게 분해되어 사용이 제한적이다. 한편, 젤라틴은 생체 결합조직인 콜라겐을 가수분해한 고분자로, 세포 배양용 스캐폴더로 많이 활용된다. 젤라틴의 세포 부착 성능을 이용하여 세포를 포집하거나 배양할 수 있으나, 그 강도가 약하고, 온도에 따른 상전이 특성이 있어, 화학적 방법으로 관능기를 도입하여 물성을 개선하고자 하는 연구들이 있다.
히알루론산과 젤라틴을 이용한 약물 전달 시스템에 관한 다수의 문헌에서는 체내 환경에 대한 소재의 물리/화학적 안정성을 향상시키고자 히알루론산/젤라틴의 화학적 가교를 제안하며, 화학적 가교는 주로 히알루론산의 hydroxyl작용기나 carboxylate와 젤라틴의 아미노산의 잔기인 amine이나 carboxylate 사이의 가교를 통해 진행된다. 그러나, 전달 가능한 단백질이나 펩타이드 유효물질의 경우 대부분 고분자 입자의 구성물질과 동일하게 hydroxyl과 amine과 같은 작용기를 보유하여 가교 과정에서 캐리어에 화학적으로 결합됨으로써, 실제 약물 방출 거동을 확인하기 어렵다.
이에, 전달하고자 하는 단백질 및 펩타이드 약학 유효물질의 구조적 변화를 유발하지 않고 약물 방출 특성 확인이 가능한 마이크로 캐리어 또는 고분자 마이크로 입자의 개발이 필요한 실정이다.
또한, 마이크로 캐리어를 이용하여 부착성 세포의 대량 확장 과정에서 기존 2차원 배양의 한계를 극복하기 위해 표면 효율을 증가시킬 수 있는 구 형태의 마이크로 캐리어가 개발되어 3차원적 확장 배양에 이용되고 있으며, 배양 종료 후 세포 탈착 과정을 통해 세포를 회수하고 있는 종래 기술 상 탈착 공정 추가에 따른 제조 비용 증가, 세포 손상 유발의 문제가 있었다.
그리고, 주사형 세포 치료제의 경우, 주로 액상에 세포가 부유하는 상태로 환부에 주입하게 됨에 따라, 부착성 세포의 경우 생존에 안정적이지 않은 환경과 체내 면역반응에 인해 체내 이식율 및 세포 생존율이 낮아지는 한계가 있었다.
이에, 세포탈착공정없이 3차원 배양후 바로 체내 주입이 가능하며, 부착성 세포에 안정적인 환경을 제공하여 세포 생존율이 높아지면서 높은 체내 이식율에 기여할 수 있는 마이크로 캐리어의 개발이 필요한 실정이다.
본 발명은 높은 가교 효율 및 생산 수율과 동시에, 안정성을 구현할 수 있을 뿐만 아니라, 단백질 또는 펩타이드 약학 유효물질의 화학적 변형 없이 약물 방출 특성을 확인할 수 있고, 세포탈착공정없이 3차원 배양후 바로 체내 주입이 가능하며, 부착성 세포에 안정적인 환경을 제공하여 세포 생존율이 높아지면서 높은 체내 이식율에 기여할 수 있는 마이크로 캐리어를 제공하기 위한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 마이크로 캐리어를 포함하는, 세포 복합체를 제공하기 위한 것이다.
또한, 본 발명은 상기의 마이크로 캐리어 또는 세포 복합체를 포함하는 의료용 조성물을 제공하기 위한 것이다.
또한, 본 발명은 상기의 마이크로 캐리어 또는 세포 복합체를 포함하는 미용 조성물을 제공하기 위한 것이다.
또한, 본 발명은 상기의 의료용 조성물을 포함하는 의료 용품을 제공하기 위한 것이다.
또한, 본 발명은 상기의 미용 조성물을 포함하는 미용 용품을 제공하기 위한 것이다.
본 명세서에서는, 생체 적합성 고분자를 포함하는 고분자 매트릭스; 및 상기 고분자 매트릭스에 분산되고, 반응성 작용기의 함량이 1 mol/103g 이하인 폴리펩타이드;를 포함하는 고분자 마이크로 입자; 및 상기 고분자 마이크로 입자의 표면 상에 형성된 세포 부착 유도층;을 포함하는, 마이크로 캐리어가 제공된다.
본 명세서에서는 또한, 상기 마이크로 캐리어; 및 상기 마이크로 캐리어 표면 상에 부착된 세포;를 포함하는, 세포 복합체가 제공된다.
본 명세서에서는 또한, 상기의 마이크로 캐리어 또는 세포 복합체를 포함하는, 의료용 조성물이 제공된다.
본 명세서에서는 또한, 상기의 마이크로 캐리어 또는 세포 복합체를 포함하는, 미용 조성물이 제공된다.
본 명세서에서는 또한, 상기의 의료용 조성물을 포함하는 의료 용품이 제공된다.
본 명세서에서는 또한, 상기의 미용 조성물을 포함하는 미용 용품이 제공된다.
이하 발명의 구체적인 구현예에 따른 마이크로 캐리어, 및 이를 포함하는 세포 복합체, 의료용 조성물, 미용 조성물, 의료 용품 및 미용 용품에 대하여 보다 상세하게 설명하기로 한다.
본 명세서에서 명시적인 언급이 없는 한, 전문용어는 단지 특정 실시예를 언급하기 위한 것이며, 본 발명을 한정하는 것을 의도하지 않는다.
본 명세서에서 사용되는 단수 형태들은 문구들이 이와 명백히 반대의 의미를 나타내지 않는 한 복수 형태들도 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 '포함'의 의미는 특정 특성, 영역, 정수, 단계, 동작, 요소 및/또는 성분을 구체화하며, 다른 특정 특성, 영역, 정수, 단계, 동작, 요소, 성분 및/또는 군의 존재나 부가를 제외시키는 것은 아니다.
그리고, 본 명세서에서 '제 1' 및 '제 2'와 같이 서수를 포함하는 용어는 하나의 구성요소를 다른 구성요소로부터 구별하는 목적으로 사용되며, 상기 서수에 의해 한정되지 않는다. 예를 들어, 본 발명의 권리 범위 내에서 제 1 구성요소는 제 2 구성요소로도 명명될 수 있고, 유사하게 제 2 구성요소는 제 1 구성요소로 명명될 수 있다.
본 명세서에서 "치환 또는 비치환된" 이라는 용어는 중수소; 할로겐기; 시아노기; 니트로기; 히드록시기; 카르보닐기; 에스테르기; 이미드기; 아미드기; 1차 아미노기; 카르복시기; 술폰산기; 술폰아미드기; 포스핀옥사이드기; 알콕시기; 아릴옥시기; 알킬티옥시기; 아릴티옥시기; 알킬술폭시기; 아릴술폭시기; 실릴기; 붕소기; 알킬기; 시클로알킬기; 알케닐기; 아릴기; 아르알킬기; 아르알케닐기; 알킬아릴기; 알콕시실릴알킬기; 아릴포스핀기; 또는 N, O 및 S 원자 중 1개 이상을 포함하는 헤테로고리기로 이루어진 군에서 선택된 1개 이상의 치환기로 치환 또는 비치환되거나, 상기 예시된 치환기 중 2 이상의 치환기가 연결된 치환 또는 비치환된 것을 의미한다. 예컨대, "2 이상의 치환기가 연결된 치환기"는 바이페닐기일 수 있다. 즉, 바이페닐기는 아릴기일 수도 있고, 2개의 페닐기가 연결된 치환기로 해석될 수도 있다.
본 명세서에서 (공)중합체는 중합체 또는 공중합체를 모두 포함하는 의미이며, 상기 중합체는 단일 반복단위로 이루어진 단독중합체를 의미하고, 공중합체는 2종 이상의 반복단위를 함유한 복합중합체를 의미한다.
본 명세서에서, 사용한 고분자의 분자량은 제조사의 측정 방법을 따르며, 그 방법은 통상적인 GPC측정법을 벗어나지 않는다. 예를 들어, 본 명세서에서, 중량 평균 분자량은 광산란법(light scattering methods) 또는 점도법으로 측정된 분자량을 의미할 수 있다.
본 발명은 다양한 변경을 가할 수 있고 여러 가지 형태를 가질 수 있는 바, 특정 실시예들을 예시하고 하기에서 상세하게 설명하고자 한다. 그러나, 이는 본 발명을 특정한 개시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 상기 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
본 명세서에서 마이크로 입자라 함은, 입자 단면이 원형 또는 타원형이고, 입자의 단축/장축의 비(구형화율)가 0.7 내지 1.0의 범위인 것을 의미한다. 입자의 단축 및 장축의 길이는 입자에 대한 광학 사진을 촬영하고, 광학 사진에서의 임의의 입자 30 개 내지 100개의 평균 값을 계산함으로써 도출될 수 있다.
본 명세서에서, 에멀전이란, 유상 또는 수상의 섞이지 않는 액체 중 하나 이상을 미립자 상태(분산질)로 다른 액체(분산매)에 분산시켜 놓은 혼합상을 의미한다. 에멀전은 분산상의 입도 크기에 따라, 통상적으로, 마크로에멀전, 마이크로에멀전, 나노에멀전으로 나뉠 수 있다.
이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
1. 마이크로 캐리어
발명의 일 구현예에 따르면, 생체 적합성 고분자를 포함하는 고분자 매트릭스; 및 상기 고분자 매트릭스에 분산되고, 반응성 작용기의 함량이 1 mol/103g 이하인 폴리펩타이드;를 포함하는 고분자 마이크로 입자; 및 상기 고분자 마이크로 입자의 표면 상에 형성된 세포 부착 유도층;을 포함하는, 마이크로 캐리어가 제공될 수 있다.
종래의 고분자 마이크로 입자는, 유기 용매 상에 바로 입자를 첨가하여 가교반응을 진행함에 따라, 고분자의 농도 및 가교제의 함량에 따라 입자의 형태가 크게 좌우되며, 특히 고분자의 농도가 낮거나 가교제의 함량이 적을 경우 입자의 형태가 유지되지 못하여 마이크로 입자의 형성이 어렵다는 문제가 있었다.
이에, 본 발명자들은 후술하는 고분자 마이크로 입자의 제조방법과 같이, 2차에 걸쳐 가교 반응을 진행함에 따라 동일한 가교제 양으로 가교밀도를 극대화시키는 동시에, 마이크로 입자 내 약학 유효 물질의 방출 거동을 확인하고 발명을 완성하였다.
특히, 2차에 걸친 가교 반응 중 2차 가교 반응을 고체상에서 진행함에 따라, 적은 양의 가교제로도 구형의 입자를 구현할 수 있으며, 생산 수율이 향상된다는 점 또한 실험을 통해 확인하였다.
또한, 상기 일 구현예의 마이크로 캐리어는 상기 고분자 마이크로 입자의 표면 상에 형성된 세포 부착 유도층을 포함함에 따라, 세포탈착공정없이 3차원 배양후 바로 체내 주입이 가능하며, 부착성 세포가 안정적으로 마이크로 캐리어와 부착한 상태로 복합체를 형성함으로써, 세포 생존율이 높아지면서 높은 체내 이식율을 구현할 수 있음을 실험을 통해 확인하고 발명을 완성하였다.
구체적으로, 상기 생체 적합성 고분자란 인체에 적용되는 의약들의 효과적인 약물 전달을 위하여, 인체 내에 직접 주입이 가능한 고분자를 의미한다. 구체적으로 상기 생체 적합성 고분자는, 히알루론산(Hyaluronic acid: HA), 카르복시메틸셀룰로오스(Carboxymethyl cellulose: CMC), 알긴산(alginic acid), 펙틴, 카라기난, 콘드로이틴(설페이트), 덱스트란(설페이트), 키토산, 폴리라이신(polylysine), 콜라겐, 젤라틴, 카르복시메틸 키틴(carboxymethyl chitin), 피브린, 아가로스, 풀루란, 폴리에스테르아마이드(polyesteramide), 폴리(발레릭 산), 폴리아크릴레이트, 셀룰로오스 아세테이트, 폴리(비닐 이미다졸), 폴리비닐피롤리돈(PVP), 폴리메타크릴레이트, 하이드록시프로필메틸셀룰로오스(HPMC), 에틸셀룰로오스(EC), 하이드록시프로필셀룰로오스(HPC), 싸이클로덱스트린, 및 폴리 아크릴산 공중합체, 및 이들의 유도체로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상의 고분자일 수 있다.
보다 구체적으로, 상기 생체 적합성 고분자는 히알루론산(Hyaluronic acid: HA), 젤라틴 또는 히알루론산 및 젤라틴의 혼합물일 수 있다.
　본 명세서에서, 히알루론산은 히알루론산 자체와 히알루론산 염을 모두 포함하는 의미일 수 있다. 이에 따라, 히알루론산 수용액은 히알루론산의 수용액, 히알루론산 염의 수용액, 및 히알루론산 과 히알루론산 염의 혼합 수용액을 모두 포함하는 개념일 수 있다. 상기 히알루론산 염은 히알루론산 나트륨, 히알루론산 칼륨, 히알루론산 칼슘, 히알루론산 마그네슘, 히알루론산 아연, 히알루론산 코발트 등의 무기염과, 히알루론산 테트라부틸암모늄 등의 유기염 및 그 혼합물일 수 있다.
발명의 일 구현예에서, 히알루론산의 분자량은 특별히 제한되는 것은 아니지만, 다양한 물성과 생체적합성을 구현하기 위해 500 g/mol 이상 5,000,000 g/mol 이하임이 바람직하다.
본 명세서에서, 젤라틴은 동물에서 유래된 콜라겐을 산 또는 알칼리로 처리하고 후속하여 추출하여 수득되는 단백질을 의미할 수 있다.
발명의 일 구현예에서, 젤라틴의 분자량은 특별히 제한되는 것은 아니지만, 다양한 물성과 생체적합성을 구현하기 위해 100,000 g/mol 이상 5,000,000 g/mol 이하임이 바람직하다.
본 발명자들은, 고분자 마이크로 입자에 대한 연구를 진행하여, 후술하는 바와 같이 팽윤된 에멀젼에서 1차 가교반응 이후 탈수 응집된 고체상에서 진행되는 2차의 가교반응을 거침에 따라, 동일한 가교제 양으로 가교밀도를 극대화됨을 확인하고 발명을 완성하였다.
특히, 2차에 걸친 가교 반응 중 2차 가교 반응을 보다 응집된 고체상에서 진행함에 따라, 적은 양의 가교제로도 구형의 입자를 구현할 수 있으며, 생산 수율이 향상된다는 점 또한 실험을 통해 확인하고 발명을 완성하였다.
또한, 종래 사용되는 고분자 마이크로 입자의 경우, 제조 중 약학 유효 물질이 가교에 참여하게 되어 구조가 변하거나 혹은 실제 방출 특성이 없거나 저하되는 기술적 문제점이 있었으나, 본원 고분자 마이크로 입자의 경우 상기 고분자 매트릭스에 분산되고, 반응성 작용기의 함량이 1 mol/103g 이하인 폴리펩타이드를 이용함에 따라 우수한 단백질 약물 방출 모델로서의 특성이 구현될 수 있다는 것을 실험을 통해 확인하고 발명을 완성하였다.
구체적으로, 상기 일 구현예의 마이크로 캐리어에 포함된 고분자 마이크로 입자는 반응성 작용기의 함량이 1 mol/103g 이하, 또는 0.001 mol/103g 이상 1 mol/103g 이하, 또는 0.001 mol/103g 이상 0.5 mol/103g 이하, 또는 0.001 mol/103g 이상 0.1 mol/103g 이하인 폴리펩타이드를 포함할 수 있다.
즉, 상기 일 구현예에서, 폴리펩타이드의 반응성 작용기의 함량이 1 mol/103g 이하임은, 상기 일 구현예의 마이크로 캐리어에 포함된 고분자 마이크로 입자에 포함되는 폴리펩타이드 103g 에 대하여, 반응성 작용기가 1 mol 이하로 포함됨을 의미할 수 있다.
상기 반응성 작용기 함량의 측정 방법은 크게 제한되지 않으나, 예를 들어 폴리펩타이드 103g을 유기 용매에 용해시키고, 메틸레드 또는 페놀프탈레인 등의 지시약을 첨가한 이후 0.1M 염산 (아민 작용기) 또는 수산화나트륨 (카르복실 작용기)으로 중화 적정함에 따라 측정하거나, 하기와 같은 수학식을 통하여 계산할 수 있다.
[수학식]
반응성 아민 (카르복실) 작용기 함량 (mol/103g) = 첨가한 염산의 양 (L) (또는 수산화나트륨의 양) x 염산 수용액의 molarity (mol/L) (또는 수산화나트륨 수용액의 molarity) / 용매에 용해시킨 폴리펩타이드의 양 (103g)
상기 일 구현예의 마이크로 캐리어에 포함된 고분자 마이크로 입자는 폴리펩타이드의 반응성 작용기의 함량이 1 mol/103g 이하임에 따라, 폴리펩타이드에 반응성 작용기가 존재하지 않거나 극소량으로 포함되어, 고분자 마이크로 입자의 물리적 및 화학적 안정성 향상을 위한 화학적 가교 과정에서 가교제와 폴리펩타이드 내 반응성 작용기의 반응을 최소화할 수 있다. 이에 따라, 가교에 의한 단백질 약물의 기능 상실의 문제점이 발생하지 않을 뿐만 아니라, 우수한 단백질 약물 방출특성이 구현될 수 있다.
상기 일 구현예에서, 상기 폴리펩타이드의 유체 역학적 반경(hydrodynamic radius)은 1 nm 내지 30 nm, 또는 1 nm 내지 20 nm, 또는 1 nm 내지 15 nm 일 수 있다.
상기 폴리펩타이드의 유체 역학적 반경(hydrodynamic radius)은 1 nm 내지 30 nm 임에 따라 동일한 고분자 마이크로 입자에서의 폴리펩타이드 방출 속도를 조절할 수 있는 기술적 효과가 구현될 수 있다.
구체적으로, 상기 폴리펩타이드의 유체 역학적 반경(hydrodynamic radius) 은 1 mg/mL 농도의 폴리펩타이드 수용액 3 mL를 plastic square cuvette에 넣고 37°C조건에서 NanoBrook 173 plus (Brookhaven Instruments Corporation) 장치를 이용하여 측정할 수 있다.
한편, 상기 일 구현예에서 반응성 작용기의 함량이 1 mol/103g 이하인 폴리펩타이드는, 표면의 반응성 작용기가 블록킹 화합물로 90 몰% 이상, 또는 90 몰% 이상 100 몰% 이하, 또는 95 몰% 이상 100 몰% 이하, 또는 99몰% 이상 100 몰% 이하 치환된 폴리펩타이드를 포함할 수 있다.
상기 블록킹 화합물의 예가 크게 한정되는 것은 아니며, 상기 폴리펩타이드에 함유된 반응성 작용기와 반응하여 화학결합을 형성할 수 있는 관능기 및 반응성이 약한 블록킹 그룹을 갖는 화합물이라면 제한없이 사용가능하다.
상기 폴리펩타이드에 함유된 반응성 작용기와 반응하여 화학결합을 형성할 수 있는 관능기의 일례를 들면, 이소시아네이트기, 카르복시기, 할로겐기 등을 들 수 있다. 또한, 상기 반응성이 약한 블록킹 그룹의 일례를 들면, 탄소수 1 내지 50의 알킬기, 탄소수 2 내지 50의 시클로알킬기, 탄소수 6 내지 50의 아릴기, 탄소수 3 내지 50의 헤테로아릴기 등을 들 수 있다.
본 명세서에 있어서, 알킬기는 알케인(alkane)으로부터 유래한 1가의 작용기로, 직쇄 또는 분지쇄일 수 있고, 상기 직쇄 알킬기의 탄소수는 특별히 한정되지 않으나 1 내지 20인 것이 바람직하다. 또한, 상기 분지쇄 알킬기의 탄소수는 3 내지 20이다. 알킬기의 구체적인 예로는 메틸, 에틸, 프로필, n-프로필, 이소프로필, 부틸, n-부틸, 이소부틸, tert-부틸, sec-부틸, 1-메틸-부틸, 1-에틸-부틸, 펜틸, n-펜틸, 이소펜틸, 네오펜틸, tert-펜틸, 헥실, n-헥실, 1-메틸펜틸, 2-메틸펜틸, 4-메틸-2-펜틸, 3,3-디메틸부틸, 2-에틸부틸, 헵틸, n-헵틸, 1-메틸헥실, 옥틸, n-옥틸, tert-옥틸, 1-메틸헵틸, 2-에틸헥실, 2-프로필펜틸, n-노닐, 2,2-디메틸헵틸, 1-에틸-프로필, 1,1-디메틸-프로필, 이소헥실, 2-메틸펜틸, 4-메틸헥실, 5-메틸헥실, 2,6-디메틸헵탄-4-일 등이 있으나, 이들에 한정되지 않는다. 상기 알킬기는 치환 또는 비치환될 수 있으며, 치환되는 경우 치환기의 예시는 상술한 바와 같다.
본 명세서에 있어서, 시클로알킬기는 시클로알케인(cycloalkane)으로부터 유래한 1가의 작용기로, 단환식 또는 다환식 일 수 있고, 특별히 한정되지 않으나, 탄소수는 3 내지 20이다. 또 하나의 실시상태에 따르면, 상기 시클로알킬기의 탄소수는 3 내지 10이다. 구체적으로 시클로프로필, 시클로부틸, 시클로펜틸, 3-메틸시클로펜틸, 2,3-디메틸시클로펜틸, 시클로헥실, 3-메틸시클로헥실, 4-메틸시클로헥실, 2,3-디메틸시클로헥실, 3,4,5-트리메틸시클로헥실, 4-tert-부틸시클로헥실, 시클로헵틸, 시클로옥틸, 바이시클로[2,2,1]헵틸 등이 있으나, 이에 한정되지 않는다. 상기 시클로알킬기는 치환 또는 비치환될 수 있으며, 치환되는 경우 치환기의 예시는 상술한 바와 같다.
본 명세서에 있어서, 아릴기는 아렌(arene)으로부터 유래한 1가의 작용기로, 특별히 한정되지 않으나 탄소수 6 내지 20인 것이 바람직하며, 단환식 아릴기 또는 다환식 아릴기일 수 있다. 상기 아릴기가 단환식 아릴기로는 페닐기, 바이페닐기, 터페닐기 등이 될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 다환식 아릴기로는 나프틸기, 안트라세닐기, 페난트릴기, 파이레닐기, 페릴레닐기, 크라이세닐기, 플루오레닐기 등이 될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 아릴기는 치환 또는 비치환될 수 있으며, 치환되는 경우 치환기의 예시는 상술한 바와 같다.
본 명세서에 있어서, 헤테로아릴기는 탄소가 아닌 원자, 이종원자를 1 이상 포함하는 것으로서, 구체적으로 상기 이종 원자는 O, N, Se 및 S 등으로 이루어진 군에서 선택되는 원자를 1 이상 포함할 수 있다. 탄소수는 특별히 한정되지 않으나, 탄소수 4 내지 20인 것이 바람직하며, 상기 헤테로아릴기는 단환식 또는 다환식일 수 있다. 헤테로고리기의 예로는 티오펜기, 퓨라닐기, 피롤기, 이미다졸릴기, 티아졸릴기, 옥사졸릴기, 옥사디아졸릴기, 피리딜기, 바이피리딜기, 피리미딜기, 트리아지닐기, 트리아졸릴기, 아크리딜기, 피리다지닐기, 피라지닐기, 퀴놀리닐기, 퀴나졸리닐기, 퀴녹살리닐기, 프탈라지닐기, 피리도 피리미딜기, 피리도 피라지닐기, 피라지노 피라지닐기, 이소퀴놀리닐기, 인돌릴기, 카바졸릴기, 벤즈옥사졸릴기, 벤즈이미다졸릴기, 벤조티아졸릴기, 벤조카바졸릴기, 벤조티오펜기, 디벤조티오펜기, 벤조퓨라닐기, 페난쓰롤리닐기(phenanthroline), 티아졸릴기, 이소옥사졸릴기, 옥사디아졸릴기, 티아디아졸릴기, 벤조티아졸릴기, 페노티아지닐기, 아지리딜기, 아자인돌릴기, 이소인돌릴기, 인다졸릴기, 퓨린기(purine), 프테리딜기(pteridine), 베타-카볼릴기, 나프티리딜기(naphthyridine), 터-피리딜기, 페나지닐기, 이미다조피리딜기, 파이로피리딜기, 아제핀기, 피라졸릴기 및 디벤조퓨라닐기 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 헤테로아릴기는 치환 또는 비치환될 수 있으며, 치환되는 경우 치환기의 예시는 상술한 바와 같다.
할로겐기의 예로는 불소, 염소, 브롬 또는 요오드가 있다.
보다 구체적인 일례를 들면, 상기 블록킹 화합물의 예로는, 친전자성 탄소를 포함한 관능기를 가진 블록킹 화합물로서, 플루오레세인 이소티오시아네이트(Fluorescein isothiocyanate, FITC), 로다민 B 이소티오시아네이트(Rhodamine B isothiocyanate, RBITC), 테트라메틸로다민 B 이소티오시아네이트(Tetramethylrhodamine B isothiocyanate), N-hydroxy-succinimidyl-ester linked fluorescein (NHS-fluorescein), 6-[Fluorescein-5(6)-carboxamido]hexanoic acid N-hydroxysuccinimide ester, Fluorescein-5-EX N-hydroxysuccinimide ester, Alexa Fluor™ 350 NHS Ester, Alexa Fluor™ 430 NHS Ester, Alexa Fluor™ 488 NHS Ester, Rhodamine Green™ Carboxylic Acid, Succinimidyl Ester, Hydrochloride (5(6)-CR 110, SE), Rhodamine Red™-X, Succinimidyl Ester, 5-isomer, 및 Alexa Fluor™ 647 NHS Ester 로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 화합물을 들 수 있다.
상기 일 구현예에서, 폴리펩타이드의 반응성 작용기가 블록킹 화합물과 반응하여 90 몰% 이상 치환됨에 따라, 상술한 바와 같이 상기 일 구현예의 마이크로 캐리어에 포함된 고분자 마이크로 입자에 포함되는 폴리펩타이드의 반응성 작용기의 함량이 1 mol/103g 이하일 수 있다.
즉, 상기 일 구현예에서, 폴리펩타이드의 반응성 작용기가 블록킹 화합물과 반응하여 90 몰% 이상 치환됨에 따라, 폴리펩타이드에 반응성 작용기가 존재하지 않거나 극소량으로 포함되어, 고분자 마이크로 입자의 물리적 및 화학적 안정성 향상을 위한 화학적 가교 과정에서 가교제와 반응성 작용기의 반응을 최소화할 수 있다. 이에 따라, 가교에 의한 단백질 약물의 기능 상실의 문제점이 발생하지 않을 뿐만 아니라, 우수한 단백질 약물 방출특성이 구현될 수 있다.
상기 일 구현예에서, 상기 반응성 작용기는 아민기, 하이드록시, 페닐 하이드록시기 및 이미도기로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
상기 반응성 작용기는 고분자 마이크로 입자에 포함되는 폴리펩타이드에 포함된 반응성 작용기 일 수 있다.
상기 반응성 작용기가 물리적 및 화학적 안정성 향상을 위한 화학적 가교 과정에서 가교제와 반응함에 따라, 가교에 의한 단백질 약물의 기능 상실뿐만 아니라 단백질 약물 방출특성이 구현되지 않는 문제점이 발생할 수 있다.
상기 일 구현예에서, 상기 폴리펩타이드는 블록킹 화합물과 반응성 작용기의 결합물인 작용기를 갖는 폴리펩타이드를 포함할 수 있다. 즉, 상기 폴리펩타이드는 블록킹 화합물과 반응성 작용기의 결합물인 작용기 및 블록킹 화합물과 반응하지 않은 반응성 작용기를 가질 수 있다. 그리고, 상기 폴리펩타이드는 블록킹 화합물과 반응하지 않은 반응성 작용기의 함량이 상술한 바와 같이 1 mol/103g 이하를 만족할 수 있다.
상기 블록킹 화합물과 반응성 작용기의 결합물인 작용기의 예가 크게 한정되는 것은 아니며, 상술한 다양한 블록킹 화합물과 반응성 작용기의 반응으로 얻어지는 반응생성물에 포함된 작용기라면 제한없이 적용가능하다. 상기 블록킹 화합물과 반응성 작용기의 결합물인 작용기의 일례를 들면, 우레탄, 티오우레탄, 우레아, 티오우레아, 아미드, 에테르, 티오에테르, 아민 등을 들 수 있다.
보다 구체적인 일례를 들면, 상기 폴리펩타이드는 이소티오시아네이트(Isothiocyanate)기를 포함한 블록킹 화합물과 반응성 작용기의 결합물인 티오우레아 또는 티오우레탄계 작용기를 갖는 폴리펩타이드를 포함할 수 있다.
구체적으로, 상기 고분자 마이크로 입자는, 이소티오시아네이트(Isothiocyanate) 를 포함하는 블로킹 화합물과 반응성 작용기를 포함하는 폴리펩타이드의 반응결과물을 포함할 수 있다.
즉, 이소티오시아네이트(Isothiocyanate) 를 포함하는 블로킹 화합물에 포함되는 이소티오시아네이트(Isothiocyanate)기 (-N=C=S)와 반응성 작용기를 포함하는 폴리펩타이드에 포함되는 반응성 작용기가 반응하여 티오우레아계 작용기를 형성하여, 티오우레아계 작용기를 갖는 폴리펩타이드를 포함할 수 있다.
또한, 상기 반응성 작용기를 포함하는 폴리펩타이드의 예가 크게 제한되는 것은 아니나, 상기 일 구현예의 고분자 마이크로 입자의 적용 용도에 따라, 해당 용도에 적합한 폴리펩타이드를 제한 없이 적용할 수 있다. 즉, 상기 폴리펩타이드의 구체적인 예는 한정되지 않고, 1차 아민을 N 말단에 포함할 수 있다. 예를 들어 상기 폴리펩타이드는 폴리글라이신, 폴리알라닌, 폴리발린, 폴리류신, 폴리아이소류신, 폴리페닐알라닌, 폴리트립토판, 폴리 글루탐산, 폴리프롤린, 폴리아스팔산일 수 있다.
상기 폴리펩타이드가 1차 아민외 친핵성 관능기를 1 mol/103g 이상 포함할 경우, 블로킹 화합물과의 반응에도 반응성 작용기가 모두 보호되지 않아, 화학적 가교제와 보호되지 않은 반응성 작용기의 부가 반응으로 인하여 고분자 마이크로 입자의 약물 방출 특성이 저하될 수 있다.
상기 폴리펩타이드의 첨가량 또한 크게 한정되지 않으며, 적용 용도와 대상에 따라 함량을 제한없이 사용할 수 있다. 예를 들어, 상기 폴리펩타이드는 상기 고분자 마이크로 입자 100 중량부 대비 0.0001 중량부 이상 1000 중량부 이하로, 고분자 마이크로 입자 대비 소량, 과량 제한없이 포함될 수 있다.
한편, 상기 고분자 매트릭스는 생체 적합성 고분자가 제1 가교제를 매개로 가교된 제1 가교 영역; 및 생체 적합성 고분자가 제2 가교제를 매개로 가교된 제2가교 영역;을 포함할 수 있다.
상기 제1 가교 영역은 생체 적합성 고분자를 포함하는 에멀전과 제1 가교제의 1차 가교반응이 진행되어 형성된 가교 영역을 의미하며, 상기 제2 가교 영역은 생체 적합성 고분자를 포함하는 에멀전에서 제1 가교제와의 1차 가교반응이 진행되지 않아, 제2 가교제와 2차 가교반응이 진행되어 형성된 가교 영역 및 제1 가교영역과 제2 가교제가 추가적인 2차 가교반응을 통하여 형성된 가교 영역을 의미할 수 있다.
상기 발명의 일 구현예에서 제1 가교제는, 그 예가 크게 제한되는 것은 아니다. 구체적으로 상기 제1 가교제는 염화 철(Ⅲ),　염화 알루미늄 중 하나를 포함할 수 있다.
상기 발명의 일 구현예에서 제2 가교제는, 그 예가 크게 제한되는 것은 아니다. 구체적으로 상기 제2 가교제는 부탄디올디글리시딜에테르(1,4-butandiol diglycidyl ether: BDDE), 에틸렌글리콜디글리시딜에테르(ethylene glycol diglycidyl ether: EGDGE), 헥산디올디글리시딜에테르(1,6-hexanediol diglycidyl ether), 프로필렌글리콜디글리시딜에테르(propylene glycol diglycidyl ether), 폴리프로필렌글리콜디글리시딜에테르(polypropylene glycol diglycidyl ether), 폴리테트라메틸렌글리콜디글리시딜에테르(polytetramethylene glycol diglycidyl ether), 네오펜틸글리콜디글리시딜에테르(neopentyl glycol diglycidyl ether), 폴리글리콜폴리글리시딜에테르(polyglycerol polyglycidyl ether), 디글리세롤폴리글리시딜에테르(diglycerol polyglycidyl ether), 글리세롤폴리글리시딜에테르(glycerol polyglycidyl ether), 트리메틸프로판폴리글리시딜에테르(tri-methylpropane polyglycidyl ether), 비스에폭시프로폭시에틸렌(1,2-(bis(2,3-epoxypropoxy)ethylene), 펜타에리쓰리톨폴리글리시딜에테르(pentaerythritol polyglycidyl ether), 소르비톨폴리글리시딜에테르(sorbitol polyglycidyl ether), 디비닐설폰(divinylsulfone) 및 글루타알데히드(glutaraldehyde)로 이루어진 군에서 선택된 하나를 포함할 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 제2 가교제는 부탄디올디글리시딜에테르(1,4-butandiol diglycidyl ether: BDDE)일 수 있다.
한편, 상기 마이크로 캐리어에 포함된 고분자 마이크로 입자는 증류수에서의 평균 직경이 1 ㎛ 이상 1000 ㎛ 이하, 100 ㎛ 이상 1000 ㎛ 이하, 100 ㎛ 이상 800 ㎛ 이하, 100 ㎛ 이상 750 ㎛ 이하, 100 ㎛ 이상 600 ㎛ 이하, 150 ㎛ 이상 600 ㎛ 이하일 수 있는데, 고분자 마이크로 입자의 평균 직경이 상술한 범위를 만족하는 경우 세포 부착 및 배양 성능이 우수하다.
또한, 상기 마이크로 캐리어에 포함된 고분자 마이크로 입자는 하기 수학식 1에 의한 팽윤도가 10 이하, 0.1 이상 10 이하, 0.1 이상 5이하, 0.5 이상 5이하, 0.9 이상 4.5 이하일 수 있다.
[수학식 1]
팽윤도 = {(증류수에서의 평균직경)3 - (건조 입자의 평균직경)3} / (건조 입자의 평균직경)3.
상기 고분자 마이크로 입자의 팽윤도가 10을 초과하는 경우, 가교 밀도가 낮고 기계적 강도가 열등하여 안정성이 저하되는 기술적 문제점이 발생할 수 있다.
또한, 상기 일 구현예의 마이크로 캐리어에 포함된 고분자 마이크로 입자는, 150 시간 이상 배양한 이후, pH 5.0 이상 및 30 ℃ 이상 40 ℃ 이하의 방출 조건에서 약학 유효물질의 방출량이 20 % 이상 100 % 이하, 50 % 이상 100 % 이하, 75 % 이상 100 % 이하, 90 % 이상 100 % 일 수 있다.
상기 방출 조건은 구체적으로 pH 5.0 이상, pH 5.0 이상 pH 14.0 이하, pH 5.0 이상 pH 11.0 이하, pH 5.6 이상 pH 11.0 이하일 수 있다.
또한, 상기 방출 조건은 구체적으로 30 ℃ 이상 40 ℃ 이하, 35 ℃ 이상 40 ℃ 이하, 36 ℃ 이상 38 ℃ 이하일 수 있다.
상기 일 구현예의 마이크로 캐리어에 포함된 고분자 마이크로 입자의 방출량이 20 % 이상 100 % 이하임에 따라, 가교제를 사용하여 약물 유효 물질 방출 특성이 우수한 고분자 마이크로 입자가 구현될 수 있다.
한편, 상기 일 구현예의 마이크로 캐리어에 포함된 고분자 마이크로 입자를 제조하는 방법의 예가 크게 한정되는 것은 아니나, 예를 들어, 폴리펩타이드 및 블록킹 화합물의 결합물, 생체 적합성 고분자 및 제1 가교제를 포함한 혼합물을 1차 가교반응시켜 가교 입자를 형성하는 단계; 및 상기 가교 입자를 추출하여 제2 가교제를 포함한 유기 용매 상에서 2차 가교 반응시키는 단계;를 포함하는, 고분자 마이크로 입자의 제조방법이 사용될 수 있다.
종래의 고분자 마이크로 입자는, 유기 용매 상에 바로 입자를 첨가하여 가교반응을 진행함에 따라, 고분자의 농도 및 가교제의 함량에 따라 입자의 형태가 크게 좌우되며, 특히 고분자의 농도가 낮거나 가교제의 함량이 적을 경우 입자의 형태가 유지되지 못하여 마이크로 입자의 형성이 어렵다는 문제가 있었다.
이에, 본 발명자들은 상기 고분자 마이크로 입자의 제조방법과 같이, 2차에 걸쳐 가교 반응을 진행함에 따라 동일한 가교제 양으로 가교밀도를 극대화 시키는 동시에, 약학 유효물질의 방출 거동을 확인하였다.
특히, 2차에 걸친 가교 반응 중 2차 가교 반응을 고체상에서 진행함에 따라, 적은 양의 가교제로도 구형의 입자를 구현할 수 있으며, 생산 수율이 향상된다는 점 또한 실험을 통해 확인하였다.
구체적으로, 상기 생체 적합성 고분자란 인체에 적용되는 의약들의 효과적인 약물 전달을 위하여, 인체 내에 직접 주입이 가능한 고분자를 의미한다. 구체적으로 상기 생체 적합성 고분자는, 히알루론산(Hyaluronic acid: HA), 카르복시메틸셀룰로오스(Carboxymethyl cellulose: CMC), 알긴산(alginic acid), 펙틴, 카라기난, 콘드로이틴(설페이트), 덱스트란(설페이트), 키토산, 폴리라이신(polylysine), 콜라겐, 젤라틴, 카르복시메틸 키틴(carboxymethyl chitin), 피브린, 아가로스, 풀루란, 폴리락타이드, 폴리글리코라이드(PGA), 폴리락타이드-글리코라이드 공중합체(PLGA), 폴리안하이드라이드(polyanhydride), 폴리오르쏘에스테르(polyorthoester), 폴리에테르에스테르(polyetherester), 폴리카프로락톤(polycaprolactone), 폴리에스테르아마이드(polyesteramide), 폴리(뷰티릭 산), 폴리(발레릭 산), 폴리우레탄, 폴리아크릴레이트, 에틸렌-비닐아세테이트 중합체, 아크릴 치환 셀룰로오스 아세테이트, 비-분해성 폴리우레탄, 폴리스티렌, 폴리비닐 클로라이드, 폴리비닐 풀루오라이드, 폴리(비닐 이미다졸), 클로로설포네이트 폴리올레핀(chlorosulphonate polyolefins),폴리에틸렌 옥사이드, 폴리비닐피롤리돈(PVP), 폴리에틸렌글리콜(PEG), 폴리메타크릴레이트, 하이드록시프로필메틸셀룰로오스(HPMC), 에틸셀룰로오스(EC), 하이드록시프로필셀룰로오스(HPC), 싸이클로덱스트린, 폴리(N-이소프로필아미드)(PNIPAam), 폴록사머 (poloxamer), 및 폴리 아크릴산 공중합체, 및 이들의 유도체로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상의 고분자일 수 있다.
보다 구체적으로, 상기 생체 적합성 고분자는 히알루론산(Hyaluronic acid: HA), 젤라틴 또는 히알루론산 및 젤라틴의 혼합물일 수 있다.
　본 명세서에서, 히알루론산은 히알루론산 자체와 히알루론산 염을 모두 포함하는 의미일 수 있다. 이에 따라, 히알루론산 수용액은 히알루론산의 수용액, 히알루론산 염의 수용액, 및 히알루론산 과 히알루론산 염의 혼합 수용액을 모두 포함하는 개념일 수 있다. 상기 히알루론산 염은 히알루론산 나트륨, 히알루론산 칼륨, 히알루론산 칼슘, 히알루론산 마그네슘, 히알루론산 아연, 히알루론산 코발트 등의 무기염과, 히알루론산 테트라부틸암모늄 등의 유기염 및 그 혼합물일 수 있다.
발명의 일 구현예에서, 히알루론산의 분자량은 특별히 제한되는 것은 아니지만, 다양한 물성과 생체적합성을 구현하기 위해 500 g/mol 이상 5,000,000 g/mol 이하임이 바람직하다.
본 명세서에서, 젤라틴은 동물에서 유래된 콜라겐을 산 또는 알칼리로 처리하고 후속하여 추출하여 수득되는 단백질을 의미할 수 있다.
발명의 일 구현예에서, 젤라틴의 분자량은 특별히 제한되는 것은 아니지만, 다양한 물성과 생체적합성을 구현하기 위해 100,000 g/mol 이상 5,000,000 g/mol 이하임이 바람직하다.
상기 폴리펩타이드 및 블록킹 화합물의 결합물에서, 상기 블록킹 화합물의 예가 크게 한정되는 것은 아니며, 상기 폴리펩타이드에 함유된 반응성 작용기와 반응하여 화학결합을 형성할 수 있는 관능기 및 반응성이 약한 블록킹 그룹을 갖는 화합물이라면 제한없이 사용가능하다.
상기 폴리펩타이드에 함유된 반응성 작용기와 반응하여 화학결합을 형성할 수 있는 관능기의 일례를 들면, 이소시아네이트기, 카르복시기, 할로겐기 등을 들 수 있다. 또한, 상기 반응성이 약한 블록킹 그룹의 일례를 들면, 탄소수 1 내지 50의 알킬기, 탄소수 2 내지 50의 시클로알킬기, 탄소수 6 내지 50의 아릴기, 탄소수 3 내지 50의 헤테로아릴기 등을 들 수 있다.
보다 구체적인 일례를 들면, 상기 블록킹 화합물의 예로는, 친전자성 탄소를 포함한 관능기를 가진 블록킹 화합물로서, 플루오레세인 이소티오시아네이트(Fluorescein isothiocyanate, FITC), 로다민 B 이소티오시아네이트(Rhodamine B isothiocyanate, RBITC), 테트라메틸로다민 B 이소티오시아네이트(Tetramethylrhodamine B isothiocyanate), N-hydroxy-succinimidyl-ester linked fluorescein (NHS-fluorescein), 6-[Fluorescein-5(6)-carboxamido]hexanoic acid N-hydroxysuccinimide ester, Fluorescein-5-EX N-hydroxysuccinimide ester, Alexa Fluor™ 350 NHS Ester, Alexa Fluor™ 430 NHS Ester, Alexa Fluor™ 488 NHS Ester, Rhodamine Green™ Carboxylic Acid, Succinimidyl Ester, Hydrochloride (5(6)-CR 110, SE), Rhodamine Red™-X, Succinimidyl Ester, 5-isomer, 및 Alexa Fluor™ 647 NHS Ester 로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 화합물을 들 수 있다.
또한, 상기 폴리펩타이드의 예가 크게 제한되는 것은 아니나, 상기 일 구현예의 고분자 마이크로 입자의 적용 용도에 따라, 해당 용도에 적합한 폴리펩타이드를 제한 없이 적용할 수 있다. 즉, 상기 폴리펩타이드의 구체적인 예는 한정되지 않고, 1차 아민을 1종 이하로 포함할 수 있다. 예를 들어 상기 폴리펩타이드는 폴리글라이신, 폴리알라닌, 폴리발린, 폴리류신, 폴리아이소류신, 폴리페닐알라닌, 폴리트립토판, 폴리 글루탐산, 폴리프롤린, 폴리아스팔산일 수 있다.
상기 폴리펩타이드가 1차 아민을 2종 이상 포함할 경우, 이소티오시아네이트(Isothiocyanate) 를 포함하는 블로킹 화합물과의 반응에도 반응성 작용기가 모두 티오우레아계 작용기로 보호되지 않아, 티오우레아계 작용기로 보호되지 않은 반응성 작용기를 포함하게 되어, 보호되지 않은 반응성 작용기의 부가 반응으로 인하여 고분자 마이크로 입자의 약물 방출 특성이 저하될 수 있다.
보다 구체적인 일례를 들면, 상기 폴리펩타이드 및 블록킹 화합물의 결합물은 이소티오시아네이트(Isothiocyanate)기를 포함한 블록킹 화합물과 반응성 작용기의 결합물인 티오우레아 또는 티오우레탄계 작용기를 갖는 폴리펩타이드의 결합물을 포함할 수 있다.
구체적으로, 상기 고분자 마이크로 입자는, 이소티오시아네이트(Isothiocyanate) 를 포함하는 블로킹 화합물과 반응성 작용기를 포함하는 폴리펩타이드의 반응결과물을 포함할 수 있다.
즉, 이소티오시아네이트(Isothiocyanate) 를 포함하는 블로킹 화합물에 포함되는 이소티오시아네이트(Isothiocyanate)기 (-N=C=S)와 반응성 작용기를 포함하는 폴리펩타이드에 포함되는 반응성 작용기가 반응하여 티오우레아계 작용기를 형성하여, 티오우레아계 작용기를 갖는 폴리펩타이드를 포함할 수 있다.
상기 제1 가교제는, 그 예가 크게 제한되는 것은 아니다. 구체적으로 상기 제1 가교제는 염화 철(Ⅲ),　염화 알루미늄 중 하나를 포함할 수 있다.
한편, 상기 폴리펩타이드 및 블록킹 화합물의 결합물, 생체 적합성 고분자 및 제1 가교제를 포함한 혼합물을 1차 가교반응시켜 가교 입자를 형성하는 단계는, 상기 폴리펩타이드, 블록킹 화합물 및 생체 적합성 고분자를 녹인 혼합 용액을 형성하는 단계; 및 상기 혼합용액을 토출시켜 제1 가교제에 첨가하는 단계;를 포함할 수 있다.
즉, 상기 1차 가교반응은 상기 폴리펩타이드 및 블록킹 화합물의 결합물과 생체 적합성 고분자를 포함하는 혼합 용액에 제1 가교제를 첨가하여 진행되는 액체상 반응일 수 있다.
또한, 상기 폴리펩타이드 및 블록킹 화합물의 결합물, 생체 적합성 고분자 및 제1 가교제를 포함한 혼합물을 1차 가교반응시켜 가교 입자를 형성하는 단계에서, 상기 1차 가교반응은 이온 가교 반응일 수 있다.
즉, 상기 폴리펩타이드 및 블록킹 화합물의 결합물, 생체 적합성 고분자 및 제1 가교제를 포함한 혼합물을 1차 가교반응시켜 가교 입자를 형성하는 단계에서, 제1 가교제는 이온 화합물일 수 있다. 상기 발명의 일 구현예에서 제1 가교제는, 그 예가 크게 제한되는 것은 아니다. 구체적으로 상기 제1 가교제는 염화 철(Ⅲ),　염화 알루미늄 중 하나를 포함할 수 있다.
한편, 상기 가교 입자를 추출하여 제2 가교제를 포함한 유기 용매 상에서 2차 가교반응시키는 단계에서, 상기 가교 입자 및 제2 가교제는 고체상으로 가교반응을 진행하는 것일 수 있다.
즉, 상기 고분자 마이크로 입자의 제조방법에 따르면, 알칼리성 유기 용매 상에서 고체상으로 진행되는 2차 가교반응이 포함될 수 있다. 또한 상기 고체상으로 진행되는 2차 가교반응은 팽윤된 고분자 입자를 탈수화시켜 보다 응집된 상태로 진행되는 2차 가교반응을 의미할 수 있다. 발명의 일 구현예와 같이, 유기 용매 상에서 고체상으로 진행되는 2차 가교반응이 포함, 즉, 팽윤된 고분자 입자를 탈수화시켜 보다 응집된 상태로 진행되는 2차 가교반응을 포함하는 경우, 그렇지 않은 경우와 비교하여 우수한 가교 효율이 구현되어, 높은 강도를 가지는 마이크로 입자를 얻을 수 있다.
상기 가교입자를 회수하는 것은, 체눈의 크기가 30 ㎛ 이상인 망체를 사용하는 방식에 의할 수 있다. 이와 같이 1차 가교반응을 통하여 형성된 가교입자를 회수한 이후, 유기용매에 재분산하여 제2 가교제를 첨가함에 따라 2차 가교반응이 보다 응집된 고체상에서 진행될 수 있다.
상기 제2 가교제는, 그 예가 크게 제한되는 것은 아니다. 구체적으로 상기 제2 가교제는 부탄디올디글리시딜에테르(1,4-butandiol diglycidyl ether: BDDE), 에틸렌글리콜디글리시딜에테르(ethylene glycol diglycidyl ether: EGDGE), 헥산디올디글리시딜에테르(1,6-hexanediol diglycidyl ether), 프로필렌글리콜디글리시딜에테르(propylene glycol diglycidyl ether), 폴리프로필렌글리콜디글리시딜에테르(polypropylene glycol diglycidyl ether), 폴리테트라메틸렌글리콜디글리시딜에테르(polytetramethylene glycol diglycidyl ether), 네오펜틸글리콜디글리시딜에테르(neopentyl glycol diglycidyl ether), 폴리글리콜폴리글리시딜에테르(polyglycerol polyglycidyl ether), 디글리세롤폴리글리시딜에테르(diglycerol polyglycidyl ether), 글리세롤폴리글리시딜에테르(glycerol polyglycidyl ether), 트리메틸프로판폴리글리시딜에테르(tri-methylpropane polyglycidyl ether), 비스에폭시프로폭시에틸렌(1,2-(bis(2,3-epoxypropoxy)ethylene), 펜타에리쓰리톨폴리글리시딜에테르(pentaerythritol polyglycidyl ether), 소르비톨폴리글리시딜에테르(sorbitol polyglycidyl ether), 디비닐설폰(divinylsulfone) 및 글루타알데히드(glutaraldehyde)로 이루어진 군에서 선택된 하나를 포함할 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 제2 가교제는 부탄디올디글리시딜에테르(1,4-butandiol diglycidyl ether: BDDE)일 수 있다.
상기 제1 가교제 및 제2 가교제는 각각 독립적으로 염화 철(Ⅲ),　염화 알루미늄, 1,4-부탄디올디글리시딜에테르, 글루타알데히드, 에틸렌글리콜디글리시딜에테르, 헥산디올디글리시딜에테르, 프로필렌글리콜디글리시딜에테르, 폴리에틸렌글리콜디글리시딜 에테르, 폴리프로필렌글리콜디글리시딜에테르, 폴리테트라메틸렌글리콜디글리시딜에테르, 네오펜틸글리콜디글리시딜에테르, 폴리글리콜폴리글리시딜에테르, 디글리세롤폴리글리시딜에테르, 글리세롤폴리글리시딜에테르, 트리메틸프로판폴리글리시딜에테르, 비스에폭시프로폭시에틸렌, 펜타에리쓰리톨폴리글리시딜에테르 및 소르비톨폴리글리시딜에테르, 디비닐설폰, 로 이루어진 군에서 선택된 하나를 포함할 수 있다.
또한, 상기 제2 가교제는 상기 생체 적합성 고분자 100 중량부에 대하여 30 중량부 이상 300 중량부 이하, 40 중량부 이상 250 중량부 이하, 또는 50 중량부 이상 200 중량부 이하로 포함될 수 있다. 발명의 일 구현예에 따른 고분자 마이크로 입자의 제조방법은, 상술한 바와 같이 1차 가교반응 이후 2차 가교반응을 진행함에 따라, 상기 생체 적합성 고분자 100 중량부에 대하여 30 중량부 이상 300 중량부 이하의 제2 가교제를 첨가하여 충분한 기계적 강도 및 구형화율을 구현하는 고분자 마이크로 입자를 제조할 수 있다.
제2 가교제를 상기 생체 적합성 고분자 100 중량부에 대하여 30 중량부 미만으로 첨가하는 경우 가교도가 낮아 입자 형성이 어려우며, 300 중량부를 초과하여 첨가하는 경우, 과량의 미반응한 가교제가 제거되지 않고 가교 입자에 잔존하는 기술적 문제점이 발생할 수 있다.
한편, 상기 가교 입자를 추출하여 제2 가교제를 포함한 유기 용매 상에서 2차 가교반응시키는 단계에서, 상기 유기 용매는 에탄올, N,N-디메틸포름아미드, N,N-디메틸아세트아미드, N-메틸-2-피롤리돈, N-메틸카프로락탐, 2-피롤리돈, N-에틸피롤리돈, N-비닐피롤리돈, 디메틸술폭사이드, 테트라메틸우레아, 피리딘, 디메틸술폰, 헥사메틸술폭사이드, 감마-부티로락톤, 3-메톡시-N,N-디메틸프로판아미드, 3-에톡시-N,N-디메틸프로판아미드, 3-부톡시-N,N-디메틸프로판아미드, 1,3-디메틸-이미다졸리디논, 에틸아밀케톤, 메틸노닐케톤, 메틸에틸케톤, 메틸이소아밀케톤, 메틸이소프로필케톤, 사이클로헥사논, 에틸렌카보네이트, 프로필렌카보네이트, 디글라임, 4-하이드록시-4-메틸-2-펜타논, 에틸렌 글리콜 모노메틸 에테르, 에틸렌 글리콜 모노메틸 에테르 아세테이트, 에틸렌 글리콜 모노에틸 에테르, 에틸렌 글리콜 모노에틸 에테르 아세테이트, 에틸렌 글리콜 모노프로필 에테르, 에틸렌 글리콜 모노프로필 에테르 아세테이트, 에틸렌 글리콜 모노이소프로필 에테르, 에틸렌 글리콜 모노이소프로필 에테르 아세테이트, 에틸렌 글리콜 모노뷰틸 에테르, 에틸렌 글리콜 모노뷰틸 에테르 아세테이트로 이루어진 군에서 선택된 하나일 수 있다.
한편, 상기 일 구현예의 마이크로 캐리어는 상기 고분자 마이크로 입자의 표면 상에 형성된 세포 부착 유도층;을 포함할 수 있다. 상기 세포 부착 유도층은 세포 부착성 물질들로 구성되며, 부착성 세포들이 안정적으로 부착, spreading 및 배양될 수 있도록 한다.
상기 세포 부착 유도층은 젤라틴, 콜라겐, 피브로넥틴(fibronectin) 키토산, 폴리도파민, 폴리 L-라이신, 비트로넥틴(vitronectin), RGD를 포함한 펩타이드, RGD를 포함한 아크릴계 고분자, 리그닌(lignin), 양이온성 덱스트란 및 이들의 유도체로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 세포 부착성 물질을 포함할 수 있다. 즉, 상기 세포 부착 유도층은 젤라틴, 콜라겐, 피브로넥틴(fibronectin) 키토산, 폴리도파민, 폴리 L-라이신, 비트로넥틴(vitronectin), RGD를 포함한 펩타이드, RGD를 포함한 아크릴계 고분자, 리그닌(lignin), 양이온성 덱스트란 및 이들의 유도체로 이루어진 군에서 선택되는 1종, 또는 이들의 2종 이상의 혼합물을 포함한 세포 부착성 물질을 포함할 수 있다.
상기 세포 부착 유도층은 상기 고분자 마이크로 입자의 표면 상에 형성될 수 있다. 즉, 상기 고분자 마이크로 입자의 표면에 상기 세포 부착 유도층이 직접 접촉하거나, 혹은 상기 고분자 마이크로 입자의 표면에 접촉한 다른 기타 층의 표면 에 상기 세포 부착 유도층이 접촉할 수 있다.
일례로, 상기 마이크로 캐리어는 고분자 마이크로 입자의 표면에 직접 접촉하도록 형성되는 세포 부착 유도층을 포함하여, 마이크로 캐리어의 표면에 세포 부착 유도층을 도입하여 배양액 내에서 마이크로 캐리어의 부유도가 조절될 수 있으며, 세포를 안정적으로 부착 배양하는 효과를 가질 수 있다.
상기 세포 부착 유도층은 1 nm 내지 10,000 nm, 또는 10 nm 내지 1000 nm, 또는 50 nm 내지 500 nm, 또는 80 nm 내지 200 nm의 층 두께를 가질 수 있으며, 상기 세포 부착 유도층의 층 두께는 상기 마이크로 캐리어 전체의 반직경에서 내부의 고분자 마이크로 입자의 반직경을 뺀 값을 통해 구할 수 있다. 상기 반직경은 직경의 1/2값을 의미한다. 상기 직경을 측정하는 방법의 예가 크게 한정되는 것은 아니나, 일례를 들면 공초점 형광 현미경, 전자 투과 현미경(TEM) 또는 단면 IR, 단면 SEM 이미지를 통해 측정가능하다.
상기 마이크로 캐리어는 1 ㎛ 내지 1,000 ㎛, 또는 10 ㎛ 내지 1000 ㎛, 또는 100 ㎛ 내지 1,000 ㎛, 또는 100 ㎛ 내지 800 ㎛의 평균직경을 가질 수 있다. 상기 직경을 측정하는 방법의 예가 크게 한정되는 것은 아니나, 일례를 들면 광학 현미경을 통해 측정가능하다.
한편, 상기 고분자 마이크로 입자의 반직경과 세포 부착 유도층의 두께의 비율은 1:0.00001 내지 1:0.1, 또는 1:0.0001 내지 1:0.01일 수 있다.
상기 고분자 마이크로 입자의 반경과 세포 부착 유도층의 두께의 비율이 1:0.00001 미만인 경우, 상기 고분자 마이크로 입자 대비 세포 부착 유도층이 너무 얇아 세포 배양 시 세포와 마이크로 캐리어의 부착도가 감소될 우려가 있고, 1:0.1를 초과하는 경우, 상기 고분자 마이크로 입자 대비 세포 부착 유도층이 두꺼워져, 고분자 마이크로 입자의 친수성도와 같은 물성을 변화시켜 분산성을 저하시키는 문제가 발생할 수 있다.
상기 마이크로 캐리어는 하기 수학식으로 계산되는 세포 부착성이 2000 % 이상, 또는 2500 % 이상, 또는 3000 % 이상, 또는 4000 % 이하, 또는 2000 % 내지 4000 %, 또는 2500 % 내지 4000 %, 또는 3000 % 내지 4000 %일 수 있다.
[수학식]
세포부착성 = (마이크로 캐리어를 세포배양액에 투입하여 37 ℃에서 7일간 배양한 후 세포수 / 세포배양액에 최초 포함된 세포수) X 100
상기 세포배양액, 세포, 배양조건에 대해서는 특별히 한정되지 않으며, 기존에 알려진 다양한 세포배양액, 세포, 배양조건을 제한없이 적용할 수 있다. 그리고, 상기 세포수를 측정하는 방법도 특별히 한정되지 않으며, 기존에 알려진 다양한 세포수 측정방법을 제한없이 적용할 수 있다.
상기 마이크로 캐리어는 하기 수학식으로 계산되는 세포 부착성이 2000 % 이상, 또는 2500 % 이상, 또는 3000 % 이상, 또는 4000 % 이하, 또는 2000 % 내지 4000 %, 또는 2500 % 내지 4000 %, 또는 3000 % 내지 4000 %를 만족함에 따라, 마이크로 캐리어의 세포 부착력이 향상되어, 이를 통해 3차원적 확장 배양을 통해 표면 효율을 증가시켜 부착성 세포의 대량 확장이 가능한 장점이 있다.
반면, 상기 마이크로 캐리어는 하기 수학식으로 계산되는 세포 부착성이 상술한 범위에 미치지 못하는 경우, 마이크로 캐리어의 표면의 세포 부착력이 약해, 3차원적 확장 배양이 충분히 진행되기 어려운 한계가 있다.
한편, 상기 마이크로 캐리어는 상기 고분자 마이크로 입자의 표면 상에 형성된 프라이머 고분자층을 더 포함할 수 있다.
즉, 상기 고분자 마이크로 입자 표면에, 프라이머 고분자층 1종과 세포부착 유도층 1종의 혼합층이 더 포함될 수 있다. 프라이머 고분자층 1종과 세포부착 유도층 1종의 혼합층에서 이들의 적층 순서는 특별히 한정되지 않으며 프라이머 고분자층상에 세포부착 유도층이 적층된 구조, 혹은 세포부착 유도층상에 프라이머 고분자층이 적층된 구조를 모두 적용가능하다.
한편, 상기 프라이머 고분자층은 상기 고분자 마이크로 입자의 표면에 기능성 고분자를 도입할 수 있는 점착층 역할을 하며, 이로 인해 마이크로 캐리어 표면에 세포 부착을 위한 고분자 층이 효과적으로 도입되고 배양 중에도 안정적으로 유지될 수 있도록 한다.
상기 프라이머 고분자층은 그 예가 크게 한정되는 것은 아니나, 수상 접착을 유도할 수 있는 카테콜 유도체로서 L-디하이드록시 페닐알라닌(L-DOPA), 도파민(dopamine), 폴리도파민, 노레피네프린(norepinephrine), 에피네프린(epinephrine), 에피갈로카테킨(epigallocatechin) 및 이들의 유도체로 이루어진 군에서 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 포함할 수 있다.
상기 마이크로 캐리어는 세포 배양용 마이크로 캐리어일 수 있다.
2. 세포 복합체
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 일 구현예의 마이크로 캐리어; 및 상기 마이크로 캐리어 표면 상에 부착된 세포;를 포함하는, 세포 복합체가 제공될 수 있다. 상기 마이크로 캐리어에 관한 내용은 상기 일 구현예에서 상술한 모든 내용을 포함할 수 있다.
상기 다른 구현예의 세포 복합체는, 세포가 안정적으로 마이크로 캐리어와 부착한 상태로 복합체를 형성함으로써, 세포 생존율이 높아지면서 높은 체내 이식율을 구현할 수 있다.
상기 세포는 부착성 동물 세포로 그 예가 크게 한정되는 것은 아니나, 예를 들어 섬유아세포 (fibroblasts), 상피세포 (epithelial cell), 골아세포 (osteoblast), 연골세포 (chondrocyte), 간세포, 인간 유래 제대혈 세포, 인간 골수 유래 중간엽 줄기세포 (mesenchymal stem cell), CHO(Chinese hamster ovary) 세포, 신장세포 (HEK293, BHK21, MDCK, vero cell 등), 또는 이들의 2종 이상 혼합물일 수 있다.
상기 세포의 밀도는 1.02 g/cm3 이상 1.1 g/cm3 미만일 수 있다.
상기 세포는 상기 마이크로 캐리어의 표면 상에 부착될 수 있다. 즉, 상기 마이크로 캐리어의 표면에 세포가 직접 접촉하거나, 혹은 상기 마이크로 캐리어의 표면에 접촉한 다른 기타 층의 표면에 세포가 접촉할 수 있다.
3. 의료용 조성물
본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 상기 일 구현예의 마이크로 캐리어 또는 상기 다른 구현예의 세포 복합체를 포함하는 의료용 조성물이 제공될 수 있다. 상기 마이크로 캐리어에 관한 내용은 상기 일 구현예에서 상술한 모든 내용을 포함할 수 있다. 상기 세포 복합체에 관한 내용은 상기 다른 구현예에서 상술한 모든 내용을 포함할 수 있다.
즉, 상기 일 구현예의 약학 유효물질이 의료용으로 적용되는 경우, 의료용 조성물이 제공될 수 있다.
이와 같은 경우, 의료용 유효 물질의 예는 크게 한정되지 않으며, 상기 일 구현예의 고분자 마이크로 입자의 적용 용도에 따라, 해당 용도에 적합한 유효 물질을 제한 없이 적용할 수 있다. 즉, 상기 의료용 유효 물질의 구체적인 예는 한정되지 않고, 폴리글라이신, 폴리알라닌, 폴리발린, 폴리류신, 폴리아이소류신, 폴리페닐알라닌, 폴리트립토판, 폴리 글루탐산, 폴리프롤린, 폴리아스팔산 등을 포함하거나, 엘라스틴 유래 폴리펩타이드 ((발린-프롤린-글라이신-발린-글라이신)의 반복 중합체) 등의 의료용 유효 물질을 포함할 수 있으며, 의료용 효과가 입증된 모든 물질이 제한 없이 적용 가능하다.
상기 의료용 유효물질의 첨가량 또한 크게 한정되지 않으며, 적용 용도와 대상에 따라 함량을 제한 없이 사용할 수 있다. 예를 들어, 상기 의료용 유효물질은 상기 고분자 마이크로 입자 100 중량부 대비 0.0001 중량부 이상 1000 중량부 이하로, 고분자 마이크로 입자 대비 소량, 과량 제한 없이 포함될 수 있다.
4. 미용 조성물
본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 상기 일 구현예의 마이크로 캐리어 또는 상기 다른 구현예의 세포 복합체를 포함하는 미용 조성물이 제공될 수 있다. 상기 마이크로 캐리어에 관한 내용은 상기 일 구현예에서 상술한 모든 내용을 포함할 수 있다. 상기 세포 복합체에 관한 내용은 상기 다른 구현예에서 상술한 모든 내용을 포함할 수 있다.
즉, 상기 일 구현예의 약학 유효물질이 미용용으로 적용되는 경우, 미용 조성물이 제공될 수 있다.
이와 같은 경우, 미용용 유효 물질의 예는 크게 한정되지 않으며, 상기 일 구현예의 고분자 마이크로 입자의 적용 용도에 따라, 해당 용도에 적합한 유효 물질을 제한 없이 적용할 수 있다. 즉, 상기 미용 유효 물질의 구체적인 예는 한정되지 않고, 천연 추출물, 단백질, 비타민, 효소, 항산화제 등이 있으며, 미용 효과가 입증된 모든 물질이 제한 없이 적용 가능하다.
상기 미용 유효물질의 첨가량 또한 크게 한정되지 않으며, 적용 용도와 대상에 따라 함량을 제한 없이 사용할 수 있다. 예를 들어, 상기 미용 유효물질은 상기 고분자 마이크로 입자 100 중량부 대비 0.0001 중량부 이상 1000 중량부 이하로, 고분자 마이크로 입자 대비 소량, 과량 제한 없이 포함될 수 있다.
5. 의료 용품
본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 상기 다른 구현예의 의료용 조성물을 포함하는 의료 용품이 제공될 수 있다. 상기 의료용 조성물에 관한 내용은 상기 다른 구현예에서 상술한 모든 내용을 포함할 수 있다.
상기 의료 용품의 예가 크게 한정되지 않으나, 본 발명의 특성이 구현되기 위해서는 체내에 삽입되어 사용되거나 혹은 장기간 강도가 유지되어야 하는 경우에 적합하며, 예를 들어, 체내 보형물, 체내 삽입형 약물 전달체, 경피패치, 창상 치료제 등을 들 수 있다.
6. 미용 용품
본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 본 발명은 상기 다른 구현예의 미용 조성물을 포함하는 미용 용품이 제공될 수 있다. 상기 미용 조성물에 관한 내용은 상기 다른 구현예에서 상술한 모든 내용을 포함할 수 있다.
상기 미용 용품의 예가 크게 한정되지 않으나, 본 발명의 특성이 구현되기 위해서는 예를 들어, 미용 크림, 로션, 헤어 겔, 팩 등을 들 수 있다.
상기 미용 팩의 구조가 크게 한정되는 것은 아니나, 예를 들어, 지지체, 및 상기 지지체 상에 형성되며, 상기 다른 구현예의 고분자 마이크로 입자를 포함한 미용적 유효 물질 전달층을 포함할 수 있다. 상기 지지체의 예로는 직포, 부직포, 실리콘, 폴리에틸렌테레프탈레이트, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리우레탄, 금속 망사, 폴리에스테르 등을 들 수 있다.
본 발명에 따르면, 높은 가교 효율 및 생산 수율과 동시에, 안정성을 구현할 수 있을 뿐만 아니라, 단백질 또는 펩타이드 약학 유효물질의 화학적 변형 없이 약물 방출 특성을 확인할 수 있고, 세포탈착공정없이 3차원 배양후 바로 체내 주입이 가능하며, 부착성 세포에 안정적인 환경을 제공하여 세포 생존율이 높아지면서 높은 체내 이식율에 기여할 수 있는 마이크로 캐리어, 이를 포함하는 세포 복합체, 의료용 조성물, 미용 조성물, 의료 용품 및 미용 용품이 제공될 수 있다.
발명을 하기의 실시예에서 보다 상세하게 설명한다. 단, 하기의 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기의 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
<실시예 : 고분자 마이크로 입자 및 세포 배양용 마이크로 캐리어의 제조>
실시예 1
(1) 고분자 마이크로 입자의 제조
히알루론산염(중량 평균분자량: 500kDa) 0.15 g 및 젤라틴(젤강도: 300 g) 1 g을 각각 증류수에 1.0 wt.%, 12.5 wt.%로 녹여 제조한 다음, 이 두 용액을 1:1 부피비로 혼합한다. 여기에 플루오레세인 이소티오시아네이트-폴리프롤린 (유체 역학적 반경(hydrodynamic radius): 2.5 nm, 반응성 작용기 함량: 0.01 mol/103g)수용액을 600 ㎍/mL의 농도로 혼합하였다. 상기 혼합 용액(4 g)을 Buchi encapsulator 의 노즐 통해 토출시키고 5wt% FeCl3 (iron chloride) 용액에 고형화시켜 입자를 제조하였다. 이후, 상기 고형 입자를 에탄올에 5회 세척한 후, 고형입자 분산액 25 g에 가교제로 1,4-부탄디올 디글리시딜 에터(1,4-Butandiol diglycidyl ether, BDDE)를 0.5 ml(0.55 g)를 첨가하여 상온에서 4일 동안 가교반응시켰다. 이후, 에탄올에 세척하고 체눈의 크기가 45 ㎛인 망체를 사용하여 제조된 가교입자를 회수하였다.
(2) 세포 배양용 마이크로 캐리어 제조
회수된 입자를 도파민이 1 mg/mL로 용해된 tris buffer (pH 8.0)에 침지하여 교반 하에 상온에서 2시간 동안 코팅하였다. 과량의 코팅물질을 에탄올로 세척 후 45 ㎛ sieve에 입자를 거른 뒤, 세포 배양용 마이크로 캐리어로 사용하였다.
실시예 2
실시예 1의 (1)에서 1,4-부탄디올 디글리시딜 에터 함량을 1 ml(1.1 g)로 첨가한 것을 제외하고는, 실시예 1과 동일한 방법으로 고분자 마이크로 입자 및 세포 배양용 마이크로 캐리어를 제조하였다.
실시예 3
실시예 1의 (1)에서 노즐의 크기를 200 ㎛로 변경한 것을 제외하고는, 실시예 1과 동일한 방법으로 고분자 마이크로 입자 및 세포 배양용 마이크로 캐리어를 제조하였다.
실시예 4
실시예 1의 (1)에서 노즐의 크기를 200 ㎛로 변경하고, 1,4-부탄디올 디글리시딜 에터 함량을 1 ml(1.1 g)로 첨가한 것을 제외하고는, 실시예 1과 동일한 방법으로 고분자 마이크로 입자 및 세포 배양용 마이크로 캐리어를 제조하였다.
실시예 5
실시예 1의 (1)에서 노즐의 크기를 300 ㎛로 변경한 것을 제외하고는, 실시예 1과 동일한 방법으로 고분자 마이크로 입자 및 세포 배양용 마이크로 캐리어를 제조하였다.
실시예 6
실시예 1의 (1)에서 노즐의 크기를 300 ㎛로 변경하고, 1,4-부탄디올 디글리시딜 에터 함량을 1 ml(1.1 g)로 첨가한 것을 제외하고는, 실시예 1과 동일한 방법으로 고분자 마이크로 입자 및 세포 배양용 마이크로 캐리어를 제조하였다.
<비교예>
비교예 1: 고분자 마이크로 입자의 제조
히알루론산염(중량 평균분자량: 500kDa) 0.15 g 및 젤라틴(젤강도: 300 g) 1 g을 각각 증류수에 1.5 wt.%, 10 wt.%로 녹여 제조한 다음, 이 두 용액을 1:1 부피비로 혼합한다. 플루오레세인 이소티오시아네이트-폴리프롤린 (유체 역학적 반경(hydrodynamic radius): 1.7 nm, 반응성 작용기 함량: 1.1 mol/103g)수용액을 600 ㎍/mL의 농도로 혼합하였다. 상기 혼합 용액(4 g)을 액체 파라핀 용액 (40 g)과 혼합하여 유중수형(W/O) 마이크로 에멀젼을 포함하는 혼합액을 제조하였다. 이후, 상기 혼합액 44 g에 가교제로 1,4-부탄디올 디글리시딜 에터(1,4-Butandiol diglycidyl ether, BDDE)를 1.1 g (1 ml)첨가하고, 상온에서 4일 동안 가교반응시킨 후, 아세톤, 디클로로메탄, 에탄올 순서로 세척하여 가교입자를 제조하였다. 이 때, 체눈의 크기가 45 ㎛인 망체를 사용하여 제조된 가교입자를 회수하였다.
비교예 2: 고분자 마이크로 입자의 제조
비교예 1에서 유효물질을 플루오레세인 이소티오시아네이트-폴리프롤린 대신 인간 성장 호르몬(human growth hormone) (유체 역학적 반경(hydrodynamic radius): 2.5 nm, 반응성 작용기 함량: 10 mol/103g)을 사용한 것을 제외하고는, 비교예 1과 동일한 방법으로 제조하였다.
비교예 3: 고분자 마이크로 입자의 제조
비교예 1에서 유효물질을 플루오레세인 이소티오시아네이트-폴리프롤린 대신 소혈청 알부민(bovine serum albumin) (유체 역학적 반경(hydrodynamic radius):3.8 nm, 반응성 작용기 함량: 20 mol/103g)을 사용한 것을 제외하고는, 비교예 1과 동일한 방법으로 제조하였다.
비교예 4: 고분자 마이크로 입자의 제조
비교예 1에서 유효물질을 플루오레세인 이소티오시아네이트-폴리프롤린 대신 플루오레세인 이소티오시아네이트-폴리라이신(유체 역학적 반경(hydrodynamic radius):1.9 nm, 반응성 작용기 함량: 50 mol/103g)을 사용한 것을 제외하고는, 비교예 1과 동일한 방법으로 제조하였다.
비교예 5: 고분자 마이크로 입자의 제조
실시예 1의 (1)에서 유효물질을 플루오레세인 이소티오시아네이트-폴리프롤린 대신 플루오레세인 이소티오시아네이트-폴리라이신(유체 역학적 반경(hydrodynamic radius): 1.9 nm, 반응성 작용기 함량: 50 mol/103g)을 사용한 것을 제외하고는, 실시예 1의 (1)과 동일한 방법으로 제조하였다.
비교예 6: 세포 배양용 마이크로 캐리어의 제조
실시예 1의 (1)에서 얻어진 고분자 마이크로 입자를 세포 배양용 마이크로 캐리어로 사용하였다.
구분 BDDE:HA 몰비 약학 유효물질 종류 약학 유효물질의 양
실시예1 15:1 FITC-(poly-proline) 1200 ng
실시예2 30:1 FITC-(poly-proline) 1200 ng
실시예3 15:1 FITC-(poly-proline) 1200 ng
실시예4 30:1 FITC-(poly-proline) 1200 ng
실시예5 15:1 FITC-(poly-proline) 1200 ng
실시예6 30:1 FITC-(poly-proline) 1200 ng
비교예1 30:1 FITC-(poly-proline) 100 ng
비교예2 30:1 Human growth hormone 100 ng
비교예3 30:1 Bovine serum albumin 100 ng
비교예4 30:1 FITC-(poly-L-lysine) 100 ng
비교예5 30:1 FITC-(poly-L-lysine) 100 ng
* BDDE: 1,4-부탄디올 디글리시딜 에터(1,4-Butandiol diglycidyl ether)
* HA: 히알루론산염(중량 평균분자량: 500kDa, 제조사: SK바이오랜드)
* FITC: 플루오레세인 이소티오시아네이트(Fluorescein isothiocyanate)
<실험예1>
상기 실시예 및 비교예에서 제조된 고분자 마이크로 입자에 대하여 다음과 같은 방법으로 고분자 마이크로 입자의 물성을 측정하고 표2, 표3에 기재하였다.
1. 평균 직경 및 팽윤도
상기 실시예 및 비교예의 고분자 마이크로 입자의 평균직경을 측정하고, 이로부터 팽윤도를 계산하였다.
본 발명에 따른 입자의 팽윤도는 하기 수학식 1에 의하여 계산하였다.
[수학식 1]
팽윤도 = {(증류수에서의 평균직경)3 - (건조 입자의 평균직경)3} / (건조 입자의 평균직경)3.
이때, 팽윤도 값이 0에 가까울수록 팽윤이 일어나지 않는 것을 의미하고, 그 값이 커질수록 팽윤되어 입자가 커지는 것을 의미한다.
건조 입자의 평균 직경과 증류수에서의 평균직경은 광학 현미경(Olympus, BX53)을 이용하여 측정하였다.
2. 구형화도
상기 실시예 및 비교예의 고분자 마이크로 입자의 광학(Olympus, BX53) 사진을 촬영하고, 이로부터 구형화도를 계산하였다.
본 발명에 따른 구형화도는 광학 사진에서의 임의의 30개 입자의 가장 긴 직경 대 가장 짧은 직경의 비율(장경비)의 평균 값으로 계산하였다.
이때, 구형화도 값이 100에 가까울수록 구형에 가까운 것을 의미한다.
구분 건조 입자의 평균 직경 (㎛) 증류수에서의 평균직경(㎛) 팽윤도 구형화도
실시예1 200 310 2.7 80
실시예2 234 330 1.8 80
실시예3 194 322 3.5 80
실시예4 248 434 4.3 80
실시예5 354 446 0.9 80
실시예6 588 804 1.5 80
비교예1 500 1250 2.5 90
비교예2 510 1240 2.4 90
비교예3 504 1190 2.3 90
비교예4 505 1200 2.37 90
비교예5 510 1210 2.37 80
상기 표 2에 나타난 바와 같이, 1차 가교 이후 입자를 회수하여 2차 가교 시키는 단계를 포함하는 본원 제조방법에 의하여 제조된 실시예의 고분자 마이크로 입자는, 구형화도가 80 이상으로 나타나 높은 구형화도를 나타내면서도, 동시에 팽윤도가 0.9 이상 4.3 이하로 나타나 우수한 가교도를 나타냄을 확인할 수 있었다.
3. 방출량
하기 표 3에 표시되어 있는 각 방출 조건에서 상기 실시예 및 비교예의 고분자 마이크로 입자를 5 mg/mL로 분산 시킨 후, 37 ℃ 에서 4주 배양하였다. Fluorescence intensity를 495 nm의 파장에서, Synergy HTX multi-mode plate reader기기 (BioTek 사)를 사용하여 배양 상층액의 495 nm에서의 형광 intensity를 측정하고, 상기 실시예 및 비교예에서 사용한 폴리펩타이드 및 블록킹 화합물(플루오레세인 이소티오시아네이트)의 결합물 Calibration curve를 통해 플루오레세인 이소티오시아네이트-폴리펩타이드 함량을 계산하였다.
구분 방출 조건 방출 기간 방출량(%)
실시예 1 pH 7.4, 37 ℃ 150 시간 100
실시예 2 pH 7.4, 37 ℃ 150 시간 100
실시예 3 pH 7.4, 37 ℃ 150 시간 100
실시예4 pH 7.4, 37 ℃ 150 시간 100
실시예 5 pH 7.4, 37 ℃ 150 시간 100
실시예 6 pH 7.4, 37 ℃ 150 시간 100
비교예1 pH 7.4, 37 ℃ 4주 17
비교예2 pH 7.4, 37 ℃ 4주 0
비교예3 pH 7.4, 37 ℃ 4주 0
비교예4 pH 7.4, 37 ℃ 4주 0
비교예5 pH 7.4, 37 ℃ 150 시간 0
상기 표 3에 나타난 바와 같이, 1차 가교 이후 입자를 회수하여 2차 가교 시키는 단계를 포함하는 본원 제조방법에 의하여 제조된 실시예의 고분자 마이크로 입자는, 150 시간 이상의 방출기간동안 100% 의 방출량을 나타내어 약학 유효물질의 화학적 변형 없이 단백질 약물 방출 특성을 나타냄을 확인할 수 있었다. 반면, 1차 가교 만을 거친 비교예의 고분자 마이크로 입자는 150 시간 이상의 방출 기간동안 20% 이하의 방출량을 나타내어 약학 유효물질의 화학적 변형으로 인하여 매우 불량한 단백질 약물 방출 특성을 나타냄을 확인할 수 있었다.
<실험예2>
상기 실시예1 및 비교예6에서 제조된 세포배양용 마이크로 캐리어에 대하여 다음과 같은 방법으로 물성을 측정하고 표4에 기재하였다.
4. 코팅층 두께
세포배양용 마이크로 캐리어 내 고분자 마이크로 입자의 표면에 형성된 코팅층 두께는 단면 TEM 이미지를 통해 측정하였다.
5. 세포 부착성
100 mL vertical wheel bioreactor (PBS社)에 중간엽 줄기세포(밀도: 1.05 g/cm3)를 포함하는 배양액을 채우고, 상기 세포 배양용 마이크로 캐리어를 배양액에 주입하고 교반하였다. 37 ℃에서 7일간 배양한 후, 세포 배양용 마이크로 캐리어에서 배양된 세포 수를 확인하였다. 그리고 하기 수학식과 같이 초기 투입된 세포 수와 비교하여 마이크로 캐리어의 세포 부착성을 평가하였다.
세포부착성 = (마이크로 캐리어를 세포배양액에 투입하여 37 ℃에서 7일간 배양한 후 세포수 / 세포배양액에 최초 포함된 세포수) X 100
구분 코팅층 두께(㎛) 세포부착성 (%)
실시예 1 0.1 3000
비교예 6 코팅층 없음 1700
상기 표4에 나타난 바와 같이, 실시예1의 세포 배양용 마이크로 캐리어는 고분자 마이크로 입자 표면에 0.1 ㎛의 세포부착성 물질 코팅층을 포함함에 따라, 세포부착성이 비교예6 대비 현저히 향상된 것을 확인할 수 있었다.

Claims (20)

  1. 생체 적합성 고분자를 포함하는 고분자 매트릭스; 및 상기 고분자 매트릭스에 분산되고, 반응성 작용기의 함량이 1 mol/103g 이하인 폴리펩타이드;를 포함하는 고분자 마이크로 입자; 및
    상기 고분자 마이크로 입자의 표면 상에 형성된 세포 부착 유도층;을 포함하는, 마이크로 캐리어.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 폴리펩타이드의 유체 역학적 반경(hydrodynamic radius)이 1 nm 내지 30 nm인, 마이크로 캐리어.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 반응성 작용기는 아민기, 하이드록시, 티올, 페닐 하이드록시기 및 이미도기로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인, 마이크로 캐리어.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 반응성 작용기의 함량이 1 mol/103g 이하인 폴리펩타이드는,
    표면의 반응성 작용기가 블록킹 화합물로 90 몰% 이상 치환된 폴리펩타이드를 포함하는, 마이크로 캐리어.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 폴리펩타이드는 블록킹 화합물과 반응성 작용기의 결합물인 작용기를 갖는 폴리펩타이드를 포함하는, 마이크로 캐리어.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 고분자 마이크로 입자는 증류수에서의 평균 직경이 1 ㎛ 이상 1000 ㎛ 이하인, 마이크로 캐리어.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 고분자 마이크로 입자는 하기 수학식 1에 의한 팽윤도가 10 이하인, 마이크로 캐리어:
    [수학식 1]
    팽윤도 = {(증류수에서의 평균직경)3 - (건조 입자의 평균직경)3} / (건조 입자의 평균직경)3.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 고분자 마이크로 입자는,
    150 시간 이상 배양한 이후, pH 5.0 이상 및 30 ℃ 이상 40 ℃ 이하의 방출 조건에서 약학 유효물질의 방출량이 20 % 이상 100 % 이하인, 마이크로 캐리어.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 고분자 매트릭스는 생체 적합성 고분자가 제1 가교제를 매개로 가교된 제1 가교 영역; 및
    생체 적합성 고분자가 제2 가교제를 매개로 가교된 제2가교 영역;을 포함하는, 마이크로 캐리어.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 생체 적합성 고분자는 히알루론산 및 젤라틴을 포함한, 마이크로 캐리어.
  11. 제1항에 있어서,
    상기 세포 부착 유도층은 젤라틴, 콜라겐, 피브로넥틴 키토산, 폴리도파민, 폴리 L-라이신, 비트로넥틴, RGD를 포함한 펩타이드, RGD를 포함한 아크릴계 고분자, 리그닌, 양이온성 덱스트란 및 이들의 유도체로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 세포 부착성 물질을 포함하는, 마이크로 캐리어.
  12. 제1항에 있어서,
    상기 세포 부착 유도층은 1 nm 내지 10,000 nm의 층 두께를 갖는, 마이크로 캐리어.
  13. 제1항에 있어서,
    상기 마이크로 캐리어는 1 ㎛ 내지 1000 ㎛의 평균직경을 갖는, 마이크로 캐리어.
  14. 제1항에 있어서,
    상기 마이크로 캐리어는 하기 수학식으로 계산되는 세포 부착성이 2000 % 이상인, 마이크로 캐리어:
    [수학식]
    세포부착성 = (마이크로 캐리어를 세포배양액에 투입하여 37 ℃에서 7일간 배양한 후 세포수 / 세포배양액에 최초 포함된 세포수) X 100.
  15. 제1항에 있어서,
    상기 마이크로 캐리어는 세포 배양용 마이크로 캐리어인, 마이크로 캐리어.
  16. 제1항의 마이크로 캐리어; 및
    상기 마이크로 캐리어 표면 상에 부착된 세포;를 포함하는, 세포 복합체.
  17. 제1항의 마이크로 캐리어 또는 제16항의 세포 복합체 중 어느 하나를 포함하는, 의료용 조성물.
  18. 제1항의 마이크로 캐리어 또는 제16항의 세포 복합체 중 어느 하나를 포함하는, 미용 조성물.
  19. 제17항의 의료용 조성물을 포함하는, 의료 용품.
  20. 제18항의 미용 조성물을 포함하는, 미용 용품.
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