KR20230047126A - 선택적 폐 전달을 위한 폴리(아민-코-에스테르) 중합체성 입자 - Google Patents

선택적 폐 전달을 위한 폴리(아민-코-에스테르) 중합체성 입자 Download PDF

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더블유. 마크 솔츠만
아글라이아 엔토코우
다니엘 그레이프
에이미 카프만
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예일 유니버시티
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Abstract

폴리(아민-코-에스테르) 중합체, 이로부터 활성제 로딩된 폴리플렉스 및 입자를 형성하는 방법, 및 최적 흡수량으로 핵산 작용제의 전달을 위해 이를 사용하는 방법이 개발되었다. 실시예에서는 노출된 카복실산 및/또는 히드록실 기와의 조합에서 임계 분자량, 및 제조 방법을 입증한다. 전형적으로, 조성물은 다른 대조군 형질 주입 시약과 비교하여 독성이 덜하거나, 약물 전달에 보다 효율적이거나, 또는 이들의 조합이다. 일부 실시형태에서, 조성물은 생체내 전달에 적합하며, 질병 또는 병태를 치료하기 위해 대상체에게 전신 투여될 수 있다.

Description

선택적 폐 전달을 위한 폴리(아민-코-에스테르) 중합체성 입자
관련 출원에 관한 상호 참조
본 출원은 2020년 7월 28일자로 출원된 미국 특허 출원 제63/057,626호 및 2021년 5월 27일자로 출원된 미국 특허 출원 제17/332,175에 대한 이익 및 우선권을 주장하며, 그 전문은 본원에 참조로 포함된다.
연방 지원 연구 또는 개발에 관한 진술
본 발명은 미국 국립 보건원이 수여하는 HL142674, HL133016 및 HL150766에 따라 정부 지원으로 이루어졌다. 정부는 본 발명에 특정 권리를 갖는다.
기술분야
본 발명의 기술분야는 일반적으로 폐 면역 세포, 특히 대식세포 및 단핵구로 작용제를 선택적으로 전달 및 흡수하기 위한 진단제, 예방제 및/또는 치료제의 개선된 폐 전달을 위한 중합체 조성물 및 방법에 관한 것이다.
폐 고혈압(PH)과 같은 심혈관 질환은 인간 건강에 심각한 악영향을 끼친다. 실제로, 20 mmHg 초과의 평균 폐 동맥 압력으로 정의되는 PH는 미국에서만 매년 20,000명 초과가 사망하는 원인이 된다(문헌[Simonneau G, et al. Eur Respir J. 2019;53(1); George Chest. 2014;146(2):476-95]). PH는 임상 표현, 혈류역학, 병리학적 소견 및 치료법에 기반하여 세계 보건 기구(WHO)에 의해 5개의 그룹으로 분류되는 임상 상태의 불균질 집합을 포함한다(Simonneau의 문헌).
특발성(IPAH; 예전에는 1차 PH로서 분류됨)을 포함하는 WHO 그룹 1 또는 폐 동맥 고혈압(PAH), 및 폐 질환 및/또는 저산소증에 기인한 그룹 3이 대표적이다. PAH 사례의 거의 절반은 유전성 또는 약물-유도된 IPAH이다. 다른 중요한 하위 그룹은 주요 원인이 결합 조직 질환, 주로 전신 경화증(SSc; 경피증으로도 알려짐)인 PAH 상태와 관련된다(문헌[Hoeper MM, et al. Lancet Respir Med. 2016;4(4):306-22; Galie N, et al. Eur Heart J. 2016;37(1):67-119]).
불행하게도, PAH는 초기 진단 후 7년 이내에 환자의 50%가 사망할 정도로 매우 병적이고 치명적이다(문헌[Benza Chest. 2012;142(2):448-56]). 더 나아가, SSc-PAH의 예후는 IPAH의 예후보다 매우 나쁘다(문헌[Fisher MR, et al. Arthritis Rheum. 2006;54(9):3043-50]). PAH에 대해 이용가능한 다수의 의약이 있음에도 불구하고, 상기 질환의 반전을 유도하거나 진행을 방지하는 치료법은 없다. 마찬가지로, 그룹 3 환자 중에서, PH는 폐 기저 질환에 대해 실질적으로 나쁜 예후의 전조가 된다(Hoeper의 2016년 문헌).
죽상동맥경화증 및 동맥 재협착증과 같은 많은 심혈관 질환은 과도하고 비정상적인 평활근 세포(SMC)를 특징으로 하고, 마찬가지로 PH에서 정상적으로 근육화되지 않은 원위 폐 세동맥의 SMC 코팅은 주요한 병리학적 특징이다. 이러한 과근육화는 폐 동맥 순응도를 감소시키며, 이는 IPAH 사망률의 강한 독립적 예측 인자이다(문헌[Mahapatra, et al. J Am Coll Cardiol. 2006;47(4):799-803]). PAH에 대한 현재의 치료는 주로 혈관 확장을 유도하지만, 이러한 치료법은 과량의 근육화를 약화시키지 않는다. 치료 공백은 대체로 병인에 대한 이해의 한계를 반영하므로 PH의 병리생물학에 대한 추가 조사가 가장 중요하다.
혈소판-유래된 성장 인자 수용체(PDGFR)-β를 발현하는 특화된 폐 세동맥 SMC는 저산소증-유도된 PH 동안 병리학적 원위 세동맥 SMC를 클론 확장하고 생성하지만, 이러한 정형화된 과정의 조절은 불완전하게 이해된다(문헌[Sheikh Cell Rep. 2014;6(5):809-17; Sheikh Sci Transl Med. 2015;7(308):308ra159]). SMC에서 저산소증-유도성 인자(HIF) 1-α의 상향조절은 원위 근육화에서 중요한 역할을 하며, SMC 그 자체에서 그러한 경로 외에도, 비세포 자율 조절이 중요하다(문헌[Ball, et al. Am J Respir Crit Care Med. 2014;189(3):314-24.; Sheikh Cell Rep. 2018;23(4):1152-65]). 이와 관련하여, 내피 세포(EC)는 가장 많이 연구된 세포 유형이다. 예를 들어, PDGF 경로는 혈관 SMC 발달 및 질병에 필수적이며(문헌[Andrae et al. Genes Dev. 2008;22(10):1276-312; Seidelmann Cell Mol Life Sci. 2014;71(11):1977-99]), EC에서 리간드 PDGF-β의 결실은 저산소증-유도된 원위 폐 세동맥 근육화, PH 및 우심실 비대(RVH)를 약화시킨다(Sheikh의 2018년 문헌).
설치류에서 실험적 저산소증은 원위 폐 세동맥 근육화, PH 및 우심실 비대를 유발한다. PDGF로 약칭되는 혈소판-유래된 성장 인자에 의해 조절되는 신호 전달 경로는 PH에서 SMC 병리생리학에 필수적이다. 실제로, 병리학적 SMC에서 증가된 수준의 수용체 PDGFR-β가 존재하며, 내피 세포에서 리간드 PDGF-β의 결실은 PH를 약화시킨다. 지난 10년 동안, 여러 질병에서 면역 시스템이 관여한다는 새로운 발견은 과학자들에게 폐 병리학에서 대식세포의 역할을 추가로 조사하도록 동기를 부여하였다. 저산소증은 폐에서 증가된 대식세포 모집을 유도하고, 대식세포에 의해 발현되는 엄선된 수용체 또는 작용제(예를 들어, CX3CR1, 류코트리엔 B4)의 약리학적 억제는 PH를 완화시키는 것으로 나타났지만; 이러한 결과는 또한 다른 세포 유형에 의해서도 생성되므로 세포 특이성 문제가 발생한다.
혈관 세포 유형 외에도, 단핵구/대식세포를 포함한 면역 세포가 PH와 관련하여 최근에 점점 더 관심을 받고 있다(문헌[Florentin et al. Cytokine. 2017;100:11-5; Nicolls et al Am J Respir Crit Care Med. 2017;195(10):1292-95]). 마우스가 저산소증에 노출되는 경우, 단핵구는 폐 혈관주위 공간으로 이동하여, 간질 대식세포로 분화한다(문헌[Florentin et al Cytokine. 2017;100:11-5; Nicolls et al. Am J Respir Crit Care Med. 2017;195(10):1292-9]). 이러한 마우스의 기관지폐포 세척은 흡인된 기관지폐포 세척액(BALF)뿐만 아니라 잔류 폐에서 대식세포의 증가를 입증한다(문헌[Amsellem V, et al. Am J Respir Cell Mol Biol. 2017;56(5):597-608]). 마찬가지로, 대식세포 마커 CD68을 발현하는 세포는 인간 PAH 환자의 폐 내의 혈관 폐쇄성 병변 근처에 풍부하다(문헌[Tuder et al. Am J Pathol. 1994;144(2):275-85]). PH의 설치류 모델에서, 대식세포에 의해 발현되는 엄선된 수용체 또는 작용제(예를 들어, CX3CR1, 류코트리엔 B4)의 전반적인 유전적 또는 약리학적 억제는 PH를 완화시키는 것으로 나타났지만(문헌[Amsellem, et al. Sci Transl Med. 2013;5(200):200ra117]); 이러한 결과는 또한 다른 세포 유형에 의해서도 생성되므로 대식세포 특이성 문제가 발생한다.
단핵구/대식세포가 PH 및 다른 혈관 질환의 병인에서 명백하게 중요한 역할을 하지만, 이와 관련하여 SMC의 생물학을 조절하는 데 있어서의 역할은 잘 확립되지 않았다. 죽상동맥경화성 플라크가 형성되는 동안, 희귀 SMC의 클론 확장은 골수-유래된 세포(아마도 대식세포)에 의해 조절되는 것으로 최근에 입증되었다(문헌[Misra A, et al. Nat Commun. 2018;9(1):2073]). 더 나아가, 죽상동맥경화증에 걸리기 쉬운 마우스로부터 활성화된 대식세포에 의해 조건화된 배지는 대동맥 SMC 이동 및 증식을 유도한다(Misra의 2018년 문헌). PH와 관련하여, 인터류킨-4에 의해 사전 활성화된 대식세포의 저산소증 노출은 폐 동맥 SMC(PASMC)의 증식을 유도하는 조건화 배지를 생성한다(문헌[Vergadi E, et al. Circulation. 2011;123(18):1986-95]). 또한, C-C 모티프 케모카인 수용체 2 및 5의 이중 억제는 대식세포 조건화 배지-PASMC 증식 및 이동의 유도를 약화시킨다(문헌[Abid, et al. Eur Respir J. 2019;54(4)]).
또한, 비효율적인 Csf1r-Cre-Mer-Cre에 의한 단핵구/대식세포에서 PDGF-B의 하향조절은 저산소증-유도된 폐 혈관 재형성을 적당히 억제하지만, 혈류역학 및 기본 경로는 평가되지 않은 것으로 최근에 밝혀졌다(문헌[Sheikh, Cell Reports, 2018. 23:1152; Epelman S, et al. Immunity. 2014;40(1):91-104]).
이러한 세포가 PH의 예방 또는 치료에 중요하더라도, 질병을 치료하거나 그 증상을 완화하기 위해 이들 세포로 선택적 전달하기 위한 수단은 없다.
따라서, 본 발명의 목적은 치료제, 진단제 및/또는 예방제를 폐 면역 세포, 특히 폐 대식세포 및 단핵구로 선택적으로 그리고 효과적으로 전달할 수 있는 개선된 중합체를 제공하는 것이다.
폐 대식세포-유래된 PDGF-B는 병리학적 SMC 확장에서 중요한 역할을 하며, PH와 같은 질환을 치료하거나 완화하는 치료 표적으로서 사용될 수 있다. 마우스 모델, 다중 유전자의 세포 유형-특이적 결실, IPAH 및 SSc-PAH 환자로부터의 인간 대식세포 및 PDGF-β에 대한 생체내 나노입자-전달된 siRNA를 사용하여 연구를 수행하였다. 골수 세포 내의 폐 대식세포의 결핍 또는 PDGF-β 결실은 저산소증-유도된 원위 근육화, PH 및 폐포 근섬유아세포 축적을 약화시킨다. 그 결과 단핵구/대식세포가 폐 고혈압(PH)에서 중요한 역할을 한다는 것이 확립되었다.
저산소증 마우스 모델뿐만 아니라 인간 단핵구-유래된 대식세포를 사용하여, 대식세포로부터 혈소판-유래된 성장 인자(PDGF)-B가 PH 환자 및 실험용 PH 마우스의 폐에서 상향조절됨이 입증되었다. 대식세포-유래된 PDGF-B는 PH의 병인의 중요한 성분인, 인간 폐 동맥 평활근 세포의 증가된 이동 및 증식을 유도한다. 더 나아가, 상기 발견은 골수 세포 내의 PDGF-β의 유전적 결실이 저산소증-유도된 PH를 방지함을 나타낸다. 그 결과 HIF1-α 및 HIF2-α가 대식세포에서 PDGF-B의 상류이고, 저산소증 노출된 마우스의 LysM+ 세포에서 Hifa 유전자의 결실이 PDGF-β 결실과 유사한 효과를 가짐이 입증된다. 보완적인 시도로서, 정상 산소 조건 하에, 골수 세포에서 HIFα 기능 획득은 폐 대식세포 축적 및 PDGF-β 발현 및 원위 근육화, PH 및 RVH를 유도한다. IPAH 및 SSc-PAH 환자로부터 대식세포에 의해 조건화된 배지는 PDGF-B-의존성 방식으로 인간 PASMC(hPASMC) 증식 및 이동을 유도한다. 그 결과 PDGF-β siRNA로 로딩된 경구기관 투여된 나노입자가 저산소증-유도된 폐 대식세포 PDGF-β 발현, 원위 근육화, PH, RVH 및 폐포 근섬유아세포 축적을 현저하게 약화시키는 것으로 나타난다. 이들 모두는 폐 대식세포-유래된 PDGF-B의 표적화가 PH에 대한 치료 전략임을 입증한다.
현재, 다수의 나노입자-기반 기술이 FDA-승인되었지만, 이들은 주로 정맥내 투여되어 순환을 통해 표적 기관(들)에 도달한다. 폴리(아민-코-에스테르)로 형성된 입자가 치료제, 예방제 또는 진단제를 대식세포와 같이 폐관을 감싸는 면역 세포로 선택적으로 전달하고 그에 의해 흡수되기 위해 사용될 수 있는 것으로 발견되었다. 실시예에서는 입자가 폐관에 투여될 때 표적 모이어티의 부재 하에서 높은 로딩 및 선택적 흡수를 가짐을 입증한다.
PH와 같은 폐 장애 외에도, 치료될 질병 또는 병태에는 감염성 질병, 암, 대사 장애, 자가면역 질병, 염증성 장애 및 연령-관련 장애가 포함된다. 입자는 에어로졸, 흡입기, 건조 분말, 삽관법 및 점적법에 의해 투여될 수 있다.
실시예에서는 PDGF-β에 대한 침묵(si) RNA로 로딩된 큰 나노입자(직경이 400 nm)를 마우스에게 경구기관 투여함을 입증한다. 이러한 나노입자는 폐 대식세포에 의해 우선적으로 흡수된다(나노입자를 흡수하는 총 세포 중, 대식세포에 해당하는 세포의 비율은 기관지폐포 세척액에서 약 95%이고, 기관지폐포 세척 후 잔류 폐에서 약 85%이다). 경구기관 투여에 의해, PDGF-β 침묵의 효율은 폐 대식세포에서 높고(>85% 녹다운(knockdown)), 저산소증-유도된 병리학적 원위 세동맥 근육화, 폐 동맥 압력 및 우심실 비대를 효과적으로 방지/방해할 수 있다.
도 1a 내지 1f는 폐 대식세포가 저산소증으로 축적되고 저산소증-유도된 폐 혈관 재형성 및 PH에 대해 중요하다는 것을 나타내는 그래프이다. 야생형 마우스를 최대 21일 동안 저산소증(10% FiO2)에 노출시키거나, 지시된 바와 같이 정상 산소에서 유지하였다. BALF 및 잔류 폐를 수확하고, 단일 세포 현탁액을 유세포 분석으로 처리하였다. CD64+Ly6G- 대식세포에 해당하는 주어진 구획에서의 총 세포의 비율을 결정하였다. 시점당 n=3 마우스. 도 1a 및 1b는 BALF(도 1a) 및 잔류 폐(도 1b)에 대한 저산소증 기간 동안의 CD64+Ly6G- 세포(%)의 그래프이다. 도 1c 내지 1d는 정상 산소 및 저산소증에 대한 RVSP(mm Hg)(도 1c) 및 RV/(LV+S)(도 1d, Fulton 지수(F; 우심실[RV] 대 좌심실[LV]과 중격[S]의 합의 중량비)가 나타남. n=3 마우스)의 그래프이다. PBS(비히클) 또는 클로드로네이트를 함유하는 리포솜을 저산소증(또는 대조군으로서 정상 산소)의 발병 시에 그리고 그 후에 21일 처리 동안에는 3일마다 경구기관 투여하였다. 도 1e 및 1f, BALF(도 1g) 및 잔류 폐(도 1h)의 총 세포에서 CD64+Ly6G- 대식세포의 백분율을 결정하였다. n=3 마우스.
도 2a 내지 2f는 폐 대식세포 PDGF-β 수준이 저산소증에 따라 증가하고, LysM+ 세포 내의 PDGF-β 결실이 원위 근육화 및 PH를 약화시킴을 나타내는 그래프이다. BALF(도 2a) 및 잔류 폐(도 2b), CD64+Ly6G- 세포를 최대 21일 동안 저산소증(10% FiO2)에 노출되거나 지시된 바와 같이 정상 산소에 노출된 야생형 마우스로부터 FACS에 의해 단리하였다. PDGF-β mRNA 수준을 qRT-PCR(표 1 참조)에 의해 측정하였다. 시점당 n=3 마우스이며, qRT-PCR을 세 벌씩 수행하였다. 도 2c 내지 2f, Cre 없음 또는 LysM-Cre를 또한 갖는 PDGF-β (flox/flox) 마우스를 21일 동안 저산소증에 노출시키거나 정상 산소에서 유지하였다. 도 2c, RVSP; 도 2d, RV/(LV+S), 도 2e, RV/LV+S 변화, 및 도 2f, 근섬유/100 폐포. 유전형에 의해 계층화된 저산소증과 정상 산소 값 사이의 Fulton 지수 차이가 도 2c에 나타나 있다. Tukey's 다중 비교 시험(*, **, ***, #, 대 정상 산소, 각각 p < 0.05, < 0.01, < 0.001, < 0.0001)과 함께 일원 분산 분석(one-way ANOVA)을 도 2c 내지 2d에서 사용하였고, Student's t-시험을 도 2e에서 사용하였다.
도 3a 내지 3d. LysM + 세포 내의 Vhl 결실은 정상 산소 하에서 원위 근육화 및 PH를 유도한다. Cre 없음 또는 LysM-Cre를 또한 갖는 Vhl (flox/flox) 마우스를 탄생 후 49일 동안 정상 산소에서 유지하였다. 도 3a, BALF를 단리하였고, PDGF-β 전사 수준을 나타낸 바와 같은 Fulton 지수(도 3c, BALF; 3b, 폐)에 의해 측정하였다. 대식세포(별표)의 수를 100개의 폐포에 대해 정량화하였다(도 3d). 마우스당 500개 초과의 폐포를 정량화하였다. n=3 마우스. Student's t-시험을 사용하였다.
도 4a 내지 4f. 골수 세포 내의 Hif1a 결실은 저산소증-유도된 PDGF-β 발현, 원위 근육화 및 PH를 약화시킨다. BALF 세포를 정상 산소 또는 저산소(10% FiO2, 최대 21일) 야생형 마우스로부터 단리하였다. β-액틴에 대한 HIF1-α의 밀도측정과 함께 HIF1-α 및 β-액틴 단백질을 웨스턴 블롯(Western blot)에 의해 평가하였다. 시점당 n=3 마우스. Tukey's 다중 비교 시험과 일원 분산 분석. Cre 없음 또는 LysM-Cre를 또한 갖는 Hif1a (flox/flox) 마우스를 3 또는 21일 동안 저산소증에 노출시켰다. 저산소증 3일째에, BALF 세포의 PDGF-β 전사 수준을 qRT-PCR에 의해 결정하였다(도 4a, 4b). 폐 바이브라톰(vibratome) 절편을 SMA, 대식세포 마커 CD64 및 핵(DAPI)에 대해 염색하였다. 대식세포 및 폐포 근섬유아세포의 수를 100개의 폐포에 대해 정량화하였다(도 4c, 4d). n=3 내지 5 마우스, qRT-PCR을 세 벌씩 수행하였다. 마우스당 700개 초과의 폐포를 정량화하였다. 저산소증 21일째에, L.L1.A1.L1 영역에서 원위 세동맥이 있는 바이브라톰 절편을 SMA 및 CD31에 대해 염색하였고, RVSP 및 Fulton 지수를 도 4e, 4f에 나타낸 바와 같이 측정하였다. n=3 마우스.
도 5a 내지 5f. LysM + 세포 내의 Hif2a 결실은 저산소증-유도된 PDGF-β 발현, 원위 근육화 및 PH를 약화시킨다. BALF 세포를 최대 21일 동안 정상 산소 또는 저산소증(10% FiO2)에 노출된 야생형 마우스로부터 단리하였다. β-액틴에 대한 HIF2-α의 밀도측정과 함께 웨스턴 블롯을 사용하여 HIF2-α 및 β-액틴 단백질 수준을 평가하였다. 시점당 n=3 마우스. 도 5a. Tukey's 다중 비교 시험과 일원 분산 분석. 도 5b 내지 5f. Cre 없음 또는 LysM-Cre를 또한 갖는 Hif2a (flox/flox) 마우스를 3 또는 21일 동안 저산소증에 노출시켰다. 저산소증 3일째에, BALF 세포를 qRT-PCR에 의해 결정된 PDGF-β mRNA 수준(도 5b)으로 단리하였고, 폐에 대한 바이브라톰 절편을 SMA, CD64 및 핵(DAPI)에 대해 염색하였다. 대식세포 및 폐포 근섬유아세포의 수를 100개의 폐포에 대해 정량화하였다(도 5c 내지 5d). n=3 내지 5 마우스, qRT-PCR을 세 벌씩 수행하였다. 마우스당 700개 초과의 폐포를 정량화하였다. 저산소증 21일째에, L.L1.A1.L1 영역에서 원위 세동맥이 있는 바이브라톰 절편을 SMA 및 MECA-32에 대해 염색하였고, RVSP 및 Fulton 지수를 측정하였다(도 5e, 5f). n=3 마우스. Student's t-시험.
도 6a 내지 6e. PAH 환자로부터 대식세포에 의해 분비된 PDGF-B는 hPASMC 증식 및 이동을 촉진시킨다. 인간 대조군 및 IPAH 또는 SSc-PAH 환자의 말초 혈액 단핵 세포로부터 단핵구를 단리하고, 배양물에서 대식세포로 분화시켰다. 도 6a, 인간 대조군 단핵구로부터 유래된 대식세포를 12시간 동안 정상 산소 또는 저산소(3% O2) 조건 하에서 배양한 후, PDGF-β mRNA 수준을 qRT-PCR에 의해 측정하였다. n=3 인간(2명의 여성과 1명의 남성, 30 내지 60세), qRT-PCR을 세 벌씩 수행하였다. 도 6b, qRT-PCR을 사용하여 대조군 및 PAH 환자로부터의 대식세포의 PDGF-β mRNA 수준을 분석하였다. PAH 진단 부류에 대해 n=5 인간 및 n=9 대조군(표 S2 참조), qRT-PCR을 세 벌씩 수행하였다. 도 6c, hPASMC를 대조군 및 환자 대식세포에 의해 사전 조건화된 배지를 사용하여 24시간 동안 배양하였다. 이러한 인큐베이션 마지막 10시간에 BrdU를 포함시켰다. 이어서, 세포를 BrdU 및 핵(프로피듐 아이오다이드[PI])에 대해 염색하였다. 도 6c에서, 대조군 인간 및 환자에 대해 BrdU를 발현하는 총 세포(PI+ 핵)의 비율을 대조군에 대한 이러한 비율로 정규화하였다. 도 6d에서, 항-PDGF-B 차단 항체 또는 대조군 IgG를 hPASMC와 함께 인큐베이션하기 전 1시간에 조건화 배지에 첨가하였다. 결과는 환자 진단 부류에 의해 계층화된, IgG 처리에 비해 항-PDGF-B 처리에 대해 BrdU+인 총 (PI+) 세포의 백분율의 비이다. PAH 진단 부류에 대해 n=3 인간 및 n=6 대조군(표 S3 참조), 인간 1명당 10개의 현미경 필드, 필드당 30 내지 60개의 세포. 대조군 또는 환자 대식세포에 의해 사전 조건화된 배지를 1시간 동안 항-PDGF-B 차단 또는 대조군 IgG 항체로 처리한 후 Boyden 장치의 하단 챔버에 놓았다. hPASMC를 상단 챔버에 추가하여 8시간 동안 조건화 배지를 향한 이동을 평가하였다. 이동된 세포(즉, 막의 하단 표면 상에서)를 Crystal Violet으로 염색하였다. 도 6e에서, 대조군 환자, IgG 처리에 대한 이동된 세포의 정량화가 나타나 있다. PAH 부류에 대해 n=4 인간 및 n=3 대조군(표 4 참조), 인간 1명당 5개의 현미경 필드, 필드당 8 내지 90개의 세포. Tukey's 다중 비교 시험과 일원 분산 분석 및 Student's t-시험을 사용하였다. #, ## 대 IPAH, p<0.05, <0.01, 및 *, **, ***, ns 대 상응하는 IgG 대조군, 각각 p<0.05, <0.01, <0.0001, 유의적이지 않음.
도 7a 내지 7f. 나노입자-매개된 PDGF-β의 녹다운은 원위 세동맥 근육화, 근섬유아세포 축적 및 PH를 약화시킨다. 염료 DiD로 로딩된 나노입자(직경 400 nm)를 정상 산소 마우스에 경구기관 투여하고, 12시간 후에, BALF 및 잔류 폐로부터의 세포를 CD64에 대해 염색하고 유세포 분석으로 처리하였다. 도 7a, CD64를 발현하는 DiD+ 나노입자(지시된 바와 같은 400 또는 200 nm의 직경)를 함유하는 BALF 또는 잔류 폐(RL) 세포의 비율을 나타내는 정량화. 처리마다 n=3 마우스. 정상 산소 마우스로부터 BALF 세포를 수확하고, DiD-로딩된 400 nm 나노입자와 함께 6시간 동안 배양한 후 핵에 대해 염색하였다(DAPI). 도 7b 내지 7f, 400 nm 직경의 나노입자에 PDGF-β에 대해 표적화된 siRNA 또는 스크램블(scramble) (Scr) RNA를 로딩한 다음, 저산소증 발병 시에 그리고 그 후 매주 2회 마우스에게 투여하였다. 저산소증 3일째에 마우스로부터 폐를 단리하고, Ly6G 및 CD64에 대해 염색하고, 유세포 분석으로 처리하고, CD64+Ly6G- 대식세포의 백분율을 도 7b에서 정량화하였다. 처리마다 n=3 마우스. 도 7c에서, CD64+Ly6G- 대식세포의 PDGF-β RNA 수준을 qRT-PCR에 의해 정량화하였다. 처리마다 n=3 마우스, qRT-PCR을 세 벌씩 수행하였다. 도 7d 내지 7f, 마우스를 21일 동안 저산소증으로 처리하거나, 정상 산소에서 유지하였다. 저산소 마우스의 경우, L.L1.A1 영역 또는 폐포 영역에서 원위 세동맥을 함유하는 절편을 CD31 및 SMA에 대해 염색하였다. RVSP(도 7d), Fulton 지수(도 7e) 및 100개의 폐포당 근섬유아세포의 수(도 7f)를 측정하였다. 마우스당 500개 초과의 폐포를 정량화하였다. Tukey's 다중 비교 시험과 일원 분산 분석 및 Student's t-시험을 사용하였다. * 대 정상 산소, p<0.05. ns, 유의적이지 않음. 기준 막대, 10 μm(D) 및 25 μm(I, L).
도 8은 동물 및 인간 연구에 대해 사용되는 방법의 개략도이다.
I. 정의
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "폴리플렉스"는 전형적으로 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드가 그 안에 캡슐화되어 있고, 그 안에 분산되어 있고/있거나 그 표면과 결합되어 있는 중합체성 마이크로입자 및/또는 나노입자 또는 미셀을 지칭한다.
용어 "마이크로입자"는 약 1 마이크로미터 이상 내지 약 1000 마이크로미터 이하의 평균 직경을 갖는 물체를 포함한다. 용어 "마이크로입자"는 마이크로구 및 마이크로캡슐뿐만 아니라, 위의 두 범주 중 어느 하나에 쉽게 속하지 않을 수 있는 구조를 포함한다. 마이크로입자는 구 또는 비구형일 수 있고, 임의의 규칙 또는 불규칙 형상일 수 있다. 직경이 약 1 마이크로미터(1000 nm) 미만의 평균 직경을 갖는 구조가 "나노입자"로 지칭되고, "나노구" 및 "나노캡슐"이 포함된다. 용어 "직경"은 물리적 직경 또는 수력학적 직경을 지칭하기 위해 사용된다. 본질적으로 구형 입자의 직경은 물리적 직경 또는 수력학적 직경을 지칭할 수 있다. 비구형 입자의 직경은 수력학적 직경을 지칭할 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 비구형 입자의 직경은 입자의 표면 상의 두 지점 사이의 가장 큰 선형 거리를 지칭할 수 있다. 여러 입자를 지칭할 때, 입자의 직경은 전형적으로 입자의 평균 직경을 지칭한다. 입자 직경은 동적 광 산란 및 공초점 현미경을 포함하지만, 이로 한정되지 않은 당업계의 다양한 기술을 사용하여 측정될 수 있다.
마이크로입자 또는 나노입자를 함유하는 조성물은 다양한 입자 크기를 갖는 입자를 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, 입자 크기 분포는, 예를 들어 평균 부피 직경의 약 20% 미만의 표준 편차 내에서 균일할 수 있고, 다른 실시형태에서, 예를 들어 중앙값 부피 직경의 약 10%, 8%, 5%, 3% 또는 2% 내에서 더욱 더 균일할 수 있다.
본원에서 일반적으로 사용되는 바와 같은 "약제학적으로 허용가능한"은 정통한 의학적 판단 범위 내에서, 타당한 이득/위험 비율에 상응하는 과도한 독성, 자극, 알러지 반응 또는 다른 문제 또는 합병증 없이 인간 및 동물의 조직, 기관 및/또는 체액과 접촉하여 사용하기에 적합한 화합물, 물질, 조성물 및/또는 투약 형태를 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "생체 적합한"은 그 자체로 호스트(예를 들어, 동물 또는 인간)에게 독성이 없거나, 호스트에서 독성 농도의 단량체성 또는 올리고머성 아단위 또는 다른 부산물을 생성하는 속도로 분해되지 않는(물질이 분해되는 경우) 하나 이상의 물질을 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "생분해성"은 그 물질이 전형적으로 가수분해 또는 효소 작용에 의해 그 성분의 아단위로 분해 또는 붕괴되는 것을 의미한다.
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "계면활성제"는 액체의 표면 장력을 저하시키는 작용제를 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같은 "서방성"은 물질의 전체 양이 한꺼번에 생물학적으로 이용가능하게 되는 볼루스(bolus) 유형의 투여와 반대로 연장된 시간에 걸친 물질의 방출을 지칭한다.
문구 "비경구 투여" 및 "비경구로 투여"는 당업계에 인지되는 용어이며, 여기에는 주사와 같이 장관 및 국소 투여와 다른 투여 방식이 포함되며, 제한 없이 정맥내, 근육내, 흉막내, 혈관내, 심낭내, 동맥내, 수막강내, 낭내, 안와내, 심장내, 진피내, 복강내, 경기관, 피하, 표피하, 관절내, 피막하, 지주막하, 척수내 및 흉골내 주사 및 주입이 포함된다.
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "표적화 모이어티"는 특정 장소에 국한되거나 멀리 있는 모이어티를 지칭한다. 모이어티는, 예를 들어 단백질, 핵산, 핵산 유사체, 탄수화물 또는 소 분자일 수 있다. 상기 실체는, 예를 들어 치료 화합물, 예컨대 소 분자, 또는 진단체, 예컨대 검출가능한 라벨일 수 있다.
용어 "알킬"은 직쇄 알킬 기, 분지쇄 알킬 기, 시클로알킬(지환족) 기, 알킬-치환된 시클로알킬 기 및 시클로알킬-치환된 알킬 기를 포함한 포화 지방족 기의 라디칼을 지칭한다.
바람직한 실시형태에서, 직쇄 또는 분지쇄 알킬은 그 백본에서 30개 이하(예를 들어, 직쇄에 대해 C1-C30, 분지쇄에 대해 C3-C30), 바람직하게는 20개 이하, 보다 바람직하게는 15개 이하, 가장 바람직하게는 10개 이하의 탄소 원자를 갖는다. 1 내지 30개의 백본 탄소 원자의 개수의 모든 정수 값이 고려되며 직쇄 또는 분지쇄 알킬에 대해 개시된다. 마찬가지로, 바람직한 시클로알킬은 그 고리 구조 내에 3 내지 10개의 탄소 원자를 갖고, 보다 바람직하게는 고리 구조 내에 5, 6 또는 7개의 탄소를 갖는다. 3 내지 10개의 고리 탄소 원자의 개수의 모든 정수 값이 고려되며 시클로알킬에 대해 개시된다.
본 명세서, 실시예 및 청구범위 전체에서 사용되는 용어 "알킬"(또는 "저급 알킬")은 "비치환된 알킬" 및 "치환된 알킬" 둘 모두를 포함하도록 의도되며, 여기서 치환된 알킬은 하나 이상의 치환체가 탄화수소 백본의 하나 이상의 탄소 상의 수소를 대체하는 알킬 모이어티를 지칭한다. 그러한 치환체는 할로겐, 히드록실, 카보닐(예컨대, 카복실, 알콕시카보닐, 포르밀 또는 아실), 티오카보닐(예컨대, 티오에스테르, 티오아세테이트 또는 티오포르메이트), 알콕실, 포스포릴, 포스페이트, 포스포네이트, 포스피네이트, 아미노, 아미도, 아미딘, 이민, 시아노, 니트로, 아지도, 설프히드릴, 알킬티오, 설페이트, 설포네이트, 설파모일, 설폰아미도, 설포닐, 헤테로시클릴, 아르알킬, 또는 방향족 또는 헤테로방향족 모이어티를 포함하지만, 이로 한정되지 않는다.
탄소의 개수가 달리 명시되지 않는다면, 본원에서 사용되는 바와 같은 "저급 알킬"은 상기 정의된 바와 같지만, 그 백본 구조 내에 1 내지 10개의 탄소 원자, 보다 바람직하게는 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 알킬 기를 의미한다. 마찬가지로, "저급 알케닐" 및 "저급 알키닐"은 유사한 사슬 길이를 갖는다. 본 출원 전체를 통해, 바람직한 알킬 기는 저급 알킬이다. 바람직한 실시형태에서, 본원에서 알킬로서 지정되는 치환체는 저급 알킬이다.
당업자는 탄화수소 사슬 상에 치환된 모이어티가 적절한 경우 그 자체로 치환될 수 있는 것으로 이해할 것이다. 예를 들어, 치환된 알킬의 치환체에는 할로겐, 히드록시, 니트로, 티올, 아미노, 아지도, 이미노, 아미도, 포스포릴(포스포네이트 및 포스피네이트 포함), 설포닐(설페이트, 설폰아미도, 설파모일 및 설포네이트 포함) 및 실릴 기뿐만 아니라 에테르, 알킬티오, 카보닐(케톤, 알데하이드, 카복실레이트 및 에스테르 포함), -CF3, -CN 등이 포함될 수 있다. 시클로알킬은 동일한 방식으로 치환될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같은 "아릴"은 C5-C10-원 방향족, 헤테로환형, 융합된 방향족, 융합된 헤테로환형, 이방향족, 또는 이헤테로환형 고리 시스템을 지칭한다. 일부 형태에서, 고리 시스템은 3 내지 50개의 탄소 원자를 갖는다. 광범위하게 정의되는 본원에서 사용되는 바와 같은 "아릴"은 0 내지 4개의 헤테로원자를 포함할 수 있는 5-, 6-, 7-, 8-, 9-, 10- 및 24-원 단일 고리 방향족 기를 포함하며, 예를 들어 벤젠, 나프탈렌, 안트라센, 페난트렌, 크리센, 피렌, 코라눌렌, 코로넨, 피롤, 퓨란, 티오펜, 이미다졸, 옥사졸, 티아졸, 트리아졸, 피라졸, 피리딘, 피라진, 피리다진 및 피리미딘 등이 있다. 고리 구조 내에 헤테로원자를 갖는 그러한 아릴 기는 또한 "아릴 헤테로환형" 또는 "헤테로방향족"으로 지칭될 수 있다. 방향족 고리는 하나 이상의 고리 위치에서 할로겐, 아자이드, 알킬, 아르알킬, 알케닐, 알키닐, 시클로알킬, 히드록실, 알콕실, 아미노(또는 4차화 아미노), 니트로, 설프히드릴, 이미노, 아미도, 포스포네이트, 포스피네이트, 카보닐, 카복실, 실릴, 에테르, 알킬티오, 설포닐, 설폰아미도, 케톤, 알데하이드, 에스테르, 헤테로시클릴, 방향족 또는 헤테로방향족 모이어티, -CF3, -CN; 및 이들의 조합을 포함하지만, 이로 한정되지 않은 하나 이상의 치환체로 치환될 수 있다.
용어 "아릴"은 둘 이상의 탄소가 2개의 인접한 고리(즉, "융합된 고리")에 대해 공통인 둘 이상의 환형 고리를 갖고, 여기서 적어도 하나의 고리가 방향족이고, 예를 들어 다른 환형 고리 또는 고리들이 시클로알킬, 시클로알케닐, 시클로알키닐, 아릴 및/또는 헤테로환형일 수 있는 다환형 고리 시스템을 또한 포함한다. 헤테로환형 고리의 예에는 벤즈이미다졸릴, 벤조퓨라닐, 벤조티오퓨라닐, 벤조티오페닐, 벤즈옥사졸릴, 벤즈옥사졸리닐, 벤즈티아졸릴, 벤즈트리아졸릴, 벤즈테트라졸릴, 벤즈이속사졸릴, 벤즈이소티아졸릴, 벤즈이미다졸리닐, 카바졸릴, 4aH 카바졸릴, 카볼리닐, 크로마닐, 크로메닐, 신놀리닐, 데카히드로퀴놀리닐, 2H,6H-1,5,2-디티아지닐, 디히드로퓨로[2,3-b]테트라히드로퓨란, 퓨라닐, 퓨라자닐, 이미다졸리디닐, 이미다졸리닐, 이미다졸릴, 1H-인다졸릴, 인돌레닐, 인돌리닐, 인돌리지닐, 인돌릴, 3H-인돌릴, 이사티노일, 이소벤조퓨라닐, 이소크로마닐, 이소인다졸릴, 이소인돌리닐, 이소인돌릴, 이소퀴놀리닐, 이소티아졸릴, 이속사졸릴, 메틸렌디옥시페닐, 모르폴리닐, 나프티리디닐, 옥타히드로이소퀴놀리닐, 옥사디아졸릴, 1,2,3-옥사디아졸릴, 1,2,4-옥사디아졸릴, 1,2,5-옥사디아졸릴, 1,3,4-옥사디아졸릴, 옥사졸리디닐, 옥사졸릴, 옥스인돌릴, 피리미디닐, 페난트리디닐, 페난트롤리닐, 페나지닐, 페노티아지닐, 페녹사티닐, 페녹사지닐, 프탈라지닐, 피페라지닐, 피페리디닐, 피페리도닐, 4-피페리도닐, 피페로닐, 프테리디닐, 푸리닐, 피라닐, 피라지닐, 피라졸리디닐, 피라졸리닐, 피라졸릴, 피리다지닐, 피리도옥사졸, 피리도이미다졸, 피리도티아졸, 피리디닐, 피리딜, 피리미디닐, 피롤리디닐, 피롤리닐, 2H-피롤릴, 피롤릴, 퀴나졸리닐, 퀴놀리닐, 4H-퀴놀리지닐, 퀴녹살리닐, 퀴누클리디닐, 테트라히드로퓨라닐, 테트라히드로이소퀴놀리닐, 테트라히드로퀴놀리닐, 테트라졸릴, 6H-1,2,5-티아디아지닐, 1,2,3-티아디아졸릴, 1,2,4-티아디아졸릴, 1,2,5-티아디아졸릴, 1,3,4-티아디아졸릴, 티안트레닐, 티아졸릴, 티에닐, 티에노티아졸릴, 티에노옥사졸릴, 티에노이미다졸릴, 티오페닐 및 크산테닐이 포함되지만, 이로 한정되지 않는다. 하나 이상의 고리는 "아릴"에 대해 상기 정의된 바와 같이 치환될 수 있다.
"알콕시"는 지시된 수의 탄소 원자가 산소 가교를 통해 부착되는 상기 정의된 바와 같은 알킬 기를 지칭한다. 알콕시의 예에는 메톡시, 에톡시, n-프로폭시, i-프로폭시, n-부톡시, s-부톡시, n-펜톡시, s-펜톡시 및 이들의 유도체가 포함되지만, 이로 한정되지 않는다.
1차 아민은 암모니아 내의 3개의 수소 원자 중 하나가 치환 또는 비치환된 알킬 또는 치환 또는 비치환된 아릴 기로 대체될 때 생성된다. 2차 아민은 2개의 유기 치환체(치환 또는 비치환된 알킬, 치환 또는 비치환된 아릴 또는 이들의 조합)가 하나의 수소와 함께 질소에 결합된다. 3차 아민에서, 질소는 3개의 유기 치환체를 갖는다.
본원에서 사용되는 바와 같은 "치환된"은 단량체 상의 하나 이상의 원자 또는 원자들의 기가 대체되는 원자 또는 원자들의 기와 상이한 하나 이상의 원자 또는 원자들의 기로 대체됨을 의미한다. 일부 실시형태에서, 단량체 상의 하나 이상의 수소는 하나 이상의 원자 또는 원자들의 기로 대체된다. 수소를 대체할 수 있는 작용기의 예는 상기 정의에 열거되어 있다. 일부 실시형태에서, 생성된 단량체/중합체의 전하 또는 친수성/소수성 등과 같은 화학적 및/또는 물리적 특성이 다른 하나 이상의 작용기가 첨가될 수 있다. 예시적인 치환체에는 할로겐, 히드록실, 카보닐(예컨대, 카복실, 알콕시카보닐, 포르밀 또는 아실), 티오카보닐(예컨대, 티오에스테르, 티오아세테이트 또는 티오포르메이트), 알콕실, 포스포릴, 포스페이트, 포스포네이트, 포스피네이트, 아미노, 아미도, 아미딘, 이민, 시아노, 니트로, 아지도, 설프히드릴, 알킬티오, 설페이트, 설포네이트, 설파모일, 설폰아미도, 설포닐, 니트로, 헤테로시클릴, 아르알킬, 또는 방향족 또는 헤테로방향족 모이어티가 포함되지만, 이로 한정되지 않는다.
달리 나타내지 않는 한, 본 개시내용은 당업계의 기술에 속하는 분자 생물학, 미생물학, 세포 생물학 및 재조합 DNA의 통상적인 기술을 포함한다. 예를 들어, 문헌[Sambrook and Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edition (2001); Current Protocols In Molecular Biology [(Ausubel, et al. eds., (1987)]; Coligan, Dunn, Ploegh, Speicher and Wingfeld, eds. (1995) Current Protocols in Protein Science (John Wiley & Sons, Inc.); the series Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.): PCR 2: A Practical Approach (M. J. MacPherson, B. D. Hames and G. R. Taylor eds. (1995)]을 참조한다.
II. 입자
폐로 효율적이고 선택적으로 전달하기 위한 입자는 전형적으로 생분해성 생체 적합성 중합체로 형성된다. 이는 전형적으로 1000 nm 미만, 보다 바람직하게는 500 nm 미만, 가장 바람직하게는 적어도 100 nm의 나노입자이다. 실시예에서는 200 내지 400 nm의 나노입자가 단핵구 및 대식세포와 같은 폐 면역 세포를 선택적으로 표적화함을 입증한다.
중합체
폴리(아민-코-에스테르), 폴리(아민-코-아미드), 또는 이들의 조합을 포함하는 중합체, 및 이로부터 형성된 폴리플렉스 및 중실 입자. 폴리(아민-코-에스테르)는 WO 2013/082529, WO 2017/151623, WO 2017/197128, 미국 공개 특허 출원 제2016/0251477호, 미국 공개 특허 출원 제2015/0073041호 및 미국 특허 제9,272,043호에 논의되어 있다.
중합체에서 디에스테르 단량체를 세바스산과 같은 이산으로 치환할 경우, 히드록실과 카복실 말단 기의 혼합을 갖는 중합체가 수득될 수 있다. 이들 말단 기 둘 모두는 1,1'-카보디이미다졸에 의해 활성화될 수 있다. 활성화된 생성물은 아민-함유 분자와 반응하여 새로운 말단 기를 갖는 중합체가 수득될 수 있다.
중합체는 추가로 가수분해되어 -OH 및 -COOH와 같은 보다 활성인 말단 기를 방출할 수 있고, 여기서 -OH 및 -COOH 둘 모두는 전형적으로 중합체를, 예를 들어 수일 또는 수주 동안 제어 온도(예를 들어, 37℃ 또는 100℃)에서 인큐베이션함으로써 중합체 내의 에스테르 결합의 가수분해(본원에서 "작동"으로도 지칭됨)로부터 기원할 수 있다. 일부 실시형태에서, 중합체는 가수분해되지 않고, 따라서 "비작동됨"으로 지칭될 수 있다.
일부 실시형태에서, 중합체 내의 소수성 단량체의 함량은 폴리플렉스를 형성하는 데 사용될 경우 동일한 소수성 단량체의 함량에 비해 증가한다. 중합체 내의 소수성 단량체의 함량이 증가하면 RNA를 포함한 핵산의 존재 하에 중실 나노입자를 형성할 수 있는 중합체가 형성된다.
폴리플렉스와 달리, 이들 입자는 완충수 또는 혈청에서 인큐베이션하는 동안 또는 동물에 투여(예를 들어, 주사)할 때 장기간 동안 안정하다. 이들은 또한 장기간 활성으로 이어지는(예를 들어, siRNA 매개-녹다운(knockdown)) 핵산(예를 들어, siRNA)의 서방성을 제공한다.
A. 중합체 구조
폴리(아민-코-에스테르) 또는 폴리(아민-코-아미드)가 본원에 기재된다. 일부 형태에서, 중합체는 화학식 I에 나타낸 구조를 갖는다:
[화학식 I]
Figure pct00001
식 중, n은 1 내지 30의 정수이고,
m, o 및 p는 독립적으로 1 내지 20의 정수이고,
x, y 및 q는 독립적으로 1 내지 1000의 정수이고,
Rx는 수소, 치환 또는 비치환된 알킬, 또는 치환 또는 비치환된 아릴, 또는 치환 또는 비치환된 알콕시이고,
Z 및 Z'는 독립적으로 O 또는 NR'이고, 여기서 R'는 수소, 치환 또는 비치환된 알킬, 또는 치환 또는 비치환된 아릴이고,
R1 및 R2는 히드록실 기, 1차 아민 기, 2차 아민 기, 3차 아민 기 또는 이들의 조합을 함유하는 화학적 물질이다.
Rx 및 R' 기의 예에는 수소, 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, t-부틸, 이소부틸, sec-부틸, 시클로헥실, (시클로헥실)메틸, 시클로프로필메틸, 및 이의 동족체 및 이성질체, 예를 들어 n-펜틸, n-헥실, n-헵틸, n-옥틸, 페닐, 나프탈릴, 안트라세닐, 페난트릴, 크리세닐, 피레닐, 톨릴, 자일릴 등이 포함되지만, 이로 한정되지 않는다.
특정 실시형태에서, x, y 및/또는 q의 값은 중합체의 중량 평균 분자량이 20,000 달톤 초과, 15,000 달톤 초과, 10,000 달톤 초과, 5,000 달톤 초과, 2,000 달톤 초과인 값이다. 일부 형태에서, 중합체의 중량 평균 분자량은 약 2,000 달톤 내지 약 20,000 달톤, 보다 바람직하게는 약 5,000 달톤 내지 약 10,000 달톤이다.
중합체는 하나 이상의 락톤, 하나 이상의 아민-디올(Z 및 Z' = O), 트리아민(Z 및 Z' = NR'), 또는 히드록시-디아민(Z = O 및 Z' = NR', 또는 Z = NR' 및 Z' = O) 및 하나 이상의 이산 또는 디에스테르로부터 제조될 수 있다. 이러한 실시형태에서, 둘 이상의 상이한 락톤, 이산 또는 디에스테르, 및/또는 트리아민, 아민-디올, 또는 히드록시-디아민 단량체가 사용되는 경우, n, o, p, 및/또는 m의 값은 동일하거나 상이할 수 있다.
일부 형태에서, 락톤 단위의 조성물%는 락톤 단위 대 (락톤 단위 + 디에스테르/이산)으로 계산될 때 약 10% 내지 약 100%이다. 몰비에 대해 표현할 경우, 락톤 단위 대 (락톤 단위 + 디에스테르/이산) 함량은 약 0.1 내지 약 1이고, 즉 x/(x + q)는 약 0.1 내지 약 1이다. 바람직하게는, 락톤 단위 내의 탄소 원자의 수는 약 10 내지 약 24이고, 보다 바람직하게는 락톤 단위 내의 탄소 원자의 수는 약 12 내지 약 16이다. 가장 바람직하게는, 락톤 단위 내의 탄소 원자의 수는 12(도데칼락톤), 15(펜타데칼락톤), 또는 16(헥사데칼락톤)이다.
일부 형태에서, Z는 Z'와 동일하다.
일부 형태에서, Z는 O이고, Z'는 O이다. 일부 형태에서, Z는 NR'이고, Z'는 NR'이다. 일부 형태에서, Z는 O이고, Z'는 NR'이다. 일부 형태에서, Z는 NR'이고, Z'는 O이다.
일부 형태에서, Z'는 O이고, n은 1 내지 24의 정수, 예컨대 4, 10, 13 또는 14이다. 일부 형태에서, Z는 또한 O이다.
일부 형태에서, Z'는 O이고, n은 1 내지 24의 정수, 예컨대 4, 10, 13 또는 14이고, m은 1 내지 10의 정수, 예컨대 4, 5, 6, 7 또는 8이다. 일부 형태에서, Z는 또한 O이다.
일부 형태에서, Z'는 O이고, n은 1 내지 24의 정수, 예컨대 4, 10, 13 또는 14이고, m은 1 내지 10의 정수, 예컨대 4, 5, 6, 7 또는 8이고, o 및 p는 1 내지 6의 동일한 정수, 예컨대 2, 3 또는 4이다. 일부 형태에서, Z는 또한 O이다.
일부 실시형태에서, Z'는 O이고, n은 1 내지 24의 정수, 예컨대 4, 10, 13 또는 14이고, m은 1 내지 10의 정수, 예컨대 4, 5, 6, 7 또는 8이고, R은 알킬, 예컨대 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, t-부틸, 이소부틸, sec-부틸, 시클로헥실, (시클로헥실)메틸, 시클로프로필메틸, 및 이의 동족체 및 이성질체, 예를 들어 n-펜틸, n-헥실, n-헵틸 및 n-옥틸, 또는 아릴, 예컨대 페닐, 나프탈릴, 안트라세닐, 페난트릴, 크리세닐, 피레닐, 톨릴 또는 자일릴이다. 일부 형태에서, Z는 또한 O이다.
일부 형태에서, n은 14(예를 들어, 펜타데칼락톤, PDL)이고, m은 7(예를 들어, 세바스산)이고, o 및 p는 2(예를 들어, N-메틸디에탄올아민, MDEA)이다.
일부 실시형태에서, 폴리플렉스 또는 입자는 R1 및/또는 R2가, R1 및/또는 R2가 다음으로 이루어지거나 포함하는 상응하는 폴리플렉스와 관련이 없는 중합체로부터 형성된다:
Figure pct00002
.
일부 실시형태에서, 상기 중합체로부터 형성된 폴리플렉스 또는 입자는 R1 및/또는 R2가 다음으로 이루어지거나 포함하는 상응하는 폴리플렉스에 비해, 핵산 카고, 예컨대 RNA, 보다 특히 mRNA의 개선된 로딩, 개선된 세포 형질 주입, 개선된 세포내 엔도솜 방출 또는 이들의 조합을 나타낸다:
Figure pct00003
.
일부 형태에서, 중합체는 화학식 II의 구조를 갖는다.
[화학식 II]
Figure pct00004
식 중, J1 및 J2는 독립적으로 연결 모이어티이거나, 부재하고,
R3 및 R4는 독립적으로 히드록실 기, 1차 아민 기, 2차 아민 기, 3차 아민 기 또는 이들의 조합을 함유하는 치환된 알킬이다. 일부 형태에서, R3, R4 또는 둘 모두의 분자량은 500 달톤 이하, 200 달톤 이하, 또는 100 달톤 이하이다.
일부 형태에서, J1은 -O- 또는 -NH-이다.
일부 형태에서, J2는 -C(O)NH- 또는 -C(O)O-이다.
일부 형태에서, R3은 R4와 동일하다.
바람직하게는, R3 및/또는 R4는 선형이다.
일부 형태에서, R3, R4 또는 둘 모두는 1차 아민 기를 함유한다. 일부 형태에서, R3, R4 또는 둘 모두는 1차 아민 기 및 하나 이상의 2차 또는 3차 아민 기를 함유한다.
일부 형태에서, R3, R4 또는 둘 모두는 히드록실 기를 함유한다. 일부 형태에서, R3, R4 또는 둘 모두는 히드록실 기 및 하나 이상의 아민 기, 바람직하게는 2차 또는 3차 아민 기를 함유한다. 일부 형태에서, R3, R4 또는 둘 모두는 히드록실 기를 함유하고, 아민 기를 함유하지 않는다.
일부 형태에서, R3 및 R4 중 적어도 하나는 히드록실 기를 함유하지 않는다.
일부 형태에서, R3, R4 또는 둘 모두는 -비치환된 C1-C10 알킬렌-Aq-비치환된 C1-C10 알킬렌-Bq, -비치환된 C1-C10 알킬렌-Aq-치환된 C1-C10 알킬렌-Bq, -치환된 C1-C10 알킬렌-Aq-비치환된 C1-C10 알킬렌-Bq, 또는 -치환된 C1-C10 알킬렌-Aq-치환된 C1-C10 알킬렌-Bq이고, 여기서 Aq는 부재하거나, -NR5-이고, Bq는 히드록실, 1차 아민, 2차 아민 또는 3차 아민이고, R5는 수소, 치환 또는 비치환된 알킬, 또는 치환 또는 비치환된 아릴이다.
일부 형태에서, R3, R4 또는 둘 모두는 도 1에 나타낸 기로부터 선택된다.
일부 형태에서, 중합체는 화학식 III의 구조를 갖는다.
[화학식 III]
Figure pct00005
단량체 단위는 하나 이상의 위치에서 하나 이상의 치환체로 치환될 수 있다. 예시적인 치환체에는 알킬 기, 환형 알킬 기, 알켄 기, 환형 알켄 기, 알킨, 할로겐, 히드록실, 카보닐(예컨대, 카복실, 알콕시카보닐, 포르밀 또는 아실), 티오카보닐(예컨대, 티오에스테르, 티오아세테이트 또는 티오포르메이트), 알콕실, 포스포릴, 포스페이트, 포스포네이트, 포스피네이트, 아미노, 아미도, 아미딘, 이민, 시아노, 니트로, 아지도, 설프히드릴, 알킬티오, 설페이트, 설포네이트, 설파모일, 설폰아미도, 설포닐, 니트로, 헤테로시클릴, 아르알킬, 또는 방향족 또는 헤테로방향족 모이어티가 포함되지만, 이로 한정되지 않는다.
중합체는 바람직하게는 생체 적합하다. 다양한 고리 크기를 갖는 쉽게 이용가능한 락톤은 낮은 독성을 갖는 것으로 공지되어 있다: 예를 들어, 작은 락톤, 예컨대 폴리(카프로락톤) 및 폴리(p-디옥산온)으로부터 제조된 폴리에스테르는 임상 응용에서 사용되는 상업적으로 입수가능한 생체 물질이다. 큰(예를 들어, C16-C24) 락톤 및 이들의 폴리에스테르 유도체는 벌과 같은 살아있는 유기체에서 확인되는 천연 제품이다. 16 내지 24개의 고리 탄소 원자를 함유하는 락톤이 구체적으로 고려되며 개시된다.
일부 형태에서, 중합체는 하나 이상의 활성화된 말단 기(들)를 노출시킴으로써 온도-제어된 가수분해를 통해 추가로 활성화될 수 있다. 하나 이상의 활성화된 말단 기(들)는, 예를 들어 히드록실 또는 카복실산 말단 기일 수 있고, 이들 둘 모두는 중합체 내의 에스테르 결합의 가수분해를 통해 생성될 수 있다. 활성화된 중합체는 약 5 내지 25 kDa, 바람직하게는 약 5 내지 10 kDa의 중량 평균 분자량을 가질 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "약"은 허용가능한 파라미터 내에서의 약간의 변화를 의미한다. 명확성을 위해, "약"은 주어진 값의 ± 10%를 지칭한다. 일부 형태에서, 활성화된 중합체는 한 말단에 R1 또는 R2를 함유하고, 다른 말단에 가수분해를 통해 생성된 히드록실 또는 카복실산 말단 기를 함유한다.
일부 형태에서, 중합체는 화학식 IV의 구조를 갖는다.
[화학식 IV]
Figure pct00006
일부 형태에서, 중합체는 화학식 V의 구조를 갖는다.
[화학식 V]
Figure pct00007
일부 형태에서, 중합체는 화학식 VI의 구조를 갖는다.
[화학식 VI]
Figure pct00008
식 중, X'는 -OH 또는 -NHR'이다.
화학식 VI, V 및 VI은 중간체 생성물의 구조이다. 이들은 화학식 I, II 또는 III의 구조를 갖는 광범위한 중합체를 합성하는 데 사용될 수 있다.
B. PEG-블로킹 함유 중합체
중합체는, 예를 들어 원하는 기간에 걸쳐 제어된 방출 방식으로 하나 이상의 치료제, 예방제 및/또는 진단제를 방출할 수 있는 입자, 예컨대 마이크로입자 또는 나노입자, 또는 미셀의 형태로 약물 전달을 위해 사용될 수 있다.
pH-반응성 미셀 나노담체는 종종 양친매성 블록 공중합체의 자가 조립을 통해 형성되고, 친수성(예를 들어, PEG) 외부 셀 및 매질 pH에 반응할 수 있는 소수성 내부 코어로 이루어진다. 전형적으로, 매질 pH가 중성 또는 약 염기성으로부터 약 산성으로 변할 때, 미셀 코어는 분해가 가속되고, 물에서 완전히 용해될 수 있거나 수성 매질에서 실질적으로 팽윤된다. 결과적으로, 생리학적 pH에서 느린 약물 방출 속도를 갖는 약물 캡슐화된 미셀은 산성 pH에 의해 약물 분자를 신속하게 언로딩하도록 촉발될 수 있다. 이전의 보고서에서 미셀 코어를 구성하는 중합체 분절은 폴리(오르소 에스테르), 폴리(β-아미노 에스테르), 폴리(L-히스티딘) 등을 포함한다. 이전의 미셀 시스템 대부분이 갖는 주요 단점은 공중합체를 제조하기 위해 다단계가 필요하고, 공중합체 합성 동안 중합체 분자량을 제어하고 중합체 조성을 조정하기 곤란하다는 것이다.
공중합체는 pH의 함수로서 방출 속도의 변화를 나타냈다. PEG2K-PPMS 공중합체 샘플(PEG2K- PPMS-11%PDL, PEG2K-PPMS-30%PDL, 및 PEG2K-PPMS-51%PDL)의 DTX-캡슐화 미셀의 시험관내 약물 방출 거동을 7.4의 생리학적 pH 및 5.0의 산성 pH 둘 모두에서 PBS 용액 중에 연구하였다. 일반적으로, 모든 미셀 샘플로부터 DTX 방출은 2상 방출 동역학을 따랐고, 현저한 pH-의존성을 나타내었다. DTX-로딩된 PEG2K-PPMS 공중합체 미셀은 처음 12시간 동안 빠르게 25 내지 45% 약물을 방출한 후 이어서 132시간 동안 추가로 25 내지 40% 약물을 보다 점진적으로 방출하였다. 약물 방출 속도에 대한 매질 pH의 영향은 상당하다. 예를 들어, 인큐베이션 기간(144 시간)의 말기에, PEG2K-PPMS-11%PDL, PEG2K-PPMS-30%PDL, 및 PEG2K-PPMS-51%PDL 공중합체의 미셀로부터 방출된 축적된 DTX의 값은 7.4의 생리학적 pH에서 각각 66%, 60% 및 55%이며, 이는 5.0의 산성 pH에서 85%, 81% 및 75%로 상응하여 증가한다. PEG2K-PPMS 공중합체 미셀로부터 DTX 방출의 관찰된 pH-촉발된 가속화는 7.4로부터 5.0으로의 매질 pH의 변화가 미셀 PPMS 코어의 크기 증가 및 양성자화로 인해 미셀의 유의적인 팽윤을 유발한다는 초기 관찰과 일치한다. 이러한 pH-촉발된 미셀 크기 팽창은 포획된 DTX의 미셀 코어로부터 수성 매질로의 확산 및 방출을 틀림없이 촉진할 것이다. 주어진 pH에서, DTX 방출 속도는 아마도 미셀 코어 내의 PPMS 매트릭스와 약물의 상호작용에 의해 제어된다. PDL-풍부 PEG2K-PPMS 공중합체는 그 미셀 내부 코어에서 강한 소수성 도메인을 형성하여 소수성 DTX 분자를 보다 우수하게 포획하고 유지하는 것으로 예상되기 때문에, 그러한 공중합체 미셀로부터의 약물 방출은 보다 점진적이며 지속되어야 한다. 이러한 가설은 pH 7.4 및 5.0 둘 모두에서, 공중합체의 PPMS 사슬 분절 내의 PDL 함량이 증가함에 따라 PEG2K-PPMS 공중합체 미셀로부터의 DTX 방출 속도가 감소한다는 것을 보여주는 실험 결과에 의해 지지된다.
종양 세포에 의한 미셀의 흡수 시에, 미셀 입자는 5.5 내지 6.0의 pH 범위에서는 엔도솜에서 그리고 4.5 내지 5.0의 pH 범위에서는 리소좀에서 포획 처리되는 것으로 알려져 있다. 상기 결과에 의해 명백하게 입증되는 바와 같이, 이러한 산성 환경은 PEG2K-PPMS 공중합체 미셀로부터 빠른 DTX 방출을 확실하게 촉발시켜, 이에 따라 약물-로딩된 미셀의 세포독성을 향상시킬 것이다. 공중합체 내의 아미노 기는 엔도솜 탈출을 촉진하도록 양성자 스폰지처럼 작용할 것이다. 따라서, PEG2K-PPMS 공중합체 미셀에 의해 나타난 pH-반응성 특성이 매우 바람직하며, 이러한 특성은 이들을 항암 약물의 전달에 뛰어난 담체로 만든다.
C. 중합체의 제조 방법
중합체는 일반적으로 합성 중합체로부터 변형된다. 예시적인 합성 중합체에는 락톤, 디알킬산 및 디알킬 아민으로 형성된 폴리(아민-코-에스테르)가 포함된다. 효소 촉매, 예컨대 리파아제를 사용하여 락톤, 디알킬산 및 디알킬 아민으로부터 폴리(아민-코-에스테르)를 합성하는 방법이 또한 제공된다. 예시적인 락톤은 미국 특허 공개 제US20170121454호에 개시되어 있다.
D. 중합체로부터 형성된 입자
중합체는 하나 이상의 치료제, 진단제 또는 예방제가 그 안에 캡슐화되어 있는 마이크로입자 및/또는 나노입자를 제조하는 데 사용될 수 있다. 상기 작용제는 입자 내에 캡슐화되거나, 입자를 형성하는 중합체 매트릭스 내에 분산되거나, 입자의 표면에 공유 또는 비공유적으로 결합되거나, 또는 이들의 조합일 수 있다.
방출 속도는 중합체의 단량체 조성 및/또는 중합체의 분자량 및 이에 따른 분해 속도를 변화시킴으로써 제어될 수 있다. 예를 들어, 간단한 가수분해가 분해의 주요 메커니즘인 경우, 중합체의 소수성을 증가시켜 분해 속도를 지연시킬 수 있고, 이에 따라 방출 기간을 증가시킬 수 있다. 모든 경우에, 중합체 조성물은 유효량의 핵산(들)이 방출되어 원하는 목적/결과를 달성하도록 선택된다.
E. 퍼플렉스 및 미셀
다가양이온성 중합체의 유전자 전달 능력은 중합체 분자량, 소수성 및 전하 밀도를 포함한 여러 인자에 기인하는 것으로 발견되었다. 많은 합성 다가양이온성 물질이 비바이러스 유전자 전달을 위한 벡터로서 시험되었지만, 거의 모두는 그 낮은 효율 또는 높은 독성으로 인해 비효과적이다. 상기 기재된 대부분의 다가양이온성 벡터는 높은 전하 밀도를 나타내며, 이는 효과적인 DNA 응축을 위한 주요 요건으로 간주되었다. 결과적으로, 이들은 시험관내에서 높은 효율로 유전자를 전달할 수 있지만, 과량의 전하 밀도와 관련한 독성으로 인해 생체내 응용에 대해서는 제한된다.
고 분자량 중합체, 특히 삼원공중합체는 저 전하 밀도를 갖는다. 또한, 이들의 소수성은 특정 고리 크기를 갖는 락톤 공단량체를 선택함으로써 그리고 중합체 내의 락톤 함량을 조정함으로써 달라질 수 있다. 락톤-디에스테르-아미노 디올 삼원공중합체의 고 분자량 및 증가된 소수성은 저 전하 밀도를 보상하여 최소 독성으로 효율적인 유전자 전달을 제공한다.
바람직한 실시형태에서, 삼원공중합체는 감소된 독성으로 효율적인 유전자 전달을 나타낸다. 삼원공중합체는 유의적으로 보다 효율적인 상업적으로 입수가능한 비바이러스 벡터일 수 있다. 예를 들어, 삼원공중합체는 루시퍼라아제 발현 분석에 기반하여 PEI 및 LIPOFECTAMINE® 2000과 같은 상업적으로 입수가능한 비바이러스 벡터보다 100x 초과로 더 효율적일 수 있는 한편, 상업적으로 입수가능한 이러한 비바이러스 벡터와 비교하여 0.5 mg/ml 이하의 독성 용량에서 최소 독성을 나타낸다. 바람직하게는, 삼원공중합체는 핵산의 시험관내 및 생체내 형질 주입 둘 모두에 적합한 농도에서 비독성이다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 삼원공중합체는 세포 형질 주입의 다른 접근과 비교하여 비특이적 세포 사멸을 덜 유발한다. 바람직한 삼원공중합체는 20% PDL(삼원공중합체 III-20% PDL로도 지칭됨)을 함유하는 ω-펜타데칼락톤-디에틸 세바케이트-N- 메틸디에탄올아민 삼원공중합체이다.
PEG-블록 함유 중합체와 같은 중합체는 미셀을 제조하는 데 사용될 수 있다. 평균 미셀 크기는 전형적으로 약 100 내지 약 500 nm, 바람직하게는 약 100 내지 약 400 nm, 보다 바람직하게는 약 100 내지 약 300 nm, 보다 바람직하게는 약 150 내지 약 200 nm, 가장 바람직하게는 약 160 내지 약 190 nm의 범위이고, 이는 혈청 단백질의 존재 하에 생리학적 pH 7.4에서 안정하였다. 공중합체는 높은 혈액 적합성을 갖고, 용혈 및 응집을 유도하도록 최소 활성을 나타낸다.
미셀의 크기 및 제타 전위는 미셀을 수용하는 수성 매질의 pH가 달라질 때 유의적으로 변하는 것으로 발견되었다. 예를 들어, 크기-pH 및 제타-pH 곡선의 추세는 상이한 PDL 함량(11%, 30% 및 51%)을 갖는 3개의 PEG2K-PPMS 공중합체의 미셀에 대해 놀랍도록 유사하다. 미셀 샘플의 평균 크기는 매질 pH가 7.4로부터 5.0으로 감소될 때 점차적으로 증가하여, pH 값이 5.0 미만일 때 거의 일정하게 유지되는 것이 명백하다. 미셀에 대해 관찰되는 이러한 pH-반응성 거동은 pH가 7.4로부터 5.0으로 감소될 때 예상되며, 미셀의 PPMS 코어는 양성자화되고 보다 친수성이며, 따라서 수성 매질로부터 보다 많은 물 분자를 흡수하여 미셀의 팽윤을 유발한다. 미셀 코어는 pH 5.0에서 이미 완전히 양성자화되고, 결과적으로 미셀의 크기는 pH가 5.0으로부터 더욱 감소함에 따라 제법 일정하게 유지된다. PEG2K-PPMS 공중합체 내의 PDL 함량이 pH 7.4 내지 5.0 값에서 미셀 크기 변화 규모에 미치는 효과가 또한 주목할 만하다. 공중합체에서 PDL 함량이 감소하고, 3차 아미노 기 함량이 증가함에 따라, 양성자 및 물 분자를 흡수하는 미셀 코어의 능력이 증가하는 것으로 예상된다. 따라서, pH가 7.4로부터 5.0까지 감소할 때, 평균 미셀 크기 변화는 PEG2K-PPMS-30%PDL(184 nm 내지 214 nm) 및 PEG2K-PPMS-51%PDL(163 nm 내지 182 nm)과 비교할 경우, PEG2K-PPMS-11%PDL(200 nm 내지 234 nm)에 대해 보다 유의적이었다(도 5a).
수성 매질에서 미셀의 제타 전위는 또한 상당한 pH-의존성을 나타낸다. 생리학적 및 알칼리성 pH(7.4 내지 8.5)에서, 블랭크 PEG2K-PPMS 공중합체 미셀의 표면 전하는 음성이었지만, 이는 매질의 pH가 산성 범위(4.0 내지 6.0)로 감소할 때 양성으로 변하였다. 예를 들어, PEG2K-PPMS-11%PDL, PEG2K-PPMS- 30%PDL, 및 PEG2K-PPMS-51%PDL의 미셀은 pH 7.4에서 각각 -5.8, -7.1, -5.1 mV의 제타 전위 값을 가졌고, 이는 보다 낮은 pH 5.0에서 대응하여 +7.6, +5.8, +4.0 mV로 변하였다. 상기 논의를 기준으로, pH에 대한 이러한 표면 전하 의존성은 상이한 매질 pH에서 미셀의 PPMS 코어의 양성자화 또는 탈양성자화에 기인할 수 있다. 알칼리성 pH(7.4 내지 8.5)에서, 미셀 내의 아미노 기 대부분은 아마도 양성자화되지 않고, 미셀 입자는 미셀에 의한 PBS 중의 HPO42- 및/또는 H2PO4- 음이온의 흡수로 인해 여전히 음으로 하전된다. 특히, pH 8.5에서, 제타-전위 값은 PEG2K-PPMS-11%PDL, PEG2K-PPMS-30%PDL, 및 PEG2K-PPMS-51%PDL에 대해 각각 -8.1 mV, -7.9 mV, -9.0 mV이었다. pH가 7.4로부터 5.0으로 감소될 때, 미셀 PPMS 코어 중의 3차 아미노 모이어티는 대부분 양성자화되고, 미셀은 양으로 하전된 입자로 변한다. 일관되게, 3개의 미셀 샘플 중에서, 양성자를 흡수하기에 가장 큰 능력을 갖는 PEG2K-PPMS-11%PDL 미셀은 pH 4.0 내지 5.0에서 가장 큰 제타 전위 값을 나타내었지만, 가장 작은 양성자화 능력을 갖는 PEG2K-PPMS-51%PDL 미셀은 가장 낮은 제타 전위를 나타내었다. 매질 pH에 대한 관찰된 미셀 표면 전하 반응은 생리학적 pH에서 미셀의 음의 표면 전하가 혈액 내의 혈청 단백질과 미셀의 상호작용을 완화시키고, 생체내 순환 시간을 연장시킬 수 있기 때문에 매우 바람직하다. 반면에, 대략 6.5의 종양 세포외 pH에서 양의 표면 전하로의 반전은 표적 종양 세포에 의해 이러한 미셀의 흡수를 향상시킬 수 있다.
입자/미셀의 표면 전하는 PBS 용액(0.01 M, pH = 7.4)에서 약한 음성이며, 이는 미셀의 생체내 약물 전달 응용에 대해 유익하다. 거의 중성의 표면 전하(제타 전위 -10 내지 +10 mV)를 갖는 나노입자는 망상내피세포 시스템(RES)에 의해 그 흡수를 감소시킬 수 있고 혈액 내에서 그 순환 시간을 연장시킬 수 있는 것으로 알려져 있다. 미셀의 음의 표면 전하는 PEG 쉘의 에테르 기 또는 PPMS 코어의 아미노 기와 음이온 간의 수소 결합 상호작용을 통해 미셀 입자에 의한 PBS 중의 HPO4 2- 및/또는 H2PO4 - 음이온의 흡수로부터 생성될 수 있다. 양친매성 블록 공중합체 미셀의 경우, 미셀의 외부 쉘의 친수성 사슬 분절(예를 들어, PEG)이 짧은 사슬 블록보다 제타 전위를 감소시키는 데 더 효과적인 긴 사슬 블록을 갖는 미셀 코어의 전하를 보호할 수 있는 것으로 예상된다. 따라서, PEG2K-PPMS 공중합체 미셀과 비교할 경우 PEG5K-PPMS 공중합체 미셀에 대해 유의적으로 더 낮은 제타 전위 값이 관찰되었다.
공중합체 미셀은 pH-반응성이며: 매질 pH가 7.4로부터 5.0으로 감소함에 따라, 미셀의 크기는 미셀 크기를 유의적으로 증가시키는 한편, 미셀의 표면 전하는 음 전하로부터 양 전하로 반전된다. 이에 따라, DTX-캡슐화 공중합체 미셀은 pH 7.4에서 점진적인 서방성 약물을 나타내지만, 5.0의 산성 pH에서 DTX 방출은 현저하게 가속화된다. 이러한 현상은 종양 미세환경이 산소 관류 불량으로 인한 락트산 축적의 결과로서 전형적으로 약 산성(예를 들어, 5.7 내지 7.0)인 것으로 알려져 있기 때문에 종양 부위에서 작용제의 방출을 개선시키도록 이용된다. 반면에, 정상 조직 및 혈액의 세포외 pH는 약 염기성이다(pH 7.2 내지 7.4). 따라서, pH-반응성인 항암 약물-로딩 미셀에 대해 향상된 약물 전달 효율이 예상되며, 이는 약물 방출을 가속시키는 산성 pH에 의해 촉발될 수 있다. 더 나아가, 세포내이입 경로를 통해 종양 세포에 의한 미셀의 흡수 후 엔도솜 및 리소좀에서 보다 더 산성인 조건(pH = 4.0 내지 6.0)과 마주치게 되며, 이는 약물-캡슐화 미셀의 세포 독성을 더욱 증가시킬 수 있다.
F. 치료제, 예방제 및 진단제
중합체는 임의의 다양한 치료제, 예방제 또는 진단제를 캡슐화하거나, 그와 혼합되거나, 그와 이온적으로 또는 공유적으로 커플링되기 위해 사용될 수 있다. 광범위한 생물학적 활성 물질이 캡슐화되거나 혼입될 수 있다.
예를 들어, 100 내지 500,000 그램/몰 이상의 광범위한 분자량을 갖는 화합물이 캡슐화될 수 있다. 일부 형태에서, 캡슐화되어 전달되는 작용제는 소 분자 작용제(예를 들어, 분자량이 2,000, 1500, 1,000, 750, 또는 500 달톤 미만인 비중합체성 작용제) 또는 거대분자(예를 들어, 올리고머 또는 중합체), 예컨대 단백질, 펩타이드, 핵산 등일 수 있다. 적합한 소 분자 활성제는 유기, 무기 및/또는 유기금속 화합물을 포함한다.
적합한 치료제 및 예방제의 예에는 치료 활성, 예방 활성 또는 진단 활성을 갖는 합성 무기 및 유기 화합물, 단백질 및 펩타이드, 다당류 및 다른 당, 지질, 및 DNA 및 RNA 핵산 서열이 포함된다. 핵산 서열은 유전자, 상보성 DNA에 결합되어 전사를 억제하는 안티센스 분자, 및 리보자임을 포함한다. 적합한 물질의 예에는 단백질, 예컨대 항체, 수용체 리간드, 및 효소, 펩타이드, 예컨대 부착 펩타이드, 당류 및 다당류, 합성 유기 또는 무기 약물, 및 핵산이 포함된다. 전달에 바람직한 약물은 폐 질환 또는 장애, 특히 PH의 치료에 대해 특이적인 것이다. PH의 경우, 대부분의 약물은 평활근 세포 이완을 초래하는 혈관확장제(예를 들어, 엔도텔린 길항제, 프로스타시클린 유사체, 포스포디에스테라아제 억제제)이며, 폐 대식세포를 표적으로 하는 전략에 이들을 사용하는 것이 합당하지 않음을 의미한다. PH에서 면역 시스템을 표적으로 하는 약물은 충분히 활용되지 않은 것으로 보인다. COPD의 경우, 적절한 코르티코스테로이드가 사용될 수 있지만, 마찬가지로 흡입된 기관지확장제는 기도 SMC 이완을 초래한다.
결과는 폐 면역 세포로의 전달 및 이에 의한 흡수의 놀라운 선택성을 나타내기 때문에, 이 전달 시스템은 특히 COVID-19와 같은 바이러스성 질병, 폐 섬유증 및 폐암과 같은 질병의 치료에 관여하는 것과 같은 항바이러스제의 폐로의 국소 전달에 특히 적합하다. 또한, 이는 만성 폐쇄성 폐 질환(COPD)의 치료를 위한 면역 조절제의 전달에 분명한 이점을 갖는다.
입자로 혼입될 수 있는 예시적인 치료제에는 면역조절제, 항감염제(항바이러스제 또는 항생제 포함), 화학치료제, 단클론 항체 또는 이의 단편 또는 인간화 버전, 효소, 성장 인자, 성장 억제제, 호르몬, 호르몬 길항제 및 핵산 분자가 포함되지만, 이로 한정되지 않는다.
면역조절제에는 항염증제, 톨-유사(Toll-Like) 수용체에 결합하여 선천성 면역 시스템을 활성화시키는 리간드, 적응 면역 시스템을 동원하고 최적화는 분자, 세포독성 T 림프구, 자연 살해 세포 및 보조 T 세포의 작용을 활성화하거나 상향 조절하는 분자, 및 저해제 또는 조절 T-세포를 탈활성화하거나 하향 조절하는 분자, 및 세포(수지상 세포 및 다른 항원 제시 세포 포함)로의 입자 흡수를 촉진하는 작용제가 포함된다. 예시적인 면역조절제에는 사이토카인, 크산틴, 인터류킨, 인터페론, 올리고데옥시뉴클레오타이드, 글루칸, 성장 인자(예를 들어, TNF, CSF, GM-CSF 및 G-CSF), 호르몬, 예컨대 에스트로겐(디에틸스틸베스트롤, 에스트라디올), 안드로겐(테스토스테론, HALOTESTIN®(플루옥시메스테론)), 프로게스틴(MEGACE®(메게스트롤 아세테이트), PROVERA®(메드록시프로게스테론 아세테이트)), 및 코르티코스테로이드(프레드니손, 덱사메타손, 히드로코르티손)가 포함된다.
올리고뉴클레오타이드 약물은 DNA, RNA, 안티센스, 앱타머, 작은 간섭 RNA, 리보자임, 리보뉴클레아제 P에 대한 외부 가이드 서열, 및 트리플렉스 형성제를 포함한다.
대표적인 화학치료제에는 알킬화제(예컨대, 시스플라틴, 카보플라틴, 옥살리플라틴, 메클로르에타민, 시클로포스파미드, 클로람부실, 다카바진, 로무스틴, 카무스틴, 프로카바진, 클로람부실 및 이포스파미드), 항대사물질(예컨대, 플루오로우라실(5-FU), 젬시타빈, 메토트렉세이트, 시토신 아라비노사이드, 플루다라빈 및 플록스우리딘), 항유사분열제(탁산, 예컨대 파클리탁셀 및 데세탁셀 및 빈카 알칼로이드, 예컨대 빈크리스틴, 빈블라스틴, 비노렐빈 및 빈데신 포함), 안트라시클린(독소루비신, 다우노루비신, 발루비신, 이다루비신 및 에피루비신뿐만 아니라 악티노마이신, 예컨대 악티노마이신 D 포함), 세포독성 항생제(미토마이신, 플리카마이신 및 블레오마이신 포함), 토포이소머라제 억제제(캄프토테신, 예컨대 캄프토테신, 이리노테칸 및 토포테칸뿐만 아니라 에피포도필로톡신의 유도체, 예컨대 암사크린, 에토포사이드, 에토포사이드 포스페이트 및 테니포사이드 포함), 혈관 내피 성장 인자(VEGF)에 대한 항체, 예컨대 베바시주맙(AVASTIN®), 다른 항-VEGF 화합물; 탈리도마이드(THALOMID®) 및 이의 유도체, 예컨대 레날리도마이드(REVLIMID®); 엔도스타틴; 안지오스타틴; 수용체 티로신 키나아제(RTK) 억제제, 예컨대 수니티닙(SUTENT®); 티로신 키나아제 억제제, 예컨대 소라페닙(Nexavar®), 엘로티닙(Tarceva®), 파조파닙, 악시티닙 및 라파티닙; 형질전환 성장 인자-α 또는 형질전환 성장 인자-β 억제제, 및 표피 성장 인자 수용체에 대한 항체, 예컨대 파니투무맙(VECTIBIX®) 및 세툭시맙(ERBITUX®)이 포함된다.
입자와 결합될 수 있는 면역 보조제의 예에는 TLR 리간드, C-유형 렉틴 수용체 리간드, NOD-유사 수용체 리간드, RLR 리간드, 및 RAGE 리간드가 포함되지만, 이로 한정되지 않는다. TLR 리간드는 지질다당류(LPS) 및 이의 유도체뿐만 아니라, 모노포스포릴 지질 A(MPL), 글리코피라노실 지질 A, PET-지질 A, 및 3-O-데사실-4'-모노포스포릴 지질 A를 포함하지만, 이로 한정되지 않은, 지질 A 및 이의 유도체를 포함할 수 있다.
입자는 또한 항원 및/또는 보조제(즉, 면역 반응 향상 분자)를 포함할 수 있다. 펩타이드, 단백질 및 DNA 기반 백신을 사용하여 다양한 질병 또는 병태에 대한 면역을 유도할 수 있다. 바이러스-감염된 세포를 감지하여 파괴하기 위해 세포-매개된 면역이 필요하다. 가장 전통적인 백신(예를 들어, 단백질 기반 백신)은 오직 체액 면역만을 유도할 수 있다. DNA 기반 백신이 체액 및 세포-매개된 면역 둘 모두를 유도할 수 있기 때문에 DNA 기반 백신은 바이러스 또는 기생충에 대한 백신을 접종하는 독특한 수단을 나타낸다. DNA 백신은 2개의 주요 성분, 즉 DNA 담체(또는 전달 비히클) 및 DNA 암호화 항원으로 이루어진다. DNA 담체는 DNA를 분해로부터 보호하고, 효율적인 수준으로 특정 조직 또는 세포로의 DNA 진입 및 발현을 촉진할 수 있다.
대표적인 진단제에는 x선, 형광, 자기 공명 영상, 방사능, 초음파, 컴퓨터 단층촬영(CT), 및 양전자 방출 단층촬영(PET)에 의해 검출가능한 작용제가 포함된다. 초음파 조영제는 전형적으로 가스, 예컨대 공기, 산소 또는 퍼플루오로탄소이다. 예시적인 진단제에는 상자성 분자, 형광 화합물, 자성 분자 및 방사성 핵종, 및 x선 영상화제가 포함된다.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 방법을 사용하여 생성된 입자는 80 중량% 미만, 75 중량% 미만, 70 중량% 미만, 60 중량% 미만, 50 중량% 미만, 40 중량% 미만, 30 중량% 미만, 20 중량% 미만, 15 중량% 미만, 10 중량% 미만, 5 중량% 미만, 1 중량% 미만, 0.5 중량% 미만, 또는 0.1 중량% 미만의 상기 작용제를 함유한다. 일부 실시형태에서, 작용제는 약제학적 활성제의 혼합물일 수 있다. 로딩%는 캡슐화되는 작용제, 입자를 제조하는 데 사용되는 중합체, 및 입자를 제조하는 데 사용되는 방법을 포함한 다양한 인자에 따라 좌우된다.
폴리뉴클레오타이드
중합체성 입자는 핵산을 사용하여 세포를 형질 주입하는 데 사용될 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 하나 이상의 단백질, 기능성 핵산 또는 이들의 조합을 암호화할 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 모노시스트론성 또는 폴리시스트론성일 수 있다. 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는 다유전자성이다.
일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는 세포로 형질 주입되고, 염색체외에 남아 있다. 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는 호스트 세포로 도입되어 호스트 세포의 게놈으로 통합된다.
일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는 벡터로 또는 그 일부로 혼입된다. 유전자 서열 및 적절한 전사 및 번역 제어 요소를 함유하는 발현 벡터를 구성하는 방법이 당업계에 널리 알려져 있다. 이러한 방법은 시험관내 재조합 DNA 기술, 합성 기술 및 생체내 유전자 재조합을 포함한다. 발현 벡터는 일반적으로 예를 들어 관심 있는 폴리뉴클레오타이드일 수 있는, 삽입된 코딩 서열의 번역 및/또는 전사에 필수적인 요소 및 조절 서열을 함유한다. 코딩 서열은 프로모터 및/또는 인헨서에 작동가능하게 연결되어 원하는 유전자 산물의 발현을 제어하도록 도울 수 있다. 생명 공학에서 사용되는 프로모터는 유전자 발현의 의도된 제어 유형에 따라 상이한 유형을 갖는다. 이들은 일반적으로 구성적 프로모터, 조직 특이적 또는 발달 단계 특이적 프로모터, 유도성 프로모터 및 합성 프로모터로 분류될 수 있다.
다수의 바이러스 기반 발현 시스템이 이용될 수 있고, 예를 들어 흔히 사용되는 프로모터는 폴리오마, 아데노바이러스 2, 거대세포바이러스 및 유인원 바이러스(Simian Virus) 40(SV40)으로부터 유래된다. SV40 바이러스의 조기 및 후기 프로모터는 둘 모두가 SV40 바이러스 복제 기점을 또한 함유하는 단편으로서 바이러스로부터 쉽게 얻을 수 있기 때문에 유용하다. 보다 작거나 보다 큰 SV40 단편이 또한 사용될 수 있되, 단 여기에는 HindIII 부위로부터 바이러스 복제 기점에 위치한 BglI 부위를 향해 연장되는 대략 250 bp 서열이 포함되어야 한다.
또한 조성물의 효율적인 번역을 위해 특정 개시 신호가 요구될 수 있다. 이러한 신호는 ATG 개시 코돈 및 인접한 서열을 포함한다. ATG 개시 코돈을 포함한 외인성 번역 제어 신호가 추가적으로 제공되어야 할 수도 있다. 진핵생물 발현에서, 또한 원래의 클로닝된 분절 내에 함유되지 않은 경우 적절한 폴리아데닐화 부위를 전사 단위로 혼입시키는 것이 전형적으로 바람직할 것이다. 전형적으로, 폴리 A 첨가 부위는 전사 종결 전 위치에서 단백질의 종결 부위의 약 30 내지 2000개의 뉴클레오타이드 "하류"에 위치한다.
재조합 단백질의 장기간 고 수율 생성을 위해서, 안정한 발현이 바람직하다. 예를 들어, 단백질을 암호화하는 구성체를 안정적으로 발현하는 세포주가 조작될 수 있다. 바이러스 복제 기점을 함유하는 발현 벡터를 사용하기보다는, 적절한 발현 제어 요소(예를 들어, 프로모터, 인헨서, 서열, 전사 종결자, 폴리아데닐화 부위 등) 및 선택가능한 마커(marker)에 의해 제어된 벡터를 사용하여 호스트 세포를 형질전환시킬 수 있다. 이종 DNA를 도입한 후, 조작된 세포를 강화 배지에서 1 내지 2일 동안 성장시킬 수 있고, 이어서 이를 선택적 배지로 바꾼다. 재조합 플라스미드 내의 선택가능한 마커는 선택에 대한 저항성을 부여하고, 세포가 플라스미드를 그 염색체로 안정적으로 통합하여 성장하게 함으로써 포사이(foci)를 형성하며, 이는 결국 클로닝되어 세포주로 확장될 수 있다.
바람직한 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드 카고는 RNA, 예컨대 mRNA이다. mRNA는 관심 있는 폴리펩타이드를 암호화할 수 있다.
일부 실시형태에서, mRNA는 세포 내의 리보솜 결합, 번역 개시 및 mRNA의 안정성을 조절할 수 있는 5' 말단 및/또는 3' 폴리(A) 꼬리(tail) 상의 캡을 갖는다.
폴리뉴클레오타이드는 관심 있는 하나 이상의 폴리펩타이드를 암호화할 수 있다.
일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는 유기체에서 결함이 있는 폴리뉴클레오타이드를 보충하거나 대체한다.
일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는 선택가능한 마커, 예를 들어 약물 내성 선택 마커와 같이 진핵생물 세포에 효과적인 선택가능한 마커를 포함한다. 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는 리포터(reporter) 유전자를 포함한다.
폴리뉴클레오타이드는 기능성 핵산일 수 있거나, 이를 암호화할 수 있다. 기능성 핵산은 표적 분자에 결합하거나 특정 반응을 촉매화하는 것과 같은 특정 기능을 갖는 핵산 분자이다. 기능성 핵산 분자는 다음의 비제한적인 카테고리로 분류될 수 있다: 안티센스 분자, siRNA, miRNA, 앱타머, 리보자임, 트리플렉스 형성 분자, RNAi, 및 외부 가이드 서열. 기능성 핵산 분자는 표적 분자가 갖는 특정 활성의 작동체, 억제제, 조절제 및 자극제로서 작용할 수 있거나, 기능성 핵산 분자는 임의의 다른 분자에 독립적인 신생 활성을 가질 수 있다.
기능성 핵산 분자는 DNA, RNA, 폴리펩타이드 또는 탄수화물 사슬과 같은 임의의 거대분자와 상호작용할 수 있다. 따라서, 기능성 핵산은 표적 폴리펩타이드의 mRNA 또는 게놈 DNA와 상호작용할 수 있거나, 이들은 폴리펩타이드 그 자체와 상호작용할 수 있다. 종종 기능성 핵산은 표적 분자와 기능성 핵산 분자 사이의 서열 상동성에 기반하여 다른 핵산과 상호작용하도록 설계된다. 다른 상황에서, 기능성 핵산 분자와 표적 분자 사이의 특정 인식은 기능성 핵산 분자와 표적 분자 사이의 서열 상동성에 기반하지 않고, 오히려 특정 인식이 일어나게 하는 3차 구조의 형성에 기반한다.
안티센스 분자는 표준 또는 비표준 염기 쌍 형성을 통해 표적 핵산 분자와 상호작용하도록 설계된다. 안티센스 분자와 표적 분자의 상호작용은, 예를 들어 RNAseH 매개된 RNA-DNA 하이브리드 분해를 통해 표적 분자의 파괴를 촉진하도록 설계된다. 대안적으로, 안티센스 분자는 전사 또는 복제와 같은 표적 분자에서 정상적으로 발생하는 처리 기능을 방해하도록 설계된다. 안티센스 분자는 표적 분자의 서열을 기준으로 설계될 수 있다. 표적 분자의 가장 접근가능한 영역을 발견함으로써 안티센스 효율을 최적화하는 방법이 많이 존재한다. 예시적인 방법에는 시험관내 선택 실험, 및 DMS 및 DEPC를 사용하는 DNA 변형 연구가 포함된다. 안티센스 분자가 10-6, 10-8, 10-10 또는 10-12 이하의 해리 상수(Kd)로 표적 분자에 결합되는 것이 바람직하다.
앱타머는, 바람직하게는 특정 방식으로 표적 분자와 상호작용하는 분자이다. 전형적으로, 앱타머는 스템-루프(stem-loop) 또는 G-4분체와 같이, 정해진 2차 또는 3차 구조로 접히는 15 내지 50개의 염기 길이 범위의 작은 핵산이다. 앱타머는 ATP 및 테오필린과 같은 작은 분자뿐만 아니라 역전사효소 및 트롬빈과 같은 큰 분자에 결합할 수 있다. 앱타머는 표적 분자로부터 10-12 M 미만의 Kd로 매우 긴밀하게 결합될 수 있다. 앱타머는 10-6, 10-8, 10-10 또는 10-12 미만의 Kd로 표적 분자에 결합하는 것이 바람직하다. 앱타머는 매우 높은 등급의 특이성으로 표적 분자에 결합될 수 있다. 예를 들어, 표적 분자와 다른 분자 사이의 결합 친화도가 10,000배 초과의 차이를 갖는 앱타머가 단리되었고, 상기 결합 친화도는 분자 상의 오직 단일 위치에서만 상이하다. 앱타머는 백그라운드 결합 분자와의 Kd보다 적어도 10, 100, 1000, 10,000 또는 100,000배 더 낮은 표적 분자와의 Kd를 갖는 것이 바람직하다. 폴리펩타이드와 같은 분자에 대해 비교할 경우, 백그라운드 분자는 상이한 폴리펩타이드인 것이 바람직하다.
리보자임은 분자내 또는 분자간 화학 반응을 촉매할 수 있는 핵산 분자이다. 리보자임이 분자간 반응을 촉매하는 것이 바람직하다. 망치머리형 리보자임과 같은 자연계에서 발견되는 리보자임에 기반한 뉴클레아제 또는 핵산 중합효소 유형 반응을 촉매하는 여러 유형의 리보자임이 존재한다. 자연계에서 발견되지 않고 신생 특정 반응을 촉매하도록 조작된 다수의 리보자임이 또한 존재한다. 바람직한 리보자임은 RNA 또는 DNA 기질을 절단하고, 보다 바람직하게는 RNA 기질을 절단한다. 리보자임은 전형적으로 후속 절단과 함께 표적 기질의 인식 및 결합을 통해 핵산 기질을 절단시킨다. 이러한 인식은 종종 주로 표준 또는 비표준 염기 쌍 상호작용에 기반한다. 이러한 특징은 표적 기질의 인식이 표적 기질 서열에 기반하기 때문에 리보자임을 핵산의 표적 특이적 절단에 대해 특히 우수한 후보자로 만든다.
트리플렉스 형성 기능성 핵산 분자는 이중 가닥 핵산 또는 단일 가닥 핵산과 상호작용할 수 있는 분자이다. 트리플렉스 분자가 표적 영역과 상호작용할 경우, Watson-Crick 및 Hoogsteen 염기 쌍 형성 둘 모두에 의존하여 복합체를 형성하는 3 가닥의 DNA가 있는 트리플렉스로 불리는 구조가 형성된다. 트리플렉스 분자는 높은 친화성 및 특이성으로 표적 영역에 결합할 수 있기 때문에 바람직하다. 트리플렉스 형성 분자는 10-6, 10-8, 10-10 또는 10-12 미만의 Kd로 표적 분자에 결합하는 것이 바람직하다.
외부 가이드 서열(EGS)은 RNase P에 의해 인식된 후 표적 분자를 절단시키는, 표적 핵산 분자 형성 복합체에 결합하는 분자이다. EGS는 선택된 RNA 분자를 특이적으로 표적화하도록 설계될 수 있다. RNAse P는 세포 내에서 운반 RNA(tRNA)를 처리하는 데 도움이 된다. 박테리아 RNAse P가 모집된 후 표적 RNA:EGS 복합체가 천연 tRNA 기질을 모방하게 하는 EGS를 사용함으로써 사실상 임의의 RNA 서열을 절단할 수 있다. 마찬가지로, RNA의 진핵 EGS/RNAse P-지향된 절단을 이용하여 진핵생물 세포 내에서 원하는 표적을 절단할 수 있다. 여러 가지 표적 분자의 절단을 촉진하도록 EGS 분자를 제조하고 사용하는 방법의 대표적인 예가 당업계에 알려져 있다.
유전자 발현은 또한 RNA 간섭(RNAi)을 통해 매우 특이적인 방식으로 효과적으로 침묵될 수 있다. 이러한 침묵은 원래 이중 가닥 RNA(dsRNA)의 첨가와 함께 관찰되었다(문헌[Fire, et al. (1998) Nature, 391:806-11; Napoli, et al. (1990) Plant Cell 2:279-89; Hannon, (2002) Nature, 418:244-51]). dsRNA가 세포에 들어가면, 이는 RNase III -유사 효소, 다이서(Dicer)에 의해 3' 말단에 2개의 뉴클레오타이드 돌출부를 함유하는 21 내지 23개의 뉴클레오타이드 길이의 이중 가닥 작은 간섭 RNA(siRNA)로 절단된다(문헌[Elbashir, et al. (2001) Genes Dev., 15:188-200; Bernstein, et al. (2001) Nature, 409:363-6; Hammond, et al. (2000) Nature, 404:293-6]). ATP 의존성 단계에서, siRNA는 흔히 RNAi 유도된 침묵 복합체(RISC)로서 알려진, 다중-아단위 단백질 복합체로 통합되어, siRNA를 표적 RNA 서열로 가이드한다(문헌[Nykanen, et al. (2001) Cell, 107:309-21]). 어떤 지점에서, siRNA 듀플렉스는 풀리고, 안티센스 가닥이 RISC에 결합된 채로 유지되고, 엔도와 엑소뉴클레아제의 조합에 의해 상보성 mRNA 서열의 분해를 지시하는 것으로 보인다(문헌[Martinez, et al. (2002) Cell, 110:563-74]). 그러나, iRNA 또는 siRNA 또는 이의 사용의 효과는 임의의 유형의 메커니즘에 제한되지 않는다.
짧은 간섭 RNA(siRNA)는 서열-특이적 전사후 유전자 침묵을 유도함으로써, 유전자 발현을 감소시키거나 심지어 억제할 수 있는 이중 가닥 RNA이다. 일례로, siRNA는 siRNA와 표적 RNA 사이의 서열 동일성 영역 내에서 상동의 RNA 분자, 예컨대 mRNA의 특정 분해를 촉발한다. 예를 들어, WO 02/44321에는 3' 돌출부 말단과 염기 쌍 형성될 경우 표적 mRNA의 서열-특이적 분해될 수 있는 siRNA가 개시되어 있고, 이는 이러한 siRNA의 제조 방법을 위해 본원에서 참조로 포함된다. 서열 특이적 유전자 침묵은 효소 다이서에 의해 생성된 siRNA를 모방하는 합성 짧은 이중 가닥 RNA를 사용하여 포유류 세포에서 달성될 수 있다(문헌[Elbashir, et al. (2001) Nature, 411:494 498]) (문헌[Ui-Tei, et al. (2000) FEBS Lett 479:79-82]). siRNA는 화학적으로 또는 시험관내 합성될 수 있거나, 세포 내부의 siRNA로 처리되는 짧은 이중 가닥 헤어핀-유사 RNA(shRNA)의 결과일 수 있다. 합성 siRNA는 일반적으로 알고니즘 및 통상적인 DNA/RNA 합성기를 사용하여 설계된다. 공급업체에는 Ambion(미국 텍사스주 오스틴 소재), ChemGenes(미국 메사추세츠주 애슐랜드 소재), Dharmacon(미국 콜로라도주 라피엣 소재), Glen Research(미국 버지니아주 스털링 소재), MWB Biotech(독일 에스베르스버그 소재), Proligo(미국 콜로라도주 볼더 소재), 및 Qiagen(네덜란드 벤토 소재)이 포함된다. siRNA는 또한 Ambion's SILENCER® siRNA 구성 키트와 같은 키트를 사용하여 시험관내에서 합성될 수 있다.
벡터로부터 siRNA의 생성은 짧은 헤어핀 RNAse(shRNA)의 전사를 통해 보다 일반적으로 수행된다. 예를 들어, Imgenex's GENESUPPRESSOR™ 구성 키트 및 Invitrogen's BLOCK-IT™ 유도성 RNAi 플라스미드 및 렌티바이러스 벡터와 같이, shRNA를 포함하는 벡터의 생성을 위한 키트가 입수가능하다.
폴리뉴클레오타이드는 전형적으로 헤테로환형 염기(핵산 염기), 헤테로환형 염기에 부착된 당 모이어티, 및 당 모이어티의 히드록실 작용기를 에스테르화하는 포스페이트 모이어티를 포함하는 DNA 또는 RNA 뉴클레오타이드일 수 있다. 주요 자연 발생 뉴클레오타이드는 헤테로환형 염기로서 우라실, 티민, 시토신, 아데닌 및 구아닌, 및 포스포디에스테르 결합에 의해 연결된 리보오스 또는 데옥시리보오스 당을 포함한다.
폴리뉴클레오타이드는 DNA 또는 RNA 대응물에 비해 표적 서열에 대한 안정성, 반감기 또는 특이성 또는 친화성을 개선시키도록 화학적으로 변형된 뉴클레오타이드 유사체로 구성될 수 있다. 화학적 변형은 핵염기, 당 모이어티, 뉴클레오타이드 연결기, 또는 이들의 조합의 화학적 변형을 포함한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "변형된 뉴클레오타이드" 또는 "화학적으로 변형된 뉴클레오타이드"는 헤테로환형 염기, 당 모이어티 또는 포스페이트 모이어티 성분 중 하나 이상의 화학적 변형을 갖는 뉴클레오타이드로 정의된다. 일부 실시형태에서, 변형된 뉴클레오타이드의 전하는 동일한 핵염기 서열의 DNA 또는 RNA 올리고뉴클레오타이드에 비해 감소된다. 예를 들어, 올리고뉴클레오타이드는 낮은 음 전하 또는 양 전하를 가질 수 있거나, 전하가 없을 수 있다. 변형은 올리고뉴클레오타이드가 세포로 들어가 상기 논의된 바와 같은 유전자 발현의 억제와 같은 기능을 수행하는 능력을 방해하지 않고 바람직하게는 향상시켜야 한다.
전형적으로, 뉴클레오시드 유사체는 표준 폴리뉴클레오타이드 염기에 대해 Watson-Crick 염기 쌍 형성에 의해 수소 결합될 수 있는 염기를 지지하며, 여기서 유사체 백본은 올리고뉴클레오타이드 유사체 분자와 표준 폴리뉴클레오타이드(예를 들어, 단일 가닥 RNA 또는 단일 가닥 DNA)의 염기 사이의 서열 특이적 방식으로 그러한 수소 결합을 허용하는 방식으로 염기를 제공한다. 바람직한 유사체는 실질적으로 하전되지 않은, 인 함유 백본을 갖는 것이다.
중합체를 사용하는 폴리뉴클레오타이드 전달 효율은 폴리플렉스 표면 상의 양 전하에 의해 영향을 받을 수 있다. 예를 들어, +8.9 mV의 폴리플렉스의 제타 전위는 순환 동안 혈액 내에서 음으로 하전된 혈장 단백질을 끌어당겨 그와 결합하여, 망상내피세포 시스템(RES)에 의한 빠른 제거를 초래할 수 있다. 효율은 또한 폴리플렉스 나노입자의 불안정성에 의해 영향을 받을 수 있다. 예를 들어, 하기 실시예에 논의되는 바와 같이, 10% 혈청을 함유하는 NaAc 완충액에서 인큐베이션된 폴리플렉스 입자는 15분 이내에 크기가 거의 두 배가 되었고, 75분 후에 10배 초과까지 증가하였다. 이러한 크기 증가로 인해, 커진 폴리플렉스는 간에서 흡수되어 순환으로부터 제거될 수도 있다. 따라서, 일부 실시형태에서, 폴리플렉스는 폴리뉴클레오타이드 전달 효율을 개선하도록 처리되거나 코팅된다. 일부 실시형태에서, 코팅은 대조군에 비해 폴리플렉스의 세포 특이적 표적화를 개선시키거나, 안정성을 개선시키거나(즉, 생체내 폴리플렉스의 크기를 안정화시킴), 생체내 폴리플렉스의 반감기를 증가시키거나(즉, 체순환에서), 또는 이들의 조합이다. 일부 실시형태에서, 대조군은 코팅이 없는 폴리플렉스이다.
종양 세포를 표적화하기 위한 예시적인 폴리플렉스 코팅은 폴리E-mRGD이다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 폴리E-mRGD는 다음과 같은 3개의 분절을 함유하는 합성 펩타이드를 지칭한다: 생리학적 pH에서 음으로 하전되어, 이에 따라 폴리플렉스의 양으로 하전된 표면에 정전기 결합될 수 있는 폴리글루탐산 (폴리E) 스트레치를 포함하는 제1 분절; 중성 링커로서 작용하는 중성 폴리글리신 스트레치를 포함하는 제2 분절; 및 αvβ3 및 αvβ5와 RGD의 상호작용을 통해 종양 내피에 결합하는 RGD 서열을 포함하는 제3 분절.
폴리플렉스의 폴리뉴클레오타이드 전달 효율은 생리학적 pH에서 음으로 하전된 작용제로 입자를 코팅함으로써 개선될 수 있다. 바람직하게는, 음으로 하전된 작용제는 폴리플렉스의 양으로 하전된 표면에 정전기 결합할 수 있다. 음으로 하전된 작용제는 폴리플렉스의 전하를 중성화시키거나, 폴리플렉스의 전하를 반전시킬 수 있다. 따라서, 일부 실시형태에서, 음으로 하전된 작용제는 폴리플렉스에 순 음 전하를 부여한다.
일부 실시형태에서, 음으로 하전된 작용제는 음으로 하전된 폴리펩타이드이다. 예를 들어, 폴리펩타이드는 아스파르트산, 글루탐산 또는 이들의 조합을 포함할 수 있고, 폴리펩타이드의 전체 전하는 중성 pH에서 음이다. 입자의 표면 상에서 음의 전하를 증가시키면 상기 기재된 음의 상호작용이 감소되거나 방지될 수 있고, 여기서 더 양으로 하전된 입자는 순환 동안 혈액 내의 음으로 하전된 혈장 단백질을 끌어당겨 그와 결합하여, 망상내피세포 시스템(RES)에 의한 빠른 제거를 초래한다. 일부 실시형태에서, 입자의 제타 전위는 약 -15 mV 내지 약 10 mV, 바람직하게는 약 -15 mV 내지 약 8 mV, 보다 바람직하게는 약 -10 mV 내지 약 8 mV, 보다 바람직하게는 약 -8 mV 내지 약 8 mV이다. 제타 전위는 상기 범위보다 더 음이거나 더 양일 수 있지만, 입자는 안정하고(즉, 응집되지 않음, 등) 혈류로부터 즉시 제거되지 않아야 한다. 제타 전위는 표면 전하를 변화시키는 하나 이상의 모이어티로 입자 표면을 코팅하거나 작용화함으로써 조작될 수 있다. 대안적으로, 단량체 그 자체는 작용화될 수 있고/있거나 추가의 단량체가 중합체로 도입되어 표면 전하가 변할 수 있다.
응집 저항성이 중요할 수 있는데, 그 이유는 작은 입자 크기를 유지하면 간에 의한 제거가 제한되고 폴리플렉스 입자의 표적 세포로의 형질 주입 능력이 유지되기 때문이다. 따라서, 바람직한 실시형태에서, 폴리플렉스는 응집에 저항한다. 바람직하게는, 코팅이 있거나 없는 폴리플렉스는 반경이 약 1 nm 내지 1000 nm, 보다 바람직하게는 반경이 약 1 nm 내지 약 500 nm, 가장 바람직하게는 반경이 약 15 nm 내지 약 250 nm이다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드로 로딩된 코팅된 폴리플렉스는 반경이 약 150 nm 내지 275 nm이다.
폴리뉴클레오타이드 중량 대 중합체 중량의 비(폴리뉴클레오타이드:중합체), 폴리플렉스 코팅의 함량 및 양, 또는 이들의 조합을 사용하여 폴리플렉스의 크기를 조정할 수 있다.
G. 제형
안전하고 효과적인 것으로 간주되고, 바람직하지 않은 생물학적 부작용 또는 원하지 않는 상호작용을 유발하지 않으면서 개체에게 투여될 수 있는 물질로 구성된 약제학적으로 허용가능한 "담체"를 사용하여 제형을 제조한다. "담체"는 활성 성분 또는 성분들 이외의 약제학적 제형에 존재하는 모든 성분이다. 용어 "담체"에는 희석제, 결합제, 윤활제, 붕해제, 충전제 및 코팅 조성물이 포함되지만, 이로 한정되지 않는다. 정제 및 지연 방출 투약 형태를 제조하기 위한 물질, 장비 및 방법에 관한 상세한 정보는 문헌[Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets, eds. Lieberman et al. (New York: Marcel Dekker, Inc., 1989)] 및 문헌[Ansel et al., Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 6.sup.th Ed. (Media, PA: Williams & Wilkins, 1995)]을 참조한다.
폐 전달에 바람직한 제형은 에어로졸, 흡입기, 건조 분말, 삽관법 및 점적법에 의해 투여하기에 약제학적으로 허용가능한 담체이다.
III. 입자 또는 폴리플렉스의 제조 방법
입자는 당업계에 공지된 다양한 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 사용되는 기술은 나노입자를 형성하는 데 사용되는 중합체, 생성된 입자의 원하는 크기 범위, 및 캡슐화될 물질에 대한 적합성을 포함한 다양한 인자에 따라 좌우될 수 있다.
나노입자를 제조하는 데 사용될 수 있는 당업계에 공지된 방법에는 고분자전해질 응축(문헌[Suk et al., Biomaterials, 27, 5143-5150 (2006)] 참조); 단일 및 이중 유화; 나노입자 성형, 및 정전기 자가-조립(예를 들어, 폴리에틸렌 이민-DNA 또는 리포솜)이 포함되지만, 이로 한정되지 않는다.
일 실시형태에서, 로딩된 입자는 전형적으로 유기 용매 중의 중합체 용액을 관심 있는 폴리뉴클레오타이드와 조합함으로써 제조된다. 중합체 용액은 중합체를 용매에 용해시키거나 현탁시킴으로써 제조된다. 용매는 캡슐화될 핵산에 대해 악영향(예를 들어, 탈안정화 또는 분해)을 끼치지 않도록 선택되어야 한다. 적합한 용매에는 DMSO 및 염화메틸렌이 포함되지만, 이로 한정되지 않는다. 용매 중의 중합체의 농도는 필요에 따라 달라질 수 있다. 일부 실시형태에서, 농도는, 예를 들어 25 mg/ml이다. 중합체 용액은 또한 완충제, 예를 들어 아세트산나트륨 완충제에서 희석될 수 있다.
다음으로, 중합체 용액은 폴리뉴클레오타이드와 같이 캡슐화될 작용제와 혼합된다. 작용제는 용매에 용해되어 용액을 형성한 후 중합체 용액과 조합될 수 있다. 일부 실시형태에서, 작용제는 생리학적 완충제에 용해된 후 중합체 용액과 조합된다. 중합체 용액 부피 대 작용제 용액 부피의 비는 1:1일 수 있다. 중합체와 작용제의 조합은 형질 주입과 같은 원하는 목적으로 용액을 사용하기 전에 전형적으로 수분 동안 인큐베이션하여 입자를 형성한다. 예를 들어, 중합체/폴리뉴클레오타이드 용액은 형질 주입용으로 용액을 사용하기 전에 2, 5, 10분 또는 10분 초과 동안 인큐베이션될 수 있다. 인큐베이션은 실온에서 이루어질 수 있다.
일부 실시형태에서, 입자는 또한 사용 전에 코팅제를 함유하는 용액과 함께 인큐베이션된다. 입자 용액은 형질 주입용으로 폴리플렉스를 사용하기 전에 2, 5, 10분 또는 10분 초과 동안 코팅제와 함께 인큐베이션될 수 있다. 인큐베이션은 실온에서 이루어질 수 있다.
일부 실시형태에서, 작용제가 폴리뉴클레오타이드인 경우, 폴리뉴클레오타이드는 먼저 다가양이온과 복합체화된 후 중합체와 혼합된다. 복합체화는 폴리뉴클레오타이드와 다가양이온을 적절한 몰비로 혼합하여 달성될 수 있다. 폴리아민이 다가양이온 종으로서 사용되는 경우, 폴리아민 질소 대 폴리뉴클레오타이드 포스페이트의 몰비(N/P 비)를 결정하는 것이 유용할 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 억제 RNA 및 폴리아민은 대략 1:1 내지 1:25, 바람직하게는 약 8:1 내지 15:1의 N/P 비로 함께 혼합되어 복합체를 형성한다. 특정 몰비를 달성하기 위해 요구되는 폴리아민 용액의 부피는 다음 식에 따라 결정될 수 있다:
Figure pct00009
식 중, Mw,inhRNA = 억제 RNA의 분자량이고, Mw,P = 억제 RNA의 포스페이트 기의 분자량이고, ΦN:P = N:P 비(폴리아민의 질소 대 억제 RNA의 포스페이트의 비의 몰비)이고, CNH2, 원액 = 폴리아민 원액의 농도이고, Mw,NH2 = 폴리아민의 질소당 분자량이다. 폴리뉴클레오타이드를 다가양이온과 혼합하여 폴리뉴클레오타이드를 응축시키는 방법이 당업계에 알려져 있다. 예를 들어, 미국 공개 특허 출원 제2011/0008451호를 참조한다.
용어 "다가양이온"은 선택된 pH, 바람직하게는 생리학적 pH에서 양 전하, 바람직하게는 적어도 2의 양 전하를 갖는 화합물을 지칭한다. 다가양이온성 모이어티는 선택된 pH 값에서 약 2 내지 약 15의 양 전하, 바람직하게는 약 2 내지 약 12의 양 전하, 보다 바람직하게는 약 2 내지 약 8의 양 전하를 갖는다. 많은 다가양이온이 당업계에 공지되어 있다. 다가양이온의 적합한 성분에는 염기성 아미노산 및 이의 유도체, 예컨대 아르기닌, 아스파라긴, 글루타민, 리신 및 히스티딘; 양이온성 덴드리머; 및 아미노 다당류가 포함된다. 적합한 다가양이온은 구조가 선형, 예컨대 선형 테트라리신, 분지형 또는 덴드리머일 수 있다.
예시적인 다가양이온에는 아크릴아미드 및 2-아크릴아미도-2-메틸프로판트리메틸아민, 폴리(N-에틸-4-비닐피리딘) 또는 유사한 4차화 폴리피리딘, 디에틸아미노에틸 중합체 및 덱스트란 컨쥬게이트, 폴리미신 B 설페이트, 리포폴리아민, 폴리(알릴아민), 예컨대 강한 다가양이온 폴리(디메틸디알릴암모늄 클로라이드), 폴리에틸렌이민, 폴리브렌, 및 폴리펩타이드, 예컨대 프로타민, 히스톤 폴리펩타이드, 폴리리신, 폴리아르기닌 및 폴리오르니틴을 기반으로 한 합성 다가양이온이 포함되지만, 이로 한정되지 않는다.
일부 실시형태에서, 다가양이온은 폴리아민이다. 폴리아민은 둘 이상의 1차 아민 기를 갖는 화합물이다. 적합한 자연 발생 폴리아민에는 스페르민, 스페르미딘, 카다베린 및 푸트레신이 포함되지만, 이로 한정되지 않는다. 바람직한 실시형태에서, 폴리아민은 스페르미딘이다.
또 다른 실시형태에서, 다가양이온은 환형 폴리아민이다. 환형 폴리아민이 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어 미국 특허 제5,698,546호, WO 1993/012096 및 WO 2002/010142에 기재되어 있다. 예시적인 환형 폴리아민에는 시클렌이 포함되지만, 이로 한정되지 않는다.
스페르민 및 스페르미딘은 ODC(오르니틴 데카복실라아제)의 작용에 의해 L-오르니틴으로부터 생성되는 푸트레신(1,4-디아미노부탄)의 유도체이다. L-오르니틴은 아르기나아제에 의한 L-아르기닌 분해 산물이다. 스페르미딘은 푸트레신(1,4-디아미노부탄)의 탈카복실화 S-아데노실메티오닌(dcAdoMet) 3-아미노프로필 공여체와의 모노알킬화를 촉매하는 스페르미딘 신타아제(SpdS)에 의해 생성된 트리아민 구조이다. 푸트레신의 아미노 기들 모두의 3-아미노프로필 공여체와의 형식적인 알킬화에 의해 대칭적 테트라민 스페르민이 수득된다. 스페르민의 생합성은 dcAdoMet의 존재 하에 스페르민 신타아제(SpmS)의 효과에 의해 스페르미딘으로 진행된다. 3-아미노프로필 공여체(dcAdoMet)는 메티오닌 아데노실트랜스퍼라아제에 의한 L-메티오닌의 순차적 변환 후 AdoMetDC(S-아데노실메티오닌 데카르복실라아제)에 의한 탈카복실화에 의해 S-아데노실메티오닌으로부터 유래한다. 따라서, 푸트레신, 스페르미딘 및 스페르민은 아미노산 L-아르기닌(L-오르니틴, 푸테르신) 및 L-메티오닌(dcAdoMet, 아미노프로필 공여체)으로부터 유래된 대사산물이다.
IV. 입자/미셀을 사용하는 방법
입자는 유효량의 하나 이상의 치료제, 진단제 및/또는 예방제를 그러한 치료를 필요로 하는 환자에게 전달하기 위해 사용될 수 있다. 투여될 작용제의 양은 처방의에 의해 쉽게 결정될 수 있고, 환자의 연령 및 체중, 및 치료될 질병 또는 장애에 따라 좌우된다.
조성물은 치료 유효량으로 대상체의 폐에 투여된다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "유효량" 또는 "치료 유효량"은 치료되는 장애의 하나 이상의 증상을 치료하거나, 억제하거나, 완화하거나, 다르게는 원하는 약리학적 및/또는 생리학적 효과를 제공하기에 충분한 투여량을 의미한다. 정확한 투여량은 대상자 의존성 변수(예를 들어, 연령, 면역 시스템 건강 등), 질병 및 수행되는 치료와 같은 다양한 인자에 따라 달라질 것이다.
실시예
본 발명은 PACE 나노입자를 사용하여 혈소판-유래된 성장 인자 억제제의 선택적 표적화에 의해 폐 고혈압의 하나 이상의 증상을 선택적으로 치료할 수 있는 방법을 보여주는 하기 비제한적인 실시예를 참조로 하여 더욱 이해될 것이다.
폐 고혈압("PH")의 병리학적 특징:
원위 폐 세동맥 근육화
상승된 폐 동맥 혈압
우심실 비대(RVH)
내피 세포로부터의 혈소판-유래된 성장 인자(PDGF)-B는 PH 병인에 대해 중요하지만, PH에서 폐 대식세포 및 대식세포-유래된 PDGF-B의 역할은 충분히 기술되어 있지 않다.
하기 연구들은 폐 대식세포-유래된 PDGF-β가 PH에서 병리학적 SMC 팽창에 중요한 역할을 하고, PDGF-β의 억제제가 그 치료를 위해 폐 대식세포 및 단핵구로 선택적으로 전달될 수 있음을 입증한다.
실시예 1: 폐포 및 실질 폐 대식세포는 저산소증으로 축적되고, 그 결핍은 원위 근육화 및 PH를 약화시킨다.
야생형 또는 유전자 변형 마우스를 최대 21일 동안 저산소증에 노출시킨 PH의 모델. 폐 조직, BALF 세포 및 심장에 대한 측정 및 분석을 수행하였다. 더 나아가, 1차 단핵구가 단리되어 대식세포로 분화된 인간 환자의 신선한 전혈, 및 이러한 세포에서 분석된 RNA 함량뿐만 아니라 그러한 배양으로부터의 조건화 배지가 SMC 이동 및 증식에 미치는 효과에 대해 연구하였다.
방법 및 물질
동물 연구
Jackson Laboratory로부터 마우스를 입수하였다. 야생형 연구를 위해 C57BL/6 마우스를 사용하였고, 마우스는 LysM-Cre (문헌[Clausen Transgenic Res. 1999;8(4):265-77; Cowburn. Proc Natl Acad Sci U S A. 2016;113(31):8801-6]), ROSA26R (mTmG/mTmG) (문헌[Muzumdar MD, Tasic B, Miyamichi K, Li L, and Luo L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 2007;45(9):593-605]), PDGF-β (flox/flox) (문헌[Enge M, et al. EMBO J. 2002;21(16):4307-16]), Vhl (flox/flox) (문헌[Haase Proc Natl Acad Sci U S A. 2001;98(4):1583-8]), Hif1a (flox/flox) (문헌[Ryan. Cancer Res. 2000;60(15):4010-5]) 또는 Hif2a (flox/flox) (문헌[Gruber, Proc Natl Acad Sci U S A. 2007;104(7):2301-6])를 가졌다. 10 내지 16주령의 수컷 및 암컷 마우스 및 성별 및 연령이 부합하는 대조군을 사용하였다.
저산소증 노출 및 혈류역학 측정
제어기 및 산소 센서(BioSpherix®)가 장착된 저산소증(10% FiO2) 챔버에 마우스를 최대 21일 동안 두었다. 저산소증 처리 후, RVSP를 측정하였다. 이어서, 이소플루란 흡입에 의해 마우스를 안락사시키고, 폐 수확 외에도, 심장을 수집하여 RV 대 LV와 중격(S)의 합의 중량비인, Fulton 지수를 결정하였다(문헌[Sheikh Cell Rep. 2014;6(5):809-17]). 혈류역학 측정을 수행하는 기술자는 처리 그룹과 마우스의 유전자형에 대하여 맹검법을 사용하였다.
기관지폐포 세척액 및 폐 수확
안락사 후에, RV를 통해 폐로 PBS를 관류하였다. 전체 폐를 분석할 경우, 우측 및 좌측 폐 둘 모두를 관류 직후 수확하였다. BALF 수집을 위해, 1 ml의 PBS를 기관을 통해 폐포로 주사한 후 기관으로부터 흡인하였다. 이 절차를 1회 반복하고, 수집된 BALF를 모았다. BALF를 4℃에서 10분 동안 830 g(GS-6R 원심분리기, Beckman Coulter)으로 원심분리하고 세포 펠릿을 수집하였다. 잔류 폐에 대한 FACS 실험을 위해, BALF 제거 후, 우측 주 줄기 기관지를 결찰하고 우측 폐를 적출하였다. 면역 조직 화학을 위해, 좌측 폐를 2% 저-용융 아가로오스로 팽창시키고 빙냉 PBS에 두었다. 아가로오스가 응고될 때, 좌측 폐를 밤새 4℃에서 Dent's 고정액(4:1 메탄올:DMSO)에 침지시키고, 다음 날 세척하고 -80℃에서 100% 메탄올에 저장하였다.
나노입자 제형 및 투여
나노입자를 야생형 마우스에게 경구기관 투여하였다. 클로드로네이트- 또는 PDGF-β siRNA-로딩된 나노입자를 저산소증 발병 시에 그리고 그 후 저산소증 최대 21일 동안 3일마다 투여하였다. 염료 DiD로 로딩된 나노입자를 수용한 마우스를 6시간 동안 정상 산소에서 유지한 후 안락사시켰다. 포식세포 결핍을 위해, 0.25 mg의 클로드로네이트 또는 PBS로 로딩되고, PBS(Liposoma Research)에 용해된 50 μL의 리포솜을 주입하였다. 나노입자 흡수 평가 또는 PDGF-β 녹다운을 위해, 50% 락톤(PPMS-50COOH)과 함께 산-말단 (폴리(펜타데칼락톤-코-n-메틸디에탄올아민코-세바케이트)로 구성된 PACE 나노입자를 변형된 단일 유화액 또는 이중 유화액 용매 증발 기법을 사용하여 제형화하였다(문헌[Kauffman Biomacromolecules. 2018;19(9):3861-73]). 요약하면, 염료-로딩된 나노입자(약 200 또는 약 400 nm 직경)의 제형화에서, 중합체에 대해 0.2 중량%의 DiD(ThermoFisher)를 사용하였다. 단일 유화액 제형화 직전에 DMSO(10 μL의 10 mg/mL 용액)를 50 mg의 중합체에 용해시켰다. PDGF-β siRNA 및 스크램블 (Scr) RNA-로딩된 나노입자에 대해서, 이중 유화액 방법으로 진행하기 전에 핵산 카고(Dharmacon, 50 nM)를 아세트산나트륨 완충제(25 mM, pH 5.8)에 용해시켰다. 동적 광 산란(Zetasizer Pro, Malvern Panalytical)의 사용에 의한 수력학적 직경(404 ± 8 또는 386 ± 7 nm), 크기 분포(PDI; 0.218 ± 0.004 또는 0.238 ± 0.007) 및 제타 전위(9.4 ± 0.3 또는 10.8 ± 0.5 mV), 및 QuantIT RiboGreen 분석(ThermoFisher)의 사용에 의한 siRNA 로딩 효율(69.6　± 1.2 또는 64.3　± 0.5%)을 포함한, 나노입자(siPDGF-β 또는 Scr 로딩에 의해 계층화됨)의 파라미터를 분석하였다. 나노입자(0.2 mg)를 50 μL의 PBS에서 현탁시키고 마우스에 투여하였다. 배양물에서 대식세포에 의한 나노입자의 흡수를 확인하기 위해, BALF 세포 펠릿을 뮤린 세포 배양 배지(RPMI[Thermo Scientific], 10% 우 태아 혈청[FBS; Invitrogen], 5% 페니실린/스트렙토마이신[Life Technologies])에서 재현탁하고, 37℃에서 6시간 동안 0.25 mg/ml의 DiD-로딩된 나노입자와 함께 인큐베이션하였다.
면역 조직 화학
면역 조직 화학 분석을 위해, 100% 메탄올에 저장된 좌측 폐를 실온에서 15분 동안 5% H2O2/메탄올에서 인큐베이션하여 퍼옥시다아제 탈활성화 처리한 후, 연이어 PBS 중의 75%, 50% 및 25% 및 0% 메탄올에서 재수화시켰다. 바이브라톰을 사용하여 재수화된 폐를 150 μm의 두꺼운 절편으로 절단하고, 이를 밤새 4℃에서 IHC 차단 완충제(0.5% Triton X-100/PBS[PBS-T] 중 5% 염소 혈청)에서 인큐베이션한 후 4℃에서 3일 동안 IHC 차단 완충제에 1차 항체로 염색하였다. 연이어, 절편을 PBS-T에서 3회 세척하고, 4℃에서 밤새 IHC 차단 완충제 중의 2차 항체에서 인큐베이션하고, PBS-T에서 5회 세척하고, Dako 봉입제와 함께 슬라이드 위에 실장하고, 4℃에서 저장하였다. 사용된 1차 항체는 래트 항-MECA-32(1:15, Developmental Studies Hybridoma Bank [DSHB]), 래트 항-CD31-FITC(1:250, BD Biosciences), 마우스 항-CD64-APC(1:250, Biolegend), 래트 항-CD68-APC(1:50, Miltenyi Biotec) 및 마우스 항-SMA-Cy3 클론 1A4(1:250, Sigma)였다. 사용된 2차 항체는 Alexa 488 항-래트(1:250, Invitrogen)였다. 핵을 DAPI(1:500)로 염색하였다.
영상화
공초점 현미경(PerkinElmer UltraView VOX 스피닝 디스크 또는 Leica SP8 포인트 스캐닝)을 사용하여 염색된 절편의 영상을 획득하였다. Adobe 포토샵을 사용하여 영상을 처리하였다. 원위 근육화 분석을 위해, 이전에 기재된 좌측 폐 내의 2개의 특정 세동맥 베드에 집중하고, 이를 L.L1.A1.L1 및 L.L1.A1.M1로 나타내었다(Sheikh의 2014년 문헌; Sheikh의 2015년 문헌). 이들의 명명법은 성체 마우스 내의 정형화된 분지 패턴을 갖는 가장 가까운 기도로부터 유래된다(문헌[Sheikh et al Cell Rep. 2014;6(5):809-17, Metzger. Nature. 2008;453(7196):745-50]). 폐 세동맥의 직경 및 분지 패턴에 기반하여, 폐 세동맥은 근위(P; >75 mm 직경), 중위(M; 25 내지 75 mm), 및 원위(D; <25 mm)로서 분류되며, 명칭은 다음과 같다: L, 좌측 주요 기관지; L1, L2, L3, 측면 분지; M1, M2 내측 분지; A1, A2 전방 분지.
인간 연구
인간 대상체를 포함한 모든 절차는 Yale University의 기관 감사 위원회(IRB #1307012431 및 #1005006865)에 의해 승인되었고, 모든 관련 윤리 규정을 준수하였다. 연구에 포함시키기 전에 모든 참가자로부터 서면 동의서를 취득하였다.
인간 단핵구 단리 및 대식세포로의 분화
Yale University 의과대학 폐혈관 질병 클리닉의 IPAH 및 SSc-PAH 환자의 신선한 전혈 및 건강한 대조군이 비식별 샘플로서 Greif 연구소에 제공되었다. 이전에 기재된 방법에 기반하여 단핵구를 단리하고 대식세포로 분화시켰다(문헌[Bennett J Exp Med. 1966;123(1):145-60; Karlsson, et al. Exp Hematol. 2008;36(9):1167-75]). 요약하면, 신선한 전혈을 HBSS에서 3배 희석하고, Ficoll-Histopaque 컬럼(Fisher Scientific)에 로딩하고, 830 g으로 30분 동안 원심분리하였다. 말초 혈액 단핵 상을 흡인하고, HBSS에서 3배 희석하고, 830 g으로 10분 동안 원심분리하였다. 혈소판 제거를 보장하기 위해, 펠릿을 3 ml의 HBSS에서 재현탁하고, 830 g으로 추가 10분 동안 원심분리하였다. 이어서, 펠릿을 10% FBS가 있는 RPMI에서 재현탁하고, 37℃에서 1시간 동안 세포가 플라스틱 세포 배양 접시에 부착되게 하였다. 단핵구가 우선적으로 플라스틱에 부착된다(37)(도 S6A, B). 부유하는 세포를 버리고, 부착 세포를 PBS로 세척하고, 10분 동안 PBS에서 5 mM EDTA로 인큐베이션하고 염색 및 유세포 분석을 위해 수집하거나, 대식세포 분화 배지(ImmunoCultTM-SF 대식세포 배지 및 1 ng/ml의 대식세포 콜로니-자극 인자[둘 모두 StemCell Technologies의 것])에서 배양하였다. 4일째에 배지를 신선한 대식세포 분화 배지로 교체하였다. 6일째에, 배지를 ImmunoCultTM-SF 대식세포 배지와 교환하고, 12시간 후에, 조건화 배지를 수집하고, 세포를 수확하였다. 저산소증 연구를 위해, 건강한 기증자의 단핵구로부터 유래된 대식세포를 1% FBS 및 5% 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 RPMI에서 12시간 동안 정상 산소 또는 3% O2에 노출시켰다.
hPASMC 배양 및 증식 분석
hPASMC(American Type Culture Collection)를 10% FBS, 1% 페니실린/스트렙토마이신, 2 ng/ml의 섬유아세포 성장 인자(Promega), 3 ng/ml의 표피 성장 인자(Promega)가 보충된 M199 배지에서 계대수 6 이하로 배양하였다. 약간 변화시키면서 이전에 기재된 바와 같이 증식을 평가하였다(문헌[Dave J. Dev Cell. 2018;44(6):665-78 e6]). hPASMC를 트립신화하고, 피브로넥틴(PBS 중 10 μg/mL)으로 사전 코팅된 배양 슬라이드(BD Falcon) 상에서 밤새 배양하였다. 다음 날, 세포를 PBS로 세척하고, 0.5% FBS가 보충된 M199에서 밤새 무혈청화하였다. 이어서, 세포를 PBS에서 세척하고, 37℃에서 1시간 동안 20 μg/ml의 IgG 대조군 또는 항-PDGF-B 차단 항체(R&D Systems)로 사전 처리되거나 되지 않은 인간 대조군 또는 환자-유래된 대식세포에 의해 조건화된 배지에서 24시간 동안 배양하였다. 이러한 인큐베이션의 최종 10시간 동안, 10 μg/ml의 BrdU(Sigma)를 세포에 첨가하였다. 슬라이드를 30분 동안 4% 파라포름알데하이드에서 고정시키고, 15분 동안 물 중 0.3% Tris, 1.5% 글리신에서 세정하고, 37℃에서 30분 동안 2N HCl에서 인큐베이션하고, 0.1 M 붕산으로 세척한 후 1시간 동안 PBS-T 중 1% FBS에서 인큐베이션하였다. hPASMC를 1시간 동안 PBS-T 중 1% FBS에서 래트 항-BrdU 1차 항체(1:100, BioRad)에 의해 염색하고, PBS 중 0.5% Tween 20에서 3회 세척한 후 1시간 동안 PBS-T 중 1% FBS에서 Alexa 488(1:500, Molecular Probes) 및 PI(1:500, Sigma)에 컨쥬게이트된 염소 항-래트 2차 항체와 함께 인큐베이션하였다. 마지막으로, 슬라이드를 PBS 중 0.5% Tween 20에서 3회 세척하고, 형광 봉입제(Dako)를 사용하여 슬라이드 상에 실장하였다. 증식을 BrdU+인 총 PI+ hPASMC의 비율로서 계산하였다. 각각의 대조군 또는 환자에 대해서, 적어도 10개의 관측 필드의 점수가 매겨졌다.
SMC 이동 분석
문헌[Dave Dev Cell. 2018;44(6):665-78 e6]에 의한 방법으로 세포 이동을 평가하였다. 요약하면, hPASMC를 트립신화한 즉시 Boyden 챔버 폴리카보네이트 막(Corning Costar, 8 μm 공극)의 상단에 첨가하였다. Boyden 챔버의 하단 구획은 37℃에서 1시간 동안 20 μg/ml의 항-PDGF-B 차단 항체 또는 IgG 대조군으로 사전 처리되거나 되지 않은 인간 대조군 및 환자-유래된 대식세포에 의해 조건화된 배지를 함유하였다. hPASMC를 하단 챔버를 향해 8시간 동안 이동시켰고, 그 시기에 막을 30분 동안 4% 파라포름알데하이드에서 고정시키고, 0.1% Crystal Violet으로 염색하고, 물로 세척하였다. 막의 상단 표면을 면봉으로 긁어서 이동하지 않은 세포를 제거하고, 하단 표면 상의 세포(즉, 이동한 세포)를 영상화하여 계수하였다.
통계
모든 데이터는 평균 값 ± 표준 편차로 제시된다. Student's t-시험(독립 변수, 양측) 및 일원 분산 분석을 사용하여 각각 두 그룹 및 여러 그룹의 평균을 비교하였다(GraphPad Prism 소프트웨어). 통계적 유의차 문턱값을 p ≤ 0.05로 설정하였다. 모든 시험은 정규 분포로 가정하였다.
결과
결과들 중 도 1a-1은 폐포 및 잔류 실질 폐 대식세포, CD64+Ly6G- 세포가 저산소증으로 축적되는 것을 나타낸다.
마찬가지로, 도 2a 내지 2b에 나타낸 바와 같이, PDGF-β mRNA는 증가하였고, 폐포 및 잔류 폐 대식세포 각각에 대해 약 6배 및 약 9배의 증가된 수준으로 최고점에 도달하였다.
도 2c 내지 2f는 대식세포 결핍이 저산소증-상태의 동물에서 근육화, 우심실 수축기압뿐만 아니라 우심실 비대를 약화시킴을 입증한다.
플록스된(floxed) 대립유전자를 갖는 LysM-Cre 마우스를 사용하여 골수 세포에서 특정 유전자를 결실하였다. 저산소증 21일 후에, PDGF-β 또는 저산소증-유도성 인자 2a가 결핍된 골수 세포를 갖는 마우스는 원위 세동맥 근육화 및 PH로부터 보호되었다. 도 3a 내지 3d에 나타낸 바와 같이, 본히펠린다우(von-Hippel Lindau)는 저산소증 유도성 인자의 분해에서 중요한 역할을 하며, 결과는 골수에서 본히펠린다우 유전자의 결실이 정상 산소에서 원위 세동맥 근육화 및 PH를 초래함을 나타낸다.
도 4a 내지 4f, 도 5a 내지 5f, 및 도 7a 내지 7f에 의해 나타낸 바와 같이, PDGF-β siRNA로 로딩된 나노입자를 전달함으로써 폐 대식세포에서 PDGF-β를 약리학적으로 하향조절하는 효과를 평가하였다. 기관지폐포 세척액에서, PDGF-β siRNA는 PDGF-β 수준을 90%까지 감소시킨다. 이러한 siPDGF-β 나노입자는 저산소증-유도된 원위 폐 세동맥 근육화, PH 및 우심실 비대를 약화시킨다.
마지막으로, 이러한 연구의 임상적 적합성을 평가하는 도 6a 내지 6e에서, 인간 대식세포 및 SMC를 연구하였다. 처음에, 건강한 기증자로부터의 대식세포에서, 저산소증에 노출하여 PDGF-β 전사 수준이 2.5배 증가하였다(도 6a 내지 6b). 추가적으로, 특발성 병인 또는 경피증에 기인한 PH 환자로부터의 대식세포에서 PDGF-β 수준은 각각 5 및 10배까지 향상되었다. 도 6c 내지 6d를 참조한다. 또한, 환자 대식세포에 의해 조건화된 배지는 SMC 증식을 약 6배까지 증가시켰다. 더 나아가, 항-PDGF-B 차단 항체로 PH 환자 조건화 배지를 사전 처리하면 이러한 SMC 증식이 억제되었다. 도 6e를 참조한다. 마찬가지로, PH 환자 조건화 배지는 SMC 이동을 약 4배까지 유도하였고, 항-PDGF-B 사전 처리는 이러한 효과를 약 50%까지 감소시켰다.
도 8은 마우스 및 인간 연구에 대해 본원에서 사용되는 방법을 요약한 개략도이다.
종합하면, 실험 모델뿐만 아니라 인간 폐 고혈압 환자로부터 단리된 세포를 사용한 연구에 의해 대식세포 저산소증-유도성 인자 및 PDGF-B가 SMC 및 우심실 재형성 및 PH에서 주요 역할을 하는 것으로 입증된다. 더 나아가, 폐 대식세포에서 PDGF-β의 나노입자-매개된 침묵이 치료법이다. 본원의 연구에서 원위 근육화의 면역 조직 화학 분석은 확인된 기도 분지 좌측 기관지-제1 측면 2차 분지-제1 전방 분지-제1 측면 또는 제1 내측 분지(L.L1.A1.L1 또는 L.L1.A1.M1)에 인접한 특정 폐 새동맥 베드에 집중하였다. 정상 산소 조건 하에, 이러한 베드에서 원위 세동맥은 근육화되지 않았지만, 저산소증 노출에 의한 정형화된 근육화 과정을 겪는다(문헌[Sheikh Cell Rep. 2014;6(5):809-17; Sheikh Sci Transl Med. 2015;7(308):308ra159; Sheikh Cell Rep. 2018;23(4):1152-65]).
원위 세동맥 근육화 및 PH의 발생 외에도, 저산소증에 노출된 마우스의 폐는 과량의 대식세포를 축적한다(문헌[Amsellem Am J Respir Cell Mol Biol. 2017;56(5):597-60818, Stenmark Circ Res. 2006;99(7):675-91; Rabinovitch Annu Rev Pathol. 2007;2:369-99])(도 1a 내지 1c). 저산소증(FiO2 10%)으로 유지된 야생형 마우스에서 PH 동안 폐 대식세포 축적의 시간 경과를 최대 21일 동안 결정하였다. 폐 맥관을 플러싱한 후, 유세포 분석을 사용하여, CD64+Ly6G- 대식세포를 기관지폐포 세척액(BALF) 및 BALF 후 잔류 폐로부터 단리하였다. BALF 중의 대식세포의 백분율은 점차적으로 증가하여, 정상 산소에 비해 저산소증 21일째에 통계적 유의성에 도달한다. 반면에, 잔류 폐로부터의 대식세포는 저산소증 3일까지 2.9±0.5배 증가하고, 저산소증 21일째에 10.8+1.1배 이하로 증가한다.
클로드로네이트에 의한 폐포 및 잔류 대식세포의 결핍이 저산소증-유도된 원위 근육화 및 PH에 미치는 효과를 평가하였다. 클로드로네이트로 로딩된 리포솜 또는 인산 완충 식염수(PBS)를 갖는 대조군을 저산소증 발병 시에 그리고 뒤이은 저산소증 21일 동안 매주 2회 야생형 마우스에게 경구기관 투여하여 포식세포를 결핍시켰다. 클로드로네이트로 처리된 마우스는 Fulton 지수(즉, 우심실[RV] 대 좌심실[LV]과 중격[S]의 합의 중량비)에 의해 측정된 바와 같이 저산소증-유도된 원위 근육화, 우심실 수축기압(RVSP; 폐 동맥 수축기압과 동일함) 및 RVH를 약화시켰다. 대조군 리포솜과 비교하여, 클로드로네이트-로딩된 리포솜에 의한 처리는 대식세포를 BALF에서 약 50%까지 그리고 잔류 폐에서 약 65% 감소시켰다(도 1e, 1f). 기본 조건 하에서, 성인 폐는 매우 드문 근섬유아세포를 갖지만, 저산소증에 의해 이러한 세포의 수의 현저한 증가가 유도되는 것으로 입증되었다(문헌[Sheikh Cell Rep. 2014;6(5):809-17, Chen J Appl Physiol (1985). 2006;100(2):564-71]). 골수 세포의 결핍은 폐포 근섬유아세포의 저산소증-유도된 축적을 현저하게 억제한다.
폐 대식세포 PDGF-β는 저산소증에 의해 상향조절되고, LysM-Cre 계통에서 PDGF-β 결핍은 PH를 약화시킨다.
마우스를 저산소증에 노출시키면 전체 폐 및 구체적으로 폐 EC에서 PDGF-B 수준이 증가하지만(Sheikh의 2015년 문헌; Sheikh의 2018년 문헌); 모든 폐 PDGF-B가 EC로부터 유래하는 것은 아니다. 따라서, 최대 21일 동안 저산소증에 노출된 마우스의 BALF 및 잔류 폐로부터 FACS에 의해 단리된 CD64+Ly6G- 대식세포에서 PDGF-β 발현의 시간 경과를 계산하였다. qRT-PCR에 의해 PDGF-β mRNA 수준을 측정하였고, 이는 정상 산소와 비교하여, 저산소증 1일 이내에 증가하여 3일째에 BALF 및 잔류 폐에 대해서 각각 5.6±0.2 및 9.3±0.2배 증가된 수준으로 최고점에 도달하였다(도 2a, 2b). 단핵구/대식세포에서 PDGF-β의 상향조절을 더욱 확인하기 위해, 이 개체군을 표시하는 LysM-Cre를 사용하였다. LysM-Cre, ROSA26R (mTmG/mTmG) 마우스를 21일 동안 저산소증에 노출시키거나 정상 산소에서 유지한 후, 전체 폐로부터 FACS에 의해 GFP+ 세포를 단리하였다. PDGF-β mRNA 수준은 저산소 마우스로부터 단리된 세포에서 2.1±0.4배까지 증가하였다. 마찬가지로, 정상 산소 마우스의 BALF로부터 단리된 GFP+ 세포는 정상 산소 조건과 반대로 저산소(3% O2) 하에 배양될 경우 PDGF-β mRNA 수준을 유사하게 증가시켰다.
그 다음 단핵구/대식세포-유래된 PDGF-β가 저산소증-유도된 PH에 기여하는지를 평가하였다. 이미, Csf1r-Mer-iCre-Mer, PDGF-β (flox/flox) 마우스의 타목시펜 치료가 병리학적 원위 폐 세동맥 근육화를 적당히 약화시키는 것으로 밝혀졌지만(Sheik의 2018년 문헌), PH, RVH 및 근섬유아세포 축적에 대한 효과는 연구되지 않았다. 유도성 Csf1r-Cre는 재조합 유도에서 매우 비효율적이며(문헌[Qian Nature. 2011;475(7355):222-5; Epelman Immunity. 2014;40(1):91-104]), 본원에서, 이러한 비효율을 우회하기 위해, 구성적 LysM-Cre를 사용하여 PDGF-β를 결실하였다(도 S3A). PDGF-β (flox/flox) 백그라운드에 대해, LysM-Cre를 또한 갖는 마우스는 Cre가 없는 마우스와 비교하여 21일 저산소증 노출에 의한 원위 근육화 및 PH를 약화시켰다(도 2c, 2d). PDGF-β (flox/flox) 마우스의 Fulton 지수에 대해 LysM-Cre, PDGF-β (flox/flox) 의 Fulton 지수를 비교할 경우, 저산소증에서는 감소하고 정상 산소에서는 증가하는 추세가 있었지만 이러한 차이는 통계적 유의성에 도달하지 않았다(도 2e). 그러나, 저산소증과 정상 산소 값 사이의 Fulton 지수 차이가 유전형에 의해 계층화될 때, LysM-Cre, PDGF-β (flox/flox) 마우스에 대해서 이러한 차이는 유의적으로 46±7% 감소하였다(도 2f). 마지막으로, 골수 세포 PDGF-β 결실에 의해, 근섬유아세포는 저산소증 3일째 및 21일째에 약 60%까지 감소하였다(도 2g, H, S4A, B). 따라서, 골수 세포-유래된 PDGF-B는 저산소증-유도된 폐 혈관 재형성 및 PH에서 중요한 역할을 한다.
LysM-Cre-매개된 본히펠린다우 의 결실은 정상 산소에서 PDGF-β 발현 및 폐 혈관 재형성을 유도한다.
PH의 병인에서 골수 세포-유래된 PDGF-B의 중요한 역할을 고려하여, 이 세포 유형에 의한 저산소증-유도된 PDGF-β 발현에 근원하는 메커니즘을 평가하였다. 저산소증-유도성 인자(HIF)는 HIF1-β 및 HIFα 동형, 즉 HIF1-α 또는 HIF2-α의 이종이량체이다. 저산소증에 노출된 마우스에서, EC HIF는 세포 자율 PDGF-β 발현뿐만 아니라 원위 근육화 및 PH를 조절한다. 기질로서 산소를 사용하여, HIFα는 프롤린 히드록실화, 본히펠린다우(VHL)-E3 유비퀴틴 리가아제로의 결합을 촉진하는 변형 및 궁극적으로 프로테오좀-매개된 분해를 겪는다. 따라서, HIFα는 산소가 부족하거나, 관련된 유비퀴틴화-분해 경로가 억제될 경우(예컨대, Vhl 결실에 의해) 축적된다. 정상 산소 조건 하에서, Vhl (flox/flox) 마우스와 비교하여, LysM-Cre, Vhl (flox/flox) 마우스는 BALF 세포에서 Vh1이 감소하였고 Hif1a, Hif2a 및 PDGF-β 수준이 증가하였다(도 3a, S3D-F). 더 나아가, 골수 세포 내의 Vhl 결실은 정상 산소에서 원위 근육화, PH 및 RVH(도 3b 내지 3c)뿐만 아니라 폐 대식세포 축적(도 3d)을 유도한다.
이어서, Vhl 결실이 저산소증에 대한 비교적 짧은(7일) 노출의 효과를 강화하는지를 평가하였다. 이 시점에서, LysM-Cre를 갖는 Vhl (flox/flox) 마우스는 BALF 세포 PDGF-β mRNA 수준이 Cre가 결여된 마우스에 비해 7.6±1.2배 강력하게 증가하였다. 더 나아가, LysM+ 세포 내의 Vhl 결실은 짧은 저산소증 노출 후 현저하게 향상된 원위 근육화뿐만 아니라 증가된 RVSP 및 RVH를 유도하였다.
골수 세포 HIFα는 PDGF-β 발현 및 저산소증-유도된 원위 근육화, RVH 및 PH를 조절한다.
Vhl가 결실되고 이에 따라 HIF 경로가 유도되는 실험을 보완하기 위해, LysM+ 세포에서 Hif1a 또는 Hif2a가 결실된 연구를 진행하였다. 먼저, 야생형 마우스의 저산소증 노출의 시간 경과는 저산소증 3일까지 BALF 세포 내의 HIF1-α 및 HIF2-α 상향조절을 나타내었다(도 4a, 5a). 이 시점에서, Hif1a (flox/flox) 또는 Hif2a (flox/flox) 백그라운드에 대해 또한 LysM-Cre를 갖는 마우스는 Cre가 결여된 마우스와 비교하여 BALF 세포에서 PDGF-β 및 각각 Hif1a 또는 Hif2a의 수준을 감소시켰다(도 4b, 5b). 또한, 대식세포 마커 CD64를 발현하는 세포 및 근섬유아세포의 폐 내의 축적은 Hif1a 또는 Hif2a 결실에 의해 실질적으로 감소된다(도 4c 내지 4d, 5c 내지 5d). 또한, 저산소증 21일째의 분석은 Hif1a (flox/flox) 또는 Hif2a (flox/flox) 를 갖는 LysM-Cre 마우스가 원위 폐 세동맥 근육화, RVSP 및 Fulton 지수를 약화시키는 것으로 밝혀내었다(도 4e 내지 4f, 5e 내지 5f). 따라서, PDGF-β, Vhl, Hif1a 및 Hif2a 결실 실험을 종합하면, 결과는 골수 세포에 의한 PDGF-B 발현은 HIFα 동형 둘 모두에 의해 자율적으로 세포를 조절하고, 이는 폐 혈관 재형성 및 PH를 조절하는 주요 인자임을 시사한다.
대식세포-유래된 PDGF-B는 PAH 환자에서 증가하고, SMC 증식 및 이동을 유도한다.
다음으로, 마우스의 병리학적 폐 근육화에서의 대식세포 및 골수-유래된 PDGF-B의 두드러진 역할을 고려하여, 이러한 발견을 인간 PAH 환자에 대해 추정하고자 하였다. 먼저, 인간 대식세포로부터 PDGF-β 수준을 분석하였다. Ficoll 컬럼 원심분리에 의해 대조군 인간의 신선한 전혈로부터 말초 혈액 단핵구 세포 분획을 단리하고 플라스틱에 부착하여 단핵구에 대해 강화시켰다. 부착 세포를 대식세포 콜로니-자극 인자와 함께 인큐베이션하여 이들을 대식세포로 분화시키고, 대식세포를 12시간 동안 정상 산소에 반대되는 저산소증(3% O2)에 노출시켜 PDGF-β 전사 수준의 2.6±0.6배 증가를 유도하였다(도 6a). 이러한 연구의 임상적 적합성에 대한 강한 증거로서, IPAH 및 SSc-PAH 환자의 단핵구 순환으로부터 분화된 대식세포의 PDGF-β 수준은 대조군 인간의 것과 비교하여 각각 5.1±1.8 및 10.7±4.8배까지 향상되었다(도 6b).
PAH 환자로부터의 대식세포에 의해 조건화된 배지가 hPASMC 증식에 대해 미치는 효과 및 이러한 배지에서 PDGF-B의 역할을 평가하였다. 새롭게 분화된 대식세포에 의해 조건화된 배지에서 24시간 동안 hPASMC를 배양하고, 이러한 인큐베이션의 최종 10시간 동안 BrdU를 첨가하였다. 대조군에 비해 증식(즉, BrdU+)인 세포 백분율(프로피듐 아이오다이드[PI]+ 핵)을 결정하였다(도 6c). IPAH 및 SSc-PAH 환자로부터 유래된 대식세포에 의해 조건화된 배지의 경우, hPASMC 증식이 각각 4.6±0.3 및 7.0±1.9배까지 상대적으로 증가하였다. PDGF-B의 이러한 효과에 대한 기여를 평가하기 위해, 대식세포 조건화 배지를 hPASMC에 첨가하기 전에 1시간 동안 항-PDGF-B 차단 항체 또는 IgG 대조군과 함께 인큐베이션하였다. 대조군 환자로부터 유래된 대식세포의 경우, hPASMC 증식은 항-PDGF-B 사전 처리에 의해 변하지 않았지만, 이러한 사전 처리는 IPAH 또는 SSc-PAH 대식세포에 의해 조건화된 배지에 의해 유도된 hPASMC 증식을 유의적으로 억제하였다(도 6d).
다음으로, 유사한 접근을 사용하여 대식세포 조건화 배지 및 그 안의 PDGF-B가 hPASMC 이동에 미치는 효과를 연구하였다. 증식 연구에서와 같이, Boyden 챔버의 상단으로부터 사전 처리된 조건화 배지를 함유하는 하단 챔버를 향한 hPASMC 이동을 항-PDGF-B 또는 IgG 대조군 항체를 사용하여 평가하였다. IgG 대조군 사전 처리의 경우, IPAH 또는 SSc-PAH 대식세포로부터 조건화된 배지는 이동을 대조군 대식세포로부터의 것에 비해 각각 3.0±0.8 또는 4.2±0.8배까지 유도하였다. 더 나아가, IgG 사전 처리와 비교하여, 항-PDGF-B 사전 처리는 IPAH 또는 SSc-PAH 대식세포 조건화 배지에 의한 hPASMC 이동을 약 40 내지 50%까지 감소시켰다. 반면에, 대조군 인간으로부터 조건화 배지의 PDGF-B 사전 처리는 hPASMC 이동에 영향을 끼치지 않았다.
siPDGF-β의 나노입자 전달은 저산소증-유도된 PH를 약화시킨다
실험 PH에서 골수-유래된 PDGF-B의 중요성 및 PAH 환자의 대식세포로부터의 PDGF-B가 hPASMC에 미치는 유도 효과를 입증한 후, 폐 대식세포 내의 이러한 리간드를 폴리(아민-코-에스테르)[PACE] 중합체 및 PDGF-β siRNA로부터 형성된 나노입자를 전달함으로써 약리학적으로 하향조절하였다. 이전의 연구에서, 유사한 나노입자가 입자를 내재화하는 세포에서 단백질 발현을 지속적으로 침묵시킬 수 있는 것으로 나타났다. 먼저, 염료 DiD가 로딩된 50% 락톤(PPMS-50COOH)과 함께 산-말단 (폴리(펜타데칼락톤-코-n-메틸디에탄올아민코-세바케이트)로 구성된 400 또는 200 nm 직경의 나노입자를 야생형 마우스에게 경구기관 투여하고, 12시간 후에, 유세포 분석을 사용하여 대식세포 마커 CD64를 발현하는 폐 세포에 의한 흡수를 평가하였다(도 7a). 400 및 200 nm 직경의 나노입자 둘 모두에 대해서, 대다수의 CD64+ 세포는 DiD-표지되었다(BALF에서 >99% 및 잔류 폐에서 약 92%). 마찬가지로, CD64+인 DiD-표지된 세포의 백분율은 BALF에서 400 및 200 nm 직경의 입자(각각, 95±1% 및 93±3%)에 대해 높고 동일하였지만; 잔류 폐에서, 이러한 비율은 400 nm 입자에 대해 86±1%였고, 200 nm 입자에 대해 62±1% 아래로 떨어졌다(도 7c). 따라서, 모든 추가 실험을 400 nm 직경의 나노입자를 사용하여 수행하였다. 흡수를 확인하기 위해, 단리된 BALF 세포를 6시간 동안 DiD-로딩된 나노입자와 함께 배양하였고, 이러한 세포는 핵주위 형광을 나타내었다.
이어서, PDGF-β를 표적화하는 siRNA로 로딩된 나노입자가 저산소증 노출이 뮤린 폐에 미치는 효과를 개선시켰는지를 평가하였다. BALF 세포로 형질 주입될 때 Scr RNA 처리와 비교하여 PDGF-β 수준이 91±1%까지 감소되는, PDGF-β siRNA 올리고뉴클레오타이드를 사용하였다. 이러한 siPDGF-β 또는 Scr RNA로 로딩된 나노입자를 저산소증 발병 시에 그리고 최대 21일의 저산소증 노출 동안 매주 2회 경구기관 투여하였다. 저산소증 3일 또는 21일째에, CD64+LysG-인 전체 폐 내의 세포 백분율은 2개의 나노입자 유형으로 처리된 마우스들마다 다르지 않았다(도 7b 내지 7c). 이어서, 최대 PDGF-β 수준의 시간인, 3일째에 siPDGF-β-나노입자가 대식세포 PDGF-β RNA 수준에 미치는 효과를 결정하였다(도 2a, 2b 참조). siPDGF-β로 로딩된 나노입자는 폐 대식세포 PDGF-β 수준을 86±11%까지 감소시켰다(도 7c). 마지막으로, 21일의 저산소증 노출 동안 siPDGF-β-나노입자 처리는 원위 폐 세동맥 근육화, PH, RVH 및 근섬유아세포의 축적을 현저하게 약화시켰다(도 7d 내지 7f).
논평
SMC 계통의 확장은 다양한 심혈관 질환에 있어서 중요한 인자로서 점점 더 인식되고 있지만; 이러한 병리학적 맥락에서뿐만 아니라 정상적인 혈관 발생 동안에, EC 이외의 세포 유형에 의한 SMC의 비세포 자율 조절에 대한 이해는 기초적이다. 대식세포를 포함한 포식세포는 선천성 면역 시스템 및 PH를 포함한 다양한 심혈관 질환의 병인 둘 모두에서 근본적인 역할을 한다. 배아기 동안에, 태아 대식세포 전구체는 정상 폐로 모집되어 대식세포로 분화되고, 이어서 이러한 상주 대식세포는 국소 증식에 의해 유지된다. 반면에, PH 동안, 증가된 단핵구는 폐 맥관 및 혈관주위 영역에서 발견되며, 폐 대식세포를 생성한다. 혈관 SMC 및 폐 대식세포는 PH에서 명백하게 중요한 세포 유형이지만, 해결되지 않은 중요한 문제는 폐 대식세포가 이러한 맥락에서 SMC를 조절하는지 여부와 그 방법이다. 본원에서, PH의 마우스 모델 및 IPAH 및 SSc-PAH 환자로부터의 인간 대식세포를 사용한 연구는 대식세포-유래된 PDGF-B가 병리학적 SMC 확장 및 PH를 유도함을 입증하며, 이에 의해 대식세포-유래된 PDGF-B가 이러한 패러다임에서 중요한 인자로 확립된다. 또한, 나노입자-유래된 PDGF-β siRNA에 관한 본 발명의 발견은 흥미로운 치료적 접근을 제시한다.
기관내 투여된 클로드로네이트-함유 리포솜은 래트에서 폐포 대식세포를 결핍시키고, 저산소증-유도된 PH 및 RVH를 감소시키는 것으로 이미 밝혀졌다. 본원에서는, 마우스에서 그러한 치료가 잔류 폐뿐만 아니라 BALF 내의 대식세포를 감소시키고, 또한 원위 근육화 및 혈류역학 변화를 약화시킴을 입증한다(도 1). 이러한 접근은 단기간에 유익하지만, 대식세포의 만성 결핍은 선천성 면역에서의 필수적 역할을 고려하면 실현 불가능하다. 따라서, 바람직한 전략은 특이적 대식세포-유래된 유전자 산물을 표적화하는 것이다.
이러한 점에서, PDGF는 PH의 병인에 광범위하게 관련된다. 인간 IPAH에서, 리간드 PDGFA, PDGF-Β 및 수용체 PDGFRA 및 PDGFRB의 mRNA 수준은 작은 폐 혈관에서 상향조절되고, PDGFR-β 단백질은 전체 폐 용해물에서 증가된다. 하류 PI3K 및 PLC-감마 신호 전달을 매개하는 데 결함이 있는 단백질을 암호화하는 녹-인(knock-in) 돌연변이 Pdgfrb를 갖는 마우스는 저산소증-유도된 폐 혈관 재형성, PH 및 RVH를 둔화시켰다. 동맥관의 자궁내 부분 결찰에 의해 PH가 유도되는 태아 어린 양 모델에서, 항-PDGF-B 앱타머의 폐 동맥으로의 주입은 폐 혈관 재형성의 중증도를 절반까지 그리고 RVH를 2/3까지 감소시킨다. 또한, 범 PDGF-β (+/-) 마우스는 저산소증-유도된 원위 폐 세동맥 SMC가 결여된 반면, PDGF-β의 EC-특이적 결실은 감소되지만 원위 근육화를 전반적으로 예방하지 않는다. 본원에서, 마우스를 저산소증에 노출시킬 때, 폐포 및 잔류 폐 대식세포에 의한 PDGF-β의 발현은 현저하게 상향조절되고(저산소증 3일째까지), LysM-Cre, PDGF-β (flox/flox) 마우스는 원위 근육화 및 PH를 실질적으로 약화시켰음이 입증된다. 흥미롭게도, 이러한 저산소 마우스에서, RVH가 감소하는 추세가 있지만, 아마도 이러한 돌연변이의 정상 산소 하에서 RV 중량비는 증가하는 추세이므로 통계적 유의성에 도달하지 않는다. 실제로, 유전형에 의해 계층화된 저산소증-유도된 RVH 증가는 PDGF-β 결실에 의해 약 50%까지 감소한다. 기본 조건 하에서 RV 중량비가 향상하는 추세에 대한 설명은 명백하지 않지만, 골수 세포 유래된 PDGF-B는 정상 발달 및/또는 유지 동안 RV 질량을 제한할 수 있음을 시사한다.
이러한 데이터는 폐 대식세포-유래된 PDGF-B가 PH에서 중요한 역할을 하는 것으로 나타내지만; 이러한 세포 유형에서 PDGF-B 발현의 조절은 불완전하게 이해된다. 마우스가 저산소증에 노출되는 경우, 폐 EC는 HIF1-α-의존성 방식으로 PDGF-β 수준을 증가시키며, 본원에서, 골수 세포 Hif1a 또는 Hif2a 결실은 대조군 마우스에 비해 폐 대식세포에서 PDGF-β 수준을 감소시키는 것으로 밝혀졌다. 데이터는 골수 세포 내의 Hif1a 결실이 저산소증-유도된 PH를 방지함을 나타낸다. 또한, LysM-Cre, Hif2a (flox/flox) 마우스는 주혈흡충-유도된 PH로부터 보호되며, 결과는 이러한 마우스가 마찬가지로 저산소증-유도된 PH를 약화시켰음을 나타낸다. 보완적인 HIF 기능 획득 연구(즉, 골수 Vhl 결실)는 폐 대식세포 HIF가 정상 산소 조건 하에서 세포 자율 PDGF-β 발현, 원위 근육화, PH 및 RVH를 유도하기에 충분한 것으로 시사한다(도 3). 따라서, 대식세포 내의 HIF-유도된 PDGF-B는 혈관 재형성 및 혈류역학 변화의 저산소증 반응에 필수적인 것으로 여겨진다.
이러한 발견은 원위 세동맥 근육화와 유사하게, 폐 대식세포가 저산소증 폐에서 폐포 근섬유아세포의 축적을 유도하고(도 1), 골수-유래된 PDGF-β, Hif1a 및 Hif2a가 이 과정에 있어서 중요하다는 것을 입증한다(도 2, 4, 5). 폐 근섬유아세포는 조기 출산 후 마우스에서 정상적인 폐포 형성 동안 폐포 격벽 형성에 중요한 역할을 하며, 이후 성숙한 폐에서는 이 세포가 매우 드물다. 섬유성 질환에서, 근섬유아세포는 대부분의 과도한 세포외 매트릭스의 생성과 관련되며, 대식세포는 근섬유아세포를 모집하고 활성화하는 프로섬유성 인자를 분비한다. 반면에, 저산소증-유도된 폐포 근섬유아세포를 조절하는 데 있어서 단핵구/대식세포의 역할은 이전에 보고되지 않았다. PDGFR-β+ 세포는 폐에서 40% 초과의 저산소증-유도된 근섬유아세포를 생성하였지만(R. Chandran, I. Kabir, A. Sheikh, ELH 및 DMG, 미공개 데이터), SMA+ 세포는 겨우 약 20%의 근원이다. 이러한 결과는 PDGFR-β+SMA-인 폐 혈관주위세포가 PH에서 중요한 세포 유형임을 시사하는 다른 연구에 의거한다.
SSc 환자의 대략 10 내지 15%에서 PAH가 발생하였고, PAH는 이 환자의 주요 사망 원인이다. 실제로, 3년 생존율은 IPAH 환자에서 84%인 것에 비해 SSc-PAH에서 겨우 49%로 추정되었다. 이러한 고조된 치사율에 기인하는 한 가지 인자는 IPAH 환자에 비해 SSc-PAH에서 표준 항-PAH 치료에 대한 무 반응이다. 또한, 항-PDGFR-β 면역 조직 화학 염색은 IPAH 환자와 비교하여 SSc-PAH 환자의 작은 혈관에서 향상된다. 순환하는 단핵구의 수는 이러한 PAH 환자 개체군마다 다르지 않지만; 결과는 대조군 인간과 비교하여 이러한 단핵구로부터 유래된 대식세포 내의 PDGF-β 수준이 IPAH 환자에서보다 SSc-PAH에서 더욱 향상됨을 나타낸다. 추가적으로, 이러한 두 가지 부류의 PAH 환자로부터의 대식세포는 주로 PDGF-B-의존성 방식으로 SMC 증식 및 이동을 유도한다. 25년 전 공개된 연구는, PDGF-B 단백질 수준이 대조군에 비해 일반적인 SSc 환자(즉, PH에 대해 평가되지 않은 환자)의 BALF에서 증가한 것으로 보고하였다. 따라서, 대식세포-유래된 PDGF-B를 표적화하는 전략은 PAH에서 효능을 가질 수 있다.
이마티닙은 암에서 적용되는 BCR-ABL, c-KIT, PDGFR-α 및 -β에 대해 활성을 갖는 티로신 키나아제 억제제이다. 이마티닙을 매일 주사하면 래트에서는 모노크로탈린 또는 마우스에서는 만성 저산소증으로 인한 폐 혈관 재형성, PH 및 RVH를 반전시킨다. 불행하게도, 이러한 긍정적인 결과는 폐 동맥 고혈압, 무작위 효능 연구의 이마티닙(IMPRES)에서 PAH 환자를 추정하지 않았다. 종합하면, 환자의 94%는 이러한 경구 이마티닙 연구를 중단하였고, 경막하혈종을 포함한 심각하고 예상치 못한 부작용이 일반적이었다. 그러나, 특히 장기간 이마티닙에 대해 유지될 수 있었던 IMPRES 중의 환자는 개선된 기능성 부류 및 6분 보행 거리를 나타내었다. 이러한 결과는 폐의 특정 세포 유형(예를 들어, 대식세포)에서 특정 경로(예를 들어, PDGF-B-매개됨)를 표적화하는 항-PH 치료에 대한 필요성을 더욱 강조한다.
PDGF-β를 표적화하는 siRNA로 로딩된 경구기관 투여된 PPMS 중합체-제형화된 나노입자는 실질적으로 대식세포-유래된 PDGF-β를 하향조절하여, 저산소증-유도된 원위 폐 세동맥 근육화, PH 및 RVH를 예방한다. 이러한 나노입자는 폐 대식세포에 의해 특이적으로 그리고 광범위하게 포식작용한다. 이전의 연구들은 인간 PAH에서 효능이 있는 프로스타시클린 유사체 및 실데나필을 포함한 나노입자 운반제의 기관내 또는 정맥내 전달이 실험용 설치류 모델에서 PH를 약화시키는 것으로 입증하였다. 이와 관련하여 나노입자-매개된 RNA 간섭의 유일한 종래 기록은 SMC의 직접적인 표적화를 목적으로 하는, 안티센스 올리고뉴클레오타이드 마이크로RNA (antimiR)-145의 정맥내 전달이 래트에서 저산소증/Sugen-5416-유도된 PH를 완화시키는 것으로 입증하였지만; 이러한 antimiR은 폐 외에도, 간, 비장 및 신장에 축적된다. siRNA 로딩된 나노입자를 경구기관 투여하는 본원의 접근은 폐 대식세포에서 엄선된 유전자 산물을 특이적이고 강력하게 표적화하고, 이에 의해 부적당한 효과가 제한될 것 같으므로 유리하다. 더 나아가, PPMS 중합체-제형화된 나노입자는 비독성이고 생분해성이며, 그 카고를 분해로부터 보호한다.
종합하면, 실험용 모델뿐만 아니라 인간 PAH 환자로부터 단리된 세포를 사용한 연구는 대식세포에 의한 PDGF-B의 HIF-조절된 발현이 SMC 재형성, PH 및 RVH에서 주요한 역할을 하는 것으로 입증한다. 더 나아가, 폐 대식세포에서 PDGF-β의 나노입자-매개된 침묵은 집중적인 추가 조사가 필요한 치료 전략이다.
요약:
결과는 PACE 나노입자가 경구(또는 폐) 투여 후 폐 대식세포 및 단핵구에서 선택적 흡수를 제공하였음을 나타낸다.
결과는 또한 PDGE-β의 억제제의 이러한 전달 방법이 PH를 치료하는 데 효과적이었음을 확립한다.
도 1a 내지 1f는 BALF 및 잔류 폐로부터의 대식세포가 저산소증 노출에 따라 증가함을 나타낸다. 마우스를 0 내지 21일 동안 정상 산소 또는 저산소증(FiO2 10%)에 노출시켰다. CD64+Ly6G- 대식세포를 BALF로부터 FACS에 의해 단리하여 PDGF-β에 대해 qRT-PCR로 처리하였다. 마찬가지로, CD64+Ly6G- 대식세포를 잔류 폐로부터 단리하고, PDGF-β mRNA 수준을 평가하였다.
도 2a 내지 2f는 대식세포 결핍이 폐 고혈압을 방지함을 나타낸다. 마우스를 21일 동안 정상 산소 또는 저산소증(FiO2 10%)에 노출시키고, 부수적으로 클로드로네이트 또는 비히클로 로딩된 경구기관 리포솜을 매주 2회 수용시켰다. 클로드로네이트 처리는 저산소 마우스에서 우심실 수축기압(RVSP; 폐 동맥 수축기압과 동일함) 및 Fulton 지수에 의해 나타난 바와 같이 원위 동맥 근육화를 감소시켰다.
도 3a 내지 3d, 4a 내지 4f 및 5a 내지 5f에 의해 나타낸 바와 같이, 저산소증은 BALF 및 잔류 폐의 대식세포에서 PDGF-β를 유도한다. LysM-Cre 계통에서, PDGF-β 또는 Hif2a 결실은 저산소증-유도된 원위 근육화 및 PH를 약화시키고, Vhl 결실은 자발적 PH를 유도한다.
골수 세포 내의 PDGF-β 및 Hif2a 결실은 PH를 방지하지만, Vhl 결실은 정상 산소 조건 하에서 PH를 초래한다. 마우스를 지시된 바와 같이 저산소증 또는 정상 산소에 노출시켰다. Cre 없음 또는 LysM-Cre 및 PDGF-β, Hif2a 또는 Vhl에 대해 플록스된 대립유전자를 갖는 마우스로부터의 원위 세동맥을 갖는 폐 절편을 SMC(알파-평활근 액틴[SMA]) 및 내피 세포(EC; MECA-32)의 마커에 대해 염색하였다.
인간 PH 환자로부터의 골수 세포는 SMC 증식 및 이동을 유도하는 PDGF-β 수준을 증가시켰다.
도 6a 내지 6e는 특발성 및 경피증 PAH 환자에서 대식세포-유래된 PDGF-B가 SMC 증식 및 이동을 촉진시킴을 나타낸다. 인간 대식세포를 12시간 동안 정상 산소 또는 저산소증(3% O2) 하에 배양한 후, 대조군 및 PAH 환자로부터의 대식세포에서 PDGF-β mRNA를 qRT-PCR에 의해 측정하였다. BrdU 분석을 환자 또는 대조군 배양 배지(CM)와 함께 배양된 인간 폐 동맥 SMC에 대해 수행하였다. 항-PDGF-B 차단 Ab 또는 대조군 IgG를 CM에 첨가하였다. SMC가 Boyden 챔버의 상단에 첨가되고, CM이 항-PDGF-B Ab 또는 IgG가 있는 하단 상에 있는 이동 분석을 사용하여 대조군에 대해 이동된 세포를 정량화하였다.
도 7a 내지 7f는 골수 세포에서 PACE 나노입자(NP)-매개된 PDGF-β 녹다운이 PH를 약화시킴을 나타낸다. 마우스를 정상 산소 또는 저산소증에 노출시키고 부수적으로 스크램블(Scr) RNA 또는 PDGF-β 표적화 siRNA가 로딩된 NP를 수용시켰다. FACS에 의해 단리된 CD64+Ly6G- 대식세포를 PDGF-β mRNA에 대해 qRT-PCR로 처리하였다. 원위 세동맥이 있는 폐 절편을 SMA 및 CD31(EC 마커)에 대해 염색하였다. RVSP 및 Fulton 지수를 측정하였다. 폐 대식세포로 나노입자-전달된 siPDGF-β는 저산소증-유도된 원위 근육화, PH 및 RVH를 약화시켰다.
따라서, 결과는 다음을 확립한다:
1. PH는 PDGF-β의 폐로의 투여에 의해 치료되거나 예방될 수 있고;
2. PACE 중합체로 형성된 나노입자를 사용하여 폐 대식세포 및 단핵구에서 작용제의 선택적 흡수를 달성할 수 있다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에서 인용되는 간행물 및 이들이 인용하는 자료는 구체적으로 참조로 포함된다.
당업자는 단지 통상적인 실험을 사용하여 본원에 기재된 본 발명의 특정 실시형태에 대한 많은 등가물을 인식하거나 확인할 수 있을 것이다. 그러한 등가물은 하기 청구범위에 포함된다.

Claims (20)

  1. 하기 화학식의 중합체를 포함하고, 100 내지 500 nm, 바람직하게는 200 내지 400 nm의 평균 직경의 나노입자를 포함하는 대식세포 및 단핵구와 같은 폐 면역 세포로의 선택적 전달을 위한 전달 제형:
    [화학식 I]
    Figure pct00010

    식 중, n은 1 내지 30의 정수이고, m, o 및 p는 독립적으로 1 내지 20의 정수이고, x, y 및 q는 독립적으로 1 내지 1000의 정수이고, Rx는 수소, 치환 또는 비치환된 알킬, 또는 치환 또는 비치환된 아릴, 또는 치환 또는 비치환된 알콕시이고, Z 및 Z'는 독립적으로 O 또는 NR'이고, 여기서 R'는 수소, 치환 또는 비치환된 알킬, 또는 치환 또는 비치환된 아릴이고,
    R1 및 R2는 히드록실 기, 1차 아민 기, 2차 아민 기, 3차 아민 기 또는 이들의 조합을 함유하는 화학적 물질이다.
  2. 청구항 1에 있어서,
    R1 및/또는 R2는 다음이 아닌, 제형:
    Figure pct00011
    .
  3. 청구항 1에 있어서,
    상기 중합체는 핵산을 함유하는 폴리플렉스 또는 이의 입자 형태로 존재하는, 제형.
  4. 청구항 3에 있어서,
    R1 및/또는 R2는 다음으로 이루어진, 제형:
    Figure pct00012
    .
  5. 청구항 1에 있어서,
    상기 중합체는 화학식 II의 구조를 갖는, 제형:
    [화학식 II]
    Figure pct00013

    식 중, J1 및 J2는 독립적으로 연결 모이어티이거나, 부재하고,
    R3 및 R4는 히드록실 기, 1차 아민 기, 2차 아민 기, 3차 아민 기 또는 이들의 조합을 함유하는 치환된 알킬이다.
  6. 청구항 1에 있어서,
    상기 중합체는 화학식 III의 구조를 갖는, 제형:
    Figure pct00014
  7. 청구항 1에 있어서,
    상기 중합체는 좁은 다분산성 폴리스티렌 표준물질을 사용하여 겔 투과 크로마토그래피에 의해 측정될 경우 중량 평균 분자량이 약 2,000 달톤 내지 20,000 달톤, 바람직하게는 약 2,000 달톤 내지 약 10,000 달톤, 가장 바람직하게는 약 2000 달톤 내지 약 7,000 달톤인, 제형.
  8. 청구항 1 내지 청구항 7 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 나노입자는 치료제, 예방제 또는 진단제를 포함하는, 제형.
  9. 청구항 8에 있어서,
    상기 작용제는 폐 장애 또는 질환의 치료, 예방 또는 진단을 위한 것인, 제형.
  10. 청구항 8에 있어서,
    상기 작용제는 PDGF-β의 억제제인, 제형.
  11. 청구항 8에 있어서,
    상기 작용제는 단백질 또는 펩타이드, 당 또는 탄수화물, 지질, 지질단백질, 또는 지질다당류, 핵산 분자, 또는 분자량이 2000 달톤 미만인 소 분자인, 제형.
  12. 청구항 8에 있어서,
    에어로졸로서, 점적법으로, 분무기, 흡입기, 산소 호흡기 또는 호흡 마스크에서, 또는 건조 분말로서 투여하도록 제형화되는, 제형.
  13. 청구항 8에 있어서,
    상기 작용제는 상기 작용제를 전신이 아닌, 상기 폐 시스템으로의 국소 전달을 위한 양으로 존재하는, 제형.
  14. 유효량의 청구항 8 내지 청구항 13 중 어느 한 항에 따른 제형을 투여하는 단계를 포함하는, 치료를 필요로 하는 개체를 치료하는 방법.
  15. 청구항 14에 있어서,
    PDGF-β의 억제제를 폐 고혈압이 있는 개체에게 투여하는, 방법.
  16. 청구항 14에 있어서,
    상기 개체는 울혈성 심부전이 있는, 방법.
  17. 청구항 14에 있어서,
    상기 개체는 폐 섬유증이 있는, 방법.
  18. 청구항 14에 있어서,
    상기 개체는 폐 암이 있는, 방법.
  19. 청구항 14에 있어서,
    상기 개체는 급성 호흡 곤란 증후군이 있거나, 발병할 위험이 있는, 방법.
  20. 청구항 14에 있어서,
    상기 개체는 COVID-19와 같은 바이러스 질병이 있는, 방법.
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