JP2023536119A - 選択的肺送達のためのポリ（アミン－ｃｏ－エステル）ポリマー粒子 - Google Patents

Abstract

ポリ（アミン－ｃｏ－エステル）ポリマー、活性剤が負荷されたポリプレックスおよびその粒子を形成する方法、ならびに最適な取り込みで核酸薬剤を送達するためにそれらを使用する方法が開発されている。例は、露出したカルボン酸および／またはヒドロキシル基と組み合わせた重要な分子量、およびそれを作製する方法を実証する。典型的には、組成物は、対照の他のトランスフェクション試薬と比較して毒性が弱く、薬物送達においてより効率的であり、またはその組合せを有する。一部の実施形態では、組成物は、ｉｎ ｖｉｖｏ送達のために好適であり、疾患または状態を処置するために対象に全身投与することができる。

Description

関連出願に対する相互参照
本出願は、その全体がこれにより参照により本明細書に組み込まれる、２０２０年７月２８日に出願された米国特許出願第６３／０５７，６２６号、および２０２１年５月２７日に出願された米国特許出願第１７／３３２，１７５号の利益および優先権を主張する。

連邦政府が支援した研究または開発に関する記載
本発明は、国立衛生研究所によって付与されたＨＬ１４２６７４、ＨＬ１３３０１６、およびＨＬ１５０７６６の下で政府の支援により行われた。政府は本発明において一定の権利を有する。

発明の分野
本発明の分野は、一般的に肺免疫細胞、特にマクロファージおよび単球への薬剤の選択的送達およびそれらによる取り込みに関して、診断剤、予防剤、および／または治療剤の改善された肺送達のためのポリマー組成物および方法に関する。

発明の背景
心血管疾患、例えば肺高血圧症（ＰＨ）は、ヒトの健康に主に有害な影響を及ぼす。実際に、ＰＨは、２０ｍｍＨｇより高い平均肺動脈圧によって定義され、米国だけでも年間２０，０００例を超える死亡の原因である（Simonneau G, et al. Eur Respir J. 2019;53(1); George Chest. 2014;146(2):476-95）。ＰＨは、臨床症状、血行力学、病理所見、および治療に基づいて世界保健機構（ＷＨＯ）によって５つの群に分類される不均一な集団の臨床状態を含む（Simonneau）。

ＷＨＯの第１群または肺動脈高血圧症（ＰＡＨ）は、特発性（ＩＰＡＨ；これまで原発性ＰＨとして分類されていた）を含み、第３群は、肺疾患および／または低酸素が原因であり、代表的である。ＰＡＨ症例の約半数が、ＩＰＡＨ、遺伝性または薬物誘発性である。別の重要な亜群は、その主な原因が結合組織病、主に全身性硬化症（ＳＳｃ；強皮症としても公知である）である関連ＰＡＨ状態である（Hoeper MM, et al. Lancet Respir Med. 2016;4(4):306-22; Galie N, et al. Eur Heart J. 2016;37(1):67-119）。

残念なことに、ＰＡＨは、非常に病的で致死性であり、初回診断から７年以内に患者の５０％が死亡する（Benza Chest. 2012;142(2):448-56）。さらに、ＳＳｃ－ＰＡＨの予後は、ＩＰＡＨの予後より劇的に悪化する（Fisher MR, et al. Arthritis Rheum. 2006;54(9):3043-50）。ＰＡＨに関していくつかの利用可能な医薬があるにもかかわらず、疾患の逆転を誘導するまたは進行を防止する治療はない。同様に、第３群の患者では、ＰＨは、基礎となる肺疾患の実質的に悪い予後の前兆となる（Hoeper 2016）。

多くの心血管疾患、例えばアテローム性動脈硬化症および動脈再狭窄は、過剰かつ異常な平滑筋細胞（ＳＭＣ）によって特徴付けられ、同様にＰＨにおける通常筋性動脈化されていない遠位肺細動脈のＳＭＣによるコーティングが重要な病理学的特色である。この過剰な筋性動脈化（hypermuscularization）は、肺動脈コンプライアンスを低減させ、これはＩＰＡＨにおける死亡率の強い独立予測因子である（Mahapatra, et al. J Am Coll Cardiol. 2006;47(4):799-803.）。ＰＡＨの現在の処置は、主に血管拡張を誘導するが、これらの治療は過剰な筋性動脈化を減弱させない。処置のギャップは、主に我々の病因に対する理解の限界を反映し、したがってＰＨの病理生物学に関するさらなる研究が最重要である。

血小板由来増殖因子受容体（ＰＤＧＦＲ）－βを発現する特化した肺細動脈ＳＭＣは、クローン性に増大して低酸素誘発ＰＨの際に病的な遠位細動脈ＳＭＣを生じるが、その類型的なプロセスの調節はあまり理解されていない（Sheikh Cell Rep. 2014;6(5):809-17; Sheikh Sci Transl Med. 2015;7(308):308ra159）。ＳＭＣにおける低酸素誘導因子（ＨＩＦ）１－αの上方調節は、遠位筋性動脈化において重要な役割を果たし、ＳＭＣ自体におけるそのような経路に加えて、非細胞性の自律的調節が極めて重要である（Ball, et al. Am J Respir Crit Care Med. 2014;189(3):314-24.; Sheikh Cell Rep. 2018;23(4):1152-65）。この状況では、内皮細胞（ＥＣ）は、最も十分に研究されている細胞型である。例えば、ＰＤＧＦ経路は、血管ＳＭＣの発生および疾患にとって不可欠であり（Andrae et al. Genes Dev. 2008;22(10):1276-312; Seidelmann Cell Mol Life Sci. 2014;71(11):1977-99）、ＥＣにおけるリガンドＰＤＧＦ－βの欠失は、低酸素誘導遠位肺細動脈筋性動脈化、ＰＨ、および右心室肥大（ＲＶＨ）を減弱させる（Sheikh 2018）。

齧歯類における実験的低酸素は、遠位肺細動脈筋性動脈化、ＰＨ、および右心室肥大を引き起こす。ＰＤＧＦと略される血小板由来増殖因子によって調節されるシグナル伝達経路は、ＰＨにおけるＳＭＣの病理生物学において不可欠である。実際に、病的なＳＭＣでは受容体ＰＤＧＦＲ－βのレベルが増加し、内皮細胞におけるリガンドＰＤＧＦ－βの欠失は、ＰＨを減弱させる。過去１０年間にわたって、いくつかの疾患に免疫系が関与しているという新規知見は、科学者が肺の病態におけるマクロファージの役割をさらに調べる動機付けとなった。低酸素は、肺におけるマクロファージ動員を増加させ、マクロファージによって発現される選択受容体またはアゴニスト（例えば、ＣＸ３ＣＲ１、ロイコトリエンＢ４）を薬理学的に阻害すると、ＰＨを緩和することが示されている；しかし、これらの産物はまた、他の細胞型によっても産生され、細胞特異性の問題を生じる。

血管細胞型のほかに、単球／マクロファージを含む免疫細胞が、ＰＨの状況において最近ますます注目を集めている（Florentin et al. Cytokine. 2017;100:11-5; Nicolls et al Am J Respir Crit Care Med. 2017;195(10):1292-95）。マウスを低酸素に曝露すると、単球は、肺の血管周囲腔に遊走し、間質内マクロファージへと分化する（Florentin et al Cytokine. 2017;100:11-5; Nicolls et al. Am J Respir Crit Care Med. 2017;195(10):1292-9）。これらのマウスの気管支肺胞洗浄は、吸引された気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）ならびに残存肺中のマクロファージが増加していることを実証する（Amsellem V, et al. Am J Respir Cell Mol Biol. 2017;56(5):597-608）。同様に、マクロファージマーカーＣＤ６８を発現する細胞は、ヒトＰＡＨ患者の肺における血管閉塞性病変の近位で富化される（Tuder et al. Am J Pathol. 1994;144(2):275-85）。齧歯類のＰＨモデルでは、マクロファージによって発現される選択受容体またはアゴニスト（例えば、ＣＸ３ＣＲ１、ロイコトリエンＢ４）の全般的な遺伝的または薬理学的な阻害により、ＰＨを緩和させることが示されている（Amsellem, et al. Sci Transl Med. 2013;5(200):200ra117）；しかし、これらの産物は、他の細胞型によっても同様に産生され、マクロファージ特異性の問題を生じる。

単球／マクロファージは、ＰＨおよび他の血管疾患の病因においてまぎれもなく重要な役割を果たすが、これらの状況におけるＳＭＣの生物学の調節におけるその役割は十分には確立されていない。アテローム硬化性プラークの形成の際に、まれなＳＭＣのクローン性の増大が、骨髄由来細胞（最も可能性が高いのはマクロファージ）によって調節されることが最近実証された（Misra A, et al. Nat Commun. 2018;9(1):2073）。さらに、アテローム形成傾向のマウスからの活性化マクロファージによって馴化した培地は、大動脈ＳＭＣの遊走および増殖を誘導する（Misra 2018）。ＰＨに関連して、インターロイキン－４によって事前に活性化したマクロファージの低酸素曝露は、肺動脈ＳＭＣ（ＰＡＳＭＣ）の増殖を誘導する馴化培地を生成する（Vergadi E, et al. Circulation. 2011;123(18):1986-95）。加えて、Ｃ－Ｃモチーフケモカイン受容体２および５を二重阻害すると、マクロファージ馴化培地によるＰＡＳＭＣの増殖および遊走の誘導を減弱させる（Abid, et al. Eur Respir J. 2019;54(4)）。

非効率的なＣｓｆ１ｒ－Ｃｒｅ－Ｍｅｒ－Ｃｒｅによって単球／マクロファージにおけるＰＤＧＦ－Ｂを下方調節すると、低酸素誘導肺血管リモデリングを中等度に阻害することが最近見出されたが、血行力学および基礎となる経路は評価されなかった（Sheikh, Cell Reports, 2018. 23:1152; Epelman S, et al. Immunity. 2014;40(1):91-104）。

たとえこれらの細胞が、ＰＨの防止または処置にとって極めて重要であるとしても、疾患を処置するまたはその症状を軽減するためのこれらの細胞への選択的送達手段はない。

したがって、本発明の目的は、肺免疫細胞、特に肺マクロファージおよび単球に、治療剤、診断剤、および／または予防剤を選択的かつ有効に送達することができる改善されたポリマーを提供することである。

Simonneau G, et al. Eur Respir J. 2019;53(1) George Chest. 2014;146(2):476-95 Hoeper MM, et al. Lancet Respir Med. 2016;4(4):306-22 Galie N, et al. Eur Heart J. 2016;37(1):67-119） Benza Chest. 2012;142(2):448-56 Mahapatra, et al. J Am Coll Cardiol. 2006;47(4):799-803. Sheikh Cell Rep. 2014;6(5):809-17 Sheikh Sci Transl Med. 2015;7(308):308ra159 Ball, et al. Am J Respir Crit Care Med. 2014;189(3):314-24. Sheikh Cell Rep. 2018;23(4):1152-65 Andrae et al. Genes Dev. 2008;22(10):1276-312 Seidelmann Cell Mol Life Sci. 2014;71(11):1977-99 Florentin et al. Cytokine. 2017;100:11-5 Nicolls et al Am J Respir Crit Care Med. 2017;195(10):1292-95 Amsellem V, et al. Am J Respir Cell Mol Biol. 2017;56(5):597-608 Tuder et al. Am J Pathol. 1994;144(2):275-85 Amsellem, et al. Sci Transl Med. 2013;5(200):200ra117 Misra A, et al. Nat Commun. 2018;9(1):2073 Vergadi E, et al. Circulation. 2011;123(18):1986-95 Abid, et al. Eur Respir J. 2019;54(4) Epelman S, et al. Immunity. 2014;40(1):91-104

発明の概要
肺マクロファージ由来ＰＤＧＦ－Ｂは、病的なＳＭＣの増大において重要な役割を果たし、ＰＨなどの疾患を処置または軽減するための治療標的として使用することができる。マウスモデル、複数の遺伝子の細胞型特異的欠失、ＩＰＡＨおよびＳＳｃ－ＰＡＨ患者からのヒトマクロファージ、ならびにＰＤＧＦ－βに対するｓｉＲＮＡのｉｎ ｖｉｖｏナノ粒子送達を使用して研究を行った。肺マクロファージの枯渇または骨髄系細胞におけるＰＤＧＦ－β欠失は、低酸素誘導遠位筋性動脈化、ＰＨ、および肺胞の筋線維芽細胞蓄積を減弱させる。結果は、単球／マクロファージが、肺高血圧症（ＰＨ）において重要な役割を果たすことを確立する。

マウス低酸素症モデルならびにヒト単球由来マクロファージを使用して、マクロファージからの血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）－Ｂが、ＰＨ患者および実験的ＰＨマウスの肺において上方調節されることが実証された。マクロファージ由来ＰＤＧＦ－Ｂは、ＰＨの病因の重要な構成要素であるヒト肺動脈平滑筋細胞の遊走および増殖の増加を誘導する。さらに、骨髄系細胞におけるＰＤＧＦ－βの遺伝的欠失が、低酸素誘導ＰＨを防止することを示す知見がある。結果は、ＨＩＦ１－αおよびＨＩＦ２－αが、マクロファージにおいてＰＤＧＦ－Ｂの上流にあること、および低酸素に曝露されたマウスのＬｙｓＭ^＋細胞におけるＨｉｆａ遺伝子の欠失が、ＰＤＧＦ－β欠失と類似の効果を有することを実証している。補完的アプローチとして、正常酸素圧条件下では、骨髄系細胞におけるＨＩＦα機能獲得変異は、肺マクロファージ蓄積、およびＰＤＧＦ－β発現および遠位筋性動脈化、ＰＨ、およびＲＶＨを誘導する。ＩＰＡＨおよびＳＳｃ－ＰＡＨ患者からのマクロファージによって馴化した培地は、ヒトＰＡＳＭＣ（ｈＰＡＳＭＣ）の増殖および遊走をＰＤＧＦ－Ｂ依存的に誘導する。結果は、ＰＤＧＦ－β ｓｉＲＮＡを負荷したナノ粒子を経口気管内投与すると、低酸素誘導肺マクロファージＰＤＧＦ－β発現、遠位筋性動脈化、ＰＨ、ＲＶＨ、および肺胞の筋線維芽細胞蓄積を顕著に減弱させることを示している。これらは全て、ＰＨの治療戦略としての肺マクロファージ由来ＰＤＧＦ－Ｂの標的化を実証する。

いくつかのナノ粒子に基づく技術が現在、ＦＤＡによって承認されているが、それらは、循環を介して標的臓器に達するように主に静脈内に投与される。ポリ（アミン－ｃｏ－エステル）ポリマーから形成された粒子を、マクロファージなどの呼吸器管の内側を覆う免疫細胞に、それらに取り込まれるように治療剤、予防剤、または診断剤を選択的に送達するために使用することができることが発見されている。例は、呼吸器管に投与した場合に、粒子が、標的化部分がなくとも高い負荷および選択的取り込みを有することを実証している。

ＰＨなどの肺障害に加えて、処置される疾患または障害は、感染疾患、がん、代謝障害、自己免疫疾患、炎症障害、および加齢関連障害を含む。粒子は、エアロゾル、インヘラー、ドライパウダー、挿管、および点滴注入によって投与することができる。

例は、ＰＤＧＦ－βに対するサイレンシング（ｓｉ）ＲＮＡを負荷した大きいナノ粒子（直径４００ｎｍ）のマウスへの経口気管内投与を実証する。これらのナノ粒子は、肺マクロファージによって優先的に取り込まれる（ナノ粒子を取り込む総細胞のうち、マクロファージである細胞のパーセンテージは気管支肺胞洗浄液では約９５％であり、気管支肺胞洗浄後の残存肺では約８５％である）。経口気管内投与の場合、ＰＤＧＦ－βサイレンシングの効率は、肺マクロファージにおいて高く（＞８５％ノックダウン）、低酸素誘導病的遠位細動脈筋性動脈化、肺動脈圧、および右心室肥大を有効に防止／抑制することができる。

図１Ａ～１Ｆは、肺マクロファージが低酸素によって蓄積し、低酸素誘導肺血管リモデリングおよびＰＨにとって極めて重要であることを示すグラフである。野生型マウスを、表記のように低酸素（１０％ＦｉＯ_２）に最大２１日間曝露するか、または酸素正常状態で維持した。ＢＡＬＦおよび残存肺を採取し、単細胞懸濁物をフローサイトメトリー分析に供した。ＣＤ６４^＋Ｌｙ６Ｇ^－マクロファージである所定の区画中の総細胞のパーセンテージを決定した。各時点当たりｎ＝３のマウス。図１Ａおよび１Ｂは、低酸素の日数に対するＢＡＬＦ（図１Ａ）および残存肺（図１Ｂ）のＣＤ６４＋Ｌｙ６Ｇ－細胞（％）のグラフである。図１Ｃ～１Ｄは、酸素正常状態および低酸素に関する、ＲＶＳＰ（ｍｍＨｇ）（図１Ｃ）およびＲＶ／（ＬＶ＋Ｓ）（図１Ｄ、Ｆｕｌｔｏｎ指数（Ｆ；右心室［ＲＶ］の、左心室［ＬＶ］と中隔［Ｓ］の合計に対する重量比）を示す。ｎ＝３のマウス）のグラフである。ＰＢＳ（ビヒクル）またはクロドロネートを含有するリポソームを、低酸素（または対照としての酸素正常状態）の開始時、およびその後２１日間の処置の間に３日毎に経口気管内投与した。図１Ｅおよび１Ｆでは、ＢＡＬＦ（図１Ｇ）および残存肺（図１Ｈ）の総細胞中のＣＤ６４^＋Ｌｙ６Ｇ^－マクロファージのパーセントを決定した。ｎ＝３のマウス。 同上。 図２Ａ～２Ｆは、肺マクロファージＰＤＧＦ－βレベルが低酸素によって増加し、ＬｙｓＭ^＋細胞におけるＰＤＧＦ－β欠失が、遠位筋性動脈化およびＰＨを減弱させることを示すグラフである。ＢＡＬＦ（図２Ａ）および残存肺（図２Ｂ）のＣＤ６４^＋Ｌｙ６Ｇ^－細胞を、表記のように低酸素（１０％ＦｉＯ_２）に最大２１日間曝露したかまたは酸素正常状態の野生型マウスからＦＡＣＳによって単離した。ＰＤＧＦ－β ｍＲＮＡレベルを、ｑＲＴ－ＰＣＲによって測定した（表１を参照されたい）。時点あたりｎ＝３のマウス、ｑＲＴ－ＰＣＲを三連で実施した。図２Ｃ～２Ｆ、Ｃｒｅを有しないまたはＬｙｓＭ－Ｃｒｅも有するＰＤＧＦ－β^{（ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ）}マウスを、低酸素に２１日間曝露したかまたは酸素正常状態で維持した。図２Ｃ、ＲＶＳＰ；図２Ｄ、ＲＶ／（ＬＶ＋Ｓ）、図２Ｅ、ＲＶ／ＬＶ＋Ｓの変化、および図２Ｆ、筋線維芽細胞／肺胞１００個。遺伝子型によって層別化した低酸素値と酸素正常状態値との間のＦｕｌｔｏｎ指数の差を、図２Ｃに示す。テューキーの多重比較検定を伴う一元配置ＡＮＯＶＡ（酸素正常状態と比較してそれぞれ、^＊、^＊＊、^＊＊＊、＃、ｐ＜０．０５、＜０．０１、＜０．００１、＜０．０００１）を（図２Ｃ～２Ｄ）において使用し、スチューデントｔ検定を図２Ｅにおいて使用した。 同上。 図３Ａ～３Ｄ。ＬｙｓＭ^＋細胞におけるＶｈｌ欠失は、酸素正常状態下で遠位筋性動脈化およびＰＨを誘導する。Ｃｒｅを有しないまたはＬｙｓＭ－Ｃｒｅも有するＶｈｌ^{（ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ）}マウスを、出生後４９日間、酸素正常状態で維持した。図３Ａ、ＢＡＬＦを単離し、ＰＤＧＦ－β転写物レベルをＦｕｌｔｏｎ指数によって測定した（図３Ｃ、ＢＡＬＦ；３Ｂ、肺）を示す。肺胞１００個あたりのマクロファージ（星印）数を定量した（図３Ｄ）。マウスあたり５００個より多くの肺胞を定量した。ｎ＝３のマウス。スチューデントｔ検定を使用した。 図４Ａ～４Ｆ。骨髄系細胞におけるＨｉｆ１ａ欠失は、低酸素誘導ＰＤＧＦ－β発現、遠位筋性動脈化およびＰＨを減弱させる。ＢＡＬＦ細胞を、酸素正常状態または低酸素（１０％ＦｉＯ_２、最大２１日間）の野生型マウスから単離した。ＨＩＦ１－αおよびβ－アクチンタンパク質を、β－アクチンと比較したＨＩＦ１－αのデンシトメトリーによるウェスタンブロットによって評価した。時点あたりｎ＝３のマウス。テューキーの多重比較検定を伴う一元配置ＡＮＯＶＡ。Ｃｒｅを有しないまたはＬｙｓＭ－Ｃｒｅも有するＨｉｆ１ａ^{（ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ）}マウスを、低酸素に３または２１日間曝露した。低酸素の３日目に、ＢＡＬＦ細胞のＰＤＧＦ－β転写物レベルを、ｑＲＴ－ＰＣＲによって決定した（図４Ａ、４Ｂ）。肺ビブラトーム切片を、ＳＭＡ、マクロファージマーカーＣＤ６４、および核（ＤＡＰＩ）に関して染色した。肺胞１００個あたりのマクロファージおよび肺胞筋線維芽細胞の数を定量した（図４Ｃ、４Ｄ）。ｎ＝３～５のマウス、ｑＲＴ－ＰＣＲを三連で実施した。マウスあたり７００個より多くの肺胞を定量した。低酸素の２１日目、Ｌ．Ｌ１．Ａ１．Ｌ１領域における遠位細動脈を有するビブラトーム切片を、ＳＭＡおよびＣＤ３１、およびＲＶＳＰに関して染色し、Ｆｕｌｔｏｎ指数を、図４Ｅ、４Ｆに示すように測定した。ｎ＝３のマウス。 同上。 図５Ａ～５Ｆ。ＬｙｓＭ^＋細胞におけるＨｉｆ２ａの欠失は、低酸素誘導ＰＤＧＦ－β発現、遠位筋性動脈化およびＰＨを減弱させる。ＢＡＬＦ細胞を、酸素正常状態または低酸素（１０％ＦｉＯ_２）に最大２１日間曝露した野生型マウスから単離した。ウェスタンブロットを使用して、β－アクチンと比較したＨＩＦ２－αのデンシトメトリーによってＨＩＦ２－αおよびβ－アクチンタンパク質レベルを評価した。各時点に関してｎ＝３のマウス。図５Ａ。テューキーの多重比較検定を伴う一元配置ＡＮＯＶＡ。図５Ｂ～５Ｆ。Ｃｒｅを有しないまたはＬｙｓＭ－Ｃｒｅも有するＨｉｆ２ａ^{（ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ）}マウスを、低酸素に３または２１日間曝露した。低酸素の３日目に、ＢＡＬＦ細胞を単離し、ＰＤＧＦ－β ｍＲＮＡレベルをｑＲＴ－ＰＣＲによって決定し（図５Ｂ）、肺のビブラトーム切片を、ＳＭＡ、ＣＤ６４、および核（ＤＡＰＩ）に関して染色した。肺胞１００個あたりのマクロファージおよび肺胞筋線維芽細胞の数を定量した（図５Ｃ～５Ｄ）。ｎ＝３～５のマウス、ｑＲＴ－ＰＣＲを三連で実施した。マウスあたり７００個より多くの肺胞を定量した。低酸素の２１日目では、Ｌ．Ｌ１．Ａ１．Ｌ１領域の遠位細動脈を伴うビブラトーム切片を、ＳＭＡおよびＭＥＣＡ－３２、およびＲＶＳＰに関して染色し、Ｆｕｌｔｏｎ指数を測定した（図５Ｅ、５Ｆ）。ｎ＝３のマウス。スチューデントｔ検定。 同上。 図６Ａ～６Ｅ。ＰＡＨ患者からのマクロファージによって分泌されるＰＤＧＦ－Ｂは、ｈＰＡＳＭＣの増殖および遊走を促進する。単球を、ヒト対照およびＩＰＡＨまたはＳＳｃ－ＰＡＨ患者の末梢血単核球から単離し、培養物中でマクロファージに分化させた。図６Ａ、ヒト対照の単球に由来するマクロファージを、正常酸素圧条件または低酸素（３％Ｏ_２）条件で１２時間培養した後、ＰＤＧＦ－β ｍＲＮＡレベルをｑＲＴ－ＰＣＲによって測定した。ｎ＝３のヒト（女性２人および男性１人、３０～６０歳）、ｑＲＴ－ＰＣＲを三連で行った。図６Ｂ、ｑＲＴ－ＰＣＲを使用して、対照およびＰＡＨ患者からのマクロファージのＰＤＧＦ－β ｍＲＮＡレベルをアッセイした。ＰＡＨ診断クラスあたりｎ＝５のヒトおよびｎ＝９の対照（表Ｓ２を参照されたい）、ｑＲＴ－ＰＣＲを三連で行った。図６Ｃ、ｈＰＡＳＭＣを、対照および患者のマクロファージによって事前に馴化した培地と共に２４時間培養した。ＢｒｄＵを、このインキュベーションの最後の１０時間に含めた。次に、細胞をＢｒｄＵおよび核（ヨウ化プロピジウム［ＰＩ］）に関して染色した。図６Ｃでは、対照のヒトおよび患者に関してＢｒｄＵを発現する総細胞（ＰＩ^＋核）のパーセントを、対照のこのパーセンテージに対して正規化した。図６Ｄでは、抗ＰＤＧＦ－Ｂ遮断抗体または対照ＩｇＧを、ｈＰＡＳＭＣと共にインキュベートする１時間前に馴化培地に添加した。結果は、患者診断クラスによって層別化した、ＩｇＧ処置と比較した抗ＰＤＧＦ－Ｂ処置に関するＢｒｄＵ^＋である総（ＰＩ^＋）細胞のパーセントの比である。ＰＡＨ診断クラスあたりｎ＝３のヒトおよびｎ＝６の対照（表Ｓ３を参照されたい）、ヒトあたり１０個の顕微鏡視野、視野あたり３０～６０個の細胞。対照または患者のマクロファージによって事前に馴化した培地を、抗ＰＤＧＦ－Ｂ遮断抗体または対照ＩｇＧ抗体によって１時間処置した後、ボイデン装置の下のチャンバーに入れた。ｈＰＡＳＭＣを、上のチャンバーに添加して、馴化培地に向かう遊走を８時間評価した。遊走した細胞（すなわち、膜の下表面の細胞）を、クリスタルバイオレットによって染色した。図６Ｅでは、対照患者と比較して遊走した細胞の定量、ＩｇＧ処置を示す。ＰＡＨクラスあたりｎ＝４のヒトおよびｎ＝３の対照（表４を参照されたい）、ヒトあたり５つの顕微鏡視野、視野あたり８～９０個の細胞。テューキーの多重比較検定を伴う一元配置ＡＮＯＶＡおよびスチューデントｔ検定を使用した。ＩＰＡＨと比較して＃、＃＃、ｐ＜０．０５、＜０．０１、ならびに対応するＩｇＧ対照と比較してそれぞれ、^＊、^＊＊、^＊＊＊、ｎｓ、ｐ＜０．０５、＜０．０１、＜０．０００１、有意ではない。 同上。 図７Ａ～７Ｆ。ＰＤＧＦ－βのナノ粒子媒介ノックダウンは、遠位細動脈筋性動脈化、筋線維芽細胞蓄積、およびＰＨを減弱させる。色素ＤｉＤを負荷したナノ粒子（直径４００ｎｍ）を、正常酸素圧マウスに経口気管内投与し、１２時間後、ＢＡＬＦおよび残存肺からの細胞をＣＤ６４に関して染色し、フローサイトメトリー分析に供した。図７Ａ、ＣＤ６４を発現するＤｉＤ^＋ナノ粒子（表記のように直径４００または２００ｎｍ）を含有するＢＡＬＦまたは残存肺（ＲＬ）細胞のパーセンテージを示す定量。処置あたりｎ＝３のマウス。ＢＡＬＦ細胞を正常酸素圧マウスから採取し、ＤｉＤを負荷した４００ｎｍナノ粒子と共に６時間培養した後、核（ＤＡＰＩ）に関して染色した。図７Ｂ～７Ｆ、直径４００ｎｍのナノ粒子に、ＰＤＧＦ－βに対して標的化したｓｉＲＮＡまたはスクランブル（Ｓｃｒ）ＲＮＡを負荷した後、低酸素の開始時にマウスに投与し、その後週に２回投与した。肺を低酸素のマウスから３日目に単離し、Ｌｙ６ＧおよびＣＤ６４に関して染色し、フローサイトメトリーに供し、ＣＤ６４^＋Ｌｙ６Ｇ^－マクロファージのパーセントを、図７Ｂにおいて定量した。処置あたりｎ＝３のマウス。図７Ｃでは、ＣＤ６４^＋Ｌｙ６Ｇ^－マクロファージのＰＤＧＦ－β ＲＮＡレベルをｑＲＴ－ＰＣＲによって定量した。処置当たりｎ＝３のマウス、ｑＲＴ－ＰＣＲを三連で行った。図７Ｄ～７Ｆでは、マウスを低酸素で２１日間処置するかまたは酸素正常状態で維持した。低酸素のマウスでは、Ｌ．Ｌ１．Ａ１領域または肺胞領域における遠位細動脈を含有する切片を、ＣＤ３１およびＳＭＡに関して染色した。ＲＶＳＰ（図７Ｄ）、Ｆｕｌｔｏｎ指数（図７Ｅ）および肺胞１００個あたりの筋線維芽細胞数を測定した（図７Ｆ）。マウスあたり５００個より多くの肺胞を定量した。テューキーの多重比較検定を伴う一元配置ＡＮＯＶＡおよびスチューデントｔ検定を使用した。酸素正常状態と比較して^＊、ｐ＜０．０５。ｎｓ、有意ではない。スケールバー、１０μｍ（Ｄ）および２５μｍ（Ｉ、Ｌ）。 同上。 図８は、動物およびヒト研究のために使用した方法の概略図である。

発明の詳細な説明
Ｉ．定義
「ポリプレックス」という用語は、本明細書で使用される場合、典型的には、１つまたは複数のポリヌクレオチドがその中に封入されている、その中に分散されている、および／またはその表面と会合しているポリマーのマイクロ粒子および／もしくはナノ粒子、またはミセルを指す。

「マイクロ粒子」という用語は、約１ミクロンまたはそれより大きい平均直径から最大約１０００ミクロンの平均直径を有する物体を含む。「マイクロ粒子」という用語は、マイクロスフェアおよびマイクロカプセル、ならびに上記の２つのカテゴリーのいずれにも容易に当てはまらない可能性がある構造を含む。マイクロ粒子は、球状または非球状であり得、任意の規則的なまたは不規則な形状を有し得る。直径約１ミクロン（１０００ｎｍ）未満の平均直径を有する構造は、「ナノ粒子」と呼ばれ、「ナノスフェア」および「ナノカプセル」を含む。「直径」という用語は、物理的直径または流体力学的直径のいずれかを指すために使用される。本質的に球状の粒子の直径は、物理的または流体力学的直径を指し得る。ナノ球状粒子の直径は、流体力学的直径を指し得る。本明細書で使用される場合、非球状粒子の直径は、粒子の表面上の２つの点の間の最大直線距離を指し得る。複数の粒子について言及する場合、粒子の直径は典型的には、粒子の平均直径を指す。粒子の直径は、限定されるものではないが、動的光散乱、および共焦点顕微鏡を含む、当技術分野における多様な技術を使用して測定することができる。

マイクロ粒子またはナノ粒子を含有する組成物は、ある範囲の粒子サイズの粒子を含み得る。ある特定の実施形態では、粒子サイズの分布は、均一であり得、例えば平均体積直径の約２０％標準偏差未満内であり得、他の実施形態ではさらにより均一であり、例えばメジアン体積直径の約１０％、８％、５％、３％、または２％以内であり得る。

本明細書で一般的に使用される場合、「薬学的に許容される」とは、健全な医学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激、アレルギー応答、または合理的な利益／リスク比に見合った他の問題もしくは合併症なく、ヒトおよび動物の組織、臓器、および／または体液と接触して使用するのに好適な化合物、材料、組成物、および／または剤形を指す。

「生体適合性」という用語は、本明細書で使用される場合、それら自体が宿主（例えば、動物またはヒト）に対して毒性でもなく、宿主において毒性濃度でモノマー性もしくはオリゴマー性サブユニットまたは他の副産物を生成する速度で分解もしない（材料が分解する場合）、１つまたは複数の材料を指す。

「生分解性」という用語は、本明細書で使用される場合、材料が、典型的には、加水分解または酵素の作用によってその構成要素サブユニットへと分解または崩壊することを意味する。

「界面活性剤」という用語は、本明細書で使用される場合、液体の表面張力を低下させる作用物質を指す。

「持続放出」は、本明細書で使用される場合、物質の全量が一度に生物学的に利用可能にされるボーラス型投与とは対照的に、長期間にわたる物質の放出を指す。

「非経口投与」および「非経口的に投与される」という語句は、当技術分野で認識されている用語であり、注射などの経腸および局所投与以外の投与の様式を含み、限定されないが、静脈内、筋肉内、胸膜内、血管内、心膜内、動脈内、髄腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、嚢下、くも膜下、脊髄内および胸骨内（intrastemal）の注射および注入が挙げられる。

「標的化部分」という用語は、本明細書で使用される場合、特定の位置にまたは特定の位置から離れて局在する部分を指す。部分は、例えばタンパク質、核酸、核酸アナログ、炭水化物、または小分子であり得る。前記実体は、例えば小分子などの治療化合物、または検出可能な標識などの診断的実体であり得る。

「アルキル」という用語は、飽和脂肪族基のラジカルを指し、直鎖アルキル基、分枝鎖アルキル基、シクロアルキル（脂環式）基、アルキル置換シクロアルキル基、およびシクロアルキル置換アルキル基を含む。

好ましい実施形態では、直鎖または分枝鎖アルキルは、その骨格中に３０個またはそれよりも少ない炭素原子（例えば、直鎖についてＣ_１～Ｃ_３０、分枝鎖についてＣ_３～Ｃ_３０）、好ましくは、２０個またはそれよりも少ない、より好ましくは、１５個またはそれよりも少ない、最も好ましくは、１０個またはそれよりも少ない炭素原子を有する。１～３０の間の骨格炭素原子の数のすべての整数値が、直鎖または分枝鎖アルキルについて企図され、開示される。同様に、好ましいシクロアルキルは、それらの環構造中に３～１０個の炭素原子を有し、より好ましくは、環構造中に５、６、または７個の炭素を有する。３～１０の間の環炭素原子の数のすべての整数値が、シクロアルキルについて企図され、開示される。

「アルキル」（または「低級アルキル」）という用語は、本明細書、実施例、および特許請求の範囲の全体にわたって使用される場合、「無置換アルキル」および「置換アルキル」の両方を含むことが意図され、その後者は、炭化水素骨格の１個または複数の炭素上の水素を置き換える１個または複数の置換基を有するアルキル部分を指す。そのような置換基としては、限定されるものではないが、ハロゲン、ヒドロキシル、カルボニル（例えば、カルボキシル、アルコキシカルボニル、ホルミル、またはアシル）、チオカルボニル（例えば、チオエステル、チオアセテート、またはチオホルメート）、アルコキシル、ホスホリル、ホスフェート、ホスホネート、ホスフィネート、アミノ、アミド、アミジン、イミン、シアノ、ニトロ、アジド、スルフヒドリル、アルキルチオ、サルフェート、スルホネート、スルファモイル、スルホンアミド、スルホニル、ヘテロシクリル、アラルキル、または芳香族もしくは複素芳香族部分が挙げられる。

炭素の数が他に明示されない限り、「低級アルキル」は、本明細書で使用される場合、上記で定義されるアルキル基を意味するが、その骨格構造中に１～１０個の炭素、より好ましくは、１～６個の炭素原子を有する。同様に、「低級アルケニル」および「低級アルキニル」は、類似の鎖長を有する。本出願全体にわたって、好ましいアルキル基は、低級アルキルである。好ましい実施形態では、本明細書でアルキルとして指定される置換基は、低級アルキルである。

炭化水素鎖上で置換される部分は、適切である場合、それら自体が置換され得ることが当業者に理解されるであろう。例えば、置換アルキルの置換基としては、ハロゲン、ヒドロキシ、ニトロ、チオール、アミノ、アジド、イミノ、アミド、ホスホリル（ホスホネートおよびホスフィネートを含む）、スルホニル（サルフェート、スルホンアミド、スルファモイルおよびスルホネートを含む）、およびシリル基、ならびにエーテル、アルキルチオ、カルボニル（ケトン、アルデヒド、カルボキシレート、およびエステルを含む）、－ＣＦ_３、－ＣＮ等が挙げられ得る。シクロアルキルも同じ様式で置換され得る。

「アリール」は、本明細書で使用される場合、Ｃ_５～Ｃ_１０員の芳香族、複素環式、縮合芳香族、縮合複素環式、二芳香族、または二複素環式（bihetereocyclic）の環系を指す。一部の形態では、環系は、３～５０個の炭素原子を有する。広義の「アリール」は、本明細書で使用される場合、０～４個のヘテロ原子を含み得る５、６、７、８、９、１０および２４員の単環芳香族基、例えば、ベンゼン、ナフタレン、アントラセン、フェナントレン、クリセン、ピレン、コランニュレン、コロネン、ピロール、フラン、チオフェン、イミダゾール、オキサゾール、チアゾール、トリアゾール、ピラゾール、ピリジン、ピラジン、ピリダジンおよびピリミジンなどが挙げられる。環構造中にヘテロ原子を有するこれらのアリール基は、「アリール複素環」または「複素芳香族」とも称され得る。芳香環は、１つまたは複数の環位置で、限定されるものではないが、ハロゲン、アジド、アルキル、アラルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヒドロキシル、アルコキシル、アミノ（または４級化アミノ）、ニトロ、スルフヒドリル、イミノ、アミド、ホスホネート、ホスフィネート、カルボニル、カルボキシル、シリル、エーテル、アルキルチオ、スルホニル、スルホンアミド、ケトン、アルデヒド、エステル、ヘテロシクリル、芳香族または複素芳香族部分、－ＣＦ_３、－ＣＮ；およびそれらの組合せを含む１個または複数の置換基で置換され得る。

「アリール」という用語は、２個またはそれよりも多くの炭素が２つの隣接する環と共通である２つまたはそれよりも多くの環式環を有する多環式環系（すなわち、「縮合環」）も含み、ここで、環の少なくとも１つは芳香族であり、例えば、他の環式環または環は、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキニル、アリールおよび／または複素環であり得る。複素環式環の例としては、限定されるものではないが、ベンズイミダゾリル、ベンゾフラニル、ベンゾチオフラニル、ベンゾチオフェニル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾオキサゾリニル、ベンズチアゾリル、ベンズトリアゾリル、ベンズテトラゾリル、ベンズイソキサゾリル、ベンズイソチアゾリル、ベンズイミダゾリニル、カルバゾリル、４ａＨカルバゾリル、カルボリニル、クロマニル、クロメニル、シンノリニル、デカヒドロキノリニル、２Ｈ，６Ｈ－１，５，２－ジチアジニル、ジヒドロフロ［２，３－ｂ］テトラヒドロフラン、フラニル、フラザニル、イミダゾリジニル、イミダゾリニル、イミダゾリル、１Ｈ－インダゾリル、インドレニル、インドリニル、インドリジニル、インドリル、３Ｈ－インドリル、イサチノイル、イソベンゾフラニル、イソクロマニル、イソインダゾリル、イソインドリニル、イソインドリル、イソキノリニル、イソチアゾリル、イソキサゾリル、メチレンジオキシフェニル、モルホリニル、ナフチリジニル、オクタヒドロイソキノリニル、オキサジアゾリル、１，２，３－オキサジアゾリル、１，２，４－オキサジアゾリル、１，２，５－オキサジアゾリル、１，３，４－オキサジアゾリル、オキサゾリジニル、オキサゾリル、オキシンドリル、ピリミジニル、フェナントリジニル、フェナントロリニル、フェナジニル、フェノチアジニル、フェノキサチニル、フェノキサジニル、フタラジニル、ピペラジニル、ピペリジニル、ピペリドニル、４－ピペリドニル、ピペロニル、プテリジニル、プリニル、ピラニル、ピラジニル、ピラゾリジニル、ピラゾリニル、ピラゾリル、ピリダジニル、ピリドオキサゾール、ピリドイミダゾール、ピリドチアゾール、ピリジニル、ピリジル、ピリミジニル、ピロリジニル、ピロリニル、２Ｈ－ピロリル、ピロリル、キナゾリニル、キノリニル、４Ｈ－キノリジニル、キノキサリニル、キヌクリジニル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロイソキノリニル、テトラヒドロキノリニル、テトラゾリル、６Ｈ－１，２，５－チアジアジニル、１，２，３－チアジアゾリル、１，２，４－チアジアゾリル、１，２，５－チアジアゾリル、１，３，４－チアジアゾリル、チアントレニル、チアゾリル、チエニル、チエノチアゾリル、チエノオキサゾリル、チエノイミダゾリル、チオフェニルおよびキサンテニルが挙げられる。環の１つまたは複数は、「アリール」について上記で定義されたように、置換され得る。

「アルコキシ」は、酸素架橋を通して付着した示された炭素原子の数を有する上記で定義されたアルキル基を指す。アルコキシの例としては、限定されるものではないが、メトキシ、エトキシ、ｎ－プロポキシ、ｉ－プロポキシ、ｎ－ブトキシ、ｓ－ブトキシ、ｎ－ペントキシ、ｓ－ペントキシ、およびそれらの誘導体が挙げられる。

第一級アミンは、アンモニア中の３個の水素原子のうちの１個が置換もしくは無置換アルキル基または置換もしくは無置換アリール基によって置き換えられる場合に生じる。第二級アミンは、１個の水素と一緒に、窒素に結合した２個の有機置換基（置換もしくは無置換アルキル、置換もしくは無置換アリール、またはそれらの組合せ）を有する。第三級アミンでは、窒素は３個の有機置換基を有する。

「置換された」は、本明細書で使用される場合、モノマー上の１個もしくは複数の原子または原子の群が、置き換えられる原子または原子の群とは異なる１個もしくは複数の原子または原子の群で置き換えられていることを意味する。一部の実施形態では、モノマー上の１個または複数の水素は、１個または複数の原子または原子の群で置き換えられる。水素を置き換えることができる官能基の例は、定義において上記に列挙されている。一部の実施形態では、得られるモノマー／ポリマーの化学的および／または物理的性質、例えば、電荷または親水性／疎水性などを変える１個または複数の官能基を付加することができる。例示的な置換基としては、限定されるものではないが、ハロゲン、ヒドロキシル、カルボニル（例えば、カルボキシル、アルコキシカルボニル、ホルミル、またはアシル）、チオカルボニル（例えば、チオエステル、チオアセテート、またはチオホルメート）、アルコキシル、ホスホリル、ホスフェート、ホスホネート、ホスフィネート、アミノ、アミド、アミジン、イミン、シアノ、ニトロ、アジド、スルフヒドリル、アルキルチオ、サルフェート、スルホネート、スルファモイル、スルホンアミド、スルホニル、ニトロ、ヘテロシクリル、アラルキル、または芳香族もしくは複素芳香族部分が挙げられる。

他のものを示していない限り、本開示は、当技術分野の範囲内である分子生物学、微生物学、細胞生物学、および組換えＤＮＡの従来の技術を包含する。例えば、Sambrook and Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edition (2001); Current Protocols In Molecular Biology [(Ausubel, et al. eds., (1987)]; Coligan, Dunn, Ploegh, Speicher and Wingfeld, eds. (1995) Current Protocols in Protein Science (John Wiley & Sons, Inc.); the series Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.): PCR 2: A Practical Approach (M. J. MacPherson, B. D. Hames and G. R. Taylor eds. (1995)]を参照されたい。

ＩＩ．粒子
肺への効率的かつ選択的な送達のための粒子は、典型的には、生分解性の生体適合性ポリマーで形成される。これらは、典型的には、１０００ｎｍ未満、より好ましくは５００ｎｍ未満、最も好ましくは少なくとも１００ｎｍのナノ粒子である。例は、２００～４００ｎｍの間のナノ粒子が、単球およびマクロファージなどの肺免疫細胞を選択的に標的化することを実証する。

ポリマー
ポリ（アミン－ｃｏ－エステル）、ポリ（アミン－ｃｏ－アミド）、またはそれらの組合せを含むポリマー、ならびにそれらから形成されるポリプレックスおよび固体コア粒子。ポリ（アミン－ｃｏ－エステル）は、ＷＯ２０１３／０８２５２９号、ＷＯ２０１７／１５１６２３号、ＷＯ２０１７／１９７１２８号、米国公開出願第２０１６／０２５１４７７号、米国公開出願第２０１５／００７３０４１号、および米国特許第９，２７２，０４３号で議論されている。

ポリマー中のジエステルモノマーを二酸、例えばセバシン酸に置換すると、ヒドロキシルおよびカルボキシル末端基の混合物を有するポリマーを得ることができる。これらの２つの末端基の両方を、１，１’－カルボジイミダゾールによって活性化することができる。活性化された産物は、アミン含有分子と反応して、新規末端基を有するポリマーを生じることができる。

ポリマーをさらに加水分解して、より活性な末端基、例えば－ＯＨおよび－ＣＯＯＨを放出することができ、その両方が、典型的には、例えば制御温度（例えば、３７℃または１００℃）でポリマーを数日間または数週間インキュベートすることによるポリマー中のエステル結合の加水分解を起源とし得る（本明細書において「発動(actuation)」と呼ばれる）。一部の実施形態では、ポリマーは加水分解されず、したがって「発動されない」と呼ばれ得る。

一部の実施形態では、ポリプレックスを形成するために使用される場合、ポリマー中の疎水性モノマーの含有量を、同じ疎水性モノマーの含有量と比較して増加させる。ポリマー中の疎水性モノマーの含有量を増加させることは、ＲＮＡを含む核酸の存在下で固体コアナノ粒子を形成することができるポリマーを形成する。

ポリプレックスとは異なって、これらの粒子は、緩衝水または血清中でのインキュベーションの間、または動物への投与（例えば、注射）の際に長期間安定である。それらはまた、長期の活性（例えば、ｓｉＲＮＡ媒介ノックダウン）をもたらす核酸（例えば、ｓｉＲＮＡ）の持続的放出を提供する。

Ａ．ポリマー構造
ポリ（アミン－ｃｏ－エステル）またはポリ（アミン－ｃｏ－アミド）を、本明細書に記載する。一部の形態では、ポリマーは、式Ｉに示される構造：

［式中、ｎは１～３０の整数であり、
ｍ、ｏ、およびｐは、独立して１～２０の整数であり、
ｘ、ｙ、およびｑは、独立して１～１０００の整数であり、
Ｒ_ｘは、水素、置換もしくは非置換アルキル、または置換もしくは非置換アリール、または置換もしくは非置換アルコキシであり、
ＺおよびＺ’は、独立してＯまたはＮＲ’（式中、Ｒ’は、水素、置換もしくは非置換アルキル、または置換もしくは非置換アリールである）であり、
Ｒ_１およびＲ_２は、ヒドロキシル基、第一級アミン基、第二級アミン基、第三級アミン基、またはその組合せを含有する化学実体である］
を有する。

Ｒ_ｘおよびＲ’基の例としては、限定されるものではないが、水素、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、ｔ－ブチル、イソブチル、ｓｅｃ－ブチル、シクロヘキシル、（シクロヘキシル）メチル、シクロプロピルメチル、ならびにそのホモログおよび異性体、例えば、ｎ－ペンチル、ｎ－ヘキシル、ｎ－ヘプチル、ｎ－オクチル、フェニル、ナフタリル、アントラセニル、フェナントリル、クリセニル、ピレニル、トリル、キシリルなどが挙げられる。

特定の実施形態では、ｘ、ｙ、および／またはｑの値は、ポリマーの重量平均分子量が２０，０００ダルトンより大きく、１５，０００ダルトンより大きく、１０，０００ダルトンより大きく、５，０００ダルトンより大きく、２，０００ダルトンより大きくなるような値である。一部の形態では、ポリマーの重量平均分子量は、約２，０００ダルトン～約２０，０００ダルトンの間、より好ましくは約５，０００ダルトン～約１０，０００ダルトンの間である。

ポリマーは、１つまたは複数のラクトン、１つまたは複数のアミン－ジオール（ＺおよびＺ’＝Ｏ）、トリアミン（ＺおよびＺ’＝ＮＲ’）、またはヒドロキシ－ジアミン（Ｚ＝ＯおよびＺ’＝ＮＲ’、またはＺ＝ＮＲ’およびＺ’＝Ｏ）および１つまたは複数の二酸またはジエステルから調製することができる。２つまたはそれより多くの異なるラクトン、二酸もしくはジエステル、および／またはトリアミン、アミン－ジオール、もしくはヒドロキシ－ジアミンモノマーが使用されるそれらの実施形態では、ｎ、ｏ、ｐ、および／またはｍの値は同じであっても異なっていてもよい。

一部の形態では、ラクトン単位のパーセント組成は、約１０％～約１００％の間であり、ラクトン単位対（ラクトン単位＋ジエステル／二酸）で算出される。モル比に関して表すと、ラクトン単位対（ラクトン単位＋ジエステル／二酸）含有量は、約０．１～約１の間、すなわちｘ／（ｘ＋ｑ）は約０．１～約１の間である。好ましくは、ラクトン単位における炭素原子の数は、約１０～約２４の間、より好ましくはラクトン単位における炭素原子の数は、約１２～約１６の間である。最も好ましくは、ラクトン単位における炭素原子の数は、１２（ドデカラクトン）、１５（ペンタデカラクトン）、または１６（ヘキサデカラクトン）である。

一部の形態では、ＺはＺ’と同じである。

一部の形態では、Ｚは、Ｏであり、Ｚ’はＯである。一部の形態では、ＺはＮＲ’であり、Ｚ’はＮＲ’である。一部の形態では、ＺはＯであり、Ｚ’はＮＲ’である。一部の形態では、ＺはＮＲ’であり、Ｚ’はＯである。

一部の形態では、Ｚ’はＯであり、ｎは１～２４の整数、例えば４、１０、１３、または１４である。一部の形態では、Ｚも、Ｏである。

一部の形態では、Ｚ’はＯであり、ｎは１～２４の整数、例えば４、１０、１３、または１４であり、およびｍは１～１０の整数、例えば４、５、６、７、または８である。一部の形態では、Ｚも、Ｏである。

一部の形態では、Ｚ’はＯであり、ｎは１～２４の整数、例えば４、１０、１３、または１４であり、ｍは１～１０の整数、例えば４、５、６、７、または８であり、ならびにｏおよびｐは、１～６の同じ整数、例えば２、３、または４である。一部の形態では、Ｚも、Ｏである。

一部の実施形態では、Ｚ’はＯであり、ｎは１～２４の整数、例えば４、１０、１３、または１４であり、ｍは１～１０の整数、例えば４、５、６、７、または８であり、ならびにＲは、アルキル、例えばメチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、ｔ－ブチル、イソブチル、ｓｅｃ－ブチル、シクロヘキシル、（シクロヘキシル）メチル、シクロプロピルメチル、ならびにそのホモログおよび異性体、例えばｎ－ペンチル、ｎ－ヘキシル、ｎ－ヘプチル、およびｎ－オクチル、またはアリール、例えばフェニル、ナフタリル、アントラセニル、フェナントリル、クリセニル、ピレニル、トリル、またはキシリルである。一部の形態では、Ｚも、Ｏである。

一部の形態では、ｎは１４（例えば、ペンタデカラクトン、ＰＤＬ）であり、ｍは７（例えば、セバシン酸）であり、ｏおよびｐは２（例えば、Ｎ－メチルジエタノールアミン、ＭＤＥＡ）である。

一部の実施形態では、ポリプレックスまたは粒子は、Ｒ１および／またはＲ２が、対応するポリプレックスに関連しないポリマーから形成され、ここでＲ１および／またはＲ２は：

からなる、またはそれを含む。

一部の実施形態では、ポリマーから形成されるポリプレックスまたは粒子は、Ｒ１および／またはＲ２が：

からなる、またはそれを含む対応するポリプレックスと比べて、核酸カーゴ、例えばＲＮＡ、より詳細にはｍＲＮＡの、改善された負荷、改善された細胞トランスフェクション、改善された細胞内エンドソーム放出、またはその組合せを示す。

一部の形態では、ポリマーは、式ＩＩの構造を有する。

［式中、Ｊ_１およびＪ_２は、独立して連結部分であるかまたは存在せず、
Ｒ_３およびＲ_４は、独立してヒドロキシル基、第一級アミン基、第二級アミン基、第三級アミン基、またはその組合せを含有する置換アルキルである］。一部の形態では、Ｒ_３、Ｒ_４、または両方の分子量は、５００ダルトンもしくはそれ未満、２００ダルトンもしくはそれ未満、または１００ダルトンもしくはそれ未満である。

一部の形態では、Ｊ_１は、－Ｏ－または－ＮＨ－である。

一部の形態では、Ｊ_２は、－Ｃ（Ｏ）ＮＨ－または－Ｃ（Ｏ）Ｏ－である。

一部の形態では、Ｒ_３は、Ｒ_４と同一である。

好ましくは、Ｒ_３および／またはＲ_４は、線状である。

一部の形態では、Ｒ_３、Ｒ_４、またはその両方は、第一級アミン基を含有する。一部の形態では、Ｒ_３、Ｒ_４、またはその両方は、第一級アミン基、および１個または複数の第二級アミン基または第三級アミン基を含有する。

一部の形態では、Ｒ_３、Ｒ_４、またはその両方は、ヒドロキシル基を含有する。一部の形態では、Ｒ_３、Ｒ_４、またはその両方は、ヒドロキシル基、および１個または複数のアミン基、好ましくは、第二級アミン基または第三級アミン基を含有する。一部の形態では、Ｒ_３、Ｒ_４、またはその両方は、ヒドロキシル基を含有し、アミン基を含有しない。

一部の形態では、Ｒ_３およびＲ_４の少なくとも１つは、ヒドロキシル基を含有しない。

一部の形態では、Ｒ_３、Ｒ_４、またはその両方は、－無置換Ｃ_１～Ｃ_１０アルキレン－Ａｑ－無置換Ｃ_１～Ｃ_１０アルキレン－Ｂｑ、－無置換Ｃ_１～Ｃ_１０アルキレン－Ａｑ－置換Ｃ_１～Ｃ_１０アルキレン－Ｂｑ、－置換Ｃ_１～Ｃ_１０アルキレン－Ａｑ－無置換Ｃ_１～Ｃ_１０アルキレン－Ｂｑ、または－置換Ｃ_１～Ｃ_１０アルキレン－Ａｑ－置換Ｃ_１～Ｃ_１０アルキレン－Ｂｑ（式中、Ａｑは、存在しないかまたは－ＮＲ_５－であり、Ｂｑは、ヒドロキシル、第一級アミン、第二級アミン、または第三級アミンであり、Ｒ_５は、水素、置換もしくは無置換アルキル、または置換もしくは無置換アリールである）である。

一部の形態では、Ｒ_３、Ｒ_４、または両方は、図１に示される基から選択される。

一部の形態では、ポリマーは、式ＩＩＩの構造を有する。

モノマー単位は、１つまたは複数の位置で、１個または複数の置換基により置換することができる。例示的な置換基としては、限定されるものではないが、アルキル基、環状アルキル基、アルケン基、環状アルケン基、アルキン、ハロゲン、ヒドロキシル、カルボニル（例えば、カルボキシル、アルコキシカルボニル、ホルミル、またはアシル）、チオカルボニル（例えば、チオエステル、チオアセテート、またはチオホルメート）、アルコキシル、ホスホリル、ホスフェート、ホスホネート、ホスフィネート、アミノ、アミド、アミジン、イミン、シアノ、ニトロ、アジド、スルフヒドリル、アルキルチオ、サルフェート、スルホネート、スルファモイル、スルホンアミド、スルホニル、ニトロ、ヘテロシクリル、アラルキル、または芳香族もしくは複素芳香族部分が挙げられる。

ポリマーは好ましくは生体適合性である。さまざまな環サイズの容易に入手可能なラクトンは、低い毒性を持つことが公知である：例えば、ポリ（カプロラクトン）およびポリ（ｐ－ジオキサノン）などの小さなラクトンから調製されたポリエステルは、臨床適用において使用されている市販の生体材料である。大きな（例えば、Ｃ_１６～Ｃ_２４）ラクトンおよびそのポリエステル誘導体は、ハチなどの生物において同定されている天然産物である。１６～２４個の間の環炭素原子を含有するラクトンが、具体的に企図され、開示される。

一部の形態では、ポリマーは、温度制御された加水分解を経てさらに活性化され、それによって、１個または複数の活性化された末端基を露出させることができる。１個または複数の活性化された末端基は、例えば、ヒドロキシルまたはカルボン酸末端基であり得、これらは両方とも、ポリマー内のエステル結合の加水分解を経て生じ得る。活性化されたポリマーは、約５～２５ｋＤａ、好ましくは、約５～１０ｋＤａの重量平均分子量を有することができる。本明細書で使用される場合、「約」という用語は、許容されるパラメーター内のわずかな変動を意味する。明確性のために、「約」は、所与の値の±１０％を指す。一部の形態では、活性化されたポリマーは、一方の末端にＲ_１またはＲ_２、他方の末端にヒドロキシルまたはカルボン酸末端基を含有し、加水分解を介して生じる。

一部の形態では、ポリマーは式ＩＶの構造を有する。

一部の形態では、ポリマーは式Ｖの構造を有する。

一部の形態では、ポリマーは、式ＶＩの構造を有する。

［式中、Ｘ’は、－ＯＨまたは－ＮＨＲ’である］

式ＶＩ、Ｖ、およびＶＩは、中間生成物の構造である。それらは、式Ｉ、ＩＩ、またはＩＩＩの構造を有する多種多様なポリマーを合成するために使用することができる。

Ｂ．ＰＥＧブロッキング含有ポリマー
ポリマーは、例えば１つまたは複数の治療剤、予防剤、および／または診断剤を、制御放出様式で所望の期間にわたって放出することができる粒子、例えばマイクロ粒子もしくはナノ粒子、またはミセルの製剤中で薬物を送達するために使用することができる。

ｐＨ応答性のミセルナノ担体はしばしば、両親媒性ブロックコポリマーの自己アセンブリを介して形成され、親水性（例えば、ＰＥＧ）の外側シェル、および媒体ｐＨに応答することが可能である疎水性内部コアからなる。典型的には、媒体ｐＨを中性またはわずかに塩基性から弱酸性へと変化させると、ミセルコアは、分解が加速され、水に完全に溶解するようになるか、または水性媒体中で実質的に膨張する。その結果、生理的ｐＨで遅い薬物放出速度の薬物を封入したミセルは、酸性ｐＨがトリガーになって、薬物分子を急速に放出する（unload）ことができる。以前の報告におけるミセルコアを構成するポリマーセグメントは、ポリ（オルトエステル）、ポリ（β－アミノエステル）、ポリ（Ｌ－ヒスチジン）、およびその他を含む。以前のミセル系のほとんどに関する主な欠点は、コポリマーを調製するために複数のステップが必要であり、ポリマー分子量を制御することおよびコポリマー合成の際にポリマー組成を調整することが難しい点である。

コポリマーは、ｐＨの関数として放出速度の変動を呈した。ＰＥＧ２Ｋ－ＰＰＭＳコポリマー試料（ＰＥＧ２Ｋ－ＰＰＭＳ－１１％ＰＤＬ、ＰＥＧ２Ｋ－ＰＰＭＳ－３０％ＰＤＬ、およびＰＥＧ２Ｋ－ＰＰＭＳ－５１％ＰＤＬ）のＤＴＸ封入ミセルのｉｎ ｖｉｔｒｏ薬物放出挙動を、ＰＢＳ溶液中、７．４の生理的ｐＨおよび５．０の酸性ｐＨの両方で研究した。一般的に、全てのミセル試料からのＤＴＸ放出は、二相放出動態に従い、顕著なｐＨ依存性を呈した。ＤＴＸが負荷されたＰＥＧ２Ｋ－ＰＰＭＳコポリマーミセルは、最初の１２時間の間に２５～４５％の薬物を急速に放出し、その後１３２時間の間にさらに２５～４０％の薬物を徐々に放出した。薬物放出速度に及ぼす媒体ｐＨの影響は、実質的である。例えば、インキュベーション期間（１４４時間）の終了時、ＰＥＧ２Ｋ－ＰＰＭＳ－１１％ＰＤＬ、ＰＥＧ２Ｋ－ＰＰＭＳ－３０％ＰＤＬ、およびＰＥＧ２Ｋ－ＰＰＭＳ－５１％ＰＤＬコポリマーのミセルから放出された蓄積したＤＴＸの値はそれぞれ、７．４の生理的ｐＨで６６％、６０％、および５５％であり、５．０の酸性ｐＨでは対応して８５％、８１％、および７５％に増加する。ＰＥＧ２Ｋ－ＰＰＭＳコポリマーミセルからのＤＴＸ放出について観察されたｐＨトリガー加速は、媒体ｐＨが７．４から５．０に変化すると、ミセルＰＰＭＳコアのプロトン化およびサイズ増加によりミセルの著しい膨潤を引き起こすという以前の観察と矛盾しない。このｐＨトリガーのミセルサイズの増大は、捕捉されたＤＴＸのミセルコアから水性媒体への拡散および放出を明白に容易にする。所定のｐＨでは、ＤＴＸ放出速度は、おそらくミセルコアにおける薬物およびＰＰＭＳマトリックスの間の相互作用によって制御される。ＰＤＬに富むＰＥＧ２Ｋ－ＰＰＭＳコポリマーは、そのミセル内部コアにおいて強い疎水性ドメインを形成して、疎水性ＤＴＸ分子をより良好に捕捉および保持すると予想されることから、そのようなコポリマーミセルからの薬物放出は、より徐々に持続的となるはずである。この仮説は、ｐＨ７．４および５．０の両方で、ＰＥＧ２Ｋ－ＰＰＭＳコポリマーミセルからのＤＴＸ放出速度がコポリマーのＰＰＭＳ鎖セグメント中のＰＤＬ含有量が増加すると減少することを示す実験結果によって裏付けられる。

腫瘍細胞によってミセルが取り込まれると、ミセル粒子は、５．５～６．０の範囲のｐＨでエンドソームでの捕捉に供され、および４．５～５．０の範囲のｐＨでリソソームでの捕捉に供される。上記の結果が明らかに示しているように、これらの酸性環境は、必然的に、ＰＥＧ２Ｋ－ＰＰＭＳコポリマーミセルからの急速なＤＴＸ放出のトリガーとなり、このため、薬物が負荷されたミセルの細胞毒性を増強する。コポリマー中のアミノ基は、エンドソームエスケープを容易にするためのプロトンスポンジとして作用する。したがって、ＰＥＧ２Ｋ－ＰＰＭＳコポリマーミセルによって呈されるｐＨ応答特性は、非常に望ましく、それらは抗がん薬の送達のための優れた担体となる。

Ｃ．ポリマーを作製する方法
ポリマーは一般的に、合成ポリマーから改変される。例示的な合成ポリマーとしては、ラクトン、ジアルキル酸、およびジアルキルアミンから形成されるポリ（アミン－ｃｏ－エステル）が挙げられる。酵素触媒、例えばリパーゼを使用してラクトン、ジアルキル酸、およびジアルキルアミンからポリ（アミン－ｃｏ－エステル）を合成する方法もまた、提供される。例示的なラクトンは、米国特許出願公開第２０１７０１２１４５４号に開示されている。

Ｄ．ポリマーから形成された粒子
ポリマーを使用して、１つまたは複数の治療剤、診断剤、または予防剤をその中に封入したマイクロ粒子および／またはナノ粒子を調製することができる。薬剤を、粒子内に封入する、粒子を形成するポリマーマトリックス内に分散する、粒子の表面に共有結合的にもしくは非共有結合的に会合させる、またはその組合せを行うことができる。

放出速度は、ポリマーのモノマー組成および／またはポリマーの分子量を変化させ、このように分解速度を変化させることによって制御することができる。例えば、単純な加水分解が主な分解機構である場合、ポリマーの疎水性を増加させることは、分解速度を遅らせ、したがって放出期間を増加させ得る。全ての場合において、ポリマーの組成は、有効量の核酸が放出されて所望の目的／結果を達成するように選択される。

Ｅ．ポリプレックス（ｐｅｒｐｌｅｘ）およびミセル
ポリカチオン性ポリマーの遺伝子送達能は、ポリマーの分子量、疎水性、および電荷密度を含む複数の要因によることが発見されている。多くの合成ポリカチオン性材料が、非ウイルス性の遺伝子送達のためのベクターとして試験されているが、ほとんど全てがその低い効率または高い毒性のために無効である。以前に記載されたほとんどのポリカチオン性ベクターは、高い電荷密度を呈し、これは有効なＤＮＡ凝縮にとって主要な要件であると考えられている。その結果それらは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでは高い効率で遺伝子を送達することができるが、過剰な電荷密度に関連する毒性のために、ｉｎ ｖｉｖｏ適用は限定的である。

高分子量ポリマー、特にターポリマーは、低い電荷密度を有する。加えて、その疎水性は、特定の環サイズを有するラクトンコモノマーを選択することによって、およびポリマー中のラクトン含有量を調整することによって変化させることができる。ラクトン－ジエステル－アミノジオールターポリマーの高い分子量および増加した疎水性は、最小の毒性で効率的な遺伝子送達を提供するために低い電荷密度を代償する。

好ましい実施形態では、ターポリマーは、毒性が低減された効率的な遺伝子送達を呈す。ターポリマーは、有意により効率的な市販の非ウイルスベクターであり得る。例えば、ターポリマーは、ルシフェラーゼ発現アッセイに基づいて、市販の非ウイルスベクター、例えばＰＥＩおよびＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）２０００よりも１００倍を超えて効率的であり得るが、これらの市販の非ウイルスベクターと比較すると最大０．５ｍｇ／ｍｌの毒性の用量で最小の毒性を呈す。好ましくは、ターポリマーは、核酸のｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏトランスフェクションの両方にとって好適な濃度で非毒性である。例えば、一部の実施形態では、ターポリマーは、細胞トランスフェクションの他のアプローチと比較してより少ない非特異的細胞死を引き起こす。好ましいターポリマーは、２０％ＰＤＬを含有するω－ペンタデカラクトン－ジエチルセバケート－Ｎ－メチルジエタノールアミンターポリマー（ターポリマーＩＩＩ－２０％ＰＤＬとも呼ばれる）である。

ポリマー、例えばＰＥＧ－ブロック含有ポリマーを使用してミセルを調製することができる。平均ミセルサイズは典型的には、約１００～約５００ｎｍの範囲、好ましくは約１００～約４００ｎｍの範囲、より好ましくは約１００～約３００ｎｍの範囲、より好ましくは約１５０～約２００ｎｍの範囲、最も好ましくは約１６０～約１９０ｎｍの範囲であり、これは血清タンパク質の存在下、７．４の生理的ｐＨで安定であった。コポリマーは、高い血液適合性を有し、溶血および凝集を誘導する最小の活性を呈する。

ミセルのサイズおよびゼータ電位は、ミセルを収容する水性媒体のｐＨを変化させた場合に有意に変化することが見出された。例えば、サイズ－ｐＨおよびゼータ－ｐＨ曲線の傾向は、異なるＰＤＬ含有量（１１％、３０％、および５１％）を有する３つのＰＥＧ２Ｋ－ＰＰＭＳコポリマーのミセルと顕著に類似である。ミセル試料の平均サイズは、媒体ｐＨを７．４から５．０に減少させると徐々に増加した後、ｐＨ値が５．０未満である場合にはほぼ一定のままであることは明白である。ミセルに関して観察されたこのｐＨ応答挙動は、ｐＨを７．４から５．０に減少させる際に予想され、ミセルのＰＰＭＳコアは、プロトン化され、より親水性となり、このように、水性媒体からより多くの水分子を吸収してミセルの膨潤を引き起こす。ミセルコアは既に、ｐＨ５．０で十分にプロトン化されており、その結果として、ミセルのサイズは、ｐＨが５．０からさらに減少してもかなり一定のままである。ｐＨ値７．４～５．０の間のミセルサイズの変化の程度に及ぼすＰＥＧ２Ｋ－ＰＰＭＳコポリマー中のＰＤＬ含有量の効果もまた、顕著である。コポリマー中のＰＤＬ含有量を減少させ、第三級アミノ基の含有量を増加させると、ミセルコアがプロトンおよび水分子を吸収する能力は増加すると予想される。このように、ｐＨを７．４から５．０に減少させると、平均ミセルサイズの変化は、ＰＥＧ２Ｋ－ＰＰＭＳ－３０％ＰＤＬ（１８４ｎｍから２１４ｎｍ）およびＰＥＧ２Ｋ－ＰＰＭＳ－５１％ＰＤＬ（１６３ｎｍから１８２ｎｍ）と比較してＰＥＧ２Ｋ－ＰＰＭＳ－１１％ＰＤＬ（２００ｎｍから２３４ｎｍ）に関してより有意であった（図５Ａ）。

水性媒体中のミセルのゼータ電位はまた、実質的なｐＨ依存性も呈す。生理的およびアルカリｐＨ（７．４～８．５）では、ブランクＰＥＧ２Ｋ－ＰＰＭＳコポリマーミセルの表面電荷は負であったが、媒体ｐＨを酸性範囲（４．０～６．０）に減少させると正へと変化した。例えば、ＰＥＧ２Ｋ－ＰＰＭＳ－１１％ＰＤＬ、ＰＥＧ２Ｋ－ＰＰＭＳ－３０％ＰＤＬ、およびＰＥＧ２Ｋ－ＰＰＭＳ－５１％ＰＤＬのミセルはそれぞれ、ｐＨ７．４では－５．８、－７．１、－５．１ｍＶのゼータ電位値を有し、より低いｐＨ５．０では、対応して、＋７．６、＋５．８、＋４．０ｍＶとなった。上記の考察に基づくと、ｐＨに対するこの表面電荷依存性は、異なる媒体ｐＨでのミセルのＰＰＭＳコアのプロトン化または脱プロトン化に起因する。アルカリｐＨ（７．４～８．５）では、ミセルにおけるアミノ基のほとんどがおそらくプロトン化されず、ミセル粒子は、ミセルによるＰＢＳ中のＨＰＯ４２－および／またはＨ２ＰＯ４－アニオンの吸収により負に帯電したままである。特に、ｐＨ８．５では、ゼータ電位値は、ＰＥＧ２Ｋ－ＰＰＭＳ－１１％ＰＤＬ、ＰＥＧ２Ｋ－ＰＰＭＳ－３０％ＰＤＬ、およびＰＥＧ２Ｋ－ＰＰＭＳ－５１％ＰＤＬに関してそれぞれ、－８．１ｍＶ、－７．９ｍＶ、－９．０ｍＶであった。ｐＨを７．４から５．０に減少させると、ミセルＰＰＭＳコアにおける第三級アミノ部分がほとんどプロトン化されるようになり、ミセルを正に帯電した粒子にする。一貫して、３つのミセル試料において、最大のプロトン吸収能力を有するＰＥＧ２Ｋ－ＰＰＭＳ－１１％ＰＤＬミセルは、ｐＨ４．０～５．０で最高のゼータ電位値を示したが、最小のプロトン化能力を有するＰＥＧ２Ｋ－ＰＰＭＳ－５１％ＰＤＬミセルは、最も低いゼータ電位を示した。媒体ｐＨに対する観察されたミセル表面電荷応答は、生理的ｐＨでのミセルの負の表面電荷が、ミセルと血液中の血清タンパク質との相互作用を軽減してそのｉｎ ｖｉｖｏ循環時間を延長させることができるために非常に望ましい。他方で、およそ６．５の腫瘍細胞外ｐＨでの正の表面電荷へと逆転することは、標的腫瘍細胞によるこれらのミセルの取り込みを増強し得る。

粒子／ミセルの表面電荷は、ＰＢＳ溶液（０．０１Ｍ、ｐＨ＝７．４）中でわずかに負であり、これはミセルのｉｎ ｖｉｖｏ薬物送達適用にとって有益である。ほぼ中性の表面電荷（ゼータ電位－１０～＋１０ｍＶの間）を有するナノ粒子は、細網内皮系（ＲＥＳ）によるその取り込みを減少させ、血液中のその循環時間を増加させることができることは公知である。ミセルの負の表面電荷は、アニオンとＰＥＧシェルのエーテル基またはＰＰＭＳコアのアミノ基との間の水素結合相互作用を介した、ミセル粒子によるＰＢＳ中のＨＰＯ_４ ^２－および／またはＨ_２ＰＯ_４ ^－アニオンの吸収に起因し得る。両親媒性ブロックコポリマーミセルの場合、ミセルの外側シェルにおける親水性鎖セグメント（例えば、ＰＥＧ）は、ミセルコアにおける電荷を遮蔽することができ、長鎖ブロックは、短鎖ブロックよりもゼータ電位を低減するのに有効であると期待される。したがって、有意に低いゼータ電位値が、ＰＥＧ２Ｋ－ＰＰＭＳコポリマーミセルと比較して、ＰＥＧ５Ｋ－ＰＰＭＳコポリマーミセルに関して観察された。

コポリマーミセルは、ｐＨ応答性である：媒体ｐＨを７．４から５．０に下げると、ミセルのサイズはミセルサイズを有意に増加したが、ミセルの表面電荷は負の電荷から正の電荷へと逆転した。これに対応して、ＤＴＸ封入コポリマーミセルは、ｐＨ７．４で徐々に持続的な薬物放出を示したが、酸性のｐＨ５．０では顕著に加速されたＤＴＸ放出を示した。腫瘍の微小環境が、不良な酸素灌流による乳酸蓄積の結果として典型的には、弱酸性（例えば、５．７～７．０）であることが公知であるので、この現象を、腫瘍部位での薬剤の放出を改善するために利用することができる。これに対し、正常組織および血液の細胞外ｐＨは、わずかに塩基性（ｐＨ７．２～７．４）である。このように、増強された薬物送達効率が、ｐＨ応答性で、酸性ｐＨがトリガーになって、薬物放出を加速することができる抗がん薬が負荷されたミセルに関して予測される。さらに、ミセルはエンドサイトーシス経路を介して腫瘍細胞によって取り込まれた後、エンドソームおよびリソソームではさらにより酸性の条件（ｐＨ＝４．０～６．０）に遭遇し、これは薬物封入ミセルの細胞毒性をさらに増加させ得る。

Ｆ．治療剤、予防剤、および診断剤
ポリマーを使用して、多様な治療剤、予防剤、または診断剤のいずれかを封入し、それと混合し、またはイオン的にもしくは共有結合的にカップリングさせることができる。多種多様な生物活性材料を封入または組み込むことができる。

広範囲の分子量（例えば１モルあたり１００～５００，０００グラムまたはそれより多く）を有する化合物は、を封入することができる。一部の形態では、封入および送達される薬剤は、小分子薬剤（すなわち、２，０００ダルトン未満、１５００ダルトン未満、１，０００ダルトン未満、７５０ダルトン未満、または５００ダルトン未満の分子量を有する非ポリマー性薬剤）または高分子（例えば、オリゴマーまたはポリマー）、例えばタンパク質、ペプチド、核酸などであり得る。好適な小分子活性薬剤としては、有機、無機、および／または有機金属化合物が挙げられる。

好適な治療剤および予防剤の例としては、治療、予防、または診断活性を有する、合成無機および有機化合物、タンパク質およびペプチド、多糖類および他の糖、脂質、ならびにＤＮＡおよびＲＮＡ核酸配列が挙げられる。核酸配列としては、遺伝子、相補的ＤＮＡに結合して転写を阻害するアンチセンス分子、およびリボザイムが挙げられる。好適な材料の例としては、タンパク質、例えば抗体、受容体リガンド、および酵素、ペプチド、例えば接着ペプチド、糖類および多糖類、合成有機もしくは無機薬物、ならびに核酸が挙げられる。送達にとって好ましい薬物は、肺疾患または障害、特にＰＨの処置のために特異的な薬物である。ＰＨの場合、ほとんどの薬物は、平滑筋細胞の弛緩をもたらすことを意味する血管拡張剤（例えば、エンドセリンアンタゴニスト、プロスタサイクリンアナログ、ホスホジエステラーゼ阻害剤）であり、本発明者らの考えでは肺マクロファージを標的化する戦略にこれらを使用することは意味がない。ＰＨにおいて免疫系を標的化する薬物は、あまり利用されていないように思われる。ＣＯＰＤの場合、同様に吸入される気管支拡張剤は、気道ＳＭＣの弛緩をもたらすが、適切なコルチコステロイドを使用することができる。

結果は、肺免疫細胞への送達および肺免疫細胞による取り込みの驚くべき選択性を示すので、この送達系は、特に例えばＣＯＶＩＤ－１９などのウイルス疾患、肺線維症などの疾患、および肺がんの処置に関与するものなどの抗ウイルス剤を、肺に局所送達するために特に十分に好適である。同様に、これは、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）の処置のための免疫調節剤の送達に関して明白な利益を有する。

粒子に組み込むことができる例示的な治療剤としては、限定されるものではないが、免疫調節剤、抗感染剤（抗ウイルス剤または抗生物質を含む）、化学療法剤、モノクローナル抗体、またはその断片、またはそのヒト化バージョン、酵素、増殖因子、成長阻害剤、ホルモン、ホルモンアンタゴニスト、および核酸分子が挙げられる。

免疫調節剤は、抗炎症剤、トール様受容体に結合して自然免疫系を活性化するリガンド、適応免疫系を動員して最適化する分子、細胞傷害性Ｔリンパ球、ナチュラルキラー細胞およびヘルパーＴ細胞の作用を活性化または上方調節する分子、ならびにサプレッサーまたは制御性Ｔ細胞を脱活性化または下方調節する分子、ならびに樹状細胞および他の抗原提示細胞を含む細胞への粒子の取り込みを促進する薬剤が挙げられる。例示的な免疫調節剤としては、サイトカイン、キサンチン、インターロイキン、インターフェロン、オリゴデオキシヌクレオチド、グルカン、増殖因子（例えば、ＴＮＦ、ＣＳＦ、ＧＭ－ＣＳＦ、およびＧ－ＣＳＦ）、ホルモン、例えばエストロゲン（ジエチルスチルベストロール、エストラジオール）、アンドロゲン（テストステロン、ＨＡＬＯＴＥＳＴＩＮ（登録商標）（フルオキシメステロン））、プロゲスチン（ＭＥＧＡＣＥ（登録商標）（酢酸メゲストロール）、ＰＲＯＶＥＲＡ（登録商標）（酢酸メドロキシプロゲステロン））、およびコルチコステロイド（プレドニゾン、デキサメタゾン、ヒドロコルチゾン）が挙げられる。

オリゴヌクレオチド薬は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、アンチセンス、アプタマー、低分子干渉ＲＮＡ、リボザイム、リボヌクレアーゼＰの外部ガイド配列、および三重鎖形成剤を含む。

代表的な化学療法剤としては、アルキル化剤（例えば、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、メクロレタミン、シクロホスファミド、クロラムブシル、ダカルバジン、ロムスチン、カルムスチン、プロカルバジン、クロラムブシル、およびイホスファミド）、代謝拮抗薬（例えば、フルオロウラシル（５－ＦＵ）、ゲムシタビン、メトトレキセート、シトシンアラビノシド、フルダラビン、およびフロクスウリジン）、有糸分裂阻害薬（タキサン、例えばパクリタキセル、およびドセタキセル（decetaxel）、ならびにビンカアルカロイド、例えばビンクリスチン、ビンブラスチン、ビノレルビン、およびビンデシンを含む）、アントラサイクリン類（ドキソルビシン、ダウノルビシン、バルルビシン、イダルビシン、およびエピルビシン、ならびにアクチノマイシン類、例えばアクチノマイシンＤを含む）、細胞傷害性抗生物質（マイトマイシン、プリカマイシン、およびブレオマイシンを含む）、トポイソメラーゼ阻害剤（カンプトテシン、例えばカンプトテシン、イリノテカン、およびトポテカン、ならびにエピポドフィロトキシンの誘導体、例えばアムサクリン、エトポシド、リン酸エトポシド、およびテニポシドを含む）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）に対する抗体、例えばベバシズマブ（ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標））、他の抗ＶＥＧＦ化合物；サリドマイド（ＴＨＡＬＯＭＩＤ（登録商標））およびその誘導体、例えばレナリドミド（ＲＥＶＬＩＭＩＤ（登録商標））；エンドスタチン；アンジオスタチン；受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）阻害剤、例えばスニチニブ（ＳＵＴＥＮＴ（登録商標））；チロシンキナーゼ阻害剤、例えばソラフェニブ（Ｎｅｘａｖａｒ（登録商標））、エルロチニブ（Ｔａｒｃｅｖａ（登録商標））、パゾパニブ、アキシチニブ、およびラパチニブ；トランスフォーミング増殖因子－αまたはトランスフォーミング増殖因子－β阻害剤、ならびに上皮増殖因子受容体に対する抗体、例えばパニツムマブ（ＶＥＣＴＩＢＩＸ（登録商標））およびセツキシマブ（ＥＲＢＩＴＵＸ（登録商標））が挙げられる。

粒子と会合することができる免疫学的アジュバントの例としては、限定されるものではないが、ＴＬＲリガンド、Ｃ型レクチン受容体リガンド、ＮＯＤ様受容体リガンド、ＲＬＲリガンド、およびＲＡＧＥリガンドが挙げられる。ＴＬＲリガンドとしては、リポ多糖類（ＬＰＳ）およびその誘導体、ならびにリピドＡおよびその誘導体、例えば、限定されるものではないが、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）、グリコピラノシルリピドＡ、ＰＥＴ－リピドＡ、および３－Ｏ－デスアシル－４’－モノホスホリルリピドＡが挙げられ得る。

粒子はまた、抗原および／またはアジュバント（すなわち、免疫応答を増強する分子）も含み得る。ペプチド、タンパク質、およびＤＮＡに基づくワクチンを使用して、さまざまな疾患または状態に対する免疫を誘導してもよい。細胞媒介性免疫は、ウイルス感染細胞を検出および破壊するために必要である。ほとんどの従来のワクチン（例えば、タンパク質に基づくワクチン）は、体液性免疫のみを誘導することができる。ＤＮＡに基づくワクチンは、ＤＮＡに基づくワクチンが体液性免疫および細胞媒介性免疫の両方を誘導することができることから、ウイルスまたは寄生生物に対してワクチン接種するための独自の手段を表す。ＤＮＡワクチンは、２つの主要な構成要素、すなわちＤＮＡ担体（または送達ビヒクル）および抗原をコードするＤＮＡからなる。ＤＮＡ担体は、ＤＮＡを分解から保護し、特定の組織または細胞へのＤＮＡの進入および効率的なレベルでの発現を容易にし得る。

代表的な診断剤としては、ｘ線、蛍光、磁気共鳴画像法、放射能、超音波、コンピューター断層撮影（ＣＴ）および陽電子放射断層撮影（ＰＥＴ）によって検出可能な薬剤が挙げられる。超音波造影剤は、典型的には、気体、例えば空気、酸素、またはパーフルオロカーボンである。例示的な診断剤としては、常磁性分子、蛍光化合物、磁気分子、および放射性核種、およびｘ線造影剤が挙げられる。

一部の実施形態では、本明細書に記載される方法を使用して産生される粒子は、８０％未満、７５％未満、７０％未満、６０％未満、５０重量％未満、４０重量％未満、３０重量％未満、２０重量％未満、１５重量％未満、１０重量％未満、５重量％未満、１重量％未満、０．５重量％未満、または０．１重量％未満の薬剤を含有する。一部の実施形態では、薬剤は、薬学的活性剤の混合物であり得る。負荷パーセントは、封入される薬剤、粒子を調製するために使用されるポリマー、および粒子を調製するために使用される方法を含む多様な要因に依存する。

ポリヌクレオチド
ポリマー粒子を使用して、細胞を核酸でトランスフェクトすることができる。ポリヌクレオチドは、１つまたは複数のタンパク質、機能性核酸、またはそれらの組合せをコードすることができる。ポリヌクレオチドは、単シストロン性または多シストロン性であり得る。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、複遺伝子性である。

一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、細胞にトランスフェクトされ、染色体外のままである。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、宿主細胞に導入され、宿主細胞のゲノムに組み込まれる。

一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ベクターに、またはその一部に組み込まれる。遺伝子配列ならびに適切な転写および翻訳制御エレメントを含有する発現ベクターを構築する方法は、当技術分野において周知である。これらの方法としては、ｉｎ ｖｉｔｒｏ組換えＤＮＡ技法、合成技法、およびｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子組換えが挙げられる。発現ベクターは、一般に、調節配列、ならびに例えば、目的のポリヌクレオチドであり得る挿入されるコード配列の翻訳および／または転写に必要なエレメントを含有する。コード配列は、所望の遺伝子産物の発現を制御するのを助けるプロモーターおよび／またはエンハンサーに作動可能に連結され得る。生命工学において使用されるプロモーターは、意図される種類の遺伝子発現の制御に従って、異なる種類のものである。それらは、一般に、構成的プロモーター、組織特異的プロモーターまたは発生段階特異的プロモーター、誘導性プロモーター、および合成プロモーターに分けることができる。

いくつかのウイルスに基づく発現系が利用され得、例えば、一般に使用されるプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロウイルスおよびサルウイルス４０（ＳＶ４０）に由来する。ＳＶ４０ウイルスの初期および後期プロモーターは、両方ともＳＶ４０ウイルスの複製起点も含有する断片としてウイルスから容易に得られるので、有用である。ＨｉｎｄＩＩＩ部位からウイルス複製起点に位置するＢｇｌＩ部位の方へ伸びているおよそ２５０ｂｐの配列が含まれているという条件で、より小さいまたはより大きいＳＶ４０断片も使用され得る。

特定の開始シグナルはまた、組成物の効率的な翻訳にとって必要であり得る。これらのシグナルは、ＡＴＧ開始コドンおよび隣接する配列を含む。ＡＴＧ開始コドンを含む外因性の翻訳制御シグナルをさらに提供する必要があり得る。真核生物の発現では、シグナルが元のクローニングされたセグメント内に含有されなかった場合に、適切なポリアデニル化部位を転写単位に組み込むことが典型的には望まれるであろう。典型的には、ポリＡ付加部位は、転写終結前の位置のタンパク質の終結部位の約３０～２０００ヌクレオチド「下流」に配置される。

組換えタンパク質の長期間の高収量産生のため、安定発現が好ましい。例えば、タンパク質をコードする構築物を安定に発現する細胞系が操作され得る。ウイルス複製起点を含有する発現ベクターを使用するよりもむしろ、宿主細胞を、適切な発現制御エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー、配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位など）によって制御されるベクター、および選択マーカーで形質転換することができる。外来性ＤＮＡの導入後、操作された細胞を、富化培地中で１～２日間成長させてもよく、次いで、選択培地に切り替える。組換えプラスミド中の選択マーカーは、選択に対する耐性を付与し、細胞がプラスミドをそれらの染色体に安定に組み込み、成長して増殖巣（focus）を形成することを可能にし、次に、クローニングし、細胞系に拡大することができる。

好ましい実施形態では、ポリヌクレオチドカーゴは、ｍＲＮＡなどのＲＮＡである。ｍＲＮＡは、目的のポリペプチドをコードすることができる。

一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、５’末端にキャップおよび／または３’ポリ（Ａ）テールを有し、これは、細胞において、リボソーム結合、翻訳の開始、およびｍＲＮＡの安定性をモジュレートすることができる。

ポリヌクレオチドは、目的の１つまたは複数のポリヌクレオチドをコードし得る。

一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、生物において欠陥があるポリヌクレオチドを補充または交換する。

一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、選択マーカー、例えば真核細胞において有効な選択マーカー、例えば薬物耐性選択マーカーを含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、レポーター遺伝子を含む。

ポリヌクレオチドは、機能性核酸であり得るか、またはそれをコードすることができる。機能性核酸は、標的分子と結合すること、または特定の反応を触媒することなどの特定の機能を有する核酸分子である。機能性核酸分子は、以下の非限定的なカテゴリーに分けることができる：アンチセンス分子、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アプタマー、リボザイム、三重鎖形成分子、ＲＮＡｉ、および外部ガイド配列。機能性核酸分子は、標的分子が有する特定の活性のエフェクター、阻害剤、モジュレーター、および刺激剤として作用することができ、または機能性核酸分子は、任意の他の分子とは無関係にｄｅ ｎｏｖｏ活性を持ち得る。

機能性核酸分子は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリペプチド、または炭水化物鎖などの任意の高分子と相互作用することができる。そのため、機能性核酸は、標的ポリペプチドのｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡと相互作用することができ、またはそれらは、ポリペプチドそれ自体と相互作用することができる。多くの場合に、機能性核酸は、標的分子と機能性核酸分子との間の配列相同性に基づいて他の核酸と相互作用するように設計される。他の状況では、機能性核酸分子と標的分子との間の特異的認識は、機能性核酸分子と標的分子との間の配列相同性に基づいていないが、むしろ特異的認識が起こるのを可能にする三次構造の形成に基づく。

アンチセンス分子は、標準または非標準的な塩基対形成のいずれかにより標的核酸分子と相互作用するように設計される。アンチセンス分子および標的分子の相互作用は、例えば、ＲＮＡｓｅＨ媒介ＲＮＡ－ＤＮＡハイブリッド分解により標的分子の破壊を促進するように設計される。あるいは、アンチセンス分子は、転写または複製などの標的分子において通常行われるであろう処理機能を中断するように設計される。アンチセンス分子は、標的分子の配列に基づいて設計することができる。標的分子の最もアクセス可能な領域を見出すことによるアンチセンス効率の最適化のための多くの方法がある。例示的な方法としては、ｉｎ ｖｉｔｒｏ選択実験、ならびにＤＭＳおよびＤＥＰＣを使用するＤＮＡ改変研究が挙げられる。アンチセンス分子は、１０^－６、１０^－８、１０^－１０、または１０^－１２未満またはそれに等しい解離定数（Ｋ_ｄ）で標的分子と結合することが好ましい。

アプタマーは、好ましくは特定の方法で、標的分子と相互作用する分子である。典型的には、アプタマーは、ステムループまたはＧカルテットなどの定義された二次および三次構造にフォールドされる１５～５０塩基長の範囲の小さな核酸である。アプタマーは、ＡＴＰおよびテオフィリンなどの小分子、ならびに逆転写酵素およびトロンビンなどの大きな分子に結合することができる。アプタマーは、１０^－１２Ｍ未満の標的分子からのＫ_ｄで非常に強固に結合することができる。アプタマーが、１０^－６、１０^－８、１０^－１０、または１０^－１２未満のＫ_ｄで標的分子と結合することが好ましい。アプタマーは、非常に高い特異性で標的分子に結合することができる。例えば、標的分子と分子上の単一の位置のみで異なる別の分子との間の結合親和性において１０，０００倍超の相違を有するアプタマーが単離されている。アプタマーは、バックグラウンド結合分子とのＫ_ｄの多くとも１０分の１、１００分の１、１０００分の１、１０，０００分の１、または１００，０００分の１の標的分子とのＫ_ｄを有することが好ましい。ポリペプチドなどの分子について比較を行う場合、バックグラウンド分子は異なるポリペプチドであることが好ましい。

リボザイムは、分子内または分子間のいずれかの化学反応を触媒することができる核酸分子である。リボザイムは、分子間反応を触媒することが好ましい。ハンマーヘッド型リボザイムなどの天然系において見られるリボザイムに基づくヌクレアーゼまたは核酸ポリメラーゼ型の反応を触媒する、いくつかの異なる種類のリボザイムがある。天然系では見られないが、特定の反応をｄｅ ｎｏｖｏで触媒するように操作されているいくつかのリボザイムもある。好ましいリボザイムは、ＲＮＡまたはＤＮＡ基質を切断し、より好ましくは、ＲＮＡ基質を切断する。リボザイムは、典型的には、標的基質の認識および結合とその後の切断により核酸基質を切断する。この認識は、多くの場合、標準または非標準の塩基対の相互作用に主に基づく。標的基質の認識が標的基質配列に基づくので、この性質は、リボザイムを、核酸の標的特異的切断の特に良好な候補にする。

三重鎖形成性機能性核酸分子は、二本鎖または一本鎖核酸のいずれかと相互作用することができる分子である。三重鎖分子が標的領域と相互作用すると、三重鎖と呼ばれる構造が形成され、そこには、ワトソン－クリックおよびフーグスティーン塩基対形成の両方に依存する複合体を形成するＤＮＡの３つの鎖がある。三重鎖分子は、高い親和性および特異性で標的領域と結合することができるので、好ましい。三重鎖形成分子が、１０^－６、１０^－８、１０^－１０、または１０^－１２未満のＫ_ｄで標的分子と結合することが好ましい。

外部ガイド配列（ＥＧＳ）は、複合体を形成する標的核酸分子と結合する分子であり、これは、ＲＮａｓｅ Ｐによって認識され、次いで、標的分子を切断する。ＥＧＳは、選択したＲＮＡ分子を特異的に標的化するように設計することができる。ＲＮＡｓｅ Ｐは、細胞内のトランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）のプロセシングを支援する。細菌ＲＮＡｓｅ Ｐは、標的ＲＮＡ：ＥＧＳ複合体に天然のｔＲＮＡ基質を模倣させるＥＧＳを使用することによって、実質的に任意のＲＮＡ配列を切断するために動員され得る。同様に、真核生物ＥＧＳ／ＲＮＡｓｅ ＰのＲＮＡの指向性切断を利用して、真核細胞内の所望の標的を切断することができる。各種の異なる標的分子の切断を容易にするためにＥＧＳ分子を作製および使用する方法の代表例は、当技術分野において公知である。

遺伝子発現は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）により非常に特異的な様式で効果的にサイレンシングすることもできる。このサイレンシングは、元々は二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）の添加により観察された（Fire, et al. (1998) Nature, 391:806-11；Napoli, et al. (1990) Plant Cell 2:279-89；Hannon, (2002) Nature, 418:244-51）。ｄｓＲＮＡが細胞に侵入すると、ＲＮａｓｅ ＩＩＩ様酵素であるダイサーによって、３’末端に２つのヌクレオチドオーバーハングを含有する２１～２３ヌクレオチド長の二本鎖低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）に切断される（Elbashir, et al. (2001) Genes Dev., 15:188-200；Bernstein, et al. (2001) Nature, 409:363-6；Hammond, et al. (2000) Nature, 404:293-6）。ＡＴＰ依存性ステップでは、ｓｉＲＮＡは、一般にＲＮＡｉ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）として公知のマルチサブユニットタンパク質複合体に組み込まれ、これが、ｓｉＲＮＡを標的ＲＮＡ配列にガイドする（Nykanen, et al. (2001) Cell, 107:309-21）。ある時点でｓｉＲＮＡ二重鎖がほどけ、アンチセンス鎖がＲＩＳＣに結合したままであり、エンドヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼの組合せによって相補的ｍＲＮＡ配列の分解を方向付けると思われる（Martinez, et al. (2002) Cell, 110:563-74）。しかしながら、ｉＲＮＡもしくはｓｉＲＮＡの効果またはそれらの使用は、任意の種類の機構に限定されない。

短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）は、配列特異的な転写後遺伝子サイレンシングを誘導し、それによって、遺伝子発現を減少またはさらに阻害することができる二本鎖ＲＮＡである。一例では、ｓｉＲＮＡは、ｓｉＲＮＡおよび標的ＲＮＡの両方の間の配列同一性の領域内で、ｍＲＮＡなどの相同ＲＮＡ分子の特異的分解のトリガーになる。例えば、ＷＯ０２／４４３２１号は、３’オーバーハング末端と塩基対形成した場合に、標的ｍＲＮＡの配列特異的分解が可能なｓｉＲＮＡを開示しており、これらのｓｉＲＮＡを作製する方法について参照により本明細書に組み込まれる。配列特異的遺伝子サイレンシングは、酵素のダイサーによって産生されるｓｉＲＮＡを模倣する合成の短い二本鎖ＲＮＡを使用して哺乳動物細胞において達成することができる（Elbashir, et al. (2001) Nature, 411:494 498）（Ui-Tei, et al. (2000) FEBS Lett 479:79-82）。ｓｉＲＮＡは、化学的にもしくはｉｎ ｖｉｔｒｏで合成することができ、または細胞内部でｓｉＲＮＡにプロセシングされる短い二本鎖ヘアピン様ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）の結果であり得る。合成ｓｉＲＮＡは、一般に、アルゴリズムおよび従来のＤＮＡ／ＲＮＡ合成機を使用して設計される。供給業者としては、Ａｍｂｉｏｎ（Ａｕｓｔｉｎ、Ｔｅｘａｓ）、ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ（Ａｓｈｌａｎｄ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ（Ｌａｆａｙｅｔｔｅ、Ｃｏｌｏｒａｄｏ）、Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｓｔｅｒｌｉｎｇ、Ｖｉｒｇｉｎｉａ）、ＭＷＢ Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｅｓｂｅｒｓｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、Ｐｒｏｌｉｇｏ（Ｂｏｕｌｄｅｒ、Ｃｏｌｏｒａｄｏ）、およびＱｉａｇｅｎ（Ｖｅｎｔｏ、Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）が挙げられる。ｓｉＲＮＡは、ＡｍｂｉｏｎのＳＩＬＥＮＣＥＲ（登録商標）ｓｉＲＮＡ構築キットなどのキットを使用して、ｉｎ
ｖｉｔｒｏで合成することもできる。

ベクターからのｓｉＲＮＡの産生は、より一般には、短ヘアピンＲＮＡｓｅ（ｓｈＲＮＡ）の転写により行われる。例えば、ＩｍｇｅｎｅｘのＧＥＮＥＳＵＰＰＲＥＳＳＯＲ（商標）構築キット、ならびにＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＢＬＯＣＫ－ＩＴ（商標）誘導性ＲＮＡｉプラスミドおよびレンチウイルスベクターなどのｓｈＲＮＡを含むベクターの生成のためのキットが利用可能である。

ポリヌクレオチドは、典型的には、複素環式塩基（核酸塩基）、複素環式塩基に付着した糖部分、および糖部分のヒドロキシル機能をエステル化するリン酸部分を含むＤＮＡまたはＲＮＡヌクレオチドであり得る。主要な天然に存在するヌクレオチドは、複素環式塩基としてウラシル、チミン、シトシン、アデニンおよびグアニン、ならびにホスホジエステル結合によって連結されたリボースまたはデオキシリボース糖を含む。

ポリヌクレオチドは、ＤＮＡまたはＲＮＡ対応物と比べて、標的配列に対する安定性、半減期、または特異性もしくは親和性を改善するように化学的に改変されたヌクレオチドアナログから構成され得る。化学改変としては、核酸塩基、糖部分、ヌクレオチド連結、またはそれらの組合せの化学改変が挙げられる。本明細書で使用される場合、「改変ヌクレオチド」または「化学的に改変されたヌクレオチド」は、複素環式塩基、糖部分またはリン酸部分構成成分の１つもしくは複数の化学改変を有するヌクレオチドを定義する。一部の実施形態では、改変ヌクレオチドの電荷は、同じ核酸塩基配列のＤＮＡまたはＲＮＡオリゴヌクレオチドと比較して低減される。例えば、オリゴヌクレオチドは、低い負電荷、電荷なし、または正電荷を有することができる。改変は、オリゴヌクレオチドが細胞に侵入する能力、および上記で議論されたような遺伝子発現の阻害などの機能を行う能力を妨げるべきではなく、好ましくは、これを増強すべきである。

典型的には、ヌクレオシドアナログは、標準的なポリヌクレオチド塩基へのワトソン－クリック塩基対形成によって水素結合が可能な塩基を支持し、ここで、アナログの骨格は、オリゴヌクレオチドアナログ分子と標準的なポリヌクレオチド（例えば、一本鎖ＲＮＡまたは一本鎖ＤＮＡ）中の塩基との間の配列特異的な方法でそのような水素結合を可能にする様式で塩基を提示する。好ましいアナログは、実質的に帯電していない、リン含有骨格を有するものである。

ポリマーを使用するポリヌクレオチド送達の効率は、ポリプレックス表面上の正電荷によって影響を受け得る。例えば、＋８．９ｍＶのポリプレックスのゼータ電位は、循環の間に血液中の負に帯電した血漿タンパク質を引きつけ、それと結合し、細網内皮系（ＲＥＳ）による迅速なクリアランスをもたらし得る。効率はまた、ポリプレックスナノ粒子の不安定性によって影響を受け得る。例えば、下記の実施例において議論されるように、１０％の血清を含有するＮａＡｃ緩衝液中でインキュベートされたポリプレックス粒子は、１５分以内にサイズがほぼ２倍になり、７５分後に１０倍を上回って増加した。このサイズの増加の結果として、拡大したポリプレックスは、肝臓における取り込みによって循環から除去される可能性がある。したがって、一部の実施形態では、ポリプレックスは、ポリヌクレオチド送達効率を改善するために、処理またはコーティングされる。一部の実施形態では、コーティングは、対照と比較して、ポリプレックスの細胞特異的標的化を改善するか、安定性を改善するか（すなわち、ｉｎ ｖｉｖｏでのポリプレックスのサイズを安定化する）、ｉｎ ｖｉｖｏの（すなわち、体循環において）ポリプレックスの半減期を増加させるか、またはそれらの組合せを行う。一部の実施形態では、対照は、コーティングなしのポリプレックスである。

腫瘍細胞を標的化するための例示的なポリプレックスコーティングは、ポリＥ－ｍＲＧＤである。本明細書で使用される場合、ポリＥ－ｍＲＧＤは、３つのセグメントを含有する合成ペプチドを指す：生理学的ｐＨで負に帯電し、したがって、正に帯電したポリプレックスの表面に静電結合することができるポリグルタミン酸（ポリＥ）ストレッチを含む第１のセグメント；中性リンカーとして機能する中性ポリグリシンストレッチを含む第２のセグメント；ならびにＲＧＤとα_ｖβ_３およびα_ｖβ_５との相互作用により腫瘍内皮と結合するＲＧＤ配列を含む第３のセグメント。

ポリプレックスのポリヌクレオチド送達効率は、生理学的ｐＨで負に帯電する薬剤で粒子をコーティングすることによって改善することができる。好ましくは、負に帯電した薬剤は、ポリプレックスの正に帯電した表面に静電結合することができる。負に帯電した薬剤は、ポリプレックスの電荷を中和するか、またはポリプレックスの電荷を反転させることができる。したがって、一部の実施形態では、負に帯電した薬剤は、ポリプレックスに正味の負電荷を付与する。

一部の実施形態では、負に帯電した薬剤は、負に帯電したポリペプチドである。例えば、ポリペプチドは、ポリペプチドの全電荷が中性ｐＨで負となるように、アスパラギン酸、グルタミン酸、またはその組合せを含み得る。粒子の表面上の負電荷を増加させると、上記の負の相互作用を低減または防止することができ、より正に帯電した粒子が、循環中の血液中で負に帯電した血漿タンパク質を誘引してこれに結合し、細網内皮系（ＲＥＳ）による急速なクリアランスをもたらす。一部の実施形態では、粒子のゼータ電位は、約－１５ｍＶ～約１０ｍＶ、好ましくは約－１５ｍＶ～約８ｍＶ、より好ましくは約－１０ｍＶ～約８ｍＶ、より好ましくは約－８ｍＶ～約８ｍＶである。ゼータ電位は、粒子が安定であり（すなわち、凝集しないなど）、血流から容易に排除されない条件で、上記の範囲よりさらに負またはさらに正であり得る。ゼータ電位は、表面電荷を変化させる１つまたは複数の部分によって粒子表面をコーティングまたは官能化することによって操作することができる。あるいは、モノマーそのものを官能化することができ、および／または表面電荷を変化させる追加のモノマーをポリマーに導入することができる。

小さな粒子径を維持することで、肝臓によるクリアランスを制限し、ポリプレックス粒子の標的細胞へのトランスフェクション能力を維持するので、凝集に対する耐性は重要であり得る。したがって、好ましい実施形態では、ポリプレックスは、凝集に対して耐性である。好ましくは、ポリプレックスは、コーティングの有無にかかわらず、約１ｎｍ～１０００ｎｍの半径、より好ましくは、約１ｎｍ～約５００ｎｍの半径、最も好ましくは、約１５ｎｍ～約２５０ｎｍの半径である。例えば、一部の実施形態では、ポリヌクレオチドが負荷されたコーティングされたポリプレックスは、約１５０ｎｍ～２７５ｎｍの半径である。

ポリヌクレオチド重量のポリマー重量に対する比（ポリヌクレチド：ポリマー）、ポリプレックスコーティングの含有量および量、またはそれらの組合せを使用して、ポリプレックスのサイズを調整することができる。

Ｇ．製剤
製剤は、安全で有効であると考えられる材料から構成される薬学的に許容される「担体」を使用して調製され、望ましくない生物学的副作用または望まない相互作用を引き起こすことなく、個体に投与され得る。「担体」は、活性成分または成分以外の医薬製剤中に存在するすべての構成要素である。「担体」という用語は、限定されるものではないが、希釈剤、結合剤、滑沢剤、崩壊剤、フィラー、およびコーティング組成物を含む。
錠剤および遅延放出剤形を調製するための材料、装置およびプロセスに関する詳細な情報について、Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets, eds. Lieberman et al. (New York: Marcel Dekker, Inc., 1989)およびAnsel et al., Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 6.sup.th Ed. (Media, PA: Williams & Wilkins, 1995)を参照されたい。

肺送達のための好ましい製剤は、エアロゾル、インヘラー、ドライパウダー、挿管、および点滴注入による投与のための薬学的に許容される担体である。

ＩＩＩ．粒子またはポリプレックスを調製する方法
粒子を、当技術分野で公知の多様な技術を使用して調製することができる。使用される技術は、ナノ粒子を形成するために使用されるポリマー、得られた粒子の所望のサイズ範囲、および封入される材料の適切性を含む多様な要因に依存し得る。

ナノ粒子を調製するために使用することができる当技術分野において公知の方法としては、限定されるものではないが、高分子電解質縮合（Suk et al., Biomaterials, 27, 5143-5150 (2006)を参照されたい）；一重および二重エマルジョン；ナノ粒子成形、ならびに静電的自己アセンブリー（例えば、ポリエチレンイミン－ＤＮＡまたはリポソーム）が挙げられる。

一実施形態では、負荷された粒子は、典型的には、有機溶媒中のポリマーの溶液を、目的のポリヌクレオチドと混ぜ合わせることによって調製される。ポリマー溶液は、ポリマーを溶媒に溶解または懸濁させることによって調製される。溶媒は、封入される核酸に悪影響を及ぼさない（例えば、不安定化または分解しない）ように選択されなければならない。好適な溶媒としては、限定されるものではないが、ＤＭＳＯおよび塩化メチレンが挙げられる。溶媒中のポリマーの濃度は、必要により変えることができる。一部の実施形態では、濃度は、例えば、２５ｍｇ／ｍｌである。ポリマー溶液は、緩衝液、例えば酢酸ナトリウム緩衝液に希釈することもできる。

次に、ポリマー溶液を、ポリヌクレオチドなどの封入される薬剤と混合する。薬剤は、それをポリマー溶液と混ぜ合わせる前に、溶媒に溶解して溶液を形成することができる。一部の実施形態では、薬剤は、それをポリマー溶液と混ぜ合わせる前に、生理学的緩衝液に溶解する。ポリマー溶液体積の薬剤溶液体積に対する比は、１：１であり得る。ポリマーおよび薬剤の組合せは、典型的には、トランスフェクションなどのその所望の目的のために溶液を使用する前に、数分間インキュベートして、粒子を形成する。例えば、ポリマー／ポリヌクレオチド溶液を、トランスフェクションのために溶液を使用する前に、２、５、１０、または１０分より長くインキュベートすることができる。インキュベーションは、室温であり得る。

一部の実施形態では、粒子はまた、使用前にコーティング剤を含有する溶液とともにインキュベートされる。粒子溶液は、トランスフェクションのためにポリプレックスを使用する前に、コーティング剤とともに２、５、１０、または１０分よりも長くインキュベートすることができる。インキュベーションは、室温であり得る。

一部の実施形態では、薬剤がポリヌクレオチドである場合、ポリヌクレオチドは、ポリマーと混合する前に、最初にポリカチオンと複合体化される。複合体化は、ポリヌクレオチドおよびポリカチオンを適切なモル比で混合することによって達成することができる。ポリアミンをポリカチオン種として使用する場合、ポリアミン窒素のポリヌクレオチドリン酸に対するモル比（Ｎ／Ｐ比）を決定することが有用である。好ましい実施形態では、阻害性ＲＮＡおよびポリアミンは、およそ１：１～１：２５、好ましくは、約８：１～１５：１のＮ／Ｐ比で、一緒に混合されて、複合体が形成される。特定のモル比を達成するために必要なポリアミン溶液の体積は、以下の式：

［式中、Ｍ_{ｗ，ｉｎｈＲＮＡ}＝阻害性ＲＮＡの分子量、Ｍ_ｗ，Ｐ＝阻害性ＲＮＡのリン酸基の分子量、Φ_Ｎ：Ｐ＝Ｎ：Ｐ比（ポリアミン由来の窒素の阻害性ＲＮＡ由来のリン酸の比に対するモル比）、Ｃ_ＮＨ２、ｓｔｏｃｋ＝ポリアミンストック溶液の濃度、およびＭ_{ｗ，ＮＨ２}＝ポリアミンの窒素あたりの分子量］
に従って決定することができる。ポリヌクレオチドをポリカチオンと混合して、ポリヌクレオチドを縮合させる方法は、当技術分野において公知である。例えば、米国公開出願第２０１１／０００８４５１号を参照されたい。

「ポリカチオン」という用語は、選択されたｐＨ、好ましくは、生理学的ｐＨで、正電荷、好ましくは、少なくとも２つの正電荷を有する化合物を指す。ポリカチオン性部分は、選択されたｐＨ値で、約２～約１５の正電荷、好ましくは、約２～約１２の正電荷、より好ましくは、約２～約８の正電荷を有する。多くのポリカチオンが当技術分野において公知である。ポリカチオンの好適な構成成分としては、塩基性アミノ酸およびそれらの誘導体、例えば、アルギニン、アスパラギン、グルタミン、リシンおよびヒスチジン；カチオン性デンドリマー；ならびにアミノ多糖類が挙げられる。好適なポリカチオンは、直鎖状、例えば、直鎖状テトラリシン、分枝状またはデンドリマーの構造であり得る。

例示的なポリカチオンとしては、限定されるものではないが、アクリルアミドおよび２－アクリルアミド－２－メチルプロパントリメチルアミンに基づく合成ポリカチオン、ポリ（Ｎ－エチル－４－ビニルピリジン）または類似の４級化ポリピリジン、ジエチルアミノエチルポリマーおよびデキストランコンジュゲート、硫酸ポリミキシンＢ、リポポリアミン、ポリ（アリルアミン）、例えば、強ポリカチオンのポリ（ジメチルジアリルアンモニウムクロリド）、ポリエチレンイミン、ポリブレン、ならびにポリペプチド、例えば、プロタミン、ヒストンポリペプチド、ポリリシン、ポリアルギニンおよびポリオルニチンが挙げられる。

一部の実施形態では、ポリカチオンは、ポリアミンである。ポリアミンは、２個またはそれよりも多くの第一級アミン基を有する化合物である。好適な天然に存在するポリアミンとしては、限定されるものではないが、スペルミン、スペルミジン、カダベリンおよびプトレシンが挙げられる。好ましい実施形態では、ポリアミンは、スペルミジンである。

別の実施形態では、ポリカチオンは、環状ポリアミンである。環状ポリアミンは、当技術分野において公知であり、例えば、米国特許第５，６９８，５４６号、ＷＯ１９９３／０１２０９６号およびＷＯ２００２／０１０１４２号に記載されている。例示的な環状ポリアミンとしては、限定されるものではないが、サイクレンが挙げられる。

スペルミンおよびスペルミジンは、ＯＤＣ（オルニチンデカルボキシラーゼ）の作用によってＬ－オルニチンから産生されるプトレシン（１，４－ジアミノブタン）の誘導体である。Ｌ－オルニチンは、アルギナーゼによるＬ－アルギニン分解の産物である。スペルミジンは、プトレシン（１，４－ジアミノブタン）の脱炭酸Ｓ－アデノシルメチオニン（ｄｃＡｄｏＭｅｔ）３－アミノプロピル供与体によるモノアルキル化を触媒するスペルミジンシンターゼ（ＳｐｄＳ）によって産生するトリアミン構造である。プトレシンの両方のアミノ基の３－アミノプロピル供与体での正式なアルキル化（formal alkylation）は、対称的なテトラアミンスペルミンが生じる。スペルミンの生合成は、ｄｃＡｄｏＭｅｔの存在下でのスペルミンシンターゼ（ＳｐｍＳ）の効果によってスペルミジンに進行する。３－アミノプロピル供与体（ｄｃＡｄｏＭｅｔ）は、メチオニンアデノシルトランスフェラーゼによるＬ－メチオニンの逐次変換によってＳ－アデノシルメチオニンから誘導され、それに続いてＡｄｏＭｅｔＤＣ（Ｓ－アデノシルメチオニンデカルボキシラーゼ）により脱炭酸する。そのため、プトレシン、スペルミジンおよびスペルミンは、アミノ酸のＬ－アルギニン（Ｌ－オルニチン、プトレシン）およびＬ－メチオニン（ｄｃＡｄｏＭｅｔ、アミノプロピル供与体）から誘導される代謝産物である。

ＩＶ．粒子／ミセルを使用する方法
粒子を使用して、有効量の１つまたは複数の治療剤、診断剤、および／または予防剤を、そのような処置を必要とする患者に送達することができる。投与される薬剤の量は、処方する医師によって容易に決定することができ、患者の年齢および体重、ならびに処置される疾患または障害に依存する。

組成物は、対象の肺に治療有効量で投与される。本明細書で使用される場合、「有効量」または「治療有効量」という用語は、処置される障害の１つまたは複数の症状を処置する、阻害する、もしくは軽減するのに十分な投薬量、またはそうでなければ所望の薬理学的および／または生理学的効果を提供するのに十分な投薬量を意味する。正確な投薬量は、対象に依存する変数（例えば、年齢、免疫系の健康など）、疾患、およびもたらされる処置などの各種の要因に従って変化する。

本発明は、ＰＡＣＥナノ粒子を使用して血小板由来増殖因子阻害剤の選択的標的化によって肺高血圧症の１つまたは複数の症状を選択的に処置することができる方法を示す以下の非限定的な実施例を参照することによってさらに理解される。

肺高血圧症（「ＰＨ」）の病理学的特徴：
遠位肺細動脈筋性動脈化
上昇した肺動脈血圧
右心室肥大（ＲＶＨ）

内皮細胞からの血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）－Ｂは、ＰＨの病因にとって重要であるが、ＰＨにおける肺マクロファージおよびマクロファージ由来ＰＤＧＦ－Ｂの役割は十分に明らかにされていない。

以下の研究は、肺マクロファージ由来ＰＤＧＦ－βが、ＰＨにおける病的なＳＭＣ増大において重要な役割を果たすこと、およびＰＤＧＦ－βの阻害剤を、その処置のために肺マクロファージおよび単球に選択的に送達することができることを実証する。

（実施例１）
肺胞および肺実質マクロファージは、低酸素において蓄積し、その枯渇は遠位筋性動脈化およびＰＨを減弱させる
野生型またはトランスジェニックマウスを低酸素に最大２１日間曝露したＰＨのモデル。測定および分析を、肺組織、ＢＡＬＦ細胞、および心臓について行った。さらに、ヒト患者からの新鮮な全血について研究を行い、初代単球を単離してマクロファージへと分化させ、これらの細胞におけるＲＮＡ含有量を分析し、ならびにＳＭＣ遊走および増殖に及ぼすそのような培養物からの馴化培地の効果を分析した。

方法および材料
動物研究
マウスを、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから得た。Ｃ５７ＢＬ／６マウスを野生型研究のために使用し、マウスはＬｙｓＭ－Ｃｒｅ（Clausen Transgenic Res. 1999;8(4):265-77; Cowburn. Proc Natl Acad Sci U S A. 2016;113(31):8801-6）、ＲＯＳＡ２６Ｒ^{（ｍＴｍＧ／ｍＴｍＧ）}（Muzumdar MD, Tasic B, Miyamichi K, Li L, and Luo L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 2007;45(9):593-605）、ＰＤＧＦ－β^{（ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ）}（Enge M, et al. EMBO J. 2002;21(16):4307-16）、Ｖｈｌ^{（ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ）}（Haase Proc Natl Acad Sci U S A. 2001;98(4):1583-8）、Ｈｉｆ１ａ^{（ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ）}（Ryan. Cancer Res. 2000;60(15):4010-5）、またはＨｉｆ２ａ^{（ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ）}（Gruber, Proc Natl Acad Sci U S A. 2007;104(7):2301-6）を有した。１０～１６週齢の雄および雌マウスならびに性別および年齢をマッチさせた対照を使用した。

低酸素曝露および血行力学測定
マウスを、コントローラーおよび酸素センサーを備えた低酸素（１０％ＦｉＯ_２）チャンバー（ＢｉｏＳｐｈｅｒｉｘ（登録商標））に最大２１日間入れた。低酸素処置後、ＲＶＳＰを測定した。次に、マウスをイソフルラン吸入によって安楽死させ、肺の採取に加えて、心臓を収集して、ＲＶのＬＶと中隔（Ｓ）の合計に対する重量比であるＦｕｌｔｏｎ指数を決定した（Sheikh Cell Rep. 2014;6(5):809-17）。血行力学測定を行う技術者は、処置群およびマウスの遺伝子型に関して盲検化された。

気管支肺胞洗浄液および肺の採取
安楽死後、ＰＢＳを、ＲＶを通して肺へと灌流した。肺全体を分析する場合、左右の肺両方を、灌流後直接採取した。ＢＡＬＦの収集に関して、１ｍｌのＰＢＳを、気管を通して肺胞へと注射した後、気管から吸引した。この手順を１回繰り返し、収集したＢＡＬＦをプールした。ＢＡＬＦを、８３０ｇ（ＧＳ－６Ｒ遠心分離器、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）、４℃で１０分間遠心分離し、細胞ペレットを収集した。ＢＡＬＦを除去後の残存肺についてのＦＡＣＳ実験のために、右の主気管支を結紮し、右肺を摘出した。免疫組織化学のために、左肺を２％低融点アガロースによって膨張させ、氷冷ＰＢＳに入れた。アガロースが固化すると、左肺を、Ｄｅｎｔ固定液（４：１メタノール：ＤＭＳＯ）中に４℃で一晩浸し、翌日洗浄し、１００％メタノール中、－８０℃で保存した。

ナノ粒子製剤および投与
ナノ粒子を、野生型マウスに経口気管内投与した。クロドロネートまたはＰＤＧＦ－β ｓｉＲＮＡが負荷されたナノ粒子を、低酸素の開始時、およびその後最大２１日間の低酸素の間に３日毎に投与した。色素ＤｉＤを負荷したナノ粒子を投与したマウスを、酸素正常状態で６時間維持した後、安楽死させた。食細胞を枯渇させるために、０．２５ｍｇクロドロネートまたはＰＢＳを負荷し、ＰＢＳ（Ｌｉｐｏｓｏｍａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）に溶解したリポソーム５０μＬを注射した。ナノ粒子取り込みの評価またはＰＤＧＦ－βノックダウンに関して、５０％ラクトン（ＰＰＭＳ－５０ＣＯＯＨ）と共に酸末端を有する（ポリ（ペンタデカラクトン－ｃｏ－ｎ－メチルジエタノールアミンｃｏ－セバケート）で構成されるＰＡＣＥナノ粒子を、改変シングルエマルションまたはダブルエマルション溶媒蒸発技術を使用して製剤化した（Kauffman Biomacromolecules. 2018;19(9):3861-73）。簡単に説明すると、色素が負荷されたナノ粒子製剤（直径約２００または約４００ｎｍ）において、ポリマーに対して０．２重量％のＤｉＤ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用した。ＤＭＳＯ（１０ｍｇ／ｍＬ溶液の１０μＬ）を、シングルエマルション製剤化の直前に５０ｍｇのポリマーに溶解した。ＰＤＧＦ－β ｓｉＲＮＡおよびスクランブル（Ｓｃｒ）ＲＮＡが負荷されたナノ粒子の場合、核酸カーゴ（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ、５０ｎＭ）を酢酸ナトリウム緩衝液（２５ｍＭ、ｐＨ５．８）に溶解した後に、ダブルエマルション法に進んだ。流体力学的直径（４０４±８または３８６±７ｎｍ）、動的光散乱（Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｐｒｏ、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｐａｎａｌｙｔｉｃａｌ）を使用するサイズ分布（ＰＤＩ；０．２１８±０．００４または０．２３８±０．００７）およびゼータ電位（９．４±０．３または１０．８±０．５ｍＶ）、ならびにＱｕａｎｔＩＴ ＲｉｂｏＧｒｅｅｎアッセイ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用するｓｉＲＮＡ負荷効率（６９．６±１．２または６４．３±０．５％）を含む、ナノ粒子のパラメーター（ｓｉＰＤＧＦ－βまたはＳｃｒ負荷によって層別化）をアッセイした。ナノ粒子（０．２ｍｇ）を５０μＬのＰＢＳに懸濁し、マウスに投与した。培養物中のマクロファージによるナノ粒子の取り込みを確認するために、ＢＡＬＦ細胞ペレットをマウス細胞培養培地（ＲＰＭＩ［Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ］、１０％ウシ胎仔血清［ＦＢＳ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ］、５％ペニシリン／ストレプトマイシン［Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ］）中に再懸濁させ、０．２５ｍｇ／ｍｌ ＤｉＤが負荷されたナノ粒子と共に３７℃で６時間インキュベートした。

免疫組織化学
免疫組織化学分析に関して、１００％メタノール中に保存した左肺を、５％Ｈ_２Ｏ_２／メタノール中、ＲＴで１５分間インキュベートすることによるペルオキシダーゼ脱活性化に供した後、ＰＢＳ中７５％、５０％、および２５％、および０％メタノールで逐次的に再湿潤化した。ビブラトームを使用して再湿潤化した肺を厚さ１５０μｍの切片に切断し、これをＩＨＣブロッキング緩衝液（０．５％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標） Ｘ－１００／ＰＢＳ［ＰＢＳ－Ｔ］中の５％ヤギ血清）中、４℃で一晩インキュベートした後、ＩＨＣブロッキング緩衝液中の一次抗体によって４℃で３日間染色した。次いで、切片をＰＢＳ－Ｔ中で３回洗浄し、ＩＨＣブロッキング緩衝液中の二次抗体と共に４℃で一晩インキュベートし、ＰＢＳ－Ｔ中で５回洗浄し、Ｄａｋｏ封入培地によってスライドガラス上に封入し、４℃で保存した。使用した一次抗体は、ラット抗ＭＥＣＡ－３２（１：１５、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｓｔｕｄｉｅｓ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｂａｎｋ［ＤＳＨＢ］）、ラット抗ＣＤ３１－ＦＩＴＣ（１：２５０、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、マウス抗ＣＤ６４－ＡＰＣ（１：２５０、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ラット抗ＣＤ６８－ＡＰＣ（１：５０、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）、およびマウス抗ＳＭＡ Ｃｙ３クローン１Ａ４（１：２５０、Ｓｉｇｍａ）であった。使用した二次抗体は、Ａｌｅｘａ４８８抗ラット（１：２５０、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）であった。核をＤＡＰＩ（１：５００）によって染色した。

撮像
染色した切片の画像を、共焦点顕微鏡（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ ＵｌｔｒａＶｉｅｗ ＶＯＸスピンディスクまたはＬｅｉｃａ ＳＰ８ポイントスキャン）を使用して獲得した。Ａｄｏｂｅ Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ（登録商標）を使用して画像を処理した。遠位筋性動脈化を分析するために、本発明者らは、Ｌ．Ｌ１．Ａ１．Ｌ１およびＬ．Ｌ１．Ａ１．Ｍ１（Sheikh 2014; Sheikh 2015）として以前に記載され、示された左肺における２つの特異的細動脈床に焦点を当てた。それらの命名法は、成体マウスにおける類型的な分岐パターンを有する最も近い気道に由来する（Sheikh et al Cell Rep. 2014;6(5):809-17, Metzger. Nature. 2008;453(7196):745-50）。その直径および分岐パターンに基づいて、肺細動脈は、近位（Ｐ；直径＞７５ｍｍ）、中位（Ｍ；２５～７５ｍｍ）、および遠位（Ｄ；＜２５ｍｍ）、ならびに名称Ｌ、左主気管支（ｌｅｆｔ ｍａｉｎ ｂｒｏｎｃｈｕｓ）；Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、側枝（ｌａｔｅｒａｌ ｂｒａｎｃｈ）；Ｍ１、Ｍ２、内側枝（ｍｅｄｉａｌ ｂｒａｎｃｈ）；Ａ１、Ａ２、前枝（ａｎｔｅｒｉｏｒ ｂｒａｎｃｈ）として分類される。

ヒト研究
ヒト対象を伴う全ての手順は、Ｙａｌｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ施設内倫理委員会の承認を受け（ＩＲＢ ＃１３０７０１２４３１および＃１００５００６８６５）、本発明者らは、全ての関連する倫理的規則に従った。書面でのインフォームドコンセントを、研究への組み入れ前に全ての参加者から得た。

ヒト単球の単離およびマクロファージへの分化
Ｙａｌｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ医学部の肺血管疾患クリニックのＩＰＡＨおよびＳＳｃ－ＰＡＨ患者ならびに健康な対照からの新鮮な全血を、非特定化試料としてＧｒｅｉｆ ｌａｂに提供した。単球を、以前に記載した方法（Bennett J Exp Med. 1966;123(1):145-60; Karlsson, et al. Exp Hematol. 2008;36(9):1167-75）に基づいて単離し、マクロファージへと分化させた。簡単に説明すると、新鮮な全血を、ＨＢＳＳ中で３倍希釈し、Ｆｉｃｏｌｌ－Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅカラム（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にロードし、８３０ｇで３０分間遠心分離した。末梢血単核球相を吸引して、ＨＢＳＳ中で３倍希釈し、８３０ｇで１０分間遠心分離した。血小板の除去を確実にするために、ペレットを３ｍｌのＨＢＳＳに再懸濁させ、さらに８３０ｇで１０分間遠心分離した。次に、ペレットを、１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩに再懸濁させ、細胞をプラスチック細胞培養皿に３７℃で１時間接着させた。単球は、プラスチック（３７）に優先的に接着する（図Ｓ６Ａ、Ｂ）。浮遊している細胞を捨て、接着細胞をＰＢＳによって洗浄し、ＰＢＳ中の５ｍＭ ＥＤＴＡと共に１０分間インキュベートして染色およびフローサイトメトリーのために収集するか、またはマクロファージ分化培地（ＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ（商標）－ＳＦマクロファージ培地および１ｎｇ／ｍｌマクロファージコロニー刺激因子［いずれもＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから］）中で培養した。培地を、４日目に新鮮なマクロファージ分化培地と交換した。６日目、培地をＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ（商標）－ＳＦマクロファージ培地に変更し、１２時間後、馴化培地を収集し、細胞を採取した。低酸素研究の場合、健康なドナーの単球に由来するマクロファージを、１％ＦＢＳおよび５％ペニシリン－ストレプトマイシンを追加補充したＲＰＭＩ中、酸素正常状態または３％Ｏ_２のいずれかに１２時間曝露した。

ｈＰＡＳＭＣの培養および増殖アッセイ
ｈＰＡＳＭＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）を、１０％ＦＢＳ、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、２ｎｇ／ｍｌ線維芽細胞増殖因子（Ｐｒｏｍｅｇａ）、３ｎｇ／ｍｌ上皮増殖因子（Ｐｒｏｍｅｇａ）を追加補充したＭ１９９培地中で最大６回の継代まで培養した。増殖を、軽微な変更を加えて以前に記載されたように評価した（Dave J. Dev Cell. 2018;44(6):665-78 e6）。ｈＰＡＳＭＣを、トリプシン処理し、フィブロネクチン（ＰＢＳ中１０μｇ／ｍＬ）によって事前にコーティングした培養スライドガラス（ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ）上で一晩培養した。翌日、細胞をＰＢＳによって洗浄し、０．５％ＦＢＳを追加補充したＭ１９９中で一晩血清を枯渇させた。次に細胞をＰＢＳ中で洗浄し、２０μｇ／ｍｌ ＩｇＧ対照または抗ＰＤＧＦ－Ｂブロッキング抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）によって３７℃で１時間事前に処置したまたは処置していないヒト対照または患者由来マクロファージによって馴化した培地中で２４時間培養した。このインキュベーションの最後の１０時間に、１０μｇ／ｍｌ ＢｒｄＵ（Ｓｉｇｍａ）を細胞に加えた。スライドガラスを４％パラホルムアルデヒドに３０分間固定し、水中０．３％Ｔｒｉｓ、１．５％グリシン中で１５分間すすぎ、２Ｎ ＨＣｌ中、３７℃で３０分間インキュベートし、０．１Ｍホウ酸によって洗浄した後、ＰＢＳ－Ｔ中１％ＦＢＳで１時間インキュベートした。ｈＰＡＳＭＣを、ＰＢＳ－Ｔ中１％ＦＢＳにおけるラット抗ＢｒｄＵ一次抗体（１：１００、ＢｉｏＲａｄ）によって１時間染色し、ＰＢＳ中０．５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０で３回洗浄した後、ＰＢＳ－Ｔ中１％ＦＢＳにおけるＡｌｅｘａ４８８（１：５００、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）およびＰＩ（１：５００、Ｓｉｇｍａ）にコンジュゲートしたヤギ抗ラット二次抗体と共に１時間インキュベートした。最後に、スライドガラスをＰＢＳ中０．５％Ｔｗｅｅｎ２０で３回洗浄し、蛍光封入培地（Ｄａｋｏ）を使用してスライドガラスに封入した。増殖は、ＢｒｄＵ^＋であった総ＰＩ^＋ｈＰＡＳＭＣのパーセンテージとして計算した。各対照または患者に関して、少なくとも１０個の視野を採点した。

ＳＭＣ遊走アッセイ
細胞遊走を、Dave Dev Cell. 2018;44(6):665-78 e6による方法によって評価した。簡単に説明すると、ｈＰＡＳＭＣをトリプシン処理し、ボイデンチャンバーのポリカーボネート膜（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃｏｓｔａｒ、孔径８μｍ）の上部に直ちに加えた。ボイデンチャンバーの下部区画は、２０μｇ／ｍｌ抗ＰＤＧＦ－Ｂブロッキング抗体またはＩｇＧ対照によって３７℃で１時間事前に処置したまたは処置していないヒト対照および患者由来マクロファージによって馴化した培地を含有した。ｈＰＡＳＭＣを、下部チャンバーに向かって８時間遊走させ、その時点で膜を４％パラホルムアルデヒドに３０分間固定し、０．１％クリスタルバイオレットによって染色し、水で洗浄した。膜の上表面を、綿棒で掻き取り、遊走していない細胞を除去し、下部表面上の細胞（すなわち、遊走した細胞）を画像化して計数した。

統計学
データは全て、平均値±標準偏差として表す。スチューデントｔ検定（対応のない、両側）および一元配置ＡＮＯＶＡを使用してそれぞれ、２群および複数の群の平均値を比較した（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェア）。統計学的有意性の閾値を、ｐ≦０．０５に設定した。試験は全て正規分布を仮定した。

結果
結果の図１Ａ－１は、肺胞および残存肺実質マクロファージ、ＣＤ６４^＋Ｌｙ６Ｇ^－細胞が低酸素下で蓄積することを示している。

図２Ａ～２Ｂに示すように、同様に肺胞および残存肺マクロファージに関してそれぞれ、約６倍および約９倍増加したレベルでピークに達するＰＤＧＦ－β ｍＲＮＡの増加が存在する。

図２Ｃ～２Ｆは、マクロファージ枯渇が、低酸素条件の動物において筋性動脈化、右心室収縮期圧、ならびに右心室肥大を減弱させることを実証する。

ｌｏｘＰ導入対立遺伝子を有するＬｙｓＭ－Ｃｒｅマウスを使用して、骨髄系細胞における特定の遺伝子を欠失させた。２１日間の低酸素後、ＰＤＧＦ－βまたは低酸素誘導因子２ａを欠失させた骨髄系細胞を有するマウスは、遠位細動脈筋性動脈化およびＰＨから保護される。図３Ａ～３Ｄに示すように、フォンヒッペルリンダウは、低酸素誘導因子の分解において重要な役割を果たし、結果は、骨髄系におけるフォンヒッペルリンダウ遺伝子の欠失が、酸素正常状態において遠位細動脈筋性動脈化およびＰＨをもたらすことを示している。

図４Ａ～４Ｆ、図５Ａ～５Ｆ、および図７Ａ～７Ｆに示すように、ＰＤＧＦ－β ｓｉＲＮＡを負荷したナノ粒子を送達することによって、肺マクロファージにおけるＰＤＧＦ－βを薬理学的に下方調節する効果を評価した。気管支肺胞洗浄液において、ＰＤＧＦ－β ｓｉＲＮＡは、ＰＤＧＦ－βレベルを９０％低減させる。これらのｓｉＰＤＧＦ－βナノ粒子は、低酸素誘導遠位肺細動脈筋性動脈化、ＰＨ、および右心室肥大を減弱させる。

最後に、図６Ａ～６Ｅにおいて、本研究の臨床的関連性を評価するために、ヒトマクロファージおよびＳＭＣを研究した。最初に、健康なドナーからのマクロファージでは、低酸素への曝露により、ＰＤＧＦ－β転写物レベルが２．５倍増加した（図６Ａ～６Ｂ）。加えて、ＰＨ患者からのマクロファージにおけるＰＤＧＦ－βレベルは、特発性の病因または強皮症により、それぞれ５倍および１０倍増強された。図６Ｃ～６Ｄを参照されたい。同様に、患者のマクロファージによって馴化した培地は、ＳＭＣ増殖を約６倍増加させた。さらに、抗ＰＤＧＦ－Ｂブロッキング抗体によってＰＨ患者の馴化培地を前処置すると、このＳＭＣ増殖を阻害した。図６Ｅを参照されたい。同様に、ＰＨ患者の馴化培地は、ＳＭＣ遊走を約４倍誘導し、抗ＰＤＧＦ－Ｂの前処置はこの効果を約５０％低減させた。

図８は、マウスおよびヒト研究のために本明細書において使用した方法の概要の概略図である。

併せて考慮すると、実験モデルならびにヒト肺高血圧症患者から単離した細胞による研究は、マクロファージ低酸素誘導因子およびＰＤＧＦ－Ｂが、ＳＭＣおよび右心室リモデリングおよびＰＨにおいて主要な役割を果たすことを実証する。さらに、肺マクロファージにおけるＰＤＧＦ－βのナノ粒子媒介サイレンシングは、治療的である。本明細書のこの調査における遠位筋性動脈化の免疫組織化学分析は、同定された気道分枝、左気管支－第１の側枝二次枝－第１の前枝－第１の側枝または第１の内側枝（Ｌ．Ｌ１．Ａ１．Ｌ１またはＬ．Ｌ１．Ａ１．Ｍ１）に隣接する特定の肺細動脈床に焦点を当てた。正常酸素圧条件下では、これらの床における遠位細動脈は、筋性動脈化されなかったが、低酸素曝露によって筋性動脈化の類型的なプロセスを受ける（Sheikh Cell Rep. 2014;6(5):809-17; Sheikh Sci Transl Med. 2015;7(308):308ra159; Sheikh Cell Rep. 2018;23(4):1152-65）。

遠位細動脈筋性動脈化およびＰＨを発症することに加えて、低酸素に曝露したマウスの肺は、過度にマクロファージを蓄積する（Amsellem Am J Respir Cell Mol Biol. 2017;56(5):597-60818, Stenmark Circ Res. 2006;99(7):675-91; Rabinovitch Annu Rev Pathol. 2007;2:369-99）（図１Ａ～Ｃ）。低酸素（１０％ＦｉＯ_２）で維持した野生型マウスにおけるＰＨの際の肺マクロファージの蓄積の時間経過を最大２１日間決定した。肺血管系を洗浄し、フローサイトメトリーを使用して、ＣＤ６４^＋Ｌｙ６Ｇ^－マクロファージを、気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）およびＢＡＬＦ後の残存肺から単離した。ＢＡＬＦ中のマクロファージのパーセントは徐々に増加して、酸素正常状態と比較して低酸素２１日目では統計学的有意性に達した。これに対し、残存肺からのマクロファージは、低酸素の３日目で２．９±０．５倍増加し、低酸素の２１日目で最大１０．８±１．１倍増加した。

低酸素誘導遠位筋性動脈化およびＰＨに及ぼすクロドロネートの肺胞および残存マクロファージの枯渇の効果を評価した。クロドロネートを負荷したリポソームまたはリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を負荷した対照としてのリポソームを、食細胞を枯渇させるために、野生型マウスに低酸素の開始時、および続く２１日間の低酸素の間に週に２回経口気管内投与した。クロドロネートによって処置したマウスは、低酸素誘導遠位筋性動脈化、右心室収縮期圧（ＲＶＳＰ；肺動脈収縮期圧に等しい）、およびＦｕｌｔｏｎ指数（すなわち、右心室［ＲＶ］の、左心室［ＬＶ］と中隔［Ｓ］の合計に対する重量比）によって測定したＲＶＨを減弱させた。対照リポソームと比較すると、クロドロネートが負荷されたリポソームによる処置は、ＢＡＬＦ中のマクロファージを約５０％低減させ、残存肺中のマクロファージを約６５％低減させた（図１Ｅ、１Ｆ）。基礎条件下では、成体肺が筋線維芽細胞を有することは非常にまれであるが、低酸素は、これらの細胞の数の顕著な増加を誘導することが実証されている（Sheikh Cell Rep. 2014;6(5):809-17, Chen J Appl Physiol (1985). 2006;100(2):564-71）。骨髄系細胞の枯渇は、肺胞筋線維芽細胞の低酸素誘導蓄積を顕著に阻害する。

肺マクロファージＰＤＧＦ－βは、低酸素によって上方調節され、ＬｙｓＭ－Ｃｒｅ系列におけるＰＤＧＦ－βの欠失はＰＨを減弱させる
マウスを低酸素に曝露すると、肺全体および特に肺ＥＣにおけるＰＤＧＦ－Ｂレベルが増加する（Sheikh 2015; Sheikh 2018）；しかし、必ずしも全ての肺ＰＤＧＦ－ＢがＥＣに由来するわけではない。このため、低酸素に最大２１日間曝露したマウスのＢＡＬＦおよび残存肺からＦＡＣＳによって単離したＣＤ６４^＋Ｌｙ６Ｇ^－マクロファージにおけるＰＤＧＦ－β発現の時間経過を計算した。ＰＤＧＦ－β ｍＲＮＡレベルをｑＲＴ－ＰＣＲによって測定し、酸素正常状態と比較したところ、低酸素の１日以内に増加し、３日目にＢＡＬＦおよび残存肺に関してそれぞれ、５．６±０．２および９．３±０．２倍増加したレベルでピークに達した（図２Ａ、Ｂ）。単球／マクロファージにおけるＰＤＧＦ－βの上方調節をさらに確認するために、この集団を標識するＬｙｓＭ－Ｃｒｅを使用した。ＬｙｓＭ－Ｃｒｅ、ＲＯＳＡ２６Ｒ^{（ｍＴｍＧ／ｍＴｍＧ）}マウスを、低酸素に２１日間曝露するか、または酸素正常状態で維持した後、ＧＦＰ^＋細胞を、肺全体からＦＡＣＳによって単離した。ＰＤＧＦ－β ｍＲＮＡレベルは、低酸素マウスから単離した細胞では２．１±０．４倍増加した。同様に、正常酸素圧マウスのＢＡＬＦから単離したＧＦＰ^＋細胞は、正常酸素圧条件とは対照的に低酸素（３％Ｏ_２）下で培養した場合に、同様に増加したＰＤＧＦ－β ｍＲＮＡレベルを有した。

次に、単球／マクロファージ由来ＰＤＧＦ－βが、低酸素誘導ＰＨに寄与するか否かを評価した。以前に、Ｃｓｆ１ｒ－Ｍｅｒ－ｉＣｒｅ－Ｍｅｒ、ＰＤＧＦ－β^{（ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ）}マウスのタモキシフェン処置が、病的な遠位肺細動脈筋性動脈化を弱く減弱させることが見出されたが（Sheik 2018）、ＰＨ、ＲＶＨおよび筋線維芽細胞蓄積に及ぼす効果は研究されなかった。誘導型Ｃｓｆ１ｒ－Ｃｒｅは、組換えの誘導において極めて非効率的であり（Qian Nature. 2011;475(7355):222-5; Epelman Immunity. 2014;40(1):91-104）、本明細書ではこの非効率性を回避するために、構成的ＬｙｓＭ－Ｃｒｅを使用してＰＤＧＦ－βを欠失させた（図Ｓ３Ａ）。ＰＤＧＦ－β^{（ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ）}バックグラウンドでは、ＬｙｓＭ Ｃｒｅも有するマウスは、Ｃｒｅを有しないマウスと比較して２１日間の低酸素曝露によって遠位筋性動脈化およびＰＨを減弱させた（図２Ｃ、Ｄ）。ＬｙｓＭ－Ｃｒｅ、ＰＤＧＦ－β^{（ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ）}のＦｕｌｔｏｎ指数をＰＤＧＦ－β^{（ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ）}マウスのＦｕｌｔｏｎ指数と比較すると、低酸素によって低減する傾向があり、酸素正常状態で増加する傾向があったが、これらの差は、統計学的有意性に達しなかった（図２Ｅ）。しかし、低酸素値および酸素正常状態値の間のＦｕｌｔｏｎ指数の差を、遺伝子型によって層別化すると、ＬｙｓＭ－Ｃｒｅ、ＰＤＧＦ－β^{（ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ）}マウスに関してこの差の有意な４６±７％の低減が存在した（図２Ｆ）。最後に、骨髄系細胞のＰＤＧＦ－β欠失によって、筋線維芽細胞は、低酸素の３日間および２１日間の両方で約６０％低減した（図２Ｇ、Ｈ、Ｓ４Ａ、Ｂ）。このように、骨髄系細胞由来ＰＤＧＦ－Ｂは、低酸素誘導肺血管リモデリングおよびＰＨにおいて重要な役割を果たす。

フォンヒッペルリンダウのＬｙｓＭ－Ｃｒｅ媒介欠失は、酸素正常状態におけるＰＤＧＦ－β発現および肺血管リモデリングを誘導する
ＰＨの病因における骨髄系細胞由来ＰＤＧＦ－Ｂの重要な役割を考慮して、この細胞型による低酸素誘導ＰＤＧＦ－β発現の基礎となる機構を評価した。低酸素誘導因子（ＨＩＦ）は、ＨＩＦ１－βとＨＩＦαアイソフォーム、すなわちＨＩＦ１－αまたはＨＩＦ２－αのいずれかとのヘテロ二量体である。低酸素に曝露したマウスでは、ＥＣ ＨＩＦは、細胞の自律的ＰＤＧＦ－β発現ならびに遠位筋性動脈化およびＰＨを調節する。基質としての酸素を使用して、ＨＩＦαは、プロリンのヒドロキシル化を受けるが、これはフォンヒッペルリンダウ（ＶＨＬ）－Ｅ３ユビキチンリガーゼに対する結合を容易にし、最終的にプロテオソーム媒介分解を容易にする改変である。このように、ＨＩＦαは、酸素がわずかである場合に、または関連するユビキチン化分解経路が、例えばＶｈｌ欠失によって阻害される場合に蓄積する。正常酸素圧条件下では、Ｖｈｌ^{（ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ）}マウスと比較すると、ＬｙｓＭ－Ｃｒｅ、Ｖｈｌ^{（ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ）}マウスは、ＢＡＬＦ細胞において低減されたＶｈｌを有し、増加したＨｉｆ１ａ、Ｈｉｆ２ａおよびＰＤＧＦ－βレベルを有する（図３Ａ、Ｓ３Ｄ～Ｆ）。さらに、骨髄系細胞におけるＶｈｌ欠失は、酸素正常状態において遠位筋性動脈化、ＰＨおよびＲＶＨを誘導し（図３Ｂ～Ｃ）、ならびに肺マクロファージ蓄積を誘導する（図３Ｄ）。

次にＶｈｌ欠失が、低酸素に対する比較的短い（７日間）曝露の効果を増強するか否かを評価した。この時点では、ＬｙｓＭ－Ｃｒｅを有するＶｈｌ^{（ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ）}マウスは、Ｃｒｅを欠如するマウスのそれと比較して強く７．６±１．２倍増加したＢＡＬＦ細胞ＰＤＧＦ－βｍＲＮＡレベルを有する。さらに、ＬｙｓＭ^＋細胞におけるＶｈｌ欠失は、短期間の低酸素曝露後に遠位筋性動脈化の顕著な増強ならびにＲＶＳＰおよびＲＶＨの増加を誘導した。

骨髄系細胞ＨＩＦαは、ＰＤＧＦ－β発現および低酸素誘導遠位筋性動脈化、ＲＶＨおよびＰＨを調節する
Ｖｈｌを欠失させて、このようにＨＩＦ経路を誘導する実験を補完するために、ＬｙｓＭ^＋細胞においてＨｉｆ１ａまたはＨｉｆ２ａを欠失させる研究を行った。最初に、野生型マウスの低酸素曝露の時間経過から、３日目の低酸素によりＢＡＬＦ細胞においてＨＩＦ１－αおよびＨＩＦ２－αが上方調節されることが明らかとなった（図４Ａ、５Ａ）。この時点では、Ｈｉｆ１ａ^{（ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ）}またはＨｉｆ２ａ^{（ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ）}バックグラウンドの、同様にＬｙｓＭ－Ｃｒｅも有するマウスは、Ｃｒｅを欠如するマウスと比較して、それぞれ、ＢＡＬＦ細胞において低減されたレベルのＰＤＧＦ－βおよびＨｉｆ１ａまたはＨｉｆ２ａのいずれかを有した（図４Ｂ、５Ｂ）。加えて、マクロファージマーカーＣＤ６４を発現する細胞および筋線維芽細胞の肺における蓄積は、Ｈｉｆ１ａまたはＨｉｆ２ａ欠失によって実質的に低減される（図４Ｃ～Ｄ、５Ｃ～Ｄ）。その上、低酸素の２１日目での分析は、Ｈｉｆ１ａ^{（ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ）}またはＨｉｆ２ａ^{（ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ）}を有するＬｙｓＭ－Ｃｒｅマウスが、遠位肺細動脈筋性動脈化、ＲＶＳＰおよびＦｕｌｔｏｎ指数を減弱させることを明らかにした（図４Ｅ～Ｆ、５Ｅ～Ｆ）。このように、ＰＤＧＦ－β、Ｖｈｌ、Ｈｉｆ１ａおよびＨｉｆ２ａ欠失実験をまとめて考えると、結果は、骨髄系細胞によるＰＤＧＦ－Ｂ発現が、両方のＨＩＦαアイソフォームによって細胞自律的にモジュレートされ、肺血管リモデリングおよびＰＨを調節する重要な要因であることを示唆している。

マクロファージ由来ＰＤＧＦ－ＢはＰＡＨ患者において増加し、ＳＭＣ増殖および遊走を誘導する
マウスにおける病的な肺筋性動脈化におけるマクロファージおよび骨髄系由来ＰＤＧＦ－Ｂの突出した役割を考慮して、本発明者らは、次にこれらの知見をヒトＰＡＨ患者へと外挿しようとした。最初に、ヒトマクロファージからのＰＤＧＦ－βレベルを分析した。末梢血単核球画分を、Ｆｉｃｏｌｌカラム遠心分離によって対照のヒトの新鮮な全血から単離し、プラスチックへの接着性によって単球に関して濃縮した。接着細胞を、マクロファージコロニー刺激因子と共にインキュベートしてそれらをマクロファージへと分化させ、マクロファージに低酸素（３％Ｏ_２）を１２時間曝露すると、酸素正常状態とは対照的にＰＤＧＦ－β転写物レベルの２．６±０．６倍増加を誘導した（図６Ａ）。この研究の臨床的関連性の強い証拠として、ＩＰＡＨおよびＳＳｃ－ＰＡＨ患者の循環中の単球から分化させたマクロファージのＰＤＧＦ－βレベルはそれぞれ、対照のヒトのそれと比較して５．１±１．８および１０．７±４．８倍増強された（図６Ｂ）。

ｈＰＡＳＭＣ増殖に及ぼすＰＡＨ患者からのマクロファージによって馴化した培地の効果およびこの培地中のＰＤＧＦ－Ｂの役割を評価した。ｈＰＡＳＭＣを、新たに分化させたマクロファージによって馴化した培地中で２４時間培養し、ＢｒｄＵを、このインキュベーションの最後の１０時間加えた。対照と比較して増殖性である（すなわち、ＢｒｄＵ^＋）細胞（ヨウ化プロピジウム［ＰＩ］^＋核）のパーセントを決定した（図６Ｃ）。ＩＰＡＨおよびＳＳｃ－ＰＡＨ患者に由来するマクロファージによって馴化した培地に関して、ｈＰＡＳＭＣ増殖のそれぞれ、４．６±０．３および７．０±１．９倍の相対的増加が存在した。これらの効果に対するＰＤＧＦ－Ｂの寄与を評価するために、ｈＰＡＳＭＣに加える前に、マクロファージ馴化培地を、抗ＰＤＧＦ－Ｂブロッキング抗体またはＩｇＧ対照と共に１時間インキュベートした。対照患者に由来するマクロファージでは、ｈＰＡＳＭＣ増殖は、抗ＰＤＧＦ－Ｂ前処置によって変化しなかったが、この前処置は、ＩＰＡＨまたはＳＳｃ－ＰＡＨマクロファージによって馴化した培地によって誘導されたｈＰＡＳＭＣの増殖を有意に阻害した（図６Ｄ）。

次に、類似のアプローチを使用して、ｈＰＡＳＭＣの遊走に及ぼすマクロファージ馴化培地およびその中のＰＤＧＦ－Ｂの効果を調べた。ボイデンチャンバーの上部から、前処置した馴化培地を含有する下のチャンバーへと向かうｈＰＡＳＭＣの遊走を、増殖研究と同様に抗ＰＤＧＦ－ＢまたはＩｇＧ対照抗体によって評価した。ＩｇＧ対照前処置について、ＩＰＡＨまたはＳＳｃ－ＰＡＨマクロファージからの馴化培地は、対照マクロファージからの馴化培地と比較してそれぞれ、遊走を３．０±０．８または４．２±０．８倍誘導した。さらに、ＩｇＧ前処置と比較すると、抗ＰＤＧＦ－Ｂ前処置は、ＩＰＡＨまたはＳＳｃ－ＰＡＨマクロファージ馴化培地によるｈＰＡＳＭＣ遊走を約４０～５０％低減させた。これに対し、対照ヒトからの馴化培地のＰＤＧＦ－Ｂ前処置は、ｈＰＡＳＭＣ遊走に影響を及ぼさなかった。

ｓｉＰＤＧＦ－βのナノ粒子送達は低酸素誘導ＰＨを減弱させる
実験的ＰＨにおける骨髄系由来ＰＤＧＦ－Ｂの重要性およびｈＰＡＳＭＣに及ぼすＰＡＨ患者のマクロファージからのＰＤＧＦ－Ｂの誘導効果を実証した後、肺マクロファージにおけるこのリガンドを、ポリ（アミン－ｃｏ－エステル）［ＰＡＣＥ］ポリマーおよびＰＤＧＦ－β ｓｉＲＮＡから形成されたナノ粒子を送達することによって、薬理学的に下方調節した。以前の研究では、類似のナノ粒子が、粒子を内部移行させる細胞におけるタンパク質発現の持続的なサイレンシングが可能であることが示された。最初に、色素ＤｉＤを負荷した５０％ラクトンを含む酸末端を有する（ポリ（ペンタデカラクトン－ｃｏ－ｎ－メチルジエタノールアミンｃｏ－セバケート）（ＰＰＭＳ－５０ＣＯＯＨ）で構成される直径４００または２００ｎｍのナノ粒子を、野生型マウスに経口気管内投与し、１２時間後にフローサイトメトリー分析を使用して、マクロファージマーカーＣＤ６４を発現する肺細胞による取り込みを評価した（図７Ａ）。直径４００および２００ｎｍの両方のナノ粒子に関して、ＣＤ６４^＋細胞の大部分がＤｉＤ標識された（ＢＡＬＦでは＞９９％および残存肺では約９２％）。同様に、ＣＤ６４^＋であったＤｉＤ標識細胞のパーセントは、ＢＡＬＦにおいて直径４００および２００ｎｍの粒子に関して高く同等であった（それぞれ、９５±１％および９３±３％）；しかし、残存肺では、これらのパーセンテージは４００ｎｍ粒子では８６±１％であり、２００ｎｍ粒子では６２±１％に低下した（図７Ｃ）。このため、全てのさらなる実験を、直径４００ｎｍのナノ粒子で行った。取り込みを確認するために、単離されたＢＡＬＦ細胞を、ＤｉＤ標識ナノ粒子と共に６時間培養したところ、これらの細胞は、核周囲蛍光を示した。

次に、ＰＤＧＦ－βを標的化するｓｉＲＮＡを負荷したナノ粒子が、マウス肺に及ぼす低酸素曝露の効果を改善するか否かを評価した。ＰＤＧＦ－β ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドは、Ｓｃｒ ＲＮＡ処置と比較して、ＢＡＬＦ細胞にトランスフェクトするとＰＤＧＦ－βレベルを９１±１％低減させたことからこれを使用した。このｓｉＰＤＧＦ－βまたはＳｃｒ ＲＮＡを負荷したナノ粒子を、低酸素の開始時および最大２１日間の低酸素曝露の間に週に２回、経口気管内投与した。低酸素での３日目または２１日目に、肺全体におけるＣＤ６４^＋ＬｙｓＧ^－マクロファージであった細胞のパーセントは、２つのナノ粒子型によって処置したマウスの間で差がなかった（図７Ｂ～Ｃ）。次に、最大のＰＤＧＦ－βレベルの時点である３日目でのマクロファージＰＤＧＦ－β ＲＮＡレベルに及ぼすｓｉＰＤＧＦ－β－ナノ粒子の効果を決定した（図２Ａ、Ｂを参照されたい）。ｓｉＰＤＧＦ－βを負荷したナノ粒子は、肺マクロファージＰＤＧＦ－βレベルを８６±１１％低減させた（図７Ｃ）。最後に、２１日間の低酸素曝露の間のｓｉＰＤＧＦ－β－ナノ粒子処置は、遠位肺細動脈筋性動脈化、ＰＨ、ＲＶＨ、および筋線維芽細胞の蓄積を顕著に減弱させた（図７Ｄ～Ｆ）。

考察
ＳＭＣ系列の増大は、多様な心血管疾患における重要な要因としてますます認識されつつある；しかし、これらの病的な状況ならびに正常な血管発達の間に、ＥＣ以外の細胞型によるＳＭＣの非細胞性の自律的調節を理解することは未だ達成されていない。マクロファージを含む食細胞は、自然免疫系およびＰＨを含む多様な心血管疾患の病因の両方において根本的な役割を果たしている。胚発生期間の間に、胎児マクロファージ前駆細胞が正常な肺に動員され、マクロファージへと分化し、その後これらの常在マクロファージは、局所増殖によって維持される。これに対し、ＰＨでは、増加した単球が肺血管系および血管周囲領域に見出され、肺マクロファージを生じる。血管ＳＭＣおよび肺マクロファージは、ＰＨにおけるまぎれもなく重要な細胞型であるが、極めて重要な未解決の問題は、肺マクロファージがこの状況においてＳＭＣを調節するか否かおよびどのように調節するかという点である。本明細書において、ＰＨのマウスモデル、ならびにＩＰＡＨおよびＳＳｃ－ＰＡＨ患者からのヒトマクロファージによる本発明者らの研究は、マクロファージ由来ＰＤＧＦ－Ｂが病的なＳＭＣ増大およびＰＨを誘導することを実証し、それによってマクロファージ由来ＰＤＧＦ－Ｂをこのパラダイムにおける重要な因子として確立する。その上、本発明者らのナノ粒子由来ＰＤＧＦ－β ｓｉＲＮＡに関する知見は、興味深い治療アプローチとなる。

気管内に投与されたクロドロネート含有リポソームは、以前に、ラットにおいて肺胞マクロファージを枯渇させ、低酸素誘導ＰＨおよびＲＶＨを低減させることが示されている。本明細書において、本発明者らは、マウスにおけるそのような処置が、残存肺ならびにＢＡＬＦ中のマクロファージを低減させ、同様に遠位筋性動脈化および血行力学変化も減弱させることを実証する（図１）。このアプローチは、短期間の慢性的に枯渇しているマクロファージでは有益であるが、自然免疫におけるその不可欠な役割を考えると現実的ではない。このように、好ましい戦略は、特異的マクロファージ由来遺伝子産物を標的化することである。

これらの考え方に沿って、ＰＤＧＦは、ＰＨの病因に広く関与している。ヒトＩＰＡＨでは、リガンドＰＤＧＦＡ、ＰＤＧＦ－Β、ならびに受容体ＰＤＧＦＲＡおよびＰＤＧＦＲＢのｍＲＮＡレベルは、小さい肺血管において上方調節されており、ＰＤＧＦＲ－βタンパク質は、肺全体の溶解物において増加している。下流のＰＩ３ＫおよびＰＬＣ－ガンマシグナル伝達の媒介に欠陥を有するタンパク質をコードするノックイン変異体Ｐｄｇｆｒｂを有するマウスは、低酸素誘導肺血管リモデリング、ＰＨ、およびＲＶＨを鈍化させた。動脈管の子宮内部分的結紮によってＰＨを誘導した胎児仔ヒツジモデルでは、抗ＰＤＧＦ－Ｂアプタマーを肺動脈に注入すると、肺血管リモデリングの重症度を半分におよびＲＶＨを３分の２だけ低減する。その上、全般的ＰＤＧＦ－β^{（＋／－）}マウスは、低酸素誘導遠位肺細動脈ＳＭＣを欠如するが、ＰＤＧＦ－βのＥＣ特異的欠失は、遠位筋性動脈化を低減するが完全には防止しない。本明細書において、本発明者らは、マウスを低酸素に曝露すると、肺胞および残存肺マクロファージによるＰＤＧＦ－βの発現が顕著に上方調節され（３日目の低酸素によって）、およびＬｙｓＭ－Ｃｒｅ、ＰＤＧＦ－β^{（ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ）}マウスが、遠位筋性動脈化およびＰＨを実質的に減弱させたことを実証する。興味深いことに、これらの低酸素マウスではＲＶＨの低減傾向があるが、これらの変異体では酸素正常状態下でのＲＶ重量比が増加傾向にあるために、統計学的有意性に達しない。実際に、遺伝子型によって層別化したＲＶＨにおける低酸素誘導増加は、ＰＤＧＦ－β欠失によって約５０％低減する。基礎条件下でＲＶ重量比が増加する傾向の説明は不明であるが、本発明者らは、骨髄系細胞由来ＰＤＧＦ－Ｂが、正常な発達および／または維持の際にＲＶ質量を制限し得ることを示唆する。

このデータは、肺マクロファージ由来ＰＤＧＦ－Ｂが、ＰＨにおいて重要な役割を果たすことを示している；しかし、この細胞型におけるＰＤＧＦ－Ｂ発現の調節はあまり理解されていない。マウスを低酸素に曝露すると、肺ＥＣは、ＨＩＦ１－α依存的にＰＤＧＦ－βレベルを増加させ、本明細書において、骨髄系細胞Ｈｉｆ１ａまたはＨｉｆ２ａの欠失が、対照マウスと比較して肺マクロファージにおけるＰＤＧＦ－βレベルを低減させることが見出された。データは、骨髄系細胞におけるＨｉｆ１ａ欠失が低酸素誘導ＰＨから保護することを示している。加えて、ＬｙｓＭ－Ｃｒｅ、Ｈｉｆ２ａ^{（ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ）}マウスは、住血吸虫誘導ＰＨから保護され、結果は、これらのマウスが同様に低酸素誘導ＰＨを減弱させたことを示している。補完的なＨＩＦ機能獲得研究（すなわち、骨髄系Ｖｈｌ欠失）は、肺マクロファージＨＩＦが、正常酸素圧条件下で細胞の自律的ＰＤＧＦ－β発現、遠位筋性動脈化、ＰＨ、およびＲＶＨを誘導するために十分であることを示唆している（図３）。このように、マクロファージにおけるＨＩＦ誘導ＰＤＧＦ－Ｂは、血管リモデリングの低酸素応答および血行力学変化にとって不可欠であると考えられる。

これらの知見は、遠位細動脈筋性動脈化と同様に、低酸素の肺において、肺マクロファージが肺胞筋線維芽細胞の蓄積を誘導すること（図１）、および骨髄系由来ＰＤＧＦ－β、Ｈｉｆ１ａおよびＨｉｆ２ａがこのプロセスにとって極めて重要であること（図２、４、５）を実証する。肺筋線維芽細胞は、生後初期のマウスにおける正常な肺胞形成の間の肺胞中隔形成において重要な役割を果たすが、その後成体の肺ではこれらの細胞は非常にまれである。線維症疾患では、筋線維芽細胞は、過剰な細胞外基質の多くの生成に関与し、マクロファージは、筋線維芽細胞を動員および活性化する線維症促進因子を分泌する。これに対し、低酸素誘導肺胞筋線維芽細胞の調節における単球／マクロファージの役割は、これまで報告されていない。ＰＤＧＦＲ－β^＋細胞は、肺において低酸素誘導筋線維芽細胞の４０％より多くを生じるが（R. Chandran, I. Kabir, A. Sheikh, ELH and DMG、非公表データ）、ＳＭＡ^＋細胞は、供給源のわずか約２０％である。これらの結果は、ＰＤＧＦＲ－β^＋ＳＭＡ^－である肺周皮細胞が、ＰＨにおける重要な細胞型であることを示唆している他の研究と一致する。

ＳＳｃ患者のおよそ１０～１５％がＰＡＨを発症し、ＰＡＨは、これらの患者における主な死因である。実際に、３年生存率は、ＩＰＡＨ患者の８４％と比較してＳＳｃ－ＰＡＨではわずか４９％であると推定される。この高い死亡率に寄与する１つの要因は、ＩＰＡＨ患者と比較してＳＳｃ－ＰＡＨにおける標準的な抗ＰＡＨ処置に対する変異応答である。加えて、抗ＰＤＧＦＲ－β免疫組織化学染色は、ＩＰＡＨ患者と比較してＳＳｃ－ＰＡＨ患者では小さい血管において増強される。循環中の単球の数は、これらのＰＡＨ患者集団の間で差がない；しかし、結果は、これらの単球に由来するマクロファージでは、対照ヒトと比較して、ＰＤＧＦ－βレベルが、ＩＰＡＨ患者よりもＳＳｃ－ＰＡＨにおいて増強されることを示している。加えて、ＰＡＨ患者のこれらの２つのクラスからのマクロファージは、主にＰＤＧＦ－Ｂ依存的にＳＭＣの増殖および遊走を誘導する。２５年前に公開された研究は、ＰＤＧＦ－Ｂタンパク質レベルが、対照のそれと比較して一般的なＳＳｃ患者（すなわち、ＰＨに関して評価されていない患者）のＢＡＬＦ中で増加することを報告した。このように、マクロファージ由来ＰＤＧＦ－Ｂを標的化する戦略は、ＰＡＨにおいて有効性を有し得る。

イマチニブは、がんにおける適用に関してＢＣＲ－ＡＢＬ、ｃ－ＫＩＴ、ＰＤＧＦＲ－αおよび－βに対して活性を有するチロシンキナーゼ阻害剤である。イマチニブを毎日注射すると、ラットにおけるモノクロタリンによるまたはマウスにおける慢性低酸素による肺血管リモデリング、ＰＨ、およびＲＶＨを逆転させる。残念なことに、これらの肯定的な結果は、Ｉｍａｔｉｎｉｂ ｉｎ Ｐｕｌｍｏｎａｒｙ Ａｒｔｅｒｉａｌ Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ、ａ Ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ Ｅｆｆｉｃａｃｙ Ｓｔｕｄｙ（ＩＭＰＲＥＳ）におけるＰＡＨ患者に外挿されなかった。全体として患者の９４％が、この経口イマチニブ研究を中止し、硬膜下血腫を含む重篤かつ予想外の有害作用が一般的であった。しかし特に、イマチニブによって長期間維持することができたＩＭＰＲＥＳの患者は、改善された機能クラスおよび６分間歩行距離を示した。これらの結果は、肺の特定の細胞型（例えば、マクロファージ）における特定の経路（例えば、ＰＤＧＦ－Ｂ媒介性）を標的化する抗ＰＨ治療の必要性をさらに強調する。

ＰＤＧＦ－βを標的化するｓｉＲＮＡを負荷した経口気管内投与したＰＰＭＳポリマー製剤化ナノ粒子は、マクロファージ由来ＰＤＧＦ－βを実質的に下方調節し、低酸素誘導遠位肺細動脈筋性動脈化、ＰＨ、およびＲＶＨを防止する。これらのナノ粒子は、肺マクロファージによって特異的かつ広範に食作用を受ける。以前の研究から、プロスタサイクリンアナログおよびシルデナフィルを含む、ヒトＰＡＨにおいて有効性を有する薬剤を有するナノ粒子の気管内または静脈内送達が、実験的齧歯類モデルにおいてＰＨを減弱させることが示されている。この状況におけるナノ粒子媒介ＲＮＡ干渉に関する唯一の以前の報告は、ＳＭＣを直接標的化することをねらいとするアンチセンスオリゴヌクレオチドマイクロＲＮＡ（抗ｍｉＲ）－１４５の静脈内送達が、ラットにおける低酸素／Ｓｕｇｅｎ－５４１６誘導ＰＨを緩和させることを実証した；しかし、肺に加えて、この抗ｍｉＲは、肝臓、脾臓、および腎臓に蓄積する。ｓｉＲＮＡを負荷したナノ粒子を経口気管内投与する本明細書のアプローチは、これが肺マクロファージにおける選択的遺伝子産物を特異的かつ強力に標的化することから有利であり、それによって望ましくない効果を制限するために有望である。さらに、ＰＰＭＳポリマー製剤化ナノ粒子は、非毒性で、生分解性であり、そのカーゴを分解から保護する。

まとめると、実験モデルならびにヒトＰＡＨ患者から単離した細胞による研究は、マクロファージによるＰＤＧＦ－ＢのＨＩＦ調節発現が、ＳＭＣリモデリング、ＰＨ、およびＲＶＨにおいて主要な役割を果たすことを実証する。さらに、肺マクロファージにおけるＰＤＧＦ－βのナノ粒子媒介サイレンシングは、集中的なさらなる研究を保証する治療戦略である。

要約：
結果は、ＰＡＣＥナノ粒子が、経口（または肺）投与後に肺マクロファージおよび単球における選択的取り込みを提供したことを示す。

結果はまた、ＰＤＧＦ－βの阻害剤のこの送達方法が、ＰＨの処置において有効であったことを確立する。

図１Ａ～１Ｆは、ＢＡＬＦおよび残存肺からのマクロファージが低酸素曝露によって増加することを示している。マウスは、酸素正常状態または低酸素（１０％ＦｉＯ_２）に０～２１日間曝露した。ＣＤ６４＋Ｌｙ６Ｇ－マクロファージを、ＢＡＬＦからＦＡＣＳによって単離し、ＰＤＧＦ－βに関するｑＲＴ－ＰＣＲに供した。同様に、ＣＤ６４＋Ｌｙ６Ｇ－マクロファージを、残存肺から単離し、ＰＤＧＦ－β ｍＲＮＡレベルを評価した。

図２Ａ～２Ｆは、マクロファージ枯渇が肺高血圧症に対して保護的であることを示す。マウスを、酸素正常状態または低酸素（１０％ＦｉＯ_２）に２１日間曝露し、同時にクロドロネートまたはビヒクルを負荷した経口気管内リポソームを週に２回投与した。クロドロネート処置は、低酸素マウスにおける右心室収縮期圧（ＲＶＳＰ；肺動脈収縮期圧に等しい）およびＦｕｌｔｏｎ指数によって示されるように、遠位動脈筋性動脈化を低減させた。

図３Ａ～３Ｄ、４Ａ～４Ｆ、および５Ａ～５Ｆに示すように、低酸素は、ＢＡＬＦおよび残存肺のマクロファージにおいてＰＤＧＦ－βを誘導する。ＬｙｓＭ－Ｃｒｅ系列では、ＰＤＧＦ－βまたはＨｉｆ２ａ欠失は、低酸素誘導遠位筋性動脈化およびＰＨを減弱させ、Ｖｈｌ欠失は、自然発生ＰＨを誘導する。

骨髄系細胞におけるＰＤＧＦ－βおよびＨｉｆ２ａ欠失は、ＰＨに対して保護するが、Ｖｈｌ欠失は、正常酸素圧条件下でＰＨをもたらす。マウスを、表記のように低酸素または酸素正常状態に曝露した。Ｃｒｅを有しないまたはＬｙｓＭ－Ｃｒｅを有し、そしてＰＤＧＦ－β、Ｈｉｆ２ａまたはＶｈｌのｌｏｘＰ導入対立遺伝子を有するマウスからの遠位細動脈を有する肺切片を、ＳＭＣ（アルファ－平滑筋アクチン［ＳＭＡ］）および内皮細胞（ＥＣ；ＭＥＣＡ－３２）のマーカーに関して染色した。

ヒトＰＨ患者からの骨髄系細胞は、増加したＰＤＧＦ－βレベルを有し、これはＳＭＣの増殖および遊走を誘導する。

図６Ａ～６Ｅは、特発性および強皮症ＰＡＨ患者におけるマクロファージ由来ＰＤＧＦ－Ｂが、ＳＭＣの増殖および遊走を促進することを示す。ヒトマクロファージを、酸素正常状態または低酸素（３％Ｏ２）下で１２時間培養した後、対照およびＰＡＨ患者からのマクロファージ中のＰＤＧＦ－β ｍＲＮＡを、ｑＲＴ－ＰＣＲによって測定した。ＢｒｄＵアッセイを、患者または対照培養培地（ＣＭ）と共に培養したヒト肺動脈ＳＭＣについて実施した。抗ＰＤＧＦ－ＢブロッキングＡｂまたは対照ＩｇＧをＣＭに加えた。ボイデンチャンバーの上部にＳＭＣを加え、下部に抗ＰＤＧＦ－Ｂ ＡｂまたはＩｇＧのいずれかを含むＣＭを加えた遊走アッセイを使用して、対照と比較して遊走した細胞を定量した。

図７Ａ～７Ｆは、骨髄系細胞におけるＰＡＣＥナノ粒子（ＮＰ）媒介ＰＤＧＦ－βノックダウンが、ＰＨを減弱させることを示す。マウスを、酸素正常状態または低酸素に曝露し、スクランブル（Ｓｃｒ）ＲＮＡまたはＰＤＧＦ－β標的化ｓｉＲＮＡを負荷したＮＰを同時に投与した。ＦＡＣＳによって単離したＣＤ６４＋Ｌｙ６Ｇ－マクロファージを、ＰＤＧＦ－β ｍＲＮＡに関するｑＲＴ－ＰＣＲに供した。遠位細動脈を含む肺切片を、ＳＭＡおよびＣＤ３１（ＥＣマーカー）に関して染色した。ＲＶＳＰおよびＦｕｌｔｏｎ指数を測定した。肺マクロファージへのナノ粒子送達ｓｉＰＤＧＦ－βは、低酸素誘導遠位筋性動脈化、ＰＨ、およびＲＶＨを減弱させる。

したがって、結果は以下を確立する：
１．ＰＨは、ＰＤＧＦ－βを肺に投与することによって処置または防止することができる；および
２．ＰＡＣＥポリマーで形成されたナノ粒子を使用して肺マクロファージおよび単球における薬剤の選択的取り込みを達成することができる。

他のものを定義していない限り、本明細書で使用した全ての科学技術用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般的に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書で引用した刊行物およびそれらが引用する材料は、具体的に、参照により本明細書に組み込まれる。

当業者は、単なる通常の実験を使用して、本明細書に記載される本発明の特定の実施形態に対する多くの均等物を認識するまたは確認することができる。そのような均等物は、以下の特許請求の範囲に包含されると意図される。

Claims (20)

1. マクロファージおよび単球などの肺免疫細胞に選択的に送達するための送達製剤であって、以下の式：
   

   

   を有するポリマーを含む、平均直径が１００～５００ｎｍの間、好ましくは２００～４００ｎｍの間であるナノ粒子を含み、式中、
   ｎは、１～３０の整数であり、ｍ、ｏ、およびｐは、独立して１～２０の整数であり、ｘ、ｙ、およびｑは、独立して１～１０００の整数であり、Ｒｘは、水素、置換もしくは非置換アルキル、または置換もしくは非置換アリール、または置換もしくは非置換アルコキシであり、ＺおよびＺ’は、独立してＯまたはＮＲ’であり、式中、Ｒ’は、水素、置換もしくは非置換アルキル、または置換もしくは非置換アリールであり、
   Ｒ_１およびＲ_２は、ヒドロキシル基、第一級アミン基、第二級アミン基、第三級アミン基、またはその組合せを含有する化学実体である、
   送達製剤。
2. Ｒ１および／またはＲ２が
   

   

   ではない、請求項１に記載の製剤。
3. 前記ポリマーが、核酸を含有するポリプレックスまたはその粒子の形態である、請求項１に記載の製剤。
4. Ｒ１および／またはＲ２が：
   

   

   からなる、請求項３に記載の製剤。
5. 前記ポリマーが、式ＩＩ：
   

   

   の構造を有し、式中、Ｊ_１およびＪ_２は、独立して連結部分であるか、または存在せず、
   Ｒ_３およびＲ_４は、ヒドロキシル基、第一級アミン基、第二級アミン基、第三級アミン基、またはその組合せを含有する置換アルキルである、
   請求項１に記載の製剤。
6. 前記ポリマーが式ＩＩＩ：
   

   

   の構造を有する、請求項１に記載の製剤。
7. 前記ポリマーが、狭い多分散性ポリスチレン標準を使用するゲル浸透クロマトグラフィーによって測定される場合、約２，０００ダルトン～２０，０００ダルトンの間、好ましくは約２，０００ダルトン～約１０，０００ダルトンの間、最も好ましくは約２０００ダルトン～約７，０００ダルトンの間の重量平均分子量を有する、請求項１に記載の製剤。
8. 前記ナノ粒子が、治療剤、予防剤、または診断剤を含む、請求項１～７のいずれかに記載の製剤。
9. 前記薬剤が、肺障害または疾患の処置、防止、または診断のためのものである、請求項８に記載の製剤。
10. 前記薬剤が、ＰＤＧＦ－βの阻害剤である、請求項８に記載の製剤。
11. 前記薬剤が、タンパク質もしくはペプチド、糖もしくは炭水化物、脂質、リポタンパク質もしくはリポ多糖類、核酸分子、または２０００ダルトン未満の分子量を有する小分子である、請求項８に記載の製剤。
12. エアロゾルとして、点滴注入、ネブライザー、インヘラー、人工呼吸器、または呼吸用マスクにより、またはドライパウダーとして投与するために製剤化される、請求項８に記載の製剤。
13. 前記薬剤が、前記薬剤を、全身ではなく呼吸系に局所送達するための量で存在する、請求項８に記載の製剤。
14. 有効量の請求項８～１３のいずれかに記載の製剤を投与することを含む、処置を必要とする個体を処置するための方法。
15. ＰＤＧＦ－βの阻害剤が、肺高血圧症を有する個体に投与される、請求項１４に記載の方法。
16. 前記個体が、うっ血性心不全を有する、請求項１４に記載の方法。
17. 前記個体が肺線維症を有する、請求項１４に記載の方法。
18. 前記個体が肺がんを有する、請求項１４に記載の方法。
19. 前記個体が、急性呼吸窮迫症候群を有するまたは発症するリスクを有する、請求項１４に記載の方法。
20. 前記個体が、ＣＯＶＩＤ－１９などのウイルス疾患を有する、請求項１４に記載の方法。