KR20230043529A - 식방풍 잎 추출물을 유효성분으로 함유하는 각막손상 예방, 개선 또는 치료용 조성물 - Google Patents
식방풍 잎 추출물을 유효성분으로 함유하는 각막손상 예방, 개선 또는 치료용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 식방풍 추출물, 이의 분획물 또는 이로부터 분리된 화합물을 유효성분으로 함유함으로써, 각막의 상처 치료에 있어 그 회복속도를 향상시키고 각막 세포 보호 효과를 나타낼 수 있는 각막손상의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및, 각막손상의 예방 또는 개선용 기능성 식품에 관한 것이다
Description
본 발명은 식방풍 추출물의 천연소재로서의 신규 용도에 관한 것으로, 상세하게는 식방풍 추출물을 유효성분으로 함유하는 각막손상의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및, 각막손상의 예방 또는 개선용 기능성 식품에 관한 것이다.
컴퓨터를 비롯한 휴대용 영상기기 보급, 및 스마트 폰의 대중화가 이루어진 정보화 사회 속에서 눈에 가해지는 부담은 성별 및 나이를 불문하고 더욱 증가되고 있으며, 이에 따라 눈의 건강 관리 또한 갈수록 중요하게 여겨지고 있다. 영상매체의 증가 속에서 최근에는 고령자에서 흔하다고 알려진 건성안의 증상을 젊은 성인에서도 호소하는 경우가 점차 늘어나는 경향을 보이고 있으며, 또한, 최근 콘텍트렌즈 사용의 증가와 미세먼지에 노출되는 시간이 길어짐에 따른 부작용으로 각막손상을 겪는 환자도 증가하고 있다.
안구 표면은 결막 상피세포와 각막 상피세포로 구성된 특수한 신체표면으로, 이들 세포들은 주눈물샘과 덧눈물샘으로부터 분비되는 눈물과 함께 건강한 안구 표면을 구성하고, 이러한 건강한 안구 표면은 안구의 최적 기능을 위한 필수적인 요소이다. 이 중 각막은 앞쪽 안구 표면의 1/6 부분을 차지하고 있는 투명하고 혈관이 없는 조직으로, 눈을 외부로부터 보호할 뿐만 아니라, 빛의 굴절과 전달에 주요한 기능을 하며 신경이 발달되어 있다. 각막은 각막상피, 보우만막, 각막실질, 데스메막, 각막내피와 같은 5개의 층으로 구성되어 있다. 각막상피세포는 전체 각막의 두께의 약 10%를 차지하며 결막의 상피와 이어져 있으며, 5~7층의 세포로 이루어져 있는데, 가장 아래층의 바닥세포가 증식하여 바깥쪽으로 밀려와 7~14일 후 탈락한다.
각막은 중심부 두께가 0.5mm 정도인 얇은 조직으로 심한 충격에 쉽게 파열될 수 있다. 안구의 각막 조직이 손상되는 증상인 각막 손상의 경우, 다양한 원인에 의하여 유발될 수 있으며, 예를 들면, 각막 화상이 가장 잘 알려져 있다. 각막 화상이 발생하게 되는 경우 조직 손상이 발생하고 이로 인하여 각막의 투명성 유지 능력에 장애가 발생하여 시력 저하로 이어져 삶의 질을 심각하게 훼손하게 된다. 또한, 실질적 치료 과정에서는 각막 손상으로 유발된 염증반응이 가장 문제가 되는데, 이는 활성산소종 및 염증성 캐스케이드 반응을 증가시켜 통증을 지속시키고, 염기성 섬유모세포 생장인자 등의 합성을 유도하여 각막 조직 내 콜라겐 구조에 이상을 주어 혼탁을 유발하게 된다.
따라서 상기 전술한 바와 같이 각막 손상 및 이에 따른 염증반응으로 인한 시력 손실은 전 세계적으로 문제가 되고 있는 대표적인 질환으로, 각막 손상 질환에 대하여 효과적이고 안전한 치료제 개발의 필요성이 요구되고 있다.
한편, 식방풍(갯기름나물, Peucedanum japonicum Thunb.)은 산형과에 속하는 다년생 식물로서 세계적으로 일본, 대만, 중국, 필리핀 등 동아시아의 해변에 자생하고 우리나라에서는 대개 제주도 해안, 서해안의 강하구나 바닷가 습지에 자생한다. 어린 순은 나물 등의 식용으로 사용되며, 향과 맛이 좋아 잎은 나물로 먹고 뿌리는 약용한다. 발한, 해열, 진통 작용이 있고, 감기로 인한 발열과 두통, 신경통, 중풍, 안면신경마비, 습진 등에 효능이 있는 것으로 알려져 있다.
본 발명은 식방풍 추출물, 이의 분획물 또는 이로부터 분리된 화합물을 포함하는 각막 손상의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 식방풍 추출물, 이의 분획물 또는 이로부터 분리된 화합물을 포함하는 각막 손상 예방 또는 치료용 약제학적 제제 및 예방 또는 개선용 기능성 식품을 제공하는 것을 다른 목적으로 한다.
본 발명의 일 측면에 따르면, 식방풍(Peucedanum japonicum Thunberg) 추출물, 이의 분획물 또는 이로부터 분리된 화합물을 유효성분으로 포함하되, 상기 화합물은 네오클로로겐산(neochlorogenic acid), 클로로겐산(chlorogenic acid) 및 크립토클로로겐산(cryptochlorogenic acid)으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나를 포함하는, 각막손상 예방 또는 치료용 조성물이 제공될 수 있다.
또한, 상기 식방풍 추출물은 식방풍 잎 추출물일 수 있다.
또한, 상기 식방풍 추출물은 물, 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올 및 이들의 혼합용매 중 어느 하나의 용매에 가용한 추출물일 수 있다.
또한, 상기 분획물은 식방풍의 물 추출물을 제 1 유기용매로 분획하고 물 및 유기 분획물을 분리하는 제 1단계; 상기 제 1단계에서 분리된 물 분획물을 제 2 유기용매로 분획하고 물 및 유기 분획물을 분리하는 제 2단계; 상기 제 2단계에서 분리된 물 분획물을 제 3 유기용매로 분획하고 물 및 유기 분획물을 분리하는 제 3단계; 및 상기 제 3단계에서 분리된 물 분획물을 제 4 유기용매로 분획하고 물 및 유기 분획물을 분리하는 제 4단계; 를 포함하는 분리방법으로 분리되는, 상기 제 4단계에서 분리된 물 분획물을 포함할 수 있다.
또한, 상기 분획물은 식방풍 물 추출물을 헥산(n-Hexane), 클로로포름, 에틸아세테이트 및 부탄올 용매로 순차 분획하여 얻어지는 물 분획물, 부탄올 분획물 또는 이들의 혼합물을 포함할 수 있다.
또한, 상기 물 분획물 및 상기 부탄올 분획물의 혼합물은 혼합물에 포함되는 상기 물 분획물의 비율이 상기 부탄올 분획물의 비율 이상이 되도록 혼합될 수 있다.
또한, 상기 각막손상은 스티븐슨-존슨 증후군, 쇼그렌 증후군, 안구건조 증후군, 안구 외상, 포도막염, 각결막 상피 장해 및 외인성 안구 질환으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나에 의한 것일 수 있다.
또한, 상기 각막손상은 안구 수술, 각막 이식 수술, 콘택트 렌즈 착용, 미세먼지, 화학물질, 열 및 방사선으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나에 의하여 유발된 것일 수 있다.
본 발명의 다른 측면에 따르면, 상기 조성물을 포함하는 각막손상 예방 또는 치료용 약제학적 제제가 제공될 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 식방풍(Peucedanum japonicum Thunberg) 추출물, 이의 분획물 또는 이로부터 분리된 화합물을 유효성분으로 포함하되, 상기 화합물은 네오클로로겐산(neochlorogenic acid), 클로로겐산(chlorogenic acid) 및 크립토클로로겐산(cryptochlorogenic acid)으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나를 포함하는, 각막손상 예방 또는 개선용 기능성 식품이 제공될 수 있다.
또한, 상기 식방풍 추출물은 식방풍 잎 추출물일 수 있다.
또한, 상기 식방풍 추출물은 물, 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올 및 이들의 혼합용매 중 어느 하나의 용매에 가용한 추출물일 수 있다.
또한, 상기 분획물은 식방풍 물 추출물을 헥산(n-Hexane), 클로로포름, 에틸아세테이트 및 부탄올 용매로 순차 분획하여 얻어지는 물 분획물, 부탄올 분획물 또는 이들의 혼합물을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 측면에 따른 식방풍 추출물, 이의 분획물 또는 이로부터 분리된 네오클로로겐산(neochlorogenic acid), 클로로겐산(chlorogenic acid) 및 크립토클로로겐산(cryptochlorogenic acid)으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 화합물을 포함하는 조성물은 각막상피세포의 이동을 유도함으로써 각막의 상처 치료에 있어 그 회복속도를 향상시킬 수 있다. 이를 통하여, 각막손상의 예방 또는 치료용 약제학적 제제로 유용하게 사용될 수 있다.
또한, 각막손상으로 발생하는 세포 내 활성산소종의 영향 및 염증반응으로 인한 세포사멸을 저감 시킬 수 있어, 각막 세포의 기능을 보호하는 효과를 나타낼 수 있다.
또한, 세포독성을 나타내지 않아 인체에 대한 안전성이 우수하고, 구강섭취로도 전술한 효과를 나타낼 수 있으므로 각막손상을 예방, 개선 또는 억제하기 위한 기능성 식품으로 적용되기 적합하다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 식방풍 잎 추출물의 각막상피세포 상처치유 개선 효과를 확인한 것이고,
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 식방풍 잎 추출물이 각막 상피세포의 항산화 유전자 mRNA 발현에 미치는 영향을 확인한 것이고,
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 식방풍 잎 추출물이 UPM 노출하에서 각막손상의 회복에 미치는 영향을 확인한 것이고,
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 식방풍 잎 추출물 섭취가 UPM 노출하에 손상에서 회복중인 각막에 미치는 조직학적 변화를 확인한 것이고,
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 식방풍 잎 추출물 섭취가 UPM 노출하에 손상에서 회복중인 각막 내 면역학적 변화에 미치는 영향을 확인한 것이고,
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 식방풍 잎 추출물 섭취가 UPM 노출하에 손상에서 회복중인 각막 내 세포사멸(apoptosis)에 미치는 영향을 확인한 것이고,
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 식방풍 잎 추출물의 용매 분획 및 오픈 컬럼 크로마토그래피를 통한 분획 스킴의 일 예를 도시한 것이고,
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 식방풍 잎 추출물의 각 분획물별 HPLC결과 및 각막 상피세포에서의 상처치유 효과를 확인한 결과를 나타낸 것이고,
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 식방풍 잎 추출물의 각 분획물별로 각막 상피세포의 세포생존에 미치는 영향을 확인한 것이고,
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 식방풍 잎 추출물의 HPLC 크로마토그램(아래) 및 네오클로로제닉 산(neochlorogenic acid), 클로로제닉 산(chlorogenic acid) 및 크립토클로로제닉 산(cryptochlorogenic acid)을 스탠다드 컴파운드로 하는 HPLC 크로마토그램(위)이고,
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따른 식방풍 잎 추출물의 물 분획 및 부탄올 분획의 혼합물이 각막 상피세포에서의 상처치유에 미치는 효과를 확인한 결과를 나타낸 것이고,
도 12는 본 발명의 일 실시예에 따른 식방풍 잎 추출물의 물 분획의 HP-20 오픈 컬럼 크로마토그래피 및 그로부터 얻어진 각 획분이 각막 상피세포에서의 상처치유에 미치는 효과를 확인한 결과를 나타낸 것이고,
도 13은 본 발명의 일 실시예에 따른 식방풍 잎 추출물의 물 분획을 HP-20 오픈 컬럼 크로마토그래피를 수행하여 얻어진 각 획분이 각막 상피세포의 세포생존에 미치는 영향을 확인한 것이고,
도 14는 본 발명의 일 실시예에 따른 식방풍 잎 추출물에 함유된 유효성분이 각막 상피세포에서의 상처치유에 미치는 효과를 확인한 결과를 나타낸 것이고,
도 15는 본 발명의 일 실시예에 따른 식방풍 잎 추출물에 함유된 유효성분이 각막 상피세포의 세포생존에 미치는 영향을 확인한 것이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 식방풍 잎 추출물이 각막 상피세포의 항산화 유전자 mRNA 발현에 미치는 영향을 확인한 것이고,
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 식방풍 잎 추출물이 UPM 노출하에서 각막손상의 회복에 미치는 영향을 확인한 것이고,
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 식방풍 잎 추출물 섭취가 UPM 노출하에 손상에서 회복중인 각막에 미치는 조직학적 변화를 확인한 것이고,
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 식방풍 잎 추출물 섭취가 UPM 노출하에 손상에서 회복중인 각막 내 면역학적 변화에 미치는 영향을 확인한 것이고,
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 식방풍 잎 추출물 섭취가 UPM 노출하에 손상에서 회복중인 각막 내 세포사멸(apoptosis)에 미치는 영향을 확인한 것이고,
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 식방풍 잎 추출물의 용매 분획 및 오픈 컬럼 크로마토그래피를 통한 분획 스킴의 일 예를 도시한 것이고,
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 식방풍 잎 추출물의 각 분획물별 HPLC결과 및 각막 상피세포에서의 상처치유 효과를 확인한 결과를 나타낸 것이고,
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 식방풍 잎 추출물의 각 분획물별로 각막 상피세포의 세포생존에 미치는 영향을 확인한 것이고,
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 식방풍 잎 추출물의 HPLC 크로마토그램(아래) 및 네오클로로제닉 산(neochlorogenic acid), 클로로제닉 산(chlorogenic acid) 및 크립토클로로제닉 산(cryptochlorogenic acid)을 스탠다드 컴파운드로 하는 HPLC 크로마토그램(위)이고,
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따른 식방풍 잎 추출물의 물 분획 및 부탄올 분획의 혼합물이 각막 상피세포에서의 상처치유에 미치는 효과를 확인한 결과를 나타낸 것이고,
도 12는 본 발명의 일 실시예에 따른 식방풍 잎 추출물의 물 분획의 HP-20 오픈 컬럼 크로마토그래피 및 그로부터 얻어진 각 획분이 각막 상피세포에서의 상처치유에 미치는 효과를 확인한 결과를 나타낸 것이고,
도 13은 본 발명의 일 실시예에 따른 식방풍 잎 추출물의 물 분획을 HP-20 오픈 컬럼 크로마토그래피를 수행하여 얻어진 각 획분이 각막 상피세포의 세포생존에 미치는 영향을 확인한 것이고,
도 14는 본 발명의 일 실시예에 따른 식방풍 잎 추출물에 함유된 유효성분이 각막 상피세포에서의 상처치유에 미치는 효과를 확인한 결과를 나타낸 것이고,
도 15는 본 발명의 일 실시예에 따른 식방풍 잎 추출물에 함유된 유효성분이 각막 상피세포의 세포생존에 미치는 영향을 확인한 것이다.
본 발명은 식방풍(Peucedanum japonicum Thunberg) 추출물, 이의 분획물 또는 이로부터 분리된 화합물을 유효성분으로 포함하는 각막손상 예방 또는 치료용 조성물, 약제학적 제제 및 각막손상 예방 또는 개선용 기능성 식품에 관한 것이다.
이하, 본 발명에 대해 보다 상세히 설명한다.
본 발명의 조성물은 식방풍 추출물을 유효성분으로 포함한다. 본 발명에서 이용되는 식방풍 원료는 식방풍의 뿌리, 줄기, 열매 또는 잎일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 바람직하게는, 식방풍의 잎일 수 있다. 이를 통상의 방법에 의하여 절단, 건조 및 분쇄하여 추출을 위한 원료로 이용할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 추출물은 원료로부터 임의의 방법으로 추출된 물질을 의미하며, 이렇게 추출된 추출액, 이로부터 얻을 수 있는 농축액, 상기 농축액의 건조물 및 분말을 제한 없이 모두 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 추출물은 당업계에서 조추출물(crude extract)로 통용되는 의미를 갖지만, 광의적으로는 추출물을 추가적으로 분획(fractionation)한 분획물도 포함한다. 즉, 추출물은 추출용매를 이용하여 얻은 것뿐만 아니라, 여기에 정제과정을 추가적으로 적용하여 얻은 것도 포함한다. 예를 들어, 추출물을 일정한 분자량 컷-오프 값을 갖는 한외 여과막을 통과시켜 얻은 분획, 다양한 크로마토그래피에 의한 분리 등, 추가적으로 실시된 다양한 정제 방법을 통해 얻어진 분획도 추출물에 포함된다.
상기 식방풍 추출물의 분리방법은 특별히 한정되지 않으며, 추출물을 제조하기 위해 통상적으로 이용하는 열수추출, 실온 추출, 가온 추출 및 초음파, 초임계 등 다양한 방법을 이용할 수 있다. 바람직하게는 추출 용매를 처리하여 추출한 후 감압 농축하거나 상기 추출 용매 추출물에 대해 각종 유기용매, 예를 들면 헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트 또는 부탄올로 추가 분획할 수 있으며, 분획 후 각종 크로마토그래피로 추가 정제될 수도 있다.
상기 추출용매로는 극성 용매 또는 비극성 용매를 이용할 수 있다. 상기 극성 용매로는 예를 들면, 물, 알코올, 아세트산, DMFO(dimethyl-formamide) 및 DMSO(dimethyl sulfoxide)로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나를 이용할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 알코올로는 예를 들면, 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올, 노말-프로판올, 이소-프로판올, 노말-부탄올, 1-펜탄올, 2-부톡시에탄올 및 에틸렌글리콜로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나를 이용할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 비극성 용매로는 예를 들면, 아세톤, 아세토나이트릴, 에틸 아세테이트, 메틸 아세테이트, 플루오로알칸, 펜탄, 헥산, 2,2,4-트리메틸펜탄, 데칸, 사이클로헥산, 사이클로펜탄, 디이소부틸렌, 1-펜텐, 1-클로로부탄, 1-클로로펜탄, o-자일렌, 디이소프로필 에테르, 2-클로로프로판, 톨루엔, 1-클로로프로판, 클로로벤젠, 벤젠, 디에틸 에테르, 디에틸 설파이드, 클로로포름, 디클로로메탄, 1,2-디클로로에탄, 어닐린, 디에틸아민, 에테르, 사염화탄소 및 THF로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나를 이용할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 식방풍 추출물은 물 또는 탄소수 1 내지 4의 알코올을 포함하는 극성용매에 가용한 추출물일 수 있다. 바람직하게는, 물에 가용한 추출물일 수 있다. 보다 바람직하게는, 식방풍 원료를 물을 용매로 이용하여 추출한 후 이를 제1 내지 제4 유기용매로 분획하여 얻어지는 분획을 포함할 수 있다. 이때, 상기 제 1 내지 제 4 유기용매는 서로 다른 유기용매일 수 있다. 본 발명의 바람직한 일 실시예에 따른 식방풍 추출물은 식방풍 원료를 물을 용매로 이용하여 추출한 후 이를 헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트 및 부탄올 용매로 순차 분획하여 얻어지는 물 분획물, 부탄올 분획물 또는 이들의 혼합물을 포함할 수 있다. 여기에서, 상기 물 분획물 및 부탄올 분획물의 혼합물은, 제조되는 혼합물에서 상기 물 분획물의 비율이 상기 부탄올 분획물의 비율 이상이 되도록 혼합될 수 있다.
본 발명의 일 측면에 따른 식방풍 추출물은 네오클로로겐산(neochlorogenic acid), 클로로겐산(chlorogenic acid) 및 크립토클로로겐산(cryptochlorogenic acid)으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 화합물을 포함할 수 있다. 상기 네오클로로겐산은 하기 화학식 1로 표시될 수 있고, 상기 클로로겐산은 하기 화학식 2로 표시될 수 있고, 상기 크립토클로로겐산은 하기 화학식 3으로 표시될 수 있다.
본 발명의 일 측면에 따른 식방풍 추출물은 각막손상의 예방 또는 치료에 이용될 수 있다. 본 발명에서 예방 또는 치료의 목표로 하는 각막손상은 안구의 각막 조직이 손상되는 증상이 동반되는 것이면 특별히 이에 제한되지 않으나, 구체적으로 스티븐슨-존슨 증후군, 쇼그렌 증후군, 안구건조 증후군, 외상, 안구 수술 또는 외인성 요소에 의한 안구 외상, 감염성 혹은 비감염성의 포도막염, 외인성질환 및 각결막 상피 장해로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나일 수 있다. 상기 안구 수술은 안구를 절개하는 수술이라면 특별히 한정되지 않으며, 예를 들면, 백내장 수술, 녹내장 수술, 망막 수술, 라식 수술 및 라섹 수술이 있다. 상기 외인성 요소는 화학물질, 열, 미세먼지 또는 방사선일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 외인성질환은 각막 이식수술 후 면역거부반응 및 콘택트 렌즈 착용에 의해 유발된 것일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 측면에 따른 식방풍 추출물을 포함하는 조성물은 손상되었거나 지속적으로 손상되고 있는 중인 각막에서 각막상피세포의 이동을 유도하여 각막 회복속도를 향상시킬 수 있다. 또한, 항산화 효소의 발현을 증가시킴으로써, 각막손상으로 발생하는 세포 내 활성산소종의 영향 및 염증반응으로 인한 세포사멸을 저감시키고 세포의 기능을 보호할 수 있다. 이러한 효과를 통하여, 각막손상에 대한 예방 또는 치료 효과를 나타낼 수 있다.
본 발명의 식방풍 추출물을 포함하는 조성물은 약제학적 제제로 제조될 수 있다. 본 발명의 약제학적 제제는 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체, 희석제 및 부형제로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나를 이용하여 제제화 함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수 있다. 상기 제제는 분산제 또는 안정화제를 더 포함할 수 있다.
필요에 따라, 상기 약제학적 제제는 약제학적으로 허용되는 담체를 더 포함할 수 있다. 상기 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 예를 들면, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일이 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
필요에 따라, 본 발명의 약제학적 제제는 상기 성분들 이외에 당업계에 공지된 첨가물을 더 포함할 수 있다. 예를 들면, 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 희석제, 가용화제, 결합제, 붕해제 및 보존제로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나를 더 포함할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 약제학적 제제는 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 피부 도포, 직장주입, 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등으로 투여할 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 조절될 수 있으며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물의 1일 투여량은 0.001㎎/㎏ 내지 10g/㎏, 바람직하게는 1㎎/㎏ 내지 1g/㎏일 수 있다. 필요에 따라 상기 투여량을 수회에 나누어 일정시간 간격으로 투여할 수 있다.
본 발명의 식방풍 추출물을 포함하는 조성물은 기능성 식품으로 제조될 수 있다. 상기 기능성 식품이란 식방풍 추출물을 음료, 차류, 향신료, 껌, 과자류 등의 식품소재에 첨가하거나, 캡슐화, 분말화, 현탁액 등으로 제조한 식품으로, 이를 섭취할 경우 건강상 특정한 효과를 가져오는 것을 의미하나, 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용 등이 없어 접근성이 용이한 장점이 있다.
필요에 따라, 본 발명의 기능성 식품은 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분, 예를 들면, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소 및 조미제를 포함할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 기능성 식품은 드링크제일 수 있다. 상기 드링크제는 향미제 또는 천연 탄수화물을 더 포함할 수 있다. 상기 천연 탄수화물은 모노사카라이드(예컨대, 글루코오스, 프럭토오스 등); 디사카라이드(예컨대, 말토스, 수크로오스 등); 올리고당; 폴리사카라이드(예컨대, 덱스트린, 시클로덱스트린 등); 및 당알코올(예컨대, 자일리톨, 소르비톨, 에리쓰리톨 등)로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나일 수 있다. 상기 향미제로는 천연 향미제(예컨대, 타우마틴, 스테비아 추출물 등) 및 합성 향미제(예컨대, 사카린, 아스파르탐 등)를 단독으로 또는 혼합하여 이용할 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 본 발명을 하기 실시예에 의거하여 좀 더 상세하게 설명한다. 단, 이들 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 첨부된 특허청구범위를 제한하는 것이 아니며, 본 발명의 범주 및 기술사상범위 내에서 실시예에 대한 다양한 변경 및 수정이 가능함은 당업자에게 있어서 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 특허청구범위에 속하는 것도 당연한 것이다.
실시예
<식방풍 추출물의 제조>
세절건조한 식방풍 잎 원료 1kg을 원료로 준비하고 100℃에서 4시간 동안 열수추출하여 조추출물을 제조한 후 그를 농축하여 식방풍 열수추출물을 제조하였다. 이를 식방풍 추출물로 이용하였다.
<식방풍 추출물의 각막 상피세포 상처치유 개선효과 확인>
인간 각막상피세포주 HCE(Human corneal epithelial cell)를 Dulbecco's modified Eagle's medium/Ham's F-12 (DMEM/F-12), 5% fetal bovine serum, 5 μg/mL insulin, 10 ng/mL epidermal growth factor, 0.5% DMSO, 1% Penicillin-Streptomycin이 포함된 배지에서 37℃, 5% CO2의 조건으로 배양하였다. HCE 세포가 90%정도 채워졌을 때 24 well plate (SPL)에 1.5 X 105 cells/well으로 분주하고 24시간 뒤, FBS 및 기타 보충물질이 없는 DMEM/F-12 배지에 100μg/ml 농도의 UPM과 시험물질인 식방풍 추출물(PJE)을 농도별로 처리하였다. 다시 24시간 뒤, 200P tip을 이용해 세로로 1자모양 스크래치를 유발하고 새 DMEM/F-12 배지로 교환한 뒤, 식방풍잎 추출물을 농도별로 동일하게 처리하였다. 처리 후 0시간대에 세포 모양을 현미경으로 촬영하고, 37℃, 5% CO2의 조건으로 24시간 배양하였다. 물질처리 후 24시간대에 세포 모양을 현미경으로 촬영하고 Image J 프로그램으로 0시간대와 24시간대의 스크래치 빈공간의 면적을 측정하여 상처치유 정도를 계산하였다. 현미경 촬영 결과는 도 1의 (A)에, 상처치유 정도를 계산한 결과는 도 1의 (B)에 나타냈다. 남은 세포는 mRNA 분석을 위해 사용하였다.
도 1을 참조하면, UPM에 의해 감소하였던 세포이동활성이 식방풍 추출물 (PJE) 처리농도에 따라 유의적으로 개선된 것을 확인할 수 있다. UPM에 의해 세포 생존률이 감소하였고, 식방풍 추출물 농도에 따른 변화는 나타나지 않았다. 식방풍 추출물 최고농도 300μg/ml에서 개선율이 감소하였는데, 세포 생존에는 영향이 없는 바, 세포독성을 갖지는 않으며, 증가한 농도에 따라 이동성을 억제하는 물질이 존재할 가능성이 있음을 확인하였다.
<식방풍 추출물의 각막 상피세포 항산화 효소 mRNA 발현 분석>
UPM에 의해 세포이동성이 감소하는 것에는 UPM에 의한 세포 내 활성산소종 생성에 따른 악영향이 주요한 원인 중 하나로 알려져 있기 때문에, 항산화 시스템을 담당하는 단백질의 mRNA 발현을 분석하였다. 상처치유 분석에 사용했던 HCE 세포를 trizol reagent(Invitrogen)로 lysis하고, chloroform을 1/5부피만큼 첨가한 뒤, 잘 섞어주고 14000 rpm, 15분, 4℃로 원심분리 하였다. 상등액을 분리하여 isopropanol과 1:1로 섞고, 14000 rpm, 15분, 4℃로 원심분리 하였다. 펠렛만 남기고 상등액을 제거한 뒤, 70% 에탄올로 씻어준 뒤, 14000 rpm, 5분, 4℃로 원심분리 하였다. 펠렛만 남기고 상등액을 제거한 뒤, 공기중에 10분간 말린 뒤, 멸균증류수로 펠렛을 녹여 세포 내 전체 RNA을 얻었다. Enzynomics사의 cDNA 합성키트를 사용하여 cDNA를 합성한 뒤, Enzynomics사의 Real-time PCR 키트를 사용하여 SOD1(Superoxide dismutase 1), CAT(Catalase), HO1(Heme oxygenase 1), GPX1(Glutathione Peroxidase 1) 유전자에 대한 실시간 중합연쇄반응을 실시하고 그 결과를 도 2에 나타냈다.
도 2를 참조하면, SOD1은 UPM에 의해 발현이 감소하였고, 추출물에 의해 개선되지 않는 것으로 확인되었다. CAT은 UPM에 의해 감소하였으나 추출물에 의해 발현이 증가하는 것으로 나타났다. HO1과 GPX1은 UPM 노출에 의해 약간 증가하였고, 추출물에 의해 유의적으로 발현이 더욱 증가하는 것으로 나타났다. 따라서, SOD1을 제외한 항산화 단백질들이 식방풍 잎 추출물에 의해 증가하여 세포의 기능을 보호하였을 것으로 여겨진다.
<식방풍 추출물이 랫드 UPM 노출하 각막손상 회복에 미치는 영향 확인>
5주령의 SD(Sprague-Dawley) 랫드를 1주일간 사육실에서 적응시킨 뒤, 군당 10마리씩 배정하여 각막손상을 유발하기 5일 전부터 식방풍 추출물을 각각 0, 25, 50, 100, 200, 400 mg/kg 농도로 하루에 한번씩 구강투여 하였다. 마찬가지로 5일 전부터 식염수에 녹인 UPM 5mg/ml을 10μl씩 하루에 4회, 오른쪽 눈에 점안하였다. 5일간의 전처리 후 케타민(50mg/kg)과 럼푼(5mg/kg) 혼합액을 랫드에 복강투여하여 마취한 뒤, Alger brush 기구를 사용하여 각막 상피에 4mm 지름으로 손상을 유발하였다. 곧바로 0.5% 플루오르세인 수용액 (Sodium fluorescein) 2μl를 안구에 점안하고 눈꺼풀을 5회 깜빡여준 뒤, 식염수로 2회 씻고, 염색된 손상부위를 형광카메라(OcuScience)로 촬영하였다. 손상유발 이후 8, 16, 24, 36, 48, 72시간대에 손상부위를 플루오르세인 수용액으로 염색하여 촬영하였으며, 랫드는 실험 종료시까지 1일 4회 UPM점안 및 1일 1회 식방풍 잎 추출물을 지속적으로 구강투여하였다. 손상부위가 염색된 이미지들은 Image J 프로그램으로 안구 경계면까지의 전체면적 대비 손상부위 면적의 비율을 계산하였으며, 그룹간의 차이를 시간대별로 계산하여 비교하고 그 결과를 도 3 및 표 1에 나타냈다. 도 3의 (B) 및 (C)는 각 시료의 36시간대 결과를 비교한 것이며, (C)의 5개의 각 실험군 시료는 우측으로 갈수록 식방풍 추출물의 고농도 처리군을 의미한다. 도 3에서, NL군은 정상안, NR군은 각막 손상 대조군으로, UPM이 처리되지 않은 정상쥐(Normal)의 정상 왼쪽눈 (Normal Left eye, NL)과 각막 손상만 유발한 오른쪽 눈 (Normal Right eye, NR)을 이용한 것이다. 물질처리가 없는 정상쥐의 두 눈을 각각 활용하여 실험에 쓰이는 동물 수를 저감하였다. 또한, 도 3에서 UPM군은 각막손상에 UPM 처리가 같이 이루어진 대조군이고, PJE군은 각막손상 및 UPM 처리가 같이 이루어진 군에 식방풍 추출물(PJE)을 농도별로 투여한 실험군으로 PJE군의 각 숫자는 투여 농도를 의미한다.
도 3 및 표 1을 참조하면, UPM군은 각막 손상의 회복이 정상군에 비해 느리게 진행되었으나 식방풍 추출물을 섭취한 모든 그룹에서는 회복속도가 개선되었고, 추출물의 농도 의존적인 회복 개선이 나타나는 것을 확인할 수 있었다.
<UPM 노출하에서 식방풍 추출물의 섭취가 손상에서 회복중인 각막에 미치는 조직학적 변화 확인>
전술한 실험에 이어서 본 실험을 수행하였다. 마지막 72시간대 플루오르세인 염색 촬영이 끝난 랫드는 마취상태에서 복부동맥을 절단하여 방혈하여 안락사 시키고 안구를 적출하였다. 안구는 10% 포르말린 수용액에 고정하였고, 각막을 분리하여 일반적인 조직처리 과정에 따라 단계별로 수세, 알콜(alcohol)과 자일렌(xylene)으로 탈수시킨 후 파라핀에 포매하였다. 마이크로톰(Leica)을 이용하여 4μm 조직절편을 만들고 헤마톡실린-에오신(Hematoxylin-Eosin, Sigma)으로 염색하여 광학현미경(Nikon)으로 관찰한 후 그 결과를 도 4에 나타냈다.
도 4를 참조하면, 정상군은 각막 손상 72시간 이후 약간의 잔여 염증세포 및 각막 상피의 회복이 관찰된다. 각막 손상 후 UPM에 지속적으로 노출되면, 각막 상피의 회복이 더디고 과도한 염증세포가 유입되었다. PJE를 농도별로 섭취한 그룹들은 농도에 따라 염증세포 유입이 감소하고, 각막 상피의 회복이 개선되었다(빨간색 화살표). UPM 군의 경우 각막 안쪽에서 유입되는 염증세포가 내피층에 붙어있는 증상도 관찰되는데, PJE 섭취군에서는 동도별로 감소되는 경향을 나타냈다(검은색 화살표).
<UPM 노출하에서 식방풍 추출물의 섭취가 손상에서 회복중인 각막 내 IL6(Interleukin 6) 발현에 미치는 영향 확인>
면역화학염색법으로 각막 내 IL6의 발현을 관찰하였다. 각막 절편을 자일렌, 알코올(고농도에서 저농도), 1x PBS 순으로 수화시킨 뒤, 0.1% triton X-100 수용액, 1x sodium citrate(SciTek) 수용액, 3% hydrogen peroxide 수용액에 순차적으로 10분씩 처리한 뒤, 블록킹 용액에 1시간 처리한 뒤, IL6 항체(Abcam)를 1:100으로 처리하고 4℃에 하룻밤 반응시켰다. 다음날 DAB(3,3'-diaminobenzidine tetrahydrochloride) 염색 키트(Dako)로 염색을 마무리한 뒤, 광학현미경(Nikon)으로 관찰하고 그 결과를 도 5에 나타냈다.
도 5를 참조하면, NR군은 IL6가 약간 증가하였고, UPM군은 크게 증가한 것으로 나타났다. 식방풍 추출물을 섭취한 군은 농도 의존적으로 IL6 발현이 감소하였다. 후술할 사멸세포 염색결과를 참고하면, IL6는 아직 생존한 염증세포에서 주로 발현이 나타나고 있었다. 각막의 두께는 각막 상피의 손상에 의해 유의적으로 두꺼워졌으나 UPM과 추출물 처리에 따른 변화는 없었다.
<UPM 노출하에서 식방풍 추출물의 섭취가 손상에서 회복중인 각막 내 세포사멸(apoptosis)에 미치는 영향 확인>
각막 절편을 각막 절편을 자일렌, 알코올(고농도에서 저농도), 1x PBS 순으로 수화시킨 뒤, 세포사멸 염색키트(Sigma)로 염색한 뒤, 형광현미경(Nikon)으로 관찰하였다. 사멸 세포의 분포는 세포핵의 면적 대비 사멸세포 면적을 Image J 프로그램으로 계산하였으며, 그 결과를 형광현미경 관찰 결과와 함께 도 6에 나타냈다.
각막 손상이 없어도 노화된 상피세포 일부는 죽고 새로운 세포로 채우는 과정이 일어난다. 도 6을 참조하면, NR군에서는 각막 손상에 의해 유입된 염증세포의 일부가 사멸되어 있는 것으로 나타났다. 이러한 과정은 정상적인 wound healing 과정으로, 사멸된 세포들은 점차 다른 식세포들에 의해 제거된다. UPM 처리군은 과도한 염증세포 유입으로 인해 사멸된 세포수도 증가되어 있으며, 식방풍잎 추출물에 의해 사멸세포 수가 감소한 것으로 나타났다. 이는 염증세포 및 염증인자의 감소로 인한 것으로 보인다.
<식방풍 추출물의 용매분획 및 분획물의 HCE 세포 상처치유에 미치는 영향 확인>
식방풍에서 상처치유에 효과적인 물질을 동정하고자 용매분획을 실시하였다. 동결건조한 식방풍잎 열수추출물 100g을 물에 녹인 뒤, n-hexane, chloroform, ethyl acetate, n-butanol 순으로 각각 1L씩 1:1로 섞어 3회씩 분리하였다. 이의 구체적인 일 실시예를 도 7에 도시하였다. 유기용매층과 물층이 분리되면 유기용매층은 분리하고 물층에는 다음 유기용매를 추가하여 2차 ~ 3차로 계속하여 분획을 수행하였다. 식방풍 추출물 및 각 분획별 HPLC 결과는 도 8의 (A)에 나타냈다.
각각의 분획물은 농축 및 동결건조하여 실험에 사용하였다. 각 분획물을 UPM과 함께 농도별로 HCE 세포에 처리하고 스크래치를 유발하여 상처치유 효과 여부를 실험하였다. 각 분획물별 세포이동성을 통해 상처치유 효과를 확인한 결과는 도 8에 나타내고, 각 분획물별 세포생존에 미치는 영향을 확인한 결과는 도 9에 나타냈다.
식방풍 추출물 HPLC결과 가장 큰 피크(peak) 셋은 각각 neochlorogenic acid, chlorogenic acid 및 cryptochlorogenic acid으로 확인되었다. 식방풍 추출물의 HPLC 크로마토그램 수행 결과를 neochlorogenic acid, chlorogenic acid 및 cryptochlorogenic acid을 스탠다드 컴파운드로 한 HPLC 크로마토그램 수행 결과와 대조하였으며, 이는 도 10에 나타냈다.
도 8을 참조하면, 분획 마지막 단계의 물 분획층에서 가장 좋은 세포이동성을 보이며, Hexane, chloroform, ethylacetate 층에서는 유의적 개선 효과가 없는 것으로 나타났다. BuOH, water 층의 1, 3μg/ml 농도에서 유의적 효과를 나타냈으며, 두 층 모두 고농도에서는 개선 효과가 약간 감소하였다. HPLC 결과와 같이 chlorogenic acid가 포함될수록 효과가 나타나는 것으로 보이나, BuOH층과 water층을 비교해보면 water층의 피크 크기가 작음에도 큰 효과를 나타낸 것으로 보아 세 chlorogenic acid를 제외한 피크가 많을수록 효과가 감소하는 것으로 예측되었다. 도 9를 참조하면, 각 분획물층별 세포 생존률에는 유의적 차이가 없는 것으로 나타났다.
BuOH층과 water층에 포함된 물질들과 migration을 개선시키는 효과 간의 상관관계를 간접적으로 분석하기 위해 BuOH층과 water층을 1:2, 1:1, 2:1 비율로 섞어서 각각 wound healing assay를 수행하고 그 결과를 도 11에 나타냈다.
도 11을 참조하면, BuOH층과 water층의 비율이 2:1, 1:1에서는 비슷한 효과를 나타냈다. 2:1 비율에서는 저농도에서 효과가 관찰되었으나 최대 효과가 감소하였고, 고농도에서는 효과가 사라졌다. 즉, BuOH 층의 비율이 낮거나 같을 때 효과가 좋았고, 비율이 높을때에는 효과가 감소하는 것으로 나타났다.
<식방풍 추출물의 물 분획층 오픈컬럼 크로마토그래피 및 HCE 세포 상처치유에 미치는 영향 확인>
식방풍 잎 추출물의 용매분획물 중 각막상피세포의 상처치유에 가장 우수한 개선 효과를 보인 물층을 세분화하기 위해 오픈컬럼 크로마토그래피를 실시하였다. 이의 구체적인 방법의 일 예는 도 7에 도시하였다. HP-20 레진으로 충진한 컬럼(6.5 × 52 cm; 250-850 
m particle size, IONTEC)에 물층 20g을 흡착시키고 H2O/MeOH (10:0, 8:2, 6:4, 2:8, 0:10 v/v, step-wise system, each 8 L)으로 순차적으로 용출시켜 분리하였다. 각 비율별로 용출된 획분들을 F0~F5으로 정하고 실험에 사용하였으며, 각각의 획분은 농축 및 동결건조하여 실험에 사용하였다. 각 획분을 UPM과 함께 농도별로 HCE 세포에 처리하고 스크래치를 유발하여 상처치유 효과 여부를 실험하고 그 결과를 도 12에 나타냈다. 각 획분별 세포생존에 미치는 영향을 확인한 결과는 도 13에 나타냈다.
도 12를 참조하면, F0에서는 chlorogenic acid 들의 peak가 관찰되지 않았고, 세포 이동성도 개선되지 않는 것으로 나타났다. F1, F2에서는 peak 크기에 따라 세포 이동성에 효과를 나타났다. F3 내지 F5에서는 chlorogenic acid peak가 관찰되지 않았고, 점차 이동성도 감소하였다. 도 13을 참조하면, F0 내지 F5 각 층별로 세포 생존률에는 영향을 미치지 않았기 때문에, 기타 peak에 세포이동성을 억제하는 물질이 포함되어 있을 것으로 여겨진다.
<식방풍 잎 추출물에 함유된 주요 유효성분인 3종의 chlorogenic acids가 HCE 세포 상처치유에 미치는 영향 확인>
앞선 결과에 따라 각막상피세포의 상처치유에 효과적인 물질이 식방풍잎 추출물에 포함된 3종의 chlorogenic acid(Neochlorogenic acid(NCA, TCI), Chlorogenic acid(CA, Sigma), Cryptochlorogenic acid(CCA, Cayman)) 화합물임을 확인하였기 때문에, 각각 정제물질을 구입하여 HCE 세포의 상처치유에 직접적으로 작용하는지 여부를 확인하기 위한 실험을 실시하였다. 실험 방법은 앞서 기술한 방법과 동일하게 실시하였으며, 각막상피세포에서 상처치유 효과를 확인한 결과는 도 14에, 세포생존에 미치는 영향을 확인한 결과는 도 15에 나타냈다. 3종의 각 화합물별로 독립적으로 또는 혼합된 경우 상처치유에 효과를 나타내는 농도를 확인한 결과는 표 2에 나타냈다. 표 2에서, CA mix는 3종을 모두 포함하는 혼합물을 의미한다. 각 혼합물은 각 화합물을 동량으로 혼합하여 제조하였다.
도 14, 도 15 및 표 2를 참조하면, Chlorogenic acid(CA), Cryptochlorogenic acid(CCA), Neochlorogenic acid(NCA) 세 물질 모두 세포 이동성을 개선시켰으며 세포생존률에 영향을 주지 않는 것으로 나타났다. 또한, 혼합 처리되는 경우, 각각 두 물질 또는 세 물질 전부 포함하여 처리할 경우 개선율이 더욱 증가하였다. 각 물질별로 NCA, CCA, CA 순으로 저농도에서부터 효과를 나타냈으며(EC50값 기준), 최대 효과(ECmax값 기준)는 CA, CCA, NCA 순으로 나타나는 경향을 보였다. 이러한 경향은 두 물질끼리 섞어 처리한 경우에도 나타나서 NCA가 포함된 경우 EC50, ECmax가 상대적으로 낮아서 보다 저농도에서 효과는 있었으나 최대 효과가 낮았으며, CA+CCA는 EC50은 높았지만 최대 효과 또한 유의적으로 높게 나타났다. 세 물질을 전부 포함하여 처리한 경우 EC50은 낮고 ECmax는 가장 높게 나타났다. 따라서, 세 물질을 전부 포함했을 때, 가장 좋은 효과를 나타냈다.
Claims (13)
- 식방풍(Peucedanum japonicum Thunberg) 추출물, 이의 분획물 또는 이로부터 분리된 화합물을 유효성분으로 포함하되,
상기 화합물은 네오클로로겐산(neochlorogenic acid), 클로로겐산(chlorogenic acid) 및 크립토클로로겐산(cryptochlorogenic acid)으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나를 포함하는, 각막손상 예방 또는 치료용 조성물.
- 제 1항에 있어서,
상기 식방풍 추출물은 식방풍 잎 추출물인, 각막손상 예방 또는 치료용 조성물.
- 제 1항에 있어서,
상기 식방풍 추출물은 물, 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올 및 이들의 혼합용매 중 어느 하나의 용매에 가용한 추출물인, 각막손상 예방 또는 치료용 조성물.
- 제 1항에 있어서,
상기 분획물은 식방풍의 물 추출물을 제 1 유기용매로 분획하고 물 및 유기 분획물을 분리하는 제 1단계;
상기 제 1단계에서 분리된 물 분획물을 제 2 유기용매로 분획하고 물 및 유기 분획물을 분리하는 제 2단계;
상기 제 2단계에서 분리된 물 분획물을 제 3 유기용매로 분획하고 물 및 유기 분획물을 분리하는 제 3단계; 및
상기 제 3단계에서 분리된 물 분획물을 제 4 유기용매로 분획하고 물 및 유기 분획물을 분리하는 제 4단계; 를 포함하는 분리방법으로 분리되는 상기 제 4단계에서 분리된 물 분획물을 포함하는, 각막손상 예방 또는 치료용 조성물.
- 제 1항에 있어서,
상기 분획물은 식방풍 물 추출물을 헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트 및 부탄올 용매로 순차 분획하여 얻어지는 물 분획물, 부탄올 분획물 또는 이들의 혼합물을 포함하는, 각막손상 예방 또는 치료용 조성물.
- 제 5항에 있어서,
상기 혼합물은 혼합물에 포함되는 상기 물 분획물의 비율이 상기 부탄올 분획물의 비율 이상이 되도록 혼합된 것인, 각막손상 예방 또는 치료용 조성물.
- 제 1항에 있어서,
상기 각막손상은 스티븐슨-존슨 증후군, 쇼그렌 증후군, 안구건조 증후군, 안구 외상, 포도막염, 각결막 상피 장해 및 외인성 안구 질환으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나에 의한 것인, 각막손상 예방 또는 치료용 조성물.
- 제 1항에 있어서,
상기 각막손상은 안구 수술, 각막 이식 수술, 콘택트 렌즈 착용, 미세먼지, 화학물질, 열 및 방사선으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나에 의하여 유발된 것인, 각막손상 예방 또는 치료용 조성물.
- 제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 포함하는 각막손상 예방 또는 치료용 약제학적 제제.
- 식방풍(Peucedanum japonicum Thunberg) 추출물, 이의 분획물 또는 이로부터 분리된 화합물을 유효성분으로 포함하되,
상기 화합물은 네오클로로겐산(neochlorogenic acid), 클로로겐산(chlorogenic acid) 및 크립토클로로겐산(cryptochlorogenic acid)으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나를 포함하는, 각막손상 예방 또는 개선용 기능성 식품.
- 제 10항에 있어서,
상기 식방풍 추출물은 식방풍 잎 추출물인, 각막손상 예방 또는 개선용 기능성 식품.
- 제 10항에 있어서,
상기 식방풍 추출물은 물, 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올 및 이들의 혼합용매 중 어느 하나의 용매에 가용한 추출물인, 각막손상 예방 또는 개선용 기능성 식품.
- 제 1항에 있어서,
상기 분획물은 식방풍 물 추출물을 헥산(n-Hexane), 클로로포름, 에틸아세테이트 및 부탄올 용매로 순차 분획하여 얻어지는 물 분획물, 부탄올 분획물 또는 이들의 혼합물을 포함하는, 각막손상 예방 또는 개선용 기능성 식품.
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