KR20230033541A - 개 개체식별 키트의 대립유전자 래더 제조 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 개의 개체식별을 위한 대립유전자 래더의 제조방법 및 제조된 대립유전자 래더를 이용한 개의 개체식별방법에 관한 것으로, 상세하게는 네스티드 PCR을 이용하여 FH2001, FH2309, PEZ21, FH2107, FH2328, PEZ05, FH3313, FH2017, FH3377, FH2004, FH2054, FH2088, FH2361, PEZ02, PEZ17, PEZ16, vWF.X 및 FH2010 유전자 마커별 STR(Short Tandem Repeat) 모티프 유전자위를 포함하는 대립유전자 단편을 수득하는 단계; 및 수득된 단편을 혼합하는 단계;를 포함함으로써, 개의 개체식별에 있어서 대립유전자 지정의 정확성을 높이고 데이터베이스 표준화에 적용되기 유용한 개의 개체식별용 대립유전자 래더의 제조방법 및 제조된 대립유전자 래더를 이용한 개의 개체식별방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 개의 개체식별을 위한 대립유전자 래더의 제조방법 및 제조된 대립유전자 래더를 이용한 개의 개체식별방법에 관한 것이다.
개(Canis lupus familiaris 또는 Canis familiaris)는 대한민국에서 가장 흔한 반려동물 중 하나이다. 농림축산식품부의 ‘2019년 동물보호에 대한 국민의식조사’에 따르면, 반려동물 양육 가구는 26.4%이며, 이 중 개를 기르는 가구는 83.9%에 달한다. 최근 개와 관련된 학대, 부상, 절도 등 형사 사건이 많이 발생되고 있는데, 이와 같은 사건들에서 개의 생물학적 증거물은 용의자와 사건현장을 연결 지을 수 있는 등 중요한 역할을 하기 때문에 범죄 현장에서 개와 관련된 생물학적 증거의 중요성이 증대되고 있다.
케이나인 키트(Thermo Scientific Canine Genotypes ™ Panel 2.1 Kit, Canine Kit)는 개의 개체 식별을 위한 법과학용 STR(Short Tandem Repeat) 기반 키트로, 개 생물학적 물질의 법과학 분석을 위해 특별히 설계된 최초의 상용 키트이다. 캘리포니아 대학에서 법과학 감정을 위한 개 DNA 분석을 표준화하는 것을 목표로 개발된 발명된 멀티플렉스 PCR 키트(multiplex PCR kit)이며, 법과학 및 친자감정용으로 사용할 수 있다.
그러나 제조업체가 제공하는 빈(bin) 세트는 특정 모세관 전기영동 설정에만 적합하며, 마커 당 1~2 개의 대립유전자만 있는 하나의 대조 DNA(control DNA)를 기준으로 모든 대립유전자를 정확하게 보간(interpolate)하는 것은 불가능한 문제가 있다. 또한 키트의 프라이머 정보는 독점적 정보로 공개되지 않았으며, 제조업체는 대립유전자 래더(allelic ladder)를 제공하지 않고 있는데, STR 분석 키트에 대립유전자 래더가 없다는 것은 재현성과 실험실 간 데이터베이스 공유에 영향을 미칠 수 있는 명백한 한계이다.
상세하게는, 이 키트는 모세관 전기 영동(Capillary electrophoresis, CE)을 사용하여 PCR 제품의 크기 기반 분리를 통해 개체를 식별한다. 대립유전자 래더가 없는 경우 PCR 산물(product)의 크기는 모세관 전기 영동이 수행되는 동안 시료 샘플과 함께 실행되는 내부 표준(size standard)의 크기를 기준으로 결정되며, 유전자형 분석의 정확도는 대립유전자 래더가 빈을 보정하여 전기영동을 수행할 때 나타나는 이동성의 차이를 개선할 수 있다. 그러나 케이나인 키트(Canine Kit)에는 대립유전자 래더는 포함되어 있지 않으며 제조업체의 지침에 따라 샘플의 대립유전자 크기를 키트에 포함된 대조 DNA의 알려진 크기와 비교할 것을 권장하고 있는데, 이 방법을 사용하면 실험실 조건에 따라 대립유전자 크기를 추정할 때마다 재현성에 차이가 발생하는 문제가 있다. 또한, 마커당 1~2 개의 대립유전자만 있는 단일 대조 DNA로는 케이나인 키트에 존재하는 많은 빈을 정렬하기에 충분하지 않고, 또 해당 키트의 마커에는 많은 미세 변이 대립유전자(microvarient allele)가 존재하기 때문에 하나의 대조 DNA만으로 데이터를 표준화하는 것은 거의 불가능한 한계가 있다.
이런 이유로, 주어진 샘플의 결과를 다른 모세관 전기 영동 조건에서 생성된 데이터베이스의 정보와 비교하는 것은 정확도가 떨어지는 문제가 있다. 따라서, 보다 정확한 분석을 위해 해당 키트와 함께 사용하기 위한 대립유전자 래더의 개발이 필요한 실정이다.
일반적으로 대립유전자 래더는 각 마커별 대립유전자를 단일 PCR(mono-PCR) 수행하여 얻은 증폭 산물을 조합하여 구축하게 된다. 이 때 대립유전자 래더 구축을 위한 프라이머는 샘플 테스트에 사용되는 프라이머와 동일한 것이 사용되는데, 케이나인 키트의 경우 프라이머 정보가 공개되어 있지 않으므로 이러한 일반적인 방법으로는 대립유전자 래더의 구축이 불가능하다.
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본 발명은 개의 개체식별을 위한 대립유전자 래더의 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 제조된 대립유전자 래더를 포함하는 개의 개체식별을 위한 조성물을 제공하는 것을 다른 목적으로 한다.
또한, 제조된 대립유전자 래더를 이용하는 개의 개체식별 방법을 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.
본 발명의 일 측면에 따르면, 개체로부터 하나 이상의 핵산 샘플을 수득하는 단계; FH2001, FH2309, PEZ21, FH2107, FH2328, PEZ05, FH3313, FH2017, FH3377, FH2004, FH2054, FH2088, FH2361, PEZ02, PEZ17, PEZ16, vWF.X 및 FH2010 유전자 마커별로 각 마커별 양쪽 끝 부위(flanking region)에 특이적으로 바인딩하는 프라이머들을 이용하여 1차 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행하는 단계; 증폭된 1차 중합효소연쇄반응 산물을 주형으로 하고 케이나인 키트(Thermo Scientific Canine Genotypes ™ Panel 2.1 Kit) 유래의 프라이머 세트를 이용하여 2차 중합효소연쇄반응을 수행하는 단계; 증폭된 2차 중합효소연쇄반응 산물을 모세관 전기영동하여 각 마커별 STR(Short Tandem Repeat) 모티프 유전자위를 포함하는 대립유전자 단편을 수득하는 단계; 및 수득된 단편을 혼합하는 단계; 를 포함하는, 개의 개체식별을 위한 케이나인 키트의 대립유전자 래더를 제조하는 방법이 제공될 수 있다.
또한, 상기 1차 중합효소연쇄반응을 수행하는 단계에서, 상기 프라이머들은 각 마커에 포함된 STR 모티프 유전자위로부터 50 내지 600bp 떨어진 위치에 바인딩하여 상기 STR 모티프 유전자위를 포함하는 핵산서열을 증폭시킬 수 있다.
또한, 상기 1차 중합효소연쇄반응을 수행하는 단계에서, 상기 유전자 마커별로 대응되는 프라이머들은 각각 FH2001 마커의 경우 서열번호 37 및 38, FH2309 마커의 경우 서열번호 39 및 40, PEZ21 마커의 경우 서열번호 41 및 42, FH2107 마커의 경우 서열번호 43 및 44, FH2328 마커의 경우 서열번호 45 및 46, PEZ05 마커의 경우 서열번호 47 및 48, FH3313 마커의 경우 서열번호 49 및 50, FH2017 마커의 경우 서열번호 51 및 52, FH3377 마커의 경우 서열번호 53 및 54, FH2004 마커의 경우 서열번호 55 및 56, FH2054 마커의 경우 서열번호 57 및 58, FH2088 마커의 경우 서열번호 59 및 60, FH2361 마커의 경우 서열번호 61 및 62, PEZ02 마커의 경우 서열번호 63 및 64, PEZ17 마커의 경우 서열번호 65 및 66, PEZ16 마커의 경우 서열번호 67 및 68, vWF.X 마커의 경우 서열번호 69 및 70, 및 FH2010 마커의 경우 서열번호 71 및 72의 서열을 가지는 프라이머들일 수 있다.
또한, 상기 수득된 단편을 혼합하는 단계는, 상기 증폭된 2차 중합효소연쇄반응 산물을 모세관 전기영동시 일정한 높이로 피크가 나타나도록 대립유전자 형 마커별로 혼합하는 단계; 각 마커별 혼합물을 모세관 전기영동시 일정한 높이로 피크가 나타나도록 같은 형광 물질 색깔별로 혼합하는 단계; 및 각 색깔별 혼합물을 모세관 전기영동시 일정한 높이로 피크가 나타나도록 하나로 혼합하는 단계; 를 포함하여 수행될 수 있다.
또한, 상기 수득된 단편을 혼합하는 단계에서, 성별 결정 유전자 마커에서 유래한 단편을 추가로 혼합시킬 수 있다.
본 발명의 다른 측면에 따르면, 개체로부터 하나 이상의 핵산 샘플을 수득하는 단계; FH2001, FH2309, PEZ21, FH2107, FH2328, PEZ05, FH3313, FH2017, FH3377, FH2004, FH2054, FH2088, FH2361, PEZ02, PEZ17, PEZ16, vWF.X 및 FH2010 유전자 마커별로 각 마커별 양쪽 끝 부위(flanking region)에 특이적으로 바인딩하는 프라이머들을 이용하여 1차 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행하는 단계; 증폭된 1차 중합효소연쇄반응 산물을 주형으로 하고, 상기 산물 내에서 상기 FH2001, FH2309, PEZ21, FH2107, FH2328, PEZ05, FH3313, FH2017, FH3377, FH2004, FH2054, FH2088, FH2361, PEZ02, PEZ17, PEZ16, vWF.X 및 FH2010 유전자 마커별로 각 마커별 STR 모티프 유전자위를 포함하는 서열을 증폭시킬 수 있는 프라이머 세트를 이용하여 2차 중합효소연쇄반응을 수행하는 단계; 및 증폭된 2차 중합효소연쇄반응 산물을 모세관 전기영동하여 각 마커별 STR(Short Tandem Repeat) 모티프 유전자위를 포함하는 대립유전자 단편을 수득하는 단계; 를 포함하는, 개의 개체식별용 대립유전자 래더를 제조하기 위한 대립유전자 단편을 수득하는 방법이 제공될 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 서열번호 37 내지 71의 서열을 가지는 프라이머를 포함하는, 개의 개체식별용 대립유전자 래더를 제조하기 위한 프라이머 세트가 제공될 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 상기의 방법으로 제조된 대립유전자 래더를 포함하는, 개의 개체식별용 조성물이 제공될 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 상기의 방법으로 제조된 대립유전자 래더를 이용하는, 개의 개체식별 방법이 제공될 수 있다.
또한, 케이나인 키트(Thermo Scientific Canine Genotypes ™ Panel 2.1 Kit)와 함께 적용될 수 있다.
본 발명의 일 측면에 따른 방법으로 구축되는 인하우스 대립유전자 래더는 개의 개체식별에 있어서 대립유전자 지정의 정확성을 높이고 데이터베이스 표준화에 적용되기 유용하다.
또한, 케이나인 키트(Canine Kit)와 함께 모세관 전기 영동(CE)을 사용한 STR 분석에 적용되는 경우 유전자형 결정에 있어 정확성을 향상시킬 수 있으며, 이를 통하여 개와 관련된 법과학 분석에서의 분석 정확도를 향상시킬 수 있다.
본 발명의 다른 측면에 따른 개의 개체식별 방법은 케이나인 키트를 사용한 유전자형 분석에 대립유전자 래더를 함께 적용함으로써, 종래 케이나인 키트로만 수행된 결과물보다 데이터 분석의 정확성 및 신뢰성을 현저히 향상시킬 수 있다.
도 1은 대립유전자 래더(allelic ladder)를 구축하기 위한 방법의 도식도를 도시한 것,
도 2는 대립유전자 래더 밸런스 과정의 일 예를 도시한 것,
도 3은 160개의 대립유전자 단편을 혼합하여 생성된 대립유전자 래더의 혼합물을 나타낸 것.
도 2는 대립유전자 래더 밸런스 과정의 일 예를 도시한 것,
도 3은 160개의 대립유전자 단편을 혼합하여 생성된 대립유전자 래더의 혼합물을 나타낸 것.
본 발명은 개의 개체식별을 위한 유전자 마커에 대하여 네스티드 PCR (nested PCR)을 수행하여 각 마커별 STR(Short Tandem Repeat) 모티프 유전자위를 포함하는 대립유전자 단편을 수득하고 그를 혼합하는 단계를 포함하는 개의 개체식별용 대립유전자 래더를 제조하는 방법, 이를 통해 제조된 대립유전자 래더를 포함하는 개의 개체식별용 조성물 및 그를 이용하는 개의 개체식별 방법에 관한 것이다.
개의 식별에 변별력을 가지는 케이나인 키트(Thermo Scientific Canine Genotypes ™ Panel 2.1 Kit, Canine Kit)에 포함되는 특정 유전자 마커에 포함되는 STR 모티프 유전자위를 선정하고, 그를 증폭하여 대립유전자를 검출해 대립유전자 래더(allelic ladder)를 적용하여 표준화된 유전자형을 결정할 수 있음을 확인하고 본 발명을 안출하였다.
다른 정의가 없다면 이 명세서에서 사용된 기술 및 과학 용어는 이 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 통상적으로 이해하는 의미로 해석될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 대립유전자 래더(allelic ladder)는 빈(bin)으로 설정된 범위 안에 위치하는 피크(peak)들을 하나의 숫자(대립유전자 크기 혹은 반복 수)로 표시되는 절대값으로 변환하여 주는 것을 의미한다.
이하, 본 발명에 대해 보다 상세히 설명한다.
본 발명의 일 측면에 따르면, 개의 개체식별용 키트의 대립유전자 래더를 제조하는 방법이 제공된다. 상기 대립유전자 래더는 개의 개체식별용 키트인 케이나인 키트에 포함되는 유전자 마커 중 적어도 하나 이상에 대해, 마커별 대립유전자 형의 핵산 서열로 이루어질 수 있다.
상기 유전자 마커는 FH2001, FH2309, PEZ21, FH2107, FH2328, PEZ05, FH3313, FH2017, FH3377, FH2004, FH2054, FH2088, FH2361, PEZ02, PEZ17, PEZ16, vWF.X 및 FH2010로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나를 포함할 수 있으며, 분석결과의 정확도를 향상시키기 위한 측면에서 5개 이상, 바람직하게는 10개 이상 포함하는 것이 좋다. 필요에 따라, 성별 결정 유전자 마커를 더 포함할 수 있다. 상기 성별 결정 유전자 마커는 X와 Y 염색체에 위치한 유전자 마커가 선택될 수 있다. 예를 들어, ZFX 또는 ZFY가 선택될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 유전자 마커는 개에서 유래한 것일 수 있다.
상기 FH2001 마커는 서열번호 1, 상기 FH2309마커는 서열번호 2, 상기 PEZ21 마커는 서열번호 3, 상기 FH2107 마커는 서열번호 4, 상기 FH2328 마커는 서열번호 5, 상기 PEZ05 마커는 서열번호 6, 상기 FH3313 마커는 서열번호 7, 상기 FH2017 마커는 서열번호 8, 상기 FH3377 마커는 서열번호 9, 상기 FH2004 마커는 서열번호 10, 상기 FH2054 마커는 서열번호 11, 상기 FH2088 마커는 서열번호 12, 상기 FH2361 마커는 서열번호 13, 상기 PEZ02 마커는 서열번호 14, 상기 PEZ17 마커는 서열번호 15, 상기 PEZ16 마커는 서열번호 16, 상기 vWF.X 마커는 서열번호 17, 그리고 상기 FH2010 마커는 서열번호 18의 서열을 각각 포함할 수 있다.
상기 유전자 마커는 각각 그 서열중에 STR 모티프 서열을 포함할 수 있다. 상세하게는, 상기 FH2001 마커는 서열번호 19, 상기 FH2309 마커는 서열번호 20, 상기 PEZ21 마커는 서열번호 21, 상기 FH2107 마커는 서열번호 22, 상기 FH2328 마커는 서열번호 23, 상기 PEZ05 마커는 서열번호 24, 상기 FH3313 마커는 서열번호 25, 상기 FH2017 마커는 서열번호 26, 상기 FH3377 마커는 서열번호 27, 상기 FH2004 마커는 서열번호 28, 상기 FH2054 마커는 서열번호 29, 상기 FH2088 마커는 서열번호 30, 상기 FH2361 마커는 서열번호 31, 상기 PEZ02 마커는 서열번호 32, 상기 PEZ17 마커는 서열번호 33, 상기 PEZ16 마커는 서열번호 34, 상기 vWF.X 마커는 서열번호 35, 그리고 상기 FH2010 마커는 서열번호 36의 서열을 갖는 STR 모티프 서열을 서열 내부에 포함할 수 있다.
대립유전자 래더를 구축하기 위한 상기 유전자 마커들의 대립유전자 단편은 네스티드 PCR(nested PCR)을 통해 수득될 수 있다. 상기 네스티드 PCR은 아우터 PCR(outer PCR)을 1차로 먼저 수행하고, 이너 PCR(inner PCR)을 2차로 수행하는 단계를 포함할 수 있다. 케이나인 키트에 포함되는 전술한 18개의 STR 마커 각각에 대한 아우터 프라이머(outer primer)를 디자인하고 이를 이용한 PCR를 수행하여 STR이 포함된 DNA 단편을 얻을 수 있으며, 얻어진 DNA 단편은 추후 수행될 이너 PCR 반응을 위한 주형 DNA로 사용될 수 있다. 이 때, 상기 이너 PCR 반응을 위한 프라이머로 서열이 알려지지 않은 케이나인 키트 프라이머 혼합물을 이용할 수 있다.
1차 반응인 아우터 PCR을 수행하기 위한 아우터 프라이머는 상기 유전자 마커에 대해 케이나인 키트 유래 프라이머 바인딩 위치가 산물에 모두 포함될 수 있도록 디자인될 수 있다. 상기 아우터 프라이머는 각 유전자 마커별로 서열의 5' 및 3' 양쪽 끝 부위(flanking region)에 특이적으로 바인딩하는 프라이머들일 수 있다. 바람직하게는, 상기 아우터 프라이머는 각 유전자 마커 서열내에 포함되는 STR 모티프 유전자위(site)의 일 말단으로부터 50 내지 600bp, 바람직하게는 100 내지 400bp, 보다 바람직하게는 200 내지 300bp 떨어진 위치에 바인딩하도록 디자인된 프라이머들일 수 있다. 상기 아우터 프라이머가 STR 모티프 유전자위로부터 50bp 미만으로 떨어진 위치에 바인딩하도록 디자인되는 경우에는 2차로 수행되는 이너 PCR에서 케이나인 유래 프라이머가 제대로 바인딩되지 않는 문제가 발생할 수 있고, 600bp 초과하여 떨어진 위치에 바인딩하도록 디자인되는 경우에는 2차로 수행되는 이너 PCR의 정확성이 저감되거나 PCR 과정 중 신장 스텝에 시간이 오래 걸리게 되는 문제가 발생할 수 있어 바람직하지 않다. 상기 아우터 PCR은 각 유전자 마커별로 수행되거나, 통합하여 한번에 수행될 수도 있다.
상기 아우터 PCR을 통해 생성되는 산물은 각 유전자 마커 내부에 포함된 STR 모티프 및 상기 케이나인 키트의 프라이머가 각각 바인딩하는 위치의 서열을 포함할 수 있다. 2차 반응인 이너 PCR은 상기 아우터 PCR를 통해 얻어진 산물을 주형으로 하고, 상기 산물 내에서 STR 모티프 유전자위를 포함하는 서열을 증폭시킬 수 있는 프라이머 세트를 이용하여 수행될 수 있다. 본 발명의 바람직한 일 실시예에서, 상기 이너 PCR은 상기 케이나인 키트에 포함되는 케이나인 키트 유래 프라이머 세트를 이용하여 수행될 수 있으며, 이 경우 케이나인 키트에 특이적인 래더를 제조할 수 있다. 아우터 PCR의 산물 내에 이너 PCR을 수행하기 위한 프라이머 세트가 바인딩하는 서열이 포함될 수 있으며, 이너 PCR의 산물은 아우터 PCR의 산물보다 작게 형성될 수 있다.
상기 이너 PCR의 산물을 모세관 전기영동(capillary electrophoresis)하여 각 유전자 마커별로 STR 모티프 유전자위를 포함하는 대립유전자 단편을 수득할 수 있다.
수득된 단편을 혼합하여 대립유전자 래더를 제조할 수 있다. 필요에 따라, 대립유전자 래더 제조시 성별 결정 유전자 마커에서 유래한 단편을 추가로 혼합시킬 수 있으며, 이 때, 상기 성별 결정 유전자 마커는 개 유래 DNA를 주형으로 PCR 증폭된 산물이거나 또는 인위적으로 합성되는 것일 수 있다. 대립유전자 래더를 제조하기 위한 혼합은, 각 마커의 대립유전자가 적절한 밸런스를 가질 수 있도록, 혼합되는 각각의 단편 또는 그를 포함하는 조성물의 비율을 조절하여 수행될 수 있다. 먼저, 이너 PCR을 통해 얻어진 산물을 모세관 전기영동시 일정한 높이로 피크가 나타나도록 대립유전자 형 마커별로 혼합하는 단계가 수행되고, 다음으로 각 마커별 혼합물을 전기영동시 일정한 높이로 피크가 나타나도록 같은 형광 물질 색깔별로 혼합하는 단계가 수행된 후, 다음으로 각 색깔별 혼합물을 전기영동시 일정한 높이로 피크가 나타나도록 하나로 혼합하는 단계가 순차적으로 수행될 수 있다.
각 유전자 마커의 대립유전자 단편을 조합하여 케이나인 키트와 함께 사용될 수 있는 인하우스 대립유전자 래더(in-house allelic ladder)를 제조할 수 있다. 구축된 인하우스 대립유전자 래더는 케이나인 키트에 포함되는 유전자 마커별 대립유전자 형을 결정할 수 있으며, 모세관 전기영동을 수행할 때 실행간 변이로 발생하는 오프 래더(off ladder, OL) 대립유전자 호출을 교정할 수 있다.
본 발명의 일 측면에 따른 방법으로 제조되는 대립유전자 래더는 대립유전자 지정 정확도를 향상시킬 수 있으며, 이를 통해, 개와 관련된 법과학 분석, 데이터베이스 공유 및 실험실 간 표준화에 우수한 신뢰성을 제공할 수 있다.
본 발명의 다른 측면에 따르면, 전술한 방법에 따라 제조되는 대립유전자 래더를 포함하는 개의 개체식별용 조성물이 제공된다. 본 발명의 일 측면에 따른 방법으로 제조되는 대립유전자 래더를 포함하는 조성물은 종래 식별용 키트인 케이나인 키트의 분석정확도를 높이기 위한 보조적 조성물로 케이나인 키트와 함께 적용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 전술한 방법에 따라 제조되는 대립유전자 래더를 이용하는 개의 개체식별 방법이 제공된다. 분석 대상 개체로부터 생체 시료를 분리하고, 분리된 시료에서 핵산을 수득하여 본 발명의 일 측면에 따른 방법으로 제조되는 대립유전자 래더를 적용함으로써 FH2001, FH2309, PEZ21, FH2107, FH2328, PEZ05, FH3313, FH2017, FH3377, FH2004, FH2054, FH2088, FH2361, PEZ02, PEZ17, PEZ16, vWF.X 및 FH2010 유전자 마커별 대립유전자 형을 결정할 수 있으며, 이를 통해 개체식별 정확도를 향상시킬 수 있다.
본 발명의 일 측면에 따른 대립유전자 래더를 이용할 경우, 개 유래 핵산을 대상으로 케이나인 키트만을 적용하여 분석을 실시하는 경우 발생하는 문제점, 예를 들면 분석기기의 종류 또는 모세관 전기영동시의 환경적 영향으로 나타나는 오차값 문제를 절대값 수치인 대립유전자 래더로 표준화 함으로써 데이터를 보정할 수 있으며, 이를 통해 분석기기의 종류 및 환경적인 영향으로 나타나는 해석의 오류를 제거할 수 있어 데이터 품질 및 정확도를 향상시킬 수 있다. 여기에서, 상기 절대값 수치로는 대립유전자 크기 또는 반복 수와 같은 것들이 사용될 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시하나, 이들 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 첨부된 특허청구범위를 제한하는 것이 아니며, 본 발명의 범주 및 기술사상 범위 내에서 실시예에 대한 다양한 변경 및 수정이 가능함은 당업자에게 있어서 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 특허청구범위에 속하는 것도 당연한 것이다.
실시예
<개 샘플의 수득>
수의학 검사 후 생성되는 혈액, 청각, 비강 및 구강 면봉 샘플을 국내 동물 병원에서 제공했다. 보호자의 동의 하에 26 품종 424 마리의 개로부터 샘플을 얻었으며, 얻은 샘플의 품종(breed) 및 개체수는 하기 표 1에 정리하였다.
| 품종 (Breed) | 개체수 |
| Bedlington Terrier | 2 |
| Bichon Frise | 19 |
| Cavalier King Charles Spaniel | 1 |
| Chihuahua | 21 |
| Cocker Spaniel | 51 |
| Coton de tulear | 1 |
| Dachshund | 1 |
| French Bulldog | 1 |
| Golden Retriever | 2 |
| Italian Greyhound | 3 |
| Lakeland Terrier | 1 |
| Maltese | 50 |
| Mix dog | 56 |
| Pekingese | 1 |
| Pomeranian | 42 |
| Pompitz | 1 |
| Poodle | 51 |
| Pug | 1 |
| Schnauzer | 7 |
| SharPei | 1 |
| Shetland Sheepdog | 2 |
| Shih Tzu | 50 |
| Spitz | 2 |
| Welsh corgi | 4 |
| West Highland White Terrier | 3 |
| Yorkshire Terrier | 50 |
| 계 | 424 |
QIAsymphony® SP(Qiagen, Hilden, Germany)와 QIAsymphony® DNA Investigator kit (Qiagen)를 사용하여 제조업체의 지침에 따라 면봉에서 DNA를 추출한 다음 4℃에 보관했다. DNA 정량화는 제조업체의 사양에 따라 Qubit® 2.0 Fluorometer (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)와 함께 Qubit ™ dsDNA HS 분석 키트 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)를 사용하여 수행되었다.
<케이나인 키트를 이용한 개체별 지노타이핑>
모든 STR 단편은 제조업체의 지침에 따라 Thermo Scientific Canine Genotypes ™ Panel 2.1 키트 (Thermo Fisher Scientific), 즉 케이나인 키트를 사용하여 생성되었으며, ABI 9700 GeneAmp PCR 시스템 (Thermo Fisher Scientific)을 사용하여 증폭되었다. 모세관 전기영동(CE)은 10μL Applied Biosystems Hi-Di Formamide (Thermo Fisher Scientific), 1μL PCR 산물 및 0.2μL Applied Biosystems Liz500 size standard (Thermo Fisher Scientific)을 혼합하여 수행되었다. 모든 샘플은 Applied Biosystems POP4 ™-polymer와 36cm 모세관 컬럼을 사용하여 ABI Prism 3500xl 유전자 분석기 (Thermo Fisher Scientific)에서 분리되었다. 형광 표지된 대립유전자 단편 크기는 GeneMapper® ID-X v.1.4 소프트웨어 (Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 결정되었다.
<케이나인 키트의 대립유전자를 위한 빈 세팅>
대립유전자 래더(allelic ladder)를 만들기 전에 빈(bin) 설정을 수행했다. 대립유전자 래더는 모세관 전기영동을 수행할 때 나타나는 실행 간 변동을 완화하고 결과의 정확도를 높이는 데 유용하다. 미지의 시료에 존재하는 대립유전자와 대립유전자 래더에 포함된 단편의 길이가 같으면 환경 변화의 유형에 관계없이 전기 영동 중에 동일한 거리로 이동한다. GeneMapper® ID-X 소프트웨어는 정확한 유전형 분석을 위해 실행 폴더 당 적어도 하나의 대립유전자 래더를 함께 실행하기를 추천하는데, 소프트웨어가 대립유전자 래더의 크기에 따라 빈 오프셋(bin offset)을 계산하여 빈(bin)을 보정하여 정확한 대립유전자 호출에 기여하기 때문이다. 따라서, 마커의 각 대립유전자에 대한 빈 설정이 대립유전자 래더를 구성하기 전에 수행되었다.
케이나인 키트(Canine Kit) 제조업체에서 제공하는 빈 셋(bin set) 파일은 미국 667마리 개 유전자형 데이터 평가를 통해 생성되었기 때문에, 한국 개의 유전형 결과와 일치하지 않아 조정이 필요했다. 먼저 연구에 사용된 424 마리의 한국 개에서 얻은 대립유전자 단편의 중간 크기(bp)를 계산하였다. 이를 바탕으로 GeneMapper® ID-X 소프트웨어에 대립유전자 중간 크기 범위를 입력하여 인하우스 빈 셋(in-house bin set)을 결정했다. 빈 너비는 얻은 대립유전자 크기의 중간값을 기준으로 1bp로 설정되었다. 연구에 사용된 시료에서 3회 미만으로 검출된 대립유전자는 빈 설정에서 제외되었다. 미세 변이 대립유전자(microvarient allele)은 0.6bp의 빈 너비가 설정되었다.
모든 424 마리의 시료는 18 개의 STR 마커 및 성별 결정 마커에 대한 완전한 유전형 프로파일을 산출했다. 이 샘플들로부터 0.98bp의 평균 빈 너비로, 총 225 개의 대립유전자 빈이 생성되었다. 대립유전자 명명은 방법 (POP4 ™-폴리머, 36cm 어레이)에 설명된 전기 영동 설정을 사용할 때 대립유전자 크기(bp)를 기반으로 설정되었다. 대립유전자는 빈도(allele frequency)와 각 대립유전자의 위치가 고려되어 선택되었다.
<인하우스 대립유전자 래더 구축>
본 발명에서 대립유전자 래더(allelic ladder)를 구축하기 위한 방법의 도식도를 도 1에 도시하였다. 아우터 PCR 프라이머는 Primer-BLAST를 사용하여 NCBI (National Center for Biotechnology Information) 데이터베이스에 등록된 개의 전체 게놈 서열을 기반으로 설계되었다. 염색체에서 각 마커의 위치와 STR 모티프는 기존 문헌 (비특허문헌 1 내지 4)을 참조하여 찾아 냈으며, 케이나인 키트의 증폭산물을 포함하도록 크게 아우터 PCR 프라이머 쌍을 디자인했다. 각 마커의 아우터 PCR에 대한 정방향 및 역방향 프라이머 결합 부위는 Wang Le 등이 보고 한 방법을 응용하여, STR 반복 부위에서 약 200 ~ 300bp 떨어진 flanking region에서 디자인되었다. 아우터 PCR 증폭 산물에는 케이나인 키트가 증폭시키는 각 마커의 core repeat site와 primer-binding site가 모두 포함되도록 하였으며, 이는 해당 키트를 사용한 아우터 PCR 산물의 성공적인 증폭으로 확인되었다. 아우터 PCR 산물을 시퀀싱하여 반복 모티프가 있음을 확인하였다.
디자인된 아우터 PCR 프라이머 쌍은 하기 표 2에 정리하였다. 하기 표 2에서, 증폭 산물 크기(amplicon size)는 NCBI 레퍼런스 시퀀스에 기반한 것이다.
| 마커 (Marker) |
프라이머 구분 (primer) |
서열 (5'-3') | 증폭 산물 크기 (bp) | 첨부번호 (Accession No.) |
| PEZ02 | Forward | 서열번호 63 | 334 | CP050603 |
| Reverse | 서열번호 64 | |||
| PEZ17 | Forward | 서열번호 65 | 669 | CP050572 |
| Reverse | 서열번호 66 | |||
| FH2017 | Forward | 서열번호 51 | 511 | CP050569 |
| Reverse | 서열번호 52 | |||
| FH2309 | Forward | 서열번호 39 | 687 | CP050628 |
| Reverse | 서열번호 40 | |||
| PEZ05 | Forward | 서열번호 47 | 673 | CP050578 |
| Reverse | 서열번호 48 | |||
| FH2001 | Forward | 서열번호 37 | 402 | CP050590 |
| Reverse | 서열번호 38 | |||
| FH2328 | Forward | 서열번호 45 | 621 | CP050580 |
| Reverse | 서열번호 46 | |||
| FH2004 | Forward | 서열번호 55 | 572 | CP050600 |
| Reverse | 서열번호 56 | |||
| FH2361 | Forward | 서열번호 61 | 692 | CP050619 |
| Reverse | 서열번호 62 | |||
| PEZ21 | Forward | 서열번호 41 | 484 | CP050574 |
| Reverse | 서열번호 42 | |||
| FH2054 | Forward | 서열번호 57 | 689 | CP050578 |
| Reverse | 서열번호 58 | |||
| FH3377 | Forward | 서열번호 53 | 658 | CP050599 |
| Reverse | 서열번호 54 | |||
| FH2107 | Forward | 서열번호 43 | 682 | CP050599 |
| Reverse | 서열번호 44 | |||
| FH2088 | Forward | 서열번호 59 | 917 | CP050569 |
| Reverse | 서열번호 60 | |||
| vWF.X | Forward | 서열번호 69 | 525 | CP050582 |
| Reverse | 서열번호 70 | |||
| FH2010 | Forward | 서열번호 71 | 671 | CP050588 |
| Reverse | 서열번호 72 | |||
| PEZ16 | Forward | 서열번호 67 | 855 | CP050582 |
| Reverse | 서열번호 68 | |||
| FH3313 | Forward | 서열번호 49 | 718 | CP050573 |
| Reverse | 서열번호 50 |
아우터 PCR을 위해 20μL PCR 혼합물은 0.2-0.25ng의 주형 DNA, 2μL의 Gold ST * R 10 × buffer (Promega, Madison, WI, USA), 2.5U AmpliTaq Gold DNA 중합 효소 (Thermo Fisher Scientific) 및 각 프라이머의 10 pmol으로 구성되었으며, 음성 대조군으로는 증류수를 사용하였다. 증폭은 다음 조건을 사용하여 ABI 9700 GeneAmp PCR 시스템에서 수행되었다 : 11 분 동안 95 ℃; 30초 동안 94℃, 30초 동안 59℃, 45초 동안 72℃의 30주기; 72℃에서 15분 동안 최종 신장.
증류수로 100 ~ 1000 배 희석된 아우터 PCR 산물은 케이나인 키트에 제공된 독점 multiplex 프라이머 혼합물과 함께 이너 PCR 반응을 위한 PCR 템플릿으로 사용되었다. 이너 PCR 조건은 변성-결합-신장주기로 수행하되 오리지널 30회가 아닌 24회로 수행된 것을 제외하고는 제조업체의 지침에 따라 수행되었다. 이것은 주형 DNA의 높은 농도로부터 야기되는 stutter의 증폭을 방지하기 위함이다. PCR 증폭 산물, 대립유전자 크기 및 상대 형광 단위 (RFU) 값은 전술한 바와 같이 ABI Prism 3500xl 유전자 분석기 및 GeneMapper® ID-X 소프트웨어를 사용하여 확인했다.
모세관 전기영동 결과를 기반으로 각 대립유전자 단편에 대해 마커 내 및 마커 간 피크 높이가 균형을 이루었다. 대립유전자 단편의 RFU 값과 DNA copy 수가 선형적으로 비례하는 것으로 추정되므로, 단일 PCR product의 RFU 값을 기준으로 사용했다. 대립유전자 래더의 피크(peak) 높이 균형은 이너 PCR 산물의 양을 조정하여 맞추었으며, 래더 밸런싱 과정을 도식화한 일 예를 도 2에 도시하였다. 특정 대립유전자에 대한 RFU 값이 매우 낮을 때는 이너 PCR 증폭에 사용될 아우터 PCR 산물의 희석 비율이 감소되었다.
아우터 PCR은 18 개의 STR 마커에 대해 모두 성공적으로 증폭된 것을 확인하였다. 이너 PCR은 아우터 PCR 산물을 주형 DNA로 이용하여 성공적으로 증폭되었으며, 궁극적으로 케이나인 키트로부터 얻어지는 대립유전자 단편과 동일한 단편을 생성하였다. 총 160 개의 대립유전자 단편을 섞은 대립유전자 래더가 생성되었으며, 이를 도 3에 도시하였다.
도 3을 참조하면, 피크 높이는 PCR의 주기와 주형 DNA의 희석 비율을 조정하여 최대한의 균형을 이루었다. 서로 다른 두 대립유전자의 크기가 비슷할 때 신호 강도는 일반적으로 비슷하다. 이번 실험에서는 부득이하게 두 대립유전자 간의 크기 차이가 큰 일부 이형 접합 대립유전자(allele)인 시료가 사용되었기 때문에 FH2004, FH3313 및 FH2309의 특정 마커에 대한 피크 균형을 맞추는 데 한계가 있었으나, 이러한 한계는 추가 시료확보를 통해 개선될 수 있다.
케이나인 키트에는 성별 결정 마커로써 Zinc finger 단백질인 ZFX 및 ZFY가 포함되어 있다. 이 유전자는 각각 X와 Y 염색체에 위치하며 다양한 동물의 성별 결정에 사용된다. 성별마커(ZFX/ZFY)의 경우, STR 모티프로 추정할 수 있는 STR 마커들과는 달리 아우터 PCR 프라이머를 디자인하는 데 한계가 있었다. NCBI에 등록된 개의 ZFX (AB622136, 837 bp) 및 ZFY (AB622147, 953 bp)의 전체 시퀀스를 참조하여 ZFX / ZFY의 아우터 PCR을 위한 다양한 프라이머를 설계한 결과 아우터 PCR은 성공적으로 증폭이 되었지만, 케이나인 키트 프라이머 혼합물을 사용한 이너 PCR에서는 DNA 단편을 생성하지 못했다. 모든 마커에 둘 이상의 대립유전자가 있는 경우에만 대립유전자 래더(allelic ladder)가 GeneMapper® ID-X 소프트웨어에서 제대로 작동할 수 있다. 따라서 대립유전자 래더에 사용된 ZFX / ZFY 프라이머는 424 마리의 개로부터 얻어진 ZFX / ZFY의 대립유전자 크기에 가깝도록 설계되었다. 즉, 이러한 단편은 케이나인 키트 ZFX / ZFY의 증폭 프라이머에 의해 생성된 단편과 다르기 때문에 서열에도 차이가 있다.
<인하우스 대립유전자 래더의 유효성 검증>
이전에 유전형이 지정된 424개 시료 중 무작위로 선택된 20개와 케이나인 키트와 함께 제공된 대조 DNA(control DNA)를 대상으로, 전술한 모세관 전기영동 조건 하에서 모세관 전기 영동을 수행했다. 인하우스 대립유전자 래더(In-house allelic ladder)를 사용하였을 때 대립유전자 호출에 대한 개선을 확인하기 위해, 대립유전자 래더가 있을 때와 없을 때의 유전형 결과를 비교했다. 재현성을 평가하기 위해 실험실에서 사용할 수 있는 총 4 개의 ABI Prism 3500xl 유전자 분석기를 사용하여 모세관 전기 영동을 수행했다.
인하우스 대립유전자 래더의 유효성을 검증하기 위해 동일한 20개의 샘플 세트와 대조군 DNA를 4개의 서로 다른 3500xl 유전자 분석기를 사용하여 크기를 분리했다. GeneMapper® ID-X 소프트웨어에 대립유전자 래더가 지정되지 않은 경우, 샘플의 유전자형은 사전 설정된 빈에 의해 결정되었다. 이 실험을 통해 얻은 케이나인 키트 대조 DNA 프로필(n=18)을 표 3에, GeneMapper® ID-X 소프트웨어를 이용한 결과에서 확인된 대립유전자 콜링의 차이를 표 4에 나타냈다.
| 마커 (Marker) |
대립유전자a (Allele a) |
미드포인트 (Midpoint) |
범위 (Range) |
대립유전자b (Allele b) |
미드포인트 (Midpoint) |
범위 (Range) |
| PEZ02 | 127 | 127.56 | 127.33-127.76 | - | - | - |
| ZFX | X | 158.96 | 158.78-159.13 | - | - | - |
| PEZ17 | 199 | 198.74 | 198.54-198.91 | 211 | 210.74 | 210.5-210.97 |
| FH2017 | 262 | 262.12 | 261.99-262.25 | 266 | 266.12 | 265.98-266.22 |
| FH2309 | 393 | 392.99 | 392.81-393.17 | - | - | - |
| PEZ05 | 99 | 99.42 | 99.07-99.73 | - | - | - |
| FH2001 | 126 | 126.05 | 125.84-126.29 | 143 | 142.95 | 142.71-143.20 |
| FH2328 | 169 | 169.44 | 169.27-169.66 | 205 | 205.24 | 204.96-205.50 |
| FH2004 | 230 | 230.43 | 230.21-230.62 | 238 | 238.47 | 238.31-238.63 |
| FH2361 | 341 | 341.73 | 341.56-341.93 | 344 | 343.74 | 343.49-343.85 |
| PEZ21 | 86 | 86.50 | 86.25-86.84 | 94 | 94.37 | 94.08-94.74 |
| FH2054 | 147 | 146.73 | 146.41-146.97 | 167 | 167.32 | 167.02-167.59 |
| FH3377 | 197 | 196.90 | 196.66-197.23 | - | - | - |
| FH2107 | 371 | 370.52 | 370.41-370.60 | 390 | 389.77 | 389.66-389.87 |
| FH2088 | 122 | 121.53 | 121.33-121.74 | 126 | 125.50 | 125.25-125.87 |
| VWF.X | 156 | 156.48 | 156.26-156.83 | - | - | - |
| FH2010 | 232 | 232.05 | 231.78-232.21 | - | - | - |
| PEZ16 | 300 | 300.17 | 300.00-300.34 | 304 | 304.21 | 304.03-304.38 |
| FH3313 | 419 | 418.86 | 418.83-418.91 | 425 | 424.41 | 424.35-424.49 |
| 마커 (Marker) |
샘플 (Sample) |
모세관 전기영동 기기 (CE instrument) |
대립유전자 콜링(Allele-calling) | |
| 대립유전자 래더 없이 분석한 경우 | 대립유전자 래더와 함께분석한 경우 | |||
| FH3313 | S7 | 3500-A | OL/403 | 388/403 |
| FH3313 | S11 | 3500-B | 357/OL | 357/419 |
| FH3313 | S15 | 3500-B | 377/OL | 377/419 |
| FH3313 | S20 | 3500-A | 381/OL | 381/442 |
| FH3313 | Control | 3500-A | 419/OL | 419/425 |
| FH2107 | S1 | 3500-D | 375/OL | 375/378 |
| FH2107 | S7 | 3500-D | 375/OL | 375/378 |
| FH2107 | S10 | 3500-B | 376/OL | 376/378 |
표 4를 참조하면, 대립유전자 콜링의 정확한 정도는 대립유전자 래더의 유무에 의존적인 경향을 나타내는 것을 확인할 수 있다. 인하우스 대립유전자 래더 없이 유전형 분석을 수행한 경우 결정된 2608 개의 대립유전자 중 8개(0.3 %)가 OL(Off ladder)이 나타났다. OL은 상대적으로 큰 대립유전자를 포함하는 FH3313 및 FH2107에서 주로 발견되었다. 이러한 OL은 시료뿐만 아니라 케이나인 키트에 포함된 대조 DNA(control DNA)에서도 발생했다. 표 3을 참조하면, 대조 DNA(control DNA)의 경우 FH3313 마커의 유전자형은 419/425였다. 대립유전자 래더가 지정되지 않았을 때 419는 네 대의 기기 중 하나의 장비에서 OL로 식별되었다. 그러나 대립유전자 래더와 함께 분석했을 때 모든 기기에서 419로 올바르게 지정되었다. 모든 기기에서 실행된 모든 샘플은 대립유전자 래더가 지정되었을 때 올바르게 지정되었다. 결과적으로 대립유전자 호출에 영향을 미치는 실행 간 이동성 차이는 대립유전자 래더를 통해 보정되어 완화될 수 있다.
본 발명의 바람직한 일 실시예에서는 18 개의 STR 마커로부터 158 개의 STR 대립유전자 단편을 얻고, 성별 결정 마커를 위한 2개의 인공 단편을 얻어 총 160 개의 대립유전자가 있는 인하우스 대립유전자 래더를 구축했다. 제조된 대립유전자 래더는 소프트웨어에 의해 설정된 빈의 보간 및 보정을 통해 정확한 OL 대립유전자 호출을 향상시키는 기능이 있는 것으로 나타났다. 따라서, 대립유전자 지정의 정확도를 높이고 데이터베이스 표준화를 지원하는 데 적용될 수 있다.
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IDENTIFICATION IN DOG
<130> NP-2021-0242
<160> 72
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 687
<212> DNA
<213> Canis familiaris
<400> 1
taacctcctc agctccaagc aacaactacc actaatcttt ccatctgtat gattttgctt 60
atttgggaca ttttatgtaa ctggagtcat aaaatatgta gtcttttgtg actgagttct 120
ttcagcacag tgttttcaag gttgatctat gttgcagcat ggattagtaa tgcctgcctt 180
tctttctttt tctttctttc tttctttctt tctttctttc tttctttctt ccttccttcc 240
ttccttcctt ccttccttcc ttccttcctt ccttccttcc ttccttcctc ccttcctccc 300
tttctttcct ctaccctcag ggtgggcctc gaactcacaa ctctgatatc aagagtcata 360
tgctctacca actgagccag gcacccctgc atttcttcca attgccaaat aagatgccat 420
tgtttagatc tctcaaattt ttaatccatt catcagtcgt tagacatttg ggttgttttc 480
actttggggc tttccatgaa taataaggct gccatgaaca tttgtgtaca agattttttg 540
cagacattat tttcaattct gttgggtacc tatctaggaa tggagtcact ggctcctctg 600
gtaatgctac atgtaaccca ttgatgaact tccagactat ttccaaagtg gctgcaccat 660
tttgaattcc agcagcggta tgtgaag 687
<210> 2
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<400> 2
taacctcctc agctccaagc aacaactacc actaatcttt ccatctgtat gattttgctt 60
atttgggaca ttttatgtaa ctggagtcat aaaatatgta gtcttttgtg actgagttct 120
ttcagcacag tgttttcaag gttgatctat gttgcagcat ggattagtaa tgcctgcctt 180
tctttctttt tctttctttc tttctttctt tctttctttc tttctttctt ccttccttcc 240
ttccttcctt ccttccttcc ttccttcctt ccttccttcc ttccttcctc ccttcctccc 300
tttctttcct ctaccctcag ggtgggcctc gaactcacaa ctctgatatc aagagtcata 360
tgctctacca actgagccag gcacccctgc atttcttcca attgccaaat aagatgccat 420
tgtttagatc tctcaaattt ttaatccatt catcagtcgt tagacatttg ggttgttttc 480
actttggggc tttccatgaa taataaggct gccatgaaca tttgtgtaca agattttttg 540
cagacattat tttcaattct gttgggtacc tatctaggaa tggagtcact ggctcctctg 600
gtaatgctac atgtaaccca ttgatgaact tccagactat ttccaaagtg gctgcaccat 660
tttgaattcc agcagcggta tgtgaag 687
<210> 3
<211> 483
<212> DNA
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<400> 3
gaaactcaga aggcccgcat acctcctcaa gggcctcact agtttcaata atattcacag 60
ttcacagata tgagctgatt gttcatgcaa aaagtaattg ctcagcgcct gccacatatc 120
aagcatcgct ttgagtgctt ttgaaagaat atggacaaag tcaatgtcct ttgtgagttt 180
gtgatcttat gcaacaaccg gttttgattt ctgggccaaa ttatccaaaa ataaataaat 240
aaataaataa ataaataaat aaataaaaga tgtcactaat gacacagaaa tggaggataa 300
gactttctgg tctaaaaaaa agatcaagaa caaaccataa taaatgccaa atgtgtctat 360
actgaggtga agtgtataat gatatgtaac cattcggagc agatttgtaa aaacatttat 420
agcatcttaa caggctgatg ggagaagcag aatgaggcaa ggtgcttggc tgcttaatga 480
gca 483
<210> 4
<211> 682
<212> DNA
<213> Canis familiaris
<400> 4
caagtgctat tgatcacaga agacattttc atcaagcaac ttgtaggaca agaatatcac 60
aaaatgtgct tcagaaaatg ctcatctgaa cacttattaa ggatatttat ttggatcatg 120
ttgcacatac aatgaatcat atgatcaaat attcatttaa ctgtgtcatc attaagctaa 180
gtcctctctt tctctctttc tttttctttc tttttttctt tctttctttc tttctttctt 240
tctttctttc tttctttctt tcttctttct ttcttctttc tttctttctt tctttctttc 300
tttctttctt tctttctttc tttctttctt tctttctttc tttctttctt ctctttcttt 360
ctttttcttc tttcctttct tctctttctt tctttctttc tttctttctt ttcttctttc 420
tttctttttt ttcttctttc ttttcctttt tctttctccc acgaaagaga gtgtgagtga 480
gaagcaaaag gggagggagg ggacgaagaa tctcaaacaa actacactga gcatggagcc 540
caataatgat gatatcacaa ccctgagatc tgtcctgaga agaaacaaag agtcagacgc 600
ttaacggaat gagacactca ggtgctccaa gagaaatata ctcatatgtg tttctctatg 660
ggttatacat acccactcac cc 682
<210> 5
<211> 621
<212> DNA
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<400> 5
gcctgttaac cactagggca attgctcagc actagatgac ttataatcct tcagtctcta 60
cttttgcttt taattacaaa ctcccttttg tggcaccaat ttgtagaact taaattcatg 120
ttttagggac tttaggagta gcaaaacaac atgcataaat ttattcttat tgagatcatt 180
aataaaggct ccctaccagg tagttttcag aaatgctgtt gtatttaata cttattactg 240
tatcatatgt caaaaaaata aaggaaagaa aaaaagaaag aaagaaagaa agaagaaaga 300
gaaagaaaga aagaaagaaa gaaagaaaga aagaaagaga gaaagaaaga aagaaagaaa 360
aagcagcctc aagtcccata actgtctcct cctcttcagt gtctttttca tagcagtgac 420
acatagagct gacaagtgcc agttgttcct tcacttcccc cattcaagtc ataaaactca 480
gagcctagag cagaaggctc ctggccgcac agctggaact cccaaagaga cttgggagta 540
ggctgatgtc tgacaagatg tcttctcatc agttccaaca tcagctgctt aagggcagga 600
agggctttca gcaaggtgaa c 621
<210> 6
<211> 660
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<400> 6
actgacccga cttcctttgt catattcatt aaccttcttt cacttttgaa actgattctg 60
aaatactagc accaactgct taatcaccac ataaggtaac ttataccttg ttagcccgac 120
gatggtttgt taaagcacag ggtcatttga agcatactat ttcctaccca actaagtgga 180
ctgttgcttc tcactaaagt attagataat ctaaatctag ttcattcagt actttccaaa 240
gctctttgct gtttttcaaa ttaatgagag gtttcactgt atacaacatt gtcattaaaa 300
tttagaaagt gtaaataaat aaataaataa ataaataaat aaataaataa ataaaattta 360
gaaatgctgt gggaaacaag atagcatgct ttataatttt acttttattt gcacacttgg 420
acattaaacc gttaaacttt cacaaatctt caggacttaa aaatattccg ttcaaagctg 480
aacatgatta acattatcaa tatttattca aagtgcactt cgagtagtta atatgcctca 540
aattacaacc ttttacttag acaatccatc aaaataattt tcaagatatt tttgaaacat 600
acatttattt attttggcag ttcagtgtta aaaaaaaagc cctcactttt ctgagtagtg 660
660
<210> 7
<211> 718
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<400> 7
aaacttccac ccttgccctt tctggagggc ccatttttga tgatcctcag atctcctgta 60
gccttggttt attcccataa ccctctgcac acccaaaaag taagccttta attagctctc 120
agataacctt tgaggtatag cttctatttc tggccaggac tccttcttgt tcagggggaa 180
gagaaagaaa gaaagaaaga aaaggaagag agaaaaagga agaaagaaag aagaaaaaaa 240
gaaagaaaga aagaaagaaa gaaagaaaga aagaaagaaa gggaagagag aaaaaggaag 300
aaagaaagaa agaaagaaag agaaaagaaa gaaagaaaga aagaaagaaa gaaagaaaga 360
aagaaagaaa gaaagagaaa gaaaacgaaa gaaaaggaaa aaataagaaa agaataaagg 420
aggcaggttt tggttataga tgagatgaga ttggcttcag attgataatg ttgaagcaga 480
gacatgagta ctcataataa gattctttct tttttaaatt aatttgaaaa tttccataaa 540
accaatttta aactaaagat ggtgcactgt aatggggatg gtccagcctc acccttatat 600
cttcagtgat cttgtttagc agttaaaaaa gagacagggc atctgaggac acaactgtaa 660
ggctttgtta taaagtaact acaggtgact tggtaatggc aaacacactc tcaggcaa 718
<210> 8
<211> 511
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<400> 8
taactttgtg ccatctgccg ataataaatg agccctttat atatatccat ccaaagaatt 60
gattaaagga ttgaactgga aagatctgag gacagggctt taaagcatgc aataagcaat 120
ctcccttctt gttaactctg catatattct tcagaattca gcccagtact accttcagga 180
agctatcctg acaactcctc catctcttcc caagcctccc tgcccagact ggggaggatg 240
cctatattaa atctgggttc tccagacaaa aaaaactaat aggatatcta tctatctatc 300
tatctatcta tctatctatc tatctatcta tcatctatct acctacctac ctacctacct 360
aatttatcta tctacctgtc taaagagatt tactatagga attggctcac gtgattatag 420
aggctcataa atctaagatc tgcagccaac aaactccaga tgcaggaagt taaacacact 480
ccagtttgag tccaaaggcc tgacaatcag g 511
<210> 9
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<400> 9
ctgggctaaa ggcagatggt caatggctga gcaatccggg tatccctatc tctttttgtt 60
ttgaagtcta tagccatttc tgttctgtta tgggtgctgt ttacatgata tatctttttc 120
tctcttttta atatcaaact tttctttgag ttaaagtggt cttctaacag catatagttg 180
gaatacgttt attttcagct tgataatctt tgacttttga tcagattttt aaattcattc 240
acatttaatg ttattattga gatagattta catcggcttt ttcttttctt ttcttttctt 300
ttcttttctt ttcttttctt ttcttttctt ttcttttctt ctcttttctt tcttttcttt 360
tcttttttct tttctttctt tctttttttg tattctatgg gtctcgtatc ttcttaattc 420
ctctattgcc ttctttatta ttaagtggat actttctagc ataacatctt aatttcttta 480
attattttta tatttttgtt ttttttgaat atgtggtttt ctttttttga acattttaaa 540
gaatatttta tttaattttt catgagagag agagagagag aggcagagac acaagagaca 600
caggtagagg gagaagcagg ctccatgcag gtgggactca tatttcgggt ccccag 656
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gagcttcact tcttaccttg catttttaaa atccttacta tgtatgaact actccaggaa 60
gctctaagac atatgtgaaa catgcttcat atgttgagac aatccatggt cctcctttgt 120
ccaatctaac aattttgggt cttgataaaa tttaggggct ttgtactgtg acctactgag 180
gttgcatctt ttgtatattt gacttctata tttccatgta gtattaaaat tgagcttagt 240
actcaaagca tagtgtaaaa agaaagaaag aaagaaagaa agaaagaaag aaagaaagaa 300
agaaagaaag aagaaagaaa gaaagaaaga aagaaagaaa gaaagaaaga aagaaagaac 360
ccagcattct cagtctgtat caggcaatga gtaggtcaaa tcgtgccaac tgcctagcct 420
cagtggcaag aggaggctcc ccacttagcc ctgttcttta ggctagagac catggcagtg 480
aggtgaaaaa gtatagatag aaaaaggcat tccgacctgc atctcttaca aacaaatctg 540
acgacagtta cagatccaaa agaaaaaaaa aattcaggaa acttttaaaa aggtgatgat 600
ggccaaaaat tggggagaga ttccggaaga 630
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<212> DNA
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<400> 11
ttcagccagg ccttgtcttc atggagcaag atgtgtttgt ggtttagctc agcctcccaa 60
agacaaactt tacccctaag ggactgaact tctccatacc ataatgaaag tggaatagga 120
atctagtttt ctaggtctat acttactctt ttttctttct ttctttcttt ctttctttct 180
ttctttcttt ctttctttct ttcttctttc tttctttctt tctttctttc tttctttctt 240
tctttctttc agagggagag catgcgagca gggtggggca gtgagagagg gagagcaaga 300
gaatcttctt tctttctttc agagggagag catgcgagca gggtggggca gtgagagagg 360
gagagcaaga gaatcttaag caggttccac gttcaccatg gaattcgaca ttggggctcg 420
atctcacaaa cctgagatca tgacctgagc tgaaatcaag agtcagatgc ttacctgact 480
gagccaccca ggtacctcta cagttattct acttgctcat ggaataaaat cagaacttga 540
tccagaatgt tctagacttc cttacagtaa aagcaactga aaaaactgga tgcatgtgat 600
tgaggcttat gattagggca agcatatgat ttatcttgcc agacgtacca ctgttacccc 660
acaacaggc 669
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<400> 12
gaaggcagtg ctaaaccgct gagccaccgg ggctgccctg gcttctattt cctgaatgag 60
agttctcttc atatctatta tttcccagaa aaatcatgtg tttttagtaa ttaatgtcct 120
caccctccca ccaccgtcct gccttctgat gctactgatt gattttgctg ggttttgaac 180
tttgtacaaa tagaatcatg caacacttac tcctgtgtgt ctgatgtctt ttattcaaca 240
ttatatttct gcgtttcatt tatgttcact gtgattgtaa cttacttatt atcatcgata 300
tatggtattc tattgtatga atttaccaca gtttttactc cactctacta ttgaagattt 360
aggggttttt ttctaagttt ttggctacta tgaatagtac tactactaga agtgttgtat 420
cagtgttttg gtgaacacac atatgctttt ctattggatc tatacctcaa gagtagaagt 480
gctggttcat agggcatgca tataaccagc tttatttatt tatttattta tttatttatt 540
tatttattta tttatttatt cattcattca ttcattcatt catgagagac acacagagag 600
aggcagagat gtaggcagag ggagaagcag gctccctggc gggggggagc ccaatgtgga 660
ctcaacccca ggaccccaga atcactccca gagctgaagg cagatgctca accattgagc 720
cacctaggtg ccccataaac agctttggta gatactttca agcggttttc caaagcaggt 780
gtgccaattc acgctctgtg cagtggtgct taggagttct ggttgctcca catctcccct 840
aatacttcat attatctttt ccattttagc cagtctggta ggggtgtagt ggcctctcat 900
cgtggtctta atttgca 917
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<213> Canis familiaris
<400> 13
ccacatcagg ttccccagag ggagcctgct tctccctctg cctatgtctc tgcctctctc 60
tctgtgtctc ttatgaataa ataaatacaa tctttaaaga aaaaaaaaga aaaaaatgct 120
tggaaggtga gactgaatgt taatgttctt tagattatat acaactcatt gattcacaat 180
caaatgttat tgcgatccaa aggagaagca ggtcagagca gtcagaaatt tgattgtgag 240
gtttggctcc actatctaat tcctctgtga ctttatacag gttaactctt ctgagcttaa 300
gttctctttc tttctttctt tctttctttc tttctttctt tctttctttc ttctttcttt 360
ctttctttct ttctttcttt ctttctttct ttctttcttt ctttctttca aaaaggaatg 420
gtactacctg cttattttgg agagttaact tgaaatagtt tatgtaaaac actttgcata 480
gtgcctggta cattctaagt gcttattcag tggtgtaaga atatgtagtt aatgaacgtg 540
cagcaggaac aactcaaaga tgctgtcaag atcacttctg gacaatctga gaagcagatg 600
ccaacagctg actggacata ggaggctgtc atcacaccta gactagctcg gagaggtgtc 660
attttaagac cattctagcc tacctggggg tg 692
<210> 14
<211> 330
<212> DNA
<213> Canis familiaris
<400> 14
attggctggt ggaagaggtg ggattctgcc ctcagcttcg gggaaaatgg tttcctcctt 60
cctctctaac tgcctatgct cctccctctg ccttccttct ttccttcctt ccttccttcc 120
ttccttcctt ccttccttcc ttccttcttc cttccttcct tccttccttc cttccttcct 180
tccttccttc cttccttcct tccttgatac agtgtcattg ttcatattca agggctgtga 240
tttagaaatt tattcagcat ttttaaattt aatctggggt ccaaatatca aaaacccaga 300
attaagatga agcaagtgaa gtcttcgttt 330
<210> 15
<211> 669
<212> DNA
<213> Canis familiaris
<400> 15
ttcagccagg ccttgtcttc atggagcaag atgtgtttgt ggtttagctc agcctcccaa 60
agacaaactt tacccctaag ggactgaact tctccatacc ataatgaaag tggaatagga 120
atctagtttt ctaggtctat acttactctt ttttctttct ttctttcttt ctttctttct 180
ttctttcttt ctttctttct ttcttctttc tttctttctt tctttctttc tttctttctt 240
tctttctttc agagggagag catgcgagca gggtggggca gtgagagagg gagagcaaga 300
gaatcttctt tctttctttc agagggagag catgcgagca gggtggggca gtgagagagg 360
gagagcaaga gaatcttaag caggttccac gttcaccatg gaattcgaca ttggggctcg 420
atctcacaaa cctgagatca tgacctgagc tgaaatcaag agtcagatgc ttacctgact 480
gagccaccca ggtacctcta cagttattct acttgctcat ggaataaaat cagaacttga 540
tccagaatgt tctagacttc cttacagtaa aagcaactga aaaaactgga tgcatgtgat 600
tgaggcttat gattagggca agcatatgat ttatcttgcc agacgtacca ctgttacccc 660
acaacaggc 669
<210> 16
<211> 855
<212> DNA
<213> Canis familiaris
<400> 16
tgcctcacat tcttaccccg agaagatccc ctggaaaata tacgagtatg agcaaaaaca 60
aatgctttgg attccatata aggacaagac accttttatc agcgtatctt tggccattca 120
tatcaaactt gctattacaa aagctctgcc acttgaatat tgctttagct gctctttgta 180
aaatgacctg aaagaaagga aagaaagaaa gaagaaagaa agaaagaaag aaagaaagaa 240
aggaaggaag gaaggaagga aggaaggaag gaaggaagga agaaaggaag aaagaaagaa 300
aggaagaaag aaagagtgtg ccaaactgcc ctgatgtcag tagcatcagt ctacatgaag 360
taatgacccg aactgaaacc ctaaacccat atggctagta gaatatctgt ggttaataat 420
gtttatgtaa tccaaataaa gttaatgggt tttaggacga atcccaggga tagttaaggt 480
caaagagaat taaatgggat gtgaggggga tctggctggg acatctgttg ccctgttgat 540
tgccagggtt gatttggcct atcaggctga ctaggcgagt gtccccaccc tccctcaggg 600
ctctctgtgt gtctctcccc aagccgtgtg ctggatggaa gaggacgacc taccctgctc 660
aaggagaacc atccttccat caagggcata ggatgagctg ggttccctcg ttagaatctc 720
caaacaagct ctcaaggtct attattagaa gctttaaaaa aagagaaaga gagagaatta 780
aatgaaaacc aggattctca gtatgggaaa agattgctat cgaagacaca ttatccagtc 840
cctcaattat atgca 855
<210> 17
<211> 524
<212> DNA
<213> Canis familiaris
<400> 17
tgagactgag cctggaaggt agaccttccc accttgcaga agatgagacc gaggcccaga 60
gagttcaagt gatttggctg agatctgaaa atcccagcag tgacaagagt aatcaacacg 120
agcttatcat aggaatcgga tctatctttc tgtctgtcta tctacctacc tatcactcct 180
ccccttctct acctccacct ctaacttcat ctcatcccta ccatgtacct aaaacagtag 240
aagtctggag gaataggaat aggaatagga ataggaatag gaataggaat aggaatagga 300
ataggaatgt tgggtcacaa tagtaccctt gctgacctct gagtgggcat ctctctttcc 360
tggcctcagt gtgtgacctg gtgagctgtg acctgccccc ggtgcctccc tgcgaagatg 420
gcctccagat gaccctgacc aatcctggcg agtgcagacc caacttcacc tgtggtaaag 480
cctctgtgga tgcggagagg gtggcgcgac cattctctcc tagc 524
<210> 18
<211> 671
<212> DNA
<213> Canis familiaris
<400> 18
tggggtcctc caattgagcc ccaggttggc tccctgctca gcagggagtc tgcttctccc 60
tctccctacc ccttgcccct gatcatacct tttctctctt tctctctcag acagatgggt 120
aaaaatcttt aacaagaaaa aagaaaaaga aaaaaagatt tgcgttttcc caacttcaag 180
ttaacctgaa gtctgccagt ttacttggaa ggcctgggtg gccccttaca gcttcatttt 240
ccagcctgtg ccttaaaact ccagagaaat gcttcctcct attaacaatg tcagactctc 300
agaaaattat tgagtagtgc aaataattca ataaaacaaa tatttaaaag aatacgactc 360
tttttcattc attcattcat tcattcattc attcattcat tcatgctttt tcatgttctg 420
gtgtacatgc atgctcaact gttccattct ggatctctcc agaagcatcc actatatact 480
caaatctaca tcaagattta gtttaaaaag tagaaaagag tggatggagt ttaaaacaca 540
aaacaagaga tggtcggggg tgatggtggt taaattccac ccctggctat taattccaga 600
ccagtgacag acacaacaag ataaatatat ttttccctag tttgttccat aagctggcca 660
aacccaatca t 671
<210> 19
<211> 76
<212> DNA
<213> Canis familiaris
<400> 19
ctatctatct atctatctat ctatctatct atctatctat ctatcatcta ttgtatctat 60
ctatctacct atctat 76
<210> 20
<211> 130
<212> DNA
<213> Canis familiaris
<400> 20
ctttctttct ttttctttct ttctttcttt ctttctttct ttctttcttt cttccttcct 60
tccttccttc cttccttcct tccttccttc cttccttcct tccttccttc ctcccttcct 120
ccctttcttt 130
<210> 21
<211> 36
<212> DNA
<213> Canis familiaris
<400> 21
aaataaataa ataaataaat aaataaataa ataaat 36
<210> 22
<211> 267
<212> DNA
<213> Canis familiaris
<400> 22
tttctctctt tctttttctt tctttttttc tttctttctt tctttctttc tttctttctt 60
tctttctttc tttcttcttt ctttcttctt tctttctttc tttctttctt tctttctttc 120
tttctttctt tctttctttc tttctttctt tctttctttc ttctctttct ttctttttct 180
tctttccttt cttctctttc tttctttctt tctttctttc ttttcttctt tctttctttt 240
ttttcttctt tcttttcctt tttcttt 267
<210> 23
<211> 96
<212> DNA
<213> Canis familiaris
<400> 23
gaaagaaaaa aagaaagaaa gaaagaaaga agaaagagaa agaaagaaag aaagaaagaa 60
agaaagaaag aaagagagaa agaaagaaag aaagaa 96
<210> 24
<211> 45
<212> DNA
<213> Canis familiaris
<400> 24
taaataaata aataaataaa taaataaata aataaataaa taaaa 45
<210> 25
<211> 224
<212> DNA
<213> Canis familiaris
<400> 25
aagagaaaga aagaaagaaa gaaaaggaag agagaaaaag gaagaaagaa agaagaaaaa 60
aagaaagaaa gaaagaaaga aagaaagaaa gaaagaaaga aagggaagag agaaaaagga 120
agaaagaaag aaagaaagaa agagaaaaga aagaaagaaa gaaagaaaga aagaaagaaa 180
gaaagaaaga aagaaagaga aagaaaacga aagaaaagga aaaa 224
<210> 26
<211> 75
<212> DNA
<213> Canis familiaris
<400> 26
atctatctat ctatctatct atctatctat ctatctatct atctatcatc tatctaccta 60
cctacctacc tacct 75
<210> 27
<211> 112
<212> DNA
<213> Canis familiaris
<400> 27
ctttttcttt tcttttcttt tcttttcttt tcttttcttt tcttttcttt tcttttcttt 60
tcttctcttt tctttctttt cttttctttt ttcttttctt tctttctttt tt 112
<210> 28
<211> 95
<212> DNA
<213> Canis familiaris
<400> 28
gaaagaaaga aagaaagaaa gaaagaaaga aagaaagaaa gaaagaaaga agaaagaaag 60
aaagaaagaa agaaagaaag aaagaaagaa agaaa 95
<210> 29
<211> 63
<212> DNA
<213> Canis familiaris
<400> 29
atctatctat ctatctatct atctatctat ctatctatct atctatcatc tatctatcta 60
tct 63
<210> 30
<211> 48
<212> DNA
<213> Canis familiaris
<400> 30
tttatttatt tatttattta tttatttatt tatttattta tttattta 48
<210> 31
<211> 103
<212> DNA
<213> Canis familiaris
<400> 31
ctttctttct ttctttcttt ctttctttct ttctttcttt ctttcttctt tctttctttc 60
tttctttctt tctttctttc tttctttctt tctttctttc ttt 103
<210> 32
<211> 115
<212> DNA
<213> Canis familiaris
<400> 32
ccttccttct ttccttcctt ccttccttcc ttccttcctt ccttccttcc ttccttcttc 60
cttccttcct tccttccttc cttccttcct tccttccttc cttccttcct tcctt 115
<210> 33
<211> 95
<212> DNA
<213> Canis familiaris
<400> 33
ctttctttct ttctttcttt ctttctttct ttctttcttt ctttctttct tctttctttc 60
tttctttctt tctttctttc tttctttctt tcttt 95
<210> 34
<211> 124
<212> DNA
<213> Canis familiaris
<400> 34
aaagaaagga aagaaagaaa gaagaaagaa agaaagaaag aaagaaagaa aggaaggaag 60
gaaggaagga aggaaggaag gaaggaagga agaaaggaag aaagaaagaa aggaagaaag 120
aaag 124
<210> 35
<211> 60
<212> DNA
<213> Canis familiaris
<400> 35
aggaatagga ataggaatag gaataggaat aggaatagga ataggaatag gaataggaat 60
60
<210> 36
<211> 36
<212> DNA
<213> Canis familiaris
<400> 36
cattcattca ttcattcatt cattcattca ttcatt 36
<210> 37
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FH2001 F Outer primer
<400> 37
tgcttatggc agtatcctcg ac 22
<210> 38
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FH2001 R Outer primer
<400> 38
tgagcacgtc tattatagct gcc 23
<210> 39
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FH2309 F Outer primer
<400> 39
taacctcctc agctccaagc a 21
<210> 40
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FH2309 R Outer primer
<400> 40
cttcacatac cgctgctgga 20
<210> 41
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PEZ21 F Outer primer
<400> 41
gaaactcaga aggcccgca 19
<210> 42
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PEZ21 R Outer primer
<400> 42
tgctcattaa gcagccaagc 20
<210> 43
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FH2107 F Outer primer
<400> 43
caagtgctat tgatcacaga ag 22
<210> 44
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FH2107 R Outer primer
<400> 44
gggtgagtgg gtatgtataa c 21
<210> 45
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FH2328 F Outer primer
<400> 45
gcctgttaac cactagggca 20
<210> 46
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FH2328 R Outer primer
<400> 46
gttcaccttg ctgaaagccc 20
<210> 47
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PEZ05 F Outer primer
<400> 47
actgacccga cttcctttgt c 21
<210> 48
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PEZ05 R Outer primer
<400> 48
cactactcag aaaagtgagg gc 22
<210> 49
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FH3313 F Outer primer
<400> 49
aaacttccac ccttgccctt 20
<210> 50
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FH3313 R Outer primer
<400> 50
ttgcctgaga gtgtgtttgc 20
<210> 51
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FH2017 F Outer primer
<400> 51
taactttgtg ccatctgccg 20
<210> 52
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FH2017 R Outer primer
<400> 52
cctgattgtc aggcctttgg 20
<210> 53
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FH3377 F Outer primer
<400> 53
ctgggctaaa ggcagatggt 20
<210> 54
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FH3377 R Outer primer
<400> 54
ctggggaccc gaaatatgag 20
<210> 55
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FH2004 F Outer primer
<400> 55
gagcttcact tcttaccttg c 21
<210> 56
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FH2004 R Outer primer
<400> 56
tcttccggaa tctctcccca 20
<210> 57
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FH2054 F Outer primer
<400> 57
tacccggacc tctgccaagc 20
<210> 58
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FH2054 R Outer primer
<400> 58
gtaggcacaa tgccaagcac 20
<210> 59
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FH2088 F Outer primer
<400> 59
gaaggcagtg ctaaaccgct 20
<210> 60
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FH2088 R Outer primer
<400> 60
tgcaaattaa gaccacgatg ag 22
<210> 61
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FH2361 F Outer primer
<400> 61
ccacatcagg ttccccagag 20
<210> 62
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FH2361 R Outer primer
<400> 62
cacccccagg taggctagaa 20
<210> 63
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PEZ02 F Outer primer
<400> 63
attggctggt ggaagaggtg 20
<210> 64
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PEZ02 R Outer primer
<400> 64
aaacgaagac ttcacttgc 19
<210> 65
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PEZ17 F Outer primer
<400> 65
ttcagccagg ccttgtcttc 20
<210> 66
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PEZ17 R Outer primer
<400> 66
gcctgttgtg gggtaacag 19
<210> 67
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PEZ16 F Outer primer
<400> 67
tgcctcacat tcttaccccg 20
<210> 68
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PEZ16 R Outer primer
<400> 68
tgcatataat tgagggactg ga 22
<210> 69
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> vWF.X F Outer primer
<400> 69
tgagactgag cctggaaggt 20
<210> 70
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> vWF.X R Outer primer
<400> 70
gctaggagag aatggtcgc 19
<210> 71
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FH2010 F Outer primer
<400> 71
tggggtcctc caattgagc 19
<210> 72
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FH2010 R Outer primer
<400> 72
atgattgggt ttggccagct 20
Claims (10)
- 개체로부터 하나 이상의 핵산 샘플을 수득하는 단계;
FH2001, FH2309, PEZ21, FH2107, FH2328, PEZ05, FH3313, FH2017, FH3377, FH2004, FH2054, FH2088, FH2361, PEZ02, PEZ17, PEZ16, vWF.X 및 FH2010 유전자 마커별로 각 마커별 양쪽 끝 부위(flanking region)에 특이적으로 바인딩하는 프라이머들을 이용하여 1차 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행하는 단계;
증폭된 1차 중합효소연쇄반응 산물을 주형으로 하고 케이나인 키트(Thermo Scientific Canine Genotypes ™ Panel 2.1 Kit) 유래의 프라이머 세트를 이용하여 2차 중합효소연쇄반응을 수행하는 단계;
증폭된 2차 중합효소연쇄반응 산물을 모세관 전기영동하여 각 마커별 STR(Short Tandem Repeat) 모티프 유전자위를 포함하는 대립유전자 단편을 수득하는 단계; 및
수득된 단편을 혼합하는 단계; 를 포함하는, 개의 개체식별을 위한 케이나인 키트의 대립유전자 래더를 제조하는 방법.
- 제 1항에 있어서,
상기 1차 중합효소연쇄반응을 수행하는 단계에서, 상기 프라이머들은 각 마커에 포함된 STR 모티프 유전자위로부터 50 내지 600bp 떨어진 위치에 바인딩하여 상기 STR 모티프 유전자위를 포함하는 핵산서열을 증폭시킬 수 있는 것인, 개의 개체식별을 위한 케이나인 키트의 대립유전자 래더를 제조하는 방법.
- 제 1항에 있어서,
상기 1차 중합효소연쇄반응을 수행하는 단계에서, 상기 유전자 마커별로 대응되는 프라이머들은 각각
FH2001 마커의 경우 서열번호 37 및 38,
FH2309 마커의 경우 서열번호 39 및 40,
PEZ21 마커의 경우 서열번호 41 및 42,
FH2107 마커의 경우 서열번호 43 및 44,
FH2328 마커의 경우 서열번호 45 및 46,
PEZ05 마커의 경우 서열번호 47 및 48,
FH3313 마커의 경우 서열번호 49 및 50,
FH2017 마커의 경우 서열번호 51 및 52,
FH3377 마커의 경우 서열번호 53 및 54,
FH2004 마커의 경우 서열번호 55 및 56,
FH2054 마커의 경우 서열번호 57 및 58,
FH2088 마커의 경우 서열번호 59 및 60,
FH2361 마커의 경우 서열번호 61 및 62,
PEZ02 마커의 경우 서열번호 63 및 64,
PEZ17 마커의 경우 서열번호 65 및 66,
PEZ16 마커의 경우 서열번호 67 및 68,
vWF.X 마커의 경우 서열번호 69 및 70, 및
FH2010 마커의 경우 서열번호 71 및 72의 서열을 가지는 프라이머들인, 개의 개체식별을 위한 케이나인 키트의 대립유전자 래더를 제조하는 방법.
- 제 1항에 있어서,
상기 수득된 단편을 혼합하는 단계는,
상기 증폭된 2차 중합효소연쇄반응 산물을 모세관 전기영동시 일정한 높이로 피크가 나타나도록 대립유전자 형 마커별로 혼합하는 단계;
각 마커별 혼합물을 모세관 전기영동시 일정한 높이로 피크가 나타나도록 같은 형광 물질 색깔별로 혼합하는 단계; 및
각 색깔별 혼합물을 모세관 전기영동시 일정한 높이로 피크가 나타나도록 하나로 혼합하는 단계; 를 포함하여 수행되는, 개의 개체식별을 위한 케이나인 키트의 대립유전자 래더를 제조하는 방법.
- 제 1항에 있어서,
상기 수득된 단편을 혼합하는 단계에서,
성별 결정 유전자 마커에서 유래한 단편을 추가로 혼합시키는, 개의 개체식별을 위한 케이나인 키트의 대립유전자 래더를 제조하는 방법.
- 개체로부터 하나 이상의 핵산 샘플을 수득하는 단계;
FH2001, FH2309, PEZ21, FH2107, FH2328, PEZ05, FH3313, FH2017, FH3377, FH2004, FH2054, FH2088, FH2361, PEZ02, PEZ17, PEZ16, vWF.X 및 FH2010 유전자 마커별로 각 마커별 양쪽 끝 부위(flanking region)에 특이적으로 바인딩하는 프라이머들을 이용하여 1차 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행하는 단계;
증폭된 1차 중합효소연쇄반응 산물을 주형으로 하고, 상기 산물 내에서 상기 FH2001, FH2309, PEZ21, FH2107, FH2328, PEZ05, FH3313, FH2017, FH3377, FH2004, FH2054, FH2088, FH2361, PEZ02, PEZ17, PEZ16, vWF.X 및 FH2010 유전자 마커별로 각 마커별 STR 모티프 유전자위를 포함하는 서열을 증폭시킬 수 있는 프라이머 세트를 이용하여 2차 중합효소연쇄반응을 수행하는 단계; 및
증폭된 2차 중합효소연쇄반응 산물을 모세관 전기영동하여 각 마커별 STR(Short Tandem Repeat) 모티프 유전자위를 포함하는 대립유전자 단편을 수득하는 단계; 를 포함하는,
개의 개체식별용 대립유전자 래더를 제조하기 위한 대립유전자 단편을 수득하는 방법.
- 서열번호 37 내지 71의 서열을 가지는 프라이머를 포함하는,
개의 개체식별용 대립유전자 래더를 제조하기 위한 프라이머 세트.
- 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 따른 방법으로 제조된 대립유전자 래더를 포함하는, 개의 개체식별용 조성물.
- 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 따른 방법으로 제조된 대립유전자 래더를 이용하는, 개의 개체식별 방법.
- 제 9항에 있어서,
케이나인 키트(Thermo Scientific Canine Genotypes ™ Panel 2.1 Kit)와 함께 적용되는, 개의 개체식별 방법.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020210116637A KR20230033541A (ko) | 2021-09-01 | 2021-09-01 | 개 개체식별 키트의 대립유전자 래더 제조 방법 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020210116637A KR20230033541A (ko) | 2021-09-01 | 2021-09-01 | 개 개체식별 키트의 대립유전자 래더 제조 방법 |
Publications (1)
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|---|---|
| KR20230033541A true KR20230033541A (ko) | 2023-03-08 |
Family
ID=85507866
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020210116637A KR20230033541A (ko) | 2021-09-01 | 2021-09-01 | 개 개체식별 키트의 대립유전자 래더 제조 방법 |
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|---|---|
| KR (1) | KR20230033541A (ko) |
-
2021
- 2021-09-01 KR KR1020210116637A patent/KR20230033541A/ko active IP Right Grant
Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| Dayton M, Koskinen MT, Tom BK, Mattila AM, Johnston E, Halverson J et al. Developmental validation of short tandem repeat reagent kit for forensic DNA profiling of canine biological material. Croat Med J 2009;50(3):268-85. |
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