KR20230025578A - 양파의 안토시아닌 함량 판별용 분자 표지 및 그의 이용 - Google Patents
양파의 안토시아닌 함량 판별용 분자 표지 및 그의 이용 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 양파의 안토시아닌 함량을 판별하는 방법 및 고함량의 안토시아닌을 가지는 양파 계통을 선별하는 방법을 제공한다. 안토시아닌 함량에 대한 두 개의 양적형질유전자좌(QTL)로부터 선발한 SNP 기반의 분자 표지를 제공한다.
Description
본 발명은 양파의 안토시아닌 함량을 판별하기 위한 분자 표지(분자 마커) 및 이의 이용에 관한 것으로서, SNP 분자 표지 및 이를 이용한 양파의 안토시아닌 함량을 판별하는 방법에 관한 것이다.
양파(Allium cepa L.)는 2018년 기준 세계 연간 생산량이 96,773,819톤에 달할 정도로 많이 생산되는 경제작물이다. 국내에서는 대부분 황색 품종이 재배되고 있지만 최근 소비자들의 기능성 식품에 대한 관심과 샐러드 소비의 증가에 따라 적색 양파의 수요가 증가하고 있는 추세이다.
양파는 플라보노이드 계열 화합물으로서 안토시아닌을 포함하는데, 안토시아닌은 식물의 꽃, 과실, 줄기, 뿌리 등에 함유되어 붉은색에서 푸른색 계통의 색을 나타내며, 강한 항산화 활성이 있어 인간에 항암, 항염증, 항당뇨 작용 및 심혈관계 개선에 효과가 있다고 알려져 있다(Holton & Cornish 1995).
양파에서 플라보노이드 물질은 구피색 (bulb color)을 결정하며, 구피색은 크게 백색, 연녹색, 황색, 금색, 분홍색, 적색 등이 있다. 특히 안토시아닌은 분홍색과 적색 양파를 만드는데 관여하고 있다(Kim et al. 2005).
양파 구피색은 6개 유전자좌(I, C, G, L, L2, and R loci)의 상호작용에 의해 결정된다고 보고되었으며, 이들의 유전자좌는 플라보노이드 생합성 과정에 관여하는 다양한 유전자라는 것이 보고되었다. 적색 양파는 상보적인 두 유전자 DFR(dihydroflavonol 4-reductase)과 ANS(anthocyanidin synthase)의 상호작용에 의해 나타나며, 두 유전자 중 어느 하나라도 기능을 상실하면 황색 양파가 된다. 분홍색 양파는 ANS 유전자좌의 p 대립유전자에 의해 나타난다.
위와 같이, 양파의 서로 다른 구피색에 대한 연구는 잘 되어 있지만 적색 양파의 안토시아닌 함량에 대한 연구는 아직 미흡한 실정이다.
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강한 항산화 활성이 있어 항암, 항염증, 항당뇨 작용 및 심혈관계 개선에 효과가 있다고 알려진 안토시아닌을 고함량으로 가지는 양파는 상품가치가 크므로, 양파에서 안토시아닌의 함량을 판별하는 방법 및 고함량의 안토시아닌을 가지는 양파 계통을 선별하는 방법의 개발이 요구된다.
따라서 본 개시 내용의 해결과제는 안토시아닌의 함량을 판별하는 방법 및 고함량의 안토시아닌을 가지는 양파 계통을 선별하는 방법을 제공하는 것이다.
본 개시내용의 일 목적은 양파의 안토시아닌의 함량을 판별할 수 있는 분자 표지(마커)를 제공하는 것이다.
본 개시내용의 일 목적은 양파의 안토시아닌의 함량을 판별할 수 있는 분자표지를 증폭하기 위한 프라이머 세트를 제공하는 것이다.
본 개시내용의 다른 일 목적은 양파의 안토시아닌의 함량을 판별하기 위한 조성물, 이를 포함하는 키트를 제공하는 것이다.
본 개시내용의 다른 일 목적은 고함량의 안토시아닌을 가지는 양파 계통을 선별하기 위한 조성물, 이를 포함하는 키트를 제공하는 것이다.
그러나 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 이상에서 언급한 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 다음을 제공한다.
[1] 서열번호 1의 염기서열 내에서 301번째염기에 위치하는 단일뉴클레오타이드 다형성(single nucleotide polymorphism: SNP)을 포함하는 8-100개의 연속된 염기로 구성되는 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오타이드 서열; 서열번호 2의 염기서열 내에서 301번째 염기에 위치하는 단일뉴클레오타이드 다형성을 포함하는 8-100개의 연속된 염기로 구성되는 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오타이드 서열; 서열번호 3의 염기서열 내에서 301번째 염기에 위치하는 단일뉴클레오타이드 다형성을 포함하는 8-100개의 연속된 염기로 구성되는 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오타이드 서열; 및 서열번호 4의 염기서열 내에서 301번째 염기에 위치하는 단일뉴클레오타이드 다형성을 포함하는 8-100개의 연속된 염기로 구성되는 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오타이드 서열로 구성된 그룹으로부터 선택되는, 양파의 안토시아닌의 함량을 판별하기 위한 분자 표지.
[2] [1]의 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오타이드 서열을 증폭시킬 수 있는 양파의 안토시아닌의 함량을 판별하기 위한 프라이머 세트.
[3] [2]에 있어서, 상기 프라이머 세트는, 서열번호 5 및 6으로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 7 및 8로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 9 및 10으로 이루어진 프라이머 세트; 및 서열번호 11 및 12로 이루어진 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는, 양파의 안토시아닌의 함량을 판별하기 위한 프라이머 세트.
[4] [1]에 따른 양파 안토시아닌 함량 판별용 분자표지를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함하는, 양파 안토시아닌 함량 판별용 조성물.
[5] [4]에 있어서, 안토시아닌 함량 판별용 분자표지를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제가 [2] 또는 [3]에 따른 프라이머 세트를 하나 이상을 포함하는 것인, 양파 안토시아닌 함량 판별용 조성물.
[6] [2] 또는 [3]에 따른 프라이머 세트를 하나 이상 포함하고, 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는 양파의 안토시아닌의 함량을 판별하기 위한 키트.
[7] [6]에 있어서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs 및 버퍼를 포함하는 것을 특징으로 하는 양파의 안토시아닌의 함량을 판별하기 위한 키트.
[8] [6] 또는 [7]에 있어서, HRM 분석용 PCR 키트.
[9] (1) 양파 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계; (2) 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, [1]에 따른 분자표지 서열을 증폭하는 단계; 및 (3) 상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 양파의 안토시아닌의 함량을 판별하는 방법.
[10] (1) 양파 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계; (2) 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, [1]에 따른 분자표지 서열을 증폭하는 단계; (3) 상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계; 및 (4) 상기 증폭 단계의 산물이 동형접합형 적색 양파에 해당하는 것을 선택하는 단계를 포함하는, 고함량의 안토시아닌을 가지는 양파를 선별하는 방법.
[11] [9] 또는 [10]에 있어서,[1]에 따른 분자 표지 서열을 증폭하는 단계는 [2] 또는 [3]에 따른 프라이머 세트의 하나 이상을 이용하여 증폭 반응을 수행하는 것을 특징으로 하는 것인, 양파의 안토시아닌의 함량을 판별하거나 고함량의 안토시아닌을 가지는 양파를 선별하는 방법.
[12] [9] 또는 [10]에 있어서, 상기 증폭 산물의 검출은 겔 전기영동, 모세관 전기영동, DNA 칩, 방사성 측정, 형광 측정, 인광 측정 또는 HRM(High resolution melting)을 통해 수행되는 것을 특징으로 하는 양파의 안토시아닌의 함량을 판별하거나 고함량의 안토시아닌을 가지는 양파를 선별하는 방법.
본 발명에서 제공하는 분자표지는 양파의 안토시아닌 함량을 판별할 수 있으며, 안토시아닌 고함량 양파 품종을 선별하는데 사용될 수 있다. 따라서, 유묘기에 DNA 분석을 통해 안토시아닌의 함량을 신속하게 예측할 수 있다.
안토시아닌 고함량 개체를 선발하여 선발된 개체만 노지포장에 심는다면 육종 재배 면적을 적게 사용하여 고함량 양파를 재배할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 분자 표지를 사용하면 동형접합형 개체와 이형접합형 개체를 구분할 수 있어 바로 고정된 개체를 선발할 수 있다는 이점이 있으며, 대상 후대교배종이 안토시아닌 함량 형질을 다음 세대에서 분리할 것인지 (헤테로 유전자형), 고정되어 분리되지 않을 것인지 (호모 유전자형)에 대한 판단이 가능하다.
안토시아닌의 함량은 다양한 환경 조건에 영향을 받으나, 본 발명에 따른 HRM 분자 표지를 이용하면 환경 조건과 상관없이 고함량의 안토시아닌을 가지는 개체를 선발할 수 있다.
본 발명에 따라 선별된 안토시아닌 고함량 함유 양파는 건강기능성 식품의 개발에 사용될 수 있다.
본 발명의 효과는 이런 문언적 기재에만 한정되지 않고, 통상의 기술자가 본 발명을 통해 유추할 수 있는 것까지 모두 포함한다.
도 1은 양파(Allium cepa) 'SP3B'x'H6' 로부터의 F2 개체(individuals)의 총 안토시아닌 함량을 나타낸다. 도 1의 A는 2018년에 수확한 51개체, 도 1의 B는 2019년에 수확한 89 개체의 총 안토시아닌 함량이다.
도 2는 서열번호 1의 염기서열 및 해당 염기서열 내에서 SNP의 위치를 나타낸 것이다.
도 3은 서열번호 2의 염기서열 및 해당 염기서열 내에서 SNP의 위치를 나타낸 것이다.
도 4는 서열번호 3의 염기서열 및 해당 염기서열 내에서 SNP의 위치를 나타낸 것이다.
도 5는 서열번호 4의 염기서열 및 해당 염기서열 내에서 SNP의 위치를 나타낸 것이다.
도 6는 적색 양파에서 총 안토시아닌 함량을 조절하는 두 개의 양적형질유전자좌 (QTLs)인 qAC4.1 및 qAC4.2와 연관된 다형성 HRM 마커 및 ANS (anthocyanidin synthase) 유전자에 대한 ANS-HRM 마커의 용융 곡선 (melting curve)을 나타낸다. A, 동형접합 모계 유전자형 ('SP3B'), B, 동형접합 부계 유전자형 ('H6'); H, 이형접합 유전자형
도 7은 양파 (Allium cepa) 'SP3B' x 'H6'의 F2 집단의 크로모좀 4의 유전 연관지도 및 CIM 분석(composite interval mapping analysis)에 의한 LOD를 나타낸다. 적색선: LOD threshold, 1000 permutation test로부터 50th LOD 값 (4.17), 청색선: QTL peak position (53.6 cM), 적색 바(red bar): qAC4.1 QTL 영역, 청색바: qAC4.2 영역
도 8는 2018년(1, 3, 5, 7) 및 2019년 (2, 4, 6, 8)에 경작된 적색 양파의 평균 안토시아닌 함량에 대한, QTL qAC4.2에 연관된 4 개의 HRM 마커의 유전적 효과를 나타낸다. A: 동형접합 모계 유전형 ('SP3B'), B: 동형접합 부계 유전형 ('H6'), H: 이형접합 유전형, a 및 b는 Duncan's test에 의하여 유의한 차이를 나타낸다(p<0.05)
도 2는 서열번호 1의 염기서열 및 해당 염기서열 내에서 SNP의 위치를 나타낸 것이다.
도 3은 서열번호 2의 염기서열 및 해당 염기서열 내에서 SNP의 위치를 나타낸 것이다.
도 4는 서열번호 3의 염기서열 및 해당 염기서열 내에서 SNP의 위치를 나타낸 것이다.
도 5는 서열번호 4의 염기서열 및 해당 염기서열 내에서 SNP의 위치를 나타낸 것이다.
도 6는 적색 양파에서 총 안토시아닌 함량을 조절하는 두 개의 양적형질유전자좌 (QTLs)인 qAC4.1 및 qAC4.2와 연관된 다형성 HRM 마커 및 ANS (anthocyanidin synthase) 유전자에 대한 ANS-HRM 마커의 용융 곡선 (melting curve)을 나타낸다. A, 동형접합 모계 유전자형 ('SP3B'), B, 동형접합 부계 유전자형 ('H6'); H, 이형접합 유전자형
도 7은 양파 (Allium cepa) 'SP3B' x 'H6'의 F2 집단의 크로모좀 4의 유전 연관지도 및 CIM 분석(composite interval mapping analysis)에 의한 LOD를 나타낸다. 적색선: LOD threshold, 1000 permutation test로부터 50th LOD 값 (4.17), 청색선: QTL peak position (53.6 cM), 적색 바(red bar): qAC4.1 QTL 영역, 청색바: qAC4.2 영역
도 8는 2018년(1, 3, 5, 7) 및 2019년 (2, 4, 6, 8)에 경작된 적색 양파의 평균 안토시아닌 함량에 대한, QTL qAC4.2에 연관된 4 개의 HRM 마커의 유전적 효과를 나타낸다. A: 동형접합 모계 유전형 ('SP3B'), B: 동형접합 부계 유전형 ('H6'), H: 이형접합 유전형, a 및 b는 Duncan's test에 의하여 유의한 차이를 나타낸다(p<0.05)
본 발명의 발명자의 연구 그룹은 양파에서 GBS(genotyping by-sequencing) 분석을 통하여 안토시아닌 함량에 대한 QTL을 분석하였는데 4번 염색체 위에서 두 개의 QTLs 즉 qAC4.1(LOD=3.26, PVE=19.43%) 및 qAC4.2(LOD=3.03, PVE=26.28%)]를 탐색하였으며(Choi et al. 2020), 이는 본 발명에 편입된다.
본 발명의 일 실시예에서 양파의 안토시아닌 함량에 대한 QTLs (qAC4.1 및 qAC4.2)과 연관된 단일 뉴클레오타이드 다형성 (single nucleotide polymorphism; SNP)를 기반으로 분자표지를 개발하고, 개발된 분자표지를 추가하여 양파 4번 염색체의 유전자지도를 다시 작성하였고, QTL 분석 또한 다시 수행하였다.
그 결과, qAC4.1은 false QTL로 확인되었고, qAC4.2는 주동 QTL로 확인되었다. QTL qAC4.2의 피크 위치는 53.6 cM이었는데, 이 위치의 LOD (Logarithms of odds) 값은 7.45였고, 결정계수(R2)값은 22.51%였다. QTL 범위 안에는 4개의 분자표지(AC4.2_65336.1_1123-HRM, AC4.2_53230.3_454-HRM, AC4.2_11999.1_756-HRM 및 AC4.2_14596.1_345-HRM)가 위치하고 있었다.
HRM 분석을 실시한 결과, 적색 양파에서 4개의 분자표지 모두 B 유전형(동형접합 부계 유전형 homozygous paternal genotype)을 가지고 있을 때 평균 안토시아닌 함량이 A 유전형(동형접합 모계 유전형 homozygous maternal genotype) 또는 H 유전형(이형접합 유전형 heterozygous genotype)을 가진 것보다 높았다.
상기 4 개의 분자 표지를 기반으로 하여 HRM 분석을 실시하여, 테스트한 양파의 안토시아닌 함량을 동형접합 적색 양파와 비교하여 판별할 수 있고, 안토시아닌을 고함량으로 함유하는 양파를 명확하게 구별할 수 있음을 확인하였다.
이와 같은 연구결과를 바탕으로 본 발명은 발명의 일 양태로서, 양파의 안토시아닌 함량을 판별할 수 있으며 안토시아닌 고함량 양파 품종 육성 시 MAS (Marker-assisted selection)에 활용할 수 있는 다음의 4종의 SNP를 기반으로 한 분자표지(SNP 마커)를 제공한다.
상기 분자표지는 qAC4.2의 SNP 부위를 포함하는 전체 또는 일부 폴리뉴클레오티드일 수 있고, 구체적으로 서열번호 1의 염기서열 내에서 301번째 염기에 위치하는 단일뉴클레오타이드 다형성(single nucleotide polymorphism: SNP)을 포함하는 8-100개의 연속된 염기로 구성되는 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오타이드 서열; 서열번호 2의 염기서열 내에서 301번째 염기에 위치하는 단일뉴클레오타이드 다형성을 포함하는 8-100개의 연속된 염기로 구성되는 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오타이드 서열; 서열번호 3의 염기서열 내에서 301번째 염기에 위치하는 단일뉴클레오타이드 다형성을 포함하는 8-100개의 연속된 염기로 구성되는 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오타이드 서열; 및 서열번호 4의 염기서열 내에서 301번째 염기에 위치하는 단일뉴클레오타이드 다형성을 포함하는 8-100개의 연속된 염기로 구성되는 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오타이드 서열로 구성된 그룹으로부터 선택될 수 있다. 상기 분자표지는 5 내지 200개, 구체적으로 5 내지 150개, 보다 구체적으로 5 내지 100개, 보다 구체적으로 8 내지 100개, 보다 더 구체적으로 5 내지 50개, 보다 더 구체적으로 8 내지 50개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
본 발명의 용어 "다형성(polymorphism)"이란, 하나의 유전자 좌위(locus)에 두 가지 이상의 대립유전자(allele)가 존재하는 경우를 의미하며 다형성 부위 중에서, 개체에 따라 단일 염기만이 다른 것을 단일 뉴클레오타이드 다형성이라 한다.
본 발명의 용어 "대립유전자(allele)"란, 상동염색체의 동일한 유전자좌위에 존재하는 한 유전자의 여러 타입을 의미한다. 대립유전자는 다형성을 나타내는데 사용되기도 하며, 예컨대, SNP는 두 종류의 대립인자(biallele)를 갖는다.
본 발명의 용어 "개체"란, 안토시아닌의 함량을 확인하고자 하는 대상인 양파를 의미하며, 상기 양파로부터 얻어진 검체를 이용하여, 상기 SNP를 기반으로 하는 분자표지의 유전자형을 분석함으로써 안토시아닌 함량을 판단할 수 있다. 상기 검체로는 잎, 뿌리, 줄기, 꽃, 열매, 분리된 조직, 또는 분리된 세포와 같은 시료 등이 될 수 있으나, 이에 특별히 제한되지는 않는다.
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 양파 안토시아닌 함량 판별용 분자표지를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함하는, 양파 안토시아닌 함량 판별용 조성물을 제공한다.
본 발명의 용어 "분자표지를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제"란, 상기와 같은 유전자의 다형성 부위를 검출 또는 증폭을 통해 확인하여 양파의 안토시아닌 함량을 판별할 수 있는 제제를 의미하며, 바람직하게는 상기 SNP 분자표지의 폴리뉴클레오티드를 특이적으로 검출 또는 증폭할 수 있는 프라이머 세트 또는 프로브를 의미한다.
상기 SNP 분자표지 증폭에 사용되는 프라이머는, 적절한 버퍼 중의 적절한 조건(예를 들면, 4개의 다른 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 DNA, RNA 폴리머라제 또는 역전사 효소와 같은 중합제) 및 적당한 온도 하에서 주형-지시 DNA 합성의 시작점으로서 작용할 수 있는 단일가닥 올리고뉴클레오티드가 될 수 있는데, 상기 프라이머의 적절한 길이는 사용 목적에 따라 달라질 수 있다. 짧은 프라이머 분자는 일반적으로 주형과 안정한 혼성체를 형성하기 위해서는 더 낮은 온도를 필요로 한다. 상기 프라이머 서열은 상기 SNP 마커와 완전하게 상보적일 필요는 없으나, 상기 SNP 마커와 혼성화 할 정도로 충분히 상보적이어야 하고, 바람직하게는 서열번호 5 내지 12로 구성된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 용어 "프라이머"란, 짧은 자유 3' 말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 염기 서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 서열을 의미하며, 주로 특정 구간을 증폭하는 프라이머 세트의 형태로 사용된다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 폴리머레이즈 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. 이때, PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머의 길이는 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 프라이머 세트는 서열번호 5 및 6의 염기서열, 서열번호 7 및 8의 염기서열, 서열번호 9 및 10의 염기서열, 서열번호 11 및 12의 염기서열로 구성되는 것일 수 있다.
선별된 분자표지와 그 각각에 대한 프라이머는 예를 들어 다음 표 1과 같을 수 있다.
| 서열 (5'-> 3') | 서열번호 | |
| AC4.2_65336.1_1123-HRM | F: TCTTCGTCGCCATTAGAAGG R: GACTCAGGTTCGGGTTTGAA |
5 6 |
| AC4.2_53230.3_454-HRM | F: ACCCTTCATGGAAAGGAACG R: CCATCAGGATGGAAGTACCG |
7 8 |
| AC4.2_11999.1_756-HRM | F: CTCCCCCATCGTTGTTACTC R: CGATCTATTTCGCACGATTG |
9 10 |
| AC4.2_14596.1_345-HRM | F: GAAGCCCTCTTGCATCAGTT R: TGCCTTTTAACTCGTCAGCA |
11 12 |
본 발명의 용어, “프로브”는 다양한 길이의 DNA 또는 RNA 염기서열로 방사성 표지 또는 형광 표지 등을 통해 표지되어 있으며, 단일가닥의 염기서열로 구성되어 상보적인 서열을 가진 단일가닥 DNA 또는 RNA에 특이적으로 결합하여 혼성화하는 것이 특징이며, 혼성화한 프로브의 표지 신호를 탐지하는 방식을 통해 타겟을 검출할 수 있다.
본 발명의 프라이머 또는 프로브는 포스포아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비-제한적인 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오타이드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오타이드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르,포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는, 양파 안토시아닌 함량 판별용 키트를 제공한다.
본 발명의 키트는 HRM 분석 키트 또는 DNA 칩 키트일 수 있다.
HRM 분석은 단일 염기 다형성 (single nucleotide polymorphism, 이하 SNP)을 이용한 PCR 기반의 분석 기법으로 SNP 형태에 따라 형광시료가 감소하는 양상을 해리곡선(melting curve)으로 나타내어 유전형을 구분하는 방법으로 그래프의 모양으로 다형성을 검정한다. HRM 분석은 통상 PCR 영역 내에 존재하는 DNA 상의 SNP에 따라서, 형광시약과 결합한 증폭산물 DNA를 약 60℃에서 90℃까지 온도를 변화시키며 단일가닥의 DNA로 변성될 때의 형광강도 변화를 측정한다.
본 발명의 HRM 분석 키트는 양파 안토시아닌 함량 판단용 마커인 SNP 마커 (분자표지)의 유전자형을 증폭하여 판독하거나 PCR 해리곡선에서 작은 차이를 감지함으로써 양파의 안토시아닌 함량을 판단할 수 있다. 구체적으로, 본 발명에서 제공하는 양파 안토시아닌 함량 판단용 HRM 분석 키트는 서열번호 1의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드의 301번째 염기의 변이, 서열번호 2의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드의 301번째 염기의 변이, 서열번호 3의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드의 301번째 염기의 변이 또는 서열번호 4의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드의 301번째 염기의 변이에 따른 이중가닥의 해리 정도의 차이를 감지하여 유전자형을 판단하는 키트일 수 있다.
상기 HRM 분석 키트는 상기 SNP 마커를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 대해 특이적인 한 쌍의 프라이머, DNA 중합효소, 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), RNAase, DEPC-수(DEPC-water), 테스트 튜브 및 적절한 컨테이너 등을 포함할 수 있다.
본 발명의 DNA 칩 키트는 양파 안토시아닌 함량 판단용 마커인 SNP 마커를 포함하는 폴리뉴클레오티드의 서열과 상보적인 염기서열을 포함하는 올리고 뉴클레오티드가 부착된 칩을 이용하여 특이적으로 타겟 DNA와 혼성화하여 결합하는 것을 특징으로 하며, SNP의 염기 변이에 따라 혼성화 수준의 변화가 나타나는 것을 이용하여 양파 안토시아닌 함량을 판별할 수 있다. 구체적으로, 본 발명에서 제공하는 양파 안토시아닌 함량 판단용 DNA 칩 키트는 서열번호 1의 염기서열 내에서 301번째 염기에 위치하는 단일뉴클레오타이드 다형성(single nucleotide polymorphism: SNP)을 포함하는 8-100개의 연속된 염기로 구성되는 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오타이드 서열; 서열번호 2의 염기서열 내에서 301번째 염기에 위치하는 단일뉴클레오타이드 다형성을 포함하는 8-100개의 연속된 염기로 구성되는 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오타이드 서열; 서열번호 3의 염기서열 내에서 301번째 염기에 위치하는 단일뉴클레오타이드 다형성을 포함하는 8-100개의 연속된 염기로 구성되는 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오타이드 서열; 및 서열번호 4의 염기서열 내에서 301번째 염기에 위치하는 단일뉴클레오타이드 다형성을 포함하는 8-100개의 연속된 염기로 구성되는 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오타이드 서열로 구성된 그룹으로부터 선택되는 폴리뉴클레오타이드를 표지자와 함께 칩에 부착하고 타겟 DNA를 칩에 반응시켜 혼성화 수준을 통해 유전자형을 판단하는 키트인 것인, 양파 안토시아닌 함량 판별용 키트일 수 있다.
상기 증폭 산물의 검출은 겔 전기영동, 모세관 전기영동, DNA 칩, 방사성 측정, 형광 측정, 인광 측정 또는 HRM 분석을 통해 수행될 수 있다.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 (1) 양파 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계; (2) 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 1의 염기서열 내에서 301번째 염기에 위치하는 단일뉴클레오타이드 다형성(single nucleotide polymorphism: SNP)을 포함하는 8-100개의 연속된 염기로 구성되는 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오타이드 서열; 서열번호 2의 염기서열 내에서 301번째 염기에 위치하는 단일뉴클레오타이드 다형성을 포함하는 8-100개의 연속된 염기로 구성되는 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오타이드 서열; 서열번호 3의 염기서열 내에서 301번째 염기에 위치하는 단일뉴클레오타이드 다형성을 포함하는 8-100개의 연속된 염기로 구성되는 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오타이드 서열; 및 서열번호 4의 염기서열 내에서 301번째 염기에 위치하는 단일뉴클레오타이드 다형성을 포함하는 8-100개의 연속된 염기로 구성되는 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오타이드 서열로 구성된 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 서열을 증폭 반응을 수행하여 증폭하는 단계; 및 (3) 상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 양파의 안토시아닌의 함량을 판별하는 방법을 제공한다.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 (1) 양파 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계; (2) 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 상기 본 발명에 따른 분자표지 서열을 증폭하는 단계; (3) 상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계; 및 (4) 상기 증폭 단계의 산물이 동형접합형 적색 양파에 해당하는 것을 선택하는 단계를 포함하는, 고함량의 안토시아닌을 가지는 양파를 선별하는 방법을 제공한다.
상기 (2) 단계의 DNA 시료로부터 폴리뉴클레오티드를 증폭하는 단계는 당업자에게 알려진 어떠한 방법이든 사용가능하다. 예를 들면, 표적 핵산을 PCR을 통하여 증폭하고 이를 정제하여 얻을 수 있다. 그 외 리가제 연쇄 반응(LCR), 전사증폭(transcription amplification) 및 자가유지 서열 복제 및 핵산에 근거한 서열 증폭(NASBA)이 사용될 수 있다.
상기 (2)단계는 서열번호 5 및 6으로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 7 및 8로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 9 및 10으로 이루어진 프라이머 세트; 및 서열번호 11 및 12로 이루어진 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는, 하나 이상의 프라이머 세트를 이용하여 염기를 증폭 또는 검출하는 것일 수 있다.
상기 (3) 단계의 증폭 산물의 검출은 겔 전기영동, 모세관 전기영동, DNA 칩, 방사성 측정, 형광 측정, 인광 측정 또는 HRM 분석을 통해 수행될 수 있다.
종래기술과 다르지 않은 부분으로서 본 발명의 기술적 사상을 이해하는데 필요하지 않은 사항은 설명에서 제외한다.
본 발명의 실시예는 통상의 기술자에게 쉽게 설명하기 위하여 제공되며, 본 발명이 이런 실시예에 한정되지는 않는다. 본 출원에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시예를 설명하기 위해 사용되었으며, “포함한다” 또는 “가지다” 등의 용어는 구성이 존재한다는 것을 의미한다.
<실시예 1> 양파의 준비
F2 분리집단을 육성하기 위해 사용된 모친은 황색(yellow) 양파 계통인 'SP3B'를, 부친은 배가 반수체(doubled haploid) 적색(red) 양파 계통인 'H6'를 사용하였다. 이 F2 분리집단을 두 번 재배하였는데, 첫번째는 전남대학교 농장 포장에서 2017년 10월에 파종하여 2018년 6월에 양파구를 수확하였고(Choi et al. 2020), 두번째는 국립원예특작과학원 채소과 파속채소연구실 무안 농장에서 2018년 10월에 파종하여 2019년 6월에 양파구를 수확하였다. 수확된 양파구 중에서 황색 양파는 제외하고 적색 양파만 안토시아닌 함량 분석 실험재료로 사용하였는데, 첫번째 수확에서는 51개체를, 두번째 수확에서는 89개체를 사용하였다(도 1).
<실시예 2> F2 분리집단에서 분석된 총 안토시아닌 함량 분석
'SP3B' Х 'H6' 조합의 F2 분리집단에서 적색 양파와 황색 양파는 3:1로 분리되었는데, 본 발명자들은 이러한 양파색의 분리는 DRF 유전자의 분리에 의해 나타나는 것임을 밝혔다(Choi et al. 2020). 따라서 본 개시 내용은 2018년에 수확된 적색 양파 51개체와 2019년에 수확된 적색 양파 89개체를 이용하여 총 안토시아닌 함량을 측정하였다(도 1).
총 안토시아닌 함량 분석은 수확한 적색 양파에 대해 Shin et al. (2007)의 방법에 따라 분석하였다. 양파의 구를 각 개체별로 액체질소를 사용하여 동결 분쇄 후 2.0 mL 마이크로 원심분리기 튜브에 100 mg씩 소분하였고 600 μL의 추출용액(1% HCl이 포함된 메탄올)을 넣고 4℃, 암조건에서 6시간 동안 추출하였다. 추출액은 원심분리기 1730R (Labogene, Seoul, Korea)을 이용하여 4℃, 12,000 rpm에서 5분 동안 원심분리를 실시한 후 상층액 200 μL를 새로운 1.5 mL 마이크로 원심분리기 튜브에 옮긴 후 TDW 200 μL와 클로로포름:이소아밀알코올 (24:1)을 첨가 후 4℃, 12,000 rpm에서 5분 동안 원심분리를 실시하였다.
원심분리가 완료된 혼합액의 상층액 750 μL을 새로운 1.5 mL 마이크로 원심분리기 튜브에 옮긴 후 300 μL를 96-well microplate에 옮겨 spectrophotometer (BioTek Instruments, Inc., Winooski, Vermont, USA)를 사용하여 530 nm와 657 nm에서 측정하였다. 측정된 값은 다음공식[총 안토시아닌 함량(μg100 mg-1)=A530nm - 0.25 × A657nm]에 의해 계산되어 총 안토시아닌 함량을 측정하였다(Mancinelli & Schwartz 1984). 최종적으로 도출된 총 안토시아닌 함량은 각 개체당 5 반복의 평균값을 사용하였다.
그 결과, 2018년에 수확된 집단에서 최대값은 0.506 μg100 mg-1이고 최소값은 0.010 μg100 mg-1이며 평균값은 0.099 μg100 mg-1 이었고 표준편차는 0.013 μg100 mg-1이었다(도 1의 A). 그리고 2019년에 수확된 집단에서 최대값은 0.432 μg100 mg-1이고 최소값은 0.006 μg100 mg-1이며 평균값 은 0.116 μg100 mg-1이었고 표준편차는 0.077 μg100 mg-1 이었다(도 1의 B). 분석에 사용된 두 집단 모두 연속적인 변이를 보이는 것은 양파에서 안토시아닌 함량이 양적형질임을 의미한다. 본 연구에서 개발된 분자표지의 유전적 효과를 분석하는데 이 두 집단을 사용하였다.
<실시예 3> 양파로부터 게놈 DNA의 추출
수확한 양파구로부터 개체별로 각각 게놈 DNA를 추출하였다. 액체질소를 사용하여 양파구를 동결 분쇄하여 DNA 추출에 사용하였다. 동결 분쇄된 각 시료들을 2.0 mL 마이크로 원심분리기 튜브에 담고 5 mm 스테인레스스틸 비드와 DNA 추출 완충액 (20 mM Tris-HCl, pH7.5; 250 mM NaCl; 25 mM EDTA; 0.5% SDS) 700 μL, PVP (폴리비닐피롤리돈) 1 g과 베타-머캅토에탄올 13 μL을 넣은 후 Tissue Lyser ?Hilden, Germany)를 이용하여 60 Hz로 3분간 마쇄하였다. 그 후 Lab Armor beads bath (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA)를 사용하여 70℃에서 10분간 인큐베이션을 진행한 후 원심분리기 1730R (Labogene, Seoul, Korea)를 이용하여 4℃, 13,000 rpm에서 10분간 원심분리를 진행하였다. 원심분리가 끝난 혼합액의 상층액 600 μL를 클로로포름:이소아밀 알코올 (24:1) 600 μL가 담긴 새로운 1.5 mL 마이크로 원심분리기 튜브에 옮긴 후 4℃, 13,000 rpm에서 10분간 원심분리를 진행하였다. 원심분리가 완료된 혼합액의 상층액 500 μL을 이소프로판올 500 μL가 담긴 1.5 mL 마이크로 원심분리기 튜브에 옮긴 후 잘 섞어 준 후 -20℃에서 10분 동안 인큐베이션한 뒤 4℃, 13,000 rpm에서 10분간 원심분리를 진행하여 DNA 펠렛을 확인하였다. 확인된 DNA 펠렛을 제외한 나머지 용액을 제거하고 70% 에탄올 600 μL를 첨가하여 4℃, 13,000 rpm에서 1분간 원심분리를 진행하는 세척과정을 2회 반복하였다. 세척이 끝난 뒤 RNase 0.1 μL와 TDW (triple distilled water) 100 μL를 첨가하였고 최종적으로 BioDrop Lite (BioDrop UK Ltd., Cambridge, England)를 이용하여 DNA 농도를 20 ngμL-1로 희석하여 사용하였다.
<실시예 4> 프라이머의 디자인
본 발명자의 연구그룹은 양파 안토시아닌 함량에 대한 두 개의 양적형질유전자좌 qAC4.1과 qAC4.2를 찾아 내었는데, 이들은 각각 4번 염색체 7.0 cM과 62.0 cM 위치에서 확인되었다.
QTL qAC4.1 범위는 5.7~10.7 cM이었는데 본 발명에서는 0.0 cM에서 20.4 cM 범위에 위치하는 16개의 SNP를 선발하였고, QTL qAC4.2 범위는 51.8~62.0 cM이었는데, 41.5 cM에서 63.5 cM 범위에 위치하는 12개의 SNP를 선발하였다.
본 발명에서는 선발된 SNP를 기반으로 HRM용 프라이머를 디자인하였다(표 2). 디자인된 프라이머의 amplicon을 transcriptome sequence에 BLAST (Kim et al. 2015)하여 특이적 염기서열인지 아닌지를 확인하였다.
또한 탐색된 QTLs과 ANS 유전자의 위치를 비교하기 위하여 ANS 유전자로부터 기 개발된 HRM 프라이머를 사용하였다(Cho et al. 2021). 최종적으로 본 연구에서는 28개 세트의 프라이머를 새로 디자인하였고, 기 보고된 1개 세트의 프라이머를 사용하였다(표 2).
<실시예 5> HRM 분자표지의 개발
새롭게 디자인된 프라이머를 이용하여 2018년 수확한 양파 F2 분리집단에 분석하여 HRM 분자표지를 개발하였다.
HRM 분석은 LightCycler® Real-Time PCR (Roche, Basel, Swizerland)을 사용하여 분석하였다(Liew et al. 2004). HRM 반응액은 게놈 DNA 20 ngμL-1 2.0 μL, 10 × EasyTaq buffer 2.0 μL (Transgen Biotech, China), 2.5 mM dNTP mixture 1.0 μL, SYTO®9 green fluorescent nucleic acid stain (Life Technologies??, Carlsbad, CA, USA) 0.5 μL, 0.1 unit Taq DNA polymerase (Transgen Biotech, China), 각각의 10 pmoleμL-1 프라이머 1.0 μL, TDW 12.4 μL를 혼합하여 총 20 μL로 만들어 사용하였다. 만약 SNP 조합이 A/T, T/A, C/G 및 G/C인 경우에는 TDW 1.0 μL를 줄이고 Luna probe 1.0 μL를 추가하여 총 20 μL로 만들어 사용하였다(deSilva & Blackett 2007).
PCR 반응은 95℃에서 5분간 pre-denaturation을 진행하였고 95℃에서 20초간 denaturation, 60℃에서 20초간 annealing 및 extension 과정을 40회 반복하였으며 72℃에서 20초간 final extension 반응을 진행하였다. 최종적으로 생산된 PCR products는 LightCycler® Real-Time PCR (Roche, Basel, Swizerland)를 사용하여 65℃에서 97℃까지 0.2℃씩 온도를 증가시키며 SYTO®9 형광값을 측정하여 용융 곡선 그래프 (melting curve graph)를 작성하였다.
작성된 용융 곡선은 LightCycler® ver. 1.1.0.1320 프로그램(Roche, Basel, Swizerland)을 사용하여 유전자형 분석을 수행하였다. 유전자형은 3개의 그룹으로 동형접합형(homozygous)인 A('SP3B' type)와 B('H6' type), 이형접합형 (heterozygous)인 H로 구분하여 분류하였다.
새롭게 디자인된 프라이머를 이용하여 2018년 수확한 양파 F2 분리집단에 분석하여 최종적으로 11개의 HRM 분자표지를 개발하였다(도 6).
qAC4.1과 연관된 SNP에서 개발된 HRM 분자표지는 AC4.1_91314.1_297-HRM, AC4.1_ 57513.1_394-HRM, AC4.1_53764.1_356-HRM, AC4.1_82084.4_ 2119-HRM 및 AC4.1_27269.1_95-HRM 등 5개였고, qAC4.2와 연관된 SNP에서 개발된 HRM 분자표지는 AC4.2_68134.1_ 674-HRM, AC4.2_65336.1_1123-HRM, AC4.2_26019.3_513- HRM, AC4.2_53230.3_454-HRM, AC4.2_11999.1_756-HRM 및 AC4.2_14596.1_345-HRM 등 6개였다. 또한 4번 염색체에서 탐색된 두 개의 QTLs과 ANS 유전자의 위치를 비교하기 위해 ANS-HRM 분자표지를 분석하였는데 다형성을 보였다(도 6)
<실시예 6> 개발된 HRM 분자표지를 이용한 양파 유전자지도 작성 및 QTL 분석
유전자지도는 JoinMap® 4.1 프로그램을 이용하여 작성하였다 (Van Ooijen 2006). 연관 그룹은 LOD≥3.0과 최대 거리 30 cM 기준으로 나누었고, 연관 거리는 Kosambi mapping function을 사용하여 계산하였다(Kosambi 1944). 집단 옵션은 F2를 사용하였다(Van Ooijen 2006). 최종 연관 지도는 MAPCHART v.2.1 프로그램을 사용하여 그렸다(Voorrips 2002).
QTL 분석은 Windows QTL Cartographer ver. 2.5 프로그램을 이용하여 수행하였다(Silva et al. 2012). 분자표지 유전형과 안토시아닌 함량 표현형의 연관을 분석하기 위해 1.0 cM walking speed를 사용하여 composite interval mapping (CIM) 분석 방법을 사용하였다. LOD threshold는 1000번의 permutation tests를 수행한 후 50번째 높은 LOD값(유의성 5% 기준)을 사용하였다.
통계 분석 유전자형 분석 결과, 분자표지의 유전형이 나타내는 평균 안토시아닌 함량간 유의미한 차이를 확인하기 위하여 R studio ver. 4.0.2를 이용하여 5%(α=0.05)의 유의수준에서 ANOVA 분석 및 Duncan's new multiple range test를 수행하였다(Venables et al. 2020)
기 작성된 양파 4번 염색체 유전자지도(Choi et al. 2020)에 본 연구에서 개발된 HRM 분자표지를 추가하여 새로운 연관 지도를 작성하였다(도 7). 13개의 HRM 분자표지와 22개의 GBS-기반 SNP 분자표지로 이루어진 4번 염색체 유전자지도는 총 88.1 cM의 연관 거리를 보였다.
새롭게 작성된 유전자지도를 이용하여 안토시아닌 함량에 대한 QTL 분석을 다시 수행하였다. 그 결과, qAC4.1은 QTL로 나타나지 않았고, qAC4.2는 주동 QTL로 나타났다(도 7). 이전 연구에서 탐색되었던 qAC4.1은 false QTL인 것으로 판단되었는 데, 이는 새롭게 개발된 HRM 분자표지가 유전자지도에 위치함으로써 그 유전자형이 더 정확하게 scoring되었기 때문인 것으로 생각된다(표 3).
표 3은 양파 (Allium cepa) 'SP3B'x 'H6'으로부터의 F2 개체(individuals)에서 GBS 분석 및 HRM 마커 분석 사이의 점수화된 유전형 (scored genotype)을 비교한 것이다.
GBS 분석을 통해 생성된 유전자형은 in silico 분석을 통해 생성되는 데이터이기 때문에 항상 에러를 포함할 수 있는 여지가 있다. 본 연구에서도 T57513.1_394-GBS와 T57513.1_394-HRM 데이터를 비교한 결과, 3개의 유전형에서 차이가 났고 GBS 분석에서 분석이 안된 2개의 missing data가 HRM 분자표지 분석에서 genotyping이 되었다(표 3). 반면 T53764.1_356-GBS와 T53764.1_356-HRM 데이터를 비교한 결과에서는 잘못 scoring된 유전형은 없었으나 GBS에서 분석이 안 된 3개의 missing data가 HRM 분자표지 분석에서는 genotyping이 되었다.
반면에 qAC4.2는 이전 연구 결과와 마찬가지로 주동 QTL로 나타났다(도 7). QTL peak position은 53.6 cM이었는데, 이 위치의 LOD값은 7.45였고, phenotypic variance explained (PVE)를 설명하는 결정계수(R2)값은 22.51%였다. LOD threshold값(4.17)을 넘는 QTL 범위는 T65336.1_1123과 T79877.1_198 사이인데(표 4), 4개의 HRM 분자표지(AC4.2_65336.1_1123-HRM, AC4.2_53230.3_454-HRM, AC4.2_11999.1_ 756-HRM 및 AC4.2_14596.1_345-HRM)가 위치하고 있었다 (도 7). 따라서 이 4개의 HRM 분자표지를 이용하여 안토시아닌 함량에 대한 유전적 효과를 추가적으로 분석하였다.
이전 연구에 따르면 ANS 유전자는 양파의 4번 염색체 위에 위치한다는 결과가 있었고(Masuzaki et al. 2006), ANS 유전자의 변이 형태에 따라 적색 양파의 적색 강도가 달라진다는 결과도 있었다(Kim et al. 2006). 따라서 본 연구에서는 ANS 유전자가 안토시아닌 함량에 관여하는 여러 유전자 중 하나일 것으로 생각되어 ANS 유전자로부터 개발된 ANS-HRM 분자표지와 기 탐색된 QTLs의 위치를 비교하였다. 그 결과, ANS 유전자는 QTL qAC4.2와 연관되어 있었으나 QTL 범위에는 포함되지 않았다(도 3). 이는 본 연구에서 사용한 분리집단에서는 ANS 유전자가 안토시아닌 함량에 영향을 미치지 않았다는 것을 의미한다.
표 4는 Allium cepa 'SP3B'x'H6'의 F2 집단에서 검출된 QTL qAC4.2의 상세한 정보이다.
<실시예 7> 선발된 HRM 분자표지의 안토시아닌 함량에 대한 유전적 효과 분석
안토시아닌 함량 조절 QTL qAC4.2와 연관된 4개의 HRM 분자표지(AC4.2_65336.1_1123-HRM, AC4.2_53230.3_454-HRM, AC4.2_11999.1_756-HRM 및 AC4.2_14596.1_345-HRM)를 2018년과 2019년에 수확된 적색 양파를 이용하여 안토시아닌 함량에 대한 유전적 효과를 분석하였다.
그 결과, 2018년 수확된 'SP3B' Х 'H6' 조합의 F2 분리집단 분석에서 4개의 분자표지 모두 B 유전형(homozygous paternal genotype)을 가지고 있을 때 평균 안토시아닌 함량이 A 유전형(homozygous maternal genotype) 또는 H 유전형(heterozygous genotype)을 가진 것보다 높았다. 각 분자표지별로 유의성을 확인하기 위하여 5% (α=0.05)의 유의수준에서 ANOVA 분석과 Duncan's test를 수행한 결과 모두 유의성을 보였다. 또한 H 유전형의 평균 안토시아닌 함량이 A 유전형의 값과 비슷한 것으로 보아 B 유전형이 A 유전형에 대해 열성으로(recessive) 작용하였다(도 8).
2019년 수확된 F2 분리집단 분석에서는 AC4.2_65336.1-1123- HRM 분자표지만 유전자형에 따른 유의성이 있었고, 나머지 3개의 분자표지(AC4.2_53230.3_454-HRM, AC4.2_11999.1_ 756-HRM 및 AC4.2_14596.1_345-HRM)는 유전자형에 따른 유의성이 없었다. 하지만 B 유전자형의 평균 안토시아닌 함량이 A 또는 H 유전자형의 함량보다 높은 경향성은 있었다. 이는 본 연구에서 개발된 분자표지를 사용하여 B 유전자 형을 선발한다면 평균적으로 높은 안토시아닌 함량을 가진 개체를 선발할 수 있음을 의미한다(도 8).
이상에서는 본 발명을 설명하였으나, 본 발명은 개시된 실시예 및 첨부된 도면에 의하여 한정되지 않으며 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 이내에서 통상의 기술자에 의하여 다양하게 변형될 수 있다. 또한 본 발명의 실시예에서 설명한 기술적 사상은, 각각 독립적으로 실시될 수도 있고, 둘 이상이 서로 조합되어 실시될 수도 있다.
<110> INDUSTRIAL COOPERATION FOUNDATION JEONBUK NATIONAL UNIVERSITY
<120> Molecular marker for validating the anthocyanin content of onion
and use thereof
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<160> 12
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 600
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> AC4.2_65336.1_1123-HRM
<400> 1
aaaaccactt ccttctccac ttccacttcc agtcgaattc aagttcaagc ccttgacacc 60
aatatcatat gcaggtgatc catccgggtt aaacaacccg taatgtcttt ctgaacccgg 120
atccggtttc agattctcat taaacagagc aaatacataa acctccaatg gcacatctgg 180
attcataggc gttcccttcc cactctccat caacttcatc agattcccat tgtatttcat 240
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tgacactctc acctcaattt ccttgtctcc tcctgcagaa gtgattgcgg atctgactgc 360
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<211> 600
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> AC4.2_53230.3_454-HRM
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agaaaggtaa tgcagctagg aagggtgttt gatgaagcta ggttttgagg aggaggctgc 180
tgcctaataa gtttgaaaag aatggtgcat gtctaaattc cacattttta gatgtctgaa 240
aaataatgct cctgaatatt ggcttaacct agacccttca tggaaaggaa cgggtccccc 300
aatgcggcgg tacttccatc ctgatggctc cctgactgca gaccctgaag acaaagtgtg 360
gggcggtcat gaatgcacat tcacaatcat caccagttac cttgaagacg gaactatcag 420
gaatcattat gtcagaatca accgctggcc tcaactgaaa atttctagaa ataaggactg 480
gagctggaaa atgtcgaata atatctacca ttataatagc gttcctgatg ctgaaaaaga 540
gggtggaaca ggtcctttgt ttcctgcctg gtaattcact acctatatat atgttctttt 600
600
<210> 3
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> AC4.2_11999.1_756-HRM
<400> 3
tcttcaagct gtgccactag agactctagc tctgcagtat atgcctgctt cctctcccta 60
gacctagcag cagattcccg atttttgatc atcctcttct gcctctgcag cgcggccttc 120
tctgccggat ccaaactgcc cccacttcta tcgatcctct tcctccctct ccctctcgcc 180
gccgccactc cggccacctc cgttcccgtc ctttccagaa aatcttccag agtcatctcc 240
gctgctcctc ctcccccatc gttgttactc ggttcggccc actccacctt gtttatgctc 300
ccctgtctgg acactgcagg ggatgtgccg ttcgattcaa tcgtgcgaaa tagatcgtct 360
atgttcatcg atgtcagaga tttaagggag tagagcgaag actggcgagt tatgtttgat 420
gctgttgctg atgatgctga cggcatcacg cgtgatgatg ccattaaatt atttgattat 480
tcgagggtgt ttggggatta ttgtgttttt tatttgggga cggttgggtt aaaatgagac 540
gtggaggatg ggggtgaaaa acagacgtga ggaaaggata aac 583
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<211> 600
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> AC4.2_14596.1_345-HRM
<400> 4
taatgatccg attcttactc tctgccattg catcaggtat ttctaattaa ttcacatttg 60
ttggtttgta tcttccactt gaattcgctt tgcagtaatg gtaaacgcaa tgagtgcggc 120
acataccaag aggagatcca cggctgaaaa tggcgagaca gggatcgatc cagggctgac 180
cacattgatc agcaatggtg aggatctggg cccaatcgcc agacacgcat tcgagtcagg 240
caagccggaa gccctcttgc atcagttaag aaacattgta aaaaagaaag aaatcgagat 300
cgaggaactg tgcaagcttc attacgaaga tttcatacta gccgtcgatg aacttagagg 360
tgtgttggta gatgctgacg agttaaaagg catgctcacg ggtgagaatt tcaaactgca 420
ggaaatttcc aagtctcttc tttcaaaatt ggtacagctc cttgagttgt actcaatcaa 480
aaagaatgtt gcggaagcca tacagatgtt gaagatttgt gtgcaggtat caaatttatg 540
tcacacgtgc aatcaacaca tatcaaatgg gaaatttcac cttgcactta aggcattaaa 600
600
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<212> DNA
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<220>
<223> Primer (F)
<400> 5
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<220>
<223> Primer (R)
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<212> DNA
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<220>
<223> Primer (F)
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acccttcatg gaaaggaacg 20
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<212> DNA
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<220>
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<212> DNA
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer (R)
<400> 12
tgccttttaa ctcgtcagca 20
Claims (12)
- 서열번호 1의 염기서열 내에서 301번째 염기에 위치하는 단일뉴클레오타이드 다형성(single nucleotide polymorphism: SNP)을 포함하는 8-100개의 연속된 염기로 구성되는 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오타이드 서열;
서열번호 2의 염기서열 내에서 301번째 염기에 위치하는 단일뉴클레오타이드 다형성을 포함하는 8-100개의 연속된 염기로 구성되는 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오타이드 서열;
서열번호 3의 염기서열 내에서 301번째 염기에 위치하는 단일뉴클레오타이드 다형성을 포함하는 8-100개의 연속된 염기로 구성되는 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오타이드 서열; 및
서열번호 4의 염기서열 내에서 301번째 염기에 위치하는 단일뉴클레오타이드 다형성을 포함하는 8-100개의 연속된 염기로 구성되는 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오타이드 서열로 구성된 그룹으로부터 선택되는, 양파의 안토시아닌의 함량을 판별하기 위한 분자 표지. - 제1항의 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오타이드 서열을 증폭시킬 수 있는 양파의 안토시아닌의 함량을 판별하기 위한 프라이머 세트.
- 제2항에 있어서, 상기 프라이머 세트는, 서열번호 5 및 6으로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 7 및 8로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 9 및 10으로 이루어진 프라이머 세트; 및 서열번호 11 및 12로 이루어진 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는, 양파의 안토시아닌의 함량을 판별하기 위한 프라이머 세트.
- 제1항에 따른 양파 안토시아닌 함량 판별용 분자표지를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함하는, 양파 안토시아닌 함량 판별용 조성물.
- 제4항에 있어서, 안토시아닌 함량 판별용 분자표지를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제가 제2항 또는 제3항에 따른 프라이머 세트를 하나 이상 포함를 포함하는 것인, 양파 안토시아닌 함량 판별용 조성물.
- 제2항 또는 제3항에 따른 프라이머 세트를 하나 이상 포함하고, 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는 양파의 안토시아닌의 함량을 판별하기 위한 키트.
- 제6항에 있어서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs 및 버퍼를 포함하는 것을 특징으로 하는 양파의 안토시아닌의 함량을 판별하기 위한 키트.
- 제6항 또는 제7항에 있어서, HRM 분석용 PCR 키트.
- (1) 양파 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계; (2) 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 제1항에 따른 분자표지 서열을 증폭하는 단계; 및 (3) 상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 양파의 안토시아닌의 함량을 판별하는 방법.
- (1) 양파 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계; (2) 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 제1항에 따른 분자표지 서열을 증폭하는 단계; (3) 상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계; 및 (4) 상기 증폭 단계의 산물이 동형접합형 적색 양파에 해당하는 것을 선택하는 단계를 포함하는, 고함량의 안토시아닌을 가지는 양파를 선별하는 방법.
- 제9항 또는 제10항에 있어서, 제1항에 따른 분자 표지 서열을 증폭하는 단계는 제2항 또는 제3항에 따른 프라이머 세트의 하나 이상을 이용하여 증폭 반응을 수행하는 것을 특징으로 하는 것인, 양파의 안토시아닌의 함량을 판별하거나 고함량의 안토시아닌을 가지는 양파를 선별하는 방법.
- 제9항 또는 제10항에 있어서, 상기 증폭 산물의 검출은 겔 전기영동, 모세관 전기영동, DNA 칩, 방사성 측정, 형광 측정, 인광 측정 또는 HRM(High resolution melting)을 통해 수행되는 것을 특징으로 하는 양파의 안토시아닌의 함량을 판별하거나 고함량의 안토시아닌을 가지는 양파를 선별하는 방법.
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| KR1020210106943A KR102597200B1 (ko) | 2021-08-12 | 2021-08-12 | 양파의 안토시아닌 함량 판별용 분자 표지 및 그의 이용 |
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Patent Citations (2)
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