KR20230025437A - 이온-교환 멤브레인, 필터 및 방법 - Google Patents

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Abstract

기술되는 것은 다공성 중합체성 멤브레인 및 멤브레인 표면에 이미다졸 이온-교환 기를 포함하는 이온-교환 멤브레인; 상기 이온-교환 멤브레인을 포함하는 이온-교환 멤브레인 및 필터; 그리고 액체로부터 하전된 생물학적 분자를 분리하기 위한 상기 이온-교환 멤브레인 및 필터의 사용 방법이다.

Description

이온-교환 멤브레인, 필터 및 방법
하기 상세한 설명은 다공성 중합체성 베이스, 및 다공성 중합체성 베이스에 결합되어 있는 이미다졸 이온-교환 기를 포함하는 이온-교환 멤브레인; 상기 이온-교환 멤브레인을 포함하는 이온-교환 멤브레인 및 필터; 그리고 액체로부터 (비제한적으로) 플라스미드 DNA와 같은 하전된 생물학적 분자를 분리하기 위한 상기 이온-교환 멤브레인 및 필터의 사용 방법에 관한 것이다.
DNA, 예컨대 플라스미드 DNA ("pDNA")와 같은 하전된 생물학적 분자의 정제는 통상적으로 이온-교환 크로마토그래피에 의해 수행된다. 그러나, 크로마토그래피 수지는 저조한 접근성(accessibility), 느린 물질 수송 및 낮은 결합 용량을 나타낼 수 있다. 또한, 크로마토그래피 컬럼을 충진, 세척 및 검증하는 것은 노동- 및 시간-집약적이다.
[발명의 개요]
하기 상세한 설명은 DNA (예컨대 플라스미드 DNA), 단백질, 핵산, 내독소, 바이러스 등과 같은 하전된 생물학적 분자를 흡착하기에 충분하게 큰 세공을 갖는 단일-사용의 (일회용의) 고도로 전달성인 이온-교환 멤브레인을 제공하는 것에 의해 크로마토그래피 수지와 연관된 지금까지 정제 방법의 제한을 해소하는 이온-교환 멤브레인 및 관련 방법을 포함한다. 상기 다공성 멤브레인은 멤브레인에 대한 분자의 우수한 접근성을 위한 고도의 표면적, 및 높은 결합 용량을 갖는다.
본 상세한 설명은 개선된 이온-교환 멤브레인 및 관련 방법에 관한 것으로써, 여기서 상기 멤브레인은 예컨대 pH를 기준으로 하전된 생물학적 분자를 선택적으로 흡착하고 차후 방출하는 (탈착시키는) 데에 효과적이다. 상기 멤브레인은 다공성 중합체성 멤브레인의 표면에 위치하는 하전된 이미다졸 기 형태의 이온-교환 기를 포함한다. 이온-교환 멤브레인은 사용 및 재-사용될 수 있거나 또는 일회용일 수 있는 "시트" 또는 "필름"의 형태로 존재한다. 일회용 설계는 더 빠른 설치 시간, 유연성 있는 처리 및 용이한 취급으로 이어진다. 표면적 및 세공 크기를 포함한 최적화된 멤브레인 형태구조는 표적 분자로서의 하전된 생물학적 화합물의 가용 표면적에의 강화된 노출 및 더 큰 결합 용량으로 인하여 액체 매체로부터의 생물학적 분자 (예컨대 플라스미드 DNA)의 더 효율적인 분리 및 수집을 가능하게 한다. 통상적인 크로마토그래피 수지 상 기술은 본원에서 기술되는 방법의 효율을 달성하지 못한다.
본원에서 사용될 때, "표적" 분자 등의 용어는 바람직하게는 액체 중 다른 분자로부터 분리되는 액체 중 분자를 지칭한다. 생물학적 유체는 플라스미드 DNA, RNA, 지질다당류, 단백질 및 게놈 DNA를 포함한 다수의 서로 다른 하전된 생물학적 분자들을 함유할 수 있다. 분리 과정 또는 정제 과정에서, 이들 중 어느 하나는 표적 분자가 될 수 있으며, 모든 다른 하전된 분자는 비-표적 분자 또는 "불순물"인 것으로 간주된다. 생물학적 유체 (또는 기타 액체)에 함유되어 있는 특정의 하전된 생물학적 분자는 선택되는 (표적인) 하전된 생물학적 분자의 높은 상업적 중요성 또는 가치와 같은 다양한 인자들을 기준으로 유체 중 다른 하전된 생물학적 분자 대비 표적 분자로서 선택될 수 있다. 다양한 예에서는, 플라스미드 DNA가 RNA, 지질다당류, 단백질 및 게놈 DNA를 포함할 수 있는 비-표적 분자에 대비하여 생물학적 유체 중 표적 분자로 선택될 수 있다. 본 상세한 설명의 다른 예시적인 방법에 따르면, RNA 분자, 지질다당류, 단백질 또는 게놈 DNA와 같은 다른 하전된 생물학적 분자가 표적 분자로 선택될 수도 있다.
역시 기술되는 바와 같은 방법에 따르면, 멤브레인 상에 흡착시키기 위하여 선택되는 하전된 생물학적 분자는 표적 분자일 수 있거나, 또는 비-표적 분자일 수 있다. 기술되는 바와 같은 멤브레인은 표적 분자 및 비-표적 분자 모두를 포함하는, 액체 중에 존재하는 다수의 하전된 생물학적 분자들의 혼합물로부터 액체 중에 함유되어 있는 1종 또는 다수의 하전된 생물학적 분자를 선택적으로 흡착하는 데에 사용될 수 있다. 구체적인 예로서, 멤브레인은 불순물은 흡착하지 않으면서 다양한 하전된 생물학적 분자들 (예컨대 RNA, 지질다당류 및 게놈 DNA와 같은 "불순물")의 혼합물 내에 플라스미드 DNA를 함유하는 생물학적 액체에 함유되어 있는 플라스미드 DNA에 선택적으로 결합되는 (그것을 선택적으로 흡착하는) 데에 사용될 수 있다. 불순물은 멤브레인을 통과하는 반면, 플라스미드 DNA는 멤브레인 상에 흡착되며, 차후에 탈착 (용리) 및 수집될 수 있다. 다른 예에 따르면, 멤브레인은 플라스미드 DNA에 결합되지 (그것을 흡착하지) 않으면서 플라스미드 DNA가 아닌 다른 하전된 생물학적 분자에 선택적으로 결합되는 (그것을 선택적으로 흡착하는) (예컨대 RNA, 지질다당류, 단백질 및 게놈 DNA와 같은 "불순물"에 결합되는) 데에 사용될 수 있다. 플라스미드 DNA는 멤브레인을 통과한 후 수집될 수 있다.
다공성 멤브레인의 표면은 하전된 생물학적 분자를 선택적으로 흡착하고 방출하는 데에 효과적인 하전된 이미다졸 이온-교환 기를 포함한다. 단일 특정 예에 따르면, 본 개시내용의 예시적인 멤브레인은 생물학적 액체에서의 RNA, 지질다당류, 단백질 및 게놈 DNA와 같은 "불순물" 대비 플라스미드 DNA의 선택적인 결합에 효과적일 수 있다. 이미다졸은 대략 5.2의 pKa를 갖는 독특한 관능기이다. 기술되는 바와 같은 멤브레인은 pH-의존성을 나타내며 일시적인 표면 전하 밀도, 예를 들면 5.2 미만 범위의 pH에서 양성 전하 및 5.2를 초과하는 범위 pH에서의 중성 전하를 나타내는 이미다졸 기를 갖는다. 이미다졸 관능기의 일시적인 표면 전하 밀도는 액체 매체로부터의 원하는 생물학적 분자의 분리 및 차후의 가변적인 pH 조건 도입시의 분자의 방출 및 수집을 가능하게 한다. 산성 조건하에서, 멤브레인 표면은 주로 양성으로 하전되며, 정전기적 상호작용을 통해 플라스미드 DNA 분자와 같은 하전된 생물학적 분자에 결합할 수 있다. 염기성 조건에서는, 이미다졸 기가 탈양성자화되어 이미다졸 기와의 하전된 생물학적 분자 (예컨대 플라스미드 DNA 분자)의 정전기 복합체를 제거함으로써, 크로마토그래피 수지 상에 비해 상당히 더 낮은 이온 강도에서의 하전된 생물학적 분자 (예컨대 플라스미드 DNA 분자)의 선택적인 방출을 초래한다.
일 측면에서, 본 발명은 이미다졸 이온-교환 기를 포함하는 다공성 이온-교환 멤브레인 시트를 사용하여 액체로부터 하전된 생물학적 분자를 분리하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 하전된 생물학적 분자를 함유하는 액체를, 하전된 생물학적 분자가 이온-교환 멤브레인 상에 흡착되도록 하는 흡착 조건에서, 다공성 중합체성 시트 및 다공성 중합체성 시트 표면에 이미다졸 이온-교환 기를 포함하는 다공성 이온-교환 멤브레인과 접촉시키는 것을 포함한다. 차후의 상승된 pH 값으로의 멤브레인의 도입은 하전된 생물학적 분자를 방출함으로써, 하전된 생물학적 분자가 농축된 형태로 수집되는 것을 가능하게 한다. 더하여, 멤브레인의 물리적 특징이 하전된 이미다졸 이온-교환 기에 대한 생물학적 분자의 접촉 및 노출에 영향을 주어, 멤브레인에의 분자의 견인을 강화할 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 멤브레인 표면에 이미다졸 이온-교환 기를 포함하는 다공성 이온-교환 멤브레인에 관한 것으로써, 여기서 상기 이미다졸 이온-교환 기의 전하는 pH-의존성이어서, 5.2 미만 범위의 pH에서 양성 전하 및 5.2 초과 범위의 pH에서 중성 전하를 나타낸다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 중합체성 다공성 멤브레인 베이스의 표면에 그라프팅된 이미다졸 이온-교환 기를 포함하는 다공성 이온-교환 멤브레인의 제조 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 다공성 중합체성 멤브레인의 표면에 이미다졸 이온-교환 기를 화학적으로 결합시키는 것을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 베이스의 표면에 이미다졸 이온-교환 기를 포함하는 중합체성 다공성 멤브레인 베이스 및 가교된 중합체 네트워크를 포함하는 다공성 이온-교환 멤브레인의 제조 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 베이스의 표면에 코팅 조성물을 배치하는 것으로써 상기 코팅 조성물이 비닐이미다졸 및 가교제를 포함하는 것, 그리고 상기 비닐이미다졸과 가교제를 반응시켜 표면 상에 가교된 중합체 네트워크를 형성시키는 것을 포함한다.
도 1a 및 1b는 기술되는 바와 같은 예시적인 필터 생성물 및 방법을 나타낸다.
도 2는 멤브레인 전하 밀도의 측정 방법을 위한, 중량% 염료에 대비한 염료 용액 흡광도의 표를 나타낸다.
하기 상세한 설명은 다공성 이온-교환 멤브레인; 이온-교환 멤브레인을 포함하는 생성물; 및 하전된 생물학적 분자를 함유하는 액체로부터 DNA, 예컨대 플라스미드 DNA와 같은 하전된 생물학적 분자를 분리하기 위한 것과 같은, 이온-교환 멤브레인의 사용 방법에 관한 것이다.
상기 다공성 이온-교환 멤브레인은 다공성 중합체성 멤브레인의 표면에 결합되어 있는 이미다졸 이온-교환 기를 포함하는 다공성 중합체성 멤브레인을 포함한다. 상기 이미다졸 이온 교환 기는 하전된 생물학적 분자의 선택적 결합 및 탈-결합 ("용리")을 위하여 pH를 기준으로 하전될 수 있다. 이미다졸 이온 교환 기는 대략 5.2의 pKa로 인하여 플라스미드 DNA와 같은 하전된 생물학적 분자를 정제하는 데에 독특하게 효과적이다. 이미다졸 이온 교환 기는 pH-의존성이며 일시적인 표면 전하 밀도를 제공한다. 산성 조건하에서, 이미다졸 기는 주로 양성 전하를 나타내며, 정전기적 상호작용을 통해 플라스미드 DNA와 같은 하전된 생물학적 기에 결합할 수 있다. 반면, 이미다졸 기는 염기성 조건하에서는 탈양성자화되어 정전기 복합체의 파괴, 및 차후의 더 우수한 수율 및 크로마토그래피 수지 상에 비해 상당히 더 낮은 이온 강도에서의 하전된 생물학적 분자 (예컨대 플라스미드 DNA)의 방출을 초래한다.
상기 다공성 중합체성 멤브레인은 바람직하게는 2개의 반대되는 주 표면 및 상기 2개 표면 사이의 두께를 포함하는 "시트" 또는 "필름"의 형태로 존재한다. 상기 시트는 편평하게 놓여졌을 때 실질적으로 평면이며, 실질적으로 균일한 두께를 갖는다. 평면 시트 멤브레인은 길이 및 너비 차원으로 연장되어 제3 차원에서 두께에 의해 분리되는 2개의 반대되는 주 표면을 한정하는 것으로 간주될 수 있다. 시트는 바람직하게는 길이 및 너비 차원에 비해 상대적으로 균일한 두께를 가질 수 있다. 기술되는 바와 같은 "멤브레인"이 다른 형태의 이온 교환 매체인 다공성 중합체성 수지 입자의 모음과 같은 미립자 형태로 존재하는 것은 아니다. 기술되는 바와 같은 "멤브레인"은 "멤브레인"에 비해 실질적으로 더 큰 두께 차원을 갖는 다공성 크로마토그래피 매체의 다른 형태인 "모노리스(monolith)" 크로마토그래피 장치와도 다르다.
멤브레인은 액체로부터의 하전된 생물학적 분자의 분리 및 수집에 영향을 주며 이미다졸 이온-교환 기에 대한 생물학적 분자의 노출 시간 및 접촉을 강화할 수 있는 물리적 특징을 보유하는 중합체성 다공성 멤브레인 베이스로 구성된다. 다공성 중합체성 멤브레인 베이스는 다공도, 세공 크기 및 두께를 포함한 원하는 물리적 특징을 제공하도록 선택될 수 있다.
기술되는 바와 같은 유용한 멤브레인의 한 가지 특성은 염료-결합 용량의 기술에 의해 측정될 수 있는 전하 밀도로써, 예컨대 제곱 센티미터 당 마이크로그램의 측정과 같이 다양한 그와 같은 기술들이 멤브레인의 단위 면적 당 특정 관능기의 양 (예컨대 그램으로 나타내는 질량 기준)을 측정하는 것으로 알려져 있다. 측정 기술은 일반적으로 멤브레인 표면의 이온 교환 기에 결합되는 알려져 있는 양의 염료를 함유하는 염료 용액에 멤브레인을 노출시키는 것에 의해 수행된다. 음성으로 하전된 염료는 양성으로 하전된 이온 교환 기에 결합된다. 염료가 이온 교환 기에 결합되기 전 및 후에 적격인 자외선 파장에 대한 염료 용액의 흡광도가 측정된다. 멤브레인에의 노출 전 및 후의 염료 용액의 흡광도 차이는 멤브레인 표면 이온 교환 기의 양과 연관될 수 있다. 유용하거나 바람직한 멤브레인에 따르면, 염료-결합 기술에 의해 측정되었을 때의 멤브레인의 전하 밀도는 제곱 센티미터 당 300 마이크로그램 이하, 예컨대 제곱 센티미터 당 10 내지 90 마이크로그램, 또는 제곱 센티미터 당 20 내지 70 마이크로그램의 범위일 수 있다.
멤브레인은 멤브레인이 본 상세한 설명의 방법에 따라 기능하는 것을 가능하게 하는 임의의 두께를 가질 수 있다. 유용하거나 바람직한 두께는 5 내지 300 마이크로미터, 예컨대 10 또는 20 내지 50, 100, 또는 200 마이크로미터의 범위일 수 있다.
다공성 멤브레인은 하전된 생물학적 분자를 함유하는 액체로부터 DNA, 예컨대 플라스미드 DNA와 같은 하전된 생물학적 분자를 분리하는 (선택적으로 흡착 및 방출하는) 데에 있어서 멤브레인이 본원에서 기술되는 바와 같이 효과적이 되는 것을 가능하게 하게 되는 임의의 다공도를 가질 수 있다. 예시적인 다공성 멤브레인은 20 내지 95% 범위에 걸친 다공도, 예컨대 60 내지 90% (부피) 범위의 다공도를 가질 수 있다. 본원에서 사용될 때, 그리고 다공성 멤브레인 관련 기술분야에서, 다공성 멤브레인의 "다공도" (때로는 공극 분율로도 지칭됨)는 멤브레인의 총 부피 중 %로서의 멤브레인 중 공극 (즉 "빈") 공간의 척도로써, 멤브레인의 총 부피에 대비한 멤브레인 공극 부피의 분율로 계산된다. 0%의 다공도를 갖는 바디는 완전히 고형질이다.
유용한 다공성 멤브레인의 예는 미세다공성 멤브레인 또는 거대다공성 멤브레인 중 어느 하나로 간주되는 크기 (평균 세공 크기)의 세공을 가질 수 있다. 예시적인 세공 크기 (평균 세공 크기)는 0.2 내지 10 마이크로미터의 범위일 수 있다. 세공 크기는 종종 다공성 재료의 평균 세공 크기로 기록되는데, 수은 세공측정법(Mercury Porosimetry) (MP), 주사 전자 현미경법(Scanning Electron Microscopy) (SEM), 액체-액체 치환 세공측정법(Liquid-Liquid Displacement Porometry) (LLDP) 또는 공기-액체 치환 세공측정법(Air-Liquid Displacement Porometry) (ALDP)에 의한 것과 같은 공지의 기술에 의해 측정될 수 있다.
멤브레인은 개방형 세공 셀 구조, 필라멘트형, 비-직조형 (예컨대 전기방사 나노섬유 멤브레인) 또는 또 다른 효과적인 다공성 구조를 가질 수 있다.
다공성 중합체성 멤브레인 베이스의 중합체는 멤브레인의 표면에 화학적으로 결합된 이미다졸 이온-교환 기를 가질 수 있는 임의의 것일 수 있다. 다양한 서로 다른 중합체들 (즉 "베이스 중합체들")이 다공성 중합체성 필터 멤브레인을 형성시키는 데에 가용한데, 특정 예로는 비-플루오린화 중합체 예컨대 폴리올레핀 (예컨대 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 폴리할로올레핀), 폴리에스테르, 폴리이미드, 폴리에테르이미드, 폴리술폰, 폴리에테르술폰, 폴리카르보네이트는 물론, 플루오로중합체, 그리고 기타 일반 및 특수 유형의 유용한 중합체들이 포함된다.
적합한 폴리올레핀에는 예를 들면 폴리에틸렌 (예컨대 초-고분자량 폴리에틸렌 (UPE)), 폴리프로필렌, 알파-폴리올레핀, 폴리-3-메틸-1-부텐, 폴리-4-메틸-1-부텐, 그리고 에틸렌, 프로필렌, 3-메틸-1-부텐 또는 4-메틸-1-부텐의 서로 또는 부차량의 다른 올레핀과의 공중합체가 포함되며; 예시적인 폴리할로올레핀에는 폴리테트라플루오로에틸렌, 폴리비닐리덴 플루오라이드, 그리고 이들과 다른 플루오린화 또는 비-플루오린화 단량체의 공-중합체가 포함된다. 예시적인 폴리에스테르에는 폴리에틸렌 테레프탈레이트 및 폴리부틸렌 테레프탈레이트는 물론, 관련 공-중합체들이 포함된다.
이미다졸 이온-교환 기는 어떠한 효과적인 형태로도 다공성 중합체성 멤브레인의 표면에 존재할 수 있으며, 이미다졸 이온-교환 기가 다공성 멤브레인의 베이스 중합체에 화학적으로 결합되는 그라프팅 기술에 의한 것, 또는 다공성 멤브레인의 표면에 이미다졸 이온-교환 기를 포함하는 가교된 중합체 네트워크를 형성하는 기술에 의한 것과 같은 어떠한 효과적인 방법에 의해서도 표면에 배치될 수 있다.
그라프팅 기술에 따르면, 이미다졸 기는 다공성 멤브레인을 형성하는 중합체 재료 중 중합체성 사슬의 탄소 원자에, 즉 멤브레인을 구성하는 베이스 중합체에 화학적으로 결합 (즉 그라프팅, 공유 화학 결합)될 수 있다. 예를 들어 멤브레인이 폴리올레핀 (예컨대 폴리에틸렌)으로 구성되는 경우, 이미다졸 이온-교환 기는 폴리올레핀 (예컨대 폴리에틸렌)의 선형 탄소 백본 탄소 원자에 화학적으로 결합된다. 이미다졸 기는 비닐이미다졸 단량체의 베이스 중합체와의 UV-개시 반응을 포함하는 화학 반응, 및 예컨대 중합체성 백본에서의 멤브레인의 중합체 재료에 비닐이미다졸 단량체를 화학적으로 결합시키기 위한 임의적으로 1종 이상 공-단량체의 존재하에서의 비닐이미다졸 단량체의 중합에 의해 멤브레인 베이스 중합체의 탄소 원자에 결합될 수 있다. 비닐이미다졸 단량체 및 임의적인 공-단량체는 베이스 중합체의 탄소 원자에 결합된 측-쇄를 형성하게 된다. 상기 측쇄는 중합체성 백본의 탄소와 측쇄의 제1 이미다졸 기 사이에 2가의 연결 기를 포함하게 된다. 바람직한 2가 연결 기는 부식성 조건에서의 이미다졸의 안정성을 초래하는 것, 예를 들면 2가 메틸렌 기, 즉 -CH2-와 같은 2가 알킬렌 기일 수 있다.
측-쇄의 길이 (즉 측-쇄의 비닐이미다졸 단량체 및 임의적인 공-단량체의 수)는 5 내지 1000개 단량체, 또는 10 내지 100 또는 500개 단량체와 같은 임의의 유용한 길이일 수 있다.
측-쇄 및 백본에의 결합의 예는 하기 화학식 1의 구조를 가질 수 있다:
Figure pct00001
도시되어 있는 바와 같이, 화학식 1의 측쇄는 오로지 비닐이미다졸 단량체로부터 유래된다. 다른 예에서, 측쇄는 비닐이미다졸, 그리고 비닐이미다졸 단량체 사이에서 측쇄의 일부가 되게 되는 1종 이상의 공단량체로부터 유래될 수 있다. 적합한 공단량체의 예에는 N-[2-(디메틸아미노)에틸]아크릴아미드 및 N-[2-(디에틸아미노)에틸]아크릴아미드가 포함된다.
다공성 멤브레인의 표면에 가교된 중합체 네트워크 코팅을 형성시키는 기술에 따르면, UV 방사선 및 UV 개시제의 존재하에 반응되어 중합된 가교 코팅을 형성하는 비닐이미다졸 및 가교제, 예컨대 2-관능성 가교 분자 예컨대 2-관능성 아크릴레이트 화합물 (예컨대 메틸렌-비스아크릴아미드 (MBAM))을 포함하는 단량체들로부터 중합체성 네트워크가 형성된다.
이미다졸 기를 포함하는 가교된 중합체 네트워크 코팅은 멤브레인의 표면 상에 형성되며, 코팅 또는 이미다졸 기가 멤브레인의 중합체에 화학적으로 결합되지는 않는다. 그러나, 이미다졸 기와 이미다졸 기가 화학적으로 결합되어 있는 가교된 중합체 네트워크 중합체 사이의 연결은 이미다졸 기와 중합체 네트워크 탄소 원자 사이의 직접적인 결합이다. 이미다졸-포함 가교된 중합체 네트워크의 구조를 화학식 2로 나타내었다:
Figure pct00002
화학식 2는 가교된 중합체 네트워크 코팅의 중합체만을 나타낸다. 도시되지 않은 것은 도시되어 있는 가교된 중합체 네트워크가 그 위에 코팅되는 다공성 멤브레인의 베이스 중합체이다.
화학식 1의 그라프팅된 중합체 구조 및 화학식 2의 중합체성 가교 네트워크 코팅 중 이미다졸 이온-교환 기는 모두 기술되는 바와 같은 방법에 따라 기술되는 바와 같은 다공성 이온-교환 멤브레인의 일부로서 사용될 때 유용하거나 유리한 효과성 및 안정성을 나타낸다. 이러한 중합체성 구조는 멤브레인 표면 상에 유용하거나 유리한 수준의 전하 밀도를 생성시킬 수 있다.
또한 유리하게는, 화학식 1 및 화학식 2의 이미다졸 이온-교환 기는 부식성인 세척 주기를 포함한 다수의 사용 주기에 걸친 하전된 분자의 흡착 및 탈착 주기 동안 상대적으로 우수한 안정성을 나타낼 수 있다. 화학식 1 및 화학식 2의 이미다졸 이온-교환 기는 알칼리성 (부식성, 염기성) pH에서 수행되는 임의의 공정 단계 동안 상대적으로 높은 화학적 안정성을 나타낼 수 있다. 중합체 (화학식 1의 베이스 중합체 또는 화학식 2의 가교된 중합체 네트워크 코팅)에의 이미다졸 기의 결합은 염기성 조건에 노출되었을 때 실질적으로 안정하다.
염기성 조건은 예컨대 멤브레인의 표면으로부터 하전된 분자를 제거함으로써 멤브레인이 다시 하전된 분자를 흡착하는 데에 사용될 수 있도록 하는 세척을 위한 멤브레인의 처리 동안 사용될 수 있다. 멤브레인이 재-사용되는 것을 가능하게 하기 위하여 수행되는 이와 같은 유형의 "세척" 단계는 때로는 소듐 히드록시드 용액 또는 또 다른 염기성 (부식성) 용액을 사용하여 멤브레인을 세척하는 것에 의해 수행된다. 멤브레인이 이와 같은 방식으로 세척되는 경우, 중합체의 탄소 원자와 이미다졸 기 질소 원자 사이의 직접적인 결합에 의해, 또는 대안적으로는 기술되는 바와 같이 메틸렌 기와 같은 알킬렌 기를 통해 결합되는 이미다졸 이온-교환 기는 멤브레인의 표면에서 유지되는 것과 관련하여 실질적으로 안정하다. 비교하자면, 다른 2가 연결 기, 예컨대 연결 에스테르 (R-O-C(O)-(이미다졸 질소)) (하기 화학식 3 참조)를 통해 결합되는 이미다졸 이온-교환 기는 염기성 조건에 노출되었을 때 훨씬 더 용이하게 제거될 수 있는 바, 다시 말하자면 훨씬 덜 "부식 안정성"이다.
중합체 (R로 지칭)와 이미다졸 기 사이의 에스테르 (-O-C(O)-) 연결을 포함하는 화학식 3은 부식성 세척 단계에서 경험하는 것들과 같은 부식성 조건에 대하여 덜 안정하다:
Figure pct00003
멤브레인은 다른 비-표적 분자 (예컨대 "불순물")와 함께 하전된 표적 분자의 조합을 함유하는 액체로부터 표적 또는 비-표적 분자를 제거하기 위하여 표적인 하전된 생물학적 분자 1종 또는 조합, 비-표적인 하전된 생물학적 분자, 또는 표적 및 비-표적인 하전된 생물학적 분자의 조합을 선택적으로 흡착하고 임의적으로 선택적으로 탈착 ("용리")하는 데에 유용할 수 있다. 흡착된 후, 하전된 표적 또는 비-표적 분자는 탈착될 수 있다. 표적 및 비-표적 분자 양자의 조합이 흡착되는 경우, 표적 또는 비-표적 분자 중 어느 하나가 선택적으로 탈착될 수 있다.
한 가지 구체적인 방법에 따라, 멤브레인은 비-표적 분자는 흡착하지 않으면서 먼저 원하는 표적 분자를 선택적으로 흡착하는 데에 사용될 수 있다. 흡착된 표적 분자는 이후 용리되어, 개시 액체에서 발견되는 불순물 없이 농축된 형태로 수집될 수 있다.
대안적인 방법에 의해, 멤브레인은 원하는 표적 분자는 흡착하지 않으면서 비-표적 분자인 하전된 생물학적 분자 1종 또는 조합을 선택적으로 흡착하는 데에 사용될 수 있다. 흡착되는 비-표적인 하전된 생물학적 분자는 멤브레인 표면 상에 유지되는 반면, 원하는 표적 분자는 멤브레인으로 유통되어, 흡착된 비-표적 분자들로부터 별도로 수집 및 회수될 수 있다. 이와 같은 방법에 의하면, 멤브레인은 비-표적 분자만을 선택적으로 제거하는 반면, 표적 분자는 멤브레인을 통과한다.
또 다른 방법에 의하면, 멤브레인은 표적 및 비-표적 분자 양자의 조합을 흡착한 후, 이어서 표적 또는 비-표적 분자 중 어느 하나를 선택적으로 탈착하는 데에 사용될 수 있는 바, 결과는 비-표적 분자로부터의 표적 분자의 분리이다. 흡착 후, 표적 또는 비-표적 분자 중 어느 하나를 탈착하는 데에는 선택적 탈착이 사용될 수 있다.
멤브레인으로부터의 선택된 분자의 탈착은 탈착 용액의 선택 특징, 예컨대 하기를 포함하는 화학적 또는 물리적 특징에 의해 달성될 수 있다: 특히 탈착 용액의 조성 (예컨대 계면활성제 또는 이온성 화합물을 첨가하는 것에 의함), 염도, pH 또는 전도도. 탈착은 서로 다른 크기의 생물학적 화합물 (예컨대 RNA 대 DNA)에 대하여 조정될 수 있는 탈착 용액의 체류 시간에 의해서도 조절될 수 있다. 이와 같은 방법에 의하면, 멤브레인은 비-표적 분자로부터 표적 분자를 분리하기 위한 표적 분자 단독 또는 비-표적 분자 단독의 특이적인 탈착을 선택적으로 가능하게 한다. 비-표적 분자만이 탈착되는 경우, 표적 분자는 멤브레인 상에 유지되며, 비-표적 분자를 탈착시키는 단계 후 차후에 별도의 탈착 단계로 탈착될 수 있다.
기술되는 방법에 따르면, 회수될 수 있는 원하는 표적 분자의 양은 유용하게 되는 임의의 양일 수 있다. 유용한 양은 표적 분자의 유형, 특히 표적 분자의 가치에 따라 달라질 수 있다. 회수되는 표적 분자의 유용한 양은 탈착되는 것에 의해 수집되는, 멤브레인 상에 흡착된 표적 분자의 양 (%로 나타냄)으로 측정될 수 있는데; 회수되는 표적 분자의 %는 탈착 전에 멤브레인 상에 원래 흡착되었던 표적 분자의 총량에 대비한 멤브레인 상에 흡착된 다음 탈착되는 표적 분자의 양이다. 이를 기반으로 할 때, 기술되는 바와 같은 방법에 의해 달성될 수 있는 회수 표적 분자의 유용한 양의 예는 원래 멤브레인에 흡착되는 표적 분자의 총량 중 적어도 10, 40, 50, 70, 또는 심지어는 80 또는 90% 탈착일 수 있다.
하전된 생물학적 화합물 (예컨대 표적 분자 및 비-표적 분자)을 함유하는 액체는 임의의 공급원으로부터 유래되며 적어도 1종의 원하는 표적 생물학적 분자를 함유하는 액체일 수 있다. 예시적인 액체는 예를 들면 세균 세포의 알칼리성 용해에 의해 생물학적 분자를 함유하는 세균 세포로부터 유래될 수 있다. 알칼리성 용해법은 일정량의 표적 분자는 물론 RNA 및 세균 내독소와 같은 불순물을 함유하는 생물학적 액체를 제공할 수 있다. 본원에서 기술되는 바와 같은 방법은 RNA 및 내독소와 같은 비-표적 분자는 흡착하지 않으면서 종종 플라스미드 DNA일 수 있는 표적 생물학적 화합물을 선택적으로 흡착할 수 있다. 흡착된 표적 분자는 이후 정제 및 농축된 형태로 용리될 수 있다. 대안적으로, 방법은 플라스미드 DNA를 흡착하지 않으면서 비-플라스미드 DNA (또는 다른 비-표적) 분자를 흡착할 수 있다. 비-흡착 플라스미드 DNA 또는 다른 표적 분자는 흡착되지 않고 멤브레인을 통과함으로써, 수집될 수 있다. 또 다른 선택사항으로써, 방법은 표적 분자를 포함한 하전된 분자들의 조합을 흡착할 수 있으며, 탈착 단계가 표적 또는 비-표적 분자 중 어느 하나를 선택적으로 탈착함으로써 본원에서 기술되는 바와 같이 비-표적 분자로부터 표적 분자를 분리할 수 있다.
유용하거나 바람직한 방법에서, 표적 분자 및 비-표적 불순물을 함유하는 생물학적 액체는 산성 조건과 같은 흡착 조건에서 기술되는 바와 같은 이온-교환 멤브레인과 접촉된다. 흡착 조건은 약 6 미만, 예컨대 약 4.5 내지 약 5.5 범위인 pH일 수 있다. 흡착 조건은 하전된 생물학적 분자가 멤브레인 표면상의 이온-교환 기에 흡착되도록 한다. 원할 경우, 표적 분자, 비-표적 분자 또는 양자는 이미다졸 이온-교환 기에 정전기적으로 견인되는 것에 의해 이온-교환 멤브레인 상에 흡착된다.
흡착에 이어서, 멤브레인은 나머지 생물학적 액체로부터 제거되는데, 특히 멤브레인이 흡착된 표적 분자를 함유하는 경우, 흡착된 하전된 생물학적 분자를 방출하기 위하여 표적 분자와 이미다졸 이온-교환 기 사이의 정전기적 견인을 붕괴시키는 용리 조건에 노출된다. 유용하거나 바람직한 용리 조건은 멤브레인이 그의 표면에 흡착된 하전 분자를 함유하고 있는 동안 멤브레인을 약 7을 초과하는 pH, 예컨대 약 7.5 내지 약 9.5 범위의 pH를 갖는 탈착 용액과 접촉시키는 것에 의해 달성될 수 있다.
임의적으로, 표적 또는 비-표적 분자 중 어느 하나의 선택적 탈착을 달성하기 위하여, 탈착 단계는 하기를 포함한 화학적 또는 물리적 특징과 같은 탈착 용액의 특징을 선택하는 것에 의해 조절될 수 있다: 특히 조성 (예컨대 계면활성제 또는 이온성 화합물을 첨가하는 것에 의함), 염도, pH, 전도도. 선택적 탈착은 서로 다른 크기의 생물학적 화합물에 대하여 조정될 수 있는 탈착 용액의 체류 시간을 선택하는 것에 의해서도 달성될 수 있다.
이온성 멤브레인으로부터 흡착된 분자를 용리시키기 위한 지금까지의 특정 기술들은 멤브레인이 흡착된 하전 분자를 함유하고 있는 경우 염 또는 염 혼합물을 함유함으로써 흡착된 하전 분자를 탈착시키는 탈착 용액에 멤브레인을 노출시키는 단계를 포함하거나 필요로 할 수도 있다. 염이 존재하면, 탈착 용액은 증가된 전도도를 나타낸다. 그와 같은 탈착 용액의 예는 50 mM의 트리스(Tris) 및 1.5 M의 소듐 클로라이드, 또는 또 다른 염 또는 염 혼합물을 함유함으로써 용리 용액이 센티미터 당 40 내지 120 밀리시멘스(milliSiemens) 범위의 전도도를 가지도록 할 수 있다.
본 상세한 설명의 방법이 염을 함유하며 상기 범위의 전도도를 갖는 탈착 용액과 멤브레인 (흡착된 하전 분자를 함유함)을 접촉시키는 단계를 허용하고 그로부터 이익을 얻을 수 있기는 하지만, 기술되는 바와 같은 예시적인 방법에서는 염을 함유하며 염의 존재로 인하여 증가된 전도도를 갖는 탈착 용액과 기술되는 바와 같은 멤브레인을 접촉시키는 단계가 필요하지 않다. 본 상세한 설명의 예시적인 특정 방법에 따르면, 멤브레인이 흡착된 하전 분자를 함유하는 경우 용리를 수행하기 위하여 염을 함유하는 탈착 용액과 멤브레인을 접촉시키는 단계는 필요하지 않으며, 명확하게 회피되거나 배제될 수 있다.
염을 함유하며 용리를 촉진하는 전도도를 갖는 탈착 용액과 멤브레인을 접촉시키는 임의적인 단계는 통상적으로 멤브레인을 낮은 pH의 용액과 접촉시키는 용리 단계와 분리되며 그에 대하여 부가적인 부가 단계이다. 염을 사용한 부가적인 탈착 단계는 회피될 경우 유리하게도 액체로부터 원하는 표적 분자를 분리하는 과정의 전체적인 복잡성 및 비용을 감소시키게 된다.
다공성 멤브레인은 생물학적 액체로부터 표적 분자를 흡착하고 탈착 (용리)하는 데에 효과적인 기술되는 바와 같은 멤브레인을 포함하는 여과 시스템에서 사용되는 필터 또는 필터 카트리지와 같은 필터 바디(filter body) 내에 포함될 수 있다. 상기 여과 시스템은 예를 들면 흡착 조건에서 액체의 유동 통로 중 필터 바디 또는 필터 카트리지의 일부로서 멤브레인을 배치함으로써, 액체가 멤브레인으로 유통되도록 하여 액체 중 하전된 생물학적 분자가 멤브레인 상에 흡착되도록 하게 된다. 필터 바디 또는 필터 카트리지의 구조는 필터 내에서 멤브레인을 지지하여 유체가 필터 유입구로부터 유동하고 멤브레인을 통과한 후 필터 유출구를 통과함으로써 필터 바디를 통과할 때 멤브레인을 통과하도록 하는 1종 이상의 다양한 추가적인 재료 및 구조를 포함할 수 있다. 필터 바디에 의해 지지되는 멤브레인은 특히 주름진 원통, 원통형 패드, 다중 "적층" 멤브레인, 또는 더 비-주름형인 (편평한) 원통형 시트, 주름진 시트와 같은 어떠한 유용한 형상으로도 존재할 수 있다.
필터 바디에 포함되는 멤브레인의 한 가지 예를 도 1a 및 1b에 나타내었다. 나타낸 바와 같이, 필터(100)는 유입구(106), 유출구(108), 그리고 멤브레인(104)을 포함하는 내부를 한정하는 바디(102)를 포함한다. 유입구(106)를 통과하는 액체는 유출구(108)로부터 유출되기 전에 멤브레인(104)을 통과해야 한다.
사용시, 표적 분자 및 불순물을 함유하는 생물학적 액체(110)는 산성 pH와 같은 흡착 조건에서 유입구(106)로 전달된다. 액체(110)가 멤브레인(104)을 통과할 때, 생물학적 액체 중에 함유되어 있는 표적 분자는 멤브레인(114) 표면상의 이미다졸 이온-교환 기에 흡착된다. 액체(110) 중 비-표적 분자는 흡착되지 않는다. 감소된 양의 표적 분자를 함유하는 생물학적 액체(120)는 유출구(108)를 통과하는 것에 의해 바디(102)로부터 유출된다. 액체(110)는 원하는 양의 표적 분자가 멤브레인(104) 상에 흡착되도록 하는 양으로 필터(100)를 통과한다.
도 1b에 나타낸 바와 같이, 이어지는 단계에서는, 탈착 용액(130)을 유입구(106)로 전달하여 탈착 용액이 멤브레인(104)을 통과하도록 하는 것에 의해, 흡착된 표적 분자가 멤브레인(104)으로부터 용리된다. 탈착 용액(130)은 멤브레인(104)으로부터 흡착된 표적 분자를 방출하기에 충분하게 높은 pH를 갖는다. 일정량의 정제된 표적 분자를 함유하는 탈착 용액(140)은 유출구(108)에서 바디(100)로부터 유출된다.
도 1a 및 1b의 대안적인 방법에 의하면, 표적 분자 및 불순물 (비-표적 분자)을 함유하는 액체(110)는 산성 pH와 같은 흡착 조건에서 유입구(106)로 전달된다. 액체(110)가 멤브레인(104)을 통과할 때, 생물학적 액체에 함유되어 있는 비-표적 분자는 멤브레인(114) 표면상의 이미다졸 이온-교환 기에 흡착된다. 액체(110) 중 표적 분자는 흡착되지 않는다. 감소된 양의 비-표적 분자를 함유하는 생물학적 액체(120)는 유출구(108)를 통과하는 것에 의해 바디(102)로부터 유출된다. 생물학적 액체(120) 중에 함유되어 있는 표적 분자는 유용한 방법에 의해 수집될 수 있다.
다른 방법에 따르면, 표적 분자 및 비-표적 분자를 함유하는 액체(110)는 산성 pH와 같은 흡착 조건에서 유입구(106)로 전달된다. 액체(110)가 멤브레인(104)을 통과할 때, 액체에 함유되어 있는 표적 분자 및 비-표적 분자는 멤브레인(114) 표면상의 이미다졸 이온-교환 기에 흡착된다. 감소된 양의 표적 분자 및 감소된 양의 비-표적 분자를 함유하는 생물학적 액체(120)는 유출구(108)를 통과하는 것에 의해 바디(102)로부터 유출된다.
도 1b에 나타낸 바와 같이, 이어지는 단계에서는, 탈착 용액(130)을 유입구(106)로 전달하여 탈착 용액이 멤브레인(104)을 통과하도록 하는 것에 의해, 흡착된 표적 분자 또는 흡착된 비-표적 분자 중 어느 하나가 멤브레인(104)으로부터 선택적으로 용리된다. 탈착 용액(130)은 원하는 조성 (예컨대 계면활성제 또는 이온성 화합물의 존재), 염도, pH, 전도도 등을 포함할 수 있는 pH 및 기타 특성을 가지며, 원하는 시간량 동안 멤브레인(104)과 접촉됨으로써 멤브레인(104) 표면으로부터의 표적 또는 비-표적 분자 중 어느 하나의 선택적인 탈착을 야기한다.
하기의 비-제한적인 실시예에 의해 본 개시내용의 방법 및 멤브레인의 특징 및 장점들을 더 상세하게 예시한다.
[ 실시예 ]
실시예 1: 본 실시예는 코팅을 형성시키기 위한 단량체 및 가교제를 함유하는 용액을 사용한 표면 개질 물질의 제조를 설명한다.
대표적인 실험으로써, 실온에서 하기를 함유하는 용액을 제조하였다: 0.2%의 이르가큐어(Irgacure) 2959, 5%의 메탄올, 3%의 비닐이미다졸, 1%의 메틸렌 비스아크릴아미드 (MBAM) 가교제 및 90.8%의 물.
실시예 2: 본 실시예는 그라프팅 단계에서 사용하기 위한 개시제 용액의 제조를 설명한다.
대표적인 개시제 용액을 형성시키기 위하여, 0.2 그램의 벤조페논 (99%, 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich) 사)을 39.8 그램의 이소프로필 알콜 (IPA)에 용해시켜 0.5 중량% 벤조페논 용액을 수득하였다.
실시예 3: 본 실시예는 그라프팅을 위한 단량체 용액 (A) 및 (B)의 제조를 설명한다.
대표적인 실험으로써, 실온에서 5%의 비닐이미다졸 및 95%의 물을 함유하는 용액 (A)를 제조하였다.
대표적인 실험으로써, 실온에서 4%의 비닐이미다졸, 1%의 디메틸아크릴아미드 및 95%의 물을 함유하는 용액 (B)를 제조하였다.
실시예 4: 본 실시예는 양성 전하를 갖는 중합된 비닐이미다졸 단량체를 갖는 코팅을 사용하여 어떻게 폴리에틸렌 (PE) 멤브레인이 표면 개질될 수 있는지를 설명한다.
대표적인 실험으로써, 이소프로필 알콜 (IPA) 용액을 사용하여 25초 동안 UPE 멤브레인 (1 마이크로미터 공칭 세공 크기 등급)의 시트를 습윤화하였다. 100%의 물을 포함하는 교환 용액을 사용하여 멤브레인을 세정하고 IPA를 제거하였다. 다음에, 멤브레인 시트를 실시예 1에서 기술된 표면 개질 용액에 도입하였다. 멤브레인을 2분 동안 용액에 침지하였다. 멤브레인 시트를 제거하여, 1 mil 폴리에틸렌 시트들 사이에 배치하였다. 테이블 상에 그것을 편평하게 놓으면서 폴리에틸렌/멤브레인 시트/폴리에틸렌 샌드위치 상에 고무 롤러를 굴리는 것에 의해 과량의 용액을 제거하였다. 다음에, 200 내지 600 nm 파장에서 방출하는 퓨전 시스템즈(Fusion Systems) 광대역 UV 노출 실험실 장치를 통해 조립체를 운반하는 수송 장치에 상기 폴리에틸렌 샌드위치를 테이핑하였다. 노출 시간은 얼마나 빠르게 조립체가 UV 장치를 통해 이동하는지에 의해 조절하였다. 본 실시예에서, 조립체는 분 당 10 피트로 UV 챔버를 통해 이동하였다. UV 장치로부터 유출된 후, 샌드위치로부터 멤브레인을 제거하고, 즉시 DI수에 배치한 후, 거기에서 5분 동안 침지하는 것에 의해 멤브레인을 세척하였다. 다음에, 처리된 멤브레인 샘플을 메탄올 중에서 5분 동안 세척하였다. 이와 같은 세척 절차 후, 50℃로 작동하는 오븐의 홀더 상에서 10분 동안 멤브레인을 건조하였다.
실시예 5: 본 실험은 실시예 4에 따라 개질된 멤브레인의 염료 결합 용량 (DBC)이 어떻게 측정되었는지를 설명한다.
염료-결합 용량 (DBC)은 멤브레인 표면 전하 밀도의 간접 시험이다. 더 높은 DBC는 멤브레인 표면에서의 더 높은 전하 밀도, 즉 멤브레인 표면상 이미다졸 기의 더 높은 농도를 의미한다.
실시예 4에 따라 제조된 건조한 47 mm 디스크 멤브레인을 0.002 중량%의 폰세우(Ponceau)-S 염료 (시그마 사)를 함유하는 비커에 배치하였다. 비커에 뚜껑을 덮고, 실온에서 연속적으로 혼합하면서, 5분 동안 멤브레인을 침지하였다. 다음에, 멤브레인 디스크를 제거하고, 512 nm에서 작동하는 캐리(Cary) 분광광도측정기 (아길렌트 테크놀로지스(Agilent Technologies) 사)를 사용하여 염료 용액의 흡광도를 측정하였다. 측정된 결과를 개시 용액 (멤브레인 침지 전)의 흡광도와 비교하였다. 도 2에 도시되어 있는 보정 곡선을 사용하여 염료 용액 흡광도 데이터를 중량%로, 그리고 최종적으로 멤브레인 단위 면적 당 결합된 염료의 질량으로 전환하였다. 이와 같은 절차에 따라 제조된 멤브레인의 염료 결합 용량은 42 μg/cm2이었다.
실시예 6: 본 실시예는 어떻게 PE 멤브레인이 양성 전하를 갖는 그라프팅 중합된 비닐이미다졸 단량체를 사용하여 표면 개질될 수 있는지를 설명한다.
대표적인 실험으로써, 실시예 2에 따라 제조된 개시제 용액을 사용하여 25초 동안 UPE 멤브레인 (0.2 마이크로미터 공칭 세공 크기 등급)의 시트를 습윤화하였다. 100%의 물을 포함하는 교환 용액을 사용하여 멤브레인을 세정하고 멤브레인 표면 상에 개시제를 침전시켰다. 다음에, 멤브레인 시트를 실시예 3에서 기술된 표면 개질 용액 (A)에 도입하였다. 멤브레인을 2분 동안 용액에 침지하였다. 멤브레인 시트를 제거하여, 1 mil 폴리에틸렌 시트들 사이에 배치하였다. 테이블 상에 그것을 편평하게 놓으면서 폴리에틸렌/멤브레인 시트/폴리에틸렌 샌드위치 상에 고무 롤러를 굴리는 것에 의해 과량의 용액을 제거하였다. 다음에, 200 내지 600 nm 파장에서 방출하는 퓨전 시스템즈 광대역 UV 노출 실험실 장치를 통해 조립체를 운반하는 수송 장치에 상기 폴리에틸렌 샌드위치를 테이핑하였다. 노출 시간은 얼마나 빠르게 조립체가 UV 장치를 통해 이동하는지에 의해 조절하였다. 본 실시예에서, 조립체는 분 당 10 피트로 UV 챔버를 통해 이동하였다. UV 장치로부터 유출된 후, 샌드위치로부터 멤브레인을 제거하고, 즉시 DI수에 배치한 후, 거기에서 5분 동안 침지하는 것에 의해 멤브레인을 세척하였다. 다음에, 처리된 멤브레인 샘플을 메탄올 중에서 5분 동안 세척하였다. 이와 같은 세척 절차 후, 50℃로 작동하는 오븐의 홀더 상에서 10분 동안 멤브레인을 건조하였다.
이와 같은 절차에 따라 제조된 멤브레인의 염료 결합 용량은 10 μg/cm2이었다. 측정은 실시예 5에서 설명된 바와 같이 수행되었다.
실시예 7: 본 실시예는 어떻게 PE 멤브레인이 양성 전하를 갖는 그라프팅 중합된 비닐이미다졸 및 N,N 디메틸 아크릴아미드 단량체를 사용하여 표면 개질될 수 있는지를 설명한다.
대표적인 실험으로써, 실시예 2에 따라 제조된 개시제 용액을 사용하여 25초 동안 UPE 멤브레인 (0.2 마이크로미터 공칭 세공 크기 등급)의 시트를 습윤화하였다. 100%의 물을 포함하는 교환 용액을 사용하여 멤브레인을 세정하고 멤브레인 표면 상에 개시제를 침전시켰다. 다음에, 멤브레인 시트를 실시예 3에서 기술된 표면 개질 용액 (B)에 도입하였다. 멤브레인을 2분 동안 용액에 침지하였다. 멤브레인 시트를 제거하여, 1 mil 폴리에틸렌 시트들 사이에 배치하였다. 테이블 상에 그것을 편평하게 놓으면서 폴리에틸렌/멤브레인 시트/폴리에틸렌 샌드위치 상에 고무 롤러를 굴리는 것에 의해 과량의 용액을 제거하였다. 다음에, 200 내지 600 nm 파장에서 방출하는 퓨전 시스템즈 광대역 UV 노출 실험실 장치를 통해 조립체를 운반하는 수송 장치에 상기 폴리에틸렌 샌드위치를 테이핑하였다. 노출 시간은 얼마나 빠르게 조립체가 UV 장치를 통해 이동하는지에 의해 조절하였다. 본 실시예에서, 조립체는 분 당 10 피트로 UV 챔버를 통해 이동하였다. UV 장치로부터 유출된 후, 샌드위치로부터 멤브레인을 제거하고, 즉시 DI수에 배치한 후, 거기에서 5분 동안 침지하는 것에 의해 멤브레인을 세척하였다. 다음에, 처리된 멤브레인 샘플을 메탄올 중에서 5분 동안 세척하였다. 이와 같은 세척 절차 후, 50℃로 작동하는 오븐의 홀더 상에서 10분 동안 멤브레인을 건조하였다.
실시예 8: 본 실시예는 어떻게 폴리에틸렌 (PE) 멤브레인이 비닐이미다졸 단량체 및 N-[2-(디메틸아미노)에틸]아크릴아미드 단량체 양자를 함유하는 중합된 가교 코팅을 사용하여 표면 개질될 수 있는지를 설명한다.
대표적인 실험으로써, 이소프로필 알콜 (IPA) 용액을 사용하여 25초 동안 UPE 멤브레인 (1 마이크로미터 공칭 세공 크기 등급)의 시트를 습윤화하였다. 100%의 물을 포함하는 교환 용액을 사용하여 멤브레인을 세정하고 IPA를 제거하였다. 다음에, 4%의 N-[2-(디메틸아미노)에틸]아크릴아미드, 4%의 비닐이미다졸, 2%의 메틸렌 비스아크릴아미드, 0.4%의 이르가큐어 2959, 10%의 메탄올 및 79.6%의 탈이온수를 함유하는 표면 개질 용액에 멤브레인 시트를 도입하였다. 멤브레인을 2분 동안 표면 개질 용액에 침지하였다. 멤브레인 시트를 제거하여, 2개의 폴리에틸렌 시트들 사이에 배치하였다. 테이블 상에 그것을 편평하게 놓으면서 폴리에틸렌/멤브레인 시트/폴리에틸렌 샌드위치 상에 고무 롤러를 굴리는 것에 의해 과량의 용액을 제거하였다. 다음에, 200 내지 600 nm 파장에서 방출하는 퓨전 시스템즈 광대역 UV 노출 실험실 장치를 통해 조립체를 운반하는 수송 장치에 상기 폴리에틸렌 샌드위치를 테이핑하였다. 노출 시간은 얼마나 빠르게 조립체가 UV 장치를 통해 이동하는지에 의해 조절하였다. 본 실시예에서, 조립체는 분 당 9 피트로 UV 챔버를 통해 이동하였다. UV 장치로부터 유출된 후, 샌드위치로부터 멤브레인을 제거하고, 즉시 DI수에 배치한 후, 거기에서 5분 동안 침지하는 것에 의해 멤브레인을 세척하였다. 다음에, 처리된 멤브레인 샘플을 메탄올 중에서 5분 동안 세척하였다. 이와 같은 세척 절차 후, 50℃로 작동하는 오븐의 홀더 상에서 10분 동안 멤브레인을 건조하였다.
비교 실시예 9: 본 실시예는 어떻게 폴리에틸렌 (PE) 멤브레인이 N-[2-(디메틸아미노)에틸]아크릴아미드 단량체를 함유하는 중합된 가교 코팅을 사용하여 표면 개질되는지를 설명한다.
대표적인 실험으로써, 이소프로필 알콜 (IPA) 용액을 사용하여 25초 동안 UPE 멤브레인 (1 마이크로미터 공칭 세공 크기 등급)의 시트를 습윤화하였다. 100%의 물을 포함하는 교환 용액을 사용하여 멤브레인을 세정하고 IPA를 제거하였다. 다음에, 8%의 N-[2-(디메틸아미노)에틸]아크릴아미드, 2%의 메틸렌 비스아크릴아미드, 0.4%의 이르가큐어 2959, 10%의 메탄올 및 79.6%의 탈이온수를 함유하는 표면 개질 용액에 멤브레인 시트를 도입하였다. 멤브레인을 2분 동안 표면 개질 용액에 침지하였다. 멤브레인 시트를 제거하여, 2개의 폴리에틸렌 시트들 사이에 배치하였다. 테이블 상에 그것을 편평하게 놓으면서 폴리에틸렌/멤브레인 시트/폴리에틸렌 샌드위치 상에 고무 롤러를 굴리는 것에 의해 과량의 용액을 제거하였다. 다음에, 200 내지 600 nm 파장에서 방출하는 퓨전 시스템즈 광대역 UV 노출 실험실 장치를 통해 조립체를 운반하는 수송 장치에 상기 폴리에틸렌 샌드위치를 테이핑하였다. 노출 시간은 얼마나 빠르게 조립체가 UV 장치를 통해 이동하는지에 의해 조절하였다. 본 실시예에서, 조립체는 분 당 9 피트로 UV 챔버를 통해 이동하였다. UV 장치로부터 유출된 후, 샌드위치로부터 멤브레인을 제거하고, 즉시 DI수에 배치한 후, 거기에서 5분 동안 침지하는 것에 의해 멤브레인을 세척하였다. 다음에, 처리된 멤브레인 샘플을 메탄올 중에서 5분 동안 세척하였다. 이와 같은 세척 절차 후, 50℃로 작동하는 오븐의 홀더 상에서 10분 동안 멤브레인을 건조하였다.
실시예 10: 실시예 4의 멤브레인 3개 층을 서로 적층하고, 50 mM 칼륨 아세테이트 630 mM NaCl pH 5 중 125 ng/uL의 플라스미드 DNA 용해물 12 mL를 사용하여 시험하였다. 이어서, 50 mM 칼륨 아세테이트 630 mM NaCl pH 5를 사용하여 멤브레인을 세척한 다음, 50 mM 트리스 pH 9를 사용하여 용리시켰다. 93%의 수율을 동반하여, 결합 용량은 4.6 mg/mL이었다.
실시예 11: 실시예 4의 멤브레인 3개 층을 서로 적층하고, 0.875 M 칼륨 아세테이트 pH 5 중 41 ng/uL의 플라스미드 DNA 용액 12 mL를 사용하여 시험하였다. 첫 번째 경우에서는, 50 mM 트리스 1.5 M NaCl pH 9를 사용하여 용리를 수행함으로써, 353 ug의 DNA를 산출하였다. 두 번째 경우에서는, 50 mM 트리스 1.5 pH 9를 사용하여 용리를 수행함으로써, 343 ug을 산출하였다. 수율은 용리 완충제 중 염이 있고 없는 것이 유사하였다.
실시예 12: 실시예 8의 멤브레인 2개 층을 서로 적층하고, 50 mM 칼륨 아세테이트 630 mM NaCl pH 5 중 RNase를 동반한 30 ng/uL의 플라스미드 DNA 용해물 8 mL를 사용하여 시험하였다. 이어서, 50 mM 칼륨 아세테이트 630 mM NaCl pH 5를 사용하여 멤브레인을 세척한 다음, 50 mM 트리스 1.5 M NaCl pH 9를 사용하여 용리시켰다. 64%의 수율을 동반하여, 결합 용량은 3.3 mg/mL이었다.
비교 실시예 13: 비교 실시예 9의 멤브레인 2개 층을 서로 적층하고, 50 mM 칼륨 아세테이트 630 mM NaCl pH 5 중 RNase를 동반한 30 ng/uL의 플라스미드 DNA 용해물 8 mL를 사용하여 시험하였다. 이어서, 50 mM 칼륨 아세테이트 630 mM NaCl pH 5를 사용하여 멤브레인을 세척한 다음, 50 mM 트리스 1.5 M NaCl pH 9를 사용하여 용리시켰다. 84%의 수율을 동반하여, 결합 용량은 2.3 mg/mL이었다.
예시적인 실시양태 및 특징들을 참조하여 다양한 방법 및 멤브레인들이 본원에서 개시되기는 하였지만, 상기한 실시양태 및 특징들이 본 개시내용의 영역을 제한하고자 하는 것은 아니며, 관련 기술분야 통상의 기술자라면, 본원의 개시내용을 기반으로 다른 변이, 변형 및 다른 실시양태들을 떠올리게 될 것임을 알고 있을 것이다. 이에 따라, 본 개시내용은 그와 같은 모든 변이, 변형 및 대안적인 실시양태들을 이하에서 제시되는 청구범위의 기술사상 및 영역 내에 포괄하는 바이다.

Claims (39)

  1. 다공성 이온-교환 멤브레인 시트를 사용하여 액체로부터 하전된 생물학적 분자를 분리하는 방법으로서, 하전된 생물학적 분자를 함유하는 액체를, 하전된 생물학적 분자가 이온-교환 멤브레인 상에 흡착되도록 하는 흡착 조건에서, 다공성 중합체성 시트 및 다공성 중합체성 시트 표면에 이미다졸 이온-교환 기를 포함하는 다공성 이온-교환 멤브레인과 접촉시키는 것을 포함하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 하전된 생물학적 분자가 플라스미드 DNA인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 흡착 조건이 약 6 미만의 pH를 포함하는 것인 방법.
  4. 제1항에 있어서, 흡착된 생물학적 분자를 용리 조건에서 이온-교환 멤브레인으로부터 용리시키는 것을 추가적으로 포함하는 방법.
  5. 제4항에 있어서, 용리 조건이 약 7을 초과하는 pH를 포함하는 것인 방법.
  6. 제1항에 있어서, 이온-교환 멤브레인이 20 내지 95% (부피)의 다공도를 갖는 것인 방법.
  7. 제1항에 있어서, 이온-교환 멤브레인이 5 내지 300 마이크로미터 범위의 두께를 갖는 것인 방법.
  8. 제1항에 있어서, 이온-교환 멤브레인이 0.2 내지 10 마이크로미터 범위의 평균 세공 크기를 갖는 세공을 포함하는 것인 방법.
  9. 제1항에 있어서, 다공성 중합체성 시트가 폴리올레핀, 폴리술폰, 폴리비닐리덴플루오라이드, 폴리올레핀, 폴리프로필렌, 셀룰로스 아세테이트, 나일론 및 폴리테트라플루오로에틸렌으로 이루어진 군으로부터 선택되는 베이스 중합체를 포함하는 것인 방법.
  10. 제9항에 있어서, 다공성 중합체 시트가 2종 이상의 베이스 중합체를 포함하는 것인 방법.
  11. 제9항에 있어서, 베이스 중합체가 초고분자량 폴리에틸렌을 포함하는 것인 방법.
  12. 멤브레인 표면에 이미다졸 이온-교환 기를 포함하는 다공성 이온-교환 멤브레인으로서, 여기서 이미다졸 이온-교환 기의 전하는 pH-의존성이고, 5.2 미만 범위의 pH에서 양성 전하 및 5.2 초과 범위의 pH에서 음성 전하를 나타내는 것인 다공성 이온-교환 멤브레인.
  13. 제12항에 있어서, 중합체성 다공성 멤브레인 베이스에 화학적으로 결합된 이미다졸 이온-교환 기를 갖는 중합체성 다공성 멤브레인 베이스를 포함하는 멤브레인.
  14. 제13항에 있어서, 이미다졸 이온-교환 기가 2가 알킬렌 연결 기를 통해 중합체성 베이스의 탄소-대-탄소 연결의 탄소 원자에 결합된 것인 멤브레인.
  15. 제14항에 있어서, 2가 알킬렌 연결 기가 -CH2-인 멤브레인.
  16. 제13항에 있어서, 베이스 중합체의 분지로서 연장되는 이미다졸 이온-교환 기를 포함하는 중합체성 측쇄를 포함하는 멤브레인.
  17. 제16항에 있어서, 중합체성 측쇄가 중합된 비닐이미다졸 단량체 및 임의적인 공-단량체로부터 유래된 것인 멤브레인.
  18. 제12항에 있어서, 중합체성 다공성 멤브레인 베이스, 및 베이스 표면에 이미다졸 이온-교환 기를 포함하는 가교된 중합체 네트워크를 포함하는 멤브레인.
  19. 제18항에 있어서, 가교된 중합체 네트워크가
    중합체 백본,
    중합체 백본의 탄소 원자에 결합된 이미다졸 기, 및
    중합체 백본의 탄소 원자에 결합된 2가 가교 기
    를 포함하는 것인 멤브레인.
  20. 제19항에 있어서, 중합체 백본이 중합된 비닐이미다졸 단량체를 포함하는 것인 멤브레인.
  21. 제19항에 있어서, 2가 가교 기가 2-관능성 아크릴아미드 가교 단량체로부터 유래된 것인 멤브레인.
  22. 제21항에 있어서, 2-관능성 아크릴아미드 가교 단량체가 N,N-디메틸 아크릴아미드인 멤브레인.
  23. 제12항에 있어서, 20 내지 95% (부피)의 다공도를 갖는 멤브레인.
  24. 제12항에 있어서, 5 내지 300 마이크로미터 범위의 두께를 갖는 멤브레인.
  25. 제12항에 있어서, 0.2 내지 10 마이크로미터 범위의 평균 세공 크기의 세공을 갖는 멤브레인.
  26. 제13항에 있어서, 베이스 중합체가 폴리올레핀, 폴리프로필렌, 폴리술폰, 폴리비닐리덴플루오라이드, 폴리프로필렌, 셀룰로스 아세테이트, 나일론 또는 폴리테트라플루오로에틸렌 중 1종 이상을 포함하는 것인 멤브레인.
  27. 제13항에 있어서, 베이스 중합체가 초고분자량 폴리에틸렌인 멤브레인.
  28. 다공성 중합체성 멤브레인 베이스의 표면에 이미다졸 이온-교환 기를 화학적으로 결합시키는 것을 포함하는, 이미다졸 이온-교환 기를 포함하는 다공성 이온-교환 멤브레인을 제조하는 방법.
  29. 제28항에 있어서, 화학적으로 결합시키는 것이, 다공성 중합체성 멤브레인 베이스의 표면에 이미다졸 이온-교환 기를 그라프팅하는 것을 포함하는 것인 방법.
  30. 제29항에 있어서, 그라프팅하는 것이, 중합체성 다공성 멤브레인 베이스를 비닐이미다졸 단량체 및 임의적인 공-단량체와 반응시켜 베이스로부터 연장되는 이미다졸 이온 교환 기를 포함하는 중합체성 측쇄를 형성시키는 것을 포함하는 것인 방법.
  31. 제30항에 있어서, 공단량체가 N-[2-(디메틸아미노)에틸]아크릴아미드 및 N-[2-(디에틸아미노)에틸]아크릴아미드인 방법.
  32. 제28항에 있어서, 멤브레인의 이미다졸 이온-교환 기가 5.2 미만 범위의 pH에서 양성 전하 및 5.2 초과 범위의 pH에서 음성 전하를 나타내는 것인 방법.
  33. 제28항에 있어서, 이온-교환 멤브레인이 20 내지 95% (부피)의 다공도를 갖는 것인 방법.
  34. 제28항에 있어서, 이온-교환 멤브레인이 5 내지 300 마이크로미터 범위의 두께를 갖는 것인 방법.
  35. 제28항에 있어서, 이온-교환 멤브레인이 0.2 내지 10 마이크로미터 범위 평균 세공 크기를 갖는 세공을 포함하는 것인 방법.
  36. 제28항에 있어서, 베이스 중합체가 폴리올레핀, 폴리프로필렌, 폴리술폰, 폴리비닐리덴플루오라이드, 폴리프로필렌, 셀룰로스 아세테이트, 나일론 또는 폴리테트라플루오로에틸렌 중 1종 이상을 포함하는 것인 방법.
  37. 제28항에 있어서, 베이스 중합체가 초고분자량 폴리에틸렌인 방법.
  38. 제28항에 있어서, 화학적으로 결합시키는 것이,
    비닐이미다졸 및 가교제를 포함하는 코팅 조성물을 베이스의 표면에 배치하는 단계, 및
    비닐이미다졸과 가교제를 반응시켜, 표면 상에 가교된 중합체 네트워크를 형성시키는 단계
    를 포함하는 것인 방법.
  39. 제38항에 있어서, 다공성 이온-교환 멤브레인이, 중합체성 다공성 멤브레인 베이스, 및 베이스 표면에 이미다졸 이온-교환 기를 포함하는 가교된 중합체 네트워크를 포함하는 것인 방법.
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