KR20230022901A - 신규 암 치료용 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 암 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로서, 본 발명은 신호조절 단백질(signal-regulatory protein) 또는 상기 신호조절 단백질을 포함하는 융합단백질 및 다량체화 도메인을 포함하는 융합단백질의 다량체 및 면역원성 세포사멸 유도제를 유효성분으로 포함하는 암 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

Description

신규 암 치료용 조성물{A novel pharmaceutical composition for treating cancer}
본 발명은 신규 암 치료용 조성물에 관한 것이다.
암을 치료하기 위한 방법으로는 수술을 통한 치료, 방사선 치료 그리고 항암제 투여를 통한 치료 등이 있으나 이러한 치료방법들은 부작용이 수반되거나, 암의 진행 정도에 따라 시술이 제한적으로 적용된다. 특히, 항암제는 거듭된 연구결과 양적인 측면에서는 그 종류가 늘었지만, 질적인 측면에서는 큰 변화가 없었다. 그 이유는 항암제 대부분이 분열이 왕성한 세포의 세포주기를 멈추게 하고 사멸케 하는 메커니즘으로 작동하기 때문이며, 이로 인해 암세포 이외에도 정상적으로 분열하는 세포를 공격해서 항암제의 대표적 부작용인 탈모, 식욕부진 그리고 백혈구 감소로 인한 면역력 저하 등이 일어난다. 대표적인 항암제인 독소루비신은 안트라사이클린계 항종양제에 속하는 항암제로, 안트라사이클린계 항암제는 세포 주기 선택적으로 작용하는 항암제로 세포 분열을 저해하며, 악성 림프종(림프육종, 호지킨병 및 비호지킨병), 소화기암(위암, 간암, 직장암, 담낭 및 담관암, 결장암, 췌장암), 급성 골수성 백혈병, 연조직 골육종, 유방암, 난소암, 폐암, 기관지암, 방광암, 윌름종양 등 다양한 암 치료에 사용된다. 최근 연구결과에 따르면 안트라사이클린계 항암제는 칼레티귤린(caleticulin)의 세포막으로의 세포사멸 전 이동(preapoptotic translocation)을 유도하여 암세포의 면역원성 세포사멸을 유도하는 것으로 보고된 바 있다(Obeid et al., Nat. Med., 13(1): 54-61, 2007). 한편, 상기와 같은 면역기능 강화를 통한 암 치료 전략은 최근 들어 주목을 받고 있는데, 면역 세포와 암의 상관관계 연구는 전 세계적으로 1970년대부터 시작되어 암과 싸울 수 있는 생체의 무기인 면역 세포들의 기능들이 매우 중요시 되면서 2000년 이후로 기하급수적으로 연구 보고되고, 항암 면역 치료 항체인 Keytruda(Pembrolizumab, Merck사 개발)가 2014년 9월 미국 FDA를 통해 신속 승인(Accelerated approval)을 받는 등 항암 면역 치료 연구에 대한 중요성이 대두되고 있다. 특히 면역 세포들은 암세포에 대하여 순찰하고 찾아다니며 움직이기 때문에 그 효과가 국소에 그치지 않고 전신의 암 발병을 감시, 억제하는 작용을 해줄 뿐 아니라, 다양한 암세포에 적용 가능하다. 따라서, 기존의 암세포 괴사에 집중하는 기존 접근 방식에서 벗어나, 인체 내 면역세포의 역동적인 네트워킹을 조절함으로써 암 미세환경을 극복하는 암 예방 및 치료 전략의 새로운 패러다임 제시가 필요한 상태이다.
본 발명은 상기 문제점을 포함한 다양한 문제점을 해결하기 위한 것으로서, 면역원성 세포사멸(immunogenic cell death) 유도 및 면역세포 네트워킹 제어를 통한 암 면역치료 효율을 극대화할 수 있는 면역 치료제 및 그의 용도를 제공하는 것을 목적으로 한다. 그러나 이러한 과제는 예시적인 것으로, 이에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 관점에 따르면, V6I, V27I, A27I, I31F, E47V, K53R, E54Q, H56P, L66T, S66Y 및 V92I로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환변이를 포함하는 Sirp 고친화성 변이체 및 항체의 중쇄의 힌지 부위와 CH2 및 CH3 부분을 포함하는 Fc 단편을 포함하는 융합단백질 및 안트라사이클린 계열 항암제를 유효성분으로 포함하는 암치료용 약학적 조성물이 제공된다.
본 발명의 일 관점에 따르면, V6I, V27I, A27I, I31F, E47V, K53R, E54Q, H56P, L66T, S66Y 및 V92I로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환변이를 포함하는 Sirp 고친화성 변이체 및 항체의 중쇄의 힌지 부위와 CH2 및 CH3 부분을 포함하는 Fc 단편을 포함하는 융합단백질 및 안트라사이클린 계열 항암제를 치료를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 상기 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암 치료 방법이 제공된다.
상기한 바와 같이 이루어진 본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명은 신호조절 단백질과 면역원성 세포사멸 유도제의 병용투여에 의한 상승효과에 의해 암치료효과를 극대화할 수 있다.
도 1a는 본 발명의 일 실시예에 따른 페리틴 중쇄 단백질 및 Sirpα로 구성된 융합단백질의 자기조립에 의해 생성되는 나노케이지의 내부에 독소루비신이 적재된 독소루비신 적재 Sirp 단백질 다량체의 개략적인 모습을 도시한 개요도이고, 도 1b는 실제 제조된 본 발명의 일 실시예에 따른 독소루비신이 적재된 FHSirpα 다량체(FHSirpα-dox)를 형광 FPLC 분석한 결과 나타내는 그래프이고, 도 1c는 실제 제조된 본 발명의 일 실시예에 따른 독소루비신이 적재된 FHSirpα 다량체(FHSirpα-dox)의 입도를 동적 광산란(DLS) 분석을 통해 분석한 결과를 나타내는 히스토그램이며, 도 1d는 상기 독소루비신이 적재된 FHSirpα 다량체(FHSirpα-dox)를 투과 전자현미경으로 촬영한 사진이다.
도 2a는 실험예 1-1의 in vivo 항암활성 분석을 위한 동물실험의 실험스케쥴을 나타낸 개요도이고, 도 2b는 상기 도 2a의 스케쥴대로 수행한 in vivo 항암효과 분석결과를 나타내는 그래프이며(*: P < 0.05, ***: P < 0.001), 도 2c는 암세포 접종 25일째 각 실험군의 종양부위를 촬영한 사진이고(좌우측은 동일 실험군의 독립적인 실험동물을 나타냄), 도 2d는 암세포 접종 25일째 각 실험군으로부터 적출된 종양조직의 무게를 측정한 결과를 나타내는 그래프이다(***: P < 0.001).
도 3a는 본 발명의 일 실시예에 따른 FHSirpα-dox 및 대조군으로 완충액을 투여한 암 모델 동물에서 적출한 종양조직 내의 대식세포 및 수지상세포의 존재여부 및 비율을 확인하고자 각각 항-F4/80 항체 및 항-CD11c 항체를 이용하여 FACS 분석을 수행한 결과를 나타내는 히스토그램이고, 도 3b는 종양조직에서 분리된 전체 세포수 대비 F4/80-양성 세포(좌측) 및 CD11c-양성 세포(우측)의 비율을 나타내는 그래프이다(*: P < 0.05, ***: P < 0.001).
도 4a는 실험동물에 CT26.CL25 암세포 접종 후 완충액 또는 다양한 실험물질(dox, wrFH-dox, mSirpα + dox 및 FHSirpα-dox) 투여 후, 분리된 종양배액림프절(tumor drained lymph node) 세포에 다양한 작용 펩타이드(β-galactosidase, gp70 유래의 AH1 펩타이드 및 PIA 펩타이드) 처리 시 INF-γ의 발현정도를 측정한 결과를 나타내는 그래프이고(*: P < 0.05, **: P < 0.01), 도 4b는 상기 도 4a의 실험동물로부터 분리된 비장세포에 상기 작용 펩타이드 처리 시 INF-γ의 발현정도를 측정한 그래프이다(*: P < 0.05, **: P < 0.01).
도 5는 실험동물에 종양이식 후 완충액 또는 본 발명의 일 실시예에 따른 독소루비신의 병용투여제(FHSirpα-dox) 투여 후 종양 부위에서의 CD8+ T 세포의 축적 정도를 비교한 결과를 나타내는 면역조직화학분석 결과로서, 상단은 완충액 투여 후의 종양조직 절편에 대한 형광염색 사진이고, 하단은 본 발명의 일 실시예에 따른 FHSirpα-dox 투여 후 종양조직 절편에 대한 형광염색 사진이며, 맨 좌측열은 DAPI를 이용하여 핵을 염색한 결과를 나타내고, 왼쪽에서 두 번째 열은 항-CD8 항체를 이용하여 염색한 결과를 나타내며, 왼쪽에서 세 번째 열은 상기 DAPI 염색과 항-CD8 항체 염색 결과를 병합한 이미지이고, 맨 우측열은 세포 분절(cell segmentation) 분석 결과를 나타낸다.
도 6a는 CT26.CL25 암세포 접종에 의한 암 모델 동물에 완충액, wtFH-dox 및본 발명의 일 실시예에 따른 FHSirpα-dox를 각각 종양내 1회 투여 후, 시간의 경과에 따른 종양의 크기를 측정한 결과를 나타내는 그래프이고(**: P < 0.01, ***: P < 0.001), 도 6b는 암세포 접종 후 25일째에 상기 암 모델 동물의 종양접종부위를 촬영한 사진이며, 도 6c는 상 도 6a의 실험동물로부터 암세포 접종 25일째에 적출된 종양조직의 무게를 측정한 결과를 나타내는 그래프이다(*: P < 0.05, **: P < 0.01).
도 7a는 CT26.CL25 암세포 접종에 의한 암 모델 동물에 완충액 또는 다양한 실험물질(dox, wtFH-dox, mSirpα + dox 및 FHSirpα-dox) 투여 후, 암세포 접종 25일째에 종양조직을 적출하고 해당 부위를 봉합한 후, 반대쪽에 최초 접종한 CT26.CL25 암세포와 동일한 양인 1x106 세포를 접종하여 재투여(rechallenge)한 후, 대조군과 FHSirpα-dox 처리군에 대하여 시간의 경과에 따른 2차 암세포 접종부위를 촬영한 일련의 사진이고(상단과 하단은 동일 동물의 촬영각도를 달리하여 촬영한 사진임), 도 7b는 상기 암 모델동물의 시간의 경과에 따른 무-종양 동물의 비율을 측정한 그래프이며, 도 7c는 상기 암 모델동물의 시간의 경과에 따른 생존율을 측정한 그래프이다,
도 8a는 CT26 암세포 접종에 의한 암 모델 동물에 완충액 또는 다양한 실험물질(dox, wtFH-dox, mSirpα + dox 및 FHSirpα-dox) 정맥주사로 투여 후, 암세포 접종 25일째까지 3일 간격으로 종양조직의 크기를 측정한 결과를 나타내는 그래프이고(***: P < 0.001), 도 8b는 상기 암 모델 동물에서 암세포 접종 25일째에 적출된 종양조직의 무게를 측정한 결과를 나타내는 그래프이다(*: P < 0.05, ***: P < 0.001).
도 9a는 B16F10-Ova 암세포 접종에 의한 암 모델 동물에 완충액 또는 다양한 실험물질(dox, wtFH-dox, mSirpα + dox 및 FHSirpirpα-dox) 정맥주사로 투여 후, 암세포 접종 25일째까지 3일 간격으로 종양조직의 크기를 측정한 결과를 나타내는 그래프이고(**: P < 0.01), 도 9b는 상기 암 모델 동물에서 암세포 접종 25일째에 적출된 종양조직의 무게를 측정한 결과를 나타내는 그래프이다(**: P < 0.01).
도 10은 B16F10-Ova 암세포 접종에 의한 암 모델 동물에 완충액 또는 FHSirpα-dox 투여 후, 종양조직을 적출하여 단일세포화한 후 분리된 수지상세포를 OT-1 T 세포와 공배양한 후 배양상등액에 존재하는 INF-γ의 양을 정량함으로써 교차프라이밍 능력을 확인한 그래프이다(*: P < 0.05).
도 11a는 상기 B16F10.Ova 암세포 접종에 의한 암 모델 동물에 완충액 또는 다양한 실험물질(dox, FHSirpα 및 FHSirpα-dox) 투여 후, CFSE로 염색한 OT-1 T-세포를 주입하고 해당 암 모델 동물에서 적출한 종양배액림프절 세포를 단일세포화한 후, 이를 FACS 분석한 결과를 나타내는 히스토그램이고, 도 11b는 상기 도 11a의 결과를 CFSE로 염색한 OT-1 T-세포의 세대별 비율(%)을 나타내는 그래프이다(**: P < 0.01).
도 12a는 본 발명의 일 실시예에 따른 FHSirpα 및 FcSirpα의 BMDM의 암세포(HT29)에 대한 탐식작용에 미치는 영향을 분석한 일련의 형광현미경 사진이고, 도 12b는 상기 도 12a의 BMDM의 암세포 탐식율을 정량화한 결과를 나타내는 그래프이며(*: P < 0.05; ***: P < 0.001), 도 12c는 다양한 농도(50 nM, 500 nM, 및 5 μM)의 FcSirpα 및 400 nm의 FHSirpα를 BMDM에 처리시 HT29 암세포에 대한 탐식 정도를 나타낸 그래프이다(***: P < 0.001).
도 13a는 B16F10 암세포를 피하주입하여 암을 유발시킨 C57BL/6 야생형 마우스에 본 발명의 일 실시예에 따른 FcSirpα 및/또는 미토잔트론을 종양내 주사로 투여한 후 시간의 경과에 따른 종양조직의 부피를 측정한 결과를 나타내는 그래프이고(***: P < 0.001), 도 13b는 상기 도 13a의 실험에 사용된 실험동물의 암세포 주입후 21일째까지의 실험동물의 생존률을 기록한 그래프이며(***: P < 0.001), 도 13c는 상기 실험동물을 암세포 주입후 21일째에 희생시킨 후 적출한 암조직의 평균 무게를 측정한 결과를 나타내는 그래프이고, 도 13d는 상기 실험동물의 몸무게의 변화를 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 14는 B16F10 암세포를 피하주입하여 암을 유발시킨 C57BL/6 야생형 마우스에 본 발명의 일 실시예에 따른 FcSirpα 및/또는 미토잔트론을 종양내 주사로 투여한 후, 암세포 주입 21일째에 실험동물을 희생시킨 후 적출된 암조직을 단일세포화한 후 항-CD8 항체를 이용하여 유세포분석을 수행함으로써 CD8+ T 세포 침윤정도를 측정한 결과를 나타내는 그래프이다(*: P < 0.05).
용어의 정의
본 문서에서 사용되는 "면역원성 세포사멸(immunogenic cell death)"는 안트라사이클린(anthracyclines), 옥살리플라틴(oxaliplatin) 및 보르테조밉(bortezomib)과 같은 세포증식 억제제나 방사선 요법 및 광역학 치료법에 의해 야기되는 일종의 세포사멸을 의미한다. 상기 면역원성 세포사멸은 일반적인 세포사멸과 달리, 암세포의 면역학적 세포사멸은 수지상세포(dendritic cell)의 활성화와 그에 따른 특이적인 T 세포 반응의 활성화를 통해 효과적인 항암 면역반응을 유발할 수 있다. 면역원성 세포사멸을 유발하는 물질을 "면역원성 세포사멸 유도제(immunogenic cell death inducer)"라고 한다. 상기 면역원성 세포사멸 및 면역원성 세포사멸 유도제에 대하여는 Kroemer 등(Annu. Rev. Immunol., 31: 51-72, 2013)에 잘 정리되어 있다. 상기 문헌은 전체적으로 본 문서에 참조로 삽입된다.
본 문서에서 사용되는 용어 "다량체화 도메인(multimerization domain)"은 동형의 단백질이 자기조립(self-assembly)에 의해 다량체화 하는데 있어서 중요한 역할을 하는 최소의 부위를 포함하는 단백질 도메인을 의미한다. 상기 다량체화 도메인에는 이량체화 도메인, 삼량체화 도메인, 4량체화 도메인, 6량체화 도메인, 12량체화 도메인, 24량체화 도메인 등 다양한 자기조립단백질의 자기조립 관여 도메인이 포함된다. 상기 이량체화 도메인에는 구체적으로 항체의 중쇄의 힌지 부위와 CH2 및 CH3 부분을 포함하는 Fc 단편, 수용체 타이로신 카이네이즈(RTK)의 세포질 도메인, 키네신의 이량체화 도메인, 피브로넥틴의 이량체화 도메인, Tol-유사 수용체(TLR)의 이량체화 도메인, 튜블린의 이량체화 도메인 등이 포함된다. 상기 삼량체화 도메인에는 콜라겐의 삼량체화 도메인, TRAIL의 삼량체화 도메인, Eml4 단백질의 삼량체화 도메인, 클래트린(Clathrin)의 삼량체화 도메인 등이 포함된다. 상기 4량체화 도메인에는 p53의 4량체화 도메인, DsRed의 4량체화 도메인, 아세틸콜린 에스터레이즈(AChE)의 4량체화 도메인 등이 존재한다. 6량체화 도메인은 HSP100 단백질의 6량체화 도메인, 상기 12량체화 도메인은 SPD(surfactant protein D, WO2013115608A1) 및 M. tuberoculosis Hsp16.3이 포함된다. 상기 24량체화 도메인에는 페리틴 중쇄 단백질, 페리틴 경쇄 단백질, M. jannanschii Hsp16.5, 및 효모 Hsp26이 포함된다. 상기와 같이 자기조립에 의해 다량체화하는 단백질을 "자기조립 단백질"이라 하는데 상기 자기조립 단백질은 특별한 유도물질의 도움이 없이 발현과 동시에 규칙적인 배열에 의해 다량체(multimer)를 형성함으로써 나노입자를 형성할 수 있는 단백질을 의미한다. 자기조립 단백질에는 sHsp(small heat shock protein), 페리틴, vault, P6HRC1-SAPN, M2e-SAPN, MPER-SAPN, 및 다양한 바이러스 또는 박테리오파지 캡시드 단백질이 포함된다. 상기 자기조립 단백질에 관해서는 Hosseinkhani 등(Chem. Rev., 113(7): 4837-4861, 2013)에 잘 기술되어 있다. 상기 문헌은 전체적으로 본 문서에 참조로 삽입된다.
본 문서에서 사용되는 용어 "Sirp(signal-regulatred protein)"는 골수세포에서 주로 발현되고 그리고 줄기세포 또는 신경세포에서 발현되는 Sirp족 단백질 중 조절성 막 당단백질이다. 상기 Sirp 중 Sirpα 및 Sirpγ는 억제성 수용체로 작용하며, 광범위하게 발현되는 막통과 단백질인 CD47 단백질과 상호작용하는데 이는 이른 바 "날 먹지마(don't eat me)" 신호로 불린다. 이러한 상호작용은 숙주세포 탐식작용과 같은 선천적 면역세포의 효과기 작용을 음성적으로 조절한다. 이는 Ig-유사 또는 Ly49 수용체를 경유한 MHC I 계열 분자에 의해 제공되는 자가 신호와 유사하다. CD47를 과발현하는 암세포는 Sirpα 또는 Sirpγ를 활성화시켜 대식세포-매개 파괴를 억제한다. 최근 연구에 의하면 Sirpα의 고친화성 변이체가 암세포 상에서 CD47을 마스킹하여 암세포에 대한 탐식작용을 증가시킨다는 보고가 있다(Weiskopf et al., Science 341(6141): 88-91, 2013).
본 문서에서 사용되는 용어 "페리틴 중쇄 단백질(ferritin heavy chain protein, 이하 'FH'로 약칭함)"은 원핵생물 및 진핵생물에서 주요 세포내 철 저장 단백질인 페리틴의 중쇄 소단위를 구성하는 단백질은 의미하는데, 페리틴 단백질은 페리틴 중쇄 및 경쇄 각각 24 소단위체로 구성된다. 페리틴 단백질의 주요 기능은 철을 수용성의 비독성 상태로 저장하는 것이다. 페리틴 중쇄 단백질은 경쇄 단백질 없이도 24개의 소단위가 자기조립하여 내부가 빈 나노입자 형성하는 것으로 알려진 바 있다(Cho et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 327(2): 604-608, 2005). 페리틴 중쇄 단백질은 자기조립 나노입자 내부의 빈 내부 공간에 다른 약물을 적재함으로써 나노케이지(nanocage)의 역할을 수행할 수 있고, 이런 특성으로 인해 약물전달체 등의 목적으로 연구되고 있다.
본 문서에서 사용되는 용어 "안트라사이클린 계열 항암제(anthracyclin-type anticancer agent)"는 스트렙토마이세스 속 세균인 Streptomyces peucetius var. caesius 유래의 암 화학요법에 사용되는 세포주기 비특이적인 항암제 계열을 지칭한다. 안트라사이클린 계열 항암제는 백혈병, 림프종, 유방암, 위암, 자궁암, 난소암, 방광암, 및 폐암을 포함한 다양한 암의 치료에 사용되는데, 종래에 개발되어온 화학요법 항암제 중 가장 효과적인 항암제 중의 하나이다. 최초로 발견된 안트라사이클린계열 항암제로는 다우노루비신(daunorubicin)이 있고, 바로 이어 개발된 독소루비신(doxorubicin), 그 뒤로 개발된 에피루비신(epirubicin), 이다루비신(idarubicin), 픽산트론(pixantrone), 사바루비신(sabarubicin), 발루비신(valrubicin) 등이 존재한다. 안트라사이클린 계열 항암제의 작용기전으로는 DNA/RNA 가닥의 염기쌍 사이에 삽입됨으로써 DNA 및 RNA 합성을 억제하여 신속히 성장하는 암세포의 복제를 방해하는 것, 토포아이소머레이즈 II 효소 활성을 억제하여 슈퍼코일화 DNA의 긴장완화를 억제하여 전사와 복제를 방해하는 것, 철-매개 유리 산소 라디컬의 형성을 통한 DNA, 단백질 및 세포막의 손상 유도 및 DNA 손상 반응, 에피게놈 및 전사체를 탈조절하는 크로마틴으로부터 히스톤 축출 유도 등이 거론되고 있다. 최근 연구에 따르면 독소루비신이 CD4+ 세포를 활성화시킴으로써 Th1 면역반응을 증가시킨다고 보고된 바 있고(Park et al., Int. Immunopharmacol. 9(13-14): 1530-1539, 2009), 수지상세포(dendritic cell)와 독소루비신의 병용투여시 골육종의 면역학적 세포사멸(immunogenic cell death)를 유발함으로써 항암활성을 나타낸다고 보고된 바 있다(Kawano et al., Oncol. Lett. 11:2169-2175, 2016).
본 문서에서 사용되는 용어 "탁산계열 항암제(taxanoid anticancer agent 또는 taxne anticancer drug)"는 주목속(Taxus sp.) 식물로부터 추출된 디테르페노이드 탁산 유도체(diterpenoid taxane derivatives)로, 세포내의 마이크로튜블의 조립을 증진시키고 해체를 저해하는 기전을 가진 유사분열 억제제이다. 현재 상용화된 약물로는 파클리탁셀(paclitaxel) 및 도세탁셀(docetaxel) 등이 존재하며, 이중 파클리탁셀은 주목(Taxus brevifolia)의 주피에서 추출한 탁산계열 항암제로 1992년 난치성 난소암 치료제로 미국 FDA의 승인을 받았고, 도세탁셀은 Taxus bacaata에서 유래된 탁산계열 항암제로서 파클리탁셀과 효능이 유사하며, 유방암, 비세포폐암, 림프종, 방광암 등의 치료에 사용되고 있으며, 파클리탁셀에 비해 친수성이 높은 특성을 가지고 있다. 최근에는 탁산계열 항암제 역시 암세포를 세포독성 T 림프구에 대하여 감작시킴으로써 이들 암세포의 면역원성 세포사멸을 촉진시키는 기전을 갖는 것으로 밝혀지고 있다.
본 문서에서 사용되는 용어 "면역 검문소 억제제(immune checkpoint inhibitor)"는 T 림프구와 같은 특정 유형의 면역계 세포 및 일부 암세포에 의해 생산된 특정 단백질을 차단하는 유형의 약물을 의미하는데 이들 단백질들은 면역반응을 억제하고, T 림프구가 암세포를 살상하는 것을 방지한다. 따라서 이러한 단백질이 차단되면 면역계의 "제동장치"가 풀어지고 T 림프구가 암세포를 더 잘 죽일 수 있다. 상기 "면역 검문소"로 현재까지 잘 알려진 것은 PD-1/PD-L1 및 CTLA-4/B7-1/B7-2 등이 존재한다. PD-1 저해제로는 Pembrolizumab(상표명: Keytruda), Nivolumab(상표명: Opdivo) 등이 존재하고, PD-1의 리간드인 PD-L1 저해제로는 Atezolizumab(상표명: Tecentriq), 및 Avelumab(상표명: Bavencio) 등이 존재한다. 한편 CTLA-4/B7-1/B7-2의 상호작용을 저해하는 CTLA-4 저해제로는 Ipilimumab(상표명: Yervoy) 등이 FDA의 승인을 받은 바 있다. 최근 몇 년 동안 특히 전이성 흑색종(metastatic melanoma) 또는 호지킨 림프종(hodgkin lymphoma) 환자에게서 인상적인 성공을 거두었으며 다른 유형의 암 환자를 대상으로 한 임상시험에서 많은 가능성을 보여주고 있다.
발명의 상세한 설명
본 발명의 일 관점에 따르면, V6I, V27I, A27I, I31F, E47V, K53R, E54Q, H56P, L66T, S66Y 및 V92I로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환변이를 포함하는 Sirp 고친화성 변이체 및 항체의 중쇄의 힌지 부위와 CH2 및 CH3 부분을 포함하는 Fc 단편을 포함하는 융합단백질 및 안트라사이클린 계열 항암제를 유효성분으로 포함하는 암치료용 약학적 조성물이 제공된다.
상기 암 치료용 약학적 조성물에 있어서, 상기 Sirp 고친화성 변이체는 V6I, A27I 또는 V27I, I31F, E47V, K53R, E54Q, H56P, L66T 또는 S66T 및 V92I의 치환변이를 모두 포함하는 것인 일 수 있다.
상기 암 치료용 약학적 조성물에 있어서, 상기 Sirp 고친화성 변이체는 서열번호 5, 15, 17, 18, 및 23 내지 33로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열로 구성될 수 있다.
상기 암 치료용 약학적 조성물에 있어서, 상기 신호조절 단백질 및 상기 Fc 단편 사이에 링커 펩타이드를 추가로 포함할 수 있다.
본 문서에서 사용되는 "항체"는 면역글로불린(immunoglobulin)이라고도 불리우며, 박테리아나 바이러스와 같은 외래성 물질을 확인하거나 중화시키기 위해 면역계에 의해 사용되는 플라스마 세포로부터 생성되는 Y-자 형태의 단백질을 의미한다. 본 문서에서 사용되는 상기 항체에는 항체 유래의 다양한 "기능성 단편", 예컨대, Fab, F(ab')2, Fab', ScFv 및 sdAb가 포함된다.
분 문서에서 사용되는 용어 "항체의 기능성 단편"은 항체에서 유래한 항원 결합능을 가지고 있는 단편으로서 항체를 단백질 절단효소로 절단하여 생성된 단편은 물론 재조합 방식에 생성된 단일쇄 단편을 모두 포함한다.
본 문서에서 사용되는 용어 "Fab"는 항원-결합 항체단편(fragment antigen-binding)으로서 항체 분자를 단백질 분해효소인 파파인으로 절단하여 생성되는 단편으로 VH-CH1 및 VL-CL의 두 펩타이드의 이량체로, 파파인에 의해 생성된 다른 단편은 Fc(fragment crystallizable)라 지칭한다.
본 문서에서 사용되는 용어 "F(ab')2"는 항체를 단백질 분해효소인 펩신으로 절단하여 생성되는 단편 중 항원결합 부위를 포함하는 단편으로 상기 Fab 두 개가 이황화결합으로 연결된 4량체의 형태를 나타낸다. 펩신에 의해 생성된 다른 단편은 pFc'으로 지칭한다.
본 문서에서 사용되는 용어 "Fab'"는 상기 F(ab')2를 약한 환원조건에서 분리시킴으로써 생성되는 Fab와 구조가 유사한 분자이다.
본 문서에서 사용되는 용어 "ScFv"는 "single chain variable fragment"의 약어로서 실제 항체의 단편은 아니며, 항체의 중쇄 가변영역(VH)과 경쇄 가변영역(VL)을 약 25 a.a. 크기의 링커 펩타이드로 연결하여 제조한 일종의 융합단백질로서 고유의 항체 단편이 아님에도 불구하고 항원 결합능을 지닌 것으로 알려지고 있다(Glockshuber et al., Biochem. 29(6): 1362-1367, 1990).
본 문서에서 사용되는 용어 "sdAb(single domain antibody)"는 나노바디(nanobody)라고 지칭되며, 항체의 단일 가변영역 단편으로 구성된 항체 단편이다. 주로 중쇄로부터 유래한 sdAb가 사용되나, 경쇄로부터 유래한 단일 가변영역 단편 역시 항원에 대하여 특이적 결합이 되는 것으로 보고되고 있다.
본 문서에서 사용되는 "항체 유사체(antibody mimetic)"는 두 개의 중쇄 및 두 개의 경쇄가 이종사합체의 4차구조를 형성하여 기능을 발휘하는 통상의 전장 항체와 달리, 항원 결합능을 유지하는 최소단위를 포함하는 단편(예컨대, Fab, F(ab')2, Fab' 또는 중쇄 및 경쇄의 가변영역을 링커로 연결한 인위적 단편인 단일쇄 가변 단편(single-chain variable fragment, scFv), 경쇄가 없이 중쇄만으로 구성되는 낙타과 또는 연골어류 유래의 항체 단편(VHH, VNAR 등) 또는 nanobody, monobody, 가변 림프구 수용체(VLR) 등 비항체 유래의 단백질 스캐폴드로부터 제조되는 항체 유사단백질을 포함하는 개념이다.
상기 암 치료용 약학적 조성물에 있어서, 상기 링커 펩타이드는 (G4S)n, (GSSGGS)n, KESGSVSSEQLAQFRSLD(서열번호 5), EGKSSGSGSESKST(서열번호 66), GSAGSAAGSGEF(서열번호 67), (EAAAK)n, CRRRRRREAEAC(서열번호 68), A(EAAAK)4ALEA(EAAAK)4A(서열번호 69), GGGGGGGG(서열번호 70), GGGGGG(서열번호 71), GGGGS(서열번호 72), AEAAAKEAAAAKA(서열번호 73), PAPAP(서열번호 74), (Ala-Pro)n, VSQTSKLTRAETVFPDV(서열번호 75), PLGLWA(서열번호 76), TRHRQPRGWE(서열번호 77), AGNRVRRSVG(서열번호 78), RRRRRRRR(서열번호 79), GFLG(서열번호 80), 또는 GSSGGSGSSGGSGGGDEADGSRGSQKAGVDE(서열번호 81)일 수 있다.
아울러 상기 약학적 조성물에 있어서, 상기 융합단백질은 정제를 효율적으로 하기 위해 N-말단 또는 C-말단에 정제용 태그 펩타이드가 추가로 포함할 수 있다. 상기 태그 펩타이드는 HisX6 펩타이드(서열번호 82), GST 펩타이드, FLAG 펩타이드(DYKDDDK, 서열번호 83), 스트렙타비딘 결합 펩타이드, V5 에피토프 펩타이드(GKPIPNPLLGLDST, 서열번호 84), Myc 펩타이드(EQKLISEE, 서열번호 85), 또는 HA 펩타이드(YPYDVPDYA, 서열번호 86)일 수 있다.
상기 암 치료용 약학적 조성물에 있어서, 상기 안트라사이클린 계열 항암제는 다우노루비신(daunorubicin), 독소루비신(doxorubicin), 에피루비신(epirubicin), 이다루비신(idarubicin), 픽산트론(pixantrone), 사바루비신(sabarubicin), 미토잔트론(mitoxantrone) 또는 발루비신(valrubicin)일 수 있다.
상기 암 치료용 약학적 조성물은 추가로 면역 검문소 억제제를 포함할 수 있는데, 상기 면역 검문소는 PD-1, PD-L1, CTLA-4, B7-1 또는 B7-2일 수 있고, 상기 면역 검문소 억제제는 PD-1/PD-L1 상호작용 억제제 또는 CTLA-4/B7-1/B7-2 상호작용 억제제일 수 있다.
상기 암 치료용 약학적 조성물에 있어서, 상기 PD-1/PDL1 상호작용 저해제 는 PD-1 또는 PDL1을 표적으로 하는 항체 또는 상기 항체의 기능성 단편 또는 단일쇄 기반의 항체 유사체일 수 있고, 상기 CTLA-4/B7-1/B7-2 상호작용 억제제 역시 상기 CTLA-4, B7-1 또는 B7-2를 표적으로 하는 항체 또는 상기 항체의 기능성 단편 또는 단일쇄 기반의 항체 유사체일 수 있으며, 상기 PD-1 또는 PDL1을 표적으로 하는 항체는 펨브롤리주맙(Pembrolizumab), 니볼루맙(Nivolumab), 아테졸리주맙(Atezolizumab) 또는 아벨루맙(Avelumab)일 수 있으며, 상기 CTLA-4/B7-1/B7-2 상호작용 저해제는 이필리무맙(Ipilimumab)일 수 있다.
상기 암 치료용 약학적 조성물에 있어서, 상기 단일쇄 기반의 항체 유사체는 scFv, sdAb, 다이아바디(diabody), 모노바디(monobody), 가변 림프구 수용체(variable lymphocyte receptor, VLR), 나노바디(nanobody) 또는 낙타과 중쇄 단편(VHH)일 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 상기 본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 상기 조성물은 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있으나, 비경구를 위한 제형인 것이 바람직하다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테로 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
상기 약학적 조성물은 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 현탁제, 용액제, 유제, 시럽제, 멸균된 수용액, 비수성 용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제 및 좌제로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형을 가질 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여될 수 있는데, 비경구로 투여되는 경우, 정맥내 주사, 비강내 흡입, 근육내 투여, 복강내 투여, 경피흡수 등 다양한 경로를 통해 투여하는 것이 가능하다.
상기 본 발명의 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여된다.
본 문서에서 사용되는 용어 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 0.1 mg/kg 내지 1 g/kg의 용량으로 투여될 수 있으며, 더 바람직하게는 1 mg/kg 내지 500 mg/kg의 투여량으로 투여된다. 한편, 상기 투여량은 환자의 나이, 성별 및 상태에 따라 적절히 조절될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 항암제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 다른 항암제와 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 신호조절 단백질(signal-regulatory protein) 또는 상기 신호조절 단백질을 포함하는 융합단백질 및 면역원성 세포사멸 유도제의 암 치료용 약학적 조성물의 제조에 있어서의 용도가 제공된다.
본 발명의 또 다른 일 관점에 따르면, 신호조절 단백질(signal-regulatory protein) 또는 및 다량체화 도메인을 포함하는 융합단백질의 다량체 및 면역원성 세포사멸 유도제를 치료를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 상기 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암치료 방법이 제공된다.
상기 면역원성 세포사멸 유도제는 상기 융합단백질의 다량체가 나노케이지를 형성할 경우 상기 나노케이지로 내로 적재될 수 있는 이러한 면역원성 세포사멸 유도제의 적재는 이들 약물이 용해된 세포배양 배지 내에서 재조합 엑소좀을 생산하도록 유전자 조작된 세포를 배양함으로써 달성될 수 있고, 분리된 나노케이지를 안트라사이클린 계열 항암제가 용해된 용매에 넣고 교반함으로써 생성할 수 있다. 바람직하게는 미리 2가 금속이온(예컨대, Cu2+, Fe2+, 및 Zn2+)과 안트라사이클린 계열 항암제의 복합체를 형성시킨 후, 제조된 페리틴 중쇄 나노케이지의 내부 공극에 상기 2가 금속이온-안트라사이클린 계열 항암제 복합체가 스며들도록 완충액 상에서 반응시킴으로써 적재할 수 있다. 또한 pH차이에 의한 페리틴 중쇄 나노케이지의 해체-재조립(disassemble-reassemble)과정을 통하여 내부 공극에 항암제가 적재될 수 있으며, 이온 농도차에 의한 공극 열림 현상에 의하여 단백질 나노케이지에 항암제가 적재될 수 있다.
최근 암 면역 요법의 표적이 되는 신생항원(neoantigens)으로 알려진 종양의 돌연변이 된 단백질의 동정은 항종양 T 세포 반응을 증가시키는 치료법의 개발로 이어졌고 암세포의 변이원성(mutagenic nature)이 매우 높기는 하지만 종양에서 발현된 변이 단백질의 1%만이 암 환자에서 면역 반응을 유발한다. 신생항원이 면역원성을 갖기 위해서는 세포 표면의 주요 조직 적합성 복합체(MHC) 분자에 의해 처리된 후 제시되어야 하고 종양에서 숙주의 T 세포로 면역원성 신생항원을 효율적으로 전달하는 것이 활성화되고 이는 항원제시세포(APCs)가 적재된 신생항원 펩타이드에 의해서만 달성된다. 본 발명자들은 면역 억제성 종양 미세 환경의 활성화-에너지 한계점을 극복하고 숙주의 T 세포에 대한 APC에 의한 종양 신생항원의 전달 및 제시를 중재하기 위한 새로운 전략을 개발하였다. 상기 전략은 APC에 의한 암세포 식균작용을 강화시키는 리간드를 전달하는 것뿐만 아니라 면역원성 암 세포 사멸(ICD)을 유도하는 약물을 포함하는 자연적으로 유도된 페리틴 기반 나노 캡슐에 기초한다. 이에 따라 본 발명자들은 페리틴 중쇄 단백질 및 Sirpα로 구성된 융합단백질의 자기조립에 의해 생성되는 나노케이지의 내부에 독소루비신이 적재된 항암 복합 나노케이지 또는 상기 항암 복합 나노케이지에 T 림프구와 같은 특정 유형의 면역계 세포 및 일부 암세포에 의해 생산된 특정 단백질을 차단하는 유형의 약물을 의미하는 면역 검문소 억제제(immune checkpoint inhibitor)를 추가로 포함하여 암세포에 대한 면역원성 세포 사멸을 유도하여 암 항원에 특이적인 종양 면역을 촉진시키고 종래 항암제로부터 유발되는 부작용이 없으며 치료 후에도 면역세포에 의한 항암효과가 지속 가능한 차세대 항암 치료제를 개발하였다.
이하, 첨부된 도면들을 참조하여 본 발명을 상세히 설명한다. 설명의 편의를 위하여 도면에서는 구성 요소들이 그 크기가 과장 또는 축소될 수 있다.
도 1a는 본 발명의 일 실시예에 따른 페리틴 중쇄 단백질 및 Sirpα로 구성된 융합단백질의 자기조립에 의해 생성되는 나노케이지의 내부에 독소루비신이 적재된 항암 복합 나노케이지의 개략적인 모습을 도시한 개요도이다. 도 1a에 도시된 바와 같이, 페리틴 중쇄 단백질의 C-말단에 Sirpα 또는 Sirpγ 단백질을 연결한 융합단백질을 발현시킬 경우 페리틴 중쇄 단백질 24 소단위체의 자기조립에 의해 내부가 빈 페리틴 나노케이지를 형성한다. 이러한 나노케이지에 구리(Cu)와 같은 금속입자와 약물의 복합체를 처리할 경우, 나노케이지 내부로 약물이 적재될 수 있다. 이렇게 생성된 독소루비신이 적재된 FHSirpα 나노케이지는 형광 FPLC 분석결과 나노케이지 내부에 독소루비신이 제대로 적재되었음을 확인할 수 있었고(도 1b 참조), 동적 광산란 분석 및 전자현미경 촬영 결과 20 nm 안팎의 직경을 갖는 구형의 나노입자를 형성함을 확인할 수 있었다(도 1c 및 1d 참조)
상기와 같이 제조된 독소루비신이 적재된 다량체성 FHSirpα은 암 모델 동물을 대상으로 한 생체내 항암활성 분석결과, 정맥내 투여 및 종양내 투여 모두 암세포의 성장을 현저하게 억제시킴을 확인하였다(도 2a 내지 2c, 도 6a 내지 6c 참조).
상기와 같은 본 발명의 일 실시예에 따른 다량체성 Sirpα 단백질 및 독소루비신의 병용투여제는 선천성 면역세포인 대식세포와 수지상세포 그리고 CD8+ 세포를 종양조직으로 침윤시킬 뿐만 아니라(도 3a, 3b 및 도 5 참조), 종양조직 주변의 림프절 및 비장 내에 존재하는 면역세포를 활성화시켜, 암 특이적인 면역을 획득함이 확인되었다(도 4).
뿐만 아니라, 본 발명의 다량체성 Sirpα 단백질 및 독소루비신의 병용투여제를 투여한 실험동물에서 종양조직을 적출한 후 동일 암세포를 재접종하는 rechallenge 실험결과 추가적인 투여 없이도 동일 암의 재발을 매우 효율적으로 억제하는 것으로 나타났다(도 7a 내지 7c 참조).
아울러, 본 발명의 일 실시예에 따른 본 발명의 다량체성 Sirpα 단백질 및 독소루비신의 병용투여제는 CT26.CL25 대장암 세포 외에, CT26 대장암 세포 및 B16F10-Ova 흑색종 세포에 있어서도 매우 효과적인 항암활성을 나타냈다(도 8a 내지 9b).
특히, 상기 B16F10-Ova 흑색종 세포에 대한 항암활성의 기전과 관련하여 본 발명의 다량체성 Sirpα 단백질 및 독소루비신의 병용투여제가 교차프라이밍 능력을 가지고 있는지 확인한 결과, MHC 1형 분자와 함께 미접촉(naive) CD8+ T 세포에 항원을 제시함으로써 상기 미접촉 CD8+ T 세포의 자극 및 분화를 촉진하는 것으로 확인되었다(도 10 내지 도 11b).
상기와 같은 결과는 본 발명의 일 실시예에 따른 다량체성 Sirp 단백질 및 면역원성 세포사멸 유도제의 병용투여가 Sirp 단백질의 단독투여 및 면역원성 세포사멸 유도제 단독투여 시에는 매우 미약했던 면역반응에 기반한 항암활성에 대한 매우 놀라운 상승효과를 나타낼 수 있음을 시사하는 것이다.
본 발명의 병용투여제는 APCs(antigen presenting cells)에 의한 암 세포 식균작용을 강화하는 리간드(ligands) 뿐만 아니라 면역원성 암세포 사멸(immunogenic cancer cell death, ICD)을 유발하는 약물을 전달한다. 본 발명의 병용투여제는 죽어가는 암세포에서 위험신호(danger signals) 및 신생항원(neoantigens)의 분비를 유도하고 종양세포 식균작용을 강화하며 신생항원 펩타이드를 적재한 수지상 세포에 의해 종양 특이적 T 세포를 교차프라이밍(cross-priming)함으로써 암세포의 존재에 대한 숙주의 면역계를 일깨우고 암에 대한 내재적 항암 백신효과(intrinsic anti-cancer vaccination)를 획득한다.
대식세포 및 수지상 세포와 같은 선천적 면역세포는 식균작용 및 항원제시(antigen presentation)를 통해 적응면역계의 활성을 매개하고 병원균에 대해 초기 숙주방어(initial host defense)에 있어 중요한 역할을 담당하지만 종양세포가 선천적 면역세포에 의한 식균작용을 회피하는 한 가지 기전은 '나를 먹지 마시오(Do not eat me' 신호인 CD47을 상향 조절하는 하는 것이다. 종양세포와 포식세포(phagocytic cells) 사이의 CD47-Sirpα 축을 차단시킬 경우 종양세포에 대한 식세포작용을 증가시키는 것으로 나타나, 암 면역요법에서의 표적으로서의 장점을 입증하였다. 아울러, CD47 기반 치료법은 면역능을 가진(immunocompetent) 마우스 모델에서 선천 및 적응면역(adaptive immune) 반응 간에 연결을 유도하여 항암 면역 효과를 증진시키는 것으로 보고되었다(Liu, X. J. et al., Nat Med. 21, 1209-1215, 2015). 최근에 암 치료제로 CD47을 차단하는 Sirpα 변이체 및 나노바디가 개발되어 왔다. 그러나, 이들 Sirpα 변이체 자체의 항암활성은 생각보다 뛰어난 것은 아닌 것으로 알려지고 있다.
이에, 본 발명자들은 CD47-매개 면역치료요법을 개선하기 위하여, 예의 노력한 결과, 인간 및 마우스 CD47에 결합 및 길항할 수 있는 Sirp 단백질이 다량체를 형성할 수 있도록 인간 페리틴 중쇄 단백질과 융합시켜 발현하는 한편, 이러한 다량체화된 융합단백질과 독소루비신과 같은 면역원성 세포사멸 유도제를 병용처리할 경우, 이들 Sirp단백질의 기능을 현저하게 향상시켜 암세포의 면역세포 회피를 억제하고 면역세포에 의한 암세포의 사멸을 더욱 증진시킬 수 있음을 확인할 수 있었다.
본 발명자들은 죽어가는 암세포에서 면역원성 신생항원 및 위험신호의 분비를 위한 전략을 예의 연구한 결과, 상기 다량체성 Sirp 및 면역원성 세포사멸 유도제의 병용처리 시 국소 염증반응을 자극하고 신생항원을 적재한 수지상 세포의 생성을 더욱 강력하게 촉발함을 규명하였다. 일부 죽어가는 암세포는 대규모의 면역반응을 유발하는데, 이러한 현상을 '면역원성 세포 사멸(immunogenic cell death, ICD)이라 한다(Kroemer et al. Annu. Rev. Immunol. 31: 51-72, 2013). ICD는 시공간적으로 제한된 하기 세 가지 구분되는 '위험'신호의 조합과 의사소통한다.
1) 소포체(ER)에 존재하는 칼레티큘린(calreticulin, CRT)의 세포 표면으로의 이동(translocation)과 관련된 "나를 먹으시오(eat-me)" 신호; 2) ATP의 분비의 활성화와 관련된 "나를 찾으시오(find-me)"신호; 그리고 3) nuclear high-mobility group box 1(HMGB1) 단백질의 세포외 분비와 관련된 항원 처리 및 T 세포로의 제시를 촉진하는 신호. 이러한 신호는 T 세포로 종양 신생항원의 제시를 자극하기 위해 수지상 세포 표면에 발현된 일련의 수용체를 조절한다. 따라서 본 발명자들은 종양 미세 환경에 CD47 길항제와 함께 전달된 ICD 유도제가 죽어가는 암세포로부터 위험 신호를 유발하고 세포 면역반응을 시작할 것이라는 가설을 정립하였다.
다량체성 Sirp와 함께 전달하기 위한 ICD 유도제로서 치료된 암세포에서 ICD의 세 가지 특성을 유도하는 안트라사이클린 계열 항암제인 독소루비신(dox)을 선택하였고, 철 항성성의 매개자인 페리틴의 금속 이온-결합 친화력의 장점을 이용하였다. 상기 페리틴의 금속-이온 결합 친화력은 금속-기반의 약물 또는 금속-복합체 약물을 페리틴의 내부 공극(central cavity)에 축적시킬 수 있게 해준다. 본 발명자들은 이를 위해 Cu(II)와 사전 복합화 된 독소루비신을 나노케이지 내부 공극으로 내제화시킴으로써 FHSirpα 나노케이지에 봉입된 독소루비신 제제를 제조하였으며, 이를 FHSirpα-Dox로 명명하였다. FHSirpα 내부로의 독소루비신의 성공적인 적재는 크기-제한 크로마토그래피로 확인하였고 포획된 독소루비신의 양은 FHSirpα 나노케이지 당 54 독소루비신 분자인 것으로 확인되었다.
상기 FHSirpα-Dox를 종양모델 마우스에 투여한 결과 다량의 다량체화 CD47 길항제 및 ICD의 유리한 종양 축적을 반영한 강력한 상승성 항암활성을 확인할 수 있었다. 국소 염증반응을 자극하고 면역 억제성 종양 미세환경에서 선천성 면역세포의 식세포 작용과 성숙은 T 세포에 면역원성 종양 신생항원의 효과적인 전달 및 제시를 유도한다. 이러한 강력한 면역반응은 전체 종양 박멸과 지속적인 항-종양 면역반응을 초래하였고 총체적으로, 종양에 대한 숙주의 면역계를 활성화시키는 보편적이고 효과적인 접근법임이 입증되었다.
비교해 보면, 현재의 암 백신은 원하는 표적 종양 신생항원의 지속적인 발현을 필요로 하고, 표적 항원을 발현하지 않는 내성 클론의 형성을 유도한다는 점에서 제한적이다. 키메라 항원 수용체(CAR) T 세포 치료법은 또한 원하는 표적 종양 신생항원이 지속적으로 발현될 필요가 있으며, 최적화 요구 사항 및 생체 외 조작의 경제적 비용을 포함한 다른 주요 장애물과도 관련이 있고 PD-1 항체와 같은 조절 항체는 항-종양 및 항-자체 자가면역 T 세포를 포함하여 모든 활성 또는 소진된 T 세포가 자극받을 수 있는 단점을 가지고 있다. 그러나 본 발명의 다량체성 Sirp 단백질 및 면역원성 세포사멸 유도제의 병용투여제는 국소적 및 전신적인 항-종양 특이적 면역 모두를 활성화시켜 '고유의 항암 백신(intrinsic anti-cancer vaccination)'으로서 그 효능을 입증하는 강력한 면역 자극제이고 내구성이 강하고 견고한 반응을 고려할 때 상기 시너지 효과는 광범위한 잠재력을 가지며 단계에 관계없이 여러 유형의 암 치료에 사용될 수 있을 것으로 사료된다.
이하, 실시예 및 실험예를 통하여 본 발명을 더 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예 및 실험예에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 수 있는 것으로, 이하의 실시예 및 실험예는 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이다.
실시예 1: 페리틴 나노케이지의 제조
1-1: 페리틴 중쇄 단백질 및 Sirp-α 고친화성 변이체의 융합단백질
본 발명자들은 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 인간 페리틴 중쇄 단백질(hFTH)을 암호화하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 2); 서열번호 3으로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 링커 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 4) 및 서열번호 5로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 Sirpα 고친화성 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 6)를 각각 PCR 또는 합성에 의해 클로닝한 후 이를 제한효소 및 라이게이즈를 이용하여 연결한 후, His tag를 포함하는 발현벡터 pT7-7에 클로닝하였다. 상기 각각의 단백질 또는 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 클로닝을 용이하게 하기 위해, hFTH와 링커 펩타이드 사이에는 제한효소 Xho I 인식부위를 추가하였고, 링커 펩타이드와 Sirpα 사이에는 제한효소 Hind Ⅲ 인식부위를 추가하였으며, Sirpα를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 3'-말단에는 제한효소 Cla I 인식부위를 추가하였다.
하나한(Hanahan)이 기술한 방법(Hanahan D, DNA Cloning vol.1, 109-135, IRS press 1985)에 의해 상기에서 제조된 벡터들을 대장균에 형질전환하였다. 구체적으로 CaCl2로 처리한 대장균 BL21(DE3)에 상기에서 제조된 벡터들을 열 충격 방법으로 형질전환시킨 후, 암피실린이 포함된 배지에서 배양하여 상기 발현벡터가 형질전환되어 암피실린 저항성을 나타내는 세포를 선별하였다. 형질전환된 세포를 OD600이 0.6이 될 때까지 36℃에서 배양한 후 1 mM IPTG를 가하여 융합단백질의 발현을 유도하고 20℃에서 16시간 동안 추가로 배양하였다. 배양을 마친 세포를 회수하여 초음파를 처리하여 파쇄하고 세포 파쇄액을 12,000 g로 30분간 원심분리하여 세포잔해물을 제거하였다. 재조합 단백질을 Ni2+-NTA 컬럼(Qiagen, Hilden, Germany)을 사용하여 각각 분리하였다(세척 버퍼: pH 8.0, 50 mM 소듐 포스페이트, 300 mM NaCl, 80 mM 이미다졸; 용출 버퍼: pH 8.0, 50 mM 소듐 포스페이트, 300 mM NaCl, 250 mM 이미다졸). 용출 버퍼의 이미다졸을 제거하기 위하여 멤브레인 필터(Amicon, 10K)를 이용하여 PBS로 버퍼를 교체해 주었다. 수득된 나노케이지의 농도는 Bradford 단백질 분석 방법으로 측정하였다. 상기와 같이 제조된 나노케이지를 'FHSirpα HV'로 명명하였다.
1-2: 페리틴 중쇄 단백질 및 Sirpα 야생형 융합단백질
본 발명자들은 Sirpα 고친화성 변이체가 아닌 서열번호 7로 기재되는 인간 Sirpα 야생형 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 8)을 사용한 것을 제외하고는 상기 실시예 1-1과 동일한 방법으로 페리틴 중쇄 단백질에 인간 Sirpα 야생형 단백질이 연결된 융합단백질 및 이를 이용한 페리틴 중쇄 나노케이지(이하, 'FH-hSirpα WT 나노케이지'로 약칭함)를 제조하였다.
1-3: 페리틴 중쇄 단백질 및 Sirpγ 야생형 융합단백질
본 발명자들은 Sirpα 고친화성 변이체가 아닌 서열번호 9로 기재되는 Sirpγ 야생형 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 10)를 사용한 것을 제외하고는 상기 실시예 1-1과 동일한 방법으로 페리틴 중쇄 단백질에 Sirpγ 야생형 단백질이 연결된 페리틴 중쇄 나노케이지(이하, 'FHSirpγ WT 나노케이지'로 약칭함)를 제조하였다.
1-4: 페리틴 중쇄 단백질 및 Sirp-γ 변이체 1 융합단백질
본 발명자들은 Sirpα 고친화성 변이체가 아닌 Sirpγ 야생형 단백질에서 상기 Sirpα 고친화성 변이체의 변이 아미노산에 상응하는 아미노산 변이를 가진 Sirpγ 변이체(이하, 'Sirpγ V1'으로 약칭함, 서열번호 11)을 암호화하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 12)를 사용한 것을 제외하고는 상기 실시예 1-1과 동일한 방법으로 페리틴 중쇄 단백질에 Sirpγ V1 단백질이 연결된 페리틴 중쇄 나노케이지(이하, 'FHSirpγ V1 나노케이지'로 약칭함)를 제조하였다.
1-5: 페리틴 중쇄 단백질 및 Sirp-γ 변이체 2 융합단백질
본 발명자들은 Sirpα 고친화성 변이체가 아닌 Sirpγ 야생형 단백질에서 27번째 아미노산이 치환되지 않은 것(valine)을 제외하고는 상기 Sirpα 고친화성 변이체의 변이 아미노산에 상응하는 아미노산 변이를 가진 Sirpγ 변이체(이하, 'Sirpγ HV2'으로 약칭함, 서열번호 13)을 암호화하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 14)를 사용한 것을 제외하고는 상기 실시예 1-1과 동일한 방법으로 페리틴 중쇄 단백질에 Sirpγ V2 단백질이 연결된 페리틴 중쇄 나노케이지(이하, 'FHSirpγ V2 나노케이지'로 약칭함)를 제조하였다.
실시예 2: 독소루비신 적재 나노 케이지의 제조
본 발명자들은 먼저 독소루비신 1 mg/ml을 구리이온(Cu2+) 1 mM과 상온에서 30분간 반응시켜 독소루비신-구리이온 복합체를 형성시켰다. 그런 다음 상기 혼합물을 상기 실시예 1-1에서 제조된 FHSirpα HV 용액(250 ㎍/ml)에 가하고 상온에서 120분간 반응시켰다. 반응물은 PD-10 칼럼을 이용한 크로마토그래피로 유리 독소루비신 및 구리이온을 제거하였다. 상기 적재된 독소루비신은 형광 분광기(2103 EnVision™ Multilabel Plate Readers, PerkinElmer, USA)로 측정한 후 표준 커브와 비교하여 정량하였고 상기 제조된 독소루비신 복합 나노케이지의 나노입자 형성 여부를 확인하기 위해, 상기 회수된 나노케이지의 입도를 동적 광산란(dynamic light scattering, DLS) 분석장치(Malvern zetasizer nano ZS, UK)을 이용하여 분석하는 한편, 투과 전자현미경으로 생성된 나노케이지를 촬영하였다.
그 결과, 도 1b에서 나타난 바와 같이, FPLC상 본 발명의 독소루비신 복합 나노케이지 역시 단일한 피크로 나타났으며, 독소루비신 측정을 위한 480 nm에서의 흡광도 측정 결과 역시 280 nm 파장에서의 단백질 검출과 동일한 머무름시간에서 확인됨으로써 본 발명의 독소루비신 복합 나노케이지 내부에 독소루비신이 성공적으로 적재되었음을 간접적으로 확인할 수 있었다. 입도분석 결과 역시 도 1c에서 나타난 바와 같이 10 내지 100 nm의 입도크기(평균 19.38ㅁ1.7 nm)를 갖는 나노입자임을 확인할 수 있었고, 투과전자현미경 촬영 결과 역시 도 1d에서 나타난 바와 같이 구형의 나노입자가 형성됨을 확인할 수 있었다.
실시예 3: FcSirpα의 제조
본 발명자들은 서열번호 89로 기재되는 인간 IgG1의 Fc 도메인을 암호화하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 90)에 서열번호 3으로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 링커 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 4) 및 서열번호 5로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 Sirpα 고친화성 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 6)가 연결된 융합단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 각각 PCR 또는 합성에 의해 클로닝한 후 이를 제한효소 및 라이게이즈를 이용하여 연결한 후, His tag를 포함하는 발현벡터 pT7-7에 클로닝하였다. 상기 각각의 단백질 또는 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 클로닝을 용이하게 하기 위해, Fc와 링커 펩타이드 사이에는 제한효소 Xho I 인식부위를 추가하였고, 링커 펩타이드와 Sirpα 사이에는 제한효소 Hind Ⅲ 인식부위를 추가하였으며, Sirpα를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 3'-말단에는 제한효소 Cla I 인식부위를 추가하였다.
하나한(Hanahan)이 기술한 방법(Hanahan D, DNA Cloning vol.1, 109-135, IRS press 1985)에 의해 상기에서 제조된 벡터들을 대장균에 형질전환하였다. 구체적으로 CaCl2로 처리한 대장균 BL21(DE3)에 상기에서 제조된 벡터들을 열 충격 방법으로 형질전환시킨 후, 암피실린이 포함된 배지에서 배양하여 상기 발현벡터가 형질전환되어 암피실린 저항성을 나타내는 세포를 선별하였다. 형질전환된 세포를 OD600이 0.6이 될 때까지 36℃에서 배양한 후 1 mM IPTG를 가하여 융합단백질의 발현을 유도하고 20℃에서 16시간 동안 추가로 배양하였다. 배양을 마친 세포를 회수하여 초음파를 처리하여 파쇄하고 세포 파쇄액을 12,000 g로 30분간 원심분리하여 세포잔해물을 제거하였다. 재조합 단백질을 Ni2+-NTA 컬럼(Qiagen, Hilden, Germany)을 사용하여 각각 분리하였다(세척 버퍼: pH 8.0, 50 mM 소듐 포스페이트, 300 mM NaCl, 80 mM 이미다졸; 용출 버퍼: pH 8.0, 50 mM 소듐 포스페이트, 300 mM NaCl, 250 mM 이미다졸). 용출 버퍼의 이미다졸을 제거하기 위하여 멤브레인 필터(Amicon, 10K)를 이용하여 PBS로 버퍼를 교체해 주었다. 수득된 융합단백질의 농도는 Bradford 단백질 분석 방법으로 측정하였다. 상기와 같이 제조된 융합단백질를 'FcSirpα'로 명명하였다.
실험예 1: FHSirpα-Dox의 in vivo 항암효과의 분석
1-1: CT26.CL25 동소적 종양 마우스 이용 항암효과 분석
본 발명자들은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 Sirpα 다량체 및 독소루비신의 병용투여제(FHSirpα-Dox)가 실제로 동물모델 실험에서도 동일한 항암효과가 나타나는지 확인하기 위해 이종이식 암 모델 마우스를 이용하여 본 발명의 실시예 2에서 제조된 FHSirpα-Dox의 항암활성을 조사하였다. 실험동물로는 Balb/c 야생형 마우스를 사용하였으며, 상기 실험동물에 대한 실험은 KIST 동물윤리위원회의 규정에 따라 수행되었다.
우선, 다양한 형태의 Sirpα 단백질과 독소루비신의 in vivo 항암활성의 측정을 위해 8주령의 Balb/c 야생형 마우스에 β-galactose를 발현하는 CT26.CL25 암세포 1X106 cells를 왼쪽 등에 피하주입하여 암을 유발시켰고, 암세포 주입 7일째에 각 실험물질(완충액, dox, wtFH-dox, mSirpα + dox, FHSirpα-dox)를 3일 간격으로 총 5차례 정맥주사로 주입하였다. 이때, 각 물질의 투여량은 각각 독소루비신(dox) 1 mg/kg, wtFH-dox 15 mg/kg(독소루비신 함량으로는 1 mg/kg에 상응함), mSirpα 9.5 mg/kg + dox 1 mg/kg, 및 FHSirpα-dox 28 mg/kg(독소루비신 함량으로는 1 mg/kg에 상응함)이었다. 그런 다음, 암세포 주입 25일째까지 3일간격으로 암세포의 부피를 캘리퍼를 이용하여 길이(L) 및 폭(W)을 측정한 후, 하기 공식을 이용하여 계산하였고(도 2a), 25일째 실험동물의 종양조직 부위를 촬영한 후 종양조직을 적출하여 종양조직의 무게를 측정하였다(도 2b 내지 2d):
암세포 부피(V[mm3])=(L[mm])x(W[mm])2x0.5
그 결과, 도 2b 및 2c에 나타난 바와 같이, 대조군(완충액만 주입)의 경우 종양의 크기가 1,000 mm3을 초과하였으며, 독소루비신 단독 처리군 역시 그 효과가 미미하였다. 아울러, 야생형 페리틴에 독소루비신을 적재한 경우(wtFH-dox) 및 야생형 Sirpα와 독소루비신의 병용투여(mSirpα + dox)의 경우 항암효과가 나타나긴 하였으나, 암세포의 성장을 충분히 억제하는 수준은 아니었다. 반면 본 발명의 일 실시예에 따른 Sirpα 다량체 및 독소루비신의 병용투여제(FHSirpα-dox)의 경우 25일 경과 시에도 암세포의 부피가 200 mm3 남짓할 정도로 암세포의 성장을 현저하게 억제하였다. 더 나아가, 본 발명의 일 실시예에 따른 Sirpα 다량체와 독소루비신의 병용투여제(FHSirpα-dox)의 경우 암세포의 성장을 거의 완벽하게 억제하여 육안으로 암세포를 구분할 수 없을 정도의 효과를 나타냈다.
상기 결과는 시험관내 실험결과와는 약간 다른 양상으로 나타났는데, 독소루비신 단독 투여, 시험관내 시험에서 대식세포의 암세포에 대한 탐식작용을 유발하였던 재조합 Sirpα 단독투여나 독소루비신과 단량체 재조합 Sirpα의 병용투여시 동물모델 실험에서는 항암효과가 그리 크지 않았다는 점을 고려하면 매우 획기적인 결과라고 할 수 있다.
아울러, 암세포 주입 25일 경과 후 실험동물을 희생한 후 적출한 종양조직의 크기를 측정한 결과, 도 2d에 나타난 바와 같이, 본 발명의 Sirpα 다량체 및 독소루비신의 병용투여시 유의한 암세포 감소효과를 나타냈고, Sirpα 다량체 없이 일반 페리틴에 독소루비신이 봉입된 복합 페리틴(wtFH-dox), 독소루비신과 단량체 재조합 Sirpα의 병용투여, 및 독소루비신 단독투여시에는 암세포 성장 억제가 제한적으로 나타났다.
1-2: 면역원성 세포사멸 분석
본 발명자들은 본 발명의 일 실시예에 따른 Sirpα 다량체 및 독소루비신의 병용투여에 의해 면역원성 세포사멸이 유도되는지 확인하기 위해, 암세포에 대한 유세포 분석을 수행하였다.
구체적으로, 본 발명자들은 CT26.CL25 암세포 1ㅧ106 세포를 8주령 Balb/c 마우스에 접종(0일째)한 후, 7일째부터 각 그룹에 실험물질(완충액, dox, wtFH-dox, mSirpα + dox, FHSirpα-dox)를 3일 간격으로 총 5차례 정맥주사로 주입하였다. 이때, 각 물질의 투여량은 각각 독소루비신(dox) 1 mg/kg, wtFH-dox 15 mg/kg(독소루비신 함량으로는 1 mg/kg에 상응함), mSirpα 9.5 mg/kg + dox 1 mg/kg, 및 FHSirpα-dox 28 mg/kg(독소루비신 함량으로는 1 mg/kg에 상응함)이었다. 암세포 주입 25일째에 종양조직을 척출하고 DNase과 콜라게네이즈(collagenase)을 이용하여 단일세포화한 후, 항-CD11c 항체 및 항-F4/80 항체를 이용하여 종양 미세환경 수지상세포와 대식세포가 얼마나 존재하는지 FACS 분석으로 조사하였다(도 3a 및 3b).
그 결과, 도 3a 및 3b에서 나타난 바와 같이, 대조군에 비해 수지상 세포 및 대식세포의 표지인자인 CD11c 양성 세포 및 F4/80 양성 세포의 수가 두 배이 이상 증가함을 확인하였다. 이는 본 발명의 일 실시예에 따른 FHSirpα-dox가 암세포에 대한 면역세포의 동원을 통해 선천성 면역반응을 유발함을 의미하는 것이다.
1-3: 항원 유도 면역 반응 분석
본 발명자들은 상기 면역반응이 암세포 특이적으로 일어났는지 확인하기 위해, 본 발명의 일 실시예에 따른 FHSirpα 다량체 및 독소루비신의 병용투여제(FHSirpα-dox)에 의한 마우스 비장 및 종양배액 림프절 내 CT26.CL25암세포에 대한 세포성 면역반응을 조사하였다. 즉, CT26.CL25의 항원인 β-galactosidase에 특이적인 T 세포의 인터페론-감마(INF-γ)의 수치를 ELISA(R&D Systems, Inc, USA) 분석으로 정량하였다. 실험예 1-1과 같은 방법으로 처리한 마우스를 그룹 당 3마리씩을 선택하여 각각의 마우스에서 비장과 종양배액림프절(tumor-drained lymph node, TDLN)을 적출하여, 멸균된 페트리디쉬에 상기 조직을 옮기고, cell strainer를 이용하여 상기 비장 및 종양배액림프절을 각각 갈아 조직 피막으로부터 세포를 분리하였다. 상기 페트리디쉬 내의 모든 내용물을 15 ml 튜브에 옮기고 RPMI 1640 배지로 가득 채운 후, 500G에서 10분간 원심분리한 후 상등액을 제거한 펠렛에 적혈구 용해 완충액(Sigma-Aldrich, Germany)를 사용하여 적혈구를 용혈시켰다. 튜브에 포함된 세포를 PBS로 세척한 후, RPMI 1640 배지에 부유시켜 종양배액림프절(tumor- drained lymph node, TDLN) 세포 및 비장세포(splenocyte)를 분리하였다. 분리된 TDLN 세포 및 비장세포를 각각 1ㅧ106 cells/500 μl 및 1ㅧ107 cells/ml로 24 웰 플레이트에 파종하고, β-gal 펩타이드(TPHPARIGL, 서열번호 87, β-gal의 아미노산 잔기 876-884를 포함하는 자연적으로 가공된 H-2 Ld 제한 에피토프를 포함함), CT26.CL25의 내재적 항원인 gp70 단백질 유래의 에피토프인 AH1(SPSYVYHQF, 서열번호 88, CT26 유래의 CTL 결정기를 포함함), P1A 펩타이드(음성대조군)를 5 μg/ml의 농도로 24시간 동안 처리하여 IFN-γ를 분비하는 CD8+ T 세포의 활성화를 촉진시켰다. 그 후에 상층액을 분리하여 인터페론-감마(INF-γ)의 수치를 ELISA(R&D Systems, Inc, USA) 분석으로 정량하였다.
그 결과, 도 4a 및 4b에서 나타난 바와 같이, 본 발명의 일 실시예에 따른 FHSirpα-dox를 투여한 동물로부터 분리된 종양배액림프절 세포 및 비장 면역세포에 β-gal 펩타이드 및 AH1 펩타이드를 처리할 경우, INF-γ의 발현이 유의하게 증가함을 확인할 수 있었다. 특히 본 발명의 일 실시예에 따른 독소루비신이 적재된 FHSirpα 나노케이지의 경우 비장세포에서 인터페론 감마의 발현 정도가 100 pg/ml 이상으로 기록되어 암세포에 대한 면역활성화 정도가 매우 높게 나타났다. 기타 독소루비신과 재조합 Sirpα의 병용투여 등 다른 제제의 경우 효과가 거의 없거나 미미하게 나타났다. 즉, FHSirpα-dox의 경우, β-galactosidase 단백질을 대식세포와 수지상세포에 효과적으로 전달하여 항원제시세포의 기능을 활성화시키며, 궁극적으로 세포 독성 T 세포를 효과적으로 자극하여 CT26.CL26 암세포에 특이적인 면역반응을 효과적으로 유도하였음을 확인할 수 있었다.
1-4: 면역조직화학 분석
본 발명자들은 상기 실험예 1-3의 결과가 암세포 조직으로의 면역세포의 결집에 의한 효과인지 확인하기 위해서, 상기 실험예 1-3에서 적출된 종양조직을 박편화하여, T 세포 마커인 CD8에 대한 면역조직화학 분석을 수행하였다.
구체적으로 상기 실험예 1-3에서 제조된 FHSirpα-dox가 투여된 실험동물에서 적출된 종양조직을 10% 중성 포르말린액에 고정 후 파라핀 블록을 제작하였고 이를 4 μm 두께의 박편으로 제조한 후, pH 6.0 구연산 수용액에 넣고 끓여 항원회수(antigen retrieval)를 수행한 다음 TBST(Tris-buffered saline, Tween-20)으로 3차례 세척한 이후 Renaissance Ab diluent(PD905, Biocare Medical)을 이용하여 차단(blocking)을 10분간 실온에서 수행하고, 항-CD8 항체(BD Bioscience, USA)와 반응시킨 후, 3차례 세척하고, 항-rat 이차 항체(MP-7445-15, Vector Laboratories, USA)와 반응시킨 다음, 3차례 세척하고 트리아민-결합 형광단(tyramine-conjugated flourophore, NEL794001KT, PerkinElmer, USA)를 이용하여 트리아민 신호증폭(tyramine signal amplification, TSA)을 수행한 후, 3차례 세척하고, 비특이적인 트리아민-결합 형광단 결합을 제거하기 위해 구연산 수용액에 넣고 끓인 후, DAPI 염색 후, PerkinElmer Vectra platform을 이용하여 촬영하였다.
그 결과 도 5에서 나타난 바와 같이, 종양조직 내에서 CD8+ T 세포가 양성으로 염색이 되었다. 이는 종양조직 내로 CD8+ T 세포가 침윤하였음을 입증하는 것으로, 상기와 같은 항암효과가 독소루비신과 Sirpα의 CD47 마스킹에 따른 면역세포의 충원의 상승작용에 의한 것임을 시사하는 것이다.
1-5: 종양내 주입시 항암효과
본 발명자들은 본 발명의 일 실시예에 따른 Sirpα 다량체 및 독소루비신의 병용투여제(FHSirpα-Dox)가 정맥주사 외에 종양내 주입(intratumoral injection) 시에도 동등한 항암효과가 나타나는지 조사하였다.
구체적으로, 8주령의 Balb/c 야생형 마우스에 CT26.CL25 암세포를 1ㅧ106 cells를 왼쪽 등에 피하접종하여 암을 유발시켰고, 암세포 주입 7일째에 각 실험물질(완충액, wtFH-dox, 및 FHSirpα-dox)를 1회 종양내 투여하였다. 이때, 각 물질의 투여량은 각각 wtFH-dox 15 mg/kg(독소루비신 함량으로는 1 mg/kg에 상응함), 및 FHSirpα-dox 28 mg/kg(독소루비신 함량으로는 1 mg/kg에 상응함)이었다. 그런 다음, 암세포 주입 25일째까지 3일 간격으로 암세포의 부피를 상기 실험예 1-1에 기재된 바와 같이 측정하였고, 25일째 실험동물의 종양조직을 적출하여 종양조직의 무게를 측정하였다.
그 결과, 도 6a에 나타난 바와 같이, 야생형 페리틴에 독소루비신을 적재한 경우 대조군에 비해 종양 성장속도가 낮았으나 그래도 여전히 종양조직이 성장하였다. 반면, 본 발명의 일 실시예에 따른 Sirpα 다량체 및 독소루비신의 병용투여제(FHSirpα-dox)의 경우 25일 경과 시에도 암세포가 거의 자라지 않았다. 아울러, 적출된 종양조직의 무게를 측정한 결과, 도 6b에서 나타난 바와 같이, wtFH-dox의 경우 종양조직의 무게는 약 0.5 g으로 1.0 g을 초과하는 대조군 대비 반 이하로 줄어든 반면, 본 발명의 일 실시예에 따른 FHSirpα-dox의 경우 종양이 거의 없다고 봐도 무방할 정도였다. 이는 본 발명의 일 실시예에 따른 Sirpα 다량체 및 독소루비신의 병용투여제가 종양내 투여시에는 더욱 항암효과가 뛰어남을 입증하는 것이다.
실험예 2: FHSirpα-Dox의 항암 기억 효과의 분석
본 발명자들은 상기 실험예 1-3의 결과로부터 본 발명의 일 실시예에 따른 FHSirpα 나노케이지의 작용이 면역세포의 충원(recruiting)에 의한 효과이기 때문에, 면역세포의 기억에 따른 기억효과가 있을 것이라 가정하고, 본 발명의 일 실시예에 따른 FHSirpα-dox 투여 후 적출된 종양조직을 희생시키지 않은 동일 동물의 다른 쪽 등에 이식한 후 시간 경과에 따라 이식된 위치에서의 암의 성장 여부를 분석하였고 및 마우스의 생존 두수를 계수하였다.
그 결과, 도 7a 및 7b에서 나타난 바와 같이, 본 발명의 일 실시예에 따른 FHSirpα-dox 투여군에서 적출된 종양조직이 이식된 동물에서는 28일이 경과할 때까지 암세포가 성장한 마우스가 단 한 마리도 관찰되지 않았으며, 다른 물질들의 투여군으로부터 적출된 종양조직이 이식된 마우스들은 시간이 경과함에 따라 정도의 차이는 있으나 암이 재발하는 양상을 나타냈다. 아울러, 동일 실험군을 대상으로 80일 경과시 생존율을 분석한 결과, 도 7c에서 나타난 바와 같이, 본 발명의 일 실시예에 따른 FHSirpα-dox 투여군은 80일 경과시까지 폐사한 실험동물이 전무했다. FHSirpα의 경우 80일 경과시 생존 두수는 80%로서 FHSirpα-Dox 다음으로 효과가 좋았고, 독소루비신 단독이나 재조합 Sirpα 단독 처리 시에는 80일 경과 후 생존율이 50%로 나타났다.
상기 결과는 본 발명의 일 실시예에 따른 나노케이지가 암세포의 생장을 억제할 뿐만 아니라, 암의 치료 이후에 재발을 억제할 수 있는 면역세포에 대한 기억효과를 제공함을 시사하는 것이다. 따라서, 본 발명의 일 실시예에 따른 나노케이지는 암의 치료 뿐만 아니라 재발의 억제에 매우 효과적일 수 있다.
실험예 3: FHSirpα-Dox의 다양한 종양에 대한 항암효과 분석
3-1: CT26 세포에 대한 항암효과 분석
본 발명자들은 본 발명의 일 실시예에 따른 Sirpα 다량체 및 독소루비신의 병용투여제가 다른 종류의 암세포에 대한 항암효과를 나타내는지 확인하기 위해, β-galatosidae를 발현하지 않는 일반 대장암 세포인 CT26 세포를 보유한 암 모델 동물에 대한 항암효과를 분석하였다.
구체적으로, 8주령의 Balb/c 야생형 마우스에 CT26 암세포 1ㅧ106 cells를 왼쪽 등에 피하접종하여 암을 유발시켰고, 암세포 주입 7일째에 각 실험물질(완충액, dox, wtFH-dox, mSirpα + dox, FHSirpα-dox)를 3일 간격으로 총 5차례 정맥주사로 주입하였다. 이때, 각 물질의 투여량은 각각 독소루비신(dox) 1 mg/kg, wtFH-dox 15 mg/kg(독소루비신 함량으로는 1 mg/kg에 상응함), mSirpα 9.5 mg/kg + dox 1 mg/kg, 및 FHSirpα-dox 28 mg/kg(독소루비신 함량으로는 1 mg/kg에 상응함)이었다. 그런 다음, 암세포 주입 25일째까지 3일 간격으로 암세포의 부피를 상기 실험예 1-1에서 기재된 방법대로 측정하였고, 25일째 실험동물의 종양조직을 적출하여 무게를 측정하였다.
그 결과, 도 8a 및 8b에서 나타난 바와 같이, dox, wtFH-dox, mSirpα + dox의 경우 대조군 대비 암세포의 성장 억제 정도가 미미했던 반면, 본 발명의 일 실시예에 따른 FHSirpα-dox의 경우 암세포가 거의 자라지 않았음을 확인할 수 있었다. 적출된 암세포의 무게를 측정한 결과 역시, dox 및 mSirpα + dox의 경우 종양조직의 무게가 대조군과 비교하여 유의한 정도로 낮지 않았으며, wtFH-dox의 경우 대조군 대비 유의하게(P < 0.05) 종양조직의 크기가 줄어들었으나 그 정도는 약하였다. 반면, 본 발명의 일 실시예에 따른 FHSirpα-dox의 경우 종양조직이 거의 없는 수준으로 봐도 무방할 정도였다.
3-2: B16F10-Ova 세포에 대한 항암효과 분석
본 발명자들은 난백알부민(ovalbumin)을 발현하는 흑색종의 일종인 B16F10-Ova 세포에 대한 항암활성을 분석하였다.
구체적으로, 본 발명자들은 구체적으로, 8주령의 Balb/c 야생형 마우스에 B16F10-Ova 암세포 1ㅧ106 cells를 왼쪽 등에 피하접종하여 암을 유발시켰고, 암세포 주입 7일째에 각 실험물질(완충액, dox, wtFH-dox, mSirpα + dox, FHSirpα-dox)를 3일 간격으로 총 3차례 정맥주사로 주입하였다. 이때, 각 물질의 투여량은 각각 독소루비신(dox) 1 mg/kg, wtFH-dox 15 mg/kg(독소루비신 함량으로는 1 mg/kg에 상응함), mSirpα 9.5 mg/kg + dox 1 mg/kg, 및 FHSirpα-dox 28 mg/kg(독소루비신 함량으로는 1 mg/kg에 상응함)이었다. 그런 다음, 암세포 주입 25일째까지 3일 간격으로 암세포의 부피를 상기 실험예 1-1에서 기재된 방법대로 측정하였고, 25일째 실험동물의 종양조직을 적출하여 무게를 측정하였다.
그 결과, 도 9a 및 9b에서 나타난 바와 같이, dox, wtFH-dox, mSirpα + dox의 경우 대조군 대비 암세포의 성장 억제 정도가 미미했던 반면, 본 발명의 일 실시예에 따른 FHSirpα-dox의 경우 암세포가 거의 자라지 않았음을 확인할 수 있었다. 적출된 암세포의 무게를 측정한 결과 역시, dox, wtFH-dox 및 mSirpα + dox의 경우 종양조직의 무게가 대조군과 비교하여 낮기는 하였으나, 유의한 정도가 아니었다. 반면, 본 발명의 일 실시예에 따른 FHSirpα-dox의 경우 종양조직 거의 없는 수준으로 봐도 무방할 정도였다.
3-3: 크로스프라이밍 능력 분석
본 발명자들은 본 발명의 일 실시예에 따른 Sirpα 다량체 및 독소루비신 병용투여제가 수지상 세포의 크로스프라이밍 능력을 가지고 있는지 여부를 조사하였다. 크로스프라이밍(cross-priming)이란 특정 항원-제시 세포(antigen-presenting cell)가 세포외 항원을 섭취하고 가공하여 CD8+ T 세포(세포독성 T 세포)에 MHC 1형 분자와 함께 제시함으로써(cross-presentation), 미접촉 CD8+ T 세포가 자극되어 세포독성 CD8+ T 세포로 분화가 되는 현상을 의미한다.
이를 위해 구체적으로, 8주령의 Balb/c 야생형 마우스에 B16F10-Ova 암세포 1ㅧ106 cells를 왼쪽 등에 피하접종하여 암을 유발시켰고, 암세포 접종 7일째에 대조군으로 완충액 및 실험군으로 FHSirpα-dox 28 mg/kg(독소루비신으로 1 mg/kg)을 3일 간격으로 총 3차례 정맥주사로 주입하였다. 마지막으로 정맥주사한지 이틀 후, 암 조직을 적출하여, DNase 및 콜라게네이즈를 이용하여 단일세포화한 후, MACS(magnetic-activated cell sorting) 방법으로 CD11c 양성 세포(수지상세포)를 분리하였다. 이후, 미접촉(naive) CD8+ T 세포의 일종인 OT-1 세포와 함께 3일간 공배양을 수행한 후, 배양상등액을 수득하여 INF-γ의 양을 ELISA 분석으로 측정하였다.
그 결과 도 10에서 나타난 바와 같이, 본 발명의 일 실시예에 따른 FHSirpα-dox 처리군의 경우 INF-γ가 100 pg/ml 이상 분비된 반면, 대조군의 경우 INF-γ 발현이 극히 미미하였다. 이는, 본 발명의 일 실시예에 따른 FHSirpα-dox 투여군의 수지상세포가 암세포 항원을 MHC 1형 분자와 함께 미접촉 CD8+ T 세포에 제시하여 이들 미접촉 CD8+ T 세포를 자극하는 크로스프라이밍 능력을 가지고 있음을 시사하는 것이다.
이어 본 발명자들은 상기 현상이 진정한 크로스프라이밍 능력인지 확인하기 위하여, 하기와 같은 추가분석을 수행하였다.
구체적으로, 8주령의 Balb/c 야생형 마우스에 B16F10-Ova 암세포 1ㅧ106 cells를 왼쪽 등에 피하접종하여 암을 유발시켰고, 암세포 접종 7일째에 각 실험물질(완충액, dox, FHSirpα 및 FHSirpα-dox)을 3일 간격으로 총 2차례 정맥주사로 주입하였다. 이 때 사용된 각 실험물질의 투여량은 독소루비신(dox)의 경우 1 mg/kg, FHSirpα는 28 mg/kg, 및 FHSirpPα-dox 28 mg/kg(dox 기준으로 1 mg/kg)이었다. 마지막으로 정맥투여 후 10일이 경과한 후, 세포 추적제인 CFSE(carbolxyfluorescein succinimidyl ester)로 염색한 OT-1 T 세포를 정맥주사로 주입하고 3일 경과 후, 종양배액림프절(TDLN)을 적출하여 단일세포화한 후, FACS 분석을 통해 OT-1 T 세포의 세포증식 정도를 CFSE 증식 분석을 통해 확인함으로써, 그룹별 교차프라이밍 능력을 분석하였다.
그 결과, 도 11a 및 11b에서 나타난 것과 같이, 완충액, dox, FHSirpα그룹에 비해 대비 본 발명의 일 실시예에 따른 FHSirpα-dox의 경우 주입한 CFSE으로 염색된 OT-1 T 세포가 더 효과적으로 증식하는 경향을 확인하였다. 구체적으로 FHSirpα-dox의 경우 증식된 7세대 OT-1 T세포의 비율이 15%로 다른 그룹에 비해 유의미하게 증가되어 있었다.
실험예 4: FcSirpα + Mtx의 항암효과
본 발명자들은 Sirpα와 항암제의 병용효과가 다른 플랫폼에서도 구현이 되는지 확인하기 위해 실시예 3에서 제조된 FcSirpα 융합단백질과 항암제 미토잔트론(mitoxantrone)의 병용시의 항암효과를 조사하였다.
4-1: FcSirpα에 의한 식세포 작용 분석
본 발명자들은 우선 FcSirpα가 암세포에 대한 대식세포의 식세포 작용에 미치는 효과를 조사하기 위해, 골수-유래 대식세포(Bone marrow-derived macrophage: BMDM)를 이용하여 암세포에 대한 식세포 작용을 분석하였다. 이를 위해 구체적으로 준비된 BMDM을 1 μM의 CellTracker Green CMFDA(Thermo Fisher Scientific, USA)로 염색하였다. 각각 20x104 세포의 염색된 대식세포를 2 ml RPMI 배지와 함께 35 mm Confocal dish에 파종하였다. RPMI 배지 내에서 준비된 골수-유래 대식세포와 120 ng/ml의 pH rodo SE(Thermo Fisher Scientific, USA)으로 염색한 HT29 암세포주를 약 37℃에서 2시간 동안 대조군 또는 실시예 1에서 제조된 FcSirpα 5 μM 또는 실시예 1에서 제조된 FHSirpα 400 nM와 함께 공배양하였다. 이 때 FcSirpα 5 μM 와 FHSirpα 400 nM은 동일한 양의 Sirpα을 지니고 있다. 공배양 2시간 후, 형광 현미경을 이용하여 암세포의 탐식정도를 분석하였고 (도 12a, 빨간색: 탐식된 암세포, 초록색: 골수-유래 대식세포), 이를 정량화하였다(도 12b). 그 결과, 도 12a 및 12b에서 확인되는 바와 같이, FcSirpα와 FHSirpα에 의해, 대식세포의 암세포 탐식 능력이 유의하게 증가하였고, 이 중 FcSirpα가 가장 우수한 탐식 능력의 증가함을 확인하였다.
이어 본 발명자들은 FcSirpα의 식세포 활성이 어떤 농도부터 나타나는지 확인하기 위해, FcSirpα의 농도를 달리하여 유세포 분석기를 이용하여 암세포에 대한 식세포 작용을 분석하였다. 이를 위해 구체적으로 준비된 BMDM을 1 μM의 CellTracker Green CMFDA(Thermo Fisher Scientific, USA)로 염색하였다. 각각 20x104 세포의 염색된 대식세포를 2 ml RPMI 배지와 함께 35 mm Peptri dish에 파종하였다. RPMI 배지 내에서 준비된 골수-유래 대식세포와 1 μM의 CellTracker Deep redd(Thermo Fisher Scientific, USA)으로 염색한 HT29 암세포주를 약 37℃에서 2시간 동안 대조군 또는 실시예 1에서 제조된 FcSirpα 또는 실시예 1에서 제조된 FHSirpα와 함께 공배양하였다. 이 때 FcSirpα 5 μM 와 FHSirpα 400 nM은 동일한 양의 Sirpα을 지니고 있다. 공배양 2시간 후, 유세포 분석기를 이용하여 암세포의 탐식정도를 분석하였고 그 결과, 도 12c에서 확인되는 바와 같이, FcSirpα 50 nM, FcSirpα 500 nM, FcSirpα 5 μM, FHSirpα 400 nM에 의해, 대식세포의 암세포 탐식 능력이 유의하게 증가하였고, 특히 FcSirpα는 50 nM의 농도부터 우수한 탐식 능력의 증가함을 확인하였다.
4-2: FcSirpα + 미토잔트론에 의한 in vivo 항암효과 분석
상기 실험결과들을 바탕으로 본 발명자들은 FcSirpα와 다른 면역원성 세포사멸 유도제인 미토잔트론(mitoxantrone)의 병용시 상승효과를 조사하였다.
이를 위해 구체적으로, C57BL/6 야생형 마우스에 B16F10 암세포 5X105 cells를 왼쪽 등에 피하주입하여 암을 유발시켰고, 암세포 주입 후 6일째(암세포 주입한 날을 0일째로 함)에 Mitoxantrone(MTX)을 10 μg 또는 FcSirpa 400 μg의 용량으로 종양 내 주사로 투여하였다. FcSirpα + MTX 그룹의 경우에는 Mitoxantrone을 10 μg 종양 내 주사 후 4시간 뒤 FcSirpα 400 μg의 용량으로 종양 내 주사로 투여하였다. 약물 투여 후, 3일 간격으로 암 사이즈를 측정하였고(도 13a) 암세포 주입 후 21일까지의 생존율을 기록하는 한편(도 13b), 암세포 주입 후 21일째에 실험 마우스를 희생시켜 암세포를 적출 후 무게를 측정하였다(도 13c). 실험결과 도 13a 내지 13c에서 나타난 바와 같이, MTX+ FcSirpα 그룹이 가장 우수한 생존율과 항암 효과를 보였다.
4-3: FcSirpα + MTX의 CD8 T 세포 침윤 능력 평가
본 발명자들은 상기 실험예 4-2의 결과로부터 FcSirpα + MTX의 병용투여시 후천성 면역 작용(adaptive immune response) 역시 증진되는지 여부를 CD8+ T 세포의 종양 미세환경 내로의 침윤 정도를 측정함으로써 평가하였다. 이를 위해 구체적으로 C57BL/6 야생형 마우스에 B16F10 암세포 5X105 cells를 왼쪽 등에 피하주입하여 암을 유발시켰고, 암세포 주입 후 6일째(암세포 주입한 날을 0일째로 함)에 Mitoxantrone을 10 μg 또는 FcSirpα 400 μg의 용량으로 종양 내 주사로 투여하였다. FcSirpα 그룹의 경우에는 Mitoxantrone을 10 μg 종양 내 주사 후 4시간 뒤 FcSirpa 400 μg의 용량으로 종양 내 주사로 투여하였다. 암세포 주입 후 21 일째에 마우스를 희생시켜 암조직을 적출한 후 단일 세포로 만들어 항-CD8 항체 염색 이후 유세포 분석기를 통해 암조직내 CD8+ T cell 침윤 정도를 비교 분석하였다. 그 결과, 도 14에서 확인되는 바와 같이, FcSirpα + MTX 그룹에서 다른 그룹에 비해 유의미한 CD8+ T cell 증가를 확인할 수 있었다. 이는, 본 발명의 일 실시예에 따른 다량체성 Sirpα 융합단백질이 면역원성 세포사멸 유도제와 병용투여시 선천성 면역반응은 물론 후천성 면역반응도 증진시킴으로써 놀라운 항암 작용을 나타냄을 보여주는 것이다.
상기 실험결과들은 Sirpα와 같은 신호조절 단백질 및 독소루비신이나 미토잔트론과 같은 면역원성 세포사멸 유도제의 병용투여에 의해 개체의 면역반응, 특히 선천성 면역반응이 강화되어 암세포의 면역학적 사멸이 매우 촉진되며, 이러한 항암활성에는 Sirp의 다량체화가 매우 중요한 역할을 수행함을 보여주는 것이다. 이와 같이 다량체화 도메인을 활용하여 Sirp 단백질의 다량체화를 하고 여기에 독소루비신과 같은 면역원성 세포사멸을 유도하는 항함화합물을 병용처리하는 병용투여제를 개발할 경우, 종래에 치료가 어려웠던 난치성 암에 대한 효율적인 치료제의 개발이 가능할 것으로 기대된다.
본 발명은 실시예를 참고로 설명되었으나 이는 예시적인 것에 불과하며, 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이로부터 다양한 변형 및 균등한 다른 실시예가 가능하다는 점을 이해할 것이다. 따라서 본 발명의 진정한 기술적 보호 범위는 첨부된 특허 청구범위의 기술적 사상에 의하여 정해져야 할 것이다.
<110> Korea Institute of Science and Technology <120> A novel pharmaceutical composition for treating cancer <130> PD18-5703-D2 <150> KR 10-2017-0126259 <151> 2017-09-28 <160> 90 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 182 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Thr Thr Ala Ser Thr Ser Gln Val Arg Gln Asn Tyr His Gln Asp Ser 1 5 10 15 Glu Ala Ala Ile Asn Arg Gln Ile Asn Leu Glu Leu Tyr Ala Ser Tyr 20 25 30 Val Tyr Leu Ser Met Ser Tyr Tyr Phe Asp Arg Asp Asp Val Ala Leu 35 40 45 Lys Asn Phe Ala Lys Tyr Phe Leu His Gln Ser His Glu Glu Arg Glu 50 55 60 His Ala Glu Lys Leu Met Lys Leu Gln Asn Gln Arg Gly Gly Arg Ile 65 70 75 80 Phe Leu Gln Asp Ile Lys Lys Pro Asp Cys Asp Asp Trp Glu Ser Gly 85 90 95 Leu Asn Ala Met Glu Cys Ala Leu His Leu Glu Lys Asn Val Asn Gln 100 105 110 Ser Leu Leu Glu Leu His Lys Leu Ala Thr Asp Lys Asn Asp Pro His 115 120 125 Leu Cys Asp Phe Ile Glu Thr His Tyr Leu Asn Glu Gln Val Lys Ala 130 135 140 Ile Lys Glu Leu Gly Asp His Val Thr Asn Leu Arg Lys Met Gly Ala 145 150 155 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Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu Ser 100 105 110 Val Arg Ala Lys Pro Ser 115 <210> 57 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SiRP alpha variant <400> 57 Glu Glu Glu Val Gln Ile Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Ser Val Ala 1 5 10 15 Ala Gly Glu Ser Val Ile Leu His Cys Thr Ile Thr Ser Leu Thr Pro 20 25 30 Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Ala Arg Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Asn Gln Arg Glu Gly Pro Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser 50 55 60 Glu Thr Thr Arg Arg Glu Asn Met Asp Phe Ser Ile Ser Ile Ser Asn 65 70 75 80 Ile Thr Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Val Lys Leu Arg Lys 85 90 95 Gly Ser Pro Asp Thr Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu Ser 100 105 110 Val Arg Ala Lys Pro Ser 115 <210> 58 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SiRP alpha variant <400> 58 Glu Glu Glu Leu Gln Ile Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Ser Val Ala 1 5 10 15 Ala Gly Glu Ser Ala Ile Leu His Cys Thr Ile Thr Ser Leu Ser Pro 20 25 30 Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Ala Arg Val Leu 35 40 45 Ile Tyr Asn Gln Arg Gln Gly Pro Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser 50 55 60 Glu Gly Thr Lys Arg Glu Asn Met Asp Phe Ser Ile Ser Ile Ser Asn 65 70 75 80 Ile Thr Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Ile Lys Leu Arg Lys 85 90 95 Gly Ser Pro Asp Thr Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu Ser 100 105 110 Val Arg Ala Lys Pro Ser 115 <210> 59 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SiRP alpha variant <400> 59 Glu Glu Glu Ile Gln Val Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Ser Val Ala 1 5 10 15 Ala Gly Glu Ser Val Ile Ile His Cys Thr Val Thr Ser Leu Phe Pro 20 25 30 Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Ala Arg Val Leu 35 40 45 Ile Tyr Asn Gln Arg Gln Gly Arg Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser 50 55 60 Glu Gly Thr Lys Arg Glu Asn Met Asp Phe Ser Ile Ser Ile Ser Asn 65 70 75 80 Ile Thr Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Val Lys Val Arg Lys 85 90 95 Gly Ser Pro Asp Thr Glu Val Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu Ser 100 105 110 Val Arg Ala Lys Pro Ser 115 <210> 60 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SiRP alpha variant <400> 60 Glu Glu Glu Val Gln Ile Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Ser Val Ala 1 5 10 15 Ala Gly Glu Ser Ile Ile Leu His Cys Thr Val Thr Ser Leu Phe Pro 20 25 30 Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Ala Arg Val Leu 35 40 45 Ile Tyr Asn Gln Arg Glu Gly Arg Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser 50 55 60 Glu Gly Thr Arg Arg Glu Asn Met Asp Phe Ser Ile Ser Ile Ser Asn 65 70 75 80 Ile Thr Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Ile Lys Leu Arg Lys 85 90 95 Gly Ser Pro Asp Thr Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu Ser 100 105 110 Val Arg Ala Lys Pro Ser 115 <210> 61 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SiRP alpha variant <400> 61 Glu Glu Glu Val Gln Leu Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Ser Val Ala 1 5 10 15 Ala Gly Glu Ser Ala Ile Leu His Cys Thr Val Thr Ser Leu Phe Pro 20 25 30 Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Ala Arg Val Leu 35 40 45 Ile Tyr Asn Gln Arg Glu Gly Pro Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser 50 55 60 Glu Gly Thr Lys Arg Glu Asn Met Asp Phe Ser Ile Ser Ile Ser Asn 65 70 75 80 Ile Thr Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Ile Lys Phe Arg Lys 85 90 95 Gly Ser Pro Asp Thr Glu Val Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu Ser 100 105 110 Val Arg Ala Lys Pro Ser 115 <210> 62 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SiRP alpha variant <400> 62 Glu Glu Glu Leu Gln Ile Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Leu Val Ala 1 5 10 15 Ala Gly Glu Thr Ala Thr Leu Arg Cys Thr Ile Thr Ser Leu Phe Pro 20 25 30 Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Gly Arg Val Leu 35 40 45 Ile Tyr Asn Gln Arg Gln Gly Pro Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser 50 55 60 Asp Thr Thr Lys Arg Asn Asn Met Asp Phe Ser Ile Arg Ile Gly Asn 65 70 75 80 Ile Thr Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Ile Lys Phe Arg Lys 85 90 95 Gly Ser Pro Asp Asp Val Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu 100 105 110 Ser Val Arg Ala Lys Pro Ser 115 <210> 63 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SiRP alpha variant <400> 63 Glu Glu Glu Leu Gln Ile Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Ser Val Ala 1 5 10 15 Ala Gly Glu Ser Ala Ile Leu His Cys Thr Ile Thr Ser Leu Phe Pro 20 25 30 Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Ala Arg Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Asn Gln Arg Gln Gly Pro Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser 50 55 60 Glu Thr Thr Lys Arg Glu Asn Met Asp Phe Ser Ile Ser Ile Ser Asn 65 70 75 80 Ile Thr Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Val Lys Phe Arg Lys 85 90 95 Gly Ser Pro Asp Thr Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu Ser 100 105 110 Val Arg Ala Lys Pro Ser 115 <210> 64 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SiRP alpha variant <400> 64 Glu Glu Glu Val Gln Ile Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Ser Val Ala 1 5 10 15 Ala Gly Glu Ser Ala Ile Leu His Cys Thr Ile Thr Ser Leu Phe Pro 20 25 30 Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Ala Arg Val Leu 35 40 45 Ile Tyr Asn Gln Lys Gln Gly Pro Phe Pro Arg Val Thr Thr Ile Ser 50 55 60 Glu Thr Thr Arg Arg Glu Asn Met Asp Phe Ser Ile Ser Ile Ser Asn 65 70 75 80 Ile Thr Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Ile Lys Phe Arg Lys 85 90 95 Gly Ser Pro Asp Thr Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu Ser 100 105 110 Val Arg Ala Lys Pro Ser 115 <210> 65 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SiRP alpha variant <400> 65 Glu Glu Glu Leu Gln Ile Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Ser Val Ala 1 5 10 15 Ala Gly Glu Ser Ala Ile Leu His Cys Thr Ile Thr Ser Leu Thr Pro 20 25 30 Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Ala Arg Val Leu 35 40 45 Ile Tyr Asn Gln Arg Gln Gly Pro Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser 50 55 60 Glu Gly Thr Arg Arg Glu Asn Met Asp Phe Ser Ile Ser Ile Ser Asn 65 70 75 80 Ile Thr Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Ile Lys Phe Arg Lys 85 90 95 Gly Ser Pro Asp Thr Glu Val Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu Ser 100 105 110 Val Arg Ala Lys Pro Ser 115 <210> 66 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker peptide <400> 66 Glu Gly Lys Ser Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Ser Thr 1 5 10 <210> 67 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker peptide <400> 67 Gly Ser Ala Gly Ser Ala Ala Gly Ser Gly Glu Phe 1 5 10 <210> 68 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker peptide <400> 68 Cys Arg Arg Arg Arg Arg Arg Glu Ala Glu Ala Cys 1 5 10 <210> 69 <211> 46 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker peptide <400> 69 Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys 1 5 10 15 Glu Ala Ala Ala Lys Ala Leu Glu Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala 20 25 30 Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Ala 35 40 45 <210> 70 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker peptide <400> 70 Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly 1 5 <210> 71 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker peptide <400> 71 Gly Gly Gly Gly Gly Gly 1 5 <210> 72 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker peptide <400> 72 Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 73 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker peptide <400> 73 Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Ala Lys Ala 1 5 10 <210> 74 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker peptide <400> 74 Pro Ala Pro Ala Pro 1 5 <210> 75 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker peptide <400> 75 Val Ser Gln Thr Ser Lys Leu Thr Arg Ala Glu Thr Val Phe Pro Asp 1 5 10 15 Val <210> 76 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker peptide <400> 76 Pro Leu Gly Leu Trp Ala 1 5 <210> 77 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker peptide <400> 77 Thr Arg His Arg Gln Pro Arg Gly Trp Glu 1 5 10 <210> 78 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker peptide <400> 78 Ala Gly Asn Arg Val Arg Arg Ser Val Gly 1 5 10 <210> 79 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker peptide <400> 79 Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg 1 5 <210> 80 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker peptide <400> 80 Gly Phe Leu Gly 1 <210> 81 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker peptide <400> 81 Gly Ser Ser Gly Gly Ser Gly Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Asp 1 5 10 15 Glu Ala Asp Gly Ser Arg Gly Ser Gln Lys Ala Gly Val Asp Glu 20 25 30 <210> 82 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HisX6 tag <400> 82 His His His His His His 1 5 <210> 83 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FLAG tag <400> 83 Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Lys 1 5 <210> 84 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> V5 epitope tag <400> 84 Gly Lys Pro Ile Pro Asn Pro Leu Leu Gly Leu Asp Ser Thr 1 5 10 <210> 85 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Myc peptide <400> 85 Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu 1 5 <210> 86 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HA tag <400> 86 Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala 1 5 <210> 87 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> beta-gal peptide <400> 87 Thr Pro His Pro Ala Arg Ile Gly Leu 1 5 <210> 88 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> AH1 peptide <400> 88 Ser Pro Ser Tyr Val Tyr His Gln Phe 1 5 <210> 89 <211> 232 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG1 Fc domain <400> 89 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 1 5 10 15 Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 20 25 30 Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val 35 40 45 Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val 50 55 60 Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln 65 70 75 80 Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln 85 90 95 Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala 100 105 110 Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro 115 120 125 Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr 130 135 140 Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 145 150 155 160 Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr 165 170 175 Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr 180 185 190 Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe 195 200 205 Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys 210 215 220 Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 225 230 <210> 90 <211> 696 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide encoding IgG1 Fc domain <400> 90 gagcccaaat cttgtgacaa aactcacaca tgcccaccgt gcccagcacc tgaactcctg 60 gggggaccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg 120 acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc 180 aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag 240 tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat 300 ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc 360 atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg 420 gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc 480 gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct 540 cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc 600 aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac 660 tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggtaaa 696

Claims (15)

  1. V6I, V27I, A27I, I31F, E47V, K53R, E54Q, H56P, L66T, S66Y 및 V92I로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환변이를 포함하는 Sirpα 고친화성 변이체 및 항체의 중쇄의 힌지 부위와 CH2 및 CH3 부분을 포함하는 Fc 단편을 포함하는 융합단백질 및 안트라사이클린 계열 항암제를 유효성분으로 포함하는 암치료용 약학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 Sirpα 고친화성 변이체는 V6I, A27I 또는 V27I, I31F, E47V, K53R, E54Q, H56P, L66T 또는 S66T 및 V92I의 치환변이를 모두 포함하는 것인, 암 치료용 약학적 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 Sirpα 고친화성 변이체는 서열번호 5, 15, 17, 18, 및 23 내지 33로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열로 구성되는, 암 치료용 약학적 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 융합단백질은 상기 Sirpα 고친화성 변이체 및 상기 Fc 단편 사이에 링커 펩타이드를 추가로 포함하는, 암 치료용 약학적 조성물.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 링커 펩타이드는 (G4S)n, (GSSGGS)n, KESGSVSSEQLAQFRSLD(서열번호 3), EGKSSGSGSESKST(서열번호 66), GSAGSAAGSGEF(서열번호 67), (EAAAK)n, CRRRRRREAEAC(서열번호 68), A(EAAAK)4ALEA(EAAAK)4A(서열번호 69), GGGGGGGG(서열번호 70), GGGGGG(서열번호 71), GGGGS(서열번호 72), AEAAAKEAAAAKA(서열번호 73), PAPAP(서열번호 74), (Ala-Pro)n, VSQTSKLTRAETVFPDV(서열번호 75), PLGLWA(서열번호 76), TRHRQPRGWE(서열번호 77), AGNRVRRSVG(서열번호 78), RRRRRRRR(서열번호 79), GFLG(서열번호 80), 또는 GSSGGSGSSGGSGGGDEADGSRGSQKAGVDE(서열번호 81)인, 암 치료용 약학적 조성물.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 융합단백질은 N-말단 또는 C-말단에 정제용 태그 펩타이드를 추가로 포함하는, 암 치료용 약학적 조성물.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 태그 펩타이드는 HisX6 펩타이드(서열번호 82), GST 펩타이드, FLAG 펩타이드(DYKDDDK, 서열번호 83), 스트렙타비딘 결합 펩타이드, V5 에피토프 펩타이드(GKPIPNPLLGLDST, 서열번호 84), Myc 펩타이드(EQKLISEE, 서열번호 85), 또는 HA 펩타이드(YPYDVPDYA, 서열번호 86)인, 암 치료용 약학적 조성물.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 안트라사이클린 계열 항암제는 다우노루비신(daunorubicin), 독소루비신(doxorubicin), 에피루비신(epirubicin), 이다루비신(idarubicin), 픽산트론(pixantrone), 미토잔트론(mitoxantrone), 사바루비신(sabarubicin), 또는 발루비신(valrubicin)인, 암 치료용 약학적 조성물.
  9. 제1항에 있어서,
    면역 검문소 억제제를 추가적으로 포함하는, 암 치료용 약학적 조성물.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 면역 검문소 억제제는 PD-1/PD-L1 상호작용 억제제 또는 CTLA-4/B7-1/B7-2 상호작용 억제제인, 암 치료용 약학적 조성물.
  11. 제11항에 있어서,
    상기 PD-1/PD-L1 상호작용 억제제는 PD-1 또는 PDL1을 표적으로 하는 항체 또는 상기 항체의 기능성 단편 또는 단일쇄 기반의 항체 유사체인, 암 치료용 약학적 조성물.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 PD-1 또는 PDL1을 표적으로 하는 항체는, 펨브롤리주맙(Pembrolizumab), 니볼루맙(Nivolumab), 아테졸리주맙(Atezolizumab) 또는 아벨루맙(Avelumab)인, 암 치료용 약학적 조성물.
  13. 제10항에 있어서,
    상기 CTLA-4/B7-1/B7-2 상호작용 억제제는 CTLA-4, B7-1 또는 B7-2를 표적으로 하는 항체 또는 상기 항체의 기능성 단편 또는 단일쇄 기반의 항체 유사체인, 암 치료용 약학적 조성물.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 CTLA-4/B7-1/B7-2 상호작용 억제제는 이필리무맙(Ipilimumab)인, 암 치료용 약학적 조성물.
  15. 제11항 또는 제13항에 있어서,
    상기 단일쇄 기반의 항체 유사체는 scFv, sdAb, 다이아바디(diabody), 모노바디(monobody), 가변 림프구 수용체(variable lymphocyte receptor, VLR), 나노바디(nanobody) 또는 낙타과 항체 중쇄 단편(VHH)인, 암 치료용 약학적 조성물.
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