KR20230018185A - InDel markers for discriminating malting barley varieties and uses thereof - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 맥주보리 품종, 구체적으로 국내외 맥주보리 29개 품종을 판별하는 InDel 마커 및 이의 이용에 관한 것이다.The present invention relates to an InDel marker for discriminating brewer's barley varieties, specifically 29 domestic and foreign brewer's barley varieties, and its use.
국산 맥주보리는 농협과 계약재배 후 대부분 수매되므로 농가의 겨울철 중요한 소득원의 하나이다. 그러나, 국산 맥주보리 재배는 관련 전문인력 양성, 기술개발, 유통채널 등과 같은 인프라가 취약하고, 맥주보리 품질 및 재배환경 개선을 위한 체계적인 연구개발이 부족하며, 맥아 보관 및 품질향상 기술이 매우 미흡한 실정이다.Since domestic beer barley is mostly purchased after contract cultivation with the Agricultural Cooperative Federation, it is one of the important sources of income for farmers in winter. However, domestic brewery barley cultivation has weak infrastructure such as training of related experts, technology development, distribution channels, etc., lack of systematic research and development to improve brewer barley quality and cultivation environment, and malt storage and quality improvement technology are very insufficient. am.
이러한 문제점들을 해결하기 위한 방편의 하나로 맥주제조에 가장 적합한 국산보리 품종을 선정하고, 이에 대해 다양한 품질향상 기술을 개발할 필요가 있다.As one of the measures to solve these problems, it is necessary to select the most suitable domestic barley variety for beer production and to develop various quality improvement technologies.
특히, 맥아제조시 맥주보리 품종의 혼입은 미발아 종자 생산 및 품질 특성 차이로 인한 맥아 품질 저하를 초래한다. 따라서 맥아제조시 품종의 순도가 중요하다. 또한 수제맥주와 지역맥주 활성화로 차별화된 국내 맥주보리 품종을 이용한 맥아의 요구도가 증가하고 있다. 이에 국내에서 재배되는 맥주보리 품종의 보호와 권리 확보가 필요하고, 국산 및 국외 맥주보리 품종의 혼종 방지에 의한 국산 맥주보리 품질 향상을 통해 국산 맥주보리의 경쟁력 향상이 필요한 실정이다. 이를 위해, 국산 및 국외 맥주보리 품종을 구별 및 판별하기 위한 기술 개발이 우선적으로 요구되어 왔다.In particular, the incorporation of brewer's barley varieties during malting causes deterioration in malt quality due to differences in the production of ungerminated seeds and quality characteristics. Therefore, the purity of the variety is important in malting. In addition, the demand for malt using differentiated domestic beer barley varieties is increasing due to the activation of craft beer and local beer. Accordingly, it is necessary to protect and secure rights for beer barley varieties cultivated in Korea, and to improve the competitiveness of domestic beer barley by improving the quality of domestic beer barley by preventing hybridization between domestic and foreign beer barley varieties. To this end, the development of technology for distinguishing and discriminating between domestic and foreign beer barley varieties has been required first.
이러한 배경 하에서, 본 발명자들은 국산 및 국외 맥주보리 품종의 혼종 방지를 위해 예의 연구 노력한 결과, 품종별로 특이적인 InDel(insertion-deletion) 변이 서열을 확인하였고, 이로부터 품종간 구별이 가능한 다형성을 보이는 17쌍의 InDel 마커를 선별하였으며, 상기 마커를 이용하여 국내외 맥주보리 29개 품종을 판별할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.Against this background, the present inventors made diligent research efforts to prevent hybridization between domestic and foreign beer barley varieties, and as a result, identified InDel (insertion-deletion) mutation sequences specific to each variety, from which 17 Pairs of InDel markers were selected, and the present invention was completed by confirming that 29 domestic and foreign brewer's barley varieties could be discriminated using the markers.
본 발명의 하나의 목적은 서열번호 1 내지 서열번호 34의 올리고뉴클레오티드; 또는 상기 올리고뉴클레오티드에 상보적인 올리고뉴클레오티드;를 포함하는, 보리 품종 판별용 프라이머 세트를 제공하는 것이다.One object of the present invention is the oligonucleotides of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 34; Or an oligonucleotide complementary to the oligonucleotide; to provide a primer set for determining barley variety, including.
본 발명의 다른 하나의 목적은 서열번호 1 내지 서열번호 34의 염기서열에서 선택되는 어느 하나 이상의 연속적인 폴리뉴클레오티드; 이들의 상보적인 폴리뉴클레오티드로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 폴리뉴클레오티드; 및 이들의 조합;으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는, 보리 품종 판별용 프라이머 세트를 포함하는, 보리 품종 판별용 조성물을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is any one or more continuous polynucleotides selected from the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 34; Any one or more polynucleotides selected from the group consisting of these complementary polynucleotides; It is to provide a composition for identifying barley varieties, including a primer set for determining barley varieties, including at least one selected from the group consisting of; and combinations thereof.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 (a) 시료로부터 분리된 DNA를 주형으로 하여 상기 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 수행하는 단계; 및 (b) 상기 (a) 단계에서 수득한, 증폭된 PCR 산물을 분석하는 단계를 포함하는, 보리 품종 판별 방법을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is (a) performing PCR using the DNA isolated from the sample as a template and using the primer set; and (b) analyzing the amplified PCR product obtained in step (a).
이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 발명에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 발명에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.A detailed description of this is as follows. Meanwhile, each description and embodiment disclosed in the present invention may also be applied to each other description and embodiment. That is, all combinations of the various elements disclosed herein fall within the scope of the present invention. In addition, it cannot be seen that the scope of the present invention is limited by the specific descriptions described below.
본 발명의 하나의 양태는 서열번호 1 내지 서열번호 34의 올리고뉴클레오티드; 또는 상기 올리고뉴클레오티드에 상보적인 올리고뉴클레오티드;를 포함하는, 보리 품종 판별용 프라이머 세트를 제공한다.One aspect of the present invention is an oligonucleotide of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 34; Or an oligonucleotide complementary to the oligonucleotide; provides a primer set for determining barley variety, including.
본 발명에 있어서, 상기 보리는 맥주 제조용 보리일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.In the present invention, the barley may be barley for beer production, but is not limited thereto.
본 발명에서 용어, "올리고뉴클레오티드"는 뉴클레오티드 단위체(monomer)가 공유결합에 의해 길게 사슬모양으로 이어진 뉴클레오티드의 중합체(polymer)로 일정한 길이 이상의 DNA 또는 RNA 가닥을 의미한다. 상기 올리고뉴클레오티드는 폴리뉴클레오티드와 혼용될 수 있다.In the present invention, the term "oligonucleotide" refers to a DNA or RNA strand of a certain length or longer as a polymer of nucleotides in which nucleotide monomers are connected in a long chain shape by covalent bonds. The oligonucleotides may be used interchangeably with polynucleotides.
본 발명에서 용어, “프라이머(primer)"는 짧은 자유 3' 말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 주형(template)와 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 주형의 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 하며, 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity)뿐만 아니라, 온도 및 이온 강도와 같은 이용 조건에 의존할 것이다. 구체적 예로, 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 구아닌 및 시토신의 함량(GC contents), GC배열, 어닐링(annealing) 온도 및 이온 강도 등 여러 조건을 고려하여 결정해야 한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 중합효소 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트(dNTPs)의 존재 하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다.In the present invention, the term "primer" is a nucleic acid sequence having a short free 3' terminal hydroxyl group, capable of forming a base pair with a complementary template, and copying the template. It refers to a short nucleic acid sequence that serves as a starting point for The length and sequence of the primers should allow the synthesis of the extension product to start, and the specific length and sequence of the primers will depend on the complexity of the DNA or RNA target required ( complexity), as well as the conditions of use, such as temperature and ionic strength.For example, the specific length and sequence of the primers are guanine and cytosine content (GC contents), GC arrangement, annealing temperature and ionic strength, etc. The decision must be made taking into consideration several conditions: Primers are selected for DNA synthesis in the presence of reagents for polymerization (i.e., DNA polymerase or reverse transcriptase) and four different nucleoside triphosphates (dNTPs) in an appropriate buffer solution and temperature. can be initiated.
본 발명에서 프라이머로 이용된 올리고뉴클레오티드는 뉴클레오티드 유사체(analogue), 구체적인 예로써 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)을 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent) 등을 포함할 수 있다.The oligonucleotides used as primers in the present invention may include nucleotide analogs, specifically phosphorothioates, alkylphosphorothioates, or peptide nucleic acids, or intercalating agents) and the like.
또한, 상기 프라이머는 변형시킬 수 있으며, 예를 들어 메틸화, 캡화, 뉴클레오타이드의 치환 또는 뉴클레오타이드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있을 수 있다.In addition, the primer may be modified, for example, methylation, capping, substitution of nucleotides or modification between nucleotides, for example, uncharged linkages (eg, methyl phosphonate, phosphotriester, phosphoroamidate) , carbamates, etc.) or to charged linkages (eg, phosphorothioates, phosphorodithioates, etc.).
본 발명의 프라이머 세트는, 구체적으로 서열번호 1 내지 서열번호 34의 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다.The primer set of the present invention may specifically include oligonucleotides of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 34.
상기 프라이머 세트는 The primer set is
i) 서열번호 2n-1의 정방향 프라이머; 및i) forward primer of SEQ ID NO: 2n-1; and
ii) 서열번호 2n의 역방향 프라이머;로 구성되는 프라이머 세트를 포함하고,ii) a reverse primer of SEQ ID NO: 2n;
상기 n은 1 내지 17의 자연수로, i) 및 ii)의 n은 동일한 값을 갖는 17쌍의 프라이머 세트로 구성될 수 있다.Where n is a natural number from 1 to 17, n in i) and ii) may be composed of 17 primer sets having the same value.
일예로, 상기 프라이머 세트는 서열번호 1 및 서열번호 2로 구성되는 프라이머 세트; 서열번호 3 및 서열번호 4로 구성되는 프라이머 세트; 서열번호 5 및 서열번호 6로 구성되는 프라이머 세트; 서열번호 7 및 서열번호 8 로 구성되는 프라이머 세트; 서열번호 9 및 서열번호 10 로 구성되는 프라이머 세트; 서열번호 11 및 서열번호 12로 구성되는 프라이머 세트; 서열번호 13 및 서열번호 14로 구성되는 프라이머 세트; 서열번호 15 및 서열번호 16으로 구성되는 프라이머 세트; 서열번호 17 및 서열번호 18로 구성되는 프라이머 세트; 서열번호 19 및 서열번호 20으로 구성되는 프라이머 세트; 서열번호 21 및 서열번호 22로 구성되는 프라이머 세트; 서열번호 23 및 서열번호 24로 구성되는 프라이머 세트; 서열번호 25 및 서열번호 26로 구성되는 프라이머 세트; 서열번호 27 및 서열번호 28로 구성되는 프라이머 세트; 서열번호 29 및 서열번호 30으로 구성되는 프라이머 세트; 서열번호 31 및 서열번호 32로 구성되는 프라이머 세트; 또는 서열번호 33 및 서열번호 34로 구성되는 프라이머 세트;로 구성될 수 있다. For example, the primer set is a primer set consisting of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2; A primer set consisting of SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4; A primer set consisting of SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6; A primer set consisting of SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8; A primer set consisting of SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 10; A primer set consisting of SEQ ID NO: 11 and SEQ ID NO: 12; A primer set consisting of SEQ ID NO: 13 and SEQ ID NO: 14; A primer set consisting of SEQ ID NO: 15 and SEQ ID NO: 16; A primer set consisting of SEQ ID NO: 17 and SEQ ID NO: 18; A primer set consisting of SEQ ID NO: 19 and SEQ ID NO: 20; A primer set consisting of SEQ ID NO: 21 and SEQ ID NO: 22; A primer set consisting of SEQ ID NO: 23 and SEQ ID NO: 24; A primer set consisting of SEQ ID NO: 25 and SEQ ID NO: 26; A primer set consisting of SEQ ID NO: 27 and SEQ ID NO: 28; A primer set consisting of SEQ ID NO: 29 and SEQ ID NO: 30; A primer set consisting of SEQ ID NO: 31 and SEQ ID NO: 32; or a primer set consisting of SEQ ID NO: 33 and SEQ ID NO: 34;
한편, 전술한 프라이머 세트와 동일한 영역을 증폭할 수 있고 동일한 기능을 하는 프라이머라면, 본 발명의 범위에 포함될 수 있다. Meanwhile, any primer capable of amplifying the same region as the above primer set and having the same function may be included in the scope of the present invention.
또한, 서열번호 1 내지 34로 구성되는 17쌍의 프라이머 세트 중 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상, 10개 이상, 11개 이상, 12개 이상, 13개 이상, 또는 14개의 프라이머 세트를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. In addition, at least 1, at least 2, at least 3, at least 4, at least 5, at least 6, at least 7, at least 8, at least 9 of the 17 pairs of primer sets consisting of SEQ ID NOs: 1 to 34 It may include, but is not limited to, 10 or more, 11 or more, 12 or more, 13 or more, or 14 primer sets.
본 발명의 보리 품종 판별용 프라이머 세트는, 표적 서열의 증폭을 위하여 사용될 수 있으며, 특히, 보리 품종 판별을 위한 Indel 서열의 증폭을 위하여 사용될 수 있다. 구체적으로, 상기 프라이머 세트는 보리 게놈 DNA의 chr1H, chr2H, chr3H, chr4H, chr5H, chr6H 및 chr7H로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상에 존재하는 InDel 서열, 즉, InDel의 마커를 검출 또는 증폭시킬 수 있는 프라이머 세트일 수 있다.The primer set for identifying barley varieties of the present invention can be used to amplify a target sequence, and in particular, can be used to amplify an Indel sequence for identifying barley varieties. Specifically, the primer set can detect or amplify an InDel sequence present in any one or more selected from the group consisting of chr1H, chr2H, chr3H, chr4H, chr5H, chr6H and chr7H of barley genomic DNA, that is, a marker of InDel. It may be a primer set with
본 발명에서 용어, "Indel(Insertion/deletion) 마커"는 DNA의 염기배열에서 일부 염기가 중간에 삽입되거나(insertion) 결실된(deletion) 변이를 총칭한다. 상기 Indel 마커는 표준유전체와 실험에 사용된 품종의 유전체 정보를 비교 분석하는 방법을 통해 표준유전체보다 삽입(insertion) 또는 결실(deletion)된 영역을 탐색하고 그 정보를 바탕으로 프라이머를 제작한다. 따라서 그 증폭 결과는 표준유전체와 비교하여 밴드 크기가 큰 경우(insertion)와 작은 경우(deletion)의 두 종류 타입을 나타낼 수 있다. In the present invention, the term "Indel (Insertion/deletion) marker" refers to mutations in which some bases are inserted or deleted in the middle of a DNA base sequence. The Indel marker searches for a region inserted or deleted from the reference genome through a method of comparatively analyzing the reference genome and the genetic information of the breed used in the experiment, and prepares primers based on the information. Therefore, the amplification result can represent two types of band size (insertion) and small band size (deletion) compared to the standard genome.
상기 "마커(marker)"는 유전적으로 불특정 연관된 유전자좌를 동정할 때 참고점으로 사용되는 염기서열을 의미한다. The "marker" refers to a nucleotide sequence used as a reference point when identifying a genetically unspecified genetic locus.
상기 용어, "표준유전체"는 본 발명의 품종 판별에 있어 기준이 되는 작물의 품종의 유전체를 의미한다.The term "standard genome" refers to the genome of a crop variety that is used as a reference in determining the variety of the present invention.
상기 용어, "유전자좌"는 분자 마커의 유전자 지도상의 위치를 의미한다. The term "locus" refers to the location on a genetic map of a molecular marker.
본 발명의 프라이머 세트는 사천6호, 두산8호, 삼도보리, 진양보리, 남향보리, 단원보리, 일진보리, 신호보리, 대영보리, 대아보리, 호품, 호진, 다진, 오름, 다호, 백호, 광맥, 이맥, 다이안, 흑호, 다품, 누리맥, 백록, 스칼렛(Scarlett), 코맨더(Commander), 바우딘(Baudin), 스틸링(Stirling)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 품종을 판별할 수 있다.The primer set of the present invention is Sacheon 6, Doosan 8, Samdo barley, Jinyang barley, Namhyang barley, Danwon barley, Iljin barley, Shinho barley, Daeyoung barley, Daeabori, Hopum, Hojin, Dajin, Oreum, Daho, Baekho, It is possible to identify one or more varieties selected from the group consisting of ore vein, emac, diane, black lake, multi-item, nuri mac, baekrok, scarlett, commander, Baudin, and stirling. there is.
본 발명의 일 구현 예에서, 본 발명에서 선별된 17쌍의 프라이머 세트를 이용하여 국내외 맥주보리 31개 품종에 대해 PCR 수행 후 다형성 분석한 결과, 국내외 맥주보리 31개 품종 중 진광보리 및 제주보리 품종을 제외한 29개 품종을 판별할 수 있음을 확인하였다(도 2 ~ 도 7).In one embodiment of the present invention, PCR was performed on 31 varieties of domestic and foreign beer barley using the 17 pairs of primer sets selected in the present invention, and then polymorphism analysis was performed. It was confirmed that 29 varieties could be identified except for (Figs. 2 to 7).
본 발명의 다른 하나의 양태는 서열번호 1 내지 서열번호 34의 염기서열에서 선택되는 어느 하나 이상의 연속적인 폴리뉴클레오티드; 이들의 상보적인 폴리뉴클레오티드로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 폴리뉴클레오티드; 및 이들의 조합;으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는, 보리 품종 판별용 프라이머 세트를 포함하는, 보리 품종 판별용 조성물을 제공한다.Another aspect of the present invention is any one or more continuous polynucleotides selected from the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 34; Any one or more polynucleotides selected from the group consisting of these complementary polynucleotides; and combinations thereof; provides a composition for identifying barley varieties, including a primer set for determining barley varieties, including at least one selected from the group consisting of;
본 발명의 또 다른 하나의 양태는 본 발명의 프라이머 세트를 포함하는, 보리 품종 판별용 키트를 제공한다.Another aspect of the present invention provides a kit for identifying barley varieties, including the primer set of the present invention.
여기에서 사용되는 용어는 전술한 바와 같다.Terms used herein are as described above.
본 발명의 키트는, 이에 제한되는 것은 아니나, PCR 키트, DNA 분석용(예, DNA 칩) 키트일 수 있다.The kit of the present invention may be, but is not limited to, a PCR kit or a DNA analysis kit (eg, a DNA chip).
본 발명의 키트는 본 발명의 조성물을 이용하여 보리 게놈 DNA의 chr1H, chr2H, chr3H, chr4H, chr5H, chr6H 및 chr7H로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상에 존재하는 InDel 서열을 증폭하여 확인함으로써, 국내외 보리 품종을 판별 또는 구별하는데 사용될 수 있다. 구체적인 일례로서, 본 발명에서 제공하는 상기 키트는 PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다.The kit of the present invention amplifies and confirms the InDel sequence present in any one or more selected from the group consisting of chr1H, chr2H, chr3H, chr4H, chr5H, chr6H and chr7H of barley genomic DNA using the composition of the present invention. It can be used to identify or distinguish barley varieties. As a specific example, the kit provided by the present invention may be a kit including essential elements required to perform PCR.
예를 들어, PCR 키트는, 이전 양태에서 전술한 프라이머 세트 외에도 테스트 튜브, 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), 다양한 효소(Taq-폴리머라아제 등), DNase, RNAse 억제제, DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다. 또 다른 예로서, 본 발명의 키트는 DNA 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 보리 품종 판별용 DNA 칩 키트일 수 있다. For example, a PCR kit may contain, in addition to the primer set described above in the previous aspect, a test tube, another suitable container, a reaction buffer (with varying pH and magnesium concentration), deoxynucleotides (dNTPs), various enzymes (Taq-polymerase, etc.) ), DNase, RNAse inhibitors, DEPC-water, sterile water, and the like. As another example, the kit of the present invention may be a DNA chip kit for identifying barley varieties, including essential elements required to perform DNA chip.
본 발명의 용어 "DNA 칩"이란, 수십만 개의 DNA의 각 염기를 한번에 확인할 수 있는 DNA 마이크로어레이의 하나를 의미한다.The term "DNA chip" of the present invention refers to one of DNA microarrays capable of identifying hundreds of thousands of DNA bases at once.
상기 DNA 칩 키트는, 일반적으로 편평한 고체 지지판, 전형적으로는 현미경용 슬라이드보다 크지않은 유리 표면에 핵산 종을 격자형 배열(gridded array)로 부착한 것으로, 칩 표면에 핵산이 일정하게 배열되어, DNA 칩 상의 핵산과 칩 표면에 처리된 용액 내에 포함된 상보적인 핵산 간에 다중 혼성화(hybridization) 반응이 일어나 대량 병렬 분석이 가능하도록 하는 도구일 수 있다.In the DNA chip kit, nucleic acid species are attached in a gridded array to a generally flat solid support plate, typically a glass surface no larger than a slide for a microscope, and nucleic acids are regularly arranged on the chip surface to form DNA. It may be a tool that enables mass parallel analysis by multiple hybridization reactions between nucleic acids on the chip and complementary nucleic acids included in the solution treated on the chip surface.
본 발명의 또 다른 하나의 양태는 (a) 시료로부터 분리된 DNA를 주형으로 하여 본 발명의 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 수행하는 단계; 및 (b) 상기 (a) 단계에서 수득한, 증폭된 PCR 산물을 분석하는 단계를 포함하는, 보리 품종 판별 방법을 제공한다.Another aspect of the present invention is (a) performing PCR using the primer set of the present invention using DNA isolated from a sample as a template; and (b) analyzing the amplified PCR product obtained in step (a).
여기에서 사용되는 용어는 전술한 바와 같다.Terms used herein are as described above.
상기 (a) 단계는 시료로부터 분리된 DNA를 주형으로 하여, 본 발명의 보리 품종 판별용 조성물 또는 본 발명의 보리 품종 판별용 키트를 이용하여 PCR을 수행하는 것일 수 있다. 상기 본 발명의 보리 품종 판별용 조성물 또는 본 발명의 보리 품종 판별용 키트는 이전 양태에서 전술한 바와 같다.In the step (a), PCR may be performed using the DNA isolated from the sample as a template and using the composition for determining the barley variety of the present invention or the kit for determining the barley variety of the present invention. The composition for determining a variety of barley or the kit for determining a variety of barley according to the present invention is as described in the previous embodiment.
상기 (a) 단계는 보리 식물 개체 또는 종자로부터 분리된 시료를 이용하여 게놈 DNA를 수득하는 단계를 추가로 포함할 수 있으며, 상기 시료는 특별히 이에 제한되지 않으나, 일예로, 종자, 분리된 조직 또는 분리된 세포일 수 있다.The step (a) may further include obtaining genomic DNA using a sample isolated from a barley plant individual or seed, and the sample is not particularly limited thereto, but for example, a seed, an isolated tissue or may be isolated cells.
상기 (a) 단계는 본 발명의 프라이머 세트를 이용한 중합효소 연쇄반응(PCR)에 의하여 수행될 수 있다. 상기 본 발명의 프라이머 세트는 이전 양태에서 전술한 바와 같다.Step (a) may be performed by polymerase chain reaction (PCR) using the primer set of the present invention. The primer set of the present invention is as described above in the previous aspect.
또한, 상기 (a) 단계의 PCR 수행 단계는 당업자에게 알려진 어떠한 방법이든 사용 가능하다. 구체적으로, 주형으로 사용되는 DNA는 각각의 개별 보리 식물 또는 종자로부터 분리된 DNA일 수 있고, 2 이상의 보리 식물 또는 종자를 포함하는 혼합 물질로부터 분리된 DNA일 수도 있다.In addition, any method known to those skilled in the art may be used for performing the PCR in step (a). Specifically, the DNA used as a template may be DNA isolated from each individual barley plant or seed, or may be DNA isolated from a mixture containing two or more barley plants or seeds.
상기 (b) 단계는 상기 (a) 단계에서 수득한, 증폭된 PCR 산물을 분석하는 것일 수 있다.Step (b) may be to analyze the amplified PCR product obtained in step (a).
상기 증폭된 PCR 산물의 분석은 당업자에게 알려진 어떠한 방법이든 사용 가능하다. 구체적으로, (a) 단계에 의하여 증폭된 DNA 마커의 서열을 결정하여, 목적하는 DNA 마커가 검출되었는지의 여부를 확인할 수 있다. 구체적인 방법으로서 DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.Any method known to those skilled in the art may be used to analyze the amplified PCR product. Specifically, by determining the sequence of the DNA marker amplified in step (a), it is possible to confirm whether the target DNA marker is detected. As a specific method, it may be performed through a DNA chip, gel electrophoresis, radioactivity measurement, fluorescence measurement, or phosphorescence measurement, but is not limited thereto.
또한, 본 발명의 프라이머 세트를 사용하여 증폭시킨 PCR 산물을 보다 효과적으로 인식하기 위하여, 상기 프라이머의 5' 또는 3' 말단에 형광물질 등으로 표지할 수 있다. 이때, 사용되는 형광물질은 특별히 이에 제한되지 않으나, FAM(6-carboxyfluorescein), HEX (2',4',5',7',-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), NEDTM 등을 사용할 수 있다. 그러나, 본 발명의 특이적 프라이머 세트는 증폭된 PCR 산물의 명확한 크기 차이로 인하여, 별다른 형광물질의 표지 없이도 겔 상에서 밴드 사이즈로 이를 명확히 구분할 수 있다.In addition, in order to more effectively recognize a PCR product amplified using the primer set of the present invention, the 5' or 3' end of the primer may be labeled with a fluorescent substance or the like. At this time, the fluorescent material used is not particularly limited thereto, but FAM (6-carboxyfluorescein), HEX (2', 4', 5', 7', -tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), NED TM etc. can be used. However, the specific primer set of the present invention can be clearly distinguished by the band size on the gel without any fluorescent labeling due to the clear size difference of the amplified PCR products.
본 발명의 마커는 국내 육성 맥주보리인 호품 등의 25개 품종과 맥아제조용으로 주로 수입되는 유럽산 맥주보리인 Scarlett 등의 4개 품종, 총 29개 맥주보리 품종을 판별할 수 있는 바, 혼종 방지 등의 품질관리로 국내 육성 품종에 대해 차별화할 수 있고, 수입 맥류 부정 유통 방지 및 국내 육성 맥류의 품질 경쟁력을 확보할 수 있으며, 나아가 국내 육성 보리 품종의 유전자원 보호에 활용할 수 있다.The marker of the present invention can discriminate a total of 29 beer barley varieties, including 25 varieties such as Hopum, a domestically grown beer barley, and 4 varieties such as Scarlett, a European beer barley mainly imported for malting, preventing hybridization, etc. Quality control can differentiate domestic breeds, prevent illegal distribution of imported barley, secure quality competitiveness of domestically grown barley, and furthermore, can be used to protect genetic resources of domestic barley varieties.
도 1은 한국 맥아보리 6개 품종과 Morex 사이에서 검출된 InDel의 분포를 나타낸 도이다. (A) 6개 국내 맥주보리 품종과 Morex 사이에서 검출된 InDels의 7개 염색체와 미지염색체(unknown chromosome)의 분포. (A-a) 각 서커스(circos)는 보리의 7개 염색체와 미지염색체를 나타내었다. (A-b~A-g) 원형 다이아그램은 맥주보리 6개 품종과 Morex간의 비교를 통해 각 염색체에서 1M 간격으로 InDel의 밀도(InDel 개수/1Mbp)를 조사하여 나타내었다. (A-b) 백호. (A-c) 광맥. (A-d) 흑호. (A-e) 호품. (A-f) 진양보리. (A-g) 누리맥. (B) 국내 맥주보리 6개 품종과 Morex 사이에서 검출된 삽입 및 결실의 크기 분포로 삽입과 결실의 길이가 길수록 모든 품종에서 개수가 급격히 줄어드는 분포를 나타내었다.
도 2는 HP1H-5, GM1H-10, GM1H-17 또는 HH1H-9 마커(프라이머) 쌍을 이용하여 국내외 맥주보리 31개 품종에 대해 PCR 수행 후 도출한 다형성 결과이다.
도 3은 50BH1H-2, NM3H-28, NM3H-36 또는 HH4H-3 마커(프라이머) 쌍을 이용하여 국내외 맥주보리 31개 품종에 대해 PCR 수행 후 도출한 다형성 결과이다.
도 4는 50GM4H-3, NM5H-3, NM5H-6 또는 50HP5H-1 마커(프라이머) 쌍을 이용하여 국내외 맥주보리 31개 품종에 대해 PCR 수행 후 도출한 다형성 결과이다.
도 5는 50HP5H-2, GM6H-30, 50GM6H-4 또는 BH7H-2 마커(프라이머) 쌍을 이용하여 국내외 맥주보리 31개 품종에 대해 PCR 수행 후 도출한 다형성 결과이다.
도 6은 50JY7H-2 마커(프라이머) 쌍을 이용하여 국내외 맥주보리 31개 품종에 대해 PCR 수행 후 도출한 다형성 결과이다.
도 7은 본 발명의 마커를 이용한 다형성 분석 결과이다.1 is a diagram showing the distribution of InDel detected between six varieties of Korean malt barley and Morex. (A) Distribution of 7 chromosomes and unknown chromosomes of InDels detected between 6 domestic beer barley cultivars and Morex. (Aa) Each circos showed 7 barley chromosomes and unknown chromosomes. (Ab~Ag) Circular diagrams are shown by examining InDel density (InDel number/1Mbp) at 1M intervals in each chromosome through comparison between 6 brewer's barley varieties and Morex. (Ab) Backhoe. (Ac) Lode veins. (Ad) Black Tiger. (Ae) good quality. (Af) Jinyang barley. (Ag) Nurimac. (B) Size distribution of insertions and deletions detected between 6 domestic brewer's barley cultivars and Morex. The longer the length of insertions and deletions, the more rapidly the number decreased in all cultivars.
2 is a polymorphism result obtained after PCR was performed on 31 domestic and foreign beer barley varieties using HP1H-5, GM1H-10, GM1H-17 or HH1H-9 marker (primer) pairs.
3 is a polymorphism result derived after PCR was performed on 31 domestic and foreign varieties of beer barley using 50BH1H-2, NM3H-28, NM3H-36 or HH4H-3 marker (primer) pairs.
4 is a polymorphism result derived after PCR was performed on 31 varieties of domestic and foreign beer barley using 50GM4H-3, NM5H-3, NM5H-6 or 50HP5H-1 marker (primer) pairs.
5 is a polymorphism result derived after PCR was performed on 31 varieties of domestic and foreign beer barley using 50HP5H-2, GM6H-30, 50GM6H-4 or BH7H-2 marker (primer) pairs.
6 is a polymorphism result derived after PCR was performed on 31 domestic and foreign beer barley varieties using a 50JY7H-2 marker (primer) pair.
7 is a polymorphism analysis result using the marker of the present invention.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다. Hereinafter, the present invention will be described in more detail through examples. However, these examples are intended to illustrate the present invention by way of example, and the scope of the present invention is not limited to these examples.
실시예 1. 국내 육성 맥주보리 품종 및 국외 맥주보리 품종의 DNA 추출Example 1. DNA extraction of domestically grown beer barley varieties and foreign beer barley varieties
국내 육성 맥주보리 27개 품종 및 국외 맥주보리 4개 품종을 포함하는 총 31개 품종은 하기 표 1 및 표 2와 같다. 31개 품종의 종자는 맥주보리 표준재배법에 준해 2017년 국립식량과학원 작물육종과 전작포장(전주)에서 수확한 종자이다.A total of 31 varieties, including 27 varieties of domestic beer barley and 4 varieties of foreign beer barley, are shown in Tables 1 and 2 below. Seeds of 31 varieties were harvested in 2017 from the Crop Breeding Division of the National Institute of Crop Science and Fielding (Jeonju) in accordance with the standard cultivation method of beer barley.
각 품종들의 게놈 DNA는 유묘의 잎으로부터 제조사의 프로토콜에 따라 Higene genomic DNA prep kit(Biofact co. Ltd, Korea)을 이용하여 추출하였다.Genomic DNA of each variety was extracted from the leaves of seedlings using the Higene genomic DNA prep kit (Biofact co. Ltd, Korea) according to the manufacturer's protocol.
WGRa: Variety used in whole genome re-sequencing. WGR a : Variety used in whole genome re-sequencing.
WGRa: Variety used in whole genome re-sequencing. WGR a : Variety used in whole genome re-sequencing.
실시예 2. 라이브러리 제작 및 염기서열 분석Example 2. Library construction and sequencing analysis
백호 등 6개 품종의 게놈 DNA에 대한 WGR(Variety used in whole genome re-sequencing)은 Phygen(Gyeonggi-do, Korea)에 의뢰하여 분석하였다. 추출한 게놈 DNA는 Quant-iTTM PicoGreen® dsDNA assay kit(Invitrogen, USA)을 이용하여 Dropsense(Trinean, Belgium)로 정량하였으며, 농도는 20ng, 총량은 2 ㎍ 이상인 것만 이용하였다. 염기서열 분석을 위한 라이브러리 제작에는 TruSeq DNA PCR- free library prep kit(Illumina, Inc., San Diego, US-CA)을 사용하였다. 추출한 게놈 DNA를 초음파 처리(sonication)을 통해 단편화한 후, ~350bp 크기의 단편만 선발하였다. 선발된 단편은 paired end sequencing을 위한 라이브러리로 제작되었고, Illumina HiSeq X platform에서 염기서열 분석을 수행하였다.WGR (Variety used in whole genome re-sequencing) of the genomic DNA of six breeds, including Baekho, was analyzed by requesting Phygen (Gyeonggi-do, Korea). The extracted genomic DNA was quantified with Dropsense (Trinean, Belgium) using the Quant-iT TM PicoGreen® dsDNA assay kit (Invitrogen, USA), and only those having a concentration of 20 ng and a total amount of 2 μg or more were used. TruSeq DNA PCR-free library prep kit (Illumina, Inc., San Diego, US-CA) was used to prepare a library for sequencing. After the extracted genomic DNA was fragmented by sonication, only ~350 bp fragments were selected. The selected fragments were prepared as a library for paired end sequencing, and sequencing was performed on the Illumina HiSeq X platform.
실시예 3. Read의 표준유전체상 매핑(mapping) 및 InDel 분석Example 3. Read standard genome mapping (mapping) and InDel analysis
각 보리품종에서 생산된 염기서열 정보로부터 phred quality score가 20 이하인 low-quality read와 중복 read를 Trimmomatic v. 0.38을 이용하여 제거하였다. Low-quality read와 중복 read가 제거되고 남은 high-quality read들을 Morex 표준유전체(Mascher et al. 2017)에 Burrows-Wheeler Aligner v. 0.7.17을 이용하여 매핑하였다. 이후 SAMtools v. 1.9를 이용하여 매핑이 되지 않거나 염색체상 여러 위치에 매핑된 read들을 제거하였다. 또한, Picard package v. 1.112를 이용하여 PCR 복제물들을 제거하였다. Genome analysis Toolkit v. 3.5의 haplotypeCaller module를 이용하여 read의 염기서열을 결정하고 vcf 파일을 작성하였다. 표준유전체와 맥주보리 품종들간의 InDel은 최소 상동성(min coverage): 5, 최대 상동성(max coverage): 250, quality≥20, SNP 비율은 0.9 조건으로 분석하였다.Trimmomatic v. Removed using 0.38. Low-quality reads and redundant reads were removed, and the remaining high-quality reads were added to the Morex standard genome (Mascher et al. 2017) with the Burrows-Wheeler Aligner v. Mapped using 0.7.17. Since SAMtools v. 1.9 was used to remove reads that could not be mapped or mapped to multiple locations on the chromosome. Also, Picard package v. PCR duplicates were removed using 1.112. Genome analysis toolkit v. The nucleotide sequence of the read was determined using the haplotypeCaller module of 3.5 and the vcf file was created. InDel between the standard genome and brewer's barley cultivars was analyzed under the following conditions: min coverage: 5, max coverage: 250, quality≥20, and SNP ratio 0.9.
백호 등 6개 맥주보리 품종은 Illumina HiSeqX platform을 이용하여 368,894,520~624,036,920개 read와 55,703,072,520~94,229,574,920bp의 염기서열을 생성하였다. 염기서열 정확도가 99%임을 나타내는 Q20은 6개 맥주보리 품종에서 평균 96%의 높은 수치를 나타내었다(표 3). Raw data의 염기서열에서 low-quality read와 중복 read를 Trimmomatic을 이용하여 제거하고 337,298,954~572,775,358개 read와 48,931,317,035~83,888,403,648bp의 trimmed 염기서열을 다시 생성하였다. 각 맥주보리 품종의 trimmed read를 표준유전체인 Morex에 매핑하였다. 그 결과 211,145,586~358,477,728개 read와 30,739,038,802~52,354,131,893bp 염기가 보리 염색체에서 한 영역에만 특이적으로 매핑되어 맥주보리 6개 품종에서 6.36~10.83 범위와 평균 7.85의 depth를 나타내었으며, 누리맥은 생성된 염기서열이 52,354,131,893bp로 가장 많아 depth 또한 10.83으로 가장 높았다. 백호 등 6개 맥주보리 품종은 평균 74.7%의 게놈 상동성을 나타내었다(표 3).368,894,520~624,036,920 reads and 55,703,072,520~94,229,574,920 bp sequences were generated for 6 beer barley varieties including Baekho using the Illumina HiSeqX platform. Q20, which indicates that the nucleotide sequence accuracy was 99%, showed a high average of 96% in 6 beer barley cultivars (Table 3). Low-quality reads and redundant reads were removed from the base sequence of raw data using Trimmomatic, and trimmed sequences of 337,298,954 to 572,775,358 reads and 48,931,317,035 to 83,888,403,648 bp were regenerated. The trimmed reads of each brewer's barley cultivar were mapped to the standard genome, Morex. As a result, 211,145,586 to 358,477,728 reads and 30,739,038,802 to 52,354,131,893 bp bases were specifically mapped to only one region on the barley chromosome, showing a range of 6.36 to 10.83 and an average depth of 7.85 in 6 varieties of beer barley. The sequence was the highest at 52,354,131,893 bp, and the depth was also the highest at 10.83. Six beer barley cultivars including Baekho showed an average of 74.7% genomic homology (Table 3).
백호 등 6개 맥주보리 품종에 대한 InDel을 분석하였다. 6개 맥주보리 품종 평균 92,552개 InDel이 존재하였다. 누리맥이 97,359개로 InDel이 가장 많았으며, 백호는 88,685개로 가장 적었다. 보리의 7개 염색체에 매핑되지 않은 염기서열인 chr. unassigned를 포함하였을 때 염색체 평균 11,569개의 InDel이 탐색되었다. InDel의 분포는 염색체별로 다르게 나타났는데 chr. unassigned를 제외하면 7H 염색체에서 품종 평균 19,554개로 가장 많은 InDel이 존재하였고, 4H에서 가장 적은 7,516개의 InDel 개수를 보였다(도 1A). 맥주보리 6개 품종과 Morex 게놈 간의 비교를 통해 각 염색체에서 1M 간격으로 InDel의 밀도(InDel 개수/1Mbp)를 조사하였다. InDel의 밀도 계산에는 1M보다 짧은 각 염색체의 마지막 영역도 포함하였다. 맥주보리 6개 품종의 InDel 밀도의 범위는 17~19개, 평균 18개였으며, 누리맥이 19개로 가장 높았으며, 백호가 17개로 가장 낮았다. 7H 염색체의 품종 평균 InDel 밀도가 30개로 가장 높았으며 chr. unassigned를 제외하면 4H 염색체가 12개로 가장 낮았다. 품종에 따른 염색체별 InDel의 분포는 비슷한 경향을 나타내었다. 그리고 염색체에 따라 InDel의 밀도가 차이를 나타낸 것과 같이 염색체 내에서도 InDel의 분포는 편중되어 나타났다. 맥주보리 6개 품종에서 공통으로 InDel이 존재하지 않는 영역의 개수는 chr. unassigned를 포함하였을 때 227개, chr. unassigned를 제외하면 193개였다. InDel이 존재하지 않는 영역의 길이가 10M 이상인 곳도 1H~7H 염색체에서 총 13개가 있었다. 특히 7H 염색체의 547~573Mbp 영역은 InDel이 존재하지 않는 가장 긴 영역이었다. 또한 1H~7H의 각 염색체에서 InDel이 존재하지 않는 비율은 1H 염색체가 가장 낮은 4.1%, 2H 염색체가 23%로 가장 높게 나타났다(도 1A). InDel was analyzed for 6 beer barley cultivars including Baekho. There were an average of 92,552 InDels for 6 beer barley cultivars. Nurimac had the most with 97,359, and Baekho had the least with 88,685. chr, a nucleotide sequence not mapped to the 7 chromosomes of barley. When unassigned was included, an average of 11,569 InDels on chromosomes were searched. The distribution of InDel was different for each chromosome, but chr. Excluding unassigned, the 7H chromosome had the most InDels, with an average of 19,554, and the smallest number of InDels, 7,516, on 4H (Fig. 1A). The density of InDel (InDel number/1Mbp) was investigated at 1M intervals on each chromosome through comparison between the six brewer barley varieties and the Morex genome. InDel's density calculations also included the last regions of each chromosome shorter than 1M. The range of InDel density of 6 varieties of beer barley was 17~19, with an average of 18, Nurimac had the highest value of 19, and Baekho had the lowest value of 17. The cultivar average InDel density of 7H chromosome was 30, which was the highest, and chr. Excluding unassigned, 4H chromosomes were the lowest at 12. The distribution of InDel by chromosome according to breed showed a similar trend. Also, the distribution of InDel was biased within chromosomes, just as the density of InDel was different depending on the chromosome. The number of regions where InDel does not exist in common in the six beer barley cultivars is chr. 227 when including unassigned, chr. Excluding unassigned, there were 193. A total of 13 regions in the 1H-7H chromosomes had a length of 10 M or more where InDel did not exist. In particular, the 547 to 573 Mbp region of the 7H chromosome was the longest region without InDel. In addition, the ratio of InDel not present in each chromosome of 1H to 7H was the lowest at 4.1% for
한편, InDel 의 밀도가 매우 높은 150개/Mbp 이상인 영역은 1H 염색체의 509~510Mbp, 3H의 18~19Mbp, 6H의 16~17Mbp, 7H의 4~5Mbp로 총 4 곳인 것으로 확인되었다(도 1A). 삽입(Insertion)과 결실(deletion)의 길이가 길수록 모든 품종에서 개수가 급격히 줄어드는 분포를 보였다(도 1B). ±1bp가 평균 62.7%로 비율이 가장 높았으며, 1~10bp가 삽입과 결실의 90% 이상을 차지하였다. 특히 >50bp의 삽입 개수는 >-50의 결실보다 약 4배 많았다(도 1B). On the other hand, regions with a very high InDel density of 150/Mbp or more were identified as 509 to 510 Mbp of
실시예 4. 품종 특이적 large-InDel 선발 및 프라이머 설계Example 4. Variety-specific large-InDel selection and primer design
분석된 InDel을 이용하여 2.0% 아가로스 겔에서 다형성 구분이 가능한 50bp 이상의 특정 맥주보리 품종에서만 특이적인 크기를 가지는 large-InDel을 선발하였다. 선발된 품종 특이적 large-InDel의 ±500bp의 인접 서열을 표준유전체 염기서열에서 추출하여 forward 및 reverse 프라이머를 설계하였다. 프라이머 설계는 Primer3를 이용하였으며, 길이는 17~25mer, GC 비율은 50%, Tm은 50~60℃, PCR 산물의 크기는 300~500 bp 조건으로 하였다. 설계된 프라이머의 특이성은 표준유전체 염기서열을 대상으로 BLASTN 분석을 통해 확인하였다.Using the analyzed InDel, a large-InDel having a specific size was selected only for a specific beer barley variety of 50 bp or more capable of polymorphism discrimination in a 2.0% agarose gel. Forward and reverse primers were designed by extracting ±500bp contiguous sequences of the selected variety-specific large-InDel from the standard genome sequence. Primer design used Primer3, and the length was 17-25mer, the GC ratio was 50%, the Tm was 50-60℃, and the size of the PCR product was 300-500 bp. The specificity of the designed primers was confirmed through BLASTN analysis of the standard genome sequence.
염기서열 분석을 통해 각 맥주보리 품종에 특이적인 InDel을 총 50,732개 선발하였다. 광맥이 가장 많은 17,895개의 품종 특이적인 InDel을 보유하였고, 진양보리는 1,357개로 가장 적었다(하기 표 4 및 표 5). 염색체 간 비교에서는 chr. unassigned를 포함하여 평균 556~11,489개의 품종 특이적 InDel이 염색체 별로 존재하였다. 94%에 해당하는 대부분의 품종 특이적 InDel은 염색체상의 유전자간(intergenic) 영역에 위치하였다. 아미노산을 암호화하는 코딩 영역(Coding region, CDS)에는 5개의 InDel이 위치하여, CDS 영역에는 InDel이 거의 존재하지 않는 것으로 나타났다. 이중 3개가 아미노산 서열의 변이를 가져오는 non-synonymous인 것으로 확인되었다(표 5).Through sequencing, a total of 50,732 InDels specific to each beer barley variety were selected. Mineral veins had the most variety-specific InDels of 17,895, and Jinyang barley had the fewest with 1,357 (Tables 4 and 5 below). In comparison between chromosomes, chr. Including unassigned, an average of 556~11,489 cultivar-specific InDels were present per chromosome. Most cultivar-specific InDels (94%) were located in intergenic regions on the chromosome. Five InDels were located in the coding region (CDS) encoding amino acids, and it was shown that almost no InDels were present in the CDS region. Three of them were confirmed to be non-synonymous, which resulted in a mutation in the amino acid sequence (Table 5).
실시예 5. Large-InDel 마커 검정Example 5. Large-InDel Marker Assay
맥주보리 6개 품종 특이적 large-InDel을 이용하여 분자마커를 제작하였다. 분자마커 제작에는 아가로스 겔에서 판별이 용이할 수 있도록 50bp 이상의 large- InDel을 총 228개 사용하였다. Large-InDel이 염색체 상에 위치하는 양편의 염기서열 정보를 Morex 표준유전체에서 얻어 forward와 reverse 프라이머를 제작하였다. 프라이머는 17~25mer, GC 비율은 50% 내외, PCR산물 크기를 300~500bp가 되도록 하였다. 228개 large-InDel 중 145개 large-InDel이 마커로 제작되었으며, 맥주보리 31개 품종에서 다형성을 검정하였다. Molecular markers were constructed using large-InDel specific to six varieties of beer barley. A total of 228 large-InDels of 50 bp or more were used to make molecular markers easy to discriminate on an agarose gel. Forward and reverse primers were prepared by obtaining the nucleotide sequence information of both sides of Large-InDel on the chromosome from the Morex standard genome. The primers were 17 to 25 mer, the GC ratio was about 50%, and the size of the PCR product was 300 to 500 bp. Among 228 large-InDels, 145 large-InDels were constructed as markers, and polymorphisms were tested in 31 varieties of beer barley.
구체적인 실험은 다음과 같다. 품종 특이적인 145개 large-InDel 마커에 대한 맥주보리 31개 품종(표 1)에 대한 large-InDel 마커 검정을 위한 PCR 조성은 게놈 DNA를 5㎕(20 ng/㎕), Taq-polymerase는 0.1㎕(5 unit/㎕, Inclone), 프라이머는 forward와 reverse를 각 1㎕(10 pmol/㎕), dNTP는 0.5㎕(10 mM dNTP mix), 10Х buffer는 2.4㎕, 전체 용량은 24㎕로 하였다. PCR 조건은 94℃ 5분 그리고 94℃ 30초, 58℃ 30초, 72℃ 1분으로 35 사이클 수행하였고, 마지막 증폭을 72℃에서 5분간 수행하였다. PCR 산물은 2% 아가로스 겔에서 전기영동하여 UV 조건에서 확인하였다. The specific experiment is as follows. The PCR composition for the large-InDel marker assay for 31 varieties of beer barley (Table 1) for 145 cultivar-specific large-InDel markers was 5 μl (20 ng/μl) of genomic DNA and 0.1 μl of Taq-polymerase. (5 units/μl, Inclone), primers were 1μl each for forward and reverse (10 pmol/μl), dNTP was 0.5μl (10 mM dNTP mix), 10Х buffer was 2.4μl, and the total volume was 24μl. The PCR conditions were 94°C for 5 minutes, 94°C for 30 seconds, 58°C for 30 seconds, and 72°C for 1 minute for 35 cycles, and the final amplification was performed at 72°C for 5 minutes. PCR products were identified under UV conditions by electrophoresis on a 2% agarose gel.
그 결과, 단일 밴드이며 대립유전자형이 2개인 large-InDel 마커 17개를 선발하였다(표 6). 선발된 large-InDel 마커의 PIC value는 0.060~0.373으로 0.5 이상의 높은 PIC value를 가지는 마커는 선발되지 않았다.As a result, 17 large-InDel markers with a single band and two alleles were selected (Table 6). The PIC values of the selected large-InDel markers ranged from 0.060 to 0.373, and markers with PIC values higher than 0.5 were not selected.
Chr. 위치Reference genome
Chr. location
size
(bp)product
size
(bp)
상기 표 6에 나타낸 17쌍의 InDel 마커를 검출할 수 있는 프라이머 쌍을 이용하여 국내외 맥주보리 31개 품종에 대해 PCR 수행 후 도출한 다형성 분석 결과는 도 2~도 7과 같다. 선발된 50BH1H-2(도 3), 50HP5H-1(도 4) 및 50JY7H-2(도 5) InDel 마커는 증폭 산물의 크기가 300~400bp이며, 2% 아가로스 겔에서 짧은 시간에 유전형 차이를 쉽게 확인할 수 있었다. 한편 전기영동을 통해 선발된 다형성 마커의 비율은 11%로 나타났다. PCR 산물을 전기영동한 결과 증폭이 되지 않는 마커나 일부 증폭이 되지 않는 맥주보리 품종은 프라이머가 혼성화되는 부위의 염기서열이 Morex의 표준유전체 염기서열과 다른 변이가 존재하였기 때문인 것으로 판단되었다. 그리고 InDel의 크기가 다르거나 InDel이 존재하지 않는 원인은 낮은 depth 및 높은 비율의 반복서열 등으로 인한 염기서열 분석의 error 때문인 것으로 추측되었다. SNP를 이용한 유전형 분석은 다소 복잡한 플랫폼과 고가의 장비가 필요하므로, 아가로스 겔에서 유전형을 쉽게 확인할 수 있는 PCR 기반의 InDel 마커는 육종 및 연구분야에 매우 유용하다.The polymorphism analysis results derived after PCR was performed on 31 varieties of domestic and foreign beer barley using primer pairs capable of detecting 17 pairs of InDel markers shown in Table 6 are shown in FIGS. 2 to 7. The selected 50BH1H-2 (FIG. 3), 50HP5H-1 (FIG. 4), and 50JY7H-2 (FIG. 5) InDel markers have amplification products of 300-400 bp in size, and genotypic differences can be observed in a short time on a 2% agarose gel. could be easily verified. Meanwhile, the percentage of polymorphic markers selected through electrophoresis was 11%. As a result of electrophoresis of the PCR products, it was determined that the markers that were not amplified or the beer barley varieties that were not partially amplified were due to the presence of mutations in the base sequence of the site where the primer was hybridized and different from the Morex's standard genome sequence. In addition, it was speculated that the cause of the different sizes of InDel or the absence of InDel was due to errors in sequencing due to low depth and high rate of repetitive sequences. Genotyping using SNPs requires a rather complex platform and expensive equipment, so PCR-based InDel markers, which can easily confirm genotypes on agarose gels, are very useful in breeding and research.
본 실시예에서 선발된 50bp 이상의 large-InDel을 이용한 17개 InDel 마커는 2% 아가로스 겔에서 다형성이 쉽게 구분되었으며, 국내에서 육성된 대부분의 맥주보리 품종을 구분하였다. 뿐만 아니라, 국외 품종인 Commander 등 4개 품종도 구분이 되어 맥주보리의 국내 품종간 및 국내 품종과 국외 품종간의 구별이 가능한 바, 혼종 방지 등의 품질관리로 국내 육성 품종에 대해 차별화할 수 있고, 수입 맥류 부정 유통 방지 및 국내 육성 맥류의 품질 경쟁력을 확보할 수 있으며, 나아가 국내 육성 보리 품종의 유전자원 보호에 활용할 수 있음을 알 수 있다.The polymorphisms of 17 InDel markers using large-InDel of 50 bp or more selected in this example were easily distinguished in 2% agarose gel, and most beer barley cultivars cultivated in Korea were distinguished. In addition, four varieties, including Commander, which are foreign varieties, are also distinguished, and it is possible to distinguish between domestic varieties of beer barley and between domestic and foreign varieties. It can be seen that it is possible to prevent illegal distribution of imported barley, to secure the quality competitiveness of domestically grown barley, and to further protect the genetic resources of domestically grown barley varieties.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.From the above description, those skilled in the art to which the present invention pertains will be able to understand that the present invention may be embodied in other specific forms without changing its technical spirit or essential features. In this regard, it should be understood that the embodiments described above are illustrative in all respects and not limiting. The scope of the present invention should be construed as including all changes or modifications derived from the meaning and scope of the claims to be described later and equivalent concepts rather than the detailed description above are included in the scope of the present invention.
<110> REPUBLIC OF KOREA(MANAGEMENT : RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION) <120> InDel markers for discriminating malting barley varieties and uses thereof <130> KPA210804-KR <160> 34 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HP1H-5_F <400> 1 tttgcaagac gttacattca tcg 23 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HP1H-5_R <400> 2 ctgtcccata tactcatgag caa 23 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GM1H-10_F <400> 3 caaggatcta agcaaacatg caa 23 <210> 4 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GM1H-10_R <400> 4 gattaatcca acggtcattg tgg 23 <210> 5 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GM1H-17_F <400> 5 ctagggatat tctgatcggt tgg 23 <210> 6 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GM1H-17_R <400> 6 ttagcatgcc tcaatcatac cat 23 <210> 7 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HH1H-9_F <400> 7 ttcatggctg ctatccttac aat 23 <210> 8 <211> 23 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23 <210> 34 <211> 23 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> 50JY7H-2_R <400> 34 gcttggcaga cttaatttac cag 23
Claims (9)
oligonucleotides of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 34; Or an oligonucleotide complementary to the oligonucleotide; a primer set for determining barley variety, including.
The primer set according to claim 1, wherein the primer set includes oligonucleotides of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 34.
i) 서열번호 2n-1의 정방향 프라이머; 및
ii) 서열번호 2n의 역방향 프라이머;로 구성되는 프라이머 세트를 포함하고,
상기 n은 1 내지 17의 자연수로, i) 및 ii)의 n은 동일한 값을 갖는 17쌍의 프라이머 세트로 구성되는 것인, 프라이머 세트.
The method of claim 1, wherein the primer set
i) forward primer of SEQ ID NO: 2n-1; and
ii) a reverse primer of SEQ ID NO: 2n;
wherein n is a natural number from 1 to 17, and n of i) and ii) consists of 17 pairs of primer sets having the same value.
According to claim 1, wherein the primer set is a primer set consisting of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2; A primer set consisting of SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4; A primer set consisting of SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6; A primer set consisting of SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8; A primer set consisting of SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 10; A primer set consisting of SEQ ID NO: 11 and SEQ ID NO: 12; A primer set consisting of SEQ ID NO: 13 and SEQ ID NO: 14; A primer set consisting of SEQ ID NO: 15 and SEQ ID NO: 16; A primer set consisting of SEQ ID NO: 17 and SEQ ID NO: 18; A primer set consisting of SEQ ID NO: 19 and SEQ ID NO: 20; A primer set consisting of SEQ ID NO: 21 and SEQ ID NO: 22; A primer set consisting of SEQ ID NO: 23 and SEQ ID NO: 24; A primer set consisting of SEQ ID NO: 25 and SEQ ID NO: 26; A primer set consisting of SEQ ID NO: 27 and SEQ ID NO: 28; A primer set consisting of SEQ ID NO: 29 and SEQ ID NO: 30; A primer set consisting of SEQ ID NO: 31 and SEQ ID NO: 32; And a primer set consisting of SEQ ID NO: 33 and SEQ ID NO: 34; that consists of, a primer set.
According to claim 1, the primer set is Sacheon No. 6, Doosan No. 8, Samdo barley, Jinyang barley, Namhyang barley, Danwon barley, Iljin barley, Shinho barley, Daeyeong barley, Daeabori, Hopum, Hojin, Minced barley, Oreum, Any one or more varieties selected from the group consisting of Daho, Whiteho, Minmaek, Emac, Diane, Blackho, Dapum, Nurimac, Baekrok, Scarlett, Commander, Baudin, and Stirling. To determine the primer set.
The method of claim 1, wherein the primer set is capable of detecting or amplifying InDel sequences present in any one or more selected from the group consisting of chr1H, chr2H, chr3H, chr4H, chr5H, chr6H and chr7H of barley genomic DNA. , a set of primers.
Any one or more continuous polynucleotides selected from the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 34; Any one or more polynucleotides selected from the group consisting of these complementary polynucleotides; A composition for identifying barley varieties, comprising a primer set for determining barley varieties, comprising at least one selected from the group consisting of; and combinations thereof.
(b) 상기 (a) 단계에서 수득한, 증폭된 PCR 산물을 분석하는 단계를 포함하는, 보리 품종 판별 방법.
(a) performing PCR using the DNA isolated from the sample as a template and using the primer set of any one of claims 1 to 6; and
(b) a method for identifying barley varieties, comprising the step of analyzing the amplified PCR product obtained in step (a).
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- 2021-07-29 KR KR1020210100043A patent/KR102606385B1/en active IP Right Grant
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| GRNT | Written decision to grant |