KR20230011606A - 고효율 분비능을 가지는 합성 분비 신호 펩타이드 및 이를 포함하는 분비 발현 시스템 - Google Patents

고효율 분비능을 가지는 합성 분비 신호 펩타이드 및 이를 포함하는 분비 발현 시스템 Download PDF

Info

Publication number
KR20230011606A
KR20230011606A KR1020210092055A KR20210092055A KR20230011606A KR 20230011606 A KR20230011606 A KR 20230011606A KR 1020210092055 A KR1020210092055 A KR 1020210092055A KR 20210092055 A KR20210092055 A KR 20210092055A KR 20230011606 A KR20230011606 A KR 20230011606A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
signal peptide
synthetic
secretion
seq
secretion signal
Prior art date
Application number
KR1020210092055A
Other languages
English (en)
Inventor
정기준
전은정
Original Assignee
한국과학기술원
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 한국과학기술원 filed Critical 한국과학기술원
Priority to KR1020210092055A priority Critical patent/KR20230011606A/ko
Publication of KR20230011606A publication Critical patent/KR20230011606A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/34—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Corynebacterium (G)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C12N15/1093—General methods of preparing gene libraries, not provided for in other subgroups
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C12N15/77—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Corynebacterium; for Brevibacterium
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01008—Endo-1,4-beta-xylanase (3.2.1.8)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명은 고효율 분비능을 가지는 합성 분비 신호 펩타이드 및 이를 이용한 목적 단백질의 분비 생산을 통한 목적단백질의 제조방법에 관한 것으로, 본 발명의 합성 분비 신호 펩타이드는 재조합 단백질의 분비 발현에 필수적인 요소로 분비 생산 시스템 구축 시 사용가능하며, 구축한 합성 분비 신호 펩타이드 라이브러리를 통해 보다 다양한 분비 신호 펩타이드를 적용하여 최적의 분비 생산 시스템 구축 할 수 있기 때문에 산업적으로 경제적인 분비 생산 시스템 구축에 있어 기반 기술로 사용될 수 있다.

Description

고효율 분비능을 가지는 합성 분비 신호 펩타이드 및 이를 포함하는 분비 발현 시스템{Synthetic Signal Peptide having High Secretory Efficeincy and Secretion System using the Same}
본 발명은 고효율 분비능을 가지는 합성 분비 신호 펩타이드에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 고효율 분비능을 가지는 합성 분비 신호 펩타이드 및 이를 이용한 목적 단백질의 분비 생산을 통한 목적단백질의 제조방법에 관한 것이다.
재조합 단백질은 현재 산업용 효소에서부터 의약용 단백질에 이르기까지 산업적으로 그 쓰임과 가치가 높아지고 있다. 이러한 재조합 단백질을 경제적으로 생산하기 위해서는 산업적 생산 공정의 단순화와 높은 수율로 생산이 가능한지가 중요하다. 미생물을 이용한 재조합 단백질 생산 시 생산 공정의 단순화는 미생물의 분비 생산 시스템을 이용하여 단순화 할 수 있다.
코리네박테리움 균주는 글루탐산, 아미노산, 라이신 등의 다양한 아미노산 생산 균주로써 이미 산업현장에 많이 사용되고 있는 산업용 균주이다. 코리네박테리움은 특히 분비 생산 시스템을 가지고 있기 때문에 이를 이용한 재조합 단백질의 분비 생산이 가능하다(Freudl, R., Journal of biotechnology,　258:101-109, 2017). 이러한 분비 생산 시스템을 이용하여 재조합 단백질을 생산하는 것은 대장균 시스템을 이용한 재조합 단백질 생산과 비교하여 보았을 때, 더 경제적인 생산이 가능하다. 대장균 시스템을 이용한 재조합 단백질 생산의 경우, 다양한 tool의 발전으로 재조합 단백질 생산이 많이 이루어져 왔지만, 세포 내에 재조합 단백질 생산을 하는 경우가 대다수이므로, 생산된 재조합 단백질의 회수를 위해서 세포 파쇄 및 분리 정제과정을 거쳐야 한다. 그러나 분비 생산 시스템을 이용한 재조합 단백질의 경우 세포 파쇄 및 분리 공정을 감축할 수 있기 때문에 분비 생산 시스템의 요구가 증가하고 있는 실정이다.
미생물을 이용한 분비 생산 시스템은 분비 신호 펩타이드를 이용하여 목적하는 재조합 단백질을 세포 외로 분비할 수 있도록 한다. 그러나 분비 신호 펩타이드의 경우 목적하는 재조합 단백질의 종류에 따라 분비능이 다르다는 한계점을 가지고 있기 때문에 적합한 분비 생산 시스템을 구축하기 위해서는 목적 단백질을 분비 할 수 있는 분비 신호 펩타이드를 선별하여 사용하는 것이 중요하다. 그렇기 때문에 알려진 다양한 분비 신호 펩타이드를 이용하여 목적 단백질에 맞는 최적의 조합을 찾고자 하는 시도들이 있지만 최대 적용 가능한 분비 신호 펩타이드는 Bacillus의 경우 400여개가 최대 적용된 바 있으며, 재조합 단백질의 최적 분비 발현 시스템을 구축하기 위해서 적용할 수 있는 경우의 수도 한정되어 있다(Degering, C. et al., Applied and environmental microbiology,　76:6370-6376, 2010). 이 외 분비 생산능을 증가시키기 위해 발현 균주의 개량을 통한 증가방법들이 발명된 바 있고(대한민국 특허공개 10-2020-0002575, 대한민국 특허출원 10-2020-0133434), 기존에 알려진 분비 신호 펩타이드를 이용하여 분비 생산한 방법들이 기술된 바 있다 (대한민국 특허 공개 10-2017-0140868). 그러나 분비 신호 펩타이드를 개발하는 방법에 대한 연구는 부족한 실정이다.
이에, 본 발명자들은 강한 분비능을 가지는 새로운 합성 분비신호 폡타이드를 개발하고자 예의 노력한 결과, 분비 생산능에 직접적으로 영향을 주는 분비 신호 펩타이드의 라이브러리를 구축하고, 이를 이용하여 엔도자일라나아제를 목적단백질로 하여 강한 분비능을 보이는 신규한 합성 분비 신호 펩타이드를 스크리닝하고, 상기 스크리닝된 분비 신호 펩타이드가 기존의 알려진 분비 신호 펩타이드에 비하여 높은 분비능을 나타내는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
1. 대한민국 특허공개 10-2020-0002575 2. 대한민국 특허출원 10-2020-0133434 3. 대한민국 특허 공개 10-2017-0140868
1. Freudl, R., Journal of biotechnology,　258:101-109, 2017 2. Degering, C. et al., Applied and environmental microbiology,　76:6370-6376, 2010
본 발명의 목적은 목적 단백질에 대한 높은 분비능을 가지는 합성 분비 신호 펩타이드를 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 합성 분비 신호 펩타이드를 코딩하는 핵산 및 상기 핵산을 포함하는 재조합 벡터를 제공하는데 있다.
본 발명이 또 다른 목적은 상기 재조합 벡터 또는 상기 합성 분비 신호 펩타이드를 코딩하는 핵산이 도입되어 있어, 상기 합성 분비 신호 펩타이드가 목적단백질과 융합 발현되는 재조합 미생물을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 미생물을 이용한 목적단백질의 제조방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 합성 분비 신호 펩타이드를 코딩하는 핵산 라이브러리 및 이의 제조방법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 M XXXXXXXX ALALA XXXXXXXXXXXX A 의 아미노산 서열을 가지고, 서열번호 1 ~ 5 중 어느 하나의 아미노산 서열로 표시되는 합성 분비 신호 펩타이드를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 합성 분비 신호 펩타이드를 코딩하는 핵산을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 합성 분비 신호 펩타이드를 코딩하는 핵산과 목적 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 재조합 벡터 또는 상기 합성 분비 신호 펩타이드를 코딩하는 핵산이 도입되어 있어, 상기 합성 분비 신호 펩타이드가 목적단백질과 융합 발현되는 재조합 미생물을 제공한다.
본 발명은 또한, 다음 단계를 포함하는 목적 단백질의 제조방법을 제공한다:
(a) 상기 재조합 미생물을 배양하여 목적단백질을 재조합 미생물의 세포 외로 분비 생산하는 단계; 및
(b) 상기 생산된 목적 단백질을 수득하는 단계.
본 발명은 또한, 서열번호 12의 염기서열로 표시되는 합성 분비 신호 펩타이드 라이브러리를 제공한다.
본 발명은 또한, 다음 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 상기 합성 분비 신호 펩타이드를 코딩하는 핵산 라이브러리의 제조방법을 제공한다:
(a) 서열번호 13 ~ 15의 정방향 프라이머와 서열번호 16 ~ 18의 역방향 프라이머를 이용하여, 주형 없이 오버래핑 PCR을 진행하여 합성 분비 신호 펩타이드 PCR 산물을 수득하는 단계;
(b) (a) 단계에서 수득된 오버래핑 PCR 산물을 서열번호 19 및 서열번호 20의 프라이머를 이용하여 PCR하여, 합성 분비 신호 펩타이드를 코딩하는 핵산 산물을 수득하는 단계; 및
(c) 상기 (b) 단계의 산물을 벡터와 라이게이션하여, 합성 분비 신호 펩타이드를 코딩하는 핵산 라이브러리를 제작하는 단계.
본 발명의 합성 분비 신호 펩타이드는 재조합 단백질의 분비 발현에 필수적인 요소로 분비 생산 시스템 구축 시 사용가능하며, 구축한 합성 분비 신호 펩타이드 라이브러리를 통해 보다 다양한 분비 신호 펩타이드를 적용하여 최적의 분비 생산 시스템 구축 할 수 있기 때문에 산업적으로 경제적인 분비 생산 시스템 구축에 있어 기반 기술로 사용될 수 있다.
도 1은 합성 분비 신호 펩타이드를 구축하기 위한 코리네박테리움 속이 가지고 있는 분비 신호 펩타이드 서열 분석 결과와 이를 바탕으로 한 합성 분비 신호 펩타이드의 서열을 나타낸 것이다.
도 2는 합성 분비 신호 펩타이드 라이브러리의 모식도이다.
도 3은 합성 분비 신호 펩타이드 라이브러리를 이용하여 엔도자일라나아제의 분비 생산 라이브러리를 구축하는 방법에 대한 모식도이다.
도 4는 자일란(xylan)이 포함된 배지에서 할로 크기(halo size)를 기반하여 분비능을 가지고 있는 균주를 스크리닝한 결과를 나타낸 것이다.
도 5의 A는 도 4에서 선별한 5개의 균주의 분비능을 확인한 SDS-PAGE 결과를 나타낸 것이고, B는 합성 신호 펩타이드 아미노산 서열 분석 결과를 나타낸 것이다. A는 배양 후 상층액만을 회수하여 30배 농축한 후 분석한 SDS-PAGE결과이다. Lane M은 단백질 마커이고, Lane N은 Empty plasmid (pHCP (대한민 공개공보 10-2018-0092110)), 그리고 나머지 Lane들은 도 4에서 선별한 엔도자일라나아제 분비 생산능을 가진 선별된 X17, X22, C1, G1, G8 균주이다. 각 분비능을 가진 균주는 X17, X22, C1, G1, G8 합성 분비 신호 펩타이드에 엔도자일라나아제 유전자가 연결되어 같이 발현되는 시스템이다. B는 분비 생산능을 가진 5개의 균주가 포함하고 있는 X17, X22, C1, G1, G8 합성 분비 신호 펩타이드들의 아미노산 서열이며 상층액으로 분비된 단백질의 N-terminal의 5개 아미노산 분석을 통해 합성 분비 신호 펩타이드가 잘리는 부분을 확인하였고 이를 /로 표기하였다. 이 분비 발현 시스템은 C. glutamicum ATCC13032에서 확인하였다.
도 6은 본 발명에서 발굴한 합성 분비 신호 펩타이드 (C1, G1, G8)와 알려진 분비 신호 펩타이드(Cg1514, Cg2052, PorB)의 분비능을 비교한 SDS-PAGE 결과이다. A의 결과는, 분비하는 목적 단백질로 엔도자일라나아제를 이용하였고, 분비 신호 펩타이드 부분만 다르며, 같은 배양 조건에서 배양 후 상층액만을 회수하여 30배 농축한 후 분석한 SDS-PAGE결과로, Lane M은 단백질 마커이고, Lane N은 Empty plasmid (pHCP)이고 나머지 각 lane은 사용한 분비 신호 펩타이드인 C1, G1, G8, Cg1514, Cg2052, PorB의 결과이다. B는 C1 합성 분비 신호 펩타이드를 이용한 엔도자일라나아제의 분비 생산 벡터의 모식도이다. 이 분비 발현 시스템은 C. glutamicum ATCC13032에서 확인하였다.
도 7은 높은 분비능을 가지는 C1 합성 분비 신호 펩타이드를 이용한 아밀라아제의 분비 생산 벡터의 모식도와 SDS-PAGE결과이다. A는 분비 생산 벡터 모식도이고, B는 C1 합성 분비 신호 펩타이드를 이용한 상층액의 SDS-PAGE 결과이다. Lane M은 단백질 마커이고, Lane N은 Empty plasmid (pHCP)이고, Lane C1은 C1 합성 분비 신호 펩타이드와 아밀라아제가 같이 발현되는 분비 시스템을 배양한 후의 상층액이다. C는 C1 합성 분비 신호 펩타이드와 Cg1514 분비 신호 펩타이드를 이용한 분비능 비교를 위한 상층액의 SDS-PAGE 결과이다. Lane M은 단백질 마커이고, Lane N은 Empty plasmid (pHCP)이고, Lane C1은 C1 합성 분비 신호 펩타이드와 아밀라아제가 같이 발현되는 분비 시스템을 배양한 후의 상층액이다. Lane Cg1514는 Cg1514 분비 신호 펩타이드와 아밀라아제가 같이 발현되는 분비 시스템을 배양한 후의 상층액이다. 위 모든 분비 발현 시스템은 C. glutamicum ATCC13032에서 확인하였다.
도 8은 C1 합성 분비 신호 펩타이드를 이용한 엔도자일라나아제 분비 생산을 C. glutamicum SP002 균주를 이용하여 유가식 배양한 결과이다. A는 시간별 유가식배양 결과로서, ● 는 성장곡선을 나타내며, □는 건조 세포 중량(DCW), ◇는 글루코스 양, ▲는 분비생산된 엔도자일라나아제의 양을 나타낸다. B는 시간별 분비생산된 엔도자일라나아제의 SDS-PAGE 결과이다. ◀는 분비된 엔도자일라나아제를 나타내고 83.1%의 수율로 생산됨을 Gelanalyzer 2010을 이용하여 분석하였다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명에서는 강한 분비능을 가지는 새로운 합성 분비신호 폡타이드를 개발하기 위하여, 코리네박테리아에서 알려진 분비 신호 펩타이드 서열을 비교분석하여, 보존되는 서열을 포함하는 분비 신호 펩타이드의 라이브러리를 구축하였다. 구축된 라이브러리에서 강한 분비능을 가지는 분비신호 펩타이드를 스크리닝하기 위하여, 엔도자일라나아제를 목적단백질로 하여 강한 분비능을 보이는 신규한 합성 분비 신호 펩타이드를 스크리닝하고, 상기 스크리닝된 분비 신호 펩타이드가 대장균과 코리네박테리움에서 기존의 알려진 분비 신호 펩타이드에 비하여 높은 분비능을 나타내는 것을 확인하였다.
따라서, 본 발명은 일 관점에서, M XXXXXXXX ALALA XXXXXXXXXXXX A (서열번호 11)의 아미노산 서열을 가지고, 서열번호 1 ~ 5 중 어느 하나의 아미노산 서열로 표시되는 합성 분비 신호 펩타이드에 관한 것이다. 또한 서열번호 11의 27개의 아미노산 서열 중, 9번째 X서열은 I, F, L 또는 V인 것이 바람직하며, 22번째 X서열은 A, P 또는 T인 것이 바람직하며, 25번째 X서열은 A, L, P, S, F 또는 V인 것이 바람직하다.
서열번호 1:
합성 분비 신호 펩타이드 C1 (27 amino acids)
MNKSKDSSIALALAFVLLIVLTPAPRA
서열번호 2:
합성 분비 신호 펩타이드 G1 (27 amino acids)
MFDAVRRGVALALALVVILFLTPHAMA
서열번호 3:
합성 분비 신호 펩타이드 G8 (27 amino acids)
MRGGRFNGIALALAILFIVLVPTMSEA
서열번호 4:
합성 분비 신호 펩타이드 X22 (27 amino acids)
MGARATASIALALAFLVIIVITPLPRA
서열번호 5:
합성 분비 신호 펩타이드 X17 (27 amino acids)
MSLTSSSCVALALALCFASISTPRVYA
다른 관점에서, 본 발명은 상기 합성 분비 신호 펩타이드를 코딩하는 핵산에 관한 것이다.
본 발명에서 상기 합성 분비 신호 펩타이드를 코딩하는 핵산은 서열번호 6 ~10의 염기서열로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있다.
서열번호 6:
합성 분비 신호 펩타이드 C1 의 nucleotide 서열 (81 bp)
ATGAATAAGAGTAAGGACTCTTCCATTGCACTCGCACTCGCATTTGTTCTTCTTATTGTTCTTACCCCAGCACCAAGAGCA
서열번호 7:
합성 분비 신호 펩타이드 G1의 nucleotide 서열 (81 bp)
ATGTTCGACGCCGTCCGTCGTGGTGTTGCACTCGCACTCGCACTTGTTGTTATTCTTTTTCTTACCCCGCATGCAATGGCA
서열번호 8:
합성 분비 신호 펩타이드 G8의 nucleotide 서열 (81 bp)
ATGAGGGGTGGGAGGTTCAATGGTATTGCACTCGCACTCGCAATTCTTTTTATTGTTCTTGTTCCCACAATGTCTGAAGCA
서열번호 9:
합성 분비 신호 펩타이드 X22의 nucleotide 서열 (81 bp)
ATGGGTGCTCGTGCTACTGCTTCTATTGCACTCGCACTCGCATTTCTTGTTATTATTGTTATTACACCCCTCCCAAGGGCA
서열번호 10:
합성 분비 신호 펩타이드 X17의 nucleotide 서열 (81 bp)
ATGAGCCTCACCTCCTCTTCTTGTGTTGCACTCGCACTCGCACTCTGCTTCGCCAGCATCAGCACCCCCCGGGTCTACGCA
또 다른 관점에서, 본 발명은 상기 합성 분비 신호 펩타이드를 코딩하는 핵산과 목적 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터에 관한 것이다.
본 발명의 재조합 벡터는 상기 합성 분비 신호 펩타이드를 코딩하는 핵산과 목적유전자가 연결되어 합성 분비 신호 펩타이드가 목적 단백질과 융합단백질 형태로 발현되는 구조를 가지는 것이 바람직하다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 상기 재조합 벡터 또는 상기 합성 분비 신호 펩타이드를 코딩하는 핵산이 도입되어 있어, 상기 합성 분비 신호 펩타이드가 목적단백질과 융합 발현되는 재조합 미생물에 관한 것이다.
본 발명에서 상기 미생물은 E. coli, Corynebacterium sp., Bacillus sp., Lactobacillus sp., Pseudomonas sp., Mycobacterium sp. 또는 Yarrowia sp. 일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 양태에서는 대장균에 합성분비신호 펩타이드와 엔도자일라나아제를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 형질전환한 재조합 미생물이 엔도자일라나아제를 효과적으로 분비 생산하는 것을 확인하였다.
본 발명의 다른 양태에서는 코리네박테리움 글루타미콤 균주에 합성분비신호 펩타이드와 엔도자일라나아제를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 형질전환한 재조합 미생물이 엔도자일라나아제를 효과적으로 분비 생산하는 것을 확인하였다. 분비 생산된 단백질은 배양액의 상층액 만을 회수하여 SDS-PAGE를 통해 분석하였고, 목적단백질인 엔도자일라나아제(48 kDa)가 분비되는 것을 확인하였고, SDS-PAGE image 분석 프로그램인 Gelanalyzer 2010을 이용하여 분비된 엔도자일라나아제는 전체 분비된 단백질 중에서 약 83%에 해당되는 것을 확인하였다 (도 8B). 이를 이용하여 분비된 엔도자일라나아제의 양은 최대 3.2 g/L가 분비 생산되는 것을 확인하였다. 이는 코리네박테리움 글루타미쿰에서 확인된 최고 분비 생산량이다.
따라서, 본 발명은 또 다른 관점에서, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 목적 단백질의 제조 방법에 관한 것이다:
(a) 상기 재조합 미생물을 배양하여 목적단백질을 재조합 미생물의 세포 외로 분비 생산하는 단계; 및
(b) 상기 생산된 목적 단백질을 수득하는 단계.
또 다른 관점에서 본 발명은 서열번호 12의 염기서열로 표시되는 합성 분비 신호 펩타이드를 코딩하는 핵산 라이브러리에 관한 것이다.
서열번호 12(합성 분비 신호 펩타이드 라이브러리의 nucleotide 서열 (81 bp))
ATGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNTTGCACTCGCACTCGCANNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNVCMNNNNNNBYNNNNGCA
본 발명은 또한, 서열번호 12의 염기서열로 표시되는 합성 분비 신호 펩타이드 라이브러리를 제공한다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 상기 합성 분비 신호 펩타이드를 코딩하는 핵산 라이브러리의 제조방법에 관한 것이다:
(a) 서열번호 13 ~15의 정방향 프라이머와 서열번호 16 ~ 18의 역방향 프라이머를 이용하여, 주형 없이 오버래핑 PCR을 진행하여 합성 분비 신호 펩타이드 PCR 산물을 수득하는 단계;
(b) (a) 단계에서 수득된 오버래핑 PCR 산물을 서열번호 19 및 서열번호 20의 프라이머를 이용하여 PCR하여, 합성 분비 신호 펩타이드를 코딩하는 핵산 산물을 수득하는 단계; 및
(c) 상기 (b) 단계의 산물을 벡터와 라이게이션하여, 합성 분비 신호 펩타이드를 코딩하는 핵산 라이브러리를 제작하는 단계.
본 발명에서 사용되는 “분비 신호 펩타이드”는 특정 목적 단백질을 세포 내에서 세포 외로 분비할 수 있도록 도움을 주는 signal peptide 이며, 분비 생산 시스템 구축에 필수적인 펩타이드이다. 이 서열은 일반적인 분비 신호 과정인 Sec-dependent pathway에 기반하여 구축하였다. 그러나 본 발명에서 방법은 Sec-dependent pathway 뿐만 아니라 Tat-dependent pathway 시스템에도 동일한 방법을 이용하여 구축할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계의 통상적인 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
이하, 실시예에서 사용한 프라이머 서열을 표 1에 나타내었다.
실시예에서 사용한 프라이머 서열
서열번호 프라이머 명칭 5 ’- 3 ’
13 SPL_1_F TAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGRVKRVKRVKRVKNNYNNYNNYNTTGCACTCGCACTCGCA
14 SPL_2_F TAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGNNCNNCNNCNNCNNYNNYNNYNTTGCACTCGCACTCGCA
15 SPL_3_F TAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGNNTNNTNNTNNTNNYNNYNNYNTTGCACTCGCACTCGCA
16 SPL_SapI_1_R GCAGCGGCCGCAAAAGCTCTTCATGCNNNNRVNNNNNNKGBGNNGNNGNNGNNGNNGNNGNNTGCGAGTGCGAGTGCAA
17 SPL_SapI_2_R GCAGCGGCCGCAAAAGCTCTTCATGCNNNNRVNNNNNNKGBANNANNANNANNANNANNANNTGCGAGTGCGAGTGCAA
18 SPL_SapI_3_R GCAGCGGCCGCAAAAGCTCTTCATGCNNNNRVNNNNNNKGBAANAANAANAANAANAANAANTGCGAGTGCGAGTGCAA
19 XbaI_RBS_NdeI_F CCTCTAGAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATG
20 NotI_SfiI_SapI_R CAGGCAGCGGCCGCGGCCCCCGAGGCCGCAAAAGCTCTTCATGC
21 XbaI_SapI_XynA_F AATTCTCTAGAGCTCTTCTGCAGCCGA
22 EcoRI_NotI_SfiI_R CCAGTGAATTCCTTTCGTTTTATTTGATGCCT
23 NdeI_Cg2052_F TAACATATGTTACGAAAAACAGTTACCG
24 Cg2052_ XynA _R GCGCCGAGGGTGGACTCGGCTCTAGAAGCAGAAGAGACAGAATTCAT
25 NdeI_Cg1514_F TAACATATGTTAAACAGAGTCAGTCGTATTG
26 Cg1514_ XynA _R GCGCCGAGGGTGGACTCGGCTCTAGAGCTTTGTGCAGTGGAAGTAGG
27 NdeI_PorB_F TAACATATGAAGCTTTCACACCGCAT
28 PorB_ XynA _R GCGCCGAGGGTGGACTCGGCTCTAGATGCGGAAGCAGGTGCTGCG
29 XbaI_ XynA _F AATTTCTAGAGCCGAGTCCACCCTCGGCGC
30 pCES208_no Ter_R TCAGTACCGACGGTGATATGG
31 XbaI_SapI_Amy_F AATTCTCTAGAGCTCTTCTGCAGATGAACAAGTGTCAATGAAAGAT
32 EcoRI_NotI_SfiI_Amy _R AATTGAATTCTAAGGCAGCGGCCGCGGCCCCCGAGGCCTTATTTGTCATCGTCATCTTTATAAT
33 pCES208_confirm_F CTGATCCTCCGGCGTTCA
34 SapI_C1_R CCGCAAAAGCTCTTCATGCTCTTGGTGCTGGGGT
실시예 1: 합성 분비 신호 펩타이드 라이브러리의 제작
합성 분비 신호 펩타이드 라이브러리를 제작하기 위하여 코리네박테리아에서 알려진 분비 신호 펩타이드들의 서열을 SignalP5.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)으로 비교 분석하였고(도 1A), 이를 이용하여 27개의 아미노산 서열을 기본으로 합성 분비 신호 펩타이드를 구축하였다.
도 1A에서와 같이 알려진 분비 신호 펩타이드 서열의 비교 분석을 통해 합성 분비 신호 펩타이드 라이브러리는 시작 아미노산인 메티오닌과 hydrophobic 부분의 5개 아미노산 (ALALA) 부분과 마지막 알라닌 서열을 고정하여 도 1B와 같은 서열 구성이 오도록 디제너레이트 프라이머(degenerated primer)를 합성하여 주형없이 프라이머 만을 이용하여 오버랩핑 PCR을 진행하였다. 모든 프라이머는 GENOTECH(대전, 한국)에서 주문제작하여 사용하였다. 사용한 디제너레이트 프라이머는 정방향 프라이머인 SPL_1_F, SPL_2_F, SPL_3_F 3가지와 역방향 프라이머 SPL_SapI_1_R, SPL_SapI_2_R, SPL_SapI_3_R 3가지를 (서열번호 13, 14, 15, 16, 17, 18) 이용하여 PCR을 시행하였다. PCR은 98 ℃5분으로 1 cycle, 98 ℃20초, 53 ℃ 20초, 72 ℃45초로 30 cycle, 72 ℃5분으로 1 cycle을 시행하였다. 상기 PCR에서 얻어진 합성 분비 신호 펩타이드 PCR 산물을 정방향 프라이머 XbaI_RBS_NdeI_F (서열번호 19)과 역방향 프라이머 NotI_SfiI_SapI_R (서열번호 20)을 이용하여 PCR을 진행하였고, PCR은 98 ℃5분으로 1 cycle, 98℃ 20초, 53 ℃ 20초, 72℃ 45초로 30 cycle, 72℃ 5분으로 1 cycle을 시행하였다. 이를 XbaI, NotI 제한효소로 절단하고 동일한 제한효소로 절단한 pHCP (한국 공개 공보 10-2018-0092110) 벡터와 T4 DNA 라이게이즈를 이용하여 라이게이션 하여 합성 분비 신호 펩타이드 라이브러리 벡터를 구축하였다(도 2). 구축한 합성 분비 신호 펩타이드 라이브러리는 E. coli NEB 10-beta (New England Biolabs, Ipswich, MA, USA)에 형질전환하여 라이브러리를 최종 구축하였다.
실시예 2: 엔도자일라나아제와 합성 분비 신호 펩타이드의 라이브러리 구축
구축한 합성 분비 신호 펩타이드 라이브러리의 목적 단백질 분비 생산을 확인하기 위하여 목적 단백질로서 엔도자일라나아제 (XynA)를 선정하였고, 엔도자일라나아제와 합성 분비 신호 펩타이드의 라이브러리를 구축하였다. 먼저 목적 단백질이 포함된 벡터 구축을 위해 엔도자일라나아제는 pHCP-S-XynA (J.W. Choi, S.S. Yim, K.J. Jeong. (2018). "Development of a high-copy-number plasmid via adaptive laboratory evolution of Corynebacterium glutamicum", Appl Microbiol Biot, 102 873-883.)를 주형으로 하여 정방향 프라이머인 XbaI_SapI_XynA_F(서열번호 21)와 역방향 프라이머인 EcoRI_NotI_SfiI_R(서열번호 22)을 이용하여 엔도자일라나아제 유전자를 PCR로 증폭 후, XbaI, NotI 제한효소로 절단하고 동일한 제한효소로 절단한 pHCP 벡터와 T4 DNA 라이게이즈를 이용하여 라이게이션하여 pHCP-XynA 벡터를 구축하였다. 이에 실시예 1에서 구축한 합성 분비 신호 펩타이드 라이브러리를 정방향 프라이머 pCES208_confirm_F(서열번호 33)와 역방향 프라이머 pCES208_no Ter_R(서열번호 30)를 이용하여 PCR로 합성 분비 신호 펩타이드 라이브러리를 증폭 후, KpnI, SapI 제한효소 처리하였고, 이를 같은 제한효소 처리한 pHCP-XynA 벡터와 T4 DNA 라이게이즈를 이용하여 라이게이션 하여 엔도자일라나아제와 합성 분비 신호 펩타이드의 라이브러리 벡터 (pHCP-SP-XynA)를 구축하였다 (도 3). 상기 엔도자일라나아제와 합성 분비 신호 펩타이드의 라이브러리는 E. coli NEB 10-beta (New England Biolabs, Ipswich, MA, USA)에 형질전환하여 엔도자일라나아제 분비 생산 라이브러리를 최종 구축하였다.
실시예 3: 엔도자일라나아제 활성을 이용한 합성 분비 신호 펩타이드 라이브러리의 스크리닝
실시예 2에서 구축한 엔도자일라나제 분비 생산 라이브러리를 이용하여 분비 생산능을 가진 균주를 스크리닝 하기 위하여 엔도자일라나아제의 자일란 분해 활성을 이용하였다. 상기 라이브러리를 E. coli NEB 10-beta에서 수득하여 C. glutamicum ATCC13032 균주에 형질전환하였고, 이를 1%의 자일란이 포함된 한천배지에서 30℃, 30시간 배양하여 halo를 형성하는 균주를 선별하였다. 선별한 균주를 새로운 1% 자일란이 포함된 BHI(Brain heart infusion, BD) 한천배지에서 30℃, 30 시간 배양하여 형성하는 halo의 지름을 측정하였다(도 4). 최종적으로 약 200개의 halo를 형성하는 균주를 선별하였고, 이 중 상위 그룹에서 무작위로 5개의 균주를 선별하였다.
실시예 4: 엔도자일라나아제 분비능 확인 및 합성 분비 신호 펩타이드 서열 분석
실시예 3에서 선별한 5개의 균주를 BHI(Brain heart infusion, BD) 배지에서 30℃, 200 rpm, 24시간의 배양 후, 새로운 BHI 배지에 1/100의 부피만큼 옮겨 동일한 조건으로 배양하였다. 배양 후, 13000 rpm, 4℃에서 10 분 원심분리를 통해 배양액의 상층액만을 회수하여 아세톤 침전방법을 이용하여 단백질을 수득하였다. 상기 수득된 단백질은 SDS-PAGE를 수행하여 분비된 엔도자일라나아제의 양을 비교하였다 (도5A). 또한 동일한 배양 후, 선별한 5개의 C. glutamicum ATCC13032가 가지고 있는 분비 생산 벡터를 회수하여 분비능을 보인 합성 분비 신호 펩타이드의 뉴클레오티드 서열을 확인하였다. 이를 이용하여 선별된 5개 균주의 발현되는 아미노산 서열을 확인하였고, 분비된 엔도자일라나아제를 SDS-PAGE에서 분리하여 N-terminal amino acid 분석을 통한 5개 아미노산 서열을 확인하였다 (도 5B). 이를 통해 도 5B의 AESTL 서열을 확인하였고, 이는 엔도자일라나아제의 아미노산 서열임을 확인하였고, 구축한 합성 신호 펩타이드 부분에서 정확히 잘려 목적 단백질인 엔도자일라나아제만이 세포 외로 분비됨을 확인하였다.
실시예 5: 최종적으로 발굴한 3개의 분비 신호 펩타이드를 이용한 분비능 분석
실시예 4에서 확인한 5개의 균주 중 분비능이 높았던 C1, G1, G8에 대하여 기존 알려진 코리네박테리움 분비 신호 펩타이드와의 분비능 비교를 진행하였다. 알려진 코리네박테리움 분비 신호 펩타이드는 Cg2052, Cg1514, PorB 를 사용하였고, 이는 C. glutamicum ATCC13032를 주형으로 하여 정방향 프라이머인 NdeI_Cg2052_F (서열번호 23)와 역방향 프라이머인 Cg2052_XynA_R (서열번호 24)로 PCR하여 알려진 분비 신호 펩타이드를 증폭하였고, pHCP-XynA를 주형으로 하여 정방향 프라이머인 XbaI_XynA_F (서열번호 29)와 역방향 프라이머인 pCES208_no Ter_R(서열번호 30)를 이용하여 엔도자일라나아제를 증폭 후, 상기 알려진 분비 신호 펩타이드 증폭 산물과 정방향 프라이머인 NdeI_Cg2052_F와 역방향 프라이머인 pCES208_no Ter_R를 이용하여 오버래핑 PCR 진행 하였다. 이후 NdeI, NotI 제한효소를 처리하였고, 동일한 제한효소로 절단한 pHCP 벡터와 T4 DNA 라이게이즈를 이용하여 라이게이션하여 Cg2052 분비 신호 펩타이드 서열을 포함한 엔도자일라나아제 분비 생산 균주를 제작하였다. Cg1514와 PorB 분비 신호 펩타이드를 이용한 엔도자이라나아제 분비 생산 균주도 동일한 방법으로 진행하여 제작하였고, 사용된 정방향 및 역방향 프라이머는 NdeI_Cg1514_F(서열번호 25)와 Cg1514_ XynA _R(서열번호 26), NdeI_PorB_F(서열번호 27)와 PorB_ XynA _R(서열번호 28)를 이용하여 제작하였다.
분비 신호 펩타이드에 따른 엔도자일라나아제 분비능을 비교하기 위해 BHI(Brain heart infusion, BD) 배지에서 30℃, 200 rpm, 24시간의 배양 후, 새로운 250 mL의 플라스크에 1/100의 부피만큼 옮겨 동일한 조건으로 배양하였다. 배양 후, 13000rpm, 4℃, 10분 원심분리를 통해 배양액만을 회수하여 아세톤 침전방법을 이용하여 단백질을 수득하였다. 상기 수득된 단백질은 SDS-PAGE를 수행하여 분비된 엔도자일라나아제를 비교하였다(도 6A).
그 결과, 기존 알려진 분비 신호 펩타이드에 비하여 발굴한 합성 신호 펩타이드를 이용하는 것이 높은 분비능을 가지고 있음을 확인하였고, 그 중 C1 합성 분비 신호 펩타이드가 가장 높은 분비능을 가지고 있음을 확인하였다. C1 합성 분비 신호 펩타이드를 이용하여 엔도자일라나아제가 분비 되는 시스템은 도 6B와 같이 pHCP_C1_XynA 벡터로 명명하였다.
실시예 6: 합성 분비 신호 펩타이드를 이용한 아밀라아제의 생산
가장 높은 분비능을 가지고 있던 C1 합성 분비 신호 펩타이드를 이용하여 엔도자일라나아제가 아닌 다른 재조합 단백질에 대해서도 높은 분비능을 가지고 있는지 확인하기 위하여 목적 단백질로 아밀라아제를 이용하여 분비능을 확인하였다. 우선 목적 단백질인 아밀라아제 (AmyA)는 pCG-S-AmyA (S.S. Yim et al., Biotechnol Bioeng, 113:163-172, 2016)를 주형으로 하여 정방향 프라이머인 XbaI_SapI_Amy_F(서열번호 31)와 역방향 프라이머인 EcoRI_NotI_SfiI_Amy_R(서열번호 32)를 이용하여 아밀라아제 유전자를 증폭하였다. 상기 증폭한 아밀라아제 유전자는 XbaI, NotI 제한효소로 절단하고 동일한 제한효소로 절단한 pHCP 벡터와 T4 DNA 라이게이즈를 이용하여 라이게이션하여 pHCP-AmyA 벡터를 구축하였다. 그 후 C1 합성 분비 신호 펩타이드를 포함하는 벡터 구축을 위해, pHCP_C1_XynA으로부터 정방향 프라이머인 pCES208_confirm_F(서열번호 33) 역방향 프라이머인 SapI_C1_R(서열번호 34)를 이용하여 PCR 진행 후, XbaI, SapI 제한효소를 처리하였고, 동일한 제한효소로 절단한 pHCP-AmyA 벡터와 T4 DNA 라이게이즈를 이용하여 라이게이션하여 pHCP_C1_AmyA를 구축하였다 (도 7A). 아밀라아제 분비능 확인을 위해 BHI(Brain heart infusion, BD) 배지에서 30℃200 rpm, 24시간의 배양 후, 새로운 250 mL의 플라스크에 1/100의 부피만큼 옮겨 동일한 조건으로 배양하였다. 배양 후, 13000 rpm, 4℃10 분 원심분리를 통해 배양액만을 회수하여 아세톤 침전방법을 이용하여 단백질을 수득하였다. 상기 수득된 단백질은 SDS-PAGE를 수행하여 합성 분비 신호 펩타이드인 C1을 이용하여 아밀라아제가 분비 됨을 확인하였다(도 B). 또한 도 7C와 같이 기존에 보고된 Cg1514 분비 신호 펩타이드를 이용한 분비능과 비교하여 보았을 때에도 C1 합성 분비 신호 펩타이드를 이용하였을 때 더 높은 분비능을 가지고 있음을 확인하였다. 기존 보고된 Cg1514 분비 신호 펩타이드를 이용한 아밀라아제 생산 시스템은 보고된 것을 이용하였다 (S.S. Yim et al., Biotechnol Bioeng, 113:163-172, 2016). 이를 통해 C1 합성 분비 신호 펩타이드는 엔도자일라나아제 뿐만 아니라 아밀라아제에 대해서도 높은 분비능을 가지고 있음을 확인하였다.
실시예 7: 합성 분비 신호 펩타이드를 이용한 엔도자일라나아제의 유가식 배양
pHCP_C1_XynA를 이용한 엔도자일라나아제의 분비능을 코리네박테리움 글루타미쿰 SP002 균주(대한민국 특허 출원 10-2020-0133434(목적 단백질의 분비 생산능이 향상된 재조합 코리네박테리움))에 형질전환하여 2L 고농도 유가식 배양을 진행하였다. BHI 배지 10 mL에 overnight 배양하여 키운 균주를 최소 배양 배지에 15 g/L yeast extract, 7 g/L casamino acid, 2 g/L urea가 포함된 50 mL flask 배양으로 옮겨 30 ℃, 200 rpm, 24시간 배양 하였다. 이 후 1/10 부피의 배양액을 발효기에 접종하여, 온도는 30 ℃ pH는 계속 모니터링하면서 5 N 암모니아를 넣어 pH 7.0을 유지하였으며 용존산소량은 rpm을 1000 rpm까지 높여 조절하고, 1000 rpm 도달이후에는 산소를 넣어주어 30 % (v/v)을 유지하였다. 글루코스는 YSI 2300 STAT Plus기기를 이용해서 분석하였고 OD600nm에서 optical density를 분석하여 성장속도를 분석하였다 (도 8A). 분비 생산된 단백질은 배양액의 상층액 만을 회수하여 SDS-PAGE를 통해 분석하였고, 목적단백질인 엔도자일라나아제(48 kDa)가 분비되는 것을 확인하였고, SDS-PAGE image 분석 프로그램인 Gelanalyzer 2010을 이용하여 분비된 엔도자일라나아제는 전체 분비된 단백질 중에서 약 83%에 해당되는 것을 확인하였다 (도 8B). 이를 이용하여 분비된 엔도자일라나아제의 양은 최대 3.2 g/L가 분비 생산되는 것을 확인하였다. 이는 코리네박테리움 글루타미쿰에서 확인된 최고 분비 생산량이다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> Korea Advanced Institute of Science and Technology <120> Synthetic Signal Peptide having High Secretory Efficeincy and Secretion System using the Same <130> P21-B140 <160> 34 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic secretion signal peptide C1 <400> 1 Met Asn Lys Ser Lys Asp Ser Ser Ile Ala Leu Ala Leu Ala Phe Val 1 5 10 15 Leu Leu Ile Val Leu Thr Pro Ala Pro Arg Ala 20 25 <210> 2 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic secretion signal peptide G1 <400> 2 Met Phe Asp Ala Val Arg Arg Gly Val Ala Leu Ala Leu Ala Leu Val 1 5 10 15 Val Ile Leu Phe Leu Thr Pro His Ala Met Ala 20 25 <210> 3 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic secretion signal peptide G8 <400> 3 Met Arg Gly Gly Arg Phe Asn Gly Ile Ala Leu Ala Leu Ala Ile Leu 1 5 10 15 Phe Ile Val Leu Val Pro Thr Met Ser Glu Ala 20 25 <210> 4 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic secretion signal peptide X22 <400> 4 Met Gly Ala Arg Ala Thr Ala Ser Ile Ala Leu Ala Leu Ala Phe Leu 1 5 10 15 Val Ile Ile Val Ile Thr Pro Leu Pro Arg Ala 20 25 <210> 5 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic secretion signal peptide X17 <400> 5 Met Ser Leu Thr Ser Ser Ser Cys Val Ala Leu Ala Leu Ala Leu Cys 1 5 10 15 Phe Ala Ser Ile Ser Thr Pro Arg Val Tyr Ala 20 25 <210> 6 <211> 81 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic secretion signal peptide C1 <400> 6 atgaataaga gtaaggactc ttccattgca ctcgcactcg catttgttct tcttattgtt 60 cttaccccag caccaagagc a 81 <210> 7 <211> 81 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic secretion signal peptide G1 <400> 7 atgttcgacg ccgtccgtcg tggtgttgca ctcgcactcg cacttgttgt tattcttttt 60 cttaccccgc atgcaatggc a 81 <210> 8 <211> 81 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic secretion signal peptide G8 <400> 8 atgaggggtg ggaggttcaa tggtattgca ctcgcactcg caattctttt tattgttctt 60 gttcccacaa tgtctgaagc a 81 <210> 9 <211> 81 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic secretion signal peptide X22 <400> 9 atgggtgctc gtgctactgc ttctattgca ctcgcactcg catttcttgt tattattgtt 60 attacacccc tcccaagggc a 81 <210> 10 <211> 81 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic secretion signal peptide X17 <400> 10 atgagcctca cctcctcttc ttgtgttgca ctcgcactcg cactctgctt cgccagcatc 60 agcacccccc gggtctacgc a 81 <210> 11 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic secretion signal peptide <400> 11 Met Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ala Leu Ala Leu Ala Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ala 20 25 <210> 12 <211> 81 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic secretion signal peptide <400> 12 atgnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnttgca ctcgcactcg cannnnnnnn nnnnnnnnnn 60 nnnvcmnnnn nnbynnnngc a 81 <210> 13 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 13 taactttaag aaggagatat acatatgrvk rvkrvkrvkn nynnynnynt tgcactcgca 60 ctcgca 66 <210> 14 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 14 taactttaag aaggagatat acatatgnnc nncnncnncn nynnynnynt tgcactcgca 60 ctcgca 66 <210> 15 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 15 taactttaag aaggagatat acatatgnnt nntnntnntn nynnynnynt tgcactcgca 60 ctcgca 66 <210> 16 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 16 gcagcggccg caaaagctct tcatgcnnnn rvnnnnnnkg bgnngnngnn gnngnngnng 60 nntgcgagtg cgagtgcaa 79 <210> 17 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 17 gcagcggccg caaaagctct tcatgcnnnn rvnnnnnnkg bannannann annannanna 60 nntgcgagtg cgagtgcaa 79 <210> 18 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 18 gcagcggccg caaaagctct tcatgcnnnn rvnnnnnnkg baanaanaan aanaanaana 60 antgcgagtg cgagtgcaa 79 <210> 19 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 19 cctctagaat aattttgttt aactttaaga aggagatata catatg 46 <210> 20 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 20 caggcagcgg ccgcggcccc cgaggccgca aaagctcttc atgc 44 <210> 21 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 21 aattctctag agctcttctg cagccga 27 <210> 22 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 22 ccagtgaatt cctttcgttt tatttgatgc ct 32 <210> 23 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 23 taacatatgt tacgaaaaac agttaccg 28 <210> 24 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 24 gcgccgaggg tggactcggc tctagaagca gaagagacag aattcat 47 <210> 25 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 25 taacatatgt taaacagagt cagtcgtatt g 31 <210> 26 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 26 gcgccgaggg tggactcggc tctagagctt tgtgcagtgg aagtagg 47 <210> 27 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 27 taacatatga agctttcaca ccgcat 26 <210> 28 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 28 gcgccgaggg tggactcggc tctagatgcg gaagcaggtg ctgcg 45 <210> 29 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 29 aatttctaga gccgagtcca ccctcggcgc 30 <210> 30 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 30 tcagtaccga cggtgatatg g 21 <210> 31 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 31 aattctctag agctcttctg cagatgaaca agtgtcaatg aaagat 46 <210> 32 <211> 64 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 32 aattgaattc taaggcagcg gccgcggccc ccgaggcctt atttgtcatc gtcatcttta 60 taat 64 <210> 33 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 33 ctgatcctcc ggcgttca 18 <210> 34 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 34 ccgcaaaagc tcttcatgct cttggtgctg gggt 34

Claims (9)

  1. M XXXXXXXX ALALA XXXXXXXXXXXX A (서열번호 11)의 아미노산 서열을 가지고, 서열번호 1 ~ 5 중 어느 하나의 아미노산 서열로 표시되는 합성 분비 신호 펩타이드.
  2. 제1항의 합성 분비 신호 펩타이드를 코딩하는 핵산.
  3. 제2항에 있어서, 서열번호 6 ~10의 염기서열로 표시되는 것을 특징으로 하는 합성 분비 신호 펩타이드를 코딩하는 핵산.
  4. 제2항의 합성 분비 신호 펩타이드를 코딩하는 핵산과 목적 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터.
  5. 제4항의 재조합 벡터 또는 제2항의 합성 분비 신호 펩타이드를 코딩하는 핵산이 도입되어 있어, 상기 합성 분비 신호 펩타이드가 목적단백질과 융합 발현되는 재조합 미생물.
  6. 제5항에 있어서, 대장균, 코리네박테리움 속, 바실러스 속, 락토바실러스 속, 슈도모나스 속, 미코박테리움 속 및 야로이야속으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  7. 다음 단계를 포함하는 목적 단백질의 제조방법:
    (a) 제5항의 재조합 미생물을 배양하여 목적단백질을 재조합 미생물의 세포 외로 분비 생산하는 단계; 및
    (b) 상기 생산된 목적 단백질을 수득하는 단계.
  8. 서열번호 12의 염기서열로 표시되는 합성 분비 신호 펩타이드를 코딩하는 핵산 라이브러리.
  9. 다음 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 제8항의 합성 분비 신호 펩타이드를 코딩하는 핵산 라이브러리의 제조방법:
    (a) 서열번호 13 ~ 15의 정방향 프라이머와 서열번호 16 ~ 18의 역방향 프라이머를 이용하여, 주형 없이 오버래핑 PCR을 진행하여 합성 분비 신호 펩타이드 PCR 산물을 수득하는 단계;
    (b) (a) 단계에서 수득된 오버래핑 PCR 산물을 서열번호 19 및 서열번호 20의 프라이머를 이용하여 PCR하여, 합성 분비 신호 펩타이드를 코딩하는 핵산 산물을 수득하는 단계; 및
    (c) 상기 (b) 단계의 산물을 벡터와 라이게이션하여, 합성 분비 신호 펩타이드를 코딩하는 핵산 라이브러리를 제작하는 단계.
KR1020210092055A 2021-07-14 2021-07-14 고효율 분비능을 가지는 합성 분비 신호 펩타이드 및 이를 포함하는 분비 발현 시스템 KR20230011606A (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020210092055A KR20230011606A (ko) 2021-07-14 2021-07-14 고효율 분비능을 가지는 합성 분비 신호 펩타이드 및 이를 포함하는 분비 발현 시스템

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020210092055A KR20230011606A (ko) 2021-07-14 2021-07-14 고효율 분비능을 가지는 합성 분비 신호 펩타이드 및 이를 포함하는 분비 발현 시스템

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20230011606A true KR20230011606A (ko) 2023-01-25

Family

ID=85109820

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020210092055A KR20230011606A (ko) 2021-07-14 2021-07-14 고효율 분비능을 가지는 합성 분비 신호 펩타이드 및 이를 포함하는 분비 발현 시스템

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR20230011606A (ko)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20170140868A (ko) 2016-06-14 2017-12-22 전남대학교산학협력단 코리네박테리움 재조합 균주를 이용한 아스파라기나제의 분비생산 방법
KR20200002575A (ko) 2018-06-29 2020-01-08 엘지디스플레이 주식회사 표시장치
KR20200133434A (ko) 2019-05-20 2020-11-30 홍범 수요와 공급의 방향을 전환한 옵션 박스를 이용한 거래 중개 시스템 및 방법

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20170140868A (ko) 2016-06-14 2017-12-22 전남대학교산학협력단 코리네박테리움 재조합 균주를 이용한 아스파라기나제의 분비생산 방법
KR20200002575A (ko) 2018-06-29 2020-01-08 엘지디스플레이 주식회사 표시장치
KR20200133434A (ko) 2019-05-20 2020-11-30 홍범 수요와 공급의 방향을 전환한 옵션 박스를 이용한 거래 중개 시스템 및 방법

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
1. Freudl, R., Journal of biotechnology, 258:101-109, 2017
2. Degering, C. et al., Applied and environmental microbiology, 76:6370-6376, 2010

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2401856T3 (es) Un método para producir un polipéptido biológicamente activo que tiene actividad insulinotrópica
CN107532190A (zh) 用于肽生产的融合伴侣
US11725030B2 (en) Compositions and methods for producing high secreted yields of recombinant proteins
US11370815B2 (en) Compositions and methods for producing high secreted yields of recombinant proteins
KR20170083843A (ko) 말론산 생성능을 가지는 재조합 변이미생물 및 이를 이용한 말론산의 제조방법
JPWO2016204198A1 (ja) タンパク質の発現方法
JP5662363B2 (ja) 難発現性タンパク質の分泌のためのタンパク質融合因子（ｔｆｐ）を明らかにする方法、タンパク質融合因子（ｔｆｐ）ライブラリーを製造する方法、及び難発現性タンパク質の組み換え的生産方法
CN111153968B (zh) 一种提高外源碱性蛋白酶表达量的信号肽突变体及其构建方法与用途
CN110184254B (zh) 一种具有高耐碱性的酯酶突变体及其应用
KR102007890B1 (ko) 변형된 당 대사 경로를 갖는 재조합 균주를 이용한 당이성화 효소의 스크리닝 방법
US11046963B2 (en) Uncoupling growth and protein production
KR20230011606A (ko) 고효율 분비능을 가지는 합성 분비 신호 펩타이드 및 이를 포함하는 분비 발현 시스템
JPWO2015190458A1 (ja) 組換えブレビバチルス属細菌による組換え蛋白質の製造方法
KR20220049827A (ko) 목적 단백질의 분비 생산능이 향상된 재조합 코리네박테리움
JP4750030B2 (ja) 組換えポリペプチドを調製するための方法
JP6379537B2 (ja) 組換え水素酸化細菌およびそれを用いたタンパク質製造方法
CN112852788B (zh) 一种碱性底物选择性提高的枯草蛋白酶e突变体及其应用
KR101173272B1 (ko) 자동유도발현 프로모터 및 변이체를 이용한 단백질생산방법
KR101677368B1 (ko) 신규 프로모터 및 이의 용도
KR101840535B1 (ko) 재조합 레반슈크라제 발현 벡터
EP4389884A1 (en) Efficient production of enantiopure d-3-hydroxybutyrate
CN108498793B (zh) 杀香鱼假单胞菌dna疫苗、制备方法及其应用
JP5806897B2 (ja) ポリペプチド及び組換え微生物
KR101960450B1 (ko) 당근 Hsp17.7 유전자를 포함하는 사카로미세스 속 미생물을 이용하여 산물을 생산하는 방법
KR102083009B1 (ko) Ａｂｃ 트랜스포터를 통한 아라자임 분비 재조합 균주 및 이를 이용한 아라자임 생산방법

Legal Events

Date Code Title Description
E902 Notification of reason for refusal
E601 Decision to refuse application