KR20230005324A - 의료 용도를 위한 3차원 스캐폴드의 제조 방법 - Google Patents
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Abstract
의료 용도를 위한 멸균 스캐폴드(scaffold)의 제조 방법은 i) PLA-콜라겐 스캐폴드를 얻기 위해 폴리락타이드 폴리머 또는 코폴리머(통상적으로 PLA로 표기함)의 섬유를 포함하는 섬유 메시에 콜라겐을 로딩하는 단계, ii) 단계 i)에서 얻은 PLA-콜라겐 스캐폴드를 건조하는 단계, 및 iii) 멸균 스캐폴드를 얻기 위해, 단계 ii)에서 얻은 PLA-콜라겐 스캐폴드를 멸균하는 단계를 포함한다. 얻어진 멸균된 스캐폴드는 비멸균 스캐폴드에 비해 개선된 생물역학적 특성을 갖는다.
Description
본 발명은 약품이나 화장품에서 생체 재료로서 사용하기 위한 3차원 스캐폴드(scaffold)의 제조 방법에 관한 것이다. 스캐폴드는 폴리락타이드 또는 폴리락트산 폴리머 또는 코폴리머(통상적으로 PLA로 표시됨) 및 콜라겐으로 구성된다. 상기 방법은, i) 생물역학적 피쳐(feature) 세트, ii) 안정성 및 iii) 순도에 관한 원하는 특성을 지닌 스캐폴드 제조를 가능하게 하는 단계를 수반한다. 더욱이, 상기 방법은 사용되는 재료, 즉 PLA 및 콜라겐의 심각한 손상을 초래할 수 있는 단계 또는 얻어진 PLA-콜라겐의 심각한 손상을 초래할 수 있는 단계를 포함하지 않는다. 더욱이, 멸균 단계는 예기치 않게 스캐폴드에 특정 생물역학적 특성을 부여하는 것으로 나타났다.
조직 대체물 및 재생 플랫폼을 개발할 필요성은 최신 조직공학에서 가장 요구되고 도전적인 어플리케이션 중 하나이다. 3차원 생체재료 구조(스캐폴드)는 조직의 생체역학적 특성과 일치하고, 생체내 행동을 밀접하게 모방(세포 접착, 성장 및 조직 형성을 용이하게 함)하여 매우 바람직하다. 상기한 생체역학은 통상적으로 신체가 손상된 조직을 재건하는 것을 지원하고, 궁극적으로 관련 통증 및 치유 시간을 최소화한다. 특히 하중-적응 특성이 필요한 조직의 경우, 스캐폴드의 조합된 정적 및 동적 생체역학 특성이 치료의 최종적인 성공에 있어서 중요하다. 스캐폴드 개발에 있어서의 임의의 진전은, 생체외 조건과 예상되는 생체내 조직 재생 간의 높은 상관 관계를 보장해야만 한다. 스캐폴드의 무독성 생분해는 적절한 기간에 걸쳐 점차적으로 새로운 성장 조직으로 스트레스를 전달해야만 한다. 올바른 기계적 자극의 시너지 효과는 스캐폴딩 재료, 의도된 생물학적 환경 및 세포 존재에 크게 좌우된다.
생체역학적 스캐폴드의 가장 도전적인 어플리케이션 중 하나는 관절 연골(AC; Articular Cartilage) 치료이다. AC 손상 및 퇴화는 연령, 비만 또는 전신질환뿐만 아니라, 부상과 같은 신체적 원인으로 인해 젊고 활동적인 인구에서도 진행되고 있다. 치료하지 않으면, 이러한 결함은 골관절염(OA; OsteoArthritis)으로 진행되어, 전세계적으로 2억 4천만명 이상의 사람들에게 영향을 미칠 수 있다. 전체 연골 결손에서의 자연적인 상처 치유는 종종 기능적으로 그리고 생체역학적으로 열등한 섬유연골의 형성을 초래하여, 조직을 더 악화시키고 관절의 골관절염 변화를 일으키기 쉽다. 시작된 악순환은 궁극적으로 전체 또는 부분적인 관절 교체를 요구할 것이다. 따라서, 연골 재생 능력이 있는 생체재료 용액이 OA가 나타나기 전 초기 단계에서 연골 병변을 치료하는 데 매우 바람직하다.
임상적으로 사용되는 생체재료는 다양한 천연 유래 및 합성 물질을 포함한다. 천연 물질의 장점은, 동물 유래 물질의 적용(이종 이식)이 오염 및 원치 않는 면역 반응과 같은 특정 위험을 내포하고 있지만, 해당 목적을 위한 자연적 실행가능성이다. 이것은 이물질이나 과민 반응을 일으키지 않는 합성 물질을 사용함으로써 피할 수 있다. 합성 물질은 생물학적으로 더 유리하고 생체적합하게 형성될 수 있다. 다른 한편, 천연 유래 물질에 비해 합성 폴리머는 통상 세포 접착, 증식 및 조직 회복을 촉징하는 원하는 고유 생물학적 신호가 결여되어 있다. 그러나, 임의의 생체 재료는 통상 임상 용도 그리고 “정확한 의학” 솔루션을 목표로 평가하고 최적화하기가 어렵다. 현재 생체재료 및 조직공학 구성의 기계적 기능을 평가하는 현재 수준이 매우 불충분하다는 것이 널리 예상된다.
섬유 기원의 합성 물질은 종종 AC 치료 어플리케이션을 위해 사용된다. 이러한 스캐폴드는 75 내지 85 %의 다공성을 갖는다.
AC의 구조, 기능 및 생체역학적 거동은 매우 복잡하고, 이방성이 높으며, 시간 및 하중 이력 종속적이다. 관절 연골은, 70 내지 85 %의 물과 나머지 프로테오글리칸(글리코사미노글리칸이 병 브러시형 구조로서 부착된 단백질) 및 콜라겐을 지닌 복합물로서 이미지화될 수 있는 다성분 기재로 둘러싸인 비교적 소수의 연골 세포로 이루어진다. 프로테오글리칸과 물의 농도는 연골 조직의 깊이에 걸쳐 변한다.
혈액 공급과 림프 배액이 없으면, 관절 연골이 고립되어, 다른 결합 조직의 상처 치유 반응이 사실상 결여된다. 생체역학적 이상에 대한 조직의 높은 노출은 연골 병변의 높은 발생률을 초래한다. 외상성 또는 장기간의 비생리학적 부하로 인한 병변은 통상 골관절염(OA)으로 발전한다. OA는 전세계적으로 근골격계 질환의 가장 큰 원인이며, 서구 인구의 7 내지 10 %의 사람들에게서 발병률을 보인다. 새롭게 진단 받은 환자의 OA 추정 비용은 연간 $ 6,800이며, 이에 따라 OA를 10년 연기하면 환자당 $ 68,000를 절약할 수 있다. EU에서의 OA에 대한 지출은 연간 대략 15 내지 200억이다. 전통적으로 OA 치료를 위해 필요하지는 않았지만, 연골 치료는 관절 교체의 필요성을 지연시키거나 제거할 수 있다는 희망과 함께 퇴행성 질환의 진행을 변경할 수 있는 잠재력으로 인해 관심이 높아졌다.
심각한 질병률과 장애 가능성 외에도, 연골 외상 및 퇴행은 경제적으로도 큰 영향을 미친다. 연골 병변의 연간 발병률이 인구 10만명당 23명으로 추산하면, EU에서 수복 치료가 필요한 무릎 연골 결손 환자는 10만명이 넘는다. 연골 병리의 유병률은 인구 고령화와 비만율 증가로 인해 향후 수십년 동안 급격히 증가할 것으로 예상되며, 무릎 교체에 대한 수요는 2030년까지 크게 증가할 것으로 예상된다. 다른 한편으로, 유증상의 연골 병변이 있는 젊은 환자는 높은 기능 요구와 제한된 치료 옵션의 조합으로 인해 어려운 인구를 나타낸다. 관절 연골 수복 치료의 목적은 자연 유리 연골과 구별할 수 없는 수복 조직 아키텍처를 지닌 관절의 정상 기능을 회복하고 유지하는 것이다. 그러나, 현재 연골 병변을 위한 수복 기술은 부적절하고 개발을 필요로 한다.
외과적 수복 후, 수복된 지점의 생체역학적 특성은 약화되고, 수술후 하중을 줄여야만 한다. 따라서, 기계적 자극이 결여되면 조직 회전율과 치유 속도가 느려질 것으로 예상되며, 이에 따라 회복 시간이 오래 걸린다. 전술한 바와 같이, 생체재료 스캐폴드는 치유 병변에 구조적 지지를 제공하여 조기 하중 지지를 허용하고, 이에 따라 치유 과정을 향상시킬 수 있다. 연골 수복을 위해 천연 및 합성의 다양한 3차원 스캐폴드가 도입되었다.
본문에서 특별한 관심 대상인 스캐폴드의 한가지 타입은 통상 PLA로 표기되는 폴리락티드 폴리머 또는 코폴리머로 형성된 스캐폴드이다. 상기한 스캐폴드는 여러 공개물의 주제였다.
PLA 스캐폴드는, 예컨대 Wiley Online Library에 온라인 게시된, Muhonen 등이 저술한 DOI 10.1002/jor 23099(2015년)에 설명되어 있다. 감마선 조사(照射) PLA 스캐폴드를 재조합 2형 휴먼 콜라겐 용액에 침지하여 rhCo-PLA 스캐폴드를 얻었고, 이 스캐폴드를 멤브레인 유도 자가 연골 세포 이식(MACI) 절차를 사용하여 돼지 연구에서 테스트하였다. 그 결과를 상용 멤브레인(Chondro-Gide®)을 사용하는 MACI-치료군 및 어떠한 처리도 받지 않은 대조군과 비교하였다. 양자의 치료군 모두가 대조군에 비해 개선을 나타냈지만, 차이는 통계적으로 미미하였다. rhCo-PLA 치료 병변 중 일부에서, 수복 조직 구조뿐만 아니라 기계적 특성도 건강한 연골의 특성과 매우 유사하다.
Gasik 등은 2018년 11월호 Bioengineering and Biotechnology 제6권에서 rhCo-PLA 스캐폴드를 얻기 위해 재조합 3형 휴먼 콜라겐 용액으로 도핑되는 멸균 PLA 스캐폴드에 관해 저술하였다. 2개 타입의 스캐폴드를 비교하였다: PLA 및 rhCo-PLA 스캐폴드. 2개 타입의 스캐폴드의 생물역학적 비교 결과는, 2개의 콜라겐 첨가와 배지 조성이 스캐폴드의 탄성, 점탄성 및 비탄성 특성을 어떻게 변화시키는지를 보여주었다. 이 연구에서는, Markov Chain Monte Carlo 샘플링 형태의 BUGS(Bayesian inference Using Gibbs Sampling)를 사용하여 Muhonen 등의 연구에서 얻은 생체내 연골 수복 점수 분석을 추가로 수행하였다. 전체 정규화 ICRS (International Cartilage Repair Society)의 정규 또는 푸아송 분포를 사용한 결과는, 상용 스캐폴드의 경우의 0.38 및 자연 치유 대조군의 경우 0.288에 대해 rhCo-PLA가 통계적으로 유의미하게 높은 평균 점수(0.515)를 갖는 것을 보여준다.
Salonius 등이 2019년 저술한 J. Cell. Physiol.은 생체재료 스캐폴드와 조합된 세포 치료에 관한 것이다. 사용된 실험적인 스캐폴드 타입은 재조합 휴먼 콜라겐-폴리락타이드(rhCo-PLA))에 기초하여 하였으며, rhCo-PLA는 재조합 2형 또는 3형 휴먼 콜라겐의 용액에 멸균 PLA 스캐폴드를 침지함으로써 준비되었다. 대조군 스캐폴드 타입은 돼지 유래 1/3형 콜라겐으로부터 제조된 상용 Chondro-Gide® 멤브레인이었다. 결과는, 2형 콜라겐이 중간엽 줄기 세포(MSC; Mesenchymal Stromal Cell) 증식을 촉진하지만, rhCo-PLA 스캐폴드에 사용된 콜라겐 유형은 체외 배양 동안에 MSC 분화에 영향을 주지 않으며, MSC의 연골 분화가 rhCo-PLA 스캐폴드와 상용 콜라겐 멤브레인에서 세포 비대를 유도한다는 것을 보여주었다. 그러나, 비대는 MSC의 체외 연골 생성에서 일반적인 현상인 반면, 생체내 관절 연골 결손의 MSC는 비대 마커의 상향 조절을 나타내지 않았기 때문에 정적 세포 배향의 한계가 결과에 영향을 미칠 수 있었다고 언급되었다. 관절에서, 세포는 관절에 영양분의 흐름과 분화 신호를 제공하는 주기적인 기계적 하중을 받고 있다.
WO 2016/04221(University of Helsinki 등의 명의)는 멸균 폴리머 펠트를 콜라겐 용액에 침지함으로써 얻어진 3차원 재료에 관한 것이다. 폴리머는 PLA일수 있다. 상기한 스캐폴드는 1형 보빈 콜라겐 또는 재조합 2형 휴먼 콜라겐을 함유하는 스캐폴드에 비해 개선된 유지성/강성을 갖는 것으로 나타났다. 돼지 추출 2층 소수성 1형/3형 콜라겐 멤브레인인 Chondro-Gide® 스캐폴드에 비해, rhCo-PLA는 우측 돼지 무릎에 이식한 후 4개월의 치료 후에 우수한 성능을 나타내었다.
그러나, 원하는 특성을 갖고 여전히 안전하며 멸균 상태인, 비용 효율적이고 안전하며 신뢰 가능한 스캐폴드에 대한 분명한 요구가 있다. 더욱이, 상기한 스캐폴드가 연골 수복뿐만 아니라 사람 및 채식주의자 용도를 비롯한 일반적인 약품 또는 화장품에 일반적인 용도를 갖는 것이 유리할 것이다.
본 발명은 의료 용도를 위한 멸균 스캐폴드의 제조 방법에 관한 것으로, 상기 방법은
i) PLA-콜라겐 스캐폴드를 얻기 위해 폴리락타이드 또는 코폴리머(통상적으로 PLA로 표기함)의 섬유를 포함하는 섬유 메시에 콜라겐을 로딩하는 단계,
ii) 단계 i)에서 얻은 PLA-콜라겐 스캐폴드를 건조하는 단계, 및
iii) 멸균 스캐폴드를 얻기 위해 단계 ii)에서 얻은 PLA-콜라겐 스캐폴드를 멸균하는 단계를 포함한다.
제조 중에, PLA, 콜라겐 및 PLA-콜라겐 스캐폴드의 불필요한 분해를 피하기 위한 조치를 취한다. 이에 따라, PLA-콜라겐 스캐폴드의 멸균 단계는, 스캐폴드의 온도 상승 없이 또는 적어도 약간만의 온도 상승으로 수행된다. 이것은, 예컨대 멸균 방법의 선택에 의해 및/또는 온도 상승을 피하는 특별한 조치를 취하는 것에 의해 행해질 수 있다. 더욱이, 여기에서 예 3에 나타낸 바와 같이, 멸균 스캐폴드는 비멸균 스캐폴드에 비해 향상된 생물역학적 특성, 그리고 이에 따라 무균 조건 하에서 준비된 스캐폴드에 비해 향상된 생물역학적 특성을 갖는다.
본 발명의 방법에서 사용되는 섬유 메시는
i) 고체 형태의 PLA를 마련하는 것,
ii) PLA에 PLA 섬유를 얻는 프로세스를 행하는 것, 및
iii) 얻어진 섬유에, 섬유 메시를 얻는 프로세스를 행하는 것에 의해 얻어질 수 있다.
PLA 섬유는 기지의 방법에 의해 형성될 수 있다. 본 발명의 실시예에서, PLA 섬유를 형성하는 데 적합한 방법은 용융 방사 또는 전기 방사와 같은 방사에 의한 것이다. 방사는 통상 PLA를 용융시키고 용융된 PLA에 방사 프로세스를 실시하는 것에 의해 또는 PLA를 적절한 용매에 용해시키고 PLA 용액에 방사 프로세스를 실시하는 것에 의해 수행된다. 얻어진 섬유에는, 메시에 섬유를 포함시키는 프로세스가 실시되고, 상기한 메시에는 3D 구조를 얻는 프로세스가 더욱 실시될 수 있으며, 게다가 메시에는 메시의 섬유 또는 그 3D 구조가 함께 유지되는 것을 보장하는 프로세스가 실시될 수 있다.
상이한 구조의 스캐폴드를 얻을 수 있다.
1. 콜라겐이 섬유에 로딩된 1차원(1D) 섬유 구조(섬유의 길이 및 직경이 변할 수 있음)
2. 불투과성 2차원(2D) 기재: 해당 구조는 이 구조에 생리활성 물질(예컨대, 세포)이 포함되게 한다. 통상적으로, 세포는 2D 환경에서 배양된다.
3. 3차원(3D) 나노 다공성 하이드로겔 스캐폴드, 이 스캐폴드에서 콜라겐은 통상적으로 하이드로겔 상단에 위치하거나(즉, 나노 규모 표면을 지닌 2D 기판과 상호 작용함), 3D 구조 내부에 캡슐화된다(세포는 주변 하이드로겔을 분해하여 프로세스를 이동 또는 확장시켜야만 함).
4. 3차원(미세 다공성) 스캐폴드, 이 스캐폴드에서 높은 다공성(통상적으로, > 70 %)으로 인해 생리활성 물질이 확산 가능하고, 스캐폴드 기공 크기에 따라 1차원 스캐폴드 스트럿을 따라 정렬되거나 다수의 스트럿에 부착되어 3차원으로 확산될 수 있다.
본문에서, 스캐폴드에 관한 설명은 멸균 스캐폴드를 커버하는 것으로도 의도된다.
통상적으로, 본 발명의 스캐폴드는 3차원 구조를 갖는다. 전술한 바와 같이, 3차원 구조는 또한 나노 다공성 하이드로겔 스캐폴드 형태일 수 있으며, 이 경우에 생리활성 물질이 하이드로겔 상부에 위치하거나 3D 구조 내부에 캡슐화되고, 주위 하이드로겔은 생리활성 물질을 해제하기 위해 분해되어야만 하거나, 3차원 구조는 미세 다공성 스캐폴드 형태일 수 있으며, 이 경우에 생리활성 물질은 스캐폴드의 높은 다공성으로 인해 3차원으로 확산 가능하다.
본 발명에 따른 스캐폴드는 이와 같이 사용 가능하거나 하나 이상의 생리활성 물질으로 로딩될 수 있다. 생리활성 물질은 하나 이상의 세포(들)일 수도 있고, 생물학적 환경, 특히 포유동물 신체에서 활성을 갖는 제제일 수도 있다. 본 발명에 따른 스캐폴드에 로딩되는 세포는 병에 걸리거나 손상된 조직을 수복하도록 의도된 세포일 수 있다. 다른 생리활성 물질은 통증 완화에 적합하거나 특정 조직의 질병 치료에 적합한 약물 물질일 수 있다. 다른 생리활성 물질은 또한 전신 사용으로 의도되는 약물 물질일 수 있지만, 이 경우에 상기 약물 물질을 임플란트에 투여하기가 용이하다. 스캐폴드는 임플란트 또는 밴디지 형태일 수 있다. 스캐폴드는 인간 의학뿐만 아니라 수의학과 같은 의학 분야에서 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 스캐폴드는, 특히 AC와 같은 연골 수복에 연관되거나 골연골과 연관된 다른 의료 목적으로 사용될 수 있다. 스캐폴드는 또한, 예컨대 AO 등에서와 같은 치료 요법에서 사용될 수도 있다.
원래 연골은 이와 같이 다공성이 아니지만, 예컨대 콜라겐 함량이 높은 천연 뼈의 다공성은 뼈의 종류에 따라 50 내지 90 % 범위이다. 조직 내성장과, 영양소 및 대사 폐기물의 흐름 전달을 보장하기 위해 조직공학 스캐폴드를 위한 다공성이 높고 상호 연결된 개방 기공 구조가 필요하다. 재료의 다공성은 다수의 방식으로 결정될 수 있다. 예컨대, 마이크로컴퓨터 단층 촬영(마이크로CT) 분석, 영상 분석(예컨대, 주사 전자 현미경 또는 투과 전자 현미경), 가스 밀도 측정법, 뿐만 아니라 수은 및 액체 압출 다공성 측정법이 이용될 수 있다. 전체 다공성의 경우, 마이크로CT 분석이 최상의 방법으로 간주되는데, 그 이유는 이것인 전체 다공성 결정에 대한 신뢰성 있는 결과를 제공하기 때문이다.
본 방법에서 사용되는 섬유 메시는 다공성 구조를 갖는다. PLA 섬유 메시의 다공성은 약 80 내지 99 %, 바람직하게는 대략 85 내지 95 %이다. 2개의 성분, 즉 PLA 섬유 메시와 콜라겐 성분을 지닌 스캐폴드의 다공성은 약 70 내지 99 %, 바람직하게는 대략 80 내지 95 %이다. 멸균 전후의 스캐폴드는 동일한 범위 내의 다공성을 갖는다.
발명의 상세한 설명
전술한 바와 같이, 본 발명은 멸균 스캐폴드의 제조 방법을 제공한다. 상기 방법은
i) PLA-콜라겐 스캐폴드를 얻기 위해 폴리락타이드 또는 코폴리머(통상적으로 PLA로 표기함)의 섬유를 포함하는 섬유 메시에 콜라겐을 로딩하는 단계,
ii) 단계 i)에서 얻은 PLA-콜라겐 스캐폴드를 건조하는 단계, 및
iii) 스캐폴드를 얻기 위해 단계 ii)에서 얻은 PLA-콜라겐 스캐폴드를 멸균하는 단계를 포함한다.
본 발명의 방법은 사용되는 PLA와 콜라겐의 불필요한 분해를 피하도록 그리고 섬유 메시 및/또는 PLA-콜라겐 스캐폴드의 불필요한 분해를 피하도록 구성된다. 이에 따라, 시작 PLA 물질에 존재하는 단량체의 양/개수는 프로세스 동안에 현저히 변하지 않으며, 이에 따라 최종 스캐폴드 내의 PLA 단량체의 양/개수는 시작 PLA 물질에 가깝다. 본 발명의 사전 방법 단계 중에, PLA는 PLA 섬유를 포함하는 섬유 메시를 얻기 위해 상승된 온도를 겪을 수 있고, 예컨대 PLA 섬유 메시를 얻기 위한 방사 프로세스 중에 PLA 원료의 일부가 분해될 것으로 예상된다. 일반적으로, PLA 원료(섬유 형성 전) 내의 단량체 함량은 매우 낮으며, 예컨대 약 0.1 %이고, 섬유 메시 내의 단량체 함량은 통상 최대 약 1 %이다.
이와 유사하게, 본 발명의 방법으로 스캐폴드를 제조하는 동안, 단지 최소의 콜라겐 분해만이 일어난다. 멸균 스캐폴드로 변형되는 동안에 스캐폴드의 안정성은 특히 제조 중에, 특별히 멸균 프로세스 중에 콜라겐 성분의 온도 상승을 피하는 것에 의해 그리고 멸균 방법이 스캐폴드의 생물역학적 특성에 큰 악영향을 주지 않는 것을 보장하는 것에 의해 보장된다. 앞서 설명한 바와 같이, 멸균 프로세스는 예기치 않게 스캐폴드의 생물역학적 특성에 긍정적인 영향을 준다. 이에 따라, 실온 또는 저온에서의 감마선 조사에 의한 멸균은 건조 상태 스캐폴드 및 습윤 상태 스캐폴드 모두에 보다 안정한 구조를 제공한다. 스캐폴드는 더 강성이 되고, 생물역학적 특징의 변화가 덜하며, 이는 준비되는 스캐폴드의 승인에 유리하다.
안정성 문제에 관하여, PLA는, 열, 방사선 및 가수분해성 분해에 민감한 에스테르 본드를 함유한다. 콜라겐도 또한 요소, 방사선 유도 또는 온도 종속 분해를 비롯한 다수의 메커니즘에 의해 분해될 수 있다.
얻어진 스캐폴드는 이와 같이 사용될 수도 있고, 제한하는 것은 아니지만 세포와 같은 생리활성 물질 또는 약물 물질로 로딩되고 임플란트로서 사용될 수 있다. 상기한 경우, 스캐폴드의 멸균은 스캐폴드에 제한하는 것은 아니지만 약물 물질 또는 세포와 같은 생리활성 물질을 로딩하기 전이나 후에 일어날 수 있다.
본 발명의 방법은 아래의 특성 중 하나 이상을 갖는 스캐폴드를 제공한다:
· 임플란트에서 사용되는 경우, 시간 경과에 따라 새로운 조직이 스캐폴드를 대체하고 분해산물이 국소적으로나 전신적으로 유해하지 않도록, 스캐폴드는 세포 생존력과 생분해성을 지원하기 위해 생체 적합성이어야만 한다.
· 스캐폴드는, 세포가 스캐폴드 내부로 이동하여, 새로운 조직을 증식하고 형성할 수 있도록 하기 위해 서로 연결된 기공을 지닌 다공성이 높은 3D 구조를 갖는다.
· 스캐폴드는 사용 전에 세포가 스캐폴드에 로딩되도록 적절한 다공성을 가져야만 하고, 이에 따라 세포가 스캐폴드 내부에 머물어 새로운 조직을 증식시키고 형성할 수 있다.
· 스캐폴드는 어플리케이션, 예컨대 기계적인 자극이 AC 환경에서 잘 작동하여 새로운 조직 형성이 가능하도록 적절한 생물역학적 강도를 가져야만 한다.
· 스캐폴드는 대체하고자 하는 자연 조직을 유사하게 모방하는 것이 아니라, 어플리케이션을 위한 적절한 압축 및 감압 기능, 뿐만 아니라 로딩 및 압축 동안에 유체 흡착 및 간질액 압축을 가져야만 한다.
· 스캐폴드는 조직 내성장 및 후속하는 새로운 조직 형성을 지원하는 것을 가능하게 하도록 어플리케이션을 위한 적절한 분해 시간을 가져야만 한다.
본 발명의 방법에서 사용하기 위한 폴리머
PLA-콜라겐 스캐폴드는 본 발명에 따라 준비된다. 본문에서, PLA는 L-락티드, D-락티드에 기초한 폴리락타이드와, L-락티드 및 D-락티드에 기초한 폴리머를 포함하는 모든 입체이성체 형태의 폴리락타이드를 포함하도록 의도된다. L-형태와 D-형태의 함량 간의 비율은 변할 수 있다. 통상적으로, 본 방법에서 사용되는 PLA는 L-형태 및 D-형태 락티드 모두를 함유한다. 폴리락타이드에 대하여, 폴리머 내의 D-형태의 존재는 통상 폴리머가 분해되는 데 걸리는 시간에 영향을 준다. D-형태의 함유물은 분해 시간을 줄인다. 이러한 방식으로, 폴리머 내의 L-형태 및 D-형태의 함량을 변화시키는 것에 의해 원하는 분해 시간을 갖는 PLA를 설계할 수 있다. 그러나, D-형태의 함량은 얻어진 스캐폴드의 생물역학적 특성에도 또한 영향을 준다. 이에 따라, 스캐폴드 내의 D-형태의 함량이 높을수록, 생물역학적 특성은 약해진다. 따라서, 본 발명의 방법에서 사용하기 위한 폴리락타이드의 L-형태와 D-형태 간의 적절한 밸런스를 선택하는 것이 중요하다. 대체로, D-형태의 함량은 통상 약 1 내지 약 50 %w/w, 예컨대 약 2 내지 약 40 % w/w, 약 3 내지 약 35 % w/w 또는 약 4 내지 30 % w/w이다. 본 발명의 일실시예에서, 폴리락타이드는 L-형태를 96 % 그리고 D-형태를 4 % 함유하며, 이러한 락타이드는 96/4 폴리(L/D)락타이드라고도 표기한다.
본문에서, PLA라는 용어는, 폴리락타이드 또는 락타이드와 글리콜라이드 사이에 형성되는 폴리(락타이드-코-글리콜라이드)(PLGA)와 같은 코폴리머도 또한 포함한다. 락타이드와 글리콜라이드의 함량은 변할 수 있다.
본 발명에서 사용하기 위한, PLA 섬유 메시를 얻기 위해 사용되는 PLA 원료는 실온에서 결정된 고유한 점성, 약 1.5 dl/g 내지 약 5 dl/g, 예컨대 약 1.5 dl/g 내지 약 4 dl/g, 약 1.7 di/g 내지 약 3 dl/g, 약 1.7 dl/g 내지 약 2.5 dl/g, 또는 약 1.8 dl/g, 약 1.9 dl/g, 약 2.0 dl/g, 또는 약 2.1 dl/g, 및 최대 약 0 wt% 내지 1 wt%, 예컨대 약 0.1 wt% 내지 최대 1 wt%의 단량체의 최대 함량을 갖는다.
아래에서는, 본 발명의 방법에서 사용하기에 적합한 생분해성 PLA 폴리머에 관한 더 많은 상세가 주어진다.
적절한 폴리머는 생분해성 폴리머이다. 적절한 폴리머는 천연 또는 합성 폴리머일 수 있다. 일반적으로, 합성 생체흡수성 폴리머가 조직공학 스캐폴드로서 널리 연구된다. 쉽게 재현 가능한 특징뿐만 아니라 그 제어 가능한 화학물 및 특성은 스캐폴드 재료로서의 용도를 능가했다. 합성 생분해성 폴리머는 가수분해에 민감한 그 작용기에 따라 다양한 하위 그룹, 예컨대 에스테르, 오르토에스테르, 무수물, 카보네이트 및 아미드로 나뉠 수 있다. 특히, 폴리에스테르는 에스테르 결합의 가수분해에 의한 분해의 용이성으로 인해 다수의 임상적인 어플리케이션에서 사용되어 왔다. 또한, 그 분해산물은 일부 경우에 대사 경로를 통해 재흡수되고, 그 구조를 조정하는 것에 의해 분해율을 변경할 수 있는 가능성을 갖는다.
조직공학에서 사용되는 가장 널리 그리고 초기에 연구된 합성 생체흡수성 폴리머의 일부는 폴리에스테르이다. 폴리(α-에스테르)의 독창성은 방대한 다양성과 합성 다양성에 있다. 폴리(α-에스테르) 부류에서, 폴리글리콜라이드(PGA)와, 폴리락타이드(PLA)의 입체이성체 형태를 포함하는 폴리(α-하이드록시산)이 가장 널리 연구되는 폴리머이다.
본 발명의 방법에서, PLA가 사용된다. PLA는 옥수수, 사탕수수 및 타피오카와 같은 탄수화물 공급원에서 나온 당의 발효에서 유도된 젖산의 축합 중합에 의해서나 젖산의 환형 이량체인 락타이드의 개환 중합에 의해 생성된 열가소성 생분해성 폴리머이다. 키랄 탄소 원자로 인해, 젖산은 모든 동물과 미생물의 대사에서 발생하는 L-젖산(S) 및 D-젖산(R)이라는 2개의 거울상 이성질체(enantiomeric) 형태로 존재한다. 축합 중합에 의해서는, 단지 저분자량 PLA만이 통상 얻어진다. 고분자량 PLA는, 젖산의 다중 축합에 탈수 환형 이량체인 락타이드로의 해중합이 후속하는 개환 중합에 의해 얻어질 수 있다. 광활성 락타이드가 D-락타이드, L-락타이드로서나 메조-락타이드(D,L-락타이드)로서 확인될 수 있다. 부분 입체이성질체 구조뿐만 아니라, 라세미 락타이드, D-락타이드 및 L-락타이드의 라세미 혼합물도 또한 존재한다. 고분자 사슬의 구조와 조성, 특히 젖산의 L-이성질체 대 D-이성질체의 비율이 PLA의 처리, 결정화 및 분해에 영향을 준다. L-락타이드와 메조-L,D-락타이드 또는 라세미 락타이드의 공중합을 사용하는 것에 의해, 용융 범위가 130 내지 185 ℃인 고분자량 비정질 또는 반결정질 폴리머를 얻을 수 있다. PLLA[Poly(L-lactide)]는 L-락타이드만을 포함하는 호모폴리머로 반결정질이고, 최고 융점을 갖는 반면, D-이성질체 함량이 높은 PLA 코폴리머는 융점이 낮고, 결정화 거동이 현저히 낮아, D-함량이 12 내지 15 %를 초과할 시에 비정질이 된다.
PLA는 지방족 폴리에스테르이고, 이에 따라 그 구조에 존재하는 에스테르기로 인해 가수분해되기 쉽다. 가수분해 분해 거동, 속도 및 메커니즘은 분자 구조 또는 고차 구조를 변경하는 것에 의해 그리고 PLA의 온도, pH 및 촉매종(예컨대, 알칼리 및 요소)과 같은 매체 인자에 의해 제어 가능하다. 생체내 가수분해 분해 속도는 생체외 분해와 유사하므로, 생체내 분해는 생체외 분해 거동 및 속도로부터 어느 정도 예측할 수 있다. PLA는 가수분해를 촉진하는 효소를 필요로 하지 않는다. 젖산은 살아있는 유기체의 대사에서 발생하며, 그 결과 PLA의 분해산물은 무독성이다. 지방족 폴리에스테르의 가수분해는 에스테르 결합의 가수분해 분리가 후속하는 기재로의 수분 흡수로 시작된다. 결정도의 초기 정도는, 비정질 부분이 높은 수분 흡수율을 갖고 결정 세그먼트가 기재에서의 수분 침투를 감소시키기 때문에 가수분해 분해 속도에 영향을 준다. 또한, PLA 시편의 자가 촉매 효과가 보고된 바 있다. 자가 촉매 작용은, 분자 질량이 낮은 화합물이, 분해산물이 주위 용액에 용해되는 외측 쉘에 침투할 수 없는 경우에 시편의 중심에 카르복실기 말단기를 포함하는 화합물의 개수가 증가하는 것으로 인한 것이다.
PLA는 그 열가소성 특성으로 인해 다양한 형태로 가공될 수 있다. 용융 가공은 가장 널리 사용되는 PLA를 위한 방법이다. 추가로, 사출성형과 압출이 PLA 필름 및 상이한 부직포 또는 직물을 위한 섬유를 제조하기 위해 널리 사용되는 방법이다. 또한, PLA의 전기 방사는, 의료용 조직 스캐폴드, 상처 드레싱, 약물 담체, 보호 직물 및 나노 복합 재료로서 사용될 수 있는 얇은 섬유를 제조하는 의료 어플리케이션을 위해 사용된다. PLA의 광범위한 의료 어플리케이션으로는, 정형외과용 나사, 조직공학 스캐폴드, 봉합사, 단백질 캡슐화 및 전달, 마이크로스피어 및 약물 전달 시스템이 있다. PLLA는 우수한 인장 강도, 낮은 연신율 및 높은 모듈러스를 지닌 저속 분해 폴리머(생체 내 전체 재흡수의 경우 2년 내지 5년 이상)이다. 이것이, PLLA가 정형외과용 고정 디바이스와 같은 하중 지탱 어플리케이션에 이상적으로 간주되는 이유이다. 다른 한편으로, PDLLA는 고속으로 분해되어, 1 내지 2개월 내에 강도를 잃고, 가수분해 시에 12 내지 16개월 내에 질량 손실을 겪는다. PDLLA는 또한 PLLA에 비해 낮은 인장 강도를 갖는다. 이러한 이유로, PDLLA는 약물 전달 매체로서 그리고 조직공학을 위한 저강도 스캐폴드 재료로서 바람직하다. PLLA(반결정질), PLDLA(비정질), P(L/DL)LA 70/30(비정질) 및 P(L/D)LA 96/4(반결정질)는 의료업계에서 가장 통상적으로 사용되는 PLA 폴리머이다.
폴리락타이드계 코폴리머
PLGA는 생의학 어플리케이션에서 가장 많이 연구되는 분해성 폴리머이다. PLA 및 PGA는 매우 다른 특성을 갖기 때문에, 상이한 코폴리머 성분으로 인해 PLGA가 상이한 어플리케이션에 대해 최적화될 수 있다. 락타이드 성분이 25 내지 75 %인 경우, PLGA는 안정한 호모폴리머에 비해 가수분해 면에서 매우 불안정한 비정질 폴리머이다. 가스 발포, 마이크로스피어 소결, 포로겐 리칭(porogen leaching), 전기 방사 및 폴리머 프린팅과 같은 다수의 상이한 가공 기술이 PLGA 스캐폴드 제조에 사용되어 왔다. 다른 폴리에스테르에 비해 PLGA 분해가 빠르기 때문에, PLGA는 특별히 봉합사 및 약물 전달 디바이스로서 사용되어 있다. PLGA는 또한 우수한 세포 접착 및 증식 특성을 보여주기 때문에 조직공학 스캐폴드로 제조되어 왔다.
전술한 바와 같이, 본문에서 PLA라는 용어는 폴리락타이드 폴리머(폴리젖산 폴리머라고도 함)와, 락타이드 및 글리콜라이드를 함유하는 코폴리머 모두를 커버한다. 특정 실시예에서, PLA는 폴리락타이드 폴리머이다.
안정성에 관하여, PLA는 저분자량 PLA 또는 단량체, 이량체 등으로 분해될 수 있는 에스테르 결합을 함유한다. 본 방법에서는, 큰 분해를 피하기 위해 조치가 취해진다. 분해 속도는 온도 및 pH에 좌우된다. 본 발명의 방법에서, 용융 방사 후에 프로세스 단계 중 적어도 일부 또는 전부가 최대 실온에서, 즉 최대 25 내지 30 ℃, 예컨대 최대 25 ℃에서 수행되고, 프로세스 단계 중 소수(예컨대, 건조 및 멸균의 일부 단계)는 실온보다 훨씬 낮은 온도, 예컨대 0 ℃ 이하, 예컨대 -10 ℃, -20 ℃ 또는 -25 ℃ 이하의 온도에서 수행된다.
PLA-콜라겐 스캐폴드의 PLA 성분의 안정성은 고유 점성 또는 단량체 양의 변화에 의한 프로세싱 후에 보장될 수 있다(예컨대, 여기에서의 예 1 참조). PLA-콜라겐 스캐폴드의 전체 안정성은, 예컨대 여기에서의 예 2 및 예 3에 나타낸 바와 같은, 예컨대 생물역학적 특성화에 의해 모든 프로세싱 단계 후에 보장될 수 있다.
정의
여기에서 사용되는 “3차원 재료” 또는 “3차원 구조”는 높이, 폭 및 깊이를 갖는 임의의 재료를 일컫는다. 3차원 구조 중 일례는 스캐폴드이다. 본 발명의 3차원 재료는 바람직하게는 이식 가능하고, 생분해성이며, 생체적합성이다.
여기에서 정의되는 “생분해성 재료”는, 신체 내에 도입된 후에 용해성 무독성 부산물로 분해되기 때문에 회수 또는 추가의 조작이 필요 없는 재료이다.
여기에서 정의되는 “이식 가능한 재료”는 대상에 이식하기에 적합한 임의의 형상 또는 크기를 지닌 재료이다.
여기에서 정의되는 “생체적합성 재료”는 살아있는 조직에 무해하거나 무독성인 재료이다.
여기에서 정의되는 “로딩”, 예컨대 콜라겐의 섬유 메시로의 로딩은, 콜라겐을 섬유에 추가하거나, 섬유 메시와 접촉시켜, 콜라겐이 섬유 메시 상부에서 확인되거나, 섬유 메시에 포함되거나, 또는 섬유 메시 상부에서 확인되고 섬유 메시에 포함될 수 있거나, 섬유 메시를 콜라겐으로 함침시키는 프로세스를 의미하는 것으로 의도된다.
여기에서 사용되는 “생물역학적 강도”라는 용어는 스캐폴드가 부서지지 않고 기능을 유지하면서 생물학적 조직에 적용되는 스캐폴드의 능력 및 제조 후, 보관 중 및 적용 중에 스캐폴드의 통상적인 취급을 견디는 스캐폴드의 능력을 말하는 것으로 의도된다.
여기에서 사용되는 “기계적 강도”라는 용어는 제조 후, 저장 중 및 적용 중에 스캐폴드의 통상적인 취급을 견디는 스캐폴드의 능력을 말하는 것으로 의도된다. 이러한 맥락에서, “기계적 강도”는 이따금 “생물역학적 강도” 및 “생물역학적 기능”과 동의어로 사용된다.
본문에서, 원하는 생물역학적 특성의 개선은 i) 하나 이상의 생물역학적 파라메터 또는 생물역학적 피쳐의 증가, ii) 하나 이상의 생물역학적 파라메터 또는 생물역학적 피쳐의 감소, 또는 iii) 하나 이상의 생물역학적 파라메터 또는 생물역학적 피쳐의 무변화를 의미한다. 상기 개선은 본 발명에 따라 제조된 스캐폴드의 생물역학적 피쳐 또는 생물역학적 파라메터의 측정치를, 본 발명과 동일하지만 마지막 멸균 단계가 생략된 방법에 의해 제조된 스캐폴드의 경우와 비교하는 것에 기초한다. 원하는 개선은, 증가(또는 감소)가 1 % 이상, 2 % 이상, 3 % 이상, 4 % 이상, 5 % 이상, 6 % 이상, 7 % 이상, 8 % 이상, 9 % 이상, 또는 10 % 이상인 경우; 또는 무변화가 10 % 미만, 9 % 미만, 8 % 미만, 7 % 미만, 6 % 미만, 5 % 미만, 4 % 미만, 3 % 미만, 2 % 미만 또는 1 % 미만인 경우이다. 사용되는 데이터는 2개 이상의 측정치에 기초한 평균값이다.
본문에서, 관련 생물역학적 피쳐 또는 생물역학적 파라메터로는, 불변 모듈러스, 불변 크리프 모듈러스(즉, 크리프 조건 하에서의 불변 모듈러스), 동적 불변 모듈러스, 메모리값, 유체 이동성, 겉보기 투과성, 크리프 시의 투과성(즉, 크리프 조건 하에서의 겉보기 투과성), 동적 모듈러스(즉, 응력/스트레인 비) 및 강성(즉, 재료의 응력/스트레인 비)이 있다. 파라메터는 여기에서의 실험 섹션에서 더욱 규정된다.
본문에서, “크리프 테스트”라는 용어는 다음과 같이 설명된다: 크리프 테스트의 특성은 유사 정적(지속적으로 인가되는 응력에서 시간에 따른 스트레인의 변화)이고, 종종 재료의 점탄성 특성을 평가하고 일부 모델을 사용하여 근사화하는 데 이용된다.
여기에서 사용되는 “섬유계”라는 용어는 섬유로 형성된 재료를 말한다. 단 하나의 크기 또는 상이한 크기의 직경을 갖는 섬유가 본 발명의 방법에서 사용하기 위한 메시의 제조에 사용될 수 있다. 이러한 폴리머 섬유는 직경이 5 내지 100 ㎛, 예컨대 5 내지 75 ㎛, 5 내지 50 ㎛, 5 내지 40 ㎛, 5 내지 35 ㎛, 10 내지 75 ㎛, 10 내지 50 ㎛, 10 내지 40 ㎛, 10 내지 35 ㎛, 15 내지 75 ㎛, 15 내지 50 ㎛, 15 내지 40 ㎛, 또는 15 내지 35 ㎛의 직경을 갖는 PLA 섬유로부터 선택될 수 있다. 직경은 구조 내의 섬유들의 평균 직경이다. 섬유의 단면은 단지 라운드형으로만 제한되는 것이 아니라, 타원형, 별 모양, 직각형 또는 삼각형과 같은 임의의 다른 형상일 수도 있다.
본문에서, “다공성”은 다음과 같이 산출된다: 다공성 = 기공 체적/시편 체적 × 100 %. 또한, 다공성은, 구조의 전체적인 3D 구조를 분석할 수 있는 마이크로컴퓨터 단층 촬영(마이크로CT)에 의해 평가되는 것으로 간주된다.
본문에서, “생리활성 물질”은 생물학적 활성도 또는 약리학적 활성도를 갖는, 즉 살아있는 유기체, 조직 및/또는 세포에 영향을 주는, 예컨대 제한하는 것은 아니지만 살아있는 물질에 대해 약물이 유익한 또는 불리한 영향을 주는 물질, 화합물 및/또는 살아있는 물질이다. 약물이 복잡한 화학적 혼합물인 경우, 이러한 활성도는 물질의 활성 성분 또는 약물 분자 구조에 의해 발휘되지만, 다른 조성물에 의해 수정될 수 있다. 통상적인 예로는 항체, 효소와, 비타민, 이식편 및 세포가 있다.
본문에서, “약”이라는 용어는 언급된 값 - 10 % 내지 언급된 값 + 10 %의 범위에 대응하는 범위를 나타내는 것으로 의도된다.
섬유 및 섬유 메시를 얻기 위한 방법
PLA 폴리머의 섬유는 당업자에게 잘 알려진 다양한 방법에 의해 얻어질 수 있다. 이러한 섬유는 용융 처리 또는 전기 방사에 의해 얻어질 수 있다. 본 명세서의 예로부터 알 수 있다시피, 용융 방사는 본 발명의 방법에서 사용하기 위한 PLA 섬유를 제조하는 데 적합한 것으로 입증되었다.
용융 방사 프로세스는 폴리머의 용융 또는 폴리머를 유연한 형태로 가열하는 것을 수반한다. 따라서, 특정 폴리머의 선택에 따라, 방사 프로세스를 위한 적절한 온도가 선택된다. 통상적으로, 상기 온도는 폴리락타이드가 사용되는 경우에 약 60 내지 약 300 ℃ 범위, 예컨대 약 70 내지 약 250 ℃ 범위이다.
폴리락타이드는 L-락타이드 단량체와 D-락타이드 단량체 간의 비에 따라 비정질이나 반결정질일 수 있다. 폴리글리콜라이드는 반결정질이다. PLA는 융점 범위가 대략 170 내지 180 ℃이고, 유리 천이 온도가 대략 63 ℃인 취성 폴리머이다. P(L/D)LA의 유리 천이 온도는 대략 60 ℃이고, 반결정질 폴리(L,D-락타이드)는 대략 135 내지 170 ℃의 융점 범위를 갖는다. 비정질 폴리머는 융점을 갖지 않는다. 폴리글리콜라이드는 글리콜라이드의 개환 중합에 의해 생성된다. 폴리글리콜라이드는 대략 45 내지 55 %의 결정도를 갖는다. 폴리글리콜라이드는 고융점(~225 ℃) 및 ~35 ℃의 유리 천이 온도를 갖는다. 폴리글리콜라이드는 비교적 빨리 산성 부산물로 분해된다.
대체로, PLA의 용융 방사 프로세스는 약 60 ℃ 내지 300 ℃ 범위의 온도로 수행된다.
방사 프로세스 중에 분해를 방지하기 위해, PLA 원료는 건조되고, 보호 가스가 사용된다.
용융 방사 프로세스는, 본 발명에서 사용하기 위한 PLA 섬유 메시에 적합한 PLA 섬유를 형성한다. 방사 프로세스 동안에 PLA 재료의 약간의 변화가 일어날 수 있지만, 이러한 변화가 PLA-콜라겐 스캐폴드를 얻기 위해 결과적인 섬유 메시를 사용하는 적합성에 큰 영향을 미쳐서는 안 된다. 최종 섬유는 반결정질이다. 대체로, 최종 섬유는 PLA의 최초 단량체 양에 가까운 단량체 함량 및/또는 원료에 비해 30 %, 25 % 또는 20 % 미만의 고유 점성 감소를 갖는다. 이것은 특히, PLA 원료가 최대 2.5 dl/g의 고유 점성을 갖는 경우에 적용된다. 그러나, PLA 원료가 2.5 내지 약 5 dl/g의 고유 점성을 가지면, 최종 섬유는 약 70 % 이하, 예컨대 약 60 % 이하, 약 50 % 이하, 약 40 % 이하, 약 30 % 이하, 약 25 % 이하, 또는 약 20 % 이하만큼 고유 점성이 감소될 수 있다. 대체로, 적절한 스캐폴드는, 방사 프로세스로부터 형성된 섬유가 1.5 내지 약 5 dl/g, 예컨대 1.5 내지 4 dl/g, 또는 약 1.5 내지 약 3 dl/g 범위의 고유 점성을 갖는다. 고유 점성은 여기에서 설명한 바와 같이 실온에서 결정된다.
섬유를 얻었을 때, 섬유는 메시로 변형된다. 전술한 바와 같이, 메시는 3D 네트워크를 형성하도록 카딩(carding)될 수 있다. 카딩은, 섬유를 풀고 혼합하여 무작위로 배향된 웨브(web), 즉 카딩된 메시 또는 섬유 네트워크를 형성하는 기계적 프로세스이다. 카딩은 섬유의 스테이플의 로크(lock) 및 비조직 클럼프를 해체하여, 개별 섬유 대부분을 서로 분리되도록 정렬시킨다. 이렇게 얻어진 네크워크의 원하는 다공성을 얻기 위해, 네트워크는 니들 펀칭될 수 있으며, 니들 펀칭은, 니들의 샤프트를 따라 노치가 있는 니들을 사용하여, 니들이 섬유 메시/매트에 진입할 때에 섬유의 상부층을 잡아 이를 섬유의 내층과 꼬이게 하는 프로세스이다. 니들 펀칭은 카드로부터 꼬임 압축 3D 네트워크를 형성하여, 구조를 높은 다공성으로 유지하면서 기계적 특성을 향상시킨다.
이렇게 얻어진 섬유 메시 또는 3D 섬유 네트워크는 적어도 85 %의 다공성을 갖는다. 예시적인 다공성은 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % 및 99 %이다. 따라서, 3D 네트워크는 85 내지 99 %의 다공성을 가질 수 있다. 여기에서 정의되는 다공성, 즉 공극 비율은 재료 내 공극(즉,”비어 있는) 공간을 측정한 것이며, 총 체적에 대한 공극 체적의 비율이다. 얻어진 메시 또는 3D 네트워크는 특히 재료 전반에 걸쳐 기공 네트워크를 갖는 다공성 구조를 갖는다.
섬유 메시 또는 3D 네트워크는 원하는 형태 및/또는 크기로 절단될수 있다.
얻어진 3D 네트워크의 두께는 통상 0.1 내지 50 mm이다.
섬유 메시에 대한 콜라겐 로딩
섬유 메시 또는 3D 네트워크에 콜라겐을 로딩하기 전에, 섬유 메시 또는 3D 네트워크는 세척 절차를 거칠 수 있다. 세척 절차는 통상적으로 수성 매체, 알코올-수성 매체 또는 에탄올과 같은 알코올로 수행된다. 세척 절차는 다수 회로 수행될 수 있고, 메시 또는 3D 네트워크의 건조가 후속한다. 건조는 동결 건조 또는 실온 건조에 의해, 예컨대 클린벤치에서 수행될 수 있다. 섬유 메시 또는 3D 네트워크는 또한 의도된 용도에 적합한 크기의 조각으로 절단될 수도 있다.
얻어진 섬유 메시 또는 3D 네트워크는 콜라겐으로 로딩된다. 로딩은 주로 메시 또는 3D 네트워크의 외면 상의 로딩을 보장하도록 이루어질 수도 있고, 콜라겐을 메시 또는 3D 네트워크의 공극에 로딩하도록 수행될 수도 있다. 콜라겐은 또한 메시 또는 3D 네트워크의 섬유에 접착될 수도 있다. 콜라겐은 조합에 의해 메시 또는 3D 네트워크에 존재할 가능성이 있고, 예컨대 콜라겐은, 예컨대 접착에 의해 표면 상에 존재할 수 있으며, 콜라겐은, 예컨대 모세관력에 의해 공극에 및/또는 접착에 의해 표면에 존재할 수 있다. 콜라겐을 스캐폴드에 포함시키는 메커니즘은 주요 관심 대상은 아니지만, 본문에서 콜라겐은 메시 또는 3D 네트워크의 공극 또는 표면에 존재하는 것으로 생각된다.
통상적으로, 콜라겐의 로딩은 적절한 매체에 콜라겐을 용해 또는 분산시키는 것을 포함한다. 일반적으로, 매체는 수성 매체이다. 콜라겐을 함유하는 수성 매체의 pH 및/또는 점성은 조정될 수 있다.
적절한 매체 내의 콜라겐 농도는 약 0.1 % 내지 약 5 % w/w, 예컨대 약 0.1 % 내지 4 % w/w, 0.1 % 내지 약 3 % w/w, 약 0.1 % 약 2 % w/w이다.
메시 또는 3D 네트워크는 그 후 콜라겐 함유 매체에 침지될 수 있다. 대안으로서, 메시 또는 3D 네트워크는 용매(스캐폴드를 용해하지 않음)에 침지될 수 있고, 콜라겐의 용액/분산제가 침지된 메시 또는 3D 네트워크에 첨가된다. 콜라겐은 콜라겐 함유 매체를 메시 또는 3D 네트워크에 주입 또는 분사하는 것에 의해서도 또한 메시 또는 3D 네트워크에 로딩될 수 있다.
콜라겐 수성 매체의 pH는 프로세싱 중에 8 미만으로 유지되어야만 한다. 프로세스는 바람직하게는 실온(RT)에서 행해지지만, 45 ℃ 이하의 고온에서 행해질 수도 있다. PLA 콜라겐의 중량비는 약 95 wt% 내지 약 60 wt%의 PLA 및 40 wt% 내지 약 5 wt%의 콜라겐, 바람직하게는 약 90 wt% 내지 75 wt%의 PLA 및 25 wt% 내지 10 wt%의 콜라겐이다. 따라서, PLA와 콜라겐 간의 중량비(PLA/콜라겐)는 60/40 내지 95/5, 예컨대 70/30 내지 90/10, 75/25 내지 80/20, 또는 80/20 내지 90/10이다. 세포, 약물 등의 가능한 로딩 이전에 PLA 콜라겐의 다공성은 약 70 % 내지 99 %, 바람직하게는 약 80 % 내지 95 %이다.
여기에서 정의되는 재결합형 휴먼 콜라겐은 휴먼 콜라겐 폴리??타이드라고 하며, 이는, 예컨대 적절한 폴리뉴클레오타이드, 발현 벡터 및 호스트 세포를 사용하는 재조합 기술을 이용하는 것에 의해 형성된다. 재조합 기술은 당업자에게 잘 알려져 있으며, 예컨대 다수의 상용 재조합형 휴먼 콜라겐이 시판 중이다.
재조합형 휴먼 콜라겐의 사용은 알려진 그리고 알려지지 않은 동물 유래 병원체와 바람직하지 않은 면역 반응을 전달할 우려를 낮춘다. 게다가, 연골 재생을 위한 다른 천연 유래 재료와 달리, 재조합형 휴먼 콜라겐은 배치간 가변성(batch-to-batch variability)을 겪지 않는다. 따라서, 재조합형 휴먼 콜라겐은 우수 제조 관리 기준(GMP; Good Manufacturing Practice)으로 대량으로 균일한 품질로 제조될 수 있다.
콜라겐은 세포외 기질(ECM)에서 가장 풍부한 단백질이며, 피부와 근골격 조직의 주요 성분이다. 현재까지, 최소 28가지의 상이한 타입의 콜라겐이 확인되었다. 모든 콜라겐은, 각각 폴리프롤린 II 왼나사형의 3개의 개별 체인이 함께 코일링되어 로프형 구조를 지닌 수퍼 코일링 삼중 오른 나사형을 형성하는 삼중 나선 구조를 갖는다. 이 구조에서, 콜라겐은 특징적인 반복 시퀀스, 글리신-X-Y를 나타내며, 글리신은 삼중 나선 구조의 중심에 팩킹되기에 충분히 작은 아미노산이다. X 및 Y 위치는 임의의 아미노산일 수 있지만, X는 통상 프롤린이고 Y는 종종 하이드록시프롤린이다. 콜라겐은 그 구조 및 초분자 조직에 기초하여 상이한 그룹으로 나뉠 수 있다. 이들 그룹은 피브릴 형성 콜라겐, 피브릴 관련 콜라겐(FACIT), 네트워크 형성 콜라겐, 앵커링 피브릴, 막 관통성 콜라겐, 기저막 콜라겐 등이며, 이들은 각각 고유한 기능을 갖는다. 가장 풍부한 콜라겐 그룹은 피브릴 형성 콜라겐으로, 총 콜라겐의 약 90 %에 해당한다. I형 콜라겐은 가장 풍부하고 가장 잘 연구된 콜라겐으로, 90 %가 넘는 뼈의 유기 질량을 형성하고, 유리질 연골, 뇌 및 유리체와 같은 단지 소수의 조직만을 제외한, 힘줄, 피부, 인대, 각막 및 많은 간질 결합 조직에서 주요한 콜라겐이다. 다른 한편으로, II형 콜라겐은 유리질 연골의 특징적이고 우세한 성분이지만, 유리체, 각막 상피, 척삭, 추간판의 수핵 및 배아 상피-간엽 이행(embryonic epithelial- mesenchymal transition)에서도 또한 확인된다.
콜라겐은 높은 기계적 강도, 우수한 생체적합성, 낮은 항원성 및 콜라겐의 기계적 분해 및 수분 흡수 특성을 조절할 수 있는 교차 결합 능력을 갖고 있다. 다공성이 높은 스캐폴드로 제조될 때, 콜라겐의 교차 결합은 적절한 기계적 특성과 분해속도를 지닌 스캐폴드를 제조하기 위해 필요하다. 콜라겐은 다양한 의료 어플리케이션 및 뼈, 연골 및 피부 조직공학과 같은 광범위한 조직공학 어플리케이션에서 사용하기 위해 광범위하게 연구되어 왔다. 콜라겐을 다른 분해성 폴리머를 갖도록 수정하거나 다른 분해성 폴리머와 결합시킴으로써 생체재료로서의 콜라겐의 잠재력이 향상된다. 상업적인 양으로 순수한 형태로 쉽게 제조할 수 있는 주요 콜라겐은 I형 콜라겐이다. I형 콜라겐은 조직공학 어플리케이션을 위해 가장 널리 사용되는 콜라겐이다. 콜라겐 스캐폴드는 생분해성 합성 폴리머와 달리 성장하는 구조에 생물학적 정보를 제공하는 대안의 방식을 제공한다. 콜라겐 스캐폴드를 사용하는 동안, 조직공학 제품의 품질을 향상시키는 광범위한 세포 접착 및 다른 신호가 달성된다. 일반적으로, 동결 건조 또는 스테레오리소그래피법이 다공성 콜라겐계 스캐폴드를 제조하는 데 사용되고, 교차 결합을 위해 종종 카르보디이미드가 적용된다. 다공성 콜라겐 스캐폴드는 종종, 바이오 세라믹이나 합성 생분해성 폴리머와 같은 다른 성분과 조합된다. 콜라겐은 이미, 생체 인공 심장 판막이나 상처 드레싱과 같은 다양한 상업적 의료 제품에서 이용 가능하다. 콜라겐의 용도는 2개의 범주, 즉 천연 안정화 조직이 디바이스로서 사용되는 조직 기반 디바이스(생체 인공 심장 판막)과 콜라겐이 요소 소화 단계를 통해 용해 가능해지고, 다양한 생성물로 재구성되는 정화 콜라겐(상처 드레싱)으로 분류될 수 있다.
재조합 콜라겐은, 천연 조직이 매우 적은 콜라겐을 포함하여 모든 타입의 콜라겐을 제조할 수 있는 가능성을 지닌 고순도 무질병 운반 콜라겐을 제조하는 방법을 제공하기 때문에 등장하고 있다.
본 발명의 방법에서 사용하기 적합한 콜라겐은 동물 유래, 인간, 재조합 또는 합성 콜라겐을 포함하는 임의의 소스로부터의 콜라겐이다. 콜라겐은 I형, II형, III형, IV형, V형, VI형, IX형 또는 XI형 콜라겐일 수 있다. 이러한 콜라겐 타입의 임의의 조합도 또한 활용될 수 있다. 콜라겐은 보다 구체적으로는 I형, II형 또는 III형 콜라겐이다. 콜라겐은 또한 적어도 I형, II형 및 III형 콜라겐의 조합, 적어도 I형 및 III형 콜라겐의 조합, 적어도 I형 및 II형 콜라겐의 조합, 또는 적어도 II형 및 III형 콜라겐의 조합일 수 있다. 임의의 콜라겐은 또한 동물 유래, 재조합 또는 합성 콜라겐과 조합될 수도 있고, 콜라겐은 단독으로 또는 다른 콜라겐과 조합되어 사용될 수 있다.
여기에서 사용되는 “재조합 휴먼 콜라겐 재료”는 재조합 휴먼 콜라겐을 포함하는 임의의 재료(예컨대, 임의의 용액 또는 겔)를 일컫는다.
본 발명의 방법에서 사용되는 콜라겐은 다공성일 수 있다. 예컨대, 동결 건조는 콜라켄을 다공성 및 탄성을 갖게 하고, 이에 따라 그 목적, 예컨대 연골 세포 증식 및 연골 기질 생성을 지원하는 데 매우 적합해지게 한다. 동결 건조 콜라겐 네트워크와 같은 콜라겐은 세포 부착을 위한 우수한 미세 환경이다. 본 발명의 실시예에서, 콜라겐은 동결 건조된다. 콜라겐(예컨대, 콜라겐 용액 형태)은 이와 같이 동결 건조될 수 있다. 콜라겐 구조의 기공 크기는 20 내지 250 ㎛로 변하고, 20 내지 250 ㎛, 50 내지 250 ㎛, 30 내지 200 ㎛, 40 내지 200 ㎛, 50 내지 200 ㎛, 또는 60 내지 200 ㎛으로부터 선택될 수 있다. 또한, 콜라겐을 동결 건조 전에 겔로 변환하는 것도 가능한데, 즉 콜라겐(들)은 동결 건조 겔 형태일 수 있다.
콜라겐은 스폰지, 시트 또는 겔 형태로 조직 복구 및 재생에서 사용 가능한 스캐폴드에 사용된다. 콜라겐 스캐폴드는 기공 구조, 투과성 및 친수성과 같은 조직 재생을 가능하게 하는 올바른 특성을 갖고 있다고 생각된다. 콜라겐 스캐폴드는 3D에서 세포 접착, 강력한 세포 확산, 증식 및 분화를 지원한다.
이렇게 얻은 PLA-콜라겐 스캐폴드는 그 후 건조될 수 있다. 건조는, 선택적으로 습윤 스캐폴드를 10 h 넘게 -20 내지 -50 ℃에서 동결시키는 선행 단계를 지닌 동결 건조를 포함할 수 있다. 동결은 시편의 크기뿐만 아니라 사용되는 재료에 좌우되어, 대략 10 시간 넘게 걸린다. 동결 온도는 해당 구조 내의 발포 기공의 크기에 영향을 주고, 또한 사용되는 재료에 좌우된다. 동결 온도는 대체로 -10 ℃ 내지 -80 ℃로 변하고, 바람직하게는 -20 ℃ 내지 -50 ℃이다. 동결 건조 프로세스는 통상 동결 프로세스와 동일한 온도 범위 또는 동결 프로세스보다 낮은 온도에서 행해진다. 동결 건조 시간은 시편 크기뿐만 아니라 사용되는 재료에 좌우되며, 통상 24 시간 내지 48 시간으로 변한다.
메시 또는 3D 네트워크에 하나 이상의 콜라겐을 로딩하고 선택적으로 건조한 후에, PLA-콜라겐 스캐폴드가 얻어지며, 바람직하게는 PLA-콜라겐 스캐폴드에 콜라겐이 교차 결합된다. 교차 결합은 최종 스캐폴드의 생물역학적 강도를 증가시키고, 콜라겐 성분을 생체 내에서 보다 안정하게 하기 위해 이루어진다.
적합한 교차 결합 방법이 당업자에게 알려져 있으며, 제한하는 것은 아니지만 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드(EDC), 글루타르알데히드, 제니핀(genipin)과 같은 화학적 교차 결합제 그리고 또한 UV광이나 이들의 조합의 사용을 포함한다.
교차 결합제의 적절합 조합은 EDC이며, 바람직하게는 EDC는 NHS(N-hydroxysuccinimide)과 함께 사용된다. 교차 결합은 통상적으로 에탄올-물 용매와 같은 알코올 매체에서 수행된다. 에탄올의 함량은 통상 50 wt% 내지 99 wt%, 예컨대 60 wt% 내지 99 wt%, 70 wt% 내지 99 wt%, 80 wt% 내지 99 wt% 또는 90 wt% 내지 99 wt%이다.
교차 결합은 통상적으로 EDC 및 NHS의 사용에 의해 수행된다. EDC의 농도는 5 내지 30 mM, 예컨대 5 내지 25 mM, 10 내지 20 mM 범위, 예컨대 14 mM EDC일 수 있다. NHS의 농도는 1 내지 15 mM, 예컨대 1 내지 10 mM, 5 내지 20 mM 범위, 또는 약 6mM NHS일 수 있다.
교차 결합된 PLA-콜라겐 스캐폴드는 교차 결합 잔여물을 피하기 위해 통상적으로 물을 포함하는 수성 매체, 알코올 수성 및 또는 알코올로 대대적으로 세척된다.
그 후, 교차 결합된 PLA-콜라겐 스캐폴드가 건조된다. 건조는, 선택적으로 습윤 스캐폴드를 10 h 넘게 -20 내지 -50 ℃에서 동결시키는 선행 단계를 지닌 동결 건조를 포함할 수 있다. 동결 건조 및 동결에 관한 상세는 전술한 것과 동일하다. 온도는 최종 생성물의 기공 크기에 영향을 줄 수 있고, 이에 따라 온도가 낮을수록 기공 크기는 작아진다.
건조 PLA-콜라겐 스캐폴드의 멸균
예컨대 AC 환경에서 사용하기에 안전하고 적절히 기능하는 스캐폴드는 또한 이식 이전에 살균되어야만 한다. 가장 신뢰성 있는 이식형 의료 디바이스의 멸균 방법 중 하나는 감마선 조사이다. 감마선 조사는 매우 효율적이고, 세포 독성을 유발할 수 있는 잔여 화학물을 남기지 않는다. 그러나, 감마선 조사는 PLA와 같은 생분해성 폴리머의 특성과 콜라겐에도 또한 영향을 주는 것으로 알려져 있다. 특히, 콜라겐은 매우 높은 레벨로 조사하는 동안에 기계적 무결성의 손실을 겪을 수 있다. 콜라겐은 온도에 민감하며, 높은 온도 상승은 멸균뿐만 아니라 프로세싱 동안에 회피되어야만 한다.
PLA-콜라겐 스캐폴드는 건조 후에 멸균되어, 무균 PLA-콜라겐 스캐폴드를 형성한다. PLA, 콜라겐 또는 PLA-콜라겐 스캐폴드의 원치 않는 분해를 초래하지 않는 임의의 적절한 방법이 사용될 수 있다. 적절한 방법은 PLA-콜라겐 스캐폴드에 감마선 조사를 실시하는 것이지만, 전술한 바와 같이 콜라겐 성분의 분해를 피하기 위해 임의의 온도 상승은 방지되어야만 한다. 조사는 에너지 전달을 포함하는 프로세스이고, 이에 따라 해당 프로세스는 콜라겐과 같은 민감한 재료를 위해 온도 제어 조건 하에서 실시되어야만 한다. 온도를 낮게 유지하는 방법은 조사 프로세스 동안에 PLA-콜라겐 스캐폴드를 냉각하는 것이다. 스캐폴드는, 멸균이 수행되기 전에 통상 약 -200 ℃ 내지 약 25 ℃의 온도로 냉각된다. 이 방법에 의해, 멸균 동안에 온도는 40 도 미만으로 유지된다.
멸균 이전의 PLA-콜라겐 스캐폴드의 온도는 기본적으로 멸균 중의 PLA-콜라겐 스캐폴드의 온도 이상이다.
멸균은 통상적으로, -200 ℃ 내지 40 ℃ 범위의 온도, 예컨대 최대 30 ℃ 또는 최대 25 ℃, 또는 -100 ℃ 내지 25 ℃ 범위의 온도, 예컨대 -70 ℃, -40 ℃, 0 ℃, 10 ℃, 20 ℃ 또는 25 ℃의 온도로 실시된다.
여기에서의 예에서 나타나는 바와 같이, 감마선 조사에 의해 멸균이 이루어지는 경우에 사용되는 선량은 통상 10 kGy 내지 약 27 kGy 범위, 예컨대 15 내지 26 kGy, 16 내지 25 kGy 범위, 예컨대 18 kGy, 19 kGy, 20 kGy, 21 kGy, 22 kGy, 23 kGy, 24 kGy, 25 kGy, 26 kGy 또는 27 kGy이다.
통상, PLA-콜라겐 스캐폴드는, 멸균 프로세스 후에 스캐폴드의 무균 상태 유지를 보장하기 위해, 멸균 이전에 적절한 패키지로 팩킹된다.
멸균은 또한 본 발명의 방법의 선택적인 단계에서 이루어질 수 있다는 점을 설명해야만 한다. 이에 따라, 섬유 메시(PLA 메시)는 콜라겐으로 로딩되기 전에 멸균 처리될 수 있고, 콜라겐 자체는 PLA 섬유 메시 또는 3D 네트워크에 로딩되기 전에 멸균될 수 있다.
멸균 프로세스 채용의 주된 장점은, 최종 무균 스캐폴드가 매우 균일한 생물역학적 특성을 갖는다는 것이다. 예 3에서 알 수 있다시피, 멸균 처리되지 않고, 무균성으로 제조된 스캐폴드는 훨씬 더 다양한 생물역학적 특성을 갖는다. 규제 관점에서 볼 때, 특성에 있어서 뚜렷한 배치간 변화 없이 스캐폴드를 준비할 수 있다는 것이 주요 장점이다. 그 이유는, 생물역학적 특성이 스캐폴드가 생체 내에서 어떻게 거동하는지에 관한 지표를 제공하고, 생체내 거동을 예측하는 것, 즉 무변화 또는 단지 약간의 변화가 생체내 특성에 경미한 영향을 주는 반면, 큰 변화는 생체내 특성에 영향을 줄 수 있으며, 그러한 영향이 스캐폴드의 효과에 영향을 주는지(예컨대, 스캐폴드의 안정성, 투여 부위에 머무르는 능력, 세포 또는 생물 활성제의 방출에 관한 악영향, 바람직하지 않은 부작용 등)의 여부를 조사해야만 하기 때문이다. 따라서, 규제 승인과 관련해서도 또한 동일한 또는 거의 동일한 생물역학적 특성에 관한 엄격한 제어가 요망된다. 일반적으로, ±10 %의 특성 변화가 통상적으로 허용 가능하다.
본 명세서의 예로부터 알 수 있다시피, 본 발명에 따라 준비되는 스캐폴드는 비멸균 스캐폴드에 비해 생물역학적 특성이 향상되었다.
개선된 생물역학적 특성은 하나 이상의 생물역학적 파라메터 또는 생물역학적 피쳐, 예컨대 불변 모듈러스, 불변 크리프 모듈러스(즉, 크리프 조건 하에서의 불변 모듈러스), 동적 불변 모듈러스, 메모리값, 유체 이동성, 겉보기 투과성, 크리프 시의 투과성(즉, 크리프 조건 하에서의 겉보기 투과성), 동적 모듈러스(즉, 응력/스트레인 비) 및 강성(즉, 재료의 응력/스트레인 비)에서의 변화로서 표현될 수 있다. 원하는 변화는 i) 증가, ii) 감소, 또는 iii) 무변화일 수 있다.
일양태에서, 하나 이상의 생물역학적 파라메터 또는 생물역학적 피쳐는 습윤 조건 하에서 테스트되는 경우에는 불변 크리프 모듈러스로부터 그리고 건조 조건 하에서 테스트되는 경우에는 동적 모듈러스로부터 선택된다. 비멸균 스캐폴드와 비교하여 원하는 변화는 증가이다. 통상적으로, 증가는 1 % 이상, 2 % 이상, 3 % 이상, 4 % 이상, 5 % 이상, 6 % 이상, 7 % 이상, 8 % 이상, 9 % 이상 또는 10 % 이상이다.
일부 생물역학적 파라메터는 감소될 수 있거나, 변화하지 않는다. 상기한 파라메터는 모두가 습윤 조건 하에서 결정되는 크리프 및 동적 모듈러스에서의 투과성으로부터 선택되는 생물역학적 파라메터 또는 생물역학적 피쳐를 포함한다. 원하는 감소는 1 % 이상, 2 % 이상, 3 % 이상, 4 % 이상, 5 % 이상, 6 % 이상, 7 % 이상, 8 % 이상, 9 % 이상, 또는 10 % 이상인 반면, 무변화는 10 % 미만, 9 % 미만, 8 % 미만, 7 % 미만, 6 % 미만, 5 % 미만, 4 % 미만, 3 % 미만, 2 % 미만 또는 1 % 미만이다.
특히, 개선된 생물역학적 특성은 개선된 강성이다.
본 발명의 주요 양태에서 언급한 개별 단계에 관한 모든 상세는 본 발명의 다른 양태에 준용하여 적용되므로, 아래 단락에는 포함되지 않는다.
본 발명의 다른 양태
본 발명은 또한 멸균 PLA-콜라겐 스캐폴드의 제조 방법에 관한 것으로, 상기 방법은
a) 고체 형태의 PLA를 마련하는 단계,
b) PLA에 PLA 섬유를 얻는 프로세스를 행하는 단계,
c) 얻어진 섬유에, 섬유 메시를 얻는 프로세스를 행하는 단계,
d) PLA 섬유의 3D 네트워크를 얻기 위해 섬유 메시를 선택적으로 카딩 및/또는 니들 펀칭하는 단계,
e) 선택적으로, 섬유 메시 또는 섬유의 3D 네트워크에 1회 이상의 세척 절차를 행하는 단계,
f) 용액 또는 겔 형태의 콜라겐을 마련하는 단계,
g) PLA-콜라겐 스캐폴드를 얻기 위해, 콜라겐 용액 또는 콜라겐 겔에 단계 c) 이후에 또는 포함되는 경우에 단계 d) 또는 e) 이후에 얻어진 섬유 메시 또는 섬유의 3D 네트워크를 침지하는 단계,
h) 선택적으로, PLA-콜라겐 스캐폴드를 건조하는 단계, 및
i) 단계 g) 또는 포함되는 경우에 단계 h)에서 얻어진 PLA-콜라겐 스캐폴드를 멸균하는 단계를 포함한다.
본 발명은 또한 멸균 PLA-콜라겐 스캐폴드의 제조 방법에 관한 것으로, 상기 방법은
a) 고체 형태의 PLA를 마련하는 단계,
b) PLA에 PLA 섬유를 얻는 프로세스를 행하는 단계,
c) 얻어진 섬유에, 섬유 메시를 얻는 프로세스를 행하는 단계,
d) PLA 섬유의 3D 네트워크를 얻기 위해 섬유 메시를 카딩 및/또는 니들 펀칭하는 단계,
e) 선택적으로, 섬유 메시 또는 섬유의 3D 네트워크에 1회 이상의 세척 절차를 행하는 단계,
f) 용액 또는 겔 형태의 콜라겐을 마련하는 단계,
g) PLA-콜라겐 스캐폴드를 얻기 위해, 콜라겐 용액 또는 콜라겐 겔에 단계 d) 이후에 또는 포함되는 경우에 단계 e) 이후에 얻어진 섬유 메시 또는 섬유의 3D 네트워크를 침지하는 단계,
h) 선택적으로, PLA-콜라겐 스캐폴드를 건조하는 단계, 및
i) 단계 g) 또는 포함되는 경우에 단계 h)에서 얻어진 PLA-콜라겐 스캐폴드를 멸균하는 단계를 포함한다.
본 발명은 또한 멸균 PLA-콜라겐 스캐폴드의 제조 방법에 관한 것으로, 상기 방법은
a) 고체 형태의 PLA를 마련하는 단계,
b) PLA에 PLA 섬유를 얻는 프로세스를 행하는 단계,
c) 얻어진 섬유에, 섬유 메시를 얻는 프로세스를 행하는 단계,
d) PLA 섬유의 3D 네트워크를 얻기 위해 섬유 메시를 카딩 및/또는 니들 펀칭하는 단계,
e) 섬유의 3D 네트워크에 1회 이상의 세척 절차를 행하는 단계,
f) 용액 또는 겔 형태의 콜라겐을 마련하는 단계,
g) PLA-콜라겐 스캐폴드를 얻기 위해, 콜라겐 용액 또는 콜라겐 겔에 단계 e) 이후에 얻어진 섬유의 3D 네트워크를 침지하는 단계,
h) 선택적으로, PLA-콜라겐 스캐폴드를 건조하는 단계, 및
i) 단계 g) 또는 포함되는 경우에 단계 h)에서 얻어진 PLA-콜라겐 스캐폴드를 멸균하는 단계를 포함한다.
본 발명은 또한 멸균 PLA-콜라겐 스캐폴드의 제조 방법에 관한 것으로, 상기 방법은
a) 고체 형태의 PLA를 마련하는 단계,
b) PLA에 PLA 섬유를 얻는 프로세스를 행하는 단계,
c) 얻어진 섬유에, 섬유 메시를 얻는 프로세스를 행하는 단계,
d) PLA 섬유의 3D 네트워크를 얻기 위해 섬유 메시를 카딩 및/또는 니들 펀칭하는 단계,
e) 섬유의 3D 네트워크에 1회 이상의 세척 절차를 행하는 단계,
f) 용액 또는 겔 형태의 콜라겐을 마련하는 단계,
g) PLA-콜라겐 스캐폴드를 얻기 위해, 콜라겐 용액 또는 콜라겐 겔에 단계 e) 이후에 얻어진 섬유의 3D 네트워크를 침지하는 단계,
h) PLA-콜라겐 스캐폴드를 건조하는 단계, 및
i) 단계 h)에서 얻어진 PLA-콜라겐 스캐폴드를 멸균하는 단계를 포함한다.
본 발명의 방법에 의해 준비된 스캐폴드의 사용
본 발명에 따라 얻어진 스캐폴드는 통상적으로 인간 및 수의과 수술 치료에 사용된다. 스캐폴드는 또한 인간과 동물, 즉 반려 동물의 다른 헬스 케어 및 의료 케어와 화장품에서 사용될 수 있다.
본 발명에 따라 얻어진 스캐폴드는 관절 조인트 표면의 병변 치료, 특히 무릎과 같은 체중 지탱 조인트에서 사용될 수 있다. 이러한 병변은 영향을 받은 관절의 통증 및 잠김(locking)과 같은 증상을 나타내며, 외과적 개입을 필요로 한다. 이러한 병변은 병인이 다양하지만, 연골 손상은 외상, 골관절염(OA)과 같은 퇴행성 관절 질환 및 박리성 골연골염과 같은 발달 장애의 결과일 수 있다.
스캐폴드는 그 자체로 사용될 수도 있고, 연골 세포와 같은 조직 특이 세포, 골수로부터의 중간엽 간질 세포와 같은 체세포 또는 배아 줄기 세포, 성장 인자 또는 사이토카인과 같은 세포 성분, 혈소판 또는 혈소판 풍부 혈장과 같은 혈액 성분 및 분획, 또는 이부프로펜과 같은 항염증제와 같은 약물 물질 중 하나 이상으로 로딩되거나 이와 조합될 수도 있다. 전술한 조건 중 가장 중요한 것은 병변 필터로서 본 발명의 스캐폴드를 사용하는 것이고 두번째로 중요한 것은 잠재적인 첨가제를 포함하는 것이다.
본 발명에 따라 얻어진 스캐폴드는 미용 성형수술, 예컨대 얼굴 개선의 피부 필러로서 사용될 수 있다.
스캐폴드는 통상 신체 내에 외과적으로 전달되는데, 즉 이식된다. 스캐폴드는 연골 또는 골연골 병변에서 사용될 수 있다. 연골 관련 상태와 관련하여, 스캐폴드는 괴사 조직이 제거된 병변 부위에 이식된다. 스캐폴드는 재흡수성 봉합사 또는 피브린 접착제에 의해 병변 부위에 고정될 수 있다.
도 1은 습윤 조건의 크리프 테스트에서 얻은 불변 모듈러스 (a) 메모리값 (b) 및 투과성을 보여준다(예 3).
도 2는 습윤 조건의 동적 스트레인 스위프 테스트에 있어서의 동적 기울기 모듈러스 (a) 및 정적 기울기 모듈러스 (b)를 보여준다(예 3).
도 3은 건조 조건에서의 동적 모듈러스 대 테스트 온도를 보여준다. 알 수 있다시피, 모듈러스값에 대한 온도의 영향은 없지만, 비멸균 샘플과 멸균 샘플 간에는 통계적으로 유의미한(p=0.00) 차이가 있다(예 3).
본 발명은 아래의 비제한적인 예에서 더욱 설명된다.
도 2는 습윤 조건의 동적 스트레인 스위프 테스트에 있어서의 동적 기울기 모듈러스 (a) 및 정적 기울기 모듈러스 (b)를 보여준다(예 3).
도 3은 건조 조건에서의 동적 모듈러스 대 테스트 온도를 보여준다. 알 수 있다시피, 모듈러스값에 대한 온도의 영향은 없지만, 비멸균 샘플과 멸균 샘플 간에는 통계적으로 유의미한(p=0.00) 차이가 있다(예 3).
본 발명은 아래의 비제한적인 예에서 더욱 설명된다.
예
예 1
폴리락타이드 섬유 및 콜라겐을 사용하는, 의료 용도를 위한 멸균 스캐폴드 제조 방법은, 스캐폴드를 얻기 위해 동결 건조에 의해 해당 구조를 건조하는 단게 및 멸균되고 안정화된 PLA-콜라겐 스캐폴드, 즉 rhCo-PLA를 얻기 위해 스캐폴드를 멸균하는 단계를 포함한다. 이 예에서는, PLA 성분이 처리 방법에 의해 악영향을 받지 않는다는 점이 증명된다.
스캐폴드는 다음과 같이 제조되었다. PLA 성분, 고유 점성이 1.8 dl/g 내지 2.2 dl/g 범위인 의료 등급 폴리(L/D)락타이드 96/4[네덜란드 호린험 소재 Corbion, Purac Biochem bv사(社)] 및 그 양이 0.1 % 미만인 잔부 단량체를 사용하여 용융 방사에 의해 얇은 섬유를 제조하였다. 용융 방사 전, PLA 원료를 진공 오븐에서 건조하였다. 섬유의 용융 프로세싱은 70 내지 240 ℃의 온도 범위 내의 보호 분위기 하에서 용융 방사를 이용하여 행하였다. 방사 장비는 마이크로 압출기 및 고속 방사기로 구성된다. 섬유를 스테이플 섬유로 전달하고 메시로 카딩하였다. 카딩된 PLA 메시를 니들 펀칭함으로써 PLA 펠트를 제조하였다. PLA 펠트를 세척하고, 클린벤치에서 건조한 후, 클린룸 환경에 배치하기 전에 팩킹하였다. 염기성 완충액을 사용하여 콜라겐 용액의 pH를 7로 증가시키는 것에 의해 재조합 III형 휴먼 콜라겐(미국 캘리포니아 소재 FibroGen Ltd.사) 피브릴 형성을 행하였다. 콜라겐 겔을 형성한 후, PLA 펠트를 콜라겐 겔로 완전히 침지시키고 샘플 몰드에 배치하였다. 그 후, 이러한 구조를 동결 건조하여 완전 건조된 구조, 즉 rhCo-PLA 스캐폴드를 달성하였다. 제조된 스캐폴드를 실온에서, 14 mM의 EDC(N-[3-디메틸아미노프로필]-N'-에틸카르보디이미드 하이드로클로라이드, 핀란드 헬싱키 소재 Sigma-Aldrich사 제조) 및 6 mM의 NHS(N-하이드록시석신이미드, 핀란드 헬싱키 소재 Sigma-Aldrich사 제조)를 첨가한 95 % 에탄올 용액과 교차 결합시켰다. 그 후, 멸균화 동안에 온도 상승을 피하기 위해, 제조된 rhCo-PLA 스캐폴드를 세척하고, 동결 건조하며, 멸균화하기 전에 감마선 조사 ≤25 kGy에 의해 그리고 드라이아이스 하에서 팩킹하였다.
제조된 rhCo-PLA에 대해서, 아래의 연구를 수행하였다. L-락타이드의 단량체 양 측정은 하한이 0.01 wt%인 GC-MS 기술(핀란드 락티 소재 Rambol Analytics사)로 행하였고, 고유 점성(i.v.)는 Lauda PVS 점성계(독일 쾨니히쇼펜 소재 Lauda DR. R. Wobster GmbH, KG)를 사용하여 측정하였다. 폴리머를 1 mg/ml의 클로로포름에 용해시켜 샘플을 준비하였다. Ubbelohde 모세관 점성계 유형 0c(독일 마인즈 소재 Schott-Gerate사)를 사용하여 점성을 결정하였다.
이러한 제조 방법에 의해 표 1에서 볼 수 있는 아래의 피쳐를 지닌 폴리락타이드 섬유 및 콜라겐을 지닌 의료 용도를 위한 멸균 스캐폴드, rhCo-PLA를 얻었다.
PLA 성분의 잔여 단량체 양은, 단량체 양이 0.1 wt% 미만 - 이는 원료 단량체 양과 동일함 - 으로 유지되기 때문에 눈에 띄게 변하지 않는다. 사용되는 PLA 처리 온도와 멸균은 압출 PLA의 고유 점성을 광범위하게 변경하지 않았으며, 이 실험에서 허용 가능한 감소는 약 50 %였다.
예 2
폴리락타이드 섬유 및 콜라겐을 지닌 의료 용도를 위한 멸균 스캐폴드는, 스캐폴드를 얻기 위해 동결 건조에 의해 해당 구조를 건조하는 단계 및 멸균된 PLA-콜라겐 스캐폴드를 얻기 위해 스캐폴드를 멸균하는 단계에 의해 제조되었다. 예 1에 설명한 바와 같은 rhCo-PLA 스캐폴드를 감마선 조사에 의해 멸균시키고, 특히 콜라겐 성분에 대한 멸균 효과를 평가하였다. 또한, (드라이아이스 하에서) 멸균 효과를 나타내는 상이한 감사선 조사선량을 rhCo-PLA에 대해 사용하였다.
미국 특허 제10379106호 B2에 상세히 설명된 절차에 따라 데이터 분석을 실시하였다. 이러한 분석은 적용된 하중(응력) 및 변형(스트레인)의 데이터로부터 정적 조건 및 동적 조건 각각에서의 점성 강성 및 메모리값과 같은 불변 데이터의 추출을 포함한다. 본 명세서에서는, 아래의 정의가 사용된다:
“불변 모듈러스”는 시간 또는 주파수에 종속되지 않고, 재료 거동(예컨대, 실체값)의 예측에 사용 가능한 고유 탄성 계수값이다.
“동적 불변 모듈러스”는 동적 실제(대수) 스트레인 크기에 대한 동적 응력 크기의 비율로 실제 대수(비복소 대수)로 표현된다[통상적으로 사용되는 실제(저장) 및 가상(손실) 모듈러스 정의와는 상이함].
“메모리값”은 0 내지 1의 범위의 값을 갖는 시편의 시간 불변 특성으로, 재료 자체가 유체가 아닌 경우에도 재료의 점성 경향을 나타낸다. 메모리값은 이론적으로 예측되지 않으며, 항시 실험으로부터 결정되어야만 한다. 본 발명에서, 메모리값은 정적 (크리프) 조건 및 동적 조건에 대해 개별적으로 실험적으로 측정되었는데, 그 이유는 정적 조건과 동적 조건에서 메모리값이 상이한 것으로 확인되었기 때문이다.
“유체 이동성”은 확산계수(동일한 단위인 mm2/s를 사용함 )와 유사한 다공체 내부에서의 유체 이동 속도의 측정치(계수)이다. 그러나, 그 특성은 확산계수와 상이한데, 그 이유는 유체의 이동은 확산뿐만 아니라 대류 부분 및 모멘텀 이동으로 인해서 이루어지기 때문이다. 유체 이동성은 유체가 소정 조건 하에서 내부로 얼마나 잘 흐를 수 있는지를 나타낸다.
“겉보기 투과성”은, 유체가 그 다공성 네트워크를 통과하게 하는 다공체의 능력을 말하며, 단위 넓이(m2)로 측정된다. 겉보기 투과성은 다공성 구조를 통해 유체를 수송하기 위한 재료의 정량화된 토폴로지 용량이며, 재료 구조에만 좌우되고 유체 특성에는 좌우되지 않는다. 여기에서, 겉보기 투과성은 달시 법칙(Darcy law)에 의해 통상적으로 정의된 투과성과는 상이한데, 그 이유는 후자가 재료 시편에 걸친 유체 압력 구배의 증가를 필요로 하기 때문이다. 그러나 미국 특허 제10,379,106호 B2에서 알 수 있다시피, 여기에서도 적용되는 방법은 유체 압력 구배에 관한 지식 없이도 투과성의 측정을 허용하며, 이들 방법을 구별하기 위해 “겉보기 투과성”이라는 용어가 사용된다(밀리달시로 표시됨; 1 mDarcy = 10-15 m2).
무균 생산된 rhCo-PLA (rhCo-PLA-A)에 대해 제1 테스트를 행하였으며, 이는 조사선량이 ≥25 kGy인 표준 조사선량으로 멸균된 rhCo-PLA와 비교되었다. 해당 프로세스에서, 실제 조사선량은 29 kGy인 것으로 측정되었다(rhCo-PLA-S). 무균 생산된 rhCo-PLA(rhCo-PLA-A)는 감마선 조사된 PLA 성분(≥25 kGy의 조사선량으로 멸균됨)을 갖지만, 멸균 후, 무균 환경에서 콜라겐 성분의 첨가가 이루어졌으며, 즉 콜라겐 성분 자체는 조사되지 않았다. 따라서, PLA 섬유 성분은 동일한 특성과 전체적인 생물역학적 성능에 대한 기여도를 가져야만 하며, 그 차이는 주로 콜라겐과 그 처리의 효과로 인한 것이다.
후속하여, 동적 기계식 분석기 DMA242E(독일 셀브 소재 Netzsch Geratebau GmbH사)의 표준 압축 샘플 홀더(15 mm 직경)에서 동적 기계식 분석(DMA)를 이용하는 생물역학적 테스트 절차로 제조된 스캐폴드를 테스트하였다.
스캐폴드의 일부에는 0.2 N의 응력의 일정한 힘으로 크리프 테스트를 행하였고, 다른 부분에는 1 Hz의 주파수에서 5 내지 50 ㎛ 범위의 스트레인을 야기하는 진동력을 가하였다(스트레인-스위프법). 간단히 말해서, 프로브가 시편과 접촉하게 하고 오프셋을 테어링(taring)한 후, 매체에 침지되는 시편의 시작 높이를 다시 측정하여 실제 스트레인 계산을 위한 시작 높이로서 더욱 사용하였다.
모든 경우, 스캐폴드를 실온의 수중에 완전히 침지하고 측정 이전에 15분간 평형시켜 테스트하였다. 모든 견본은 이에 따라 완전히 함침되었으며, 기포나 건조 영역이 관찰되지 않았다. 테스트된 스캐폴드의 단면적은 20 내지 26 mm2이었다. 모든 테스트는 최대 300분 동안(치수 변화가 일정한 값에 도달할 때까지, 즉 변위 분해능 ±0.0005 ㎛) 행하였다. 이들 데이터를 저장하여 ASCII 텍스트 파일로서 데이터 처리 소프트웨어로 전송하였다(맞춤형 코드로 보완된 마이크로 엑셀) 주요 데이터를 응력 및 실제 스트레인과 실험 시간에 대한 스트레인 대 응력의 비로 변환하였다. 그 후, 시간 컨볼루션(time convolution)의 수치 알고리즘을 적용하여 가공된 데이터를 미국 특허 제10,379,106호 B2에 상술된 수학적 방법으로 행별로 쌍으로 비국부적으로 통합하였다.
이러한 실험 결과를 표 2에 나타낸다.
표 2는, 선량이 ≥25 kGy인 감마선 조사의 표준 절차에 의한 멸균이 rhCo-PLA 스캐폴드의 생물역학적 특성에 다음과 같이 영향을 준다는 것을 나타낸다.
· 크리프 테스트에서, 29 kGy의 멸균 선량에 의해 rhCo-PLA-S 스캐폴드는 조사 후에 급격히 떨어지는 불변 모듈러스의 감소(-22 %)를 겪었다. 메모리값도 또한 감소되었으며(-43 %), 이는 rhCo-PLA 스캐폴드가 멸균 후에 탄성이 더 많아졌음을 나타낸다. 멸균된 rhCo-PLA 스캐폴드의 유효 유체 이동성 및 겉보기 투과성의 감소(거의 2배)는 스캐폴드 내부의 유체 이동성이 더 적은 상태를 나타내고, 따라서 조사된 스캐폴드 구조는 유체에 대한 투과성이 더 낮아진다. 이러한 변화는 바람직하지 않으며, rhCo-PLA-S의 이러한 열등한 생물역학적 특성은 허용 불가하다. 크리프 테스트에 있어서, 이러한 멸균법은 이에 따라 rhCo-PLA 스캐폴드의 생물역학적 특징에 큰 영향을 미쳐, 의도한 어플리케이션을 위한 그 용도를 보장하는 것이 불가능해지는 것으로 확인되었다.
· 스트레인 스위프 테스트에서, 동적 불변 모듈러스는 증가하였으며(+33 %), 이는 rhCo-PLA-S 스캐폴드가 멸균 후에 더 강성으로 되었음을 나타내는데, 이로 인해 주변 조직의 동적 스트레인에 순응하는 능력이 저하되었다.
제2 단계는 rhCo-PLA 스캐폴드에 대한 보다 정확한 감마선 조사선량의 영향을 평가하는 것이었다. 표준 ≥25 kGy 하에서 rhCo-PLA 스캐폴드에 대한 상이한 감마선 조사선량을 비교하는 연구를 행하였다. 따라서, 다음 선량으로 rhCo-PLA 스캐폴드를 위한 낮은 감마선 조사선량에 의해 멸균을 실시하였다: 18 kGy(G18), 20 kGy(G20), 22kGy(G22), 및 25 kGy(G25). 비멸균 rhCo-PLA 스캐폴드(GO)를 기준으로서 이용하였다.
전술한 바와 같이, 동일한 동적 기계식 분석기 DMA242E(독일 셀브 소재 Netzsch Geratebau GmbH사)를 사용하는 동적 기계식 분석을 이용하여, 제조된 스캐폴드를 테스트하였다. 스캐폴드는 전술한 것과 유사하게 0.2 N의 일정한 힘을 받는 상태로 크리프 테스트를 받았다. 모든 경우, 스캐폴드를 실온의 수중에 완전히 침지하고 측정 이전에 15분간 평형시켜 테스트하였다. 테스트된 스캐폴드의 단면적은 37 내지 46 mm2이었다.
이러한 상이한 낮은 감사선 조사선량에 의한 rhCo-PLA 스캐폴드에 대한 생물역학적 테스트 결과를 표 3에 나타낸다. 해당 결과는, ≤25 kGy의 이러한 상이한 양의 감마선 조사가 rhCo-PLA 스캐폴드의 생물역학에 현저한 변화를 일으키지 않는다는 것을 나타낸다(이것은, 예컨대 GO 샘플의 불변 모듈러스값과 메모리값이 멸균된 샘플 G18-G25에 대해 측정된 한계 내에 있는 것으로부터 알 수 있다).
예 3
폴리락타이드 섬유 및 콜라겐을 지닌 의료 용도를 위한 멸균 스캐폴드는, 스캐폴드를 얻기 위해 동결 건조에 의해 해당 구조를 건조하는 단계 및 멸균된 PLA-콜라겐 스캐폴드를 얻기 위해 스캐폴드를 멸균하는 단계에 의해 제조되었다.
RT(S-RT) 또는 저온(-70 ℃)(S-LT)에서 감마선 조사에 의해 예 1에서 설명한 rhCo-PLA 스캐폴드를 멸균하고, 멸균 효과를 평가하여 비멸균 스캐폴드(NS)와 비교하였다. 이 테스트에서, 일반적으로 동일한 예상 선량(25 kGy) 하에서 상이한 멸균 방법에 의해 가능한 스캐폴드의 생물역학적 특성의 변화를 증명하였고, 멸균 동안의 저온이 생물역학적 특성에 영향을 주는지를 확인하였다. 아래에서 설명하겠지만 습윤 샘플뿐만 아니라 건조 샘플에 대해서도 생물역학적 테스트를 행하였다.
60 ℃까지의 건조 조건에서 그리고 압축 모드에서 25 ℃의 습윤 조건에서 생물역학적 분석이 이루어졌다. 동적 기계식 분석기 DMA242E(독일 셀브 소재 Netzsch Geratebau GmbH사)의 표준 압축 샘플 홀더(15 mm 직경)에서 동적 기계식 분석을 이용하여, 생물역학적 테스트 절차로 제조된 스캐폴드를 테스트하였다. 스캐폴드의 일부는 0.2 N의 일정한 힘을 받는 상태로 크리프 테스트를 받았고, 다른 부분은 1 Hz의 주파수에서 5 내지 25 ㎛ 진폭 범위로 스트레인 스위프 테스트를 받았다. 후자의 경우, 하중 사이클은 예 2와 유사하게 10회 반복되었다.
스캐폴드를 25 ℃의 수중에 완전히 침지하고 측정 이전에 15분간 평형시켜 테스트하였다. 모든 견본은 이에 따라 완전히 함침되었으며, 기포나 건조 영역이 관찰되지 않았다. 기계적 특성의 열안정성을 평가하기 위한 목적으로, 건조 조건(공기)에 있어서 1 Hz 및 25 ㎛ 진폭 하에서 2 K/min의 속도로 60 ℃까지 가열하여, 건조 시편 세트를 추가로 테스트하였다.
테스트된 스캐폴드의 단면적은 30 내지 40 mm2이었다. 데이터 분석은, 정적 조건 및 동적 조건 각각에서 점성 강성 및 메모리값과 같은 불변 데이터를 추출하는 것을 목표로 하는 미국 특허 제10379106호 B2에 설명된 절차에 따라 이루어졌으며, 데이터는 도 1 내지 도 3에 도시되어 있다. 반복적인 동적 하중 하에서 모든 시편은 모든 하중 시퀀스 사이클마다 점진적으로 수축한다는 점을 언급하는 것은 주목할 만하다. 따라서, 동적 응력/스트레인 비율의 적분(기울기)값(“표준 동적 모듈러스”)과 1 Hz에서의 관련 정적 응력/스트레인 비(“표준 정적 모듈러스”)가 모든 하중 사이클을 커버하는 값을 나타내도록 추출되었다.
도 1에서 볼 수 있다시피, 크리프 테스트에서는 일부 샘플 타입 간에는 현저한 차이가 있지만 나머지는 별차이가 없다(에러 바 - 습윤 조건에서의 표준편차) 예컨대, S-RT 샘플은 크리프에서 S-LT 샘플에 비해 낮은 모듈러스와 높은 투과성을 갖는다. 따라서, 멸균 절차 동안에 온도 제어(낮은 온도)의 영향이 있다.
습윤 조건(평균값)
1 Hz, 25 ℃에서의 동적 습윤 조건에서는, 샘플(NS, S-RT 및 S-LT) 간에 동적 응력/스트레인 비와 정적 응력/스트레인 비의 현저한 차이가 없다.
놀랍게도, 60 ℃까지 온도가 상승하는 1 Hz의 동적 건조 조건에서는, 동적 응력/스트레인 비와 정적 응력/스트레인 비에 있어서 샘플들 간에 현저한 차이, p=0.00가 있으며(신뢰구간이 95 %인 경우, 값 p<0.05는 양측 순열 t-테스트에 있어서 유의미함), 이는 S-RT 및 S-LT 스캐폴드가 멸균 프로세스 이후에 더 강성이 됨을 나타낸다(도 3). RT(S-RT) 또는 저온(S-LT)에서, 비멸균 샘플(NS)과 멸균 샘플(S-RT & S-LT) 간에는 이러한 차이가 있지만 멸균된 샘플들 간에는 이러한 차이가 없다. 동적 테스트 중에 온도 변화는 60 ℃까지는 특성에 영향을 주지 않는다. 또한, 60 ℃까지는 테스트 온도가 샘플 강성(즉, 재료의 응력/스트레인 비)에 영향을 주지 않는 것으로 보이며, 따라서 관찰된 차이는 주로 멸균 프로세스로 인한 것이고, 상이한 온도, 즉 실온(S-RT) 또는 저온(S-LT)은 이러한 샘플의 특성에 영향을 주지 않는 것으로 결론지을 수 있다.
이러한 결과는, 멸균[RT 또는 저온(LT)]이 일반적으로 스캐폴드 특성을 안정화한다는 것을 나타내며, 이는 건조 상태의 이들 테스트에서만 명확히 볼 수 있다.
도 3 및 표 5에서 알 수 있다시피, 모듈러스값에 대한 온도의 영향은 없지만, 비멸균 스캐폴드와 멸균 스캐폴드 간에는 통계적으로 유의미한(p=0.00) 차이가 있다.
건조 조건(평균값)
일반적으로, 멸균은 스캐폴드의 재료 특성에 악영향을 주는 것으로 생각되었지만, 이 경우에 멸균은 예상치 못한 결과를 초래하였는데, 즉 감마선 조사는 스캐폴드의 생물역학적 특성을 안정화하는 긍정적인 영향을 갖는 것으로 보인다.
요약하자면, 이 예 3은 비멸균 재료에 비해 재료에 대한 멸균 절차의 아래의 효과를 증명한다(이에 따라, 변화는 불량 - 특성의 변화가 바람직하지 않음, 양호 - 중립적인 효과, 통계적으로 유의미한 차이가 없음, 또는 우수 - 특성의 변화가 바람직함 중 어느 하나임).
전술한 바와 같이, 원하는 개선은 i) 하나 이상의 생물역학적 파라메터 또는 생물역학적 피쳐의 증가, ii) 하나 이상의 생물역학적 파라메터 또는 생물역학적 피쳐의 감소, 또는 iii) 하나 이상의 생물역학적 파라메터 또는 생물역학적 피쳐의 무변화를 의미한다.
위의 표로부터 알 수 있다시피, 다음 생물역학적 파라메터, 즉 불변 크리프 모듈러스(습윤 조건), 동적 모듈러스(건조 조건) 및 동적 모듈러스 대 온도(건조 조건)에 대해서는 증가가 바람직한 반면, 다음 생물역학적 파라메터, 즉 크리프에 있어서의 투과성(습윤 조건) 및 동적 모듈러스(습윤 조건)에 대해서는 감소 또는 무변화가 바람직하다.
전술한 바와 같이, 바람직한 개선은, 증가(또는 감소)가 1 % 이상, 2 % 이상, 3 % 이상, 4 % 이상, 5 % 이상, 6 % 이상, 7 % 이상, 8 % 이상, 9 % 이상, 또는 10 % 이상인 경우; 또는 무변화가 10 % 미만, 9 % 미만, 8 % 미만, 7 % 미만, 6 % 미만, 5 % 미만, 4 % 미만, 3 % 미만, 2 % 미만 또는 1 % 미만인 경우이다.
따라서, RT 또는 저온(LT)에서의 감마선 조사의 멸균 절차는 건조 상태와 습윤 상태 모두에서 역학적으로 보다 안정한 구조를 달성하는, 이러한 유형의 스캐폴드를 위한 긍정적인 단계인 것으로 추정할 수 있다. 또한, 저온에서의 멸균은 습윤 크리프 조건에서 특별히 나타나는 RT에서의 멸균에 비해 바람직한 결과를 얻는다.
예 1에서 설명한 rhCo-PLA 스캐폴드는 감마선 멸균 조건(선량 및 온도 제어)에 대해 예기치 않은 반응성, 예컨대 개선된 생물역학적 안정성을 가져, 기계역학적 특성의 보다 정밀한 제어와 재료 대 임상적 요구에 관해서 필요한 최적화를 가능하게 한다는 것도 또한 확인되었다. 이러한 효과는, 일반적으로 조사가 많은 유기 물질과 폴리머를 약화시키거나 심지어는 파괴하는 것으로 알려져 있기 때문에 예상치 못한 것이었다.
Claims (24)
- 의료 용도를 위한 멸균 스캐폴드(scaffold)의 제조 방법으로서,
i) PLA-콜라겐 스캐폴드를 얻기 위해, 폴리락타이드 폴리머 또는 코폴리머(통상적으로 PLA로 표기함)의 섬유를 포함하는 섬유 메시에 콜라겐을 로딩하는 단계,
ii) 단계 i)에서 얻은 PLA-콜라겐 스캐폴드를 건조하는 단계, 및
iii) 멸균 스캐폴드를 얻기 위해, 건조 단계 ii)에서 얻은 PLA-콜라겐 스캐폴드를 멸균하는 단계
를 포함하는 멸균 스캐폴드의 제조 방법. - 제1항에 있어서, 얻어진 멸균 스캐폴드는 비멸균 스캐폴드에 비해 개선된 생물역학적 특성을 갖는 것인 멸균 스캐폴드의 제조 방법.
- 제2항에 있어서, 개선된 생물역학적 특성은 하나 이상의 생물역학적 파라메터 또는 생물역학적 피쳐(feature)에서의 증가로서 나타나는 것인 멸균 스캐폴드의 제조 방법.
- 제3항에 있어서, 하나 이상의 생물역학적 파라메터 또는 생물역학적 피쳐는 습윤 조건 하에서 테스트되는 경우에는 불변 크리프 모듈러스로부터 그리고 건조 조건 하에서 테스트되는 경우에는 동적 모듈러스로부터 선택되는 것인 멸균 스캐폴드의 제조 방법.
- 제2항에 있어서, 개선된 생물역학적 특성은 하나 이상의 생물역학적 파라메터 또는 생물역학적 피쳐에서의 감소 또는 무변화로서 나타나는 것인 멸균 스캐폴드의 제조 방법.
- 제5항에 있어서, 생물역학적 파라메터 또는 생물역학적 피쳐는 모두 습윤 조건 하에서 테스트되는 크리프에서의 투과성 및 동적 모듈러스로부터 선택되는 것인 멸균 스캐폴드의 제조 방법.
- 제3항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 증가 또는 감소는 1 % 이상, 2 % 이상, 3 % 이상, 4 % 이상, 5 % 이상, 6 % 이상, 7 % 이상, 8 % 이상, 9 % 이상 또는 10 % 이상인 것인 멸균 스캐폴드의 제조 방법.
- 제5항 또는 제6항에 있어서, 무변화는 10 % 미만, 9 % 미만, 8 % 미만, 7 % 미만, 6 % 미만, 5 % 미만, 4 % 미만, 3 % 미만, 2 % 미만 또는 1 % 미만인 것인 멸균 스캐폴드의 제조 방법.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 개선된 생물역학적 특성은 강성인 것인 멸균 스캐폴드의 제조 방법.
- 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 멸균 이전의 PLA-콜라겐 스캐폴드의 온도는 기본적으로 멸균 중의 PLA-콜라겐 스캐폴드의 온도 이상인 것인 멸균 스캐폴드의 제조 방법.
- 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 멸균은 -200 ℃ 내지 40 ℃의 온도에서 실행되는 것인 멸균 스캐폴드의 제조 방법.
- 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 멸균은 감마선 조사(照射)에 의해 수행되는 것인 멸균 스캐폴드의 제조 방법.
- 제12항에 있어서, 감마선 조사선량은 최대 25 kGy인 것인 멸균 스캐폴드의 제조 방법.
- 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 i)에서의 로딩은 콜라겐 겔에 의해 수행되는 것인 멸균 스캐폴드의 제조 방법.
- 제14항에 있어서, 상기 겔에서의 콜라겐의 농도는 약 0.1 % 내지 2.0 % w/w인 것인 멸균 스캐폴드의 제조 방법.
- 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 i)에서 얻어진 스캐폴드는 5 내지 25 % w/w의 콜라겐을 함유하고, 이 퍼센티지는 PLA와 콜라겐의 총량을 기초로 하는 것인 멸균 스캐폴드의 제조 방법.
- 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 콜라겐은 재조합 콜라겐, 조직 유래 콜라겐 또는 이들의 조합인 것인 멸균 스캐폴드의 제조 방법.
- 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, PLA 섬유를 포함하고 제1항의 단계 i)에서 사용되는 메시는
i) 고체 형태의 PLA를 마련하는 것,
ii) PLA에, PLA 섬유를 얻는 프로세스를 행하는 것, 및
iii) 얻어진 섬유에, 섬유 메시를 얻는 프로세스를 행하는 것에 의해 얻어지는 것인 멸균 스캐폴드의 제조 방법. - 제18항에 있어서, 단계 ii)는 전기 방사 또는 용융 방사와 같은 방사에 의해 수행되는 것인 멸균 스캐폴드의 제조 방법.
- 제18항 또는 제19항에 있어서, 제18항의 단계 iii)에서의 메시는 3D 네트워크를 얻기 위해 카딩(carding) 또는 니들 펀칭(needle punching)을 포함하는 프로세스로 처리되는 것인 멸균 스캐폴드의 제조 방법.
- 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, PLA는 폴리락타이드인 것인 멸균 스캐폴드의 제조 방법.
- 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 멸균 전에 추가의 교차 결합 단계를 수행하는 것인 멸균 스캐폴드의 제조 방법.
- 제22항에 있어서, PLA-콜라겐 내의 콜라겐은 교차 결합되는 것인 멸균 스캐폴드의 제조 방법.
- 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 얻을 수 있는 스캐폴드.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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