KR20230001825A - 뇌질환 치료제 스크리닝 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 뇌질환 치료제 스크리닝 방법에 관한 것이다. 구체적으로, 알츠하이머 질환의 치료 효과가 있는 것으로 알려진 Rg3가 미세아교세포 또는 신경모세포종에서 M2 분극화를 촉진하고, M1 분극화를 억제하면서, NF-κB 신호전달기전을 촉진하고, SRA 단백질의 발현을 증가시킴으로써 Aβ의 축적을 억제하며, ADAM10 단백질의 발현을 증가시켜 수용성 APPα 생성 및 Aβ42 생성억제를 통해 신경세포에서 수용성 APPα 프로세싱을 억제하는 것에 기초한, 본 발명에 따른 스크리닝 방법은 뇌질환 치료제의 스크리닝에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

뇌질환 치료제 스크리닝 방법{SCREENING METHOD OF THERAPEUTIC AGENT FOR BRAIN DISEASES}
본 발명은 뇌질환 치료제 스크리닝 방법에 관한 것이다.
퇴행성 뇌질환은 노화와 함께 발생하는 퇴행성 질환 중 뇌에서 발생하는 질환을 의미하며 혈관성 치매, 알츠하이머병, 파킨슨병, 루이체 치매 및 전측두엽 치매 등을 포함한다. 특히, 알츠하이머병과 루이체 치매는 전체 치매환자의 90%를 차지하고 있으나, 많은 연구 및 개발이 지속되고 있음에도 불구하고 행동, 인지 및 기억력 개선과 같은 증상 개선을 돕는 약물만이 치료에 사용되고 있다. 따라서, 최근까지 세계적으로 그 치료제의 개발이 활발히 진행되고 있으나 가시적인 성과가 없다. 특히, 퇴행성 뇌질환의 공통 병리 현상은 중추신경세포의 사멸인데, 다른 기관의 세포들과는 달리 중추신경세포는 일단 세포가 사멸되면 재생이 거의 불가능해 영구적인 기능손실을 초래한다.
최근에 대형 제약사에서 개발된 베타아밀로이드 억제제 등의 임상시험이 모두 실패로 돌아가면서 베타아밀로이드 대신 콜린성(cholinergic) 가설이 대두되고 있다. 일반적으로 알츠하이머병은 뇌 신경세포 밖에 베타아밀로이드가 침착된 아밀로이드 플라그(plaque)와 신경세포 내 과인산화된(hyperphosphorylated) 타우(tau) 단백질의 축적을 병리적 특징으로 가지며, 이들이 원인이 되어 인지기능 저하 및 뇌신경 세포의 사멸을 초래하는 것으로 알려졌다. 이외에도 퇴행성 뇌질환의 치료제 개발을 위한 다양한 가설이 연구되고 있다.
이와 관련하여, 대한민국 등록특허 제10-2049199호는 신경세포사멸을 유도한다고 보고된 FAF1 단백질이 엑소좀에 포함된 형태로 엑소사이토시스(exocytosis)를 통해 분비되어 다른 세포의 사멸을 유도할 수 있어, FAF1 단백질의 세포외 분비를 억제하는 물질을 퇴행성 뇌질환의 치료제로서 스크리닝 하는 방법을 개시하고 있다.
대한민국 등록특허 제10-2049199호
본 발명의 목적은 뇌질환 치료제 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 신경세포 및 신경아교세포로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 세포에 후보물질을 처리하고 M2 분극화를 촉진하는 물질을 선별하는 단계를 포함하는 뇌질환 치료제 스크리닝 방법을 제공한다.
알츠하이머 질환의 치료 효과가 있는 것으로 알려진 Rg3가 미세아교세포 또는 신경모세포종에서 M2 분극화를 촉진하고, M1 분극화를 억제하면서, NF-κB 신호전달기전을 촉진하고, SRA 단백질의 발현을 증가시킴으로써 Aβ의 축적을 억제하며, ADAM10 단백질의 발현을 증가시켜 수용성 APPα 생성 및 Aβ42 생성억제를 통해 신경세포에서 수용성 APPα 프로세싱을 억제하는 것에 기초한, 본 발명에 따른 스크리닝 방법은 뇌질환 치료제의 스크리닝에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에서 분리된 Rg3를 HPLC 분석방법으로 확인한 결과 그래프이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에서 M1 또는 M2 분극화를 유도하기 위한 조건을 확립한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에서 M1 분극화가 유도된 미세아교세포가 Rg3에 의해 M1 분극화가 억제되는 것을 iNOS, IL-6 또는 TNFα 유전자 발현 변화를 통해 확인한 결과 그래프이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에서 M2 분극화가 유도된 미세아교세포가 Rg3에 의해 M2 분극화가 촉진되는 것을 Arg1, IL-10 또는 SRA 유전자 발현 변화를 통해 확인한 결과 그래프이다.
도 5는 Aβ42를 생산하는 N2a 신경모세포종에서 Rg3의 처리에 의해 Aβ의 생성이 억제됨을 확인한 결과 도면이다.
도 6은 Aβ42를 생산하는 N2a 신경모세포종에서 Rg3의 처리에 의해 ADAM10 유전자 발현이 증가한 것을 확인한 결과 그래프이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에서 NF-κB 유도에 의해 발현하는 리포터 시스템을 포함하는 세포에서 Rg3의 처리에 의해 NF-κB 신호전달기전이 증가하는 것을 확인한 결과 그래프이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에서 Rg3에 의해 SRA 단백질의 발현이 증가하는 것을 확인한 결과 도면이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에서 Rg3에 의해 ADAM10 단백질의 발현이 증가하는 것을 확인한 결과 도면이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 신경세포 및 신경아교세포로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 세포에 후보물질을 처리하고 M2 분극화를 촉진하는 물질을 선별하는 단계를 포함하는 뇌질환 치료제 스크리닝 방법을 제공한다.
본 명세서에 사용된 용어, '신경세포(neuron)' 또는 '신경아교세포(neuroglia)'는 신경계를 구성하는 세포를 의미한다. 상기 신경세포는 나트륨 통로, 칼슘 통로 등의 이온통로를 발현하여 다른 세포와는 달리 전기적인 방법으로 신호를 전달할 수 있고, 인접한 다른 신경세포와 시냅스라는 구조를 통해 화학적 신호를 주고받을 수 있다. 한편, 상기 신경아교세포는 신경원들이 고유의 기능을 수행하는데 도움을 주며, 신경세포의 작용을 돕고 보호한다. 특히, 신경아교세포는 뇌조직이 손상되었을 때 이를 회복시키는데 중요한 역할을 할 수 있다. 상기 신경세포 또는 신경아교세포는 통상의 기술분야에 알려진 모든 종류의 신경세포를 포함할 수 있다.
구체적으로, 상기 신경세포 또는 신경아교세포는 신경모세포종 및 대식세포의 전구세포에서 분화되는 미세아교세포(microglia)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 상기 신경세포 또는 신경아교세포는 M2 분극화가 유도된 것일 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어, '분극화(polarization)'는 일반적으로 대식세포(macrophage)가 분화되는 과정을 의미하는 것으로, 분화 매개물질에 따라 M1 분극화 또는 M2 분극화로 구분할 수 있다. 상기 M1 분극화는 외부 유기체나 박테리아, 바이러스 등을 인식하여 제거하는 세포로 변하는 것으로서, IFNγ나 LPS 등에 의해 M1 분극화가 진행될 수 있다. M1 분극화된 세포는 IL-1, IL-6 및 TNFα 등과 같은 염증성 사이토카인을 생성 및 분비하여 직접 외부 물질을 제거할 수 있고, IL-12 및 IL-23 등과 같은 염증성 사이토카인의 생성을 촉진하여 선천성 면역반응을 유도할 수 있다.
한편, M2 분극화는 IL-4, IL-10 및 IL-13 등에 의해 유도되고, 스캐빈저(scavenger) 수용체 및 항염증 작용에 관련된 사이토카인 수용체와 같은 다양한 수용체를 발현할 수 있다. 특히, M2 분극화된 세포에서 발현이 증가하는 Arg1은 과도하게 활성화된 면역반응의 억제나 항상성 유지에 작용할 수 있다.
본 발명에 따른 스크리닝 방법은 M2 분극화를 촉진하는 물질을 뇌질환 치료제로서 선별할 수 있다. 이때, M2 분극화 촉진은 통상의 기술분야에 알려진 M2 분극화의 마커 유전자 또는 단백질의 발현수준을 측정하여 확인할 수 있다. 구체적으로, 상기 M2 분극화 촉진은 CD206, Arg1(arginase 1), IL-10(interleukin-10), SRA(scavenger receptor type A), Fizz1(resistin-like-α) 및 Ym1(chitinase 3-like 3)로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 마커 유전자 또는 단백질의 발현수준을 증가시키는 것일 수 있다. 이때, 상기 마커 유전자 또는 단백질은 아무것도 처리하지 않은 신경세포에 비해 증가한 것일 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 스크리닝 방법은 M1 분극화를 억제하는 물질을 선별하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 M1 분극화 억제는 통상의 기술분야에 알려진 M1 분극화의 마커 유전자 또는 단백질의 발현수준을 측정하여 확인할 수 있다. 구체적으로, 상기 M1 분극화 억제는 CD86, iNOS(inducible nitric oxide synthase), IL-1(interleukin-1), IL-6(interleukin-6) 및 TNFα(tumor necrosis factor α)로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 마커 유전자 또는 단백질의 발현수준을 감소시키는 것일 수 있다. 이때, 상기 마커 유전자 또는 단백질은 아무것도 처리하지 않은 신경세포에 비해 감소한 것일 수 있다.
상기 마커 유전자 또는 단백질의 발현수준은 통상의 기술분야에 알려진 모든 방법을 사용하여 측정될 수 있다. 예를 들어, 상기 마커 유전자의 발현수준은 중합효소반응(PCR), 역전사 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응(competitive RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소반응(realtime RT-PCT), RNase 보호분석법(RNase protection assay, RPA), 노던블랏팅(northern blotting) 및 DNA 마이크로어레이 분석법 등을 이용하여 측정될 수 있다. 한편, 상기 마커 단백질의 발현수준은 웨스턴블랏팅(western blotting), ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선 면역분석법(radioimmunoassay), 방사선 면역확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(ouchterlony) 면역확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 조직면역염색, 면역 침전분석법(immunoprecipitation assay), 보체 고정 분석법(complete fixation assay), 유세포분석법(fluorescence activated cell sorter, FACS) 및 단백질 칩(protein chip) 분석법 등을 이용하여 측정될 수 있다.
상기 후보물질은 M2 분극화를 촉진할 것으로 예상되는 미지의 물질로서, 여기에는 화합물, 단백질, 추출물 등이 포함될 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 스크리닝 방법은 SRA 및 ADAM10으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 단백질의 발현을 촉진하는 물질을 선별하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 용어, 'SRA(scavenger receptor type A)' 단백질은 세포 표면 수용체 단백질인 스캐빈저 수용체 중 하나로서, 변형된 LDL에 결합하여 이를 제거하는 역할을 한다. 상기 SRA 단백질은 약 220 내지 250 kDa의 분자량을 갖는 제2형 막단백질로서 리간드 결합에 콜라겐-유사 도메인(collagen-like domain)을 사용한다. SRA 단백질은 우선적으로 변형된 LDL과 결합하나, 아밀로이드-β, 열충격 단백질(heat shock protein), 그람양성 및 그람음성 박테리아의 표면 분자, HCV 바이러스 등을 리간드로 포함할 수 있다.
한편, 상기 용어, 'ADAM10(a disintegrin and metalloproteinase domain-containing protein 10)' 단백질은 CDw156 또는 CD156c로도 알려져 있는 단백질로서, 세포 표면에서 막 단백질을 절단하는 역할을 한다. 특히, 신경세포에서 ADAM10 단백질은 아밀로이드 전구체 단백질(APP)의 단백질 분해 가공과정(proteolytic processing)을 위한 α-세크레타제 활성을 나타낸다.
상기 뇌질환은 통상의 기술분야에 알려진 모든 종류의 뇌질환을 포함할 수 있고, 구체적으로 상기 뇌질환은 퇴행성 뇌질환 또는 신경염증성 뇌질환일 수 있다. 일례로, 상기 뇌질환은 아밀로이드-β의 발현 또는 응집 수준이 정상보다 높거나 높을 위험이 있는 질환일 수 있다. 예를 들어, 상기 뇌질환은 치매, 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴병, 경도인지장애, 대뇌 아밀로이드 맥관병증, 다운증후군, 아밀로이드성 뇌졸중, 전신성 아밀로이드병, 더취(Dutch)형 아밀로이드증, 니만-픽병, 노인성 치매, 근위축성 측삭 경화증(amyotrophic lateral sclerosis), 척수소뇌성 운동실조증(spinocerebellar atrophy), 뚜렛 증후군(Tourette's syndrome), 프리드리히 보행실조(Friedrich's Ataxia), 마차도-조셉병(Machado-Joseph's disease), 루이소체 치매, 근육긴장이상(dystonia), 진행성 핵상 마비(progressive supranuclear palsy), 전두측두엽 치매, 다발성경화증, 신경모세포종, 허혈성 뇌졸중, 루게릭병 또는 크로이츠펠트야콥병일 수 있다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 상세히 설명한다, 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 이들에 의해 본 발명이 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 청구범위에 기재된 기술적 사상과 실질적으로 동일한 구성을 갖고 동일한 작용 효과를 이루는 것은 어떠한 것이라도 본 발명의 기술적 범위에 포함된다.
실시예 1. 인삼열매로부터 진세노사이드 Rg3의 분리
인삼열매로부터 통상적인 방법으로 진세노사이드 Rg3를 분리하였다. 분리된 진세노사이드 Rg3는 통상적인 방법으로 HPLC를 수행하여 확인하였고, 실험에 사용전까지 10 ㎎/㎖의 농도로 10% DMSO에 현탁하여 4℃에 보관하였다.
그 결과, 도 1에 나타난 바와 같이, 진세노사이드 Rg3가 분리된 것을 확인하였다.
실시예 2. Rg3에 의한 분극화 변화 확인
알츠하이머와 같은 퇴행성 뇌질환 치료 효과가 알려진 Rg3가 미세아교세포의 분극화에 관여하여 β-아밀로이드 세포 표면 수용체로 잘 알려진 SRA(scavenger receptor type A)의 발현을 변화시키는지 다음과 같은 방법으로 확인하였다.
2-1. 미세아교세포의 M1 또는 M2 분극화 확인
실험에 사용하기 위한 미세아교세포인 HMO6 세포주에 전염증성 사이토카인을 처리하여 M1 또는 M2 분극화를 마커 유전자인 CD86 및 CD206 유전자의 발현 수준을 통해 확인하였다.
먼저, HMO6 세포주(중앙대학교, 서울)는 10% FBS(fetal bovine serum), 100 U/㎖ 페니실린, 및 100 ㎍/㎖의 스트렙토마이신이 포함된 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium) 배양배지로 배양하여 준비하였다. 이때, 배양은 37℃ 및 5% CO2 조건하에서 수행되었고, 전체 배양접시의 90% 이상이 되도록, 20 계대를 초과하지 않도록 배양하였다. 또한, 배양배지는 2 내지 3일에 한번씩 교체하였다. 준비된 HMO6 세포주를 회수하여 폴리-L-라이신이 코팅된 35 ㎜의 배양접시에 5×105개가 되도록 분주하였다. 16시간 후, 배지를 제거하고 세포를 PBS 완충액으로 세척한 다음 혈청이 포함되지 않은 DMEM 배지를 첨가하였다. 여기에 100 ng/㎖의 LPS, 20 ng/㎖의 IFN-γ 또는 20 ng/㎖의 IL-4를 처리하여 M1 또는 M2 분극화를 유도하였다. 24 또는 48시간 후, 배양된 세포를 취하여 트리졸(trizol) 시약을 사용하여 통상적인 방법으로 전체 RNA를 추출하였다. 추출된 1 ㎍의 RNA, 올리고 dT 프라이머 및 TOP스크립트 역전사 시스템(TOPscript Reverse Transcription System, Enzynomics, 서울)을 사용하여 총 부피가 20 ㎕가 되도록 반응물을 준비하고, 이를 이용하여 제조사의 프로토콜에 따라 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA를 주형으로 하기 표 1에 기재된 CD86 및 CD206 유전자에 대한 정방향 및 역방향 프라이머를 사용하여 qPCR을 수행하였으며, qPCR은 Rotor-Gene 6000(Corbett Research, 오스트레일리아) 장치 및 SensiMix™ SYBR Hi-ROX 키트(Bioline, 영국)를 사용하여 수행되었다. 이때, 반응물은 10 ㎕의 2× 효소 마스터믹스(enzyme mastermix), 7 ㎕의 RNA 분해효소가 포함되지 않은 증류수(RNase free water), 1 ㎕의 정방향 및 역방향 프라이머(10 pM) 및 1 ㎕의 주형을 포함하도록 준비하였다. qPCR 조건은 하기 표 2에 기재된 바와 같이 수행되었고, 융해 곡선 분석(melting curve analysis)은 예상하는 PCR 산물의 형태를 확인하기 위해 사용되었다.
프라이머 서열(5'→3') 서열번호
human IL-6 forward CCAGTACCCCCAGGAGAAGA 서열번호 1
human IL-6 reverse TTGTTTTCTGCCAGTGCCTC 서열번호 2
human IL-10 forward TCACCTTCCAGTGTCTCGGA 서열번호 3
human IL-10 reverse TAGCTGGGATTACAGGTGCG 서열번호 4
human Arg1 forward AGGTGATGGAAGAAACACTC 서열번호 5
human Arg1 reverse AAACAAGCCAAGGTTATTGC 서열번호 6
human iNOS forward GATGGCCTGTCCTTGGAAAT 서열번호 7
human iNOS reverse TTTTGATCCTCACATGCCGT 서열번호 8
human CD86 forward ACATTCTCTTTGTGATGGCC 서열번호 9
human CD86 reverse GTCCAACTGTCCGAATCAAA 서열번호 10
human CD206 forward AAGCCAAGGTCCAGAAATAG 서열번호 11
human CD206 reverse AAACTAGTCAGGAAGGCTTG 서열번호 12
human TNF-alpha forward CAAAGTAGACCTGCCCAGAC 서열번호 13
human TNF-alpha reverse GACCTCTCTCTAATCAGCCC 서열번호 14
human GAPDH forward GGAGCCAAAAGGGTCATCAT 서열번호 15
human GAPDH reverse ACCACAGTCCATGCCATCAC 서열번호 16
mouse ADAM10 forward ACTTCTCCGGAATCCGTAAC 서열번호 17
mouse ADAM10 reverse GTCTGTGAAGACATAGGCCA 서열번호 18
mouse beta-actin forward TACAGCTTCACCACCACAGC 서열번호 19
mouse beta-actin reverse AGGAAGGCTGGAAAAGAGC 서열번호 20
단계 온도 시간 사이클
초기 전-반응 95℃ 15분 1회
변성 95℃ 15초 45회
어닐링 52℃ 15초
연신 72℃ 10초
수득된 PCR 산물을 1.2% 아가로즈 겔을 이용하여 전기영동함으로써 확인하였고, 인터-런 교정기(inter-run calibrator)가 사용되었다. 또한, 표준 곡선은 각각의 유전자에 대한 PCR 효율을 얻기 위해 사용되었다. 상대적인 유전자의 발현 수준은 Rotor-Gene 6000 시리즈 소프트웨어 1.7.을 사용하여 계산하였고, 결과는 β-액틴 유전자의 발현량을 기준으로 배수(fold)로 산출하였다. 이때, 대조군으로서는 아무것도 처리하지 않은 세포를 이용하였고, 그 결과 수득된 산출 결과는 도 2에 나타내었다.
도 2에 나타난 바와 같이, M1 분극화의 지표인 CD86 마커는 INF-γ 또는 LPS의 처리에 의해 유의적으로 증가하였고, M2 분극화의 지표인 C206 마커는 IL-4에 의해 현저히 증가하였다. 상기 결과에 기초하여, 이후 실험에서 M1 분극화는 IFN-γ 및 LPS로, M2 분극화는 IL-4를 이용하여 유도하였다.
2-2. Rg3에 의한 분극화 억제 확인
미세아교세포의 M1 또는 M2 분극화에 대한 Rg3의 영향은, M1 또는 M2 분극화를 유도한 미세아교세포에 처리된 Rg3에 의한 iNOS, IL-6, TNF-α, Arg1, IL-10 또는 SRA 유전자 발현 변화를 통해 확인하였다. 먼저, M1 분극화를 100 ng/㎖의 LPS 및 20 ng/㎖의 IFN-γ의 처리에 의해 유도하고, M2 분극화는 20 ng/㎖의 IL-4를 처리하여 유도하면서 5 ㎍/㎖의 Rg3를 함께 처리하여 HMO6 세포주를 준비하였다. 준비된 HMO6 세포주를 이용하여 상기 실시예 2-1에 기재된 바와 같은 방법으로 M1 분극화를 유도한 세포에서는 iNOS, IL-6 또는 TNF-α 유전자의 발현을, M2 분극화를 유도한 세포에서는 Arg1, IL-10 또는 SRA 유전자 발현을 qPCR로 확인하고, 그 결과를 도 3 및 4에 나타내었다.
도 3에 나타난 바와 같이, M1 분극화를 유도함으로써 증가된 iNOS, IL-6 및 TNF-α 유전자의 발현이 Rg3에 의해 현저히 감소하였다. 한편, 도 4에 나타난 바와 같이, M2 분극화의 유도에 의해 유의적으로 억제된 Arg1, IL-10 및 SRA 유전자 발현은 Rg3에 의해 유의적으로 증가하였다.
따라서, 상기로부터 Rg3가 미세아교세포의 M1 분극화를 억제하고, M2 분극화를 촉진할 뿐 아니라, SRA의 발현도 유의적으로 증가시켜 알츠하이머와 같은 퇴행성 뇌질환의 치료 효과를 나타냄을 알 수 있었다.
실시예 3. Rg3에 의한 Aβ42 ( amyloid -β 42) 생성 억제 확인
알츠하이머와 같은 퇴행성 뇌질환의 주요 발병기전으로 알려진 Aβ42의 축적이 Rg3에 의해 억제되는지를 웨스턴 블랏 분석 방법으로 확인하였다.
구체적으로, N2a 신경모세포종(neuroblastoma) 세포주(KCTC, 한국)는 HMO6 세포주와 동일한 방법으로 배양하여 준비하였다. 한편, APP(amyloid precursor protein)으로부터 Aβ42를 과생산하는 N2a 신경모세포종(이하, 'APPswe 세포')은, 인간 APPswe 유전자를 포함하는 플라스미드를 N2a 세포에 통상적인 방법으로 형질전환시킴으로써 제조하였다. 구체적으로, 형질전환은 6웰 플레이트에 웰당 1×105개가 되도록 분주된 N2a 세포주에 1.5 ㎍의 인간 APPswe 유전자를 포함하는 플라스미드 및 PolyFect® 형질전환 시약(Qiagen, 미국)을 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 수행되었다. 형질전환된 세포는 G418이 포함된 배지에서 배양함으로써 선별하였다. 선별된 Aβ42를 과생산하는 APPswe 세포를 상기 실시예 2-2에 기재된 바와 같은 방법으로 M1 분극화를 유도하고, 여기에 Rg3를 처리하였다. Rg3가 처리된 세포에서 Aβ42를 웨스턴 블랏 방법으로 확인하였다. 이때, 대조군으로서 APPswe 유전자를 포함하지 않는 야생형의 N2a 신경모세포종 세포주를 사용하였다.
이후, Rg3를 처리한 세포를 단백질분해효소 및 탈인산화효소(phosphatase) 억제제를 포함하는 1% RIPA 완충액으로 용해시키고, 10% SDS 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동을 수행하였다. 겔에 전개된 단백질을 PVDF 막(membrane)에 옮긴 후, 5% 탈지유(skim milk) 및 0.1% 트윈-20이 포함된 TBS 용액으로 전처리하였다. 전처리된 PVDF 막에 항-Aβ42 항체(Cell Signaling Technology, 미국) 또는 항-β-액틴 항체(Cell Signaling Technology, 미국)를 처리하여 반응시킨 후, HRP 결합된 2차 항체를 처리하였다. 항체가 처리된 PVDF 막을 ECL 용액(Thermo Fisher Scientific, 미국)으로 필름에 현상하고, 그 결과를 도 5에 나타내었다.
도 5에 나타난 바와 같이, M1 분극화가 유도된 APPswe 세포에서 유의적으로 Aβ42의 생산이 증가하였으나, 이는 Rg3를 처리함으로써 현저히 감소하였다.
실시예 4. Rg3에 의한 APP 프로세싱 기전 변화 확인
Rg3에 의한 Aβ42 생성 억제에 ADAM10(a disintegrin and metalloproteinase domain-containing protein 10) 단백질이 관련되어 있는지 확인하기 위해, 상기 실시예 3의 APPswe 세포주에서 ADAM10 유전자의 발현을 qPCR로 확인하였다. 실험은 ADAM10 유전자에 대한 프라이머를 사용한 것을 제외하고는, 실시예 2-1과 동일한 조건 및 방법으로 수행되었고, 그 결과를 도 6에 나타내었다.
도 6에 나타난 바와 같이, Rg3가 처리된 세포에서 ADAM10 유전자의 발현이 유의적으로 증가하였다. 따라서, 이로부터 Rg3가 ADAM10 유전자에 의해 발현되는 α-세크레타제(α-secretase)의 생성을 증가시켜 APP로부터 수용성 APPα의 생성을 촉진하고, Aβ42의 생성을 억제함을 알 수 있었다.
실시예 5. Rg3에 의한 NF - κB 신호전달기전 변화 확인
Rg3 입체이성질체가 베타아밀로이드 생성 APP 프로세싱을 감소시키는지 리포터 유전자 발현 분석을 이용한 NF-κB 신호전달기전 변화를 통해 확인하였다.
먼저, NF-κB-유도의 Lucia™ 리포터 유전자가 삽입된 THP-1 단핵구 세포주(InvivoGen, 미국)를 상기 서술한 바와 같은 방법으로 배양하고, 96웰 플레이트에 웰당 1×105개가 되도록 분주하였다. 2시간 후, 1 ㎍/㎖의 LPS 및 Rg3를 처리하고 6시간 동안 더 배양하고, 세포의 배양액을 취하여 96웰 플레이트의 각 웰에 20 ㎕씩 분주하였다. 여기에 QUANTI-Luc™ 분석 용액(InvivoGen, 미국)을 첨가하고, 루미노미터(luminometer)를 사용하여 루시퍼라제 활성(luciferase acitivity)을 측정하였다. 이때, 대조군으로서 LPS만 처리한 세포 및 루시퍼라제 리포터가 포함되지 않은 빈 플라스미드로 형질감염된 세포를 사용하였다. 그 결과, 측정된 루시퍼라제의 활성을 도 7에 나타내었다.
도 7에 나타난 바와 같이, Rg3의 처리에 의해 NF-κB 신호전달기전이 유의적으로 증가하였다.
실시예 6. SRA 및 ADAM10 단백질의 발현 변화 확인
IL-4를 처리함으로써 M2 분극화가 유도된 HMO6 세포주에서 Rg3의 처리에 의한 SRA 및 ADAM10 단백질의 발현변화를 면역세포화학법(immunocytochemistry, ICC)으로 확인하였다.
먼저, HMO6 세포주는 상기 서술한 바와 같이 준비하고, 4웰 플레이트에 웰당 5×105개가 되도록 분주한 후, IL-4를 처리하여 M2 분극화를 유도하였다. 여기에 5 ㎍/㎖의 Rg3를 첨가하고 48시간 동안 배양하였다. 배양이 끝난 후, 세포를 4% 파라포름알데하이드가 포함된 PBS 완충액에 15분 동안 넣어 고정시키고, 100 mM 글리세롤이 첨가된 PBS 완충액으로 2회 세척하였다. 세척된 세포를 0.1% 트리톤 X-100이 포함된 PBS 용액에 넣어 상온에서 30분 동안 반응시키고, 1% BSA(bovine serum albumin)를 첨가하여 상온에서 30분 동안 전처리하였다. 이후, 1:200으로 희석된 항-SRA 또는 항-ADAM10 1차 항체(Santa Cruz Biotechnology, 미국) 및 1% BSA가 포함된 PBST 용액으로 상온에서 2시간 동안 반응시켰다. 세포를 PBS 완충액으로 3회 세척하고, FITC 또는 알렉사플루오르 555(Alexa Fluor® 555)가 결합된 항-마우스 IgG 항체를 1:200으로 1% BSA가 포함된 PBST 용액에 희석하여 첨가하고, 1시간 동안 반응시켰다. 반응 후, 세포를 PBS 완충액으로 세척하고, 회흐스트 33342(Hoechst 33342) 또는 PI(propidium iodide)를 처리하고 실온에서 10분 동안 반응시킨 뒤, PBS 완충액으로 2회 세척하였다. 염색된 세포는 반전 형광현미경 시스템(inverted fluorescent microscope system, Eclipse Ti-S, 니콘, 일본)을 사용하여 600배의 비율로 관찰하고 그 결과를 도 8 및 9에 나타내었다.
도 8 및 9에 나타난 바와 같이, Rg3에 의해 SRA 및 ADAM10 단백질의 발현이 유의적으로 증가하였다. 특히, Rg3는 분극화가 유도되지 않은 상태(M0)에서도 SRA 단백질의 발현을 증가시켰다.
따라서, 상기로부터 Rg3가 M2 분극화를 촉진시키고, 뒤이어 SRA 단백질의 발현을 증가시킴으로써 Aβ의 축적을 억제할 뿐 아니라, ADAM10 단백질의 발현을 증가시켜 수용성 APPα 생성 및 Aβ42 생성억제를 통해 신경세포에서 수용성 APPα 프로세싱을 억제함을 알 수 있었다.
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Claims (10)

  1. 신경세포 및 신경아교세포로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 세포에 후보물질을 처리하고 M2 분극화를 촉진하는 물질을 선별하는 단계를 포함하는 뇌질환 치료제 스크리닝 방법.
  2. 제1항에 있어서, M2 분극화 촉진은 CD206, Arg1(arginase 1), IL-10(interleukin-10), SRA(scavenger receptor typa A), Fizz1(resistin-like-α) 및 Ym1(chitinase 3-like 3)로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 마커 유전자 또는 단백질의 발현수준을 증가시키는, 뇌질환 치료제 스크리닝 방법.
  3. 제1항에 있어서, M1 분극화를 억제하는 물질을 선별하는 단계를 더 포함하는, 뇌질환 치료제 스크리닝 방법.
  4. 제3항에 있어서, M1 분극화 억제는 CD86, iNOS(inducible nitric oxide synthase), IL-1(interleukin-1), IL-6(interleukin-6) 및 TNFα(tumor necrosis factor α)로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 마커 유전자 또는 단백질의 발현수준을 감소시키는, 뇌질환 치료제 스크리닝 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 신경세포 또는 신경아교세포는 신경모세포종 및 미세아교세포로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인, 뇌질환 치료제 스크리닝 방법.
  6. 제1항에 있어서, SRA 및 ADAM10(a disintegrin and metalloproteinase domain-containing protein 10)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 단백질의 발현을 촉진하는 물질을 선별하는 단계를 더 포함하는, 뇌질환 치료제 스크리닝 방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 뇌질환은 아밀로이드-β의 발현 또는 응집 수준이 정상보다 높거나 높을 위험이 있는 것인, 뇌질환 치료제 스크리닝 방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 뇌질환은 퇴행성 뇌질환 또는 신경염증성 뇌질환인, 뇌질환 치료제 스크리닝 방법.
  9. 제1항에 있어서, 상기 뇌질환은 치매, 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴병, 경도인지장애, 대뇌 아밀로이드 맥관병증, 다운증후군, 아밀로이드성 뇌졸중, 전신성 아밀로이드병, 더취(Dutch)형 아밀로이드증, 니만-픽병, 노인성 치매, 근위축성 측삭 경화증(amyotrophic lateral sclerosis), 척수소뇌성 운동실조증(spinocerebellar atrophy), 뚜렛 증후군(Tourette's syndrome), 프리드리히 보행실조(Friedrich's Ataxia), 마차도-조셉병(Machado-Joseph's disease), 루이소체 치매, 근육긴장이상(dystonia), 진행성 핵상 마비(progressive supranuclear palsy), 전두측두엽 치매, 다발성경화증, 신경모세포종, 허혈성 뇌졸중, 루게릭병 또는 크로이츠펠트야콥병인, 뇌질환 치료제 스크리닝 방법.
  10. 제1항에 있어서, 신경세포 또는 신경아교세포는 M2 분극화가 유도된 것인, 뇌질환 치료제 스크리닝 방법.
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