KR20220167045A - 식물의 내염성 개선용 조성물 및 식물의 내염성 증가 방법 - Google Patents
식물의 내염성 개선용 조성물 및 식물의 내염성 증가 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 AHL(Arabidopsis Halotolerance 2-like) 단백질의 발현 증가제를 포함하는 식물의 내염성 개선용 조성물 및 AHL 단백질 발현 증가제를 식물 세포, 종자, 또는 식물체에 처리하는 단계를 포함하는 식물의 내염성 증가 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, AHL 단백질은 염분스트레스 조건에서 시스테인(Cysteine) 발현을 조절하고 이를 통해 식물체가 염분스트레스 조건에서 올바르게 생장할 수 있게 한다. 또한, AHL 단백질이 과발현된 식물에 시스테인(Cysteine)를 추가로 처리하는 경우 염분 스트레스를 더 잘 견딜 수 있게 한다. 따라서, 식물체 내 AHL 단백질의 발현 조절 및 시스테인(Cysteine) 처리를 통해 필요한 환경에서 재배할 수 있는 식물 품종 개발에 이용이 가능하다.
Description
본 발명은 식물의 내염성 개선용 조성물 및 식물의 내염성 증가 방법에 관한 것이다.
인류의 식량 부족 문제는 늘어나는 인구에 의하여 야기되어지고 있으며 이를 극복하기 위하여, 황무지의 개간과 간척지 사업을 통한 경작이 가능한 농경지를 늘리는 노력이 중요하게 되었다. 황무지와 간척지는 일반농지와 비교하여 비생물적 스트레스가 많이 존재하는데, 특히 토양 내 염류 축적이 심각하여 작물 생육에 악영향을 미친다. 높은 농도의 염류(salts)는 이온 스트레스(ion stress)와 삼투압 스트레스(osmotic stress)를 유발시키며, 이를 통하여 산화적인 스트레스(oxidative stress)와 영양장애 같은 2차 스트레스(secondary stress)를 초래한다고 알려져 있다.
이와 같이, 작물의 염해는 염류토양과 나트륨성 토양에 작물을 재배할 때에 나타나며, 해수의 유입, 토양수분의 증발에 따른 염류의 농축, 한발로 하천수가 감소되어 해수가 역류된 염분함량이 높은 관개수의 관개, 조풍 또는 파랑에 의한 바닷물의 비말 등의 영향으로도 나타난다. 한국은 3면이 바다로 둘러져 있어 대부분은 해안으로 구성이 되어 염해지(鹽海地)가 많다. 염해지란 염수의 침입이나 토양수분의 증발로 염분의 농도가 짙어짐으로써 식물이 생육에 장애를 받는 땅으로 일부 지역은 염전으로 활용되었으며, 1960년대 이후 상당부분이 간척지로 변모하였다. 그 중 많은 면적은 숙답(熟沓)되어 벼의 수확량을 올리고 있지만, 비교적 근래에 간척사업이 끝난 신개답지의 경우 염의 피해를 받는 일이 많다.
이에 따라, 염류 농도가 높은 환경에 의한 농업생산성 저하는 심각한 수준으로 이러한 환경에 내성을 갖는 우량 품종의 개발이 식량자원의 안정적 확보에 매우 시급하게 필요한 실정이다.
본 발명은 AHL(Arabidopsis Halotolerance 2-like) 단백질의 발현 증가제를 포함하는 식물의 내염성 개선용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 상기 AHL 단백질의 발현 증가제에 시스테인을 더 포함하는 식물의 내염성 개선용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 AHL(Arabidopsis Halotolerance 2-like) 단백질 발현 증가제를 이용하여 식물의 내염성을 증가시키는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 상기 AHL 단백질 발현 증가제와 시스테인을 함께 이용하여 식물의 내염성을 증가시키는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
1. AHL(Arabidopsis Halotolerance 2-like) 단백질의 발현 증가제를 포함하는 식물의 내염성 개선용 조성물.
2. 위 1에 있어서, 상기 AHL 단백질의 발현 증가제는 AHL 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터인 식물의 내염성 개선용 조성물.
3. 위 1에 있어서, 시스테인을 더 포함하는 식물의 내염성 개선용 조성물.
4. AHL(Arabidopsis Halotolerance 2-like) 단백질 발현 증가제를 식물 세포, 종자, 또는 식물체에 처리하는 단계를 포함하는 식물의 내염성 증가 방법.
5. 위 4에 있어서, 상기 AHL 단백질 발현 증가제는 AHL 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터이고, 상기 방법은 이를 식물세포, 종자 또는 식물체에 형질전환 시키는 것인 식물 내염성 증가 방법.
6. 위 4에 있어서, 시스테인을 종자 또는 식물체에 처리하는 단계를 더 포함하는 식물 내염성 증가 방법.
본 발명의 AHL 단백질 증가제를 이용해 식물의 내염성을 개선할 수 있는 효과가 있다.
본 발명의 AHL 단백질 증가제 및 시스테인을 이용해 식물의 내염성을 개선할 수 있는 효과가 있다.
도 1은 AHLpro-GUS 형질전환(2-1 및 3-3) 계통 및 RD29A대조군 묘목의 염분 스트레스 조건에서 AHL 발현정도 및 활성을 나타낸다. 도 1의 A는 150mM NaCl 처리 하에 표시된 시점에서 총 RNA 추출을 위해 10 일된 묘목을 수확하고, AHL 발현 수준을 qPCR로 정량화 했다. RD29A는 염분 스트레스 치료를 위한 대조군으로 사용되었다. 막대그래프는 세 가지 생물학적 복제의 평균 값 (±SD)을 나타낸다. 막대그래프 위의 다른 문자는 Duncan의 다중 범위 테스트의 P <0.05에서 통계적으로 유의한 차이를 나타낸다. 도1의 B는 염분 스트레스에 대한 AHL에 대한 조직 화학적 GUS 활성을 나타낸다. AHL PRO-GUS 형질전환(2-1 및 3-3) 계통의 10 일된 전체 묘목에 150mM NaCl NaCl 처리 후, 묘목을 GUS 활성에 대해 염색하고 H2O 처리된 묘목을 대조군으로 사용했다.
도 2a는 염분 스트레스에 대한 ahl돌연변이(RNA interference lines) 및 AHL 형질 전환 식물의 생리 학적 반응을 나타낸다. A는 염분 스트레스 조건 하에서 WT, ahl 돌연변이(RNA interference lines) 및 AHL 형질 전환 식물의 발아율을 나타낸다. 150mM NaCl에 대한 종자 발아율은 각기 다른 날의 각 유전자형 샘플에 대해 표시된다. 점들은 세 가지 생물학적 복제의 평균 값 (±SD)을 나타낸다. 막대그래프 위의 다른 문자는 Duncan의 다중 범위 테스트에서 P <0.05에서 통계적으로 유의한 차이를 나타낸다. B는 18 일 동안 150mM NaCl에 노출된 WT, ahl돌연변이(RNA interference lines), AHL-RNAi (ri 2-3, ri 5-2) 및 AHL- 과발현 (OE 2-2, OE 5-1) 묘목의 표현형을 나타낸다.
도 2b는 염분 스트레스에 대한 ahl돌연변이(RNA interference lines) 및 AHL 형질 전환 식물의 생리학적 반응을 나타낸다. C는 18 일 동안 150mM NaCl에 노출된 WT, ahl돌연변이(RNA interference lines), AHL-RNAi 및 AHL-OE 묘목의 생존율 정량화한 것을 나타낸다. D는 각 샘플의 2 주일생 묘목을 0 및 150mM NaCl에 12 시간 동안 처리 후의 프롤린 농도를 나타낸다. 막대그래프는 3 개의 생물학적 복제물의 평균 값 (±SD)을 나타낸다. C와 D의 막대그래프 위의 다른 문자는 Duncan의 다중 범위 테스트에서 P <0.05에서 통계적으로 유의한 차이를 나타낸다.
도 3은 염분 스트레스 처리 중 ahl돌연변이(RNA interference lines) 및 AHL 형질 전환 식물의 H2O2 및 MDA 함량을 나타낸다. 각 샘플의 10 일 된 전체 묘목을 H2O (대조군) 및 150mM NaCl로 12 시간 동안 처리하고 DAB 염색을 수행하여 H2O2 축적을 평가했다. 12 시간 동안 H2O (대조군) 또는 150 mM NaCl로 처리한 후 10 일 된 묘목에서 H2O2 및 MDA 축적을 정량화 했다. 막대그래프는 세 가지 생물학적 복제의 평균 값 (±SD)을 나타낸다. 막대그래프 위의 다른 문자는 Duncan의 다중 범위 테스트에서 P <0.05에서 통계적으로 유의한 차이를 나타낸다.
도 4는 ahl돌연변이(RNA interference lines) 및 AHL 형질 전환 식물에서 염분 스트레스 관련 유전자의 qPCR 분석결과를 나타낸다. WT, ahl돌연변이(RNA interference lines), AHL-RNAi (ri 2-3) 및 AHL- 과발현 (OE 2-2) 식물에서 ABI5, ADC1, ADC2, AOX1a, AREB3, AtOZF2, P5CS1, RD26 및 RbohD의 발현을 나타낸다. 10 일 된 묘목을 H2O 또는 150mM NaCl로 12 시간 동안 처리했다. 각 유형의 묘목에서 total RNA를 추출하고 qPCR로 분석했다. 막대그래프는 세 가지 생물학적 복제의 평균 값 (±SD)을 나타낸다. 막대그래프 위의 다른 문자는 Duncan의 다중 범위 테스트에서 P <0.05에서 통계적으로 유의한 차이를 나타낸다.
도 5는 염분 스트레스 하에서 ahl돌연변이(RNA interference lines) 및 AHL 형질 전환 식물에서 황산염 대사 관련 유전자의 시스테인(Cysteine) 농도 및 전사 수준을 나타낸다. A는 H2O (대조군) 또는 150mM NaCl로 12 시간 동안 처리한 후 10 일 된 묘목의 시스테인(Cysteine) 농도를 나타낸다. 막대그래프는 세 가지 생물학적 복제의 평균 값 (±SD)을 나타낸다. 막대그래프 위의 다른 문자는 Duncan의 다중 범위 테스트에서 P <0.05에서 통계적으로 유의 한 차이를 나타낸다. B-E는 염분 스트레스 조건 하에서 ahl돌연변이(RNA interference lines) 및 AHL 형질 전환 식물에서 황산염 대사와 관련된 여러 유전자의 qPCR 결과를 나타낸다. 염분 스트레스 하에서 WT, ahl돌연변이(RNA interference lines), AHL-RNAi (ri 2-3) 및 AHL 과발현 (OE 2-2) 식물에서 APK1, APR1, OASA1 및 SiR의 발현을 나타낸다. 10 일 된 묘목을 H2O 또는 150mM NaCl로 12 시간 동안 처리했다. 각 유형의 묘목에서 total RNA를 추출하고 qPCR로 분석했다. 막대그래프는 세 가지 생물학적 복제의 평균 값 (±SD)을 나타낸다. 막대그래프 위의 다른 문자는 Duncan의 다중 범위 테스트에서 P <0.05에서 통계적으로 유의한 차이를 나타낸다.
도 6은 염분 스트레스 하에서 ahl돌연변이(RNA interference lines) 및 AHL 형질 전환 식물의 시스테인(Cysteine) 반응 비교를 나타낸다. A는 염분 스트레스 하에서 WT, ahl돌연변이(RNA interference lines), AHL-RNAi (ri 2-3, ri 5-2) 및 AHL 과발현 (OE 2-2, OE 5-1) 묘목의 생장에 대한 외인성 시스테인(Cysteine)의 효과를 나타낸다. 묘목은 18 일 동안 150mM NaCl과 함께 40μM 시스테인(Cysteine)을 포함하는 half strength MS 식물 배지에서 재배되었다. B는 150mM NaCl 또는 150mM NaCl + 40μM 시스테인(Cysteine)을 18 일 동안 처리한 WT, ahl돌연변이(RNA interference lines), AHL-RNAi (ri 2-3, ri 5-2) 및 AHL 과발현 (OE 2-2, OE 5-1) 형질전환 묘목의 생존율을 나타낸다. 막대그래프는 세 가지 생물학적 복제의 평균 값 (±SD)을 나타낸다. 막대그래프 위의 다른 문자는 Duncan의 다중 범위 테스트에서 P <0.05에서 통계적으로 유의한 차이를 나타낸다.
도 2a는 염분 스트레스에 대한 ahl돌연변이(RNA interference lines) 및 AHL 형질 전환 식물의 생리 학적 반응을 나타낸다. A는 염분 스트레스 조건 하에서 WT, ahl 돌연변이(RNA interference lines) 및 AHL 형질 전환 식물의 발아율을 나타낸다. 150mM NaCl에 대한 종자 발아율은 각기 다른 날의 각 유전자형 샘플에 대해 표시된다. 점들은 세 가지 생물학적 복제의 평균 값 (±SD)을 나타낸다. 막대그래프 위의 다른 문자는 Duncan의 다중 범위 테스트에서 P <0.05에서 통계적으로 유의한 차이를 나타낸다. B는 18 일 동안 150mM NaCl에 노출된 WT, ahl돌연변이(RNA interference lines), AHL-RNAi (ri 2-3, ri 5-2) 및 AHL- 과발현 (OE 2-2, OE 5-1) 묘목의 표현형을 나타낸다.
도 2b는 염분 스트레스에 대한 ahl돌연변이(RNA interference lines) 및 AHL 형질 전환 식물의 생리학적 반응을 나타낸다. C는 18 일 동안 150mM NaCl에 노출된 WT, ahl돌연변이(RNA interference lines), AHL-RNAi 및 AHL-OE 묘목의 생존율 정량화한 것을 나타낸다. D는 각 샘플의 2 주일생 묘목을 0 및 150mM NaCl에 12 시간 동안 처리 후의 프롤린 농도를 나타낸다. 막대그래프는 3 개의 생물학적 복제물의 평균 값 (±SD)을 나타낸다. C와 D의 막대그래프 위의 다른 문자는 Duncan의 다중 범위 테스트에서 P <0.05에서 통계적으로 유의한 차이를 나타낸다.
도 3은 염분 스트레스 처리 중 ahl돌연변이(RNA interference lines) 및 AHL 형질 전환 식물의 H2O2 및 MDA 함량을 나타낸다. 각 샘플의 10 일 된 전체 묘목을 H2O (대조군) 및 150mM NaCl로 12 시간 동안 처리하고 DAB 염색을 수행하여 H2O2 축적을 평가했다. 12 시간 동안 H2O (대조군) 또는 150 mM NaCl로 처리한 후 10 일 된 묘목에서 H2O2 및 MDA 축적을 정량화 했다. 막대그래프는 세 가지 생물학적 복제의 평균 값 (±SD)을 나타낸다. 막대그래프 위의 다른 문자는 Duncan의 다중 범위 테스트에서 P <0.05에서 통계적으로 유의한 차이를 나타낸다.
도 4는 ahl돌연변이(RNA interference lines) 및 AHL 형질 전환 식물에서 염분 스트레스 관련 유전자의 qPCR 분석결과를 나타낸다. WT, ahl돌연변이(RNA interference lines), AHL-RNAi (ri 2-3) 및 AHL- 과발현 (OE 2-2) 식물에서 ABI5, ADC1, ADC2, AOX1a, AREB3, AtOZF2, P5CS1, RD26 및 RbohD의 발현을 나타낸다. 10 일 된 묘목을 H2O 또는 150mM NaCl로 12 시간 동안 처리했다. 각 유형의 묘목에서 total RNA를 추출하고 qPCR로 분석했다. 막대그래프는 세 가지 생물학적 복제의 평균 값 (±SD)을 나타낸다. 막대그래프 위의 다른 문자는 Duncan의 다중 범위 테스트에서 P <0.05에서 통계적으로 유의한 차이를 나타낸다.
도 5는 염분 스트레스 하에서 ahl돌연변이(RNA interference lines) 및 AHL 형질 전환 식물에서 황산염 대사 관련 유전자의 시스테인(Cysteine) 농도 및 전사 수준을 나타낸다. A는 H2O (대조군) 또는 150mM NaCl로 12 시간 동안 처리한 후 10 일 된 묘목의 시스테인(Cysteine) 농도를 나타낸다. 막대그래프는 세 가지 생물학적 복제의 평균 값 (±SD)을 나타낸다. 막대그래프 위의 다른 문자는 Duncan의 다중 범위 테스트에서 P <0.05에서 통계적으로 유의 한 차이를 나타낸다. B-E는 염분 스트레스 조건 하에서 ahl돌연변이(RNA interference lines) 및 AHL 형질 전환 식물에서 황산염 대사와 관련된 여러 유전자의 qPCR 결과를 나타낸다. 염분 스트레스 하에서 WT, ahl돌연변이(RNA interference lines), AHL-RNAi (ri 2-3) 및 AHL 과발현 (OE 2-2) 식물에서 APK1, APR1, OASA1 및 SiR의 발현을 나타낸다. 10 일 된 묘목을 H2O 또는 150mM NaCl로 12 시간 동안 처리했다. 각 유형의 묘목에서 total RNA를 추출하고 qPCR로 분석했다. 막대그래프는 세 가지 생물학적 복제의 평균 값 (±SD)을 나타낸다. 막대그래프 위의 다른 문자는 Duncan의 다중 범위 테스트에서 P <0.05에서 통계적으로 유의한 차이를 나타낸다.
도 6은 염분 스트레스 하에서 ahl돌연변이(RNA interference lines) 및 AHL 형질 전환 식물의 시스테인(Cysteine) 반응 비교를 나타낸다. A는 염분 스트레스 하에서 WT, ahl돌연변이(RNA interference lines), AHL-RNAi (ri 2-3, ri 5-2) 및 AHL 과발현 (OE 2-2, OE 5-1) 묘목의 생장에 대한 외인성 시스테인(Cysteine)의 효과를 나타낸다. 묘목은 18 일 동안 150mM NaCl과 함께 40μM 시스테인(Cysteine)을 포함하는 half strength MS 식물 배지에서 재배되었다. B는 150mM NaCl 또는 150mM NaCl + 40μM 시스테인(Cysteine)을 18 일 동안 처리한 WT, ahl돌연변이(RNA interference lines), AHL-RNAi (ri 2-3, ri 5-2) 및 AHL 과발현 (OE 2-2, OE 5-1) 형질전환 묘목의 생존율을 나타낸다. 막대그래프는 세 가지 생물학적 복제의 평균 값 (±SD)을 나타낸다. 막대그래프 위의 다른 문자는 Duncan의 다중 범위 테스트에서 P <0.05에서 통계적으로 유의한 차이를 나타낸다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 AHL(Arabidopsis Halotolerance 2-like) 단백질의 발현 증가제를 포함하는 식물의 내염성 개선용 조성물을 제공한다.
본 발명의 AHL(Arabidopsis Halotolerance 2-like) 단백질은 황 2차대사 관련 단백질인 3'-phosphoadenosine 5'-phosphate (PAP) phosphatase 효소다.
본 발명의 At5g54390 유전자 또는 AHL 유전자는 AHL 단백질을 코딩하는 유전자를 의미한다.
보다 상세하게, 상기 AHL 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 단백질을 코딩하는 유전자로, 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열을 가지는 유전자이며, 애기장대(Arabidopsis thaliana)에서 유래되었다. 또한, 식물체에 염분 스트레스를 가할 경우 At5g54390 유전자의 발현이 증가하며, 상기 유전자의 발현을 증가시킬 경우 이러한 염분 스트레스들에 대한 내성이 증가함을 확인되어, 상기 유전자는 식물체의 내염성에 관여함을 확인하였다.
본 명세서에서 사용된 용어 "내염성"은 식물이 염분 스트레스에 견디는 성질로, 높은 염 농도에 대한 식물의 저항성을 의미한다. 소금의 농도가 높을수록 작물의 생산성에 부정적인 영향을 주며, 작물이 생산성을 잃지 않으면서 견딜 수 있는 최대 소금 농도는 작물 또는 품종마다 다르다. 따라서 간척지와 같이 소금 농도가 높은 지역에서 작물재배 시 내염성이 강한 작물 또는 품종이 필요하다.
상기 AHL 단백질 발현 증가제는 식물체 내의 AHL 단백질 발현량을 증가시켜주는 물질이라면 제한되지 않으며, 예를 들어 AHL 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에서 사용된 용어 "재조합 벡터”란 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 제작물로, 플라스미드 벡터, 코스미드 벡터, 박테리오파지 벡터 및 바이러스 벡터 등을 포함한 통상의 모든 벡터를 포함한다.
본 발명의 "재조합 벡터"는 상기 AHL 유전자가 발현될 수 있도록, 발현조절 서열과 기능적으로 연결되어 있다. 예를 들어, 벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널, 인핸서 같은 발현 조절 요소 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 신호서열 또는 리더 서열을 포함할 수 있으며 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 또한, 벡터는 선택성 마커를 포함할 수 있으며, 벡터는 자가 복제하거나 숙주 DNA에 통합될 수 있다. 본 발명의 벡터는 당해 기술 분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용한다.
상기 재조합 벡터는 벡터가 도입된 숙주의 선별을 위해 항생제 저항성 마커를 포함할 수 있고, 이는 벡터에 내재된 것이거나 외부에서 도입된 것일 수 있다.
본 발명의 재조합 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 투머파시엔스와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터 (EP0116718 B1호 참조)는 현재 식물 세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 있는 원형질체로 잡종 DNA 서열을 전이시키는데 이용되고 있다. Ti-플라스미드 벡터의 특히 바람직한 형태는 EP 0120516 B1호 및 미국 특허 제4,940,838호에 청구된 바와 같은 소위 바이너리(binary) 벡터이다.
본 발명에 따른 DNA를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중가닥 식물 바이러스 (예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다. 그러한 벡터의 사용은 특히 식물 숙주를 적당하게 형질전환하는 것이 어려울 때 유리할 수 있다.
본 발명의 재조합 벡터에서, 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제 (NOS), 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 아그로박테리움 튜머파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens)의 옥토파인(Octopine) 유전자의 터미네이터, 파세올린 (phaseoline) 터미네이터, 대장균의 rrnB1/B2 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
재조합 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 수 있다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 글리포세이트 (glyphosate) 또는 포스피노트리신(phosphinothricin)과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신 (kanamycin), 하이그로마이신 (hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol), G418, 블레오마이신(Bleomycin)과 같은 항생제 내성 유전자, aadA 유전자 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 명세서에서 사용된 용어 "프로모터(promoter)"는 구조 유전자로부터의 DNA 상부의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 중합효소가 결합하는 DNA 분자를 말한다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. "항시성 (constitutive) 프로모터"는 대부분의 환경 조건 및 발달상태 또는 세포 분화하에서 활성이 있는 프로모터이며, 본 발명에서는 항시성 프로모터의 사용이 바람직할 수 있다. 따라서, 항시성 프로모터는 선택 가능성을 제한하지 않는다.
상기 식물의 내염성 개선용 조성물은 시스테인(Cysteine)을 더 포함할 수 있다.
시스테인을 더 포함하는 경우 내염성 개선 효과가 더욱 증대될 수 있다.
AHL 단백질 발현 증가제와 시스테인은 혼합되어 있을 수 있고, 별도로 분리되어 있을 수도 있다.
AHL 단백질 발현 증가제가 AHL 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터이면, 시스테인은 AHL 단백질 발현 증가제와 별도로 식물에 처리될 수 있다.
시스테인은 예를 들면 종자 또는 식물체에 처리될 수 있다.
상기 시스테인의 처리는 시스테인을 포함하는 비료 또는 시스테인을 포함하는 식물영양제를 점적호스, 분수호스, 스프링쿨러 등의 장비를 이용해 관주하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서 사용된 용어 "관주"는 비료 또는 식물영양제를 작물 재배토양에 주입 또는 살포하는 방법을 모두 포함한다.
상기 시스테인의 처리는 시스테인을 포함하는 식물영양제를 분무기, 드론 등 다양한 장비를 이용해 종자 또는 식물체 표면에 엽면살포 또는 지제부살포 하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 시스테인을 처리하는 식물체 표면은 잎, 줄기, 뿌리, 꽃, 싹, 화경, 군엽 등을 포함할 수 있으나, 이제 제한되는 것은 아니다.
상기 시스테인의 처리는 시스테인 또는 시스테인을 포함하는 식물영양제를 식물체 내에 직접 투여하는 것일 수 있다.
상기 식물영양제에 포함된 시스테인의 농도는 10 μM, 20 μM, 30 μM, 40 μM, 50μM, 100μM 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 상기 AHL 단백질 발현 증가제를 식물 세포, 종자, 또는 식물체에 처리하는 단계를 포함하는 식물의 내염성 증가 방법을 제공한다.
본 발명에서, 상기 "AHL 단백질"에 대한 설명은 전술한 바와 같다.
상기 식물의 내염성 증가 방법은 AHL 단백질 발현 증가제를 이용해 식물세포, 종자 또는 식물체를 형질전환 시키는 것일 수 있고, 보다 구체적으로 상기 재조합 벡터를 식물세포, 종자, 또는 식물체에 형질전환 시키는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
전술한 바와 같이, 상기 AHL 단백질 발현 증가제는 식물체 내의 AHL 단백질 발현량을 증가시켜주는 물질이라면 제한되지 않으며, 보다 구체적으로는 AHL 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에서 사용된 용어 "형질전환"은, 유전물질인 DNA를 다른 계통의 살아 있는 세포에 주입했을 때, DNA가 그 세포에 들어가 유전형질(遺傳形質)을 변화시키는 현상으로, 형질변환, 형전환, 또는 형변환이라고도 한다.
본 발명의 상기 재조합 벡터로 식물체를 "형질전환"하는 것은 당업자에게 공지된 형질전환기술에 의해 수행될 수 있다. 구체적으로는, 아그로박테리움을 이용한 형질전환방법, 미세사출법(microprojectile bombardment), 일렉트로포레이션(electroporation), PEG-매개 융합법(PEG-mediated fusion), 미세주입법(microinjection), 리포좀 매개법(liposome-mediated method), 인-플란타 형질전환법(In planta transformation), 진공 침윤법(Vacuum infiltration method), 화아침지법(floral meristem dipping method) 또는 아그로박테리아 분사법(Agrobacterium spraying method)을 이용할 수 있으며, 보다 구체적으로는 아그로박테리움을 이용한 형질전환방법 또는 아그로박테리아 분사법(Agrobacterium spraying method)을 이용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 아그로박테리움을 이용한 형질전환방법에 있어서, 형질전환용 숙주인 아그로박테리움은 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens), 아그로박테리움 라이조게네스(Agrobacterium rhizogenes) 일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
형질전환된 식물 세포들은 당업계에 공지된 표준 기술을 사용하여 식물체로 재분화시킬 수 있다. 캘러스 또는 원형질체 배양으로부터 성숙한 식물의 재분화를 위한 기술은 수많은 여러 가지 종에 대해서 당업계에 주지되어 있다(Handbook of Plant Cell Culture, 1-5권, 1983-1989 Momillan, N.Y.).
본 명세서에서 사용된 용어 "식물체"는, 성숙한 식물체 뿐만 아니라 성숙한 식물로 발육할 수 있는 식물 조직 등을 모두 포함하는 의미이다.
본 발명의 "식물"의 종류는 특별히 한정되지 않는다. 예를 들어 상치, 배추, 감자 및 무를 포함하는 대부분의 쌍자엽 식물(dicotyledonous plant) 또는 벼, 보리, 바나나 등의 단자엽 식물 (monocotyledonous plant)이 모두 이용될 수 있으며, 벼, 밀, 보리, 옥수수, 콩, 감자, 밀, 팥, 귀리 및 수수를 포함하는 식량 작물류; 애기장대, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파 및 당근을 포함하는 채소 작물류; 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무우, 들깨, 땅콩 및 유채를 포함하는 특용 작물류; 사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 양다래, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구 및 바나나를 포함하는 과수류; 장미, 글라디올러스, 거베라, 카네이션, 국화, 백합 및 튤립을 포함하는 화훼류; 및 라이그라스, 레드클로버, 오차드그라스, 알파알파, 톨페스큐 및 페레니얼라이그라스를 포함하는 사료 작물류로 구성된 군으로부터 선택되는 식물체에 적용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 상기 형질전환 식물세포가 재분화된 식물체, 형질전환 된 종자 및 식물체는 AHL 유전자 또는 AHL 단백질을 발현하므로, 상기 AHL 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 도입함으로써 식물체에 존재하는 AHL 단백질의 발현을 증진시킬 수 있다.
본 발명의 방법은 시스테인을 종자 또는 식물체에 처리하는 단계를 더 포함할 수 있다.
상기 시스테인의 처리는 전술한 방법을 이용할 수 있다.
상기 재조합 벡터를 식물세포, 종자 또는 식물체에 형질전환 시키는 단계를 포함하는 식물 내염성 증가방법에 있어서, 형질전환된 종자, 또는 식물체에 시스테인을 처리하는 단계를 더 포함할 수 있다.
상기 시스테인의 처리는 전술한 방법을 이용할 수 있다.
이하, 본 발명을 구체적으로 설명하기 위해 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다.
실시예
실험재료 및 방법
1. 식물 재료 및 성장 조건 및 염분 스트레스 처리
Arabidopsis thaliana (Col-0), ahl 돌연변이(RNA interference lines), 및 이전 연구들인 Tinh Van Nguyen et al., "proline content alterative 17 (pca17) is involved in glucose response through sulfate metabolism-mediated pathway," Plant Physiol Biochem(2019): 320-328. 및 Da-Jeong Shin et al., "Loss of Arabidopsis Halotolerance 2-like (AHL), a 3′-phosphoadenosine- 5′-phosphate phosphatase, suppresses insensitive response of Arabidopsis thaliana ring zinc finger 1 (atrzf1) mutant to abiotic stress," Plant Mol Biol(2019):363-377.에서 사용된 AHL pro- β-glucuronidase (GUS2-1, GUS3-3), AHL-RNAi계통 (ri2-3, ri5-2) 및 AHL 과발현 계통 (OE2-2, OE5-1)을 포함하는 AHL 형질전환식물을 실험에 사용했다. 식물은 표준 성장 챔버에서 재배되었다. (16 시간 빛 조건 / 8 시간 암 조건, 22℃, 60 % 상대 습도 및 110 μmol m-2sec-1 강렬한 빛). 염분 스트레스 처리를 위해 10일생 식물들을 150mM NaCl 용액에 담궜다. 그리고 각각 0, 3, 6, 12 및 24 시간 후 다시 건져냈다.
2. β-glucuronidase (β-글루쿠로니다제, GUS) 염색 분석
우선, AHL pro-GUS 형질전환 식물에서 GUS 염색을 공지된 방법에 의해 수행되었다. 그 후 전체 묘목을 1mM 5- bromo -4- chloro -3- indolyl -β- glucuronic acid (X-Gluc)이 함유된 100mM 인산 나트륨 용액 (pH 7.0)에 넣은 후 37℃에서 12 시간 동안 배양했다. 그 후 70 % 에탄올로 엽록소를 제거한 후 현미경으로 묘목을 촬영하였다.
3. 염 스트레스 유발 민감도 분석
염 스트레스 유발 민감도 실험의 경우, 종자를 150mM NaCl이 있는 조건과 없는 조건에서 각각 one-half strength MS (for Murashige and Skoog)플레이트에 파종하고 성장 챔버에서 재배했다. 그 후 종자 발아 및 생존율을 측정했다. 시스테인(Cysteine)에 대한 염 스트레스 반응을 조사하기 위해, 종자를 40μM 시스테인(Cysteine) 및 150mM NaCl이 포함된 one-half strength MS (for Murashige and Skoog)플레이트에 파종하고 성장 챔버에서 재배했다. 그 후 생존율을 측정했다. 데이터는 3개의 biological replicates에서 얻었다 (각 replicate, 유전자형마다 50개 종자 사용).
4. 아미노산과 말론다이알데하이드(malondialdehyde,MDA) 측정
Pro는 약 200mg의 묘목에서 3%의 설포살리실산(sulfosalicylic acid) 2 mL로 균질화 후 200μL의 닌하이드린(ninhydrin) 시약 용액을 반응시켜 얻었다. 반응 혼합물을 400 μL의 톨루엔과 혼합하여 볼텍싱 했다. UV / VIS 분광 광도계 (JASCO, Tokyo, Japan)를 사용했고 톨루엔 층의 흡광도는 520nm로 측정되었다. Pro 농도는 표준 곡선에서 계산되었다. 시스테인(Cysteine)는 5 % 차가운 과염소산 용액에서 균질화하고 4 °C에서 20 분 동안 10,000rpm에서 원심 분리한 500mg 묘목 샘플에서 얻었다. 상층액을 ninhydrin 시약 및 빙초산과 동일한 부피 (1 : 1, mL)로 혼합했다. 이어서 반응 혼합물을 95 ℃에서 10 분 동안 가열하고 얼음에서 빠르게 냉각시켰다. 흡광도는 560 nm에서 측정되었다. 시스테인(Cysteine) 농도는 표준 곡선에서 계산되었다. MDA는 약 200mg의 묘목을 10 % 트리클로로 아세트산 (TCA) 완충액으로 분쇄한 다음 10,000rpm에서 15 분 동안 원심 분리하여 얻었다. 상층액 (0.5mL)을 0.6 % 티오바르비투르산(thiobarbituric acid) 1mL 및 10 % TCA와 혼합했다. 이어서 반응 혼합물을 95 ℃에서 15 분 동안 가열하고 얼음에서 빠르게 냉각시켰다. 착색된 상층액의 흡광도 값은 532 nm 파장에서 측정되었으며 450 및 600 nm에서 비특이적 흡광도에 대해 보정되었다.
5. 3,3'-diaminobenzidine (DAB) 염색 및 hydrogen peroxide (H
2
O
2
) 측정
H2O2 축적은 DAB 염색 버퍼에 의해 감지되었다. 10일 된 묘목을 150mM NaCl 용액에 12 시간 동안 담근 후 DAB 용액으로 12 시간 동안 염색했다. 아세트산, 에탄올, 글리세롤 (v : v : v, 1 : 3 : 1)로 엽록소를 제거한 후 묘목을 촬영했다. 묘목의 H2O2 농도를 알아내기 위해 요오드화 칼륨 완충액을 사용한 비색 기법(colorimetric technique)이 사용되었다. 150mM NaCl이 처리된 냉동 샘플 500mg을 0.1 % TCA, 1M 요오드화 칼륨 및 10mM 인산 칼륨 완충액 (pH 8.0)을 포함하는 2mL의 추출 완충액에서 4℃에서 균질화 했다. 균질물은 4℃에서 20 분 동안 12,000 rpm으로 원심 분리되었다. UV / VIS 분광 광도계 (JASCO, Tokyo, Japan) 350nm에서 상층액의 흡광도를 판독했다. 0.1 % TCA에서 제조된 H2O2 용액으로 얻은 보정 표준 곡선을 정량화에 사용했다.
6. Total RNA 추출 및 정량 실시간 PCR (qPCR) 분석
Plant RNeasy 추출 키트 (Qiagen, Valencia, CA)를 사용하여 묘목 샘플로부터 Total RNA를 분리했다. 제조업체의 지침 (Qiagen)에 따라 RNase가없는 DNase I 효소로 처리하여 Total RNA 제제에서 게놈 DNA를 제거했다. Total RNA의 농도는 분광 광도 측정을 사용하여 정량화 했으며, Total RNA의 3μg를 1.0 % 포름 알데히드 아가로스 겔에서 분리하여 RNA 농도를 알아내고 RNA integrity를 시각화 했다. qPCR은 CFX Connect 정량 PCR 장치 (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)를 사용하여 수행했다. IQ SYBR Green Supermix 키트 (Bio-Rad)는 제조업체의 지침에 따라 qPCR에 사용되었다. 액틴 1 (ACT1)은 내부 대조군으로 사용되었다. delta delta-CT 방법을 사용하여 정량 분석을 수행했다. 데이터는 3개의 biological replicates에서 얻었다(각 replicate, 각 유전자형 마다 12개 이상의 묘목사용). 실험에 사용된 반응 프라이머는 표 1에 제시되어있다.
| qPCR | Primer sequence (5' to 3') | 서열번호 |
| AHL (At5g54390) | Forward: GTGAAGCTTTTTGATATCTCTTT | 3 |
| Reverse: ACCATTCTCTATCAAAGCTAAA | 4 | |
| RD29A (At5g52310) | Forward: GACGGGATTTGACGGAGA | 5 |
| Reverse: CCGCCACATAATCTCTACCC | 6 | |
| ABI5 (At2g36270) | Forward: GAGATGACNCTBGAGGAGTT | 7 |
| Reverse: TTCTTGATCATCCTCCTCTG | 8 | |
| ACD1 (At2g16500) | Forward: CCGCGTTTGATTACGCGATT | 9 |
| Reverse: GCTTCCTCACCACACGAAGA | 10 | |
| ACD2 (At4g34710) | Forward: GACCGGAGCTCAGTGAAACA | 11 |
| Reverse: GGTCACTGCAAAGCTGTGTG | 12 | |
| AOX1a (At3g22370) | Forward: GGGTATCATTGATTCGATTA | 13 |
| Reverse: GTTATGATGATATCAATGGT | 14 | |
| AREB3 (At3g56850) | Forward: GAATTCATGTCAAGTATTCGGAATAC | 15 |
| Reverse: GTCGACATAGTCAAAAGGCCATCCAC | 16 | |
| AtOZF2 (At4g29190) | Forward: ATGATGATCGGAGAAACTCG | 17 |
| Reverse: ACACGGCTGAGTACGGTAAC | 18 | |
| P5CS1 (At2g39800) | Forward: CGACGGAGACAATGGAATTGT | 19 |
| Reverse: GATCAGAAATGTGTAGGTAGC | 20 | |
| RD26 (At4g27410) | Forward: GATCCGTTAGCCCAGTTGAG | 21 |
| Reverse: GTTTTAGTGCCTTTGGGAGC | 22 | |
| RbohD (At5g47910) | Forward: ATGAAAATGAGACGAGGCAA | 23 |
| Reverse: TGGTGTTGTTGAGGCTGCTC | 24 | |
| APK1 (At2g14750) | Forward: CACCACCGTGAGATATGATC | 25 |
| Reverse: GACCCAAATCACACATCCT | 26 | |
| APR1 (At4g04610) | Forward: CTCGTTTCGGTGTTTCATTGGAGCC | 27 |
| Reverse: ACAATCCCTTGCTCCTAACCAAACC | 28 | |
| OASA1 (At4g14880) | Forward: CAGTGAAGCTTGAATCATGG | 29 |
| Reverse: GCTGAAGCATGTAACCATTG | 30 | |
| SiR (At5g04590) | Forward: CAGAAGATCAGACTTGGGAG | 31 |
| Reverse: CACCATGAAGCTGAAACGTC | 32 | |
| ACT1 (At1g49240) | Forward: CATCAGGAAGGACTTGTACGG | 33 |
| Reverse: GATGGACCTGACTCGTCATAC | 34 |
7. 통계 분석
통계 분석은 SPSS 23.0 소프트웨어 (IBM Co, Armonk, NY)를 사용하여 수행되었으며 일원 분산 분석 (ANOVA) 및 Duncan의 다중 범위 테스트가 포함되었다. Duncan의 다중 범위 테스트에서 P <0.05는 통계적으로 유의한 차이를 나타낸다.
실험 결과
1. NaCl 처리에 의한 AHL 발현 증가
염분 스트레스에 대한 AHL의 기능을 조사하기 위해, 처음에 150 mM NaCl 처리를 한 10 일 된 Arabidopsis 묘목에서 AHL의 발현 패턴을 측정했다. 정량 실시간 PCR (qPCR)은 염분 스트레스 처리 후 6 ~ 12 시간 이내에 샘플에서 AHL 전사체 수준이 유의하게 증가했지만 그 후 감소하는 것으로 나타났다(도 1 A). RD29A (Responsive to Dehydration 29A)는 염분 스트레스 치료를 위한 양성 대조군으로 사용되었다(도 1 A). 결과는 AHL이 염분 처리에 의해 상향 조절된다는 것을 나타낸다. Arabidopsis 묘목의 여러 기관들에서 AHL의 발현에 대한 추가 자료를 얻기 위해 물 (H2O) 또는 염분 (150mM NACL)처리에 따른 1,925-bp AHL 프로모터 (pro) -GUS 형질 전환 계통 (2-1 및 3-3)의 GUS 염색을 분석했다. 도 1의 B에 나타난 바와 같이, 2 개의 개별 AHL pro-GUS 형질 전환 계통에서 H2O 처리 조건 하에서 잎의 정맥, 1 차 뿌리 및 후기 뿌리에서 GUS 염색이 관찰되었다. 150mM NaCl을 AHL pro-GUS 형질전환 묘목에 12 시간 동안 적용했을 때, GUS 활성은 염분 처리되지 않은 조건에서 보다 더 크게 증가했다 (도 1 B). 또한 염분 처리 후 배축(화살표)에서 GUS 염색이 검출되었으나 정상 조건에서는 검출되지 않았다. 따라서 AHL은 뿌리와 잎맥뿐만 아니라 고염도 조건에서 배축 조직에서도 염 스트레스 반응의 조절에 관여하는 필수 생물학적 분자다.
2. 염분 스트레스에 높은 내성을 부여하는 AHL 과발현
AHL 발현은 NaCl 처리에 의해 상향 조절되기 때문에 (도 1), 우리는 종자 발아 및 생존율을 측정하여 AHL 형질 전환 식물의 염분 스트레스 내성 조절에 AHL이 필요한지 여부를 조사했다. WT, ahl, AHL-RNAi (ri 2-3, ri 5-2) 및 AHL 과발현 (OE 2-2, OE 5-1) 식물의 종자는 0 또는 150mM NaCl을 함유하는 one-half strength MS 배지에서 발아되었다. 발아율은 150mM NaCl이 없을 때 WT, ahl 및 AHL 형질 전환 식물 간에 차이가 없었다 (데이터는 표시되지 않음). 종자 파종 4 일 후 150mM NaCl에 노출되면 두 종류의 AHL 과발현 종자의 84 ~ 92 %가 발아한 반면 WT의 63 %, ahl의 53 % 및 47 ~ 49 %와 두 개체 AHL-RNAi 계통은 각각 발아되었다 (도 2a의 A). 이러한 결과는 AHL 과발현 계통의 종자 발아가 ahl 돌연변이 및 AHL-RNAi 계통에서 보다 염분 스트레스에 내성이 있음을 나타낸다. 높은 염분 스트레스는 또한 종자 파종 후 18 일에 생존율에 상당한 차이를 가져왔다. WT 종자 중의 53 %, ahl 돌연변이(RNA interference lines) 종자 중의 23 % 및 두 AHL-RNAi 계통의 종자 중에 27-36 %가 녹색 잎을 생산한 것과 비교하면, 두 가지 유형의 AHL 과발현 종자 중 65-69 %가 녹색 잎을 생산했다. (도 2a의 B, 도 2b의 C). 종합적으로, 이러한 관찰은 AHL 발현이 염분 스트레스 조건에서 조기 묘목 성장과 관련이 있음을 시사한다. 염분 스트레스 조건에서 AHL 형질전환 계통의 Pro(Proline) 함량을 측정하기 위해 WT, ahl돌연변이(RNA interference lines), AHL-RNAi (ri 2-3) 및 AHL- 과발현 (OE 2-2) 식물의 전체 묘목의 Pro 함량을 분석했다. 염분 스트레스 처리가 없는 경우 이 모든 샘플의 Pro 수준은 비슷했다(도 2b의 D). 그러나 150mM NaCl의 존재 하에서 Pro 함량은 WT, ahl 돌연변이(RNA interference lines) 및 AHL-RNAi 식물보다 AHL-OE 계통에서 더 높았으며, WT 식물보다 ahl 돌연변이(RNA interference lines) 및 AHL-RNAi 계통에서 더 낮았다 (도 2b의 D). 이 분석은 AHL이 염분 스트레스 조건에서 Pro 축적을 조절하는 데 필요하다는 것을 보여준다.
3. 염분 스트레스 조건에서 H
2
O
2
축적 및 산화 손상을 조절하는 AHL
염분 스트레스는 식물 조직에 H2O2 및 산소 자유 라디칼과 같은 ROS의 축적을 초래한다. 염분 스트레스 조건 하에서 ROS 생산에 대한 AHL 발현의 효과를 평가하기 위해, WT, ahl 돌연변이(RNA interference lines) 및 AHL 형질전환 샘플의 전체 묘목을 150mM NaCl로 12 시간 동안 처리한 다음 H2O2 축적 분석을 위해 DAB 용액으로 염색했다. 염분 스트레스가 없을 때 H2O2 수준은 WT, ahl 돌연변이(RNA interference lines), AHL-RNAi (ri2-3) 및 AHL 과발현 (OE2-2) 묘목 간에 유사했다(도 3 A). 염분 스트레스 처리로 H2O2 생산은 WT 및 OE2-2 묘목보다 ahl 및 ri2-3 전체 묘목에서 더 높았다(도 3 A). 그 후, 고염 처리된 전체 묘목에서 H2O2 생산량을 측정했다. 도 3 B에서 볼 수 있듯이 H2O2 수준은 WT 및 AHL 과발현 묘목에서 보다 ahl 돌연변이(RNA interference lines) 및 AHL-RNAi 계통에서 유의하게 높았으며, H2O2 수준은 염 스트레스 하에서 WT 묘목보다 AHL 과발현 형질전환 계통에서 유의하게 낮았다. 이러한 관찰은 AHL이 염분 스트레스 하에서 과산화수소 축적의 조절에 관여한다는 것을 보여준다. 일반적으로 MDA 함량은 산화 손상의 지표로 간주된다. 따라서 우리는 묘목의 MDA 함량을 분석하여 염분 스트레스 조건을 받은 ahl 돌연변이(RNA interference lines) 및 AHL-RNAi 묘목의 산화적 손상을 평가했다. 염분 스트레스 처리없이 모든 샘플 식물의 기본 MDA 수준은 유사했다 (도 3 C). 염분 스트레스 처리를 통해, ahl 돌연변이(RNA interference lines) 및 AHL-RNAi 묘목의 MDA 함량은 WT 또는 AHL 과발현 형질전환 묘목보다 컸으며 (도 3 C), 이는 AHL이 ROS 관련 과정에 참여하여 염 스트레스 반응을 조절함을 의미한다.
4. AHL 형질 전환 계통에서 염 스트레스 반응 유전자의 발현
분자 수준에서 AHL 형질전환 계통의 염분 스트레스 반응을 조사하기 위해, ABA, 탈수, 염분, 산화 및 생물학적 스트레스에 의해 유발되는 것으로 알려져 있는 ABA-insensitive 5 (ABI5), Arginine Decarboxylase 1 (ADC1), ADC2, Alternative Oxidase 1a (AOX1a), ABA-Responsive Element Binding 3 (AREB3), Arabidopsis thaliana Oxidation-related Zinc Finger 2 (AtOZF2), Delta 1-pyrroline-5- carboxylate synthase 1 (P5CS1), Response to Drought 26 (RD26) 및 Respiratory burst oxidase homologue-D (RbohD) 유전자들의 전사 수준을 분석했다. qPCR 분석결과 염분 스트레스 조건 하에서 ABI5, ADC1, ADC2, AOX1a, AREB3, AtOZF2, P5CS1 및 RD26의 발현 수준이 WT 식물에 비해 AHL 과발현 (OE2-2) 계통에서 더 높았지만, ahl 돌연변이(RNA interference lines) 및 AHL-RNAi (ri2-3) 계통에서는 상기 유전자들 발현 수준이 WT 식물에 비해 더 낮았다 (도 4 A-H). RbohD 발현은 WT보다 염분 스트레스 처리된 ahl 돌연변이(RNA interference lines) 및 ri2-3 식물에서 더 높았고, WT보다 염 스트레스 처리된 OE2-2 식물에서 더 낮았다 (도 4 I). qPCR 결과는 AHL이 염분 스트레스 반응 유전자를 긍정적으로 조절함을 나타낸다.
5. 염분 스트레스 조건에서 AHL 단백질 저발현 계통의 cycteine level 감소
시스테인(Cysteine)은 식물의 환원된 황 합성에 관여하는 필수 유기 아미노산이다. 시스테인(Cysteine)은 항산화 글루타티온(antioxidant glutathione), 비타민, 싸이오닌(thionin) 및 글루코시놀레이트(glucosinolate)와 같은 필수 성분의 중요한 전구체다. 또한 시스테인(Cysteine)은 생체 조절기 역할을 하며 고 포도당, 산화 및 염분 스트레스 조건 하에서 식물 생장과 생산성을 촉진하는데 중요한 역할을 한다. 염분 스트레스에 대한 반응을 추가로 평가하기 위해 WT, ahl 돌연변이(RNA interference lines) 및 AHL 형질전환 식물의 염분 스트레스가 처리된 rosette 잎의 시스테인(Cysteine) 함량을 측정했다. 도 5 A에서 볼 수 있듯이 시스테인(Cysteine) 함량은 WT, ahl 돌연변이(RNA interference lines) 및 AHL-RNAi 식물보다 AHL 과발현 계통에서 더 높았고, 높은 농도의 NaCl 존재 여부에 관계없이 WT 식물보다 ahl 돌연변이(RNA interference lines) 및 AHL-RNAi 계통에서 더 낮았다. 이 결과는 AHL이 A. thaliana에서 시스테인(Cysteine) 생산을 조절함을 나타낸다. AHL 발현으로 인한 시스테인(Cysteine) 함량의 변화는 황산염 대사를 담당하는 것으로 알려진 Adenosin-5'-phosphosulfate kinase 11 (APK1), 3'-Phosphoadenosine 5'-phosphosulfate reductase 1 (APR1), O-Acetylserine (thiol) Lyase 1 (OASA1) 및 Sulfite reductase (SiR)를 포함한 유전자를 평가하게 했다. qPCR 분석은 WT 식물과 비교하여 APK1, APR1 및 OASA1의 발현 수준이 AHL 과발현 (OE2-2) 계통에서 더 높았고 염 스트레스 처리된 ahl 돌연변이(RNA interference lines) 및 AHL-RNAi (ri2-3) 계통에서 더 낮았다 (도 5 B-D). 염분 스트레스가 처리된 OE2-2 식물에서 SiR의 발현 수준은 WT, ahl 돌연변이(RNA interference lines) 및 ri2-3 식물에서보다 더 높았지만, 염분 스트레스 처리 동안 WT, ahl 돌연변이(RNA interference lines) 및 ri2-3 식물에서 SiR의 전사 수준이 유사했다. (도 5 E). 이러한 결과는 AHL이 염분 스트레스 하에서 이러한 황산염 대사 관련 유전자의 발현을 조절함을 나타내며, 이는 AHL이 황산염 대사 매개 경로를 통해 염분 스트레스 반응에 참여함을 의미한다.
6. 시스테인(Cysteine)의 초기 묘목 성장의 염분 스트레스 유발 억제를 조절
이전 데이터는 시스테인(Cysteine)의 축적과 OASA1 (시스테인 생합성 효소)의 발현이 염분 스트레스 처리 동안 WT 및 AHL 과발현 식물에서보다 ahl돌연변이(RNA interference lines) 및 AHL-RNAi 계통에서 더 낮다는 것을 보여주었다 (도 5 A 및 D). 또한 염분 스트레스 조건 하에서 시스테인-메티오닌 유도체 경로에서 폴리아민 합성 관련 유전자 (ADC1 및 ADC2)의 발현 수준은 WT 및 AHL 과발현 계통에 비해 ahl 돌연변이(RNA interference lines) 및 AHL-RNAi 계통에서 더 많이 억제되었다. (도 4 B 및 C). 따라서, 우리는 ahl 및 AHL-RNAi 계통의 염분 스트레스에 대한 민감도가 외인성 시스테인(Cysteine)의 적용으로 회복될 수 있는지 여부를 테스트했다. 염분 스트레스 반응에 대한 시스테인(Cysteine)의 영향을 분석하기 위해 염분 스트레스 하에서 WT, ahl 돌연변이(RNA interference lines), AHL-RNAi (ri2-3, ri5-2) 및 AHL 과발현 (OE2-2, OE5-1) 묘목의 생존율을 측정했다. 40 μM 시스테인(Cysteine)의 존재 조건 및 높은 NaCl 조건에서 시스테인(Cysteine)을 처리한 모든 샘플 묘목은 처리되지 않은 묘목보다 더 높은 생존율을 나타냈다 (도 6). 이러한 결과는 시스테인(Cysteine)가 A. thaliana에서 염분 스트레스 유발 생존 억제를 조절할 수 있음을 나타낸다. 도 6에서 보는 바와 같이 시스테인(Cysteine)을 처리했을 때 WT, ahl 돌연변이(RNA interference lines) 및 AHL-RNAi 묘목의 생존율은 높은 염분 스트레스 조건에서 유사했지만, 염분 스트레스 조건 하에서 AHL 과발현 형질 계통의 생존율보다 낮았다. 이 생존 데이터는 시스테인(Cysteine)이 염분 스트레스 조건에서 묘목 성장을 조절하는 데 중요한 역할을 한다는 것을 시사한다.
<110> INDUSTRY FOUNDATION OF CHONNAM NATIONAL UNIVERSITY
<120> COMPOSITION FOR IMPROVING PLANT SALINITY TOLERANCE AND METHOD FOR
INCREASING PLANT SALINITY TOLERANCE
<130> 21P04042
<160> 34
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 373
<212> PRT
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 1
Met Ala Val Asp Ser Leu Glu Thr Glu Ile Asp Thr Ala Val Arg Val
1 5 10 15
Val His Leu Ala Ser Ser Leu Cys Val Lys Val Gln Glu Lys Leu His
20 25 30
Leu Pro Asn Gly Gly His Val Lys Ser Lys Asp Asp Asp Ser Pro Val
35 40 45
Thr Val Ala Asp Phe Gly Val Gln Ala Ile Val Ser Trp Val Leu Ala
50 55 60
Glu Val Phe Gly Asp Gln Asn Leu Ser Ile Val Ala Glu Glu Asp Thr
65 70 75 80
Glu Thr Leu Ser Glu Ala Asp Ser Leu Gly Leu Leu Gly Ala Val Ser
85 90 95
Asn Ala Val Asn Glu Ala Leu Ser Glu Ala Gln Asn Tyr Gly Leu Pro
100 105 110
Lys Pro Val Lys Pro Leu Gly Ser Ser Glu Ile Leu Lys Ala Ile Ser
115 120 125
Arg Cys Asn Ser Val Gly Gly Pro Lys Gly Arg His Trp Val Leu Asp
130 135 140
Pro Val Asp Gly Thr Leu Gly Phe Val Arg Gly Asp Gln Tyr Ala Val
145 150 155 160
Ala Leu Ala Leu Ile Glu Asn Gly Lys Val Leu Leu Gly Val Leu Gly
165 170 175
Cys Pro Asn Tyr Pro Val Lys Lys Glu Cys Leu Ser Asn Gly Cys Asn
180 185 190
Gln Ala Met Lys Thr Lys Ala Val Ala Gly Ser Val Ser Lys Gly Cys
195 200 205
Val Met Tyr Ala Lys Arg Gly Ser Gly Gln Ala Trp Met Gln Pro Leu
210 215 220
Ile Val Gly Gly Ile Pro Glu Ser Ala Thr Leu Leu Lys Val Ser Ser
225 230 235 240
Val Asp Asp Pro Val Leu Ala Thr Val Cys Glu Pro Val Glu Arg Ala
245 250 255
Asn Ser Asn His Leu Phe Thr Ala Gly Leu Ala Asn Ser Met Gly Val
260 265 270
Arg Lys Gln Pro Met Arg Val Tyr Ser Met Val Lys Tyr Ala Ala Ile
275 280 285
Ala Arg Gly Asp Ala Glu Val Phe Met Lys Phe Ala Gln Ser Ser Tyr
290 295 300
Lys Glu Lys Ile Trp Asp His Ala Ala Gly Val Val Ile Val Glu Glu
305 310 315 320
Ala Gly Gly Val Val Thr Asp Ala Gly Gly Arg Asn Leu Asp Phe Ser
325 330 335
Lys Gly Val Tyr Leu Glu Gly Leu Asp Arg Gly Ile Ile Ala Cys Ser
340 345 350
Gly Gln Val Leu His Glu Lys Ile Ile Gly Ala Val Tyr Ala Ser Trp
355 360 365
Glu Ser Ser Ser Leu
370
<210> 2
<211> 2097
<212> DNA
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 2
gtattaaaag aaagaaagaa aaaaaaagga gaggagaaga agcagtggag agagagcatg 60
tgaataaaaa gcgtgaagct ttttgatatc tctttctctt cctcttcctt tctcctccga 120
tagatttcgc cggcgatggc ggtggactcc ttagaaacgg agattgacac ggcggtgcgt 180
gttgtccacc tcgcttcttc tctctgtgtt aaagttcaag agaagcttca tcttcctaac 240
ggtggtcacg ttaagtctaa agacgatgat tcccctgtca ccgtcgctgg ttcgatttct 300
ctgtttctct gttttgtgtt ctgttttttt ctaattgtaa ttttgagatc tgtttgtgtt 360
aaataaaaaa aaaacgaatt tttgatgttg gattgtgtaa tcgaataatc atgttcttta 420
attcgttgat agatgaaaca aaatgtgtat taaaatacaa aagtttgcaa cttttcatca 480
cttccaatga ttctctgtat tagtagttca atagtgtatc aaagttttaa acttttgttg 540
attcacttga cagattttgg tgtacaagca attgtgagct gggttttagc tgaagtgttt 600
ggtgatcaaa acctttcaat tgttgctgaa gaagacactg agacactctc tgaggctgat 660
tctttaggtc ttttaggagc tgtgtcgaat gcggttaatg aagcattgtc cgaagctcag 720
aactacgggc ttccgaagcc agttaagcca ttggggtcta gtgaaattct taaggctatt 780
agtagatgta actctgttgg aggacctaaa ggaaggcatt gggttcttga tcctgttgat 840
ggaacgttag ggtttgttcg tggggatcag tatgctgttg ctttagcttt gatagagaat 900
ggtaaagttc ttttgggtgt actaggatgt cctaattatc cggttaagaa agaatgttta 960
agtaatggtt gtaaccaagc tatgaagacg aaagctgttg ctggttcagt atcgaaagga 1020
tgtgttatgt atgcaaagag aggtagtggt caagcttgga tgcaaccttt gatcgttgga 1080
ggaataccag aatctgcaac acttcttaag gtttcttcag ttgatgatcc ggttttagct 1140
acagtttgtg agccagtaga gagagcaaac tcaaaccact tgttcactgc aggacttgcc 1200
aatagcatgg gagttaggta aatgttgttt attcactctc ttattcaaat gttacgttat 1260
tgaccaaaag ttttttgctc tgcagaaagc agcctatgcg agtgtatagc atggtgaaat 1320
atgcagcgat tgcacgtgga gacgctgaag tgtttatgaa gtttgcacag tcaagttaca 1380
aagagaagat atgggatcac gcagctggag ttgttattgt ggaagaagct ggtggtgtgg 1440
tgactgatgc gggagggaga aacttagact tctcgaaagg tgtttacttg gaaggtcttg 1500
accgtggaat catcgcatgt tctggtcaag ttttacatga gaagattata ggtgctgttt 1560
atgctagttg ggaatcttcc agtctctgaa aaagcttatc cacaatccgt agtttggtgc 1620
agcatcatcg agccaaagca aaggtaaaga agataacaaa ttgtcctctt caagattgta 1680
atcatatttg tagattactg cataagctag tggtttttaa tcggtttatt tgttccggtt 1740
taggaggaac aagggccatt acggtttagg atgagcaagg gccagtttca atgaatgtga 1800
atggcggaga agtaaatata gtcgaggaag cagcggtaaa agtaagaatc tagtttattt 1860
acctatctaa gagtaataaa gctgctgcat ttcacgaacc cttatgttct atgatcttta 1920
atggatgata tcatttttaa tcttcgtcct gtaataattc accttcaaaa cgcggattat 1980
acatgtcgtt ttcctgacaa aagacaaaaa ttagtaaatt actgaatagg ctctaactta 2040
ctccatgcta tttcaatggt taacgaccca aattgtctct caaatttaaa gattcaa 2097
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 3
gtgaagcttt ttgatatctc ttt 23
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 4
accattctct atcaaagcta aa 22
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Primer
<400> 5
gacgggattt gacggaga 18
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Primer
<400> 6
ccgccacata atctctaccc 20
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Primer
<400> 7
gagatgacnc tbgaggagtt 20
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<213> Artificial Sequence
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ttcttgatca tcctcctctg 20
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ccgcgtttga ttacgcgatt 20
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gcttcctcac cacacgaaga 20
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gaccggagct cagtgaaaca 20
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<223> Primer
<400> 12
ggtcactgca aagctgtgtg 20
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Primer
<400> 13
gggtatcatt gattcgatta 20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 14
gttatgatga tatcaatggt 20
<210> 15
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 15
gaattcatgt caagtattcg gaatac 26
<210> 16
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
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gtcgacatag tcaaaaggcc atccac 26
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 17
atgatgatcg gagaaactcg 20
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 18
acacggctga gtacggtaac 20
<210> 19
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 19
cgacggagac aatggaattg t 21
<210> 20
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 20
gatcagaaat gtgtaggtag c 21
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 21
gatccgttag cccagttgag 20
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
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gttttagtgc ctttgggagc 20
<210> 23
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Primer
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atgaaaatga gacgaggcaa 20
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
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tggtgttgtt gaggctgctc 20
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<212> DNA
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<223> Primer
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<213> Artificial Sequence
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cagaagatca gacttgggag 20
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<220>
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caccatgaag ctgaaacgtc 20
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<212> DNA
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catcaggaag gacttgtacg g 21
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<212> DNA
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<220>
<223> Primer
<400> 34
gatggacctg actcgtcata c 21
Claims (6)
- AHL(Arabidopsis Halotolerance 2-like) 단백질의 발현 증가제를 포함하는 식물의 내염성 개선용 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 상기 AHL 단백질의 발현 증가제는 AHL 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터인 식물의 내염성 개선용 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 시스테인을 더 포함하는 식물의 내염성 개선용 조성물.
- AHL(Arabidopsis Halotolerance 2-like) 단백질 발현 증가제를 식물 세포, 종자, 또는 식물체에 처리하는 단계를 포함하는 식물의 내염성 증가 방법.
- 청구항 4에 있어서, 상기 AHL 단백질 발현 증가제는 AHL 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터이고, 상기 방법은 이를 식물세포, 종자 또는 식물체에 형질전환 시키는 것인 식물 내염성 증가 방법.
- 청구항 4에 있어서, 시스테인을 종자 또는 식물체에 처리하는 단계를 더 포함하는 식물 내염성 증가 방법.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020210076099A KR20220167045A (ko) | 2021-06-11 | 2021-06-11 | 식물의 내염성 개선용 조성물 및 식물의 내염성 증가 방법 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020210076099A KR20220167045A (ko) | 2021-06-11 | 2021-06-11 | 식물의 내염성 개선용 조성물 및 식물의 내염성 증가 방법 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20220167045A true KR20220167045A (ko) | 2022-12-20 |
Family
ID=84539147
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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| KR1020210076099A KR20220167045A (ko) | 2021-06-11 | 2021-06-11 | 식물의 내염성 개선용 조성물 및 식물의 내염성 증가 방법 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR20220167045A (ko) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20200139872A (ko) | 2019-06-04 | 2020-12-15 | 대한민국(농촌진흥청장) | 내염성 BrZHD10 유전자 및 이의 용도 |
-
2021
- 2021-06-11 KR KR1020210076099A patent/KR20220167045A/ko not_active Application Discontinuation
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20200139872A (ko) | 2019-06-04 | 2020-12-15 | 대한민국(농촌진흥청장) | 내염성 BrZHD10 유전자 및 이의 용도 |
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