KR20220166811A - 바실러스 코아굴란스 포자 조성물을 사용한 유기 폐기물로부터의 락트산의 생산 - Google Patents

바실러스 코아굴란스 포자 조성물을 사용한 유기 폐기물로부터의 락트산의 생산 Download PDF

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Abstract

발효에 의해 락트산을 생산하기 위해 유기 폐기물을 재활용하는 시스템 및 방법이 제공되며, 이는 락트산-생산 박테리아인 바실러스 코아굴란스(Bacillus coagulans)의 포자의 건조 또는 부분 건조 조성물을 이용한다.

Description

바실러스 코아굴란스 포자 조성물을 사용한 유기 폐기물로부터의 락트산의 생산
본 발명은 발효 공정에 의해 락트산을 생산하기 위해 유기 폐기물을 산업적 재활용하는 것에 관한 것으로, 이는 락트산-생산 박테리아인 바실러스 코아굴란스(Bacillus coagulans) 포자의 건조 또는 부분 건조 조성물을 이용한다.
락트산 발효, 즉 미생물 발효를 통해 탄수화물 공급원으로부터 락트산을 생산하는 것은 바이오플라스틱(bioplastics) 제조의 빌딩 블록으로서 락트산을 사용하는 능력으로 인해 최근 몇 년 동안 관심을 받고 있다. 락트산은 중합되어 생분해성이며 재활용 가능한 폴리에스테르인 폴리락트산(PLA)을 형성할 수 있으며, 이는 석유로 제조된 플라스틱의 잠재적인 대체물로 간주된다. PLA는 식품 포장재, 일회용품, 섬유 및 위생 제품 산업의 섬유 등을 포함한 다양한 제품의 제조에 사용된다. PLA는 3D 프린팅에서 가장 널리 사용되는 플라스틱 필라멘트 소재이다.
발효 생물공정에 의한 락트산의 생산은 환경 문제, 비용 및 PLA의 대부분의 산업적 응용에 요구되는, 화학적 합성에 의한 거울상 이성질체적으로 순수한 락트산 생산의 어려움을 포함한 다양한 고려 사항에서 화학적 합성 방법보다 선호된다. 종래의 발효 공정은 전형적으로 탄수화물 발효의 주요 대사 최종 생산물로서 락트산을 생산하는 락트산-생산 미생물에 의한 혐기성 발효에 기초한다. PLA 생산을 위해, 발효 과정 동안 생산된 락트산을 발효 브로스(fermentation broth)로부터 분리하고 다양한 더운스트림 공정을 거쳐 정제한 다음, 정제된 락트산을 중합시킨다.
락트산은 키랄 탄소 원자를 가지고 있으므로 D- 및 L-락트산의 두 가지 거울상 이성질체 형태로 존재한다. 산업적 응용에 적합한 PLA를 생산하기 위해서는 중합 과정에서 하나의 거울상 이성질체만 이용해야 한다. 불순물의 존재 또는 D-락트산과 L-락트산의 라세미 혼합물은 낮은 결정도 및 낮은 용융 온도와 같은 바람직하지 않은 특성이 있는 중합체를 생성한다. 따라서, L-락테이트 거울상 이성질체 또는 D-락테이트 거울상 이성질체만을 생산하는 유산균(lactic acid bacteria)이 전형적으로 사용된다.
현재 이용 가능한 상업적 공정에서 락트산 발효를 위한 탄수화물 공급원은 전형적으로 옥수수 및 카사바 뿌리(cassava root)와 같은 재생 가능한 전분 함유 공급원이다. 셀룰로스가 풍부한 사탕수수 찌꺼기(sugarcane bagasse)와 같은 추가 공급원도 제안되었다.
제안된 락트산 발효를 위한 탄수화물의 추가 공급원은 도시, 산업 및 상업 기원의 혼합된 음식물 폐기물(food waste)과 같은 복합 유기 폐기물이다. 이러한 유기 폐기물은 쉽게 구할 수 있고 락트산 발효를 위한 다른 탄수화물 공급원에 비해 저렴하기 때문에 유리하다. 그러나 복잡한 유기 폐기물을 락트산과 같은 유용한 발효 제품으로 산업적 규모로 전환하는 것은 수많은 기술적 문제에 직면하고 전처리(pretreatment), pH, 온도, 미생물 등을 포함한 조작 조건에 대한 정밀한 제어가 필요하다. 해당 공정을 산업적 규모에서 경제적으로 실현 가능하게 하려면 개선이 필요하다.
Rosenberg 등. (2005) Biotechnology Letters, 27: 1943-1947은 폴리비닐알코올(PVA) 하이드로겔인 LentiKats®로 알려진 렌즈 모양의 캡슐에 있는 바실러스 코아굴란스 포자의 고정화 및 글루코스로부터 락트산을 생산하는 데에 상기 고정된 포자를 사용하는 것을 보고한다.
EP 1504109는 락트산 또는 이의 염의 생산 방법을 개시하고 있는데, 여기서 전분은 동시 당화(saccharification) 및 발효 공정을 거치며, 상기 방법은 적어도 글루코아밀라제(glucoamylase)를 포함하는 배지에서 전분을 당화하는 단계를 포함하고, 전분이 고체인 경우 액성화(liquefaction) 단계를 포함하며, 미생물을 사용하여 상기 전분을 동시에 발효시키고, 선택적으로 배지로부터 락트산을 분리하는 단계를 포함하며, 5 내지 5.80의 pH 범위로 조정된 적당한 호열성(thermophilic) 락트산-생산 미생물이 사용되는 것을 특징으로 하며, 여기서 상기 미생물은 바실러스 코아굴란스, 바실러스 써모아미로보란스(Bacillus thermoamylovorans), 바실러스 스미시(Bacillus smithii), 지오바실러스 스테로써모필러스(Geobacillus stearothermophilus)의 균주 또는 이들의 혼합물로부터 유래된다.
EP 3174988은 락트산을 포함하는 발효 생산물의 제조 방법을 개시하고 있으며, 상기 방법은 a) 리그노셀룰로스 물질을 물의 존재하에 가성 마그네슘염(caustic magnesium salt)으로 처리하여 처리된 수성 리그노셀룰로스 물질을 제공하는 단계; b) 상기 처리된 수성 리그노셀룰로스 물질을 가수분해 효소의 존재하에 당화하여 발효성 탄수화물 및 고체 리그노셀룰로스 분획을 포함하는 당화된 수성 리그노셀룰로스 물질을 제공하는 단계; c) 단계 b)와 동시에, 상기 당화된 수성 리그노셀룰로스 물질을 락트산 형성 미생물 및 가성 마그네슘염 둘 다의 존재하에 발효시켜 마그네슘 락테이트 및 고체 리그노셀룰로스 분획을 포함하는 수성 발효 브로스를 제공하는 단계; d) 상기 브로스로부터 마그네슘 락테이트를 회수하는 단계를 포함하고, 여기서 상기 당화 및 상기 발효는 동시에 수행된다.
WO 2008/043368은 호열성 포자원성(sporogenic) 미생물 균주, 예를 들어, 바실러스 코아굴란스 SIM7 DSM 14043의 내생포자(endospore)를 생산하는 방법 및 발효 공정의 접종을 위한 이의 용도를 개시하고 있다.
WO 2018/163094는 프로바이오틱스로 사용하기 위한 바실러스 코아굴란스 균주에서 포자형성(sporulation)의 유도 방법을 개시하고 있으며, 여기서 과도한 포자형성은 특정 영양소 및 미네랄의 존재에 의해 최대 109개의 포자/ml 수준까지 유도된다.
본 발명의 출원인에게 양도된 WO 2017/122197은 유기 폐기물에 존재하는 락트산을 제거하고 복합 다당류를 분해하기 위해 유기 폐기물을 처리하는데 유용한 셀룰라제(cellulase), 헤미셀룰라제(hemicellulase) 및 아밀라제(amylase)와 같은 다당류 분해 효소(polysaccharide-degrading enzyme)를 분비하도록 유전적으로 변형된 이중 작용 락트산(LA)-이용 박테리아를 개시하고 있다.
공정을 더욱 경제적으로 실현 가능하게 하기 위해 산업적 규모로 유기 폐기물로부터 락트산의 생산을 개선할 필요가 남아 있다. 공정을 단순화하고 비용을 절감하며 전체 수율을 향상시키는 시스템 및 방법이 매우 유리할 것이다.
본 발명은 산업적 규모로 락트산을 생산하기 위해 유기 폐기물을 재활용하는 시스템 및 방법을 제공하며, 이는 바실러스 코아굴란스 포자의 건조 또는 부분 건조 조성물을 이용한다. 본 발명의 시스템 및 방법은 생산 발효기에 접종하기 전에 세포를 성장시키기 위한 제어된 조건 및 복잡한 시드 라인(seed line)이 필요 없이 유기 폐기물 관리 시설 현장에서 락트산을 생산할 수 있게 한다.
본 발명은 선택적으로 당류 분해 효소(들)(saccharide-degrading enzyme(s))와 조합하여 임의의 활성화 또는 컨디셔닝이 필요 없이 락트산 생산 발효기에 접종할 준비가 된 B. 코아굴란스 포자의 건조 조성물을 추가로 제공한다. 본원에 개시된 조성물은 마그네슘 락테이트로 제형화된 포자를 포함하고, 실온에서 상기 포자의 장기간 안정성을 특징으로 한다.
일부 실시양태에 따르면, 건조 조성물은 락트산 생산 발효기에 포자를 접종하기 전에 수산화마그네슘 슬러리에 현탁된다. 놀랍게도 본 발명의 발명자들은 포자가 수산화마그네슘 슬러리 현탁액에서 생존하고 이러한 처리 후에 성공적으로 발아한다는 것을 발견하였다. 따라서, 본 발명은 생산 발효기에 접종하기 전에 건조 조성물에 존재할 수 있는 미생물 오염물질을 불활성화시키는 간단한 수단을 제공한다.
특정 실시양태에 따르면, 본 발명은 혼합된 음식물 폐기물, 일반 폐기물(municipal waste) 및 농업 폐기물로부터 락트산의 생산에 관한 것이다. 본원에 개시된 바와 같이, 바실러스 코아굴란스 포자의 건조 또는 부분 건조(반건조) 조성물은 입자 크기 감소 및 선택적으로 살균을 포함하는 전처리를 거친 전처리된 유기 폐기물과 함께 락트산 생산 발효기에 접종된다. 본원에 개시된 바와 같이, 건조 또는 부분 건조 접종물(inoculum)로부터의 바실러스 코아굴란스 포자는 다양한 공급원의 유기 폐기물이 존재하는 발효기에서 성공적으로 발아되고, 상기 유기 폐기물을 발효시켜 높은 수율로 락트산을 생산한다.
본 발명은 유리하게도 유기 폐기물로부터 락트산의 현장 생산을 위해 락트산 생산을 유기 폐기물 관리 시설로 간단하게 통합할 수 있게 한다. 통상적으로, 산업 발효 공정은 시드 트레인(seed train)이라고도 하는 시드 라인(seed line)을 포함하며, 여기서 뱅크 세포(banked cell) 샘플은 최종적으로 주(main) 발효기에 접종하기에 충분한 바이오매스를 제공하도록 증식된다. 종래의 시드 트레인 공정은 냉동보존된 세포 뱅크 바이알의 해동으로 시작하여 점차적으로 더 큰 배양 용기(culture vessel)로 여러 번 연속적으로 증식한다. 배양 부피와 세포 밀도가 미리 결정된 기준을 충족하면 배양물을 생산 생물반응기로 옮기는데 여기서 세포는 계속해서 성장하고 분열하여 원하는 생산물을 생산한다. 종래의 시드 트레인 공정은 배양 단계의 수와 냉동보존된 세포 뱅크 바이알 내 적은 세포 수로 인해 시간이 많이 걸린다. 또한, 주 생산 발효기를 포함한 각 배양 용기에 접종하기 위해서는 살균이 필요하다.
본 발명은 생산 현장에서 시드 라인이 필요하지 않고 살균 접종을 위한 간단한 수단을 제공하여 자본 지출(capital expenditure, CAPEX) 및 운영 지출(operational expenditure, OPEX)을 모두 절약한다. 본원에 개시된 바와 같은 건조 또는 부분 건조 포자 조성물은 유기 폐기물 관리 장소로 쉽게 운송될 수 있고, 저장되며 필요에 따라 저장소에서 제거될 수 있다. 놀랍게도 상기 건조 또는 부분 건조 조성물의 포자는 저장소에서 성공적으로 회수될 수 있고, 발아되고 유기 폐기물을 높은 수율로 락트산으로 발효시킬 수 있다는 것이 발견되었다. 유리하게는, 상기 건조 또는 부분 건조 포자 조성물은 냉각이 필요 없고 장기간 동안 다양한 저장 조건을 지탱한다. 하기에 예시된 바와 같이, 포자의 생존력은 저장 전반에 걸쳐 유지되고, 건조 및 저장 후의 세포 손실은 최소화된다.
본원에 기술된 바와 같이 발효를 위한 기질로서 유기 폐기물의 이용은 인간이 먹는 음식으로서 고가의 원료 물질을 이용하는 앞서 기술된 락트산 생산 공정에 비해 매우 유리하다.
본원에 추가로 개시된 바와 같이, 건조 또는 반건조 포자 조성물은 당화 및 발효를 동시에 달성하기 위해 당류 분해 효소와 함께 발효기에 접종될 수 있다. 놀랍게도, 락트산이 생산될 때까지 지연 시간이 전혀 없거나 최소로 관찰된다.
한 측면에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는, 유기 폐기물을 재활용하여 락트산 또는 이의 염을 생산하는 방법을 제공한다:
(ⅰ) 입자 크기의 감소 및 선택적으로 살균을 포함하는 전처리를 거친 전처리된 유기 폐기물을 제공하는 단계;
(ⅱ) 바실러스 코아굴란스 포자의 건조 조성물을 제공하는 단계;
(ⅲ) 상기 전처리된 유기 폐기물을 발효 반응기에서 하나 이상의 당류 분해 효소 및 상기 B. 코아굴란스 포자의 건조 조성물과 혼합하고, 혼합물을 발효 반응기에서 배양(incubating)하여 상기 유기 폐기물을 당화하고 상기 포자의 발아, 및 후속적으로 상기 포자로부터 발아하는 영양성(vegetative) B. 코아굴란스 세포에 의한 락트산 생산을 유도하는 단계; 및
(ⅳ) 발효 브로스로부터 락트산 또는 이의 염을 회수하는 단계.
일부 실시양태에서, 상기 방법은 단계 (ⅲ)에서 B. 코아굴란스 포자의 건조 조성물을 전처리된 유기 폐기물과 혼합하기 전에 수산화마그네슘 슬러리에 현탁시킴으로써, 미생물 오염 물질이 불활성화된 B. 코아굴란스 포자 현탁액을 수득하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 슬러리 중 수산화마그네슘의 농도는 1%-25% 범위이다. 추가 실시양태에서, 슬러리 중 수산화마그네슘의 농도는 10%-20% 범위이다. 또 다른 실시양태에서, 슬러리 중 수산화마그네슘의 농도는 5%-25% 범위이다. 수산화마그네슘의 예시적인 농도는 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%를 포함한다. 각각의 가능성은 별개의 실시양태를 나타낸다.
수산화마그네슘의 현탁액은 몇 분에서 최대 몇 시간까지 수행될 수 있다. 바람직하게는, 수산화마그네슘 슬러리에 현탁시키는 것은 현탁액을 25-60℃, 바람직하게는 50-60℃의 온도에서 15분 내지 3시간 동안 배양하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 수산화마그네슘 슬러리에 현탁시키는 것은 현탁액을 25-60℃의 온도에서 15-90분 동안 배양하는 것을 포함한다. 추가 실시양태에서, 수산화마그네슘 슬러리에 현탁시키는 것은 현탁액을 50-55℃의 온도에서 15-90분 동안 배양하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 수산화마그네슘 슬러리에 현탁시키는 것은 현탁액을 25-60℃의 온도에서 30-90분 또는 30-60분 동안 배양하는 것을 포함한다. 각각의 가능성은 별개의 실시양태를 나타낸다. 추가 실시양태에서, 수산화마그네슘 슬러리에 현탁시키는 것은 현탁액을 50-55℃의 온도에서 30-90분 또는 30-60분 동안 배양하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 수산화마그네슘 슬러리에서의 현탁은 실온에서 수행된다.
일부 실시양태에서, B. 코아굴란스 포자의 건조 조성물은 마그네슘 락테이트를 포함한다.
일부 실시양태에서, 유기 폐기물은 음식물 폐기물, 일반 폐기물, 농업 폐기물, 식물 재료 및 이들의 혼합물 또는 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 배양은 5-7 범위의 pH에서 수행된다. 일부 특정 실시양태에서, 배양은 5.5-6.5 범위의 pH에서 수행된다.
일부 실시양태에서, 배양은 45-60℃ 범위의 온도에서 수행된다. 일부 특정 실시양태에서, 배양은 50-55℃ 범위의 온도에서 수행된다.
일부 실시양태에서, 단계 (ⅲ)에서의 배양은 20-48시간 범위의 시간 동안 수행된다. 일부 특정 실시양태에서, 단계 (ⅲ)에서의 배양은 20-36시간 범위의 시간 동안 수행된다.
일부 실시양태에서, 하나 이상의 당류 분해 효소는 아밀라제, 셀룰라제 및 헤미셀룰로스로 이루어진 군으로부터 선택되는 다당류 분해 효소이다.
일부 실시양태에서, 하나 이상의 당류 분해 효소는 글루코아밀라제를 포함한다.
일부 실시양태에서, 단계 (ⅲ)에서의 혼합은 B. 코아굴란스의 건조 조성물을 발효 반응기에 첨가하여 발효 배지 ml당 적어도 10^4개의 포자를 수득하는 것을 포함한다. 추가 실시양태에서, 단계 (ⅲ)에서의 혼합은 B. 코아굴란스의 건조 조성물을 발효 반응기에 첨가하여 발효 배지 ml당 적어도 10^6개의 포자를 수득하는 것을 포함한다.
개시된 바와 같은 포자의 건조 접종물은 최대 15% (w/w) 또는 그 사이의 임의의 양의 수분 함량을 특징으로 한다. 일부 실시양태에서, B. 코아굴란스 포자의 건조 조성물은 최대 10% (w/w)의 수분 함량을 특징으로 한다. 일부 실시양태에서, B. 코아굴란스 포자의 건조 조성물은 4%-15% (w/w), 예를 들어, 4%-10% (w/w)의 수분 함량을 특징으로 한다. 각각의 가능성은 본 발명의 별개의 실시양태를 나타낸다.
본원에서 제공하는 바와 같이, B. 코아굴란스 포자를 포함하는 건조 또는 반건조 접종물, 제형 또는 조성물의 수분 함량은 포자 외부의 물의 양을 지칭한다(즉, 본원에서 사용되는 "수분 함량"은 포자 내부에서 발견되는 물을 포함하지 않는다). 수분 함량은 접종물, 제형 또는 조성물의 총 중량에 대한 백분율로 제공된다. 포자의 "접종물", "제형" 및 "조성물"이라는 용어는 본원에서 포자를 함유하는 조성물을 설명하기 위해 상호교환적으로 사용되며, 여기서 조성물은 건조되거나 반건조될 수 있다.
또 다른 측면에 따르면, 본 발명은
(a) 입자 크기 감소 및 선택적으로 살균을 포함하는 전처리를 거친 전처리된 유기 폐기물의 공급원;
(b) 바실러스 코아굴란스 포자의 건조 조성물;
(c) 하나 이상의 당류 분해 효소; 및
(d) 상기 전처리된 유기 폐기물, 상기 하나 이상의 당류 분해 효소, 및 상기 B. 코아굴란스 포자의 건조 조성물을 내부에서 혼합하기 위한 발효 반응기를 포함하는, 유기 폐기물을 재활용하여 락트산 또는 이의 염을 생산하는 시스템을 제공하며,
여기서 혼합물은 상기 유기 폐기물을 당화하고 상기 포자의 발아, 및 후속적으로 상기 포자로부터 발아하는 영양성 B. 코아굴란스 세포에 의한 락트산 생산을 유도하기 위해 상기 발효 반응기에서 배양된다.
일부 실시양태에서, 상기 시스템은
(a) 입자 크기 감소 및 선택적으로 살균을 포함하는 전처리를 거친 전처리된 유기 폐기물의 공급원;
(b) 수산화마그네슘 슬러리에 현탁된 B. 코아굴란스 포자의 건조 조성물;
(c) 하나 이상의 당류 분해 효소; 및
(d) 상기 전처리된 유기 폐기물, 상기 하나 이상의 당류 분해 효소, 및 상기 수산화마그네슘 슬러리에 현탁된 B. 코아굴란스 포자의 건조 조성물을 내부에서 혼합하기 위한 발효 반응기를 포함하며,
여기서 혼합물은 상기 유기 폐기물을 당화하고 상기 포자의 발아, 및 후속적으로 상기 포자로부터 발아하는 영양성 B. 코아굴란스 세포에 의한 락트산 생산을 유도하기 위해 상기 발효 반응기에서 배양된다.
추가 측면에 따르면, 본 발명은 바실러스 코아굴란스 포자; 및 마그네슘 락테이트를 포함하는, 락트산 발효를 위한 분말 형태의 건조 접종물을 제공하며, 여기서 상기 접종물은 건조되고 락트산 생산을 제공하기 위해 락트산 생산 발효기에 접종할 준비가 되어있다.
일부 실시양태에서, 건조 접종물은 분말 g당 10^8-10^10개의 포자를 포함하고, 건조 접종물 중 마그네슘 락테이트의 농도는 40-60% (w/w) 범위이다.
일부 실시양태에서, 다음 단계를 포함하는, 유기 폐기물을 재활용하여 락트산 또는 이의 염을 생산하는 방법이 제공된다:
(ⅰ) B. 코아굴란스 포자 및 마그네슘 락테이트를 포함하는 건조 접종물을 제공하는 단계;
(ⅱ) 상기 건조 접종원을 수산화마그네슘 슬러리에 현탁시킴으로써, 미생물 오염물질이 불활성화된 B. 코아굴란스 포자 현탁액을 수득하는 단계;
(ⅲ) 단계 (ⅱ)에서 수득한 현탁액을 발효 반응기에서 하나 이상의 당류 분해 효소, 및 입자 크기 감소 및 선택적으로 살균을 포함하는 전처리를 거친 전처리된 유기 폐기물과 혼합하고, 혼합물을 배양하여 상기 유기 폐기물을 당화하고 상기 포자의 발아, 및 후속적으로 상기 포자로부터 발아하는 영양성 B. 코아굴란스 세포에 의한 락트산 생산을 유도하는 단계; 및
(ⅳ) 발효 브로스로부터 락트산 또는 이의 염을 회수하는 단계.
본원에 개시된 방법은 마그네슘 락테이트의 생산에 특히 유익하다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 마그네슘 락테이트를 생산하는 방법이다. 일부 실시양태에서, 다음 단계를 포함하는, 유기 폐기물을 재활용하여 마그네슘 락테이트를 생산하는 방법이 제공된다:
입자 크기 감소 및 선택적으로 살균을 포함하는 전처리를 거친 전처리된 유기 폐기물을 제공하는 단계;
B. 코아굴란스 및 마그네슘 락테이트를 포함하는, B. 코아굴란스 포자의 건조 조성물을 제공하는 단계;
상기 B. 코아굴란스 포자의 건조 조성물을 수산화마그네슘 슬러리에 현탁시킴으로써, 미생물 오염물질이 불활성화된 B. 코아굴란스 포자 현탁액을 수득하는 단계;
상기 전처리된 유기 폐기물을 발효 반응기에서 하나 이상의 당류 분해 효소 및 상기 B. 코아굴란스 포자 현탁액과 혼합하는 단계;
상기 혼합물을 발효 반응기에서 배양하여 상기 유기 폐기물을 당화하고 상기 포자의 발아, 및 후속적으로 상기 포자로부터 발아하는 영양성 B. 코아굴란스 세포에 의한 락트산 생산을 유도하는 단계로서, 여기서 수산화마그네슘, 산화마그네슘 및 탄산마그네슘으로부터 선택되는 알칼리성 화합물을 배양 동안 상기 발효 반응기에 첨가하여 pH를 조정함으로써, 락테이트 단량체 및 Mg2+ 이온을 수득하는 단계; 및
발효 브로스로부터 마그네슘 락테이트를 회수하는 단계.
일부 특정 실시양태에서, pH를 조정하기 위해 배양 동안 발효 반응기에 첨가된 알칼리성 화합물은 수산화마그네슘이다.
또 다른 측면에 따르면, 다음 단계를 포함하는, 유기 폐기물을 재활용하여 락트산 또는 이의 염을 생산하는 방법이 제공된다:
(ⅰ) 입자 크기의 감소 및 선택적으로 살균을 포함하는 전처리를 거친 전처리된 유기 폐기물을 제공하는 단계;
(ⅱ) 15%-30% (w/w) 범위의 수분 함량을 특징으로 하는, 바실러스 코아굴란스 포자의 부분 건조 조성물을 제공하는 단계;
(ⅲ) 상기 전처리된 유기 폐기물을 발효 반응기에서 하나 이상의 당류 분해 효소 및 상기 B. 코아굴란스 포자의 부분 건조 조성물과 혼합하고, 혼합물을 발효 반응기에서 배양하여 상기 유기 폐기물을 당화하고 상기 포자의 발아, 및 후속적으로 상기 포자로부터 발아하는 영양성 B. 코아굴란스 세포에 의한 락트산 생산을 유도하는 단계; 및
(ⅳ) 발효 브로스로부터 락트산 또는 이의 염을 회수하는 단계.
일부 실시양태에서, B. 코아굴란스 포자의 부분 건조 조성물은 15%-25% (w/w) 범위의 수분 함량을 특징으로 한다.
본 발명의 다른 목적, 특징 및 이점은 하기 설명 및 실시예로부터 명백해질 것이다.
도 1. Mg(OH)2에 의한 살아있는 미생물 세포의 억제. 대장균(Escherichia coli) BL21, 바실러스 섭틸리스(Bacillus subtilis) 균주 169 및 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)를 LB(A) 또는 15% Mg(OH)2(B)에서 52℃에서 2시간 동안 배양한 후 LB 한천 플레이트에 플레이팅하였다. 52℃에서 밤새 배양한 후 상기 플레이트에서의 성장을 조사하였다.
본 발명은 유기 폐기물로부터 락트산을 생산하기 위한 산업적 발효 방법에 관한 것으로, 바실러스 코아굴란스 포자의 건조 또는 반건조 접종물을 사용한다.
유기 폐기물 관리 시설은 폐기물의 수집, 운송, 처리, 재활용/처분 및 모니터링을 취급한다. 폐기물을 락트산과 같은 유용한 화학 물질로 재활용하기 위해, 즉, 유기 폐기물을 산업 발효 공정의 기질로 이용하기 위해서는 전형적으로 현장 발효 시스템이 필요하다. 산업용 발효기의 종래의 접종 방법은 영양성 박테리아(습식 시드 트레인)를 이용한다. 이 방법은 (ⅰ) 습식 시드 제조와 생산 발효기의 정확한 접종 시간을 긴밀하게 동기화해야 하고, (ⅱ) 습식 시드 트레인(전형적으로 1:10에서 몇 리터 플라스크까지의 비율) 생산을 위한 몇 개의 소규모 발효기를 포함하는 현장 시드 트레인 생산 라인이 있어야 하는 것을 포함한, 폐기물 관리 시설에서 구현하기 어려운 많은 단점이 있다.
습식 시드 트레인은 시간과 자원을 소모하는 과정이다. 이는 생산 시간을 늘려 결과적으로 주어진 시간당 수행할 수 있는 발효 주기의 수를 제한한다.
본 발명은 유리하게도 유기 폐기물로부터 락트산의 현장 생산을 위해 락트산 생산을 유기 폐기물 관리 시설로 간단하게 통합할 수 있게 한다. 본원에 개시된 바와 같은 건조 또는 반건조 포자 조성물은 폐기물 관리 장소로 용이하게 운송될 수 있고, 저장되며 필요에 따라 저장소에서 제거될 수 있다.
일부 실시양태에서, 시드 라인에 대한 필요성이 본 발명에 의해 제거된다.
건조 또는 부분 건조 포자 접종물을 사용하면 다음을 포함하여 종래의 습식 접종물에 비해 주요 이점이 있다: (ⅰ) 시드 제조와 생산 발효기의 접종 시간을 밀접하게 동기화할 필요가 없음; (ⅱ) 습식 시드(전형적으로 1:10에서 몇 리터 플라스크까지의 비율의 시드 트레인) 생산을 위한 몇 개의 소규모 발효기를 포함하는 현장 시드 트레인 생산 라인이 있어야 할 필요가 없음; (ⅲ) 포자 생존력에 대한 최소한의 영향으로 연장된 저장 수명, 예를 들어, 몇 개월 이상(사실상 습식 시드에는 저장 수명이 없음); (ⅳ) 건조 또는 부분 건조 시드가 통제되지 않은 운송 조건에 훨씬 더 탄력적이기 때문에 특별한 용기 및 조건 없이 운송이 용이함; 및 (v) 제조 중 수분 제거로 인해 시드 중량이 크게 감소(예를 들어, 습식 접종원에 비해 95% 초과의 중량 감소)하여 운송 비용이 크게 절감됨.
중요한 것은, 건조 또는 부분 건조 시드의 제조가 시간과 장소에 따라 폐기물 관리 시설과 분리된 장소에서 수행될 수 있으므로 폐기물 관리 시설에서 시드 제조를 전담하는 숙련된 생명 공학 엔지니어의 필요성이 줄어드는 것이다.
또한, 건조 또는 부분 건조 시드를 몇 주 또는 몇 달 전에 제조하여 저장하고 생산 발효기에 즉시 접종할 수 있다는 사실은 락트산 생산 공정을 상당히 단축시킨다.
유기 폐기물로부터의 락트산 생산은 전형적으로 (ⅰ) 발효에 적합한 가용성 환원당을 방출하기 위해 하나 이상의 다당류 분해 효소를 사용한 폐기물에 존재하는 다당류의 분해("당화"); 및 (ⅱ) 락트산-생산 미생물(예를 들어, 본원에 개시된 바실러스 코아굴란스)에 의한 환원당의 락트산으로의 발효를 포함한다.
락트산 생산을 위한 재생 가능한 탄수화물 공급원은 전형적으로 다양한 비율의 환원당(글루코스, 프럭토스, 락토스 등)을 포함하지만, 전분 및 선택적으로 리그노셀룰로스 물질과 같은 다당류도 다량 포함한다. 전형적으로, 락트산-생산 미생물은 글루코스 및 프럭토스와 같은 환원당을 이용할 수 있지만 전분 및 셀룰로스와 같은 다당류를 분해하는 능력은 없다. 따라서, 이러한 다당류를 이용하기 위해서는 다당류를 분해하고 환원당을 방출하기 위해, 선택적으로 화학 처리와 함께, 다당류 분해 효소 첨가가 필요하다. 다당류 분해 효소를 공정에 통합하는 것은 기질이 하나 이상의 다당류 분해 효소로 처리되고 후속적으로 락트산-생산 미생물이 첨가되어 환원당을 발효하도록 순차적일 수 있거나 동시일 수 있으며, 여기서 상기 하나 이상의 다당류 분해 효소와 락트산-생산 미생물이 함께 혼합되어 당화와 발효가 동시에 수행된다. 동시 공정은 복합 탄수화물 공급원에서 락트산을 수득하는 데 필요한 전체 시간을 줄이는 반면, 이의 주요 과제 중 하나는 박테리아 성장과 효소 활성 조건을 일치시켜야 한다는 것이다.
일부 실시양태에 따르면, 본 발명의 방법은 동시 당화 및 발효를 사용한다. 다당류 분해 효소는 바실러스 코아굴란스 포자의 건조 또는 부분 건조 조성물과 함께 유기 폐기물에 첨가되어 폐기물에 존재하는 다당류의 분해와 락트산 생산을 동시에 얻는다.
당화 및 발효가 별도의 순차적 단계로 수행되면, 각각의 단계는 약 18-24시간 소요될 수 있다. 두 단계를 동시에 수행하면 주어진 시간 동안 더 많은 유기 폐기물이 락트산으로 전환될 수 있으므로 공정이 크게 단축되어 생산성이 향상된다.
바실러스 코아굴란스 포자 조성물
바실러스 코아굴란스는 락트산, 특히 L-락트산을 생산하는 그람 양성, 호열성, 통성 혐기성, 포자 형성 박테리아이다. B. 코아굴란스는 L-락트산을 생산하기 위한 산업 발효 공정을 위해 제안되었다. B. 코아굴란스는 또한 정상적인 장내 미생물총을 유지하고 소화율을 향상시키는 것으로 나타났으며, 보통 장내 미생물총(intestinal microflora)과 정상적인 장 기능의 생태학적 균형을 유지하기 위한 프로바이오틱으로 판매된다. 예를 들어, LactoSpore®는 말토덱스트린과 혼합된 B. 코아굴란스 포자의 분무 건조 분말을 포함하는 프로바이오틱으로 사용하기 위한 바실러스 코아굴란스(MTCC 5856) 포자 제제이다.
Yadav 등. (2009) Indian Journal of Chemical Technology, 16: 519-522는 분무 건조 동안 바실러스 코아굴란스의 프로바이오틱 보호제로서 칼슘 락테이트, 칼슘 글루코네이트, 스피룰리나(Spirulina) 및 말토덱스트린을 조사하였다.
본 발명에 따라 사용될 수 있는 바실러스 코아굴란스 균주는 B. 코아굴란스 ATCC 8038 DSM 2312, B. 코아굴란스 ATCC 23498 DSM 2314, B. 코아굴란스 MTCC 5856, B. 코아굴란스 PTA-6086(GBI-30, 6086), B. 코아굴란스 SNZ 1969를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 각각의 가능성은 본 발명의 별개의 실시양태를 나타낸다.
포자는, 예를 들어, 다음과 같이 제조할 수 있다: 제1 단계에서 B. 코아굴란스의 순수 배양물을 살균 시드 배지에 접종하고 50-55℃에서 12-24시간 동안 진탕기에서 배양한다. 이어서 시드 배양물을 포자형성 배지로 옮기고 50-55℃에서 24-48시간 동안 배양한다. 포자형성의 유도는 스트레스 조건, 예를 들어, 영양소 부족, 효모 추출물과 같은 비교적 풍부한 질소 공급원, 탄소 및 인의 제한, Mn2+ 및 Ca2+ 이온의 존재, 5-6.5의 pH 범위, 24-48시간(바람직하게는 24시간)의 배양, 및 앞서 언급한 스트레스 유발 인자의 조합이 필요하다. 수득된 포자 배양물의 포자 농도는 바람직하게는 적어도 10^7개의 포자/ml, 더욱 바람직하게는 적어도 10^8개의 포자/ml이다. 각각의 가능성은 별개의 실시양태를 나타낸다.
배양 후, 브로스를 수확하고, 원심분리하고, 펠릿을 수집한다. 일부 실시양태에서, 포자의 "반건조" 또는 "부분 건조" 제제로 지칭되는 수확된 펠릿(15%-30% w/w 범위의 수분 함량)을 칭량하고 후속적으로 마그네슘 락테이트 용액과 혼합하여 수확된 포자와 15-25% 마그네슘 락테이트(조성물 총 중량의 w/w)를 포함하는 조성물을 수득한다. 일부 실시양태에서, 수확된 포자를 포함하는 조성물 중 마그네슘 락테이트의 농도(건조 전)는 조성물 총 중량의 15-20% (w/w) 범위, 예를 들어, 15%, 16%, 17%, 18%, 19% 또는 20% (w/w)이다. 각각의 가능성은 본 발명의 별개의 실시양태를 나타낸다. 일부 실시양태에서, 상기 조성물을 건조, 예를 들어, 분무 건조시키거나 80℃에서 가열 건조시켜 분말 형태의 건조 포자 조성물을 수득한다. 본 발명에 따른 건조 포자 조성물의 수분 함량은 최대 15% (w/w), 바람직하게는 최대 10% (w/w), 전형적으로 4%-10% w/w이다. 각각의 가능성은 본 발명의 별개의 실시양태를 나타낸다.
일부 실시양태에서, 70℃-80℃의 온도에서의 가열 선택은 전형적으로 배양 후 및 건조 전에 수행된다.
일부 실시양태에서, 건조 후, 본 발명에 따른 분말 형태의 건조 조성물은 분말 g당 적어도 10^8개의 포자, 예를 들어, 분말 g당 10^8-10^10개의 포자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 발명에 따른 건조 조성물은, 예를 들어, 분말 g당 10^8개, 10^9개, 10^10개를 포함한다. 각각의 가능성은 본 발명의 별개의 실시양태를 나타낸다. 본 발명에 따른 건조 조성물은 40-60% (w/w), 예를 들어, 45%-55% (w/w), 40%-50% (w/w), 50%-60% (w/w)농도의 마그네슘 락테이트를 추가로 포함한다. 각각의 가능성은 본 발명의 별개의 실시양태를 나타낸다.
일부 실시양태에서, 본 발명에 따른 바실러스 코아굴란스 포자의 건조 조성물은 아밀라제, 셀룰라제 및 헤미셀룰라제로부터 선택된 하나 이상의 다당류 분해 효소를 추가로 포함한다. 일부 특정 실시양태에서, 본 발명에 따른 바실러스 코아굴란스 포자의 건조 조성물은 글루코아밀라제를 포함한다. 일부 예시적인 실시양태에서, 본 발명에 따른 B. 코아굴란스 포자의 건조 조성물은 아스퍼질러스 니거(Aspergillus niger)로부터의 글루코아밀라제를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명에 따른 건조 조성물은 사용 전에 저온 저장이 필요하지 않다. 따라서, 일부 실시양태에서, 락트산 생산 미생물의 저온 저장에 대한 필요성이 본 발명의 방법에 의해 제거된다.
본 발명에 따르면, 고정되지 않은 포자가 사용된다.
본 발명의 실시양태에 따르면, 발효기에 접종하기 전에 포자의 활성화가 필요하지 않다. 예를 들어, 발효기에 접종하기 전에 열 활성화가 필요하지 않다. 추가 예로서, 발효기에 접종하기 전 또는 후에 산 활성화가 필요하지 않다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 바와 같은 유기 폐기물 기질과 접촉한 후, 포자의 적어도 90%가 발아하고 영양성 세포를 생성하는데, 예를 들어, 포자의 90%-100%가 발아하고 영양성 세포를 생성한다.
유기 폐기물로부터의 락트산 생산
본원에 사용된 용어 "락트산"은 화학식 CH3CH(OH)CO2H의 하이드록시카복실산을 지칭한다. 락트산 또는 락테이트(비양성자화 락테이트)라는 용어는 락트산의 입체이성질체인 L-락트산/L-락테이트, D-락트산/D-락테이트 또는 이들의 조합을 지칭할 수 있다.
대부분의 산업 응용 분야에서 적절한 특성의 폴리락트산(PLA)을 생산하려면 고순도(광학 순도)의 L-락트산 단량체가 필요하다. 따라서, 본 발명의 방법 및 시스템은 특히 L-락트산 또는 L-락테이트 염을 고수율로 생산하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따라 사용하기에 적합한 유기 폐기물은 전형적으로 고체 및 비고체 물질을 포함하는 복합 유기 폐기물이다. 복합 유기 폐기물은 발효를 위한 탄수화물(발효에 사용할 수 있는 가용성 탄수화물 및/또는 발효를 위해 가용성 탄수화물을 방출하기 위해 효소를 통해 분해되어야 하는 다당류)을 포함하며 염, 지질, 단백질, 색소 성분, 불활성 물질 등과 같은 불순물을 추가로 함유된다. 본 발명에 따라 사용하기 위한 유기 폐기물의 예는 음식물 폐기물, 일반 폐기물의 유기 분획, 농업 폐기물, 식물 재료 및 이들의 혼합물 또는 조합을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 각각의 가능성은 별개의 실시양태를 나타낸다. 본 발명에 따른 음식물 폐기물은 식물 기원의 음식물 폐기물을 포함한다. 본 발명에 따른 음식물 폐기물은 가정용 음식물 폐기물, 상업용 음식물 폐기물 및 산업용 음식물 폐기물을 포함한다. 유기 음식물 폐기물은 채소 및 과일 잔류물, 식물, 조리된 식품, 단백질 잔류물, 도축 폐기물 및 이들의 조합에서 유래할 수 있다. 산업용 유기 음식물 폐기물은 부산물, 공장 불합격품, 시장 불량품 또는 먹을 수 없는 식품 부분(예컨대 껍질)의 트리밍(trimming)과 같은 공장 폐기물을 포함할 수 있다. 상업용 유기 음식물 폐기물은 쇼핑몰, 식당, 슈퍼마켓 등으로부터의 폐기물을 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 식물 재료는 농업 폐기물, 및 종이 폐기물과 같은 인조 제품을 포함한다. 전형적으로 유기 폐기물은, 예를 들어, 유제품과 같은 자연 발효 과정에서 발생하는 내인성 D-락트산, L-락트산 또는 L- 및 D-락트산 둘 다를 포함한다.
본 발명의 방법 및 시스템과 함께 사용하기 위한 유기 폐기물은 전형적으로 전분, 셀룰로스, 헤미셀룰로스 및 이들의 조합을 포함한 복합 다당류를 포함한다. 유기 폐기물은 또한 가용성 환원당을 포함하고/거나 가용성 환원당(발효성 탄수화물)을 수득하기 위해 하나 이상의 다당류 분해 효소로 당화된다. 본원에 사용된 "발효성 탄수화물"이라는 용어는 발효 과정 동안 바실러스 코아굴란스에 의해 락트산으로 발효될 수 있는 탄수화물을 의미한다. 환원당은 전형적으로 C5 당(오탄당), C6 당(육탄당) 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 환원당은 글루코스를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 환원당은 자일란(xylan)을 포함한다.
본 발명에 따른 유기 폐기물은 전형적으로 복합 다당류 및 환원당을 다양한 비율로 포함한다. 조성은 폐기물의 공급원에 따라 달라지는데, 일부 유기 폐기물에는 전분이 더 많을 수 있고(예를 들어, 빵집의 음식물 폐기물, 지자체의 혼합된 음식물 폐기물) 다른 유기 폐기물에는 리그노셀룰로스 물질이 풍부할 수 있다(예를 들어, 농업 폐기물). 일부 실시양태에서, 유기 폐기물은 상이한 공급원으로부터의 폐기물의 조합을 포함한다.
일부 실시양태에서, 유기 폐기물에서 전분, 셀룰로스 및 헤미셀룰로스 중 적어도 하나의 백분율은 하나 이상의 다당류 분해 효소로 처리하기 전에 측정된다. 일부 실시양태에서, 가용성 환원당의 백분율은 발효 전에 측정된다.
유기 폐기물은 전형적으로 박테리아 성장 및 락트산 생산에 필요한 질소 공급원 및 기타 영양소를 포함하지만, 이러한 영양소는 필요에 따라 락트산 생산 발효기에 별도로 공급될 수도 있다.
본 발명에 따른 유기 폐기물의 전처리는 전형적으로 입자 크기를 감소시키고 표면적을 증가시키는 것, 또한 폐기물 내의 내인성 박테리아를 불활성화시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 전처리는 파쇄(shredding), 세절(mincing) 및 살균을 포함한다.
살균은, 예를 들어, 고압 증기, UV 방사선 또는 초음파 처리를 포함한 당업계에 공지된 방법에 의해 수행될 수 있다.
전처리는, 예를 들어, 파쇄 및 살균을 포함할 수 있다. 전처리는 또한, 예를 들어, 압출기, 초음파분쇄기(sonicator), 파쇄기(shredder) 또는 블렌더와 같은 폐기물 민서(mincer)를 사용하여 동일한 양의 물과 함께 분쇄하는 것을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 하나 이상의 당류 분해 효소 및 B. 코아굴란스 포자의 건조 또는 부분 건조 조성물은 전처리된 유기 폐기물을 함유하는 발효 반응기에 동시에 첨가된다. 추가 실시양태에서, 하나 이상의 당류 분해 효소의 첨가와 B. 코아굴란스 포자의 건조 또는 부분 건조 조성물의 첨가 사이의 시간은 0 내지 5시간 범위로 범위 내의 각각의 값을 포함한다. 다른 실시양태에서, 하나 이상의 당류 분해 효소는 B. 코아굴란스 포자의 건조 또는 부분 건조 조성물이 첨가된 지 1-5시간 후, 예를 들어, B. 코아굴란스 포자의 건조 또는 부분 건조 조성물이 첨가된 지 1시간, 적어도 2시간, 2시간, 3시간, 4시간 또는 5시간 후에 첨가된다. 각각의 가능성은 별개의 실시양태를 나타낸다. 다른 실시양태에서, 하나 이상의 당류 분해 효소는 B. 코아굴란스 포자의 건조 또는 부분 건조 조성물이 첨가되기 전에 발효기에 첨가된다.
본원에 사용된 "발효 반응기에서 B. 코아굴란스 포자의 건조 조성물을 혼합하는 것", "발효 반응기에 B. 코아굴란스 포자의 건조 조성물을 첨가하는 것" 등은 건조 분말을 발효 반응기에 직접 첨가하거나 재구성 매질에서 분말을 재구성하는 것을 포함한다. 본 발명은 특히 존재할 수 있는 미생물 오염물질의 재구성 및 억제 둘 다를 달성하기 위해 수산화마그네슘 슬러리에서의 재구성을 개시한다.
일부 실시양태에서, B. 코아굴란스 포자의 건조 조성물은 발효 반응기에 접종하기 전에 수산화마그네슘 슬러리에 현탁된다. 추가 실시양태에서, 바실러스 코아굴란스 포자의 건조 조성물은 발효 반응기에 접종하기 전에 다른 알칼리성 항균성 화합물의 용액 또는 슬러리, 예를 들어, 산화마그네슘(MgO), 산화칼슘(CaO), 산화아연(ZnO) 및 탄산칼슘(CaCO3)으로 이루어진 군으로부터 선택된 알칼리성 항균성 화합물의 용액 또는 슬러리에 현탁된다. 각각의 가능성은 본 발명의 별개의 실시양태를 나타낸다.
본 발명에 따른 락트산 발효는 전형적으로 회분식, 유가식(fed-batch), 연속식 또는 반연속식 발효를 사용하여 혐기성 또는 미호기성(microaerophilic) 조건하에 수행된다. 각각의 가능성은 본 발명의 별개의 실시양태를 나타낸다.
회분식 발효에서는 탄소 기질 및 기타 성분을 반응기에 적재하고 발효가 완료되면 생산물을 수집한다. pH 조절을 위한 알칼리성 화합물을 제외하고는 반응이 완료되기 전에 다른 성분을 첨가하지 않는다. 발효는 실질적으로 일정한 온도 및 pH에서 유지되며, 여기서 pH는 알칼리성 화합물을 첨가함으로써 유지된다.
유가식 발효에서 기질은 발효 브로스의 제거 없이 반응기에 연속적으로 또는 순차적으로 공급된다(즉, 생성물(들)이 실행이 끝날 때까지 반응기에 남아 있음). 통상의 공급 방법은 간헐적, 지속적, 펄스 공급(pulse-feeding) 및 지수 공급(exponential feeding)이 있다.
연속식 발효에서는 기질을 일정한 속도로 반응기에 연속적으로 첨가하고 발효 생성물을 연속적으로 꺼낸다.
반연속식 공정에서는 배양물의 일부를 일정 간격으로 회수하고 시스템에 새로운 배지를 추가한다. 무한정 유지될 수 있는 반복 유가식 배양은 반연속식 공정의 또 다른 이름이다.
유기산 등과 같은 산성 생성물을 생산하는 발효는 전형적으로 금속 산화물, 탄산염 또는 수산화물과 같은 알칼리성 화합물의 존재하에 수행된다. 알칼리성 화합물은 발효 브로스의 pH를 전형적으로 4-7 범위의 원하는 값으로 조정하기 위해 첨가되며, 명시된 범위 내의 각각의 값을 포함한다. 알칼리성 화합물은 추가로 L-락트산을 락테이트 염으로 중화시킨다. 발효 동안 발효기의 pH는 락트산 생산으로 인해 감소하여 바실러스 코아굴란스 생산에 부정적인 영향을 미친다. 수산화마그네슘/산화마그네슘, 수산화나트륨, 수산화칼륨 또는 수산화칼슘과 같은 염기를 첨가하여 락트산을 중화시킴으로써 pH를 조정하여 락테이트를 형성한다.
일부 특정 실시양태에서, 본 발명은 유기 폐기물을 재활용하여 마그네슘 락테이트를 생산한다. 일부 실시양태에서, 이러한 공정은 발효 동안 pH를 조정하기 위한 알칼리성 화합물로서 수산화마그네슘을 이용한다. 상기 발효는 락트산 단량체와 Mg2+ 이온을 생산하며, 이는 마그네슘 락테이트로서 회수될 수 있다.
락트산 발효는 전형적으로 약 1-4일 동안 또는 그 사이의 임의의 기간, 예를 들어, 1-2일 또는 2-4일 또는 3-4일 동안 수행되며, 명시된 범위 내의 각각의 값을 포함한다.
발효가 완료된 후, 브로스는 원심분리로 정화하거나 필터 프레스를 통과시켜 발효액으로부터 고체 잔류물을 분리할 수 있다. 여액은, 예를 들어, 회전식 진공 증발기를 사용하여 농축시킬 수 있다.
본 발명에 따른 발효 브로스는 유기 폐기물에서 유래하는 D-락트산을 함유할 수 있다. D-LA는 중합을 위한 L-LA의 생산에서 바람직하지 않은데, 이는 더 많은 D,D-락타이드 및 메조-락타이드를 형성하여 PLLA 최종 생산물의 품질에 부정적인 영향을 미치기 때문이다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 방법 및 시스템은 유리하게도 D-락트산 분해 효소 또는 D-락트산 이용 미생물을 락트산 생산 전에 유기 폐기물에 또는 발효 동안 및/또는 발효 후 발효 브로스에 사용함으로써 D-락트산을 제거한다. 각각의 가능성은 별개의 실시양태를 나타낸다.
D-락트산 분해 효소로서 D-락테이트 산화효소를 사용하는 것이 현재 바람직하다. D-락테이트 산화효소는 O2를 전자 수용체로서 사용하여 D-락테이트를 피루브산과 H2O2로 산화시키는 촉매 작용을 하는 효소이다. 이 효소는 플라빈 아데닌 디뉴클레오티드(flavin adenine dinucleotide, FAD)를 촉매 활성의 보조 인자로 사용한다. 본 발명에 따른 D-락테이트 산화효소는 전형적으로 (막 결합된 것 보다는) 가용성 D-락테이트 산화효소이다. 유리하게는, 상기 효소는 D-락트산을 제거하기 위해 유기 폐기물 및 발효 브로스에서 직접 작용한다. 일부 실시양태에서, D-락테이트 산화효소는 글루코노박터(Gluconobacter) 종에서 유래한다. 일부 실시양태에서, D-락테이트 산화효소는 글루코노박터 옥시단스(Gluconobacter oxydans)에서 유래한다(예를 들어, GenBank 기탁 번호: AAW61807 참조). D-락테이트 산화효소를 사용하여 유기 폐기물에서 유래된 발효 브로스로부터 D-락테이트를 제거하는 것은 본 발명의 출원인에게 양도된 WO 2020/208635에 기술되어 있다.
본 발명의 범위 내에서 적합한 D-락트산-이용 미생물은 3가지 L-락테이트 탈수소효소가 모두 결여된 대장균을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
D-락트산/D-락테이트를 언급할 때, 본원에 사용된 "제거"는 L-락트산을 생산하고 후속적으로 산업 응용 분야에 적합한 폴리(L-락트산)으로 중합시키는 다운스트림 공정을 방해하지 않도록 잔여량으로 감소시키는 것을 의미한다. "잔여량"은 발효 종료 시 발효 브로스의 처리된 혼합물 중의 총 락테이트(L+D)의 1% (w/w) 미만의 D-락테이트, 더욱 더 바람직하게는 0.5% (w/w) 미만의 D-락테이트를 가리킨다. 일부 특정 실시양태에서, D-락테이트의 제거는 발효 종료 시 발효 브로스 중 총 락테이트의 0.5% (w/w) 미만의 D-락트산으로의 감소이다.
추가 측면 및 실시양태에 따르면, L-락테이트 단량체가 추가로 정제된다. L-락테이트 단량체는 L-락테이트 염으로서 정제될 수 있다. 대안적으로, 조악한 L-락트산을 수득하기 위해, 예를 들어, 황산을 사용한 재산성화 단계를 수행한 후 정제된 L-락트산을 수득하기 위한 정제 단계를 수행할 수 있다.
정제 공정은 증류, 추출, 전기투석, 흡착, 이온 교환, 결정화 및 이러한 방법의 조합을 포함할 수 있다. 몇몇 방법은, 예를 들어, Ghaffar 등. (2014) Journal of Radiation Research and Applied Sciences, 7(2): 222-229); 및 Lopez-Garzon 등. (2014) Biotechnol Adv., 32(5):873-904에서 검토되었다. 대안적으로, 단일 단계로 락트산의 락타이드로의 회수 및 전환이 사용될 수 있다(Dussselier 등. (2015) Science, 349(6243):78-80).
본 발명의 일부 특정 실시양태에서, 발효 동안 pH 조정에 사용되는 알칼리성 화합물은 수산화마그네슘(Mg(OH)2)이며, 결과적으로 락테이트 단량체 및 Mg2+를 포함하는 발효 브로스가 생성되고, 이는 마그네슘 락테이트로서 회수될 수 있다. 결정화를 통해 마그네슘 락테이트를 정제하기 위한 특정 다운스트림 정제 공정은 본 발명의 출원인에게 양도된 WO 2020/110108에 기술되어 있다. 해당되는 경우 D-락테이트 단량체를 제거하는 처리 후 발효 브로스에 정제 공정을 적용할 수 있다.
당류 분해 효소
본원에 사용된 "당류 분해 효소"는 이당류(bi-saccharide)(이당류(di-saccharide)), 올리고당류, 다당류 및 당접합체를 포함한 당류를 분해하는 촉매 작용을 하는 가수분해 효소(또는 이의 효소 활성 부분)를 지칭한다. 당류 분해 효소는 글리코사이드 가수분해효소(glycoside hydrolase), 다당류 분해효소(polysaccharide lyase) 및 탄수화물 에스테라제(carbohydrate esterase)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 각각의 가능성은 본 발명의 별개의 실시양태를 나타낸다. 본 발명에 사용하기 위한 당류 분해 효소는 음식물 폐기물 및 식물 재료를 포함한 유기 폐기물에서 발견되는 당류(예컨대 다당류)에 대해 활성인 것들로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 당류 분해 효소는 변형된 효소(즉, 변형되고 상응하는 야생형 효소와 상이한 효소)일 수 있다. 일부 실시양태에서, 변형은 효소의 개선된 활성을 초래하는 하나 이상의 돌연변이를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 당류 분해 효소는 야생형(WT) 효소이다.
광범위한 당류 분해 효소 그룹은 표준 분류 시스템(Cantarel 등. 2009 Nucleic Acids Res 37: D233-238)에 따라 효소 부류로 나뉘고 효소 패밀리로 더 나뉜다. 이러한 효소의 유익하고 업데이트된 분류는 탄수화물 활성 효소(Carbohydrate-Active Enzyme, CAZy) 서버(www.cazy.org)에서 확인할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명에 사용된 당류 분해 효소는 다당류 분해 효소이다. 일부 실시양태에서, 다당류 분해 효소는 전분 및 비-전분 식물 다당류로부터 선택된 다당류를 분해하는 효소이다.
일부 실시양태에서, 다당류 분해 효소는 글리코사이드 가수분해효소이다.
일부 실시양태에서, 다당류 분해 효소는 아밀라제, 셀룰라제 및 헤미셀룰라제로부터 선택된다. 각각의 가능성은 본 발명의 별개의 실시양태를 나타낸다.
셀룰라제는 엔도-(1,4)- -D-글루카나제, 엑소(1,4)-β-υ-글루카나제, β-글루코시다제(glucosidase), 카복시메틸셀룰라제(Carboxymethylcellulase, CMCase); 엔도글루카나제(endoglucanase); 셀로바이오하이드롤라제(cellobiohydrolase); 아비셀라제(avicelase), 셀루덱스트리나제(celludextrinase), 셀룰라제 A, 셀룰로신(cellulosin) AP, 알칼리 셀룰라제 및 판셀라제(pancellase) SS로부터 선택되지만 이에 제한되지 않는다. 각각의 가능성은 별개의 실시양태이다.
헤미셀룰라제는 자일라나제(xylanase)일 수 있다. 추가 헤미셀룰라제의 비제한적인 예는 아라비노푸라노시다제(arabinofuranosidase), 아세틸 에스테라제, 만나나제(mannanase), a-D-글루쿠로니다제(glucuronidase), β-자일로시다제(xylosidase), β-만노시다제(mannosidase), β-글루코시다제, 아세틸-만난에스테라제(acetyl-mannanesterase), a-갈락토시다제(galactosidase), -a-라라비나나제(Larabinanase) 및 β-갈락토시다제를 포함한다. 각각의 가능성은 본 발명의 별개의 실시양태를 나타낸다.
아밀라제는 글루코아밀라제, a-아밀라제; (1,4-a-D-글루칸 글루카노하이드롤라제(glucan glucanohydrolase); 글리코게나제(glycogenase)) β-아밀라제; (1,4-a-D-글루칸 말토하이드롤라제(glucan maltohydrolase); 글리코게나제; 사카로겐 아밀라제(saccharogen amylase)) γ-아밀라제; (글루칸 1,4-α-글루코시다제; 아밀로글루코시다제(amyloglucosidase); 엑소-1,4-α-글루코시다제; 리소좀 α-글루코시다제 및 1,4-a-D-글루칸 글루코하이드롤라제(glucan glucohydrolase)로부터 선택되지만 이에 제한되지 않는다. 각각의 가능성은 별개의 실시양태이다.
일부 실시양태에서, 본 발명에 사용된 당류 분해 효소는 이당류 분해 효소이다. 일부 실시양태에서, 이당류 분해 효소는 락타제 및 인버타제로부터 선택된다. 각각의 가능성은 본 발명의 별개의 실시양태를 나타낸다.
본 발명에 따른 당류 분해 효소는 박테리아 공급원에서 유래할 수 있다. 일부 실시양태에서, 박테리아 공급원은 호열성 박테리아이다. 본원에 사용된 용어 "호열성 박테리아"는 약 45℃ 초과, 바람직하게는 50℃ 초과의 온도에서 번성하는 박테리아를 나타낸다. 전형적으로, 본 발명에 따른 호열성 박테리아는 최적 성장 온도가 약 45℃ 내지 약 75℃, 바람직하게는 약 50-70℃이다. 당류 분해 효소에 대한 호열성 박테리아 공급원의 비제한적인 예는 다음을 포함한다: 셀룰라제 및 헤미셀룰라제 - 클로스트리듐(Clostridium) 종(예를 들어, 클로스트리듐 써모셀룸(Clostridium thermocellum)), 파에니바실러스(Paenibacillus) 종, 써모비피다 푸스카(Thermobifida fusca); 아밀라제 - 바실러스 종(예를 들어, 바실러스 스테로써모필러스(Bacillus stearothermophilus)), 지오바실러스 종(예를 들어, 지오바실러스 써모레오보란스(Geobacillus thermoleovorans), 크로모할로박터(Chromohalobacter) 종, 로도테르무스 마리누스(Rhodothermus marinus). 각각의 가능성은 별개의 실시양태이다.
추가 실시양태에서, 당류 분해 효소의 박테리아 공급원은 중온성(mesophilic) 박테리아이다. 본원에 사용된 용어 "중온성 박테리아"는 약 20℃ 내지 45℃의 온도에서 번성하는 박테리아를 나타낸다. 당류 분해 효소에 대한 중온성 박테리아 공급원의 비제한적인 예는 다음을 포함한다: 셀룰라제 및 헤미셀룰라제 - 클렙시엘라(Klebsiella) 종(예를 들어, 클렙시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumonia)), 코넬(Cohnel) 종, 스트렙토마이세스(Streptomyces) 종, 아세티비브리오 셀룰로리티쿠스(Acetivibrio cellulolyticus), 루미노코커스 알부스(Ruminococcus albus); 아밀라제 - 바실러스 종(예를 들어, 바실러스 아미롤리퀘페시언스(Bacillus amyloliquefaciens), 바실러스 섭틸리스, 바실러스 리케니포르미스(Bacillus licheniformis), 락토바실러스 페르멘툼(Lactobacillus fermentum). 당업자는 일부 중온성 박테리아(예를 들어, 몇몇 바실러스 종)가 열안정성 효소를 생산한다는 것을 이해한다.
본 발명에 따른 당류 분해 효소는 또한 진균 공급원에서 유래할 수 있다. 당류 분해 효소에 대한 진균 공급원의 비제한적 예는 다음을 포함한다: 셀룰라제 및 헤미셀룰라제 - 트리코데르마 리세이(Trichoderma reesei), 휴미콜라 인솔렌스(Humicola insolens), 푸사리움 옥시스포룸(Fusarium oxysporum); 아밀라제(예를 들어, 글루코아밀라제) - 아스퍼질러스 니거, 아스퍼질러스 오리제(Aspergillus oryzae), 페니실리움 펠루타눔(Penicillium fellutanum), 써모마이세스 라누기노수(Thermomyces lanuginosu).
본 발명에 따라 사용하기 위한 당류 분해 효소에 대한 추가 공급원은, 예를 들어, 위에서 언급한 CAZy 서버에서 찾을 수 있다.
하기 실시예는 본 발명의 특정 실시양태를 더욱 완전하게 예시하기 위해 제공된다. 그러나 이를 본 발명의 넓은 범위를 제한하는 것으로 해석해서는 안된다. 당업자는 본 발명의 범위를 벗어나지 않고 본원에 개시된 원리의 많은 변형 및 수정을 용이하게 고안할 수 있다.
실시예
실시예 1
플라스크에서의 포자 제조
바실러스 코아굴란스를 냉동 스톡으로부터 5ml의 LB(50ml 팔콘 내)에 접종하였다. 52℃, 200rpm에서 밤새 배양한 후, 200μl를 25ml의 포자형성 배지(40mM 인산칼륨, pH 6.2로 완충된 0.4% 효모 추출물)에 첨가하였다. 배양(52℃, 200rpm) 24시간 후 포자 계수와 총 계수(영양성 세포 및 포자)를 위해 샘플을 채취하였다.
계수는 다음과 같이 수행하였다: 가열(30분 동안 80℃) 전 및 후의 샘플을 연속 희석하고, LB 한천에 플레이팅하고 계수하였다. 가열되지 않은 샘플의 플레이트 수는 영양성 세포와 포자의 총 수를 나타내는 반면, 가열된 샘플의 플레이트 수는 포자 수만 나타낸다(영양성 박테리아는 고온에서 생존하지 못함).
포자 수는 ~ 10^7개의 포자/ml에 달했으며 총 박테리아 수와 동일하였다. 포자 형성 배지에서의 더 긴 배양 시간(최대 72시간)은 포자 수에 영향을 미치지 않았다.
실시예 2
발효기에서의 포자 제조
A. LB에서 밤새 성장한 B. 코아굴란스 6ml를 300ml의 포자형성 배지(40mM 인산칼륨, pH 6.2로 완충된 0.4% 효모 추출물)를 함유하는 500ml 발효기 용기에 접종하였다. 포자 발효 동안 10% 인산을 사용하여 pH를 6.5-7.0으로 유지하였다. 밤새 배양(52℃, 700rpm, 0.3VVM) 후 상술한 바와 같이 포자 계수와 총 계수를 위해 샘플을 채취하였다. 포자 수는 ~5*10^6-10^7개의 포자/ml에 달했으며, 총 수와 동일하였고, 이는 실질적으로 모든 박테리아 세포가 포자를 형성했음을 의미한다.
추가 실험에서, 더 높은 백분율의 효모 추출물(2.5%)을 포자형성 배지에 사용하였다. 10% 인산을 사용하여 pH를 조절하고 pH를 6.8로 유지하였고 포자 수가 ~10^7개의 포자/ml에 달하였다.
B. LB에서 밤새 성장한 B. 코아굴란스 6ml를 300ml의 포자형성 배지(40mM 인산칼륨으로 완충된 1% 대두 펩톤이 있는 0.4% 효모 추출물)를 함유하는 500ml 발효기 용기에 접종하였다. 10% 인산을 사용하여 pH 6.8을 유지하였다. 48-72시간 성장(45℃, 400rpm, 0.3VVM)시켜 동일한 총 수로 ~10^8개의 포자/ml를 생산하였다.
추가 실험에서 더 높은 백분율의 효모 추출물(40mM 인산칼륨으로 완충된 1% 대두 펩톤이 있는 2.5% 효모 추출물)을 사용하였으며, 포자 수율(~3*10^8개의 포자/ml)에는 큰 차이가 없었다.
실시예 3
B. 코아굴란스 포자를 사용한 락트산 발효 - 1차 프로토콜
다음 실험에서는 B. 코아굴란스 포자가 유기 폐기물(음식물 폐기물)에서 성공적으로 발아하고 상기 폐기물에 존재하는 당으로부터 락트산을 생산하는 능력을 테스트하였다. 본 실험은 B. 코아굴란스 포자에 접종하고 후속적으로(3시간 후) 다당류 분해 효소(글루코아밀라제)를 첨가하여 유기 음식물 폐기물로부터의 락트산 생산을 테스트하였다. 이 설정에서 포자 발아는 발효기 내부 온도(열 활성화)에 의해 유도되고 다당류 분해 효소를 첨가하기 전에 유기 음식물 폐기물에서 이미 발견되고 이용 가능한 환원당에 의해 지원된다.
본 실험은 슈퍼마켓 불량품에서 수거된 유기 음식물 폐기물로 수행하였다. 음식물 폐기물은 갈아서 살균해 두었다. 다음으로, 최대 작업량이 500mL인 발효기에서 전처리된 음식물 폐기물 300mL에 6*10^4개의 포자/ml로 B. 코아굴란스 포자(접종된 음식물 폐기물에서의 최종 농도)를 접종하였다. 포자는 사용할 때까지 제조된 배지에 4℃의 저온 저장으로 보관하였다. 포자를 저장소에서 제거한 후 즉시 음식물 폐기물에 접종하였다.
포자를 접종한 음식물 폐기물은 52℃, pH 6.2에서 발효시켰다. 수산화마그네슘을 사용하여 pH를 유지하였다. 3시간 배양 후, 0.5gr/L의 글루코아밀라제(GA)(아스퍼질러스 니거)를 첨가하고 동일한 pH 및 온도 조건에서 계속 배양하였다. 글루코스와 락트산 농도는 적절한 막대로 RQflex10(Merck) 판독기를 사용하여 해당 과정 동안 모니터링하였다. 포자를 첨가한 지 4.5시간 후에 락테이트 합성이 시작되었다. 불과 22시간 후에 95gr/L의 락테이트가 측정되었다. 글루코스 포텐셜(폐기물로부터 생산될 수 있는 최대 글루코스 양)을 대조군으로서 별도로 측정하였으며 93gr/L의 글루코스 포텐셜을 나타냈다. 결과는 글루코스가 락테이트로 실질적으로 완전히 전환됨을 나타내며, 이는 포자를 접종하고 3시간 후에 GA를 첨가할 때 우수한 GA 활성(당화) 및 우수한 B. 코아굴란스 활성(포자 개시 및 락테이트 생산)이 모두 나타남을 가리킨다.
실시예 4
B. 코아굴란스 포자를 사용한 락트산 발효 - 2차 프로토콜
본 실험은 슈퍼마켓 불량품에서 수거된 유기 음식물 폐기물로 수행하였다. 음식물 폐기물은 갈아서 살균해 두었다. 다음으로, 500mL 발효기에서 전처리된 음식물 폐기물 300mL에 7*10^4개의 포자/ml로 B. 코아굴란스 포자(접종된 음식물 폐기물에서의 최종 농도)를 접종하고 0.5gr/L의 글루코아밀라제를 추가로 혼합하였다. 발효는 52℃, pH 6.2에서 진행하였다. 수산화마그네슘을 사용하여 pH를 유지하였다. 글루코스 및 락트산 농도를 모니터링하였다. 포자를 첨가한 지 4시간 후에 락테이트 합성이 시작되었다. 불과 총 23시간 후에 73gr/L의 락테이트가 측정되었다. 글루코스 포텐셜(폐기물로부터 생산될 수 있는 최대 글루코스 양)을 대조군으로서 별도로 측정하였으며 72gr/L의 글루코스 포텐셜을 나타냈다. 결과는 글루코스가 락테이트로 실질적으로 완전히 전환됨을 나타내며, 이는 GA와 포자를 음식물 폐기물과 동시에 혼합할 때 우수한 GA 활성(당화) 및 우수한 B. 코아굴란스 활성(포자 개시 및 락트산 생산)이 모두 나타남을 가리킨다.
실시예 5
건조 포자 제형의 제조
A. B. 코아굴란스 포자(CFU 4.2*10^7개, 포자형성 배지: 0.4% 효모 추출물+40mM 인산칼륨)를 4℃에서 30분 동안 13000g에서 원심분리하였다. 상층액을 제거한 후, 펠릿을 칭량하고 후속적으로 마그네슘 락테이트 용액에 재현탁시켜 마그네슘 락테이트 농도가 15-25% (w/w)(조성물의 총 중량 대비 %wt) 범위, 예를 들어, 17% (w/w)인 제형을 수득하였다. 상기 제형을 80℃에서 건조시켜 건조 분말을 수득하고 실온의 암소에 보관하였다. 마그네슘 락테이트를 함유한 건조 제형의 수분 함량은 4%-10% w/w 범위였다.
포자 계수를 위해 1일째 및 7일째에 샘플을 채취하였다. 포자 계수를 위해 건조 포자 분말 샘플을 살균 수돗물에 재현탁시키고 혼합하였다. 다음으로, LB 한천에 플레이팅한 후 포자로부터 발아하는 생존 세포의 플레이트 수로 실시예 1에 기술된 바와 같이 포자 계수를 수행하였다. 포자 수는 1일째에 1.1*10^7개의 포자/ml, 7일째에 1.5*10^7개의 포자/ml에 달하였다. 이러한 결과는 포자 생존력이 건조 절차 후 및 실온에서 보관하는 내내 유지되었음을 시사한다.
B. 포자 형성 배지(10^8개의 포자/ml) 중의 B. 코아굴란스 포자 현탁액을 13000g에서 원심분리하여 부피를 70배 감소시켰다. 펠릿을 칭량하고 마그네슘 락테이트 용액에 재현탁시켜 마그네슘 락테이트의 농도가 17%(w/w, 조성물 총 중량 대비)인 제형을 수득하였다. 상기 제형을 80℃에서 건조시켜 포자와 마그네슘 락테이트의 건조 분말을 수득하였다. 건조 제형의 수분 함량은 9% (w/w)였다. 포자 농도는 5*10^10개의 포자/gr이었다.
실시예 6
반건조 포자 제형의 제조
B. 코아굴란스 포자(CFU 4.2*10^7개, 포자형성 배지: 0.4% 효모 추출물+40mM 인산칼륨)를 4℃에서 30분 동안 13000g에서 원심분리하였다. 상층액을 제거한 후, 펠릿을 칭량하고 후속적으로 마그네슘 락테이트 용액에 재현탁시켜 마그네슘 락테이트 농도가 15-25% (w/w)(조성물의 총 중량 대비 %wt) 범위, 예를 들어, 17% (w/w)인 조성물을 수득하였다. 마그네슘 락테이트를 함유한 반건조 제형의 수분 함량은 ~25% w/w, 즉 15%-30% w/w 범위였다. 상기 제형을 실온의 암소에 보관하였다. 상술된 바와 같이 포자 계수를 위해 1일째 및 7일째에 샘플을 채취하였다.
포자 수는 1일째에 2*10^7개, 7일째에 1.8*10^7개에 달하였다. 이러한 결과는 포자 생존력이 반건조 절차 후 및 실온 보관 기간 내내 유지되었음을 시사한다.
실시예 7
수산화마그네슘 슬러리에서의 건조 포자 제형의 재구성
다음 실험에서는 B. 코아굴란스 포자의 건조 제형을 15% Mg(OH)2 (w/w) 수성 슬러리에 현탁시키고 후속적으로 다양한 배양 시간 동안 15% Mg(OH)2 슬러리에서 배양하였다. 상기 슬러리는 >9.5의 pH에 도달한다. 배양 후 포자 발아에 미치는 영향과 슬러리가 미생물 오염물질의 성장을 방지하는 능력을 조사하였다.
A. 실시예 5에서와 같이 제조된 건조된 형태의 B. 코아굴란스 포자를 15% Mg(OH)2 w/w 수성 슬러리에 현탁시켜 10^8개의 포자/ml를 수득하였다. 현탁액을 4개의 분취물로 분취하고 실온에서 5분, 30분, 60분 또는 90분 동안 교반하였다. 다음으로, 샘플을 LB 한천 플레이트에 플레이팅하고 52℃에서 밤새 성장시켰다. 밤새 배양한 후에 총 박테리아 계수 및 포자 계수를 실시예 1에 기술된 바와 같이 수행하였다. 결과는 표 1에 요약되어 있다.
Figure pct00001
결과는 B. 코아굴란스 포자가 15% Mg(OH)2에서의 배양에서 생존하고 이러한 처리 후에 성공적으로 발아함을 보여주었다. 상이한 배양 시간 사이에 포자로부터 발아한 박테리아 세포의 규모에는 차이가 관찰되지 않았다.
B. 실시예 5에서와 같이 제조된 건조된 형태의 B. 코아굴란스 포자를 15% Mg(OH)2 w/w 수성 슬러리에 현탁시켜 5% 글루코아밀라제 건조 분말과 함께 10^8개의 포자/ml를 수득하였다. 현탁액을 5개의 분취물로 분취하고 5분, 30분, 60분, 90분 또는 19시간 동안 실온에서 교반하였다. 다음으로, 샘플을 LB 한천 플레이트에 플레이팅하고 52℃에서 밤새 성장시켰다. 밤새 배양한 후에 총 박테리아 계수 및 포자 계수를 실시예 1에 기술된 바와 같이 수행하였다. 결과는 표 2에 요약되어 있다.
Figure pct00002
결과는 B. 코아굴란스 포자가 15% Mg(OH)2 배양에서 생존하고 이러한 처리 후에 성공적으로 발아함을 보여주었다. 상이한 배양 시간 사이에 포자로부터 발아한 박테리아 세포의 규모에는 변화가 관찰되지 않았다. 또한, 최대 90분 동안 15% Mg(OH)2 슬러리에서 배양한 후 전분에 대한 글루코아밀라제의 활성을 조사한 결과 활성을 유지하는 것으로 나타났다.
C. Mg(OH)2 슬러리가 미생물 오염물질의 성장을 방지하고 이에 따라 B. 코아굴란스 포자를 락트산 생산 발효기에 접종하기 위한 무균 조건을 제공하는 능력을 조사하기 위해 다음 검정을 수행하였다: 대장균 BL21, 바실러스 섭틸리스 균주 169 및 사카로마이세스 세레비지애를 15% Mg(OH)2에 첨가하고(10^7개의 세포/ml) 52℃에서 2시간 동안 진탕하면서 배양하였다. 대조군 샘플을 LB에서 배양하였다. 배양 후, 15% Mg(OH)2 믹스와 LB 믹스를 각각 LB 한천 플레이트에 플레이팅하고 발효 조건을 모방하기 위해 52℃에서 배양하였다. 밤새 배양한 후 플레이트에서의 성장을 조사하였다.
도 1은 대조군 플레이트에서 미생물 집락이 명확하게 보이는 반면(8*10^7개의 CFU를 나타냄), Mg(OH)2 플레이트에서는 성장이 관찰되지 않음을 보여주는데, 이는 15% Mg(OH)2에서의 배양에 의해 미생물 성장이 성공적으로 억제됨을 나타낸다.
실시예 8
B. 코아굴란스 포자의 건조 제형을 사용한 락트산 발효
A. 신선한 B. 코아굴란스 포자와 B. 코아굴란스 포자의 건조 제형(17% 마그네슘 락테이트에서 건조, 살균 수돗물에 재현탁됨)을 사용하여 유기 폐기물을 락트산으로 발효시켰다. 상술한 실험과 유사하게, 발효는 슈퍼마켓 불량품에서 수거된, 분쇄 및 살균된 유기 음식물 폐기물로 수행하였다. 각각의 접종물을 5*10^4개의 박테리아/ml에 도달하도록 발효기에 첨가하였다. 글루코아밀라제를 박테리아/포자와 함께 발효기에 첨가하였다. 발효는 52℃, pH 6.2에서 진행하였다. 수산화마그네슘을 사용하여 pH를 유지하였다. 글루코스 및 락트산 농도를 모니터링하였다.
결과는 신선한 접종물과 건조 접종물 모두에 대해 실질적으로 유사한 래그 시간(lag time)(박테리아/포자 접종과 락트산 합성 검출 사이의 시간)과 유사한 글루코스 전환을 보여주었다. 래그 시간은 신선한 접종물과 건조 접종물 모두에 대해 4시간이었고, 글루코스는 접종 유형에 관계없이 락트산으로 완전히 전환되었다. 따라서 결과는 락트산 생산은 발효를 접종하기 위한 건조 포자 제형의 사용에 의해 부정적인 영향을 받지 않음을 나타낸다.
B. B. 코아굴란스 포자를 건조된 형태(17% 락트산 마그네슘에서 건조)로 살균 수돗물 또는 15% Mg(OH)2 슬러리에 재현탁시켰다. 건조 포자 제형 200mg을 각각의 액체 2mL에 현탁하고 와류로 잘 혼합하고 1*10^7개의 박테리아/ml에 도달하도록 전처리된 음식물 폐기물(분쇄 및 살균됨)을 함유하는 발효기에 첨가하였다. 글루코아밀라제를 박테리아/포자와 함께 발효기에 첨가하였다. 발효는 52℃, pH 6.2에서 진행하였다. 수산화마그네슘을 사용하여 pH를 유지하였다. 글루코스 및 락트산 농도를 모니터링하였다.
래그 시간은 물 기반 접종물의 경우 1.5시간, Mg(OH)2 기반 접종물의 경우 3시간이었지만, 전체 공정 시간은 두 접종물 모두 실질적으로 유사했으며 접종 유형에 관계없이 글루코스가 락트산으로 완전히 전환되었다.
실시예 9
다양한 제형에서의 예시적인 포자 농도
1. 포자의 습식 제형
1.1. 포자형성 배지의 포자 농도: 최소 10^8개의 포자/ml(= 그램당)
1.2. 15%-25% w/w 마그네슘 락테이트를 함유하는 포자형성 배지: 최소 10^7개의 포자/ml(= 그램당)
1.3. 15%-25% w/w 칼슘 락테이트를 함유하는 포자형성 배지: 최소 10^7개의 포자/ml(= 그램당).
2. 포자의 반건조 제형(원심분리 또는 막여과 후)
2.1. 마그네슘 락테이트: 모세관수를 포함한 수분 함량은 20%-30% w/w 범위이다(건조시키지 않음)
2.2. 15%-25% w/w 마그네슘 락테이트를 함유하는 포자의 반건조 제형: 적어도 10^8개의 포자/ml(= 그램당)
2.3. 칼슘 락테이트: 모세관수를 포함한 수분 함량은 20%-30% w/w 범위이다(건조시키지 않음)
2.4. 15%-25% 칼슘 락테이트를 함유하는 포자의 반건조 제형: 적어도 10^8개의 포자/ml(= 그램당).
3. 포자의 건조 제형(열 건조 또는 분무 건조 후)
3.1. 15%-25% 마그네슘 락테이트를 함유하는 제형: 적어도 10^9개의 포자/그램
3.2. 15%-25% 칼슘 락테이트를 함유하는 제형: 적어도 10^9개의 포자/그램.
특정 실시양태에 대한 전술한 설명은 본 발명의 일반적인 특성을 충분히 드러낼 것이기 때문에 다른 사람들이 현재의 지식을 적용함으로써 과도한 실험 없이 일반 개념을 벗어나지 않고 이러한 특정 실시양태 같은 다양한 적용을 쉽게 수정 및/또는 조정할 수 있을 것이고, 따라서 그러한 적응 및 수정은 개시된 실시양태의 등가물의 의미 및 범위 내에서 이해되어야 하고 의도되어야 한다. 본원에 사용된 어구 또는 용어는 제한이 아니라 설명을 위한 것임을 이해해야 한다. 다양한 개시된 기능을 수행하기 위한 수단, 재료 및 단계는 본 발명에서 벗어남이 없이 다양한 대안적인 형태를 취할 수 있다.

Claims (28)

  1. 다음 단계를 포함하는, 유기 폐기물을 재활용하여 락트산 또는 이의 염을 생산하는 방법:
    (ⅰ) 입자 크기의 감소 및 선택적으로 살균을 포함하는 전처리(pretreatment)를 거친 전처리된 유기 폐기물을 제공하는 단계;
    (ⅱ) 바실러스 코아굴란스(Bacillus coagulans) 포자의 건조 조성물을 제공하는 단계;
    (ⅲ) 상기 전처리된 유기 폐기물을 발효 반응기에서 하나 이상의 당류 분해 효소(saccharide-degrading enzyme) 및 상기 B. 코아굴란스 포자의 건조 조성물과 혼합하고, 혼합물을 발효 반응기에서 배양(incubating)하여 상기 유기 폐기물을 당화(saccharifying)하고 상기 포자의 발아, 및 후속적으로 상기 포자로부터 발아하는 영양성(vegetative) B. 코아굴란스 세포에 의한 락트산 생산을 유도하는 단계; 및
    (ⅳ) 발효 브로스(fermentation broth)로부터 락트산 또는 이의 염을 회수하는 단계.
  2. 제1항에 있어서, 단계 (ⅲ)에서 B. 코아굴란스 포자의 건조 조성물을 전처리된 유기 폐기물과 혼합하기 전에 수산화마그네슘 슬러리에 현탁시킴으로써, 미생물 오염물질이 불활성화된 B. 코아굴란스 포자 현탁액을 수득하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  3. 제2항에 있어서, 슬러리 중 수산화마그네슘의 농도가 1%-25% 범위인 방법.
  4. 제2항 또는 제3항에 있어서, 슬러리 중 수산화마그네슘의 농도가 10%-20% 범위인 방법.
  5. 제2항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 수산화마그네슘 슬러리에 현탁시키는 단계가 현탁액을 25-60℃의 온도에서 15-90분 동안 배양하는 것을 포함하는 방법.
  6. 제2항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 수산화마그네슘 슬러리에 현탁시키는 단계가 현탁액을 50-55℃의 온도에서 15-90분 동안 배양하는 것을 포함하는 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 바실러스 코아굴란스 포자의 건조 조성물이 마그네슘 락테이트를 포함하는 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 유기 폐기물이 음식물 폐기물(food waste), 일반 폐기물(municipal waste), 농업 폐기물, 식물 재료 및 이들의 혼합물 또는 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (ⅲ)에서의 배양이 5-7 범위의 pH에서 수행되는 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (ⅲ)에서의 배양이 5.5-6.5 범위의 pH에서 수행되는 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (ⅲ)에서의 배양이 45-60℃ 범위의 온도에서 수행되는 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (ⅱ)에서의 배양이 50-55℃ 범위의 온도에서 수행되는 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (ⅲ)에서의 배양이 20-48시간 범위의 시간 동안 수행되는 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (ⅲ)에서의 배양이 20-36시간 범위의 시간 동안 수행되는 방법.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 당류 분해 효소가 아밀라제, 셀룰라제 및 헤미셀룰로스로 이루어진 군으로부터 선택되는 다당류 분해 효소인 방법.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 당류 분해 효소가 글루코아밀라제를 포함하는 방법.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (ⅲ)에서의 혼합이 B. 코아굴란스의 건조 조성물을 발효 반응기에 첨가하여 발효 배지 ml당 적어도 10^4개의 포자를 수득하는 것을 포함하는 방법.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (ⅲ)에서의 혼합이 B. 코아굴란스의 건조 조성물을 발효 반응기에 첨가하여 발효 배지 ml당 적어도 10^6개의 포자를 수득하는 것을 포함하는 방법.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, B. 코아굴란스 포자의 건조 조성물이 10% w/w 이하의 수분 함량을 특징으로 하는 방법.
  20. 유기 폐기물을 재활용하여 락트산 또는 이의 염을 생산하기 위한 시스템으로서, 상기 시스템은:
    (a) 입자 크기 감소 및 선택적으로 살균을 포함하는 전처리를 거친 전처리된 유기 폐기물의 공급원;
    (b) 바실러스 코아굴란스 포자의 건조 조성물;
    (c) 하나 이상의 당류 분해 효소; 및
    (d) 상기 전처리된 유기 폐기물, 상기 하나 이상의 당류 분해 효소 및 상기 B. 코아굴란스 포자의 건조 조성물을 내부에서 혼합하기 위한 발효 반응기를 포함하고,
    여기서 혼합물은 상기 유기 폐기물을 당화하고 상기 포자의 발아, 및 후속적으로 상기 포자로부터 발아하는 영양성 B. 코아굴란스 세포에 의한 락트산 생산을 유도하기 위해 상기 발효 반응기에서 배양되는 시스템.
  21. 제20항에 있어서, 상기 시스템은:
    (a) 입자 크기 감소 및 선택적으로 살균을 포함하는 전처리를 거친 전처리된 유기 폐기물의 공급원;
    (b) 수산화마그네슘 슬러리에 현탁된 B. 코아굴란스 포자의 건조 조성물;
    (c) 하나 이상의 당류 분해 효소; 및
    (d) 상기 전처리된 유기 폐기물, 상기 하나 이상의 당류 분해 효소, 및 상기 수산화마그네슘 슬러리에 현탁된 B. 코아굴란스 포자의 건조 조성물을 내부에서 혼합하기 위한 발효 반응기를 포함하고,
    여기서 혼합물은 상기 유기 폐기물을 당화하고 상기 포자의 발아, 및 후속적으로 상기 포자로부터 발아하는 영양성 B. 코아굴란스 세포에 의한 락트산 생산을 유도하기 위해 상기 발효 반응기에서 배양되는 시스템.
  22. 바실러스 코아굴란스 포자 및 마그네슘 락테이트를 포함하는, 락트산 발효를 위한 분말 형태의 건조 접종물(dried inoculum)로서, 상기 접종물은 건조되고 락트산 생산을 제공하기 위해 락트산 생산 발효기에 접종할 준비가 되어있는 건조 접종물.
  23. 제22항에 있어서, 건조 접종물이 분말 g당 10^8-10^10개의 포자를 포함하고, 건조 접종물 중 마그네슘 락테이트의 농도가 40-60% (w/w) 범위인 건조 접종물.
  24. 다음 단계를 포함하는, 유기 폐기물을 재활용하여 락트산 또는 이의 염을 생산하는 방법:
    (ⅰ) B. 코아굴란스 포자 및 마그네슘 락테이트를 포함하는, 제22항 또는 제23항의 건조 접종물을 제공하는 단계;
    (ⅱ) 상기 건조 접종물을 수산화마그네슘 슬러리에 현탁시킴으로써, 미생물 오염물질이 불활성화된 B. 코아굴란스 포자 현탁액을 수득하는 단계;
    (ⅲ) 단계 (ⅱ)에서 수득한 현탁액을 발효 반응기에서 하나 이상의 당류 분해 효소, 및 입자 크기 감소 및 선택적으로 살균을 포함하는 전처리를 거친 전처리된 유기 폐기물과 혼합하고, 이를 배양하여 상기 유기 폐기물을 당화하고 상기 포자의 발아, 및 후속적으로 상기 포자로부터 발아하는 영양성 B. 코아굴란스 세포에 의한 락트산 생산을 유도하는 단계; 및
    (ⅳ) 발효 브로스로부터 락트산 또는 이의 염을 회수하는 단계.
  25. 제24항에 있어서, 상기 방법이 다음 단계를 포함하는, 마그네슘 락테이트를 생산하는 방법인 것인 방법:
    입자 크기 감소 및 선택적으로 살균을 포함하는 전처리를 거친 전처리된 유기 폐기물을 제공하는 단계;
    B. 코아굴란스 포자 및 마그네슘 락테이트를 포함하는, 제22항 또는 제23항의 건조 접종물을 제공하는 단계;
    B. 코아굴란스 포자의 건조 접종물을 수산화마그네슘 슬러리에 현탁시킴으로써, 미생물 오염물질이 불활성화된 B. 코아굴란스 포자 현탁액을 수득하는 단계;
    상기 전처리된 유기 폐기물을 발효 반응기에서 하나 이상의 당류 분해 효소 및 상기 B. 코아굴란스 포자 현탁액과 혼합하는 단계;
    혼합물을 발효 반응기에서 배양하여 상기 유기 폐기물을 당화하고 상기 포자의 발아, 및 후속적으로 상기 포자로부터 발아하는 영양성 B. 코아굴란스 세포에 의한 락트산 생산을 유도하는 단계로서, 수산화마그네슘, 산화마그네슘 및 탄산마그네슘으로부터 선택되는 알칼리성 화합물을 배양 동안 상기 발효 반응기에 첨가하여 pH를 조정함으로써, 락테이트 단량체 및 Mg2+ 이온을 수득하는 단계; 및
    발효 브로스로부터 마그네슘 락테이트를 회수하는 단계.
  26. 제25항에 있어서, pH를 조정하기 위해 배양 동안 발효 반응기에 첨가되는 알칼리성 화합물이 수산화마그네슘인 방법.
  27. 다음 단계를 포함하는, 유기 폐기물을 재활용하여 락트산 또는 이의 염을 생산하는 방법:
    (ⅰ) 입자 크기의 감소 및 선택적으로 살균을 포함하는 전처리를 거친 전처리된 유기 폐기물을 제공하는 단계;
    (ⅱ) 15%-30% (w/w) 범위의 수분 함량을 특징으로 하는, 바실러스 코아굴란스 포자의 부분 건조 조성물을 제공하는 단계;
    (ⅲ) 상기 전처리된 유기 폐기물을 발효 반응기에서 하나 이상의 당류 분해 효소 및 상기 B. 코아굴란스 포자의 부분 건조 조성물과 혼합하고, 혼합물을 발효 반응기에서 배양하여 상기 유기 폐기물을 당화하고 상기 포자의 발아, 및 후속적으로 상기 포자로부터 발아하는 영양성 B. 코아굴란스 세포에 의한 락트산 생산을 유도하는 단계; 및
    (ⅳ) 발효 브로스로부터 락트산 또는 이의 염을 회수하는 단계.
  28. 제27항에 있어서, B. 코아굴란스 포자의 부분 건조 조성물이 15%-25% (w/w) 범위의 수분 함량을 특징으로 하는 방법.
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Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20240061652A (ko) * 2021-09-29 2024-05-08 트리플더블유 리미티드 바실러스 코아귤란스 포자의 조성물을 사용하는 락트산 생산을 위한 유기 폐기물의 전처리
CN114107115A (zh) * 2021-11-30 2022-03-01 电子科技大学中山学院 一种高效降解餐厨垃圾复合菌剂及其制备方法
CN114317330B (zh) * 2021-12-09 2023-07-18 江苏理工学院 一株降解纤维素菌的筛选及应用
KR102589538B1 (ko) * 2023-01-30 2023-10-16 청미바이오(주) 유용미생물과 효소제를 이용한 축산용 보충사료 조성물
WO2024161401A1 (en) * 2023-02-02 2024-08-08 TripleW Ltd. Methods and systems for pre-fermentation treatment of organic waste

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005100543A1 (ja) * 2004-03-31 2005-10-27 Sankyo Lifetech Co., Ltd. Ｌ−乳酸の製造方法
JP4405914B2 (ja) * 2002-05-14 2010-01-27 ピュラック バイオケム ビー． ブイ． でんぷんの同時の糖化及び醗酵による、乳酸又はその塩の製造のための方法

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2006312157A (ja) * 2005-05-04 2006-11-16 Toru Ueda 稲藁等からの高効率乳酸・コハク酸生産方法及び石膏系土壌改良材・建築用資材生産方法
EE200600034A (et) 2006-10-11 2008-06-16 Tartu Ülikool Meetod sporogeensete fermenteeritavate termofiilsete mikroorganismi tvede endospooride saamiseks ja saadud endospooride kasutamine fermentatsiooni inokuleerimiseks
DK2191004T3 (da) * 2007-08-23 2013-09-02 Stichting Dienst Landbouwkundi Mild alkalisk forbehandling og samtidig forsukring og gæring af lignocelluloseholdig biomasse til organiske syrer
EP2604696A1 (en) * 2011-12-16 2013-06-19 PURAC Biochem BV Process for the fermentative production of lactic acid from a plant extract in the presence of a caustic magnesium salt
ES2699438T3 (es) * 2013-02-06 2019-02-11 Envera Lic Llc Mezclas de compuestos germinativos de esporas secas
CN103667110B (zh) * 2013-10-23 2016-07-06 中国科学院过程工程研究所 一株凝结芽孢杆菌及使用该菌同步糖化共发酵木质纤维素生产乳酸的集成工艺
ES2930659T3 (es) 2014-07-28 2022-12-20 Purac Biochem Bv Procedimiento para la preparación de ácido láctico
CN104694587B (zh) * 2015-02-11 2017-12-26 北京林业大学 一种由甘蔗渣生产乳酸的方法
CN104789607B (zh) * 2015-04-21 2018-01-12 北京化工大学 一种发酵‑分离耦合制备乳酸和/或乳酸盐的方法
EP3402872A4 (en) * 2016-01-11 2019-06-12 3PLW Ltd. BACTERIA USING LACTIC ACID, GENETICALLY MODIFIED TO SECURE ENZYMES DEGRADING POLYSACCHARIDES
CN106834368A (zh) * 2017-03-02 2017-06-13 江苏迪因生物科技有限公司 一种利用木质纤维素发酵生产l‑乳酸的方法
CN109837316A (zh) * 2019-02-03 2019-06-04 上海交通大学 一种利用木质纤维素玉米芯残渣高效生产l-乳酸的方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP4405914B2 (ja) * 2002-05-14 2010-01-27 ピュラック バイオケム ビー． ブイ． でんぷんの同時の糖化及び醗酵による、乳酸又はその塩の製造のための方法
WO2005100543A1 (ja) * 2004-03-31 2005-10-27 Sankyo Lifetech Co., Ltd. Ｌ−乳酸の製造方法

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