KR20220157690A

KR20220157690A - 복합추출물 또는 복합 발효추출물을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물 및 그의 제조방법

Info

Publication number: KR20220157690A
Application number: KR1020210065530A
Authority: KR
Inventors: 황기철
Original assignee: 황기철
Priority date: 2021-05-21
Filing date: 2021-05-21
Publication date: 2022-11-29

Abstract

본 출원은 땅콩새싹, 병풀, 및 고삼을 포함하는 복합추출물 또는 이를 발효시킨 복합 발효추출물을 포함하는 화장료 조성물을 제공한다. 본 출원의 화장료 조성물은 항염증 효능 및 항산화 효능을 가지는 장점이 있다.

Description

복합추출물 또는 복합 발효추출물을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물 및 그의 제조방법{COSMETIC COMPOSITION COMPRISING AND THE COMPLEX EXTRACT OR THE FERMENTED COMPLEX EXTRACT AND MANUFACTURING THE SAME}

본 출원은 복합추출물 또는 복합 발효추출물을 포함하는 화장료 조성물에 관한 것이다.

피부는 신체의 외부를 덮고 있는 하나의 막으로 여러 가지 외부의 자극, 장해, 건조 등의 환경요소로부터 신체를 보호해 주는 다양한 생리적 기능을 수행하여 내부 장기와 그 밖의 체내 기관을 보호 조절하는 역할을 한다.

그러나, 생체 외부로부터 유입되거나, 생체 내에서 발생하는 활성산소는 생체의 노화를 촉진시키거나, 암 발생의 원인이 되기도 한다. 활성산소는 단백질의 SH기와 반응해서 효소의 활성을 잃게 되거나 가교결합의 형성, DNA, RNA, 효소 및 세포막을 구성하고 있는 불포화 지방산을 산화시켜 과산화지질을 형성하게 하는데, 과산화지질은 생체에 매우 유독하여 생체의 기능을 저하시켜서 결국에는 동맥경화, 혈액순환장애, 피로, 당뇨병, 심장병, 간장장애, 발암, 암전이 등과 같은 질병의 원인이 되고 궁극적으로 노화의 원인이 된다.

종래에는 활성산소에 의한 산화를 억제하는 항산화 물질에 대한 연구가 진행된 바 있으나, 천연에 존재하는 항산화 물질은 피부에 적용할 경우 실질적으로 충분한 효과를 기대할 수 없다는 문제가 있고, 산화력이 뛰어나고 저가의 합성 항산화제는 인체 부작용 등 안전성에 대한 우려로 그 사용이 제한된다는 문제가 있다.

한편, 세포가 LPS 등의 외부 자극원에 의해 자극을 받게 되면, iNOS(유도형 NO synthase) 및 COX-2(cyclooxygenase-2)의 발현이 유도되고, 이로 인해 염증반응을 매개하는 세포 내 신호 전달 물질인 일산화질소(nitric oxide, NO)와 프로스타글란딘(prostaglandin E₂, PGE₂)을 방출하게 된다. 이렇게 과다 방출된 NO 및 PGE₂로 인해 인체 및 조직에 염증반응이 일어나게 된다.

대부분의 염증 질환의 치료제로서 널리 사용되고 있는 제제인 비스테로이드성 소염제(non-steroidal antiinflammatory drugs, NSAIDS)는 시클로옥시게나제(cyclooxygenase, COX)라고 하는 아라키돈산(arachidonicacid)로부터 프로스타글란딘(prostaglandin)의 생합성에 관여하는 효소 활성을 억제함으로써, 항염증 작용을 나타내는데, 주 치료 작용 외에 위장관 장애, 간장애, 신장애 등의 심각한 부작용을 야기하므로 장기간 사용에 있어서 제약이 따르는 문제가 있다.

따라서, DPPH 라디칼 소거능 또는 ABTS 라디칼 소거능을 가지고 세포의 산화를 억제하는 항산화 효능 및 NO 저해 활성 또는 프로스타글란딘(Prostaglandin E₂, PGE₂) 저해 활성을 가지는 항염증 효능에 탁월한 화장료 조성물의 개발이 널리 요구되며, 부작용이 거의 없어 장기간 사용하는데 무리가 없는 화장료 조성물의 개발이 요구된다.

대한민국 등록특허공보 제10-1971837호(2019.4.23. 공고)

본 출원은 상기한 바와 같은 종래 문제점을 해결하기 위해, 땅콩새싹(Peanut sprout), 병풀(Centella asiatica), 및 고삼(Sophora flavescens)을 포함하는 건조 분말을 혼합하여 추출한 복합추출물을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물을 제공한다.

본 출원의 다른 실시예는, 땅콩새싹(Peanut sprout), 병풀(Centella asiatica), 및 고삼(Sophora flavescens)을 포함하는 건조 분말을 혼합하여 추출 후 발효시킨 복합 발효추출물을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물을 제공한다.

본 출원의 다른 실시예는, 상기 화장료 조성물은 대식세포의 NO 저해 활성 및 프로스타글란딘(Prostaglandin E₂, PGE₂) 저해 활성을 가지는 항염증용인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물을 제공한다.

본 출원의 다른 실시예는, 상기 화장료 조성물은 대식세포의 NO 저해 활성을 가지는 항염증용인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물을 제공한다.

본 출원의 다른 실시예는, 상기 화장료 조성물은 프로스타글란딘(Prostaglandin E₂, PGE₂) 저해 활성을 가지는 항염증용인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물을 제공한다.

본 출원의 다른 실시예는, 상기 화장료 조성물은 DPPH 라디칼 소거능 또는 ABTS 라디칼 소거능을 가지고 세포의 산화를 억제하는 항산화용인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물을 제공한다.

상술한 과제를 해결하기 위하여, 본 출원의 하나의 실시예는, 땅콩새싹(Peanut sprout), 병풀(Centella asiatica), 및 고삼(Sophora flavescens)을 포함하는 건조 분말을 혼합하여 추출한 복합추출물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물을 제공한다.

본 출원의 하나의 실시예에서, 상기 건조 분말은 감초(Glycyrrhiza uralensis) 및 황금(Scutellaria baicalensis)으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 더 포함할 수 있다.

본 출원의 하나의 실시예는, 땅콩새싹(Peanut sprout), 병풀(Centella asiatica), 및 고삼(Sophora flavescens)을 포함하는 건조 분말을 혼합하여 추출 후 발효시킨 복합 발효추출물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물을 제공한다.

본 출원의 하나의 실시예에서, 상기 추출물은, 에탄올, 메탄올, 부탄올, 헥산, 에틸 아세테이트, 부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 디프로필렌글리콜 및 메틸렌클로라이드로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 유기 용매를 이용하여 추출할 수 있다.

본 출원의 하나의 실시예에서, 상기 건조 분말은, 땅콩새싹; 병풀; 황금; 고삼; 및 감초;를 포함하고, 상기 건조 분말 총 중량을 기준으로, 땅콩새싹 10 내지 30중량%; 병풀 10 내지 30중량%; 황금 10 내지 30중량%; 고삼 10 내지 30중량%; 및 감초 10 내지 30중량%;를 포함할 수 있다.

본 출원의 하나의 실시예에서, 상기 병풀, 황금, 고삼 또는 감초는, 잎, 줄기, 뿌리, 꽃, 종자, 새싹, 수액 및 내수피로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것에서 추출되는 것일 수 있다.

본 출원의 하나의 실시예에서, 상기 복합 발효추출물은, 유산균종균을 0.5중량% 내지 3중량% 접종하여 얻어진 것일 수 있다.

본 출원의 하나의 실시예에서, 상기 유산균종균은 락토바실러스 속(Lactobacillus sp.)이고, 락토바실러스 아시도필러스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus Brebis CD2), 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei), 락토바실러스 힐가르디(Lactobacillus hilgardii), 락토바실러스 말리(Lactobacillus mali), 락토바실러스 나겔리(Lactobacillus nagelii), 락토바실러스 플란타륨(Lactobacillus plantarium), 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri), 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus Rhamnosus), 락토바실러스 삿수멘시스(Lactobacillus satsumensis) 및 락토바실러스 서머필러스(Lactobacillus Thermophilus)로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상인 것일 수 있다.

본 출원의 하나의 실시예에서, 상기 화장료 조성물은 대식세포의 NO 저해 활성을 가지는 항염증용인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물을 제공한다.

본 출원의 하나의 실시예에서, 상기 화장료 조성물은 대식세포의 프로스타글란딘(Prostaglandin E₂, PGE₂) 저해 활성을 가지는 항염증용인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물을 제공한다.

본 출원의 하나의 실시예에서, 상기 화장료 조성물은 DPPH 라디칼 소거능 또는ABTS 라디칼 소거능을 가지고 세포의 산화를 억제하는 항산화용인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물을 제공한다.

본 출원의 하나의 실시예는, 상기 복합추출물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물의 제조방법으로서, 상기 건조 분말의 혼합물을 유기용매를 이용하여 환류 추출법, 열수 추출법 및 초음파 추출법 중 어느 하나의 방법으로 추출하는 단계; 및 여과 후 용매를 제거하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물의 제조방법을 제공한다.

본 출원의 하나의 실시예는, 상기 복합 발효추출물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물의 제조방법으로서, 상기 건조 분말의 혼합물을 유기용매를 이용하여 환류 추출법, 열수 추출법 및 초음파 추출법 중 어느 하나의 방법으로 추출하는 단계; 여과 후 용매를 제거하는 단계; 배지를 첨가하고 멸균하는 단계; 락토바실러스 아시도필러스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus Brebis CD2), 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei), 락토바실러스 힐가르디(Lactobacillus hilgardii), 락토바실러스 말리(Lactobacillus mali), 락토바실러스 나겔리(Lactobacillus nagelii), 락토바실러스 플란타륨(Lactobacillus plantarium), 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri), 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus Rhamnosus), 락토바실러스 삿수멘시스(Lactobacillus satsumensis) 및 락토바실러스 서머필러스(Lactobacillus Thermophilus)로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상을 접종하는 단계; 35℃ 내지 40℃에서 40시간 내지 50시간 동안 배양하는 단계; 및 균주를 불활성화하고 여과하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물의 제조방법을 제공한다.

본 출원의 하나의 실시예에 따른 화장료 조성물은, 대식세포의 NO 저해 활성 또는 프로스타글란딘(Prostaglandin E₂, PGE₂) 저해 활성을 가지는 항염증 효능이 있다는 장점이 있다.

본 출원의 하나의 실시예에 따른 화장료 조성물은, DPPH 라디칼 소거능 또는 ABTS 라디칼 소거능을 가지고 세포의 산화를 억제하는 항산화 효능이 있다는 장점이 있다.

도 1은 HaCaT 세포(인간피부표피세포) 독성시험 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 DPPH 라디칼 소거능을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 ABTS 라디칼 소거능을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 실시예 1, 3, 4 및 5에 대한 ABTS 라디칼 소거능을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 대식세포(RAW264.7)에서의 세포독성을 흡광도로 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 대식세포(RAW264.7)에서의 NO(Nitric Oxide) 저해 활성 결과를 흡광도로 측정하여 나타낸 것이다.
도 7은 대식세포(RAW264.7)에서의 PGE₂ 저해 활성 결과를 흡광도로 측정하여 나타낸 것이다.

이하, 본 출원을 보다 상세히 설명한다.

이하의 특정한 구조 내지 기능적 설명들은 단지 본 출원의 개념에 따른 실시예를 설명하기 위하여 예시된 것으로, 본 출원의 개념에 따른 실시예들은 다양한 형태로 실시될 수 있으며 본 명세서에 설명된 실시예들에 한정되는 것으로 해석되어서는 아니 된다.

본 출원의 개념에 따른 실시예는 다양한 변경을 가할 수 있고 여러 가지 형태를 가질 수 있으므로 특정 실시예들은 본 명세서에 상세하게 설명하고자 한다. 그러나, 이는 본 출원의 개념에 따른 실시예들을 특정한 개시 형태에 한정하려는 것이 아니며, 본 출원의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

본 명세서에서 사용하는 용어는 단지 특정한 실시예를 설명하기 위해 사용된 것으로 본 출원을 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한 복수의 표현을 포함한다.

다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 본 출원이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥상 가지는 의미와 일치하는 의미를 갖는 것으로 해석되어야 하며, 본 명세서에서 명백하게 정의하지 않는 한 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.

본 출원의 하나의 실시예는, 땅콩새싹(Peanut sprout), 병풀(Centella asiatica), 및 고삼(Sophora flavescens)을 포함하는 건조 분말을 혼합하여 추출한 복합추출물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물을 제공한다.

상기 복합추출물에서, 상기 건조 분말은 구체적으로 땅콩새싹, 병풀 및 고삼을 포함할 수 있다. 상기 건조 분말은, 더 구체적으로 땅콩새싹, 병풀, 고삼, 및 황금을 포함하거나, 땅콩새싹, 병풀, 고삼, 및 감초를 포함할 수 있다. 상기 건조 분말은, 더욱 더 구체적으로 땅콩새싹, 병풀, 고삼, 황금 및 감초를 포함할 수 있다.

본 출원의 용어 “건조 분말”은 단순히 과립화된 물질의 육안 외관을 나타내고, 최대 약 10% 또는 최대 약 5%의 물 또는 기타 용매를 함유할 수 있거나, 또는 실질적으로 물 또는 기타 용매가 없거나, 또는 무수형이다. 다르게 명시되지 않는 한, 상기 물질에 복합 또는 응집 용매가 완전히 포함되지 않음을 의미하는 것으로 의도되지는 않는다.

상기 건조 분말은 분무 건조 분말일 수 있으며, 공기 중에서 미세한 분말로 분무되어 건조시킨 분말일 수 있다. 상기 분무 건조 분말은 건조 과정에서 미세한 분말 입자들끼리 뒤엉켜 붙지 않아 95% 내지 99%로 건조시켜 우수한 품질의 분말을 제조할 수 있다는 장점이 있다.

본 출원의 용어 “복합추출물”은 천연물로부터 분리된 활성성분을 포함하고, 본 출원의 항염, 항산화 효과를 지닌 땅콩새싹(Peanut sprout), 병풀(Centella asiatica), 황금(Scutellaria baicalensis), 고삼(Sophora flavescens) 및 감초(Glycyrrhiza uralensis)로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 둘 이상의 건조 분말로 혼합하여 이루어진 추출물을 의미한다.

본 출원의 용어 “유효성분”의 의미는, 화장료 조성물로써 DPPH 라디칼 소거능, ABTS 라디칼 소거능, NO 저해 활성 및 프로스타글란딘 저해 활성을 포함하는 항산화용 또는 항염증용을 나타낼 수 있는 정도의 유효량을 함유하는 것을 의미한다. 본 출원의 화장료 조성물에 포함되는 상기 추출물의 함량은 조성물이 제품화되는 형태, 상기 화합물이 피부에 적용되는 방법 및 피부에 머무르는 시간 등에 따라 달라질 것이다.

상기 복합 발효추출물에서 건조 분말은 구체적으로 땅콩새싹, 병풀 및 고삼을 포함할 수 있다. 상기 건조 분말은, 더 구체적으로 땅콩새싹, 병풀, 고삼, 및 황금을 포함하거나, 땅콩새싹, 병풀, 고삼, 및 감초를 포함할 수 있다. 상기 건조 분말은, 더욱 더 구체적으로 땅콩새싹, 병풀, 고삼, 황금 및 감초를 포함할 수 있다.

본 출원의 용어 “복합 발효추출물”은 천연물로부터 분리된 활성성분을 포함하고, 본 출원의 항염, 항산화 효과를 지닌 땅콩새싹(Peanut sprout) 및 병풀(Centella asiatica), 황금(Scutellaria baicalensis), 고삼(Sophora flavescens) 및 감초(Glycyrrhiza uralensis)로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 건조 분말을 혼합하여 발효시킨 발효물을 의미한다. 또한, 통상적인 발효 식품에서와 같이 효모 또는 유산균을 이용하여 발효시킨 발효물을 의미하며, 예를 들면 이하 실시예에서 예시적으로 실험한 락토바실러스 플란타륨에 의한 발효물을 포함한다.

또한, 상기 복합추출물 또는 복합 발효추출물의 건조 분말은 1㎛ 내지 25㎛의 메쉬 필터로 여과하고, 이후에 상기 복합추출물 또는 복합 발효추출물을 1㎛ 내지 3㎛의 메쉬 필터로 여과하는 것일 수 있다. 상기 필터가 1㎛ 미만이면 많은 양의 추출물들이 서로 엉겨 붙어 여과되지 않는다는 문제가 있고, 25㎛를 초과하면 너무 크기가 큰 추출물들이 여과되어 용매에 녹지 않는 문제가 있다.

본 출원의 하나의 실시예에서, 상기 복합추출물 또는 복합 발효추출물은, 에탄올, 메탄올, 부탄올, 헥산, 에틸 아세테이트, 부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 디프로필렌글리콜 및 메틸렌클로라이드로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 유기 용매를 이용하여 추출할 수 있다.

구체적으로, 상기 건조 분말은, 총 100중량%를 기준으로, 땅콩새싹 15 내지 25중량%; 병풀 15 내지 25중량%; 황금 15 내지 25중량%; 고삼 15 내지 25중량%; 및 감초 15 내지 25중량%;를 포함할 수 있다.

더 구체적으로, 상기 건조 분말은, 총 100중량%를 기준으로, 땅콩새싹 20중량%; 병풀 20중량%; 황금 20중량%; 고삼 20중량%; 및 감초 20중량%;를 포함하여 중량비로 나타내었을 때 1:1:1:1:1 일 수 있다.

상기 땅콩새싹, 병풀, 황금, 고삼 및 감초 각각의 중량이 10중량% 미만이면, 항산화 효과 및 항염증 효과가 미미할 수 있는 문제가 있고, 30중량%를 초과하면, 조성물의 세포 독성이 확인되거나 조성물의 효과 대비 효율적이지 않은 원료 사용의 문제가 있다.

상기 잎, 줄기, 뿌리, 꽃, 종자, 새싹, 수액 및 내수피를 분쇄하여 용매와 혼합한 후 여액을 얻고, 상기 얻어진 여액을 여과한 후 여과물을 원심분리하여 상등액을 수득하며, 수득된 상기 상등액을 다시 여과하여 분리된 세포 외 베지클 또는 건조 분말을 수득할 수 있다.

구체적으로, 상기 추출물이 잎, 줄기, 뿌리, 꽃, 종자, 새싹, 수액 및 내수피로 이루어진 군에서 선택되는 둘 이상인 것일 때 선택되어지는 하나는 수액일 수 있고, 나머지는 잎, 줄기, 뿌리, 꽃, 종자 및 내수피와 같은 고체 추출물인 건조 분말일 수 있다.

상기 땅콩새싹, 병풀, 황금, 고삼 및 감초 건조분말을 혼합하여 복합추출물 또는 복합 발효추출물 제조시, 수액이 추가로 포함될 수 있으며, 혼합시 유효성분이 뭉치지 않고, 균일하게 혼합되어 제조될 수 있다는 장점이 있다.

상기 유산균종균이 0.5중량% 미만이면 복합 발효추출물의 발효가 이루어지지 않아 발효능이 미미할 수 있다는 문제가 있고, 3중량%를 초과하면 과발효가 되어 냄새나 색에 문제가 있고, 항산화 및 항염증 효능이 미미하다는 문제가 있다.

구체적으로, 상기 유산균종균은 락토바실러스 플란타륨(Lactobacillus plantarium)일 수 있으며, 상기 복합 발효 추출물은, 높은 항산화 및 항염증 효능이 있다는 장점이 있다.

본 출원의 하나의 실시예는, 상기 화장료 조성물은 대식세포의 프로스타글란딘(Prostaglandin E₂, PGE₂) 저해 활성을 가지는 항염증용인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물을 제공한다.

본 출원의 용어 “항염증용”은 염증 반응을 억제하거나 방해하는 것을 말하며, NO 저해 활성 또는 프로스타글란딘의 저해 활성을 가지는 것을 포함한다.

본 출원의 하나의 실시예는, 상기 화장료 조성물은 DPPH 라디칼 소거능 또는 ABTS 라디칼 소거능을 가지고 세포의 산화를 억제하는 항산화용인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물을 제공한다.

본 출원의 용어 “항산화용”는 세포내 대사 또는 자외선의 영향으로 인한 산화적 스트레스에 따라 반응성이 높은 자유 라디칼(free radical) 또는 활성산소종(reactive oxygen species; ROS)에 의한 세포의 산화를 억제하는 것을 말하며, 자유 라디칼 또는 활성산소종을 제거하여 이로 인한 세포의 손상이 감소되는 것을 포함한다.

구체적으로, 상기 복합추출물 또는 복합 발효추출물은 환류 추출법을 이용하여 추출할 수 있다. 상기 환류 추출법을 이용하면 빠른 건조로 고형분의 제조시, 조성물의 제조 속도가 단축된다는 장점이 있다. 더 구체적으로, 상기 복합추출물 또는 복합 발효추출물은 에탄올을 이용한 환류 추출법을 이용할 수 있다.

상기 유산균종균을 35℃ 미만에서 배양하면 균의 배양이 미미하여 발효가 이루어지지 않는다는 문제가 있고, 40℃를 초과하여 배양하면 균이 불활성화 되는 문제가 있다. 또한, 상기 유산균종균을 40시간 미만으로 배양하면 균의 배양이 미미하여 발효가 이루어지지 않는다는 문제가 있고, 50시간을 초과하여 배양하면 균이 불활성화 되는 문제가 있다.

상기 복합 추출물 또는 복합발효 추출물은 세포독성이 전혀 없어 인체에 무해하고 안전하므로 그 자체가 화장료 조성물로 사용될 수도 있지만, 화장료 조성물의 유효성분으로서 0.01 내지 20.0 중량%, 더욱 구체적으로 0.1 내지 10중량%의 양으로 함유되는 것이 바람직하다. 0.1 중량 % 미만은 그 효과가 미미함을 확인할 수 있었으며 그 이상의 농도를 첨가 하였을 시에 그 효과는 커진다. 하지만 조성물을 20중량%를 포함하여 제조시에는 화장품의 제형이 분리되고 추출물이 석출되는 문제가 있을 수 있어서 0.01 내지 20.0 중량%로 포함되는 것이 바람직하며, 더욱 구체적으로 0.1 내지 10중량%로 포함되면 제형이 안정적이라고 할 수 있다.

본 출원의 하나의 실시예에 따른 화장료 조성물의 제형은 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 파우더, 팩, 비누, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나인 것일 수 있다. 보다 상세하게는, 수렴 화장수, 유연 화장수, 로션, 에센스, 영양 크림, 아이크림, 클렌징크림, 팩, 영양젤 또는 마사지 크림의 제형으로 제조될 수 있다.

상기 화장료 조성물의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트검, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

상기 화장료 조성물의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

상기 화장료 조성물의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 가용화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르 가 있다.

상기 화장료 조성물의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트검등이 이용될 수 있다.

상기 화장료 조성물의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

또한, 상기 화장료 조성물에 첨가되는 첨가물 역시 한정되지 않으며 화장료 분야의 일반적인 첨가물이 첨가될 수 있다. 상기 화장료 분야의 일반적인 첨가물의 예로는 항생제, 결합제, 붕해제, 희석제, 활택제, 안정제, 보존료, 향료, 유분, 물, 계면활성제, 보습제, 저급알콜, 증점제, 킬레이트제, 색소 및 방부제로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 또는 하나 이상일 수 있다.

이하, 본 출원의 이해를 돕기 위하여 바람직한 제조예, 실시예(example), 실험예 및 제형예를 제시한다. 다만, 하기의 제조예, 실시예, 실험예 및 제형예는 본 출원의 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 본 출원이 한정되는 것은 아니다.

[실시예 1]

땅콩새싹, 병풀, 황금, 고삼 및 감초를 마쇄하여 건조 분말을 준비하였다. 상기 건조 분말들을 각각 10g 씩 1:1:1:1:1의 비율로 총 50g을 준비하였다. 70% 에탄올을 총 건조 분말 대비 10배의 양인 500ml 첨가하여 80℃에서 6시간 동안 환류 추출하였다. 그 후, 여과 장치를 이용하여 25㎛으로 여과하고, 60℃ 내지 70℃에서 감압 농축하면서 에탄올을 제거하였다. 에탄올이 제거된 후, 증류수를 총 건조 분말 대비 10배의 양인 500ml 첨가하고 1㎛로 여과하여 복합추출물을 제조하였다.

[실시예 2]

땅콩새싹, 병풀, 황금, 고삼 및 감초를 마쇄하여 건조 분말을 준비하였다. 상기 건조 분말들을 각각 10g 씩 1:1:1:1:1의 비율로 총 50g을 준비하였다. 70% 에탄올을 총 건조 분말 대비 10배의 양인 500ml 첨가하여 80℃에서 6시간 동안 환류 추출하였다. 그 후, 여과 장치를 이용하여 25㎛으로 여과하고, 60℃ 내지 70℃에서 감압 농축하면서 에탄올을 제거하였다. 에탄올이 제거된 후, dextrose를 2% 첨가하고, 15분 동안 121℃에서 고압 멸균한 배지에 락토바실러스 플란타륨(Lactobacillus plantarium)를 1% 접종하여 37℃에서 48시간 동안 배양하였다. 배양이 완료되면 균주를 불활성화시키고 1㎛로 여과하여 복합 발효추출물을 제조하였다.

[실시예 3] 내지 [실시예 5]

땅콩새싹, 병풀, 고삼 및 감초를 마쇄하여 건조 분말들을 각각 1:1:1:1의 비율로 총 50g을 준비하였다(실시예 3). 땅콩새싹, 병풀 및 고삼을 마쇄하여 건조 분말들을 각각 1:1:1의 비율로 총 50g을 준비하였다(실시예 4). 땅콩새싹 및 병풀을 마쇄하여 건조 분말들을 각각 1:1의 비율로 총 50g을 준비하였다(실시예 5). 각각의 건조분말에 70% 에탄올을 총 건조 분말 대비 10배의 양인 500ml 첨가하여 80℃에서 6 시간 동안 환류 추출하였다. 그 후, 여과 장치를 이용하여 25㎛으로 여과하고, 60℃ 내지 70℃에서 감압 농축하면서 에탄올을 제거하였다. 에탄올이 제거된 후, 증류수를 총 건조 분말 대비 10배의 양인 500ml 첨가하고 1㎛로 여과하여 복합추출물을 제조하였다.

[비교예 1]

땅콩새싹을 50g 마쇄하여 건조 분말을 준비하였다. 70% 에탄올을 건조 분말 대비 10배의 양인 500ml 첨가하여 80℃에서 6 시간 동안 환류 추출하였다. 그 후, 여과 장치를 이용하여 25㎛으로 여과하고, 60℃ 내지 70℃에서 감압 농축하면서 에탄올을 제거하였다. 에탄올이 제거된 후, 증류수를 건조 분말 대비 10배의 양인 500ml 첨가하고 1㎛로 여과하여 땅콩새싹 추출물을 제조하였다.

[비교예 2]

땅콩새싹을 50g 마쇄하여 건조 분말을 준비하였다. 70% 에탄올을 건조 분말 대비 10배의 양인 500ml 첨가하여 80℃에서 6 시간 동안 환류 추출하였다. 그 후, 여과 장치를 이용하여 25㎛으로 여과하고, 60℃ 내지 70℃에서 감압 농축하면서 에탄올을 제거하였다. 에탄올이 제거된 후, dextrose를 2% 첨가하고, 15분 동안 121℃에서 고압 멸균한 배지에 락토바실러스 플란타륨(Lactobacillus plantarium)를 1% 접종하여 37℃에서 48시간 동안 배양하였다. 배양이 완료되면 균주를 불활성화 시키고 1㎛로 여과하여 땅콩새싹 발효추출물을 제조하였다.

[비교예 3]

병풀을 50g 마쇄하여 건조 분말을 준비하였다. 70% 에탄올을 총 건조 분말 대비 10배의 양인 500ml 첨가하여 80℃에서 6 시간 동안 환류 추출하였다. 그 후, 여과 장치를 이용하여 25㎛으로 여과하고, 60℃ 내지 70℃에서 감압 농축하면서 에탄올을 제거하였다. 에탄올이 제거된 후, 증류수를 총 건조 분말 대비 10배의 양인 500ml 첨가하고 1㎛로 여과하여 병풀 추출물을 제조하였다.

[실험예 1] HaCaT의 세포독성 실험

1) 인간피부표피세포의 배양

피부 표피세포(Human 유래)인 HaCaT 세포를 사용하였다. 배지는 10% Fetal Bovine Serum (FBS, Lonza, Valais, Switzerland) medium을 함유한 DMEM low (SH30021.01, HyCloneTM, Logan, UT, USA) 배지를 이용하였다. 세포주는 습도 95%, 5% CO₂, 37℃로 조절된 배양기에서 배양하였으며, 이때 미생물의 오염이나 증식을 억제하기 위해 배지용 항생제(Penicillin streptomycin, Gibco, CA, USA)를 사용하였다. 세포가 80% 정도 dish를 덮으면 phosphated-buffered saline-EDTA (PBS-EDTA)로 세척한 후 0.05% Trypsin EDTA를 1 ml 처리하여 dish 바닥에 부착되어 있는 세포를 떼어내 계대 배양하였다. 배지는 48시간 마다 교환하여 세포를 배양하였다.

2) HaCaT 세포(인간피부표피세포) 독성시험

세포주의 생존율을 측정은 MTS (CellTiter 96^® AQueous One Solution Cell Proliferation Assay, Promega, USA)시약을 이용하여 세포의 생존율을 측정하였다. 96 well plate에 세포를 1×10⁴ cells/well의 농도로 분주 후 습도 95%, 5% CO₂, 37℃로 조절된 배양기에서 24시간 안정화하였다. 이 후, 실시예 1 내지 2 및 비교예 1 내지 3을 농도별로 처리하여 습도 95%, 5% CO₂, 37℃로 조절된 배양기에서 24시간 배양하였다. 배지를 제거한 후 시약 1ml에 배지(DMEM low, free FBS) 9ml을 넣어 희석한 후 well 당 100㎕씩 처리하였다. 37℃에서 60분 간 반응 후 microplate reader(Molecular Devices, VersaMax ELISA Microplate Reader, USA)로 490nm에서 흡광도를 측정하였으며, 세포의 생존율은 시료를 처리하지 않은 대조군(control)에 대한 실시예 1 내지 2 및 비교예 1 내지 3의 흡광도를 백분율로 표 1 및 도 1에 나타내었다.

시료농도 (%)		HaCaT(human keratinocyte) 세포 독성 (%)
시료농도 (%)	실시예 1		실시예 2	비교예 1	비교예 2	비교예 3
Control	100.00 ± 6.25
0.1	97.36±3.82		129.33±0.80*	84.99±9.87	97.98±14.59	123.38±3.99*
0.2	112.12±2.83		130.13±13.93*	92.45±4.44	123.07±8.44*	119.78±2.78*
0.5	124.90±17.1		138.94±12.88*	92.99±10.83	121.56±18.77	140.86±6.92*
1	119.69±10.74		111.16±1.72*	91.38±14.20	124.94±19.54	106.69±5.86
*p<0.05 무처리 대조군과 비교

실험 결과, 실시예 1 내지 2 및 비교예 1 내지 3에서 모두 독성은 나타나지 않았다.

[실험예 2] DPPH 라디칼 소거능 측정

DPPH assay 방법은 Yoshida et al. (1989)이 사용한 방법에 따라 측정하였다. 96well plate에 대조구인 대조군(control)에 추출물의 용매(물)를 well에 12 ㎕ 넣고, 시료구인 실시예 1 및 비교예 1 내지 3을 시험군으로 웰(well)에 각각 12 ㎕씩 넣는다. 모든 well에 에탄올을 6 ㎕씩 넣고 222 ㎕의 DPPH(0.15 mM 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH)/ethanol) 용액을 가하여 혼합한다. 실온에서 30분 동안 반응시킨 후 517nm에서 흡광도를 측정하였다. 용매(물)만을 첨가한 대조구(control)에 대한 실시예 1 및 비교예 1 내지 3의 DPPH 라디칼 소거 활성을 백분율로 표 2 및 도 2에 나타내었다.

시료농도 (%)		DPPH Radical Scavenging Activity (%)
시료농도 (%)	실시예 1		비교예 1	비교예 2	비교예 3
Control	-
1	12.6 ± 2.6		2.9 ± 1.2	4.0 ± 2.0	9.4 ± 2.1
2	28.5 ± 0.8		6.0 ± 1.1	9.3 ± 2.6	15.0 ± 2.1
5	62.6 ± 1.4		13.4 ± 1.7	18.4 ± 2.0	48.1 ± 5.6
10	84.2 ± 1.8		24.2 ± 1.8	24.4 ± 2.8	72.1 ± 7.6

실험 결과, 비교예 1은 10% 농도에서 24.2%, 비교예 2는 24.4%로 발효 전과 후의 차이는 유의적이지 않았다. 양성대조군으로 사용한 비교예 3은 동일 농도에서 72.1%의 DPPH 라디칼 소거활성을 확인했으며 실시예 1은 10% 농도에서 84.2%로 가장 우수한 DPPH 라디칼 소거활성이 나타났다. 양성대조군으로 사용한 병풀은 동일 농도에서 72.1%의 DPPH 라디칼 소거활성을 확인했으며, 특히 실시예 1은 비교예 3보다 1.2 배 DPPH 라디칼 소거활성이 우수하였다.

[실험예 3] ABTS 라디칼 소거능 측정

ABTS radical 소거 활성은 Re et al. (1999)의 방법을 변형하여 측정하였다.

7mM ABTS 5ml와 140mM potassium persulfate 88㎕를 섞은 후 상온에서 16시간 빛을 차단하여 ABTS 양이온을 형성시켰다. 이 용액을 734nm에서 흡광도 값이 0.7이 되도록 PBS로 희석하였다. ABTS 용액 190㎕와 실시예 1 내지 2 및 비교예 1 내지 3 시료 10㎕를 혼합한 후 상온에서 6분간 반응시킨 후 734nm에서 흡광도를 측정하였다.

용매(물)만을 첨가한 대조구(control)에 대한 실시예 1 및 2, 비교예 1 내지 3의 ABTS 라디칼 소거능을 백분율로 표 3 및 도 3에 나타내었다.

시료농도 (%)		ABTS Radical Scavenging Activity (%)
시료농도 (%)	실시예 1		실시예 2	비교예 1	비교예 2	비교예 3
Control	-
1	59.6 ± 1.3		55.0 ± 1.9	19.4 ± 0.7	19.2 ± 0.8	26.2 ± 0.3
2	92.1 ± 1.0		94.0 ± 1.8	36.8 ± 1.2	29.0 ± 0.6	52.1 ± 2.6
5	99.6 ± 0.1		99.7 ± 0.2	66.9 ± 0.6	67.8 ± 0.9	100.4 ± 0.5
10	99.8 ± 0.1		99.9 ± 0.1	91.2 ± 2.6	91.0 ± 3.4	99.3 ± 0.5

실험 결과, 비교예 1은 1% 농도에서 19.4%, 비교예 2는 19.2%로 발효 전과 후의 차이는 유의적이지 않았다. 양성대조군으로 사용한 비교예 3은 동일 농도에서 26.2%의 ABTS 라디칼 소거활성을 확인했으며 실시예 1은 1% 농도에서 59.6%, 실시예 2는 동일 농도에서 55.0%의 ABTS 라디칼 소거활성을 나타내었다. 발효 전과 후의 차이는 있으나 미미한 수준이였다. 양성대조군으로 사용한 비교예 3은 동일 농도에서 26.2%의 ABTS 라디칼 소거활성을 확인했으며 실시예 1은 비교예 3보다 2.3배, 실시예 2는 비교예 3보다 2.1 배 ABTS 라디칼 소거활성이 우수하였다.

또한, 실시예 1, 3, 4 및 5에 대하여도 시료 10㎕과 ABTS 용액 190㎕을 혼합하여 상온에서 6분간 반응시킨 후 734nm에서 흡광도를 측정하였다.

용매(물)만을 첨가한 대조구(control)에 대한 실시예 1 및 실시예 3 내지 5의 ABTS 라디칼 소거능을 백분율로 표 4 및 도 4에 나타내었다.

시료농도 (%)	ABTS Radical Scavenging Activity (%)
시료농도 (%)	실시예 1	실시예 3	실시예 4	실시예 5
Control	-
1	59.6 ± 1.3	28.9 ± 0.9	26.1 ± 1.2	11.2 ± 0.5
2	92.1 ± 1.0	38.2 ± 1.6	38.4 ± 0.9	19.4 ± 0.2
5	99.6 ± 0.1	70.8 ± 1.2	66.9 ± 1.4	38.5 ± 4.0
10	99.8 ± 0.1	96.3 ± 1.3	92.8 ± 0.4	76.2 ± 2.2

실험 결과, 5종의 건조분말을 혼합한 복합추출물인 실시예 1은 1% 농도에서 59.6%의 ABTS 라디칼 소거활성을 확인했으며, 동일 농도에서 4종 복합추출물인 실시예 3은 28.9%로, 3종 복합추출물인 실시예 4는 26.1%, 2종 복합추출물인 실시예 5는 11.2%의 ABTS 라디칼 소거활성을 확인하였다.

[실험예 4] 대식세포(RAW264.7) 세포독성 실험

1) RAW 264.7(대식세포) 배양

실험에 사용한 세포주 RAW 264.7은 한국세포주은행(KCLB, Seoul, Korea)에서 분양받아 사용하였다. 배지는 10% Feral Bovine Serum(FBS)를 함유한 DMEM High glucose 성장배지를 사용하였다. 세포주는 습도 95%, 5% CO₂, 37℃로 조절된 배양기에서 배양하였으며, 이 때 미생물의 오염이나 증식을 억제하기 위해 배지용 항생제 Penicillin streptomycin, Gibco, CA, USA)를 사용하였다. 세포가 80% 정도 dish를 덮으면 phosphated-buffered saline(PBS)로 세척한 후 배지 1~2ml를 dish에 분주한 후 scrapper를 이용하여 dish 바닥에 부착되어 있는 세포를 긁어 세포를 떼어내 계대 배양하였으며, 배지는 48시간마다 교환하여 세포를 배양하였다.

2) 대식세포(RAW264.7)에서의 세포독성

세포주를 96 well plate에 1×10⁴ cells/well 농도로 분주 후 안정화를 위하여 습도 95%, 5% CO₂, 37℃ 배양기에서 24시간 배양하였다. 배지 제거 후 새로운 배지로 희석한 시료를 100㎕씩 처리하여 습도 95%, 5% CO₂, 37℃배양기에서 24시간 세포에 시료를 반응하였다.

세포주의 생존율 측정은 MTS(CellTiter 96^® AQueous One Solution Cell Proliferation Assay, Promega, USA)시약을 이용하여 세포의 생존율을 측정하였다. 즉, 시약 1ml에 배지(DMEM high glucose, free FBS) 9ml을 넣어 희석한 후 well 당 100㎕씩 처리하였다. 37℃에서 60분간 반응 후 microplate reader(Molecular Devices, VersaMax ELISA Microplate Reader, USA)로 490nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포의 생존율은 시료를 처리하지 않은 대조구(control)에 대한 실시예 1 내지 2 및 비교예 1 내지 3의 시료 처리군의 흡광도를 백분율로 표시하여 표 5 및 도 5에 나타내었다.

시료농도 (%)		RAW 264.7 세포 독성 (%)
시료농도 (%)	실시예 1		실시예 2	비교예 1	비교예 2	비교예 3
Control	100.00 ± 2.31
0.01	118.51 ± 1.92*		100.15 ± 4.45	108.23 ± 5.58*	99.47 ± 4.41	94.48 ± 2.24*
0.1	117.88 ± 3.79*		107.26 ± 9.22	108.26 ± 5.06*	97.82 ± 4.08	98.15 ± 2.12
0.5	120.46 ± 4.52*		114.08 ± 8.98*	108.92 ± 6.11*	103.03 ± 3.82	98.05 ± 2.21
1	123.08 ± 2.73*		110.89 ± 5.02*	107.69 ± 1.44*	102.01 ± 2.91	100.22 ± 3.95
*p<0.05 무처리 대조군과 비교

실험 결과, 실시예 1 내지 2 및 비교예 1 내지 3에서 모두 독성은 나타나지 않았으며, 특히, 실시예 1, 2 및 비교예 1은 세포 증식 활성을 확인하였다.

[실험예 5] 대식세포(RAW264.7) NO(Nitric Oxide) 저해 활성

항염증 효능의 측정은 대식세포주에 LPS를 처리하여 LPS만을 처리한 군의 NO 생성량에 대한 LPS 와 함께 시료를 처리한 군의 NO 생성량을 측정하여 시료가 NO 생성 저해 효능을 가지는지를 측정하였다.

RAW 264.7 세포주를 96 well에 분주한 후 세포가 바닥의 약80% 이상 자랄 때까지 배양하였다. 염증을 유발하기 위하여 lipopolysaccharide (LPS, Sigma-Aldrich, MO, USA)를 1㎍/㎖의 농도로 처리하였다. 시료의 항염증 효능을 확인하기 위해 LPS 와 함께 시료를 알맞은 농도로 배지에 녹여 24시간 동안 배양하였다.

NO 생성량은 Griess 시약을 사용하여 측정하였다. Griess 시약은 2.5%의 phosphate 용액에 1% sulfanilamide와 0.1% naphthylethylene- diamine-di-hydrochloride를 혼합하여 만들었다. 위에 배양한 세포의 상등액 50㎕를 96 well plate에 취하고 여기에 Griess 시약 50㎕를 가해 15분 동안 실온에서 반응시킨 후 microplate reader (Molecular Devices, VersaMax ELISA Microplate Reader, USA)를 이용하여 540㎚에서 실시예 1 내지 2 및 비교예 1 내지 3의 흡광도를 측정하고, 그 결과를 표 6 및 도 6에 나타내었다.

NO 함량은 NaNO₂를 이용하여 검량곡선을 작성한 후 대입하여 계산하였다.

시료명	시료 농도(%)	1 ㎍/㎖ LPS	NO Production 평균(μM)	NO Production 평균(%)
Control	-	-	1.26 ± 0.15*	9.90 ± 1.21*1)
Control	-	+	12.70 ± 0.17	100.00 ± 1.35
실시예 1	0.01	+	9.13 ± 0.19*	71.92 ± 1.47*
	0.1	+	6.87 ± 0.28*	54.07 ± 2.23*
	0.5	+	1.50 ± 0.04*	11.79 ± 0.32*
	1	+	1.63 ± 0.10*	12.81 ± 0.82*
실시예 2	0.01	+	9.36 ± 0.46*	73.71 ± 3.59*
	0.1	+	8.19 ± 0.56*	64.53 ± 4.45*
	0.5	+	1.87 ± 0.20*	14.71 ± 1.54*
	1	+	2.35 ± 0.27*	18.54 ± 2.10*
비교예 1	0.01	+	11.42 ± 0.05*	89.91 ± 0.39*
	0.1	+	10.38 ± 0.48*	81.71 ± 3.81*
	0.5	+	8.61 ± 0.24*	67.79 ± 1.87*
	1	+	9.00 ± 0.30*	70.90 ± 2.39*
비교예 2	0.01	+	12.12 ± 0.25*	95.43 ± 1.93*
	0.1	+	10.22 ± 0.11*	80.46 ± 0.88*
	0.5	+	7.38 ± 0.03*	58.13 ± 0.26*
	1	+	8.12 ± 0.16*	63.96 ± 1.24*
비교예 3	0.01	+	12.33 ± 0.36	97.12 ± 2.81
	0.1	+	10.41 ± 0.32*	82.01 ± 2.49*
	0.5	+	3.94 ± 0.24*	31.03 ± 1.90*
	1	+	3.02 ± 0.43*	23.82 ± 3.42*
1) %, Mean±SD. (standard deviation). *p<0.05 LPS 처리control 군과 비교.

실험 결과, 비교예 1 및 비교예 2는 농도가 증가함에 따라 Nitric Oxide (NO)함량이 감소하였다. 특히 1% 농도에서 비교예 1은 70.90%, 비교예 2는 63.96%의 NO 생성을 보여 각각 29.10%, 36.04%의 저해활성을 보였으며, 발효보다 단순 추출이 1% 농도에서 NO 저해활성이 약 1.2배 우수함을 확인하였다. 양성대조군 비교예 3은 동일 농도(1%)에서 76.18%의 NO 저해 활성이 나타났다. 따라서, 비교예 1 및 비교예 2는 비교예 3보다 NO 저해 활성이 다소 낮음을 확인하였다.

실시예 1 및 실시예 2는 농도가 증가함에 따라 NO 함량이 감소하였다. 특히, 1% 농도에서 실시예 1은 12.81%, 실시예 2는 18.54%의 NO 생성을 보여 각각 87.19%, 81.46%의 저해활성을 보여 상기 비교예 1 및 비교예 2보다 우수한 NO 저해활성을 보였으며 단순 혼합보다는 혼합 발효가 1% 농도에서 NO 저해활성이 약 1.1배 우수함을 확인하였다.

[실험예 6] 대식세포(RAW264.7) PGE₂ 저해 활성

PGE₂의 측정은 Prostaglandin E₂ EIA Kit를 Cayman Chemical Company(Ann Arbor, Michigan, USA)에서 구매하여 사용하였으며, 측정 방법은 제조회사의 분석방법에 따라 정량하였다. 즉, RAW 264.7 세포에 농도별 시료 및 LPS(1㎍/㎖)를 24시간 전 처리 후 세포 배양 상층액을 PGE₂ 측정에 사용하였다. 배양액을 goat anti-mouse로 코팅된 96 well plate에 각각 배양액을 50㎕씩 loading 하였다. 이 후, primary antibody solution 50㎕와 PGE₂ conjugate를 50㎕씩 첨가하여 4℃에서 18시간 동안 반응시킨 후, Washing buffer로 5회 세척 한 후 Ellman's reagent을 200㎕씩 처리하여 60 내지 90분간 교반하면서 반응시킨 후, 405-420nm에서 실시예 1 내지 2 및 비교예 1 내지 3의 흡광도를 측정하고, 그 결과를 표 7 및 도 7에 나타내었다.

시료명	시료 농도(%)	1 ㎍/㎖ LPS	Prostaglandin E₂ (㎍/100 g of protein)	Prostaglandin E₂(%)
Control	-	-	3.86 ± 0.18*	6.73 ± 0.31*1)
Control	-	+	57.39 ± 1.13	100.00 ± 1.96
실시예 1	0.01	+	13.56 ± 2.29*	23.62 ± 3.98*
	0.1	+	13.88 ± 2.83*	24.19 ± 4.93*
	0.5	+	2.96 ± 0.72*	5.16 ± 1.25*
	1	+	1.46 ± 0.24*	2.54 ± 0.42*
실시예 2	0.01	+	21.43 ± 1.00*	37.34 ± 1.75*
	0.1	+	11.85 ± 0.61*	20.64 ± 1.06*
	0.5	+	1.58 ± 0.18*	2.76 ± 0.32*
	1	+	1.20 ± 0.16*	2.09 ± 0.28*
비교예 1	0.01	+	59.44 ± 2.42	103.57 ± 4.21
	0.1	+	39.53 ± 0.99*	68.87 ± 1.73*
	0.5	+	34.34 ± 1.28*	59.83 ± 2.24*
	1	+	28.56 ± 2.62*	49.77 ± 4.57*
비교예 2	0.01	+	56.89 ± 1.68	99.12 ± 2.92
	0.1	+	40.38 ± 2.39*	70.35 ± 4.16*
	0.5	+	27.20 ± 2.05*	47.38 ± 3.57*
	1	+	16.59 ± 2.49*	28.91 ± 4.35*
비교예 3	0.01	+	57.33 ± 2.80	99.89 ± 4.88
	0.1	+	51.82 ± 1.56*	90.29 ± 2.72*
	0.5	+	22.84 ± 2.71*	39.79 ± 4.71*
	1	+	11.19 ± 0.83*	19.50 ± 1.45*
1) %, Mean±SD. (standard deviation). *p<0.05 LPS 처리control 군과 비교.

실험결과, 비교예 1 및 비교예 2는 농도가 증가함에 Prostaglandin E₂(PGE₂) 함량이 감소하였다. 특히 1% 농도에서 비교예 1은 49.77%, 비교예 2는 28.91%의 PGE₂ 생성을 보여 각각 50.23%, 71.09%의 PGE₂ 저해활성을 보였으며 단순추출이 발효보다 1% 농도에서 PGE₂ 저해활성이 약 1.4배 우수함을 확인하였다. 양성대조군 비교에 3은 동일 농도(1%)에서 80.50%의 PGE₂ 저해활성을 보였다. 따라서 비교예 1 및 비교예 2는 비교예 3보다 PGE₂ 저해활성이 다소 낮음을 확인하였다.

실시예 1 및 실시예 2는 농도가 증가함에 따라 PGE₂ 함량이 감소하였다. 특히 1% 농도에서 실시예 1은 5.16%, 실시예 2는 2.09%의 PGE₂ 생성을 보여 각각 94.84%, 97.91%의 저해 활성을 보여 비교예 1 및 비교예 2보다 우수한 PGE₂ 저해 활성을 보였다. 양성대조군 비교예 3은 동일 농도(1%)에서 80.50%의 PGE₂ 저해활성을 보였다. 따라서 실시예 1 및 실시예 2는 비교예 3보다 PGE₂ 저해활성이 우수함을 확인하였다.

하기 본 출원에 따른 화장료 조성물의 제형예를 설명하나, 하기 예시 이외에도 여러 가지 제형으로 응용 가능하며, 이는 본 출원을 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

[제형예 1] 유연 화장수(스킨 로션)

하기 표 8에 기재된 조성에 따라 통상적인 방법으로 유연 화장수를 제조하였다.

성분	함량(중량%)
실시예 1 내지 5의 추출물	1
글리세린	3.5
올레일알코올	1.5
에탄올	5.5
폴리솔베이트 80	3.2
카르복실비닐폴리머	1.0
부틸렌 글리콜	2.0
프로필렌 글리콜	2.0
방부제, 향료	적량
정제수	잔량
계	100

[제형예 2] 영양 화장수(밀크 로션)

하기 표 9에 기재된 조성에 따라 통상적인 방법으로 영양 화장수를 제조하였다.

성분	함량(중량%)
실시예 1 내지 5의 추출물	1
글리세린	3.0
부틸렌글리콜	3.0
프로필렌글리콜	3.0
카르복시비닐폴리머	0.1
밀납	4.0
폴리솔베이트 60	1.5
카프릴릭/카프릭 리글리세라이드	5.0
스쿠알란	5.0
솔비타세스퀴올레이트	1.5
세테아릴 알코올	1.0
트리에탄올아민	0.2
방부제, 향료	적량
정제수	잔량
계	100

[제형예 3] 영양 크림

하기 표 10에 기재된 조성에 따라 통상적인 방법으로 영양 크림을 제조하였다.

성분	함량(중량%)
실시예 1 내지 5의 추출물	2
글리세린	3.5
부틸렌글리콜	3.0
유동파라핀	7.0
베타글루칸	7.0
카보머	0.1
카프릴릭/카프릭 리글리세라이드	3.0
스쿠알란	5.0
세테아릴 글루코사이드	1.5
소르비탄 스테아레이트	0.4
폴리솔베이트 60	1.2
트리에탄올아민	0.1
방부제, 향료	적량
정제수	잔량
계	100

이상, 본 출원을 실시예 및 실험예를 들어 상세하게 설명하였으나, 본 출원은 상기 실시예 및 실험예에 의해 한정되지 않고, 본 출원의 기술적 사상 및 범위 내에서 당 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의하여 여러 가지 변형 및 변경이 가능하다.

이상으로 본 출원의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 출원의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 출원의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

땅콩새싹(Peanut sprout), 병풀(Centella asiatica), 및 고삼(Sophora flavescens)을 포함하는 건조 분말을 혼합하여 추출한 복합추출물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
청구항 1에 있어서,
상기 건조 분말은,
감초(Glycyrrhiza uralensis) 및 황금(Scutellaria baicalensis)으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
땅콩새싹(Peanut sprout), 병풀(Centella asiatica), 및 고삼(Sophora flavescens)을 포함하는 건조 분말을 혼합하여 추출 후 발효시킨 복합 발효추출물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
청구항 3에 있어서,
상기 건조 분말은,
감초(Glycyrrhiza uralensis) 및 황금(Scutellaria baicalensis)으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
청구항 1 또는 청구항 3에 있어서,
상기 추출물은,
에탄올, 메탄올, 부탄올, 헥산, 에틸 아세테이트, 부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 디프로필렌글리콜 및 메틸렌클로라이드로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 유기 용매를 이용하여 추출한 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
청구항 2 또는 청구항 4에 있어서,
상기 건조 분말은,
땅콩새싹; 병풀; 황금; 고삼; 및 감초;를 포함하고,
상기 건조 분말 총 중량을 기준으로
땅콩새싹 10 내지 30중량%;
병풀 10 내지 30중량%;
황금 10 내지 30중량%;
고삼 10 내지 30중량%; 및
감초 10 내지 30중량%;를 포함하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
청구항 2 또는 청구항 4에 있어서,
상기 병풀, 황금, 고삼 또는 감초는,
잎, 줄기, 뿌리, 꽃, 종자, 새싹, 수액 및 내수피로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
청구항 3에 있어서,
상기 복합 발효추출물은,
유산균종균을 0.5중량% 내지 3중량% 접종하여 얻어진 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
청구항 8에 있어서,
상기 유산균종균은 락토바실러스 속(Lactobacillus sp.)이고,
락토바실러스 아시도필러스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus Brebis CD2), 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei), 락토바실러스 힐가르디(Lactobacillus hilgardii), 락토바실러스 말리(Lactobacillus mali), 락토바실러스 나겔리(Lactobacillus nagelii), 락토바실러스 플란타륨(Lactobacillus plantarium), 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri), 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus Rhamnosus), 락토바실러스 삿수멘시스(Lactobacillus satsumensis) 및 락토바실러스 서머필러스(Lactobacillus Thermophilus)로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
청구항 1 또는 청구항 3에 있어서,
상기 화장료 조성물은 대식세포의 NO 저해 활성을 가지는 항염증용인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
청구항 1 또는 청구항 3에 있어서,
상기 화장료 조성물은 대식세포의 프로스타글란딘(Prostaglandin E₂, PGE₂) 저해 활성을 가지는 항염증용인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
청구항 1 또는 청구항 3에 있어서,
상기 화장료 조성물은 DPPH 라디칼 소거능 또는 ABTS 라디칼 소거능을 가지고 세포의 산화를 억제하는 항산화용인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
청구항 1의 제조방법으로서,
상기 건조 분말의 혼합물을 유기용매를 이용하여 환류 추출법, 열수 추출법 및 초음파 추출법 중 어느 하나의 방법으로 추출하는 단계; 및
여과 후 용매를 제거하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물의 제조방법.
청구항 3의 제조방법으로서,
상기 건조 분말의 혼합물을 유기용매를 이용하여 환류 추출법, 열수 추출법 및 초음파 추출법 중 어느 하나의 방법으로 추출하는 단계;
여과 후 용매를 제거하는 단계;
배지를 첨가하고 멸균하는 단계;
락토바실러스 아시도필러스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus Brebis CD2), 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei), 락토바실러스 힐가르디(Lactobacillus hilgardii), 락토바실러스 말리(Lactobacillus mali), 락토바실러스 나겔리(Lactobacillus nagelii), 락토바실러스 플란타륨(Lactobacillus plantarium), 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri), 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus Rhamnosus), 락토바실러스 삿수멘시스(Lactobacillus satsumensis) 및 락토바실러스 서머필러스(Lactobacillus Thermophilus)로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상을 접종하는 단계;
35℃ 내지 40℃에서 40시간 내지 50시간 동안 배양하는 단계; 및
균주를 불활성화하고 여과하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물의 제조방법.