KR20220154384A - 반감기가 증가된 단백질 나노케이지 및 이를 이용한 약물전달체 - Google Patents

Abstract

본 발명은 페리틴; 상기 페리틴의 말단과 연결하는 링커; 및 상기 링커에 의하여 페리틴과 연결되어 있는 FcRn 결합 도메인(FBD);을 포함하는 융합단백질 나노케이지에 관한 것이다. 본 발명에 따른 순환 시간이 긴 페리틴 나노케이지는 진단, 약물 및 백신 전달 등에 새로운 플랫폼으로 널리 활용될 수 있고, 생체 적합성 혈청 반감기 연장방법으로 사용됨으로써 신규 나노케이지 및 그를 포함하는 약물전달체의 생산효과를 구현할 수 있다.

Description

반감기가 증가된 단백질 나노케이지 및 이를 이용한 약물전달체{Protein nanocage with increased half-life and drug delivery system using the same}

본 발명은 반감기가 증가된 단백질 나노케이지 및 이를 이용한 약물전달체에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 인체 내에 반감기를 연장할 수 있는 FcRn 결합 도메인을 단백질 나노케이지 외부에 발현함으로써 페리틴이 FcRn과 결합할 수 있도록 하여 얻어진 반감기가 증가된 단백질 나노케이지 및 이를 이용한 약물전달체에 관한 것이다.

단백질 기반의 나노케이지(nanocage)가 나노의약(nanomedicine) 분야에서 개발되고 있는데 이는 구조적 안정성, 높은 생체 친화성, 낮은 독성 프로파일 및 정밀한 변형을 통한 기능성 부분의 결합을 위한 다기능성 등 훌륭하고 유리한 특징이 많기 때문이다. 현재까지 유전학 및 화학적 전략을 통한 변형은 약물 캡슐화, 표적 조직으로의 전달 및 단백질-기반 나노케이지가 단순히 담체의 역할뿐만 아니라 약리학적으로 활성인 작용제 자체에 기여할 수 있는 인자로 바람직한 분비 동력학(release kinetics)을 최적화시키는 것을 입증하였다. 상기 물질 종류는 대표적으로 페리틴 나노케이지를 말하고 상기 자연-파생된 물질은 약물과 백신전달, 진단, 생광물화(biomineralization) 스캐폴드 및 그 이상의 적용을 위한 유일한 플랫폼임을 증명하였다. 또한, 단백질 기반의 나노케이지의 특징에 더하여, 페리틴 나노케이지는 Escherichiacoli에서 수용성 재조합 단백질로서 높은 생산 수준을 나타내고, 10 nm 스케일에서 균일한 크기 및 형상 분포를 가지며, 나노 케이지 (nanocage) 코어에 약물을 캡슐화하기 위한 pH 의존적인 방식의 가역적 분해/조립이 가능하다.

현재까지 많은 연구가 염료, 펩타이드, 단백질 및 항체 단편을 유전적으로 화학적으로 결합시키고 자기 공명 영상(MRI), 양전자 방출 단층 촬영(PET), 광학 이미징, 약물 전달체 및 약리학적 활성제를 위한 다수의 금속과 약물을 캡슐화하기 위해 상기와 같은 특징을 이용하였다.

그러나 나노약물 분야에서 많은 유망한 특징과 적용에도 불구하고 페리틴 나노케이지는 모든 단백질-기반의 치료제의 빠른 분해(rapid degradation)와 짧은 반감기(ashort half-life)라는 문제점을 가지고 있다. 일반적으로 페리틴은 동물 모델을 이용한 연구결과 정맥 내 주입 후 혈장으로부터 신속하게 제거되는 것으로 알려져 있다. 이는 여러 세포 유형에 존재하는 페리틴 수용체 뿐만 아니라 간에서의 높은 수준의 축적과 신장에 의한 빠른 제거가 순환에 있어 페리틴 나노케이지의 체류 시간을 감소시킨다.

단백질 나노 케이지는 생체 적합성 및 구조적 특성으로 인해 생체 의학 분야에 적용할 수 있는 강력한 도구이다. 특히, 단백질 기반 나노케이지의 임상 개발에 있어 중요한 과제 및 한계는 생체 내 안정성과 흡수, 분포, 대사 및 배설(ADME)에 관한 문제이다. 따라서, 최근 연구들은 페리틴 나노케이지의 짧은 반감기를 극복하는 방법을 연구하였고 예컨대, 반감기 연장을 위해 잘 알려진 방법인 PEGylation을 종양 표적화를 위한 페리틴에 적용하였다. 그러나 여러 유익한 특성에도 불구하고, PEGylation은 다음의 몇 가지 문제점을 가지고 있다: (i) 단백질 표면에 접합을 위해 추가적인 화학 반응이 필요하다. (ii) 균질한 제품을 생산하기가 어려워 수율이 낮아지고 제조원가가 높아진다. (iii) 단백질의 생물학적 기능은 무작위 PEG화 동안 감소될 수 있다. 이러한 이유로 최근에 PASylated 페리틴 나노케이지를 만들기 위해 PAS(프롤린, 알라닌, 세린) 폴리펩티드의 사용이 보고되었고 독소루비신을 캡슐화하여 순환계에서 독소루비신의 더 긴 체류 시간을 나타내었지만 나노케이지의 약물 동력학에 관한 정확한 분석은 포함되지 않았다.

대한민국 공개특허 10-2018-0008349

상기와 같은 문제를 해결하기 위하여, 본 발명은 FcRn 결합 도메인(FBD)을 이용하여 FcRn 매개 반감기를 연장하는 융합단백질 나노케이지를 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 나노케이지 및 전달 대상 약물을 포함하는 약물 전달체를 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은,

페리틴;

상기 페리틴의 말단과 연결하는 링커; 및

상기 링커에 의하여 페리틴과 연결되어 있는 FcRn 결합 도메인(FBD);을 포함하는 것을 특징으로 하는 융합단백질 나노케이지를 제공한다.

상기 페리틴은 인간 유래의 페리틴 중쇄 단백질인 것이 바람직하다.

상기 FcRn 결합 도메인(FBD)은 서열번호 3, 서열번호 5 내지 9 중에서 선택된 어느 하나의 아미노산 서열로 구성되는 것이 바람직하다.

상기 나노케이지는 서열번호 10 내지 16 중에서 선택된 어느 하나의 단백질로 구성되는 것이 바람직하다.

또한 상기 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은,

상기 나노케이지 및 전달 대상 약물을 포함하는 약물 전달체를 제공한다.

본 발명에 따른 순환 시간이 긴 페리틴 나노케이지는 진단, 약물 및 백신 전달 등에 새로운 플랫폼으로 널리 활용될 수 있고, 생체 적합성 혈청 반감기 연장방법으로 사용됨으로써 신규 나노케이지 및 그를 포함하는 약물전달체의 생산효과를 구현할 수 있다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 인간 Fc 도메인와 인간 FcRn 결합 잔기를 도시한 것이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 융합 단백질의 발현 및 자기조립 메카니즘을 도시한 것이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따라 FFPN 융합 단백질의 형태를 관찰하기 위해 각 FFPN을 negative staining TEM으로 분석한 결과를 도시한 것이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따라 동적 광 산란(DLS) 분석에 의하여 각 FFPN의 단분산성을 도시한 것이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 각 페리틴 FBD 융합 단백질의 CD 스펙트럼을 도시한 것이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따라 A280으로 측정한 1개월 동안 FFPN의 단백질 농도변화를 도시한 것이다.

이하 본 발명에 대하여 보다 상세히 설명한다.

본 발명은 페리틴; 상기 페리틴의 말단과 연결하는 링커; 및 상기 링커에 의하여 페리틴과 연결되어 있는 FcRn 결합 도메인(FBD);을 포함하는 것을 특징으로 하는 융합단백질 나노케이지를 제공한다.

본 발명의 명세서에서 사용되는 용어 "페리틴(ferritin) "은 동물체 내의 철의 저장 단백질로 간장, 비장, 골수 등에 분포하고 있고 분자량 504 kDa의 아포페리틴이란 단백질이 1 분자당 2,000개의 3가의 철과 결합한 철 단백질이며 페리틴은 생체 내에서는 철의 흡수 및 저장에 관여하고 있다.

본 발명의 명세서에서 사용되는 용어 "페리틴 중쇄 단백질(ferritin heavy chain protein)"은 원핵생물 및 진핵생물에서 주요 세포내 철 저장 단백질인 페리틴의 중쇄 소단위를 구성하는 단백질을 의미하고, 페리틴 단백질은 페리틴 중쇄 및 경쇄 각각 24 소단위체로 구성된다. 페리틴 단백질의 주요 기능은 철을 수용성의 비독성 상태로 저장하는 것이다. 페리틴 중쇄 단백질은 경쇄 단백질 없이도 24개의 소단위가 자기조립하여 내부가 빈 나노입자를 형성하는 것으로 알려진 바 있다.

페리틴 중쇄 단백질은 자기조립 나노입자의 빈 내부 공간에 다른 약물을 적재함으로써 나노케이지(nanocage)의 역할을 수행할 수 있고, 이런 특성으로 인해 약물전달체 용도로 사용될 수 있다.

그동안 무기 나노입자(inorganic nanoparticle), 마이셀(micelles), 및 양이온성 리포솜(cationic liposomes) 등 합성 운반체(Synthetic carriers)는 전달효율이 낮고 독성이 강하다는 한계가 있었다. 자연유래 나노 운반체는 최소한의 독성, 생체적합성, 수용성 등 장점 때문에 합성 운반체의 대안으로 각광받고 있다. 페리핀, virus-like particles (VLPs), eukaryotic vaults 및 기타 많은 단백질 나노케이지는 자연에서 유래한 나노캐리어(nanocarrier)들의 대표적인 표본이다. 단백질 나노케이지는 단백질 하위단위(나노입자)의 자가조립에 의해 케이지와 같은 구조를 형성할 수 있으며, 균질한 크기를 유지할 수 있다. 그들의 단일 서브유닛은 유전적 또는 화학적 변경(modification)을 통해 조절할 수 있다.

천연 스캐 폴드로 분류되는 페리틴 나노 케이지는 항상성을 유지하기 위해 다양한 생물학적 시스템에서 철의 저장과 방출을 조절하는 단백질이다. 페리틴 나노 케이지는 24 개의 페리틴 모노머로 구성되어 있다. 페리틴 서브 유닛은 직경이 8nm이고, 외부 직경이 12nm인 내부 공간을 포함하는 속이 빈 구형 쉘로 자가조립될 수 있다. 이 구조는 진단 및 치료 분자를 로딩하기 위한 내부 부분 또는 페리틴 DNA의 N- 말단 또는 C- 말단에서 다른 기능성 DNA와의 유전적 변형을 통해 표적 능력과 생체 적합성을 향상시키기 위한 외부 부분을 설계할 수 있다. 페리틴은 큰 구조적 손상없이 광범위한 pH 수준과 고온을 견딜 수 있다는 특징이 있다.

본 발명에 따른 융합단백질 나노케이지(FFPN)에 이용된 FcRn 결합 도메인(FBD)은 인간 유래 단백질(IgG), 애피바디(Affibody) 단백질, 또는 알부민(Albumin)인 것이 바람직하다.

인간 유래 단백질(IgG)는 pH 의존적 방식으로 FcRn에 결합한다. IgG는 pH 5.5 ~ 6 정도의 엔도 솜(endosome)의 산성 환경에서 FcRn과 결합한다. pH 7.4 정도의 염기성 또는 생리적 pH에서 결합을 해리한다. 거의 모든 세포 유형에서 FcRn은 엔도솜과 같은 세포 내 소포에 존재하며, 세포 표면에서 제한적으로 발현된다. FcRn의 발현 부위와 pH 의존적 결합 특성으로 인해 IgG는 비특이적 endocytosis을 통해 세포로 유입될 수 있다. endocytosed IgG는 엔도솜 경로를 따라 이동하는 동안 엔도솜의 산성 환경 (pH 6)에서 FcRn과 마주칠 수 있다. 이 미세 환경에서 IgG와 FcRn은 유리한 상호 작용을 보이고, FcRn-IgG 복합체는 리소좀 분해 경로를 회피한다. 세포 외 중성 pH로 인해 원형질막으로 돌아 가면 FcRn-IgG 복합체가 해리되고 IgG가 세포 외 공간으로 되돌아가게 된다(즉, 혈장), 따라서 IgG의 혈청 순환 시간을 연장할 수 있다.

애피바디(affibody)는 인공항체의 일종으로 황색포도구균(Staphylococcus aureus)의 단백질 A(SPA) 중 Z 도메인으로 불리우며, pH 의존적 방식으로 FcRn에 결합할 수 있도록 엔지니어링될 수 있다. IgG 결합 영역인 58 아미노산 잔기를 사용한다. 애피바디는 알파 나선으로 구성되어 있으며, 이황화결합이 결여되어 있다. 애피바디는 모단백질 도메인의 결합능력에 관련되어 있는 두 개의 알파-나선에 위치한 13개의 아미노산을 무작위로 변이시킴으로써 다양한 항원에 대한 특이적 결합능력을 갖게 되는 것으로 알려지고 있다. FcRn과 직접 상호 작용할 수 있는 애피바디(affibody) 분자(ZFcRn)를 생성하고, 융합 파트너로서 생체 내에서 혈장 반감기를 연장하는 각 단백질의 능력을 보면, 애피바디는 작은 친화성 단백질(small affinity proteins)로 분류될 수 있다. 그들의 작은 크기와 독립적인 접힘은 그들의 융합 파트너의 고유한 특성을 방해하지 않는다. 그들은 E. coli 발현 시스템에서 효율적으로 재조합적으로 생산될 수 있다. 이들의 단백질 분해에 대한 안정성과 높은 열 안정성은 생체 내 구조화되지 않은 펩타이드에 비해 이점으로 작용할 수 있다. 향후 실시예에서는 향상된 FcRn 친화력에 대한 결합력을 갖도록 두 개의 Z 도메인을 연결하여 FBD에 대한 Z 도메인의 homodimer를 제조한 것을 설명한다.

알부민(SA)도 pH 의존적 방식으로 FcRn에 결합한다. FcRn 매개 재활용 경로로 인해 혈액에서 매우 긴 순환 시간(~ 19일)을 나타내며 상대적으로 분자 크기가 크다. 알부민의 경우 HSA(Human serum albumin), BSA, ovalbumin 등 여러 동식물에 존재하는 알부민이 다양한 종류가 있으나, 바람직하게는 의약품으로 사용하는 human serum albumin(HSA)를 사용할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 따라 약물-알부민 접합, 알부민 융합, 알부민 결합 도메인 (ABD) 등을 사용한 알부민 처리 등의 FcRn을 매개하여 반감기를 연장할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따른 융합단백질 나노케이지(FFPN)는, 먼저 자기조립 단백질(예: 페리틴) 서브 유닛의 C- 말단 또는 N-말단에 FBD 서열을 삽입하여 두 개의 FBD homodimers를 형성함으로써 FBD 테트라머를 형성하도록 인간 페리틴 중쇄를 유전적으로 형성한다. 하나의 Fc homodimers는 두 개의 FcRn 분자에 결합할 수 있다. FBD 클러스터는 FBD 단량체와 비교하여 증가된 결합력을 포함할 수 있으며, 이는 FcRn 결합 친화도가 증가된 융합단백질을 형성한다.

자기조립 단백질(페리틴)과 FBD 도메인을 연결하기 위하여 링커가 사용될 수 있다. 본 발명에서 자기조립 단백질의 C- 또는 N- 말단과 연결되는 링커는 이에 한정되는 것은 아니지만 GG, GGGGSGGGGSGGGGSLE 등일 수 있다.

본 발명에서 링커는 긴 링커(-L-)와 짧은 링커(-S-), 유연한 링커와 딱딱한 링커가 있다. 긴 링커를 사용하면 페리틴과 FBD 사이의 거리가 유지되고 응집이 줄어들 수 있다. 한편 짧은 링커를 사용하면 입체 장애를 유발하여 FcRn 상호 작용을 방해할 가능성이 있다. 링커의 길이에 따른 실험 조건은 FcRn 상호 작용의 구조적 안정성 및 입체 장애를 고려하여 발현 수준 및 단백질 수율 분석을 위해 다양하게 변경할 수 있다.

형성된 FFPN 융합 단백질의 형태는 구형이며, 페리틴의 속이 빈 케이지 모양의 구조를 나타낼 수 있다. FcRn과 결합이 가능한 도메인인 FBD는 FFPN 나노케이지의 외부 표면에 발현될 수 있다.

FFPN에서도 힌지 영역이 없는 것(예: hxFc, hxCH₂)과 힌지 영역이 있는 것(예: wtFc, hCH₂)으로 구분될 수 있다. 힌지 영역이 있는 FFPN이 약간 더 높은 용해도를 나타내고 힌지 영역의 이황화 결합에 영향을 미칠 수 있는 것으로 보인다. FFPN이 힌지 영역을 소유하면 이황화 결합이 FFPN을 응집하여 용해도 수준을 낮출 수 있다.

본 발명의 FFPN 융합 단백질은 추가적으로 자기조립되어 나노케이지(nanocage)를 형성할 수 있다. 본 발명의 명세서에서 사용되는 용어 "나노케이지(nanocage)"는 중공의 나노입자(hollow nanoparticle)를 의미하는 것로서, 여기에는 무기 나노케이지와 유기 나노케이지가 포함될 수 있고, 무기 나노케이지는 은 나노입자를 끓는 물에서 염화금산(HAuCl₄)과 반응시킴으로써 생성되는 속이 빈 다공성의 골드 나노입자이고, 유기 나노입자에는 페리틴 자기집합 나노케이지와 같은 단백질 나노케이지가 포함될 수 있다.

FcRn은 IgG의 Fc 부분에 결합한다. IgG Fc 영역과 FcRn 사이에 상호작용은 pH-의존성이다. 유체 상 세포내 이입(fluid phase endocytosis)에 의해 세포 내로 진입한 이후에, IgG는 엔도솜 내로 격리되고 산성 pH(6~65)에서 높은 친화성으로 FcRn에 결합한다. IgG-FcRn 복합체가 혈장 막으로 순환할 때, IgG는 약한 염기성 pH (~74)에서 혈류 (bloodstream) 내에서 FcRn으로부터 급속하게 해리한다. 이러한 수용체-매개된 재순환 메커니즘(recycling mechanism)에 의해, FcRn은 리소좀 내에서 분해로부터 IgG를 효과적으로 보호하고, 따라서 순환 IgG의 반감기를 연장시킨다.

전달 대상 약물은 치료 대상 질환에 따라 결정되며, 예컨대, 항암치료를 위해서 항암제가 사용될 수 있고, 염증성 질환의 치료에는 스테로이드, COX2 저해제나 TNF-α 저해제와 같은 항염증제가 사용될 수 있으며, 당뇨병의 치료를 위해서는 DPP-4 저해제, 인슐린, GLP-1과 같은 혈당강하제가 사용될 수 있다. 고혈압 치료를 위해서 혈관확장제가 사용될 수 있으며, 암이나 감염성 질환의 치료를 위해 면역촉진제, 자가면역질환의 치료나 장 기이식자의 치료를 위해 면역억제제가 사용될 수 있고, 파킨슨병의 치료를 위해 L-DOPA 또는 도파민 작용제, MAO-B 저해제가 사용될 수 있다. 알츠하이머 환자의 인지능 개선을 위해 콜린에스터레이즈 저해제가 사용될 수 있고, 혈우병 환자의 치료를 위해 혈액응고인자가 사용될 수 있으며, 각종 신경질환의 치료를 위해 T-타입 칼슘채널 차단제 또는 N-타입 칼슘채널 차단제와 같은 채널 차단제가 사용될 수 있다.

본 발명의 약물 전달체 또는 약학적 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 상기 조성물은 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있으나, 비경구를 위한 제형인 것이 바람직하다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.

경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.

비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테로 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.

약물전달체 또는 약학적 조성물은 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 현탁제, 용액제, 유제, 시럽제, 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제 및 좌제로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형을 가질 수 있다.

본 발명의 약물전달체 또는 약학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여될 수 있는데, 비경구로 투여되는 경우, 정맥내 주사, 비강내 흡입, 근육내 투여, 복강내 투여, 경피흡수 등 다양한 경로를 통해 투여하는 것이 가능하다.

본 발명의 약물전달체 또는 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여된다. 본 발명에서 용어 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 0.1 mg/kg 내지 1 g/kg의 용량으로 투여될 수 있으며, 더 바람직하게는 1 mg/kg 내지 500 mg/kg의 투여량으로 투여된다. 한편, 상기 투여량은 환자의 나이, 성별 및 상태에 따라 적절히 조절될 수 있다.

본 발명의 약물전달체 또는 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료제와 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

이하, 첨부된 도면들을 참조하면서 본 발명의 바람직한 실시예에 대해 상세히 설명하기로 한다. 한편, 해당 기술분야의 통상적인 지식을 가진자로부터 용이하게 알 수 있는 구성과 그에 대한 작용 및 효과에 대한 도시 및 상세한 설명은 간략히 하거나 생략하고 본 발명과 관련된 부분들을 중심으로 상세히 설명하도록 한다.

<실시예>

재료

FBD 시리즈의 생성을 위해 적절한 프라이머를 사용하여 6 개의 유전자 클론을 준비하기 위해 중합 효소 연쇄 반응 (PCR) 증폭이 적용된다. wtFc와 Z의 화학 유전자는 Cosmo Genetech (Korea)에서 합성하였으며, wtFc는 hxFc, hCH₂, hxCH₂ 증폭을 위한 PCR에서 부모 DNA로 사용되었다. wtFc의 7 개 아미노산이 돌연변이 되어 Fc701을 생성하였다:

(1) N-XhoI-(wtFc)-HindIII-C;

(2) N-XhoI-(hxFc)-HindIII-C;

(3) N-XhoI-(hCH2)-HindIII-C;

(4) N-XhoI-(hxCH2)-HindIII-C;

(5) N-XhoI-(Z)-HindIII-C;

(6) N-XhoI-(Fc701)-HindIII-C.

FBD (FFPN)를 표시하는 페리틴 나노 케이지를 생성하기 위하여 위의 유전자를 pT7-7 플라스미드의 human ferritin heavy chain(FTN) 유전자에 개별적으로 연결하였다. FFPN의 정제를 용이하게 하기 위해 N-terminal hexa-histidine tag를 첨가하였다. N-NdeI-6Histidine-(FTN)-Linker-XhoI- 최종 ligation후 FFPN의 생합성을 위해 다음과 같은 발현 벡터를 구축하였다:

i) N-NdeI-6Histidine-(FTN)-Linker-XhoI-(wtFc)-HindIII-C;

ii) N-NdeI-6Histidine-(FTN)-Linker-XhoI-(hxFc)-HindIII-C;

iii) N-NdeI-6Histidine-(FTN)-Linker-XhoI-(hCH₂)-HindIII-C;

iv) N-NdeI-6Histidine-(FTN)-Linker-XhoI-(hxCH₂)-HindIII-C;

v) N-NdeI-6Histidine-(FTN)-Linker-XhoI-(Z)-HindIII-C;

vi) N-NdeI-6Histidine-(FTN)-Linker-XhoI-(Fc701)-HindIII-C

(Table 1).

(GGGGS)₃ linker and (GG) linker were cloned between FTN and XhoI.

Transformation and Protein Expression

시퀀싱이 완료된 후 FFPN의 발현 벡터를 E. coli (BL21 (DE3))로 형질 전환시켰다. 형질 전환된 대장균의 콜로니를 ampicillin 항생제가 첨가된 3ml LB 배지에서 37℃, 150rpm에서 16 시간 동안 성장시켰다.

그 후 배양 배지를 37℃, 150rpm에서 진탕 플라스크에서 더 큰 규모(250:1)로 옮겼다. DX-11 FX + spectrophotometer(DENOVIX)로 측정한 OD 600(600nm에서의 광학 밀도)이 0.6 (4.8 Х 10^8 세포/ml)에 도달할 때까지 배양액을 배양하였다.

1M IPTG (isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside; Promega)를 1:1000의 최종 농도로 배지에 1mM으로 주입하여 재조합 단백질 발현은 20℃에서 18 시간 동안 배양하였다. 마지막으로 배양이 완료된 후 4500g, 5 분에서 원심 분리를 사용하여 배양 배지에서 대장균을 수확하였다.

SDS-PAGE

FFPN의 용해도는 SDS-PAGE(Bio-Rad)를 사용하여 분석되었다. SDS-PAGE겔은 12 % 아크릴 아미드의 농도로 형성되었다. 5X SDS 로딩 염료(0.5g SDS, 0.025g Bromophenol blue, 0.386g Dithiothreitol, 1.25ml 1M Tris-HCl pH 7.4, 2.5ml Glycerol)를 샘플에 첨가하여 단백질을 변성시키고 10 분 동안 95℃에서 가열, 가열 블록을 사용하였다. MINI-PROTEAN Electrophoresis System (Bio-Rad)을 사용하여 전기영동으로 샘플을 분리하였다. SDS-PAGE 겔의 바닥에서 로딩 염료가 빠져 나갈 때까지 약 90 분 동안 전기영동으로부터 160V의 일정한 전압이 공급되었다. 전기영동이 끝난 후 SDS-PAGE 겔을 coomassie blue(40% methanol, 10% acetic acid and 0.1% coomassie blue R-250 in distilled water)로 선택적으로 단백질을 검출하기 위해 염색하였다. 가용성 및 불용성 단백질의 비율을 결정하기 위해 염색된 젤의 각 밴드를 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 분석하였다.

단백질 나노입자의 정제

재조합 단백질을 함유하는 cell pellets을 20ml 용해 완충액(lysis buffer ; 1M Tris-HCl at pH 7.5 with 10 mM 이미다졸)에 현탁시켰다. 그런 다음 ultrasonicator (Sonic and Matrials INC)를 사용하여 45 분 동안 cell을 용해시켰다(power 35%, time interval for pulse on 3 seconds/off 3 seconds). 세포 용해물(cell lysate)을 원심분리하여 4℃, 13000rpm에서 10 분 동안 상층액으로부터 가용성 단백질을 수집하였다. 가용성 단백질을 포함하는 상층액을 Ni-NTA 친화성 크로마토그래피를 위해 poly-prep 크로마토그래피 컬럼(Bio-Rad)에 로드하였다. 재조합 단백질의 N-말단에 있는 헥사-히스티딘 잔기로 인해 Ni-비드(500μl)에 결합된 단백질이 컬럼에 추가되었다. 컬럼을 세척 버퍼(1M Tris-HCl at pH 7.4 with 40 mM imidazole)로 두 번 세척한 후, 용출 버퍼(1M Tris-HCl at pH 7.4 with 250 mM imidazole)를 사용하여 재조합 단백질을 용출하였다. 마지막으로 300 kDa molecular weight cut-off dialysis tube (Spectrum LABs)을 이용하여 4℃에서 16 시간 동안 5 ~ 20 mM Tris 완충액 또는 증류수로 완충액을 교환하였다.

단백질 수율 계산

버퍼가 증류수로 변경된 후 각 재조합 단백질의 농도는 DX-11 FX + spectrophotometer (DENOVIX)를 사용하여 280nm (A280)의 흡광도로 모니터링하였다. 1L 박테리아 배양에서 수확한 총 단백질 함량은 수학식 1에 따라 계산하였다:

[수학식 1]

Total protein amount per liter of bacteria (mg/L)

투과전자현미경(TEM) 분석

단백질 나노케이지 자가조립의 형태를 관찰하기 위하여 0.1mg/ml FFPN을 200 구리 그리드 카본 필름(Electron Microscopy Sciences)에서 2% 몰리브덴산 암모늄(ammonium molybdate) 수용액으로 네거티브 염색하였다. 각 FFPN 및 몰리브덴산 암모늄 수용액 10μl를 사용하였다. 각 FFPN을 그리드에 떨어 뜨리고 실온에서 30 초 동안 흡수하고 그리드 위에 남아있는 잔여 용액을 제거하였다. 이후 그리드에 남아 있는 샘플을 몰리브덴산 암모늄으로 30초 동안 염색하고 그리드 위에 남아 있는 잔여 용액을 제거하였다. 그리드는 하루 동안 실온에서 공기 중에서 건조되었다. TEM 이미지는 Bio Transmission Electron Microscope HT7700 (Hitachi)을 사용하여 관찰하였다.

동적 광산란(DLS; Dynamic light scattering) 분석

FFPN의 직경은 동적 광산란법(dynamic light scattering)으로 측정하였다. FFPN은 증류수에서 최종 농도 1mg/ml로 준비하였다. FFPN은 분석 전에 0.2 micrometer centrifuge tube filter (Corning)로 여과하였다. 필터링된 샘플은 disposable cuvettes (Folded Capillary Zeta Cell, Zetasizer)에 로드되었다. DLS 데이터는 Zetasizer Nano ZS system (Malvern Instruments)을 사용하여 분석하였다.

원편광 이색성(CD; Circular dichroism)

FFPN의 2차 구조는 원편광 이색성 분광기(circular dichroism spectroscopy)로 분석하였다. 정제된 단백질을 5mM Tris 완충액에서 16 시간 동안 투석하고 최종 농도를 0.25mg/ml로 조정하였다. CD 스펙트럼은 J-1500 원편광 이색성 분광기(JASCO)로 수집하였다. FFPN의 파장 스펙트럼은 25℃에서 190 ~ 260 nm의 far UV에서 수집하였다.

표면 플라즈몬 공명 측정(SPR; Surface plasmon resonance)

human FcRn과 FFPN의 결합 친화도는 SR7500DC system (Reichert)을 사용하여 표면 플라즈몬 공명 측정(surface plasmon resonance)에 의해 분석되었다. 재조합 human FcRn (Bio-techne, Catalog Number: 8639-FC)은 CM5 센서칩에 고정되었고 sodium acetate buffer at pH 4.5 버퍼를 이용하였다.

중성 pH에서 결합 친화도를 테스트하기 위해 단백질 샘플은 pH 7.4 Tris, 0.005 % Tween-20 버퍼에 최종 농도는 20 mM로 희석하였다. pH 6에서 결합 친화도를 테스트하기 위하여 동일한 샘플을 산성 pH로 조정한 동일한 버퍼에 희석하였다. FcRn과 샘플의 결합 해리는 각각 pH 7.4 및 pH 6에서 동일한 화학적 조성을 갖는 해리 완충액으로 조사하였다. FFPN은 5분 동안 30μL/min의 유속으로 25℃에서 FcRn과 연관되었고, 70μL/min의 유속으로 25℃에서 10분 동안 해리되었다. 분석물로서 FFPN은 200 nM에서 4 nM 사이의 연속 희석으로 구성하였다. 혼합되지 않은 실행 버퍼의 신호로부터의 결합 곡선은 분석 물로부터의 결합 곡선을 맞추기 위해 사용하였다. 결합 곡선의 감산은 평형 해리 상수 (KD)에 대해 계산하였다. 신호는 Scrubber2 software program (BioLogic Software)을 이용해 분석하였다.

결과 및 평가

구조

FBD 시리즈는 Fc 도메인, CH₂ 도메인, Z 도메인으로 구성된다.

Fc는 pH 의존적 방식으로 FcRn과 상호 작용하여 혈청 반감기를 연장하는 데 중요한 부분이다. CH₂는 Fc 도메인의 위쪽 부분이다. FcRn과 Fc 도메인 사이의 상호 작용은 FcRn의 α2- 도메인과 Fc의 CH₂-CH₃ 접합부에서 히스티딘 잔기 사이의 정전기에 의해 매개된다. 위치 지정 돌연변이 유발 연구에 따르면, 뮤린 FcRn에 대한 뮤린 Fc의 중요한 결합 부위가 His310, His435, Ile253 및 적은 정도로 Tyr436 및 His433 인간 세포 시스템에서 더 많은 수의 잔기가 FcRn-Fc 상호 작용에 관여한다. 인간 Fc에서 이러한 잔기는 인간 FcRn과 직접 상호 작용한다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 His435, Asn434, Gln311, Thr307, Lys288, Ser254 및 Ile253을 도시한다. 이들 7개 잔기 중 5개는 CH₂ 도메인에 속한다. 또한 토끼를 이용한 in vivo 실험에서 인간 CH₂의 반감기(~ 70h)가 인간 CH₃ (~ 15h)의 반감기보다 상당히 길다는 것이 밝혀졌다. 이러한 이유로 크기 다양성을 위해 FBD 시리즈에 CH₂를 추가하여 FFPN크기를 다양화하였다.

이 펩타이드는 인간 유래 물질에서 유래하기 때문에 다른 물질보다 인체에서 면역 반응을 일으킬 가능성이 적다. E. coli 시스템에서 Fc 또는 CH₂ 융합 단백질을 발현함으로써 진핵 세포에 비해 융합 단백질을 생산하는 것이 간단하다. 또한 제품의 품질 관리가 용이하고 경제적으로 생산할 수 있다. Fc 도메인과 그 단편이 E. coli 시스템에서 발현되면 cellular glycosylation mechanism이 결여되어 glycan chains이 제거된다. Aglycosylated Fc domain of IgG는 glycosylated IgG와 비교하여 구분되는 Fc 구조를 가지고 있기 때문에 FcγR 결합을 나타내지 않는다. 이러한 이유로 Aglycosylated Fc 또는 CH₂ 융합 단백질에서는 FcγR과의 상호 작용이 나타나지 않는다. FcγR과의 상호 작용은 면역 이펙터 기능을 활성화 또는 비활성화하는데 중요하므로, 융합 단백질은 ADCC, ADCP와 같은 FcγR 결합으로 인한 부작용을 피할 수 있다. 다행히도 Fc 도메인과 FcRn의 상호 작용은 글리코실화의 영향을 받지 않으며, 융합 단백질은 여전히 pH 의존적 FcRn 결합을 유지한다.

예외적으로, 돌연변이 Fc 도메인인 Fc701은 pH 의존적 FcRn 결합 능력을 가진 aglycosylated Fc 도메인에 비해 FcγRI 결합 친화도가 더 높다. 이 돌연변이 Fc는 박테리아에서 발현되는 aglycosylated Fc (Fc701)의 면역 효과를 향상시키기 위해 개발되었다. 상위 CH₂ 영역 (Q295R, A330V, L328W, I332Y, P331A)에 5 점의 치환 돌연변이를 도입하고, CH₃ 영역 (E382V, M428I)에 2 점을 도입함으로써 Fc701은 자연상태의 aglycosylated IgG에 비해 FcγRI에 대해 100 배 이상의 향상된 결합 친화성을 보여주었다. 52 FBD 시리즈에 이 7 점 돌연변이 단백질을 추가하였다. 이 융합 파트너는 종양 세포(ADCC, ADCP)의 수지상 세포 매개 면역 반응과 같은 치료적 적용이 필요할 때 이점을 가질 수 있다.

또한 Z 도메인이라고 하는 pH 의존적 FcRn 결합 친화성을 갖는 애피바디(affibody)가 있다. Z 도메인은 FcRn 구조 시스템에 결합하는 능력을 가진 작은 친화성 단백질인 애피바디 분자이다. FcRn과 직접 상호 작용할 수 있는 일련의 애피바디 분자를 생성하고 융합 파트너로서 생체 내에서 혈장 반감기를 연장하는 각 단백질의 능력을 조사하였다. 그들의 작은 크기와 독립적인 접힘은 그들의 융합 파트너의 고유한 특성을 방해하지 않는다. 그들은 E. coli 발현 시스템에서 효율적으로 재조합적으로 생산할 수 있다. 이들의 단백질 분해에 대한 안정성과 높은 열 안정성은 생체 내 구조화되지 않은 펩타이드에 비해 이점으로 작용할 수 있다. 또한 임상 데이터는 인체에서 애피바디의 기능을 제시하고자 하였다. 본 발명자들은 향상된 FcRn 친화력에 대한 결합력을 갖도록 두 개의 Z 도메인을 연결하여 FBD에 대한 Z 도메인의 homodimer를 생산하였다.

도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 융합 단백질의 발현 및 자기조립 메카니즘을 도시한 것이다. 도 2를 참조하면, FFPN을 생산하기 위하여, 본 발명자들은 먼저 페리틴 서브 유닛의 C- 말단에 FBD 서열을 삽입하여 두 개의 FBD homodimers를 형성함으로써 FBD tetramers를 형성하도록 인간 페리틴 중쇄를 유전적으로 조작하였다. 하나의 Fc homodimers는 자연에서 두 개의 FcRn 분자에 결합할 수 있다. FBD 클러스터는 FBD 단량체와 비교하여 증가된 결합력을 포함할 수 있으며, 이는 결합성 관련 FcRn 결합 친화도가 증가된 융합 페리틴을 제시하였다. 페리틴과 FBD 도메인을 연결하기 위해 짧은 (GG) 링커(표 1에서 -S-; 짧은 링커) 또는 유연한 (GGGGS) 3 링커(표 1에서 -L-; 긴 링커)를 사용하였다. 링커의 길이에 따른 실험 조건은 FcRn 상호 작용의 구조적 안정성 및 입체 장애를 고려하여 발현 수준 및 단백질 수율 분석을 위해 다양화하였다. FFPN의 정제를 용이하게 하기 위하여 N-terminal hexa-histidine tag를 첨가하였다.

Expression Level 및 단백질 수율

Fc 영역의 상단에는 상부 CH₂ 영역에 위치한 9 개의 아미노산으로 구성된 힌지(hinge) 영역이 있다. IgG는 원래 이합체에 존재한다. 힌지 영역은 이황화 결합에 의해 IgG dimerization 의 Fc를 안정화한다. 본 발명자들은 힌지 영역의 이황화 결합이 E. coli 시스템의 발현 및 정제 안정성에 영향을 미칠 수 있다고 가정하였다. 그래서 본 발명자들은 힌지 영역의 존재에 따라 Fc와 CH₂ 도메인을 'wtFc (힌지 영역 있음), hxFc (힌지 영역 없음), hCH₂ (힌지 영역 있음) 및 hxCH₂ (힌지 영역 없음)'으로 다양화하였다. 각 융합 단백질의 발현 수준은 SDS PAGE 및 ImageJ 소프트웨어 프로그램으로 분석된다.

표 2는 FBD 융합 단백질 나노 케이지 (FFPN)의 각 발현 수준과 단백질 수율을 나타낸다. F-S-wtFc에 비해 F-L-wtFc는 더 높은 발현 수준을 나타낸다. 이러한 결과는 긴 링커를 사용한 경우 페리틴과 FBD 사이의 거리가 유지되고 응집이 줄어들 수 있으며, 짧은 링커를 사용하는 경우 입체 장애를 유발하여 FcRn 상호 작용을 방해할 수 있으므로 짧은 링커가 있는 FFPN을 제외하였다. 힌지 영역이 없는 FFPN과 비교하여 힌지 영역이 없는 FFPN은 비슷한 발현 수준을 나타내지만 약간 더 높은 용해도를 나타낸다. 힌지 영역의 이황화 결합은 용해도에 영향을 미칠 수 있다고 생각된다. FFPN이 힌지 영역을 소유하면 이황화 결합이 FFPN을 응집하여 용해도 수준을 낮춘다. Z는 상당히 높은 용해도로 발현되었다. 또한 1L 배양 당 24mg의 가장 높은 단백질 수율을 나타낸다. 이러한 특성은 애피바디의 친화성 단백질의 특징에서 비롯된다. 아미노산 구성으로 인해 시스테인 잔기의 부재는 가용화된 상태에서 구조를 안정화시킬 수 있었다. wtFc에서 7 개 잔기에 돌연변이가 있는 Fc701은 E. coli에서 다소 낮은 발현 수준을 보이지만 wtFc와 유사한 단백질 수율을 나타내었다. 모든 FFPN은 E. coli 발현 시스템에서 고도로 발현되며 일반적인 수율은 박테리아 배치 배양 1 리터당 12mg 이상이었다.

*protein yields per liter of bacteria culture (mg/L)

n.d., not determined

특성분석

도 3은 본 발명의 일 실시예에 따라 FFPN 융합 단백질의 형태를 관찰하기 위해 각 FFPN을 negative staining TEM으로 분석한 결과를 도시한 것이다. 도 3을 참조하면, 모든 FFPN은 구형이며 페리틴의 속이 빈 케이지 모양의 구조를 나타내었다. FBD는 FFPN 나노 케이지의 외부 표면에 성공적으로 발현된 것을 확인할 수 있다.

도 4는 본 발명의 일 실시예에 따라 동적 광 산란 (DLS)분석에 의하여 각 FFPN의 단분산성을 도시한 것이다. 도 4를 참조하면, 동적 광산란(DLS) 분석은 각 FFPN의 단분산성을 확인했으며, 크기는 이론적 직경과 유사하였다. Fc, CH₂ 및 Z의 이론적 크기는 각각 6.3 nm, 4 nm 및 5 nm이다. Fc (wtFc, hxFc, Fc701)가있는 FFPN은 직경이 10 ~ 18nm 정도 증가하였다. CH₂ (hCH₂, hxCH₂)가 있는 FFPN은 직경이 약 5 ~ 7nm 증가하였다. Z가 있는 FFPN은 크기가 가장 적게 증가하였다. FFPN의 오차율은 유연한 링커가 FBD가 쉽게 이동할 수 있도록 해주기 때문에 FBD의 크기에 따라 증가하고 있다.

안정성(시간 의존 안정성)

시간에 따른 구조적 안정성을 조사하기 위하여 Far-UV (260-190 nm) 원형 이색성(CD) 분석을 통해 한 달 후 FFPN의 2 차 구조와 구조적 변화를 측정하였다. 본 발명자들은 한 달의 시간 간격으로 각 FFPN의 CD 스펙트럼을 측정하고 각 스펙트럼을 비교하였다.

도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 각 페리틴 FBD 융합 단백질의 CD 스펙트럼을 도시한 것이다. 도 5를 참조하면, wtFTN은 222nm 및 208nm에서 이중 음의 피크를 보여 주며, 이는 α- 나선형 단백질의 전형적인 2차 구조를 나타낸다. 인간 페리틴의 결정 구조는 페리틴이 주로 α- 나선의 2 차 구조를 구성함을 의미한다.

FFPN과 wtFTN을 비교하면, FFPN은 일반적으로 α- 나선형 구조를 유지하는 반면, 약 216nm의 두 피크 사이에 주요 음의 값을 추가로 얻었으며 이는 β- 시트의 CD 스펙트럼을 의미한다. 실제로, IgG1의 Fc 도메인은 anti-parallel β-sheet를 높은 비율의 2차구조로 가지고 있다 (β- 시트의 45 % 및 α- 나선의 7 %). 59-61 구조에서 힌지 영역의 효과를 확인하기 위해 wtFc와 hCH₂를 hxFc 및 hxCH₂와 비교하여 wtFc와 hxFc, hCH₂ 및 hxCH₂ 사이에 유사한 스펙트럼이 관찰되었다. 이 결과에서 힌지 영역의 이황화 결합은 각 융합 파트너의 구조 형성에 영향을 주지 않았다.

Fc 도메인과 CH₂ 도메인의 β- 시트의 비율은 비슷하지만 CH₂- 융합 FFPN의 β- 시트 구조의 전체 양은 크기로 인해 Fc- 융합 FFPN에 비해 낮다. 일부 연구에서는 응집체 형성과 β시트 구조의 형성이 종종 상관 관계가 있다. CH₂- 융합 FFPN에서 한 달 후 CD 스펙트럼은 Fc-융합 FFPN에 비해 크게 변하지 않았다. 또한 hxCH₂-fusion FFPN은 거의 동일한 스펙트럼을 보여준다. 이러한 경향은 β-시트 비율의 차이에서 비롯될 수 있다. 이 두 비교에서 β-시트 비율이 낮고 힌지 영역이없는 FFPN은 더 나은 시간 의존적 구조 안정성을 보여주었다.

7 개의 돌연변이를 포함하는 Fc 변이체인 Fc701는 wtFc와 비교하여 약간 다르지만 유사한 CD 스펙트럼을 보였으나, 1 개월 후 스펙트럼도 변화하여 222nm 및 208nm에서 약한 음의 피크를 나타낸다. 이 결과는 Fc701의 돌연변이가 Fc의 2 차 구조에는 영향을주지 않았지만 구조적 안정성에는 영향을 미쳤음을 시사한다. 이러한 안정성의 단점 때문에 후속 연구에서 Fc701 융합 FFPN을 제외하였다.

주로 α- 나선 구조로 구성된 Z가있는 FFPN은 분석 전과 다음 달에 222nm 및 208nm에서 음의 피크를 갖는 전형적인 α- 나선 스펙트럼을 보여준다. 한달 뒤 스펙트럼 또한 222nm 및 208nm에서 명확한 두 개의 피크를 보여 주어 1 개월 동안 2 차 구조가 잘 보존되었음을 나타낸다.

도 6은 본 발명의 일 실시예에 따라 A280으로 측정한 1개월 동안 FFPN의 단백질 농도변화를 도시한 것이다. 도 6을 참조하면, A280으로 측정한 단백질 농도로 1개월 전 농도와 비교하여 1 개월 후 각 FFPN의 가용성 단백질 수율을 나타내고 있다. Fc701을 제외한 모든 FFPN은 가용성 형태로 90 % 이상의 단백질 농도 유지를 나타낸다.

생물 의약의 운송 및 보관 조건은 생물 의약품 시장의 비용에 영향을 미칠 수 있다. 이 연구에서 FFPN은 시간 의존적 안정성을 가지고 있으므로 생물 의학 개발에 유리하다.

Binding Kinetics

FcRn 매개 세포 내 재활용의 경우, 산성 조건(pH 5.5 ~ 6.0)에서 FFPN의 높은 결합 친화도 및 인간 FcRn에 대한 중성 환경(pH 7.4)에서 낮은 결합 친화도가 혈청 반감기를 연장하는 데 중요한 요소이다.

FFPN의 평형 결합 상수를 얻기 위해 인간 FcRn을 CM5 센서 칩에 고정하고 FFPN의 pH 의존적 FcRn 상호 작용을 pH 6.0 및 pH 7.4에서 표면 플라즈몬 공명 (SPR)으로 측정하였다. 각 FFPN은 pH 6 및 pH 7.4의 20mM Tris 버퍼에서 준비된다.

표 3의 결과는 wtFTN이 산성 또는 중성 pH 조건에서 FcRn에 결합하지 않았음을 보여 주며, 이는 FBD에 의해서만 FcRn에 대한 결합을 매개할 수 있음을 확인시킨다. 힌지 영역이 있거나 없는 모든 FFPN은 Z를 제외하고 pH 6에서 약 1 ~ 2 nM의 유사한 결합 친화성을 나타낸다. FBD에 힌지 영역이 있는 wtFc 및 hCH₂는 힌지 영역이 없는 hxFc 및 hxCH₂보다 약간 높은 결합 친화성(2.3 배 및 1.7 배)을 나타낸다.

그러나 pH 6에서의 결과와 달리 pH 7.4에서의 친화성은 힌지 영역의 존재 여부에 따라 뚜렷한 차이를 나타내었다. 우선, 모든 FFPN의 FcRn에 대한 결합은 pH 6에 비해 절대적으로 감소하여 FBD 융합 단백질이 FcRn에 대한 pH 의존적 결합 능력을 가지고 있음을 나타낸다. 힌지 영역이 없는 FFPN(hxFc, hxCH₂, Z)은 힌지 영역 (wtFc, hCH₂, Fc701)이 있는 FFPN에 비해 약 10 배 더 높은 평형 해리 상수를 나타내었다. hxFc는 wtFc보다 10배 낮은 결합 친화도를 보였고, hxCH₂는 hCH₂보다 18 배 더 낮은 결합 친화도를 나타내었다. Z는 또한 힌지 영역이 없는 FFPN과 유사한 결합 친화도를 나타내었다. 또한 pH 7.4에서 해리율 측면에서 Fc와 CH₂를 비교해 보면 CH₂는 산성 pH에서 더 나은 결합률을 보여주고 중성 pH에서 해리율을 나타내었다. hCH₂ 및 hxCH₂는 각각 wtFc 및 hxFc보다 더 높은 해리 상수를 가졌다. Fc701은 wtFc와 유사한 결합 친화성을 보였는데, 이는 유전적 융합이 그의 FcRn 결합 특성에 영향을 미치지 않았음을 나타낸다. pH 7.4에서 IgG-FcRn의 효율적인 해리는 FcRn 매개 반감기 연장을 위해 pH 6에서 IgG-FcRn의 결합보다 훨씬 중요하다. 예를 들어, 중성 및 산성 pH 모두에서 FcRn 결합 능력이 향상되도록 조작된 IgG의 경우 반감기가 연장되지 않았다.

힌지 영역이 없는 FBD는 pH 6에서 유리한 association rate와 pH 7.4에서 효율적인 해리를 나타냈다. 이러한 특징을 바탕으로 FFPN은 in vivo에서도 바람직하게 연장된 반감기를 나타낼 것으로 예상된다.

	hFcRn에 대한 친화성 pH 6.0 [nM]	hFcRn에 대한 친화성 pH 7.4 [nM]
FTN-L-wtFc	1.13	1040
FTN-L-hxFc	2.70	10600
FTN-L-hCH2	0.61	1260
FTN-L-hxCH2	1.09	23100
FTN-L-Z	7.80	9180
FTN-L-Fc701	1.63	990
wtFTN	n.b.	n.b.

n.b.는 유의미한 결합이 관측되지 않음

평가

FBD는 인간 유래 단백질 (IgG) 또는 구조적 안정성이 높은 애피바디(affibody) 단백질의 단백질 부분이다. wtFc, hxFc, hCH₂, hxCH₂, Z 및 Fc701가 이에 해당된다. FBD는 유연한 15개 아미노산 링커에 의해 인간 페리틴 중쇄와 유전적으로 결합된다. 재조합 페리틴 모노머의 24개의 서브 유닛은 자가 조립에 의해 균일한 중공 구형 구조를 형성하며 TEM 및 DLS로 확인된다. Fc701을 이용한 FFPN을 제외한 모든 FBD 융합 단백질 나노케이지는 한 달 동안 구조적 안정성을 나타냈다.

모든 FFPN은 인간 FcRn과 pH 의존적 결합 친화성을 가졌다. pH 6에서 FcRn과의 결합률은 서로 현저한 차이를 나타내지 않았지만, pH 7.4에서는 힌지 영역이 없는 FBD (hxFc, hxCH₂ 및 Z)로 구성된 FFPN의 해리율이 현저하게 높았다(10 ~ 18 배). 힌지 영역(wtFc, hCH₂, Fc701)이 있는 FBD보다. pH 7.4에서 FcRn과의 효율적인 해리는 생체 내에서 FcRn 매개 재활용에 중요한 요소이다.

순환시간이 긴 페리틴 나노케이지는 진단, 약물 및 백신 전달 등에 새로운 플랫폼으로 널리 활용될 수 있다. 또한 FFPN은 대장균에서 합성된 높은 수율로 인해 산업 분야에 적용될 가능성이 있다. FBD는 페리틴을 넘어 다른 단백질 나노 케이지나 단백질 약물에도 적용될 수 있으며 궁극적으로 생체 적합성 혈청 반감기 연장 방법으로 플랫폼 기술에 사용될 수 있다.

전술한 내용은 후술할 발명의 청구범위를 더욱 잘 이해할 수 있도록 본 발명의 특징과 기술적 장점을 다소 폭넓게 상술하였다. 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허청 구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (5)

1. 페리틴;
   상기 페리틴의 말단과 연결하는 링커; 및
   상기 링커에 의하여 페리틴과 연결되어 있는 FcRn 결합 도메인(FBD);을 포함하는 것을 특징으로 하는 융합단백질 나노케이지.
   
2. 제 1 항에 있어서,
   상기 페리틴은 인간유래의 페리틴 중쇄 단백질인 것을 특징으로 하는 융합단백질 나노케이지.
   
3. 제 1 항에 있어서,
   상기 FcRn 결합 도메인(FBD)은 서열번호 3, 서열번호 5 내지 9 중에서 선택된 어느 하나의 아미노산 서열로 구성되는 것을 특징으로 하는 융합단백질 나노케이지.
   
4. 제 1 항에 있어서,
   상기 나노케이지는 서열번호 10 내지 16 중에서 선택된 어느 하나의 단백질로 구성되는 것을 특징으로 하는 융합단백질 나노케이지.
   
5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항의 나노케이지 및 전달 대상 약물을 포함하는 약물 전달체.

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