KR20220151166A - 중간체 공통 중간체를 통한 돌라스타틴 및 아우리스타틴 유사체의 효율적인 제조 - Google Patents

중간체 공통 중간체를 통한 돌라스타틴 및 아우리스타틴 유사체의 효율적인 제조 Download PDF

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제임스 워커
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Abstract

식 I의 보편적인 돌라스타틴 코어를 제공하는 단계
Figure pct00080

C-말단 카복실산 기를 아민 (A)과 반응시켜 아미드 결합을 형성하는 단계 및 N-말단 아민을 카복실산 (CA)과 반응시켜 아미드 결합을 형성하는 단계, 여기서 단계는 둘 중 하나의 순서로 수행될 수 있음, 를 포함하는 돌라스타틴, 아우리스타틴 또는 관련 화합물 제조 방법. 또한 제공된 것은 돌라스타틴, 아우리스타틴 및 관련 화합물의 제조에서의 사용을 위한 보편적인 돌라스타틴 코어의 단리된 염이다. 또한 제공된 것은 고순도 돌라스타틴 코어 및 고순도 돌라스타틴 및 아우리스타틴 화합물의 제조에 유용한 많은 중간체 및 공정 단계이다.

Description

중간체 공통 중간체를 통한 돌라스타틴 및 아우리스타틴 유사체의 효율적인 제조
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2020년 3월 9일에 출원된 미국 가특허출원 제62/987,150호의 우선권을 주장하며, 이 가출원의 전체 내용은 여기에 참조로 포함된다.
돌라스타틴 및 관련 아우리스타틴은 특히 암 세포에 직접 전달하기 위해 항체에 커플링될 때 중요한 항종양제로 인식되는 화합물 부류이다. 많은 복잡한 천연 제품 및 유도체와 마찬가지로 이러한 분자의 합성은 일반적으로 수많은 화학적 단계를 필요로 하는 상당히 집약적이다. 오늘날 과학자들은 각각의 합성을 새로 개발해야 하며, 접합체를 위한 돌라스타틴 및 아우리스타틴 함유 페이로드의 cGMP 제조를 가능하게 하는 추가 개발이 필요하다.
이들 임상적으로 중요한 화합물을 생산하고 새로운 돌라스타틴, 아우리스타틴 및 관련 화합물의 개발을 가능하게 하기 위한 새롭고 보다 효율적인 합성 방법에 대한 요구가 존재한다.
요약
여기서 제공된 것은 화학식 I의 화합물
Figure pct00001
I
여기서 R1, R2, R3, R4 R5 및 R8는 각각 H, C1-C6 알킬, C1-C6 치환된 알킬, -OR11, -NR11R12, -SR11 및 할로로부터 독립적으로 선택되고; R11 및 R12는 H, C1-C6 알킬로부터 독립적으로 선택되고; R6 및 R7는 각각 독립적으로 H 또는 C1-C4 알킬; R9는 H 또는 산 보호기, 및 R10는 H 또는 아미노 보호기, 로부터 출발하여, C-말단 카복실산 기를 아민 (A)과 반응시켜 아미드 결합을 형성하는 단계 및N-말단 아민을 카복실산 (CA)과 반응시켜 아미드 결합을 형성하는 단계에 의해, 돌라스타틴, 아우리스타틴 또는 관련 화합물을 제조하는 방법이다. 반응 단계, 즉 C-말단 카르복실산과 아민(A)의 반응 또는 N-말단 아민과 카르복실산(CA)의 반응은 어느 순서로든 수행할 수 있다.
아민 (A)은 알킬아민, 알칸올아민, 아릴알칸올아민, 아미노산, 아미노산 유도체, 펩티드, 및 펩티드 유도체로부터 선택될 수 있다. 다양한 실시양태에서, 아민 (A)은 하나 이상의 치환기를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 아민 (A)은 보호기를 포함한다.
카복실산 (CA)는 아미노산, 아미노산 유도체, 펩티드 및 펩티드 유도체로부터 선택될 수 있다. 일부 실시양태에서, 카복실산 (CA)은 하나 이상의 치환기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 카복실산 (CA)은 보호기를 가질 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 화학식 I의 화합물 내 R 기는 화학식 IA의 화합물을 얻도록 선택된다:
Figure pct00002
.
또한 제공된 것은 화학식 II의 단리된 염:
Figure pct00003
II
여기서 R1, R2, R3, R4 R5 및 R8는 각각 독립적으로 H, C1-C6 알킬, C1-C6 치환된 알킬, -OR11, -NR11R12, -SR11 및 할로로부터 선택되고, R11 및 R12는 H 및 C1-C6 알킬로부터 독립적으로 선택되고, R6 및 R7는 각각 독립적으로 H 또는 C1-C4 알킬, R10는 H 또는 아미노 보호기; 그리고 Y+는 반대이온이다.
또한 제공된 것은 화학식 III의 화합물:
Figure pct00004
III
여기서 R1, R2, R3, R5 및 R8는 각각 H, C1-C6 알킬, C1-C6 치환된 알킬, -OR11, -NR11R12, -SR11 및 할로로부터 독립적으로 선택되고, R11 및 R12는 H 및 C1-C6 알킬로부터 독립적으로 선택되고, R6 및 R7는 각각 H 또는 C1-C4 알킬로부터 독립적으로 선택되고, Z-는 반대이온이다.
고순도 돌라스타틴 코어 및 고순도 돌라스타틴 및 아우리스타틴 제조에 유용한 부가적 중간체 화합물 및 공정 단계가 또한 제공된다.
도 1는 바람직한 화학식 I의 화합물의 구조적 특징을 나타낸다.
도 2는 화학식 I의 제조를 위한 합성 반응식을 나타낸다.
도 3은 여기에 설명된 보편적인 돌라스타틴 코어와 함께 (A) MMAE, (B) MMAF, (C) XMT-1505, XMT-1536, (D) 앰버스타틴 269, (E) 아우리스타틴 W, (F) 돌라스타틴 10 및 (G) 화이자 아우리스타틴을 포함하여 클리닉에 들어온 예시적인 돌라스타틴 및 아우리스타틴 페이로드를 도시하고, 돌라스타틴 코어는 각 페이로드에서 강조 표시된다.
도 4는 돌라스타틴 코어로부터의 2가지 경로를 통한 mc-Val-Cit-PAB-N-Me-Val-OH, MMAE 및 vcMMAE의 제조를 위한 합성 반응식을 나타낸다.
상세한 설명
아우리스타틴 및 돌라스타틴을 제조하는 통상적인 방법의 결점을 극복하기 위해, 본 발명자들은 다수의 돌라스타틴, 아우리스타틴 및 관련 화합물로 효율적으로 형질전환될 수 있는 고급 중간체를 확인 및 합성했다. 보편적인 돌라스타틴 코어의 이러한 식별 및 합성을 통해, 본 발명자들은 도 3에 도시된 것과 같은 기존 돌라스타틴 및 아우리스타틴의 고효율 합성을 제공하도록 맞춤화될 수 있는 새로운 플랫폼을 개발할 수 있었다. 또한, 이 플랫폼은 새로운 돌라스타틴, 아우리스타틴 및 관련 화합물을 개발하기 위해 사용될 수 있다.
식 I에 나타낸 보편적인 돌라스타틴 코어를 사용하여 돌라스타틴, 아우리스타틴 또는 관련 화합물을 제조하는 단순화된 방법이 본원에 제공된다:
Figure pct00005
I.
본원에 제공된 방법에 따르면, C-말단 카르복실산은 아민(A)과 반응하여 아미드 결합을 형성하고, N-말단 아민은 카르복실산(CA)과 반응하여 아미드 결합을 형성하고, 돌라스타틴, 아우리스타틴 또는 추가 돌라스타틴 또는 아우리스타틴 중간체 화합물은 스페이서, 링커 및 부착기 중 하나 이상의 첨가에 의해 추가로 변형될 수 있다. 이러한 단계는 어느 순서로든 수행될 수 있으며, 즉 일부 실시양태에서 C-말단 카르복실산이 먼저 아민(A)과 반응한 다음 N-말단 아민이 카르복실산(CA)과 반응하다. 다른 실시양태에서, N-말단 아민은 먼저 카르복실산(CA)과 반응한 다음, C-말단 카르복실산은 먼저 아민(A)과 반응하여 관심 대상인 돌라스타틴, 아우리스타틴 또는 추가의 돌라스타틴 또는 아우리스타틴 중간체를 형성한다.
적절한 산 및 아민 보호기는 후속 단계에서 반응되는 말단을 보호하기 위해 사용될 수 있다. N-말단 아민에 보호기가 있는 실시양태에서, 보호기는 카르복실산(CA)과 반응하기 전에 통상적인 방법에 의해 제거될 수 있다. 보호기가 포함되지 않은 경우 선택적 탈보호 단계가 필요하지 않는다. 유사하게, C-말단 카르복실산 상에 보호기가 존재 하는 실시양태에서, 보호기는 아민(A)과 반응하기 전에 통상적인 방법에 의해 제거될 수 있다. 보호기가 포함되지 않은 경우 선택적 탈보호 단계가 필요하지 않는다.
C-말단 카르복실산을 아민(A)과 반응시킬 때 및 N-말단 아민을 카르복실산(CA)과 반응시킬 때 적합한 커플링제가 사용될 수 있다. 본원에 제공된 방법에 사용되는 적합한 커플링제는 카르보닐디이미다졸(CDI), 프로필포스폰산 무수물(T3P) 용액 및 HATU를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 다른 적합한 커플링제는 업계에서의 통상의 기술자에게 공지되어 있다. 일부 실시양태에서, 커플링 첨가제가 사용된다. 커플링 첨가제는 부반응을 억제하고 라세미화를 줄이기 위해 커플링 반응에 사용된다. 본원에 기재된 반응에 유용한 커플링 첨가제는 N-히드록시숙신이미드 (HOSu), N-히드록시-5-노르보르넨-2,3-디카복시미드 (HONB), 1-히드록시벤조트리아졸 (HOBt), 6-클로로-1-히드록시벤조트리아졸 (6-Cl-HOBt), 1-히드록시-7-아자벤조트리아졸 (HOAt), 3-히드록시-4-옥소-3,4-디히드로-1,2,3-벤조트리아진 (HODhbt), 이의 아자 유도체 (HODhat), 및 2-피리디놀 1-옥사이드 (HOPO)를 포함한다. 부가적으로, N-말단 아민을 카르복실산(CA)과 반응시킬 때, 카르복실산은 미리 예비형성된 활성화된 에스테르의 형태일 수 있다. 일반적인 예비형성된 활성화 에스테르는 다음을 포함한다: N-히드록시숙신이미드 (NHS-에스테르), 4-니트로페놀 (PNP-에스테르), 테트라/펜타플루오로페놀 (TFP/PFP-에스테르) 및 N-카복시무수물 (NCA's). 다른 적합한 예비형성된 활성화 에스테르는 업계에서의 통상의 기술자에게 공지되어 있다.
화학식 I의 보편적인 돌라스타틴 코어에 대해
Figure pct00006
I
R1, R2, R3, R4 R5 및 R8는 각각 H, C1-C6 알킬, C1-C6 치환된 알킬, -OR11, -NR11R12, -SR11 및 할로로부터 독립적으로 선택되고; R11 및 R12는 H, C1-C6 알킬로부터 독립적으로 선택되고; R6 및 R7는 각각 독립적으로 H 또는 C1-C4 알킬; R9는 H 또는 산 보호기, 및 R10는 H 또는 아미노 보호기이다.
아민 (A)은 알킬아민, 알칸올아민, 아릴알칸올아민, 아미노산, 아미노산 유도체, 펩티드 및 펩티드 유도체로부터 선택될 수 있다. 아민(A)이 펩티드 또는 펩티드 유도체인 경우, 길이는 2 내지 6개의 아미노산 잔기인 것이 바람직하다. 다양한 실시양태에서, 아민 (A)은 하나 이상의 치환기를 포함할 수 있고, 적합한 치환기는 C1-C6 알킬, 히드록시, C1-C6 알콕시, 아미노, 티올, C1-C6 알킬티오, 및 할로를 포함한다. 일부 실시양태에서, 아민 (A)는 보호기를 포함한다. 적합한 아민 보호기는, 비제한적으로, tert-부톡시카르보닐 기 (Boc), 9-풀루오레닐메톡시카르보닐 기 (Fmoc), 벤조일옥시카르보닐 기 (Cbz, Z), 및 알릴옥시카르보닐 (Alloc)를 포함한다. 적합한 카복실 보호기는, 비제한적으로, 단순 에스테르, 가령 메틸 에스테르, 에틸 에스테르, tert-부틸 에스테르, 및 벤질 에스테르, 또한, 예를 들어, 트리틸, 2,4-디메톡실베닐 (Dmb), 및 9-풀루오레닐메틸 (Fm)와 함께 형성된 에스테르를 포함한다. 다른 적합한 보호기는 업계에서의 통상의 기술자에게 공지되어 있다. 일부 실시양태에서, 아민 (A)은 스페이서, 링커 및 부착 기 중 하나 이상의 포함할 수 있다.
다양한 실시양태에서, 아민 (A)은 페닐알라닌, 페닐알라닌 유도체, 치환된 페닐알라닌, 치환된 페닐알라닌 유도체, 트립토판, 트립토판 유도체, 치환된 트립토판, 치환된 트립토판 유도체, 페닐프로판올아민, 보호된 페닐프로판올아민, 치환된 페닐프로판올아민, 보호된 치환된 페닐프로판올아민, 돌라페닌 및 보호된 돌라페닌, 치환된 돌라페닌, 보호된 치환된 돌라페닌, 돌라페닌 유도체, 보호된 돌라페닌 유도체, 치환된 돌라페닌 유도체, 보호된 돌라페닌 유도체로부터 선택된다.
카복실산 (CA)은 아미노산, 아미노산 유도체, 펩티드 및 펩티드 유도체로부터 선택될 수 있다. 카복실산 (CA)이 펩티드 또는 펩티드 유도체인 경우, 길이는 2 내지 6개의 아미노산 잔기인 것이 바람직하다. 일부 실시양태에서, 카복실산 (CA)은 하나 이상의 치환기를 포함하고, 적합한 치환기는 C1-C6 알킬, 히드록시, C1-C6 알콕시, 아미노, 티올, C1-C6 알킬티오, 및 할로를 포함한다. 일부 실시양태에서, 카복실산 (CA)은 보호기를 가질 수 있다. 적합한 카복실 보호기는, 비제한적으로, 단순 에스테르, 가령 메틸 에스테르, 에틸 에스테르, tert-부틸 에스테르, 및 벤질 에스테르, 또한, 예를 들어, 트리틸, 2,4-디메톡실베닐 (Dmb), 및 9-풀루오레닐메틸 (Fm)와 함께 형성된 에스테르를 포함한다. 적합한 아민 보호기는, 비제한적으로, tert-부톡시카르보닐 기 (Boc), 9-풀루오레닐메톡시카르보닐 기 (Fmoc), 벤조일옥시카르보닐 기 (Cbz, Z), 및 알릴옥시카르보닐 (Alloc)를 포함한다. 다른 적합한 보호기는 업계에서의 통상의 기술자에게 공지되어 있다. 일부 실시양태에서, 카복실산 (CA)은 스페이서, 링커 및 부착 기 중 하나 이상의 포함할 수 있다.
다양한 실시양태에서, 카복실산 (CA)은 발린, 보호된 발린, 치환된 발린, 보호된 치환된 발린, 발린 유도체, 보호된 발린 유도체, 치환된 발린 유도체, 보호된 치환된 발린 유도체, 알라닌, 보호된 알라닌, 치환된 알라닌, 보호된 치환된 알라닌, 알라닌 유도체, 보호된 알라닌 유도체, 치환된 알라닌 유도체 및 보호된 치환된 알라닌 유도체로부터 선택된다.
일부 바람직한 실시양태에서, 화학식 I의 화합물은
Figure pct00007
이고 R 기는 위에서 정의된 바와 같다.
일부 바람직한 실시양태에서, 화학식 I의 화합물 내 R 기는 화학식 IA의 화합물을 생성하도록 선택된다:
Figure pct00008
.
또한 제공된 것은 화학식 II의 단리된 염:
Figure pct00009
II
여기서 R1, R2, R3, R4 R5 및 R8는 각각 독립적으로 H, C1-C6 알킬, C1-C6 치환된 알킬, -OR11, -NR11R12, -SR11 및 할로로부터 선택되고, R11 및 R12는 H 및 C1-C6 알킬로부터 독립적으로 선택되고, R6 및 R7는 각각 독립적으로 H 또는 C1-C4 알킬, R10는 H 또는 아미노 보호기; 그리고 Y+는 반대이온이다.
화학식 II의 단리된 염의 일부 실시양태에서, R1, R2, R3, R4 R5 및 R8는 각각 H, 메틸, 에틸, n-프로필, 이소-프로필, n-부틸, sec-부틸, tert-부틸, 및 iso-부틸로부터 독립적으로 선택되고; R6 및 R7는 각각 독립적으로 H 또는 메틸, R10는 H 또는 tert-부톡시카르보닐 (Boc)이고, Y+는 화학식 N+HR13R14R15의 암모늄 이온이고 여기서 R13은 임의로 치환된 C1-C8 알킬 및 임의로 치환된 C3-C8 시클로알킬로부터 선택되고; R14 및 R15는 독립적으로 H, 임의로 치환된 C1-C8 알킬 및 임의로 치환된 C3-C8 시클로알킬로부터 선택되고; 여기서 각각의 임의의 치환기는, 만약 존재한다면, 알킬 및 아릴로부터 선택된다.
제10 또는 11 항에 있어서 Y+ 디에틸암모늄 이온, 디부틸암모늄 이온, 디시클로헥실암모늄 이온, 메틸시클로헥실암모늄 이온 및 메틸벤질암모늄 이온으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 단리된 염.
일부 실시양태에서, 화학식 II의 단리된 염은 다음 구조를 가지고
Figure pct00010
여기서 R 기는 위에서 정의된 바와 같다.
바람직한 실시양태에서, 화학식 II의 단리된 염은 다음 구조를 가진다
Figure pct00011
또한, 본원에 기재된 보편적인 돌라스타틴 코어의 제조뿐만 아니라 돌라스타틴, 아우리스타틴 및 관련 화합물의 대안적인 제조 방법 모두에 유용한 추가 화합물이 제공된다. 이들 화합물은 본원에 기술된 보편적인 돌라스타틴 코어의 제조에서 중간체이다. 이러한 중간체의 사용은 고순도 돌라스타틴 코어뿐만 아니라 고순도 돌라스타틴 및 아우리스타틴 화합물을 생성한다. 고순도 화합물을 생성하는데 있어서의 유용성은 보편적인 돌라스타틴 코어의 합성을 넘어 확장된다는 것이 또한 밝혀졌다; 이들 화합물은 또한 다른 경로를 통해 고순도 돌라스타틴 및 아우리스타틴 화합물을 생산하는 다른 방법에 적합하다.
화학식 III의 화합물이 본원에 제공되고:
Figure pct00012
III
여기서 R1, R2, R3, R5 및 R8는 각각 H, C1-C6 알킬, C1-C6 치환된 알킬, -OR11, -NR11R12, -SR11 및 할로로부터 독립적으로 선택되고, R11 및 R12는 H 및 C1-C6 알킬로부터 독립적으로 선택되고, R6 및 R7는 각각 H 또는 C1-C4 알킬로부터 독립적으로 선택되고, Z-는 반대이온이다. 일부 실시양태에서, 화학식 III의 화합물은 용액이다. 다른 실시양태에서, 화학식 III의 화합물은 단리될 수 있다. 염 형태는 대규모 분리 및 정제를 용이하게 한다. 결정화를 통해 컬럼 크로마토그래피의 기능 이상으로 불순물을 제거할 수 있다. 염은 고순도의 벤치 안정 고체인 반면 유리 염기는 오일이다. 이 염을 사용하면 컬럼 크로마토그래피가 필요한 방법에 비해 훨씬 더 큰 규모의 생산이 가능하다.
화학식 III의 일부 실시양태에서, R1, R2, R3, R5 및 R8는 각각 H, 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, sec-부틸, 이소-부틸, 및 tert-부틸로부터 독립적으로 선택되고; R6 및 R7는 각각 H, 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, sec-부틸, 이소-부틸, 및 tert-부틸로부터 독립적으로 선택되고; 그리고 Z-은 할라이드, 설페이트, 수소 설페이트, 포스페이트, 수소 포스페이트, 디수소 포스페이트, 메실레이트, 토실레이트, 벤젠 설포네이트, 에틸설포네이트, 니트레이트, 포르메이트, 아세테이트, 트리플루오로아세테이트, 옥살레이트, 및 시트레이트로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 화학식 III의 화합물은
Figure pct00013
이고 여기서 R 기 및 Z-는 위에서 정의된 바와 같다.
바람직한 실시양태에서, 화학식 III의 화합물은 다음이다:
Figure pct00014
.
또한, 먼저 화학식 III의 화합물을 수성 염기와 접촉시켜 반대이온을 제거하는 단계, 및 이후 화학식 III의 화합물을 N-보호된 아미노산 N-카복시무수물과 접촉시켜 화학식 IV의 화합물을 얻는 단계:
Figure pct00015
IV
여기서 R1, R2, R3, R5, R6, R7 및 R8는 위에서 정의된 바와 같고; R16는 아미노산 측쇄, 및 R17는 보호기임, 에 의해 아미노산을 화학식 III의 화합물
Figure pct00016
III
여기서 R1, R2, R3, R5 및 R8는 각각 H, C1-C6 알킬, C1-C6 치환된 알킬, -OR11, -NR11R12, -SR11 및 할로로부터 독립적으로 선택되고; R11 및 R12는 H 및 C1-C6 알킬로부터 독립적으로 선택되고; R6 및 R7는 각각 H 또는 C1-C4 알킬로부터 독립적으로 선택되고, Z-는 반대이온임;에 커플링하는 방법이 제공된다. 다양한 실시양태에서, 수성 염기는 Na2CO3, NaHCO3, NaOH, Na2HPO4, 및 Na3PO4로부터 선택된다. Boc-NCA 커플링은 작동상 편리하고 화학식 IV의 화합물의 분리를 용이하게 하고, 반응이 완료되고 부산물이 수성 후처리에 의해 쉽게 퍼징된다. HATU 매개 커플링의 경우 5-10%에 비해 Boc-NCA를 사용하면 0.5% 미만의 에피머화가 관찰된다. 이것은 HATU가 에피머화를 최소화하기 위해 선호되는 커플링제이기 때문에 특히 주목할 만하다. 부분입체 이성질체 불순물은 제거하기 어렵기 때문에 이것은 특히 중요하다.
이 방법의 일부 실시양태에서, 출발 화합물 III, 및 최종 화합물, IV는, 각각 H, 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, sec-부틸, 이소-부틸, 및 tert-부틸로부터 독립적으로 선택되는 R1, R2, R3, R5 및 R8를 갖고; R6 및 R7는 각각 H, 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, sec-부틸, 이소-부틸, 및 tert-부틸로부터 독립적으로 선택되고, Z-은 할라이드, 설페이트, 수소 설페이트, 포스페이트, 수소 포스페이트, 디수소 포스페이트, 메실레이트, 토실레이트, 벤젠 설포네이트, 에틸설포네이트, 니트레이트, 포르메이트, 아세테이트, 트리플루오로아세테이트, 옥살레이트, 및 시트레이트로부터 선택된고, 및 N-보호된 아미노산 N-카복시무수물은 Boc- 보호된 아미노산 N-카복시무수물이고, 및 수성 염기는 Na2CO3, NaHCO3, NaOH, Na2HPO4, 및 Na3PO4 ,로부터 선택되고 바람직하게는 Na2CO3이다.
여전히 다른 실시양태에서, 화학식 III의 화합물은
Figure pct00017
수성 염기는 Na2CO3이고, N-보호된 아미노산 N-카복시무수물은 Boc-Val-NCA이고, 화학식 IV의 화합물은 다음이다:
Figure pct00018
IV.
또한 제공된 것은 칼럼 크로마토그래피 사용 없이 화학식 V의 결정성 화합물을 제조하는 방법이고, 이 방법은 화학식 V의 미정제 히드록시 산을 제공하는 단계
Figure pct00019
V
여기서 R2, R3, 및 R5는 각각 H, C1-C6 알킬, C1-C6 치환된 알킬, -OR11, -NR11R12, -SR11 및 할로로부터 독립적으로 선택되고; R11 및 R12는 H, C1-C6 알킬로부터 독립적으로 선택되고, R6은 H 및 C1-C4 알킬로부터 선택됨; 미정제 히드록시 산을 가용성 용매에서 용해시키는 단계, 불용성 용매를 부가하는 단계, 결정화를 개시하는 단계, 및 결정화가 완료되도록 방치하여 화학식 V의 정제 히드록시 산을 얻는 단계를 포함한다. "가용성 용매"는 히드록시산이 용해되는 용매이고; 일부 실시양태에서, 가용성 용매는 히드록시산을 용해할 때 가열된다. "불용성 용매"는 히드록시산이 불용성인 용매이다. 바람직한 실시양태에서, 가용성 용매는 tert-부틸 메틸 에테르(MTBE)이고 불용성 용매는 헵탄이다. 일부 실시양태에서, 결정화는 히드록시산을 시딩함으로써 개시된다. 다른 실시양태에서, 결정화는 열 순환에 의해 개시된다. 여전히 다른 실시양태에서, 결정화는 시딩 및 열 순환의 조합에 의해 개시될 수 있다. 생성된 정제된 히드록시산은 결정질 고체로 단리될 수 있으며 추가 정제 없이 바로 사용할 수 있다 - 즉, 이 공정을 사용할 때 컬럼 크로마토그래피가 필요하지 않는다. 유리하게는, 결정화는 부분입체선택성의 완전한 제어를 허용하여 다운스트림 물질의 품질 및 순도를 개선하다.
일부 실시양태에서, 화학식 V의 히드록시 산은 다음이고
Figure pct00020
여기서 R2, R3 및 R5는 각각 H, 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, sec-부틸, 이소-부틸, 및 tert-부틸로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택되고; R6은 H 및 메틸로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 바람직한 실시양태에서, 가용성 용매는 뜨거운 MTBE이고 불용성 용매는 헵탄이다. 다양한 실시양태에서, 결정화는 시딩, 열 순환 또는 시딩 및 열 순환의 조합 에 의해 개시될 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 화학식 V의 히드록시 산은 다음이다
Figure pct00021
.
일부 실시양태에서, 방법은 화학식 V의 정제된 히드록시산을 단리하는 단계를 추가로 포함한다. 생성된 화학식 V의 정제된 히드록시산은 결정질 고체이다.
일부 실시양태에서, 방법은 임의의 단계에서 컬럼 크로마토그래피에 대한 필요 없이 화학식 V의 히드록시산의 합성을 포함한다. 예시적인 실시양태에서, 상기 나타낸 Ile-히드록시산은 N-Boc 이소류신으로 출발하여 합성된다. 이 방법은 N-Boc-이소류신을 모노-에틸 말로네이트와 축합하여 Ile-케토-에스테르를 제공하고, Ile-케토-에스테르를 환원시켜 Ile-히드록시-에스테르를 제공하고, Ile-히드록시-에스테르를 비누화하여 Ile-하이드록시산을 형성하는 단계를 포함한다. 그 다음 생성된 Ile-히드록시산을 가용성 용매에 미정제 Ile-히드록시산을 용해시키고, 불용성 용매를 첨가하고, 히드록시산을 시딩하여 결정화를 개시하고, 결정화가 완료되도록 방치하여 정제된 Ile-히드록시산을 수득함으로써 정제한다. 정제된 Ile-히드록시산을 임의로 여과하고 건조시켜 결정질 고체를 수득한다.
유리하게는, 이 방법은 컬럼 크로마토그래피에 대한 필요 없이 높은 부분입체선택성으로 화학식 V의 화합물을 제조하는 고도로 대량생산가능한 방법을 제공한다. 결정화 단계는 컬럼 크로마토그래피의 필요성을 제거하고 후속 사용을 위해 저장할 수 있는 결정 형태의 물질을 제공하다.
또한 제공된 것은 화학식 VI의 화합물:
Figure pct00022
VI
이고 여기서 R2, R3, 및 R5는 각각 H, C1-C6 알킬, C1-C6 치환된 알킬, -OR11, -NR11R12, -SR11 및 할로로부터 독립적으로 선택되고; R11 및 R12는 H, C1-C6 알킬로부터 독립적으로 선택되고, R6은 H 및 C1-C4 알킬로부터 선택되고; 그리고 R13은 임의로 치환된 C1-C8 알킬 및 임의로 치환된 C3-C8 시클로알킬로부터 선택되고; R14 및 R15는 독립적으로 H, 임의로 치환된 C1-C8 알킬 및 임의로 치환된 C3-C8 시클로알킬로부터 선택되고; 여기서 각각의 임의의 치환기는, 만약 존재한다면, 알킬 및 아릴로부터 선택된다. 염 형태는 대규모 분리 및 정제를 용이하게 한다. 결정화는 컬럼 크로마토그래피의 능력을 넘어서는 불순물 제거를 가능하게 한다. 염은 고순도의 벤치 안정 고체인 반면 유리 산은 오일이다.
일부 실시양태에서, 화학식 VI 화합물은
Figure pct00023
이고 여기서 R2, R3 및 R5는 각각 H, 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, sec-부틸, 이소-부틸, 및 tert-부틸로부터 독립적으로 선택되고, R6은 H 및 메틸로부터 선택되고; 그리고 NHR13R14R15은 디에틸암모늄 이온, 디부틸암모늄 이온, 디시클로헥실암모늄 이온, 메틸시클로헥실암모늄 이온 및 메틸벤질암모늄 이온으로부터 선택된다.
여전히 다른 실시양태에서, 화학식 VI의 화합물은:
Figure pct00024
이다.
유리하게는, 화학식 VI의 화합물은 고체로서 단리될 수 있다. 일부 실시양태에서, 화학식 VI의 화합물은 결정성 고체이다.
추가 제공된 것은 화학식 VII의 화합물
Figure pct00025
VII
이고 여기서 R1 및 R8는 H, C1-C6 알킬, C1-C6 치환된 알킬, -OR11, -NR11R12, -SR11 및 할로로부터 독립적으로 선택되고; R11 및 R12는 H, C1-C6 알킬로부터 독립적으로 선택되고; R7은 H 또는 C1-C4 알킬로부터 선택되고; 그리고 X-은 할라이드, 설페이트, 수소 설페이트, 포스페이트, 수소 포스페이트, 디수소 포스페이트, 메실레이트, 토실레이트, 벤젠 설포네이트, 에틸설포네이트, 니트레이트, 포르메이트, 아세테이트, 옥살레이트, 및 시트레이트로부터 선택된다. 염 형성은 이 물질이 유리 염기로 불안정하기 때문에 유리하다. 염의 물리적 특성은 반대 이온에 따라 다르다. 일부 염 형태에서 물질은 결정화될 때 불순물을 효율적으로 제거하는 고순도의 벤치 안정성 고체이다. 다른 염 형태는 점성 오일을 생성한다.
일부 실시양태에서, 화학식 VII의 화합물은
Figure pct00026
이고 여기서 R1 및 R8는 H, 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, sec-부틸, 이소-부틸, 및 tert-부틸로부터 독립적으로 선택되고, R7은 H 및 메틸로부터 선택되고; 그리고 X-는 할라이드, 바람직하게는 클로라이드이다.
여전히 다른 실시양태에서, 화학식 VII은
Figure pct00027
.
이고 이는 결정화될 때 불순물을 효율적으로 제거하는 고순도의 벤치 안정성 고체이다.
유리하게는, 화학식 VII의 화합물은 고체로서 단리될 수 있다. 일부 실시양태에서, 화학식 VII의 화합물은 결정성 고체이다.
또한 제공된 것은 화학식 VIII의 화합물:
Figure pct00028
VIII이다.
이 화합물은 vcMMAE 뿐만 아니라 다른 아우리스타틴 및 돌라스타틴의 단순화된 제조에 유리하게 사용될 수 있다.
또한 특정 관심 아우리스타틴을 제조하는 방법이 제공된다.
또한, 커플링제의 존재 하에서 코어 화합물을 노르에페드린과 접촉시켜 코어 화합물-노르에페드린 중간체를 형성하는 단계, 코어 화합물-노르에페드린 중간체를 탈보호시켜 탈보호된 코어 화합물-노르에페드린 중간체를 형성하는 단계, 탈보호된 코어 화합물-노르에페드린 중간체을 커플링제의 존재 하에서 N-Boc-N-Me-Val-OH와 접촉시켜 N-Boc-MMAE를 형성하는 단계, 및 N-Boc-MMAE를 탈보호시켜 MMAE을 얻는 단계에 의해, 하기 화학식 IA의 코어 화합물로부터 모노메틸 아우리스타틴 E를 제조하는 방법이 제공된다:
Figure pct00029
IA.
그런 다음 MMAE를 사용하여 vcMMAE를 제조할 수 있다. 예를 들어, MMAE는 커플링 첨가제의 존재 하에서 mc-Val-Cit-PABC-PNP와 접촉시킨다. 반응이 완료될 때까지 진행하고 생성물을 rp-HPLC로 정제한다.
추가 제공된 것은, 커플링제의 존재 하에서 코어 화합물을 노르에페드린과 접촉시켜 코어 화합물-노르에페드린 중간체를 형성하는 단계, 코어 화합물-노르에페드린 중간체를 탈보호시켜 탈보호된 코어 화합물-노르에페드린 중간체를 형성하는 단계, 탈보호된 코어 화합물-노르에페드린 중간체을 커플링제의 존재 하에서 mc-Val-Cit-PAB-N-Me-Val-OH와 접촉시켜 vcMMAE를 형성하는 단계에 의해, 화학식 IA의 코어 화합물로부터 vc-MMAE를 제조하는 방법이 제공된다:
Figure pct00030
IA.
또한 제공된 것은 코어 화합물을 커플링제의 존재 하에서 L-페닐알라닌 메틸 에스테르 염산과 접촉시켜 N-Boc-Val-Dil-Dap-Phe-OMe를 형성하는 단계, N-Boc-Val-Dil-Dap-Phe-OMe를 탈보호시켜 Val-Dil-Dap-Phe-OMe을 얻는 단계, Val-Dil-Dap-Phe-OMe을 커플링제의 존재 하에서 N-Boc-Me-Val-OH과 접촉시켜 N-Boc-N-Me-Val-Val-Dil-Dap-Phe-OMe를 형성하는 단계, 및 N-Boc-N-Me-Val-Val-Dil-Dap-Phe-OMe를 탈보호시켜 MMAF을 얻는 단계에 의해, 화학식 IA의 코어 화합물로부터 모노메틸 아우리스타틴 F를 제조하는 방법이 제공된다:
Figure pct00031
IA.
다른 아우리스타틴, 돌라스타틴 및 관련 화합물은 또한 본원에 기재된 것과 유사한 방법을 사용하여 제조될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "알킬"은 직쇄 또는 분지형 포화 탄화수소를 지칭한다. 대표적인 알킬 기는, 비제한적으로, -메틸, -에틸, -n-프로필, -n-부틸, -n-펜틸, -n-헥실 등을 포함하고; 예시적 분지형 일킬은, 비제한적으로, -이소프로필, -sec-부틸, -이소부틸, -tert-부틸, -이소펜틸 및 2-메틸부틸을 포함한다. 알킬기는 안정한 화합물을 생성하기 위해 이용가능한 임의의 지점에 부착될 수 있다. 용어 알킬은 또한 완전히 치환된 탄소를 포함하는 것을 의미한다.
용어 "아미노"는 -NH2뿐만 아니라 수소 원자 중 하나가 비수소 치환기로 대체된 "이치환된 아미노"를 지칭하고; 그리고 "삼치환된 아미노"(여기서, 두 수소 원자가 모두 동일하거나 상이할 수 있는 비-수소 치환기로 대체됨)를 포함한다.
용어 "아민(A)"은 구체적으로 본원에 기재된 범용 돌라스타틴 코어의 C-말단 카르복실산과 반응하는 아민-함유 화합물을 지칭한다. 아민 (A)는 알킬아민, 알칸올아민, 아릴알칸올아민, 아미노산, 아미노산 유도체, 및 펩티드로부터 선택될 수 있다. 다양한 실시양태에서, 아민 (A)은 하나 이상의 치환기를 포함할 수 있고, 적합한 치환기는 C1-C6 알킬, 히드록시, C1-C6 알콕시, 아미노, 티올, C1-C6 알킬티오, 및 할로를 포함한다. 일부 실시양태에서, 아민 (A)은 보호기를 포함한다. 보호기는 아민 보호기, 카르복실 보호기, 또는 측쇄 또는 다른 보호 가능한 위치 상의 보호기일 수 있다. 적합한 아민 보호기는, 비제한적으로, tert-부톡시카르보닐 기 (Boc), 9-풀루오레닐메톡시카르보닐 기 (Fmoc), 벤조일옥시카르보닐 기 (Cbz, Z), 및 알릴옥시카르보닐 (Alloc)를 포함한다. 적합한 카복실 보호기는, 비제한적으로, 단순 에스테르, 가령 메틸 에스테르, 에틸 에스테르, tert-부틸 에스테르, 및 벤질 에스테르, 또한, 예를 들어, 트리틸, 2,4-디메톡실베닐 (Dmb), 및 9-풀루오레닐메틸 (Fm)와 함께 형성된 에스테르를 포함한다. 다른 적합한 보호기는 업계에서의 통상의 기술자에게 공지되어 있다. 일부 실시양태에서, 아민 (A)은 페닐알라닌, 페닐알라닌 유도체, 치환된 페닐알라닌, 치환된 페닐알라닌 유도체, 트립토판, 트립토판 유도체, 치환된 트립토판, 치환된 트립토판 유도체, 페닐프로판올아민, 보호된 페닐프로판올아민, 치환된 페닐프로판올아민, 보호된 치환된 페닐프로판올아민, 돌라페닌 및 보호된 돌라페닌, 치환된 돌라페닌, 보호된 치환된 돌라페닌, 돌라페닌 유도체, 보호된 돌라페닌 유도체, 치환된 돌라페닌 유도체, 보호된 돌라페닌 유도체로부터 선택된다. 여전히 다른 실시양태에서, 아민은 바람직하게는 2 내지 6개의 아미노산 잔기를 갖는 펩티드일 수 있고, 아미노산 잔기는 천연 발생 아미노산, 비표준 아미노산, 치환된 아미노산 및 아미노산 유도체의 조합을 포함할 수 있고, 보호기를 포함할 수 있다.
용어 "아미노산"은 천연 발생 아미노산, 즉 표준 및 비표준 아미노산뿐만 아니라 화학적으로 합성된 아미노산을 모두 지칭하고, L- 및 D-이성질체 둘 다를 포함한다. 치환된 아미노산은 일반적으로 측쇄에 하나 이상의 치환기를 포함하는 아미노산이다. 아미노산 유도체는 α-아미노기 또는 아실기가 화학적으로 변형된 아미노산이다. 이러한 변형은 예를 들어 보호기, 스페이서, 링커, 또는 아미노산의 추가 변형에 유용한 기타 작용기의 추가를 포함할 수 있다. 보호된 아미노산은 α-아미노기, 아실기 또는 α-아미노기와 아실기 모두에 보호기를 갖는 아미노산 유도체이다. 적합한 아민 보호기는, 비제한적으로, tert-부톡시카르보닐 기 (Boc), 9-풀루오레닐메톡시카르보닐 기 (Fmoc), 벤조일옥시카르보닐 기 (Cbz, Z), 및 알릴옥시카르보닐 (Alloc)를 포함한다. 적합한 카복실 보호기는, 비제한적으로, 단순 에스테르, 가령 메틸 에스테르, 에틸 에스테르, tert-부틸 에스테르, 및 벤질 에스테르, 또한, 예를 들어, 트리틸, 2,4-디메톡실베닐 (Dmb), 및 9-풀루오레닐메틸 (Fm)와 함께 형성된 에스테르를 포함한다.
용어 "아릴"은 탄소환식 방향족 기를 지칭한다. 아릴 기의 예는 비제한적으로, 페닐, 나프틸 및 안트라세닐을 포함한다. 다양한 실시양태에서, 카복실산 (CA)은 아미노산, 아미노산 유도체, 펩티드 및 펩티드 유도체로부터 선택된다.
본원에 사용된 용어 "카르복실산(CA)"은 구체적으로 본원에 기재된 방법에서 보편적인 돌라스타틴 코어의 N-말단과 반응하는 카르복실산 함유 화합물을 지칭한다. 카복실산 (CA)은 아미노산, 아미노산 유도체, 펩티드 및 펩티드 유도체로부터 선택될 수 있다. 카복실산 (CA)이 펩티드 또는 펩티드 유도체인 경우, 길이는 2 내지 6개의 아미노산 잔기인 것이 바람직하다. 일부 실시양태에서, 카복실산 (CA)은 하나 이상의 치환기를 포함하고, 적합한 치환기는 C1-C6 알킬, 히드록시, C1-C6 알콕시, 아미노, 티올, C1-C6 알킬티오, 및 할로를 포함한다. 일부 실시양태에서, 카복실산 (CA)은 보호기를 가질 수 있다. 보호기는 카르복실 보호기, 아민 보호기, 또는 측쇄 또는 다른 보호 가능한 위치 상의 보호기일 수 있다. 적합한 카복실 보호기는, 비제한적으로, 단순 에스테르, 가령 메틸 에스테르, 에틸 에스테르, tert-부틸 에스테르, 및 벤질 에스테르, 또한, 예를 들어, 트리틸, 2,4-디메톡실베닐 (Dmb), 및 9-풀루오레닐메틸 (Fm)와 함께 형성된 에스테르를 포함한다. 적합한 아민 보호기는, 비제한적으로, tert-부톡시카르보닐 기 (Boc), 9-풀루오레닐메톡시카르보닐 기 (Fmoc), 벤조일옥시카르보닐 기 (Cbz, Z), 및 알릴옥시카르보닐 (Alloc)를 포함한다. 다른 적합한 보호기는 업계에서의 통상의 기술자에게 공지되어 있다. 일부 실시양태에서, 카복실산 (CA)은 스페이서, 링커 및 부착 기 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
용어 "커플링제"는 아미노산의 α-아미노기 또는 보편적인 돌라스타틴 코어의 N-말단 아민과 같은 아미노기와의 반응을 촉진하기 위해 카르복실산의 카르복실 모이어티를 활성화하기 위해 사용되는 펩티드 커플링 시약을 지칭한다. 본원에 제공된 방법에 사용되는 적합한 커플링제는 카르보닐디이미다졸(CDI), 프로필포스폰산 무수물(T3P) 용액 및 HATU를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 다른 적합한 커플링제는 업계에서의 통상의 기술자에게 공지되어 있다. 커플링제는 일반적으로 디이소프로필에틸아민(DIPEA) 및 N-메틸모르폴린(NMM)과 같은 염기의 존재 하에 사용된다.
용어 "커플링 첨가제"는 펩티드 결합의 형성을 촉진하는 것 외에도 부반응을 억제하고 라세미화를 감소시키는 펩티드 커플링 시약을 지칭한다. 본원에 기재된 반응에 유용한 커플링 첨가제는 N-히드록시숙신이미드 (HOSu), N-히드록시-5-노르보르넨-2,3-디카복시미드 (HONB), 1-히드록시벤조트리아졸 (HOBt), 6-클로로-1-히드록시벤조트리아졸 (6-Cl-HOBt), 1-히드록시-7-아자벤조트리아졸 (HOAt), 3-히드록시-4-옥소-3,4-디히드로-1,2,3-벤조트리아진 (HODhbt), 이의 아자 유도체 (HODhat), 및 2-피리디놀 1-옥사이드 (HOPO)를 포함한다. 커플링 첨가제는 일반적으로 2,6-루티딘, DIPEA 및 NMM과 같은 염기의 존재 하에 사용된다.
용어 "할로"는 불소, 염소, 브롬 및 요오드와 같은 주기율표 VIIa의 원소를 지칭한다. 용어 "할라이드"는 할로겐 이온을 나타낸다.
용어 "헤테로사이클릭"은 고리에 적어도 하나의 비-탄소 원자를 함유하는 임의의 알킬 또는 아릴 고리, 즉 각각 헤테로알킬 및 헤테로아릴을 지칭한다. 예시적인 비-탄소 원자는 비제한적으로, 산소, 질소 및 황을 포함하고; 헤테로사이클릭 고리는 고리에 2개 이상의 비탄소 원자를 포함할 수 있고; 그러한 경우에, 2개 이상의 비-탄소 원자는 동일하거나 상이할 수 있다.
용어 "링커"는 한쪽 말단에서 항체 또는 소분자 표적화 기에 부착되고 다른 말단에서 돌라스타틴 또는 아우리스타틴과 같은 세포독성제에 부착되도록 변형된 화학적 실체를 지칭한다. 통상적인 링커는 절단가능한 링커 및 절단불가능한 링커를 포함한다. 링커는 항체, 항체 단편 또는 다른 표적화 실체에 대한 부착을 위한 부착기, 및 예를 들어 절단가능한 부위에서 상호작용을 허용하는 스페이서를 포함할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "펩티드"는 2개 이상의 아미노산, 치환된 아미노산, 아미노산 유도체, 또는 표준, 비표준 및 화학적으로 합성된 아미노산을 포함하고, 아미드 결합으로 함께 연결된 L - 및 D-이성질체를 포함하는, 2 이상의 아미노산, 치환된 아미노산, 아미노산 유도체, 또는 치환된 아미노산 유도체이다. 펩티드은 N-말단 또는 C-말단에서 보호기를 포함할 수 있다. 적합한 아민 보호기는, 비제한적으로, tert-부톡시카르보닐 기 (Boc), 9-풀루오레닐메톡시카르보닐 기 (Fmoc), 벤조일옥시카르보닐 기 (Cbz, Z), 및 알릴옥시카르보닐 (Alloc)를 포함한다. 적합한 카복실 보호기는, 비제한적으로, 단순 에스테르, 가령 메틸 에스테르, 에틸 에스테르, tert-부틸 에스테르, 및 벤질 에스테르, 또한, 예를 들어, 트리틸, 2,4-디메톡실베닐 (Dmb), 및 9-풀루오레닐메틸 (Fm)와 함께 형성된 에스테르를 포함한다. 아민(A) 또는 카르복실산(CA)에 펩타이드, 치환 펩타이드, 펩타이드 유도체 또는 치환 펩타이드 유도체를 사용하는 경우, 2-6 아미노산 잔기인 것이 바람직하다.
용어 "치환기"는 예를 들어, 알킬, 시클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 아민 등의 수소 원자를 대체하는 임의의 기를 지칭한다. 치환기는 비제한적으로, 알킬, 치환된 알킬, 아릴, 헤테로아릴, 에테르, 아민, 아미드, 티올, 설파이드, 디설파이드, 할로 및 보호기와 같은 기를 포함할 수 있다. 여기서 기술된 방법에서 사용된 아민 (A) 및 카복실산 (CA)에 대한 적합한 치환기는 C1-C6 알킬, 예를 들어, 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, sec-부틸, 이소부틸, tert-부틸, 펜틸, 등, 히드록시, C1-C6 알콕시, 예를 들어, 메톡시, 에톡시, 등, 아미노, 티올, C1-C6 알킬티오, 및 할로를 포함한다.
실시예. 다음 실시예는 보편적인 돌라스타틴 코어 및 유용한 중간체의 합성의 예시이다.
실시예 1. N-Boc-돌라이소류신 메틸벤질아민 염의 제조.
Figure pct00032
THF (5 vol.) 내 N-Boc-이소류신 (100 g, 1 equiv.)의 냉각 용액 (7 °C)에 CDI (1 equiv.)를, 조금씩 충전했다. 반응물을 20 °C까지 데우고 4 h 동안 교반하고, 이후 0 °C까지 냉각했다. THF (15 vol.) 내 포타슘 모노-에틸 말로네이트 (2.2 equiv.)의 현탁액에 7 °C에서 무수 MgCl2 (2.75 equiv.)를, 조금씩 충전하고, 이후 20 °C까지 데우고 1 h 동안 교반했다. 이 현탁액을 0 °C까지 냉각하고, Et3N (3.15 equiv.)로 충전하고, 2 h 동안 0 °C에서 교반했다. 0 °C 이미다졸라이드 용액을 천천히 말로네이트 현탁액에 충전하고 온도를 ≤ 3 °C로 유지시켰다. 조합시킨 현탁액을 20 °C까지 데우고 18-72 h 동안 교반했다. 반응물을 10% (w/w) 수성 시트르산 (20 vol.)로 급냉하고, 내부 온도를 ≤ 23 °C로 유지시키고, 이후 감압 하에서 농축했다. 산성 수성 층을 MTBE로 추출했다(3 x 5 vol.). 조합시킨 유기 추출물을 20% (w/w) 수성 Na2CO3 (2 x 5 vol.)로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고 감압 하에서 농축하여 소정의 Ile-케토-에스테르 (95% 수율)를 추가 정제 없이 얻었다.
Figure pct00033
MeOH (5 vol.)를 ≤ -40 °C까지 냉각하고 KBH4 (2.0 equiv.)를 충전하고 -40 °C에서 30 min 동안 교반했다. MeOH (5 vol.) 내 Ile-케토-에스테르 (130 g, 1 equiv.)의 용액 및 천천히 KBH4 슬러리에 충전하고, 내부 온도를 ≤ -40 °C로 유지시켰다. 반응물을 5 h 동안 -40 °C에서 교반했다. 반응물을 내부 온도를 ≤ 8 °C로 하고 결과로 얻어진 pH 3-5에서 10% (w/w) 수성 시트르산 (20 vol.)의 교반 용액 충전으로 급냉했다. MeOH를 감압 하에서 제거하고, 남은 수성 상을 MTBE로 추출했다 (3 x 5 vol.). 조합시킨 유기 추출물을 20% (w/w) 수성 Na2CO3 (2 x 5 vol.)로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 감압 하에서 농축하여 소정의 Ile-히드록시-에스테르 (89% 수율, dr ≥ 13:1)를 추가 정제 없이 얻었다.
Figure pct00034
EtOH (5 vol.) 내 Ile-히드록시-에스테르 (118 g, 1 equiv.)의 RT 용액에 2.5 M 수성 NaOH (1.05 equiv.)를 충전했다. 반응물을 내부 온도 ≤ 23 °C에서 2.5 h 동안 교반했다. EtOH를 감압 하에서 제거하고 염기성 수성 상을 MTBE로 추출했다 (2 x 5 vol.). 조합시킨 유기 상을 2.5 M 수성 NaOH로 추출했다 (2 x 0.5 vol.). 수성 상을 조합시키고 H3PO4 (85 wt%, 1.5 equiv.)로 pH 4로 산성화했다. 산성화 수성 상의 MTBE로 추출했다 (3 x 5 vol.). 조합시킨 유기 추출물을 Na2SO4 상에서 건조시키고 감압 하에서 미정제 Ile-히드록시-산의 일정 중량으로 농축했다 (99% 수율). 미정제물의 얻어진 중량을 이후의 결정화에서 사용했다.
미정제 Ile-히드록시-산을 MTBE (2 vol.) 및 헵탄 (2 vol.) 내에 용해시키고, 이후 55 °C까지 데웠다. 헵탄 (4 vol.)을 충전하고, 온도 55 °C에서 유지시켰다. 혼합물을 45 °C까지 냉각하고 시딩했다 (0.5 wt%). 결정화 개시가 관찰된 후, 혼합물을 45 °C에서 2 h 동안 유지시키고, RT까지 1 h에 걸쳐 냉각하고, 강하게 다시 12 h 동안 교반하고, 이후 고체 생성물을 여과로 단리했다. 여과 케이크를 헵탄 (2 vol.)으로 세척하고 진공 하에서 건조시키고 소정의 Ile-히드록시-산을 얻었다 (75% 수율, dr > 99:1). 결정화 단계는 컬럼 크로마토그래피에 의한 정제의 필요성을 제거하여 안정적이고 견고한 생성물과 확장성을 제공하다.
Figure pct00035
무수 디메톡시에탄 (20 vol.) 내 Ile-히드록시-산 (5 g, 1 equiv.)의 냉각 (-45 °C) 용액에 LiHMDS (헥산 내 1.0 M, 4.0 equiv.)를 충전하고, 내부 온도 ≤ -45 °C를 유지시켰다. MeOTf (4.3 equiv.)를 이후 충전하고, 내부 온도를 ≤ -45 °C에서 유지시켰다. 반응물을 완료로 판정될 때까지 ≤ -45 °C에서 5 h 동안 교반했다. 반응물을 메탄올 (5 vol.) 및 10% (w/w) 수성 NaOH (4.0 equiv.)의 부가로 급냉하고, 내부 온도 ≤ -45 °C를 유지시키고, 이후 5 °C까지 데우고 완료로 판정될 때까지 교반했다. 반응 혼합물을 감압 하에서 농축하여 유기 용매를 제거하고 이후 헵탄 (20 vol.)로 희석하고, 이를 10% (w/w) 수성 NaOH로 추출했다 (2 x 5 vol.). 조합시킨 염기성 수성 상을 H3PO4의 부가로 pH 4로 조정하고 이후 1:1 헵탄/MTBE로 추출했다 (3 x 5 vol.). 조합시킨 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고 감압 하에서 미정제 N-Boc-Dil로 농축했다. 단리된 미정제물의 얻어진 중량을 이후의 크로마토그래피 단계에서 사용했다.
미정제 N-Boc-Dil을 최소량의 1:5 MTBE/헵탄을 사용하여 실리카(미정제 1g당 20g 이상의 실리카; 용리제로 평형화된 실리카)에 로딩하고 20% MTBE/ 헵탄/0.1% 아세트산으로 용리했다. 양의 분획을 조합시키고 압력을 가하여 감소시켰고, 그 결과로 얻어진 중량은 후속 재결정화에 사용되었다.
Figure pct00036
N-Boc-Dil (1 equiv.)를 헵탄 (10 vol.) 내에 용해시키고 50 °C로 30 min 동안 가열했다. S-α-메틸벤질아민 (0.95 equiv.)를 충전하고, 반응물을 37 °C까지 냉각하고, 이후 시딩했다 (0.5 wt%). 반응물을 20 °C까지 1 h에 걸쳐 냉각하고 부가적 6 h 동안 교반하고, 이후 고체 생성물을 여과로 단리했다. 여과 케이크를 헵탄 (2 vol.)으로 세척하고 진공 하에서 건조시키고 최종 N-Boc-Dil.메틸벤질아민을 얻었다.
실시예 2. O-벤질 에스테르 돌라프로인 염산 염의 제조.
Figure pct00037
THF (30 vol.) 내 (4R,5S)-(+)-4-메틸-5-페닐-2-옥사졸리디논 (100.0 g, 1 equiv.)의 용액을 -20 °C까지 냉각했다. 예비냉각 용액에 리튬 클로라이드 (1.1 equiv.), 이후 Et3N (1.3 equiv.)를 내부 온도 < -15 °C를 유지시키면서 부가했다. 프로피온산 무수물 (1.2 equiv.)를 내부 온도 < - 15 °C를 유지시키면서 30 min.에 걸쳐 부가했다. 혼합물을 23 °C까지 데우고 16 h 동안 교반했다. 반응물을 감압 하에서 농축하고 EtOAc (5 vol.) 및 0.2 M 수성 HCl (5 vol.) 사이에서 분배시켰다. 유기 층을 1 M 수성 NaHCO3 (2 x 2 vol.) 및 염수 (2 x 1 vol.)로 세척했다. 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과시키고 감압 하에서 농축하여 소정의 Evans-타입 옥사졸리디논 (130.1 g, 99%)를 점성, 밝은 황색 오일로서 얻었고 이를 추가 정제 없이 사용했다.
Figure pct00038
CH2Cl2 (10 vol.) 내 (4R,5S)-4-메틸-5-페닐-3-프로피오닐옥사졸리딘-2-온 (25.75 g, 1.1 equiv.)의 용액을 0 °C까지 냉각했다. 트리에틸아민 (1.5 equiv.)를 이 냉 반응 혼합물에 충전했고, 이후 반응 온도 < 4 °C를 유지시키면서 디부틸 붕소 트리플레이트 (CH2Cl2 내 1 M, 1.3 equiv.)를 부가했다. 반응물을 1 h 동안 0°C 에서 교반하고 이후 -70 °C까지 냉각했다. CH2Cl2 (6 vol.) 내 N-Boc-L-프로리날 (20.0 g, 1.0 equiv.)의 용액을 충전하고, 온도 < -60 °C를 유지시켰다. 반응물을 2 h 동안 -70 °C에서, 1 h 동안 -0 °C에서, 이후 15 min동안 실온에서 교반했다. 반응물을 0.1 M 수성 소듐 포스페이트 완충액 (pH=7, 8 vol.)으로 급냉하고, 이후 온도 < 10 °C를 유지시키면서 30% 수성 H2O2/MeOH (1:2, 30 vol.)을 천천히 부가하고 1 h 동안 교반했다. 혼합물을 탈이온수 (15 vol.)로 희석하고 감압 하에서 농축하여 유기 용매를 완전히 제거했다. 탈이온수 (15 vol.)를 잔사에 부가했다. 혼합물을 EtOAc로 추출했다 (3 x 15 vol.). 조합시킨 유기층을 1 M KHSO4 (15 vol.), 탈이온수 (15 vol.), 포화 수성 NaHCO3 (15 vol.) 및 염수 (15 vol.)로 세척했다. 차콜 (20 wt%)을 충전하고 여과로 제거했다. 여액을 감압 하에서 농축하여 Evans 알돌 부가물을 백색 발포물로서 얻었고 이를 추가 정제 없이 사용했다 (45 g).
Figure pct00039
무수 THF (13 vol.) 내 Evans 알돌 부가물 (50 g, 1.0 equiv.)의 용액에 물(3.3 vol.)을 충전하고 5 °C까지 냉각했다. 30% 수성 H2O2 (1 vol.)를 부가하고, 이후의 탈이온수 (2 vol.) 내 LiOH (1.6 equiv.)를 부가했다. 반응물을 5 h 동안 5°C에서 질소 분위기 하에서 교반했다. 반응물을 탈이온수 (5 vol.) 내 NaHSO3 (4 equiv.)의 부가로 급냉하고 16 h 동안 교반했다. 결과로 얻어진 혼합물을 포화 수성 NaHCO3로 pH 9로 조정하고 CH2Cl2로 세척했다 (2 x 10 vol.). 수성 층을 냉각하고 1 M 수성 KHSO4의 부가로 pH 2로 조정하고 EtOAc로 추출했다 (2 x 10 vol.). 조합시킨 EtOAc 추출물을 염수 (10 vol.)로 세척하고 이후 Na2SO4 상에서 건조시키고 감압 하에서 농축하여 N-Boc-Dap-히드록시-산을 황색 오일로서 얻었고 이를 추가 정제 없이 사용했다 (24 g).
Figure pct00040
무수 THF (20 vol.) 내 N-Boc-Dap-히드록시-산 (6.0 g, 1.0 equiv.)의 -50 °C 용액에 Me2SO4 (2.5 equiv.)를 부가하고, 이후 온도 < -50 °C를 유지시키면서 LiHMDS (THF 내 1 M, 2.5 equiv.)를 부가했다. 반응물을 실온까지 데우고 48 h 동안 질소 분위기 하에서 교반했다. 반응물을 10% 수성 NaOH의 부가로 급냉하고 12 h 동안 교반했다. 혼합물을 감압 하에서 농축하여 THF를 제거하고 1 M 수성 H3PO4의 부가로 pH 4로 조정했다. 산성화된 수성 층을 MTBE (3 x 10 vol.)로 추출하고 감압 하에서 농축하여 N-Boc-Dap를 황색 오일로서 얻었고 이를 추가 정제 없이 사용했다 (5.5 g).
Figure pct00041
DMF (8 vol.) 내 N-Boc-Dap (2.45 g, 1 equiv.)의 용액에 K2CO3 (2.0 equiv.), KI (0.1 equiv.) 및 벤질 클로라이드 (1.1 equiv.)를 부가했다. 반응물을 16 h 동안 RT에서 교반하고 이후 톨루엔 (5 vol.) 및 탈이온수 (5 vol.)의 부가로 급냉했다. 유기 층을 수집하고 수성 층을 톨루엔으로 추출했다 (5 vol.). 조합시킨 유기 층을 탈이온수 (5 vol.)로 세척하고 감압 하에서 농축했다. 잔사를 헵탄 내지 60:40 헵탄/EtOAc 구배로 용리하면서 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 (Sfar 50 g duo)를 통해 정제하여 N-Boc-Dap 벤질 에스테르를 무색 오일로서 얻었다 (2.84 g, 88%).
Figure pct00042
톨루엔 (5 vol.) 내 N-Boc-Dap 벤질 에스테르 (5.7 g, 1 equiv.)의 교반 용액에 CPME 내 3 M HCl (2.5 equiv.)를 부가했다. 16 h 동안 교반후, 반응물을 감압 하에서 농축하여 CPME 및 HCl를 제거했다. 잔사를 톨루엔 (5 vol.) 내에 용해시키고 80 °C로 가열했다. 용해 후, 반응물을 RT까지 냉각하고 고체 생성물을 여과로 단리했다. 고체를 톨루엔 (2 vol.)로 세척하고 건조시키고 O-Bn-Dap.HCl (2.9 g, 61%)를 백색 결정성 고체로서 얻었다.
실시예 3. Dil-Dap-O-Bn.HCl의 제조
Figure pct00043
CPME (4 vol.) 내 N-Boc-Dil.메틸벤질아민 (10 g, 1 equiv.)의 교반 혼합물을 4 M 수성 HCl (3 x 1.5 vol.) 및 탈이온수 (3 vol.)로 세척했다. 조합시킨 수성 세척액을 CPME (3 vol.)로 추출하고 조합시킨 유기 층을 일정 부피 증류 (10 vol.)로 건조시켰다. 교반 용액에 OBn-Dap.HCl (1 equiv.), NMI (1 equiv.), T3P (EtOAc 내 50% 용액, 1.5 equiv.) 및 DIPEA (3 equiv.)를 부가했다. 2 h 동안 교반 후 반응물을 4 M 수성 HCl (3 vol.)의 부가로 급냉하고 층을 분리했다. 유기 층을 4 M 수성 HCl (3 vol.) 이후 탈이온수 (3 vol.)로 세척했다. 조합시킨 수성 층을 CPME (3 vol.)로 추출하고 이후 조합시킨 유기 층을 일정 부피 증류 (10 vol.)로 건조시켰다. 교반 용액에 CPME 내 3 M HCl (5 equiv.)를 부가했다. 16 h 동안 교반 후 반응물을 농축했다. 잔사를 MTBE/CPME로부터 결정화하여 Dil-Dap-OBn.HCl를 백색 고체로서 얻었다 (8.6 g, 68%, 99.6 A%).
실시예 4. Dil-Dap-OBn.HCl로부터 단리된 보편적인 돌라스타틴 코어 N-Boc-Val-Dil-Dap-OH.DCHA의 제조
Figure pct00044
CH2Cl2 (4 vol.) 내 Dil-Dap-OBn.HCl의 용액을 20% 수성 Na2CO3 (3 x 2 vol.)로 세척하고 수성 층을 CH2Cl2 (2 vol.)로 추출했다. 조합시킨 유기 층을 탈이온수 (3 vol.)로 세척하고 일정 부피 증류 (10 vol.)로 건조시켰다. N-Boc-Val-NCA (1.5 equiv.)를 교반 용액에 부가하고 반응을 35 °C에서 16 h 동안 교반했다. 용매를 iPrOAc로 바꾸고 반응을 1 M 수성 NaHCO3 (5 vol.) 및 글리신 (5 equiv.)의 부가로 급냉했다. 유기 층을 1 M NaHCO3 (5 vol.) 및 탈이온수 (5 vol.)로 세척했다. N-Boc-Val-Dil-Dap-OBn 생성물을 이후의 단계에서 iPrOAc 내 용액으로서 사용했다.
Figure pct00045
iPrOAc (10 vol.) 내 N-Boc-Val-Dil-Dap-OBn (2 g, 1 equiv.) 교반 용액에 MeOH (1 vol.), 5% Pd/C (0.1 wt.), TEA (6 equiv.) 및 포름산 (5 equiv.)를 부가했다. 16 h 후 용액을 Celite를 통해 여과시키고 여액을 4 M 수성 HCl (3 x 5 vol.) 및 탈이온수 (5 vol.)로 세척했다. 용매를 80:20 헵탄/iPrOAc로 바꾸고 DCHA (1 equiv.)를 충전했다. 돌라스타틴 코어, N-Boc-Val-Dil-Dap-OH.DCHA, (75%, 99 A%)를 여과로 백색 결정성 고체로서 단리했다.
실시예 5. 보편적인 돌라스타틴 코어의 전체 제조
Figure pct00046
THF (5 vol.) 내 N-Boc-이소류신 (1 eq.) 냉각 용액 (0 oC)에 CDI (1 eq.)를 조금씩 충전했다. 반응물을 RT까지 데워지도록 방치하고 3 h 동안 교반했다. THF (15 vol.) 내 포타슘 모노에틸 말로네이트 (2.2 eq.)의 현탁액에 0 oC에서 Et3N (3.15 eq.) 및 무수 MgCl2 (2.75 eq.)를 부가했다. 현탁액을 RT까지 데워지도록 방치하고, 3 h 동안 교반하고 이후 0 oC까지 냉각했다. RT 이미다졸라이드 용액을 천천히 말로네이트 현탁액에 충전하고 온도를 NMT 5 oC에서 유지시켰다. 조합시킨 현탁액을 RT까지 데워지도록 방치하고 72 h 동안 교반했다. 반응물을 10% 수성 시트르산 (20 vol.)로 급냉하고 감압 하에서 농축하여 THF를 제거했다. 산성 수성 층을 MTBE로 추출했다(3 x 5 vol.). 조합시킨 유기 추출물을 sat. aq. NaHCO3 (5 vol.)로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고 감압 하에서 농축하여 소정의 생성물 (95% 수율)를 추가 정제 없이 얻었다.
Figure pct00047
메탄올 (5 vol.)를 NMT -40 oC까지 냉각하고 KBH4 (2 eq.)를 충전하고 NMT -40 oC에서 30 min 동안 교반했다. 케토-에스테르 (1 eq.)를 메탄올 (5 vol.) 내에 용해시키고 천천히 KBH4 슬러리에 충전하고 내부 온도 NMT -40 oC를 유지시켰다. 반응물을 4 h 동안 그 온도에서 교반하고 이후 10% 수성 시트르산 (20 vol.)의 교반 용액 충전으로 급냉했다. 결과로 얻어진 용액의 pH는 3-5였다. MeOH를 감압 하에서 제거하고 이후 수성 층을 MTBE로 추출했다 (3 x 5 vol.). 조합시킨 유기 추출물을 sat. aq. NaHCO3 (5 vol.)로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고 감압 하에서 농축하여 소정의 생성물 (89% 수율)를 추가 정제 없이 얻었다 (부분입체선택성 13:1).
Figure pct00048
EtOH (5 vol.) 내 Ile-히드록시-에스테르 (1 eq.)의 RT 용액에 10% 수성 NaOH (1.05 eq.)를 충전하고 물 (4 vol.)로 희석했다. 반응물을 RT 에서 2.5 h 동안 교반하고 이후 HPLC은 반응이 완료되었음을 나타냈다. EtOH를 감압 하에서 제거하고 염기성 수성 상을 MTBE로 추출했다 (2 x 5 vol.). 조합시킨 유기 상을 10% 수성 NaOH (0.5 vol.)로 추출하고 수성 추출물을 염기성 수성 상을 함유하는 생성물과 조합시켰다. 조합시킨 수성 상의 H3PO4 (85 wt%, 1.5 eq.)로 산성화하여 pH를 4로 조정했다. 산성화 수성 상의 MTBE로 추출했다 (3 x 5 vol.). 조합시킨 유기 추출물을 Na2SO4 상에서 건조시키고 감압 하에서 일정 중량으로 농축했다 (99% 수율).
단리된 생성물의 중량을 이후의 결정화에서 사용했다. 미정제 Ile-히드록시-산을 MTBE (2 vol.) 및 헵탄 (2 vol.) 내에 용해시키고 용액을 NMT 55 oC까지 데웠다. 헵탄 (4 vol.)를 충전하고 온도 NLT 50 oC를 유지시켰다. 부가 후 혼합물을 45 oC까지 냉각했다. 45 oC로 냉각후 결정화가 개시되었다 (자발적 또는 0.5wt%의 씨드 첨가). 결정화 후 개시가 관찰되었고 혼합물을 45 oC에서 2 h 동안 유지시키고 이후 RT까지 냉각했다. RT로 냉각후 슬러리를 강하게 12 h 동안 교반하고 이후 여과로 단리했다. 여과 케이크를 헵탄 (2 vol.)로 세척하고 진공 하에서 건조시켰다. 생성물을 dr > 99:1로 75% 수율로 단리했다.
Figure pct00049
무수 THF (20 vol.) 내 Ile-히드록시-산 (1 eq.)의 용액을 NMT -50oC까지 냉각하고 Me2SO4 (2.05 eq.)를 충전하고 온도 NMT -50 oC를 유지시켰다. LiHMDS (THF 내 1.0 M, 3.3 eq.)를 충전하고 온도 NMT -50 oC를 유지시켰다. 반응물을 RT까지 데워지도록 방치하고 밤새 교반했다. 반응물을 10% 수성 NaOH (10 eq.)의 부가로 급냉하고 12 h 동안 교반했다. 혼합물을 감압 하에서 농축하여 THF를 제거하고 이후 염기성 수성 상의 MTBE로 추출했다 (2 x 5 vol.). 수성 상의 H3PO4의 부가로 pH 4로 조정하고 MTBE로 추출했다 (3 x 5 vol.). 조합시킨 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고 감압 하에서 농축하고, 미정제 물질을 우수한 수율로 단리했다. N-Boc-Dil를 이후의 단계에서 결정화로 추가 정제했다.
Figure pct00050
N-Boc-Dil (1 eq.)를 헵탄 (10 vol.) 내에 용해시키고 50 oC로 가열했다. S-α-메틸벤질아민 (1 eq.)를 충전하고 반응을 35 oC까지 냉각했다. 35 oC에서 1 h 동안 교반 후 반응물을 RT까지 냉각하고 강하게 12 h 동안 교반했다. 고체를 여과로 단리하고 헵탄 (2 vol.)로 세척하고 고수율 (70%)로 염을 얻었다.
Figure pct00051
(4R,5S)-4-메틸-5-페닐-3-프로피오닐옥사졸리딘. 30 vol.의 테트라히드로푸란 내 (4R,5S)-(+)-4-메틸-5-페닐-2-옥사졸리디논 (100.0 g, 0.564 mol, 1 equiv)의 용액을 70% 수-MeOH/건조 얼음 배쓰 내에서 -20 °C까지 냉각했다. 예비냉각 용액에 리튬 클로라이드 (26.32 g, 0.621 mol, 1.1 equiv), 이후 트리에틸아민 (102.2 mL, 0.734 mol, 1.3 equiv)를 온도를 -15 °C 미만으로 유지하는 속도에서 부가했다. 프로피온산 무수물 (86.82 mL, 0.677 mol, 1.2 equiv)를 이후 온도를 -15 °C 미만으로 유지하는 속도에서 30 min에 걸쳐 부가했다. 혼합물을 이후 배쓰로부터 제거하고 실온에서 밤새 교반했다 (~15 h). 반응이 완료되면 (LCMS 또는 HPLC로 확인), 혼합물을 감압 하에서 농축했다. 혼합물을 이후 500 mL의 에틸 아세테이트 및 500 mL의 0.2 M 염산 사이에서 분배시켰다. 유기 층을 이후 수집하고 2 x 100 mL의 1 M 소듐 바이카보네이트 및 2 x 100 mL 염수로 세척했다. 유기 층을 수집하고 소듐 설페이트 상에서 건조시켰다. 감압 하에서 농축에 의해 최종 생성물 (130.1 g, 0.558 mol, 99%)를 점성, 약간 황색 오일로서 얻었다. 정제는 필요하지 않았다.
Figure pct00052
N-Boc-Pro-Xc. 4 vol의 MTBE 내 (4R,5S)-4-메틸-5-페닐-3-프로피오닐옥사졸리딘 (35.9 g, 0.164 mol, 1.3 equiv)의 용액을 얼음 배쓰 내에서 0 °C까지 냉각했다. 냉각 용액을 트리에틸아민 (34.8 mL, 0.201 mol, 2.0 equiv)으로 충전하고 이후 디클로로메탄 내 1.0 M 디부틸보릴 트리플루오로메탄설포네이트 용액 (150.0 mL, 0.150 mol, 1.20 equiv)을 온도를 5 °C 미만으로 유지하는 속도에서 조심스럽게 부가했다. 혼합물을 5 hrs 동안 교반하도록 방치했다. 5 hrs 후, 용액을 아세톤/건조 얼음 배쓰 내에서 -78 °C까지 냉각했다. 다음 25 mL의 MTBE 내 Boc-L-프로리날 (25.0 g, 0.125 mol, 1.0 equiv)의 용액을 제조하고 -78 °C까지 냉각했다. 냉각 용액을 이후 온도를 -60°C 미만으로 유지하는 속도에서 반응 혼합물에 캐눌라를 삽입했다. 반응물을 천천히 24 hrs 동안 실온까지 데워지도록 방치했다. 반응물을 이후 포스페이트 완충액 (pH=7, 50 mL)로 급냉하고, 이후 75 mL의 메탄올을 부가하고, 이후 0 °C까지 냉각했다. 냉각 용액에 30% 수성 수소 퍼옥사이드 및 메탄올 (1:2, 100 mL)의 용액을 내부 온도를 10 °C 미만으로 유지하는 속도에서 부가했다. 반응물을 이후 0 °C에서 1 hr 동안 교반했다. 반응물을 100 mL의 물로 급냉하고, 이후 감압 하에서 농축했다. 수성 혼합물을 이후 MTBE (2 x 100 mL)로 추출하고 유기 층을 조합시켰다. 유기 층을 이후 1 M 포타슘 바이설페이트 (2 x 30 mL), 포화 소듐 바이카보네이트 (2 x 30 mL), 및 염수 (2 x 30 mL)로 세척했다. 유기 층을 이후 수집하고 소듐 설페이트 상에서 건조시키고 이후 감압 하에서 농축했다. 미정제 생성물을 이후 10% 내지 30% 헵탄 내 에틸 아세테이트를 사용하여 Si 칼럼 크로마토그래피를 통해 정제하여 syn-부가물 (11.62 g, 0.027 mol, 22%)를 백색 발포물로서 얻었다.
Figure pct00053
N-Boc-Dap-Xc. 5 vol의 디클로로메탄 내 N-Boc-Dap-Xc (19.0 g, 0.044 mol, 1.0 equiv)의 용액을 얼음 배쓰 내에서 0 °C까지 냉각했다. 냉각 용액에 프로톤-스폰지 (28.3 g, 0.132 mol, 3.0 equiv), 이후 트리메틸옥소늄 테트라플루오로보레이트 (12.85 g, 0.087 mol, 2.0 eq)를 부가했다. 반응 혼합물을 실온까지 데워지도록 밤새 (~18 h) 방치했다. 반응물을 0 °C까지 냉각하고 0 °C까지 냉각된 30 mL의 물의 부가로 급냉했다. 반응물을 이후 celite의 패드를 통해 여과시키고, 여액을 감압 하에서 증발시키고 250 mL의 MTBE 및 200 mL의 물 사이에서 분배시켰다. 유기 층을을 분리하고, 수성 층을 3 x 20 mL의 MTBE로 추출했다. 유기 층을 조합시키고 1 M 수성 포타슘 바이설페이트 용액 (2 x 20 mL), 포화 소듐 바이카보네이트 용액 (2 x 20 mL), 및 염수 (2 x 20 mL)로 세척했다. 유기 층을 이후 소듐 설페이트 상에서 건조시키고 감압 하에서 농축하여 미정제 생성물을 오일로서 얻었다. 생성물을 이후 Si 칼럼 크로마토그래피 (0% 내지 15% 헵탄 내 에틸 아세테이트)를 통해 정제했다. N-Boc-Dap-Xc (11.54 g, 0.026 mol, 59%)를 투명한 오일로서 단리했다.
Figure pct00054
N-Boc-Dap-OBn. THF (9.2 mL) 내 n-BuLi의 용액(헥산 내 2.5M, 4.93 mL, 0.012 mol, 2.2 equiv)를 0 °C까지 냉각했다. 벤질 알콜 (2.55 mL, 0.025 mol, 4.3 eq)를 한방울씩 용액에 부가했다. 반응물을 0 °C에서 1 hr 동안 교반하도록 방치했다. 한편, THF 내 N-Boc-Dap-Xc (2.56 g, 5.73 mmol, 1.0 equiv)의 0.2 M 용액을 제조하고 0 C까지 냉각했다. BnOLi-BnOH를 반응 온도를 5 °C 미만으로 유지하는 속도에서 N-Boc-Dap-Xc 용액 내로 캐눌라 삽입했다. 반응물을 1-3 h 동안 HPLC에 의한 완료까지 교반하도록 방치했다. 반응 혼합물을 15 mL의 에틸 아세테이트로 희석하고 15 mL의 소듐 바이카보네이트의 느린 부가를 통해 급냉했다. 유기 층을을 분리하고 부가적 15 mL의 소듐 바이카보네이트, 이후 2 x 15 mL의 물 및 2 x 15 mL의 염수로 세척했다. 유기 층을 이후 수집하고 소듐 설페이트 상에서 건조시켰다. 용액을 회전 증발 하에서 농축하여 미정제 생성물을 얻었다. 미정제 생성물을 0-50% EtOAc/헵탄 구배를 사용하여 Si 칼럼 크로마토그래피를 통해 정제하여. 생성물 (1.78 g, 4.72 mmol, 82%)를 투명한 오일로서 단리했다.
Figure pct00055
OBn-Dap-HCl 염. N-Boc-Dap-OBn (5.7 g, 15 mmol, 1.0 equiv)를 5 vol의 톨루엔 내에 용해시켰다. 용액에 CPME 내 3 M 수소 클로라이드 용액 (12.6 mL, 2.5 equiv)를 부가했다. 반응 혼합물을 교반하도록 밤새 방치했다. 완료 후, 용액을 회전 증발 하에서 농축했다. 미정제 물질을 5 vol의 톨루엔 내에 취하고, 80 oC로 가열하고 이후 RT까지 냉각하도록 방치했다. 12 h 동안 RT에서 교반 후 생성물을 여과로 단리했다. 여과 케이크를 2 vol.의 톨루엔으로 세척하고 생성물을 백색 고체로서 얻었다 (2.9 g, >99% 순도, 62%).
Figure pct00056
N-Boc-Dil.아민 염 (1 eq.)를 CPME (10 vol.) 내에 용해시키고 2.0 M HCl (5 vol.)로 3회 및 H2O로 1회 세척하고, 조합시킨 수성 세척액을 CPME (10 vol.)로 추출하고 조합시킨 유기 층을 10 vol로 농축하여 이후 일정 부피를 수분 함유량이 <0.1%일 때까지 진공 증발시켰다. OBn-Dap.HCl (1 eq.)를, DIPEA (3.0 eq), 1-메틸이미다졸 (1.0 eq), 및 T3P (1.5 eq.) 이후 충전했다. 반응물을 RT O/N에서 교반하였고, 이때 HPLC 분석은 소정의 중간체가 형성되었음을 나타냈다. 반응물을 2.0 M HCl(5 vol.)로 2회 및 물(5 vol.)로 2회 세척한 다음, 물 함량이 <0.1%가 될 때까지 일정한 부피로 진공 증류시켰다. CPME 내 3.0 M HCl(7.5 당량)을 충전하고 반응물을 실온 O/N에서 교반하고, 이때 HPLC 분석은 소정의 생성물이 형성되었음을 나타냈다. HCl을 제거하고 용매를 MTBE로 교환하기 위한 일정한 부피의 진공 증류를 수행하고 MTBE로부터 생성물을 재결정화했다. 생성물을 여과에 의해 백색 고체로서 단리했다(70% 수율).
Figure pct00057
Dil-Dap-OBn.HCl를 DMF (15 vol.) 내에 용해시켰다. 이 용액에 N-Boc-Val (1.5 eq.), DIPEA (3 eq.) 및 COMU (1.9 eq.)를 충전했다. 반응물을 RT O/N에서 교반했다. 이후 반응물을 2 M 수성 HCl (10 vol.)의 부가로 급냉하고 EtOAc로 추출했다 (2 x 10 vol.). 조합시킨 유기층을 1 M 수성 NaHCO3 (10 vol.)로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고 감압 하에서 농축했다. 미정제 물질을 헵탄 내 EtOAc 구배로 칼럼 크로마토그래피 (25 g/g 로딩)로 정제했다. N-Boc-Val-Dil-Dap-OBn를 투명한 오일로서 단리했다 (72%).
Figure pct00058
N-Boc-Val-Dil-Dap-OBn를 MeOH (10 vol.) 용해시키고 활성탄 페이스트 유형 487-10R487(0.1당량)에 10% 팔라듐을 충전했다. 트리에틸아민 (10 eq.) 및 포름산 (9 eq.)을 부가하고 반응을 RT에서 48 h 동안 교반했다. 셀라이트(1 wt.)를 부가하고 MeOH로 헹구면서 셀라이트 패드를 통해 반응물을 여과했다. 여액을 농축하고 0.1% AcOH 첨가제를 포함하는 헵탄 중 EtOAc 구배를 사용하는 컬럼 크로마토그래피(25g/g 로딩)로 정제했다. N-Boc-Val-Dil-Dap-OH를 95% 수율로 단리했다.
실시예 6. 모노메틸아우리스타틴 E (MMAE)의 제조에서 보편적인 돌라스타틴 코어의 사용
A. Val-Dil-Dap-(1S,2R)-(+)-노르에페드린의 제조
iPrOAc (10 vol.) 내 N-Boc-Val-Dil-Dap-OH.DCHA (실시예 4) (1 g, 1 equiv.)의 용액을 4 M 수성 H3PO4 (2 x 2 vol.) 이후 탈이온수 (2 vol.)로 세척하고 유기 층을 Na2SO4로 건조시키고, 여과시키고 감압 하에서 농축했다. 잔사에 iPrOAc (10 vol.), (1S,2R)-(+)-노르에페드린 (1.2 equiv.), NMI (1 equiv.), DIPEA (1.5 equiv.) 및 T3P (EtOAc 내 50%, 2 equiv.)를 부가했다. RT에서 2 h 동안 교반 후 반응물을 2 M 수성 HCl (10 vol.)의 부가로 급냉하고 층을 분배시켰다. 유기 층을 2 M 수성 HCl (10 vol.) 이후 20% 수성 Na2CO3 (10 vol.)로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과시키고 감압 하에서 농축했다. 잔사를 톨루엔 (10 vol.) 및 CPME 내 3 M HCl (5 equiv.) 내에 용해시켰다. RT에서 72 h 동안 교반 후 반응물을 1 M 수성 NaHCO3의 부가로 pH 9로 급냉하고 층 분배시켰다. 수성 층을 iPrOAc (3 x 10 vol.)로 추출하고 조합시킨 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과시키고 농축하여 이후의 단계에서 추가 정제 없이 사용할 수 있는 Val-Dil-Dap-(1S,2R)-(+)-노르에페드린 (650 mg, 80%)를 얻었다.
B. N-Boc-MMAE의 제조
DMF (10 vol.) 내 Val-Dil-Dap-(1S,2R)-(+)-노르에페드린 (100 mg, 1 equiv.)의 교반 용액에 HATU (1.5 equiv.), N-Boc-N-Me-Val-OH (1.5 equiv.), 및 DIPEA (2.5 equiv.)를 충전했다. RT에서 16 h 동안 교반 후 반응물을 2 M 수성 HCl (10 vol.)의 부가로 급냉했다. EtOAc (10 vol.)를 충전하고 층을 분배시켰다. 수성 층을 EtOAc (2 x 10 vol.)로 추출하고 조합킨 유기 층을 1 M 수성 NaHCO3 (10 vol.)로 세척했다. 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과시키고 감압 하에서 농축했다. 잔사를 80:20 EtOAc/헵탄 내지 80:20 EtOAc/EtOH 구배로 용리하면서 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 (Sfar HC 10 g)로 정제했다. 생성물 함유 분획을 조합시키고 감압 하에서 농축하여 N-Boc-MMAE (130 mg, 96%)를 무색 오일로서 얻었다.
C. MMAE의 제조
톨루엔 (20 vol.) 내 Boc-MMAE (130 mg, 1 equiv.)의 교반 용액에 4 M 디옥산 내 HCl (5 equiv.)를 부가했다. RT에서 16 h 동안 교반 후 반응물을 1 M 수성 NaHCO3의 부가로 pH 9로 급냉하고 층 분배시켰다. 수성 층을 EtOAc (3 x 10 vol.)로 추출하고 조합시킨 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과시키고 농축하여 미정제 MMAE를 얻었다. 잔사를 60/40 EtOAc/헵탄 내지 80:20 EtOAc/EtOH 구배로 용리하면서 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 (Sfar HC 10 g)로 정제했다. 생성물 함유 분획을 조합시키고 감압 하에서 농축하여 MMAE (100 mg, 80%)를 무색 오일로서 얻었다. 정제된 물질의 일부를 분취용 rp-HPLC(물 및 아세토니트릴 중 0.05% 포름산, YMC PackPro C18, 250 x 20 mm, 10 μm)로 단리했다. 구조는 1H NMR(문헌과 일치하는 스펙트럼) 및 고분해능 질량 분석에 의해 확인되었다 (ESI, m/z = 718.5136; calc. [M+H]+ 718.5113).
실시예 7. MMAE로부터 vcMMAE의 제조
DMF (10 vol.) 내 MMAE (36 mg, 1 equiv.)의 교반 용액에 mc-Val-Cit-PABC-PNP (1.1 equiv.), HOPO (1.1 equiv.) 및 2,6-루티딘 (2 vol.)를 부가했다. 실온에서 밤새 교반한 후 물질을 분취용 rp-HPLC(물 및 아세토니트릴 중 0.05% 포름산, YMC PackPro C18, 250 x 20 mm, 10 μm)로 정제했다. 양성 분획을 동결건조하여 vcMMAE(65 mg, 98%)를 단리하고 1H NMR(문헌과 일치하는 스펙트럼) 및 고해상도 질량 분석기로 구조를 확인했다 (ESI, m/z = 1316.7820; calc. [M+H]+ 1316.7864).
실시예 8. vcMeVal-OH의 제조
Figure pct00059
신틸레이션 바이알에 N-메틸-L-발린(6.2 당량) 및 mc-Val-Cit-PABC-PNP(500 mg, 1.0 당량)를 첨가했다. 바이알을 질소(x 3)로 퍼징하고, 고체를 2,6-루티딘(4.0 vol.) 및 DMF(4.0 vol.)에 현탁시켰다. 고체 HOPO(1.2 당량)를 한번에 첨가하고, 용기를 밀봉하고, 반응물을 48시간 동안 강하게 교반했다. 반응물을 MTBE(200vol.)에 붓고, 생성된 혼합물을 진공 여과(MTBE로 세척)하여 회색 고체를 전달했다. 고체를 최소 AcOH(4.0 vol.)에 가용화하고, 생성된 용액을 실리카겔 상에서 크로마토그래피로 정제하여(CH2Cl2중 5% MeOH 내지 20%) mc-Val-Cit-PAB-N-Me-Val-OH를 담황색 잔사로서 제공했다 (200 mg).
실시예 9. Val-Dil-Dap-(1S,2R)-(+)-노르에페드린로부터 vcMMAE의 제조
DMF (10 vol.) 내 Val-Dil-Dap-(1S,2R)-(+)-노르에페드린 (50 mg, 1 equiv.)의 교반 용액에 mc-Val-Cit-PAB-N-Me-Val-OH (1.5 equiv.), HATU (1.5 equiv.) 및 2,6-루티딘 (10 vol.)를 부가했다. 반응물을 O/N 교반하고 분취용 rp-HPLC(물 및 아세토니트릴 중 0.05% 포름산, YMC PackPro C18, 250 x 20 mm, 10 μm)로 정제했다. 화합물을 단리하고(20mg, 20%) 구조를 HPLC(이전 vcMMAE 물질과 일치하는 체류 시간) 및 고분해능 질량 분석법으로 확인했다(ESI, m/z = 1316.7766; calc. [M+H]+ 1316.7864).
실시예 10. 보편적인 돌라스타틴 코어로부터 Val-Dil-Dap-Phe-OMe의 제조
iPrOAc (10 vol.) 내 N-Boc-Val-Dil-Dap-OH.DCHA (실시예 4) (0.525 g, 1 equiv.)의 용액을 4 M 수성 H3PO4 (2 x 2 vol.) 이후 탈이온수 (2 vol.)로 세척하고 유기 층을 Na2SO4로 건조시키고, 여과시키고 감압 하에서 농축했다. 잔사에 iPrOAc (10 vol.), L-페닐알라닌 메틸 에스테르 염산 (1.1 equiv.), NMI (1 equiv.), DIPEA (2.5 equiv.) 및 T3P (EtOAc 내 50%, 2 equiv.)를 부가했다. RT에서 O/N 교반 후 반응물을 2 M 수성 HCl (10 vol.)의 부가로 급냉하고 층을 분배시켰다. 유기 층을 2 M 수성 HCl (10 vol.) 이후 20% 수성 Na2CO3 (10 vol.)로 세척하고 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과시키고 감압 하에서 농축했다. 잔사를 톨루엔 (5 vol.), 1,4-디옥산 (5 vol.) 및 3 M CPME 내 HCl (5 equiv.) 내에 용해시켰다. RT에서 16 h 동안 교반 후 반응물을 1 M 수성 NaHCO3의 부가로 pH 9로 급냉하고 층 분배시켰다. 수성 층을 iPrOAc (3 x 10 vol.)로 추출하고 조합시킨 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과시키고 농축하여 추가 정제 없이 사용할 수 있는 Val-Dil-Dap-Phe-OMe (350 mg, 80%)를 얻었다.
실시예 11. 모노메틸아우리스타틴 F (MMAF)의 제조
A. Boc-MMAF-OMe의 제조
DMF (10 vol.) 내 Val-Dil-Dap-Phe-OMe (100 mg, 1 equiv.)의 교반 용액에 HATU (1.1 equiv.), N-Me-Val-OH (1.1 equiv.) 및 2,6-루티딘 (10 vol.)를 충전했다 RT에서 2 h 동안 교반 후 반응물을 2 M 수성 HCl (10 vol.)의 부가로 급냉했다. EtOAc (10 vol.)를 부가하고 층 분배시켰다. 수성 층을 EtOAc (2 x 10 vol.)로 추출하고 조합시킨 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과시키고 감압 하에서 농축했다. 잔사를 80:20 EtOAc/헵탄 내지 80:20 EtOAc/EtOH 구배로 용리하면서 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 (Sfar HC 10 g)로 정제했다. 양성 분획의 농축으로 Boc-MMAF-OMe (124 mg, 93%)를 무색 잔사로서 얻었다.
B. MMAF의 제조
톨루엔 (8 vol.) 및 1,4-디옥산 (8 vol.) 내 Boc-MMAF-OMe (124 mg, 1 equiv.)의 교반 용액에 CPME 내 3 M HCl (16 vol.)를 부가했다. 반응물을 RT에서 16 h 동안 교반하고 20% 수성 Na2CO3의 부가로 pH 11로 급냉했다. 혼합물을 iPrOAc (3 x 10 vol.)로 추출하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과시키고 감압 하에서 농축했다. 잔사를 4 M 수성 HCl (20 vol.) 및 AcOH (20 vol.) 내에 용해시키고 RT에서 24 h 동안 교반했다. 반응을 분취용 rp-HPLC(물 및 아세토니트릴 중 0.05% 포름산, Phenomenex Kinetex F5, 150 x 21.2 mm, 5 μm)로 정제했다. 고순도 분획을 조합시키고 동결건조하여 MMAF(7 mg, 5%)를 생성했다. 구조는 1H NMR(문헌과 일치하는 스펙트럼) 및 고분해능 질량 분석에 의해 확인되었다 (ESI, m/z = 732.4901; calc. [M+H]+ 732.4906).
본 명세서에 제공된 모든 예는 본질적으로 예시적이며 청구범위에 의해 정의된 바와 같은 본 발명의 범위를 제한하는 것을 의미하지 않는다.

Claims (32)

  1. 다음 단계를 포함하는 돌라스타틴, 아우리스타틴 또는 관련 화합물 제조 방법:
    화학식 I의 화합물, 또는 이의 염을 제공하는 단계,
    Figure pct00060
    I
    여기서
    R1, R2, R3, R4 R5 및 R8는 각각 H, C1-C6 알킬, C1-C6 치환된 알킬, -OR11, -NR11R12, -SR11 및 할로로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택되고,
    R11 및 R12는 H, C1-C6 알킬로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택되고,
    R6 및 R7는 각각 독립적으로 H 또는 C1-C4 알킬,
    R9는 H 또는 산 보호기, 및
    R10는 H 또는 아미노 보호기;
    만약 R9가 산 보호기이면, C-말단 카복실산 기를 탈보호시키는 단계,
    C-말단 카복실산 기를 아민 (A)과 반응시켜 아미드 결합을 형성하는 단계 ;
    만약 R10가 아미노 보호기이면, N-말단 아민을 탈보호시키는 단계,
    N-말단 아민을 카복실산 (CA)과 반응시켜 아미드 결합을 형성하는 단계.
  2. 제 1항에 있어서
    만약 R9가 산 보호기이면, C-말단 카복실산 기를 탈보호시키고, 이후
    C-말단 카복실산 기를 아민 (A)과 반응시켜 아미드 결합을 형성하는 단계;가
    만약 R10가 아미노 보호기이면, N-말단 아민을 탈보호시키고, 이후
    N-말단 아민을 카복실산 (CA)과 반응시켜 아미드 결합을 형성하는 단계
    전에 수행되는 방법.
  3. 제 1 항에 있어서
    만약 R10가 아미노 보호기이면, N-말단 아민을 탈보호시키고, 이후
    N-말단 아민을 카복실산 (CA)과 반응시켜 아미드 결합을 형성하는 단계;가
    만약 R9가 산 보호기이면, C-말단 카복실산 기를 탈보호시키고, 이후
    C-말단 카복실산 기를 아민 (A)과 반응시켜 아미드 결합을 형성하는 단계
    전에 수행되는 방법.
  4. 제 1 내지 3 항 중 어느 한 항에 있어서 아민 (A)는 알킬아민, 알칸올아민, 아릴알칸올아민, 아미노산, 아미노산 유도체, 펩티드 및 펩티드 유도체로 이루어진 그룹으로부터 선택되고,
    여기서 아민 (A)은 하나 이상의 치환기를 가질 수 있고,
    여기서 아민 (A)은 보호기를 가질 수 있는 방법.
  5. 제 1 내지 4항 중 어느 한 항에 있어서 아민 (A)는 페닐알라닌, 페닐알라닌 유도체, 치환된 페닐알라닌, 치환된 페닐알라닌 유도체, 트립토판, 트립토판 유도체, 치환된 트립토판, 치환된 트립토판 유도체, 페닐프로판올아민, 보호된 페닐프로판올아민, 치환된 페닐프로판올아민, 보호된 치환된 페닐프로판올아민, 돌라페닌 및 보호된 돌라페닌, 치환된 돌라페닌, 보호된 치환된 돌라페닌, 돌라페닌 유도체, 보호된 돌라페닌 유도체, 치환된 돌라페닌 유도체, 보호된 돌라페닌 유도체로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
  6. 제1 내지 5 항 중 어느 한 항에 있어서 카복실산 (CA)는 아미노산, 아미노산 유도체, 펩티드 및 펩티드 유도체로 이루어진 그룹으로부터 선택되고,
    여기서 카복실산 (CA)은 하나 이상의 치환기를 가질 수 있고,
    여기서 카복실산 (CA)은 보호기를 가질 수 있는 방법.
  7. 제 1 내지 6항 중 어느 한 항에 있어서 카복실산 (CA)는 발린, 보호된 발린, 치환된 발린, 보호된 치환된 발린, 발린 유도체, 보호된 발린 유도체, 치환된 발린 유도체, 보호된 치환된 발린 유도체, 알라닌, 보호된 알라닌, 치환된 알라닌, 보호된 치환된 알라닌, 알라닌 유도체, 보호된 알라닌 유도체, 치환된 알라닌 유도체 및 보호된 치환된 알라닌 유도체로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
  8. 제1 내지 7 항 중 어느 한 항에 있어서 카복실산 (CA)은 스페이서, 링커 및 부착 기 중 하나 이상을 포함하는 방법.
  9. 제1, 2 또는 4 내지 8 항 중 어느 한 항에 있어서 화학식 I의 화합물은
    Figure pct00061
    인 방법.
  10. 화학식 II의 단리된 염:
    Figure pct00062
    II
    여기서
    R1, R2, R3, R4 R5 및 R8는 각각 H, C1-C6 알킬, C1-C6 치환된 알킬, -OR11, -NR11R12, -SR11 및 할로로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택되고,
    R11 및 R12는 H 및 C1-C6 알킬로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택되고,
    R6 및 R7는 각각 독립적으로 H 또는 C1-C4 알킬,
    R10는 H 또는 아미노 보호기; 그리고
    Y+는 반대이온임.
  11. 제 10항에 있어서,
    R1, R2, R3, R4 R5 및 R8는 각각 H, 메틸, 에틸, n-프로필, 이소-프로필, n-부틸, sec-부틸, tert-부틸, 및 iso-부틸로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택되고;
    R6 및 R7는 각각 독립적으로 H 또는 메틸,
    R10는 H 또는 tert-부톡시카르보닐 (Boc), 및
    Y+는 화학식 N+HR13R14R15의 암모늄 이온이고 여기서 R13는 임의로 치환된 C1-C8 알킬 및 임의로 치환된 C3-C8 시클로알킬로 이루어진 그룹으로부터 선택되고; R14 및 R15는 독립적으로 H, 임의로 치환된 C1-C8 알킬 및 임의로 치환된 C3-C8 시클로알킬로 이루어진 그룹으로부터 선택되고; 여기서 각각의 임의의 치환기는, 만약 존재한다면, 알킬 및 아릴로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 단리된 염.
  12. 제10 또는 11 항에 있어서 Y+ 디에틸암모늄 이온, 디부틸암모늄 이온, 디시클로헥실암모늄 이온, 메틸시클로헥실암모늄 이온 및 메틸벤질암모늄 이온으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 단리된 염.
  13. 제10 내지 12 항 중 어느 한 항에 있어서, 염은
    Figure pct00063
    인 염.
  14. 식 III의 화합물:
    Figure pct00064
    III
    여기서
    R1, R2, R3, R5 및 R8는 각각 H, C1-C6 알킬, C1-C6 치환된 알킬, -OR11, -NR11R12, -SR11 및 할로로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택되고,
    R11 및 R12는 H 및 C1-C6 알킬로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택되고,
    R6 및 R7는 각각 H 또는 C1-C4 알킬로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택되고,
    Z-는 반대이온임.
  15. 제 14항에 있어서,
    R1, R2, R3, R5 및 R8는 각각 H, 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, sec-부틸, 이소-부틸, 및 tert-부틸로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택되고,
    R6 및 R7는 각각 H 및 메틸로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택되고,
    Z-는 할라이드, 설페이트, 수소 설페이트, 포스페이트, 수소 포스페이트, 디수소 포스페이트, 메실레이트, 토실레이트, 벤젠 설포네이트, 에틸설포네이트, 니트레이트, 포르메이트, 아세테이트, 트리플루오로아세테이트, 옥살레이트, 및 시트레이트로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 화학식 III의 화합물.
  16. 제14 또는 15 항에 있어서, 화합물은:
    Figure pct00065
    인 화학식 III의 화합물.
  17. 다음 단계를 포함하는, 아미노산을 화학식 III의 화합물
    Figure pct00066
    III
    여기서
    R1, R2, R3, R5 및 R8는 각각 H, C1-C6 알킬, C1-C6 치환된 알킬, -OR11, -NR11R12, -SR11 및 할로로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택되고,
    R11 및 R12는 H 및 C1-C6 알킬로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택되고,
    R6 및 R7는 각각 H 또는 C1-C4 알킬로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택되고,
    Z-는 반대이온임, 에 커플링하는 방법:
    식 III의 화합물을 수성 염기와 접촉시켜 반대이온을 제거하는 단계, 및
    식 III의 화합물을 N-보호된 아미노산 N-카복시무수물과 접촉시켜 화학식 IV의 화합물을 얻는 단계:
    Figure pct00067
    IV
    여기서
    R1, R2, R3, R5, R6, R7 및 R8는 위에서 정의된 바와 같고,
    R16는 아미노산 측쇄, 및
    R17는 보호기임.
  18. 제 17 항에 있어서
    R1, R2, R3, R5 및 R8는 각각 H, 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, sec-부틸, 이소-부틸, 및 tert-부틸로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택되고,
    R6 및 R7는 각각 H, 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, sec-부틸, 이소-부틸, 및 tert-부틸로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택되고,
    Z-는 할라이드, 설페이트, 수소 설페이트, 포스페이트, 수소 포스페이트, 디수소 포스페이트, 메실레이트, 토실레이트, 벤젠 설포네이트, 에틸설포네이트, 니트레이트, 포르메이트, 아세테이트, 트리플루오로아세테이트, 옥살레이트, 및 시트레이트로 이루어진 그룹으로부터 선택되고;
    수성 염기는 Na2CO3, NaHCO3, NaOH, Na2HPO4, 및 Na3PO4로 이루어진 그룹으로부터 선택되고,
    N-보호된 아미노산 N-카복시무수물은 Boc- 보호된 아미노산 N-카복시무수물인 방법.
  19. 제 17 또는 18항에 있어서 화학식 III의 화합물은
    Figure pct00068

    이고 수성 염기는 Na2CO3이고,
    N-보호된 아미노산 N-카복시무수물은 Boc-Val-NCA이고,
    식 IV의 화합물은:
    Figure pct00069
    인 방법.
  20. 다음 단계를 포함하는 화학식 V의 미정제 히드록시 산을 정제하기 위한 방법:
    식 V의 미정제 히드록시 산을 제공하는 단계
    Figure pct00070
    V
    여기서
    R2, R3, 및 R5는 각각 H, C1-C6 알킬, C1-C6 치환된 알킬, -OR11, -NR11R12, -SR11 및 할로로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택되고; R11 및 R12는 H, C1-C6 알킬로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택되고,
    R6는 H 및 C1-C4 알킬로 이루어진 그룹으로부터 선택됨;
    가용성 용매 내에 미정제 히드록시 산을 용해시키는 단계,
    불용성 용매를 부가하는 단계,
    결정화를 개시하는 단계, 및
    결정화가 완료되도록 방치하여 화학식 V의 정제 히드록시 산을 얻는 단계.
  21. 제20 항에 있어서, 화학식 V의 히드록시 산은
    Figure pct00071

    이고 여기서
    R2, R3 및 R5는 각각 H, 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, sec-부틸, 이소-부틸, 및 tert-부틸로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택되고,
    R6는 H 및 메틸로 이루어진 그룹으로부터 선택되고,
    가용성 용매는 tert-부틸 메틸 에테르 (MTBE)을 포함하고,
    불용성 용매는 헵탄을 포함하고,
    결정화는 시딩, 열 순환 또는 이의 조합에 의해 개시되는 방법.
  22. 제20 또는 21 항에 있어서 화학식 V의 히드록시 산은
    Figure pct00072
    인 방법.
  23. 제20-22 항 중 어느 한 항에 있어서, 화학식 V의 정제 히드록시 산을 단리하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  24. 식 VI의 화합물:
    Figure pct00073
    VI
    여기서
    R2, R3, 및 R5는 각각 H, C1-C6 알킬, C1-C6 치환된 알킬, -OR11, -NR11R12, -SR11 및 할로로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택되고; R11 및 R12는 H, C1-C6 알킬로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택되고,
    R6는 H 및 C1-C4 알킬로 이루어진 그룹으로부터 선택되고; 그리고
    R13는 임의로 치환된 C1-C8 알킬 및 임의로 치환된 C3-C8 시클로알킬로 이루어진 그룹으로부터 선택되고; R14 및 R15는 독립적으로 H, 임의로 치환된 C1-C8 알킬 및 임의로 치환된 C3-C8 시클로알킬로 이루어진 그룹으로부터 선택되고; 여기서 각각의 임의의 치환기는, 만약 존재한다면, 알킬 및 아릴로 이루어진 그룹으로부터 선택됨.
  25. 제24 항에 있어서, 화학식 VI의 화합물은
    Figure pct00074

    이고 여기서
    R2, R3 및 R5는 각각 H, 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, sec-부틸, 이소-부틸, 및 tert-부틸로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택되고,
    R6는 H 및 메틸로 이루어진 그룹으로부터 선택되고; 그리고
    NHR13R14R15는 디에틸암모늄 이온, 디부틸암모늄 이온, 디시클로헥실암모늄 이온, 메틸시클로헥실암모늄 이온 및 메틸벤질암모늄 이온으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 화합물.
  26. 제24 또는 25 항에 있어서, 화학식 VI의 화합물은:
    Figure pct00075
    인 화합물.
  27. 제24-26 항 중 어느 한 항에 있어서 화학식 VI의 화합물은 고체인 화합물.
  28. 식 VII의 화합물
    Figure pct00076
    VII
    여기서
    R1 및 R8는 H, C1-C6 알킬, C1-C6 치환된 알킬, -OR11, -NR11R12, -SR11 및 할로로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택되고; R11 및 R12는 H, C1-C6 알킬로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택되고;
    R7는 H 또는 C1-C4 알킬로 이루어진 그룹으로부터 선택되고; 그리고
    X-는 할라이드, 설페이트, 수소 설페이트, 포스페이트, 수소 포스페이트, 디수소 포스페이트, 메실레이트, 토실레이트, 벤젠 설포네이트, 에틸설포네이트, 니트레이트, 포르메이트, 아세테이트, 옥살레이트, 및 시트레이트로 이루어진 그룹으로부터 선택됨.
  29. 제28 항에 있어서 화학식 VII의 화합물은
    Figure pct00077

    이고 여기서
    R1 및 R8는 H, 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, sec-부틸, 이소-부틸, 및 tert-부틸로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택되고,
    R7은 H 및 메틸로부터 선택되고; 그리고
    X-는 할라이드인 화합물.
  30. 제28 또는 29 항에 있어서 화학식 VII의 화합물은
    Figure pct00078
    인 화합물.
  31. 제28-30 항 중 어느 한 항에 있어서 화학식 VII의 화합물은 고체인 화합물.
  32. 식 VIII의 화합물:
    Figure pct00079
    VIII.
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