KR20220150345A - 프로테아제-처리 분자 - Google Patents

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KR20220150345A
KR20220150345A KR1020227034213A KR20227034213A KR20220150345A KR 20220150345 A KR20220150345 A KR 20220150345A KR 1020227034213 A KR1020227034213 A KR 1020227034213A KR 20227034213 A KR20227034213 A KR 20227034213A KR 20220150345 A KR20220150345 A KR 20220150345A
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Abstract

본 발명은 적어도 하나의 프로테아제-절단가능 링커를 포함하는 단백질 분자에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 이러한 단백질 분자의 프로테아제-절단에 의해 얻을 수 있는 단백질 분자, 및 치료에서의 이들의 용도에 관한 것이다.

Description

프로테아제-처리 분자
본 발명은 적어도 하나의 프로테아제-절단가능 링커를 포함하는 단백질 분자에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 이러한 단백질 분자의 프로테아제 처리에 의해 얻을 수 있는 단백질 분자, 및 치료에서의 이들의 용도에 관한 것이다.
천연 발생 IgG 항체는 2가이고 단일특이적이다. 다수의 상이한 항원에 대한 결합 특이성을 갖는 다중특이적, 예를 들어 이중특이적 항체는 재조합 기술을 사용하여 생성될 수 있으며, 광범위한 임상 적용을 가질 것으로 예상된다. 완전한 IgG 항체 분자가 4개의 폴리펩티드 사슬, 즉 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 포함하는 Y형 분자인 것은 잘 알려져 있다. 각 경쇄는 2개의 도메인, 즉 가변 또는 VL 도메인(또는 영역)으로 알려진 N-말단 도메인 및 불변 또는 CL 도메인/영역(불변 카파(Cκ) 또는 불변 람다(Cλ) 도메인)으로 알려진 C-말단 도메인으로 구성된다. 각 중쇄는 항체의 클래스에 따라 4개 또는 5개의 도메인으로 구성된다. N-말단 도메인은 가변(또는 VH) 도메인(또는 영역)으로 알려져 있으며, 그 다음에는 제1 불변(또는 CH1) 도메인, 힌지 영역, 이어서 제2 및 제3 불변(또는 CH2 및 CH3) 도메인이 있다. 조립된 항체에서, VL 및 VH 도메인은 함께 회합하여 항원 결합 부위를 형성한다. 또한, CL 및 CH1 도메인은 함께 회합하여 하나의 중쇄를 하나의 경쇄와 회합된 상태로 유지한다. 2개의 중쇄-경쇄 이종이량체는 CH2 및 CH3 도메인의 상호작용 및 두 중쇄 상의 힌지 영역 간의 상호작용에 의해 함께 회합한다.
다중특이적 항체의 생성과 함께 발생하는 주요 문제 중 하나는 경쇄 쌍형성 오류(mispairing)이다. 두 개의 서로 다른 중쇄의 쌍형성은 노브-인투-홀(knob-into-hole)과 같은 기술에 의해 해결될 수 있지만, 정확한 경쇄 회합을 시키는 것도 필수적이다. 더 많은 변형을 필요로 하는 Fab 단편 계면 내에 변형이 적용되어야 하므로, 구조적 관점에서 이는 더 큰 문제일 것이다. 어떤 경우든, 원치 않는 종의 형성을 피하면서 적절한 사슬 회합을 달성하기 위해 중쇄의 이종이량체화 및 동족 경쇄와의 회합은 상당히 많은 수의 다양한 설계를 필요로 한다. 또한, 경쇄 및 중쇄를 암호화하는 상이한 벡터/플라스미드로부터의 다중특이적 분자의 발현은 정확한 사슬 쌍형성을 위한 최적의 비를 제공하기 위해 모든 플라스미드를 동일한 정도로 번역할 것을 필요로 한다.
본 발명은 설계-기반 다중특이적 형태에서 프로세스-기반 다중특이적 형태로 패러다임을 변화시켜 경쇄 쌍형성 문제를 해결한다. 여기에서 항체 서열의 변형은 필요하지 않다.
일 양태에서, 본 발명은 하기 식을 갖는 적어도 하나의 폴리펩티드 사슬을 포함하는 단백질에 관한 것이다.
PP1-PCL-PP2
[식에서,
PP1은 제1 폴리펩티드이고,
PP2는 제2 폴리펩티드이고,
PCL은 아미노산 서열 HRRX1X2RSVDE(서열번호 42)를 포함하는 적어도 하나의 프로테아제-절단 부위를 포함하는 프로테아제-절단가능 링커이고, X1 및 X2는 아미노산, 바람직하게는 천연 발생 아미노산으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택됨]
일 구현예에서, 프로테아제는 푸린 및/또는 푸린-유사 프로테아제이다.
일 구현예에서, 적어도 하나의 프로테아제-절단 부위는 아미노산 서열 HRRRKRSVDE(서열번호 43) 또는 아미노산 서열 HRRQQRSVDE(서열번호 44)를 포함한다.
일 구현예에서, 링커의 프로테아제-절단은 단백질의 활성 변화를 유발한다.
일 구현예에서, 활성 변화는 적어도 하나의 항원에 대한 결합 또는 증가된 결합이다.
일 구현예에서, 프로테아제-절단은 세포 내에서 일어난다.
일 구현예에서, 프로테아제-절단가능 링커는 2개의 프로테아제-절단 부위를 포함하고, 2개의 프로테아제-절단 부위는 각각 프로테아제-절단가능 링커의 N-말단 및 C-말단에 위치하고, 2개의 프로테아제-절단 부위는 동일하거나 상이할 수 있다.
일 구현예에서, 프로테아제-절단가능 링커는 10 내지 80개의 아미노산 잔기의 길이를 갖는다.
일 구현예에서, 적어도 하나의 프로테아제-절단 부위의 앞 및/또는 뒤에는 글리신 및 세린으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 또는 10개 이상의 연속 아미노산 잔기가 배치된다.
일 구현예에서, 프로테아제-절단가능 링커는 (GS)n, (G4S)n(서열번호 51), (HH)n, (EAAAK)n(서열번호 52), (AP)nA(서열번호 53), (KQGKQ)n(서열번호 54), 및 이들의 조합으로 이루어진 군(n은 1 내지 10에서 선택되는 정수임)으로부터 선택되는 아미노산 서열을 추가로 포함한다.
일 구현예에서, 프로테아제-절단가능 링커는 GSHHHHHHHHGGGGS(서열번호 45), GGGGSEAAAKEAAAKGGGGS(서열번호 46), APAPAPAPAPAPAPA(서열번호 47), GSKQGKQKQGKQGS(서열번호 48), 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 추가로 포함한다.
일 구현예에서, PP1은 적어도 하나의 면역글로불린 불변 영역 및/또는 적어도 하나의 면역글로불린 가변 영역을 포함하고/하거나, PP2는 적어도 하나의 면역글로불린 불변 영역 및/또는 적어도 하나의 면역글로불린 가변 영역을 포함한다.
일 구현예에서,
PP1은 면역글로불린 불변 영역을 포함하고 PP2는 면역글로불린 가변 영역을 포함하거나,
PP1은 면역글로불린 가변 영역을 포함하고 PP2는 면역글로불린 불변 영역을 포함하거나,
PP1은 면역글로불린 불변 영역을 포함하고 PP2는 면역글로불린 불변 영역을 포함하거나,
PP1은 면역글로불린 가변 영역을 포함하고 PP2는 면역글로불린 가변 영역을 포함한다.
일 구현예에서, 단백질은 항체 또는 항체 유도체이다.
일 구현예에서, 단백질은 단일쇄 항체, 바람직하게는 다중특이적 단일쇄 항체이다.
일 구현예에서, 단백질은
(a) VL-CL-PCL-VH-CH1-힌지-CH2-CH3,
[식에서,
VL은 면역글로불린 경쇄 가변 영역이고;
CL은 면역글로불린 경쇄 불변 영역이고;
VH는 면역글로불린 중쇄 가변 영역이고;
CH1은 면역글로불린 CH1 중쇄 불변 영역이고;
힌지는 면역글로불린 힌지 영역이고;
CH2는 면역글로불린 CH2 중쇄 불변 영역이고;
CH3는 면역글로불린 CH3 중쇄 불변 영역이고;
PCL은 프로테아제-절단가능 링커임];
(b) VLa-CLa-PCL-VLb-CLb,
[식에서,
VLa는 제1 면역글로불린 경쇄 가변 영역이고;
VLb는 제2 면역글로불린 경쇄 가변 영역이고;
CLa는 제1 면역글로불린 경쇄 불변 영역이고;
CLb는 제2 면역글로불린 경쇄 불변 영역이고;
PCL은 프로테아제-절단가능 링커임]; 및
(c) VLa-CLa-PCL-VLb-CLb-L-힌지-CH2-CH3
[식에서,
VLa는 제1 면역글로불린 경쇄 가변 영역이고;
VLb는 제2 면역글로불린 경쇄 가변 영역이고;
CLa는 제1 면역글로불린 경쇄 불변 영역이고;
CLb는 제2 면역글로불린 경쇄 불변 영역이고;
L은 임의적 링커이고;
힌지는 면역글로불린 힌지 영역이고;
CH2는 면역글로불린 CH2 중쇄 불변 영역이고;
CH3는 면역글로불린 CH3 중쇄 불변 영역이고;
PCL은 프로테아제-절단가능 링커임]
로 이루어진 군으로부터 선택되는 식을 갖는 폴리펩티드 사슬을 포함한다.
일 구현예에서, 단백질은 식 VL-CL-PCL-VH-CH1-힌지-CH2-CH3를 갖는 폴리펩티드 사슬을 포함하고, VL은 VH와 쌍을 이루어 항원 결합 부위를 형성한다.
일 구현예에서, 항원 결합 부위는 프로테아제-절단가능 링커의 프로테아제-절단 시 활성이 되거나 증가된 활성을 나타낸다.
일 구현예에서, 단백질은 식 VL-CL-PCL-VH-CH1-힌지-CH2-CH3를 갖는 폴리펩티드 사슬의 2개의 카피를 포함하고, 2개의 카피는 적어도 2개의 이황화 결합을 통해 서로 회합된다.
일 구현예에서, 단백질은 식 VLa-CLa-PCL-VHa-CH1a-힌지-CH2-CH3를 갖는 제1 폴리펩티드 사슬, 및 식 VLb-CLb-PCL-VHb-CH1b-힌지-CH2-CH3를 갖는 제2 폴리펩티드 사슬을 포함하고,
식에서,
VLa는 제1 면역글로불린 경쇄 가변 영역이고;
VLb는 제2 면역글로불린 경쇄 가변 영역이고;
CLa는 제1 면역글로불린 경쇄 불변 영역이고;
CLb는 제2 면역글로불린 경쇄 불변 영역이고;
VHa는 제1 면역글로불린 중쇄 가변 영역이고;
VHb는 제2 면역글로불린 중쇄 가변 영역이고;
CH1a는 제1 면역글로불린 CH1 중쇄 불변 영역이고;
CH1b는 제2 면역글로불린 CH1 중쇄 불변 영역이고;
VLa는 VHa와 쌍을 이루어 항원 A에 결합하는 항원 결합 부위를 형성하고, VLb는 VHb와 쌍을 이루어 항원 B에 결합하는 항원 결합 부위를 형성하고;
제1 폴리펩티드 사슬은 적어도 2개의 이황화 결합을 통해, 그리고 임의로 적어도 하나의 추가적인 Fc 상호작용을 통해 제2 폴리펩티드 사슬과 회합된다.
일 구현예에서, 항원 결합 부위 A 및/또는 항원 결합 부위 B는 프로테아제-절단가능 링커의 프로테아제-절단 시 활성이 되거나 증가된 활성을 나타낸다.
일 구현예에서, 적어도 하나의 추가적인 Fc 상호작용은 적어도 하나의 노브-인투-홀 상호작용이다.
일 구현예에서, 단백질은 식 VLb-L1-VLa-L2-CL을 갖는 제1 폴리펩티드 사슬, 식 VHa-L3-VHb-L4-CH1-힌지-CH2-CH3를 갖는 제2 폴리펩티드 사슬, 및 식 VLc-CLc-PCL-VHc-CH1c-힌지-CH2-CH3를 갖는 제3 폴리펩티드 사슬을 포함하고,
식에서,
VLa는 제1 면역글로불린 경쇄 가변 영역이고;
VLb는 제2 면역글로불린 경쇄 가변 영역이고;
VLc는 제3 면역글로불린 경쇄 가변 영역이고;
CL은 면역글로불린 경쇄 불변 영역이고;
CLc는 면역글로불린 경쇄 불변 영역이고;
VHa는 제1 면역글로불린 중쇄 가변 영역이고;
VHb는 제2 면역글로불린 중쇄 가변 영역이고;
VHc는 제3 면역글로불린 중쇄 가변 영역이고;
CH1은 면역글로불린 CH1 중쇄 불변 영역이고;
CH1c는 면역글로불린 CH1 중쇄 불변 영역이고;
힌지는 면역글로불린 힌지 영역이고;
CH2는 면역글로불린 CH2 중쇄 불변 영역이고;
CH3는 면역글로불린 CH3 중쇄 불변 영역이고;
L1, L2, L3, 및 L4는 링커이고,
VLa는 VHa와 쌍을 이루어 항원 A에 결합하는 항원 결합 부위를 형성하고, VLb는 VHb와 쌍을 이루어 항원 B에 결합하는 항원 결합 부위를 형성하고, VLc는 VHc와 쌍을 이루어 항원 C에 결합하는 항원 결합 부위를 형성하고;
제2 폴리펩티드 사슬은 적어도 2개의 이황화 결합을 통해, 그리고 임의로 적어도 하나의 추가적인 Fc 상호작용을 통해 제3 폴리펩티드 사슬과 회합된다.
일 구현예에서, 항원 결합 부위 C는 프로테아제-절단가능 링커의 프로테아제-절단 시 활성이 되거나 증가된 활성을 나타낸다.
일 구현예에서, 적어도 하나의 추가적인 Fc 상호작용은 적어도 하나의 노브-인투-홀 상호작용이다.
일 구현예에서, 단백질은 식 VLa-CLa-PCL-VLb-CLb를 갖는 제1 폴리펩티드 사슬, 및 식 VHa-CH1a-L-VHb-CH1b-힌지-CH2-CH3를 갖는 제2 폴리펩티드 사슬을 포함하고,
식에서,
VHa는 제1 면역글로불린 중쇄 가변 영역이고;
VHb는 제2 면역글로불린 중쇄 가변 영역이고;
CH1a는 제1 면역글로불린 CH1 중쇄 불변 영역이고;
CH1b는 제2 면역글로불린 CH1 중쇄 불변 영역이고;
L은 임의적 링커이고;
힌지는 면역글로불린 힌지 영역이고;
CH2는 면역글로불린 CH2 중쇄 불변 영역이고;
CH3는 면역글로불린 CH3 중쇄 불변 영역이고;
VLa는 VHa와 쌍을 이루어 항원 A에 결합하는 항원 결합 부위를 형성하고, VLb는 VHb와 쌍을 이루어 항원 B에 결합하는 항원 결합 부위를 형성한다.
일 구현예에서, 항원 결합 부위 B는 프로테아제-절단가능 링커의 프로테아제-절단 시 활성이 되거나 증가된 활성을 나타낸다.
일 구현예에서, 단백질은 제1 폴리펩티드 사슬의 2개의 카피 및 제2 폴리펩티드 사슬의 2개의 카피를 포함하고, 제2 폴리펩티드 사슬의 2개의 카피는 적어도 2개의 이황화 결합을 통해 서로 회합된다.
일 구현예에서, 단백질은 식 VLb-CLb-PCL-VLa-CLa를 갖는 제1 폴리펩티드 사슬, 식 VLc-CLc-PCL-VLd-CLd를 갖는 제2 폴리펩티드 사슬, 식 VHa-CH1a-L-VHb-CH1b-힌지-CH2-CH3를 갖는 제3 폴리펩티드 사슬, 및 식 VHc-CH1c-L-VHd-CH1d-힌지-CH2-CH3를 갖는 제4 폴리펩티드 사슬을 포함하고,
식에서,
VLa는 제1 면역글로불린 경쇄 가변 영역이고;
VLb는 제2 면역글로불린 경쇄 가변 영역이고;
VLc는 제3 면역글로불린 경쇄 가변 영역이고;
VLd는 제4 면역글로불린 경쇄 가변 영역이고;
CLa는 제1 면역글로불린 경쇄 불변 영역이고;
CLb는 제2 면역글로불린 경쇄 불변 영역이고;
CLc는 제3 면역글로불린 경쇄 불변 영역이고;
CLd는 제4 면역글로불린 경쇄 불변 영역이고;
VHa는 제1 면역글로불린 중쇄 가변 영역이고;
VHb는 제2 면역글로불린 중쇄 가변 영역이고;
VHc는 제3 면역글로불린 중쇄 가변 영역이고;
VHd는 제4 면역글로불린 중쇄 가변 영역이고;
CH1a는 제1 면역글로불린 CH1 중쇄 불변 영역이고;
CH1b는 제2 면역글로불린 CH1 중쇄 불변 영역이고;
CH1c는 제3 면역글로불린 CH1 중쇄 불변 영역이고;
CH1d는 제4 면역글로불린 CH1 중쇄 불변 영역이고;
L은 임의적 링커이고;
힌지는 면역글로불린 힌지 영역이고;
CH2는 면역글로불린 CH2 중쇄 불변 영역이고;
CH3는 면역글로불린 CH3 중쇄 불변 영역이고;
VLa는 VHa와 쌍을 이루어 항원 A에 결합하는 항원 결합 부위를 형성하고, VLb는 VHb와 쌍을 이루어 항원 B에 결합하는 항원 결합 부위를 형성하고, VLc는 VHc와 쌍을 이루어 항원 C에 결합하는 항원 결합 부위를 형성하고, VLd는 VHd와 쌍을 이루어 항원 D에 결합하는 항원 결합 부위를 형성하고;
제3 폴리펩티드 사슬은 적어도 2개의 이황화 결합을 통해, 그리고 임의로 적어도 하나의 추가적인 Fc 상호작용을 통해 제4 폴리펩티드 사슬과 회합된다.
일 구현예에서, 항원 결합 부위 B 및/또는 항원 결합 부위 D는 프로테아제-절단가능 링커의 프로테아제-절단 시 활성이 되거나 증가된 활성을 나타낸다.
일 구현예에서, 적어도 하나의 추가적인 Fc 상호작용은 적어도 하나의 노브-인투-홀 상호작용이다.
일 구현예에서, 단백질은 식 VLa-CLa-PCL-VLb-CLb-L-힌지-CH2-CH3를 갖는 제1 폴리펩티드 사슬, 및 식 VHa-CH1a-L-VHb-CH1b-힌지-CH2-CH3를 갖는 제2 폴리펩티드 사슬을 포함하고,
식에서,
VHa는 제1 면역글로불린 중쇄 가변 영역이고;
VHb는 제2 면역글로불린 중쇄 가변 영역이고;
CH1a는 제1 면역글로불린 CH1 중쇄 불변 영역이고;
CH1b는 제2 면역글로불린 CH1 중쇄 불변 영역이고;
L은 임의적 링커이고;
힌지는 면역글로불린 힌지 영역이고;
CH2는 면역글로불린 CH2 중쇄 불변 영역이고;
CH3는 면역글로불린 CH3 중쇄 불변 영역이고;
VLa는 VHa와 쌍을 이루어 항원 A에 결합하는 항원 결합 부위를 형성하고, VLb는 VHb와 쌍을 이루어 항원 B에 결합하는 항원 결합 부위를 형성하고;
제1 폴리펩티드 사슬은 적어도 2개의 이황화 결합을 통해, 그리고 임의로 적어도 하나의 추가적인 Fc 상호작용을 통해 제2 폴리펩티드 사슬과 회합된다.
일 구현예에서, 항원 결합 부위 B는 프로테아제-절단가능 링커의 프로테아제-절단 시 활성이 되거나 증가된 활성을 나타낸다.
일 구현예에서, 적어도 하나의 추가적인 Fc 상호작용은 적어도 하나의 노브-인투-홀 상호작용이다.
다른 양태에서, 본 발명은 상기 정의된 바와 같은 단백질을 암호화하는 핵산 또는 핵산 세트에 관한 것이다.
다른 양태에서, 본 발명은 상기 정의된 바와 같은 핵산 또는 핵산 세트를 포함하는 벡터 또는 벡터 세트에 관한 것이다.
다른 양태에서, 본 발명은 상기 정의된 바와 같은 단백질, 상기 정의된 바와 같은 핵산 또는 핵산 세트, 또는 상기 정의된 바와 같은 벡터 또는 벡터 세트를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다.
일 구현예에서, 숙주 세포는 내인성 또는 외인성 푸린 및/또는 푸린-유사 프로테아제를 발현한다.
일 구현예에서, 숙주 세포는 포유류 세포이다.
일 양태에서, 본 발명은
i) 상기 정의된 바와 같은 숙주 세포를 배양하는 단계; 및
ii) 숙주 세포로부터 단백질을 단리하는 단계를 포함하는 단백질 생성 방법에 관한 것이다.
다른 양태에서, 본 발명은 상기 정의된 바와 같은 방법에 의해 얻을 수 있는 단백질에 관한 것이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 상기 정의된 바와 같은 단백질의 푸린 및/또는 푸린-유사 프로테아제-절단에 의해 얻을 수 있는 단백질에 관한 것이다.
일 구현예에서, 상기 정의된 바와 같은 단백질은 치료 활성 단백질이다.
일 양태에서, 본 발명은 치료에 사용하기 위한 상기 정의된 바와 같은 단백질에 관한 것이다.
다른 양태에서, 본 발명은 의약의 제조에 있어서 상기 정의된 바와 같은 단백질의 용도에 관한 것이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 상기 정의된 바와 같은 단백질의 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 질환 또는 장애의 치료 또는 예방 방법에 관한 것이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 상기 정의된 바와 같은 단백질을 포함하는 약학적 조성물 또는 키트에 관한 것이다.
다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 42 내지 44 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드, 이러한 펩티드를 포함하는 단백질, 이러한 펩티드 또는 단백질을 암호화하는 핵산, 이러한 핵산을 포함하는 벡터, 또는 이러한 펩티드, 단백질, 핵산, 또는 벡터를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다.
도 1: 프로테아제-절단가능 동종이량체 항체 형태. (A) 단일쇄(sC) 단일클론 IgG. CL(예를 들어, Cκ) 도메인은 C-말단에서 중쇄의 VH 도메인의 N-말단과 함께 프로테아제-절단가능 링커(PCL) 서열을 통해 연장된다. (B) 단일 경쇄(sLC) 2가 이중특이적 탠덤-IgG. 중쇄의 VH-CH1(VHb) 도메인은 N-말단에서 예를 들어 (G4S)3 링커(서열번호 55)를 통해 제2 VH-CH1 도메인(VHa)과 함께 연장된다. 경쇄의 VL-CL 도메인(VLb)은 N-말단에서 PCL 서열을 사용하여 제2 VL-CL 도메인(VLa)과 함께 연장된다.
도 2: 프로테아제-절단가능 동종이량체 항체 형태. (A) 단일 경쇄(sLC) 다중특이적 탠덤-IgG. 중쇄의 VH-CH1(VHb 및 VHd) 도메인은 N-말단에서 예를 들어 (G4S)3 링커(서열번호 55)를 통해 제2 VH-CH1 도메인(VHa 및 VHc)과 함께 연장된다. 경쇄의 VL-CL 도메인(VLb 및 VLd)은 N-말단에서 PCL 서열을 사용하여 제2 VL-CL 도메인(VLa 및 VLc)과 함께 연장된다. (B) 단일쇄(sC) 1가 이중특이적 탠덤-유사-IgG. 제1 중쇄의 VH-CH1 도메인(VHb)은 N-말단에서 예를 들어 (G4S)3 링커(서열번호 55)를 통해 제2 VH-CH1 도메인(VHa)과 함께 연장되고; 제2 중쇄의 힌지 영역은 2개의 VL-CL 도메인과 함께 연장되고, VLb 및 Fv a는 PCL 서열을 통해 연결된다. (C) 단일쇄(sC) Fab 함유 삼중특이적 CODV-IgG. 항체의 하나의 아암은 CODV-HC(VHa-링커-VHb-링커-CH1-힌지-CH2-CH3)와 회합된 CODV-LC(VLb-링커-VLa-링커-CL)를 포함하고, 다른 아암은 단일쇄(sC) Fab 아암을 포함하고, VHc 도메인은 N-말단에서 PCL 서열을 사용하여 VLc-CL 도메인과 함께 연장된다. (D) 단일쇄(sC) 단일클론 IgG. 각 HC의 VHa 및 VHb 도메인은 N-말단에서 PCL 서열을 사용하여 각각 VLa-CL 및 VLb-CL 도메인과 함께 연장된다. 모든 이종이량체 분자의 중쇄는 바람직하게는 비대칭 항체를 형성하는 하나 이상의 노브-인투-홀(KIH) 돌연변이를 포함한다.
도 3: HEK293-FS 세포로부터 탠덤-항-IL4 x 항-IL13-huIgG1 구성체의 분석. 패널 (A)는 분석용 크기 배제 크로마토그래피를 사용한 친화성 및 분취용 SEC 후 탠덤-IgG 생성물(탠덤-IgG 대조군; sLC-PCL1-탠덤-IgG, 및 sLC-PCL2-탠덤-IgG)의 순도를 나타낸다. 패널 (B)는 분석용 소수성 상호작용 크로마토그래피를 사용한 항체 생성물의 균질성을 나타낸다. 패널 (C)는 4~12% Bis/Tris MOPS 소듐 도데실 설페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)을 사용한 항체의 환원 형태(각각 1개의 중쇄 및 2개의 경쇄/1개의 단일 LC) 및 산화 형태(온전한 탠덤-IgG)를 나타낸다.
도 4: HEK293-FS 세포로부터 탠덤-항-IL4 x 항-IL13-huIgG1 구성체의 분석. 패널 (A)는 분석용 크기 배제 크로마토그래피를 사용한 친화성 및 분취용 SEC 후 탠덤-IgG 생성물(sLC-PCL1-탠덤-IgG, sLC 델타PCL 탠덤-IgG, 및 sLC-PCL2-탠덤-IgG)의 순도를 나타낸다. 패널 (B)는 분석용 소수성 상호작용 크로마토그래피를 사용한 항체 생성물의 균질성을 나타낸다. 패널 (C)는 4~12% Bis/Tris MOPS 소듐 도데실 설페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)을 사용한 항체의 환원 형태(각각 1개의 중쇄 및 2개의 경쇄/1개의 단일 LC) 및 산화 형태(온전한 탠덤-IgG)를 나타낸다.
도 5: HEK293-FS 세포에서 프로테아제와 공동발현된 sLC 탠덤-IgG의 분석. 패널 (A)는 분석용 크기 배제 크로마토그래피를 사용한 친화성 및 분취용 SEC 후 탠덤-IgG 생성물(sLC-PCL1-탠덤-IgG, sLC 델타PCL 탠덤-IgG)의 순도를 나타낸다. 패널 (B)는 분석용 소수성 상호작용 크로마토그래피를 사용한 항체 생성물의 균질성을 나타낸다. 패널 (C)는 4~12% Bis/Tris MOPS 소듐 도데실 설페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)을 사용한 항체의 환원 형태(각각 1개의 중쇄 및 2개의 경쇄/1개의 단일 LC) 및 산화 형태(온전한 탠덤-IgG)를 나타낸다. 패널 (D)는 푸린 및 푸린-KDEL과 공동발현 후 sLC 탠덤-IgG-PCL1의 탈글리코실화 후 및 환원 조건하에서의 LC-MS 분석을 나타낸다.
도 6: 안정한 CHO 9E4 세포 풀에서 프로테아제 공동발현의 존재 및 부재하에서의 sLC 탠덤-IgG의 분석. 안정한 세포 풀(좌측 패널: 프로테아제 공동발현 있음, 우측 패널: 프로테아제 공동발현 없음)에서 발현된 정제된 항체의 산화 형태(온전한 탠덤-IgG) 및 환원 형태(각각 1개의 중쇄 및 2개의 경쇄/1개의 단일 LC)를 나타낸다(4~12% Bis/Tris MOPS 소듐 도데실 설페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)을 사용).
도 7: SDS-PAGE를 사용한 HEK293-FS 및 ExpiCHO 세포에서 발현된 sC-IgG 및 탠덤-유사 IgG의 분석. 패널 (A)는 HEK293-FS 세포에서 발현된 두 가지 항체 형태의 환원 형태(1개의 중쇄 및 1개의 경쇄/1개의 sC(좌측), 1개의 중쇄 및 미/처리 sC(우측)) 및 산화 형태(온전한 탠덤-IgG)를 나타내고, 패널 (B)는 ExpiCHO 세포에서 발현된 상응하는 구성체를 나타낸다(단백질 A 및 SEC 정제 후 4~12% Bis/Tris MOPS 소듐 도데실 설페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)을 사용).
도 8: HEK293-FS 세포에서 프로테아제와 공동발현된 sC-IgG 및 탠덤-유사 IgG의 분석. 패널 (A)는 sC-IgG의 환원 형태(1개의 중쇄 및 1개의 경쇄/1개의 sC) 및 산화 형태를 나타내고, 패널 (B)는 탠덤-유사 IgG의 환원 형태(1개의 중쇄 및 미/처리 sLC) 및 산화 형태(온전한 탠덤-유사 IgG)를 나타낸다(단백질 A 및 SEC 정제 후 4~12% Bis/Tris MOPS 소듐 도데실 설페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)을 사용, HEK293-FS 세포에서 PCSK 계열 구성원과의 공동발현 후).
도 9: HEK293FS 세포에서 발현된 삼중특이적 CODV-sCFab-IgG의 분석. 패널 (A)는 분취용 SEC 크로마토그래피를 나타내고, 패널 (B)는 LabCHip 전기영동 장치를 사용한 분취용 SEC 후 산화 형태(온전한 삼중특이적 CODV-Fab-IgG) 및 환원 형태(CODV 중쇄와 경쇄 및 단일/처리 Fab 중쇄와 경쇄)를 나타낸다.
본 발명을 아래에 상세히 기술하기 전에, 방법론, 프로토콜 및 시약은 달라질 수 있으므로, 본 발명이 본원에 기술된 특정 방법론, 프로토콜 및 시약에 한정되지 않는다는 점을 이해해야 한다. 또한, 본원에서 사용된 용어는 특정 구현예를 설명하기 위한 목적으로만 사용된 것으로 본 발명의 범위를 제한하고자 하는 것이 아니며, 본 발명의 범위는 첨부된 청구범위에 의해서만 제한될 것임을 이해해야 한다. 달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술 용어 및 과학 용어는 당업자가 통상적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 바람직하게는, 본원에서 사용되는 용어는 문헌["A multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPAC Recommendations)", Leuenberger, H.G.W, Nagel, B. and Koelbl, H. eds. (1995), Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basel, Switzerland]에 기술된 바와 같이 정의된다.
본 명세서 전체에 걸쳐 여러 문헌이 인용된다. 상기 또는 하기에서 본원에 인용된 각각의 문헌(모든 특허, 특허출원, 과학 간행물, 제조업체 사양, 지침 등을 포함함)은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다. 본원의 어떠한 내용도 본 발명이 선행 발명으로 인해 이러한 개시보다 선행할 자격이 없음을 인정하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
이하, 본 발명의 요소에 대해 설명한다. 이러한 요소들은 특정 구현예와 함께 열거되지만, 임의의 방식과 임의의 수로 조합되어 추가 구현예를 생성할 수 있음을 이해해야 한다. 다양하게 기술된 실시예 및 바람직한/특정 구현예가 본 발명을 명시적으로 기술된 구현예로만 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 이 [발명을 실시하기 위한 구체적인 내용]은 명시적으로 기술된 구현예를 임의의 수의 개시된 요소 및/또는 바람직한 요소와 조합시킨 구현예를 뒷받침하고 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 또한, 문맥에서 달리 나타내지 않는 한, 본 출원에 기술된 모든 요소의 임의의 순열 및 조합은 본 출원의 설명에 의해 개시되는 것으로 간주되어야 한다.
문맥에서 달리 요구하지 않는 한, 본 명세서 및 뒤따르는 청구범위 전반에 걸쳐, "포함한다"라는 단어 및 "포함하는"과 같은 변형어는 언급된 정수 또는 단계 또는 정수군 또는 단계군을 포함하되, 임의의 기타 정수 또는 단계 또는 정수군 또는 단계군을 배제하지 않음을 암시하는 것으로 이해되어야 한다. 본 명세서 및 첨부된 청구범위에서 사용되는 단수 형태는 문맥에서 달리 명시하지 않는 한 복수의 지시대상을 포함한다.
일 양태에서, 본 발명은 하기 식을 갖는 적어도 하나의 폴리펩티드 사슬을 포함하는 단백질에 관한 것이다.
PP1-PCL-PP2
[식에서,
PP1은 제1 폴리펩티드이고,
PP2는 제2 폴리펩티드이고,
PCL은 아미노산 서열 HRRX1X2RSVDE(서열번호 42)를 포함하는 적어도 하나의 프로테아제-절단 부위를 포함하는 프로테아제-절단가능 링커이고, X1 및 X2는 아미노산, 바람직하게는 천연 발생 아미노산으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택됨]
단백질이 상기 정의된 바와 같은 둘 이상의 폴리펩티드 사슬을 포함하는 경우, 이러한 폴리펩티드 사슬은 동일하거나 상이할 수 있다.
본 발명에 따른 용어 "펩티드"는 펩티드 결합에 의해 공유 연결된 2개 이상, 바람직하게는 3개 이상, 바람직하게는 4개 이상, 바람직하게는 6개 이상, 바람직하게는 8개 이상, 바람직하게는 9개 이상, 바람직하게는 10개 이상, 바람직하게는 13개 이상, 바람직하게는 16개 이상, 바람직하게는 21개 이상, 바람직하게는 최대 8, 10, 20, 30, 40, 또는 50개, 특히 100개의 아미노산을 포함하는 물질을 지칭한다. 용어 "단백질" 또는 "폴리펩티드"는 거대 펩티드, 바람직하게는 100개 초과의 아미노산 잔기를 갖는 펩티드를 지칭하지만, 일반적으로 용어 "펩티드", "폴리펩티드", 및 "단백질"은 동의어이며 본원에서 상호교환적으로 사용된다.
일 구현예에서, 단백질은 재조합 단백질이다. 일 구현예에서, 단백질은 융합 단백질이다.
본 발명의 맥락에서 용어 "재조합"은 "유전자 조작을 통해 만들어진"을 의미한다. 바람직하게, "재조합 대상"은 천연 발생적이지 않다.
본원에서 사용되고 대상에게 적용되는 "천연 발생"이란 용어는 대상이 자연에서 발견될 수 있다는 사실을 나타낸다. 예를 들어, 자연에서 공급원으로부터 단리될 수 있고 인간에 의해 의도적으로 변형되지 않은 유기체(바이러스를 포함함)에 존재하는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열은 천연 발생적이다.
용어 "융합 단백질"(또는 "키메라 단백질")은 일반적으로, 2개 이상의 별개의 단백질 및/또는 펩티드를 연결, 특히 공유 연결함으로써 생성되어, 원래의 단백질 및/또는 펩티드 각각으로부터 유래된 기능적 특성을 갖는 단일 단백질을 생성하는 단백질을 지칭한다.
본원에서 사용되는 용어 "링커"는 바람직하게는 펩티드 링커, 즉 펩티드 결합을 통해 연결된 아미노산으로 구성된 링커를 지칭한다. 그러나, 본 발명에 따른 링커는 비펩티드성 중합체(예를 들어, PEG)와 같은 비펩티드성 성분도 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 펩티드 링커는 임의의 길이를 가질 수 있다(즉, 임의의 수의 아미노산 잔기를 포함할 수 있다). 그러나, 펩티드 링커는 연결된(connected/linked) 모이어티가 예를 들어 서로 또는 다른 모이어티와 상호작용/쌍형성할 수 있도록 적절한 정도의 유연성을 제공하기에 충분히 길고, 적절한 단백질 접힘을 허용하기에 충분히 긴 것이 바람직하고; 세포에서 안정성(예를 들어, 단백질분해 안정성)을 제공하기에 충분히 짧은 것이 바람직하다. 적합한 펩티드 링커는 예를 들어 전체 내용 본원에 포함되는 문헌[Chen et al., Adv Drug Deliv Rev. 2013, 65(10):1357-69]에 기술되어 있다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 펩티드 링커는 1 내지 100개의 아미노산의 길이를 갖는다.
펩티드 링커의 유연성은 일반적으로, 아미노산이 작고 아미노산 사슬의 회전 또는 굽힘을 방해하는 부피가 큰 측쇄가 없는 경우 증가한다. 따라서, 본 발명의 펩티드 링커는 바람직하게는, 작은 아미노산, 특히 글리신, 알라닌, 세린, 트레오닌, 류신, 및 이소류신의 증가된 함량을 갖는다. 바람직하게는, 펩티드 링커의 아미노산 중 적어도 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 이상이 이러한 작은 아미노산이다. 특정 구현예에서, 본 발명에 따른 펩티드 링커는 아미노산 중 적어도 50%, 바람직하게는 적어도 60%, 더 바람직하게는 적어도 70%, 더 바람직하게는 적어도 80%, 더욱 더 바람직하게는 적어도 85%가 각각 글리신 또는 세린 잔기인 글리신-세린-풍부 링커이다. 본 발명에 따른 펩티드 링커는 또한 글리신 및/또는 세린 잔기로만 구성될 수 있다(각각 글리신 링커, 세린 링커, 또는 글리신-세린 링커로 지칭됨). 예시적인 펩티드 링커는 아미노산 식 (GlSm)n의 서열을 포함한다(l은 1 내지 4의 정수이고, m은 1 또는 2이고, n은 1 내지 12, 바람직하게는 1 내지 10, 예를 들어 2 내지 10, 또는 4 내지 10의 정수임). 본 발명에 따른 펩티드 링커는 다른 서열 요소, 예를 들어 His-태그를 포함하거나 이로 구성될 수도 있다.
일부 구현예에서, 본 발명에 따른 펩티드 링커는 또한 강성 펩티드 링커일 수 있다. 이러한 강성 펩티드 링커는 당업자에게 알려져 있으며, 예를 들어 일반식 (XP)n을 갖는 프롤린-풍부 펩티드 링커를 포함한다(X는 임의의 아미노산, 바람직하게는 알라닌, 리신, 또는 글루탐산을 나타내고, n은 정수, 바람직하게는 1 내지 12의 정수임). 이러한 모티프의 특정 예는 (AP)nA(서열번호 53)이다. 강성 펩티드 링커 서열 모티프의 또 다른 예는 (EAAAK)n(서열번호 52)이다(n은 정수, 바람직하게는 1 내지 12의 정수임).
본원에서 사용되는 용어 "프로테아제-절단가능 링커"("PCL")는 적어도 하나의 프로테아제-절단 부위를 포함하는 링커를 지칭한다.
본 발명에 따른 "프로테아제-절단 부위"("PCS"; 본원에서 프로테아제 인식 부위라고도 함)는 단백질의 번역 후에 기능하는 효소(프로테아제)의 표적인 단백질 내 일종의 효소 절단 부위이다. 일 구현예에서, 이러한 효소는 골지(Golgi) 내강으로부터 트랜스-골지 구획으로의 수송 중에 기능한다. 세포내 처리 효소(프로테아제)는 세포로부터 단백질이 분비되기 전에 폴리펩티드를 절단한다.
일 구현예에서, 프로테아제는 푸린 및/또는 푸린-유사 프로테아제이다. 용어 "푸린" 및 "푸린-유사 프로테아제"는 EC 번호 3.4.21.75에 해당하는 효소를 지칭한다. 푸린은 PACE(Paired basic Amino acid Cleaving Enzyme)로도 알려진 서브틸리신-유사 프로단백질 전환효소이다. 푸린은 비활성 전구체 단백질의 섹션을 결실시켜 생물학적 활성 단백질로 전환한다. 푸린 및/또는 푸린-유사 프로테아제(푸린 계열 프로테아제의 구성원으로 지칭될 수도 있음)의 예는 PCSK1(PC1/Pc3로도 알려짐), PCSK2(PC2로도 알려짐), PCSK3(푸린 또는 PACE로도 알려짐), PCSK4(PC4로도 알려짐), PCSK5(PCS 또는 PC6로도 알려짐), PCSK6(PACE4로도 알려짐), 및 PCSK7(PC7/LPC, PC8, 또는 SPC7으로도 알려짐)을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
본원에서 사용되는 용어 "아미노산" 또는 "아미노산 잔기"는 천연 발생 아미노산, 비천연 아미노산, 아미노산 유사체, 및 천연 발생 아미노산과 유사한 방식으로 기능하는 아미노산 모방체(이들은 구조가 D 및 L 이성체 형태를 허용할 경우 모두 D 및 L 이성체로 존재함)를 지칭한다. 아미노산은 본원에서, 명칭, 일반적으로 알려진 세 글자 기호, 또는 IUPAC-IUB 생화학 명명 위원회(Biochemical Nomenclature Commission)에서 권장하는 한 글자 기호로 지칭된다.
아미노산과 관련하여 사용될 때, 용어 "천연 발생"은 20가지 통상적인 아미노산(즉, 알라닌(A), 시스테인(C), 아스파트산(D), 글루탐산(E), 페닐알라닌(F), 글리신(G), 히스티딘(H), 이소류신(I), 리신(K), 류신(L), 메티오닌(M), 아스파라긴(N), 프롤린(P), 글루타민(Q), 아르기닌(R), 세린(S), 트레오닌(T), 발린(V), 트립토판(W), 및 티로신(Y))과, 셀레노시스테인, 피롤리신, 및 피롤린-카복시리신을 나타낸다.
본원에서 사용되는 용어 "비천연 아미노산"은 임의의 유기체의 유전자 코드에서 천연적으로 암호화되지 않거나 발견되지 않는 아미노산을 지칭하는 의미이다. 이러한 아미노산은 예를 들어 순전히 합성인 화합물일 수 있다. 비천연 아미노산의 예는 하이드록시프롤린, 감마-카복시글루타메이트, O-포스포세린, 아제티딘카복실산, 2-아미노아디프산, 3-아미노아디프산, 베타-알라닌, 아미노프로피온산, 2-아미노부티르산, 4-아미노부티르산, 6-아미노카프로산, 2-아미노카프로, 2-아미노이소부티르산, 3-아미노이소부티르산, 2-아미노피멜산, 3차-부틸글리신, 2,4-디아미노이소부티르산, 데스모신, 2,2'-디아미노피멜산, 2,3-디아미노프로피온산, N-에틸글리신, N-메틸글리신, N-에틸아스파라긴, 호모프롤린, 하이드록시리신, 알로-하이드록시리신, 3-하이드록시프롤린, 4-하이드록시프롤린, 이소데스모신, 알로-이소류신, N-메틸알라닌, N-메틸글리신, N-메틸이소류신, N-메틸펜틸글리신, N-메틸발린, 나프탈라닌, 노르발린, 노르류신, 오르니틴, D-오르니틴, D-아르기닌, p-아미노페닐알라닌, 펜틸글리신, 피페콜산, 및 티오프롤린을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
본원에서 사용되는 용어 "아미노산 유사체"는 천연 발생 아미노산과 동일한 기본 화학 구조를 갖는 화합물을 지칭한다. 아미노산 유사체는 가역적 또는 비가역적으로, 화학적으로 차단되거나, C-말단 카복시기, N-말단 아미노기, 및/또는 측쇄 기능성 기가 화학적으로 변형된 천연 및 비천연 아미노산을 포함한다. 이러한 유사체는 메티오닌 설폭사이드, 메티오닌 설폰, S-(카복시메틸)-시스테인, S-(카복시메틸)-시스테인 설폭사이드, S-(카복시메틸)-시스테인 설폰, 아스파트산-(베타메틸에스테르), N-에틸글리신, 알라닌 카복사미드, 호모세린, 노르류신, 및 메티오닌 메틸 설포늄을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
본원에서 사용되는 용어 "아미노산 모방체"는 아미노산의 일반 화학 구조와는 상이한 구조를 갖지만 천연 발생 아미노산과 유사한 방식으로 기능하는 화합물을 지칭한다.
일 구현예에서, X1 및 X2는 리신(K), 글루타민(Q), 및 아르기닌(R)으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다. 일 구현예에서, X1X2는 KK, KQ, KR, QK, QQ, QR, RK, RQ, 및 RR로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일 구현예에서, 적어도 하나의 프로테아제-절단 부위는 아미노산 서열 HRRRKRSVDE(서열번호 43) 또는 아미노산 서열 HRRQQRSVDE(서열번호 44)를 포함한다.
일 구현예에서, 링커의 프로테아제-절단은 단백질의 활성 변화를 유발한다.
일 구현예에서, 활성 변화는 적어도 하나의 항원에 대한 결합 또는 증가된 결합이다.
본 발명에 따른 용어 "결합"은 바람직하게는 특이적 결합과 관련된다. 항체 또는 항체 유도체와 같은 결합제가 소정 표적에 결합할 수 있지만 다른 표적에 (실질적으로) 결합할 수 없는 경우, 해당 결합제는 상기 소정 표적에 대해 특이적이다.
본 발명에 따르면, 항체 또는 항체 유도체와 같은 결합제가 소정 표적에 대해 유의한 친화도를 갖고 표준 분석에서 상기 소정 표적에 결합하는 경우, 해당 결합제는 상기 소정 표적에 결합할 수 있다. "친화도" 또는 "결합 친화도"는 흔히 평형 해리 상수(KD)에 의해 측정된다. 바람직하게, 용어 "유의한 친화도"는 해리 상수(KD)가 10-5 M 이하, 10-6 M 이하, 10-7 M 이하, 10-8 M 이하, 10-9 M 이하, 10-10 M 이하, 10-11 M 이하, 또는 10-12 M 이하인 소정 표적에 대한 결합을 의미한다.
제제가 표적에 대해 유의한 친화도를 갖지 않고 표준 분석에서 상기 표적에 유의하게 결합하지 않는 경우, 특히 검출가능하게 결합하지 않는 경우, 해당 제제는 상기 표적에 (실질적으로) 결합할 수 없다. 바람직하게는, 제제가 최대 2, 바람직하게는 10, 더 바람직하게는 20, 특히 50 또는 100 μg/ml 이상의 농도로 존재하는 경우, 해당 제제는 상기 표적에 검출가능하게 결합하지 않는다. 바람직하게는, 제제가 결합할 수 있는 소정 표적에 대한 결합의 KD보다 적어도 10배, 100배, 103배, 104배, 105배, 또는 106배 더 높은 KD로 표적에 결합하는 경우, 해당 제제는 상기 표적에 대해 유의한 친화도를 갖지 않는다. 예를 들어, 제제가 결합할 수 있는 표적에 대한 제제의 결합의 KD가 10-7 M인 경우, 제제가 유의한 친화도를 갖지 않는 표적에 대한 결합의 KD는 적어도 10-6 M, 10-5 M, 10-4 M, 10-3 M, 10-2 M, 또는 10-1 M일 것이다.
표적에 대한 제제의 결합은 임의의 적합한 방법(예를 들어, 문헌[Berzofsky et al., "Antibody-Antigen Interactions" In Fundamental Immunology, Paul, W. E., Ed., Raven Press New York, N Y (1984), Kuby, Janis Immunology, W. H. Freeman and Company New York, N Y (1992)], 및 본원에 기술된 방법 참조)을 사용하여 실험적으로 측정될 수 있다. 친화도는 평형 투석과 같은 통상적인 기술의 사용; 제조업체가 제시한 일반 절차에 따른 BIAcore 2000 장비의 사용; 방사성표지 표적 항원을 이용한 방사면역측정법; 또는 당업자에게 알려진 다른 방법에 의해 용이하게 측정될 수 있다. 친화도 데이터는 예를 들어 문헌[Scatchard et al., Ann N.Y. Acad. ScL, 51:660 (1949)]의 방법에 의해 분석될 수 있다. 특정 항체-항원 상호작용의 측정된 친화도는 다른 조건(예를 들어, 염 농도, pH)에서 측정되는 경우 달라질 수 있다. 따라서, 친화도 및 다른 항원-결합 파라미터, 예를 들어 KD, IC50의 측정은 바람직하게는 항체 및 항원의 표준 용액, 및 표준 완충제를 사용하여 수행된다.
용어 "증가된 결합"은 프로테아제-절단 전의 결합에 비해 적어도 50%, 적어도 100%, 적어도 200%, 적어도 300%, 적어도 400%, 또는 적어도 500%만큼 증가된 결합을 의미할 수 있다.
일 구현예에서, 프로테아제-절단은 세포 내에서, 예를 들어 본원에 정의된 바와 같은 숙주 세포 내에서 일어난다. 따라서, 프로테아제-절단가능 링커에 포함된 프로테아제-절단 부위는 세포내 처리 부위로 지칭될 수도 있다. 본 발명에 따른 프로테아제-절단가능 링커는 생체내 절단가능 링커로 지칭될 수도 있다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 적어도 하나의 프로테아제-절단 부위를 포함하는 본 발명에 따른 프로테아제-절단가능 링커는 프로테아제(예를 들어, 푸린 및/또는 푸린-유사 프로테아제), 특히 외인성 프로테아제의 공동발현 없이 세포내/생체내에서 절단/처리된다. 본원에서 사용되는 용어 "공동발현"은, 예를 들어 프로테아제를 암호화하는 핵산으로 숙주 세포를 형질감염시켜 프로테아제를 발현하도록 숙주 세포를 유전적으로 조작하는 것과 같은 인공적인 공동발현을 지칭하는 의미이다.
일 구현예에서, 프로테아제-절단가능 링커는 2개의 프로테아제-절단 부위를 포함하고, 2개의 프로테아제-절단 부위는 각각 프로테아제-절단가능 링커의 N-말단 및 C-말단에 위치하고, 2개의 프로테아제-절단 부위는 동일하거나 상이할 수 있다.
일 구현예에서, 프로테아제-절단가능 링커는 10 내지 80개의 아미노산 잔기, 바람직하게는 20 내지 80개의 아미노산, 더 바람직하게는 20 내지 70개의 아미노산, 더 바람직하게는 30 내지 70개의 아미노산, 더욱 더 바람직하게는 30 내지 60개의 아미노산의 길이를 갖는다.
일 구현예에서, 적어도 하나의 프로테아제-절단 부위의 앞 및/또는 뒤에는 글리신 및 세린으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 또는 10개 이상의 연속 아미노산 잔기가 배치된다.
일 구현예에서, 프로테아제-절단가능 링커는 (GS)n, (G4S)n(서열번호 51), (HH)n, (EAAAK)n(서열번호 52), (AP)nA(서열번호 53), (KQGKQ)n(서열번호 54), 및 이들의 조합으로 이루어진 군(n은 1 내지 12, 바람직하게는 1 내지 10에서 선택되는 정수임)으로부터 선택되는 아미노산 서열을 추가로 포함한다. 일 구현예에서, 프로테아제-절단가능 링커는 아미노산 서열 (G4S)n(서열번호 51)을 포함한다(n은 2 내지 10, 바람직하게는 4 내지 10에서 선택되는 정수임).
일 구현예에서, 프로테아제-절단가능한 추가 링커는 GSHHHHHHHHGGGGS(서열번호 45), GGGGSEAAAKEAAAKGGGGS(서열번호 46), APAPAPAPAPAPAPA(서열번호 47), GSKQGKQKQGKQGS(서열번호 48), 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다.
일 구현예에서, 프로테아제-절단가능 링커(PCL)는 PCSA-L-PCSB 구조를 가지며, PCSA와 PCSB는 동일하거나 상이할 수 있는, 본원에 정의된 바와 같은 프로테아제-절단 부위이고, L은 상기 정의된 바와 같은, 서열번호 45 내지 48 및 51 내지 54, (GS)n, (HH)n, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 링커이다.
일 구현예에서, PP1은 적어도 하나의 면역글로불린 불변 영역 및/또는 적어도 하나의 면역글로불린 가변 영역을 포함하고/하거나, PP2는 적어도 하나의 면역글로불린 불변 영역 및/또는 적어도 하나의 면역글로불린 가변 영역을 포함한다.
일 구현예에서, 단백질은 항체 또는 항체 유도체이다.
일 구현예에서, 단백질은 단일쇄 항체, 바람직하게는 다중특이적(예를 들어, 이중특이적, 삼중특이적, 사중특이적, 오중특이적, 육중특이적 등) 단일쇄 항체이다. 본원에서 사용되는 용어 "단일쇄 항체"는 또한, 바람직하게는 적어도 하나의 공유 또는 비공유 결합(예를 들어, 2개의 이황화 결합)을 통해 서로 회합된 1개 초과(예를 들어, 2개)의 단일쇄를 포함하는 항체 또는 항체 유도체를 지칭한다.
용어 "항체"(또는 "면역글로불린")는 이황화 결합에 의해 상호 연결된 적어도 2개의 중(H)쇄 및 2개의 경(L)쇄를 포함하는 당단백질이다. 용어 "항체"는 단일클론 항체, 재조합 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 및 이들 중 임의의 것의 조합을 포함한다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역(VH) 및 중쇄 불변 영역(CH)으로 구성된다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역(VL) 및 경쇄 불변 영역(CL)으로 구성된다. 가변 영역 및 불변 영역은 본원에서 각각 가변 도메인 및 불변 도메인으로도 지칭된다. VH 및 VL 영역은 프레임워크 영역(FR)으로 지칭되는 더 보존된 영역 사이에 배치된 상보성 결정 영역(CDR)으로 지칭되는 초가변성의 영역들로 더 세분될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 아미노-말단에서 카복시-말단으로 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4의 순서로 배열된 3개의 CDR 및 4개의 FR로 구성된다. VH의 CDR은 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3로 지칭되고, VL의 CDR은 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3로 지칭된다. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 포함한다. 항체의 불변 영역은 중쇄 불변 영역(CH) 및 경쇄 불변 영역(CL)을 포함하며, CH는 불변 도메인 CH1, 힌지 영역, 및 불변 도메인 CH2 및 CH3(아미노-말단에서 카복시 말단으로 CH1, CH2, CH3의 순서로 배열됨)로 더 세분될 수 있다. 항체의 불변 영역은 면역계의 다양한 세포(예를 들어, 이펙터 세포) 및 전형적인 보체계의 첫 번째 구성요소(C1q)를 포함한, 숙주 조직 또는 인자에 대한 면역글로불린의 결합을 매개할 수 있다. 일 구현예에서, CL 영역/도메인은 본원에서 Cκ 영역/도메인으로 지칭된다.
항체는 마우스, 래트, 토끼, 기니피그, 및 인간을 포함하는(이에 한정되지 않음) 다양한 종으로부터 유래될 수 있다.
본원에 기술된 항체는 IgA, 예컨대 IgA1 또는 IgA2, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgE, IgM, 및 IgD 항체를 포함한다. 다양한 구현예에서, 항체는 IgG1 항체, 더 구체적으로는 IgG1 카파 또는 IgG1 람다 이소형(즉, IgG1, κ, λ), IgG2a 항체(예를 들어, IgG2a, κ, λ), IgG2b 항체(예를 들어, IgG2b, κ, λ), IgG3 항체(예를 들어, IgG3, κ, λ), 또는 IgG4 항체(예를 들어, IgG4, κ, λ)이다. 일 구현예에서, 항체 또는 항체 유도체는 각각 IgG1 항체 또는 IgG1 항체 유도체이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "이소형"은 중쇄 불변 영역 유전자에 의해 암호화되는 항체 클래스(예를 들어, IgM 또는 IgG1)를 지칭한다. "이소형 전환"은 항체의 클래스 또는 이소형이 하나의 Ig 클래스에서 다른 Ig 클래스 중 하나로 변경되는 현상을 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 "단일클론 항체"는 단일 분자 조성물의 항체 분자 제제를 지칭한다. 단일클론 항체는 단일 결합 특이성 및 친화도를 나타낸다. 일 구현예에서, 단일클론 항체는 불멸화 세포에 융합된 비인간 동물, 예를 들어 마우스에서 획득된 B세포를 포함하는 하이브리도마에 의해 생성된다.
본원에서 사용되는 용어 "힌지" 또는 "힌지 영역"은 IgG 및 IgA, 특히 IgG(즉, IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4, 특히 IgG1) 면역글로불린 클래스의 중쇄 중심부에서 이황화 결합에 의해 이 두 사슬을 연결하는 유연한 아미노산 스트레치를 지칭한다.
본원에서 사용되는 용어 "항체 유도체"는 포함하는 것으로 명시된 적어도 도메인을 포함하고 여전히 표적 분자에 결합할 수 있지만 IgA, IgD, IgE, IgG, IgM, IgY, 또는 IgW와 같은 항체의 전체 구조를 갖지 않는 분자를 지칭한다. 상기 유도체는 이의 기능적(즉, 표적 결합, 특히 특이적 표적 결합) 항체 단편, 예컨대 Fab2, 또는 이러한 유도체의 조합, 예를 들어 2가 Fab일 수 있으나 이에 한정되지 않는다. 이는 또한 추가 가변 도메인과 같은 추가 항체 도메인이 추가된 항체와 관련된다. 일 구현예에서, 용어 "항체 유도체"는 본원에 기술된 바와 같은 단일쇄 항체와 관련된다. 따라서, 용어 "항체 유도체"는 또한 다중특이적(예를 들어, 이중특이적, 삼중특이적, 사중특이적, 오중특이적, 육중특이적 등) 및 다가(예를 들어, 2가, 3가, 4가 등) 항체를 포함한다.
일 구현예에서,
PP1은 면역글로불린 불변 영역을 포함하고 PP2는 면역글로불린 가변 영역을 포함하거나,
PP1은 면역글로불린 가변 영역을 포함하고 PP2는 면역글로불린 불변 영역을 포함하거나,
PP1은 면역글로불린 불변 영역을 포함하고 PP2는 면역글로불린 불변 영역을 포함하거나,
PP1은 면역글로불린 가변 영역을 포함하고 PP2는 면역글로불린 가변 영역을 포함한다.
일 구현예에서, 단백질은 단일쇄(sC) 단일클론 IgG(예를 들어, 문헌[Spies et al., J Mol Imm. 2015, 67:95-106]에 기술된 것), 단일 경쇄(sLC) 2가 이중특이적 탠덤-IgG(예를 들어, WO 2009/052081 A2에 기술된 것), 단일 경쇄(sLC) 다중특이적 탠덤-IgG(예를 들어, 문헌[Wu et al., Nat. Biotechnol. 2007, 25:1290-1297]에 기술된 것), 단일쇄(sC) 1가 이중특이적 탠덤-유사-IgG(예를 들어, 문헌[Brinkmann & Kontermann, MAbs 2017, 9:182-212]에 기술된 것), 삼중특이적 CODV-sC-Fab-IgG(예를 들어, 문헌[WO 2017/180913 A2 및/또는 Xu et al., Science 2017, 358(6359):85-90]에 기술된 것), 및 단일쇄(sC) 이중특이적 IgG(예를 들어, 문헌[Fitzgerald et al., Mol Cancer Ther. 2013, 13:410-25]에 기술된 것)로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일 구현예에서, 단백질은
(a) VL-CL-PCL-VH-CH1-힌지-CH2-CH3,
[식에서,
VL은 면역글로불린 경쇄 가변 영역이고;
CL은 면역글로불린 경쇄 불변 영역이고;
VH는 면역글로불린 중쇄 가변 영역이고;
CH1은 면역글로불린 CH1 중쇄 불변 영역이고;
힌지는 면역글로불린 힌지 영역이고;
CH2는 면역글로불린 CH2 중쇄 불변 영역이고;
CH3는 면역글로불린 CH3 중쇄 불변 영역이고;
PCL은 프로테아제-절단가능 링커임];
(b) VLa-CLa-PCL-VLb-CLb,
[식에서,
VLa는 제1 면역글로불린 경쇄 가변 영역이고;
VLb는 제2 면역글로불린 경쇄 가변 영역이고;
CLa는 제1 면역글로불린 경쇄 불변 영역이고;
CLb는 제2 면역글로불린 경쇄 불변 영역이고;
PCL은 프로테아제-절단가능 링커임]; 및
(c) VLa-CLa-PCL-VLb-CLb-L-힌지-CH2-CH3
[식에서,
VLa는 제1 면역글로불린 경쇄 가변 영역이고;
VLb는 제2 면역글로불린 경쇄 가변 영역이고;
CLa는 제1 면역글로불린 경쇄 불변 영역이고;
CLb는 제2 면역글로불린 경쇄 불변 영역이고;
L은 임의적 링커이고;
힌지는 면역글로불린 힌지 영역이고;
CH2는 면역글로불린 CH2 중쇄 불변 영역이고;
CH3는 면역글로불린 CH3 중쇄 불변 영역이고;
PCL은 프로테아제-절단가능 링커임]
로 이루어진 군으로부터 선택되는 식을 갖는 폴리펩티드 사슬을 포함한다.
본원에 개시된 식과 관련하여 사용될 때의 기호 (-)는 공유 결합, 특히 펩티드 결합, 또는 하나 이상의 아미노산 잔기, 예를 들어 본원에 기술된 바와 같은 펩티드 링커를 지칭하는 의미이다.
일 구현예에서, L은 5 내지 25개의 아미노산 잔기, 바람직하게는 10 내지 20개의 아미노산 잔기, 바람직하게는 12 내지 18개의 아미노산 잔기, 더 바람직하게는 13 내지 17개의 아미노산 잔기, 더욱 더 바람직하게는 14 내지 16개의 아미노산 잔기, 예를 들어 15개의 아미노산 잔기의 길이를 갖는 것이 바람직한 본원에 정의된 바와 같은 펩티드 링커이다. 일 구현예에서, L은 아미노산 중 적어도 50%, 바람직하게는 적어도 60%, 더 바람직하게는 적어도 70%, 더 바람직하게는 적어도 80%, 더욱 더 바람직하게는 적어도 85%가 각각 글리신 또는 세린 잔기인 글리신-세린-풍부 링커이다. 일 구현예에서, L은 글리신 링커, 세린 링커, 또는 글리신-세린 링커이다. 일 구현예에서, L은 서열 (G4S)n(서열번호 51)을 갖는다(n은 1 내지 5, 예를 들어 1 내지 3, 또는 2 내지 4에서 선택되는 정수임). 일 구현예에서, L은 서열 (G4S)3(서열번호 55)를 갖는다.
일 구현예에서, 단백질은 식 VL-CL-PCL-VH-CH1-힌지-CH2-CH3를 갖는 폴리펩티드 사슬을 포함하고, VL은 VH와 쌍을 이루어 항원 결합 부위를 형성한다.
일 구현예에서, 항원 결합 부위는 프로테아제-절단가능 링커의 프로테아제-절단 시 활성이 되거나 증가된 활성을 나타낸다.
바람직하게는, 본원에서 사용되는 "~와 쌍을 이룬다"는 용어는 규칙적인, 예를 들어 천연 발생적인 면역글로불린, 특히 IgG에서 발생하는 면역글로불린 불변 영역 또는 면역글로불린 가변 영역의 이량체화를 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 "항원 결합 부위"("파라토프"라고도 함)는 항원을 인식하여 이에 결합하는 항체의 부분을 지칭한다.
일 구현예에서, 단백질은 식 VL-CL-PCL-VH-CH1-힌지-CH2-CH3를 갖는 폴리펩티드 사슬의 2개의 카피를 포함하고, 2개의 카피는 적어도 2개의 이황화 결합을 통해 서로 회합된다.
일 구현예에서, 단백질은 식 VLa-CLa-PCL-VHa-CH1a-힌지-CH2-CH3를 갖는 제1 폴리펩티드 사슬, 및 식 VLb-CLb-PCL-VHb-CH1b-힌지-CH2-CH3를 갖는 제2 폴리펩티드 사슬을 포함하고,
식에서,
VLa는 제1 면역글로불린 경쇄 가변 영역이고;
VLb는 제2 면역글로불린 경쇄 가변 영역이고;
CLa는 제1 면역글로불린 경쇄 불변 영역이고;
CLb는 제2 면역글로불린 경쇄 불변 영역이고;
VHa는 제1 면역글로불린 중쇄 가변 영역이고;
VHb는 제2 면역글로불린 중쇄 가변 영역이고;
CH1a는 제1 면역글로불린 CH1 중쇄 불변 영역이고;
CH1b는 제2 면역글로불린 CH1 중쇄 불변 영역이고;
VLa는 VHa와 쌍을 이루어 항원 A에 결합하는 항원 결합 부위를 형성하고, VLb는 VHb와 쌍을 이루어 항원 B에 결합하는 항원 결합 부위를 형성하고;
제1 폴리펩티드 사슬은 적어도 2개의 이황화 결합을 통해, 그리고 임의로 적어도 하나의 추가적인 Fc 상호작용을 통해 제2 폴리펩티드 사슬과 회합된다.
일 구현예에서, 항원 결합 부위 A 및/또는 항원 결합 부위 B는 프로테아제-절단가능 링커의 프로테아제-절단 시 활성이 되거나 증가된 활성을 나타낸다.
본원에서 사용되는 용어 "추가적인 Fc 상호작용"은 본원에 언급된 적어도 2개의 이황화 결합 이외의, 2개의 Fc 분자(예를 들어, 2개의 이종 Fc 분자) 간, 특히 2개의 Fc 분자의 CH3 도메인 간의 상호작용을 의미한다. 추가적인 Fc 상호작용의 예는 노브-인투-홀 상호작용(자세한 내용은 아래 참조), 소수성 상호작용(예를 들어, 특정 돌연변이의 도입으로 인한 상호작용; 예를 들어 문헌[Von Kreudenstein et al., MAbs 2013, 5(5):646-654] 참조), 정전기 상호작용(예를 들어, 정전기 스티어링으로 인한 상호작용; 예를 들어 문헌[Gunasekaran et al., J Biol Chem 2010, 285(25):19637-19646] 참조), IgG 및 IgA의 교번 CH3 세그먼트로 인한 상호작용(SEED technology; 예를 들어 문헌[Davis et al., Protein Eng Des Sel 2010, 23(4):195-202] 참조), CH3 도메인의 C-말단에서의 절단가능한 류신 지퍼와 같은 이종이량체 모듈의 융합으로 인한 상호작용(LUZ-Y technology; 예를 들어 문헌[Wranik et al., J Biol Chem 2012, 287(52):43331-43339] 참조)을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
일 구현예에서, 적어도 하나의 추가적인 Fc 상호작용은 적어도 하나의 노브-인투-홀 상호작용(예를 들어, 2개의 노브-인투-홀 상호작용)이다.
본원에서 사용되는 용어 "노브-인투-홀 상호작용"은 노브-인투-홀 아미노산 변화를 기반으로 하는 상호작용을 의미한다. 이러한 변화는 예를 들어 문헌[Merchant et al., Nat. Biotechnol. 1998, 16:677-681]에 기술된 바와 같이, 예를 들어 이중특이적 항체의 생성에서, 중쇄(H) 면역글로불린 사슬의 이종이량체화에 사용되는 항체 조작에서 잘 알려진 합리적 설계 전략을 나타낸다. 제1 면역글로불린 사슬 또는 제1 항체의 불변 영역(예를 들어, CH3)에 노브를 생성하고 제2 면역글로불린 사슬 또는 제2 항체의 불변 영역(예를 들어, CH3)에 홀을 생성하기 위해 아미노산 변화를 조작한다. 노브는 아미노산의 "매우 큰" IMGT 볼륨 클래스에 속하는 아미노산(예: 티로신, Y)으로 표시되는 반면, 홀은 "작은" IMGT 볼륨 클래스에 속하는 아미노산(예: 트레오닌, T)로 표시된다(20가지 통상적인 아미노산의 IMGT 클래스에 대해서는 문헌[Pommie et al., J. Mol. Recognit. 2004, 17:17-32] 참조). 본 발명에 따른 특히 바람직한 노브-인투-홀 아미노산 변화는 문헌[Spies et al., J Mol Imm. 2015, 67:95-106]에 기술된 것들을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
일 구현예에서, 단백질은 식 VLb-L1-VLa-L2-CL을 갖는 제1 폴리펩티드 사슬, 식 VHa-L3-VHb-L4-CH1-힌지-CH2-CH3를 갖는 제2 폴리펩티드 사슬, 및 식 VLc-CLc-PCL-VHc-CH1c-힌지-CH2-CH3를 갖는 제3 폴리펩티드 사슬을 포함하고,
식에서,
VLa는 제1 면역글로불린 경쇄 가변 영역이고;
VLb는 제2 면역글로불린 경쇄 가변 영역이고;
VLc는 제3 면역글로불린 경쇄 가변 영역이고;
CL은 면역글로불린 경쇄 불변 영역이고;
CLc는 면역글로불린 경쇄 불변 영역이고;
VHa는 제1 면역글로불린 중쇄 가변 영역이고;
VHb는 제2 면역글로불린 중쇄 가변 영역이고;
VHc는 제3 면역글로불린 중쇄 가변 영역이고;
CH1은 면역글로불린 CH1 중쇄 불변 영역이고;
CH1c는 면역글로불린 CH1 중쇄 불변 영역이고;
힌지는 면역글로불린 힌지 영역이고;
CH2는 면역글로불린 CH2 중쇄 불변 영역이고;
CH3는 면역글로불린 CH3 중쇄 불변 영역이고;
L1, L2, L3, 및 L4는 링커이고,
VLa는 VHa와 쌍을 이루어 항원 A에 결합하는 항원 결합 부위를 형성하고, VLb는 VHb와 쌍을 이루어 항원 B에 결합하는 항원 결합 부위를 형성하고, VLc는 VHc와 쌍을 이루어 항원 C에 결합하는 항원 결합 부위를 형성하고;
제2 폴리펩티드 사슬은 적어도 2개의 이황화 결합을 통해, 그리고 임의로 적어도 하나의 추가적인 Fc 상호작용을 통해 제3 폴리펩티드 사슬과 회합된다.
일 구현예에서, 항원 결합 부위 C는 프로테아제-절단가능 링커의 프로테아제-절단 시 활성이 되거나 증가된 활성을 나타낸다.
일 구현예에서, 적어도 하나의 추가적인 Fc 상호작용은 적어도 하나의 노브-인투-홀 상호작용(예를 들어, 2개의 노브-인투-홀 상호작용)이다.
일 구현예에서, L1, L2, L3, 및 L4는 1 내지 25, 바람직하게는 2 내지 25, 더 바람직하게는 5 내지 20, 더 바람직하게는 10 내지 20개의 아미노산 잔기의 길이를 갖는 것이 바람직한 본원에 정의된 바와 같은 펩티드 링커로부터 독립적으로 선택된다. 일 구현예에서, L1, L2, L3, 및 L4는 아미노산 중 적어도 50%, 바람직하게는 적어도 60%, 더 바람직하게는 적어도 70%, 더 바람직하게는 적어도 80%, 더욱 더 바람직하게는 적어도 85%가 각각 글리신 또는 세린 잔기인 글리신-세린-풍부 링커이다. 일 구현예에서, L1, L2, L3, 및 L4는 각각 글리신 링커, 세린 링커, 또는 글리신-세린 링커이다. 일 구현예에서, L1, L2, L3, 및 L4는 서열 (G4S)n(서열번호 51)을 갖는다(n은 1 내지 5, 예를 들어 1 내지 3, 또는 2 내지 4에서 독립적으로 선택되는 정수임).
일 구현예에서, 단백질은 식 VLa-CLa-PCL-VLb-CLb를 갖는 제1 폴리펩티드 사슬, 및 식 VHa-CH1a-L-VHb-CH1b-힌지-CH2-CH3를 갖는 제2 폴리펩티드 사슬을 포함하고,
식에서,
VHa는 제1 면역글로불린 중쇄 가변 영역이고;
VHb는 제2 면역글로불린 중쇄 가변 영역이고;
CH1a는 제1 면역글로불린 CH1 중쇄 불변 영역이고;
CH1b는 제2 면역글로불린 CH1 중쇄 불변 영역이고;
L은 임의적 링커이고;
힌지는 면역글로불린 힌지 영역이고;
CH2는 면역글로불린 CH2 중쇄 불변 영역이고;
CH3는 면역글로불린 CH3 중쇄 불변 영역이고;
VLa는 VHa와 쌍을 이루어 항원 A에 결합하는 항원 결합 부위를 형성하고, VLb는 VHb와 쌍을 이루어 항원 B에 결합하는 항원 결합 부위를 형성한다.
일 구현예에서, 항원 결합 부위 B는 프로테아제-절단가능 링커의 프로테아제-절단 시 활성이 되거나 증가된 활성을 나타낸다.
일 구현예에서, L은 본원에 정의된 바와 같은 펩티드 링커이다. 일 구현예에서, L은 5 내지 25개의 아미노산 잔기, 바람직하게는 10 내지 20개의 아미노산 잔기의 길이를 갖는다.
일 구현예에서, 단백질은 제1 폴리펩티드 사슬의 2개의 카피 및 제2 폴리펩티드 사슬의 2개의 카피를 포함하고, 제2 폴리펩티드 사슬의 2개의 카피는 적어도 2개의 이황화 결합을 통해 서로 회합된다.
일 구현예에서, 단백질은 식 VLa-CLa-PCL-VLb-CLb를 갖는 제1 폴리펩티드 사슬, 식 VLc-CLc-PCL-VLd-CLd를 갖는 제2 폴리펩티드 사슬, 식 VHa-CH1a-L-VHb-CH1b-힌지-CH2-CH3를 갖는 제3 폴리펩티드 사슬, 및 식 VHc-CH1c-L-VHd-CH1d-힌지-CH2-CH3를 갖는 제4 폴리펩티드 사슬을 포함하고,
식에서,
VLa는 제1 면역글로불린 경쇄 가변 영역이고;
VLb는 제2 면역글로불린 경쇄 가변 영역이고;
VLc는 제3 면역글로불린 경쇄 가변 영역이고;
VLd는 제4 면역글로불린 경쇄 가변 영역이고;
CLa는 제1 면역글로불린 경쇄 불변 영역이고;
CLb는 제2 면역글로불린 경쇄 불변 영역이고;
CLc는 제3 면역글로불린 경쇄 불변 영역이고;
CLd는 제4 면역글로불린 경쇄 불변 영역이고;
VHa는 제1 면역글로불린 중쇄 가변 영역이고;
VHb는 제2 면역글로불린 중쇄 가변 영역이고;
VHc는 제3 면역글로불린 중쇄 가변 영역이고;
VHd는 제4 면역글로불린 중쇄 가변 영역이고;
CH1a는 제1 면역글로불린 CH1 중쇄 불변 영역이고;
CH1b는 제2 면역글로불린 CH1 중쇄 불변 영역이고;
CH1c는 제3 면역글로불린 CH1 중쇄 불변 영역이고;
CH1d는 제4 면역글로불린 CH1 중쇄 불변 영역이고;
L은 임의적 링커이고;
힌지는 면역글로불린 힌지 영역이고;
CH2는 면역글로불린 CH2 중쇄 불변 영역이고;
CH3는 면역글로불린 CH3 중쇄 불변 영역이고;
VLa는 VHa와 쌍을 이루어 항원 A에 결합하는 항원 결합 부위를 형성하고, VLb는 VHb와 쌍을 이루어 항원 B에 결합하는 항원 결합 부위를 형성하고, VLc는 VHc와 쌍을 이루어 항원 C에 결합하는 항원 결합 부위를 형성하고, VLd는 VHd와 쌍을 이루어 항원 D에 결합하는 항원 결합 부위를 형성하고;
제3 폴리펩티드 사슬은 적어도 2개의 이황화 결합을 통해, 그리고 임의로 적어도 하나의 추가적인 Fc 상호작용을 통해 제4 폴리펩티드 사슬과 회합된다.
일 구현예에서, 항원 결합 부위 B 및/또는 항원 결합 부위 D는 프로테아제-절단가능 링커의 프로테아제-절단 시 활성이 되거나 증가된 활성을 나타낸다.
일 구현예에서, 적어도 하나의 추가적인 Fc 상호작용은 적어도 하나의 노브-인투-홀 상호작용(예를 들어, 2개의 노브-인투-홀 상호작용)이다.
일 구현예에서, L은 본원에 정의된 바와 같은 펩티드 링커이다. 일 구현예에서, L은 5 내지 25개의 아미노산 잔기, 바람직하게는 10 내지 20개의 아미노산 잔기의 길이를 갖는다.
일 구현예에서, 단백질은 식 VLa-CLa-PCL-VLb-CLb-L-힌지-CH2-CH3를 갖는 제1 폴리펩티드 사슬, 및 식 VHa-CH1a-L-VHb-CH1b-힌지-CH2-CH3를 갖는 제2 폴리펩티드 사슬을 포함하고,
식에서,
VHa는 제1 면역글로불린 중쇄 가변 영역이고;
VHb는 제2 면역글로불린 중쇄 가변 영역이고;
CH1a는 제1 면역글로불린 CH1 중쇄 불변 영역이고;
CH1b는 제2 면역글로불린 CH1 중쇄 불변 영역이고;
L은 임의적 링커이고;
힌지는 면역글로불린 힌지 영역이고;
CH2는 면역글로불린 CH2 중쇄 불변 영역이고;
CH3는 면역글로불린 CH3 중쇄 불변 영역이고;
VLa는 VHa와 쌍을 이루어 항원 A에 결합하는 항원 결합 부위를 형성하고, VLb는 VHb와 쌍을 이루어 항원 B에 결합하는 항원 결합 부위를 형성하고;
제1 폴리펩티드 사슬은 적어도 2개의 이황화 결합을 통해, 그리고 임의로 적어도 하나의 추가적인 Fc 상호작용을 통해 제2 폴리펩티드 사슬과 회합된다.
일 구현예에서, 항원 결합 부위 B는 프로테아제-절단가능 링커의 프로테아제-절단 시 활성이 되거나 증가된 활성을 나타낸다.
일 구현예에서, 적어도 하나의 추가적인 Fc 상호작용은 적어도 하나의 노브-인투-홀 상호작용(예를 들어, 2개의 노브-인투-홀 상호작용)이다.
일 구현예에서, L은 본원에 정의된 바와 같은 펩티드 링커이다. 일 구현예에서, L은 5 내지 25개의 아미노산 잔기, 바람직하게는 10 내지 20개의 아미노산 잔기의 길이를 갖는다.
다른 양태에서, 본 발명은 본원에 정의된 바와 같은 단백질을 암호화하는 핵산 또는 핵산 세트에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, "핵산"(또는 "핵산 분자")은 바람직하게는 데옥시리보핵산(DNA) 또는 리보핵산(RNA)이다. 핵산 분자는 본 발명에 따르면, 단일가닥 또는 이중가닥이며 선형이거나 공유적으로 폐쇄되어 원을 형성하는 분자의 형태일 수 있다.
용어 "DNA"는 데옥시리보뉴클레오티드 잔기를 포함하며 바람직하게는 전적으로 또는 실질적으로 데옥시리보뉴클레오티드 잔기로 구성된 분자와 관련된다. "데옥시리보뉴클레오티드"는 베타-D-리보푸라노실기의 2'-위치에 하이드록실기가 결여된 뉴클레오티드와 관련된다. 용어 "DNA"는 단리된 DNA, 예컨대 부분적으로 또는 완전히 정제된 DNA, 본질적으로 순수한 DNA, 합성 DNA, 및 재조합적으로 생성된 DNA를 포함하며, 하나 이상의 뉴클레오티드의 부가, 결실, 치환, 및/또는 변경에 의해 천연 발생 DNA와는 다른 변형 DNA를 포함한다. 이러한 변경은 예를 들어 DNA의 말단(들)에 또는 내부에, 예를 들어 DNA의 하나 이상의 뉴클레오티드에 비뉴클레오티드 물질이 부가되는 것을 포함할 수 있다. DNA 분자의 뉴클레오티드는 또한 비표준 뉴클레오티드, 예컨대 비천연 뉴클레오티드 또는 화학적 합성 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 이러한 변경된 DNA는 유사체 또는 천연 발생 DNA의 유사체로 지칭될 수 있다. 뉴클레오티드와 관련하여 사용될 때, 용어 "천연 발생"은 염기 아데닌(A), 시토신(C), 구아닌(G), 티민(T), 및 우라실(U)을 나타낸다.
용어 "RNA"는 리보뉴클레오티드 잔기를 포함하며 바람직하게는 전적으로 또는 실질적으로 리보뉴클레오티드 잔기로 구성된 분자와 관련된다. "리보뉴클레오티드"는 베타-D-리보푸라노실기의 2'-위치에 하이드록실기를 갖는 뉴클레오티드와 관련된다. 용어 "RNA"는 단리된 RNA, 예컨대 부분적으로 또는 완전히 정제된 RNA, 본질적으로 순수한 RNA, 합성 RNA, 및 재조합적으로 생성된 RNA를 포함하며, 하나 이상의 뉴클레오티드의 부가, 결실, 치환, 및/또는 변경에 의해 천연 발생 RNA와는 다른 변형 RNA를 포함한다. 이러한 변경은 예를 들어 RNA의 말단(들)에 또는 내부에, 예를 들어 RNA의 하나 이상의 뉴클레오티드에 비뉴클레오티드 물질이 부가되는 것을 포함할 수 있다. RNA 분자의 뉴클레오티드는 또한 비표준 뉴클레오티드, 예컨대 비천연 뉴클레오티드 또는 화학적 합성 뉴클레오티드 또는 데옥시뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 이러한 변경된 RNA는 유사체 또는 천연 발생 RNA의 유사체로 지칭될 수 있다. 본 발명에 따르면, "RNA"는 단일가닥 RNA 또는 이중가닥 RNA를 나타낸다. 일 구현예에서, RNA는 mRNA, 예를 들어 시험관내 전사된 RNA(IVT RNA) 또는 합성 RNA이다. 또한 RNA는 예를 들어 RNA의 안정성(예를 들어, 반감기)을 증가시키는 하나 이상의 변형에 의해 변형될 수 있다. 이러한 변형은 당업자에게 알려져 있으며, 예를 들어 5'-캡 또는 5'캡 유사체를 포함한다.
다른 양태에서, 본 발명은 본원에 정의된 바와 같은 핵산 또는 핵산 세트를 포함하는 벡터 또는 벡터 세트에 관한 것이다.
본원에서 사용되는 용어 "벡터"는 플라스미드 벡터, 코스미드 벡터, 파지 벡터, 예컨대 람다 파지, 바이러스 벡터, 예컨대 아데노바이러스 또는 바큘로바이러스 벡터, 또는 인공 염색체 벡터, 예컨대 박테리아 인공 염색체(BAC), 효모 인공 염색체(YAC), 또는 P1 인공 염색체(PAC)를 비롯하여 당업자에게 알려진 모든 벡터를 포함한다. 상기 벡터는 발현 벡터와 클로닝 벡터를 포함한다. 발현 벡터는 플라스미드와 바이러스 벡터를 포함하며, 일반적으로, 목적하는 암호화 서열 및 특정 숙주 유기체(예를 들어, 박테리아, 효모, 식물, 곤충, 또는 포유류) 또는 시험관내 발현 시스템에서 작동가능하게 연결된 암호화 서열의 발현에 필요한 적절한 DNA 서열을 포함한다. 일반적으로 클로닝 벡터는 목적하는 특정 DNA 단편의 조작 및 증폭에 사용되며, 목적하는 DNA 단편의 발현에 필요한 기능적 서열이 결여되어 있을 수 있다.
대안적으로, 본 발명에 따른 핵산 분자는 게놈, 예를 들어 숙주 세포의 게놈 내로 통합될 수 있다. 특정 핵산 분자를 게놈 내로 통합시키는 수단 및 방법은 당업자에게 알려져 있다.
다른 양태에서, 본 발명은 본원에 정의된 바와 같은 단백질, 본원에 정의된 바와 같은 핵산 또는 핵산 세트, 또는 본원에 정의된 바와 같은 벡터 또는 벡터 세트를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다.
용어 "세포" 또는 "숙주 세포"는 바람직하게는 온전한 세포, 즉 효소, 소기관, 또는 유전 물질과 같은 정상적인 세포내 성분을 방출하지 않은 온전한 막을 가진 세포와 관련된다. 온전한 세포는 바람직하게는 생존가능 세포, 즉 정상적인 대사 기능을 수행할 수 있는 살아있는 세포이다. 바람직하게, 상기 용어는 본 발명에 따르면, 외인성 핵산으로 형질감염될 수 있는 임의의 세포와 관련된다. 바람직하게, 이러한 세포는 외인성 핵산으로 형질감염되어 수여체에게 전달되면 수여체에서 상기 핵산을 발현할 수 있다. 용어 "세포"는 박테리아 세포를 포함하고; 기타 유용한 세포는 효모 세포, 진균 세포, 또는 포유류 세포이다. 적합한 박테리아 세포는 에셰리키아 콜라이(Escherichia coli), 프로테우스(Proteus), 및 슈도모나스(Pseudomonas) 균주와 같은 그람-음성 박테리아 균주, 및 바실루스(Bacillus), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 스타필로코커스(Staphylococcus), 및 락토코커스(Lactococcus) 균주와 같은 그람-양성 박테리아 균주로부터 유래된 세포를 포함한다. 적합한 진균 세포는 트리코데르마(Trichoderma), 뉴로스포라(Neurospora), 및 아스페르길루스(Aspergillus) 종으로부터 유래된 세포를 포함한다. 적합한 효모 세포는 사카로마이세스(Saccharomyces) 종(예를 들어, 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)), 시조사카로마이세스(Schizosaccharomyces) 종(예를 들어, 시조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe)), 피키아(Pichia) 종(예를 들어, 피키아 파스토리스(Pichia pastoris) 및 피키아 메타놀리카(Pichia methanolica)), 및 한세눌라(Hansenula) 종으로부터 유래된 세포를 포함한다. 적합한 포유류 세포는 예를 들어 CHO 세포, BHK 세포, HeLa 세포, COS 세포, HEK 293(예를 들어, HEK 293-FS) 등을 포함한다. 그러나, 양서류 세포, 곤충 세포, 식물 세포, 및 이종 단백질의 발현을 위해 당업계에서 사용되는 임의의 다른 세포도 또한 사용될 수 있다. "세포" 또는 "숙주 세포"는 단리되거나, 조직 또는 유기체, 특히 "비인간 유기체"의 일부일 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "비인간 유기체"는 비인간 영장류 또는 그 밖의 동물, 특히 소, 말, 돼지, 양, 염소, 개, 고양이, 토끼와 같은 포유류 또는 마우스, 래트, 기니피그, 및 햄스터와 같은 설치류를 포함하는 의미이다.
일 구현예에서, 숙주 세포는 내인성 또는 외인성 푸린 및/또는 푸린-유사 프로테아제를 발현한다.
일 구현예에서, 숙주 세포는 포유류 세포이다. 일 구현예에서, 포유류 세포는 바람직하게는 CHO 9E4, ExpiCHO, CHO DG44, 및 CHO K1으로 이루어진 군으로부터 선택되는 CHO 세포이다.
일 양태에서, 본 발명은 단백질, 예를 들어 본원에 정의된 바와 같은 단백질을 생성하는 방법으로서,
i) 본원에 정의된 바와 같은 숙주 세포를 배양하는 단계; 및
ii) 숙주 세포로부터 단백질을 단리하는 단계를 포함하는 단백질 생성 방법에 관한 것이다.
일 구현예에서, 상기 숙주 세포는 상기 단백질의 발현이 가능한 조건하에 배양된다.
다른 양태에서, 본 발명은 본원에 정의된 바와 같은 방법에 의해 얻을 수 있는(또는 얻은) 단백질에 관한 것이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 본원에 정의된 바와 같은 단백질의 푸린 및/또는 푸린-유사 프로테아제-절단에 의해 얻을 수 있는(또는 얻은) 단백질에 관한 것이다.
일 구현예에서, 본원에 정의된 바와 같은 단백질은 치료 활성 단백질이다.
본원에서 사용되는 용어 "치료 활성 단백질"은 치료에 적합한, 즉 질환 또는 장애를 치료하는 데 사용될 수 있는 단백질을 지칭한다. 일 구현예에서, 치료 활성 단백질은 치료적으로 관련된 항원에 결합하는 항체 또는 항체 유도체이다.
본원에 기술된 바와 같은 모든 항체 및 항체 유도체의 경우, 치료적으로 관련된 항원은 예를 들어 IL-4, IL-13, PD-1, 4.1BB, OX40, 및 GITR로 이루어진 군으로부터 각 특이성에 대해 독립적으로 선택된다. 본원에 기술된 바와 같은 모든 이중특이적 항체 및 항체 유도체의 경우, 항원 쌍은 예를 들어 항원 쌍 IL-4 & IL-13, PD-1 & OX40, PD-1 & GITR, 및 PD-1 & 4.1BB로 이루어진 군으로부터 선택된다. 본원에 기술된 모든 삼중특이적 항체 또는 항체 유도체의 경우, 2개의 항원은 예를 들어 항원 쌍 IL-4 & IL-13, PD-1 & OX40, PD-1 & GITR, 및 PD-1 & 4.1BB로 이루어진 군으로부터 선택된다. 제3 및 제4 항원은 상기 목록에서 선택되는 다른 항원일 수 있다. 본원에 기술된 바와 같은 삼중특이적 항체 또는 항체 유도체의 일 구현예에서, 항원은 PD-1, GITR, 및 OX40이다.
일 양태에서, 본 발명은 치료에 사용하기 위한 본원에 정의된 바와 같은 단백질에 관한 것이다.
다른 양태에서, 본 발명은 의약의 제조에 있어서 본원에 정의된 바와 같은 단백질의 용도에 관한 것이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 본원에 정의된 바와 같은 단백질의 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 질환 또는 장애의 치료 방법에 관한 것이다.
본원에서 사용되는 용어 "의약"은 치료법에서, 즉 질환 또는 장애의 치료에서 사용되는 물질/조성물을 의미한다.
"치료"는 질환 또는 장애를 예방하거나 제거하기 위해; 대상체에서 질환 또는 장애의 저지하거나 늦추기 위해; 대상체에서 새로운 질환 또는 장애의 발병을 억제하거나 늦추기 위해; 질환 또는 장애가 현재 있거나 이전에 있었던 대상체에서 증상 및/또는 재발의 빈도 또는 중증도를 감소시키기 위해; 그리고/또는 대상체의 수명을 연장, 즉 증가시키기 위해 대상체에게 화합물 또는 조성물, 또는 화합물 또는 조성물의 조합물을 투여하는 것을 의미한다.
특히, 용어 "질환 또는 장애의 치료"는 질환 또는 장애 또는 이의 증상에 대한 치유, 지속기간의 단축, 개선, 예방, 진행 또는 악화의 늦춤 또는 억제, 또는 발병의 예방 또는 지연을 포함한다.
본 발명에 따르면, 용어 "질환"은 임의의 병리학적 상태, 특히 암, 감염성 질환, 염증성 질환, 자가면역 장애, 및 이식 거부반응을 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 "암"은 비정상적으로 조절된 세포의 성장, 증식, 분화, 부착, 및/또는 이동을 특징으로 하는 질환을 포함한다. "암세포"는 통제되지 않는 빠른 세포 증식에 의해 성장하고 새로운 성장을 시작한 자극이 중단된 후에도 계속 성장하는 비정상적인 세포를 의미한다. 본 발명에 따른 용어 "암"은 백혈병, 정상피종, 흑색종, 기형종, 림프종, 신경모세포종, 신경교종, 직장암, 자궁내막암, 신장암, 부신암, 갑상선암, 혈액암, 피부암, 뇌암, 자궁경부암, 장관암, 간암, 결장암, 위암, 장암, 두경부암, 위장관암, 림프절암, 식도암, 결장직장암, 췌장암, 이비인후(ENT)암, 유방암, 전립선암, 자궁암, 난소암 및 폐암, 및 이들의 전이를 포함한다. 이들의 예는 폐 암종, 유방 암종, 전립선 암종, 결장 암종, 신세포 암종, 자궁경부 암종, 또는 상기 암 유형 또는 종양의 전이이다.
본 발명에 따른 용어 "암"은 또한 암 전이를 포함한다. "전이"는 암세포가 원래 부위에서 신체의 다른 부분으로 퍼지는 것을 의미한다. 전이의 형성은 매우 복잡한 과정이며, 원발성 종양으로부터의 악성 세포 분리, 세포외 기질의 침입, 내피 기저막을 통한 체강 및 혈관으로의 침투, 및 이후 혈액에 의해 운반된 후 표적 기관의 침윤에 의존한다. 마지막으로, 표적 부위에서의 새로운 종양, 즉 2차 종양 또는 전이성 종양의 성장은 혈관신생에 의존한다. 종양 세포 또는 구성요소가 남아 전이 가능성이 나타날 수 있기 때문에 종양 전이는 원발성 종양을 제거한 후에도 종종 발생한다. 일 구현예에서, 본 발명에 따른 용어 "전이"는 원발성 종양 및 국소 림프절계에서 멀리 떨어진 전이와 관련된 "원격 전이"와 관련된다.
용어 "감염성 질환"은 개인 간 또는 유기체 간에 전염될 수 있고 미생물제에 의해 유발되는(예: 감기) 임의의 질환을 의미한다. 감염성 질환의 예는 바이러스 감염성 질환, 예컨대 AIDS(HIV), A, B, 또는 C 형 간염, 헤르페스, 대상포진(수두), 독일 홍역(풍진 바이러스),황열병, 뎅기열 등 플라비바이러스, 인플루엔자 바이러스, 출혈성 감염성 질환(마버그 또는 에볼라 바이러스), 및 중증 급성 호흡기 증후군(SARS), 박테리아 감염성 질환, 예컨대 레지오넬라병(Legionella), 성병(예: 클라미디아 또는 임질), 위궤양(헬리코박터), 콜레라(비브리오), 결핵, 디프테리아, 대장균에 의한 감염, 포도상구균, 살모넬라 또는 연쇄상구균(파상풍); 원생동물 병원체에 의한 감염, 예컨대 말라리아, 수면병, 리슈만편모충증; 톡소플라스마증, 즉 플라스모듐, 트리파노소마, 리슈마니아, 및 톡소플라스마에 의한 감염; 또는 예를 들어 크립토코커스 네오포르만스(Cryptococcus neoformans), 히스토플라스마 캡슐라툼(Histoplasma capsulatum), 콕시디오이데스 이미티스(Coccidioides immitis), 블라스토마이세스 데르마티티디스(Blastomyces dermatitidis), 또는 칸디다 알비칸스(Candida albicans)에 의해 유발되는 진균 감염을 포함한다.
용어 "염증성 질환"은 조직, 특히 결합 조직의 높은 수준의 염증, 또는 이러한 조직의 변성을 특징으로 하거나 이와 관련된 임의의 질환을 의미한다. 만성 염증성 질환은 지속적인 염증을 특징으로 하는 질병이다. (만성) 염증성 질환의 예는 셀리악병, 혈관염, 루푸스, 만성 폐쇄성 폐질환(COPD), 과민성 장 질환, 죽상경화증, 관절염, 강직성 척추염, 크론병, 대장염, 만성 활동성 간염, 피부염, 및 건선을 포함한다.
용어 "자가면역 장애"는 신체가 자체 조직의 일부 구성 요소에 대해 면역원성(즉, 면역계) 반응을 일으키는 임의의 질환/장애를 의미한다. 즉, 면역계가 체내의 일부 조직 또는 계통을 자신으로 인식하는 능력을 상실하고 마치 외래종인 것처럼 표적화하고 공격한다. 자가면역 질환은, 주로 하나의 기관이 영향을 받는 질환(예: 용혈성 빈혈 및 항면역 갑상선염)과 자가면역 질환의 진행이 여러 조직을 통해 확산되는 질환(예: 전신 홍반성 루푸스)으로 분류할 수 있다. 예를 들어, 다발성 경화증은 T세포가 뇌와 척수의 신경 섬유를 둘러싸고 있는 외피를 공격하여 발생하는 것으로 여겨진다. 그 결과 협응력 상실, 쇠약, 시야 흐림이 나타난다. 자가면역 질환은 당업계에 알려져 있으며, 예를 들어 하시모토 갑상선염, 그레이브병, 루푸스, 다발성 경화증, 류마티스 관절염, 용혈성 빈혈, 항면역 갑상선염, 전신 홍반성 루푸스, 셀리악병, 크론병, 대장염, 당뇨병, 경피증, 건선 등을 포함한다.
용어 "이식 거부반응"은 이식된 조직 또는 기관이 수여체의 면역계에 의해 거부되는 것을 의미하며, 이는 궁극적으로 이식 조직 또는 기관을 파괴할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "유효량"은 특히, 바람직하게는 허용할 수 없는 부작용을 일으키지 않으면서, 목적하는 치료 반응 또는 목적하는 치료 효과를 단독으로 또는 추가 용량과 함께 달성하는 양인 "치료 유효량"을 의미한다. 특정 질환 또는 특정 병태의 치료의 경우, 목적하는 반응은 바람직하게는 해당 질환 경과의 억제와 관련된다. 이는 질환의 진행을 늦추는 것, 특히 질환의 진행을 방해하거나 역전시키는 것을 포함한다. 질환 또는 병태의 치료에서의 목적하는 반응은 또한 상기 질환 또는 상기 병태의 발병 지연 또는 발병 예방일 수 있다. 본원에 기술된 단백질의 유효량은 치료될 병태, 질환의 중증도, 대상체의 개별 파라미터(연령, 생리적 상태, 크기 및 체중 포함), 치료 지속기간, (존재할 경우) 수반되는 치료법의 유형, 특정 투여 경로, 및 유사 요인에 따라 달라질 것이다. 따라서, 본원에 기술된 제제의 투여 용량은 이러한 몇몇 파라미터에 따라 달라질 수 있다. 대상체에서의 반응이 초기 용량으로 불충분한 경우, 더 높은 용량(또는 상이한 더 국소화된 투여 경로에 의해 달성되는 효과적으로 더 높은 용량)이 사용될 수 있다.
용어 "대상체"는 본 발명에 따르면, 치료를 위한 대상체, 특히 질환에 걸린 대상체("환자"라고도 함)를 의미하며, 이는 인간, 비인간 영장류 또는 그 밖의 동물, 특히 소, 말, 돼지, 양, 염소, 개, 고양이, 토끼와 같은 포유류 또는 마우스, 래트, 기니피그, 및 햄스터와 같은 설치류를 포함한다. 일 구현예에서, 대상체/환자는 인간이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 상기 정의된 바와 같은 단백질을 포함하는 약학적 조성물 또는 키트에 관한 것이다. 일 구현예에서, 약학적 조성물은 약학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함한다.
본 발명의 약학적 조성물은 비경구 전달용으로 선택될 수 있다. 대안적으로, 조성물은 흡입용으로 또는 소화관을 통한 전달용으로, 예컨대 경구용으로 선택될 수 있다. 이러한 약학적으로 허용되는 조성물의 조제는 당업계의 기술 범위 내에 있다.
본원에서 사용되는 용어 "약학적으로 허용되는 담체" 또는 "생리학적으로 허용되는 담체"는 항체-유사 결합 단백질의 전달을 달성하거나 향상시키기에 적합한 하나 이상의 제형화 물질을 지칭한다. 약학적 조성물 중의 1차 담체는 사실상 수성 또는 비수성일 수 있다. 예를 들어, 주사용으로 적합한 비히클 또는 담체는 물, 생리 식염수 용액, 또는 인공 뇌척수액일 수 있으며, 비경구 투여용 조성물에 일반적으로 사용되는 다른 물질로 보충될 수 있다. 중성 완충 식염수 또는 혈청 알부민과 혼합된 식염수는 추가의 예시적인 비히클이다. 다른 예시적인 약학적 조성물은 약 pH 7.0~8.5의 Tris 완충제, 또는 약 pH 4.0~5.5의 아세테이트 완충제를 포함하며, 이는 소르비톨 또는 적합한 대체제를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 일 구현예에서, 항체-유사 결합 단백질 조성물은 원하는 정도의 순도를 갖는 선택된 조성물을 임의의 제형화제와 동결건조 케이크 또는 수성 용액의 형태로 혼합함으로써 보관용으로 제조될 수 있다. 또한, 항체-유사 결합 단백질은 수크로스와 같은 적절한 부형제를 사용하여 동결건조물로 제형화될 수 있다.
약학적 조성물은 예를 들어 조성물의 pH, 삼투압농도, 점도, 투명도, 색상, 등장성, 냄새, 무균성, 안정성, 용해 또는 방출 속도, 흡착성 또는 침투성을 변경, 유지, 또는 보존하기 위한 제형화 물질을 함유할 수 있다. 적합한 제형화 물질은 아미노산(예컨대, 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌, 또는 리신), 항균제, 항산화제(예컨대, 아스코르브산, 아황산나트륨, 또는 아황산수소나트륨), 완충제(예컨대, 붕산염, 중탄산염, Tris-HCl, 시트르산염, 인산염, 또는 기타 유기산), 증량제(예컨대, 만니톨 또는 글리신), 킬레이트제(예컨대, 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)), 착화제(예컨대, 카페인, 폴리비닐피롤리돈, 베타-시클로덱스트린, 또는 하이드록시프로필베타-시클로덱스트린), 충전제, 단당류, 이당류, 및 기타 탄수화물(예컨대, 글루코스, 만노스, 또는 덱스트린), 단백질(예컨대, 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 면역글로불린), 착색제, 착향제 및 희석제, 유화제, 친수성 중합체(예컨대, 폴리비닐피롤리돈), 저분자량 폴리펩티드, 염형성 반대이온(예컨대, 나트륨), 보존제(예컨대, 염화벤잘코늄, 벤조산, 살리실산, 티메로살, 페네틸 알코올, 메틸파라벤, 프로필파라벤, 클로르헥시딘, 소르브산, 또는 과산화수소), 용매(예컨대, 글리세린, 프로필렌 글리콜, 또는 폴리에틸렌 글리콜), 당알코올(예컨대, 만니톨 또는 소르비톨), 현탁제, 계면활성제 또는 습윤제(예컨대, 플루로닉; PEG; 소르비탄 에스테르; 폴리소르베이트, 예컨대 폴리소르베이트 20 또는 폴리소르베이트 80; 트리톤; 트로메타민; 레시틴; 콜레스테롤 또는 틸록사폴), 안정성 강화제(예컨대, 수크로스 또는 소르비톨), 장성 강화제(예컨대, 알칼리 금속 할로겐화물, 바람직하게는, 염화나트륨 또는 염화칼륨, 또는 만니톨 소르비톨), 전달 비히클, 희석제, 부형제 및/또는 약학적 보조제를 포함하나 이에 한정되지 않는다(예를 들어, 문헌[REMINGTON's PHARMACEUTICAL SCIENCES (18th Ed., A.R. Gennaro, ed., Mack Publishing Company 1990)], 및 이의 후속판 참조).
본원에서 사용되는 용어 "부품 키트(간략히, 키트)"는 하나 이상의 용기 및 임의로 데이터 캐리어를 포함하는 제조 물품을 지칭한다. 상기 하나 이상의 용기는 위에서 언급된 제제(시약) 중 하나 이상으로 충전될 수 있다. 예를 들어 희석제, 완충제, 및 추가 시약을 포함하는 추가 용기가 키트에 포함될 수 있다. 상기 데이터 캐리어는 비전자 데이터 캐리어, 예를 들어 그래픽 데이터 캐리어, 예컨대 정보 리플릿, 정보 시트, 바코드, 또는 액세스 코드, 또는 전자 데이터 캐리어, 예컨대 콤팩트 디스크(CD), 디지털 다기능 디스크(DVD), 마이크로칩, 또는 다른 반도체-기반 전자 데이터 캐리어일 수 있다. 액세스 코드는 데이터베이스, 예를 들어 인터넷 데이터베이스, 중앙 집중식 또는 분산형 데이터베이스에 대한 접속을 허용할 수 있다. 상기 데이터 캐리어는 본 발명의 제제, 예를 들어 본원에 기술된 바와 같은 단백질 및 약학적 조성물뿐만 아니라 핵산 분자 및 숙주 세포와 같은 관련 제제의 사용을 위한 지침을 포함할 수 있다.
다른 양태에서, 본 발명은 식 VLb-L1-VLa-L2-CL을 갖는 제1 폴리펩티드 사슬, 식 VHa-L3-VHb-L4-CH1-힌지-CH2-CH3를 갖는 제2 폴리펩티드 사슬, 및 식 VLc-CLc-PCL-VHc-CH1c-힌지-CH2-CH3를 갖는 제3 폴리펩티드 사슬을 포함하는 단백질에 관한 것으로,
식에서,
VLa는 제1 면역글로불린 경쇄 가변 영역이고;
VLb는 제2 면역글로불린 경쇄 가변 영역이고;
VLc는 제3 면역글로불린 경쇄 가변 영역이고;
CL은 면역글로불린 경쇄 불변 영역이고;
CLc는 면역글로불린 경쇄 불변 영역이고;
VHa는 제1 면역글로불린 중쇄 가변 영역이고;
VHb는 제2 면역글로불린 중쇄 가변 영역이고;
VHc는 제3 면역글로불린 중쇄 가변 영역이고;
CH1은 면역글로불린 CH1 중쇄 불변 영역이고;
CH1c는 면역글로불린 CH1 중쇄 불변 영역이고;
힌지는 면역글로불린 힌지 영역이고;
CH2는 면역글로불린 CH2 중쇄 불변 영역이고;
CH3는 면역글로불린 CH3 중쇄 불변 영역이고;
PCL은 프로테아제-절단가능 링커이고;
L1, L2, L3, 및 L4는 링커이고,
VLa는 VHa와 쌍을 이루어 항원 A에 결합하는 항원 결합 부위를 형성하고, VLb는 VHb와 쌍을 이루어 항원 B에 결합하는 항원 결합 부위를 형성하고, VLc는 VHc와 쌍을 이루어 항원 C에 결합하는 항원 결합 부위를 형성하고;
제2 폴리펩티드 사슬은 적어도 2개의 이황화 결합을 통해, 그리고 임의로 적어도 하나의 추가적인 Fc 상호작용을 통해 제3 폴리펩티드 사슬과 회합된다.
일 구현예에서, 항원 결합 부위 C는 프로테아제-절단가능 링커의 프로테아제-절단 시 활성이 되거나 증가된 활성을 나타낸다.
일 구현예에서, 프로테아제-절단가능 링커는 본원에 정의된 바와 같은 프로테아제-절단가능 링커이다.
일 구현예에서, 적어도 하나의 추가적인 Fc 상호작용은 적어도 하나의 노브-인투-홀 상호작용(예를 들어, 2개의 노브-인투-홀 상호작용)이다.
일 구현예에서, L1, L2, L3, 및 L4는 1 내지 25, 바람직하게는 2 내지 25, 더 바람직하게는 5 내지 20, 더 바람직하게는 10 내지 20개의 아미노산 잔기의 길이를 갖는 것이 바람직한 본원에 정의된 바와 같은 펩티드 링커로부터 독립적으로 선택된다. 일 구현예에서, L1, L2, L3, 및 L4는 아미노산 중 적어도 50%, 바람직하게는 적어도 60%, 더 바람직하게는 적어도 70%, 더 바람직하게는 적어도 80%, 더욱 더 바람직하게는 적어도 85%가 각각 글리신 또는 세린 잔기인 글리신-세린-풍부 링커이다. 일 구현예에서, L1, L2, L3, 및 L4는 각각 글리신 링커, 세린 링커, 또는 글리신-세린 링커이다. 일 구현예에서, L1, L2, L3, 및 L4는 서열 (G4S)n(서열번호 51)을 갖는다(n은 1 내지 5, 예를 들어 1 내지 3, 또는 2 내지 4에서 독립적으로 선택되는 정수임).
본 발명은 또한 본원에 기술된 바와 같은 본 발명의 임의의 양태에서 서열번호 42 내지 44 중 어느 하나의 아미노산 서열의 기능적(즉, 프로테아제-절단가능) 변이체(의 용도)를 포함한다. 일 구현예에서, 변이체는 서열번호 42 내지 44 중 어느 하나의 아미노산 서열에 대한, 최대 3, 2, 또는 1개의 아미노산 치환, 바람직하게는 보존적 아미노산 치환, 최대 3, 2, 또는 1개의 아미노산 잔기의 결실(예를 들어, N-말단 및/또는 C-말단에서의 결실), 및/또는 최대 3, 2, 또는 1개의 아미노산 잔기의 부가(예를 들어, N-말단 및/또는 C-말단에의 부가)를 포함한다. 보존적 아미노산 치환은 아미노산을 동일한 아미노산 계열의 다른 아미노산, 즉 (예를 들어, 전하 및/또는 크기 관점에서) 측쇄 관련이 있는 아미노산으로 치환하는 것을 포함한다. 천연 발생 아미노산은 일반적으로 4가지 계열, 즉 산성(아스파테이트, 글루타메이트), 염기성(리신, 아르기닌, 히스티딘), 비극성(알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), 및 비하전 극성(글리신, 아스파라긴, 글루타민, 시스테인, 세린, 트레오닌, 티로신) 아미노산으로 분류된다. 페닐알라닌, 트립토판, 및 티로신은 때로는 함께 방향족 아미노산으로 분류된다. 보존적 치환은 당업계에 잘 알려져 있다(예를 들어, 문헌[Creighton (1984) Proteins. W.H. Freeman and Company] 참조). 일 구현예에서, 변이체는 다음의 아미노산 치환 중 하나 이상(예를 들어, 최대 3, 2, 또는 1개)을 포함한다: R→K, S→T/A(즉, S→T 또는 S→A), V→A/I/L(즉, V→A 또는 V→I 또는 V→L), D→E, E→D. 일 구현예에서, 변이체(예를 들어, 서열번호 42의 변이체)는 다음의 아미노산 치환 중 하나 이상(예를 들어, 최대 3개, 2개, 또는 1개)을 포함한다: S→T/A, V→A/I/L, D→E, E→D.
이하, 하기 실시예를 참조하여 본 발명을 추가로 설명하며, 이는 본 발명의 범위를 제한하려는 것이 아니라 예시하기 위함이다.
실시예
실시예 1: 재료 및 방법
HEK 293-FS, ExpiCHO 세포 및 안정한 CHO 9E4 세포 풀에서 프로테아제-절단가능 단일특이적 및 이중특이적 분자의 발현
단일클론 항체의 경우, 발현 플라스미드는 프로테아제-절단가능 링커를 통해 연결된 중쇄 및 경쇄를 포함하는 단일쇄(항-IL4-hIgG1)를 암호화했고; 이중특이적 탠덤-IgG 항체의 경우, 발현 플라스미드는 중쇄 또는 단일 경쇄(프로테아제-절단가능 링커로 연결된 2개의 Fab 단편)를 암호화했고; 이중특이적 탠덤-유사 항체의 경우, 발현 플라스미드는 중쇄 또는 중쇄-경쇄 연결 구성체를 암호화했다. 프로테아제의 경우, 발현 플라스미드는 푸린, PCSK5, PCSK6, PCSK7, 또는 추가적인 KDEL-신호 펩티드가 있는 푸린의 인간 프로펩티드 서열을 암호화했다. 모든 발현 플라스미드를 E. coli DH5a에서 증식시켰다. 형질감염에 사용된 플라스미드는 Qiagen EndoFree Plasmid Mega Kit를 사용하여 E. coli로부터 제조하였다.
F17 무혈청 현탁 배양(Invitrogen)에서 성장하는 HEK 293-FS 세포를 폴리에틸렌이민 형질감염 시약을 사용하여, 표시된 단일쇄 또는 LC 및 HC 플라스미드로 형질감염시켰다. F17 무혈청 현탁 배양(Invitrogen)에서 성장하는 ExpiCHO 세포를 적합한 형질감염 시약을 사용하여, 표시된 플라스미드로 형질감염시켰다.
37℃에서 7일 동안 배양한 후, 원심분리로 세포를 제거하고 상청액을 0.22 μm 필터에 통과시켜 입자를 제거하였다.
HEK293-FS 또는 ExpiCHO 세포의 공동 형질감염을 위해, 항체 구성체를 위한 플라스미드를 프로테아제의 프로펩티드 서열을 암호화하는 개별 발현 플라스미드와 1:1의 몰비로 혼합하였다.
안정한 CHO 9E4 세포 풀의 생성을 위해, CHO 9E4 세포를 CD CHO 무혈청 배지(Invitrogen)에서 배양하고, 단일 경쇄 및 중쇄를 각각 암호화하는 트랜스포존-기반 플라스미드와 함께 MaxCyte STX 기기 및 완충제 시약(MaxCyte Inc.)을 사용하여 전기천공하였다. 프로테아제 공동발현의 경우, 플라스미드 함량의 30%는 트랜스포존-기반 프로테아제-암호화 플라스미드였다. MSX 선택 마커를 포함하는 CD CHO 배지에서 6일 동안 안정한 세포 풀을 선택하였다. 항체의 발현을 위해, 선택 압력하에 FeedB(Invitrogen)를 함유하는 OPTi CHO 배지(Invitrogen)에서 13일 동안 37℃에서 배양한 후, 상청액을 원심분리로 분리하고 0.22 μm 필터에 통과시켜 입자를 제거하였다.
정제를 위해, 항체를 MabSelect SuRe 컬럼(Cat. No.: 11-0034-93, GE Healthcare)에 포획하고 0.1 M 시트레이트 완충액(pH 3.0)으로 용리시켰다. 1:6(v/v) Trizma(pH 8.0, Sigma Aldrich)를 첨가하여 용리 분획을 직접 중화시켰다. Superdex200 16/60(GE)을 사용한 크기 배제 크로마토그래피(SEC)에 의한 단백질의 폴리싱(polishing) 및 최종 한외여과 농축 단계 후에, 단백질을 추가 특성화에 사용하였다.
소듐 도데실 설페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE) 및 모세관 전기영동
SDS-PAGE의 경우, 2 μg 단백질 샘플을 NuPage LDS Sample Buffer(ThermoFisher Scientific)와 혼합하였고; 환원 조건을 위해, 2 μg 단백질을 DTT(디티오트레이톨)를 함유하는 NuPage LDS Sample Buffer와 혼합하고 95℃에서 5분 동안 가열하였다. 샘플 및 Color Protein Standard Broad Range ladder(New England Biolabs)를 4~12% Bis/Tris 겔(Invitrogen)에 로딩하고 NuPage MOPS SDS Running Buffer(ThermoFisher Scientific)에서 45분 동안 200 V로 전개시켰다. Instant Blue Coomassie protein stain(Expedeon)으로 겔을 염색시켰다. 모세관 전기영동의 경우, Protein Clear HR 분석 키트 및 LabChip Touch SP2 기기(Perkin Elmer)를 사용하여 제조업체의 프로토콜에 따라 환원 및 산화 조건하에 단백질 샘플을 제조하였다.
분석용 크기 배제 크로마토그래피(SEC)
분석용 SEC는 AdvanceBio 300 컬럼(4.6 mm x 300 mm) 및 AdvanceBio 300 가드 컬럼(Agilent Technologies)을 갖춘 BioSECcurity 기기(PSS Polymer)를 사용하여 25℃에서 수행하였다. 분석은 2x 농축 D-PBS 완충액(Thermo Fisher Scientific)을 사용하여 280 nm에서 검출하면서 0.5 ml/분의 유량으로 실행하였다. 10 μl의 단백질 샘플(1 mg/ml)을 컬럼 상에 적용하였다. WinGPC 소프트웨어 v8.1(PSS Polymer)을 사용하여 데이터 평가를 수행하였다. 분자량 추정을 위해 SEC 컬럼을 단백질 보정용 표준 혼합물(Agilent Technologies)로 보정하였다.
분석용 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC)
분석용 HIC는 TSKgel Butyl-NPR 컬럼(2.5 μm, 4.6 x 35 mm)(Tosoh Bioscience)을 갖춘 LC10 HPLC 기기(Shimadzu) 또는 Vanquish HPLC 기기(Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 25℃에서 수행하였다. 분석은 280 nm에서 검출하면서 1 ml/분의 유량으로 실행하였다. 5 μg의 희석되지 않은 단백질 샘플을 컬럼 상에 적용하였다. 구배 용리는 7분 내에 15% B에서 85% B까지, 이어서 1분 내에 100% B까지, 그 후 1분 내에 15% B까지, 그 후 15% B에서 3분의 평형화였다. 완충액 A는 1.5 M 황산암모늄, 25 mM 인산나트륨(pH 7.0)으로 구성되었다. 완충액 B는 25 mM 인산나트륨(pH 7.0)으로 구성되었다. LabSolutions 소프트웨어 v5.85(Shimadzu) 또는 Chromeleon 7 소프트웨어(Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 데이터 평가를 수행하였다.
질량 분석법(MS)
이종이량체 구성체의 단백질 무결성 및 잠재적인 쌍형성 오류를 LC-질량 분석(LC-MS)에 의해 분석하였다. 단백질 샘플을 37℃에서 16시간 동안 0.5 μl PNGaseF(글리세롤 무함유, New England Biolabs)로 처리된 LC-MS 등급의 물(Thermo Scientific)에 0.17 mg/ml로 희석시킨 12.5 μg의 단백질을 사용하여 탈글리코실화하였다. LC-MS 분석은 Thermo Fisher Orbitrap Lumos LC/MS 기기를 사용하여 수행하였다. MabPac RP HPLC 컬럼, 분석용 4 μm 입자 크기, 2.1 x 100 mm(Thermo Scientific)를 사용하여 300 μL/분으로 역상(RP) 크로마토그래피를 수행하였다. 용리제는 LC 물, 0.1% 포름산(A) 및 90% 아세토니트릴, 10% LC 물, 0.1% 포름산(B)이었다. 2 μg의 단백질을 컬럼에 주입하고 12분 내에 0%에서 95% B까지의 선형 구배를 사용하여 용리시켰다. Expressionist 소프트웨어 13.0.3(Genedata)을 사용하여 데이터 분석을 수행하였다. GPMAW 소프트웨어 버전 10.32b1(Lighthouse data)을 사용하여 단백질의 아미노산 서열을 기반으로 분자 질량을 계산하였다.
표면 플라스몬 공명(SPR)
항체 구성체에 대한 항원의 결합은 HBS-EP 완충액(GE Healthcare)과 BIAcore 3000 기기(GE Healthcare)로 표면 플라스몬 공명(SPR)을 이용해 측정하였다. 항원으로서, 인간 IL4(IL004, Millipore) 및 인간 IL13(IL012, Millipore)을 사용하였다. 표준 절차를 사용하여 연구용 등급 CM5 칩(GE Life Sciences) 상의 1차 아민기를 통해 항-인간 Fc 포획 항체(인간 항체 포획 키트, GE Life Sciences)를 고정시켰다(11000 RU). 30 RU의 최대 피분석물 결합을 생성하는 조정된 RU 값을 사용하여 10 μL/분의 유량으로 리간드를 포획하였다. 시험 항체 구성체를 피분석물로 사용하여 30 μL/분의 유량으로 300초의 해리 시간으로 240초 동안 100 nM 농도로 주입하였다. 인간 IL4 및 IL13에 대해, 각각 0.1 nM 내지 3 nM 및 0.8 nM 내지 25 nM의 희석 시리즈를 사용하였다. 포획 키트와 함께 제공된 재생 완충액을 2분 동안 주입하여 칩 표면을 재생시켰다. 센서그램은 블랭크 칩 표면 및 HBS-EP 완충액 블랭크로 이중 교정되었다. BIAevaluation 소프트웨어 v4.1을 사용하여 데이터 분석을 수행하였다.
실시예 2: HEK293-FS 세포에서 프로테아제-절단가능 탠덤-IgG의 발현 및 생체내 처리
VLa-Cκ 및 VLb-Cκ 사슬이 상이한 프로테아제-절단가능 링커 서열을 통해 연결된 중쇄(HC) 및 단일 경쇄(sLC)를 암호화하는 2개의 플라스미드의 일시적 형질감염 후, HEK293-FS 세포에서 이중특이적 탠덤-IgG(도 1의 B; 표 1) 구성체를 발현시켰다. 대조군으로서, 2개의 개별 사슬로 발현된 VLa-Cκ 및 VLb-Cκ를 갖는 탠덤-(항-IL4x항-IL13)-huIgG1(탠덤-IgG 대조군)을 사용하였다. sLC 탠덤-IgG는 대조군 탠덤-IgG와 유사한 발현 및 정제 특성을 나타냈다(도 3의 A 및 B; 표 1에서 볼드체로 표시된 선택된 구성체).
Figure pct00001
프로테아제-절단가능 링커가 있는 탠덤-IgG 구성체의 생체내 처리의 환원 조건하에서의 SDS-PAGE 분석은 변형된 프로테아제 인식/절단 부위 HRRRKRSVDE(PCS2; 서열번호 43; "PCL2"는 PCS2를 포함하는 PCL을 지칭함)가 있는 링커 서열을 포함하는 sLC가 탠덤-IgG 대조군에서 볼 수 있는 바와 같이 2개의 개별 경쇄를 나타냄(도 3의 C)을 보여주었다. 변형된 프로테아제 인식/절단 부위 HRRQQRSVDE(PCS2a; 서열번호 44; "PCL2a"는 PCS2a를 포함하는 PCL을 지칭함)에서도 유사한 결과를 얻었다. 대조적으로, 최소 프로테아제 인식 서열(PCS1; 서열번호 49; "PCL1"은 PCS1을 포함하는 PCL을 지칭함), 상이한 링커 서열 또는 결실된 인식 서열(델타PCS/PCL)을 포함하는 모든 구성체는 HEK293-FS 세포에서 발현 중에 생체내 처리되지 않았으며, 환원 조건하에서 단일 LC 및 HC의 동일한 프로파일을 나타냈다(도 3의 C; sLC PCL1 탠덤-IgG에 대해 나타낸 예시적인 프로파일).
탠덤-IgG 구성체의 단백질 무결성 및 생체내 처리를 LC-질량 분석(LC-MS)에 의해 추가로 분석하였다. 환원 및 비환원 조건하에 탈글리코실화 후 샘플을 측정하였다. 단백질의 아미노산 서열을 기반으로 분자 질량을 계산하였다(표 2). LC-MS 분석을 통해 PCS2 인식 부위를 포함하는 탠덤-IgG 구성체에서 링커 서열의 완전한 생체내 처리가 확인되었다. 대조적으로, 결실(델타PCS/PCL) 또는 최소 PCS(PCS1) 인식 부위를 갖는 탠덤-IgG의 단백질 샘플에서는 처리가 검출되지 않았다. 또한, 2개의 개별 LC로 구성된 대조군 탠덤-IgG는 HC에 대한 LC의 쌍형성 오류(3*LC1 + 1*LC2 + 2*HC)를 나타냈으며, 이는 sLC를 LC1 및 LC2로 처리한 후 sLC 탠덤-IgG-PCL2에서는 관찰되지 않았다. 따라서, sLC 탠덤-IgG 구성체는 이러한 이중특이적 IgG-형태에서 LC-HC 쌍형성 오류를 줄이거나 방지한다. 또한, 완전 처리된 샘플에서, 카복시-말단 프로테아제에 의한 프로테아제 인식 부위 RRKR을 포함하는 C-말단 하전 아미노산의 추가 처리가 관찰되었다(RRKR-소실). 대조적으로, Edman 시퀀싱에 의해 추가 N-말단 처리는 볼 수 없었다(데이터는 나타내지 않음).
Figure pct00002
실시예 3: ExpiCHO 세포에서 프로테아제-절단가능 탠덤-IgG의 발현 및 생체내 처리
ExpiCHO 세포에서의 탠덤-IgG의 일시적 발현에 대해, 선택된 sLC 구성체를 표 3에 나타냈다. 상이한 프로테아제 인식 부위를 갖는 sLC 탠덤-IgG는 대조군 탠덤-IgG와 유사한 발현 및 정제 특성을 나타냈다(도 4의 A 및 B). 그러나, 발현 수준은 HEK293-FS 세포에서의 일시적 형질감염 및 발현에 비해 낮았다.
Figure pct00003
탠덤-IgG의 생체내 처리의 환원 조건하에서의 SDS-PAGE 분석은 변형된 프로테아제 인식 부위 HRRRKRSVDE(PCS2; 서열번호 43)가 있는 링커 서열을 포함하는 sLC가 2개의 개별 경쇄를 나타냄을 보여주었다(도 4의 C). 최소 프로테아제 인식 서열(PCS1; 서열번호 49) 또는 결실된 인식 서열(델타PCS/PCL)을 포함하는 구성체는 ExpiCHO 세포에서 내인성 발현 프로테아제에 의해 생체내 처리되지 않았다. 따라서, ExpiCHO 세포에서의 프로테아제-절단가능 sLC 탠덤-IgG의 발현에서 HEK293-FS 배양 결과가 확인되었다.
LC-MS 분석을 통해 카복시-말단 프로테아제에 의한 C-말단 하전 아미노산의 추가 처리 프로파일(RRKR-소실)을 갖는 ExpiCHO 세포에서 완전 처리된 sLC-PCL2 탠덤-IgG의 SDS-PAGE 결과가 확인되었다.
Figure pct00004
실시예 4: HEK293-FS 세포에서 프로테아제 및 프로테아제-절단가능 구성체의 공동 형질감염
sLC의 링커 서열에 PCS1 및 델타PCS 인식 부위를 포함하는 sLC가 있는 탠덤-IgG 구성체를 HEK293-FS 세포에서 PCSK 계열의 프로테아제와 공동 형질감염시켜(표 5) 프로테아제의 과발현에 의해 생체내 처리를 유도하였다. sLC 탠덤-IgG 구성체는 단일 형질감염된 항체와 유사한 발현 및 정제 특성을 나타냈다(도 5의 A 및 B). 감소된 발현 수율은 공동 형질감염(개별 프로테아제를 암호화하는 플라스미드와 1:1의 몰비)에서 더 낮은 플라스미드 양으로 인한 것이었다. SDS-PAGE 및 LC-MS의 생체내 처리 분석을 통해, 재조합적으로 발현된 인간 푸린 및 KDEL-보유 서열이 있는 인간 푸린을 사용한 PCS1 인식 부위를 포함하는 sLC 탠덤-IgG의 처리가 확인되었다(도 5의 C 및 D). 대조적으로, 다른 프로테아제 계열 구성원의 과발현은 sLC 탠덤-IgG 처리를 유발하지 않았다. sC-IgG 및 탠덤-유사 IgG 구성체에 대해 유사한 결과를 얻었다(도 7의 A 및 B).
Figure pct00005
안정한 CHO 세포 풀의 생성을 위해, sLC의 링커 서열에 PCS1, PCS2, 및 델타PCS 인식 부위를 포함하는 sLC가 있는 탠덤-IgG 구성체를 암호화하는 트랜스포존-기반 플라스미드, 및 탠덤-IgG 대조군(2개의 LC 플라스미드)을 프로테아제 공동발현의 존재 및 부재하에 CHO 9E4 세포의 전기천공에 사용하였다. sLC 탠덤-IgG 구성체는 탠덤-IgG 대조군과 유사한 발현 및 정제 특성을 나타냈다. SDS-PAGE의 생체내 처리 분석을 통해, 프로테아제 공동발현 없이 발현된 샘플에서 PCS2 인식 부위를 포함하는 sLC 탠덤-IgG의 처리 및 재조합적으로 발현된 인간 푸린을 사용하여 PCS1 및 PCS2 인식 부위가 있는 탠덤-IgG에 대해 처리된 sLC가 확인되었다(도 6).
실시예 5: 프로테아제-절단가능 링커가 있는 이중특이적 sLC 탠덤-IgG의 항원 결합 평가
HEK293-FS 또는 ExpiCHO 세포에서 발현된 상이한 이중특이적 탠덤-IgG 구성체, 및 푸린 변이체를 사용한 공동 형질감염으로부터 생체내 처리된 탠덤-IgG의 결합을 표면 플라스몬 공명(SPR)을 통해 측정하였다. 2가지 인간 항원 IL4 및 IL13에 대한 결합을 개별 단일클론 항체의 결합 특성과 비교하였다. 단일클론 항-IL4 및 항-IL13 mAb 및 이중특이적 탠덤-IgG의 결합 특성을 표 6에 나타냈다. IL4에 대한 특이적 결합은 모든 탠덤-IgG에 대해 측정되었고 항-IL4 대조군 항체의 특이적 결합에 필적하였다. 대조적으로, IL13에 대한 특이적 결합은 생체내 처리된 탠덤-IgG, 및 2개의 LC를 포함하는 탠덤-IgG 대조군에 대해서만 검출가능하였다. 미처리 sLC 탠덤-IgG는 결합을 나타내지 않았다. 따라서, 탠덤-IgG의 내부 위치에 있는 VLb(IL13에 대한 VL)를 외부 위치에 있는 IL4 결합 Fab의 Cκ 도메인과 연결하는 링커 서열의 처리가 기능적 IL13 결합 부위에 필요하다. 따라서, 생체내 처리는 내인적으로 발현된 프로테아제를 통해 또는 공동 형질감염된 푸린 변이체를 통해 매개될 수 있다.
Figure pct00006
실시예 6: HEK293-FS 및 ExpiCHO 세포에서 프로테아제-절단가능 링커가 있는 sC-IgG 및 탠덤-유사 IgG의 발현 및 정제
표 6 및 표 7은 각각 일시적 형질감염 후 HEK293-FS 및 ExpiCHO 배양물로부터의 프로테아제-절단가능 링커 서열이 있는 sC-IgG 및 탠덤-유사 IgG 구성체의 발현 및 정제 데이터를 나타낸다.
단백질 A 정제 및 분취용 SEC 후, sC-IgG는 83~99%의 단량체 피크 분율을 가진 높은 순도를 나타냈다. (G4S)n(서열번호 51) 링커 서열의 길이가 감소함에 따라 sC-IgG에 대한 단백질 수율이 떨어졌다.
sC-IgG와 달리, 탠덤-유사 IgG 형태는 분취용 SEC의 고분자량 종에서 볼 수 있는 바와 같이 높은 응집 가능성과 함께 낮은 단백질 순도(23~75% 단량체 피크 분율)만을 나타냈다.
Figure pct00007
Figure pct00008
두 세포주 모두에서, PCS2 인식 부위가 있는 sC-IgG 및 탠덤-유사 IgG만이 sLC 탠덤-IgG 형태에 대해 나타낸 바와 같이 단백질 발현 중에 내인성 프로테아제에 의해 각각의 사슬 단편으로 절단되었다(도 7의 A 및 B).
실시예 7: HEK293-FS 세포에서 프로테아제 및 프로테아제-절단가능 구성체의 공동 형질감염
링커 서열에 PCS1 및 델타PCS 인식 부위를 포함하는 sLC가 있는 단일쇄 Ig 및 탠덤-유사 IgG 구성체를 HEK293-FS 세포에서 PCSK 계열의 프로테아제와 공동 형질감염시켜 프로테아제의 과발현에 의해 생체내 처리를 유도하였다. SDS-PAGE의 생체내 처리 분석을 통해, 재조합적으로 발현된 인간 푸린 및 KDEL-보유 서열이 있는 인간 푸린을 사용한 PCS1 인식 부위를 포함하는 sC-IgG 및 탠덤-유사 Ig의 유도된 처리가 확인되었다(도 8의 A 및 B). 또한, PACE4의 과발현은 부분 처리된 구성체로 이어진다.
실시예 8: HEK293-FS 세포에서 프로테아제-절단가능 CODV-scFab-IgG의 발현 및 생체내 처리
VLc-Cκ 및 VHc-CH1-CH2-CH3 사슬이 상이한 프로테아제-절단가능 링커 서열을 통해 연결된 CODV HC, CODV LC, 및 단일쇄(sC)를 암호화하는 3개의 플라스미드의 일시적 형질감염 후, HEK293-FS 세포에서 삼중특이적 CODV-scFab-IgG(도 2의 C; 표 8) 구성체를 발현시켰다. 대조군으로서, 2개의 개별 사슬로 발현된 Fab-LC 및 HC를 갖는 삼중특이적 CODV-Fab-IgG(전형적인 CODV-Fab-IgG 대조군)를 사용하였다. 단일쇄 Fab CODV는 SEC에서 응집체 피크의 감소와 함께, 대조군과 유사한 발현 및 정제 특성을 나타냈다(표 9, 도 9의 A).
Figure pct00009
환원 조건하에서의 전기영동 분석은 PCS2(서열번호 43) 또는 PCS2a(서열번호 44) 서열을 포함하는 Fab 아암의 단일쇄가 HEK293-FS 세포에서 발현 후 처리되어 Fab-LC 및 Fab-HC 부분으로 이어짐을 보여주었다(도 9의 B).
Figure pct00010
Figure pct00011
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Figure pct00030
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Figure pct00032
Figure pct00033
Figure pct00034
Figure pct00035
Figure pct00036
Figure pct00037
Figure pct00038
SEQUENCE LISTING <110> SANOFI <120> Protease-Processed Molecules <130> 589-312 PCT <150> EP 20305233.7 <151> 2020-03-05 <160> 75 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 724 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-IL4-VL-huIGKC-[PCS1]-<(G4S)10>-[PCS1]-anti-IL4-VH-huIGHG1 <400> 1 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Val Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Thr Ile Thr Leu Thr Cys His Ala Ser Gln Asn Ile Asp Val Trp 20 25 30 Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Asn Ile Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Lys Ala Ser Asn Leu His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Gly Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala His Ser Tyr Pro Phe 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala 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Gln Lys 275 280 285 Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu Arg 290 295 300 Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 305 310 315 320 Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr 325 330 335 Cys Gln Gln Gly His Thr Leu Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys 340 345 350 Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro 355 360 365 Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu 370 375 380 Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp 385 390 395 400 Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp 405 410 415 Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys 420 425 430 Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln 435 440 445 Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 450 455 460 <210> 74 <211> 682 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-PD1-VH-huIGH-G11-huIGH-H1-<(G4S)3>-anti-OX40-VH-huIGHG1-(LALA) <400> 74 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Asp Cys Lys Ala Ser Gly Ile Thr Phe Ser Asn Ser 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Lys Arg Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Phe 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Thr Asn Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 100 105 110 Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser 115 120 125 Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp 130 135 140 Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr 145 150 155 160 Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr 165 170 175 Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln 180 185 190 Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp 195 200 205 Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Gly Gly Gly 210 215 220 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu 225 230 235 240 Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val 245 250 255 Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Ser Tyr Met Ser Trp 260 265 270 Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Asp Met Tyr 275 280 285 Pro Asp Asn Gly Asp Ser Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Arg Glu Arg Val 290 295 300 Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Leu Glu Leu Ser 305 310 315 320 Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val Leu Ala Pro 325 330 335 Arg Trp Tyr Phe Ser Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 340 345 350 Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser 355 360 365 Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp 370 375 380 Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr 385 390 395 400 Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr 405 410 415 Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln 420 425 430 Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp 435 440 445 Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro 450 455 460 Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro 465 470 475 480 Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr 485 490 495 Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn 500 505 510 Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg 515 520 525 Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val 530 535 540 Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser 545 550 555 560 Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys 565 570 575 Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp 580 585 590 Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe 595 600 605 Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu 610 615 620 Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 625 630 635 640 Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly 645 650 655 Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr 660 665 670 Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 675 680 <210> 75 <211> 463 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-PD1-VL-huIGKC-[PCS2a]-<(G4S)3>-[PCS2a]-anti-OX40-VL-huIGKC <400> 75 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Ser Asn Trp Pro Arg 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys His Arg Arg Gln Gln Arg Ser Val Asp Glu 210 215 220 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser His 225 230 235 240 Arg Arg Gln Gln Arg Ser Val Asp Glu Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser 245 250 255 Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys 260 265 270 Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys 275 280 285 Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu Arg 290 295 300 Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 305 310 315 320 Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr 325 330 335 Cys Gln Gln Gly His Thr Leu Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys 340 345 350 Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro 355 360 365 Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu 370 375 380 Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp 385 390 395 400 Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp 405 410 415 Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys 420 425 430 Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln 435 440 445 Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 450 455 460

Claims (15)

  1. 하기 식을 갖는 적어도 하나의 폴리펩티드 사슬을 포함하는 단백질.
    PP1-PCL-PP2
    [식에서,
    PP1은 제1 폴리펩티드이고,
    PP2는 제2 폴리펩티드이고,
    PCL은 아미노산 서열 HRRX1X2RSVDE(서열번호 42)를 포함하는 적어도 하나의 프로테아제-절단 부위를 포함하는 프로테아제-절단가능 링커이고, X1 및 X2는 아미노산, 바람직하게는 천연 발생 아미노산으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택됨]
  2. 제1항에 있어서, 적어도 하나의 프로테아제-절단 부위는 아미노산 서열 HRRRKRSVDE(서열번호 43) 또는 아미노산 서열 HRRQQRSVDE(서열번호 44)를 포함하는, 단백질.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 링커의 프로테아제-절단은 단백질의 활성 변화를 유발하고, 바람직하게는 활성 변화는 적어도 하나의 항원에 대한 결합 또는 증가된 결합인, 단백질.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 프로테아제-절단가능 링커는 2개의 프로테아제-절단 부위를 포함하고, 2개의 프로테아제-절단 부위는 각각 프로테아제-절단가능 링커의 N-말단 및 C-말단에 위치하고, 2개의 프로테아제-절단 부위는 동일하거나 상이할 수 있는, 단백질.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, PP1은 적어도 하나의 면역글로불린 불변 영역 및/또는 적어도 하나의 면역글로불린 가변 영역을 포함하고/하거나, PP2는 적어도 하나의 면역글로불린 불변 영역 및/또는 적어도 하나의 면역글로불린 가변 영역을 포함하고, 바람직하게는
    PP1은 면역글로불린 불변 영역을 포함하고 PP2는 면역글로불린 가변 영역을 포함하거나,
    PP1은 면역글로불린 가변 영역을 포함하고 PP2는 면역글로불린 불변 영역을 포함하거나,
    PP1은 면역글로불린 불변 영역을 포함하고 PP2는 면역글로불린 불변 영역을 포함하거나,
    PP1은 면역글로불린 가변 영역을 포함하고 PP2는 면역글로불린 가변 영역을 포함하는, 단백질.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 항체 유도체이고, 바람직하게는 단일쇄 항체, 바람직하게는 다중특이적 단일쇄 항체인 단백질.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    (a) VL-CL-PCL-VH-CH1-힌지-CH2-CH3,
    [식에서,
    VL은 면역글로불린 경쇄 가변 영역이고;
    CL은 면역글로불린 경쇄 불변 영역이고;
    VH는 면역글로불린 중쇄 가변 영역이고;
    CH1은 면역글로불린 CH1 중쇄 불변 영역이고;
    힌지는 면역글로불린 힌지 영역이고;
    CH2는 면역글로불린 CH2 중쇄 불변 영역이고;
    CH3는 면역글로불린 CH3 중쇄 불변 영역이고;
    PCL은 프로테아제-절단가능 링커임];
    (b) VLa-CLa-PCL-VLb-CLb,
    [식에서,
    VLa는 제1 면역글로불린 경쇄 가변 영역이고;
    VLb는 제2 면역글로불린 경쇄 가변 영역이고;
    CLa는 제1 면역글로불린 경쇄 불변 영역이고;
    CLb는 제2 면역글로불린 경쇄 불변 영역이고;
    PCL은 프로테아제-절단가능 링커임]; 및
    (c) VLa-CLa-PCL-VLb-CLb-L-힌지-CH2-CH3
    [식에서,
    VLa는 제1 면역글로불린 경쇄 가변 영역이고;
    VLb는 제2 면역글로불린 경쇄 가변 영역이고;
    CLa는 제1 면역글로불린 경쇄 불변 영역이고;
    CLb는 제2 면역글로불린 경쇄 불변 영역이고;
    L은 임의적 링커이고;
    힌지는 면역글로불린 힌지 영역이고;
    CH2는 면역글로불린 CH2 중쇄 불변 영역이고;
    CH3는 면역글로불린 CH3 중쇄 불변 영역이고;
    PCL은 프로테아제-절단가능 링커임]
    로 이루어진 군으로부터 선택되는 식을 갖는 폴리펩티드 사슬을 포함하는 단백질.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 항의 단백질을 암호화하는 핵산 또는 핵산 세트.
  9. 제8항의 핵산 또는 핵산 세트를 포함하는 벡터 또는 벡터 세트.
  10. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 단백질, 제8항의 핵산 또는 핵산 세트, 또는 제9항의 벡터 또는 벡터 세트를 포함하는 숙주 세포로서 바람직하게는 포유류 세포인 숙주 세포.
  11. 단백질 생성 방법으로서,
    i) 제10항에 따른 숙주 세포를 배양하는 단계; 및
    ii) 숙주 세포로부터 단백질을 단리하는 단계를 포함하는 방법.
  12. 제11항의 방법에 의해 얻을 수 있는 단백질.
  13. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 단백질의 푸린 및/또는 푸린-유사 프로테아제-절단에 의해 얻을 수 있는 단백질.
  14. 제1항 내지 제7항, 제12항 또는 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 치료 활성 단백질인 단백질.
  15. 제14항에 있어서, 치료에 사용하기 위한 단백질.
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